JP2022553300A - 新規抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体 - Google Patents

Abstract

新規なヒト由来モノクローナル中和Ｎｏｇｏ－Ａ特異的抗体、並びに、そのフラグメント、誘導体及び変異体、並びに、それらに関連づけられる方法が提供される。併せて、Ｎｏｇｏ－Ａ特異的抗体に関連するポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞及びキットも提供される。抗体、免疫グロブリン鎖、並びにその結合フラグメント、誘導体及び変異体は、それぞれＮｏｇｏ－Ａ標的化免疫療法及び診断のための医薬組成物及び診断組成物に使用することができる。

Description

本発明は、一般に、Ｎｏｇｏ－Ａに特異的に結合してこれを中和する、網膜症などの中枢神経系の疾患及び外傷の治療において有用な、新規なヒト由来抗体、並びにそのフラグメント、誘導体及び生物工学的変異体に関する。

網膜などの中枢神経系組織（ＣＮＳ）は、損傷組織を再生する能力が限られている。ＣＮＳの再生は、成長シグナル伝達の様々な細胞内在性抑制因子並びに細胞外機構によって阻害される。後者には、グリア瘢痕やミエリンにおいて強化される増殖阻害因子が含まれる。Ｎｏｇｏ－Ａは、血管系及び神経細胞の両方の損傷した中枢神経系における回復及び可塑性の量を制限するミエリン関連因子の１つと見なされている（Ｗａｅｌｃｈｌｉ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，２０１３）。これは、レチクロンタンパク質ファミリーのメンバーであり、少なくとも２つの生物学的に活性で薬理学的に異なるドメインであるＮｏｇｏ－６６及びＮｏｇｏ－ＡΔ２０を有しており、両方とも神経突起の成長に対する強力な阻害活性を有することが分かっている（ＧｒａｎｄＰｒｅ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ４１７（２００２），５４７－５１、Ｏｅｒｔｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３（２００３），５３９３－４０６）。したがって、Ｎｏｇｏ－Ａの阻害活性のブロックは、血管及びニューロンの修復及び成長を改善及び促進することによって、ＣＮＳ組織の血管及びニューロン要素の損傷又は変性を伴う障害又は状態を治療するための重要な医薬標的であることが分かっている（Ｐｅｒｎｅｔ，ＢＢＡ－Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１７で概説）。

これに関連して、神経突起成長の強力な阻害剤である（後に、ラットにおけるｎｏｇｏ Ａ遺伝子によってコードされることが分かった）ラットミエリンタンパク質ＮＩ－２２０／２５０に対して惹起されたマウスモノクローナル抗体ＩＮ－１が、ＣＮＳ損傷後の軸索再生及び機能的回復を促進することが報告されている（Ｓｃｈｎｅｌｌ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｂ，Ｎａｔｕｒｅ ３４３（１９９０），２６９－２７２、Ｂｒｅｇｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３７８（１９９５），４９８－５０１、Ｔｈａｌｌｍａｉｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １（１９９８），１２４－１３１、及びＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ４０３（２０００），４３４－４３９）。Ｎｏｇｏ－Ａを標的とする治療上有効なモノクローナル抗体を開発するためのさらなる試みがなされている。例えば、国際公開第２００４／０５２９３２号には、インビトロ及びインビボでＮｏｇｏ－Ａ誘導阻害を効率的に阻止することが分かっているマウス抗体１１Ｃ７が記載されている（上記のＯｅｒｔｌｅ ｅｔ ａｌ，（２００３）、Ｌｉｅｂｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５８（２００５），７０６－７１９）。例えば、生きている動物では、１１Ｃ７の投与は、ラットの脊髄病変後の軸索成長及び歩行運動回復を刺激することができ、ＣＮＳにおける虚血損傷後の血管再生を促進することが示された（上記のＬｉｅｂｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）、Ｊｏｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｉａ ６６（２０１８），２０７９－２０９３、Ｒｕｓｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １１６（２０１９），１４２７０－１４２７９）。さらに、Ｌｉｎｄａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ（２０１３）による研究では、皮質脊髄路切断後又は片側亜型フォトトロボティックストローク（unilateral subtotal photothrombotic stroke）後の抗体１１Ｃ７の感覚運動皮質への髄腔内適用（Ｗａｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４４（２０１４），１２５０－５）が、成体ラットの前肢微細運動の高度な機能回復をもたらすことが観察されている。髄腔内の抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体適用による腕の機能の大きな機能的回復もまた、頸髄又は運動皮質損傷を有するマカクザルにおいて観察された（Ｆｒｅｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．１２（２００６），７９０－２、Ｈａｍａｄｊｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．２２３（２０１２），３２１－４０））。さらに、Ｎｏｇｏ－Ａの不活性化は、網膜損傷後の視覚の可塑性及び回復を改善することが示され得る（例えば、Ｍｄｚｏｍｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ（２０１８）９：７２７を参照されたい）。

さらなるモノクローナル抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体は、国際公開第２００５／０６１５４４号（マウス抗体２Ａ１０及びそのヒト化バージョンＨ１ Ｌ１１）、国際公開第２００７／０６８７５０号及び国際公開第２００９／０５６５０９号（ＡＴＩ３５５、ＨｕＭａｂｍｏｕｓｅ（商標）で産生されたモノクローナル抗体６Ａ３に由来し、この遺伝的に再構成されたマウスは、Ｍｅｄａｒｅｘ Ｉｎｃによって生産されたものであり、ヒト免疫グロブリン遺伝子によってそれらのマウスの対応する遺伝子が置き換えられている）に開示されている。これらの抗体のいくつかは、脊髄損傷（ＳＣＩ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び多発性硬化症（ＭＳ）の治療に関する臨床試験の対象であり、上記のＳｃｈｍａｎｄｋｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）、及びＫｕｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｒｅｈａｂｉｌ．Ｎｅｕｒａｌ Ｒｅｐａｉｒ．（２０１８），５７８－５８９を参照されたい。ＡＴＩ３３５は、ＮＧ－１０１とも呼ばれ、現在、急性頸部脊髄損傷（ＳＣＩ）を有する患者における、特に抗体療法が四肢麻痺患者の運動機能及び生活の質を改善することができる場合の安全性及び予備的有効性に関して多施設で国際的なプラセボ対照第ＩＩ相試験において調査されており、そこでは、抗体は４５ｍｇの髄腔内ボーラス注射によって投与される（例えば、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０３９３５３２１を参照されたい）。

要約すると、これまでのモノクローナル抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体の開発は、脊髄損傷（ＳＣＩ）、脳卒中又は網膜症、例えば、膜血管障害などの網膜を含む中枢神経系（ＣＮＳ）の損傷又は障害若しくは変性を伴う障害又は状態の予防的又は治療的処置に大いに有望である。

しかしながら、モノクローナル抗体の場合、産物の起源は免疫原性に影響を及ぼし得る重要な因子である。マウス抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒトモノクローナル抗体と比較して、ヒトにおいて免疫応答を強く誘発することが分かっているが、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒトモノクローナル抗体はまた、投薬レジメンや患者集団によっては、高い割合で免疫原性を誘発し得ることに留意すべきである。実際、ファージディスプレイを使用して開発された幾つかのヒト抗体や、トランスジェニックマウスに由来する完全な「ヒト」抗体でさえ、有意な抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を有し得る（例えば、Ｈａｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ．２０１０ Ｍａｙ－Ｊｕｎ；２（３）：２５６－２６５、及び“Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ”，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＤＥＲ）Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＢＥＲ）Ａｕｇｕｓｔ ２０１４ Ｃｌｉｎｉｃａｌ／Ｍｅｄｉｃａｌ．を参照されたい）。したがって、いくつかのケースでは、かなりの数の患者においてＡＤＡが持続的に陽性であったことにより、治療が中止された（例えば、Ｋｕｒｉａｋｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１６），Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ １２９８４７３，ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５５／２０１６／１２９８４７３、及びＤａｖｄａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（２０１９）７：１０５，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ４０４２５－０１９－０５８６－０を参照されたい）。

これに関連して、モノクローナル抗体の免疫原性はまた、抗体調製物の不純物及び不均一性に起因し得、例えば、抗体の化学的分解産物及びこれによる抗体分子の安定性の欠如に起因し得る（例えば、Ｄｏｅｖｅｎｄａｎｓ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ８（２０１９），２１；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３９０／ａｎｔｉｂ８０１００２１．を参照されたい）。

国際公開第２００４／０５２９３２号 国際公開第２００５／０６１５４４号 国際公開第２００７／０６８７５０号 国際公開第２００９／０５６５０９号

Ｗａｅｌｃｈｌｉ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，２０１３ ＧｒａｎｄＰｒｅ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ４１７（２００２），５４７－５１ Ｏｅｒｔｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３（２００３），５３９３－４０６ Ｐｅｒｎｅｔ，ＢＢＡ－Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１７ Ｓｃｈｎｅｌｌ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｂ，Ｎａｔｕｒｅ ３４３（１９９０），２６９－２７２ Ｂｒｅｇｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３７８（１９９５），４９８－５０１ Ｔｈａｌｌｍａｉｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １（１９９８），１２４－１３１ Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ４０３（２０００），４３４－４３９ Ｌｉｅｂｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５８（２００５），７０６－７１９ Ｊｏｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｉａ ６６（２０１８），２０７９－２０９３ Ｒｕｓｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １１６（２０１９），１４２７０－１４２７９ Ｌｉｎｄａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ（２０１３） Ｗａｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４４（２０１４），１２５０－５ Ｆｒｅｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．１２（２００６），７９０－２ Ｈａｍａｄｊｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．２２３（２０１２），３２１－４０） Ｍｄｚｏｍｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ（２０１８）９：７２７ Ｓｃｈｍａｎｄｋｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１４） Ｋｕｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｒｅｈａｂｉｌ．Ｎｅｕｒａｌ Ｒｅｐａｉｒ．（２０１８），５７８－５８９ ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０３９３５３２１ Ｈａｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ．２０１０ Ｍａｙ－Ｊｕｎ；２（３）：２５６－２６５ "Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ"，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＤＥＲ）Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＢＥＲ）Ａｕｇｕｓｔ ２０１４ Ｃｌｉｎｉｃａｌ／Ｍｅｄｉｃａｌ Ｋｕｒｉａｋｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１６），Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ １２９８４７３，ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５５／２０１６／１２９８４７３、及びＤａｖｄａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（２０１９）７：１０５，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ４０４２５－０１９－０５８６－０ Ｄｏｅｖｅｎｄａｎｓ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ８（２０１９），２１；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３９０／ａｎｔｉｂ８０１００２１

本発明は、特許請求の範囲において特徴付けられ、本明細書に開示され、以下の実施例及び図に例示される実施形態に関する。すなわち、本発明は、網膜や末梢神経系（ＰＮＳ）組織などの中枢神経系（ＣＮＳ）の傷害又は障害又は変性を伴う多様な障害又は状態の予防的処置又は治療的処置において特に有用な、Ｎｏｇｏ－Ａ特異的ヒト由来モノクローナル抗体及びそのＮｏｇｏ－Ａ結合フラグメント、並びに本明細書中に例示される抗体の同等な合成変異体及び生物工学的誘導体に関する。

実施例に例示されるように、複雑な抗体発見プロセスにおいて、幸いにも、例えば、成長阻害性ＣＮＳミエリンの存在下で神経突起の成長を増進することによって、広範囲の片側運動皮質脳卒中（unilateral motor cortex strokes）後の成体ラットの損なわれた前肢の機能的回復を増進することによって、又は脳卒中のマウスモデルの脳卒中損傷後のペナンブラにおける血管新生を増加させることによって、Ｎｏｇｏ－Ａの生物学的活性を中和することができる高親和性ヒトモノクローナル抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体をクローン化及び同定することができた。この抗体は、「ゴールドスタンダード」と見なされる、以前に確立されたマウス抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体「１１Ｃ７」と少なくとも同程度に有効であり、例えば、脳卒中の研究において、脳卒中後の高度な前肢使用の機能的回復をもたらす。具体的には、本発明の範囲内で行われた実験は、運動皮質の永続的な脳卒中の後の成体マウスのペナンブラ内で本発明の抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体によって血管新生が誘導されることを実証する（例えば、実施例９を参照されたい）。したがって、本発明の抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体は、一般に、血管新生促進効果を特徴とすることができ、また、損傷後３週間まで虚血境界域における血管修復／成長を促進することができることを特徴とすることができる。追加的に又は代替的に、本発明の抗Ｎｏｇｏ抗体は、血管内皮細胞を形成することができ、新たに形成される血管内皮細胞の数を対照と比較して増大させる顕著な効果を有することができることを特徴とすることができる（例えば、実施例９を参照されたい）。

要約すると、本発明に従って行われた実験は、神経突起の伸長及び再生、並びに例えば脳卒中後の機能及び血管の修復に効能がある抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体の同定に成功した。

さらに、本発明に従って行われるさらなる実験において示され得るように、本発明の抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの一般的な緩衝液において非常に可溶性（ＰＢＳにおいて少なくとも２０ｍｇ／ｍｌまで）でありかつ特に安定であって、例えば、凍結融解サイクルの繰り返し（ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．４、７ｍｇ／ｍｌ）は、検出可能なレベルの凝集生成物及び分解生成物をもたらさなかった（例えば、実施例１０及び図９を参照されたい）。

驚くべきことに、本発明の抗体は、（１６０個を超えるアミノ酸にわたって伸びる）Ｎｏｇｏ－ＡΔ２０（ｄ２０）ドメインに結合し、抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体１１Ｃ７と少なくとも同程度に有効であるが、１１Ｃ７並びに他の既知の抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体であるオザンズマブ(ozanezumab)及びＡＴＩ３５５のエピトープとは異なるエピトープを認識し、Ｎｏｇｏ－Ａへの結合について抗体１１Ｃ７と競合しない。特に、実施例３に示されるように、本発明の抗体ＮＧ００４は、伸長されたｄ２０ｐｌｕｓ領域に加えて、阻害領域（ヒトアミノ酸位置５４３～８６６）のいくつかのさらなるアミノ酸Ｃ末端及びＮ末端に結合する。エピトープマッピングにより、天然Ｎｏｇｏ－Ａタンパク質のアミノ酸６８３～６８９に対応するアミノ酸１４１－ＩＮＡＡＬＱＥ－１４７（配列番号２１）を含むヒトＮｏｇｏ－Ａのｄ２０ｐｌｕｓ領域内の配列が、本発明の抗体ＮＧ００４によって認識される最小エピトープとして同定された（実施例４及び図３を参照されたい）。したがって、一実施形態では、抗体は、アミノ酸配列ＩＮＡＡＬＱＥ（配列番号２１）を含むＮｏｇｏ－Ａエピトープに結合する（実施例４を参照されたい）。したがって、本発明は、抗体ＮＧ００４と同じ結合特異性を有する、すなわち、脳卒中のマウスモデルにおいて、成長阻害性ＣＮＳミエリンの存在下で神経突起の成長を増進し、及び／又は脳卒中損傷後のペナンブラの血管新生を増加させる特徴を有する抗体又はその結合フラグメントに関し、当該抗体又はその結合フラグメントは、好ましくは、Ｎｏｇｏ－ＡΔ２０（ｄ２０）ドメイン、特にアミノ酸配列１４１－ＩＮＡＡＬＱＥ－１４７（配列番号２１）に結合する。言及した特徴は、別記の実施例に開示される実験及びアッセイに従って容易に特定することができ、その場合、抗体ＮＧ００４を参照抗体として使用することができる。典型的には、そのような抗体は、同じエピトープ及びペプチドでそれぞれＮｏｇｏ－Ａに結合することについて、対応する参照抗体と競合する。

したがって、一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ＮＧ００４に由来し、図１Ａに示され、かつ、下記の図１の凡例において説明される配列番号２及び配列番号７又は配列番号１２のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域を特徴とすることができる。別の実施形態では、本発明の抗体は、抗体ＮＧ０３４に由来し、図１Ｂに示され、かつ、下記の図１の凡例において説明される配列番号１２及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨ鎖及びＶＬ鎖のＣＤＲ又は超可変領域を特徴とすることができる。

本発明の範囲内で行われたさらなる実験によって、本発明の抗体が、Ｎｏｇｏ－Ａを発現する細胞及び組織を免疫染色することができることが明らかになった。具体的には、免疫蛍光染色によって、（Ｎｏｇｏ－Ａを細胞内及び細胞表面に発現する）ヒトオリゴデンドロサイト細胞株ＭＯ３．１３及びラット神経細胞株Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ－１（ＮＳ－１）、並びに、ラットＣＮＳ組織におけるオリゴデンドロサイト及び運動ニューロンが、ＮＧ００４によって、陽性対照抗体の１１Ｃ７及びオザンズマブと同程度にまで陽性に染色されたことが示されている。本発明に従って行われた実験の過程において、本発明の抗体ＮＧ００４は、これまでゴールドスタンダードとして使用されてきた抗体１１Ｃ７と少なくとも同程度に効率的であり、成長阻害性ＣＮＳミエリンを含有するＮｏｇｏ－Ａの存在下で神経突起伸長を誘導するためのＩＣ５０が、５ｎＭ未満、さらには１２ｎＭ未満であることがさらに示された（実施例８を参照されたい）。

したがって、本発明の範囲内で行われた実験で得られた結果に基づいて、望ましくないＮｏｇｏ－Ａ活性に関連する障害の治療に治療的に有用な新規クラスの抗Ｎｏｇｏ抗体が提供される。

本発明に従って行われ、実施例に記載される実験において初めて得られたヒト由来抗体を参照して、本発明を例示し、説明するが、本発明の抗体又は抗体フラグメントは、対象抗体の１つ以上の機能的特性、特に、Ｎｏｇｏ－Ａに対するその中和活性を保持する、化学的技術又は組換え技術によって合成されるあらゆる操作された抗体又は抗体様Ｎｏｇｏ－Ａ結合分子を意味する抗体の合成誘導体及び生物工学的誘導体を含むものと理解されるべきである。したがって、本発明は、簡潔さのために、抗体を参照して説明する場合があるが、別段に述べない限り、その合成誘導体及び生物工学的誘導体、並びに同等なＮｏｇｏ－Ａ結合分子が、用語「抗体」を意味し、その意味内に含まれる。

本発明のさらなる実施形態は、以下の説明及び実施例から明らかになるであろう。

本発明の抗Ｎｏｇｏ－Ａ特異的ヒト抗体ＮＧ００４（Ａ）及びＮＧ０３４（Ｂ）の可変領域、すなわち重鎖及びカッパ軽鎖（ＶＨ、ＶＬ）のアミノ酸配列。フレームワーク領域（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）が示され、ＣＤＲには下線が引かれている。Ｋａｂａｔナンバリングスキームを用いた（参照：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）。Ｋａｂａｔナンバリングスキームは、前述のウェブ参照において言及され、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／０９２０７７号の２８頁の表１に与えられている。別段に明記されない限り、本発明の抗体又はそのＮｏｇｏ－Ａ結合フラグメント、変異体若しくは誘導体における特定のアミノ酸残基位置のナンバリングへの言及は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによるが、ただしこれは理論上のことであり、本発明の全ての抗体に等しく適用されるわけではない。例えば、第１のＣＤＲの位置に応じて、次のＣＤＲはいずれかの方向にシフトされ得る。したがって、図１におけるＣＤＲの表示及び／又は配列表に関して故意でない誤り又は不一致がある場合、当業者は、本出願の開示内容、すなわち、抗体ＮＧ００４及び抗体ＮＧ０３４の可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖のアミノ酸配列に基づいて、Ｋａｂａｔに従い、正しいＣＤＲ配列を決定するのに十分な立場にあり、Ｋａｂａｔは、特許請求される抗体及びそのＮｏｇｏ－Ａ結合フラグメントを定義するために使用されるものとする。配列番号２及び配列番号７（Ａ）に示される抗体ＮＧ００４並びに配列番号１２及びに配列番号１７（Ｂ）に示される抗体ＮＧ０３４の可変重鎖ＶＨ及び軽鎖ＶＬの配列が示されている。本明細書でさらに説明するように、ＣＤＲ及び／又はフレームワーク領域内では、Ｍｉｒｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．３２（２０１４）８０６－８１９、８１３頁、図６、特に例えば２つのアミノ酸の位置が交換されるようなＡＢモデル又はＬＧモデルに示されるように、元のアミノ酸単独の物理化学特性又は元のアミノ酸と隣接するアミノ酸との物理化学特性のいずれかを考慮に入れた保存的アミノ酸置換が好ましい。 組換え発現されたヒト及びラットのＮｏｇｏ－Ａのｄ２０ｐｌｕｓ領域、並びにラット脳梁オリゴデンドロサイトに対する抗体ＮＧ００４及びＮＧ０３４の結合特異性。（Ａ）ＮＧ００４は、高い親和性／結合活性でヒトＮｏｇｏ－Ａのｄ２０ｐｌｕｓ領域に結合する。ＮＧ００４のＥＣ₅₀値は０．２６ｎＭである。（Ｂ）ＮＧ００４は、ラットＮｏｇｏ－Ａのｄ２０ｐｌｕｓ領域に弱く結合する。（Ｃ）ＮＧ０３４は、高い親和性／結合活性でヒトＮｏｇｏ－Ａのｄ２０ｐｌｕｓ領域に結合する（ＮＧ０３４のＥＣ₅₀値は０．２９８ｎＭである）。（Ｄ）ＮＧ０３４は、ラットＮｏｇｏ－Ａのｄ２０ｐｌｕｓ領域に高い親和性／結合活性で結合する（ＮＧ０３４のＥＣ₅₀値は０．２２９ｎＭである）。（Ｅ）ＮＧ００４及びＮＧ０３４は、固定ラット脳組織切片に対する免疫蛍光染色によって示されるように、ラット脳梁オリゴデンドロサイトを陽性染色し、対照抗体であるオザンズマブの染色パターンと同様の染色パターンをもたらす。二次ロバ抗ヒトＣｙ３標識（Ｄｏ×Ｈｕ Ｃｙ３）抗体単独では染色は観察されない。 ペプスキャン分析によって評価した抗体ＮＧ００４のＮｏｇｏ－Ａ結合エピトープ。ＮＧ００４のペプスキャン画像。ＮＧ００４結合は、Ｎｏｇｏ－Ａのｄ２０ｐｌｕｓ領域のアミノ酸１４１～１４７をカバーするペプチド３４、３５及び３６（白いボックス）で生じた（ペプチド３４：１３３－ＥＥＩＫＥＰＥＮＩＮＡＡＬＱＥ－１４７ 配列番号２２、ペプチド３５：１３７－ＥＰＥＮＩＮＡＡＬＱＥＴＥＡＰ－１５１ 配列番号２３、ペプチド３６：１４１－ＩＮＡＡＬＱＥＴＥＡＰＹＩＳＩ－１５５ 配列番号２４、コンセンサス結合配列：１４１－ＩＮＡＡＬＱＥ－１４７ 配列番号２１）。 抗体オザンズマブ及び１１Ｃ７を用いたＮｏｇｏ－Ａへの競合的結合のための抗体ＮＧ００４及びＮＧ０３４の交差競合アッセイ。ＮＧ００４は、抗体オザンズマブ（Ａ）及び１１Ｃ７（Ｂ）との競合的結合を示さない。ＮＧ０３４は、ヒトのｄ２０ｐｌｕｓ領域（Ｃ）においてＮＧ００４及び１１Ｃ７との競合的結合を示さない。 ＮＧ００４のインビボ標的関与を、ＮＧ００４によるラットの髄腔内処置によって１週間分析し、その後、免疫蛍光染色によってＣＮＳにおけるＮｏｇｏ－Ａ及びＮｏｇｏ－Ｂのタンパク質レベルの分析を行った。（Ａ）ＮＧ００４は、ＣＮＳにおける内因性Ｎｏｇｏ－Ａレベルを下方制御する。（Ｂ）ＮＧ００４は、ＣＮＳにおける内因性Ｎｏｇｏ－Ｂレベルを上方制御する。（Ｃ）ＮＧ００４はＣＮＳにおける内因性ＮｇＲ１レベルを上方制御する。 長期増強（ＬＴＰ）に対するＮＧ００４の効果を、マウス海馬におけるエクスビボアッセイで分析した。（Ａ）陽性対照として使用した抗体１１Ｃ７は、Ｎｏｇｏ－ＡをブロックすることによってＬＴＰの増加をもたらす。ＦＧ１２は不活性対照抗体である。（Ｂ）抗体ＮＧ００４は、１１Ｃ７と同様のエクスビボ活性を発揮し、言い換えれば、ＬＴＰを増加させる。（Ｃ）より高用量のＮＧ００４（２５μｇ／ｍｌ）は、効果量及び作用の発現を増加させる。 成長阻害性ＣＮＳミエリン抽出物及び抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体の存在下又は非存在下でのＮ１Ｅマウス神経芽腫細胞のインビトロ神経突起伸長アッセイ。（Ａ，Ｂ）ＮＧ００４は、抗体１１Ｃ７と非常に類似して、用量依存的にラット脊髄抽出物（ＳＣＥ）の存在下で神経突起伸長を刺激する。（Ｃ，Ｄ）ＮＧ００４及びＮＧ０３４は、抗体ＡＴＩ３５５と非常に類似して、非ヒト霊長類のＣＮＳ抽出物（ＣＮＳＥ）の存在下で神経突起伸長を刺激する。それぞれの不活性対照抗体３．１ ＩｇＧ１は影響を及ぼさない。 成体マウスのインビボ脳卒中モデル；脳卒中の３週間後の局所脳卒中コア（focal stroke core）の周囲の虚血境界域における血管修復の程度。（Ａ）ＮＧ００４は、対照抗体ＦＧ１２／Ｂ５と比較して虚血境界域内の血管領域を増大させる。（Ｂ）ＮＧ００４は、対照抗体ＦＧ１２／Ｂ５と比較して血管分岐部の数を増加させる。（Ｃ）ＮＧ００４は、対照抗体ＦＧ１２／Ｂ５と比較して虚血境界域内の血管長を増加させる。（Ｄ）ＮＧ００４は、ＣＤ３１＋内皮細胞の増殖速度を増加させる。全てのパラメータの効果サイズは、ＮＧ００４及び１１Ｃ７について同様である。 凍結融解サイクルを繰り返した後の異なるｐＨ値でのＮＧ００４のサイズ排除クロマトグラフィー分析は、抗体が非常に安定していることを示す。 虚血性脳卒中及び２週間の抗Ｎｏｇｏ－Ａ処置後の機能回復。ラットに、片側フォトトロボティックストローク（unilateral photothrombotic stroke）を与え、２つの異なる抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体（１１Ｃ７［４ｍｇ／ｍｌ］；ＮＧ００４［４ｍｇ／ｍｌ又は８ｍｇ／ｍｌ］）又は対照抗体（ＢｒｄＵ抗体、４ｍｇ／ｍｌ）のいずれかを用いて、浸透圧ミニポンプで２週間、髄腔内に連続的に（２ｍｌ）処置した。異なる処置群の水平ラダー成功スコア評価（前肢障害：正しい歩数／総歩数）。（Ａ）傷害後の毎週の水平ラダーの成績のタイムライン。（Ｂ）損傷後６３日目の成績。ＮＧ００４ ８ｍｇで処置した動物は、抗ＢｒｄＵ処置の動物と比較して有意な改善を示した。ＮＧ００４ ４ｍｇの動物は、改善の明確な傾向を示した。 ＮＧ００４アイソタイプ（ＩｇＧ１及びＩｇＧ４）、リツキシマブ（Rituximab）（ＩｇＧ１、Ｍａｂｔｅｒａ）及びナタリズマブ（Natalizumab）（ＩｇＧ４、Ｔｙｓｉｂｒａ）を使用して、ＥＬＩＳＡベースのＣＤＣアッセイにおいてＣ１ｑ結合を比較した。ＮＧ００４ ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐは、Ｃ１ｑに対する反応性の低下を示し、他のＩｇＧ４（ナタリズマブ）と同様の挙動を示す。

一般に、本発明は、Ｎｏｇｏ－Ａに結合し、Ｎｏｇｏ－Ａを中和することができるヒト由来モノクローナル抗体、並びにそのフラグメント、誘導体及び変異体に関する。より具体的には、本発明は、特許請求の範囲において特徴付けられ、明細書に開示され、以下の実施例及び図にさらに示される実施形態に関する。それらのヒト起源、すなわちヒト体内でのオリジナル抗体の成熟、及びＮｏｇｏ－Ａに対するそれらの中和能のために、抗体は高い治療価値を有し、好ましくはヒトにおいて実質的に非免疫原性である。

別段の記載がない限り、本明細書で使用される用語には、Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９７，ｒｅｖｉｓｅｄ ２０００ ａｎｄ ｒｅｐｒｉｎｔｅｄ ２００３，ＩＳＢＮ ０ １９ ８５０６７３ ２、第２版，２００６年出版，ＩＳＢＮ ０－１９－８５２９１７－１ ９７８－０－１９８５２９１７－０に提供されている定義が与えられる。

さらに、別段の記載がない限り、本発明を特徴付けるために本明細書で使用される用語及び表現には、国際公開第２０１５／０９２０７７号、特に２８頁のＣＤＲ定義の表１を含む、１６頁～４２頁のサブセクション「Ｉ．定義」に提供される定義が与えられ、その開示内容は参照により本明細書に明示的に組み込まれる。同じことが、抗体、ポリヌクレオチドなどについて国際公開第２０１５／０９２０７７号に開示される全体的な実施形態にも当てはまる。加えて、「背景技術」で引用された科学刊行物及び特許出願が、特許請求される本発明に関する先行技術を表すことを認めることなく、Ｎｏｇｏ－Ａ及び抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体、宿主細胞におけるそれらの組換え産生、精製、修飾、医薬組成物中での製剤化及び治療的使用に関するそれらの開示内容、並びに当技術分野で一般的な用語及び特徴は、特許請求される本発明を実施するときの当業者に依拠し得、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１４ ｂｙ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡを参照されたく、これにはまた、抗体の精製及び貯蔵、縮重オリゴヌクレオチド、５’－ＲＡＣＥ、ファージディスプレイ及び突然変異誘発の使用などの抗体の操作、免疫ブロッティングプロトコル、並びに最新のスクリーニング及び標識技術も記載されている。

「中和」及び「中和抗体」という用語はそれぞれ、抗原又は生きている微生物の少なくとも一部の生物学的活性を低減又は消失させる抗体を意味するという点において、当技術分野における一般的な形で使用される。例えば、本発明の抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体は、例えば、実施例に記載のアッセイにおいて、十分な量でＮｏｇｏ－Ａの活性を消失又は低下させる場合、中和抗体である。中和は、一般に５０％阻害濃度（ＩＣ５０）によって定義され、中和滴定曲線下面積（ＡＵＣ）に基づいて統計学的に評価することができる。本発明の例示的な抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体のＩＣ５０値は、本明細書、例えば、図５～図８において説明され記載されている。具体的には、本発明の抗体の中和能は、抗体が、免疫組織化学で測定した場合に、ＣＮＳにおいてインビボで内因性Ｎｏｇｏ－Ａを下方制御し、マウス海馬のＬＴＰアッセイで測定した場合に、長期シナプス可塑性（長期増強、ＬＴＰ）を増加させ、インビトロ神経突起伸長アッセイで神経突起伸長を刺激し、インビボマウス脳卒中モデルのペナンブラにおいて血管新生を誘導するという点において、例えば、実施例６～９に示されるように分析され、また分析され得る。

したがって、本発明は、一般に、Ｎｏｇｏ－Ａの生物学的活性を中和し、例えば実施例８で実証されるように、増殖阻害性ＣＮＳ抽出物の存在下で、用量依存的に神経突起伸長を誘導し、かつ／又は例えば実施例９で実証されるように、脳卒中のペナンブラの血管新生を誘導することができる、ヒト由来組換えモノクローナル抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体及びその抗原結合フラグメントに関する。

グリア由来の軸索成長阻害タンパク質は、成体ＣＮＳへの損傷後の機能的修復を制限する。とりわけ、Ｎｏｇｏ－Ａ並びに例えばＭＡＧ及びＯＭｇｐは、ニューロン（共）受容体（neuronal (co-)receptors）、例えば、Ｎｏｇｏ受容体－１（ＮｇＲ１）などのＮｏｇｏＡ受容体、スフィンゴ脂質受容体Ｓ１ＰＲ２又はロイシンリッチリピート、及びＬＩＮＧＯ－１としても知られる免疫グロブリン様ドメイン含有タンパク質と相互作用して、軸索成長の阻害をもたらす阻害剤である。例えば、阻害性タンパク質（例えば、Ｎｏｇｏ－Ａ）と相互作用すると、ＮｇＲ１複合体は、成長円錐の崩壊及び神経突起伸長の阻害をもたらすシグナルを伝達する。上記のように、ラットにおけるＮＧ００４の髄腔内投与のインビボ試験により、ＣＮＳ組織におけるＮｏｇｏ－Ａが、対照抗体処置と比較して有意に減少することが実証された。したがって、リガンドＮｏｇｏ－Ａの受容体結合を阻害する既知の機構とは対照的に、本発明の抗体はまた、リガンドを系から低減し、すなわち、ＣＮＳにおけるＮｏｇｏ－Ａレベルを下方制御することによって、強力な生物学的効果を発揮する。

ラットにおけるＮＧ００４の髄腔内投与のインビボ実験は、Ｎｏｇｏ－Ａ受容体ＮｇＲ１が上方制御されたことをさらに実証し（図５Ｃ参照）、ＮＧ００４がインビボでＮｏｇｏ－Ａに結合し、ＣＮＳ Ｎｏｇｏ－Ａレベルの下方制御及び補償機構としてその受容体ＮｇＲ１の上方制御を誘導することを示唆した。したがって、抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体、好ましくは抗体ＮＧ００４又はＮＧ０３４を使用する治療アプローチは、Ｎｏｇｏ－ＡへのＮｏｇｏ－Ａ受容体結合も阻害する分子、例えば、ＮｇＲ１、Ｓ１ＰＲ２又はＬＩＮＧＯ－１と組み合わせた場合にさらに改善され得る。特に、本発明の抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体、すなわちＮＧ００４及びＮＧ０３４は、系からＮｏｇｏ－Ａを除去し、ＮｇＲ１、Ｓ１ＰＲ２又はＬＩＮＧＯ－１のようなＮｏｇｏ－Ａ受容体は刺激されない。この機構は、ＭＡＧ、ＯＭｇｐ及びＮｏｇｏ－Ａなどのミエリン関連成長阻害剤のデコイ又はトラップとして作用し、それらのシグナル伝達を阻害して、ニューロン成長を促進する、最近開発された可溶性ヒト融合タンパク質であるＡＸＥＲ－２０４の機構に類似している（Ｂｒａｄｂｕｒｙ ａｎｄ Ｏｌｉｖｅｉｒａ，Ｂｒａｉｎ １４３（２０２０），１６１８－１６２２を参照されたい）。したがって、本発明の抗Ｎｏｇｏ抗体は、ＡＸＥＲ－２０４で治療することができる疾患の治療に使用し得ると考えることは賢明なことである。

したがって、さらなる態様では、本発明は、本明細書で定義される末梢（ＰＮＳ）及び／又は中枢（ＣＮＳ）神経系の疾患又は外傷の治療に使用するために、抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体、好ましくはＮＧ００４又はＮＧ０３４を、Ｎｏｇｏ－Ａのその受容体複合体への結合を阻害する分子又は受容体後シグナル伝達経路のブロッカーと組み合わせて適用する併用療法に関する。Ｎｏｇｏ－Ａ受容体結合を阻害する分子は当技術分野で既知である。例えば、ＮｇＲ１媒介性神経突起伸長阻害を阻害する単離されたポリペプチドフラグメントは、国際公開第２００７／０８９６０１号に記載されており、あるいは、ＮｇＲ１に結合し、Ｎｏｇｏ－ＡのＮｇＲ１への結合をブロックし、Ｎｏｇｏ－Ａによって誘導される軸索成長阻害の抑制をもたらす嗅索アッシャーサブスタンス（lateral olfactory tract usher substance）（ＬＯＴＵＳ）は、Ｋｕｒｉｈａｒａ ａｎｄ Ｔａｋｅｉ，Ｎｅｕｒａｌ Ｒｅｇｅｎ Ｒｅｓ．１０（２０１５），４６－４８に記載されている。さらに、抗ＬＩＮＧＯ－１抗体Ｌｉ８１(opicinumab)（オピシヌマブ）は、ＬＩＮＧＯ－１機能をブロックし、動物モデルにおいて堅牢な再髄鞘化活性を示す。この抗体は、再発型多発性硬化症を有する個体に対する治療に使える可能性があるとして、現在、第２相臨床試験で研究がなされている（Ｈａｎｆ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ １２（１）（２０２０）、１７１３６４８を参照されたい）。

Ｎｏｇｏ－Ａと同様に、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）及びオリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（ＯＭｇｐ）は軸索阻害の役割を有するので、本発明の抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体による治療は、抗ＭＡＧ抗体及び／又は抗ＯＭｇｐ抗体と組み合わせることができる（例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｌ．Ｓｔｒｏｋｅ Ｒｅｓ．４（２０１３），４７７－４８３、及びＩｒｖｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．２５（２００５），９８－１０７を参照されたい）。

さらに、例えば、実施例８において抗体ＮＧ００４について実証されるように、本発明の抗体は、低い阻害濃度（ＩＣ₅₀）で特に高い中和活性を有する。具体的には、神経突起伸長を刺激するための本発明の抗体のＩＣ₅₀値が１１．１６ｎＭであることが示されており、これは、ゴールドスタンダードとしてこれまで使用されてきた参照抗体１１Ｃ７について測定されたＩＣ₅₀値よりも著しく低い（図７Ａを参照されたい）。したがって、一実施形態では、抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントは、神経突起伸長阻害アッセイにおいて神経突起伸長を誘導するためのＩＣ₅₀値が１５ｎＭ未満、好ましくは１２ｎＭ未満であることを示す。

実施例及び図、例えば、図２においてさらに例示されるように、本発明の抗体は、元々はヒトドナーから単離されており、ヒトＮｏｇｏ－Ａに結合することが示される。したがって、一実施形態では、本発明の抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体及びＮｏｇｏ－Ａ結合フラグメントは、抗体ＮＧ００４に由来し、ラット又はマウスなどの他の種に由来する対応する抗原よりも優先的にヒトＮｏｇｏ－Ａ ｄ２０ｐｌｕｓペプチドを認識する。本発明の抗体の特異性や親和性などの結合特性が、本明細書中に記載され、また、示されるいくつかの実験アッセイにおいて、例えば、実施例３から５及び図２から図４において試験されている。これに関連して、結合親和性の尺度を得るために、実施例３で行われたＥＬＩＳＡにおいて本発明の抗体のＥＣ₅₀を求めた。実証されたところでは、本発明の抗体は、ＥＣ₅₀値によって確認されるように、特に高い見かけの結合親和性を示す。具体的には、ヒトＮｏｇｏ－Ａ ｄ２０ｐｌｕｓペプチドに結合するための抗体ＮＧ００４のＥＣ₅₀は０．２６ｎＭである一方、ラットＮｏｇｏ－Ａは弱く結合しているにすぎない（実施例３を参照されたい）。他の実施形態では、本発明の抗体は、ヒト及びラットのＮｏｇｏ－Ａを高親和性で認識する抗体ＮＧ０３４に由来する。具体的には、ＮＧ０３４のＥＣ₅₀は、ヒトとの結合については０．２９８ｎＭであり、ラットのｄ２０ｐｌｕｓ領域との結合については０．２２９ｎＭである（実施例３を参照されたい）。ＨＥＫ細胞上に発現したヒト及びラットのＮｏｇｏ－ＡへのＮＧ００４の結合は、免疫沈降アッセイとそれに続くウェスタンブロット検出によってさらに確認された。

したがって、本発明の抗体は、好ましくは、神経突起伸長阻害アッセイにおいて神経突起伸長を誘導するためのＩＣ₅₀値が、１５ｎＭ未満、好ましくは１２ｎＭ未満、より好ましくは約１１ｎＭであること、及び／又は、ヒト若しくはラットのｄ２０ｐｌｕｓ領域に結合するためのＥＣ₅₀値が、０．５ｎＭ未満、好ましくは０．４ｎＭ未満、より好ましくは約０．３ｎＭであることを特徴とし得る。しかしながら、抗体フォーマット、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ４又はＦａｂフラグメントのような抗体フラグメントが使用されるかどうかにも依存して、ＩＣ₅₀及びＥＣ₅₀値は、逸脱する場合があり、例えば上記及び実施例で述べた値よりも高い場合又は低い場合がある。したがって、この文脈において、「約」という用語は、実施例において参照抗体について求められた値とは異なり得る値を意味し、その差は好ましくは一桁未満の大きさであり、最も好ましくは同じ桁に収まる大きさであり、例えば、ＩＣ₅₀は参照値±１０ｎＭであり得、ＥＣ₅₀は参照値±０．３ｎＭであり得る。

実施例５及び図４の競合アッセイにおいて実証されるように、主題の抗体は、少なくとも抗体１１Ｃ７との間でＮｏｇｏ－Ａに対する競合的結合を示さず、ＮＧ００４について示されるように、好ましくはオザンズマブとの間でも競合的結合を示さない。したがって、一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、追加的又は代替的に、Ｎｏｇｏ－Ａへの結合について抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体１１Ｃ７と競合せず、好ましくはオザンズマブとも競合しない。抗体間の競合は、試験中の免疫グロブリンが、Ｎｏｇｏ－Ａなどの共通抗原への参照抗体の特異的結合によって阻害されるアッセイによって確かめられる。数多くのタイプの競合的結合アッセイが知られている（上記のＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）、（２０１４）を参照されたい）。好ましくは、競合結合アッセイは、実施例５に記載される条件下で行われる。

神経突起伸長阻害剤Ｎｏｇｏ－Ａは、３つの阻害領域を含む。２つはスプライス変異体Ｎｏｇｏ－Ｂ（２つの膜貫通領域とＮ末端の先端のＮＩＲドメインとの間に位置するＮｏｇｏ－６６）と共有され、１つはスプライス変異体Ｎｏｇｏ－Ｃ（Ｎｏｇｏ－６６）と共有される。Ｎｏｇｏ－Ａの神経突起伸長に対する阻害性が高い特有のドメインは、Ｎｏｇｏ－Ａのエクソン３に位置し、デルタ２０領域（ｄ２０；ヒトアミノ酸位置５６６～７４８）と呼ばれる（Ｏｅｒｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３（２００３），５３９３－５４０６）。実施例３において実証されるように、本発明の抗体は、ｄ２０領域（Ｎｏｇｏ－Ａ－Δ２０ドメイン）に加えて、阻害性領域（ヒトアミノ酸位置５４３～８６６）のＣ末端及びＮ末端におけるいくつかのさらなるアミノ酸、いわゆるｄ２０ｐｌｕｓ領域を含有するフラグメントに結合する。したがって、本発明の一実施形態において、本抗体は、ヒトＮｏｇｏ－Ａのアミノ酸位置５４３～８６６の間の領域内のＮｏｇｏ－Ａに結合し、好ましくは、ヒトＮｏｇｏ－Ａのアミノ酸６８３～６８９に対応するアミノ酸配列１４１－ＩＮＡＡＬＱＥ－１４７（配列番号２１）を含むか又はそれからなるエピトープ及び／又はペプチドに結合する（実施例４を参照されたい）。

本発明は、その可変領域、すなわち、結合ドメインにおいて、図１Ａ及び図１Ｂにそれぞれ示されるアミノ酸配列を有する可変重鎖（Ｖ_H）及び可変軽鎖（Ｖ_L）を含むことを特徴とする抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体及びその抗原結合フラグメントを例示している。対応するヌクレオチド及びアミノ酸配列を以下の表ＩＩに示す。

例のごとく、各鎖の可変ドメインは、相補性決定領域と呼ばれる３つの超可変ループ（ＣＤＲ、ＣＤＲ－１、ＣＤＲ－２及びＣＤＲ－３）を含む。ＣＤＲは、可変ドメインの表面にこれらのループを表示する「コア」βシート構造を形成するフレームワーク領域（ＦＲ－１、ＦＲ－２、ＦＲ－３、及びＦＲ－４）と呼ばれる構造的に保存された領域によって分離されている。ＣＤＲ配列の長さ及び組成は、特にＣＤＲ３において、非常に多様である。ＣＤＲは、抗原と相互作用する抗体のパラトープに近似しており、したがって抗原結合残基を含有する。したがって、抗体をその６つのＣＤＲによって定義することが一般的である。Ｖ_H鎖及びＶ_L鎖の上記アミノ酸配列におけるＣＤＲの例示的なセットを図１Ａ及び図１Ｂに示す。しかしながら、以下で論じられるように、当業者は、追加的又は代替的に、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の場合、図１Ａ及び図１Ｂのいずれか１つに示されるものとは、そのアミノ酸配列が１個、２個、３個又はそれ以上のアミノ酸で異なるＣＤＲが使用され得るという事実を十分に承知している。図１の図の凡例で述べたように、当業者は、例えばｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓに要約されているような一般的な原理に従ってＣＤＲを容易に識別することができる。これに関連して、図１に示される抗体のＣＤＲはＫａｂａｔらによって示されているが、当業者は、ＣＤＲのいくつかの定義、すなわち、以下の定義が一般的に使用されていることを知っている。
（ｉ）最も一般的に使用される配列多様性に基づくＫａｂａｔの定義、
（ｉｉ）構造ループ領域の位置に基づくＣｈｏｔｈｉａ定義、
（ｉｉｉ）上記２つの間の折衷案としての、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアで使用されるＡｂＭの定義、及び
（ｉｖ）最近導入された、利用可能な複雑な結晶構造の分析に基づくＣｏｎｔａｃｔ定義。この定義は、それらが抗原との相互作用に関与する残基であるため、突然変異誘発を行って抗体の親和性を改変するために最も有用である可能性が高い。各抗体に接触するＣＤＲ残基の各ＣＤＲのサマリーデータを伴うリストについては、例えば、ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ（ここではまた、ａｂｙｍｏｄ．ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇで入手可能なａｂＹｍｏｄなどの抗体モデリングソフトウェアについても言及されている）を参照されたい。

以下の表Ｉは、異なる概念によって定義されるＣＤＲ位置間の関係を示す。

上述の定義については、また、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｅｂｅｌ（ｅｄｓ．）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌ．２、ＤＯＩ １０．１００７／９７８－３－６４２－０１１４７－４＿３，＃Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ ２０１０、特に、第３章、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓの３３－５１頁、並びに、特に、抗体の番号付け及び抗原の結合表面／残基の定義の重要性及び意義の理解を扱うＤｏｎｄｅｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（２０１８），２２７８を参照されたく、例えば、前出のＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７），９０１－９１７）、Ｃｏｎｔａｃｔ（Ｍａｃ Ｃａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２（１９９６）、７３２－７４５）、及び、ＩＭＧＴ（ＩＭＧＴ（登録商標）、ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）による古典的ＣＤＲ定義の相違点を説明するＤｏｎｄｅｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、図４及び図６を参照されたい。ＡｂＭの定義は、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用される上記２つの間の折衷案である。

この上の図は、ＣＤＲ－Ｈ１（ＶＨ－ＣＤＲ１）の代替的な定義を示す。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａのナンバリングスキームを水平に示し、ＣＤＲのＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ及びＣｏｎｔａｃｔの定義を２つのナンバリングスキームの上下の矢印で示す。

一実施形態では、本発明は、ヒト由来モノクローナル抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体又はそのＮｏｇｏ－Ａ結合フラグメント、合成誘導体若しくは生物工学的誘導体に関し、ここで、そのフラグメント又は誘導体は、ＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３を含む可変重鎖（ＶＨ）と、Ｋａｂａｔによって定義されるＶＬ ＣＤＲ１、２及び３を含む可変軽鎖（ＶＬ）とを含み、
（ａ）ＶＨ－ＣＤＲ１は配列番号３のアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体は１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｂ）ＶＨ－ＣＤＲ２は配列番号４のアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体は１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｃ）ＶＨ－ＣＤＲ３は配列番号５のアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体は１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｄ）ＶＬ－ＣＤＲ１は配列番号８のアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体は１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｅ）ＶＬ－ＣＤＲ２は配列番号９のアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、かつ
（ｆ）ＶＬ－ＣＤＲ３は配列番号１０のアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、あるいは、
（ｇ）ＶＨ－ＣＤＲ１は配列番号１３のアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｈ）ＶＨ－ＣＤＲ２は配列番号１４のアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｉ）ＶＨ－ＣＤＲ３は配列番号１５のアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｊ）ＶＬ－ＣＤＲ１は配列番号１８のアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｋ）ＶＬ－ＣＤＲ２は配列番号１９のアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、かつ、
（ｌ）ＶＬ－ＣＤＲ３は配列番号２０のアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含む。

追加的に又は代替的に、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、
（ａ）ＶＨ鎖が配列番号２に示されるアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体が１つ以上のアミノ酸置換を含み、かつ、
（ｂ）ＶＬが配列番号７に示されるアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体が１つ以上のアミノ酸置換を含み、あるいは、
（ｃ）ＶＨが配列番号１２に示されるアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体が１つ以上のアミノ酸置換を含み、かつ、
（ｄ）ＶＬが配列番号１７に示されるアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体が１つ以上のアミノ酸置換を含み、
好ましくは、上記ＶＨ鎖及びＶＬ鎖のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２及び配列番号７と少なくとも９０％同一であることを特徴とする。この実施形態では、好ましくは、Ｋａｂａｔの定義によるＣＤＲの１つ以上は実質的に変更されずに維持される。しかしながら、パラトープがそのＣＤＲに対応するという単純化された仮定の下では、それらが可変領域に存在する構造ループと非常によく相関することから、追加的又は代替的に、ＣＤＲのＣｈｏｔｈｉａ定義が使用され得る。したがって、主題の抗体ＮＧ００４及びＮＧ０３４と同等の抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体を提供するためには、Ｋａｂａｔに従って定義されるＣＤＲの場合には、上記１つ以上の、好ましくは２つ以下のアミノ酸置換のうちの少なくとも１つ又は２つは、Ｃｈｏｔｈｉａ及び／又はＩＭＧＴによって定義されるＣＤＲの外側で行われ、最も好ましくはＫａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａに従って定義されるＣＤＲの重複の外側で行われる。

例えば、ＣＤＲ内のアミノ酸置換に関しては、それぞれ可変重鎖及び可変軽鎖並びにフレームワークのアミノ酸配列、好ましくは保存的アミノ酸置換は、例えば、Ｍｉｒｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．３２（２０１４），８０６－８１９において分析され記載される最も頻繁に交換されるアミノ酸に従って実行される（Ｍｉｒｓｋｙ ｅｔ ａｌ．の８１３頁の図６を参照されたい）。具体的には、ＶＨ－ＣＤＲ１内で、ＳはＴで置換されていてもよく、ＶＨ－ＣＤＲ３内で、ＶはＥで置換され、ＴはＳで置換され、かつ／又はＭはＶで置換されていてもよく、ＶＬ－ＣＤＲ１内で、ＲはＫで置換され、ＲはＥで置換され、かつ／又はＴは置換されていてもよく、ＶＬ－ＣＤＲ２内で、ＳはＡで置換され、かつ／又はＡはＧで置換されていてもよく、ＶＬ－ＣＤＲ３において、ＰはＳで置換されていてもよい。既に述べたように、好ましくは、上記のＭｉｒｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（２０１４）の図６に示されるモデルＬＧ及びＡＢのいずれか又は好ましくは両方において同じカテゴリーに属するアミノ酸置換が選択され、ＬＧモデルはアミノ酸の特性を維持する傾向が好ましいものであり、ここで、アミノ酸置換は、好ましくは、元のアミノ酸の物理化学的特性、すなわち疎水性、極性又は荷電特性が実質的に維持されるように選択され、あるいは、例えば２つ以上のアミノ酸置換が行われる場合には、それらが、表面の物理化学的特性を全て一緒にもたらすよう互いに補償するように選択される。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、図１Ａ及び図１Ｂに示されるＶＨ領域及びＶＬ領域と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列の変異体を含む。

当然ながら、理論的考察に加えて、合理的な時間及び過度の負担内でＣＤＲ変異体を同定するための実験的アプローチも存在する。例えば、Ｔｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．８（２０１７），９８６には、天然の多様性突然変異誘発を使用した抗体可変ドメインの簡易な親和性成熟が記載されている。実際、既に数年前に、Ｒａｊｐａｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ１０２（２００５），８４６６－８４７１には、コンビナトリアルライブラリーを使用することによって抗体の親和性を大幅に改善するための一般的な方法が報告されており、ＴＮＦ－αへのより高い親和性結合をもたらす２１個のＣＤＲ位置における３８個の置換を同定する抗ＴＮＦ－α抗体Ｄ２Ｅ７（ＨＵＭＩＲＡ（著作権））を用いたそれらの方法が説明されていた。より最近になって、Ｃａｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．１００６９８０、２０１９年５月１日に、タンパク質－タンパク質ドッキングモデルを微調整し、続いてハイブリドーマ由来抗体ＡＢ１のその抗原マウスＣＣＬ２０に対する親和性を増加させる２つの単一点変異を同定できるようにすることを可能にした、デノボドッキング、モデリング及び合理的設計のインシリコ親和性成熟をアラニンスキャニングと共に用いる、実験的に誘導された計算抗体親和性成熟が記載されている。

したがって、各抗体は独特であり、異なる特徴を有し得るが、それにもかかわらず、リード候補が提供されると、本出願に開示される本発明の教示を考慮し、また、これまでに開発された計算設計及び実験アプローチを考慮する当業者は、抗体の所望の特徴、例えば、実施例において例示され、特許請求の範囲において具体的に定義される抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体について記載される特徴を保持する同等の抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体を得ることができる。これに関連して、変異型抗体は、親抗体の結合特異性を実質的に維持し、例えば、Ｎｏｇｏ－Ａとの結合について親抗体と競合する一方で、既に述べた先行技術の抗体の１つ以上、好ましくはその全てと競合せず、すなわち、少なくとも１１Ｃ７と競合せず、好ましくはオザンズマブとも競合しないことが良く理解され、これは実施例５に記載される競合アッセイに従って評価することができる。具体的には、抗体ＮＧ００４に由来する本発明の抗体は、抗体１１Ｃ７及びオザンズマブと競合しない。しかしながら、好ましくは、本発明の抗体は、その免疫グロブリン鎖の一方又は両方において、図１に示す可変領域の１つ、２つ又は３つ全てのＣＤＲ、あるいは、図１に示す可変領域のＣＤＲと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である１つ、２つ又は３つ全てのＣＤＲを含む。追加的又は代替的に、ＦＲ由来の１つ以上のフレームワーク領域（ＦＲ）は、図１Ａ及び図１Ｂに示す対応するＦＲと８０％同一であり、好ましくは、図１Ａ及び図１Ｂに示すフレームワーク領域と８５％、９０％、９５％、９６、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である。いくつかの実施形態では、１つ、２つ、３つ、又は４つ全てのＦＲ（各々が、図１Ａ及び図１Ｂにそれぞれ示されるＦＲと少なくとも９０％、９０～９５％、及び／又は９５～９９％同一である）が存在する。

当技術分野で知られているように、可変重鎖のＣＤＲ３（ＶＨ－ＣＤＲ３）は、主に抗原特異性を決定するようである（例えば、Ｘｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３（２０００）、３７－４５を参照されたい）。これに関連して、特異性を生じさせるのは重鎖ＣＤＲ３の多様性であるが、ＶＨ－ＣＤＲ１残基及びＶＨ－ＣＤＲ２残基は広く交差反応性であり、体細胞高頻度変異による改善を受けることが知られた（Ｄａｖｉｓ，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（２００４）、２３９－２４３を参照されたい）。したがって、一実施形態では、参照抗体ＮＧ００４の免疫学的特徴を有し、それぞれのエピトープにおいてその結合Ｎｏｇｏ－Ａと競合することができる本発明の抗体は、その可変領域において、少なくとも対応する参照抗体のＶＨ－ＣＤＲ３、あるいは、そのアミノ酸配列が、参照ＶＨ－ＣＤＲ３と少なくとも９０％同一であり、好ましくは９５％同一であり、さらに９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＨ－ＣＤＲ３を含む。例えば、参照抗体の変異型抗体は、参照（親）抗体のＶＨ－ＣＤＲ３を保持し得るが、ＶＨ－ＣＤＲ１及び／又はＶＨ－ＣＤＲ２は、１つ以上のアミノ酸置換を含み得る（上記を参照されたい）。

本発明のさらなる追加的又は代替的な実施形態において、抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体、その抗原結合フラグメント、合成変異体又は生物工学的変異体は、標的に対する適切な結合親和性、並びに薬物動態学的特性及び安定性の特性を有するように最適化され得る。したがって、グリコシル化、酸化、脱アミノ化、ペプチド結合切断、イソ－アスパラギン酸形成及び／又は不対システインからなる群から選択される修飾を受けやすいＣＤＲ又は可変領域中の少なくとも１つのアミノ酸は、そのような改変を欠くか、あるいは、少なくとも１つの糖鎖が欠失しているか又は抗体に対して化学的若しくは酵素的に付加されている、変異アミノ酸によって置換されている（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９７（２００８），２４２６－２４４７；Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０（２０１０），３４５－３５２；Ｈａｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ．６（２０１４），３２７－３３９を参照されたい）。

免疫グロブリン又はそのコードｃＤＮＡはさらに修飾され得る。したがって、さらなる実施形態では、本発明の方法は、キメラ抗体、マウス化抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、二重特異性抗体、融合抗体、標識抗体又はそれらのうちのいずれか１つのアナログを産生する工程のうちのいずれか１つを含む。対応する方法は当業者に既知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８８）の第１版、及び、Ｅｄｗａｒｄ Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄによる第２版、Ｄａｎａ－Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（著作権）２０１４，ＩＳＢＮ ９７８－１－９３６１１３－８１－１に記載されている。例えば、Ｆａｂフラグメント及びＦ（ａｂ’）２フラグメントは、組換えによって、あるいは、（Ｆａｂフラグメントを生成するための）パパイン又は（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成するための）ペプシンなどの酵素を使用して、免疫グロブリン分子をタンパク質分解的に切断することによって生成し得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域及び重鎖のＣＨ１ドメインを含む。そのようなフラグメントは、例えば、免疫グロブリンの免疫特異的部分を放射性同位元素などの検出試薬に結合することを含む免疫診断手順で使用するには十分である。

したがって、一実施形態では、本発明の抗体は、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメント及びＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖抗体及びジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）からなる群から選択されるフォーマットで、かつ／又は、キメラマウス－ヒト抗体若しくはマウス化抗体のフォーマットで提供される場合がある。

しかしながら、本発明による実施例に例示されるように、好ましくは、抗体が定常ドメインを含む完全なＩｇＧ抗体が使用される。定常ドメインは、天然のもの、すなわち可変ドメインと共に元々クローニングされたものであってもよいし、又は異種のもの、例えば動物実験が想定される場合にはマウスの定常ドメインであってもよい。好ましくは、定常ドメインは、ヒトに天然に存在する抗体の定常ドメインと比較して、異なるＩｇＧサブタイプ、例えば、ＩｇＧ４対ＩｇＧ１、又は異なるアロタイプ及びアレルをそれぞれ有するヒト由来のものである。「アロタイプ」の定義では、アロタイプを血清学的に決定するために抗体試薬が利用可能であることが必要である。その決定が配列レベルでのみ行われる場合、多型は「アレル（対立遺伝子）」として記載されなければならない。このことは、アレル－アロタイプの対応が実験的に証明されている場合、又は個々の配列が実証されている配列と同一である場合に、アロタイプとの対応を確立することを妨げるものではない。

本発明の好ましい実施形態では、定常ドメインは、ＣＤＲ並びにＶＨ鎖及びＶＬ鎖の少なくとも１つに対してそれぞれ異種であり、例えば、好ましくはＩｇＧタイプの、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン及び／又は免疫グロブリン軽鎖定常ドメインである。追加的に又は代替的に、抗体の異種部分は哺乳動物の分泌シグナルペプチドであり得る。換言すれば、一実施形態では、本発明の抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体並びにそのＮｏｇｏ－Ａ結合フラグメント、合成誘導体及び生物工学的誘導体は、（ｉ）ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域に対して異種であるポリペプチド配列、あるいは、少なくとも１つのＣＤＲを含む融合タンパク質、及び／又は（ｉｉ）免疫グロブリンに由来するポリペプチドの非天然変異体であって、野生型ポリペプチドと比較して１つ以上のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を含む重鎖定常領域を含む非天然変異体、である。

既に述べたように、５つの免疫グロブリンアイソタイプが存在し、そのうちの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）がヒト血清において最も豊富である。４つのサブクラスであるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４は、高度に保存されており、それらの定常領域、特にヒンジ及び上部ＣＨ２ドメインが異なる。これらの領域は、ＩｇＧ－Ｆｃ受容体（ＦｃｇＲ）及びＣ１ｑの両方への結合に関与している。結果として、異なるサブクラスは、ＦｃｇＲ発現細胞を誘発して食作用又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害をもたらすこと、及び、補体を活性化すること、という両方の点で、異なるエフェクター機能を有する。Ｆｃ領域はまた、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合エピトープも含み、これは、半減期の延長、胎盤輸送、及び粘膜表面を通るＩｇＧの双方向輸送に関与する。しかし、ＦｃＲｎは骨髄細胞でも発現し、古典的なＦｃｇＲ及び補体と共に食作用及び抗原提示の両方に関与する。グリコシル化の形態の抗体のこれらの特性、ＩｇＧ多型及び翻訳後修飾が、ＩｇＧ機能にどのように影響するかは、Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ ａｎｄ ａｌｌｏｔｙｐｅｓ：ｆｒｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：５２０．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１４．００５２０、及び、ｄｅ Ｔａｅｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ２０１９，８，３０；ｄｏｉ：１０．３３９０／ａｎｔｉｂ８０２００３０に記載されている。好ましくは、本発明の抗体中に存在する免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖定常ドメインはＩｇＧタイプのものであり、最も好ましくはＩｇＧ４クラス又はアイソタイプのものである。ヒト免疫グロブリンＧアイソタイプ４（ＩｇＧ４）抗体は、免疫エフェクター機能の低下が望ましい場合の抗体療法の有力候補である。

本発明の抗体の一実施形態では、Ｆｃ部分は、当該分野で既知の技術を使用して免疫エフェクター機能を低下させるように変異させられ得る。例えば、定常領域ドメインの（点変異又は他の手段による）欠失又は不活性化は、脳脊髄液／ＣＮＳ区画に適用された改変抗体の、血液脳関門の経上皮輸送体へのＦｃ受容体結合を減少させ、それにより、そのＮｏｇｏ－Ａタンパク質結合を増加させ得る。他の場合には、本発明に沿った定常領域の修飾が補体結合を抑制し、その結果、コンジュゲート化細胞毒素の血清半減期及び非特異的会合を減少させることがあり得る。定常領域のさらに他の修飾を使用して、抗原特異性又は抗体柔軟性の増加による組織抗原相互作用の増強を可能にするジスルフィド結合又はオリゴ糖部分を修飾することができる。得られた生理学的プロファイル、バイオアベイラビリティ及び改変の他の生化学的効果、例えばＮｏｇｏ－Ａタンパク質の結合及び中和、生体内分布及び血清半減期は、過度の実験を行うことなく、周知の免疫学的技術を使用して容易に測定及び定量化することができる。Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）及び補体タンパク質Ｃ１ｑへの結合を完全に欠いており、それ故に免疫エフェクター機能が失われている組換えヒトＩｇＧ抗体（ｈＩｇＧ）は、様々な治療用途に有用である。（一般にＬＡＬＡ変異と呼ばれる）Ｌｅｕ２３４ＡｌａとＬｅｕ２３５Ａｌａの組合せは、ＦｃγＲＩＩａ結合を排除し、ＩｇＧ１とＩｇＧ４の両方についてＦｃγＲＩ、ＩＩａ、及びＩＩＩａへの検出可能な結合を排除することが示され、また、ＬＡＬＡ－ＰＧ変異は、マウスＩｇＧ及びヒトＩｇＧにおいてＦｃ機能を無効にしたという点で、ＬＡＬＡ変異単独よりも改善されたことが分かった。対応する報告については、例えば、Ｓａｕｎｄｅｒｓ（２０１９）Ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｈａｌｆ－Ｌｉｆｅ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１２９６．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１９．０１２９６、及び、Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２９（２０１６），４５７－４６６を参照されたい。

ＩｇＧ４抗体は、Ｆａｂアーム交換（ＦＡＥ）として知られるプロセスを経ることができる動的分子である。これは、未知の特異性を有する機能的に一価の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）をもたらし、よって潜在的に治療有効性を低下させる。実施例において例示されるように、特定の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＩｇＧ４クラス又は-変異を含むアイソタイプのものである。Ｓ２２８Ｐ変異は、新規定量的イムノアッセイと生理学的マトリックス調製物の組合せを使用して実証されるように、インビボ及びインビトロでＩｇＧ４ Ｆａｂアーム交換を防止する（Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９０（２０１５），５４６２－５４６９を参照されたい）。実施例１２で確認されるように、ＮＧ００４ ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐは、実際にＣ１ｑに対する反応性の低下を示し、ナタリズマブのような他のＩｇＧ４抗体と同様に挙動する。

反復凍結融解サイクルが抗体を変性させ、その結合容量を低下させる凝集体を形成させる可能性があること（凍結融解損傷）は、当分野では既知の問題である（例えば、Ａｂｃａｍ抗体保存ガイドを参照されたい）。このような抗体の劣化は、凝集又は分解が、抗体活性の低下だけでなく、免疫原性反応をももたらし得るので、治療用抗体にとって特に有害である（Ｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３３（２０１０），１４１３－１４１７）。対照的に、本発明の抗体は特に安定である。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって実証されるように、本抗体を反復凍結融解サイクルにさらしても、２０回の凍結融解後に凝集や分解を起こさない（実施例１０及び図９Ｂを参照されたい）。さらに、本発明の抗体をｐＨ６～８の異なるｐＨ値にさらしても、ＳＥＣによって決定される抗体の完全性に影響を及ぼさないことが示され得る（実施例１０及び図９Ａを参照されたい）。理論に束縛されるものではないが、先の観察結果が、定常ドメイン自体がヒト対象への投与に適用可能な濃度での製剤化の安定性及び／又は適合性を担うわけではないか、又は単独で担うわけではないことを示したことから、可変領域、特にＣＤＲ並びにＶＨ及びＶＬが、それぞれ、抗体分子に必要な完全性及び安定性を付与すると考えられる。したがって、本発明の抗体は、好ましくは、少なくとも、上記のいずれかの定義による、好ましくはＫａｂａｔによるＣＤＲと、最も好ましくは、図１Ａ又は図１Ｂにそれぞれ示される、ＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列の実質上全体とを含むにもかかわらず、特に保存的アミノ酸置換を考慮した場合に、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９９％又は１００％の変動を可能にし得る。

本発明はまた、本発明の抗体若しくはその抗原結合フラグメント又はその免疫グロブリンのＶＨ及びＶＬをコードする１つ以上のポリヌクレオチドにも関し、好ましくはポリヌクレオチドはｃＤＮＡである。

本発明の好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、表ＩＩに示される抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体のＶ_H鎖又はＶ_L鎖をコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸を含むか、それから実質的になるか、又はそれからなる。これに関して、当業者は、軽鎖及び／又は重鎖をコードするポリヌクレオチドが１つ以上のポリヌクレオチドによってコードされ得ることを容易に理解するであろう。したがって、一実施形態では、ポリヌクレオチドは、表ＩＩに示される抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体のＶ_H鎖及びＶ_L鎖のポリヌクレオチド配列を有する核酸を含むか、それから実質的になるか、又はそれからなる。

本発明の一実施形態では、ポリヌクレオチドは、異種核酸、例えばプロモーター、転写及び／又は翻訳エンハンサー配列などの発現制御配列、内部リボソーム結合部位、宿主における組換え発現のためのペプチドリーダー配列をコードする核酸などに連結される。したがって、本発明は、ヒト由来の組換え抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体又はそのＮｏｇｏ－Ａ結合フラグメント、合成誘導体若しくは生物工学的誘導体をコードするポリヌクレオチドに関し、該ポリヌクレオチドは
（ｉ）Ｋａｂａｔによって定義されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＨ鎖、並びに／又はＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬ鎖、ここで、
（ａ）ＶＨ－ＣＤＲ１は配列番号３のアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体は１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｂ）ＶＨ－ＣＤＲ２は配列番号４のアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体は１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｃ）ＶＨ－ＣＤＲ３は配列番号５のアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体は１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｄ）ＶＬ－ＣＤＲ１は配列番号８のアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体は１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｅ）ＶＬ－ＣＤＲ２は配列番号９のアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体は、１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、かつ
（ｆ）ＶＬ－ＣＤＲ３は配列番号１０のアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体は１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、かつ／又は
（ｉｉ）ＶＨ鎖及び／又はＶＬ鎖、ここで
（ａ）ＶＨ鎖が配列番号２に示されるアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体が１つ以上のアミノ酸置換を含み、かつ、
（ｂ）ＶＬは配列番号７に示されるアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体は１つ以上のアミノ酸置換を含み、
ここで、好ましくは、ＶＨ鎖アミノ酸配列及びＶＬ鎖アミノ酸配列がそれぞれ配列番号２及び配列番号７と少なくとも９０％同一であり、あるいは
（ｉｉｉ）Ｋａｂａｔによって定義されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＨ鎖、並びに／又はＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬ鎖、ここで、
（ａ）ＶＨ－ＣＤＲ１は配列番号１３のアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体は１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｂ）ＶＨ－ＣＤＲ２は配列番号１４のアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体は１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｃ）ＶＨ－ＣＤＲ３は配列番号１５のアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体は１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｄ）ＶＬ－ＣＤＲ１は配列番号１８のアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体は１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
（ｅ）ＶＬ－ＣＤＲ２は配列番号１９のアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体は１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、かつ
（ｆ）ＶＬ－ＣＤＲ３は配列番号２０のアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体は１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、かつ／又は
（ｉｖ）ＶＨ鎖及び／又はＶＬ鎖、ここで、
（ａ）ＶＨ鎖は配列番号１２に示されるアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体は１つ以上のアミノ酸置換を含み、かつ
（ｂ）ＶＬが配列番号１７に示されるアミノ酸配列又はその変異体を含み、当該変異体が１つ以上のアミノ酸置換を含み、
ここで、好ましくは、ＶＨ鎖アミノ酸配列及びＶＬ鎖アミノ酸配列が、それぞれ配列番号１２及び配列番号１７と少なくとも９０％同一である、
をコードするポリヌクレオチド。

さらに、本発明は、異種核酸に連結されたポリヌクレオチドに関し、該ポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号３、配列番号４及び配列番号５にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドであって、ＶＨが配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と対になったときにＮｏｇｏ－Ａに結合するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号８、配列番号９及び配列番号１０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＬを含む免疫グロブリンの軽鎖又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドであって、ＶＬが配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＶＨと対になったときにＮｏｇｏ－Ａに結合するポリヌクレオチド、
（ｃ）ポリヌクレオチドであって、
（ｉ）配列番号３、配列番号４及び配列番号５にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＨを含む免疫グロブリンの重鎖又はそのフラグメント、及び
（ｉｉ）配列番号８、配列番号９及び配列番号１０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＬを含む免疫グロブリンの軽鎖又はそのフラグメント
をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む免疫グロブリンの重鎖又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドであって、ＶＨが配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬと対になったときにＮｏｇｏ－Ａに結合するポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む免疫グロブリンの軽鎖又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドであって、ＶＬが配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＶＨと対になったときにＮｏｇｏ－Ａに結合するポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む免疫グロブリンの重鎖又はそのフラグメントと、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む免疫グロブリンの軽鎖又はそのフラグメントとをコードするポリヌクレオチド、
（ｇ）（ａ）～（ｆ）のうちのいずれか１つのポリヌクレオチドであって、ＣＤＲが１つ以上、好ましくは２つ以下のアミノ酸置換を含み、かつ／又は可変領域配列が配列番号２又は配列番号７と少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドである。

あるいは、本発明は、異種核酸に連結されたポリヌクレオチドに関し、該ポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドであって、ＶＨが配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と対になったときにＮｏｇｏ－Ａに結合するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＬを含む免疫グロブリンの軽鎖又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドであって、ＶＬが配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むＶＨと対になったときＮｏｇｏ－Ａに結合するポリヌクレオチド、
（ｃ）ポリヌクレオチドであって、
（ｉ）配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＨを含む免疫グロブリンの重鎖又はそのフラグメントと、
（ｉｉ）配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＬを含む免疫グロブリンの軽鎖又はそのフラグメント
をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む免疫グロブリンの重鎖又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドであって、ＶＨが配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬと対になったときにＮｏｇｏ－Ａに結合するポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む免疫グロブリンの軽鎖又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドであって、ＶＬが配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むＶＨと対になったときにＮｏｇｏ－Ａに結合するポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む免疫グロブリンの重鎖又はそのフラグメントと、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む免疫グロブリンの軽鎖又はそのフラグメントとをコードするポリヌクレオチド、
（ｇ）（ａ）～（ｆ）のうちのいずれか１つのポリヌクレオチドであって、ＣＤＲが１つ以上、好ましくは２つ以下のアミノ酸置換を含み、かつ／又は可変領域配列が配列番号１２又は配列番号１７と少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチドである。

さらに、本発明は、それらのポリヌクレオチドの１つ以上を含む、１つのベクター若しくは複数のベクターに関し、好ましくは、ベクターは発現ベクターであり、１つ以上のポリヌクレオチドは発現制御配列に作動可能に連結されている。

このポリヌクレオチドは、異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製するために、例えば、アミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を付与するために、当技術分野で周知のヌクレオチド配列を操作する方法、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第４版）：Ｔｈｒｅｅ－ｖｏｌｕｍｅ ｓｅｔ；Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ（２０１２）ＩＳＢＮ １０：１９３６１１３４２２／ＩＳＢＮ １３：９７８１９３６１１３４２２ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；最新版（２０１４）ＩＳＢＮ ９７８－１－９３６１１３－４２－２、及び、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９８）とその最新版に記載される技術を参照されたい、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を使用して作製することができ、必要に応じて操作することができる。

本発明の抗体分子又は抗体の重鎖若しくは軽鎖、又はその一部（好ましくは重鎖若しくは軽鎖可変ドメインを含む）をコードするポリヌクレオチドが得られた後に、当技術分野で周知の技術を使用する組換えＤＮＡ技術によって、当該抗体分子を産生するためのベクターを産生することができる。このように、ヌクレオチド配列をコードする抗体を含有するポリヌクレオチドを発現させることによってタンパク質を調製するための方法が本明細書に記載される。当業者に周知の方法を使用して、抗体コード配列並びに適切な転写シグナル及び翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボ遺伝子組換えが含まれる。したがって、本発明は、プロモーターに連結して作動可能な、本発明の抗体分子又はその重鎖若しくは軽鎖、あるいは重鎖若しくは軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列（例えば、国際公開第８６／０５８０７号及び国際公開第８９／０１０３６号、並びに米国特許第５，１２２，４６４号を参照されたい）を含み得、抗体の可変ドメインは、重鎖又は軽鎖全体の発現のために、このようなベクターにクローニングされ得る。

「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は、本明細書では、宿主細胞に所望の遺伝子を導入し発現させるためのビヒクルとして本発明に従って使用されるベクターを意味するために使用される。当業者に知られているように、そのようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス及びレトロウイルスからなる群から容易に選択され得る。一般に、本発明に適合するベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローニングを容易にするための適切な制限部位、並びに真核細胞又は原核細胞に入り、かつ／又は複製する能力を含む。マーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）、又は銅などの重金属に対する耐性を提供し得る。選択マーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接連結され得るか、又は共形質転換によって同じ細胞に導入され得る。ｍＲＮＡの最適な合成のために、さらなる要素が必要とされる場合がある。これらの要素は、シグナル配列、スプライスシグナル、並びに転写プロモーター、エンハンサー及び終結シグナルを含み得る。二重鎖抗体の発現のために、以下に詳述するように、重鎖及び軽鎖の両方をコードする単一のベクター又は複数のベクターを、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞において共発現させることができる。

宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター、即ち重鎖由来ポリペプチドをコードする第１のベクターと軽鎖由来ポリペプチドをコードする第２のベクターで共導入され得る。２つのベクターは、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択マーカーを含み得る。あるいは、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一のベクターを使用してもよい。そのような状況では、軽鎖は、毒性のない重鎖が過剰にならないように、有利には重鎖の前に配置される（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２（１９８６），５２；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７（１９８０），２１９７を参照されたい）。重鎖及び軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含み得る。発現ベクターを従来の技術によって宿主細胞にトランスフェクトし、次いでトランスフェクトされた細胞を従来の技術によって培養して、本明細書に記載の方法で使用するための抗体を産生する。したがって、本発明はまた、１つ以上の本発明のポリヌクレオチド又は１つ若しくは複数の本発明のベクターを含む宿主細胞に関する。

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技術を使用して構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターを宿す細胞を指す。組換え宿主から抗体を単離するためのプロセスの説明において、用語「細胞」及び「細胞培養」は、明確に別段に指定されない限り、抗体の供給源を示すために互換的に使用される。換言すれば、「細胞」からのポリペプチドの回収は、スピンダウンされた全細胞からの回収、又は培地及び懸濁細胞の両方を含有する細胞培養物から回収のいずれかを意味し得る。

現在、ほとんど全ての治療用抗体は、変化した非ヒトグリコシル化パターンに起因する免疫原性のリスクを低減するために、依然として哺乳動物細胞株において産生されている。しかしながら、最近のグリコシル化操作された酵母、昆虫細胞株及びトランスジェニック植物の開発によって、「ヒト様」翻訳後修飾を有する抗体を得ることが期待されている。さらに、グリコシル化されていない二重特異性抗体を含むより小さな抗体フラグメントは、細菌内で産生することに成功しており、臨床試験に進んでいる。今後数年のうちに、非哺乳動物供給源に由来する最初の治療用抗体産物を期待することができる。本発明のヒト由来の組換え抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体又はそのＮｏｇｏ－Ａ結合フラグメント、合成誘導体又は生物工学的誘導体を調製するために適用することができる現在の抗体産生系についての説明については、種々の用途に対するそれらの有用性を含めて、Ｆｒｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３；４：２１７，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ｏｎ Ｊｕｌｙ ２９，２０１３ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１３．００２１７に記載されており、哺乳動物細胞におけるヒト抗体の一過性発現については、Ｖａｚｑｕｅｚ－Ｌｏｍｂａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １３（２０１８），９９－１１７；ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９５（２０１９），ｅ７７．ｄｏｉ：１０．１００２／ｃｐｐｓ．７７に記載されている。

本発明の抗体分子が組換え発現されると、本発明の抗体全体である、それらの二量体、個々の軽鎖及び重鎖、又は他の免疫グロブリン形態は、当技術分野の標準的な手順に従って、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、特にプロテインＡにちなんだ特定の抗原に対する親和性によるアフィニティークロマトグラフィー、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、例えば硫酸アンモニウム沈殿によって、あるいは、タンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術によって、精製することができる（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）、及び、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１４ ｂｙ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡを参照されたい）。このように、本発明はまた、抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体及び／又はそのフラグメント若しくはその免疫グロブリン鎖を調製するための方法であって、
（ａ）抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体、Ｎｏｇｏ－Ａ結合フラグメント又はその免疫グロブリン鎖の発現を可能にする条件下で、本明細書で先に定義したポリヌクレオチド又はベクターを含む、本明細書で先に定義した宿主細胞を培養すること、及び
（ｂ）培養物から抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体、Ｎｏｇｏ－Ａ結合フラグメント又はその免疫グロブリン鎖を単離すること、を含む、方法に関する。

さらに、本発明はまた、本明細書で先に定義したポリヌクレオチドによってコードされる、かつ／又は上記の組換え生産方法によって得られる、抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体、Ｎｏｇｏ－Ａ結合フラグメント及びその免疫グロブリン鎖に関する。

特定の実施形態では、抗体ポリペプチドは、抗体と通常関連しないアミノ酸配列又は１つ以上の部分を含む。例示的な変形例を以下により詳細に説明する。例えば、本発明の一本鎖Ｆｖ抗体フラグメントなどの抗体又はそのＮｏｇｏ－Ａ結合フラグメントは、自由なリンカー配列を含み得、又は修飾して機能的部分若しくは検出可能な標識（例えば、ＰＥＧ、薬物、毒素、又は標識、例えば、蛍光、化学発光、放射性、酵素、核磁気、重金属、タグ、フラグなど）を付加することができる（例えば、一般的な技術については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１４ ｂｙ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡを、また、動的細胞イメージングのための蛍光標識戦略の進歩については、Ｄｅａｎ ａｎｄ Ｐａｌｍｅｒ，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１０（２０１４），５１２－５２３を、そして、抗体－薬物コンジュゲート及び抗体模倣物のための酵素ベースの標識戦略については、Ｆａｌｃｋ ａｎｄ Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ７（２０１８），４；ｄｏｉ：１０．３３９０／ａｎｔｉｂ７０１０００４を参照されたい）。

本発明の抗体ポリペプチドは、融合タンパク質を含み得るか、融合タンパク質から実質的になり得るか、融合タンパク質からなり得る。融合タンパク質は、例えば、少なくとも１つの標的結合部位を有する免疫グロブリンＮｏｇｏ－Ａ結合ドメインと、少なくとも１つの異種部分、すなわち天然では生来連結していない部分とを含むキメラ分子である。アミノ酸配列は、通常、融合ポリペプチド中で一緒にされた別個のタンパク質中に存在し得、又はそれらは通常、同じタンパク質中に存在するが、融合ポリペプチド中の新しい配置に配置され得る。融合タンパク質は、例えば、化学合成によって、又はペプチド領域が所望の関係でコードされているポリヌクレオチドを作製し翻訳することによって作製することができる。

「異種」という用語は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドに適用される場合、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、それが比較されている残りの実体とは異なる実体に由来することを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、抗体又はその抗原結合フラグメント、変異体若しくは類似体に融合される「異種ポリペプチド」は、同じ種の非免疫グロブリンポリペプチド又は異なる種の免疫グロブリン若しくは非免疫グロブリンポリペプチドに由来する。

ヒト由来の組換え抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体又はそのＮｏｇｏ－Ａ結合フラグメント、合成誘導体若しくは生物工学的誘導体は、本明細書で先に記載したように、任意選択で、融合タンパク質として、かつ／又は、標識されたものとして、そして、当該分野で知られている標準的な技術に従って、様々な適用のために提供される（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１４ ｂｙ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡを参照されたい）。治療用抗体の設計、製造及び製剤における現在の進歩は、Ｓｉｆｎｉｏｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ２０１９，８（２），３６；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３９０／ａｎｔｉｂ８０２００３６に記載されており、ここでは、調節された機能を有する抗体の戦略的設計のための計算手法の開発も議論されている。

本発明は、本発明の前述のＮｏｇｏ－Ａ結合分子、例えば、抗体又はそのＮｏｇｏ－Ａ結合フラグメント、変異体若しくは生物工学的誘導体、あるいは本明細書で先に定義した本発明のポリヌクレオチド、ベクター又は細胞を含む組成物に関する。一実施形態では、本発明の組成物は医薬組成物であり、医薬的に許容される担体をさらに含む。

ポリヌクレオチド及び当該ポリヌクレオチドを含む本発明の組成物は、治療的なアプローチに使用することができる。例えば、ＤＮＡ又はｍＲＮＡ形態で抗体をコードするヌクレオチド配列の治療薬への使用については、Ｈｏｅｃｋｅ ａｎｄ Ｒｏｏｓｅ，Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１７（２０１９），５４に要約されている。それらのヌクレオチド配列は、それぞれの抗体を生体内原位置で産生することができる治療される対象に直接投与され得る。さらに、Ｓｃｈｌａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ７６（２０１９），３０１－３２８には、治療アプローチ及び受動免疫療法に使用するための、インビボでのＤＮＡベースの抗体発現、並びに、対応するプラスミド及びウイルスベクター、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及びインビトロ転写（ＩＶＴ）によって調製されたｍＲＮＡ構築物が記載されている。一般に、ＲＮＡワクチン接種は、がん免疫療法、神経変性疾患、感染症、組織再生及びタンパク質補充療法からの応用が広がる分野である。

したがって、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡを含み、治療薬として細胞内での翻訳のために使用され得る。したがって、本発明のポリヌクレオチド、具体的には、ＲＮＡは、標的細胞において本発明の抗体を産生するために使用することができる。適切なＲＮＡを産生するための様々なアプローチが当業者に既知であり、それらは市販されている（例えば、インビトロ転写、ＲＮＡのキャッピング、及び細胞内での翻訳のためのポリ（Ａ）尾部ｍＲＮＡの作製のためのキット）。国際公開第２００８／０８３９４９Ａ２号には、対応する抗体の発現のための抗体コード非修飾及び修飾ＲＮＡ、並びに転写方法及び抗体を発現させるための方法が記載されている。国際公開第２００９／１２７２３０号には、自然免疫刺激応答を抑制及び／又は回避するのに適した修飾（ｍ）ＲＮＡが記載されている。さらに、ＲＮＡが、対応するＵ又はＣカノニカルヌクレオシドの代わりにプソイドウリジン（Ψ）及び／又は５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を含む、ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ（商標）によって使用される技術が開発されている。そのようなＲＮＡは、免疫原性が低いことが分かっており、修飾ヌクレオシドを含有しない対応するｍＲＮＡよりもはるかに高いレベルでタンパク質に翻訳される。対応する技術は、例えば、Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３（２００５），１６５－１７５，Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １６（２００８），１８３３－１８４０、及びＡｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３８（２０１０），５８８４－５８９２に記載されている。さらに、欧州特許出願公開第１ ６０４ ６８８号には、Ｇ／Ｃ含有量が増大しコドン使用頻度が最適化された安定化及び翻訳最適化ｍＲＮＡが記載されている。ＲＮＡの修飾のためのさらなるアプローチは、例えば、Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９（２０１１），１５４－１５７及び国際公開第２００７／０２４７０８号に記載されている。

したがって、一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、未修飾の又は上記のように修飾され、対応する抗体への翻訳に適したｍＲＮＡ又はその派生物であり得るＲＮＡである。

上述したように、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターに関する。一実施形態では、ベクターは遺伝子導入ベクター、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶベクターを使用して神経変性疾患を治療するための治療アプローチは、例えば、いずれもＡＡＶベクター化抗タウ抗体に関連する国際公開第２０１５／０３５１９０号及びＬｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ３６（２０１６），１２４２５－１２４３５に記載されている。そのような構築物は、抗体をコードする遺伝子を脳に直接送達する、ひいては、血液脳関門を迂回するために使用することができる。さらに、国際公開第２０１７／１８９９６３号には、一般に、抗体及び抗体ベースの組成物をコードするように操作されたウイルスゲノムを有する新規ＡＡＶ粒子、並びに疾患、障害及び／又は状態の治療、予防、診断及び研究のためにこれらの構築物（例えば、ＶＡＤ）を使用する方法が記載されている。中枢神経系の神経変性疾患におけるＡＡＶの進展及び臨床応用は、Ｑｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒａｌ Ｒｅｇｅｎ Ｒｅｓ １４（２０１９），９３１－９３８に概説されている。

ＡＡＶベクターは、いくつかの有利な特徴のために遺伝子治療アプローチにおいて広く使用されている。ＡＡＶは、感染細胞において非複製であり、したがって、いかなる既知の疾患とも関連しない。さらに、ＡＡＶは、多種多様な宿主細胞に導入することができ、宿主細胞のゲノムに組み込まれず、静止細胞及び分裂細胞の両方に感染することができる。ＡＡＶは、インビボで非複製細胞及び長寿命細胞を形質転換し、目的のタンパク質の長期発現をもたらす。さらに、ＡＡＶを細胞生物学及び分子生物学技術を用いて操作することで、ＡＡＶウイルスゲノムにコードされたペイロードを有する非毒性粒子を生成し、副作用が少ないか全くない状態で標的の組織又は細胞セットに送達することができる。上記を考慮すると、ベクター化された抗体を送達するためにＡＡＶを使用すると、治療期間を通して、より長期間の有効性、より少ない用量の治療、及びより一貫した抗体レベルが可能になる。

ＡＡＶはパルボウイルス科のメンバーであり、約５，０００ヌクレオチド未満の直鎖状一本鎖ＤＮＡゲノムを含む。ＡＡＶは、効率的な複製のために、ヘルパーウイルス（すなわち、アデノウイルス又はヘルペスウイルス）との同時感染、又はヘルパー遺伝子の発現を必要とする。治療用核酸の投与に使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、親ゲノムの約９６％が欠失しており、その結果、ＤＮＡの複製及びパッケージングのための認識シグナルを含有する末端反復配列（ＩＴＲ）のみが残っている。これにより、ウイルス遺伝子の発現による免疫学的又は毒性の副作用が排除される。さらに、特定のＡＡＶタンパク質を産生細胞に送達することにより、必要に応じて、ＡＡＶ ＩＴＲを含むＡＡＶベクターを細胞ゲノムの特定の領域に組み込むことが可能になる（例えば、米国特許第６，３４２，３９０号及び同第６，８２１，５１１号を参照されたい）。組み込まれたＡＡＶゲノムを含む宿主細胞は、細胞の増殖又は形態において変化を示さない（例えば、米国特許第４，７９７，３６８号を参照されたい。）。ＡＡＶベクターは、当技術分野で既知の任意のＡＡＶ血清型を使用して作製することができる。いくつかのＡＡＶ血清型及び１００を超えるＡＡＶ変異体が、アデノウイルスストック又はヒト若しくは非ヒト霊長類組織から単離されている（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １４（３），（２００６），３１６に概説されている）。

本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸配列に加えて、ＡＡＶベクターは、宿主細胞における核酸配列の発現を提供する発現制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写ターミネーター、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）などを含み得る。例示的な発現制御配列は当技術分野で公知であり、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．（１９９０）に記載されている。

したがって、本発明は、本発明の抗体をコードする単離された核酸配列を含む遺伝子導入ベクターに関する。遺伝子導入ベクターは、上記のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり得る。

本発明はまた、上記成分、例えば、本発明の抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体、Ｎｏｇｏ－Ａ結合フラグメント、生物工学的誘導体又はその変異体、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞のうちの１つ以上が入った１つ以上の容器を含むパック又はキットの形態の医薬組成物及び診断組成物をそれぞれ提供する。そのような容器は、医薬品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された書式の通知を伴う場合があり、その通知は、ヒト投与のための製造、使用又は販売の機関による承認を示す。追加的又は代替的に、キットは、適切な免疫ベースの診断アッセイにおいて使用するための試薬及び／又は説明書を含む。本発明の組成物、例えば、キットは、当然のことながら、Ｎｏｇｏ－Ａの存在を伴う疾患又は障害のリスク評価、診断、予防及び治療に特に適しており、特に、本明細書で先に論じた一般にＮｏｇｏ－Ａを伴う障害の治療に適用可能である。

本発明の医薬組成物は、当技術分野で周知の方法に従って製剤化することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００）ｂｙ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＩＳＢＮ０－６８３－３０６４７２を参照されたい）。好適な医薬担体の例は当技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。そのような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤化することができる。ＲＮＡベースの組成物に関しては、国際公開第２０２０／０８９３４２号、国際公開第２０１９／２０７０６０号、及び国際公開第２０１８／２３２３５５号に、対象へのＲＮＡの効率的な投与のための脂質ベースの製剤及びポリマーベースの製剤がそれぞれ記載されている。さらに、中性リポポリプレックス（ＬＰＰ）へのＲＮＡのカプセル化は、Ｐｅｒｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ １７（２０１９）に記載されている。Ｒｏｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ７（２０１７），１０８６３にはまた、ＲＮＡ－リポプレックスの静脈内投与のためのアプローチも記載されている。これらの医薬組成物は、適切な用量で対象に投与することができる。適切な組成物の投与は、種々の方法によって、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、硝子体内、局所若しくは皮内投与又は脊髄若しくは脳送達によって行うことができる。鼻腔スプレー製剤などのエアロゾル製剤には、保存剤及び等張剤とともに活性剤の精製水溶液又は他の溶液が含まれる。そのような製剤は、好ましくは、鼻粘膜に適合するｐＨ及び等張状態に調整される。

投与計画は、主治医及び臨床的要因によって決定される。医学分野で周知のように、任意の１人の患者の投与量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間及び投与経路、全身の健康状態、並びに同時に投与される他の薬物などの多くの要因に依存する。

Ｎｏｇｏ－Ａは、その成長制限特性により、神経系の損傷及び疾患に悪影響を及ぼす可能性がある。それ故に、Ｎｏｇｏ－Ａは、その様々な神経生物学的役割と相関して、様々なＣＮＳ損傷及び疾患に関与していた。原理上、Ｎｏｇｏ－Ａ関連疾患は、神経及び／又は血管修復に関連する神経系の疾患又は外傷として理解されている。Ｎｏｇｏ－Ａ阻害は、末梢（ＰＮＳ）及び中枢（ＣＮＳ）神経系の様々な疾患、すなわち、より具体的には、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、レビー様病変又は他の認知症全般、外傷性脳損傷、脊髄損傷、頭蓋、脳若しくは脊髄の外傷後の疾患、脳卒中、又は脱髄疾患などの神経変性疾患において有益な効果を有すると考えられている。そのような脱髄疾患としては、多発性硬化症、単相性脱髄、脳脊髄炎、多巣性白質脳症、全脳炎、マルキアファーヴァ・ビニャミ病、橋髄鞘崩壊症（pontine myelinolysis）、副腎白質ジストロフィー、ペリツェウス・メルツバッハ病、海綿状変性、アレキサンダー病、カナバン病、異染性白質ジストロフィー及びクラッベ病が挙げられるが、これらに限定されない。

さらに、変性眼障害は、一般的な虚血性網膜症、前部虚血性視神経症、あらゆる形態の視神経炎、滲出型及び萎縮型加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、網膜色素変性症、シュタルガルト病、ベスト硝子体網膜変性症、レーバー先天性黒内障及び他の遺伝性網膜変性、病的近視、未熟児網膜症、及びレーバー遺伝性視神経症、角膜移植又は屈折角膜手術による後遺症、並びに角膜ヘルペス角膜炎などの網膜細胞又は角膜細胞の変性を直接的又は間接的に伴い得る。さらに、Ｎｏｇｏ－Ａは、精神状態、特に統合失調症及びうつ病において役割を果たすことができることが分かった。

インビボ実験により、本発明の抗体による治療が、不規則な水平ラダー渡りによって示されるように、マウス脳卒中モデルにおいて、細かい運動制御を必要とする歩行運動タスクにつき、より良好な回復をもたらすことが確認された（実施例１１及び図１０を参照されたい）。

したがって、本発明はまた、上に列挙したものを含むＮｏｇｏ－Ａに関連する疾患又は障害、好ましくはＰＮＳ又はＣＮＳの疾患を治療する方法であって、本発明の前述のＮｏｇｏ－Ａ結合分子、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞のうちのいずれか１つの治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。原理上、本発明の抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体は、上記の「背景技術」の節で本明細書に引用される従来の抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体に関する参考文献に開示されているのと同じ疾患及び障害の治療に適している。

さらなる実施形態では、Ｎｏｇｏ－Ａに関連するＰＮＳ又はＣＮＳの疾患、障害、又は症状を治療するのに有用な他の薬剤の同時投与又は逐次投与が望ましい場合がある。例えば、本発明の抗体又はそのＮｏｇｏ－Ａ結合フラグメント、変異体若しくは生物工学的誘導体は、例えば、限定するものではないが脳卒中又は脊髄損傷後にニューロン損傷及び軸索再生のさらなる阻害をブロックする手段としてコルチコステロイドのような抗炎症剤；神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）などの神経栄養因子；又は、Ｅｘｅｌｏｎ（商標）（リバスチグミン）若しくはレボドパ（Ｌ－ＤＯＰＡ（３，４－ジヒドロキシ－Ｌ－フェニルアラニン））などの神経変性疾患のための他の薬物と組み合わせて投与することができる。脳卒中の治療のための他の適切な組合せパートナーは、アルテプラーゼ及びデスモテプラーゼ（例えば、国際公開第９０／０９４３８号に開示されているＤＳＰＡ）である。一実施形態では、本発明は、特に脳卒中の治療のための、本発明の抗体又はＮｏｇｏ－Ａ結合フラグメントとデスモテプラーゼとを含む組合せ、並びに当該組合せを含む医薬組成物を提供する。本明細書で使用する場合、２つの薬剤が、同時に投与されるか又はそれらの薬剤が同時に作用するような様式で独立して投与される場合に、当該２つの薬剤が組み合わせて投与される、と言う。

コード番号、一般名又は商品名によって識別される有効成分の構造は、標準公定書の実際の版「メルクインデックス」、又はデータベース、例えば、ＩＭＳヘルスが提供する国際特許（例えば、ＩＭＳ世界出版物）又はその他のデータベースから取得することができる。

別の例では、本発明の抗体又はそのＮｏｇｏ－Ａ結合フラグメント、変異体若しくは誘導体を発現する細胞を脊髄損傷部位に移植して、損傷部位全体の軸索成長を促進することができる。そのような移植細胞は、損傷又は外傷後に脊髄機能を回復するための手段を提供する。そのような細胞には、嗅神経鞘細胞、及び胎児神経移植片又は組織移植片の異なる系統の幹細胞が含まれ得る。

本明細書の本文を通して、いくつかの文献が引用される。引用された全ての参考文献（背景技術の節を含む本出願を通して引用される文献参照、発行された特許、公開された特許出願、及び製造業者の仕様書、説明書などを含む）の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれるが、引用された文献が実際に本発明に関する先行技術であることを認めるものではない。

例示のみを目的として本明細書に提供され、本発明の範囲を限定することを意図しない以下の具体例を参照することによってより完全な理解を得ることができる。

実施例１：抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体の単離及び同定
もともと国際公開第２００８／０８１００８号に記載されていたＮｅｕｒｉｍｍｕｎｅ ＡＧによる特許技術プラットフォームであるＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（商標）（ＲＴＭ（商標））技術を利用して、これを改変、改良、標的Ｎｏｇｏ－Ａに特別に適合させて、Ｎｏｇｏ－Ａを標的とするヒト由来抗体を同定した。

実施例２：抗体配列及び組換え発現の決定
上記で同定した抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体の可変領域のアミノ酸配列を、ヒトメモリーＢ細胞から得られたそれらのｍＲＮＡ及びｃＤＮＡ配列に基づいてそれぞれ決定した（図１Ａ、図１Ｂを参照されたい）。ヒト定常ドメイン又はマウス定常ドメインを有する完全ヒトＩｇＧ１抗体の組換え発現を、実質的に、国際公開第２００８／０８１００８号の実施例に記載されるように、例えば、９９頁及び１００頁の方法のセクションに記載されるように行った。

フレームワーク領域及び相補性決定領域を、Ａｂｙｓｉｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｙｓｉｓ／）などデータベースにおいて利用可能な参照抗体配列との比較によって決定し、Ｋａｂａｔナンバリングスキーム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／）を使用して注釈を付けた。

実施例３：結合特性
神経突起伸長阻害剤Ｎｏｇｏ－Ａは、３つの阻害領域を含む。２つはスプライス変異体Ｎｏｇｏ－Ｂ（２つの膜貫通領域とＮ末端の先端のＮＩＲドメインとの間に位置するＮｏｇｏ－６６）と共有され、１つはスプライス変異体Ｎｏｇｏ－Ｃ（Ｎｏｇｏ－６６）と共有される。Ｎｏｇｏ－Ａの神経突起伸長に対する阻害性が高い特有のドメインは、Ｎｏｇｏ－Ａのエクソン３に位置し、デルタ２０領域（ｄ２０；ヒトアミノ酸位置５６６～７４８）と呼ばれる（Ｏｅｒｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３（２００３），５３９３－５４０６）。抗体ＮＧ００４、ＮＧ０３４の結合特性を確認し、ラット等の他の種に対する交差反応性をモニターするために、ｄ２０領域と、阻害領域のＣ末端及びＮ末端のいくつかのさらなるアミノ酸（ヒトアミノ酸位置５４３～８６６）とを含むフラグメントを用いたＥＬＩＳＡを行った。このフラグメントはラット又はヒトｄ２０ｐｌｕｓと呼ばれ、大腸菌で組換え産生されている。抗体がｄ２０ｐｌｕｓ領域に強く結合することを調べるため、また主題の抗体ＮＧ００４及び抗体ＮＧ０３４の結合特性を既に知られている抗体（１１Ｃ７及びオザンズマブ）と比較するために、ＥＬＩＳＡを使用し、ＥＣ₅₀値を比較した。

ＥＬＩＳＡは、標準的なプロトコル（Ｅｎｇｖａｌｌ＆Ｐｅｒｌｍａｎｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９（１９７２），１２９－１３５，Ｅｎｇｖａｌｌ＆Ｐｅｒｌｍａｎｎ，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８（１９７１），８７１－８７４）に従って行う。簡単に説明すると、ＥＬＩＳＡプレートを３μｇ／ｍｌのラット配列由来ｄ２０ｐｌｕｓ又はヒト配列由来ｄ２０ｐｌｕｓのいずれかでコーティングし、５％ミルクパウダー（ラピライト、Ｍｉｇｒｏｓ）でブロックし、ＮＧ００４でプローブする。各プレートには、内部標準として１１Ｃ７及び／又はオザンズマブの段階希釈液が入っている。最後に、プレートを対応する二次抗体と（１１Ｃ７を抗マウスＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１６０７８と）、ＮＧ００４及びオザンズマブを抗ヒトＨＲＰ（シグマ、Ａ０１７０－１ＭＬ）とインキュベートする。プレートをＴＭＢ基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で発色させ、１Ｍ ＨＣｌで停止させる。読み出しはＴｅｃａｎ Ｓｐａｒｃプレートリーダーで行う。

図２Ａに示すように、ＮＧ００４は、ＥＣ₅₀が０．２６ｎＭという低いｎＭ範囲において、高い親和性をもって、生理学的ｐＨでヒトｄ２０ｐｌｕｓ領域に結合する。抗体１１Ｃ７のＥＣ５０値は０．１４ｎＭ、オザンズマブについては０．２０ｎＭである。対応するラットペプチドｄ２０ｐｌｕｓは、ＮＧ００４に弱く結合するにすぎない（図２Ｂ）。これらのデータにより、デルタ２０領域がＮｏｇｏ－Ａタンパク質内の活性結合部位であることが確認される。

図２Ｃ及び図２Ｄに示すように、ＮＧ０３４は、生理学的ｐＨでヒトｄ２０ｐｌｕｓ領域及びラットｄ２０ｐｌｕｓ領域の両方に対して、ＥＣ₅₀が、ヒト型では０．２９８ｎＭ、ラット型では０．２２９ｎＭという低ｎＭ範囲において、高い親和性をもって結合する。

さらに、ＮＧ００４及びＮＧ０３４は、ラット脳梁オリゴデンドロサイト（非固定）（図２Ｅ）、ラット脳梁脊髄（固定）、並びに固定ヒトＭＯ３．１３、ラットＮＳ－１細胞、並びにラットＣＮＳ組織のオリゴデンドロサイト及び運動ニューロンを陽性染色することが示されており、染色パターンは、例えば、オザンズマブの染色パターンと同様である。

実施例４：抗体ＮＧ００４の結合エピトープの評価
ＮＧ００４のエピトープマッピングを、オーバーラップするペプチドのスキャンを用いて行った。Ｎｏｇｏ－Ａのｄ２０ｐｌｕｓ領域の配列（ヒトＮｏｇｏ－Ａのアミノ酸５４３～８６６）を、個々のペプチド間に１１アミノ酸のオーバーラップを有する直鎖状の１５ｍｅｒペプチドとして合成した。それらのペプチドをニトロセルロース薄膜（ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ベルリン、ドイツ）にスポットした。この膜をメタノール中で５分間活性化し、室温で１０分間ＴＢＳ中で洗浄した。非特異的結合部位を室温で２時間、Ｒｏｔｉ（登録商標）－Ｂｌｏｃｋ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ＋Ｃｏ．ＫＧ（カールスルーエ、ドイツ））を用いてブロッキングした。ＮＧ００４（１μｇ／ｍｌ）を、Ｒｏｔｉ（登録商標）－Ｂｌｏｃｋにおいて室温で３時間インキュベートした。一次抗体の結合を、ＨＲＰコンジュゲート化ロバ抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して調べた。ブロットを、ＥＣＬ及びＩｍａｇｅＱｕａｎｔ３５０検出器（ＧＥヘルスケア、Ｏｔｅｌｆｉｎｇｅｎ、スイス）を使用して発色させ、評価した。

抗体ＮＧ００４は、Ｎｏｇｏ－Ａのｄ２０ｐｌｕｓ領域内の配列１４１－ＩＮＡＡＬＱＥ－１４７に対応するスポット３４、３５及び３６（図３、白ボックス）を認識する。さらに、アラニン及びトランケーションスキャン（alanine and truncations scans）を実施して、同定された最小エピトープを確認した。

実施例５：競合アッセイ
アッセイは、Ｋｗａｋ＆Ｙｏｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９１（１９９６），４９－５４によって提示される方法に基づいている。具体的には、抗原ヒトｄ２０＋をコーティングした後、ＴＢＳ－０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中５％粉乳でブロッキングした。ブロッキング後、競合抗体１１Ｃ７及びオザンズマブを特定抗体のＥＣ₅₀濃度以上でインキュベートした。洗浄後、ＮＧ００４又はＮＧ０３４のマウスＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４アイソタイプのいずれかを、３０μｇ／ｍｌ（２００ｎＭ）の濃度で始まる段階希釈物としてウェルに添加した。３倍の段階希釈を１２希釈にわったって行った。競合抗体との競合が起こる場合、ＮＧ００４又はＮＧ０３４の結合が減少し、ＥＣ₅₀値のシフト及び／又は高濃度プラトーの吸光度の値の減少として示される。

ＮＧ００４は、抗体オザンズマブ（図４Ａ）及び１１Ｃ７（図４Ｂ）とＮｏｇｏ－Ａに対する競合的結合を示さない。ＮＧ０３４は、抗体１１Ｃ７及びＮＧ００４（図４Ｃ）とＮｏｇｏ－Ａに対する競合的結合を示さない。

実施例６：インビボモデルにおける標的関与
無傷の成体ラット（Ｌｏｎｇ Ｅｖａｎｓ、Ｊａｎｖｉｅｒ）に、浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚｅｔ ２ＭＬ１ポンプ）を介して腰部脊髄上にポンピング速度１０μｌ／ｈで７日間、抗体を髄腔内投与した。この期間の後、動物を屠殺し、その組織を処理してバイオマーカーに対する抗体の効果を評価した。具体的には、動物を麻酔し、生理食塩水で経心的に灌流した後に、４％ホルマリンで経心的に灌流した。次いで、ＣＮＳ組織試料をＯＣＴ封入剤に包埋して凍結し、クライオスタット上で切断した。注入された抗体ＮＧ００４．ｍ１、１１Ｃ７（陽性対照）及びアイソタイプ対照抗ＢｒｄＵ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）の効果を、選択されたバイオマーカー、すなわちＮｏｇｏ－Ａ、Ｎｏｇｏ－Ｂ及びＮｇＲ１で試験した。

統計解析には、Ｐｒｉｓｍ７．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）及びＲ（Ｒバージョン３．４．１）を使用した。経時的な群内の統計的検定には、通常の一元配置ＡＮＯＶＡを用いた後に、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いる。経時的に群間及び群内の差の検出、並びに経時的に３つ以上の群の比較には、反復測定による二元配置ＡＮＯＶＡを用いた後に、Ｔｕｋｅｙ多重比較検定を用いる。全ての実験の有意性の閾値を＊Ｐ＜０．０５に設定する。より小さいＰ値は、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１として表す。棒グラフでは、全てのデータを平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）としてプロットしている。ボックスプロットのグラフでは、データは中央値±２５パーセンタイル（ボックス）及び最小／最大（ひげ）として表される。全てのグラフにおいて、ドットは個々の動物を表す。

２ｍｇ及び４ｍｇのＮＧ００４でそれぞれ１週間処置したラットの髄腔内処置は、免疫蛍光染色によって評価したとき、ＣＮＳにおける内因性Ｎｏｇｏ－Ａタンパク質レベルの下方制御をもたらす（図５Ａ）。抗体１１Ｃ７を陽性対照として使用した。対照的に、ＮＧ００４及び１１Ｃ７は、ＣＮＳにおける内因性Ｎｏｇｏ－Ｂタンパク質レベルを上方制御する（図５Ｂ）。抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体ＮＧ００４及び１１Ｃ７を７日間注入したラットの海馬のＣＡ３領域は、対照の抗ＢｒｄＵ抗体で処置したラットと比較して、ＮｇＲ１の蛍光強度が有意に高いことが示された。このように、ＮｇＲ１の有意な上方制御が認められる（図５Ｃ）。

実施例７：ＬＴＰアッセイ
抗体１１Ｃ７によるＮｏｇｏ－Ａ中和は、マウス海馬において長期シナプス可塑性（長期増強、ＬＴＰ）を有意に増加させたことが示されている（Ｄｅｌｅｋａｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １０８（２０１１），２５６９－２５７４）。公開されたプロトコルに従って、ＮＧ００４のＬＴＰを増加させる効力について分析した（上記のＤｅｌｅｋａｔｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１））。

図６Ｂに示すように、ＮＧ００４は、陽性対照１１Ｃ７と同様のエクスビボ活性を示す（図６Ａと図６Ｂとを比較されたい）。さらに、より高用量のＮＧ００４（２５μｇ／ｍｌ）は、効果量及び作用の発現を増加させる。

実施例８：インビトロ神経突起伸長アッセイ
抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体の生物学的活性を評価するために、神経突起伸長阻害アッセイを行った。培養中の神経細胞を粗脳脊髄界面活性剤抽出物（Ｎｏｇｏ－Ａ含有抽出物）で処理すると、神経突起伸長が阻害される。以前の研究では、この阻害活性が、Ｎｏｇｏ－Ａに対する特異的抗体、例えば１１Ｃ７、ＡＴＩ３５５又はオザンズマブによって約２０％中和され得ることが分かっている（上記のＯｅｒｔｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００３）、上記のＬｉｅｂｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）、Ｗｅｉｎｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３２（２００６），１６１－１７３）。アッセイは、Ｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７（１９９５），２５２４－２５２９によって確立されたプロトコルに従って実施した。初代ニューロン又は神経芽細胞腫細胞の神経突起伸長が、ラット脊髄抽出物又は非ヒト霊長類ＣＮＳ抽出物（ＣＮＳＥ）（Ｎｏｇｏ－Ａを含有する）によって阻害され、機能的に活性な抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体によって、この阻害の部分的な逆転／中和が起こることが示された。ＮＧ００４及びＮＧ０３４の生物学的活性を、陽性対照抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体１１Ｃ７及びＡＴＩ３５５と比較して試験した。

Ｎ１Ｅ－１１５細胞株は、Ｔ．Ａｍａｎｏ、Ｅ．Ｒｉｃｈｅｌｓｏｎ及びＭ．Ｎｉｒｅｎｂｅｒｇによって、マウス自然発生神経芽腫腫瘍Ｃ－１３００をクローニングすることによって１９７１年に確立された。Ｎ１Ｅ－１１５細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（注文番号：ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２２６３）によって供給された。分化のために、接着性Ｎ１Ｅ－１１５細胞を分化培地（２％Ｌ－グルタミンを補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）培地）中の４８ウェルプレートで増殖させる。この細胞を回収し、無血清分化培地に再懸濁して、密度２．２×１０⁴細胞／ｍｌの細胞懸濁液を得る。次いで、ウェル当たり４５０μｌの細胞懸濁液を４８ウェルプレートに播種して、ウェル当たり最終密度を１×１０⁴細胞とし、阻害性抽出物及び試験抗体の添加前に、３７℃で５％ＣＯ₂下、加湿インキュベータ内で２４時間インキュベートした。

独立したアッセイの比較可能性を保証するために、ＣＮＳ抽出物の新しい調製が行われるたびに、ＣＮＳ抽出物の半数阻害（ＨＭＩ₅₀）値（half-maximal inhibition (HMI50) value）を求める必要があった。ＣＮＳ抽出物のＨＭＩ₅₀値を求める手順を、１濃度あたり３ウェルを用いて以下のように行った。ＰＢＳ中で予め混合したＮ１Ｅ－１１５細胞に、ＣＮＳ抽出物を濃度を増加させながら（５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ）、ウェル当たり５０μｌの最終量に至るまで添加した。２４時間後、細胞を固定し、分析のためにクマシー染色した。クマシー染色した細胞を、半自動ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２５００ＨＳを使用して画像化し、各ウェルの予め定められた位置の８つの１０倍明視野画像を取得し、そのうちの４つをＨＭＩ₅₀値を求めるために分析した。ＨＭＩ₅₀値は、形態学的基準に基づいて目測で推定したところ、溶媒対照（ＰＢＳ）については、Ｎ１Ｅ－１１５細胞の約８０％が中程度に長い神経突起を示し、例えば１２．５μｇ／ｍｌのＣＮＳ抽出物によって、神経突起を有する細胞の数が６０％に減少し、例えば２０μｇ／ｍｌのＣＮＳ抽出物によって、神経突起を有する細胞の数が４０％に減少し、例えば４０μｇ／ｍｌのＣＮＳ抽出物によって、神経突起を有する細胞の数がほぼ０％に減少している。これらの形態学的基準に基づいて、ＨＭＩ₅₀値は、溶媒対照条件と比較して、５０％の細胞が神経突起を有する細胞形態を示すものとして定義することができる。ＨＭＩ₅₀値は、同じＣＮＳ抽出物の供給源を使用した各実験において一定であった。新しいＣＮＳ抽出物を調製した場合、ＨＭＩ₅₀を再度決定する必要があった。

Ｎ１Ｅ－１１５細胞をＣＮＳ抽出物及び試験する抗体（ＮＧ００４．ｈ４．ｍ１骨格ヒトＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ及びＮＧ００４．ｍ１骨格マウスＩｇＧ１）で処置して２４時間インキュベートした後に、固化、クマシー染色及び画像取得を行った。ＴＩＦＦ画像の分析には、Ｆｉｊｉの内蔵グリッドプラグイン及びセルカウンタプラグイン（ＩｍａｇｅＪソフトウェア）を使用した。画素を対物倍率に基づいてμｍ²に変換した。カウントフレームグリッドを、カウントフレームグリッドの線の間に、１ポイントサイズ当たりの面積が一定（２１’７０８．８μｍ²）となるように画像に重ねた。コンピュータマウスを使用して、画像ごとに細胞体（カウンタ１）をマークし、Ｆｉｊｉ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒソフトウェアプラグインによってカウントした。同様に、神経突起（細胞体直径よりも長い突起）とグリッドライン（カウンタ２）との交点をマークした。神経突起伸長を正確に定量化するために、特定のカットオフを設定した。すなわち、（ａ）細胞体が画像フレームの外縁に接触する場合にはカウントせず、（ｂ）突起が細胞体直径よりも長い場合には神経突起と見なし、（ｃ）カウント枠の外縁との交点はカウントせず、（ｄ）死細胞をカウントから除外する。死細胞と考えられるものを、小円形形態によって視覚的に判断した（Ｒｏｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １００（２０００），２５－３２）。次いで、得られた交点の数と細胞の数の比を以下の式によって計算した：細胞当たりの平均神経突起伸長＝交点の総数／総細胞数。

各実験条件について、３つのウェル反復／実験及び３つの独立した実験のそれぞれの４つの画像を分析した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７．０３ソフトウェアを用いて、データのプロット及び統計分析を行った。データを、ｐｏｓｔ－ｈｏｃ ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡを使用して統計学的に分析した。

図７Ａ及び図７Ｂに示されるように、分化させた、ラットＣＮＳ抽出物で処理したＮ１Ｅ－１１５細胞を抗体ＮＧ００４で処理すると、神経突起伸長が刺激され、すなわち、神経突起伸長のＮｏｇｏ－Ａ誘導阻害が逆転される。この効果に対するＮＧ００４のＩＣ₅₀値は１１．１６ｎＭであり、陽性対照抗体１１Ｃ７については１９．３４ｎＭである。さらに、図７Ｃ及び図７Ｄは、抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体ＮＧ００４及びＮＧ０３４が、成長阻害性霊長類ＣＮＳ抽出物の存在下での神経突起伸長促進について内部参照抗体ＡＴＩ３５５と同様の機能活性を示したことを示している。抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体ＮＧ００４及びＮＧ０３４は、粗非ヒト霊長類ＣＮＳ抽出物（Ｎｏｇｏ－Ａ含有）媒介神経突起伸長阻害を中和し、ヒトに系統発生的に近い種における生物学的活性の証拠を示している。アイソタイプ対照抗体３．１（組換えヒト抗ＩＡＶ ＨＡ抗体ＦａｂフラグメントｍＡｂ ３．１、Ｗｙｒｚｕｃｋｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８８（２０１４），７０８３－７０９２）を陰性対照として使用し、抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体ＡＴＩ３５５を陽性対照として使用した。

実施例９：インビボ脳卒中マウスモデルにおける血管形成
Ｎｏｇｏ－Ａは、神経突起成長阻害に加えて、ＣＮＳの発達において血管新生の負の調節因子として作用することも分かっている（Ｗａｅｌｃｈｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １１０（２０１３），Ｅ１９４３－５２）。したがって、脳卒中のマウスモデル（Ｒｕｓｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １１６（２０１９），１４２７０－１４２７９、及び、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１７（１９８５），４９７－５０４）において、モノクローナル抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体（ＮＧ００４）が脳卒中損傷後のペナンブラの血管新生を増加させる可能性を、既に確立されている抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体１１Ｃ７又は対照抗体ＦＧ１２／Ｂ５（Ｍｕｒａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６０（２００４），１７２－１７４）と比較して調べた。抗体を、脳室に埋め込んだ浸透圧ミニポンプを介して、脳卒中成体マウスに１４日間投与した。２１日後、動物を屠殺し、その組織を処理して、ペナンブラ内の血管ネットワーク、並びに血管面積分率、血管分岐部の数、血管の長さ及び直径、並びに脳卒中後の血管間の距離に対する抗体（ＮＧ００４、１１Ｃ７、ＦＧ１２／Ｂ５）の効果を評価した。そこで、成体雌マウス（１０週）に、確立されたプロトコル（Ｗａｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ５０（２０１４），１２５０－１２５５，ａｎｄ Ｂａｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３４（２０１４），３３７８－３３８９）に従って、右運動皮質のフォトトロボティックストローク（photothrombotic stroke）を発症させた。増殖性血管内皮細胞を標識するために、マウスに、脳卒中後の６日目、７日目及び８日目に３回連続して、５－エチニル－２’－デオキシウリジン（ＥｄＵ、５０ｍｇ／ｋｇ体重、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を腹腔内注射した。ＥｄＵ取込みは、脳卒中の２１日後に、Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、４０μｍのフリーフローティング冠状切片で検出した。持続的なＣＮＳ送達のために、抗体を、３２ｇａカテーテル（ＣＲ３２１８，ＲｅＣａｔｈＣｏ，ＬＬＣ，２８５３－１０６ Ｏｘｆｏｒｄ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ａｌｌｉｓｏｎ Ｐａｒｋ，ＰＡ１５１０１）を有する浸透圧Ａｌｚｅｔミニポンプモデル番号１００２（０．２５μｌ／ｈポンプ流量、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、米国）に充填し、公知のプロトコル（Ｉｎｅｉｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １２（２０１７），１０４－１３１）に従って病変部位とは反対側の側脳室（contralesional cerebral lateral ventricle）に加えた。割り当てた抗体であるＩｇＧ１マウスモノクローナル抗体１１Ｃ７（陽性対照）、ＦＧ１２／Ｂ５（陰性対照）、ＩｇＧ１キメラモノクローナル抗体ＮＧ００４が充填された浸透圧ポンプのうちの１つを各動物に与えた。全ての抗体の濃度は７ｍｇ／ｍｌであった。全体的な健康状態を評価するために、動物の体重を毎日測定し、相互作用ニューロスコア（interactive neuro-score）を以前に公開されたプロトコル（Ｓｈｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １６８（２００８），４３１－４４２）に従って記録した。群間に統計的差異は観察されなかったが、ＮＧ００４を投与した動物は、最初の数日間でより良好な回復をする傾向があった。２１日後、動物を屠殺し、標準プロトコル（Ｒｕｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１６（２０１９），１４２７０－１４２７９）に従って経心的に灌流して脳切片を得た。ペナンブラ内の血管新生に対する注入抗体ＮＧ００４、１１Ｃ７及びＦＧ１２／Ｂ５の効果を評価するために、血管面積分率、血管長、血管分岐部、血管距離及び距離のばらつきなどの様々な生物学的に関連する血管パラメータを評価した。さらに、新たに形成された血管の形成を、抗ＣＤ３１抗体（ラット、１：５０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５５０２７４）による免疫組織化学的染色後に決定される、ＣＤ－３１陽性血管内皮細胞の核へのヌクレオチド類似体及び有糸分裂マーカーＥｄＵの取込みによって評価した。

新たに生成された血管を、虚血境界域内のＣＤ３１／ＥｄＵ二重陽性細胞の量を定量することによって同定した。画像をＩｍａｇｅＪ（ＦＩＪＩ）で分析した。画像を８ビットフォーマットに変換し、Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｐｌｕｇｉｎを用いて手動で閾値処理して、２値化画像を得た。ノイズを除去するために、０．５ピクセルの中央値を適用した。関心領域（ＲＯＩ）を手動で選択し、全てのパラメータについて分析した。１）面積分率：ハイライトされ、０ではないＲＯＩ内のピクセルのパーセンテージ。２）血管長：画像をスケルトン化し、プラグインスケルトン長ツール（plugin Skeleton length tool）で分析した－ＲＯＩ内の全ての構造の長さを合計した。３）分枝の数を、Ａｎａｌｙｚｅ Ｓｋｅｌｅｔｏｎツールによって評価した。４）単一血管間の最小距離を計算するＮＮＤツールによって血管の距離及びばらつきを計算した。これから、平均及び標準偏差を計算して、ＲＯＩにおける血管間の平均距離及び分布のばらつきに関する情報を得た。血管長及び分枝の数の値を、関心領域の総面積に対して正規化した。統計解析は、Ｐｒｉｓｍ７．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）及びＲ（Ｒバージョン３．４．１）を用いて行った。経時的な群内の統計学的検定には、通常のｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡを用いた後に、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いた。経時的に群間及び群内の差の検出、及び経時的に３つ以上の群の比較には、反復測定によるｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡを用いた後に、Ｔｕｋｅｙ多重比較検定を用いた。行動回復とｏｕｔ－ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ ｆｉｂｅｒｓとの間の相関分析には、スピアマンの相関を適用した。全ての実験において、有意性の閾値を＊Ｐ＜０．０５に設定した。より小さいＰ値は、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１として表す。棒グラフでは、全てのデータを平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）としてプロットしている。ボックスプロットのグラフでは、データは中央値±２５パーセンタイル（ボックス）及び最小／最大（ひげ）として表される。全てのグラフにおいて、ドットは個々の動物を表す。

図８に示すように、ＮＧ００４及び１１Ｃ７で処置した動物の脳卒中後の脳組織は、脳卒中の２１日後に、対照と比較して虚血境界域における血管床がより高度に発達していることが示された。これは、血管が占める総面積分率の増加（ＮＧ００４で０．１２±０．０３、１１Ｃ７で０．１１５±０．０３、対照で０．０７±０．０１）、１ｍｍ²当たりの分岐数の増加（ＮＧ００４で３７９．１８±９６．６２、１１Ｃ７で３４９．４±７１．９６、対照で１５６．７９±３１．８２）、及び１ｍｍ²当たりの血管長（ｍｍ）（ＮＧ００４で２１．９０±３．８３、１１Ｃ７で２０．０３±１．６９、対照で１２．８９±２．８２）によって示された（図８Ａ～図８Ｃ）。血管パラメータのいずれにおいても、１１Ｃ７とＮＧ００４との間に差は検出されなかった。重要なことに、全群間で脳卒中サイズに検出可能な差はなかった（データは示さず）。虚血境界域におけるより高度に発達した血管床は、新たに形成された血管を介して生成されると仮定された。したがって、ヌクレオチド類似体ＥｄＵ（５０ｍｇ／ｋｇ体重）を、血管新生のピーク時である損傷の６～８日後に毎日全身注射した。虚血境界域において新たに形成された血管内皮細胞（ＣＤ３１＋）をカウントした。対照（２８．５１±８．８）と比較して、抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体を投与した両群（ＮＧ００４：５５．２０±１２．７、１１Ｃ７：５７．３０±１９．５７）において、１ｍｍ²当たりのＣＤ３１／ＥｄＵ＋細胞の数の増加が観察された（図８Ｄ）。要約すると、抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体で処置した両方の群では、損傷の３週間後に対照抗体を投与した動物と比較して、区別できない程度まで血管修復が増強されることが分かった。また、新たに形成された血管内皮細胞の数が、ＮＧ００４処置動物及び１１Ｃ７処置動物の両方の群において、同じ程度の群まで増加することも分かった。したがって、ＮＧ００４は、脳卒中後の血管修復のための強力な抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体である。

実施例１０：抗体の完全性及び安定性
抗体の安定性及び完全性を分析するために、標準プロトコル（Ｐｏｒａｔｈ＆Ｆｌｏｄｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ１８３（１９５９），１６５７－１６５９）に従ってサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った。簡単に言えば、抗体を異なる緩衝液に透析した。透析後、抗体を試験管に移し、４０℃及び４℃で最大９週間インキュベートした。１週目、２週目、４週目及び９週目に、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ ＩｎｃｒｅａｓｅカラムのＡｍｅｒｓｈａｍ製の１００μｌループに、流速０．７５ｍｌ／分で試料を引き入れて注入した。ランニングバッファーは、ｐＨ７．４のＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳを使用した。

図９Ａ及び図９Ｂに示すように、抗体ＮＧ００４は、異なるｐＨ値（ｐＨ６、７．４、８）及び人工ＣＳＦにおいて、並びに反復凍結融解サイクル後において非常に安定である。さらに、分解及び凝集は観察されず、親和性が維持された（データは示さず）。

実施例１１：ＮＧ００４による処置後の歩行運動タスクの機能的回復
片側フォトトロボティックストローク（unilateral photothrombotic stroke）のラットモデルにおける運動機能回復、特に髄腔内適用後の熟練した前肢機能の機能回復に対する、ヒトＮＧ００４モノクローナル抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体の前臨床有効性を、既に確立されている抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体１１Ｃ７又は対照抗体（「抗ＢｒｄＵ」）と比較して評価した。

機能的回復を扱うために、良好に順化され、取り扱われた若齢成体雌Ｌｏｎｇ－Ｅｖａｎｓラットを微細運動行動タスク（水平ラダー試験）で訓練し、それらのベースライン行動成績を３つのセッションで記録した。次いで、感覚運動皮質に向けたフォトトロボティックストローク（photothrombotic stroke）を施し、浸透圧ポンプを介して抗体（１１Ｃ７、ＮＧ００４（ＩｇＧ１キメラモノクローナル抗体ＮＧ００４）、抗ＢｒｄＵ）を脳卒中ラットの髄腔内に１４日間投与した。動物の行動成績を、脳卒中誘発後（損傷後４日目）並びに最大９週間（損傷後７日目、１４日目、２１日目、２８日目、３５日目、４２日目、４９日目、５６日目、６３日目）にわたって毎週記録した。

４０匹のラットを以下の群に分けた。
１．ＮＧ００４＿４ｍｇ：１０匹のラットに１４日間にわたって累積用量で４ｍｇのＮＧ００４を投与した。
２．ＮＧ００４＿８ｍｇ：１０匹のラットに１４日間にわたって累積用量で８ｍｇのＮＧ００４を投与した。
３．１１Ｃ７：１０匹のラットに１４日間にわたって累積用量で４ｍｇの１１Ｃ７を投与した（陽性対照）。
４．抗ＢｒｄＵ：１０匹のラットに１４日間にわたって累積用量で４ｍｇのＢｒｄＵに対するマウスモノクローナル抗体を投与した（陰性対照）。
ここでは、４匹の動物を屠殺しなければならなかった（第１群から２匹の動物と、第２群及び第４群から各１匹の動物）。

動物を、個別に換気されたケージ（ＩＶ型）に、３匹１群で、食物及び水の不断給餌で、１２時間の暗／明サイクルを繰り返しながら収容した。市販業者（Ｊａｎｖｉｅｒ．Ｌａｂｓ、Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ－Ｓａｉｎｔ－Ｉｓｌｅ、フランス）から到着した後、４０匹の雌Ｌｏｎｇ Ｅｖａｎｓラット（年齢：１２～１６週、体重：２００～２５０ｇ）を動物施設に一週間順化させた。その後、実験者は、ストレスレベルを低下させるために、実験開始前の１週間、標準的な手順に従って動物を取り扱った。

不規則水平ラダー歩行試験は、熟練した歩行を評価するための運動及び協調試験であり、不規則に間隔を空けたラダーのラングの上に前足が明確に置かれることを判定する（Ｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２８（２００８），９３８６－４０３を参照されたい）。水平ラダー歩行試験装置は、透明なプレキシガラス製の側壁と金属製のラング（直径３ｍｍ）とからなり、ラングは、ラング間の最小距離が１ｃｍで全長が１ｍのラダー通路を形成するように挿入することができる。ラングは、大脳皮質に足の置き場を再評価させるために、最大距離３ｃｍで、不規則に間隔を空ける。ベースライン水平ラダー成績を３日間連続して記録した。各セッションについて３回の実行を記録し、全ての実行の高速ビデオ記録につき、ラング上の足の置き場について分析した。

Ｌｉｎｄａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ １３７（２０１４），７３９－７５６、及びＷａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １７（１９８５），４９７－５０４に既に記載されているように、全ての動物に片側フォトトロボティックストロークを与えて、それらの選択した足の感覚運動皮質を病変させた。動物は、損傷から十分に回復した。罹患前肢は、麻痺の徴候を示したが、動物は、歩行し、登り、食べ、そして身づくろいをすることができた。持続的なＣＮＳ送達のために、カテーテルを有する、指定した抗体で満たされた浸透圧ポンプを準備し、フォトトロボティックストローク手術の直後に腰椎液腔に抗体を送達した。１４日後、ポンプを取り外し、行動試験を開始した。水平ラダーデータの分析のために、正しく前肢／足を置いた成功率を、対応する肢によって行われた総歩数のパーセントとして計算した。

統計解析は、Ｐｒｉｓｍ７．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いて行った。経時的な群内の統計的検定には、ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡを用いた後、ＬＳＤ（最小有意差）フィッシャー検定を用いた。特定の時点での群間の差を検出するために、対応のない片側ｔ検定を用いた。行動回復とＣＳＴ頸髄発芽（cervical spinal cord sprouting）との間の相関分析のために、スピアマン相関を適用した。全ての実験において、有意性は閾値を＊Ｐ＜０．０５に設定した。より小さいＰ値は、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１として表す。棒グラフでは、全てのデータを平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）としてプロットしている。全てのグラフにおいて、ドットは個々の動物を表す。

抗Ｎｏｇｏ－Ａで処置した動物は、対照抗体で処置した動物と比較して、水平ラダータスクにおいて改善された機能的回復を示した。

損傷後４日目に、全ての動物は、同等の成功率の低下を示した（抗ＢｒｄＵの場合には３４．４３％±８．０８％へ低下、抗Ｎｏｇｏ－Ａ処置１１Ｃ７の場合には３８．３７％±４．８７％へ低下、ＮＧ００４ ４ｍｇ／ｍｌの場合には３４．８５％±６．１２％へ低下、ＮＧ００４ ８ｍｇ／ｍｌの場合には３３．７５％±５．２５％へ低下）。１４日目以降、抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体ＮＧ００４ ８ｍｇ／ｍｌ及び１１Ｃ７で処置した動物の成績は絶えず改善し、抗ＢｒｄＵで処置した動物と比較した場合に、損傷後６３日目に有意差に達した（図１０を参照されたい）。したがって、この結果は、抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体ＮＧ００４で処置すると、不規則な水平ラダー渡りによって示されるように、細かい運動制御を必要とする歩行運動タスクについて、より良好な回復をもたらすことを示した。

実施例１２：抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体ＮＧ００４は、補体依存性ＣＤＣが減少している
Ｃ１ｑ結合ＥＬＩＳＡアッセイを実施して、抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性に関するＦｃ特性を分析し、ヒトＣ１ｑ（Ｓｉｇｍａ Ｃ１７４０－５ｍｇ）の沈着を測定した。Ｃ１ｑ沈着は、１μｇ／ｍｌ抗体をコートしたポリスチレンプレートで、ＴＢＳ－０．１容量％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１５ｍＭ ＣａＣｌ₂及び１ｍＭ ＭｇＣｌ₂中の８つの異なる濃度のＣ１ｑ（１．２～２０μｇ／ｍｌ）を３７℃で１時間インキュベートして評価した。検出には、ヒツジ抗ヒトＣ１ｑポリクローナル抗体（ｂｉｏｒａｄ２２２１－５００４Ｐ）を用いた。対照として、作用機序が既知の２つの臨床抗体を使用した。リツキシマブ（ヒトＩｇＧ１）は陽性として、ナタリズマブ（ヒトＩｇＧ４）は陰性対照として使用した。ＮＧ００４ ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐの内部陽性対照は、ＩｇＧ１アイソタイプのＮＧ００４とした。１０分後、比色ＴＭＢ反応を１Ｍ ＨＣｌで停止させ、４５０ｎｍにおけるＯＤをＴＥＣＡＮ Ｓｐａｒｋプレートリーダーで測定した。

ＮＧ００４ ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体及びナタリズマブは、ＩｇＧ１アイソタイプと比較してＣ１ｑ結合活性の低下を示した（図１１を参照されたい）。これらの結果は、ＮＧ００４ ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐが他のＩｇＧ４と同様に挙動し、ＣＤＣが減少していることを示している。

Claims (15)

1. ヒト由来組換えモノクローナル抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントであり、Ｎｏｇｏ－Ａ－Δ２０ドメインに結合し、脳卒中のペナンブラにおいて、用量依存的に神経突起伸長及び／又は血管新生を誘導することができる、抗体又はその抗原結合フラグメント。
2. 配列番号２１のアミノ酸配列を含むか若しくは配列番号２１のアミノ酸配列からなるペプチドに結合し、かつ／又はＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３を含む可変重（ＶＨ）鎖と、ＶＬ ＣＤＲ１、２及び３を含む可変軽（ＶＬ）鎖とを含み、ここで、
   （ａ）ＶＨ－ＣＤＲ１は配列番号３のアミノ酸配列又はその変異体を含み、該変異体は１又は２つのアミノ酸置換を含み、
   （ｂ）ＶＨ－ＣＤＲ２は配列番号４のアミノ酸配列又はその変異体を含み、該変異体は１又は２つのアミノ酸置換を含み、
   （ｃ）ＶＨ－ＣＤＲ３は配列番号５のアミノ酸配列又はその変異体を含み、該変異体は１又は２つのアミノ酸置換を含み、
   （ｄ）ＶＬ－ＣＤＲ１は配列番号８のアミノ酸配列又はその変異体を含み、該変異体は１又は２つのアミノ酸置換を含み、
   （ｅ）ＶＬ－ＣＤＲ２は配列番号９のアミノ酸配列又はその変異体を含み、該変異体は１又は２つのアミノ酸置換を含み、
   （ｆ）ＶＬ－ＣＤＲ３は配列番号１０のアミノ酸配列又はその変異体を含み、該変異体は１又は２つのアミノ酸置換を含む、又は
   前記抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＨ鎖、並びに／又はＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬ鎖を含み、ここで、
   （ｇ）ＶＨ－ＣＤＲ１は配列番号１３のアミノ酸配列又はその変異体を含み、該変異体は１又は２つのアミノ酸置換を含み、
   （ｈ）ＶＨ－ＣＤＲ２は配列番号１４のアミノ酸配列又はその変異体を含み、該変異体は１又は２つのアミノ酸置換を含み、
   （ｉ）ＶＨ－ＣＤＲ３は配列番号１５のアミノ酸配列又はその変異体を含み、該変異体は１又は２つのアミノ酸置換を含み、
   （ｊ）ＶＬ－ＣＤＲ１は配列番号１８のアミノ酸配列又はその変異体を含み、該変異体は１又は２つのアミノ酸置換を含み、
   （ｋ）ＶＬ－ＣＤＲ２は配列番号１９のアミノ酸配列又はその変異体を含み、該変異体は１又は２つのアミノ酸置換を含み、
   （ｌ）ＶＬ－ＣＤＲ３は配列番号２０のアミノ酸配列又はその変異体を含み、該変異体は１又は２つのアミノ酸置換を含む、
   請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
3. （ａ）前記ＶＨが配列番号２に示されるアミノ酸配列又はその変異体を含み、該変異体は１又は２つのアミノ酸置換を含み、かつ
   （ｂ）前記ＶＬが配列番号７に示されるアミノ酸配列又はその変異体を含み、該変異体は１又は２つのアミノ酸置換を含み、好ましくは、
   前記ＶＨ及び前記ＶＬのアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２及び配列番号７と少なくとも９０％同一であり、又は
   （ｃ）前記ＶＨ鎖が配列番号１２に示されるアミノ酸配列又はその変異体を含み、該変異体は１以上のアミノ酸置換を含み、かつ、
   （ｄ）前記ＶＬが配列番号１７に示されるアミノ酸配列又はその変異体を含み、該変異体は１以上のアミノ酸置換を含み、好ましくは、
   前記ＶＨ鎖及び前記ＶＬ鎖のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１２及び配列番号１７と少なくとも９０％同一である、
   請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
4. 免疫グロブリン重鎖定常領域、免疫グロブリン軽鎖定常領域をさらに含み、好ましくは、前記免疫グロブリン重鎖定常領域及び／又は免疫グロブリン軽鎖定常領域がＩｇＧタイプのものである、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
5. ＩｇＧと比較してエフェクター機能が低下した定常ドメインＦｃ領域を含み、好ましくは、前記定常ドメインがＩｇＧ４クラスのものである、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
6. ＩｇＧ４クラス又はＳ２２８Ｐ変異を含むアイソタイプである、請求項５に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
7. 単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメント、及びＦ（ａｂ’）₂フラグメント、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖抗体、及びジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）からなる群から選択され、かつ／又はマウス－ヒトキメラ抗体である、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
8. 請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント又はその免疫グロブリンＶＨ及びＶＬをコードする１つ以上のポリヌクレオチドであって、好ましくはｃＤＮＡであり、かつ／又は異種核酸に作動可能に連結されている、ポリヌクレオチド。
9. 請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクター。
10. 請求項８に記載のポリヌクレオチド又は請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。
11. 抗Ｎｏｇｏ－Ａ抗体、その抗原結合フラグメント又はその免疫グロブリン鎖を調製する方法であって、
    （ａ）請求項１０に記載の細胞を培養すること、及び
    （ｂ）前記抗体、その抗原結合フラグメント又はその免疫グロブリン鎖を前記培養物から単離することを含む、方法。
12. 請求項８に記載のポリヌクレオチドによってコードされている、又は請求項１１に記載の方法によって得ることができる、抗体、その抗原結合フラグメント、又はその免疫グロブリン鎖。
13. 請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、或は請求項１２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
    （ｉ）酵素、放射性同位体、蛍光化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、タグ、フラグ、及び重金属からなる群から選択される標識で検出可能に標識されている、
    （ｉｉ）薬物に結合している、又は
    （ｉｉｉ）ポリエチレングリコールを含む、
    抗体又はその抗原結合フラグメント。
14. 請求項１から７、１２又は１３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項８に記載のポリヌクレオチド、請求項９に記載のベクター、又は請求項１０に記載の細胞を含む組成物であり、好ましくは、
    （ｉ）医薬的に許容される担体をさらに含む医薬組成物、又は
    （ｉｉ）キットとして設計されており、任意に、免疫に基づく診断方法において従来から使用される試薬をさらに含む、診断用組成物
    である、組成物
15. 網膜を含む末梢（ＰＮＳ）及び／又は中枢（ＣＮＳ）神経系の疾患又は外傷の治療において使用するための、或は、ヒト若しくは動物の身体におけるＮｏｇｏ－Ａのインビボ検出において使用するための、
    好ましくは、前記疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、レビー様病変及び他の認知症全般、頭蓋、脳又は脊髄の外傷後の疾患、脳卒中、外傷性脳損傷、脱髄疾患、並びに、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、滲出型及び萎縮型加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、及び他の眼科的適応症からなる群から選択される眼科的疾患、からなる群から選択される神経変性疾患である、
    請求項１から７、１２又は１３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項８に記載のポリヌクレオチド、請求項９に記載のベクター、又は請求項１０に記載の細胞。

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