JPH04504799A

JPH04504799A - 新規血栓溶解剤

Info

Publication number: JPH04504799A
Application number: JP2503321A
Authority: JP
Inventors: バルドゥス，ベルトルト; ドナー，ペーター; シュロイニング，ヴォルフ―ディーター; アラゴン，アレハンドロ; ボイドル，ヴェルナー; クレッチュマー，イェルン　ライナー; ヘントラー，ベルナルト　ヤッケス; ランガー，ゲルノット
Original assignee: シェーリング　アクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 1989-02-13
Filing date: 1990-02-13
Publication date: 1992-08-27
Anticipated expiration: 2014-06-14
Also published as: FI103577B; FI913818A0; DK0383417T3; IE73229B1; EP0383417B1; GR3019328T3; HU217219B; WO1990009438A1; AU5080790A; FI103577B1; AU642404B2; HUT59724A; NO308708B1; JP2904918B2; EP0383417A1; CA2046632A1; DE69024382D1; ES2085326T3; IE900506L; NO913129L

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】新規血栓溶解剤本発明は、新規血栓溶解剤、その単離法及びその薬物学的使用に関する。

血栓は、血管内での血塊の形成により生ぜしめられる。肺動脈塞栓症を包含する静脈血栓と急性心筋梗塞症を包含する動脈血栓とは区別されている。

肺動脈塞栓症及び心筋梗塞症は緊急医療処置を必要とする救急事態である。

種々の侵入的方法と並んで、近年、プラスミノーゲンアクチベータを用いる酵素的血栓溶解の形も包含されている。血栓溶解剤と称されているこれら物質は、血中のプラスミノーゲン、線維素溶解系の不活性プロ酵素を、活性の蛋白質分解酵素プラスミンに変える。プラスミンそのものは、線維素物質フィブリン（これは血塊の主成分である）を溶かし、栓塞された血管を再解放し、血流を回復させる。しかしながら、プラスミンは比較的非特異的なプロテアーゼであり、即ち血液中で一旦形成されると、これは蛋白質分解により、無傷止血のために不可欠の血中成分（例えばフィブリノーゲン）を破壊し、その際に特定の状況下で出血の危険を誘発する。

初期の立役溶解剤であるストレプトキナーゼ及びウロキナーぜは、循環内に一旦注入されると、全身的にプラスミノ−ｒンｔプラスミンに変え、全身的な蛋白質分解を誘発する。従って、これらの物質を用いる血栓溶解治療は、厘々、出血に基づく合併症を伴なう。

その後にフィブリン特異性立役溶解が開発され、ここでは組織型の再結合プラスミノ−ｒンアクチペータ（簡略化のためにｔ−ＰＡと称される）が使用され、このジレンマは解消された。血液循環内で、ｔ−ＰＡはプラスミノ−ｒンに対して低い親和性を有するだけである。しかしながら、繊維素物質フイデリン（これと特異的な結合部位で反応する）の存在時に、この親和性は数倍も高められ、結果的に血栓の表面上にプラスミンを形成する。このことは、試験管内及び動物実験で立証でき九が、臨床研究では、循環系面枠の迅速溶解をもたらすｔめには多量のｔ−ＦＡが必要であることが示されている。

しかしながら、このような多量のｔ−ＰＡの適用量が注入されると、これはストレプトキナーゼ及びウロキナーゼの場合におけると同様に出血の相対的危険を伴なう全身的な蛋白質分解を起こさせる。従って、現在は、ｔ−ＰＡの相対的フィブリン特異性が問題になっている。この理由は、ｔ−ＰＡの主特性にある。即ち、この分子は、好適な条件（高酵素濃度、長い露出時間、高い基質濃度、至適− 及びイオン環境）下では、フィブリンの不存在下でも、プラスミノ−ｒンをプラスミンに変える活性プロテア−ぜである。これらの全ての条件は、ｔ−ＰＡｔ− 用いる現在の臨床標準治療に合致しフィブリン特異性の基準を満几す多くの特異性プラスミノ−ｒンアクチペータをめる研究の間に、ｖ−ＰＡと称されているフィブリン溶解活性を示す新規の天然物質が発見された。

本発明は、オオコウモリ属（Ｄｅｓｍｏｄｕｓ　５ｐａｃ、）のコラモリの唾液からの立役溶解活性剤ｖ−ＰＡに関し、これは次の特性で識別されるニー　唾液腺ｃ　ＤＮＡバンクから、４種のｖ−ＰＡ蛋白質に関してコードする次の４種のｃ　ＤＮＡが発見された：（１）　ｖ−ＰＡα１：フィンが−ドメイン、ＥＧＦ　（上皮生長因子）ドメイン、クリングル（Ｋｒｉｎｇｅｌ　）ドメイン、及びプロテアーゼドメインより成る高分子量形（例１８）、（２）　ｖ−ＰＡα２　二ｖ−ＰＡα、と同じドメインを有するが、ヌクレオチド及びアミノ酸配列においてｖ−ＰＡα１とは異なる高分子量形、（３１ｖ−ＰＡｔ：　ＥＧＦドメイン、クリングルドメイン及びプロテアーゼドメインより成る分子形（例１８）＋４１　Ｖ−ＰＡｔ：クリングルドメイン及びプロテアーゼドメインより成る低分子量形、 −この活性剤ｖ−ＰＡα１の主蛋白質バンドは、非還元条件下でのドデシル硫酸ナトリウムデル電気泳動において、分子量４５０００±２０００を示す（例２）、−活性剤ｖ−ｐｌの主蛋白質バンドは、非還元条件下でのドデシル硫酸す）　ＩＪウムｒル電気泳動において、分子量３９０００±３０００ｅ示し、還元条件下で分子量４３０００±２０００を示す（例１）、−活性剤ｖ−ＰＡｔの活性（ａｃｔｉｖｉｔｙ　）は、分子量、！１００００±５０００　ｔ−有ｆ　ル’ｙ ’ル濾過ｆｙ　ラム（ス＜ロース１２　；　５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２　）から溶離される（例１）、−活性剤ｖ−ＰＡβの等電点（ｐＩ）は６．８〜８．５の範囲にある、 −活ａ剤は３Ｈ−ジインプロピルフルオロホスフェートと反応し、従って血清プロテアーゼである（例９）、−活性剤ｖ−ＰＡα、及びｖ−ＰＡｔは、色属性ペプチド：Ｓ　−２２８８（Ｈ−Ｄ　−１１ｅ　−Ｐｒｏ　−Ａｒｇ　−ｐＮＡ　）及びｓ　−’ｌ　４　、！ｌ　ａ　（（ｏｌｕ　−ＧＩＹ　−Ａｒｇ　−ｐＮＡ　）　ｋ加水分解するが色原住ペグチドＳ−２２５１（Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ　−Ｌｅｕ　−Ｌｙｓ　−ｐＮＡ　）　ｆ加水分解しない（例１６）、−この活性剤は、４〜１０．５の一範囲では溶解素（１ｙｓｉｎ　）セファロース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ　）　（例１４）に結合しない、 −活性剤ｖ−ＰＡα１及びｖ−ＰＡｔは、フィブリングレート上で溶解貴翰゛（１ｙｓｉｓ　ｈａｌｏｓ）　を生ぜしめるがカゼインプレート上では生ぜしめない（例１５）、−活性剤ｖ−ＰＡα、及びｖ−ＰＡｔは、ｐＨ７，５でＺｎ”＋プレートセファロースに結合する（例１及び２）−活性剤ｖ−ｐＡβは、促進剤例えばフィブリンの存在のみでプラスミノ−ｒンを活性化するがフイデ＋）／　ｙンの存在下では活性化しない（例７）、−活性ｖ−ＰＡβは、フィブリンモノマーの存在において、プラスミノ−ｒンをプラスミンに変える際の典型的なミバエリス−メンテン反応速度論には従かわず、ｖ−ＰＡｔはアロステリック特性を有する酵素である（例１２）、 −活性剤は、試験管内で、濃度に依存して、ヒト全血トロンビンを溶解する（例８）・ −再構成され几試験管内で凝血可能な系において、活性剤ｖ−ＰＡｔは、ｔ−ＦＡとは対照的に、測定可能なフィブリノ−ｒン分解をも几らさない（例１０）、 −試験管内フィブリン溶解テスト（ｒｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｌｏｔ−Ｌｙｓｉｓ　Ａｓ５ａｙ　）で、この活性剤は濃度に応じてフィブリン溶解を起こさせる（例１３）、−活性剤ｖ−ＰＡα、及びｖ−ＰＡｔは、ヘパリン−セファロース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ　）に結合し、適当な溶液により、再びそれから溶離されうる（例４）、 −活性剤は、糧々のコチウ花科植物の穫子から単離され几固定化阻害剤に結合し、適当な溶液によりそれから再び分離で゛きる（例６）、 −活性剤ｖ−ＰＡα、及びｖ−ＰＡｔは、フィブリンセライトに結合し、適当な方法で再び溶離することができる（例５）、 −活性剤は、特定の条件下にヒドロキシアパタイトに結合し、燐酸塩含有緩衝液で再び溶離させることができる（例２）、 −活性剤ｖ−ＰＡα□及びｖ−ＰＡｌは適当な方法で相互に分離し、かつ単離することができる（例２．４及び５）、−活性剤ｖ−ＰＡα、及びｖ−ＰＡ／は、それらのＮ−末端アミノ散配列に関して相互に異なっている（例６）、−活性剤ｖ−ＰＡα、及びｖ−ＰＡｌは、それらのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列に関して相互に異なって込る（例１８Ｌ− 一　これら活性剤のコード化配列は、相応するベクター「セグタン（５ｅｐｔａｎ　）　Ｊ中に導入することができる。これらは、適当な真核細胞系中で活性剤を表現する（例１９）。

血栓溶解活性剤ｖ−ＰＡは、人体内の立坑を溶解し、従って、例えば心臓梗塞の治療に好適である、天然由来の新規プラスミノ−ｒンアクチペータである。

この剤は、オオコウモリ属の全てのコラモリの唾液中に低濃度で発見され、おそらく、この種の動物の唾液腺の細胞により発現されている。オオコウモリ属のコラモリには、アメリカ大陸の全ての糧類のコラモリが包含される。中央アメリカ及びメキシコのオオコウモリ属は、殊に徹底的な研究の対象となつ九。

本発明は、請求の範囲第９項に記載の方法でオオコウモリ属の唾液から血栓溶解性ｖ−ＰＡ’ｉ単離するいくつかの方法にも関し、これは、遠心分離された唾液を緩衝液中に入れ、Ｚｎ←ケレートセファロースヵラムのクロマトグラフィにかけ、このカラムの洗浄後にこの活性剤ｖ−ＰＡ　Ｗ”定量的に溶離させ、集めたフラクションを塩の不存在下にスペロース１２を通して濾過し、最後に、再び生理食塩水の存在でｒル濾過させることよりなる。正確な方法パラメータを後の例ＩＫ示す。

本発明は、更に、化合物ｖ−ＰＡ並びに慣用の助剤及び賦形剤より成る医薬品に関する。

ｔ−ＦＡと比較七九この新規立役溶解剤の優秀性は、後の例７．８．１０及び１５から引き出すことができる。

「実質的に純粋な」とは、蛋白質が、その活性か、天然の蛋白質よりも著るしく増大される程度まで精製されていることを意味する。有利には、この蛋白質を精製して均質にし、かつ、最も有利には少なくとも９０チまで、殊に９５−以上の純度まで精製する。

本発明のＤＮＡ配列は、慣用法で、通常の即ち市場で入手可能なベクター例えば、通常の、即ち市場で入手しうるセルライン中での表現のために有用であるプラスミド、ファージ等中に挿入することができる。

Ｖ−ＰＡ配列を得る之°めに特異的なオリゴヌクレオチドグローブ（ｐｒｏｂｅ　）は、通例、ｔ−ＰＡとは異なるリーダー領域又は完全配列中の配列を選択することにより構成される（第２７図の比較参照）。

前記のように、このグローブのＤＮＡ配列は、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＡＬｕＩｉ用いる消化によりクローンｖＰＡβから誘導されｆｔ−ｃＤＮＡライブラリィ（ｖＰＡ７　）及びｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡクローンからの相応する配列（ｔ−ｐＡ）のスクリーニングの几めに使用される。

抗体は、通例、例えば羊等の動物中でそれを生起させる常法により製造することもできる。

本発明のｖ−ＦＡは、ヒトを包含する動物に、ｔ−ＰＡの使用と同様であるが、前記のよりなり−ＰＡの選択性に基づく僅かな副作用を伴って適用することができる。

一般に、ｔ−ＰＡに必要である用量よりも低い量で使用可能である。好適な活性は、通例、慣用のプロトコルを用いて測定することができる。典型的な症状には、血栓溶解が有用であるもの例えば心臓梗塞、発作、動脈血橙症等である。薬物学的処方物の製造の几めに有用ながレヌス添加剤を使用することができる。

例　１吸血コラモリ（Ｄｅｓｍｏｄｕｓ　ｒｏｔｕｎｄｕｓ　）からの唾液のパッチ（主として分子形ｖ−ＰＡｌを含有）６０ｄの処理唾液６ｒ３ｍｔ＠４℃及び６０００．９で遠心分離する。

上置みｔ−２Ｑ　ｍＭ　）リス（ｐｌ（７，５）　／　１００　ｍＭ　ＮａＣ６／　０．０１　％プルロニックＦ６８で調整し、ケレートセファロース２００ｄの充填されているクロマトグラフィカラムに迅速流で導入し、１０ｍＭトリス（ｐＪ（７，５）／　１Ｑ　Ｑ　ｍＭ　ＮａＣ１／　１　ｍＭイミダゾール／　０．０１　％プルロニックＦ６８で均衡化させる。このカラムを、この緩衝液で、２８０　ｎｍで測定される光学密度が基準線に達するまで（約６００Ｒｇ）洗浄する。その後、このｖ−ＰＡ　ｋ　１　０　ｍ）Ｊ　）　リ　ス　（ｔＪ（７，５）／　１　０　０ｍＭＮａＣ２１０，０１％プルロニックＦ６８中の１〜５０ｍＭイミダゾール勾配溶液で溶離させる（第１図）。この精製工程を４℃で実施する。

Ａ［ＪＦＳ−吸収単位（完全スケール）ｂ）　ＮａＣｔを用いないｒル濾過２＋　＋ケレートセファロース　クロマトグラフィからのｖ−ＦＡ含有フラクション５１ＬＩ　’ｔ、２０　ｍＭ　）リス（−８，０）　／　０．０１　％プルロニックＦ６８中のスペロース（５ｕｐｅｒｏｓｅ　）　１２　ＨＲ１６／　５０クロマトグラフイカラム上から、ＦＰＬＣ系（ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　を用いて、クロマトグラフィにかけた（第２図）。

この精製工程を用いて、フィブリン溶解活性を有しないプロテアーゼが分離される。ｖ−ＰＡ活性を有するフラクションをプ・−ルする。

ｅ）　ＮａＣｔを用いるｒル濾過前記のｖ−ＰＡプール２　ｍｌ　ｆ凍結乾燥により０．２ｄまで濃縮し、５　Ｑ　ｍＭ　）リス（ｐＨ８，０）／　１６０ｍＭＮａＣｔ１０．０１１プルｌ：ｌ　ニックＦ６８中で、スペロース１２ＨＲ１０／３０クロマトグラフィカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）を通して、ＦＰＬＣ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　を用いてクロマトグラフィにかける（第３図）。

一一一一アミド分解活性第３図デル濾過Ｖ−ＰＡは、分子量約４ｏｏｏｏｔ−有して均一で鋭いピークとして溶離される。

この精製法の結果ｔ−第４図にまとめる。

第４Ａ図は、鋭感な銀着色法を伴なう非還元ＳＤＳポリアクリルアミドケ９ル電気泳動における各精製工程からの試料を示している。第４Ｂ図は、’／−ＰＡβ が、ＤＴでによるジサルファイド橋の切断の間に、この分子は２個の蛋白質バンドに分かれないので、１個の蛋白質連鎖より成ることを示している。ＤＴＴによる蛋白質連鎖の線状化により説明されうる分子量の明白な上昇が起０つでいる。

似ム　６８０００ −　ＸＩＤＣ刀、−−一、２０α℃ □　１１ｅ０００富化された活性の濃縮物を、８〜２５チ濃度の勾配ｒル中での非還元条件下でのＳＤＳ　ｒルミ気泳動にかける。このｒルのいくつかを、銀で着色してその蛋白質を可視化し、他をトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ　）　Ｘ−１００（１％）中で洗浄してＳＤＳ　’ｉ除き、グラミノ−ｒンを含有するフィブリンインジケータ２ル（Ｆｉｂｒｉｎ−Ｚｙｍｏｇｒａ−ｐｈｉｅ　；　Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ　Ａ、及びＲ５１ｃｈ　Ｅ、、　Ｊ、　ＩＥｘｐ＋Ｍａｄ、１４８　：　２２３〜２５４．１９７８）上に置く。

従って、活性剤Ｖ−ＰＡβの活性（インジケータデル中での溶解貴翰によりｌ＆１ＪＩＬ５る）は、平均分子量３９０００±５ｏｏｏｔをする蛋白質バンドに関連している。この溶解貴翰は、もっばら、プラスミノ−ｒンー含有フイデリンインジケータビル上で検出できるが、プ２スミノーｒン不含のフィブリンインジケータ２ル又はグツスミノーダン含有カゼインインジケータｒル上では検出できな −、同じ方法に供されたｔ−ＰＡは、プラスミノ−ｒン含有カゼインインジケータデル中でも溶解貴翰を形成する。

従って、精製され比活性剤ｖ−ＰＡβの活性は、平均分子量４３０００±２０００（還元条件下にＳＤＢポリアクリルアミド電気泳動で、第４Ｂ図）ｔ−有する蛋白質と同じであり、プラスミノ−ｒンをフィブリンの存在下にプラスミンに変え、線維物質フィブリンを溶解させる。力ぜインの存在でもプラスミノ−ｒ　ｙ　ｆ活性化することのできるｔ−ＰＡとは対照的に、ｖ−ＰＡβは、カぜインの存在でプラスミノ−ｒンをプラスミンに変換することは不可能である。

更に、本発明は、次の例に基づ１！特徴付けることができる：例　２吸血コラモリ（Ｄｅｓｍｏｄｕｓ　ｒｏｔｕｎａｕ８　）の唾液からのｖ−ＰＡ α１及びＶ−ＦＡ／の分離及び精製（ａｌ　Ｚｎ”＋ケレートセファロース　クロマトグラフィ唾液２０ｄｔ４℃、６０００Ｉｉで遠心する。上置みｔ　２０　ｍＭ　）リス（ｐｔ４７．５　）　／　１００　ｍＭＮａｃｔ及び０．０５％プル４ニツクＦ６８で調整する。クロマトグラフィ管にＺｎ”＋ケレートセファロース（１０ｍＭトリス（ｐｆ（７，５）　／　１００　ｍＭ　ＮａＣｔ／　１ｍＭイミダゾール１０．０５チグルａニツクＦ　６８０．０５チで平衡化されｍ１ｓｄを充填し、唾液上置入をこの上からクロマトグラフィにかける。カラムを平衡化緩衝液で洗浄する。その後１０　ｍＭ　）リス（ｐ）１７．５　）　／　Ｉ　Ｍ　ＮａＣＬ／　１　ｍＭイミダゾール／　０．０５１プルロニックＦ’、５８を用いてまずｖ−ＰＡα１ｔ−溶離させる（これはなお少量のｖ−ＰＡ／を含有する）（第５図）。次いで、なお少量のｖ−ＰＡα１を含有するｖ−ＰＡ／　ｆ　１ｍＭ　）リス（ｐｉ４７．５）／１００ｍＭ　ＮａＣ４／　０．０５　’ ｌｌｒプルロニックＦ’６８中の１〜５ｍＭイミダゾール勾配溶液を用いて溶離させる。

←−→　フィブリン溶解活性第５図：　唾液のＺｎ”＋　ケレート　セファロース　クロマトグラフィｔｂ＋　ヒドロキシアパタイト　クロマトグラフィクロマトグラフィ用カラムにヒドロキシアパタイト８ｄを充填し、５　ｍＭ　）リス（ｐ）（８，０）１５００ｍＭＮａＣｔ／　０．０１　％プルロニックＦ６８で平衡化させる。

Ｚｎ”＋ケレート　クロマトグラフィ（第５図）からのプールをヒドロヤシアパタイトカラム上に通し、平衡化緩衝液で洗浄し、ｖ−ＰＡを、５００　ｍＭ　ＮａＣ２／　０．［１１チプルロニツク？６Ｂ中の０．５〜１［１０ｍＭ燐酸ナトリウム勾配溶液で溶離させる（第６図）。活性フラクションをプールする。

第６図　Ｚｎ”＋ケレートクロ！トグラフイからのプールのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ（ｃｌ　！ｒ”ル濾過ヒドロキシアパタイト　クロマトグラフィ（第６図）からのプールｔ−２０ｍＭ　）リス（ｐＨ８，０）／１６０ｍＭＮａＣＬに対して透析させ、凍結乾燥によｒ）０．６ｍｌまで濃縮する。この濃縮物ｆ：ＦＰＬＣ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）を用いてスペロース１２ＨＲ１６１５０カラム上のクロマトグラフィにカーける（第７図）。

第７図　ヒドロキアパタイトクロマトグラフイからのプールのビル濾過このビル濾過の活性フラクションのａａ物を、非還元条件下のＳＤ８ポリアクリルアミドｒルビル泳動を用いて分析し、その後、このビルをクマシーデルー（（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ　）で染色すると、分子量４３０００を有する蛋白質バンドが可視になる（第８図）。

圓３０００Ｇ　− 第８図　第７図のビル濾過からのｖ　−ＰＡα１のＳＤ８ポリアクリルアミド電気泳動、Ｍ−マーカー蛋白質の分子量第８図から明らかなよりに、ｖ−ＰＡα、は他の蛋白質を含有しない。この精製されたｖ−ＰＡα１も、例１Ｃに記載されているように、インジケータビル（フィシリン　チモグラフイ）中で同じ分子量４’３０００ｔ−有する溶解電輪を生じる。この溶解牽輪も、もっばらプラスミノ−ｒン含有フイデリン　インジケータビル上に認められるが、プラスミノ−ｒン含有カゼインインジケータビル上には認められない。

例　６ｖ−ＰＡα、及びＶ−ＰＡＩのエリトリナ・ラテイシ−ｅｒ　（Ｋｒｙ−ｔｈｒｉｎａ　ｌａｔｉｓｓｉｍａ　：　ＥＴＩ　）の種子からのトリプシンインジケータＤＥ−３への結合及び溶離ｇＴＩ　（ｇｒｙｔｅｃｈ　８ｅｒｖｉｃｅ　ＬＴＤ、　Ａｒｃａｄｉａ、　５ｏｕｔｈ　Ａｆ−ｒｉｃａ　）　５０ｒｎ９を、製造者データに従って、活性化され７’ｊ　ＣＨセファロース４　Ｂ　（ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　６．６　＆に共有結合させる。Ｉ　Ｍ　）　ＩＪス（ｐＨ６，８）　’ｔ−用いて、唾液１６ゴを、Ｊ（７，５に調節し、４℃及び６０００．９で１０分間遠心させる。クロマトグラフィ管ＨＲ１０／２（ｐｈａｒｍａｃｉａ　）に、ＥＴＩ　ＣＨセファロース、ｉＢ（前記参照）２ｍｌｔ充填する。

ＦＰｔ、Ｃ系（ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　ｋ用いて、この親和性クロマトグラフィ処理を行なう。この几めに、唾液上室みｌ　ｌＩｃＴｌ　ＣＨセファロース４Ｂ上に通し、’ｌ　Ｑ　ｍＭ　）リス（ｐＨ７−５）　／　Ａ　００　ｍＭ　ＮａＣ２１０，０１％プルンニックで充分に洗浄する。溶離は２０ｍＭ　）　リ　ス　（ｐＨ７，５）　／　４　０　０　ｍＭＮａｃｔ／　１．６　ＭＫＳＣＮｌｏ、０１％プルロニックＴ？６８ｔ−用いて行なう。この工程の間に、フィブリン溶解活性及びアミド分解活性が１蛋白質−一りと共に溶離される。

フラクション第９図；　ＥＴＩセファロース４Ｂクロマトグラフィこのクロマトグラフィを非還元条件下に、ＳＤＳポリアクリルアミドデル　クロマトグラフィを用いて分析すると、２つのｖ−ＰＡ形ｖ−ＰＡα１及びＶ−臥０（著るしく濃縮されていることが確認できる。

この唾液のバッチ中に現われる２つの分子ｖ−ＰＡ形は、前記条件下にｇＴＩ　 −ＣＨセファロース４Ｂに結合し、１．６Ｍ　Ｋ８Ｃ’Ｎ又は他のカオトｏｇツク（ｃｈａｏ　ｔｒｏ−ｐｉｃ　）化合物の存在で溶離させることができる。

例　４ヘパリンセファロースへ活性剤ｖ−ＰＡαｔ　及（Ｊ　ｖ−ＰＡβアロース（ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　１　ｒｌＬｌを充填する。ＥＴＩ　−ＯＨセファロース４Ｂクロマトグラフイからのフラクション１８（例３、第９図及び第１０図）　ｔ　２０　ｍＭ　ト１ノス（ｐＨ７，５）　／　５０　ｍＭ　ＮａＣ２／　０− ０１　％プルロニックＦ６８に対して透析させ、ＰＦＬＰ系（ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　ｔ”用いてヘパリンセファロース上のクロマトグラフィにかける。透析物の装入の後に、カラムを２０ｍＭトリス（ＦＪ（７，２）　／　５０　ｍＭ　ＮａＣ２／　０．０１　ＴｏプルロニックＦ６８で洗浄し、次いで、２０ｍＭトリス（ｐ）！　７．２　）　１０．０１　％プルｏニックＦ６８中の５０〜１０Ｃ］ＯｍＭＮａＣｔ勾配溶液で溶離させる（第１１図）。

グラフィＨ２５２６２フ　２８　２９　３０ヘパリンセフアロース　クロマトグラフィを用いて、例えば分子形ｖ−ＰＡα、及びｖ−ＰＡβを結合しかつ溶離させ即ち精製することが可能である。第１１図及び第１２図から明らかなように、分子’Ｖ−ＰＡ形、ｖ−ＰＡβは、ヘパリンセファロースに分子ｖ−ＰＡα１形よりも弱く結合し、即ち、ｖ−ＰＡβの溶離の九めには、ｖ−ＰＡα１の溶離の九めに必要であるよジも低いＮａＣ１濃度が適当である。

従って、この例に記載のクロマトグラフィ法を用いると、２ｆｌのｖ−ＰＡ形を相互に分離することが可能で活性剤ｖ−ＰＡα１及びｖ−ＰＡβのフィブリンセライト（Ｃｅ１ｉｔｅ　）への結合及び溶離親和性媒体フィブリンセライトは、公知方法で製造される（　Ｈｕｓａｉｎ、　Ｓ、　Ｌｉｐｉｎｓｋｉ　、　Ｂ、及びＧｕｒｆ３＊ｌ　Ｃｈ　ＩＶ、のＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７８．４２６５〜４２６９．１９８１）。このフィブリンセライト物質ｉｍｔりｏマドグラフィカラムＨＲ５／　５　（ｐｈａｒｍａｃｔａ）中に充填する。

ＥＴＴ　−ＣＨセファロース４Ｂクロマトグラフィ（例３、第９図及び第１０図）からのフラクション１７を２０　ｍＭ　）リス（ｐＨ８−０）　／　２０　ｍＭ　ＮａＣ６／　ｏ、ｏ　１　％プルロニックＦ６８に対して透析させ、フィブリンセライト上で、Ｆ’ＰＬＣ系（ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　を用いてクロマトグラフィにかける。透析され几フラクションの適用の後に２０　ｍＭ　）リス（ｐＨ８−０）　／　２０　ｍＭ　ＮａＣ４／　０．０１チプルロニツク１６８を用いて洗浄し、こうして見出された活性剤ｔ　２０　ｍＭ　）リス（ｐＨ８，０）　１０．０１　％プルロニックＦ６８中の２０〜１０００　ｍＭＮａｃｔの勾配溶液で溶離させる（第１３図）。

フラクション第１６図　ＥＴＩ−ＣＨセファロース４Ｂ上で精製されたＶ−ＦＡ活性剤（ｖ− ＰＡα□及びｖ−ＰＡβ）のフィブリンセライトクロマトグラフィＶ−ＰＡ−含有フラクション全ＳＤＳポリアクリルアミドビル電気泳動に供する（第１４図）。

第１４図フィブリンセライトクロマトグラフィ（第１３図）からの活性剤含有フラクションの非還元条件下での１２．５％濃度８０Ｂポリアクリルアミｐｒル電気泳動、引続くりマシーブルー染色。

Ｍ：　マーカー蛋白質の分子量、数字は第１３図からのフラクションに相当活性剤ｖ−ＰＡα１及びｖ−ＰＡ／は、低いＮａＣ２濃度で、フィブリンセライトに結合し、再び緩衝液中のＮａＣ２濃度の増加により溶離されうる。この工程の間に、ｖ−ＰＡβは明らかにｖ−ＰＡα１よりも弱くフィブリンセライトに結合することが観察される。それというのも、ｖ−ＰＡβとは対照的にｖ−ＰＡα 、形は高いＮａＣｔ濃度でのみ溶離するからである。従ってこの精製法は、Ｖ− ＰＡ７１とｖ−ＰＡα、との分離の几めにも使用できる。

例　６精製ｖ−ＦＡ形ｖ−Ｆ’Ａα、及びｖ−ＰＡβのＮ−末端アミノ酸１、第４図）を含有するフラクションを、適当なＭ菌液に対する透析の後に、非還元条件下での１２．５％ポリアクリルアミドｒビル気泳動にかける。電気泳動を行なつ几後に、このビルを電気泳動装置がら取り出し、慣用方法（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ　Ｐ、にょるＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｓｍ、　２６２．１００３５〜１０（］！＋８．１９８７年参照）により、ポリビニリデン　ジフルオリド膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｅｎ、　Ｍｉｌｌニー外科用メスで削り取り、オートマチック４７７Ａプロテインシーケンサ−／　１２０　ｋ７ｆライ”）’−（ＡｐｐｌｉｅｄＢｙｉｏｓｙａｔｅｍ　ＵＳＡ　）中で、Ｎ−末端アミノ酸配列を直接測定する。この分析を繰り返し行なう。次に示す配列が認められる：ＡＬａ　Ｔｙ′ｒＧ１７　Ｖａｌ　ＡＬａ　Ｘ　ＬＹＳ　Ｘ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　（）ｉｎ　ｍｔ　Ｔｈｒ　？　ＡｒｇＡｄａ　Ｔｙｒ　Ｇ１７　（）ｌｙ　Ｘ　ｅａｒ　Ｇｌｕ　Ｔｉｕ　Ａｒｇ　Ｃ’ｆＢ　Ｆｈｅ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　’Ｉｈｒ　Ｘ　fｌｎ　Ａｌａ　Ａｌａ（Ｘ−明白に測定されなかつ九）このよりに測定され次配列を用いて、吸血コラモリ（Ｄｅｓｍｏｄｕｓ　ｒｏｔｕｎｄｕａ）の唾液腺から、ｃＤＮＡバンクをスクリーニングし７ｔ（例１８）。

２５　例　７例１により精製され九活性剤Ｖ−Ｐｋβとｔ−ＰＡとのプラスミノ−ダン活性の比較特異的なプラスミノ−ｒンアクチベータ（ｐＡ）’を適当な高濃度のプラスミノーゲン（ＰＬＯ）　ト共に、緩衝液環境例えば５　Ｑ　ｍＭ　）リス（ＰＨ７，４）　、２０　ｍＭＮａＣｌ　中、５７℃でインキュベートすると、次の１埋に従ってグラスミノが形成される：ＰＡ　＋　ＰＬＧ　（±促進剤）二〔ＰＡ／ＰＬＧ（±促進剤）〕 ↓ｒＰＡ＋プラスミン（±促進剤）こうして形成され九プラスミンは、このプロテアーゼに関して広範囲に特異的な色属性トリペプチドＨ−Ｄ　−Ｖａｌ　−Ｌａｕ　−Ｌｙｓ−ｐＮＡ　（Ｓ　２２５１　）により検出されうる。この反応は、次の１埋に従って進行する：グラスミノ　＋　Ｈ−Ｄ　−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ↓ｒ〔プラスミノ／　Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ　）↓ グラスミノ＋ｐＮＡｐＮＡ　（ｐ−ニトロアニリン〕の製造割合は、４０５ｎｍで測光法により測定でき、酵素プラスミンの濃度に比例する。この２つのｙＫ埋を組み合せることにより、グラスミノ−ｒンアクチベータの活性の表現であるプラスミノの形成割合を測定することが可能である。第１５図は、促進剤フィデリノーｒン（凝血基質）及びフィブリン（溶解されるべき立坑中の線維質）の不在及び存在下におけるｔ−ＰＡ及びｖ−Ｐへのプラスミン形成割合を示している。

第１５図このテストは９６穴マイクロ滴定グレート上で行なう。各々の穴の容量は２２０ μｔである。プラスミノｆンの濃度は（１，５μＭ、　ＩＩ　−Ｄ　−Ｖａｌ　 −Ｌｅｕ　−ＬＩＹ８−ｐＮＡの濃度は０．６８　ｍＭ、ｔ−ＦＡの濃度は０．０５　Ｉ［Ｊであり、国際土塊溶解検定法（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、　Ｃ１ｏｔ−ＬｙｓｉｓＡｓｓａｙ　ｊ　Ｇａｆｆｎｅｙ　ｌ　Ｐ−Ｊ　−Ｃｕｒ　ｔｉｓ＋　Ａ−Ｄ−１ＴｈｒＯｍｂ０８゜Ｈａｅｍｏｓｔ、ａｓ＋　５５　：　１５４〜１３６．１９８５参照）により測定され７ｔｖ−ＰＡの利用活性は、１０倍高い、即ち約０．５Ｕである。促進剤の濃度は約２０μｇ／穴である。

従って、ｔ−ＰＡは、促進剤の不在でもグラスミノ−ｒンｔかつ７＋プリノーダンの存在でも非常に高い活性化割合で活性化する。この記載検定においては、Ｖ −ＰＡは繊維物質の存在下でもっばらプラスミノ−ｒンを活性化する。

例　８ｖ−ＰＡα１及びｖ−ＰＡβの血栓溶解作用とｔ−ＰＡのそれとの比較新規活性剤の血管溶解作用を、新しく開発され九マイクロークロッドーリシスアッセイ（ＭＣＬＡ　）により、ｔ−ＦＡと比較して検査する。それぞれ、新鮮なヒト全血１００μｔｋマイクロ滴定プレートの穴の中にピペットで入れ、それぞれ凝血剤（”　ＴｈｒｏｍｂｏｒａＬ″、　Ｆ！Ｂｈｒｉｎｇ−Ｗｏｒｋｓ　）　１０μｔと一緒にし、３７℃で１時間インヤニベートする。生じ几立坑を、これらを、遠心により予め得られた自然存在の血漿１００μｔと一緒にする前に燐酸塩緩衝塩化ナトリウム溶液（ＰＨ１）で２回洗浄する。この血漿を引！！きｔ −ＰＡ及びそれぞれ１．５６〜１２．５１Ｊ／ｄの濃度のｖ−ＰＡと一緒にする。このように処理され九マイクロ滴定グレートを湿気の多い室中、３７℃で１８時間貯麓する。インキュベーション期間の経過後に、このプレート全振動台（Ｒｅｄ　Ｒｏｔｅｒ）上で振動し、その際、血莱樟本を各々の穴から取り出し、再蒸留水で１：乙に稀釈しく溶解により放出され九赤血球細胞を破裂させる）、こうして放出され几赤血球色素をマイクロ滴定プレート７オトメータ中、ｄ　９２　ｎｍで測光法により測定する。

試験管内でのヒト全血塊溶解ニープラスミノーｒンアクチペータの作用−第１６ａ図このテストの結果は、第１Ｓａ図及び第１６ｂ図がら明らかである；標準ｔ−ＰＡとの比較において、新規活性剤の均等作用濃度（国際土塊溶解検定法で測定して）は、ｔ−ＰＡよジも良好にヒト全血血栓を溶解する。

新規活性剤ｖ−ＦＡ／の約３　ｔｙ　／　ｍｌですら、このテストモデルで、著るしい血栓溶解作用を示し九が、ｔ−ＰＡ３Ｕでは対照との差を示さない。

同様な実験でｔ−ＰＡ及びｖ−ＰＡによりヒト全血血栓溶解の時間依存性を調査する。

各＆　ｔ−ＰＡ及びｖ−ＰＡの６．２５　Ｕ及び１２．５σを、前記糸中、５７ ℃で２５時間インキュベートする。１５時間後に、試料を２時間毎に取り出し、測光法テストの几めの記載のように調製する。結果を第１７ａ図及試験管内での全立坑溶解第１７ａ図　時間（ｈ）血栓からの赤血球の放出として測定される血栓溶解の開始は、ｔ−ｐＡによるよりもこの活性物質により明らかにより迅速である。新規活性物質の６．２５単位は、２３時間後にｔ−ＰＡの２倍にも増大され几立役溶解を示している（　１２．５単位）。

例　９セリンプロテアーゼは、特に活性部位滴定質ジインプロピルフルオロホスフェート（ＤＩＦＰ　）　ト特ｘ的ｉｃ反応するこの目的の友めに、活性剤ｔ−ｐ）１８．０に緩衝させ、１：２０の割合でプロピレングリコール中の３　Ｈ−ｏｒＦｐと混合する。このバッチを室温で１晩インキユベートする。このバッチの少量を非還元条件下での１２．５　％ＳＤＳ　ｒル上で分離させる。次いで、この’ｉ’／Ｉ／ｌｚアングリフアイ（Ａｍｐｌｉｆｙｉ　Ａｍｅｒｓｈａｍ　）中、室温で３０分インキュベートし、引続き乾燥させる。次いでこのｒルを４日間露光し、引続きこのＸ−線フイルムを現象させる。その中に配合され比放射能標識され几ＤＩＦＰを有するセリンプロテア− ぜは、黒色バンドとしてこのフィルム上で可視になる（第１８図）。ｔ−ＰＡは、例えば、見掛は上の分子量７５８０００±５０００ｔ−有する僅かな黒色主バンドを生じ、これとは対照的に、新規活性剤は、分子量３９０００±２−００ＣＩ！する強い黒色主バンド（ｖ−ＰＡβ）及び４３０００±２０００での黒色バンド（ｖ−ＰＡα、）ヲ示す。

同じ電気泳動条件下で得られた対照ｒルｉｉ＊トリトンＸ−１００で洗浄し、引続きフィブリン−及びプラスミノ−ｒン含有インジケータデル上に置く。電気泳動にかけられ比活性剤の活性の位置は、３Ｈ−ＤＩＦＰ標識セリンプロテアーゼの黒色バンドと一致しており、この活性剤の活性ｇ理を表わしている。

３種の異なる濃度で配置された、３Ｈ−ＤＩＦＰ−処理された活性剤のオートラジオダラム例１０試験管内でのｔ−ＰＡ及びｖ−ＰＡβのフイデリノーデン！！二−−一−一一一 −一−−−−−−−−−−ヒト血漿中、３゛７℃でｔ−ＰＡ　ｔ−インキュベートする際に、凝固しうるフイブリノーゲンの濃度は時間に応じて減少する。これは、ｔ−ＦＡの相対的フイデリン特異性に依り、この血栓溶解剤の特性である。

凝固しうるヒトフイプリノーデン３〜と５０　ｍＭ　）リス（ｐＨ７，４）　Ａ　ＯｍＭ　ＮａＣ４それぞれ１１Ｌｔから溶液を製造し、この溶液をとトゲラスミノ−ｒン１μＭと一緒にする。

バッチの少量分を、ｔ−ＦＡ５．１　Ｕ％　６．２５　Ｕ及び１２．５Ｕと一緒にし、かつそれぞれｖ−ＰＡの同じ活性と一緒にする。プラスミノ−ｒンアクチペータ不含の第３のバッチを対照とする。各処置群当り各々６バツチを使用する。プラスミノ−ｒンアクチベータの添加の直後に、全てのバッチからそれぞれ少量分を取り出し、クラウスによる方法（Ｃ１ａｕｓｓ、　Ｖ、Ａ、　Ａｃｔａ　Ｈａｅｍａｔｏｌ。

１７：２！１７〜２４６．１９５７参照）を用いて凝血しうるフィブリノ−ｒンを測定する。この少量分の１部を更にｒルミ気泳動で分析する。更に、３７℃でインキュベートされ几このバッチからの少量取り出し分ｔ−２，４及び６時間後に得た。フイデリノーＹン測定の結果を第１表に示す。

第１表シ冒ン時間（ｈ）ｕｚｓｚ　ｔｔ、ｓ　ｔ、ｚツ　３，１　’　ＩＬツ　６．２ツ　コ、ｌ　ｏｆ工ａ＠　ｔｓｓｓ　１，７　・、１　１＠、５　１ｇ１，３　１＠、暑　１４１４　（廖１ζ］１１１、ＩＩ　１．１１１１．１　１＋１．４１．？　１０，４　１．？ｆ１１．ｆ１．４Ｌ、ＳＩ＠、１１１１．＠０１．コＳ、ＳＨ，Ｉ　Ｉｆ、コ　１０．１　１＠Ｊ　１．７　・、９嘗、ＳＨ，Ｉ　１言、＋＋　１＠ｊ　１．４　會、・　９．春　９．７１２、？　Ｉｆ、２１０．？　ｌ、Ｔ　１．Ｔ　１．４　・ｌ＠７　１１ｊ　１１，１　Ｈ，ｌ’　＋１１．ＩＨ，！　１１．！　＋１．＋＋　Ｎ、１曾２．７ＩＩＩ・０４１１，０上ユニ立　１１１３　嘗１，１　＋０，５　Ｈ，１１１＋番　璽１４　１０ｊ　盲１．９ＨμＩＩμ盲Ｏ９＠１れＯ曾ｔ、４１１，４　＋０４　１Ｌ１１４　１４．５　１ｆｆ、１　１２．Ｉ　Ｈ，４雷２．＋１３．１１１４唱２．５１１ｊＬｌ　１４１１　１コー　１２，４　１！、Ｓ１＠、Ｉ　ロ、−１１，２１− 〇、＋　０４　１２，４１１、＠　目、７　１２．１＄嘗コ、１１４．４１７．＠１２．２１３．１１Ｌ＠１コ、ＩＩコ、Ｉ　Ｉｆ、１　１！４　１２．コ　−１１，１皿　１グ、１１？、ｌ　１３，４　１Ｌ２盲才、コ嘗２．＄１１．１雷コ、ａ１！、ｌ　＋２，２　１コ、コＨＪＨ１，ｌｌ官２．１＋１．２クラウスに依る凝血時間は秒で示されている。インキュベーションの２時間後の早い時期に、ｔ−ＰＡ−含有バッチのいずれも、凝血可能なフィブリノ−ｒ７を示さず、凝血時間は〉５００秒であつ几。これとは対照的に、対照バッチ中でも新規活性剤と一緒にされ几バッチ中でも、フィブリノ−ダン分解の徴候は認められない。この実験ａ、ｔ−ＰＡと比べ几新規活性剤ｖ−ＰＡβの充分に高い（絶対的ではないとしても）フィブリン特異性を示している。

ｒルミ気泳動により実施され几少量分の分析において、更に、この新規活性剤を有するバッチ中のフイデリノーデンは、６時間のインキュベーションの後にも対照バッチ中のフィブリノ−ｒンとは区別できないが、ｔ−ＰＡ　’ｉ有するバッチ中では、単に２時間後に、分解され几フイデリノーｒンが検出でき九。

例１１攬々のプラスミノ−ｒンアクチベータ及びｖ−ＰＡα、試験容器中で、ＰＢ８　／　０．０１　％ツイーン８０中のプラスミノ−ｒン不含フイデリノーダン（２Ｉｎ９／ｍｊ）１００μｔ１種々の濃度の相応するプラスミノ−ｒノアクチベータ１０μを及びトロンビン（０，！ＩＵ）１０μｔを５７℃で丁０分間インキュベートする。次いで、このように形成され几フイデリンｔｉｏｏｏｏ、ｐで５分間の遠心により除去し、上置み中で残留プラスミノ−ｒンアクチベータ活性を、フィブリンプレート試験法により測定し、出発量と関連させた。これと平行して、同じ条件下に、プラスミノ−ｒンアクチベータ溶液をフィブリン不含で製造する（対照：結合なし）。

プラスミノーデン不含のフィブリンへのＰＡの結合ｔ−ＰＡ　αメーＰＡ　βｖ −ｐ＾　容ζｕ−Ｐ＾第１９図ｖ−ＰＡα１は、ｔ−ＦＡと同様に良好なフィブリン結合を示す（第１９図）。

これとは対照的に、ｖ−ＰＡβは、ｖ−ＰＡα１よりも著るしく弱いフィブリン親和性を示す。

ｖ−ＦＡ７により示されるこのフィブリン親和性は、更に強（ＮａＣｔ濃度に依存する（第１９図）。

例１２ｔ−ＰＡ及びｖ−ＰｋｊｌによるＧｌｕ−プラスミノ−ｒン作囚　１容器中で、プラスミノ−ｒンアクチペータ２０μｔ、２ｍＭ）リスＣｐＨ７，４）７６００ｍＭ尿素中のフィブリンモノマ−（６０μｇ／ＩＲ１）　１０μ乙、プラスミン不含のグラスミノ−ダン（全バッチ中００〜６μＭの変動性濃度）　５０　ｔｔｌ　ｔ　２０　ｍＭ　）リス（、ｐＨ７，４）及び２０　ｍＭ　トリス（ｐＪ（７，４＞　／　０．０１％ツイーン８０　１７０μを中、３７℃で攪拌下にインキュベートする。

ＣＢ＋　付加的な試験管内で、それぞれ、水中の色原性のプラスミン特異性基質８２２５１（３ｍＭ）１００μを及び２０ｍＭトリス（ｐＨ７，４）　／　１８０　ｍＭ　ＮａＣｔ４００μｔ′ｆ−５７℃で準備する。

種々異なる時点で２０μｔを囚から取り出し、管ＣＢ＋中に移し、３７℃で更に１時間インキュベートシ、１Ｍクエン酸５００μｔの添加により反応を停止させる。

このインキュベーテイングバッチ中に形成されたプラスミンは、り−ニトロアニリンを放出を伴って色原性基質５２２５１のペプチド基を分離する。このｐ−二トロアニンンを、４０５μｍで測光法により測定する。

前記の反応式と同様に、純粋プラスミンを用いて較正曲線を作り、°これから、こうして形成されたプラスミンの濃度を直接計算することができる。

第２０図（ｖ−ＰＡβ）及び第２１図（ｔ−ＰＡ）中に、前記で得られ几データを示す。この几めに、プラスミン形成割合ｖｆプラスミン濃度に対してプロットする。

天然ｖ−ＰＡ／＋モノマーによるＧ／ｕ−ｆ５スミノーｒン活性の反応速度ｔ− ＰＡ＋モノマーによるＧ　／ｕ−シラスミノ−ダン活性の反応速度第２１図ｔ−ＰＡの場合には、典型的なミバエリスメンテンの反応速度論が得られる。このｔ−ＰＡデータをラインウニバー−パーク（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ　）プロット中に移す（第２１図に挿入）と、直線が得られる。

ｖ−ＰＡβデータをプロットする際には、まったく異なる図が得られる。プラスミノ−ｒンアクチベータｖ−ＰＡβは、ｔ−ＰＡのそれとは異なる反応速度特性を示す。得られた曲線は、ミバエリスメンテンの反応速度論には従かわず、むしろアロステリック酵素の典型的な経過を示し、ラインウニバーパークプロットもアロステリック酵素の典型的な曲線を示す（第２０図）。

ｔ−ＦＡとは対照的であるプラスミノ−ｒンアクチベータｖ−ＰＡβはアロステリック酵素である。

例１３再構成立坑溶解糸上でのｖ−ＰＡβの作用（国際立坑溶純粋ヒトグラスミノーダンは、一定量のヒトプラスミノ−ダン及び種々の濃度のグラスミノ−ｒンアクチベータの存在において、トロンビンに共に凝血させる。

こうして形成された血流中で、プラスミノ−ダンはプランミノ−ｒンアクチベータによりプラスミンに変えられ、このプラスミンそのものは、血流中の線維質フィブリンを溶かす。トロンビンの添加と土塊の完全溶解との間の時間を測定し、グラスミノ−ｒンアクチベータ濃度に対して二重対数的にプロットする。前記厘埋に従って、精製され几活性剤の緩衝溶液１２．５〜１００μｔを試験し、ｔ− ＰＡの１２．５〜１００ＩＵと比較する。結果ｔ−＄２２図で説明する。

新規活性剤ｖ−ＰＡβは、ｔ−ＰＡと比較して、平行な濃度作用曲線を生じる。

精製され几活性剤の溶液の１００μｔは、この試験データによれば、ｔ−ＰＡ− 比較可能活性的４ＱＵを有する。

試験の詳細：凍結乾燥され几試験トロンビン（Ｂｅｈｒｉｎｇ　１Ｍａｒｂｕｒｇ）を蒸溜水１ｍｌ中に溶がす。これは、３０ＩＵ／ｄの活性を生じる。ヒトプラスミノーゲン（Ｋａｂｉ　、−ｃｈ　）ｔ　２　ｍＭ　ＨＣ２＋　５０　ｑｂグリセリン＋ＰＥ（）６０００　５Ｊｉｌ／を中に溶かす。結果は、１０ＩＵ／ゴの活性である。

ヒトフィブリノ−ｆ　７　（Ｋａｂｉ、Ｍｕｎｉｃｈ　）　ｔ’、次の組成：　ＫＨ２ＰＯ４１−６０５ｊｉ　／　ｔ　−Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２０８−５８ｉ／ｌ、　ツイーン８０　１Ｄｏｔ／ｌＸ　Ｈ８Ａ３００ダ／ｌを有する燐酸塩緩衝液中の凝固しうる蛋白質２ｗＬｔ／ｌの濃度にする。標準ｔ−ＰＡ全１０００１Ｕ／ゴの活性まで稀釈する。

グラスミノ−ｒン２０μｔ＋トロンビン１００μｔｔ試験管内にピペット装入し、３７℃でインキュベートする。同時にフーイゾノーダン１ゴ及びプラスミノ− ｒノアクチベータ１２．５〜１００μｔを加え、ストップウォッチを始動させる。２分後に、立坑上にがラスピーズ（直径６　ｗａｇ　）を置く。がラスビーズが試験管の底に達し几らストップウォッチを止め、時間を記載する。

例１４溶解素（Ｌｙｓｉｎ　）セファロース４Ｂへのｖ−ＰＡ／及びｔ−ＰＡの結合グラスミンアクチペータを相応するーにし、この条件下で溶解素委セファロースで処理する。この溶解素Ｉや贈χセファロースを充分に洗浄し、集め几装置み中で活１字帛−性を測定する。少量のｖ−ＦＡ用いては溶離実験は実施できながつ几。

第２３図溶解素セファロースへのｖ−ＰＡβ及びｔ−ＦＡの結合例１５ｖ−ＰＡβ及びｔ−ＰＡのカゼイン溶解プラスミノーダンアクチベータの活性は、いわゆるフィブリンプレートテスト（Ａｓｔｒｕｐ　Ｔ、及びＭｕｅｌｌｔｉｌｒのＡｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　ｄ　０１３４６〜３５１．１９５２）により測定できる。グラスミノ−ｒンアクチベータを予め打ち抜かれ九人中で３７℃でインキュベートする。プラスミノ−ｒンの存在の場合には、こうして形成され°几プラスミンはフィブリンを良好に溶解し、溶屏貴翰が形成され、その直径は使用プラスミノーグンアクチベータの濃度に依り決まる。

フィシリン特異性プラスミノ−ｒンアクチペータから、これはフィブリン以外の蛋白質を攻撃しないことが予恵される。これは、ここに記載の方法で、フィブリノをカゼインに代えてプラスミノ−ｒンを用いて試験することができる（第２４図）。

第２４図ｔ−ＰＡと比較したｖ−ＰＡ／のフイデリン特異性試験第２４図から明らかなように、ｖ−ＰＡβは、ｔ−ＰＡとは対照的に、プラスミノ−ｒン含有カゼインプレート上で何ら溶解貴翰を示さない。これは、Ｖ−ＰＡβの絶対的ブイプリン特異性を示している。

例１６プラスミノーダンアクチペータｔ−ｐＡ、つ筒キナーゼ、及びＶ−ＰＡα１及びｖ−ＦＡ／の活性形を用いる種々の９６穴プレート中で、各々１００吐トリス（、ｐｉ４８．０　）　／　１００　ｍＭ　Ｍａｃｔ／　０．０１　％ツイーン８０９゜１１１及び相応す−る色原性基質（Ｋａｂｉ　Ｖｉｔ、ｒｕｍ、　Ｓｔａｃｋｈｏｌｍ。

５ｖｒｅｄｅｎから）５０μｔを、０．０３／Ｃ１，０６１０，１１０，３／　０．６及びｉｍＭの最終濃度で、相応するプラスミノ−ｒノアクチベータ１０μ ｔ（１大当９３単位）と共に３７℃でインキュベートし、こうして放出され几ｐ −ニトロアニリンを、０〜７時間の間の種々の時点で測光法により４０５　ｎｍで測定する。得られるデータをラインウニバーパークプロットを用いて評価し、Ｋｍ値金測定する（　Ｓｅｇｅｌ、　１．Ｈ，Ｅｎｚｙｍｅ　Ｋｉｎｅｔｉｃｓ。

Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ、　Ｎｅｖｒ　Ｙｏｒｋ　）。次の色原性基質を用い友：Ｈ−ｃ＋−ｖａｌ−Ｌｅｕ−ｔ、ｙｓ−ｐＮＡ（Ｓ−２２５１）Ｈ−Ｄ−ＩＬｅ ’−Ｐｒｏ−ＡｒＳ−ｐＮＡ（８−２２８８）＜ｏｌｕ−ｏｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（ｓ−２４４４）次のＫｍ値（ｍモル／１）が測定され几：プラスミノーーン　Ｓ−２２８８８−２４４４ｔ、　−Ｐ　Ａ　Ｏ，７（１，０）　２．０ウロキナ−（ｐＯ，、ｉ（０，２）　０．１（０，０９）ｖ−ＰＡαｔ　１−０２．０ｖ−ＰＡβ　２．０　２．０括弧内の値は、文献（Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇｅｒ　Ｐ、　５ｃａｎｄ、　Ｉ。

Ｃ１１ｎ、　Ｌａｂ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　４２−追補１．６２．１９８２）から採用し几。

Ｖ−ＰＡα、及びｖ−ＰＡβの活性剤形は、ｔ−ＰＡの場合におけると同様な馳値を示している。ｖ−ＰＡαｌ、Ｖ−ＰＡβ及びｔ−ＦＡは色原性基質Ｓ−２２５１での変換を示さな一〇例１７吸血コラモリ（Ｄｅｓｍｏｄｕｇ　ｒｏｔｕｎｄｕｊ　）の唾液腺からのプラスミノ−ｒンアクチベータに関するセグメント吸血コラモリの唾液腺からの全ＲＮＡ　’ｉ　、グアニジニウム　インチオシアネート法に従って単離する（Ｃｈｉｒｇ−ｖｒｉｎ、　Ｊ、Ｍ、　Ｐｒｚｙｂｙｌａ、　Ａ、ｇ、　ＭａｃＤｏｎａｌｄ、　ＲＪ、　Ｒｕｔｔｅｒ。

Ｗ、Ｊ、、阻ｏｃｈｓｍｉｓｔｒｙ　１８　：　５２９４〜５２９９（１９７９））’。全ＲＮＡ　５００μｇ１ポリＡｔ−ＲＮＡ　２５μＪかう、オリゴ″（ｄｔ）セルロース　アフィニティクｏ−ｖトグラフィ（Ａｖｉｖ、　Ｈ，、Ｌｅｄｅｒ、　Ｐ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａａ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　６９　：　１　４０８〜１　４１　２　（１９７２））により単離する。

ｃＤＮＡ合成は、がブレル及びホフマンの方法（Ｃ）ｕｂｌｅｒ。

Ｕ、　Ｈｏｆｆｍａｎｎ、　Ｂ、　Ｇｅｎｅ　２５　：　２６３〜２６９　Ｃ１９８５）〕で、ファルマシアＬＫＢバイオテクノｃＩシイＡ　Ｂ　ＯｃＤＮＡシンテックスキット（ｃＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｘ　Ｋｉｔ　ｏｆ　ＰｈａｒｍａｃｉａしＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＡＢ　）　’に用いて行なり。個々の工程は正確に製造者による指示に従って行なう。ＥｃｏＲＩアダプター（１μ ｌ）を用いて提供された二本鎖ｃ　ＤＮＡと、ｇｃｏＲＩ−カット、脱ホスホリル化されたファージベクターλｇｔ↑０（４μｇ）と金、Ｔ　４−　ＤＮＡりが −ぜを用いて連結させる（　Ｈｕｙｎｈ、　’ｒ、ｖ、　Ｙｏｕｎｇ、　ｋ−臣 ■ｓ＊ｐ、＋Ｗ、によるＰｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

中のＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｏｌｕｍｅ　１．　Ｇｌｏｖｒｅｎ、　Ｄ、Ｍ、　ＩＲＬＯｒｆｏｒｄ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ＋　ＤＣ（１９８５）　）。

このりが−ゼバツチを、パッケージングエクストラクツ（Ｇｉｇａ−ｐａｃｋ　Ｕ　Ｇｏｌｄ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　ＳｔｒａｔａｇＥｌｎｌＬａ　Ｊｏｌｌａ、　ＵＳＡ　）　を用い、この製造者の指示に従って伝染性ファージ中にパッケージする。こうして得られた１次ｃＤＮＡ遺伝子バンクは、組換えλファージ１ｘ１０６を含有する。

２、　ヒト組織特異性グラスミノ−ｒンアクチベータ（ｔ−ＰＡ　）に関するｃ　ＤＮＡ遺伝子の３２ｐ−ラベル配列を有するＣＤ？ＪＡ遺伝子バンクのスクリーニングニックトランスレーション（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　’ｒ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ＋Ｅ、Ｆ、Ｓａｍｋ）ｒｏｏｋ＋　Ｊ、ｌ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ　１９８２　）　）により放射能ラベルさ！’Ｌ７ｔｔ−ＰＡｃＤＮＡ配列（Ｆｉｓｈｅｒ、　Ｒ，Ｗａｌｌｅｒ、　ＦＪ、に、　Ｇｒｏｓｓｉ、　Ｇ。

Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、　Ｄ、　Ｔｉｚａｒｄ、　Ｒ，及びＳｃｈｌｅｕｎｉｎｇ、Ｗ、ＤのＪ。

ヲ、吸血コラモリ唾液プラスミノーダンアクチベータｃ　ＤＮＡの同定用のグローブ（ｐｒｏｂθ）として使用する。

合計５ｏｏｏｏの組換えλファージのＤＮＡ　ｋ　、レプリカ（Ｒｅｐｌｉｃａ　）膜（Ｇｏｎｅ　５ｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ、　Ｄｕ　Ｆｏｎｔ　ｄ。

Ｎｅｍｏｕｒｓ、　ＮＥＮ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓの登録商標）に転移させる。

この漠の処理及びバイブリド形成溶液の組成は、調造者により提供され九データに依る。このバイブリド形成及び洗浄の温度は４２℃である。最終洗浄工程を４　Ｘ　Ｓｅｃ緩衝液中で行なう。

スクリーニングされｔ組換えファージ５００００から、陽性クローン１１が単離された。

陽性クローンのｃＤＮＡ挿入を、標準法に従って、市場で入手される配列決定ベクターＭ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９中に転移クローニングさせ（Ｍｅｓｓｉｎｇｙジデオキシヌクレオチド法（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、　Ｎ１ｃｋｌａｎ、　８゜Ｃ０ｕｌＳＯｎ＋　ｋ、Ｒ−のＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４、５４６５〜５４＜５７（１９７７））に従って配列決定する。ヒ）　ｔ−ＦＡに関するｃ　ＤＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列との個々のクローンのヌクレオチド配列の比較（Ｐｅｎｎ１ｃａ、　Ｄ、　Ｈｏｌｍｅｓ、　ｗ、Ｅ、、　Ｋｏｈｒ、　Ｗ、Ｊ、　Ｈａｒｋｉｎｓ。

Ｒ，Ｎ、、　Ｖｅｈａｒ、　Ｇ、Ａ、　Ｗａｒｄ、　Ｃ，Ａ、、　Ｂｅｎｎｅｔ、　Ｗ、Ｆ、。

Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ、　Ｂ−ｈ　Ｓｅｅｂｕｒｇ、　Ｐ−Ｈ，＊　Ｈ８７ｎｅｋｌｉｌｒ＋　Ｈ８Ｌ、及びＧｏｅｄｄｅｌ、　Ｄ、Ｖ、のＮａｔｕｒｅ　３０３．２１４〜２２１（１９８５））により、高度の配列同一性（〉８０％〕が達成される。誘導された蛋白質配列も、ヒ）　ｔ−ＰＡの部分との高い配列同一性（＞７０％）’ｔ−示す。いずれのクローン（、完全な吸血コウモリプラスミノーダンアクチペータ遺伝子に関するｃＤＮＡ　ｔ−含有しない。

これらのクローンの１つの部分配列は、吸血コウモリの唾液腺からの更なるｃＤＮＡ遺伝子バンクをスクリーニングする之めの試料として役立つ（例１８）。

例１８吸血コウモリの唾液腺からのプラスミノ−ｒレアクチベータの完全ｃＤＮＡクローンの単離、特性化及び配列決定１、　吸血コウモリの唾液腺ＲＮＡからのｃ　ＤＮＡ遺伝遺伝子バグアユジニウムンチオシアネートを用いる消化及び引続く塩化セシウムクッション（１）を用いる超遠心により、吸血コウモ’）　ＣＤ、　ｒｏｔｕｎｄｕｓ　）の唾液腺から全ＲＮＡ　ｉ単離する。凍結乾燥され几全ＲＮＡ　５　Ｉｎｇから、オリチーデオキシ−チミジンセルロース（２，３）上での親和クロマトグラフィの２回実施にょリボＩＪ　Ａ＋ＲＮＡ　８０μｇが得られる。この調製物５μｇを、がデレル及びホフマンの方法（４）の変法（ＺＡＰ　−ｃＤＮＡ　５ｙｎ−ｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ、　Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ　）　（５、６）に従がうｃ　ＤＮＡ合成のために使用する。第１の連鎖の合成を、オリヒーテオキシチミジン部分を含有するオリゴヌクレオチド及び制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩ　（６）の認識配列を用いて開始させ、５−メチルデオキシシチジンの使用を伴なうモロネイ（Ｍｏ１ｏｎｅｙ　）マウス白血病ウィルスの逆転写におり実施する。第２の連鎖を、Ｅ、コリーリボヌクレアーぜＨの存在でＥ、コリーＤＮＡポリメラーゼエにより合成する。こうして形成された二本鎖ｃ　ＤＮＡの末端’１ｉＴｄＤＮＡポリメラーゼで平担化させ、次いでＴ　４　ＤＮＡすが−−ｔ！′を用いてＫｃｏＲＩアダプタに連結させる。生成りＮＡ末端ｔ−Ｔ４ポリヌクレオチドキナ−ぜを用いてホスホリル化する。制限酵素ＸｈｏｌでのｃＤＮＡの消化の後に、セファロースＣＬ、　−４Ｂ　（ｐｈａｒ−ｍａｃｉａ　）上でのｒル濾過を実施する。５００塩基対の最小寸法を有するｃＤＮＡ含有フラクションを集めると、収量はｃＤＮＡ約１．２μｇである。この量の１／３　ｔ”　、スタラタジエン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ　；　ｔ、ａ　Ｊｏｌｌａ　ＵＳＡ　）　（５１７）のバクテリオファージベクターＵｎｉ　−ＺＡＰ　（ＴＭ）ＸＲ（特許出願中）のＢｃｏＲニー　Ｘｈｏｌで制限消化され、脱ホスホリル化され九アーム３μＩと連結させる。この連結バッチをイがパック■ゴールドパッケージングエクストラクツ（Ｇｉｇａｐａｃｋ　［Ｉ　Ｇｏｌｄ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｅｘｔｒａｃｔｓ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　）　（８）　ｋ用いて７個の別個のバッチにパッケージする。こうして、１次ｃＤＮＡ遺伝子バンクが、組換えλバクテリオファージ４　Ｘ　１０’以上を有して得られる。

２、吸血コウモリの唾液からのプラスミノ−ｒンアクチペータのｃＤＮＡクローンの同定完全ｃ　ＤＮＡクローンの同定の九めに使用されるグローブは、第１　ｃＤＮＡ遺伝子バンクから単離され几クローンの５′−末端から７６塩基対の長さく第２６Ｃ図のヌクレオチド１４１〜２１６）のＡｌｕＩ　−ＢａｍＨＩ制限消化により生成されたＤＮＡフラグメントである（例１７参照）。このフラグメントを〔 α−３２Ｐ〕デオキシアデノシン三燐酸の存在でのニックトランスレーション（ａ）により放射能ラベリングし、１次ｃＤＮＡ遺伝子バンクの組換えバクテリオファージ合計１．２　Ｘ　１０ＳのＤＮＡが固定されているレプリカフィルターのバイブリド形成の几めに使用する（１０）。バイブリド形成及び洗浄温度は５０℃である。最終洗浄工程は２　Ｘ　Ｓａｃ緩衝液中で行なう（１０）。レプリカフィルターのオートラジオグラフィで信号を発生しｆＪ：、２００以上のクローンのうち、５０クロニンを分離ブレーティングアウト及び前記プラークフィルターバイブリド形成の繰９反しにより精製する。こうして、３８クローンが単離され、これは、第２スクリーングで明白な陽性信号を生じる。

３、ＣＤＮＡクローンの特性化及び配列決定バクテリオファージの同じセグメント中に組込まれ九ｃＤＮＡフラグメントｌ包含する単離された陽性ＵｎｉｔＺＡＰ　（ＴＭ）　ＸＲパクテリオファーゾクローン中に含有されているプラスミドルゾル−スクリプト（ｐ’Ｂ１ｕｓｃｒｉｐｔ）ＳＫｔ−１いわゆる生体内切出しく７．１４）によりバクテリオファージから取り出し、こうして、陽性バクテリオファージクローンを基幹とする種々のｐブルースクリストＳＫプラスミドクローン合計３５が得られる。このプラスミドを、ピルンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　）　及びドリイ（Ｄｏｌｙ　）の方法（１１）に従って単離し、それらのｃ　ＤＮＡ分を、酵素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩｉ用いる制限分析（第２５図）及び５′−末端のＤＮＡ配列決定に従って４クラスα１．Ｃ２，β、γに分ける。全４クラスの最長ｃＤＮＡクローンのｃ　ＤＮＡ分をバクテリオファージベクターＭ１３ｍＰ１９にサブクローニングしく１２）、かつサンが−（Ｓａｎｇｅｒ　）によるジデオΦジヌクレオチド法（８ｅｑｕｅｎａｓｅ　ｋｉｔ、　Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　ＢｉｏｃｈａｍｉｃａｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、ＵＳＡ　）　（ｆ　３　ｒ　１　５　）　で、部分的にオリゴヌクレオチドプライマー（これは、殊にこの目的のために合成され、ｃＤＮＡプロポーションの配列に対し相補、的である）を用いて配列決定する。

このように誘導され几蛋白質配列を有する完全ｃ　ＤＮＡ配列（３′−末端に存在するポＩＪ　Ａ連鎖の短セグメントを包含）を第２６ａ図、＄２６１：＋図、第２６ｃ図及び第２６ｄ図に示す。

し　Ｃｈｉｒｇｖｉｎ、　Ｊ、Ｍ、、　Ｐｒｚｙｂｙｌａ、　Ａ、Ｅ、＋　ＭａｃＤｏｎａｌｄ。

Ｒ，Ｊ、　Ｒｕｔｔｅｒ、　Ｗ、Ｊ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１８，５２−９１−５２９９　（１９７９）。

２、５ＣｎＷＩｌｋ）＋　ＭｌＡｌｉｔａｌｏ、　ｘ＊、　Ｖａｒｍｕｓ、　Ｍ −Ｅ−＊　Ｆ！Ｌｓｈｏｐ。

Ｊ、Ｍ、、　Ｎａｔｕｒｅ　５０５．４９７−５０１　（１９８３）−５、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＡＢ、　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉ−ｃａｔｉＯｎ　Ｋｉｔ　−Ｉｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎｓ、　１−１６（ｎｏ　ｙｅａｒｇｉｖｅｎ）４、Ｇｕｂｌｅｒ、　ｕ、−、ＨＯｆｆｍａｎ＋　Ｂ、、　Ｇｅｎｅ　２ｓ、　２５３−２５９（１９６３）。

５、　Ｈｕｓｅ、　Ｗ、Ｄ、、　Ｈａｎｓｅｎ、　Ｃ，＋　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　１＋　１−５（１９８９）。

６、　Ｆｉｒｍａ　Ｓｔｒａｔａｇｅｎａ、　ＺＡＰ−ｃＤＮＡ−（ＴＭ）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｌｔ−Ｉｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｍａｎｕａｌ、　１−２１　（１９８９）−７、Ｆｉｒｍａ　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｕｎｉ−ＺＡＰ（ＴＭ）ＸＲＣｌｏｎｉｎｇ　Ｋｌｔ−Ｉｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｍａｎｕａｌｓ　１−１１　（１９８９）。

３、　Ｆｉｒｍａ　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｇｉｇａｐａｃｋ　ＩＩ　Ｇｏｌｄ　ＰａｃｋａｇｉｎｇＥｘｔｒａｃｔ−Ｉｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｍａｎｕａｌｓ　１−５　（１９８９）９、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　ｇ、Ｆ、、　８ｅｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、。

Ｍｏ１ｅ　ｃｕｌａｒ　ＣＣｌ０ｎｌｎ＋　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋　（１９８２）１Ｑ、　Ｄｕ　Ｐｏｎｔ　ｄｏ　Ｎｅｍｏｕｒｓ、　ＮＥＮ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ。

Ｃｏ１ｏｎｙ／Ｐ１ａｑｕｅＳｃｒｅｅｎ、　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ＴｒａｎｓｆｅｒＭｅｍｂｒａｎｅ　−Ｄ１ｒｅｃｔｉｏｎｓ＋　１−１１　（ｎｏ　ｙｅａｒ）１１、　Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、　Ｈ，Ｃ，、Ｄｏｌｙ、　Ｊ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

７．１５１３−１５２３　（１９７９）。

１２、Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、、　Ｍｏｔｈ、　Ｋｎｚｙｍｏｌ、　１０１．　２Ｏ−７９（１９８３）。

１５、　Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ＋、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ｓ、、　Ｃｏｕｌｓｏｎ、　Ａ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４．　５４６５−５４６７　（１９７７）−１４、８ｈｏｒ　ｔ−Ｊ　、Ｍ−＊　Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ、　Ｊ　− Ｍ−８ｏｒｇａ　ｌ　Ｊ　−Ｍ−＋　Ｈｕｇｅ。

ｗ、ｏ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１６．　７５８３−７６００（１９８８）。

１５、　Ｕｎｉｔｅｓ　８ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ０ｒｐＯｒａｔｉＯｎｓ　５ｔｏｐ−Ｂｙ−８ｔａｐ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　Ｆｏｒ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｗｉｔｈ８ｅｑｕｅｎａｓｅ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　２ −（Ｌ　１−２１　（１９８８）。

／（４シラスミドクローン）及びｒ（１プラスミドクローン）の４群からの各々最長ＣＤＮＡ分を有する選択されたｐブルースクリプトＳＫプラスミドクローンの制限パターン制限酵素ＢａｍＨＩ　（Ｂ）、Ｐｓｔｆ　（Ｐ）又はこれら２種の制限酵素（ＢＰ）で消化されたこのプラスミドＤＮＡグレパレーションｔ−１，８ｅアがロースダン上で分離し九〇この寸法に関連する「ものさし」は、プラスミドｐＢ５２２（Ｍ、　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ社のＤＮＡ分子量マーカー５）で表現され、制限酵素Ｈａｅｌｌで消化され几。

明白に可視のフラグメントの寸法は、５８７．５４０．５０４．４５８．４３４．２６７．２３４．２１３．１９２〜１８４及び１２６塩基対（上から下方へ）である。電気泳動分離後に、このアがロースデルをエチジウムゾロミドで着色し、写真撮影し友。この群α１及びβから、残りの多くの写真撮影され九クローンはそれぞれ配列決定され几。

ｌ　ＧＧＣＧ（コ’；ＡＡＧＣＣＣＴＧＣｋＮ；ＡＧＣＴＧＡＧＯＴＧＡＣαに；ＡＡＡＴＣＣＴＣＴＯＣＭ；ＧＭｉ）ｄ３）Ｊｈα込Ｎ４U０第２６ａ図１２６１　ＣＧＣＴＧＣＧＣＡＣＣＣＡＡＧ？Ｆｌ’ＣＴＧ？ｒＴ入ＡＣＡＡＡＡＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡｃｕＣＮにＣＴＧＴＧＴＧＣＴＧＧ`　１３２０ＲＣＡＰＫＦｒｌｔＦＮＫＴＶＴＮＮＭＬＣＡＧ第２６ａ図（続き）１　ＧＣＣＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＣＧＧＧＭＡＴＣＣＴＣＴＣＣＡＧＧＡＧＡＧ　ＴＧ　６０ＤＩＴＳＨＰＷＱＡ入工ＦＡＱＮＲＲ５ＳＧ坑２６ｂ図１２６１　ＴＣＧＡＡＧＴｒＴＣ１℃ｆｆｌ’ＡＡＣＡＡＡＡＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＴＧＣＴＧＴＧ？ＧＣＴＧＧＡＧＡＣＡＣＧbＧＧ　１３２０ＳＫＦＬＦＮＫＴＶＴＮＮＭＬＣＡＧＤＴＲ第２６ｂ図（続き）１　（ＪＣＣＡＡＧＧＣ［ＧＧＡＧＡＧＡ’！％ＧＣＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＣＧＧＧＡＡＡ　６０第２６ｃ図第２６ｃ図（続き）１　ＧＣＴＡＣＡＧＡＧＡＡＧＣＣＣＧＣＣＣＡＣＴＧＴＧＧＧＣ（ＪＷＴＧＡＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＴＧＣＴＴ％ＡＩすαλシ１Ｇ　６０第２６ｄ図第２６ｄ図（４ｉ！き）９６フ　ＣＡＣＣＴＧＣＧ、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、９フ４ｔ−ＰＡのそれ（下段）との比較第２６ａ図：誘導されたアミノ酸配列を伴なうα、群の最長プラスミドクローンのｃＤＮＡ挿入の完全ＤＮＡ配列。コード化配列はヌクレオチド９４　（ＡＴ（）　−−−−）から開始し、ヌクレオチド１５２７　（−−−−ＴＡＡ　）のストップコドンで終っている。この誘導され几アミノ酸配列は、単一文字コードで示されており、各々のアミノ酸はトリプレットの第１ヌクレオチド〔これによりコードされている〕の下にある。

第２６ｂ図：誘導され几アミノ酸配列を有するα２型のプラスミドクローンのｃＤＮＡ挿入の完全ＤＮＡ配列。

このコード化配列は、ヌクレオチド８５　（ＡＴＧ　−−−）で開始し、ヌクレオチド１５１８　（−−−ＴＡＡ　）のストップコドンの所で終っている。この誘導され几アミノ酸配列は、単一文字コードで示されており、各々のアミノ酸はトリプレットの最初のヌクレオチド（これにエフコードされている）の下にある。

第２６ｃ図：誘導され九アミノ酸配列を有するβ群の最長プラスミドクローンのｃＤＮＡ挿入の完全ＤＮＡ配列。

このコード化配列はヌクレオチド１１７　（ＡＴＧ　−−−）で開始し、ヌクレオチド１４１２　（−−−ＴＡＡ　）のストップコドンで終っている。誘導されたアミノ酸配列は、単一文字コードで示されており、各々のアミノ酸はトリプレットの最初のヌクレオチド（これにエフコードされている）の下にある。

第２６ｄ図：誘導されたアミノ酸配列を有するγ−型のプラスミドクローンのｃＤＮＡ挿入の完全ＤＮＡ配列。

コード化配列はヌクレオチド１８０　（ＡＴＣ−−−）で開始し、ヌクレオチド１　！ｌ　６４　（−−−ＴＡＡ　）の所のストップコドンで終っている。誘導されたアミノ酸配列は、単一文字コードで示されており、各々のアミノ酸はトリプレットの最初のヌクレオチド（これによりコード化されている）の下にある。

例１９゜活性剤ｔ−ＰＡのコード化配列を含有する表現ベクターの構造及び卵母細胞中へマイクロインジェクトするα１、α２、β及びγ形のｖ−ＰＡのｃ　ＤＮＡクローンからのコード化配列ヲ、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩを用いる開裂により、かつＥ、コリーＤＮＡポリフラーぜ工のクレノフ７ラグメントでの後処理及び低融点アがロースダルからの単離の後に得、Ｅ、コリーＤＮＡポリメラーゼＩのクレノフフラグメントにより充填され九べ／　Ｉ　−ｐｓＶＬ　−ＥｃｏＲＩ−のＸｂａ　Ｉ部位内に連結させ、牛の腸ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）で処理する。

この正しい配列ｔ−ＢａｍＨＩでテストする。ｐｓＶＬ　−Ｅｃ。

ＲＩは、市場で入手しうるＳＶ４０表現プラスミドｐ８ＶＬの銹導体（ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　ｋ包含する。

ｖ−ＰＡクローニング部位の指示を伴なう表現ベクターｐｓＶ？、−ＥｃｏＲＩを示す図こりして得られた表現ベクターを塩化セシウム勾配上で精失し、キセノプス・ラエヴイス（Ｘｅｎｏｐｕｓ　１ａｅｖｉａ）卵母細胞中へのマイクロインジェクションの九めに使用する。

卵母細胞インジェクションは次の文献に従って実施した：１、Ｇｕｒｄｏｎ、　Ｊ、Ｂ、、　ａｎｄ　Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ、　Ｌ、、　ｉｎ　’Ｍｉｃｒｏ−ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎｅｌｌｅ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　＠。

ａｄｓ、　Ｃｅ１ｉｓ、　Ｊ、Ｌ、　Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ、　Ａ、、　ａｎｄ　Ｌｏｙｔｅｒ、　Ａ、＋Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＬＯｎｄＯｎ＋　１９８６゜２、Ｃｏｌｍａｎ、　Ａ、、　ｉｎ　”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ”、ｅｄｓ、Ｈａｍｅｓ、Ｒ＋Ｊ、、ａｎｄＨｉｇｇｉｎｓ＋　Ｓ、Ｊ、、ＩＲ’Ｌ−Ｐｒｅｓｓ　０ｘｆｏｒｄ、１９８４＋５、　Ｌａｎｇｅｒ、Ｇ、、’ Ａｎａｌｙｓｅ　ｄｅｓ　Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ＵＩＴｈｅｓｉｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｋａｉｓｅｒｓｌａｕｔｅｒｎ＋　１９８７゜ｖ−ＰＡ表現ベクターでインジェクトされた卵母細胞を、パース（Ｂａｒｔｈ　）培地（文献２）を用いて製造されたフィブリンプレート中に埋封しｔ後に、溶解輩輪が得られる。フィブリングレートの代りにカゼイングレートラ用いると、溶解は起こらない（α７、α２、β）。

ｖ−ＦＡ配列を含有しないベクターでインジェクトされた卵母細胞は、溶解貴翰を示さない。

このｖ−ＰＡ　ｃＮＡ配列は、’　ｖ−ＦＡ蛋白質を細胞外に送出する几めに応答する機能性信号ペプチド配列を含有する。

これらの結果は、こうして得られたｖ−ｐＡｃＤＮＡクローンが完全であり、適当な表現ベクター内への導入の後に、絶対的にフィブリン特異性である活性作用剤を生じることを示している。

国際調査報告国際調査報告ＥＰ　９０００２４２Ｓ＾　３４３６９

Claims

【特許請求の範囲】１．フイブリンの存在下であるがフイブリノーゲンの不存在下に血栓溶解性の活性プラスミノーゲンであり、アロステリツクであることを特徴とする実質的に純粋な蛋白質。２．請求の範囲第１項記載の蛋白質ｖ−ＰＡα１、ｖ−ＰＡα２又はｖ−ＰＡβ 。３．第２６ａ図、第２６ｂ図及び第２６ｃ図の配列を有する、請求の範囲第１項記載の蛋白質。４．請求の範囲第１項に記載の蛋白質をコードする単離されたＤＮＡ。５．第２６α図、第２６ｂ図及び第２６ｃ図のヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の単離されたＤＮＡ。６．請求項４に記載のＤＮＡよりなるベクターで形質変換された微生物。７．請求の範囲第６項におけるｖ−ＰＡをコードするＤＮＡを表現することより成る、ｖ−ＰＡの製法。８．フイブリンの存在で血栓溶解作用を有する、吸血コウモリ類の唾液からの血栓溶解剤において、これは、（１）ｖ−ＰＡα１：フインガードメイン、ＦＧＦ（上皮生長因子）ドメイン、クリンゲルドメイン及びプロテアーゼドメインよりなる高分子量形（２）ｖ−ＰＡα２：ｖ−ＰＡα１と同じドメインを有するがヌクレオチド並びにアミノ酸配列でｖ−ＰＡα１とは異なる高分子量形（３）ｖ−ＰＡβ：ＥＦＧドメイン、クリンゲルドメイン及びプロテアーゼドメインよりなる分子形（４）ｖ−ＰＡγ：タリンゲルドメイン及びプロテアーゼドメインよりなる低分子量形を特徴とし、ここで活性剤ｖ−ＰＡα１の主蛋白質バンドは、非還元条件下でのドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動において４３０００±２０００の分子量を示し、−活性剤Ｖ−ＰＡβの主蛋白質バンドは、非還元条件下でのドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動で３９０００±３０００、還元条件下で４３０００±２０００の分子量を示し、 −活性剤ｖ−ＰＡβの活性を分子量４００００±３０００の分子量を有するゲル濾過カラム（スペロース１２）から溶離させ、 −活性剤ｖ−ＰＡβの等電点（ＰＩ）は６．８〜８．５の範囲内にあり、 −活性剤は３Ｈ−ジイソプロピルフルオロホスフエートと反応し、従つてセリンプロテアーゼであり、−活性剤ｖ−ＰＡα１及びｖ−ＰＡβは、色原性ペプチドＳ−２２８８（Ｈ−Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）及びＳ−２４４４（＜Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）を加水分解するが、色原性ペプチドＳ−２２５１（Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ）を加水分解せず、−活性剤はｐＨ４〜１０．５の範囲で溶解素セフアロースに結合せず、 −活性剤ｖ−ＰＡα１及びｖ−ＰＡβは、フイブリンプレート上で溶解量輪を生成するがカゼインプレート上では生成せず、 −活性剤ｖ−ＰＡα１及びｖ−ＰＡβは、ｐＨ７．５でＺｎ＋＋ケレートセフアロースに結合し、 −活性剤ｖ−ＰＡβは、促進剤例えばフイブリンの存在下のみでプラスミノーゲンを活性化し、フイブリノーゲンの不存在下には活性化せず、 −活性剤ｖ−ＰＡβは、フイブリンモノマーの存在下でプラスミノーゲンをプラスミンに交換する典型的ミハエリス−メンテン反応速度論に従がわず、ｖ−ＰＡ βはアロステリツク特性を有する酵素であり、−活性剤は、試験管内で、濃度に応じてヒト全血トロンビンを溶解し、 −再構成された、試験管内で凝血しうる系で、活性剤ｖ−ＰＡβは、ｔ−ＰＡとは対照的に、測定可能なフイブノーゲン分解をもたらさず、 −活性剤は、濃度に応じてフイブリン溶解を起こさせ、 −活性剤ｖ−ＰＡα１及びｖ−ＰＡβは、へパリンセフアロースに結合し、適当な溶液によりこれから再び溶離でき、 −活性剤は、種々のコチヨウ花科の種子から単離された固定化阻害剤に結合し、適当な溶液によりこれから再び分離でき、 −活性剤ｖ−ＰＡα１及びｖ−ＰＡβは、フイブリンセライトに結合し、適当な方法で再び溶離でき、−活性剤は特定の条件下でヒドロキシアパタイトに結合し、燐酸塩含有緩衝液で再び溶離でき、−活性剤ｖ−ＰＡα１及びｖ−ＰＡβは、適当な方法で相互に分離でき、かつ単離でき、 −活性剤ｖ−ＰＡα１及びｖ−ＰＡβは、それらのＮ−末端アミノ酸配列に関して相互に異なるものであり、−活性剤ｖ−ＰＡα１及びｖ−ＰＡβは、それらのアミノ酸及びヌクレオチド配列に関して相互に異なることを特徴とする、フイブリンの存在でフイブリン溶解性の活性を有する血栓溶解性ｖ−ＰＡ。９．請求の範囲第８項に記載の吸血コウモリの唾液から、血栓溶解性ｖ−ＰＡを単離する方法において、遠心された唾液を緩衝液中に入れ、Ｚｎ＋＋ケレートセフアロースカラムのクロマトグラフイにかけ、このカラムの洗浄の後に活性剤ｖ −ＰＡを定量的に溶離させ、集めたフラクシヨンを、塩の不存在下にスペロース１２を通すゲル濾過を行ない、引続き、生理学的食塩水の存在で再度、ゲル濾過することを特徴とする、吸血コウモリの唾液から血栓溶解性ｖ−ＰＡを単離する方法。１０．請求の範囲第８項に記載の化合物を慣用の助剤及び賦形剤と共に含有する医薬品。