JP4824565B2 - タンパク質溶液のクロマトグラフィー分析の方法 - Google Patents
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Description
この発明はタンパク質の分析方法に関するものである。
より詳細には、本発明は、クロマトグラフィー法（例えばHPLC）によるタンパク質の分析に関するものである。本明細書中、タンパク質の「分析」とは、タンパク質の定量的測定と純度の評価の両者を意味する。
より詳細には、本発明は、クロマトグラフィー法（例えばHPLC）によるタンパク質の分析に関するものである。本明細書中、タンパク質の「分析」とは、タンパク質の定量的測定と純度の評価の両者を意味する。
医薬品中のタンパク質は、そのタンパク質を定量し純度を保証するために分析せねばならない。このことにより、患者への正確且つ再現性ある投薬が可能となる。
薬用タンパク質ならびに不純物、凝集物、および分解生成物の定量には分析技術が必要である。多量体タンパク質、例えば二量体の場合、解離の存在および程度（即ち量）の検出に分析技術が必要とされる。このような分析技術は、精密（即ち、同じ試料を複数回検査した場合の変異の度合いが低くなければならない）且つ正確（即ち、測定値が実際の値にできるだけ近くなければならない）であるべきである。再現性もまた重要である。
薬用タンパク質ならびに不純物、凝集物、および分解生成物の定量には分析技術が必要である。多量体タンパク質、例えば二量体の場合、解離の存在および程度（即ち量）の検出に分析技術が必要とされる。このような分析技術は、精密（即ち、同じ試料を複数回検査した場合の変異の度合いが低くなければならない）且つ正確（即ち、測定値が実際の値にできるだけ近くなければならない）であるべきである。再現性もまた重要である。
タンパク質に用いられる分析検定の一例はサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）であるがこれは、水溶液中のタンパク質を、分子量の相違によってタンパク質の混合物を分離する固体またはゲル相を通過させるものである。得られるクロマトグラムは試料中のタンパク質に関連する1またはそれ以上のピークを示し、それらは分子量によって同定できる。所定のタンパク質に関連するピーク下面積を用いて試料中のタンパク質量を定量できる。ピークの形状は純度の評価に利用できる。
タンパク質に用いられる分析検定のもう一つの例は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、特に逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）である。薬用タンパク質を含有する試料を、そのタンパク質から不純物を分離するカラムを通過させる。タンパク質と不純物はクロマトグラム上のピークとして溶出する。SECと同様、与えられたタンパク質に関連するピーク下面積を用いて試料中の当該タンパク質量を定量できる。ピークの形状は純度の評価に利用できる。
例えば上述の方法のようなクロマトグラフィー法では、タンパク質を水性溶媒に溶解し、利用するクロマトグラフィー系が許容できる程度に希釈せねばならない。タンパク質水溶液の取り扱い中、そのタンパク質の一部が、取り扱いおよび閉じ込め装置、例えば、毛細管、試験管、ビーカー、注射筒等のガラスまたはプラスチック壁への吸着によって失われる危険性が存在し、これがタンパク質の定量を困難にする。タンパク質の吸着は検定の精度、確度、および再現性を低下させる、結果の変異を導く。
SECによるタンパク質の精製に、そして新しいタンパク質の分子量を決定する検定に、界面活性剤が使用されてきた。例えばEP0530937およびDE3917949を参照されたい。
タンパク質吸着に起因する変異を回避することにより検定の精度、確度および再現性が改善された、タンパク質定量および/または純度評価のためのタンパク質分析クロマトグラフィー法のあることが望ましい。
タンパク質吸着に起因する変異を回避することにより検定の精度、確度および再現性が改善された、タンパク質定量および/または純度評価のためのタンパク質分析クロマトグラフィー法のあることが望ましい。
この度、Poloxamerの種類の界面活性剤がタンパク質の喪失を回避し、同時にクロマトグラフィー分析を妨害しないことが発見された。
第一の態様では、本発明は、タンパク質試料溶液のクロマトグラフィー分析法において、タンパク質試料溶液にPoloxamerを添加することから成る改善を提供する。
第二の態様では、本発明は、タンパク質濃度を、利用するクロマトグラフィー系が許容できるレベルに導くための希釈試料を調製する工程を含む、タンパク質のクロマトグラフィー分析法において、この希釈試料溶液にPoloxamerを添加することから成る改善を提供する。
第三の態様では、本発明は、試料中のタンパク質の純度および/または量のクロマトグラフィー分析法を提供し、この方法は該試料がPoloxamerを含有するように調製する工程を含む。
第一の態様では、本発明は、タンパク質試料溶液のクロマトグラフィー分析法において、タンパク質試料溶液にPoloxamerを添加することから成る改善を提供する。
第二の態様では、本発明は、タンパク質濃度を、利用するクロマトグラフィー系が許容できるレベルに導くための希釈試料を調製する工程を含む、タンパク質のクロマトグラフィー分析法において、この希釈試料溶液にPoloxamerを添加することから成る改善を提供する。
第三の態様では、本発明は、試料中のタンパク質の純度および/または量のクロマトグラフィー分析法を提供し、この方法は該試料がPoloxamerを含有するように調製する工程を含む。
本発明者等は、純度およびタンパク質含有量を検定しようとするタンパク質溶液にPoloxamerを含有させることにより、タンパク質の吸着が減少し、検定の精度、確度および再現性の増大が導かれることを発見した。
本出願の文脈中、「分析」という語は、それによって試料中のタンパク質の純度および/または量（例えば濃度）、好ましくは量を決定する分析工程を包含することを意味する。好ましい態様では、本発明方法は、試料中のタンパク質の純度および/または量の分析方法を含み、その方法は、Poloxamerを含有するように該タンパク質試料を調製し、クロマトグラフィーの工程、好ましくはSECまたはRP-HPLC工程を実施する工程を含む。好ましくはこのクロマトグラフィーの工程の後に、そのタンパク質の純度および/または量を決定するためのデータ操作の工程が続く。タンパク質の量は、標準を用いた校正からのデータを使用して決定できる。校正は、試料の分析前または後に実施できる。
Poloxamerはポリ(オキシエチレン)-ポリ(オキシプロピレン)ブロックから成る、分子量範囲1000ないし＞16000のブロックコポリマーである。これらの主たる特性は、ポリ(オキシエチレン)セグメントが疎水性でポリ(オキシプロピレン)セグメントが親水性であることである。これらの物質は非イオン性界面活性剤として挙動し、一般に「プルロニック」という商品名で知られている。
様々な分子量および濃度範囲の、数多くの等級のプルロニックを本発明に従って使用できる。
上述のように、Poloxamer（プルロニック）界面活性剤はエチレンオキシド（EO）とプロピレンオキシド（PO）のブロックコポリマーである。プロピレンオキシドブロック（PO）が2つのエチレンオキシド（EO）ブロックに挟まれている。
上述のように、Poloxamer（プルロニック）界面活性剤はエチレンオキシド（EO）とプロピレンオキシド（PO）のブロックコポリマーである。プロピレンオキシドブロック（PO）が2つのエチレンオキシド（EO）ブロックに挟まれている。
プルロニック界面活性剤は2段階プロセスで合成する：
1. プロピレングリコールの2個のヒドロキシ基にプロピレンオキシドを制御しつつ添加することにより、所望分子量の疎水性物質を創成し；そして、
2. エチレンオキシドを加えてこの疎水性物質を親水基の間に挟む。
プルロニック（登録商標）F77では、ポリオキシエチレン（親水性物質）のパーセンテージは70%であり、疎水性物質（ポリオキシプロピレン）の分子量はおよそ2306Daである。
プルロニックF87では、ポリオキシエチレン（親水性物質）のパーセンテージは70%であり、疎水性物質（ポリオキシプロピレン）の分子量はおよそ2644Daである。
プルロニックF88では、ポリオキシエチレン（親水性物質）のパーセンテージは80%であり、疎水性物質（ポリオキシプロピレン）の分子量はおよそ2644Daである。
プルロニックF68では、ポリオキシエチレン（親水性物質）のパーセンテージは80%であり、疎水性物質（ポリオキシプロピレン）の分子量はおよそ1967Daである。
1. プロピレングリコールの2個のヒドロキシ基にプロピレンオキシドを制御しつつ添加することにより、所望分子量の疎水性物質を創成し；そして、
2. エチレンオキシドを加えてこの疎水性物質を親水基の間に挟む。
プルロニック（登録商標）F77では、ポリオキシエチレン（親水性物質）のパーセンテージは70%であり、疎水性物質（ポリオキシプロピレン）の分子量はおよそ2306Daである。
プルロニックF87では、ポリオキシエチレン（親水性物質）のパーセンテージは70%であり、疎水性物質（ポリオキシプロピレン）の分子量はおよそ2644Daである。
プルロニックF88では、ポリオキシエチレン（親水性物質）のパーセンテージは80%であり、疎水性物質（ポリオキシプロピレン）の分子量はおよそ2644Daである。
プルロニックF68では、ポリオキシエチレン（親水性物質）のパーセンテージは80%であり、疎水性物質（ポリオキシプロピレン）の分子量はおよそ1967Daである。
プルロニックF77の典型的な性質を下に列挙する：
平均分子量：6600；
融点/流動点：48℃；
20℃における物理的形態：固体；
粘度（ブルックフィールド）cps：480［25℃で液体、60℃でペースト、77℃で固体］；
25℃における表面張力、ダイン/cm；
0.1%濃度：47.0
0.01%濃度：49.3
0.001%濃度：52.8
25℃におけるヌジョールに対する界面張力、ダイン/cm；
0.1%濃度：17.7
0.01%濃度：20.8
0.01%濃度：25.5
Draves Wetting、秒、25℃
1.0%濃度：＞360
0.1%濃度：＞360
泡高さ
Ross Miles、0.1%、mm、50℃：100
Ross Miles、0.1%、mm、26℃：47
Dynamic、0.1%、mm、400ml/分：＞600
水溶液中での曇点、℃
1%濃度：＞100
10%濃度：＞100
HLB（親水性親油性比）：25。
平均分子量：6600；
融点/流動点：48℃；
20℃における物理的形態：固体；
粘度（ブルックフィールド）cps：480［25℃で液体、60℃でペースト、77℃で固体］；
25℃における表面張力、ダイン/cm；
0.1%濃度：47.0
0.01%濃度：49.3
0.001%濃度：52.8
25℃におけるヌジョールに対する界面張力、ダイン/cm；
0.1%濃度：17.7
0.01%濃度：20.8
0.01%濃度：25.5
Draves Wetting、秒、25℃
1.0%濃度：＞360
0.1%濃度：＞360
泡高さ
Ross Miles、0.1%、mm、50℃：100
Ross Miles、0.1%、mm、26℃：47
Dynamic、0.1%、mm、400ml/分：＞600
水溶液中での曇点、℃
1%濃度：＞100
10%濃度：＞100
HLB（親水性親油性比）：25。
プルロニックF87の典型的な性質を下に列挙する：
平均分子量：7700；
融点/流動点：49℃；
20℃における物理的形態：固体；
粘度（ブルックフィールド）cps：700［25℃で液体、60℃でペースト、77℃で固体］；
25℃における表面張力、ダイン/cm；
0.1%濃度：44.0
0.01%濃度：47.0
0.001%濃度：50.2
25℃におけるヌジョールに対する界面張力、ダイン/cm；
0.1%濃度：17.4
0.01%濃度：20.3
0.01%濃度：23.3
Draves Wetting、秒、25℃
1.0%濃度：＞360
0.1%濃度：＞360
泡高さ
Ross Miles、0.1%、mm、50℃：80
Ross Miles、0.1%、mm、26℃：37
Dynamic、0.1%、mm、400ml/分：＞600
水溶液中での曇点、℃
1%濃度：＞100
10%濃度：＞100
HLB（親水性親油性比）：24。
平均分子量：7700；
融点/流動点：49℃；
20℃における物理的形態：固体；
粘度（ブルックフィールド）cps：700［25℃で液体、60℃でペースト、77℃で固体］；
25℃における表面張力、ダイン/cm；
0.1%濃度：44.0
0.01%濃度：47.0
0.001%濃度：50.2
25℃におけるヌジョールに対する界面張力、ダイン/cm；
0.1%濃度：17.4
0.01%濃度：20.3
0.01%濃度：23.3
Draves Wetting、秒、25℃
1.0%濃度：＞360
0.1%濃度：＞360
泡高さ
Ross Miles、0.1%、mm、50℃：80
Ross Miles、0.1%、mm、26℃：37
Dynamic、0.1%、mm、400ml/分：＞600
水溶液中での曇点、℃
1%濃度：＞100
10%濃度：＞100
HLB（親水性親油性比）：24。
プルロニックF88の典型的な性質を下に列挙する：
平均分子量：11400；
融点/流動点：54℃；
20℃における物理的形態：固体；
粘度（ブルックフィールド）cps：2300［25℃で液体、60℃でペースト、77℃で固体］；
25℃における表面張力、ダイン/cm；
0.1%濃度：48.5
0.01%濃度：52.6
0.001%濃度：55.7
25℃におけるヌジョールに対する界面張力、ダイン/cm；
0.1%濃度：20.5
0.01%濃度：23.3
0.01%濃度：27.0
Draves Wetting、秒、25℃
1.0%濃度：＞360
0.1%濃度：＞360
泡高さ
Ross Miles、0.1%、mm、50℃：80
Ross Miles、0.1%、mm、26℃：37
Dynamic、0.1%、mm、400ml/分：＞600
水溶液中での曇点、℃
1%濃度：＞100
10%濃度：＞100
HLB（親水性親油性比）：28。
平均分子量：11400；
融点/流動点：54℃；
20℃における物理的形態：固体；
粘度（ブルックフィールド）cps：2300［25℃で液体、60℃でペースト、77℃で固体］；
25℃における表面張力、ダイン/cm；
0.1%濃度：48.5
0.01%濃度：52.6
0.001%濃度：55.7
25℃におけるヌジョールに対する界面張力、ダイン/cm；
0.1%濃度：20.5
0.01%濃度：23.3
0.01%濃度：27.0
Draves Wetting、秒、25℃
1.0%濃度：＞360
0.1%濃度：＞360
泡高さ
Ross Miles、0.1%、mm、50℃：80
Ross Miles、0.1%、mm、26℃：37
Dynamic、0.1%、mm、400ml/分：＞600
水溶液中での曇点、℃
1%濃度：＞100
10%濃度：＞100
HLB（親水性親油性比）：28。
プルロニックF68の典型的な性質を下に列挙する：
平均分子量：8400；
融点/流動点：52℃；
20℃における物理的形態：固体；
粘度（ブルックフィールド）cps：1000［25℃で液体、60℃でペースト、77℃で固体］；
25℃における表面張力、ダイン/cm；
0.1%濃度：50.3
0.01%濃度：51.2
0.001%濃度：53.6
25℃におけるヌジョールに対する界面張力、ダイン/cm；
0.1%濃度：19.8
0.01%濃度：24.0
0.01%濃度：26.0
Draves Wetting、秒、25℃
1.0%濃度：＞360
0.1%濃度：＞360
泡高さ
Ross Miles、0.1%、mm、50℃：35
Ross Miles、0.1%、mm、26℃：40
Dynamic、0.1%、mm、400ml/分：＞600
水溶液中での曇点、℃
1%濃度：＞100
10%濃度：＞100
HLB（親水性親油性比）：29。
平均分子量：8400；
融点/流動点：52℃；
20℃における物理的形態：固体；
粘度（ブルックフィールド）cps：1000［25℃で液体、60℃でペースト、77℃で固体］；
25℃における表面張力、ダイン/cm；
0.1%濃度：50.3
0.01%濃度：51.2
0.001%濃度：53.6
25℃におけるヌジョールに対する界面張力、ダイン/cm；
0.1%濃度：19.8
0.01%濃度：24.0
0.01%濃度：26.0
Draves Wetting、秒、25℃
1.0%濃度：＞360
0.1%濃度：＞360
泡高さ
Ross Miles、0.1%、mm、50℃：35
Ross Miles、0.1%、mm、26℃：40
Dynamic、0.1%、mm、400ml/分：＞600
水溶液中での曇点、℃
1%濃度：＞100
10%濃度：＞100
HLB（親水性親油性比）：29。
上に列挙したものと同様の性質を持つその他のポリマーもまた本発明方法に使用できる。好ましい界面活性剤は、プルロニックF68（Poloxamer 188）および同様の性質を持つ界面活性剤である。
故に、本発明は、利用するクロマトグラフィー系が許容できるタンパク質濃度を有するタンパク質試料を調製する工程を含む、改善されたタンパク質のクロマトグラフィー分析方法に関するものであり、この改善は、該タンパク質試料溶液にPoloxamer、好ましくはプルロニックF68を添加することから成る。
この方法は、本質的には任意のタンパク質、例えばインスリン、エタネルセプト、第VIII因子、成長ホルモン（ソマトトロピン）、抗体（例えばインフリキシマブ）、白血病阻害因子（LIF、エンフィレルミン）、インターロイキン、例えばインターロイキン-6（アテキサキンα）、腫瘍壊死因子結合タンパク質（TBP-1、オネルセプト）、インターロイキン-18結合タンパク質（IL-18BP、タデキン）、抗CD-11a（エファリズマブ）と共に利用できる。好ましい態様では、タンパク質は糖タンパク質、例えばエリスロポエチン（EPO）、ダルベポエチンα、ヒトプロテインC、インターフェロン（例えばインターフェロンβ1a、1b、特に好ましくはインターフェロンβ-1a）、αガラクトシダーゼAである。好ましくはタンパク質は二量体タンパク質、即ちサブユニットで構成されており（ヘテロ二量体を包含する）、特に好ましくは二量体またはヘテロ二量体糖タンパク質、例えば甲状腺刺激ホルモン（TSH）、およびゴナドトロピン類：卵胞刺激ホルモン（FSH）、黄体化ホルモン（LH）、および絨毛性ゴナドトロピン（CG）である。好ましくはこれらのタンパク質はヒトタンパク質である。
以下の実施例では、プルロニックF68（Poloxamer 188）を超純水中100μg/mlの濃度で使用する。しかしながら本発明は、異なる等級のプルロニックおよび異なる濃度のプルロニックの使用をもまた包含することを理解されたい。
実施例1
FSHの定量的測定のSEC法における改良試料の調製
この研究の目的は、rec-FSH（Fertinex、この場合Fertinex 75IU）を含有する調製品中のタンパク質含有量を求めるサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）法において改良試料調製品を適格とすることである。実施される修飾は、吸着によるタンパク質の喪失を制御するために、全タンパク質溶液（試料、対照試料および標準）の調製に、プルロニックF68 100μg/mlを超純水中に含有する溶液を使用することである。
FSHの定量的測定のSEC法における改良試料の調製
この研究の目的は、rec-FSH（Fertinex、この場合Fertinex 75IU）を含有する調製品中のタンパク質含有量を求めるサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）法において改良試料調製品を適格とすることである。実施される修飾は、吸着によるタンパク質の喪失を制御するために、全タンパク質溶液（試料、対照試料および標準）の調製に、プルロニックF68 100μg/mlを超純水中に含有する溶液を使用することである。
ヘテロ二量体FSH（FSHはαサブユニットとβサブユニットから成る）および解離したFSHの混合物から成る試料を調製し分析した。この方法はヘテロ二量体FSHと遊離サブユニットの定量が可能であった。
この研究は、医薬品レファランス標準を用いる一点検量線が、良好な全精度2.0%をもってタンパク質含有量の測定に好適であること、そして、この方法が、試験範囲内（26.6ないし160μg/ml）で直線性のあることを示している。
さらに、この試験には、表示のようにWatersおよびVarian HPLC系の両者が使用できる。全バッチの平均タンパク質含有量の結果における相違は、この方法の全精度よりも低い。
この変化が元のSEC法自身に何ら影響を及ぼさなかったという事を強調することは重要である。
この研究は、医薬品レファランス標準を用いる一点検量線が、良好な全精度2.0%をもってタンパク質含有量の測定に好適であること、そして、この方法が、試験範囲内（26.6ないし160μg/ml）で直線性のあることを示している。
さらに、この試験には、表示のようにWatersおよびVarian HPLC系の両者が使用できる。全バッチの平均タンパク質含有量の結果における相違は、この方法の全精度よりも低い。
この変化が元のSEC法自身に何ら影響を及ぼさなかったという事を強調することは重要である。
より詳細には、試料および標準調製品の修飾は以下の通りであった：
・試料およびレファランス標準の調製には超純水中100μg/mlのプルロニックF68を使用する。
・一連の分析を通じて使用するブランク溶液は100μg/mlプルロニックF68溶液である。
・SST対照試料および分析セッションを通じて注入される対照試料の調製は、系の適合性を有する注入ができるに充分な、そして分析セッション全体を通じて注入される対照に対して充分なアンプルを再構成およびプールすることにより、実施する。
・試料およびレファランス標準の調製には超純水中100μg/mlのプルロニックF68を使用する。
・一連の分析を通じて使用するブランク溶液は100μg/mlプルロニックF68溶液である。
・SST対照試料および分析セッションを通じて注入される対照試料の調製は、系の適合性を有する注入ができるに充分な、そして分析セッション全体を通じて注入される対照に対して充分なアンプルを再構成およびプールすることにより、実施する。
材料および装置
材料
対照試料：高精製尿FSH（u-FSH-HP）バッチ17304010
被験試料：75IU u-FSH-HPバッチNo.17301010、17315040および17318040。
装置
HPLCポンプmod.600Eまたは626［Waters］
UV検出機mod.486または996［Waters］
カラム：Progel TSK G2000 SW 60cm X 7.5mm［Supelco］
方法
カラムは移動相（燐酸緩衝液0.1M；Na2SO4 0.1M、pH6.70）で1時間、流速0.70ml/分でコンディショニングした。分析中、カラムはおよそ4℃に維持した。
材料
対照試料：高精製尿FSH（u-FSH-HP）バッチ17304010
被験試料：75IU u-FSH-HPバッチNo.17301010、17315040および17318040。
装置
HPLCポンプmod.600Eまたは626［Waters］
UV検出機mod.486または996［Waters］
カラム：Progel TSK G2000 SW 60cm X 7.5mm［Supelco］
方法
カラムは移動相（燐酸緩衝液0.1M；Na2SO4 0.1M、pH6.70）で1時間、流速0.70ml/分でコンディショニングした。分析中、カラムはおよそ4℃に維持した。
分析のため、以下の溶液を使用した：
標準溶液：高精製FSHの溶液（0.041μg/μl）をプルロニックF68（100μg/ml）を用いて調製した。
試料溶液：試料溶液は、異なる量のヘテロ二量体FSH（Fertinex）および解離FSHを有するよう、プルロニックF68（100μg/ml）を含有する溶液中に調製した。
対照溶液：対照溶液は、プルロニックF68（100μg/ml）を含有する溶液中に溶解したFSHを用いて調製した。
標準および試料溶液を注入し（100μl）、カラムを0.70ml/分の一定流速で溶離した。214nmのUV吸収によって検出した。ピーク下面積を用いてヘテロ二量体FSHおよびそれぞれのFSHサブユニットを決定した。
標準溶液：高精製FSHの溶液（0.041μg/μl）をプルロニックF68（100μg/ml）を用いて調製した。
試料溶液：試料溶液は、異なる量のヘテロ二量体FSH（Fertinex）および解離FSHを有するよう、プルロニックF68（100μg/ml）を含有する溶液中に調製した。
対照溶液：対照溶液は、プルロニックF68（100μg/ml）を含有する溶液中に溶解したFSHを用いて調製した。
標準および試料溶液を注入し（100μl）、カラムを0.70ml/分の一定流速で溶離した。214nmのUV吸収によって検出した。ピーク下面積を用いてヘテロ二量体FSHおよびそれぞれのFSHサブユニットを決定した。
結果
或る分析方法の精度は、定められた条件の下で同じ均質な試料を複数回サンプリングして得られた一連の測定値間での一致の近似性（ばらつきの程度）を表す。精度は3つのレベルで考えることができる：反復性（または検定内精度）、中間精度および再現性。この検査において、検定の反復性、中間精度および再現性を取り扱った。
5回の独立した分析セッションにおいて、3つのFertinex医薬品バッチを標準（検量線）に対して定量した。
或る分析方法の精度は、定められた条件の下で同じ均質な試料を複数回サンプリングして得られた一連の測定値間での一致の近似性（ばらつきの程度）を表す。精度は3つのレベルで考えることができる：反復性（または検定内精度）、中間精度および再現性。この検査において、検定の反復性、中間精度および再現性を取り扱った。
5回の独立した分析セッションにおいて、3つのFertinex医薬品バッチを標準（検量線）に対して定量した。
表1に示したFertinex 75IUの結果と共に、分散分析（ANOVA）枝分かれ配置を用いてこの分析法の反復性（または検定内精度）、中間精度および再現性（全精度）を評価した。検査に付した結果の総数は45であった。得られた結果は以下の通りであった：
・反復性（または検定内精度）：1.3%
・中間精度：1.0%
・再現性（全精度）：1.6%
全体としての結果を以下の表1に示す：
・反復性（または検定内精度）：1.3%
・中間精度：1.0%
・再現性（全精度）：1.6%
全体としての結果を以下の表1に示す：
理解できるように、Cochran CおよびBartlett試験のp値は常に0.05より大きく、この事は、95%信頼レベルにおける標準偏差には統計学的に有意な差異は無く、0.9980より高い相関係数が常に満たされる事を意味している。
線形回帰が観察されたデータを表現する充分なモデルであるかどうかを決定するための、不適合度検定を実施した。この統計学的検査に基づき、ラン7のp値が0.05より大でないとしても、線形回帰がこのデータを表現する最良モデルであることが分かった。この分析セッションについては、やはり線形回帰が99.96%適合性を有する最良モデルである。平方根および指数モデルといった他のモデルを検査したが、観察されたデータのより良い適合性は示されなかった。
実施例2
FSHの純度決定を行うSEC法における改良試料調製およびスパイキング操作
スパイキング実験では、既知量のヘテロ二量体FSHまたは解離FSHのいずれかをFSHの試料に添加した（スパイキング）。得られたヘテロ二量体および/または解離サブユニットのピークを評価して回収率%および純度%を求めた。
FSHの純度決定を行うSEC法における改良試料調製およびスパイキング操作
スパイキング実験では、既知量のヘテロ二量体FSHまたは解離FSHのいずれかをFSHの試料に添加した（スパイキング）。得られたヘテロ二量体および/または解離サブユニットのピークを評価して回収率%および純度%を求めた。
この分析法において実施する修飾は、全てのタンパク質溶液（試料、スパイク溶液）の調製に超純水中の100μg/mlプルロニックF68を含む溶液を使用して、吸着によるタンパク質の喪失を制御することである。この修飾は、特にクロマトグラフィーに影響を及ぼさずにこの方法の精度を増大させて、より精密且つ正確な純度決定を可能にするために行った。
この研究の枠組みにおいて、この方法の精度決定をも検討した。この方法の精度（全精度1.8%）は、プルロニックF68を導入しない分析法を確認した時に観察されたこの方法の精度（精度2%）に比して、僅かに改善された。100%でのスパイク溶液の通常収率は、良好な確度を示す。
この研究の枠組みにおいて、この方法の精度決定をも検討した。この方法の精度（全精度1.8%）は、プルロニックF68を導入しない分析法を確認した時に観察されたこの方法の精度（精度2%）に比して、僅かに改善された。100%でのスパイク溶液の通常収率は、良好な確度を示す。
この方法の確度をさらに決定するため、さらなるスパイキング実験を実施した。プルロニックF68有りおよび無しのスパイキング溶液では、異なるピーク下面積が得られるという事が観察された。試料調製物中にプルロニックF68を含むスパイキング溶液の面積は、プルロニックF68を使用せずに調製したスパイキング溶液のおよそ2倍の大きさである。
観察される面積が異なるのは、試料調製に使用するポリプロピレン材料上に解離サブユニットが吸着するためであると考えられる。
観察される面積が異なるのは、試料調製に使用するポリプロピレン材料上に解離サブユニットが吸着するためであると考えられる。
スパイクされたFSHの遊離サブユニットの回収が95%−105%の範囲内であることが、以下の表3および4で観察できる。さらに、5回のランを通じた精度（変動係数として報告（CV%)）が純度およびスパイクの回収について1.0%ないし1.5%の範囲であることもまた観察できる。CV%が低いほど、ランの間の変異が小さい。
これは、プルロニックF68無しで調製した試料に優る実質的な改善である。
これは、プルロニックF68無しで調製した試料に優る実質的な改善である。
別の研究プロトコルの枠組みでは、プルロニックF68を使用した、および使用しない医薬品バッチの分析を実施した。結果のうちの一つは、スパイキング溶液（解離r-hFSH）のピーク下面積が、プルロニックF68の導入と共におよそ2倍になるというものである。この現象は、プルロニックF68が存在しないと、試料調製中に遊離サブユニットが使用材料上に吸着されるためである可能性が最も高い。この面積の増大が分析に影響を及ぼすかどうかを判定するため、プルロニックF68有りおよび無しでのスパイキング実験を3つのレベルで実施した。以下の試料をn=2で試験した：
1. プルロニックF68有りの試料調製
・スパイキング溶液無しの試料；
・解離r-hFSHでスパイクした試料（2μgを注入）；
・スパイキング溶液（解離r-hFSH 2μgを注入）；
・解離r-hFSHでスパイクした試料（1.5μgを注入）；
・スパイキング溶液（解離r-hFSH 1.5μgを注入）；
・解離r-hFSHでスパイクした試料（1μgを注入）；
・スパイキング溶液（解離r-hFSH 1μgを注入）；
・スパイキング溶液無しの試料；
・解離r-hFSHでスパイクした試料（2μgを注入）；
・スパイキング溶液（解離r-hFSH 2μgを注入）；
・解離r-hFSHでスパイクした試料（1.5μgを注入）；
・スパイキング溶液（解離r-hFSH 1.5μgを注入）；
・解離r-hFSHでスパイクした試料（1μgを注入）；
・スパイキング溶液（解離r-hFSH 1μgを注入）；
結果を表5に示す：
上の表から、プルロニックF68の添加が、理論的回収率（100%）および面積の回収%に近接した、スパイクの回収%の点で良好な結果を与えることが理解できる。この後者のパラメータは、定められたスパイキングレベルにおけるスパイキング溶液の面積を、100%のスパイキング溶液の面積で除することにより算出する。この結果（即ち、1.5μg/注入によるスパイキングで 76%）を、実施した理論的スパイキングレベル（即ち75%）と比較する。
2. プルロニックF68無しの試料調製
以下の試料をn=2で試験した。
・スパイキング溶液無しの試料；
・解離r-hFSHでスパイクした試料（2μgを注入）；
・スパイキング溶液（解離r-hFSH 2μgを注入）；
・解離r-hFSHでスパイクした試料（3μgを注入）；
・スパイキング溶液（解離r-hFSH 3μgを注入）；
・解離r-hFSHでスパイクした試料（4μgを注入）；
・スパイキング溶液（解離r-hFSH4μgを注入）；
以下の試料をn=2で試験した。
・スパイキング溶液無しの試料；
・解離r-hFSHでスパイクした試料（2μgを注入）；
・スパイキング溶液（解離r-hFSH 2μgを注入）；
・解離r-hFSHでスパイクした試料（3μgを注入）；
・スパイキング溶液（解離r-hFSH 3μgを注入）；
・解離r-hFSHでスパイクした試料（4μgを注入）；
・スパイキング溶液（解離r-hFSH4μgを注入）；
結果を以下の表6に示す。
試料調製にプルロニックF68を使用せずに得られた結果では、スパイク溶液の回収率は、理論的回収率（100%）から4-5%偏位する。面積の回収%では、結果は、スパイク溶液の面積が小さすぎるため、実施した理論的スパイキングレベルから著しく偏位する。
プルロニックF68を使用しておよび使用せずに得られた結果の相違は、プルロニックが検定溶液に含まれない場合、被験試料が試料調製中に使用材料上に吸着されることによって説明できる。同じスパイキングレベル（100%）について得られたスパイキング溶液のピーク下面積は、プルロニックF68が存在して吸着が回避された場合、およそ2倍である。
遊離サブユニットの吸着は、注入当たり2μg（100%）における、プルロニックF68有りのスパイキング溶液のピーク下面積とプルロニックF68無しのスパイキング溶液の面積の相違によって算出できる［即ち、プルロニックF68無しの、スパイキングレベル100%におけるピーク下面積（表6：922106）を、プルロニックF68有りの、スパイキングレベル100%におけるピーク下面積（表5：2037915）から差し引く］。この相違は1'115'809の面積に相当する。この面積は、プルロニックF68が存在しない場合の試料調製中に吸着された解離サブユニットの量を反映しており、プルロニックF68不在時に得られる面積の補正に利用できる。この補正を考慮に入れて算出した面積の回収率を表7に示す。このデータは理論的スパイキングレベルに近い。
プルロニックF68を使用しておよび使用せずに得られた結果の相違は、プルロニックが検定溶液に含まれない場合、被験試料が試料調製中に使用材料上に吸着されることによって説明できる。同じスパイキングレベル（100%）について得られたスパイキング溶液のピーク下面積は、プルロニックF68が存在して吸着が回避された場合、およそ2倍である。
遊離サブユニットの吸着は、注入当たり2μg（100%）における、プルロニックF68有りのスパイキング溶液のピーク下面積とプルロニックF68無しのスパイキング溶液の面積の相違によって算出できる［即ち、プルロニックF68無しの、スパイキングレベル100%におけるピーク下面積（表6：922106）を、プルロニックF68有りの、スパイキングレベル100%におけるピーク下面積（表5：2037915）から差し引く］。この相違は1'115'809の面積に相当する。この面積は、プルロニックF68が存在しない場合の試料調製中に吸着された解離サブユニットの量を反映しており、プルロニックF68不在時に得られる面積の補正に利用できる。この補正を考慮に入れて算出した面積の回収率を表7に示す。このデータは理論的スパイキングレベルに近い。
表5および6に示した純度の結果は、プルロニックの導入有りと無しとで異なっている。この相違は吸着現象の影響であるとも考えられる。純度パーセントは、プルロニックF68を使用した時には、はるかにより正確である。
幾つかの生成物バッチを、試料調製時にプルロニックF68の導入有りおよび無しでSECにより純度を検査した。結果を表8に示す。
幾つかの生成物バッチを、試料調製時にプルロニックF68の導入有りおよび無しでSECにより純度を検査した。結果を表8に示す。
スパイキング溶液の純度および回収率
上の表8に示したデータに基づくと、プルロニックの導入有りおよび無しでの回収率の相違は約2%である事が理解できる。この相違は、95%信頼レベルでANOVAを実施すると統計学的に有意である（p値0.008）。さらに同表を眺めると、プルロニックF68の導入有りおよび無しでは、純度に、およそ7%という統計学的に有意な差を見出すことができる（ANOVA p値1.2 10-8）。
さらに、表8から、プルロニックF68を試料溶液に含有させた時にはCV%がより低いことも理解できる［プルロニックF68無しで2.5%に対してプルロニックF68有りで1.5および1.8%］。低いCV%は、ラン間の変異の度合いがより小さいことを示す。
スパイキング溶液の純度および回収率におけるこれらの統計学的相違は、プルロニックF68を使用しない場合の試料調製時に起こる吸着現象によって説明できる（以下の表9を参照されたい）。
上の表8に示したデータに基づくと、プルロニックの導入有りおよび無しでの回収率の相違は約2%である事が理解できる。この相違は、95%信頼レベルでANOVAを実施すると統計学的に有意である（p値0.008）。さらに同表を眺めると、プルロニックF68の導入有りおよび無しでは、純度に、およそ7%という統計学的に有意な差を見出すことができる（ANOVA p値1.2 10-8）。
さらに、表8から、プルロニックF68を試料溶液に含有させた時にはCV%がより低いことも理解できる［プルロニックF68無しで2.5%に対してプルロニックF68有りで1.5および1.8%］。低いCV%は、ラン間の変異の度合いがより小さいことを示す。
スパイキング溶液の純度および回収率におけるこれらの統計学的相違は、プルロニックF68を使用しない場合の試料調製時に起こる吸着現象によって説明できる（以下の表9を参照されたい）。
表9およびその後の表では、「二量体および凝集体」とは、一般的に望ましくないと考えられる凝集したFSH分子およびヘテロ二量体FSHの二量体を指す。
表9から、スパイキング溶液の純度および回収率の計算に用いた面積の精度（CV%）は、殆ど常に、プルロニックF68を導入しない場合よりプルロニックF68を導入した場合の方が良好である［より低いCV%は、改善された精度を示す］。
プルロニックF68有りの平均面積／プルロニックF68無しの平均面積の比を算出すると分かるように、二量体および凝集体、遊離サブユニットおよび単量体の吸着速度は異なっている。表10に見られるように、プルロニックF68有りの面積増大%は、考慮に入れた面積に依存し一定ではない。
プルロニックF68有りの平均面積／プルロニックF68無しの平均面積の比を算出すると分かるように、二量体および凝集体、遊離サブユニットおよび単量体の吸着速度は異なっている。表10に見られるように、プルロニックF68有りの面積増大%は、考慮に入れた面積に依存し一定ではない。
遊離サブユニットのピークは試料調製物の試験中に主ピークから分割されないという事実のため、純度を決定するためには遊離サブユニットのスパイキングを実施しなければならない。純度%（または単量体%）は下の式で表す：
［式中、A：スパイク無しの試料の合計面積
B：スパイキング溶液の合計面積
C：スパイクされた試料のサブユニットピーク面積
D：スパイク無しの試料中の二量体および凝集体、
である］。
B：スパイキング溶液の合計面積
C：スパイクされた試料のサブユニットピーク面積
D：スパイク無しの試料中の二量体および凝集体、
である］。
スパイクの回収の許容基準は以下のように表される：
［式中、A：スパイク無しの試料の合計面積
B：スパイキング溶液の合計面積
E：スパイクされた試料の合計面積、
である］。
上の式を考慮に入れて、プルロニックF68の導入有りおよび無しの場合の純度計算を実施できる。さらに、プルロニックF68の効果を考慮に入れるため、吸着効果を考慮したプルロニックF68の導入無しの面積について計算を行うことができる。式は以下の通りとなる：
［式中、A：スパイク無しの試料の合計面積
B：スパイキング溶液の合計面積
C：スパイクされた試料のサブユニットピーク面積
D：スパイク無しの試料中の二量体および凝集体
E：スパイクされた試料の合計面積
Rx：プルロニックF68無しの平均面積Xで除したプルロニックF68有りの平均面積Xの比率、
である］。
B：スパイキング溶液の合計面積
E：スパイクされた試料の合計面積、
である］。
上の式を考慮に入れて、プルロニックF68の導入有りおよび無しの場合の純度計算を実施できる。さらに、プルロニックF68の効果を考慮に入れるため、吸着効果を考慮したプルロニックF68の導入無しの面積について計算を行うことができる。式は以下の通りとなる：
B：スパイキング溶液の合計面積
C：スパイクされた試料のサブユニットピーク面積
D：スパイク無しの試料中の二量体および凝集体
E：スパイクされた試料の合計面積
Rx：プルロニックF68無しの平均面積Xで除したプルロニックF68有りの平均面積Xの比率、
である］。
実施例3
RP-HPLCによるインターフェロンβ-1a検定：標準曲線アプローチに対する一標準点アプローチの適格化
この実施例は、RP-HPLCによるインターフェロンβ-1a検定の場合に、本発明に係る改良法を適用することにより、即ち試料喪失を回避するためにプルロニック界面活性剤を使用することにより、如何にして標準曲線アプローチ（以後「現行検定」と称する）を一標準点アプローチに改変することが可能となるかを示すものである。
RP-HPLCによるインターフェロンβ-1a検定：標準曲線アプローチに対する一標準点アプローチの適格化
この実施例は、RP-HPLCによるインターフェロンβ-1a検定の場合に、本発明に係る改良法を適用することにより、即ち試料喪失を回避するためにプルロニック界面活性剤を使用することにより、如何にして標準曲線アプローチ（以後「現行検定」と称する）を一標準点アプローチに改変することが可能となるかを示すものである。
本発明に係る改良法のための薬物試料調製において、インターフェロンβ-1aを、Poloxamer無しの0.05M酢酸ナトリウム（pH3.8）の代わりに0.1%Poloxamer 188（プルロニックF68）を含有する希釈緩衝液0.05M酢酸ナトリウム（pH3.8）を用いて1ないし7に希釈した。
ICH指針に従って最適化RP-HPLC検定を適格とし、以下の特性を目指した：
・直線性の範囲：切片が統計学的に0と相違しない3.3ないし8.8μgの範囲でのインターフェロンβ-1aの注入に対して直線性を確認した。これらの結果は一標準点アプローチを支持する。
・精度：医薬品標準と一標準点アプローチを用いた最適化した検定の精度を、薬物標準および標準曲線アプローチを用いた現行検定で得られる精度と比較した。プルロニックF68を用いた最適化検定で1回の反復実験について得られた全体的精度（全ての薬物および医薬品試料についてプールしたCVは1.2%）は、プルロニックF68を使用しない現行検定で1回の反復実験について得られた精度1.9%より良好であることが示された。
・特異性：
最適化した検定で観察できる成分は、特異性について確認されている現行検定で分析された薬物および医薬品の処方に既に存在する。新しい標準におけるPoloxamer 188の存在は、最適化した検定を妨害しないことが立証された。最適化した検定にはさらなる成分は導入されず、故にこの最適化検定は特異的である。
・確度：最適化した検定で得られた結果と現行検定で得られた結果（これら最後の結果をレファランス値と考える）を比較することにより、最適化した検定の確度を評価した。この目的のため、幾つかの薬物と医薬品（HSAを含有する液体処方、HSAを含まない液体処方）を分析した。全事例において、最適化／現行インターフェロンβ-1a検定の比は、統計学的に100%と相違せず、この事は、二つのインターフェロンβ-1a検定が統計学的に等価な結果を産むことを証明している。
・直線性の範囲：切片が統計学的に0と相違しない3.3ないし8.8μgの範囲でのインターフェロンβ-1aの注入に対して直線性を確認した。これらの結果は一標準点アプローチを支持する。
・精度：医薬品標準と一標準点アプローチを用いた最適化した検定の精度を、薬物標準および標準曲線アプローチを用いた現行検定で得られる精度と比較した。プルロニックF68を用いた最適化検定で1回の反復実験について得られた全体的精度（全ての薬物および医薬品試料についてプールしたCVは1.2%）は、プルロニックF68を使用しない現行検定で1回の反復実験について得られた精度1.9%より良好であることが示された。
・特異性：
最適化した検定で観察できる成分は、特異性について確認されている現行検定で分析された薬物および医薬品の処方に既に存在する。新しい標準におけるPoloxamer 188の存在は、最適化した検定を妨害しないことが立証された。最適化した検定にはさらなる成分は導入されず、故にこの最適化検定は特異的である。
・確度：最適化した検定で得られた結果と現行検定で得られた結果（これら最後の結果をレファランス値と考える）を比較することにより、最適化した検定の確度を評価した。この目的のため、幾つかの薬物と医薬品（HSAを含有する液体処方、HSAを含まない液体処方）を分析した。全事例において、最適化／現行インターフェロンβ-1a検定の比は、統計学的に100%と相違せず、この事は、二つのインターフェロンβ-1a検定が統計学的に等価な結果を産むことを証明している。
結論として、本方法は現行検定よりも良好な精度を有し、現行検定で得られる結果に対し統計学的に等価である正確な結果を産む。
本発明を、SECおよびRP-HPLCクロマトグラフイー法の両方におけるタンパク質の定量的測定および純度評価の実施例に言及しつつ記載した。
以下の請求項で定義する本発明の精神および範囲を逸脱することなく、その他多くの等価な実施例を実施できることは明白である。
本発明を、SECおよびRP-HPLCクロマトグラフイー法の両方におけるタンパク質の定量的測定および純度評価の実施例に言及しつつ記載した。
以下の請求項で定義する本発明の精神および範囲を逸脱することなく、その他多くの等価な実施例を実施できることは明白である。
Claims (8)
- 試料中のタンパク質をクロマトグラフィーにより分析して当該タンパク質を定量するための方法であって、
ａ）Poloxamerを含有するように当該タンパク質試料を調製する工程、
ｂ）クロマトグラフィーを実施する工程、
ｃ）当該タンパク質の量を決定するためのデータ操作の工程、ここで、当該タンパク質の量は、標準を用いた校正からのデータを使用して決定される、
を含んで成り、分析を実施するタンパク質が二量体糖タンパク質又はインターフェロンである、方法。 - タンパク質濃度を、利用するクロマトグラフィー系が許容できるレベルとするために試料を希釈する工程を更に包含する、請求項１に記載の方法。
- クロマトグラフィーがサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）または逆相HPLC（RP-HPLC）である、請求項１又は２に記載の方法。
- 分析を実施するタンパク質がFSHである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 分析を実施するタンパク質がインターフェロンβ-1aである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- PoloxamerがプルロニックF68（Poloxamer 188）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- プルロニックF68を、タンパク質試料溶液において、超純水中100μg/mlの濃度で使用する、請求項６に記載の方法。
- プルロニックF68を、タンパク質試料溶液において、pH3.8の酢酸ナトリウム緩衝液中0.1%の濃度で使用する、請求項６に記載の方法。
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