ES2297423T3 - Metodo de analisis cromatografico de una solucion proteica. - Google Patents

Metodo de analisis cromatografico de una solucion proteica. Download PDF

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ES2297423T3 ES04733570T ES04733570T ES2297423T3 ES 2297423 T3 ES2297423 T3 ES 2297423T3 ES 04733570 T ES04733570 T ES 04733570T ES 04733570 T ES04733570 T ES 04733570T ES 2297423 T3 ES2297423 T3 ES 2297423T3
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Giuseppe Arpaia
Marco Berardi
Enrico Chavez
Reinoud Driebergen
Carlo Emanuele Giartosio
Pierre Lepage
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Abstract

Un procedimiento de análisis cromatográfico de una proteína en una muestra para cuantificar la proteína, en el que el procedimiento comprende: 1) una etapa de preparar la muestra de proteína para que contenga un poloxámero; 2) una etapa de realizar una cromatografía; y 3) una etapa de tratamiento de datos para determinar la cantidad de la proteína, en la que se determina la cantidad de la proteína usando datos de calibración con un patrón.

Description

Método de análisis cromatográfico de una solución proteica.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a procedimientos para el análisis de proteínas.
Más específicamente, se refiere al análisis de proteínas por procedimientos cromatográficos (por ejemplo CLAR). Por "análisis" de proteínas se quiere dar a entender aquí la determinación cuantitativa de una proteína.
Antecedentes de la invención
En productos farmacéuticos hay que analizar proteínas para cuantificar la proteína y para garantizar su pureza. Esto permite una dosificación correcta y reproducible al paciente.
Son necesarias técnicas analíticas para cuantificar la proteína farmacéutica así como impurezas, agregados, y productos de degradación. En el caso de proteínas multímeras, tales como dímeras, se requieren técnicas analíticas para detectar la presencia y proporción (es decir cantidad) de disociación.
Técnicas analíticas de este tipo deberían ser precisas (es decir el grado de variación debería ser bajo cuando la misma muestra se prueba múltiples veces), y exactas (es decir el valor medido debería estar lo más próximo posible al valor real). La reproducibilidad también es importante.
Un ejemplo de un ensayo analítico que se puede usar con proteínas es la cromatografía por exclusión de tamaño (CET), en la que una proteína en solución acuosa se hace pasar sobre una fase sólida o gel que separa mezclas de proteína por diferencias en su peso molecular. El cromatograma resultante muestra uno o más picos asociados con la proteína o las proteínas en la muestra, que pueden ser identificadas por el peso molecular. El área bajo un pico asociado con una proteína dada se puede usar para cuantificar la cantidad de esa proteína en la muestra. La forma del pico se puede usar para evaluar la pureza.
Otro ejemplo de un ensayo analítico que se puede usar con proteínas es la cromatografía líquida de alta resolución (CLAR), en particular cromatografía líquida de alta resolución de fase reversa (CLAR-FR). Una muestra que contiene la proteína farmacéutica se hace pasar a través de una columna que separa la proteína de cualquier impureza. La proteína y cualquier impureza se eluyen como picos en un cromatograma. Igual que con CET, el área bajo un pico asociado con una proteína dada se puede usar para cuantificar la cantidad de esa proteína en la muestra. La forma del pico se puede usar para evaluar la pureza.
En procedimientos cromatográficos, tales como los anteriormente mencionados, la proteína tiene que estar disuelta en un disolvente acuoso y diluida en una proporción aceptable para el sistema cromatográfico que se use. Durante el manejo de la solución acuosa de proteína, existe el riesgo de que se pierda parte de la proteína por adsorción en la instalación de manejo y confinamiento, tal como paredes de capilares de vidrio y de plástico, tubos de ensayo, vasos de precipitado, jeringas, etc., haciendo difícil la cuantificación de la proteína. La adsorción de proteína conduce a variaciones en los resultados que restan precisión, exactitud y reproducibilidad al ensayo.
Se han usado tensioactivos en la purificación de proteínas por CET, y en ensayos en los que se determina el peso molecular de una nueva proteína, véanse por ejemplo los documentos EP 0530937 y DE 3917949.
Katakam y col., Journal of Pharmaceutical Sciences 84:713-716 (1995) describen un estudio sobre estabilidad física de una formulación de hormona humana del crecimiento tras exposición a interfases aire/agua. Adicionalmente, se investigó la influencia de tensioactivos no iónicos, tales como Pluronic F68, sobre la estabilidad. Se analizó la formación de agregados por CET-CLAR. Este análisis cromatográfico permitió extraer conclusiones sobre la naturaleza de los agregados, a saber el hecho de que fueran no covalentes.
Sería deseable tener un procedimiento cromatográfico de análisis de proteína para cuantificar proteína y/o evaluar pureza, en el que se mejoren la precisión, exactitud y reproducibilidad del ensayo evitando variaciones debidas a adsorción de proteína.
Resumen de la invención
Se ha descubierto ahora que un tensioactivo de la clase de Poloxámeros evita la pérdida de proteína y al mismo tiempo no interfiere con el análisis cromatográfico.
En un primer aspecto, la invención proporciona un procedimiento de análisis cromatográfico de una proteína en una muestra para cuantificar la proteína, en el que el procedimiento comprende:
1)
una etapa de preparar la muestra de proteína para que contenga un poloxámero;
2)
una etapa de realizar una cromatografía; y
3)
una etapa de tratamiento de datos para determinar la cantidad de la proteína, en la que se determina la cantidad de la proteína usando datos de calibración con un patrón.
En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un poloxámero en análisis cromatográfico para cuantificar la proteína en una muestra de proteína.
Descripción detallada de la invención
Los inventores han encontrado que incluyendo un Poloxámero en una solución de proteína que se ha de analizar respecto a contenido de proteína, se disminuye la adsorción de proteína, lo que conduce a que se aumenten precisión, exactitud y reproducibilidad del ensayo.
En el contexto de la presente solicitud, el término "análisis" quiere dar a entender que abarca un procedimiento analítico por el que se determina la cantidad (por ejemplo concentración) de una proteína en una muestra. El procedimiento de la invención comprende un procedimiento para el análisis de la cantidad de una proteína en una muestra, comprendiendo el procedimiento una etapa de preparar la muestra de proteína para que contenga un Poloxámero, y realizar una etapa de cromatografía, preferiblemente una etapa CET o CLAR-FR. La etapa de cromatografía es seguida por una etapa de tratamiento de datos para determinar la cantidad de la proteína. La cantidad de proteína se determina usando datos de calibración con un patrón. La calibración se puede llevar a cabo antes o después del análisis de la muestra.
Los Poloxámeros son copolímeros de bloques hechos de bloques de poli(oxietileno)-poli(oxipropileno) con intervalos de P.M. de 1.000 a > 16.000. Su característica principal es que los segmentos de poli(oxietileno) son hidrófilos y los segmentos de poli(oxipropileno) hidrófobos. Estas sustancias se comportan como tensioactivos no iónicos y generalmente son conocidos con el nombre comercial de "Pluronics".
En conformidad con esta invención se pueden usar muchas clases de Pluronics con diversos intervalos de peso molecular y concentración.
Como se ha mencionado anteriormente, los tensioactivos de Poloxámero (Pluronic) son copolímeros de bloques de oxido de etileno (EO) y oxido de propileno (PO). El bloque de óxido de propileno está emparedado entre dos bloques de óxido de etileno (EO).
1
Los tensioactivos de Pluronic se sintetizan en un procedimiento en dos etapas:
1. Se crea un compuesto hidrófobo del peso molecular deseado mediante la adición controlada de óxido de propileno a los dos grupos hidroxilo de propilenglicol; y
2. Se añade óxido de etileno para emparedar el compuesto hidrófobo entre grupos hidrófilos.
En Pluronic® F77, el porcentaje de poli(oxietileno) (hidrófilo) es 70%, y el peso molecular del compuesto hidrófobo (poli(oxipropileno)) es aproximadamente 2.306 Da.
En Pluronic F87, el porcentaje de poli(oxietileno) (hidrófilo) es 70%, y el peso molecular del compuesto hidrófobo (poli(oxipropileno)) es aproximadamente 2.644 Da.
En Pluronic F88, el porcentaje de poli(oxietileno) (hidrófilo) es 80%, y el peso molecular del compuesto hidrófobo (poli(oxipropileno)) es aproximadamente 2.644 Da.
En Pluronic F68, el porcentaje de poli(oxietileno) (hidrófilo) es 80%, y el peso molecular del compuesto hidrófobo (poli(oxipropileno)) es aproximadamente 1.967 Da.
Propiedades típicas de Pluronic F77 se enumeran a continuación:
Peso molecular medio: 6600;
Punto de fusión/vertido: 48ºC;
Estado físico @ 20ºC: sólido;
Viscosidad (Brookfield) cps: 480 [líquidos a 25ºC, pastas a 60ºC y sólidos a 77ºC];
\vskip1.000000\baselineskip
Tensión superficial, dinas/cm @ 25ºC:
0,1% conc.: 47,0
0,01% conc.: 49,3
0,001% conc.: 52,8
\vskip1.000000\baselineskip
Tensión interfacial, dinas/cm @ 25ºC frente a Nujol:
0,1% conc.: 17,7
0,01% conc.: 20,8
0,01% conc.: 25,5
\vskip1.000000\baselineskip
Humectación de Draves, segundos, 25ºC
1,0% conc.: > 360
0,1% conc.: > 360
\vskip1.000000\baselineskip
Altura de espuma
Ross Miles, 0,1%, mm @50ºC:100
Ross Miles, 0,1%, mm @26ºC:47
Dinámica, 0,1%, mm @ 400 ml/min: > 600
\vskip1.000000\baselineskip
Punto de enturbiamiento en solución acuosa, ºC
1% conc.: > 100
10% conc.: > 100
EHL (equilibrio hidrófilo lipófilo): 25
Propiedades típicas de Pluronic F87 se enumeran a continuación:
Peso molecular medio: 7700;
Punto de fusión/vertido: 49ºC;
Estado físico @ 20ºC: sólido;
Viscosidad (Brookfield) cps: 700 [líquidos a 25ºC, pastas a 60ºC y sólidos a 77ºC];
\vskip1.000000\baselineskip
Tensión superficial, dinas/cm @ 25ºC:
0,1% conc.: 44,0
0,01% conc.: 47,0
0,001% conc.: 50,2
\newpage
Tensión interfacial, dinas/cm @ 25ºC frente a Nujol:
0,1% conc.: 17,4
0,01% conc.: 20,3
0,01% conc.: 23,3
\vskip1.000000\baselineskip
Humectación de Draves, segundos, 25ºC
1,0% conc.: > 360
0,1% conc.: > 360
\vskip1.000000\baselineskip
Altura de espuma
Ross Miles, 0,1%, mm @50ºC:80
Ross Miles, 0,1%, mm @26ºC:37
Dinámica, 0,1%, mm @ 400 ml/min: > 600
\vskip1.000000\baselineskip
Punto de enturbiamiento en solución acuosa, ºC
1% conc.: > 100
10% conc.: > 100
EHL (equilibrio hidrófilo lipófilo): 24
\vskip1.000000\baselineskip
Propiedades típicas de Pluronic F88 se enumeran a continuación:
Peso molecular medio: 11400;
Punto de fusión/vertido: 54ºC;
Estado físico @ 20ºC: sólido;
Viscosidad (Brookfield) cps: 2300 [líquidos a 25ºC, pastas a 60ºC y sólidos a 77ºC];
\vskip1.000000\baselineskip
Tensión superficial, dinas/cm @ 25ºC:
0,1% conc.: 48,5
0,01% conc.: 52,6
0,001% conc.: 55,7
\vskip1.000000\baselineskip
Tensión interfacial, dinas/cm @ 25ºC frente a Nujol:
0,1% conc.: 20,5
0,01% conc.: 23,3
0,01% conc.: 27,0
\vskip1.000000\baselineskip
Humectación de Draves, segundos, 25ºC
1,0% conc.: > 360
0,1% conc.: > 360
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.930000\baselineskip
Altura de espuma
Ross Miles, 0,1%, mm @50ºC:80
Ross Miles, 0,1%, mm @26ºC:37
Dinámica, 0,1%, mm @ 400 ml/min: > 600
\vskip1.000000\baselineskip
Punto de enturbiamiento en solución acuosa, ºC
1% conc.: > 100
10% conc.: > 100
EHL (equilibrio hidrófilo lipófilo): 28
\vskip1.000000\baselineskip
Propiedades típicas de Pluronic F68 se enumeran a continuación:
Peso molecular medio: 8400;
Punto de fusión/vertido: 52ºC;
Estado físico @ 20ºC: sólido;
Viscosidad (Brookfield) cps: 1000 [líquidos a 25ºC, pastas a 60ºC y sólidos a 77ºC];
\vskip1.000000\baselineskip
Tensión superficial, dinas/cm @ 25ºC:
0,1% conc.: 50,3
0,01% conc.: 51,2
0,001% conc.: 53,6
\vskip1.000000\baselineskip
Tensión interfacial, dinas/cm @ 25ºC frente a Nujol:
0,1% conc.: 19,8
0,01% conc.: 24,0
0,01% conc.: 26,0
\vskip1.000000\baselineskip
Humectación de Draves, segundos, 25ºC
1,0% conc.: > 360
0,1% conc.: > 360
\vskip1.000000\baselineskip
Altura de espuma
Ross Miles, 0,1%, mm @50ºC:35
Ross Miles, 0,1%, mm @26ºC:40
Dinámica, 0,1%, mm @ 400 ml/min: > 600
\vskip1.000000\baselineskip
Punto de enturbiamiento en solución acuosa, ºC
1% conc.: > 100
10% conc.: > 100
EHL (equilibrio hidrófilo lipófilo): 29
\global\parskip1.000000\baselineskip
En los procedimientos de la invención también se pueden usar otros polímeros que tengan propiedades similares a las que se han enumerado anteriormente. El tensioactivo preferido es Pluronic F68 (Poloxámero 188), y tensioactivos que tengan propiedades similares.
El procedimiento según la invención se puede usar esencialmente con cualquier proteína, por ejemplo, insulina, etanercept, Factor VIII, hormona del crecimiento (Somatotropina), anticuerpos (tales como infliximab), factor inhibidor de leucemia (FIL, enfilermin), una interleucina, tal como interleucina-6 (Atexakin alfa), proteína que se une al factor de necrosis tumoral (TBP-1, onercept), proteína que se une a interleucina-18 (IL-18, Tadekin), anti-CD11a (Efalizumab). En una realización preferida, la proteína es una glicoproteína tal como eritropoyetina (EPO), darbepoyetina alfa, proteína C humana, interferones (tales como interferón beta 1a, 1b, particularmente preferiblemente interferón beta 1a), alfa galactosidasa A. Preferiblemente la proteína es una proteína dímera, es decir compuesta de subunidades (que incluyen heterodímeros), particularmente preferiblemente una glicoproteína dímera o heterodímera, por ejemplo hormona estimuladora de tiroides (HET), y las gonadotropinas: hormona estimuladora de folículo (HEF), hormona luteinizante (HL), y gonadotropina coriónica(GC). Preferiblemente estas proteínas son proteínas
humanas.
En los Ejemplos que siguen, se usa Pluronic F68 (Poloxámero 188) a la concentración de 100 \mug/ml en agua ultrapura. Sin embargo, se entiende que el uso de diferentes clases de Pluronic y diferentes concentraciones del mismo está englobado en la presente invención.
Ejemplo 1 Preparación de muestra mejorada en el procedimiento de CET de determinación cuantitativa de HEF
El propósito de este estudio era habilitar una preparación de muestra mejorada en el procedimiento de Cromatografía por Exclusión de Tamaño (CET) respecto al contenido en proteína en una preparación que contiene rec-HEF (Fertinex, en este caso Fertinex 75 IU).
La modificación implementada era el uso de una solución que incluía 100 \mug/ml de Pluronic F68 en agua ultrapura para preparación de todas las soluciones de proteína (muestra, muestra de control y patrón) a fin de controlar las pérdidas de proteína debidas a adsorción.
Se prepararon y se analizaron muestras que consistían en mezclas de HEF heterodímera (HEF se compone de subunidad-\alpha y subunidad-\beta) y HEF disociada. El procedimiento permitió la cuantificación de HEF heterodímera y subunidades libres.
Este estudio muestra que una curva de calibración de punto único que usa patrón de referencia de producto medicinal es adecuada para determinar el contenido de proteína con una buena precisión total de 2,0% y que el procedimiento es lineal dentro del intervalo probado (26,6 a 160 \mug/ml).
Además, se pueden usar sistemas de CLAR tanto de Waters como de Varian según se muestra durante el estudio. La diferencia en los resultados medios de contenido de proteína de todos los lotes es más baja que la precisión total del procedimiento.
Es importante destacar que este cambio no tuvo impacto alguno sobre el propio procedimiento CET original.
Más específicamente, la modificación de las preparaciones de muestra y patrón fue como sigue:
\bullet
Uso de 100 \mug/ml de Pluronic F68 en agua ultrapura para la preparación muestras y patrón de referen- cia.
\bullet
La solución para ensayo en blanco que se usa a lo largo de la secuencia analítica es la solución de 100 \mug/ml de Pluronic F68.
\bullet
La preparación para muestra de control de SST así como para muestras de control inyectadas durante la sesión analítica se realiza reconstituyendo y juntando ampollas suficientes para que permitan las inyecciones del sistema adecuadamente así como para los controles que se inyectan a lo largo de la sesión analí- tica.
Materiales e instalación Materiales
Muestra de control: HEF urinaria altamente purificada (u-HEF-HP) lote 1730410
Muestras de prueba: 75 IU (u-HEF-HP) lotes n^{os}. 17301010, 17315040 y 17318040.
Instalación
Bomba de CLAR mod. 600E ó 626 [Waters]
Detector UV mod. 486 ó 996 [Waters]
Columna: Progel TSK G2000 SW 60 cm X 7,5 mm [Supelco]
Procedimiento
Se acondicionó la columna durante una hora con la fase móvil (tampón de fosfato 0,1 M; Na_{2}SO_{4} 0,1 M, pH 6,70), a un caudal de 0,70 ml/minuto. Se mantuvo la columna a 4ºC aproximadamente a lo largo del análisis.
Para análisis, se usaron las siguientes soluciones:
Solución patrón: se preparó una solución de HEF altamente purificada (0,041 \mug/\mul) con Pluronic F68 (100 \mug/ml).
Soluciones de muestra: se prepararon las soluciones de muestra para que tuvieran cantidades variables de HEF heterodímera (Fertinex) y HEF disociada, en solución que contenía Pluronic F68 (100 \mug/ml).
Soluciones de control: se preparó solución de control usando HEF disuelta en una solución que contenía Pluronic F68 (100 \mug/ml).
Se inyectaron las soluciones de patrón y de muestra (100 \mul), y se eluyó la columna a un caudal constante de 0,70 ml/min. La detección fue por absorción UV a 214 nm. Se usó el área bajo los picos para determinar HEF heterodímera y las respectivas subunidades de HEF.
Resultados
La precisión de un procedimiento analítico expresa la proximidad de la concordancia (grado de dispersión) entre una serie de mediciones obtenidas a partir de un muestreo múltiple de una misma muestra homogénea bajo las condiciones prescritas. La precisión se puede considerar a tres niveles: repetibilidad (o precisión intra-ensayo), precisión intermedia y reproducibilidad. Durante este estudio se lograron repetibilidad, precisión intermedia así como reproducibilidad del ensayo.
En cinco sesiones analíticas independientes, se cuantificaron tres lotes de productos medicinales de Fertinex frente al patrón (curva de calibración).
Con los resultados de Fertinex 75 IU que se presentan en la Tabla 1, se usó un diseño de análisis de varianza (ANOVA) Anidado para estimar la repetibilidad (o precisión intra-ensayo), la precisión intermedia y la reproducibilidad (precisión total) del procedimiento analítico. El número total de resultados bajo estudio fue 45. Los resultados obtenidos fueron como sigue:
\bullet
Repetibilidad (o precisión intra-ensayo): 1,3%
\bullet
Precisión intermedia: 1,0%
\bullet
Reproducibilidad (precisión total): 1,6%.
Los resultados globales se tabulan en la siguiente Tabla 1:
TABLA 1 Resultados de contenido en proteína (\mug/ampolla) obtenidos con patrón de curva de calibración
2
Los resultados patrón obtenidos al estudiar la precisión y robustez se usaron para identificar la linealidad y el intervalo del procedimiento analítico. La aproximación para el análisis estadístico fue comprobar la homogeneidad de la varianza (prueba de Cochran C y Bartlett), el defecto de ajuste y realizar análisis de regresión (coeficiente de correlación). Del Ciclo 1 al Ciclo 5 se hicieron con sistemas de Waters mientras que del Ciclo 6 al Ciclo 8 se hicieron con sistema de Varian.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 2 Resultados estadísticos respecto a linealidad
3
Como puede verse, los valores p de las pruebas de Cochran y Bartlett son siempre mayores de 0,05 lo que da a entender que no hay diferencia estadísticamente significativa entre las desviaciones típicas al 95% de nivel de confianza y también se cumple siempre un coeficiente de correlación superior a 0,9980.
Se comprobó el defecto de ajuste para determinar si la regresión lineal es un modelo adecuado para describir los datos observados. Basados en esta prueba estadística, la regresión lineal resultó ser el mejor modelo para describir los datos incluso si el valor p del Ensayo 7 es no mayor de 0,05. Para esa sesión analítica particular, la regresión lineal todavía es el mejor modelo con un 99,96% de ajuste. Se probaron otros modelos, tales como los modelos exponenciales y de raíz cuadrada, y no mostraron un ajuste mejor de los datos observados.
Ejemplo 2 Preparación de muestra mejorada y procedimiento de adición en el procedimiento CET de determinación de pureza de HEF
En un experimento de adición, se añadieron cantidades conocidas tanto de HEF heterodímera como de HEF disociada a una muestra de HEF ("de adición"). Los picos resultantes de subunidades heterodímeras y/o disociadas se evaluaron respecto a % de recuperación y % de pureza.
La modificación implementada en el procedimiento analítico es el uso de una solución que incluye 100 \mug/ml de Pluronic F68 en agua ultrapura para preparación de todas las soluciones de proteína (muestra, solución de adición) para controlar las pérdidas de proteína debidas a la adsorción. Las modificaciones se hicieron específicamente para aumentar la precisión del procedimiento, sin impactar en la cromatografía del procedimiento, para posibilitar una determinación de pureza más precisa y exacta.
En la estructura de este estudio, también se investigó la determinación de la precisión del procedimiento. La precisión del procedimiento (precisión total 1,8%) se mejoró ligeramente cuando se comparó con la precisión del procedimiento observada durante la validación del procedimiento analítico sin introducción de Pluronic F68 (precisión 2%). La recuperación regular de las soluciones de adición al 100% indica una buena exactitud.
Se realizó un experimento de adición suplementario para determinar aún más la exactitud del procedimiento. Se observó que se obtiene diferente área bajo el pico para la solución de adición con y sin Pluronic F68. El área de la solución de adición con Pluronic F68 en la preparación de la muestra es aproximadamente dos veces mayor que la de la solución de adición preparada sin el uso de Pluronic F68.
Se piensa que las diferentes áreas observadas son debidas a la adsorción de las subunidades disociadas sobre el material de polipropileno usado para la preparación de muestra.
En las Tablas 3 y 4 siguientes se puede ver que la recuperación de subunidades de HEF libres de adición está dentro del intervalo 95% - 105%. Además, también se puede ver que la precisión [reseñada como coeficiente de variabilidad (% CV)] sobre los cinco ciclos oscila de 1,0% a 1,5% tanto para la pureza como para la recuperación de la adición. Cuanto más bajo es el % de CV, menor es la variabilidad entre ciclos.
Esto es una mejora sustancial sobre las muestras preparadas sin Pluronic F68.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 3 Resultados de % de recuperación de la adición
4 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 4 Resultados de % de pureza de la adición
5
En la estructura de otro protocolo de estudio, se realizó el análisis de lotes de producto medicinal con y sin uso de Pluronic F68. Uno de los resultados es que el área bajo el pico de la solución de adición (r-hHEF disociada) se multiplica aproximadamente por dos con la introducción de Pluronic F68. Este fenómeno es debido lo más probablemente a la adsorción de subunidades libres sobre el material usado durante la preparación si no está presente Pluronic G68. Para determinar si este aumento de área tiene impacto sobre el análisis, se realizó un experimento de adición a tres niveles sin y con Pluronic F68. Las siguientes muestras se probaron por duplicado:
1. Preparación de muestra con Pluronic F68
\bullet
Muestra sin solución de adición;
\bullet
Muestra a la que se adiciona r-hHEF disociada (2 \mug por inyección);
\bullet
Solución para adición (2 \mug de r-hHEF disociada por inyección);
\bullet
Muestra a la que se adiciona r-hHEF disociada (1,5 \mug por inyección);
\bullet
Solución para adición (1,5 \mug de r-hHEF disociada por inyección);
\bullet
Muestra a la que se adiciona r-hHEF disociada (1 \mug por inyección);
\bullet
Solución para adición (1 \mug de r-hHEF disociada por inyección);
\newpage
Los resultados se presentan en la tabla 5:
TABLA 5 Resultados de preparaciones de muestra que usan Pluronic F68: área bajo el pico
6
A partir de la tabla anterior, se puede ver que la adición de Pluronic F68 da buenos resultados en términos de % de recuperación de la adición, que está próxima a la recuperación teórica (100%) y del % de recuperación de áreas. Este último parámetro se calcula dividiendo el área de la solución de adición al nivel de adición definido entre el área de la solución de adición al 100%. El resultado (es decir 76% para adición con 1,5 \mug/inyección) se compara con el nivel de adición teórico realizado (es decir 75%).
2. Preparación de muestra sin Pluronic F68
Las siguientes muestras se probaron por duplicado:
\bullet
Muestra sin solución de adición;
\bullet
Muestra a la que se adiciona r-hHEF disociada (2 \mug por inyección);
\bullet
Solución para adición (2 \mug de r-hHEF disociada por inyección);
\bullet
Muestra a la que se adiciona r-hHEF disociada (3 \mug por inyección);
\bullet
Solución para adición (3 \mug de r-hHEF disociada por inyección);
\bullet
Muestra a la que se adiciona r-hHEF disociada (4 \mug por inyección);
\bullet
Solución para adición (4 \mug de r-hHEF disociada por inyección);
Los resultados se muestran en la Tabla 6 siguiente:
TABLA 6 Resultados de las preparaciones de muestra sin Pluronic F68: área bajo el pico
7
Para los resultados obtenidos sin el uso de Pluronic F68 en la preparación de muestra, la recuperación de solución de adición se desvía 4-5% de la recuperación teórica (100%). Para % de recuperación de áreas, los resultados se desvían significativamente del nivel de adición teórico realizado, debido a un área demasiado baja de la solución de adición.
Se piensa que los diferentes resultados obtenidos con y sin Pluronic F68 se pueden explicar por la adsorción de las muestras de prueba sobre el material usado durante la preparación de muestra si no se incluye Pluronic en las soluciones de ensayo. El área bajo el pico de solución de adición obtenida para el mismo nivel de adición (100%) es aproximadamente dos veces mayor cuando está presente Pluronic F68 y evita la adsorción.
La adsorción de subunidades libres se puede calcular por diferencia entre el área bajo el pico de la solución de adición con Pluronic F68 y el área de la solución de adición sin Pluronic F68 a nivel de adición de 2\mug por inyección (100%) [es decir restando el área bajo el pico a un nivel de adición de 100% sin Pluronic F68 (Tabla 6: 922106) del área bajo el pico a un nivel de adición de 100% con Pluronic F68 (Tabla 5: 2037915)]. La diferencia corresponde a un área de 1115809. Esta área refleja la cantidad de subunidades disociadas que se adsorben durante la preparación de muestra cuando no está presente Pluronic F68, y se puede usar para corregir el área obtenida en ausencia de Pluronic F68. Las recuperaciones de área calculadas teniendo en cuenta esta corrección se pueden ver en la tabla 7. Los datos están más próximos al nivel de adición teórico.
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TABLA 7 % de recuperación de área con y sin tener en cuenta adsorción (en ausencia de Pluronic F68)
8
Los resultados de pureza presentados en las tablas 5 y 6 difieren sin y con la introducción de Pluronic. También se piensa que esta diferencia ha de ser un efecto del fenómeno de adsorción. El porcentaje de pureza es significativamente más exacto cuando se usa Pluronic F68.
Varios lotes de producto se probaron por CET respecto a pureza sin y con introducción de Pluronic F68 en la preparación de muestra. Los resultados se pueden ver en la tabla 8:
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 8 Resultados de % de recuperación y % de pureza de producto medicinal probado sin y con Pluronic F68
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Pureza y recuperación de la solución de adición
Basados en los datos presentados en la Tabla 8 anterior, se puede ver que la diferencia entre la recuperación sin y con introducción de Pluronic es aproximadamente 2%. Esta diferencia es estadísticamente significativa cuando se realiza ANOVA a un nivel de confianza de 95% (valor p 0,008). Además, cuando se observa la misma tabla también se puede ver una diferencia significativa de aproximadamente 7% en pureza con y sin introducción de Pluronic F68 (ANOVA valor p 1,2 10^{-8}).
Aun más, se puede ver a partir de la Tabla 8 que el % de CV es más bajo cuando se incluyó Pluronic F68 en la solución de muestra [2,5% sin Pluronic F68 frente a 1,5 y 1,8% con Pluronic F68]. Un % de CV más bajo indica un grado de variabilidad menor entre ciclos.
Estas diferencias estadísticas en pureza y recuperación de la solución de adición pueden ser explicadas por el fenómeno de adsorción que ocurre durante la preparación de muestra cuando no se usa Pluronic F68 (véase la siguiente Tabla 9).
En la Tabla 9 y Tablas posteriores, "Dímeros y Agregados" se refiere a moléculas de HEF agregadas y dímeros de HEF heterodímera que generalmente se considera que son indeseables.
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11
12 
\newpage
13 
\newpage
A partir de la Tabla 9 se puede ver la precisión (% de CV) de las áreas usadas para el cálculo de pureza y recuperación de soluciones de adición es casi siempre mejor con Pluronic F68 que sin la introducción de Pluronic F68 [% de CV más bajo indica precisión mejorada].
Las tasas de adsorción de dímeros y agregados, subunidades libres y monómero son diferentes como se puede ver cuando se calcula la relación de área media con Pluronic F68/área media sin Pluronic F68. Como se puede ver en la tabla 10, el aumento de % de área con Pluronic F68 no es constante dependiendo del área considerada.
TABLA 10 % de aumento de área con introducción de Pluronic F68
14
Para determinar la pureza, se tiene que realizar la adición de subunidades libres debido al hecho de que el pico de unidades libres no se resuelve del pico principal durante la prueba de preparación de muestra. El % de pureza (ó % de monómero) se expresa por la fórmula a continuación:
% Pureza = \frac{A + B - C - D}{A}
donde:
A: Área total de muestra sin adición
B: Área total de solución para adición
C: Área del pico de subunidades de muestra de adición
D: Dímeros y agregados en muestra sin adición.
El criterio de aceptación para recuperación de adición se expresa como sigue:
% Recuperación = \frac{E}{A + B}
donde:
A: Área total de muestra sin adición
B: Área total de solución para adición
E: Área total de muestra de adición.
Teniendo en consideración las fórmulas anteriores, se puede realizar el cálculo de la pureza con y sin introducción de Pluronic F68. Además, para tener en consideración el efecto de Pluronic F68, también se pueden hacer cálculos con áreas sin introducción de Pluronic F68 que tienen en cuenta el efecto de adsorción. Las fórmulas serán las
siguientes:
\newpage
% \ Pureza \ corregida = \frac{A \ x \ R_{a} + B \ x \ R_{b} - C \ x \ R_{c} - D \ x \ R_{d}}{A \ x \ R_{a}}
\vskip1.000000\baselineskip
\quad
% \ Recuperación \ corregida = \frac{E \ x \ R_{e}}{A \ x \ R_{a} + B \ x \ R_{b}}
donde:
A: Área total de muestra sin adición
B: Área total de solución para adición
C: Área del pico de subunidades de muestra de adición
D: Dímeros y agregados en muestra sin adición
E: Área total de muestra de adición
R_{x}: Relación de área media X con Pluronic F68 dividida entre área media X sin Pluronic F68.
Ejemplo 3 Ensayo de interferón beta-1a por CLAR-FR: Habilitación de una aproximación de un punto patrón frente a la aproximación de una curva patrón
Este Ejemplo muestra como, en el caso de ensayo de interferón beta-1a por CLAR-FR, fue posible modificar una aproximación de curva patrón, que se denomina en adelante "ensayo actual", a una aproximación de "Un Punto Patrón" aplicando el procedimiento mejorado de esta invención, esto es, usando un tensioactivo Pluronic para evitar pérdidas de muestra.
En la preparación de muestra de sustancia medicinal para el procedimiento mejorado de la invención, se diluyó 1 a 7 interferón beta-1a usando como tampón de dilución acetato sódico 0,05 M que contenía 0,1% de Poloxámero 188 (Pluronic F68) a pH 3,8 en vez de acetato sódico 0,05 M a ph 3,8 sin Poloxámero.
El ensayo CLAR-FR optimizado se habilitó según las directrices ICH y se identificaron las siguientes características:
\bulletIntervalo de linealidad: Se verificó la linealidad para la inyección de interferón beta-1a en el intervalo de 3,3 a 8,8 \mug, con una ordenada en el origen estadísticamente no diferente de cero. Estos resultados apoyan la aproximación Un Punto Patrón.
\bulletPrecisión: Se comparó la precisión del ensayo optimizado que usa el Patrón de Producto Medicinal y la aproximación de Un Punto Patrón con la precisión obtenida con el ensayo actual que usa el Patrón de Sustancia Medicinal y la aproximación de curva Patrón. Se mostró que la precisión global obtenida para un replicado con el ensayo optimizado que usa Pluronic F68 (CV acumulado de 1,2% para todas las muestras de Sustancias Medicinales y Productos medici-
nales) era mejor que la precisión de 1,9% obtenida para un replicado con el ensayo actual, que no usó Pluronic F68.
\bulletEspecificidad: Los componentes que se pueden observar en el ensayo optimizado ya están presentes en las formulaciones de Sustancia Medicinal y Producto Medicinal que se analizan en el ensayo actual que se validó respecto a especificidad. Se demostró que la presencia de Poloxámero 188 en el nuevo Patrón no interfiere en el ensayo optimizado. Dado que en el ensayo optimizado no se introducen componentes adicionales, el ensayo optimizado es por lo tanto específico.
\bulletExactitud: La exactitud del ensayo optimizado se evaluó por comparación de los resultados obtenidos con el ensayo optimizado frente a los resultados obtenidos con el ensayo actual, siendo considerados estos últimos resultados como el valor de referencia. A este fin, se analizaron varias Sustancias Medicinales y Productos Medicinales (formulación líquida que contiene HSA, formulación líquida exenta de HSA). En todos los casos, la relación Optimizado/Actual del ensayo de interferón beta-1a no fue estadísticamente diferente de 100% lo que demuestra que los dos ensayos de interferón beta-1a generan resultados estadísticamente equivalentes.
En conclusión, el procedimiento tiene una precisión mejor que el ensayo actual, y genera resultados exactos estadísticamente equivalentes a los obtenidos con el ensayo actual.
Esta invención se ha descrito con referencia a ejemplos tanto de determinación cuantitativa de proteínas como de evaluación de pureza de las mismas en procedimientos cromatográficos tanto de CET como de CLAR-FR.

Claims (11)

1. Un procedimiento de análisis cromatográfico de una proteína en una muestra para cuantificar la proteína, en el que el procedimiento comprende:
1)
una etapa de preparar la muestra de proteína para que contenga un poloxámero;
2)
una etapa de realizar una cromatografía; y
3)
una etapa de tratamiento de datos para determinar la cantidad de la proteína, en la que se determina la cantidad de la proteína usando datos de calibración con un patrón.
2. Un procedimiento de la reivindicación 1, que incluye adicionalmente la etapa de preparar una muestra diluida para llevar la concentración de la proteína a un nivel aceptable para el sistema cromatográfico que se use.
3. Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la cromatografía es cromatografía por exclusión de tamaño (CET) o CLAR de fase reversa (CLAR-FR).
4. Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína sobre la que se lleva a cabo el análisis es una glicoproteína dímera.
5. Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína sobre la que se lleva a cabo el análisis es HEF.
6. Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 3, en el que la proteína sobre la que se lleva a cabo el análisis es un interferón.
7. Un procedimiento de la reivindicación 6, en el que la proteína sobre la que se lleva a cabo el análisis es un interferón beta-1a.
8. Un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el Poloxámero es Pluronic F68 (Poloxámero 188).
9. Un procedimiento de la reivindicación 8, en el que se emplea Pluronic F68 a una concentración de 100 \mug/ml en agua ultrapura en la solución de muestra de proteína.
10. Un procedimiento de la reivindicación 8, en el que se emplea Pluronic F68 a una concentración de 0,1% en tampón de acetato sódico a pH 3,8 en la solución de muestra de proteína.
11. El uso de un poloxámero en análisis cromatográfico para cuantificar la proteína en una muestra de proteína.
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