CN105431378A - 纳米粒子-抗体偶联物的纯化 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用大小排阻层析纯化抗体-纳米粒子偶联物的方法。

Description

纳米粒子-抗体偶联物的纯化
相关专利申请是交叉引用
本申请要求基于2014年6月25日提交的第62/016,752号美国临时申请的优先权，该申请通过引用纳入本文用于所有目的。
背景技术
P-点纳米粒子(如第US2012/0282632号专利公开中所述)有很强的荧光，偶联于抗体或其他蛋白质时是有用的报道子。抗体与纳米粒子之间的偶联反应通常采用过量抗体以获得最适偶联比。偶联后，偶联物需与过量游离抗体分离，因为未偶联的抗体会与偶联物竞争目标物结合。由于游离抗体与纳米粒子大小和密度相近，这成了难题。
发明概述
在此提供的是将抗体-纳米粒子偶联物与游离抗体分离并纯化的方法。一些实施方式中，所述方法包括：提供抗体-纳米粒子偶联物、游离抗体、聚二醇表面活性剂和缓冲液的混合物，该混合物的离子强度至少50mM；该混合物与基于多糖的大小排阻介质接触由此将抗体-纳米粒子偶联物与游离抗体分离；从介质中收集富集了所述抗体-纳米粒子偶联物的级份，由此与游离抗体分离并纯化。
一些实施方式中，基于多糖的大小排阻介质包含琼脂糖。
一些实施方式中，缓冲液包含磷酸盐。一些实施方式中，缓冲液是磷酸盐缓冲液(PBS)。一些实施方式中，PBS的浓度是0.5-2.0X。
一些实施方式中，抗体是IgG抗体。一些实施方式中，抗体是四聚体IgG抗体。
一些实施方式中，纳米粒子是聚合物点(p-点)。一些实施方式中，p-点直径为5-100nm，并且是胶体半导体聚合物。一些实施方式中，p-点有荧光。
一些实施方式中，表面活性剂是PluronicF-68。一些实施方式中，表面活性剂在混合物中的浓度是0.02％-1.0％。
一些实施方式中，混合物的离子强度是75-300mM。
一些实施方式中，混合物还包含游离纳米粒子，所述介质将游离纳米粒子与偶联物分离。
另一实施方式中，所述方法包括：提供抗体-纳米粒子偶联物、游离抗体、聚烷二醇表面活性剂和缓冲液的混合物，所述混合物的离子强度至少50mM；所述混合物与纳米膜过滤器接触从而将抗体-纳米粒子偶联物与游离抗体分离；由所述过滤器中收集富集了所述抗体-纳米粒子偶联物的级份，由此将抗体-纳米粒子偶联物与游离抗体分离并纯化。
一些实施方式中，缓冲液包含磷酸盐。一些实施方式中，缓冲液是磷酸盐缓冲液(PBS)。一些实施方式中，PBS的浓度是0.5-2.0X。
一些实施方式中，抗体是IgG抗体。一些实施方式中，抗体是四聚体IgG抗体。
一些实施方式中，所述纳米粒子是聚合物点(p-点)。一些实施方式中，所述p-点直径为5-100nm，并且是胶体半导体聚合物。一些实施方式中，p-点有荧光。
一些实施方式中，表面活性剂是PluronicF-68。一些实施方式中，表面活性剂在混合物中的浓度是0.02％-1.0％。
一些实施方式中，混合物的离子强度是75-300mM。
一些实施方式中，混合物还包含游离纳米粒子，所述介质将游离纳米粒子与偶联物分离。
定义
“抗体”指免疫球蛋白或其片段形式。抗体一词包括但不限于来自人或其他哺乳动物细胞系的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM各类多克隆抗体或单克隆抗体，包括天然形式的和基因改造的抗体，例如人源化抗体，人抗体，单链抗体，嵌合抗体，合成抗体，重组抗体，杂合抗体，突变抗体，接枝抗体，以及体外产生的抗体。“抗体”还可包括复合物形式，这包括但不限于含有免疫球蛋白部分的融合蛋白。“抗体”还可包括抗体片段，例如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb、Fc，以及其他组成，不论它们是否保留有抗原结合功能。
附图说明
图1是463nm吸光度对级份数曲线的比较。所展示的实验是在30cm的Superose6柱上纯化低离子强度20mM的HEPES-KOH缓冲液中的纳米粒子-抗体偶联样品。
图2是463nm吸光度对级份数曲线的比较。所展示的实验是在30cm的Superose6柱上纯化含0.1％PluronicF-68的1XPBS中的纳米粒子-抗体偶联样品。
发明详述
抗体-纳米粒子偶联物难以与没有偶联的游离抗体分离并纯化是因为偶联物与游离抗体的大小和密度近乎相同，还因为纳米粒子容易聚结和沉淀。发明人出乎意料地发现，一些条件的组合能够实现抗体-纳米粒子偶联物与游离抗体的分离。即，本发明发明人发现，含表面活性剂的高离子强度缓冲液可用于保持偶联物的溶解，并在基于多糖的大小排阻介质上产生偶联物与游离抗体的充分分离，从而能纯化偶联物。
据信，该纯化方法适用于多种抗体-纳米粒子偶联物。例如，一些实施方式中，抗体是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体。一些实施方式中，抗体是抗原结合性抗体片段，例如Fab、F(ab')2或Fv，或是包含这些片段的融合蛋白。一些实施方式中，抗体是单链抗体如scFv，一种或多种抗体的重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)的融合体。抗体可以是重组抗体或天然抗体。抗体可可以是人、小鼠、大鼠、兔、牛、山羊、骆驼或其他产抗体物种的抗体。
纳米粒子是纳米级的离子，例如约1nm至约1000。一些实施方式中，粒子大小为1-300nm、5-80nm或8-60nm。许多纳米粒子大致为球形，因此尺寸以球形的半径或直径表示。也可用流体动力学半径或直径来定义纳米粒子的尺寸。
一些实施方式中，纳米粒子是荧光半导体聚合物点。此类p-点的例子可见于，例如Wu,C等，Chem.Mater.，21:3816-3822(2009)；Rahim,N.A.A.等，Adv.Mater.21:3492-3496(2009),Rong等，ACSNano7(1):376-84(2013)；专利公开US2013/0266957、WO2012/054525和2012/0282632。层析p-点可通过将聚合物塌缩(collapsing)成稳定的亚微米粒子来制备。本发明的纳米粒子可用本领域已知的各种聚合物塌缩方法来获得，包括但不限于依赖于沉淀的方法，依赖于形成乳液的方法(如细乳液或微乳液)以及依赖于凝结的方法。
可根据需要将纳米粒子官能化以便纳米粒子连接抗体。纳米粒子的官能化可参见例如美国专利公开US2012/0282632。例如，可将纳米粒子官能化为具有一个或多个羧酸基团，于是可用这些基团通过一个或多个街头连接抗体。偶联物的组分(如抗体和纳米粒子)可共价或非共价相连。非共价连接的一个例子是生物素-链霉亲和素亲和力，此时，偶联物成员之一生物素化，另一成员则连接链霉亲和素。连接的其他选择例如但不限于：纳米粒子与抗体的胺直接偶联；用马来酰亚胺修饰纳米粒子然后连接具有外露巯基(例如抗体经巯基乙胺或2-亚氨基硫烷(Traut试剂)处理而产生的外露巯基)的抗体；用肼修饰纳米粒子并连接具有氧化多糖(醛)的抗体；或采用点击化学(例如，用变形炔烃(strainedalkyne)修饰纳米粒子并连接叠氮化物修饰的抗体)。
各种偶联方法都可用于将抗体与纳米粒子偶联。一般说来，为产生理想得率的偶联物，偶联反应中抗体是过量的。由此会在偶联反应后产生大量游离(没有偶联的)抗体。一些实施方式中，反应混合物中还有一定量的没有偶联的游离纳米粒子。在此所述的方法能够用于将偶联物与偶联反应的没有偶联的游离组分分离并纯化。一些实施方式中，采用了与残余反应性基团反应从而阻断反应的物质。例如，马来酰亚胺官能化的纳米粒子与巯基化或经还原的抗体之间的偶联可用烷基化剂(包括但不限于N-乙基马来酰亚胺)来终止或淬灭。附加了NHS的纳米粒子与蛋白质之间的反应可用胺(包括但不限于乙醇胺)来终止或淬灭。
偶联后，所得偶联混合物(纳米粒子/抗体偶联物和未反应的游离抗体，可能还有游离纳米粒子)被调至至少50mM(例如50-500mM、50-300mM、100-300mM等)的离子强度。例如，混合物的离子强度可用高离子强度缓冲液(如含有高浓度粒子的缓冲液)来调节，由此保持上述离子强度。一些实施方式中，所述缓冲液包含至少50或100mMNa+或K+。一些实施方式中，所述缓冲液包含磷酸盐(PO4 3-)。缓冲液例子之一是磷酸盐缓冲液(PBS)(1XPBS＝10mM磷酸钠，150mM氯化钠，pH7.8)。一些实施方式中，混合物中包含0.5-3X，如0.5-2.0X、如1X的PBS。
离子强度按下式计算：
I = 1 2 Σ i = 1 n c i z i 2 ,
其中，ci是离子i的摩尔浓度(M，mol/L)，zi是离子的电荷数，对溶液中所有粒子求和。
混合物中还包括足量的表面活性剂，用于防止偶联物从混合物中聚结和沉淀，尤其加入高离子强度缓冲液后，否则会发生偶联物聚结和沉淀。一些实施方式中，表面活性剂是非离子聚二醇表面活性剂。一些实施方式中，表面活性剂是含聚氧丙烯的表面活性剂，如泊洛沙姆表面活性剂。泊洛沙姆表面活性剂的特征在于中央的聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))疏水链及其两侧的两个聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))亲水链。由于聚合物链段的长度可定制，现有许多不同的泊洛沙姆，性能略有差异。泊洛沙姆共聚物的命名一般为字母"P"(代表泊洛沙姆)后接三个数字，前两位乘以100即聚氧丙烯核心的大致分子量，最后一位乘以10即聚氧乙烯含量百分比(例如，P407＝聚氧丙烯分子量为4,000g/mol、含70％聚氧乙烯的泊洛沙姆)。至于Pluronic和Synperonic的泊洛沙姆的商品名，这些共聚物编号首先是表示其室温下的物理形态的字母(L＝液体，P＝膏体，F＝片(固态))，接着是两位或三位数字。第一位数字(三位数时则是前两位)乘以300即疏水链的大致分子量，最后一位乘以10即聚氧乙烯含量百分比(例如，F-68表示聚氧丙烯分子量1,800g/mol，含80％聚氧乙烯)。泊洛沙姆表面活性剂的例子包括但不限于：PluronicsF-68。表面活性剂的浓度可用常规方法测定(即，不致偶联物沉淀出现的滴定量)。一些实施方式中，表面活性剂的浓度是0.02％-1％，如0.05-0.2％，如0.1％。
然后，将含有表面活性剂、偶联物和游离抗体的含缓冲高离子强度混合物加到基于多糖(即含有多糖)的大小排阻介质上，用以将偶联物与游离抗体及可能存在的游离纳米粒子分离。大小排阻介质用于层析时，根据分子量或体积大小来分离分子。大小排阻层析是基于可溶蛋白质或其他目标分子通过特定大小颗粒的填充柱时的选择性透过，所述颗粒具有孔，孔的大小通常但不必定已知。比孔大的蛋白质不会进入孔。不进孔的大蛋白绕过颗粒，在空体积(Vo)中洗脱。很小的蛋白质和盐滞留在颗粒内，直到达到总透过体积(Vt)。空体积和总透过体积之间洗脱的蛋白质根据分子大小和形状得以分辨。
一些实施方式中，基于多糖的大小排阻介质中的多糖是琼脂糖。一些实施方式中，多糖是右旋糖苷。基于琼脂糖的大小排阻介质的一个例子是Superose6或12(GE医疗集团(GEHealthcare))。有些情况下，介质是层析柱，样品从上方加入，由重力牵引通过层析柱。其他实施方式中，可以根据需要人工加压(如HPLC)。
可对凝胶排阻介质的输出进行监测，以检测偶联物、游离抗体或视需要而定的其他样品组分，由此确定含有偶联物且不含游离抗体或比之原偶联混合物游离抗体至少有所减少的级份。一些实施方式中，所得的纯化偶联物级份中去除了偶联反应中至少90％、95％、99％的未反应抗体，。测定输出的示例性方法包括监测纳米粒子或抗体的特征吸收波长。“级份”在此指层析输出的一部分，不论层析输出是如何收集的，也不论输出是间歇性收集还是连续收集。
作为大小排阻介质的替代，可将高离子强度、含表面活性剂的偶联混合物加到纳米膜过滤器中来将偶联物与游离抗体分离。此时，纳米膜的纳米孔被选为不让偶联物通过而让未偶联抗体通过。可令偶联反应物流过纳米多孔膜，这样，已偶联的纳米粒子会被截留，没有偶联的抗体则透过膜。重复稀释和再过滤得到基本不含未反应抗体(例如至少90％、95％、99％偶联反应中未反应的抗体被去除)的制备物。纳米孔的大小转取决于偶联物中纳米粒子的大小。
实施例
进行了将抗体-纳米孔偶联物与偶联反应物质如游离抗体分离并纯化的最初试验。试验了适当高排阻限介质上的高分辨大小排阻层析，但发现P-点纳米粒子与许多商业来源的介质结合，不从层析柱中洗出。发现这一现象在Superose6(GE医疗集团(GEHealthcare))、Sephacryl400和Superdex200上不显著。
起先试验在Sephacryl400和Superdex200上纯化偶联物，但不成功。这些试验中，低离子强度20mMHEPES-KOH缓冲液中的纳米粒子-抗体偶联样品加到10cmSephacryl或Superdex200柱上。偶联物与游离抗体分离情况很差(不显示数据)。监测P-点的463nm吸光度。在天然凝胶上用密度计监测IgG。
制备10cm的Superose6(基于琼脂糖的大小排阻介质)重力柱。低离子强度20mMHEPES-KOH缓冲液中的纳米粒子-抗体偶联样品加到柱上，没有获得有用的分离。重复这一实验，但改用30cm的Superose6柱。虽然偶联物峰与游离抗体分离，但峰肩严重重叠(见图1)，因此，这些条件无法实现理想的偶联物纯化。
将高离子强度缓冲液(1XPBS)试用于偶联物，但这高离子强度的缓冲液造成了偶联物沉淀，无法继续纯化。用1XPBS制备了另一混合物，但还含有0.1％PluronicF-68。该混合物中，偶联物保持在溶液中并被加到30cm的Superose6柱上。由此所得偶联物与游离抗体的分离(图2)显著优于用HEPES-KOH缓冲液混合物的结果，能够将抗体偶联物与游离抗体分离并纯化。
权利要求中非指定数量的单数形式包含复数含义。“包含”、“包括”及类似用语表示除记载于其后的步骤或元素之外可选包括而不排除其他步骤或元素。文中提到的所有专利、专利申请及其他出版文献均通过引用而被完全纳入。若文中引用的参考资料或现有技术与本文在某项明示内容上有所出入，应取取信本申请所作教导的解答或解决分案。这包括某术语或表述的业内理解与本文明确给出的定义之间存在差异的情形。

Claims (27)

1.一种将抗体-纳米粒子偶联物与游离抗体分离并纯化的方法，所述方法包括：
提供所述抗体-纳米粒子偶联物、所述游离抗体、聚二醇表面活性剂和缓冲液的混合物，所述混合物的离子强度至少50mM；
所述混合物与基于多糖的大小排阻介质接触来分离所述抗体-纳米粒子偶联物与所述游离抗体；以及
从介质中收集富集了所述抗体-纳米粒子偶联物的级份，由此将抗体-纳米粒子偶联物与游离抗体分离并纯化。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述基于多糖的大小排阻介质包含琼脂糖。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述缓冲液包含磷酸盐。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述缓冲液是磷酸盐缓冲液(PBS)。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述PBS的浓度是0.5-2.0X。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗体是IgG抗体。
7.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗体是四聚体IgG抗体。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述纳米粒子是聚合物点(p-点)。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述p-点直径为5-100nm，并且是胶体半导体聚合物。
10.如权利要求8或9所述的方法，其中，所述p-点有荧光。
11.如权利要求1所述的方法，其中，所述表面活性剂是PluronicF-68。
12.如权利要求1或11所述的方法，其中，所述表面活性剂在混合物中的浓度是0.02％-1.0％。
13.如权利要求1所述的方法，其中，所述混合物的离子强度是75-300mM。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述混合物还包含游离纳米粒子，所述介质将游离纳米粒子与偶联物分离。
15.一种将抗体-纳米粒子偶联物与游离抗体分离并纯化的方法，所述方法包括：
提供所述抗体-纳米粒子偶联物、所述游离抗体、聚烷二醇表面活性剂和缓冲液的混合物，所述混合物的离子强度至少50mM；
所述混合物与纳米膜过滤器接触来分离抗体-纳米粒子偶联物与游离抗体；以及
从过滤器中收集富集了所述抗体-纳米粒子偶联物的级份，由此将抗体-纳米粒子偶联物与游离抗体分离并纯化。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述缓冲液包含磷酸盐。
17.如权利要求15所述的方法，其中，所述缓冲液是磷酸盐缓冲液(PBS)。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述PBS的浓度是0.5-2.0X。
19.如权利要求15所述的方法，其中，所述抗体是IgG抗体。
20.如权利要求15所述的方法，其中，所述抗体是四聚体IgG抗体。
21.如权利要求15所述的方法，其中，所述纳米粒子是聚合物点(p-点)。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述p-点直径为5-100nm，并且是胶体半导体聚合物。
23.如权利要求21或22所述的方法，其中，所述p-点有荧光。
24.如权利要求15所述的方法，其中，所述表面活性剂是PluronicF-68。
25.如权利要求15或24所述的方法，其中，所述表面活性剂在混合物中的浓度是0.02％-1.0％。
26.如权利要求15所述的方法，其中，所述混合物的离子强度是75-300mM。
27.如权利要求15-26中任一项所述的方法，其中，所述混合物还包含游离纳米粒子，所述介质将游离纳米粒子与偶联物分离。
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