JP2014153057A - 標識抗体の製造方法 - Google Patents
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Abstract
蛍光色素等の機能性分子を含有するシリカナノ粒子の表面に抗体が結合してなる標識抗体の製造方法であって、イムノアッセイにおいて、非特異的な吸着を低減し、かつ、検出対象たる標的抗原の捕捉効率(標的抗原に対する結合効率)が高められた標識抗体を製造するための方法を提供する。
【解決手段】
a)機能性分子を含有し、表面にチオール基を有するシリカナノ粒子と、マレイミド基及びアミノ基を有するリンカー分子とを溶媒中に共存させ、これにより前記チオール基と前記マレイミド基との間でチオエーテル結合を形成させて、リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子を得る工程、及び
b)前記のリンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子と、カルボジイミドと、抗体とを水系溶媒中に共存させ、前記リンカー分子が有するアミノ基と、前記抗体が有するカルボキシル基との間でアミド結合を形成させる工程
を含む、標識抗体の製造方法。
【選択図】なし
Description
また、本発明は、機能性分子含有シリカナノ粒子の表面に抗体を結合させた標識抗体であって、イムノアッセイにおいて、非特異的な吸着を低減し、かつ、検出対象たる標的抗原の捕捉効率が高められた標識抗体を提供することを課題とする。
<1>a)機能性分子を含有し、表面にチオール基を有するシリカナノ粒子と、マレイミド基及びアミノ基を有するリンカー分子とを溶媒中に共存させ、これにより前記チオール基と前記マレイミド基との間でチオエーテル結合を形成させて、リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子を得る工程、及び
b)前記のリンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子と、カルボジイミドと、抗体とを水系溶媒中に共存させ、前記リンカー分子が有するアミノ基と、前記抗体が有するカルボキシル基との間でアミド結合を形成させる工程
を含む、標識抗体の製造方法。
<2>工程a)における溶媒が非プロトン性溶媒である、前記<1>に記載の標識抗体の製造方法。
<3>非プロトン性溶媒が、ジメチルスルホキシド、スルホラン、ピリジン、N−メチルピロリドン、N−シクロヘキシルピロリドン、N,N−ジメチルホルムアミド、及びN,N−ジメチルアセトアミドから選ばれる、前記<1>又は<2>に記載の製造方法。
<4>リンカー分子の構造が、2価の脂肪族基もしくはアリーレン基又はこれらの組み合わせを介してマレイミド基とアミノ基とが連結した構造である、前記<1>〜<3>のいずれか1項に記載の製造方法。
<5>標識抗体の平均粒径が20〜500nmである、前記<1>〜<4>のいずれか1項に記載の製造方法。
<6>機能性分子が、蛍光分子、吸光分子、磁性分子、放射性分子及びpH感受性分子からなる群から選ばれる、前記<1>〜<5>のいずれか1項に記載の製造方法。
<7>機能性分子を含有し、表面にチオール基を有するシリカナノ粒子において、表面に存在するチオール基の密度が0.002〜0.2個/nm2であり、該チオール基の量により抗体の結合量が制御される、前記<1>〜<6>のいずれか1項に記載の製造方法。
<8>機能性分子を含有するシリカナノ粒子を標識粒子とし、その表面にリンカーを介して抗体が結合してなる標識抗体であって、
前記の機能性分子を含有するシリカナノ粒子と前記リンカーとがチオエーテル結合により連結し、前記抗体と前記リンカーとの連結構造が、*−C(=O)−NH−(*は抗体側を示す。)である、標識抗体。
<9>リンカーが、2価の脂肪族基もしくはアリーレン基又はこれらの組み合わせを有する、前記<8>に記載の標識抗体。
<10>平均粒径が20〜500nmである、前記<8>又は<9>に記載の標識抗体。
<11>前記<8>〜<10>のいずれか1項に記載の標識抗体が分散媒中に分散してなるコロイド。
<12>分散媒が緩衝液である、前記<11>に記載のコロイド。
<13>前記<8>〜<10>のいずれか1項に記載の標識抗体を含む分析試薬。
上記アンモニア水含有溶媒としては、例えば、水/エタノールを体積比で1/10〜1/1とした混合液に、例えば28%程度のアンモニア水を、アンモニア濃度が0.2〜3wt%になるように加えた溶液を用いることができる。
前記シラン化合物(シロキサン成分)に特に制限はなく、例えば、テトラエトキシシラン(TEOS)やテトラメトキシシランのようなテトラアルコキシシランの他、γ-メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPS)、γ-メルカプトプロピルトリエトキシシラン、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン(APS)、3−チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3−グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、3−イソシアナトプロピルトリエトキシシラン、3−[2−(2−アミノエチルアミノ)エチルアミノ]プロピルトリエトキシシラン等のシランカップリング剤も用いることができる。中でも、TEOSを好適に用いることができる。
なお、上記シラン化合物としてMPS等のチオール基を有するものを使用すると、得られる機能性分子含有シリカナノ粒子の表面にはチオール基が存在することになるため、後述する機能性分子含有シリカナノ粒子表面へのチオール基の導入操作は必ずしも必要なくなる。
当該平均粒径は透過型電子顕微鏡(TEM)、走査型電子顕微鏡(SEM)等の画像から無作為に選択した100個の標識粒子の合計の投影面積から複合粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択した複合粒子の個数(100個)で割った値に相当する円の直径の平均値(平均円相当直径)として算出することができる。
所望の平均粒径のシリカナノ粒子は、YM−10、YM−100(いずれも商品名、ミリポア社製)等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行うことで得ることができる。また、適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清又は沈殿を回収することで得ることもできる。
例えば、機能性分子含有シリカナノ粒子を水とエタノールの混合溶媒に分散させ、チオール基を有するシランカップリング剤とアンモニア水とを添加して攪拌することで、機能性分子含有シリカナノ粒子の表面にチオール基を導入することができる。
チオール基を有するシランカップリング剤は、当該チオール基がアルキレン基又はアルキレンオキシ基を介してケイ素原子に結合した構造であることが好ましい。当該アルキレン基又はアルキレンオキシ基の炭素数は、2〜10が好ましく、2〜5がより好ましく、2〜4がさらに好ましい。このようなシランカップリング剤として、メルカプトアルキルトリアルコキシシランがより好ましく、その具体例としては、例えば、3−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、3−メルカプトプロピルトリエトキシシラン、3−メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン、11−メルカプトウンデシルトリメトキシシランが挙げられる。
上記の水とエタノールの混合溶媒は水/エタノールが体積比で1/10〜1/1とすることが好ましい。また、機能性成分含有シリカナノ粒子の最終濃度は0.1〜2wt%とすることが好ましく、添加するチオール基を有するシランカップリング剤の量は、機能性分子含有シリカナノ粒子1gに対して、0.2〜20mmolとすることが好ましい。また、アンモニア水の添加は、例えば28%程度のアンモニア水を用いて、アンモニア濃度が0.2〜3wt%になるように加えることが好ましい。
したがって、より簡便な方法で、しかもチオール基の導入量を自由に、かつ高い再現性で制御できる方法を用いて、チオール基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子を調製することが好ましい。
このような調製方法として、例えば以下の工程を含む方法(連続法)が挙げられる。
機能性分子が結合したオルガノアルコキシシランとテトラアルコキシシランとをアンモニア水含有溶媒中で混合し、該溶媒中に該機能性分子を含有するシリカのコア粒子を形成させて該コア粒子の分散液を得る工程、及び
上記工程で得られた分散液に、チオール基を有するシランカップリング剤とテトラアルコキシシランを添加して、シリカのコア粒子にシェル層を形成させる工程。
上記連続法では、機能性分子含有シリカナノ粒子の調製からチオール基の導入を連続的に行うことができるため作業時間と労力も大幅に改善される。
ゼータ電位は、ゼータサイザーナノ(商品名、マルバーン社製)、ELS−Z1(商品名、大塚電子社製)、NICOMP 380ZLS(商品名、IBC社製)等を用いて測定することができる。
シリカナノ粒子表面のチオール基量は、DNTB(5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid))を試薬として用いて行うことができる。DNTBを用いたチオール基の定量法としては、例えば、Archives of Biochemistry and Biophysics, 82, 70(1959)の方法で行うことができる。具体的な方法の一例としては、リン酸緩衝液(pH7.0)に溶解した10mMのDNTBの溶液20μLと、200mg/mLに調製したシリカナノ粒子コロイド2.5mLとを混合し、1時間後に412nmの吸光度を測定し、標準物質としてγ−メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPS)を用いて作成した検量線からチオール基量を定量することができる。
リンカー分子は、マレイミド基とアミノ基とをそれぞれ1つずつ有することが好ましい。
本発明に用いるリンカー分子の分子量は特に制限されないが、150〜5000であることが好ましい。
分子内にマレイミド基とアミノ基を有するリンカー分子としては、例えば、N−(4−アミノフェニル)マレイミド、N−(2−アミノエチル)マレイミド塩酸塩、N−アセチルアミノマレイミドが挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
上記のマレイミド基とチオール基との反応は、用いるリンカー分子が塩酸塩などの塩である場合は水や緩衝液中で行うことができる。用いるリンカー分子が塩でない場合は非プロトン性溶媒中で行う。プロトン性溶媒を用いると、マレイミド基が溶媒分子と反応し、その結果チオール基との反応性が低下する場合があるため、非プロトン性溶媒を用いた方がマレイミドの反応性が高い。上記非プロトン性溶媒は、シリカナノ粒子が分散しうるものであれば制限はないが、極性溶媒であることが好ましい。この極性非プロトン性溶媒として、例えば、ジメチルスルホキシド、スルホラン、ピリジン、N−メチルピロリドン、N−シクロヘキシルピロリドン、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミドが挙げられる。中でもN,N−ジメチルホルムアミドが好適である。
通常、生化学分野においては、マレイミド基とチオール基との反応は、抗体等の生体分子の活性低下を防ぐために、やむを得ず水系溶媒を用いて行われることが多い。しかし、本発明の製造方法では、マレイミド基は機能性分子含有シリカナノ粒子のチオール基と反応させればよく、抗体と反応させる必要がないため、マレイミド基とチオール基との反応を非プロトン系溶媒中で極めて効率よく行わせることができる。
すなわち、本発明において「リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子と、カルボジイミドと、抗体とを水系溶媒中に共存させ」とは、下記(a)〜(d)のいずれの形態も包含する意味に用いる。
(a)リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子と、カルボジイミドと、抗体とを同時に水系溶媒中に混合する形態、
(b)抗体とカルボジイミドとを予め水系溶媒中に共存させた後、これと、リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子とを混合する形態、
(c)リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子と抗体とを予め水系溶媒中に共存させた後、これと、カルボジイミドとを混合する形態、
(d)リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子とカルボジイミドとを予め水系溶媒中に共存させた後、これと、抗体とを混合する形態。
反応温度は0〜60℃であることが好ましく、10〜40℃であることがより好ましい。また、反応時間は5分以上が好ましく、5〜600分であることがより好ましい。
上記で得られた標識抗体に残存する活性エステルの反応性を無くすために、さらに、ウシ血清アルブミンやカゼイン等を加えて混合しても良い。
当該平均粒径は、透過型電子顕微鏡(TEM)、走査型電子顕微鏡(SEM)等の画像から無作為に選択した50個の粒子の合計の投影面積から粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択した粒子の個数(50個)で割った値に相当する円の直径の平均値(平均円相当直径)を求めた値である。
前記平均粒径は、一次粒子が凝集してなる二次粒子の粒径は含まない。
標的抗原の捕捉能の向上は、より低分子の抗体を用いた場合により顕著になる。例えば、抗体として、F(ab’)2抗体やFab抗体などのフラグメント抗体、scFvやsc(Fv)2などの一本鎖抗体、VH及びVLを含むポリアミノ酸を用いた場合により顕著である。
本発明の製造方法では、リンカー分子として炭素鎖の長さの異なるものや芳香環を含むものを選択することができ、リンカー分子の構造を適宜選択することによって、機能性分子含有シリカナノ粒子の表面に結合する抗体の標的抗原捕捉能をより効果的に引き出すことができる。
別の表現をすれば、本発明の標識抗体は、機能性分子を含有するシリカナノ粒子が有するチオール基と、リンカー分子が有するマレイミド基とが、チオエーテル結合により結合した構造、及び、該リンカー分子が有するアミノ基と、抗体が有するカルボキシル基とが、アミド結合により結合した構造を有する。
チオール基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子、リンカー分子、抗体は、上述の本発明の製造方法で説明したものと同義である。
本発明の標識抗体は、標的抗原の捕捉能に優れる。加えて、抗原抗体反応に基づく結合でない、いわゆる非特異的吸着がより抑えられる。本発明の標識抗体を含む分析試薬を用いた分析結果は、後述する実施例に示されるように、高感度で、かつ信頼性に優れる。
本発明のコロイドは、標識試薬液として用いることができる。また、分析試薬に含まれる標識試薬の調製に用いることができる。
上記標的抗原に特に制限はなく、通常の分析・検査・診断における検出対象となる分子等が挙げられる。その一例として、ウイルス抗原、食物アレルゲン、血液検査等における各種マーカー、毒素、細胞膜タンパク質、細胞膜糖鎖、免疫グロブリン等が挙げられる。
本発明の分析試薬の好適な例として、コンジュゲートパッドに本発明の標識抗体が保持されたテストストリップを有するイムノクロマトグラフィー装置等が挙げられる。
(機能性分子含有シリカナノ粒子の調製)
機能性分子として蛍光分子であるカルボキシローダミン6Gを含有するシリカナノ粒子を調製した。
得られた5−(及び−6)−カルボキシローダミン6G−APS複合体の溶液600μLと、エタノール140mL、TEOS(信越シリコーン社製)6.5mL、蒸留水20mL及び28質量%アンモニア水15mLを混合し、室温で24時間反応を行った。
反応液を18000×gの重力加速度で30分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿した機能性分子含有シリカナノ粒子に蒸留水を4mL加え、該粒子を分散させ、再度18000×gの重力加速度で30分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに2回繰り返し、蛍光分子含有シリカナノ粒子の分散液に含まれる未反応のTEOSやアンモニア等を除去し、平均粒径271nmの蛍光分子含有シリカナノ粒子1.65gを得た。収率約94%。
上記で得た粒子1gを水/エタノール=1/4の混合液150mLに分散させた。これにMPS(和光純薬株式会社製)を1.5mL加えた。続いて28%アンモニア水20mLを加え、室温で4時間混合した。
反応液を18000×gの重力加速度で30分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿したシリカナノ粒子に蒸留水を10mL加え、粒子を分散させ、再度18000×gの重力加速度で30分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに2回繰り返し、チオール基を有する蛍光分子含有シリカナノ粒子の分散液に含まれる未反応のMPSやアンモニア等を除去し、チオール基が導入された蛍光分子含有シリカナノ粒子(以下、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Aと呼ぶ。)を得た。
上記のチオール基導入蛍光シリカナノ粒子A500mgを用いて、DNTBによるチオール基の定量分析を行った。その結果、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Aの粒子表面のチオール基の密度は、0.046個/nm2であった。
14質量%のアンモニア水をエタノールで5倍希釈して175mLのアンモニア水含有溶媒を調製した。該アンモニア水含有溶媒にTEOS(信越シリコーン社製)1.5mL(6.75mmol)と、参考例1で調製した5−(及び−6)−カルボキシローダミン6G−APS複合体(5mM)1.5mLとを添加して、40℃で30分攪拌することで蛍光分子を含有するコア粒子が形成された溶液(以下、コア蛍光粒子含有溶液と呼ぶことがある。)を得た。
MPS/TEOS混合液は追添の直前に調製した。
条件1〜3で得られたチオール基導入蛍光シリカナノ粒子B〜Dをそれぞれ500mg用いてDNTBによるチオール基の定量分析を行った。その結果、粒子表面のチオール基の密度は、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Bが0.012個/nm2、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Cが0.056個/nm2、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Dが0.072個/nm2であった。
参考例1で作製したチオール基導入蛍光シリカナノ粒子A(平均粒径260nm)の分散液(濃度25mg/ml、分散媒:蒸留水)40μLに、DMF460μLを加え、15000×gの重力加速度で10分遠心分離した。上清を除去し、DMFを500μL加え遠心分離し、上清を除去した。再度DMFを500μL加えチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Aを分散させた。これにリンカー分子として3−マレイミド安息香酸を1mg加え、30分混合することで、上記リンカー分子のマレイミド基とチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Aのチオール基との間でチオエーテル結合を形成させた。
この反応液を15000×gの重力加速度で10分遠心分離し、上清を除去後、蒸留水90.6μLを加え、粒子を分散させた。続いて、0.5M MES(2−モルホリノエタンスルホン酸)(pH6.0)100μL、50mg/mL NHS(N−ヒドロキシスクシンイミド) 230.4μL、19.2mg/mL EDC(1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)75μLを加え混合した。これに抗A型インフルエンザ核タンパク質抗体(6.2mg/ml、マウス由来、HyTest社製)を4.0μL加え、10分間混合した。
15000×gの重力加速度で10分遠心分離し、上清を除去した。10mM KH2PO4(pH7.5)を400μL加え、粒子を分散させた。続いて15000×gの重力加速度で10分遠心分離し、上清を除去した。再度10mM KH2PO4(pH7.5)を400μL加え、粒子を分散させてコロイドを得た。
参考例2で調製したチオール基導入蛍光シリカナノ粒子B〜Dを用いて、比較例1と同様の方法で抗体の結合処理を行い、粒子が分散した各コロイドを得た。タンパク定量の結果、抗体が結合した蛍光分子含有シリカナノ粒子(標識抗体)1gあたりの抗体の結合量は、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Bを用いた場合は3.7mg、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Cを用いた場合は9.2mg、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Dを用いた場合は12.8mgであった。
参考例1で作製したチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Aを用いて、以下の方法で抗体を結合させた。
チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Aの分散液(濃度25mg/ml、分散媒:蒸留水)40μLに、DMF460μLを加え、15000×gの重力加速度で10分遠心分離した。上清を除去し、DMFを500μL加え遠心分離し、上清を除去した。再度DMFを500μL加えチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Aを分散させた。これにリンカー分子としてN−(4−アミノフェニル)マレイミドを1mg加え、30分混合することで、上記リンカー分子のマレイミド基とチオール基導入蛍光シリカナノ粒子のチオール基との間でチオエーテル結合を形成させた。
この反応液を15000×gの重力加速度で10分遠心分離し、上清を除去後、蒸留水90.6μLを加え、粒子を分散させた。続いて、0.5M MES(2−モルホリノエタンスルホン酸)(pH6.0)100μL、50mg/mL NHS(N−ヒドロキシスクシンイミド) 230.4μL、19.2mg/mL EDC(1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)75μLを加え混合した。これに抗A型インフルエンザ核タンパク質抗体(6.2mg/ml、マウス由来、HyTest社製)を4.0μL加え、10分間混合した。
15000×gの重力加速度で10分遠心分離し、上清を除去した。10mM KH2PO4(pH7.5)を400μL加え、粒子を分散させた。続いて15000×gの重力加速度で10分遠心分離し、上清を除去した。再度10mM KH2PO4(pH7.5)を400μL加え、粒子を分散させてコロイドを得た。
このコロイドをサンプルとして、タンパク定量を行った。タンパク定量はPierceBCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific社製)を用いた。その結果、蛍光分子含有シリカナノ粒子1gあたりの抗体の結合量は、7.9mgであった。
参考例2で調製したチオール基導入蛍光シリカナノ粒子B〜Dを用いて、実施例1と同様の方法で抗体の結合処理を行い、粒子が分散した各コロイドを得た。タンパク定量の結果、抗体が結合した蛍光分子含有シリカナノ粒子1gあたりの抗体の結合量は、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Bを用いた場合は4.2mg、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Cを用いた場合は8.8mg、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Dを用いた場合は11.3mgであった。
抗体固定化メンブレンを以下の方法で作製した。
メンブレン(丈25mm、商品名:Hi−Flow Plus120 メンブレン、MILLIPORE社製)の端から約6mmの位置に、幅約1mmのA型インフルエンザ用テストラインとして、ウサギ由来の抗A型インフルエンザ核タンパク質抗体(ポリクローナル抗体、自社製)を1mg/mL含有する溶液((50mMKH2PO4,pH7.0)+5%スクロース)を0.75μL/cmの塗布量で塗布した。
前記抗体固定化メンブレン、サンプルパッド(Glass Fiber Conjugate Pad(GFCP)、MILLIPORE社製)、及び吸収パッド(Cellulose Fiber Sample Pad(CFSP)、MILLIPORE社製)をバッキングシート(商品名AR9020,Adhesives Research社製)上で組み立てた。なお、メンブレンはA型インフルエンザ用テストラインがサンプルパッド側、コントロールラインが吸収パッド側になる向きで構成した。
光源と光学フィルタと光電子倍増管(PMT)からなる検出ユニットを有し、該検出ユニットが、モーターによって一定速度で直線移動する機構を備え、PMTの受光強度を50μ秒ごとに記録する記録機構を備えた検出装置を作製した。なお、検出ユニットは、光源が532nmのレーザダイオードであり、レーザダイオードをサンプルに照射し、反射光を550nm以上の波長の光のみを透過する光学フィルタを透過させた後に光電子増倍管(PMT)で受光する機構を有する。
表2に示す組成で、A型インフルエンザ核タンパク質の溶液を調製した。続いて同混合液100μLと、比較例のコロイドA(2.5mg/mL)2μLの混合液をテストストリップのサンプルパッド部分に滴下した。比較例のコロイドB〜D、本発明のコロイドA〜Dについても同様に試験を実施した。15分後、上記検出器によって測定しラインの発光強度を数値化した。結果を表2に示す。
機能性分子含有シリカ粒子として参考例1で作製したチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Aを用い、抗体としてFab化した抗A型インフルエンザ核タンパク質抗体を用いて比較例1と同様の方法でシリカ粒子と抗体を結合させた。得られたコロイドをサンプルとしてタンパク定量を行った結果、抗体の結合量は、抗体が結合した蛍光分子含有シリカナノ粒子1gあたり7.1mgであった。
機能性分子含有シリカ粒子として参考例1で作製したチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Aを用い、抗体として、比較例3で用いたのと同一のFab化した抗A型インフルエンザ核タンパク質抗体を用いて、実施例1と同様の方法でシリカ粒子と抗体を結合させた。得られたコロイドをサンプルとしてタンパク定量を行った結果、抗体の結合量は、抗体が結合した蛍光分子含有シリカナノ粒子1gあたり8.5mgであった。
試験例1と同様の方法で、イムノクロマト試験を実施した。結果を表3に示す。
2 サンプルパッド
3 コンジュゲートパッド
4 抗体固定化メンブレン
41 判定部(テストライン)
42 コントロールライン
5 吸収パッド
6 バッキングシート
Claims (13)
- a)機能性分子を含有し、表面にチオール基を有するシリカナノ粒子と、マレイミド基及びアミノ基を有するリンカー分子とを溶媒中に共存させ、これにより前記チオール基と前記マレイミド基との間でチオエーテル結合を形成させて、リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子を得る工程、及び
b)前記のリンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子と、カルボジイミドと、抗体とを水系溶媒中に共存させ、前記リンカー分子が有するアミノ基と、前記抗体が有するカルボキシル基との間でアミド結合を形成させる工程
を含む、標識抗体の製造方法。 - 工程a)における溶媒が非プロトン性溶媒である、請求項1に記載の標識抗体の製造方法。
- 非プロトン性溶媒が、ジメチルスルホキシド、スルホラン、ピリジン、N−メチルピロリドン、N−シクロヘキシルピロリドン、N,N−ジメチルホルムアミド、及びN,N−ジメチルアセトアミドから選ばれる、請求項2に記載の製造方法。
- リンカー分子の構造が、2価の脂肪族基もしくはアリーレン基又はこれらの組み合わせを介してマレイミド基とアミノ基とが連結した構造である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の製造方法。
- 標識抗体の平均粒径が20〜500nmである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の製造方法。
- 機能性分子が、蛍光分子、吸光分子、磁性分子、放射性分子及びpH感受性分子からなる群から選ばれる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の製造方法。
- 機能性分子を含有し、表面にチオール基を有するシリカナノ粒子において、表面に存在するチオール基の密度が0.002〜0.2個/nm2であり、該チオール基の量により抗体の結合量が制御される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の製造方法。
- 機能性分子を含有するシリカナノ粒子を標識粒子とし、その表面にリンカーを介して抗体が結合してなる標識抗体であって、
前記の機能性分子を含有するシリカナノ粒子と前記リンカーとがチオエーテル結合により連結し、前記抗体と前記リンカーとの連結構造が、*−C(=O)−NH−(*は抗体側を示す。)である、標識抗体。 - リンカーが、2価の脂肪族基もしくはアリーレン基又はこれらの組み合わせを有する、請求項8に記載の標識抗体。
- 平均粒径が20〜500nmである、請求項8又は9に記載の標識抗体。
- 請求項8〜10のいずれか1項に記載の標識抗体が分散媒中に分散してなるコロイド。
- 分散媒が緩衝液である、請求項11に記載のコロイド。
- 請求項8〜10のいずれか1項に記載の標識抗体を含む分析試薬。
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