CN104981693A - 标记抗体的制造方法 - Google Patents

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Abstract

一种标记抗体的制造方法，其包含下述工序：a)使含有功能性分子且表面具有硫醇基的二氧化硅纳米颗粒与具有马来酰亚胺基及胺基的连接分子共存在溶剂中，由此在上述硫醇基与上述马来酰亚胺基之间形成硫醚键，从而获得键合有连接分子且含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒，及b)使上述键合有连接分子且含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒、碳二亚胺及抗体共存在水系溶剂中，在上述连接分子所具有的胺基与上述抗体所具有的羧基之间形成酰胺键。

Description

标记抗体的制造方法
技术领域
本发明涉及一种标记抗体的制造方法。
背景技术
近年来，数nm～1μm左右的微粒被用于各种领域而受到注目。例如，用于吸附剂、催化剂等的多孔质二氧化硅颗粒或沸石颗粒，用于颜料的碳黑、金属氧化物颗粒、无机化合物颗粒，用于导电材料的金属纳米颗粒，用于树脂的补强剂的二氧化硅颗粒等，上述微粒的材质及用途涉及多个方面。另外，尤其是在生物技术的领域，半导体纳米颗粒、或含有荧光色素的二氧化硅纳米颗粒等作为新型标记用颗粒的应用备受期待。另外，含有高浓度色素的二氧化硅纳米颗粒具有高摩尔吸光系数，因此作为更高感度的标记用颗粒的应用受到期待。
上述标记用颗粒通过使具有与特定目标分子结合的能力的生物分子(蛋白质或核酸等)键合在其表面，从而可用作能够用于目标分子的检测、定量、染色等的标记试剂。
发明内容
本发明的课题在于提供一种用于制造标记抗体的方法，该标记抗体是抗体键合在含有荧光色素等功能性分子的二氧化硅纳米颗粒(以下也称作含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒)的表面而成的，其中，该方法是用于制造下述标记抗体：在免疫测定中减少非特异性吸附、且提高作为检测对象的目标抗原的捕捉效率(对目标抗原的结合效率)。
另外，本发明的课题在于提供一种标记抗体，该标记抗体是使抗体键合在含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒的表面而成的，其中，该标记抗体在免疫测定中减少非特异性吸附、且提高作为检测对象的目标抗原的捕捉效率。
本发明人发现，使抗体键合在含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒的表面而成的标记抗体中，其对目标抗原的结合能力(目标抗原的捕捉能力)根据抗体在该二氧化硅纳米颗粒表面的键合方式而有较大变动。并且发现，若使抗体的羧基与二氧化硅纳米颗粒表面的硫醇基经由连接分子而键合，并将这种形态的标记抗体用于免疫测定，则非特异性吸附被大幅抑制，并且目标抗原的捕捉能力大幅提高。本发明是基于这些见解而完成的。
本发明的课题是通过下述手段而达成的。
＜1＞一种标记抗体的制造方法，其包含下述工序：a)使含有功能性分子且表面具有硫醇基的二氧化硅纳米颗粒与具有马来酰亚胺基及胺基的连接分子共存在溶剂中，由此在上述硫醇基与上述马来酰亚胺基之间形成硫醚键，获得键合有连接分子且含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒，及
b)使上述键合有连接分子且含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒、碳二亚胺及抗体共存在水系溶剂中，在上述连接分子所具有的胺基与上述抗体所具有的羧基之间形成酰胺键。
＜2＞如上述＜1＞的标记抗体的制造方法，其中，工序a)中的溶剂是非质子性溶剂。
＜3＞如上述＜1＞或＜2＞的制造方法，其中，非质子性溶剂选自二甲基亚砜、环丁砜、吡啶、N-甲基吡咯烷酮、N-环己基吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、及N,N-二甲基乙酰胺。
＜4＞如上述＜1＞～＜3＞中任一项的制造方法，其中，连接分子的结构是马来酰亚胺基与胺基经由2价的脂肪族基或亚芳香基(arylene)或者它们的组合连结而成的结构。
＜5＞如上述＜1＞～＜4＞中任一项的制造方法，其中，标记抗体的平均粒径为20～500nm。
＜6＞如上述＜1＞～＜5＞中任一项的制造方法，其中，功能性分子选自由荧光分子、吸光分子、磁性分子、放射性分子及pH敏感性分子组成的组。
＜7＞如上述＜1＞～＜6＞中任一项的制造方法，其中，在含有功能性分子且表面具有硫醇基的二氧化硅纳米颗粒中，存在于表面的硫醇基的密度为0.002～0.2个/nm2，抗体的键合量受该硫醇基的量控制。
＜8＞一种标记抗体，其是以含有功能性分子的二氧化硅纳米颗粒作为标记颗粒且抗体经由连接基而键合在其表面而成的，其中，
上述含有功能性分子的二氧化硅纳米颗粒与上述连接基通过硫醚键连结，上述抗体与上述连接基的连结结构为*-C(＝O)-NH-(*表示抗体侧)。
＜9＞如上述＜8＞的标记抗体，其中，连接基具有2价的脂肪族基或亚芳香基或者它们的组合。
＜10＞如上述＜8＞或＜9＞的标记抗体，其中，平均粒径为20～500nm。
＜11＞一种胶体，其是上述＜8＞～＜10＞中任一项的标记抗体分散在分散介质中而成的。
＜12＞如上述＜11＞的胶体，其中，分散介质为缓冲液。
＜13＞一种分析试剂，其含有上述＜8＞～＜10＞中任一项的标记抗体。
通过本发明的标记抗体的制造方法(以下也简单称为本发明的制造方法)，可获得免疫测定中的非特异性吸附被进一步抑制、且目标抗原的捕捉能力进一步提高的标记抗体。另外，通过本发明的制造方法，由于抗体的键合量受含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒表面的硫醇基的量控制，因此可更精密地控制抗体在该二氧化硅纳米颗粒表面上的键合量。
本发明的标记抗体在免疫测定中的非特异性吸附更少，另一方面，目标抗原的捕捉能力进一步提高。另外，本发明的标记抗体是抗体经由连接分子而与含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒表面通过共价键牢固且稳定地键合，因此抗体难以自含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒脱离。
本发明的上述以及其它特征及优点可适当参照附图，根据下述记载而更加明了。
附图说明
图1是示意性地表示实施例所使用的免疫层析装置的试带的结构的图。图1中(a)表示俯视图，(b)表示纵截面图。
具体实施方式
以下基于本发明的优选实施方式而对其进行详细说明。
本发明的制造方法中，使用含有功能性分子且表面具有硫醇基的二氧化硅纳米颗粒。该二氧化硅纳米颗粒具备作为所谓标记用颗粒的性能。本发明的制造方法中，使特定的连接分子经由该二氧化硅纳米颗粒表面的硫醇基而共价键合在上述二氧化硅纳米颗粒，并进而使该抗体经由抗体所具有的羧基而共价键合在该连接分子的其它部位。由此，可获得键合有与上述二氧化硅颗粒表面的硫醇基的量相对应的量的抗体的标记抗体。以上述方式获得的标记抗体可用于各种诊断试剂、检查试剂等分析试剂。
上述含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒中的“功能性分子”并无特别限制，优选采用分析试剂等中可成为检测指标的标记分子。作为该功能性分子，可例示荧光分子、吸光分子、磁性分子、放射性分子、pH敏感性色素分子等，可使用它们中的1种或2种以上。
含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒可通过如下方法制备：获得通过共价键、离子键及其它化学键或物理性吸附使功能性分子与硅烷偶联剂键合而成的生成物(键合有功能性分子的有机烷氧基硅烷)，使该生成物与1种或2种以上硅烷化合物(硅氧烷成分)在例如含氨水的溶剂中水解、缩聚而形成硅氧烷键，由此制备上述含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒。
作为上述含氨水的溶剂，例如可使用在将水/乙醇以体积比计设为1/10～1/1的混合液中按照氨浓度为0.2～3wt％的方式添加例如28％左右的氨水而成的溶液。
上述硅烷化合物(硅氧烷成分)并无特别限制，例如，如四乙氧基硅烷(TEOS)或四甲氧基硅烷这样的四烷氧基硅烷，除此以外，也可使用γ-巯丙基三甲氧基硅烷(MPS)、γ-巯丙基三乙氧基硅烷、γ-胺基丙基三乙氧基硅烷(APS)、3-硫氰基丙基三乙氧基硅烷、3-缩水甘油醚氧基丙基三乙氧基硅烷、3-异氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷、3-[2-(2-胺基乙基胺基)乙基胺基]丙基三乙氧基硅烷等硅烷偶联剂。其中，可优选地使用TEOS。
需要说明的是，若使用MPS等具有硫醇基的物质作为上述硅烷化合物，则所得的含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒的表面存在硫醇基，因此无需后文叙述的向含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒表面导入硫醇基的操作。
在使功能性分子与硅烷偶联剂共价键合的情况下，例如，可使用具有N-羟基丁二酰亚胺(NHS)酯基、马来酰亚胺基、异氰酸酯基、异硫氰酸酯基、醛基、对硝基苯基、二乙氧基甲基、环氧基、氰基等活性基的功能性分子与具有可与上述活性基反应的官能基(例如胺基、羟基、硫醇基等)的硅烷偶联剂。
具有NHS酯基的功能性分子中，作为该功能性分子为荧光分子的情况下的优选例，可列举5-(及-6)-羧基四甲基罗丹明-NHS酯(商品名，emp Biotech GmbH公司制造)、下式所表示的DY550-NHS酯、下式所表示的DY630-NHS酯(均为商品名，Dyomics GmbH公司制造)等具有NHS酯基的荧光色素化合物，但本发明并不限于此。
在功能性分子具有丁二酰亚胺基的情况下，可使其与具有胺基的硅烷偶联剂键合。作为具有胺基的硅烷偶联剂的具体例，可列举γ-胺基丙基三乙氧基硅烷(APS)、3-[2-(2-胺基乙基胺基)乙基胺基]丙基三乙氧基硅烷、3-(2-胺基乙基胺基)丙基二甲氧基甲基硅烷、3-胺基丙基三甲氧基硅烷等。其中，可优选地使用APS。
以上述方式制备的含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒的形状为长轴与短轴的比为2以下的球状。另外，平均粒径优选为1～1000nm，更优选为20～500nm。
该平均粒径可如下算出：利用图像处理装置自透射式电子显微镜(TEM)、扫描式电子显微镜(SEM)等的图像随机选择的100个标记颗粒的合计投影面积求出复合颗粒的占有面积，以相当于该合计占有面积除以所选择的复合颗粒的个数(100个)而得的值的圆的直径的平均值(平均圆当量径)的形式而算出上述平均粒径。
所需的平均粒径的二氧化硅纳米颗粒可通过使用YM-10、YM-100(均为商品名，Millipore公司制造)等超滤膜进行超滤而获得。另外，也可通过以适当的重力加速度进行离心分离并回收上清液或沈淀而获得。
接着，对于向含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒的表面导入硫醇基的方法进行说明。
向二氧化硅纳米颗粒表面导入硫醇基可通过通常的方法而完成，例如，可采用Journal of Colloid and Interface Science,159,150-157(1993)、国际公开2007/074722A1公报所记载的方法。
例如，使含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒分散在水与乙醇的混合溶剂中，添加具有硫醇基的硅烷偶联剂与氨水并搅拌，由此可向含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒的表面导入硫醇基。
具有硫醇基的硅烷偶联剂优选为该硫醇基经由亚烷基或亚烷氧基而键合在硅原子而成的结构。该亚烷基或亚烷氧基的碳原子数优选为2～10，更优选为2～5，进而优选为2～4。作为这种硅烷偶联剂，更优选为巯基烷基三烷氧基硅烷，作为其具体例，例如，可列举3-巯丙基三甲氧基硅烷、3-巯丙基三乙氧基硅烷、3-巯丙基甲基二甲氧基硅烷、11-巯基十一烷基三甲氧基硅烷。
上述水与乙醇的混合溶剂优选为以体积比计将水/乙醇设为1/10～1/1。另外，含有功能性分子的二氧化硅纳米颗粒的最终浓度优选为设为0.1～2wt％，所添加的具有硫醇基的硅烷偶联剂的量相对于含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒1g，优选设为0.2～20mmol。另外，氨水的添加优选为使用例如28％左右的氨水、以氨浓度为0.2～3wt％的方式添加。
上述硫醇基导入方法中，制备成为核的含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒、将其分离清洗之后进行硫醇基导入操作，因此需花费时间与劳力。另外，以高再现性导入所期望量的硫醇基也困难。通常，为了以高再现性导入硫醇基，使具有硫醇基的硅烷化合物充分进行反应。然而，该充分反应会导致导入至含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒表面的硫醇基的量过剩，颗粒表面的疏水性提高(即ζ电势的绝对值变低)而易产生颗粒彼此的凝集。
因此，优选使用更简便而且可自由地、且以高再现性控制硫醇基的导入量的方法，由此来制备具有硫醇基的含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒。
作为这种制备方法，例如可列举包含以下工序的方法(连续法)。
(连续法)
在含有氨水的溶剂中将键合有功能性分子的有机烷氧基硅烷与四烷氧基硅烷混合，使该溶剂中形成含有该功能性分子的二氧化硅的核颗粒而获得该核颗粒的分散液的工序，及
在上述工序所得的分散液中添加具有硫醇基的硅烷偶联剂与四烷氧基硅烷，从而在二氧化硅的核颗粒形成壳层的工序。
通过调节上述具有硫醇基的硅烷偶联剂与上述四烷氧基硅烷的添加比率，可自由地调节所导入的硫醇基的量。作为该四烷氧基硅烷，优选为TEOS。
上述连续法中，自含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒的制备至硫醇基的导入可连续进行，因此作业时间与劳力也得以大幅改善。
导入有硫醇基的含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒的ζ电势的绝对值优选为20～70mV。对于ζ电势的绝对值为上述范围内的颗粒而言，其凝集得以抑制，分散性进一步提高。
ζ电势可使用Zetasizer Nano(商品名，Malvern公司制造)、ELS-Z1(商品名，大冢电子公司制造)、NICOMP 380ZLS(商品名，IBC公司制造)等进行测定。
含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒表面的硫醇基的量可利用后文叙述的方法、以通过键合在SH基上而显色的试剂进行定量。本发明所使用的具有硫醇基的含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒中的硫醇基的量优选为以二氧化硅纳米颗粒的每单位表面积的密度计，设为0.002～0.2个/nm2。若表面的硫醇基的密度小于0.002个/nm2，则经由连接分子而结合的生物分子的量少，存在作为标记试剂而难以充分发挥功能的情况。另外，若表面的硫醇基的密度大于0.02个/nm2，则二氧化硅纳米颗粒表面的疏水性过度提高，容易产生因疏水性相互作用引起的非特异性吸附的增加、及颗粒的分散性的降低。对于本发明所使用的具有硫醇基且含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒中的硫醇基的量而言，更优选以二氧化硅纳米颗粒的每单位表面积的密度计为0.005～0.1/nm2，进而优选为0.01～0.05/nm2。
(二氧化硅纳米颗粒表面的硫醇基量的定量法)
二氧化硅纳米颗粒表面的硫醇基量的定量可使用DNTB(5,5'Dithiobis(2-nitrobenzoic acid))作为试剂而进行。作为使用DNTB的硫醇基的定量法，例如，可利用Archives of Biochemistry and Biophysics,82,70(1959)的方法进行。作为具体方法的一例，可将溶解在磷酸缓冲液(pH7.0)中而成的10mM的DNTB溶液20μL与制备为200mg/mL的二氧化硅纳米颗粒胶体2.5mL混合，1小时后测定412nm的吸光度，根据使用γ-巯丙基三甲氧基硅烷(MPS)作为标准物质而制成的校准曲线对硫醇基量进行定量。
本发明所使用的连接分子只要分子内具有马来酰亚胺基与胺基，则并无特别限制，优选为该马来酰亚胺基与胺基经由2价的脂肪族基或亚芳香基或者它们的组合而连结的分子。上述2价的脂肪族基的碳原子数优选为1～20的整数，更优选为2～10的整数。另外，作为上述亚芳香基，优选为亚苯基。
连接分子优选具有马来酰亚胺基与胺基各1个。
本发明所使用的连接分子的分子量并无特别限制，优选为150～5000。
作为分子内具有马来酰亚胺基与胺基的连接分子，例如，可列举N-(4-胺基苯基)马来酰亚胺、N-(2-胺基乙基)马来酰亚胺盐酸盐、N-乙酰胺基马来酰亚胺，但本发明并不限于此。
本发明的制造方法中，首先，使上述连接分子的马来酰亚胺基与导入在含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒表面的硫醇基之间形成硫醚键，从而获得键合有连接分子且含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒。
上述马来酰亚胺基与硫醇基的反应在所使用的连接分子为盐酸盐等盐的情况下，可在水或缓冲液中进行。在所使用的连接分子并非盐的情况下，在非质子性溶剂中进行。若使用质子性溶剂，则马来酰亚胺基与溶剂分子反应，其结果，存在与硫醇基的反应性降低的情况，因此使用非质子性溶剂时马来酰亚胺的反应性较高。上述非质子性溶剂只要能够分散二氧化硅纳米颗粒则并无限制，优选为极性溶剂。作为该极性非质子性溶剂，例如，可列举二甲基亚砜、环丁砜、吡啶、N-甲基吡咯烷酮、N-环己基吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺。其中优选为N,N-二甲基甲酰胺。
通常，在生物化学领域，马来酰亚胺基与硫醇基的反应中，为了防止抗体等生物分子的活性降低，不得已而使用水系溶剂进行的情况较多。然而，本发明的制造方法中，只要使马来酰亚胺基与含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒的硫醇基反应即可，无需使其与抗体反应，因此可使马来酰亚胺基与硫醇基的反应在非质子系溶剂中极有效地进行。
上述反应中，具有硫醇基且含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒在溶剂中的浓度优选设为0.05～2质量％，优选相对于具有硫醇基且含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒1mg而使0.1～5mg的连接分子反应。反应温度优选为0～60℃，更优选为0～40℃。反应时间优选为5分钟以上，更优选为5～120分钟。
通过使抗体经由该连接基而键合在以上述方式制备的键合有连接分子且含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒，可制造键合有抗体的含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒。具体而言，使上述抗体与后文叙述的碳二亚胺共存于水系溶剂中而使该抗体的羧基活性酯化，使该活性酯与连接分子所具有的胺基之间形成酰胺键。该键合反应也可在水系溶剂中进行。由抗体与碳二亚胺的混合而引起的抗体所具有的羧基的活性酯化可在将抗体与键合有连接分子且含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒混合前进行，也可在该混合后进行，也可与该混合同时进行。
即，本发明中所谓“使键合有连接分子且含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒、碳二亚胺及抗体共存在水系溶剂中”用于包含下述(a)～(d)中任一形态的含义。
(a)使键合有连接分子且含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒、碳二亚胺及抗体同时在水系溶剂中混合的形态；
(b)预先使抗体与碳二亚胺共存在水系溶剂中后，将其与键合有连接分子且含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒混合的形态，
(c)预先使键合有连接分子且含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒与抗体共存在水系溶剂中后，将其与碳二亚胺混合的形态；
(d)预先使键合有连接分子且含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒与碳二亚胺共存在水系溶剂中后，将其与抗体混合的形态。
作为上述抗体，包含免疫球蛋白(全抗体)、将其酵素分解而得的F(ab')2或Fab、经由连接基将重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)串联连结而成的scFv或sc(Fv)2、由2个经由连接基连结VH与VL而成的单元所构成的二聚体、人工化学合成的含有VH及VL的聚胺基酸、使用大肠杆菌或酵母等作为表现体系而制作的含有VH及VL的重组蛋白质或重组聚胺基酸。即，本发明中所谓“抗体”，是指具有VH及VL的分子或单元，只要具有VH及VL，则其形态并无限定。
上述水系溶剂并无特别限制，优选为缓冲液，可优选地使用磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、碳酸缓冲液等通常的水系缓冲液。
作为上述碳二亚胺，并无特别限制，可采用通常用于羧基的活性酯化的碳二亚胺。例如，可使用1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺等。另外，也可使N-羟基丁二酰亚胺或磺基-N-羟基丁二酰亚胺等与碳二亚胺同时共存，将由碳二亚胺产生的活性酯基衍生化为更稳定的活性酯基。
在键合于含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒表面的连接分子与抗体通过酰胺键而连结时，优选相对于键合有连接分子且含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒1mg而使抗体5～500μg共存并反应。
反应温度优选为0～60℃，更优选为10～40℃。另外，反应时间优选为5分钟以上，更优选为5～600分钟。
通过经过上述各工序，在水系溶剂中可获得键合有抗体的含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒、即标记抗体。
为消除上述所得的标记抗体中残存的活性酯的反应性，也可进而添加牛血清白蛋白或酪蛋白等并进行混合。
对于本发明的制造方法所制造的标记抗体而言，抗体键合在含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒表面的量可利用通常的方法进行测定。例如，可利用UV法、Lowry法、Bradford法进行定量。
通过本发明的制造方法所制造的标记抗体的平均粒径优选为1～1000nm，更优选为20～500nm。
该平均粒径为如下求出的值：利用图像处理装置而自透射式电子显微镜(TEM)、扫描式电子显微镜(SEM)等的图像随机选择的50个颗粒的合计投影面积求出颗粒的占有面积，求出相当于该合计占有面积除以所选择的颗粒个数(50个)而得的值的圆的直径的平均值(平均圆当量径)而得的值作为上述平均粒径。
上述平均粒径不包含一次颗粒凝集而成的二次颗粒的粒径。
通过本发明的制造方法所制造的标记抗体的粒度分布的变异系数(所谓CV值)并无特别限制，优选为10％以下，更优选为8％以下。
通过本发明的制造方法所制造的标记抗体中，抗体在含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒表面的键合量与导入至含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒中的硫醇基的量呈正的相关关系，因此通过控制硫醇基的导入量，可精密地控制抗体的键合量。例如，只要为特定的相同条件下制作的具有硫醇基的含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒，则颗粒表面的硫醇基的量为一定，因此可获得键合有始终为一定量的抗体的含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒。由此，在将键合有抗体的含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒用于所需的检测试验或分析试验时，可大幅抑制所得的输出值(例如荧光强度)的不均，可进行定量性及可靠性优异的试验。另外，通过预先测定含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒表面的硫醇基的量，可估计抗体的键合量。因此，只要预先制作多个改变硫醇基的键合量的含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒，即可根据目的而制备键合有所期望量的抗体的含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒。
本发明的制造方法中，抗体是经由自身具有的羧基而键合在含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒表面的。即，在含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒表面大量存在抗体的胺基酸序列中的羧基末端(C末端)与连接分子的胺基发生酰胺键合的情况。据认为，由此抗体的可变区易向与二氧化硅颗粒侧相反侧(二氧化硅颗粒的外侧)配向等，目标抗原的捕捉能力提高。
目标抗原的捕捉能力的提高在使用更低分子的抗体时变得更显著。例如，在使用F(ab')2抗体或Fab抗体等片段抗体、scFv或sc(Fv)2等单链抗体、含有VH及VL的聚胺基酸作为抗体的情况下更显著。
本发明的制造方法中使用表面具有硫醇基的含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒，通过使用该具有硫醇基的含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒，方可使抗体与含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒简便且均质地键合。作为使含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒与抗体经由连接分子牢固且稳定地键合的方法，例如也可考虑如下方法等：向含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒的表面导入胺基而非硫醇基，使连接分子所具有的活性酯基与该胺基共价键合，进而使连接分子所具有的马来酰亚胺基与导入抗体的硫醇基共价键合。然而，实际上，表面导入有胺基的含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒易凝集，实用性较差。可认为其原因在于，与表面具有硫醇基的二氧化硅纳米颗粒相比，表面具有胺基的二氧化硅纳米颗粒的疏水性更高。
本发明的制造方法中，作为连接分子，可选择碳链的长度不同者或含有芳香环者，通过适当选择连接分子的结构，可更有效地发挥键合在含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒表面的抗体的目标抗原捕捉能力。
本发明的标记抗体是可通过上述的本发明的制造方法而获得的颗粒。本发明的标记抗体以含有功能性分子的二氧化硅纳米颗粒作为标记颗粒，且抗体经由连接基而键合在其表面。含有功能性分子的二氧化硅纳米颗粒与连接基通过硫醚键而连结，上述抗体与上述连接基的连结结构以*-C(＝O)-NH-**(*表示抗体侧，**表示连接基侧)表示。
若换另一种表现，本发明的标记抗体具有：含有功能性分子的二氧化硅纳米颗粒所具有的硫醇基与连接分子所具有的马来酰亚胺基通过硫醚键键合而成的结构、及该连接分子所具有的胺基与抗体所具有的羧基通过酰胺键键合而成的结构。
具有硫醇基的含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒、连接分子、抗体与上述本发明的制造方法中所说明的含义相同。
本发明的标记抗体可用作标记试剂，可使后文叙述的各种分析试剂含有其作为标记试剂。
本发明的标记抗体的目标抗原的捕捉能力优异。除此以外，并非基于抗原抗体反应的结合，即所谓非特异性吸附受到进一步抑制。如后文叙述的实施例所示，使用含有本发明的标记抗体的分析试剂所得的分析结果的感度高、且可靠性优异。
本发明的胶体是使本发明的标记抗体分散在分散介质中而成的。
上述分散介质并无特别限制，只要可使本发明的标记抗体均匀分散即可，优选为亲水性的溶剂。作为亲水性溶剂，例如，可列举水、甲醇、乙醇、水与甲醇的混合溶剂、水与乙醇的混合溶剂、PBS(磷酸缓冲食盐水)、Tris缓冲液、HEPES缓冲液等缓冲液。
另外，从进一步防止本发明的标记抗体的非特异性吸附的观点而言，也可使本发明的胶体含有聚乙二醇(PEG)、血清白蛋白(BSA)等任意的阻断剂。另外，也可含有叠氮化钠等防腐剂。
在本发明的胶体中，本发明的标记抗体稳定地存在，可维持抗体的目标抗原捕捉能力并且进行长期保存。
本发明的胶体可用作标记试剂液。另外，可用于制备分析试剂所含的标记试剂。
本发明的分析试剂含有本发明的标记抗体。本发明的分析试剂用作用以检测抗体可识别的目标抗原的检测试剂、用以对该目标抗原进行定量的定量试剂、用以分离该目标抗原的分离试剂、用以将该目标抗原单离而回收的回收试剂、标记该目标抗原的标记试剂等。
上述目标抗原并无特别限制，可列举通常的分析、检查、诊断中的检测对象的分子等。作为其中一例，可列举病毒抗原、食物过敏原、血液检查等中的各种标记物、毒素、细胞膜蛋白质、细胞膜糖链、免疫球蛋白等。
作为本发明的分析试剂的优选例，可列举具有在结合垫(conjugate pad)保持有本发明的标记抗体的试带的免疫层析装置等。
[实施例]
[参考例1]具有硫醇基的含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒的制备-1
(含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒的制备)
制备含有作为荧光分子的羧基罗丹明(carboxyrhodamine)6G作为功能性分子的二氧化硅纳米颗粒。
将31mg的5-(及-6)-羧基罗丹明6G-丁二酰亚胺酯(succinimidyl ester)(商品名，empBiotech GmbH公司制造)溶解在10mL的二甲基甲酰胺(DMF)中。在其中加入12μL的APS(Shin-Etsu Silicones公司制造)，在室温(23℃)下反应1小时，而获得5-(及-6)-羧基罗丹明6G-APS复合体(5mM)。
将获得的5-(及-6)-羧基罗丹明6G-APS复合体的溶液600μL与乙醇140mL、TEOS(Shin-Etsu Silicones公司制造)6.5mL、蒸馏水20mL及28质量％氨水15mL混合，在室温下反应24小时。
将反应液在18000×g的重力加速度下离心分离30分钟，除去上清液。在沈淀出的含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒中加入4mL蒸馏水，使该颗粒分散，再次在18000×g的重力加速度下离心分离30分钟。进而将本清洗操作重复2次，除去含荧光分子的二氧化硅纳米颗粒的分散液中所含的未反应的TEOS或氨等，获得平均粒径271nm的含荧光分子的二氧化硅纳米颗粒1.65g。产率为约94％。
(硫醇基的导入)
使上文中获得的颗粒1g分散在水/乙醇＝1/4的混合液150mL中。在其中加入1.5mL的MPS(和光纯药股份有限公司制造)。继而加入28％氨水20mL，在室温下混合4小时。
在18000×g的重力加速度下将反应液离心分离30分钟，除去上清液。在沈淀出的二氧化硅纳米颗粒中加入10mL的蒸馏水，使颗粒分散，再次在18000×g的重力加速度下离心分离30分钟。进而将本清洗操作重复2次，将具有硫醇基的含荧光分子的二氧化硅纳米颗粒的分散液中所含的未反应的MPS或氨等除去，获得导入有硫醇基的含荧光分子的二氧化硅纳米颗粒(以下称作硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒A)。
(硫醇基的定量分析)
使用上述硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒A 500mg，利用DNTB进行硫醇基的定量分析。其结果，硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒A的颗粒表面的硫醇基的密度为0.046个/nm2。
[参考例2]具有硫醇基的含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒的制备-2
利用乙醇将14质量％的氨水稀释5倍而制备175mL的含氨水的溶剂。在该含氨水的溶剂中添加TEOS(Shin-Etsu Silicones公司制造)1.5mL(6.75mmol)与参考例1所制备的5-(及-6)-羧基罗丹明6G-APS复合体(5mM)1.5mL，在40℃下搅拌30分钟，由此获得形成有含有荧光分子的核颗粒的溶液(以下有时称作含核荧光颗粒溶液)。
在上述含核荧光颗粒溶液中进一步添加TEOS(Shin-Etsu Silicones公司制造)1.5mL(6.75mmol)、与以成为10mM的浓度的方式溶解在二甲基甲酰胺(DMF，和光纯药公司制造)中的5-(及-6)-羧基罗丹明6G-APS 550μL(5.5μmol)，在40℃下搅拌30分钟，由此在核荧光颗粒形成壳层，获得含有含荧光分子的二氧化硅纳米颗粒(以下有时称作第1荧光二氧化硅纳米颗粒)的溶液。
在上述含第1荧光二氧化硅纳米颗粒溶液中进一步添加500μL(2.26mmol)的TEOS与265μL(2.65μmol)的以成为10mM的浓度的方式溶解在DMF中的5-(及-6)-羧基罗丹明6G-APS，在40℃下搅拌30分钟，获得含有在第1荧光二氧化硅纳米颗粒进一步形成有壳层的颗粒(以下有时称作第2荧光二氧化硅纳米颗粒)的溶液。
为了向第2荧光二氧化硅纳米颗粒的表面导入巯丙基，而在上述含第2二氧化硅纳米颗粒溶液中进一步添加1mL的以表1的条件1的混合比所制备的MPS(和光纯药股份有限公司制造)与TEOS的混合液(MPS/TEOS混合液)。在室温下搅拌30分钟，由此获得含有表层具有羟基与巯丙基的含荧光分子的二氧化硅纳米颗粒(以下称作硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒B)的溶液。同样地，也制备含有下述含荧光分子的二氧化硅纳米颗粒(以下分别称为硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒C、硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒D)的溶液，该含荧光分子的二氧化硅纳米颗粒是通过添加以表1的条件2及3的混合比所制备的MPS/TEQS混合液所制备的。
MPS/TEOS混合液是在即将进一步添加之前进行制备的。
[表1]
(硫醇基的定量分析)
分别使用500mg的以条件1～3所得的硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒B～D，利用DNTB进行硫醇基的定量分析。其结果，颗粒表面的硫醇基的密度如下：硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒B为0.012个/nm2，硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒C为0.056个/nm2，硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒D为0.072个/nm2。
[比较例1]标记抗体的制造(经由抗体的胺基的键合-1)
在参考例1中所制作的硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒A(平均粒径260nm)的分散液(浓度25mg/ml，分散介质：蒸馏水)40μL中加入460μL的DMF，以15000×g的重力加速度离心分离10分钟。除去上清液，加入500μL的DMF并离心分离，除去上清液。再次加入500μL的DMF，使硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒A分散。在其中加入1mg的作为连接分子的3-马来酰亚胺苯甲酸，混合30分钟，由此使上述连接分子的马来酰亚胺基与硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒A的硫醇基之间形成硫醚键。
以15000×g的重力加速度将该反应液离心分离10分钟，除去上清液后，加入90.6μL的蒸馏水，使颗粒分散。继而，加入0.5M的MES(2-吗啉乙磺酸)(pH6.0)100μL、50mg/mL的NHS(N-羟基丁二酰亚胺)230.4μL、19.2mg/mL的EDC(1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺)75μL并混合。在其中加入4.0μL的抗A型流感核蛋白质抗体(6.2mg/ml，取自小鼠，HyTest公司制造)，混合10分钟。
以15000×g的重力加速度离心分离10分钟，除去上清液。加入400μL的10mM的KH2PO4(pH7.5)，使颗粒分散。继而以15000×g的重力加速度离心分离10分钟，除去上清液。再次加入400μL的10mM的KH2PO4(pH7.5)，使颗粒分散而获得胶体。
以该胶体为样品，进行蛋白质定量。蛋白质定量是使用Pierce BCA Protein AssayKit(Thermo Fisher Scientific公司制造)。其结果，每1g键合有抗体的含荧光分子的二氧化硅纳米颗粒(标记抗体)抗体的键合量为8.5mg。
继而在上述胶体中加入10μL的10％BSA并混合10分钟。以15000×g的重力加速度离心分离10分钟，除去上清液。加入500μL的10mM的KH2PO4(pH7.5)，使颗粒分散，以15000×g的重力加速度离心分离10分钟，除去上清液。再次加入400μL的10mM的KH2PO4(pH7.5)，使颗粒分散，从而获得分散有含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒的胶体(以下称作比较例的胶体A)，该含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒的胶体键合有抗A型流感核蛋白质抗体。
[比较例2]标记抗体的制造(经由抗体的胺基的键合-2)
使用参考例2中所制备的硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒B～D，按照与比较例1相同的方式进行抗体的键合处理，获得分散有颗粒的各胶体。蛋白质定量的结果，每1g键合有抗体的含荧光分子的二氧化硅纳米颗粒(标记抗体)的抗体键合量如下：在使用硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒B的情况下为3.7mg，在使用硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒C的情况下为9.2mg，在使用硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒D的情况下为12.8mg。
继而，在上述各胶体中加入10μL的10％BSA并混合10分钟。以15000×g的重力加速度离心分离10分钟，除去上清液。加入500μL的10mM的KH2PO4(pH7.5)，使颗粒分散，以15000×g的重力加速度离心分离10分钟，除去上清液。再次加入400μL的10mM的KH2PO4(pH7.5)，使颗粒分散，获得分散有键合有抗A型流感核蛋白质抗体的含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒的胶体(与上述硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒B～D相对应，以下称作比较例的胶体B～D)。
[实施例1]标记抗体的制造(经由抗体的羧基的键合-1)
使用参考例1中所制作的硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒A，利用以下方法使抗体键合。
在硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒A的分散液(浓度25mg/ml，分散介质：蒸馏水)40μL中加入460μL的DMF，以15000×g的重力加速度离心分离10分钟。除去上清液，加入500μL的DMF并进行离心分离，除去上清液。再次加入500μL的DMF，使硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒A分散。在其中加入1mg的作为连接分子的N-(4-胺基苯基)马来酰亚胺，混合30分钟，由此使上述连接分子的马来酰亚胺基与硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒的硫醇基之间形成硫醚键。
以15000×g的重力加速度将该反应液离心分离10分钟，除去上清液后，加入90.6μL的蒸馏水，使颗粒分散。继而，加入100μL的0.5M的MES(2-吗啉乙磺酸)(pH6.0)、230.4μL的50mg/mL的NHS(N-羟基丁二酰亚胺)、75μL的19.2mg/mL的EDC(1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺)并混合。在其中加入4.0μL的抗A型流感核蛋白质抗体(6.2mg/ml，取自小鼠，HyTest公司制造)，混合10分钟。
以15000×g的重力加速度离心分离10分钟，除去上清液。加入400μL的10mM的KH2PO4(pH7.5)，使颗粒分散。继而以15000×g的重力加速度离心分离10分钟，除去上清液。再次加入400μL的10mM的KH2PO4(pH7.5)，使颗粒分散而获得胶体。
以该胶体为样品进行蛋白质定量。蛋白质定量是使用Pierce BCA Protein AssayKit(Thermo Fisher Scientific公司制造)。其结果，每1g含荧光分子的二氧化硅纳米颗粒的抗体键合量为7.9mg。
继而，在上述胶体中加入10μL的10％BSA并混合10分钟。以15000×g的重力加速度离心分离10分钟，除去上清液。加入500μL的10mM的KH2PO4(pH7.5)，使颗粒分散，以15000×g的重力加速度离心分离10分钟，除去上清液。再次加入400μL的10mM的KH2PO4(pH7.5)，使颗粒分散，从而获得分散有键合有抗A型流感核蛋白质抗体的含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒A的胶体(以下称作本发明的胶体A)。
[实施例2]标记抗体的制造(经由抗体的羧基的键合-2)
使用参考例2中所制备的硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒B～D，按照与实施例1相同的方式进行抗体的键合处理，获得分散有颗粒的各胶体。蛋白质定量的结果，每1g键合有抗体的含荧光分子的二氧化硅纳米颗粒的抗体键合量如下：在使用硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒B的情况下为4.2mg，在使用硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒C的情况下为8.8mg，在使用硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒D的情况下为11.3mg。
继而，在上述各胶体中加入10μL的10％BSA并混合10分钟。以15000×g的重力加速度离心分离10分钟，除去上清液。加入500μL的10mM的KH2PO4(pH7.5)，使颗粒分散，以15000×g的重力加速度离心分离10分钟，除去上清液。再次加入400μL的10mM的KH2PO4(pH7.5)，使颗粒分散，获得分散有键合有抗A型流感核蛋白质抗体的含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒的胶体(与上述硫醇基导入二氧化硅纳米颗粒B～D相对应，以下称作本发明的胶体B～D)。
[试验例1]免疫层析法试验
(免疫层析法用试带的制作)
通过以下方法制作抗体固定化膜片。
在距离膜片(长25mm，商品名：Hi-Flow Plus 120膜片，MILLIPORE公司制造)一端约6mm的位置，以0.75μL/cm的涂布量涂布按照1mg/mL含有源自兔子的抗A型流感核蛋白质抗体(多株抗体，本公司制造)的溶液((50mM的KH2PO4，pH7.0)+5％蔗糖)，作为宽度约1mm的A型流感用测试线。
继而，作为宽度约1mm的控制线，以0.75μL/cm的涂布量涂布按照1mg/mL含有源自山羊的抗小鼠IgG抗体(AKP Goat anti-mouse IgG Antibody，BioLegend公司制造)的溶液((50mM的KH2PO4，pH7.0)无糖)，在50℃下干燥30分钟。需要说明的是，测试线与控制线的间隔为3mm。
在背衬片(商品名AR9020，Adhesives Research公司制造)上组装上述抗体固定化膜片、样品垫(Glass Fiber Conjugate Pad(GFCP)，MILLIPORE公司制造)、及吸收垫(Cellulose Fiber Sample Pad(CFSP)，MILLIPORE公司制造)。需要说明的是，膜片是按照A型流感用测试线为样品垫侧、控制线为吸收垫侧的朝向而构成的。
(检测装置)
制作检测装置，该检测装置具有由光源、滤光片及光电倍增管(PMT)构成的检测单元，该检测单元具备通过马达而以一定速度进行直线移动的机构、和每隔50微秒记录一次PMT的受光强度的记录机构。需要说明的是，检测单元具有如下机构：光源为532nm的激光二极管，使激光二极管照射样品，使反射光透过仅透过550nm以上波长的光的滤光片后以光电倍增管(PMT)接收光。
(流感核蛋白质的迅速判定)
制备如表2所示的浓度的A型流感核蛋白质的溶液(50mM KH2PO4，pH7.0)。继而将100μL的该溶液与2μL的比较例的胶体A(2.5mg/mL)的混合液滴加在试带的样品垫部分。也以同样的方式对比较例的胶体B～D、本发明的胶体A～D实施试验。15分钟后，通过上述检测器进行测定，将线的发光强度数值化。将结果示于表2。
如表2所示，可知，若将使用相同的硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒的胶体进行比较，则不含A型流感核蛋白质的样品(0ng/mL)中，与比较例的胶体相比，本发明的胶体的测试线强度受到抑制，非特异性吸附更少。另一方面，含有A型流感核蛋白质的样品(20ng/mL及50ng/mL)中，与比较例的胶体相比，本发明的胶体的测试线强度得以大幅提高。
[比较例3]标记抗体的制造(经由抗体的胺基的键合-3)
使用参考例1中所制作的硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒A作为含功能性分子的二氧化硅颗粒，使用经Fab化的抗A型流感核蛋白质抗体作为抗体，按照与比较例1相同的方式使二氧化硅颗粒与抗体键合。以所得的胶体为样品进行蛋白质定量，结果，每1g键合有抗体的含荧光分子的二氧化硅纳米颗粒抗体的键合量为7.1mg。
继而，在上述胶体中加入10μL的10％BSA，混合10分钟。以15000×g的重力加速度离心分离10分钟，除去上清液。加入500μL的10mM的KH2PO4(pH7.5)，使颗粒分散，以15000×g的重力加速度离心分离10分钟，除去上清液。再次加入400μL的10mM的KH2PO4(pH7.5)，使颗粒分散，获得分散有键合有经Fab化的抗A型流感核蛋白质抗体的含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒的胶体(以下称作比较例的胶体A')。
[实施例3]标记抗体的制造(经由抗体的羧基的键合-3)
使用参考例1中所制作的硫醇基导入荧光二氧化硅纳米颗粒A作为含功能性分子的二氧化硅颗粒，使用与比较例3所使用者相同的经Fab化的抗A型流感核蛋白质抗体作为抗体，按照与实施例1相同的方式使二氧化硅颗粒与抗体键合。以所得的胶体为样品进行蛋白质定量，结果，每1g键合有抗体的含荧光分子的二氧化硅纳米颗粒抗体的键合量为8.5mg。
继而，在上述胶体中加入10μL的10％BSA，混合10分钟。以15000×g的重力加速度离心分离10分钟，除去上清液。加入500μL的10mM的KH2PO4(pH7.5)，使颗粒分散，以15000×g的重力加速度离心分离10分钟，除去上清液。再次加入400μL的10mM的KH2PO4(pH7.5)，使颗粒分散，获得分散有键合有经Fab化的抗A型流感核蛋白质抗体的含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒的胶体(以下称作本发明的胶体A')。
[试验例2]免疫层析法试验
按照与试验例1相同的方式实施免疫层析试验。将结果示于表3。
[表3]
如表3所示，不含A型流感核蛋白质的样品(0ng/mL)中，与比较例3的胶体相比，实施例3的胶体的测试线强度受到显著抑制。并且，含有A型流感核蛋白质的样品(20ng/mL及50ng/mL)中，与比较例3的胶体相比，实施例3的胶体的测试线强度得以大幅提高。若比较表2的结果与表3的结果，则可知，与键合通常的抗体(全(whole)抗体)的情况相比(表2)，在使用片段抗体的情形(表3)时，经由抗体的胺基而与二氧化硅颗粒键合者与经由抗体的羧基而与二氧化硅颗粒键合者之间，后者(表3)的测试线强度的差增大。一般而言，已知在以血液样品等生物检体为样品的情况下，与全抗体相比片段抗体的非特异性吸附较少，检测感度良好。因此，在使用片段抗体的情况下，更具优势的本发明的标记抗体在实际检查的现场可成为更有用的检查工具。
虽说明了本发明与其实施方式，但只要本发明没有特别指定，则即使在说明本发明的任一细部中，皆非用以限定本发明，且只要在不违反本案权利要求所示的发明精神与范围下，应作最大范围的解释。
本申请主张基于2013年2月4日在日本提出专利申请的特愿2013-19972的优先权，本发明是参照该申请并将其内容加入作为本说明书记载的一部分。
【符号说明】
1：试带
2：样品垫
3：结合垫
4：抗体固定化膜片
41：判定部(测试线)
42：控制线
5：吸收垫
6：背衬片

Claims (13)

1.一种标记抗体的制造方法，其包含下述工序：
a)使含有功能性分子且表面具有硫醇基的二氧化硅纳米颗粒与具有马来酰亚胺基及胺基的连接分子共存在溶剂中，由此在该硫醇基与该马来酰亚胺基之间形成硫醚键，获得键合有连接分子且含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒，及
b)使该键合有连接分子且含功能性分子的二氧化硅纳米颗粒、碳二亚胺及抗体共存在水系溶剂中，在该连接分子所具有的胺基与该抗体所具有的羧基之间形成酰胺键。
2.如权利要求1所述的标记抗体的制造方法，其中，工序a)中的溶剂为非质子性溶剂。
3.如权利要求2所述的制造方法，其中，非质子性溶剂选自二甲基亚砜、环丁砜、吡啶、N-甲基吡咯烷酮、N-环己基吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、及N,N-二甲基乙酰胺。
4.如权利要求1～3任一项所述的制造方法，其中，连接分子的结构是马来酰亚胺基与胺基经由2价的脂肪族基或亚芳香基或者它们的组合连结而成的结构。
5.如权利要求1～4任一项所述的制造方法，其中，标记抗体的平均粒径为20nm～500nm。
6.如权利要求1～5任一项所述的制造方法，其中，功能性分子选自由荧光分子、吸光分子、磁性分子、放射性分子及pH敏感性分子组成的组。
7.如权利要求1～6任一项所述的制造方法，其中，在含有功能性分子且表面具有硫醇基的二氧化硅纳米颗粒中，存在于表面的硫醇基的密度为0.002个/nm2～0.2个/nm2，抗体的键合量受该硫醇基的量控制。
8.一种标记抗体，其是以含有功能性分子的二氧化硅纳米颗粒作为标记颗粒且抗体经由连接基而键合在该二氧化硅纳米颗粒的表面而成的，其中，
所述含有功能性分子的二氧化硅纳米颗粒与所述连接基通过硫醚键而连结，所述抗体与所述连接基的连结结构为*-C(＝O)-NH-，*表示抗体侧。
9.如权利要求8所述的标记抗体，其中，连接基具有2价的脂肪族基或亚芳香基或者它们的组合。
10.如权利要求8或9所述的标记抗体，其中，平均粒径为20nm～500nm。
11.一种胶体，其是权利要求8～10任一项所述的标记抗体分散在分散介质中而成的。
12.如权利要求11所述的胶体，其中，分散介质为缓冲液。
13.一种分析试剂，其含有权利要求8～10任一项所述的标记抗体。
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