CN116297904A - 一种测定丙氨酰谷氨酰胺原料药中有关物质的高效液相色谱方法 - Google Patents

一种测定丙氨酰谷氨酰胺原料药中有关物质的高效液相色谱方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种测定丙氨酰谷氨酰胺原料药中有关物质的高效液相色谱方法，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，能够有效的分离丙氨酰谷氨酰胺有关物质，包括降解杂质和工艺杂质，且该方法的精密度高，柱子的使用寿命长，能够更好的控制丙氨酰谷氨酰胺原料药的产品质量。

Description

一种测定丙氨酰谷氨酰胺原料药中有关物质的高效液相色谱 方法
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，涉及一种测定丙氨酰谷氨酰胺原料药中有关物质的高效液相色谱方法。
背景技术
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺又称丙谷二肽，分子式为C8H15N3O4，是白色或类白色的疏松块状物。丙氨酰谷氨酰胺是肠外营养的一个组分，适用于需要补充谷氨酰胺的病人，比如处于分解代谢或高代谢状况的病人。
丙氨酰谷氨酰胺原料药质量标准在《中国药典》2020版(二部)中有收录，其有关物质检测方法：采用氨基键合硅胶为填充剂的色谱柱。当前中国药典方法存在的挑战具体为：色谱柱的使用寿命短、方法重现性差、杂质分离度不佳甚至无法分离。
发明内容
针对现有的技术的不足，本发明的目的在于提供一种测定丙氨酰谷氨酰胺原料药中有关物质的高效液相色谱方法，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，使用寿命更长，重现性更佳，对杂质的分离效果更好，检测灵敏度更高。
为实现发明目的，本发明采取如下的技术方案：
一种丙氨酰谷氨酰胺原料药有关物质的高效液相色谱方法，包括如下步骤：
(1)配制溶液：
a、稀释剂：纯化水；
b、供试品溶液：取丙氨酰谷氨酰胺原料药适量，加溶剂稀释，作为供试品溶液；c、对照品溶液：取丙氨酰谷氨酰胺原料药适量，加溶剂稀释，作为对照品溶液；d、系统适用性溶液：取丙氨酰谷氨酰胺杂质即丙氨酰按谷氨酰胺适量，加溶剂稀释，作为系统适用性溶液；
(2)检测：
分别取供试品溶液、对照品溶液、系统适用性溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，按加校正因子的主成分外标法计算；
色谱条件如下：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
检测波长：200nm±2nm；
流速：0.9～1.1ml/min；
柱温：32～34℃；
进样器温度：2～8℃
进样体积：10～50μL；
流动相：磷酸盐缓冲溶液-乙腈
洗脱方式：等度洗脱。
进一步地，所述的流动相的配置方法为：取磷酸二氢钾1.36g，加水1000ml使溶解，用磷酸溶液调节pH值至2.1±0.05，加乙腈11.5ml±0.5ml，加辛烷磺酸钠0.108g，溶解后混匀。
进一步地，所述步骤(1)中的供试品溶液的浓度为1～3mg/ml；对照品溶液的浓度为0.8～4μg/ml；系统适用性溶液的主成分浓度为1～4mg/ml，杂质浓度为0.8～4μg/ml。
作为优选，系统适用性溶液的主成分浓度的浓度为2mg/ml。
作为优选，所述步骤(2)中流速为1.0ml/min，柱温为33℃，进样器温度5℃，进样体积为20μL。
进一步地，所述步骤(2)中检测方法的色谱柱规格为Inertsil ODS-3V，5μm，4.6×250mm；
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的丙氨酰谷氨酰胺原料药有关物质检测方法，能够有效的分离丙氨酰谷氨酰胺有关物质，包括降解杂质和工艺杂质，且该方法的精密度高，柱子的使用寿命长，能够更好的控制丙氨酰谷氨酰胺原料药的产品质量。
附图说明
图1为实施例1中的中国药典收载方法的液相色谱图；
图2为实施例1中的本申请方法的液相色谱图；
图3为实施例2系统适用性溶液的液相色谱图；
图4为实施例2供试品溶液的液相色谱图。
具体实施方式
为是本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案晶型清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的描述中，所涉及的各种仪器与材料说明如下：
1、材料
丙氨酰谷氨酰胺对照品(中国食品药品检定研究院，批号140702-202005)；丙氨酰谷氨酰胺原料药(精晶药业股份有限公司，批号C582204006)；环-(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)(中国食品药品检定研究院，批号140702-202005)；环-(L-丙氨酰-L-谷氨酸)(中国食品药品检定研究院，批号140761-201903)；L-焦谷氨酰-L-丙氨酸(中国食品药品检定研究院，批号140766-201803)；L-焦谷氨酸(中国食品药品检定研究院，批号140762-202103)；D-丙氨酰-L-谷氨酰胺(中国食品药品检定研究院，批号140763-201602)；L-丙氨酰-L-谷氨酸(中国食品药品检定研究院，批号140765-201702)；L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(上海柯维化学技术有限公司，批号30175-A6)；环状亚胺(QCC，批号13-JAN-22-33)；丙氨酰-谷氨酰-丙氨酰-谷氨酰胺(QCC，批号13-JAN-22-27)；丙氨酰-(γ-谷氨酰)-丙氨酰-谷氨酰胺(QCC，批号24-NOV-20-28)。
2、主要仪器
Agilent1260高效液相色谱仪；DAD检测器。
3、已知杂质的化学结构式
Figure BDA0004045939710000031
Figure BDA0004045939710000041
实施例1：丙氨酰谷氨酰胺有关物质检测结果对比
表1中国药典-系统适用性溶液
Figure BDA0004045939710000042
Figure BDA0004045939710000051
表2申请方法-系统适用性溶液
Figure BDA0004045939710000052
实验结果表明，采用中国药典方法的系统适用性溶液色谱图中，杂质7、杂质8未分离，主峰与前后峰的分离度分别为1.4、0.6，不符合分离度不小于1.5的要求；采用申请方法的系统适用性溶液色谱图中，各峰完全分离，分离度不小于2.0，分离情况极佳。
实施例2：丙氨酰谷氨酰胺原料药有关物质检测
(1)高效液相色偶条件：
色谱柱：Inertsil ODS-3V，5μm，4.6×250mm；
检测波长：200nm；
流速：1.0ml/min；
柱温：33℃；
进样器温度：5℃
进样体积：20μL；
流动相：磷酸盐缓冲溶液(取磷酸二氢钾1.36g，加水1000ml使溶解，用磷酸溶液调节pH值至2.1±0.05，加乙腈11.5ml±0.5ml，加辛烷磺酸钠0.108g，溶解后混匀)；
洗脱方式：等度洗脱。
(2)样品及溶液配制：
稀释剂：纯化水；
空白溶液：稀释剂；
供试品溶液：精密称取丙氨酰谷氨酰胺原料药，用溶剂稀释成2mg/ml的溶液；系统适用性溶液：精密称取丙氨酰谷氨酰胺对照品、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8、杂质9、杂质10，用溶剂稀释成含丙氨酰谷氨酰胺2mg/ml、杂质1 4μg/ml、杂质2 0.8μg/ml、杂质3 2μg/ml、杂质4 1μg/ml、杂质5 1μg/ml、杂质6 4μg/ml、杂质7 2μg/ml、杂质8 2μg/ml、杂质9 2μg/ml、杂质10 2μg/ml的溶液；
(3)测定法
分别取空白溶液、供试品溶液、系统适用性溶液，采用上述色谱条件进样，记录色谱图，按加校正因子的主成分外标法计算。
实验结果：系统适用性溶液液相色谱图见图1，供试品溶液液相色谱图见图2。
表3有关物质验证-系统适用性-系统适用性溶液-2
Figure BDA0004045939710000061
实验结果表明，系统适用性溶液色谱图中，各峰之间的分离度均大于1.5，各杂质的理论塔板数均大于5000。丙氨酰谷氨酰胺供试品溶液色谱图中未检出杂质。
实施例3：方法学验证
1、专属性
仪器及色谱条件同实施例1。
考察各峰之间的分离度
取丙氨酰谷氨酰胺对照品、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8、杂质9、杂质10各适量，用纯化水溶解并稀释制成混合溶液，取20μl，注入高效液相色谱仪，结果显示各峰之间的分离度符合要求。
2、检测限和定量限
精密称取丙氨酰谷氨酰胺对照品、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8、杂质9、杂质10各适量，用去离子水溶解并逐级稀释，注入高效液相色谱仪，取信噪比约为10的浓度为定量限，信噪比约为3的浓度为检测限。定量限测得结果为：各已知杂质和丙氨酰谷氨酰胺定量限浓度在0.0399ug/ml～0.197ug/ml，相对于供试品溶液浓度在0.002％～0.01％，各已知杂质峰和丙氨酰谷氨酰胺峰的信噪比在17-752。检测限测得的结果为：各已知杂质和丙氨酰谷氨酰胺检测限在0.0120ug/ml～0.0591ug/ml，相对于供试品浓度在0.0006％～0.003％；各已知杂质峰和丙氨酰谷氨酰胺峰的信噪比在6～144。
3、线性关系
精密称取丙氨酰谷氨酰胺对照品、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8、杂质9、杂质10对照品各适量，用纯化水溶解并稀释至LOQ、50％限度浓度、100％限度浓度、150％限度浓度、200％限度浓度的溶液。分别取20μl，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为总过指标(Y)，进样浓度为横坐标(X)，得到线性回归方程为，具体结果见表2。
表4有关物质验证-线性结果
Figure BDA0004045939710000071
Figure BDA0004045939710000081
Figure BDA0004045939710000091
Figure BDA0004045939710000101
结果表明：各杂质在定量限至限度2倍范围内峰面积与浓度呈良好线性关系，相关系数r均为1.000。响应因子(A/C)RSD在0.74％～8.18％。Y轴截距与100％响应值比值在0.12％～1.96％。
4、稳定性
对照品溶液：精密称取丙氨酰谷氨酰胺对照品适量，稀释成1ml中含丙氨酰谷氨酰胺2μg的溶液。
供试品溶液：精密称取丙氨酰谷氨酰胺原料药适量，稀释成1ml中含丙氨酰谷氨酰胺2mg的溶液。
系统适用性溶液：精密称取丙氨酰谷氨酰胺对照品、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8、杂质9、杂质10对照品各适量，配制成1ml中含丙氨酰谷氨酰胺2mg、杂质1 4μg、杂质2 0.8μg、杂质3 2μg、杂质4 1μg、杂质5 1μg、杂质6 4μg、杂质7 2μg、杂质8 2μg、杂质9 2μg、杂质10 2μg的溶液。加标供试品溶液：精密称取丙氨酰谷氨酰胺原料药、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8、杂质9、杂质10对照品各适量，配制成1ml中含丙氨酰谷氨酰胺2mg、杂质1 4μg、杂质2 0.8μg、杂质3 2μg、杂质4 1μg、杂质5 1μg、杂质6 4μg、杂质7 2μg、杂质8 2μg、杂质9 2μg、杂质10 2μg的溶液。取丙氨酰谷氨酰胺对照品溶液、供试品溶液、系统适用性溶液、加标供试品溶液，在5℃放置0、10、24、46、68、84小时分别吸取20μl，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，结果见表3、表4、表5、表6。
表5系统适用性溶液稳定性(5℃)
Figure BDA0004045939710000102
/>
Figure BDA0004045939710000111
表6对照品溶液稳定性(5℃)
时间 0h 10h 24h 52h 74h 84h RSD(％)
峰面积 58.595 58.106 57.793 58.069 59.051 58.122 0.78
表7供试品溶液稳定性(5℃)
Figure BDA0004045939710000112
表8供试品加标溶液稳定性(5℃)
Figure BDA0004045939710000121
/>
Figure BDA0004045939710000131
/>
Figure BDA0004045939710000141
结果表明：系统适用性溶液冷藏放置5天各峰峰面积RSD均不大于5％，故系统适用性溶液溶液5℃放置5天内稳定性良好。
对照品溶液冷藏放置84h小时主峰各时间点测定的峰面积RSD不大于5.0％，故对照品溶液溶液冷藏放置84小时内稳定性良好。
供试品溶液冷藏放置84小时各杂质含量与0小时各杂质含量的差值均不大于0.001％，故供试品溶液5℃放置84小时内稳定性良好。
供试品加标溶液冷藏放置84小时各杂质含量与0小时各杂质含量的差值均小于0.01％，故供试品加标溶液冷藏放置84小时内稳定性良好。
5、精密度
5.1、重复性
取1ml中含丙氨酰谷氨酰胺2mg、杂质1 4μg、杂质2 0.8μg、杂质3 2μg、杂质4 1μg、杂质5 1μg、杂质6 4μg、杂质7 2μg、杂质8 2μg、杂质9 2μg、杂质10 2μg的加标供试品溶液，每次吸取20μl，注入高效液相色谱仪，连续进样6次、测定峰面积，结果见表7。
表9重复性试验结果
Figure BDA0004045939710000142
Figure BDA0004045939710000151
/>
结果表明：6份供试品加标溶液中，杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8、杂质9、杂质10的平均含量分别为0.20％、0.04％、0.10％、0.05％、0.05％、0.18％、0.10％、0.10％、0.10％、0.10％，RSD分别为0.00％、0.00％、0.00％、0.00％、0.00％、2.29％、5.35％、0.00％、0.00％、0.00％。
5.2、中间精密度
不同试验人员在不同时配制下列溶液：
对照品溶液：精密称取丙氨酰谷氨酰胺对照品适量，稀释成1ml中含丙氨酰谷氨酰胺2μg的溶液。
供试品溶液：精密称取丙氨酰谷氨酰胺原料药适量，稀释成1ml中含丙氨酰谷氨酰胺2mg的溶液。
系统适用性溶液：精密称取丙氨酰谷氨酰胺对照品、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8、杂质9、杂质10对照品各适量，配制成1ml中含丙氨酰谷氨酰胺2mg、杂质1 4μg、杂质2 0.8μg、杂质3 2μg、杂质4 1μg、杂质5 1μg、杂质6 4μg、杂质7 2μg、杂质8 2μg、杂质9 2μg、杂质10 2μg的溶液。加标供试品溶液：精密称取丙氨酰谷氨酰胺原料药、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8、杂质9、杂质10对照品各适量，配制成1ml中含丙氨酰谷氨酰胺2mg、杂质1 4μg、杂质2 0.8μg、杂质3 2μg、杂质4 1μg、杂质5 1μg、杂质6 4μg、杂质7 2μg、杂质8 2μg、杂质9 2μg、杂质10 2μg的溶液。取丙氨酰谷氨酰胺对照品溶液、供试品溶液、系统适用性溶液、加标供试品溶液，在5℃放置0、10、24、46、68、84小时分别吸取20μl，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，结果见表8。
表10中间精密度试验结果
Figure BDA0004045939710000152
Figure BDA0004045939710000161
结果表明：各杂质的6份供试品溶液含量相对标准偏差(RSD)分别为0.00％、0.00％、0.00％、0.00％、0.00％、0.00％、0.00％、0.00％、0.00％、0.00％，均为0.00％。
6、准确度试验
杂质混合溶液：精密称取杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7、杂质8、杂质9、杂质10适量，用溶剂稀释成杂质混合溶液。精密称取丙氨酰谷氨酰胺原料药，然后加入杂质混合溶液，稀释成含丙氨酰谷氨酰胺2mg/ml、其他杂质分别为80％限度浓度、100％限度浓度、120％限度浓度的溶液，各平行配制3份。分别吸取20μl，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，计算回收率，结果见表9。
表11准确度试验结果
Figure BDA0004045939710000162
/>
Figure BDA0004045939710000171
/>
Figure BDA0004045939710000181
/>
Figure BDA0004045939710000191
/>
Figure BDA0004045939710000201
结果表明：已知杂质定量限浓度下平均加样回收率均在86.11％～110.26％之间，3份回收率RSD均小于6.67％，50％、100％、150％浓度下平均加样回收率均在97.33％～103.98％之间，9份回收率RSD均不大于1.12％，方法的准确度良好。

Claims (6)

1.一种测定丙氨酰谷氨酰胺原料药中有关物质的高效液相色谱方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制溶液：
a、稀释剂：纯化水；
b、供试品溶液：取丙氨酰谷氨酰胺原料药适量，加溶剂稀释，作为供试品溶液；
c、对照品溶液：取丙氨酰谷氨酰胺原料药适量，加溶剂稀释，作为对照品溶液；
d、系统适用性溶液：取丙氨酰谷氨酰胺杂质即丙氨酰按谷氨酰胺适量，加溶剂稀释，作为系统适用性溶液；
(2)检测：
分别取供试品溶液、对照品溶液、系统适用性溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，按加校正因子的主成分外标法计算；
色谱条件如下：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
检测波长：200nm±2nm；
流速：0.9～1.1ml/min；
柱温：32～34℃；
进样器温度：2～8℃
进样体积：10～50μL；
流动相：磷酸盐缓冲溶液-乙腈；
洗脱方式：等度洗脱。
2.根据权利要求1所述的一种测定丙氨酰谷氨酰胺原料药中有关物质的高效液相色谱方法，其特征在于，所述的流动相的配置方法为：取磷酸二氢钾1.36g，加水1000ml使溶解，用磷酸溶液调节pH值至2.1±0.05，加乙腈11.5ml±0.5ml，加辛烷磺酸钠0.108g，溶解后混匀。
3.根据权利要求1所述的丙氨酰谷氨酰胺原料药有关物质的高效液相色谱方法，其特征在于，所述步骤(1)中的供试品溶液的浓度为1～3mg/ml；对照品溶液的浓度为0.8～4μg/ml；系统适用性溶液的主成分浓度为1～4mg/ml，杂质浓度为0.8～4μg/ml。
4.根据权利要求3所述的丙氨酰谷氨酰胺原料药有关物质的高效液相色谱方法，其特征在于，系统适用性溶液的主成分浓度的浓度为2mg/ml。
5.根据权利要求1所述的一种测定丙氨酰谷氨酰胺原料药中有关物质的高效液相色谱方法，其特征在于，所述步骤(2)中流速为1.0ml/min，柱温为33℃，进样器温度5℃，进样体积为20μL。
6.根据权利要求1所述的一种测定丙氨酰谷氨酰胺原料药中有关物质的高效液相色谱方法，其特征在于，所述的色谱柱规格为ODS-3V，5μm，4.6×250mm。
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