JPH05502375A - 活性化可能なフィブリン溶解および抗血栓症タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２０、連続培養で増殖する哩乳類細胞からなる請求の範囲第１９項に記載の細胞 系。

２１、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン類縁体を発現するために形質転 換されるチャイニーズハムスター卵巣細胞。

２２、請求の範囲第１項ないし第１２項のいずれか１つに記載の１またはそれ以 上の化合物および医薬的または獣医学的に許容し得る担体からなる医薬組成物。

２３、請求の範囲第１項ないし第１２項のいずれか１つに記載の化合物の該投与 の実効、無害な量からなる血栓性の病気の治療または予防の方法。

２４、ヒトまたは獣医薬に用いるための請求の範囲第１項ないし第１２項のいず れか１つに記載のタンパク様化合物。

２５、血栓崩壊または抗血栓剤の調製での請求の範囲第１項ないし第１２項のい ずれか１つに記載の化合物の使用。

明細書 活性化可能なフィブリン溶解および抗血栓症タンパク質本発明は、フィブリン溶 解活性を有するためにまたは血液の凝固組成を抑制するために活性化することの できるタンパク質化合物に関する。本発明はまた、該化合物の全部または一部の 核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）の符号化に関する。より詳しく述べると、本発明は 、プラスミノーゲン類縁体、該類縁体の調製、該類縁体を含有する医薬組成物お よび血栓症疾患の治療における該類縁体の使用に関する。

プラスミノーゲンは、血液中の凝固系と本来相対系であるフィブリン溶解系の重 要な構成要素である。血液凝固作用プロセスにおいて、酵素活性段階は、凝固ま たは血栓の骨格を形成するフィブリンネットワークの発生に関係する。

フィブリンネットワークの分解（フィブリン溶解）は、プラスミン酵素の活性に より達成される。プラスミノーゲンは、プラスミンの不活性な前駆体であり、プ ラスミンへのプラスミノーゲンの変換は、プラスミノーゲンの５６１番目のアル ギニンと５６２番目のバリン間のペプチド結合の切断により達成される。生理学 上の条件下で、該結合の切断は、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ） またはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）により触媒させる 。

凝固およびフィブリン溶解系の間の平衡が、局部的に不安定である場合には、血 管向凝固は、冠状血栓症および心筋梗塞のような状態、深静脈血栓症、発作、末 梢動脈閉塞および塞栓症に導く不適当な場所で形成される。このような場合、フ ィブリン溶解剤の投与が、凝固溶解の促進のための有益な治療であることがわか っている。

フィブリン溶解治療は、ｔＰＡ、ｕＰＡ、ストレプトキナーゼおよびアニソイレ ーテット（ａｎｉｓｏｙｌａｔｅｄ）プラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性 化因子錯体、ＡＰＳＡＣのような多くのプラスミノーゲン活性化因子の効力に伴 ない相対的に広く行き渡たるものとなっている。

各これらの治療薬は、凝固分解作用を促進することがわかっているが、どれも、 血栓症の治療に関する治療剤としての理想的なものより少なく凝固分解作用をな すフィブリン溶解の活性面において欠陥を持つ（マーダーとシェリーに。急性心 筋梗塞または他の血栓症疾患の治療に関するｔｐＡに伴う１つの大きな問題は、 およそ５分の人の血漿生物学的半減期のために血液循環から素早く取り除かれる ものである（バウナメアック（Ｂｏｕｎａｍｅａｕｘ）らによる：コンテンポラ リー　インューズ　イン　へモスタシス　アンド　トロンボシス（Ｃｏｎｔｅｍ ｐｏｒａｒｙ　ｌ５ｓｕｅｓ　ｉｎ　Ｈｅａｍｏｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｒ ｏｍｂｏｓｉｓ）ｖｏｌ　１　ｐ５−９１．１９８５．　カレン（Ｃｏｌｌｅｎ ）らの編集発行人、チャーチル　リビングストーンＣｈｕｒｃｈｉｌｌ　Ｌｉｖ ｉｎｇｓｔｏｎｅ））　ｏ　これは、多量の投与を点滴によりＰＡを投入するこ とを必要とする結果を招く。該治療はその結果高価となり、かつ治療を開始する ことができる時までに入院させなければならない患者として延期される。

単鎖型（ｓｃｕＰＡ）かまたは二重鎖型（ｔｃｕＰＡ）のクロー１−＋−ゼは、 類似した早い血漿クリアランスを持ち、また連続的な点滴による投薬を必要とす る。

全ての前記治療薬が有する主な課題は、臨床上有用な服用として、該治療薬が通 常の血液循環中のプラスミノーゲンを活性化する場合に、該治療薬は、血栓特効 薬ではないことである。この主な結果は、血液凝固に関するフィブリノーゲンの ようなタンパク質が破壊され、ひどい出血が起こすことが有り得ることである。

これはまた、生理学上の濃度で、フィブリンに粘り着き、フィブリンの選択的な プラスミノーゲン活性化を示す事実にもかかわらずｔＰＡで発生する。

生存するプラスミノーゲン活性化因子の性能の別の重要な欠点は、再潅流された 血管の再閉塞が一般に血栓崩壊剤の投薬の停止後発生することである。このこと は、血栓溶解の部位でトロンボゲン形成物質の存続のためであると考えられる。

言い換えれば、フィブリン溶解増大へのアプローチが、現在、フィブリン溶解活 性を有するためにまたは凝固形成を抑制するために活性化した分子の使用に基づ いて工夫されている。（切断を含む）活性かは、血液凝固に関する１またはそれ 以上の内因性の酵素により触媒することができる。このアプローチの強みは、フ ィブリン溶解の血栓選択力または凝固形成活性の抑制が、血栓特有な局所限定の 活性化酵素として達成される。

本発明の第１の目的によれば、フィブリン溶解活性を有するためにまたは凝固形 成を抑制するために、血液凝固に関する酵素により活性化するタンパク質化合物 を提供するものである。

本発明の第１の目的によるタンパク質化合物は、したがって、少な（とも１種の 方法により活性化することのできるものである。第１に、該化合物は、フィブリ ン溶解活性を有するために活性化される。第２に、該化合物は、凝固形成を抑制 するために活性化される。考えられるところでは、該化合物は、双方の機能を有 するために活性化することのできるものである。活性化は、多くの場合に、切断 により最も便利に達成される。

好ましくは、該化合物は、活性化された場合に、自然の哺乳動物のフィブリン溶 解剤および／または哺乳動物の凝固形成の阻害剤として同質の活性を十分に有す る。該化合物の量的条件において、該活性が好ましいものである間は、該活性が 優れていない場合に本発明の利益をなお有してなる自然化合物より良くない場合 と同様である。１−たがって、本発明の好ましい化合物は、自然の哺乳動物のフ ィブリン溶解剤および／または哺乳動物の凝固形成の阻害剤の自然前駆体として 同質の活性を有するものと理解される。また、該化合物の量的条件において、該 前駆体が活性化する、＝とができるについて容易さか望まれるが、必ずしも自然 化合物と同様である必要はない。

フィブリン溶解活性を存するために活性化し寿るものである自然タンパク質化合 物は、プラスミンを形成するために切断されるプラスミノーゲンである。プラス ミノーゲン類縁体は、本発明の化合物の好適なグループを形成する。

野生型プラスミノーゲン分子の分析は、セリンプロテアーゼドメイン、５個のク リングルドメインおよびプラスミン切断により除去される７８番目のアミノ酸の Ｎ−末端の連続物で組立てられた糖タンパク質として表すことができる。プラス ミンによる切断は、Ｎ−末端メチオニン、リシンまたはバリン残基、リシン−プ ラスミノーゲンとして一般に呼ばれるものも全ての形成を引き起こすために６８ 番目のアルギニンと６９番目、７７番目のりシンと７８番目のりシンまたは７８ 番目のりシンと７９番目のバリン結合の加水分解を含む。完全なプラスミノーゲ ンは、Ｎ−末端グルタミン酸残基を有する場合、グルタミン酸−プラスミノーゲ ンと関連している。グリコジル化は、２８９番目のアスパラギンと３４６番目の トレオニン残基に生じるが、該大きさと組成は、変わりやすく、血漿中にプラス ミノーゲンの多くの異なった分子量の形成の共存したものに導くものである。セ リンプロテアーゼドメインは、他のセリンプロテアーゼとの相同により認めるこ とができ、プラスミンに対する活性化では、フィブリン崩壊に関係する触媒活性 ドメインである。５個のクリングルドメインは、ｔＰＡおよびプロトロンビンの ような他の血漿タンパク質中のそれらに対する相同であり、フィブリン結合およ び例えば血栓に対するプラスミノーゲンおよびプラスミンの局所解決に関係する 。プラスミノーゲンは、単一なポリペプチド鎖として血液中に正常に循環するチ モーゲンであり、５６１番目のアルギニンと５６２番目のバリンアミノ酸の間の ペプチド結合の分裂により二重鎖酵素プラスミンに転換される。この分裂は、ｔ ＰＡとｕＰＡのようなプラスミノーゲン活性化因子により特に触媒される。これ は、カステリノ（Ｃａｓｔｅｌ　１ｉｎｏ）、エフ、ジエイ、　、１９８４、セ ミナー　イン　トロンボシス　アンド　へモステシス（Ｓｅｍｉｎａｒ　ｉｎ　 Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）　１０　：　１８− ２３に精密に調べられている。本明細書中では、プラスミノーゲンは、プラスミ ノーゲンが７９０番目のアミノ酸タンパク質であり、そして切断の部位が５６０ 番目のアルギニンと５６１番目のバリンのペプチド結合であると指示されている ソットルプージエンセン（Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ）ら（アトラス　オブ プロテイン　シーフェンス　アンド　ストラフチャーＡｔ１ａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏ ｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ）　（デイホフ（Ｄ ａｙｈｏｆｆ）　、エム、オー０、編集）　５　増補３、ｐ、９５（１９７８） ）のタンパク質順にする研究にしたがってすンバリングされた。しかしながら、 適当なプラスミノーゲンｃＤＮＡは、本発明の当該実施態様に役立ち、しがも６ ５番目の部位での特別なイソロイシンを持つ７９１９１番目基のタンパク質のた めのコードがフロスグレン（Ｐｒｓｇｒｅｎ）ら（エフィイービイエス　レター ズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）　２１３　２５４−２６０　（１９８７））　 により単離された。

本明細書中では、プラスミノーゲン中のアミノ酸のタンパク質のナンバリングは 、用いたｃＤＮＡのそれに一致する。

プラスミノーゲンの構築に多型性を有し、切断部位のナンバリングが異なるプラ スミノーゲンの形成を有するものであるが、該変異体が、本実施態様中に含まれ ることを意味する。

ここで、プラスミノーゲン類縁体とは、本明細書中に用いる場合、野生型プラス ミノーゲンと異なる分子および切断するための能力を有する分子または他にプラ スミン活性を有する分子を形成するために作用することを意味する。

グルタミン酸−プラスミノーゲンの血漿半減期は、２゜２日であり、リシン−プ ラスミノーゲンの血漿半減期は、０．８であることが測定されている（クレビス （Ｃ１ａｅｙｓ）、エッチ、アンド　バーミレン（Ｖｅｒｍｙｌｅｎ）、ジエイ 、１９１ｅｎ）、ビイ、アンド　ライマン（Ｗｉｍａｎ）　、ビイ、プロテアー ゼス　アンド　バイオロジカル　コントロール（Ｐｒｏｔｅａｓｈｓ　ａｎｄ　 Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）、２９１−３０３．　レイッヒ（Ｒｅ ｉｃｈ）　、イー、等による編集　コールド　スプリング　ハーバ−ラボラトリ −（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　）。

本発明の当該実施態様の範囲内でのプラスミノーゲン類縁体は、十分な程度に野 生型プラスミノーゲンのフィブリン結合活性を保持するが、活性化特性が変えら れるものであり、望ましいプラスミノーゲン類縁体は、野生型プラスミノーゲン のフィブリン結合活性の少なくとも１種である血漿半減期を有するものであるが 、当該特性は必須のものではない。血液凝固メカニズムは、血餅のメツシュのよ うなタンパク質骨格を形成し、不溶フィブリンの生成に達する酵素反応系からな る。トロンビンは、フィブリンへの可溶なフィブリノーゲンの変換に関与する酵 素である。トロンビンへの、トロンビンの不活性な前駆体である、プロトロンビ ンの変換は、活性化された因子Ｘ（因子Ｘａ）により触媒される。（トロンビン は、また因子ＩＩａおよび因子■とじてのプロトロンビンとしても知られている 。）因子Ｘａは、外因性または内因性因子Ｘから発生させる。

外因性ルートでは、因子■は、因子■ａに活性化され、因子Ｘから因子Ｘａを発 生する。内因性ルートでは、因子Ｘａへの因子Ｘの活性化は、因子ＩＸａにより 触媒される。因子ＩＸａは、因子ＸＩａの活性により因子■から発生し、順に因 子Ｘ■から生ずる因子ＸＩｒａの活性化により発生する。

因子Ｘｎａは、カリクレインの活性により因子Ｘ■から発生する。因子■ａおよ び因子Ｖａは、それぞれ、因子Ｘおよび因子■の活性化での副因子として働くと 考えられる。

フィブリンが、フィブリノーゲンから最初に形成される場合、ぐにゃぐにゃな形 になる。ぐにゃぐにゃなフィブリンは、因子ＸＩＩＩａの活性により固いフィブ リンに変えられ、架橋フィブリン分子となる。

活性化タンパク質Ｃは、タンパク質Ｃより生ずる、血栓モジュール（Ｔｈｒｏｍ ｂｏｍｄｕｌｉｎ）に伴なう組合せによる、トロンビンの活性化により凝固形成 範囲に発生するセリンプロテアーゼの抗凝血物質である。活性化タンパク質Ｃは 、副因子Ｖａおよび■ａの副凝血物質を切断し、不活性化することにより凝固形 成を制御する ここで血液凝固に関係する酵素とは、本明細書に用いる場合、カリクレイン因子 ＸＩＩａＳＸＩａ、ＩＸａ、■ａ、Ｘａおよびトロンビン（因子■ａ）を含むも のであり、フィブリン形成および活性化タンパク質Ｃに直接関係するものであり 、そして血液凝固の制御に関係するものである。より好ましい酵素は、因子Ｘａ およびトロンビンであり、最も直接にフィブリン形成に関与するためである。

少なくとも因子Ｘａおよびトロンビンの発生および活性は、血栓発生が、トロン ボゲン形成の刺激の部位に限定されることを確かめるためにしっかりと制御され ている。この局部限定は、少な（とも２つの制御機構の合計の操作により達成さ れる。血小板のリン脂質細胞膜および血管損傷の部位での内皮細胞とに密接に関 係のある複合体としての血液凝固酵素機能（マン（Ｍａｎｎ）、ケイ、シイ、　 、１９８４、プログレス　イン　ヘモスタシス　アンド　トロンボシス（Ｐｒｏ ｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ　ａｎｃｌ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ） 　、１−２４、編集スピード（Ｓｐｅａｔ）　、ティ、エッチ、ブラウン（Ｇｒ ｕｎｅ）アンド　ストラットン（Ｓｔｒａｔｔｏｎ））および循環中に血栓の部 位から放出される遊離トロンビンまたは因子Ｘａは、抗トロンビン■のようなプ ロテナーゼ阻害剤の活性により急速に不活性化される。

例えば、凝固カスケード中の終りから２番目（因子Ｘａ）および終り（トロンビ ン）の酵素の活性は、特によく、血栓発生の部位に限定され、当該理由が望まし い。

トロンビンは、血栓と連合して残存し、フィブリンに非共有結合することがわか っている。プラスミンに伴う血栓の消化では、活性トロンビンが遊離され、一般 にプラスミノーゲン活性化因子によるフィブリン溶解治療に伴い生じる血栓およ び血管の再閉塞の改善に寄与するものと考える（ブローム（Ｂｌｏｏｍ）エイ、 エル、　、１９６２、ブリ、ジエイ、ヘマトール（Ｂｒ、Ｊ、ＨａｅｌｌＩａｔ ｏｌ）、８２．１２９；フランシス（Ｆｒａｎｃｉｓ）ら１９８３、ジェイ、ラ ボ、タリン、メディ、（Ｊ、Ｌａｂ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｅｄ、）　、１０２．２２０ ；ミイルシャピ（Ｍｉ　ｒｓｈａｈｆ　）ら、１９８９、ブルード（Ｂｆｏｏｄ ）　７４．１０２５）。

を記理由に関し、プラスミノーゲンまたはトロンビンまたは因子Ｘａによりそれ を活性化し得るものにさせるための他の潜在的に活性化し得るタンパク質化合物 を改良するために、それによって、血栓選択、フィブリン溶解または凝固形成阻 害タンパク質の好ましいクラスを創造するために本発明のある種の実施態様にお いて好ましいものである。

最も好ましいプラスミノーゲン類縁体は、長期血栓半減期所有のもとの基体のプ ラスミノーゲン分子の有望な性質を保持（７，２種のメカニズムの組合せにより 血栓選択を示す、すなわち、クリングルドメインを経て結合されるフィブリンお よび酵素の１種の活性により新しい血栓形成の部位でプラスミンに変換させるな るものの新規な性質は、血栓の形成に関係し、好ましくはこれらが限定されたも のである。

因子Ｘａ　（Ｅ、Ｃ，３，４，２１，６）は、２７３番目のアルギニンと２７４ 番目の）・レオニンおよび３２２番目のアルギニンと３２３番目のイソロイシン のペプチド結合の特異的な切断によるトロンビンに対するヒトプロトロンビンを 変換させるセリンプロテアーゼである（マン（Ｍａｎｎ）ロンビンにおいて、２ ７３番目のアルギニンと２７４番目のトレオニンの部位はイソロイシン−グルタ ミン酸−グリシンのトリペプチドに付随され、３２２番目のアルギニンと３２３ 番目のイソロイシンの部位は、イソロイシン−アスパラギン酸−グリシンのトリ ペプチドに付随される。該構築は、切断部位に付随する局部的なアミノ酸順に決 定させるために出現する因子Ｘａによる認識のために必要とされる（マグヌソン Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ）ら、１９７５、プロテアーゼアンド　バイロジカル　コン トロール、１２３−１４９、編集、レイッヒ（Ｒｅｉｃｈ）ら、コールド　スプ リング　ハーバ−ラボラトリ−、ニーヨーク）。イソロイシン−グルタミン酸− グルシン−アルギニンおよびイソロイシン−アスパラギン酸−グルシン−アルギ ニンの順に関する特異性は、因子Ｘａが他のタンパク質、例えば、本フォーマッ トと著＋、　＜異なるアミノ酸順に付随する３３６．３７２．１６８９および１ ７２ユの部位での因子■、を切断するとわかる場合、絶対でない。（イートン（ Ｅａｔｏ口）ら、１９８６バイオケミストリー　２５　５０５−５１２）。因子 Ｘａに関する主要な自然基質は、プロトロンビンであり、好ましい認識の順は、 アルギニンおよびグリシンが、それぞれＰｌおよびＰ２の部位を占有し、酸性残 基（アスパラギンまたはグルタミン酸）が、Ｐ３の部位を占有し、イソロイシン または（アラニン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような）他の小さい親 水性残基が、Ｐ４の部位を占有するものである。しかしながら、因子Ｘａが当該 フォーマットと異なる順序で切断することができる場合、因子Ｘａにより切断し 得る他の順序は、本発明で用いることができ、同様に、凝固カスケードの他の酵 素により他の順序で切断（−得ることができる。

ｔＰＡおよびｕＰＡによりプラスミンへのプラスミノーゲンの変換は、結合され たジスルフィド、軽鎖（プロテアーゼドメイン）上のアミノ末端バリンおよび重 鎖上のカルボキシ末端アルギニ／を有する二重鎖タンパク質を生成するために５ ６１番目のアルギ゛ニンと５６２番目のバリンの間のペプチド結合の切断を含む 。プラスミノーゲンは、切断されず、トロンビンまたは因子Ｘａによりいかなる 重要な程変に、およびこれらのより好ましい酵素により切断され得るものである プラスミノーゲン類縁体を作製するために活性化されたものであり、ｔＰＡおよ びｕＰＡにより認識された５５９番目のプロリン、５６０番目のグリシン、５６ １番目のアルギニン、５６２番目のバリンの切断部位は、変えることができるも のである。例えば、因子Ｘａにより切断されるプラスミノーゲン類縁体を作製す るために、因子Ｘａにより切断１−得るアミノ酸配列は、プラスミノーゲン分子 に置換される。因子Ｘａにより切断されたプロトロンビン中の部位の１つである イソロイシン−グルタミン酸−グルシン−アルギニンの配列は、上記配列順序に なる。

他の可能性は、他のタンパク質またはペプチド中に因子Ｘａにより切断された配 列の配列または擬態である。５５８番目のプロリンがインロイシン−グルタミン 酸により取り除かれ、置換されてなるプラスミノ−ケン類縁体は、軽鎖（プロテ アーゼドメイン）上のアミノ末端バリンおよび重鎖上のカルボキン末端アルギニ ンを有する二重鎖プラスミン類縁体の結合されたジスルフィドを生成するために 因子Ｘａにより切断される５６１番目のアルギニンと５６２番目のバリン（野生 型プラスミノーゲンバンバリング）のペプチド結合を有している。タンパク質生 成を促進するような切断し博るリンカ−のカルボキシ末端部分としてのイソロイ シン−グルタミン酸−グルシン−アルギニンの配列に関するＤＮＡ暗号は、英国 特許比＠ＧＢ−Ａ−２１６０２０６中に記載されているが、チモーゲンに関する 変更活性化プロセスを許すためのイソロイシン−グルタミン酸−グルシン−アル ギニンの配列の使用は、その明細書中には記載されていない。

プラスミノーゲン変異体の切断および活性化またはトロンビンまたは因子Ｘａの ような凝固カスケードの酵素による他の潜在的な活性し得るタンパク質化合物は 、例えば、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、およびプラスミノーゲン変異体の場合 においては、５２２５１色原体分析またはフィブリンゲル溶解分析を使用するプ ラスミンの形成に関する分析による多くの方法で測定することができる。

トロンビン（Ｅ、Ｃ，３，４゜２１．５）は、フィブリノーゲン（Ａアルファお よびＢベータ鎖）、因子Ｘ■、因子ｖ１因子■、因子■、タンパク質Ｃおよび抗 トロンビンを含有の多くのタンパク質のタンパク質加水分解を触媒するセリンプ ロテアーゼである。トロンビンにより認識されるために必要とされる構築は、切 断部位の周りの局部的なアミノ酸配列により主に決定されると思われるが、切断 部位から離れた配列により変化し得る程度によっても決定される。例えば、フィ ブリノ−ケンＡアルファ鎖において、残基Ｐ２（バリン）、Ｐ９（フェニルアラ ニン）およびＰｌｏ（アスパラギン酸）は、１６番目のアルギニンと１７番目の グリシンのペプチド結合にエイ、エフ、ら　１９８９、バイオケミストリー　２ ８３０８２−３０９４）でα−トロンビン−触媒切断に関して万事を決定される 。トロンビンにより切断される幾つかのタンパク質およびペプチドの比較研究は 、α−トロンビンに関する最適の切断部位が、（ｉ）Ｐ３およびＰ４の各々が、 別々に（バリンのような）親水性アミノ酸であり、ＰＩ’　およびＰ２′の各々 が、別々にバリン類似の親水性アミノ酸のような非酸性アミノ酸であるＰ４−Ｐ ３−プロリン−アルギニン−Ｐ１′−Ｐ２′および（ｉｉ）Ｐ２およびＰ１′が 、り′リシンであるＰ２−アルギニン−ＰＩ’の構造を有する（チャンク（Ｃ） １ａｎｇ）　、ジエイ、１９８５、ヨーロ、ジエイ、バイオケミ。

（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　１５１　２１７−２２４　）とする提案へ 導かれる。しかしながら、トロンビンにより切断され、本発明に用いられる一般 構造の例外である。

トロンビンにより切断され、認識されることのできるプラスミノーゲン類縁体を 生成するためには、トロンビンにより認識され、切断される部位は、適当な場所 でプラスミノーゲン分子中に置換されることである。フィブリノーケンＡアルフ ァ鎖中のトロンビンにより切断されるようなアミノ酸配列が用いることができる 。他の可能な配列は、切断がトロンビンにより触媒されるフィブリノーケンＢベ ータ、因子Ｘ■、因子■、因子■、因子■、タンパク質Ｃ１抗トロンビン■およ び他のタンパク質のトロンビンによる切断に関係するものを含むことができる。

プラスミノ−ケンのトロンビン切断し得る類縁体の例としては、５５９番目のプ ロリン、５６０番目のグリシンの配列は、５５９番目のグリシン−５６０番目の プロリン−５６１番目のアルギニン−５６２番目のバリンの配列を生成するため に５５９番目のグリシン、５６０番目のプロリンに変化するもの、フィブリノー ゲンＡアルファ中に１７−２０の部位に知られているとものと同一であるものが ある。これは、フィブリノーゲンＡアルファ中の主なトロンビン切断部位ではな いが、トロンビンは、１９番目のアルギニンと２０番目のバリンのペプチド結合 を切断することができる。

こうした微妙な変化は、全ての活性および安定性の重要な特徴は、特に好ましい 場合には、変異種誘導体に残るものである場合、重要である。

本発明の好適な実施態様においては、５５５番目のプロリンから５６６番目のシ スティンまでを含んだ残基の単独または複数のアミノ酸置換、付加または欠損に よるプラスミノーゲン類縁体に関する。こうしたプラスミノーゲン類縁体は、ト ロンビン、因子Ｘａまたはフィブリン溶解活性を伴うプラスミン類縁体を生成す べき血液凝固に関係する他の酵素により切断される。

本発明の好適な実施態様によるプラスミノーゲン類縁体は、１またはそれ以上の 付加、欠損または置換である（野生型グルタミン酸プラスミノーゲンに比べた場 合の）他の変形を含むものである。こうした変形のｆ！７＋ｉとしては、フィブ リン結合活性を増大させるために１またはそれ以上のクリンクルドメインの付加 、除去、置換または変更がある。

欠損を含む変形の例としては、アミノ末端６８．７７または７８アミノ酸が欠損 したものであるプラスミノーゲン類縁体のリシン−プラスミノーゲン変異体があ る。こうした変異体は、野生型グルタミン酸−プラスミノーゲンからなるリシン −プラスミノーゲンに関して認められる場合に、フィブリン結合活性を増大させ ることができる（ポック（Ｂｏｋ）　、アール、エイ、およびマンゲル（Ｍａｎ ｇｅｌ）、ダブリス９エフ、１９８５、バイオケミストリー　２４　３２７９− ３２８６）。

プラスミン阻害剤アルファー２抗プラスミンは、血液中の存在し、血液凝固のフ ィブリンマトリックス中に取り入れることができる。この阻害剤の役目は、凝固 および循環中にプラスミン活性を制約することである。本発明のプラスミノーゲ ンの高凝固選択類縁体に関しては、プラスミノーゲン阻害剤結合を妨害するセリ ンプロテアーゼドメイン中に変異を導入するために有利なものである。この変異 は、組織プラスミノーゲン活性化剤に阻害剤結合を防ぐために示された部位に類 似した場所にすることができる（マデイソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）　、イー、エル 、ら　１９８９　ネーチャー３３９　７２１−７２４）。

本発明による他の複数の修飾プラスミノーゲンは、グリコリル化パタンを妨害し 、還元し、または変更するために１またはそれ以上の修飾を含む。こうした修飾 を取り入れるプラスミノーゲン類縁体は、より長い半減期、還元された血漿クリ アランスおよび／またはより高い特異活性を有する。

他のタンパク質は、また該タンパク質がフィブリン溶解活性または凝固形成阻害 すべき血液凝固に関係する酵素により切断されるかまたはそうでなければ活性化 されるため変更される。単鎖ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤（ｓｃｕＰ Ａ）は、フィブリン溶解タンパク質の一例であり、タンパク質Ｃは、非常に活性 化されることのできる血液凝固の阻害に関係がある酵素の一例である。

５ｃｕＰＡは、１５８番目のりシンと１５９番目のイソロイシンのペプチド結合 のプラスミン切断による二重鎖ＵＰＡ　（ｔ　ｃ　ｕＰＡ）に対して活性化され る。トロンビンは、１５６番目のアルギニンと１５７番目のフェニルアラニンの ペプチド結合を切断することにより５ｃｕＰＡを失活する。５ｃｕＰＡ類縁体は 、切断部位前後のアミノ酸配列が、ｊ・ロンビンにより切断されるために変更さ れることで、または血液凝固に関係する他の酵素が、活性なｔｃｕＰＡを生成す ることで組み立てることができる。

タンパク質Ｃは、血栓モジュール（ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌ　ｉｎ）へのトロ ンビン結合の活性によりそれの活性化された形に切断される。本発明の範囲内の タンパク質Ｃ類縁体は、活性化されたタンパク質Ｃを形成するために毎秒（ｐｅ ｒ　ｓｅ）　Ｉ・ロンビンにより切断し得るように修飾される。

融解タンパク質は、血液凝固の部位でフィブリン溶解または抗凝血物質タンパク 質の選択的脱離を達成するために組立てられる。これを達成するために、凝固の フィブリン溶解または阻害に関係するタンパク質は、血液凝固に関係する酵素で ある。前記切断し得るタンパク質に取り入れられるタンパク質の一例としては、 ｔ　Ｐ　Ａ　、、ｕ　Ｐ　Ａ　％ストレプトキナーゼ、プラスミノーゲン、タン パク質Ｃ１ヒルジンおよび抗トロンビン■を含む。血液凝固の溶解（例えば、ア ルブミン、長い血漿半減期）に直接関連しない好ましい性質を有するタンパク質 まで前記タンパク質の融解は、また、有益なものである。

本発明の範囲内のプラスミノーゲン類縁体の好ましい特徴は、また、本発明の他 の化合物に適当に当てはまる。

本発明の第１の目的による化合物は、任意の都合の良いルートにより合成させる ことができる。本発明の第１の目的によれば、上記に記載されたようなタンパク 質化合物の合成に関する工程を提供するものであり、−緒におよび／または結ば れたオリゴペプチドの連続のアミノ酸残基のカップリングからなる工程である。

けれども、タンパク質は、主に、化学的手段により全部または部分的に合成され 、該選択のルートは、相当する核酸配列の、なるべく生体内で、リポソームの翻 訳である。該タンパク質は、適当にグリコジル化される。

使用する組換えＤＮＡ技術による本発明にしたがってタンパク質を生成すること が好ましいものであり、特に、それらは自然のタンパク質の（アミノ酸置換、欠 損または付加によるかまたは）類似するものである。ＤＮＡの記号化したプラス ミノーゲンまたは他の自然のタンパク質は、ＣＤＮＡまたはゲノムクローンから なるか、または合成されるものである。アミノ酸置換、付加または欠損は、好ま しくは、部位特異的変異誘発により導入される。適当なりＮＡ配列の記号化した グルタミン酸−プラスミノーゲン、リシン−プラスミノーゲンおよびプラスミノ ーゲン類縁体および本発明の範囲内の他の化合物は、遺伝子工学における当業者 によく知られた方法で得られる。例えば組織プラスミノーゲン活性化因子を含む 幾つかのタンパク質に関しては、式ベクター中に記号配列を挿入し、適当な宿主 細胞中に該ベクターを移入することにより組換えタンパク質を得るための通常の 方法である。適当な宿主は、エシェリキアたはより高度な真核細胞である。；− かしながら、プラスミノーゲンは、発現することが非常に困麹であり、幾つかの 不成功な試みは、哺乳類動物細胞中の再組立てプラスミノ−ケンを生成して作る ことができる（バスバイ（Ｂｕｓｂｙ）ニス、ら　１９８８、フィブリノリンス 　２、サブル（Ｓｕｐｐｉ）、１．６４；ホワイトフリート−スミス（Ｗｈ４　 ｔｅｆ　１ｅｅｔ−３ＩＩＩｉｔｈ）Ｖら、１９８９、アーチ、バイオフ、／ぐ イオブ、　Ａｒｅｈ、Ｂｉｏｃ　、　Ｂ１１ｏｌｊ、）　２７１．３９０−３９ ９）。エシェリキア・コリ（Ｅ、ｅｏｌｉ）中のプラスミノーゲンを発現するこ とは可能であるが、該タンパク質は、不溶な形に作ることができ、復元すること ができなければならない。十分な復元は、現在の技術では困難である。プラスミ ノーゲンは、０．７〜１．０μｇ／１０’個の（６６時間後に感染を測定した） 細胞のレベルでバクロビラス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）ベクター感染した細胞 システムに用いる挿入細胞で発現される（ホワイトフリート−スミスら、同前） が、この方法は安定な細胞系生成するプラスミノーゲンを発生させず、グリコジ ル化のような任意な翻訳後修飾は、標準ではない。

本発明の第３の目的によれば、上記に記載されたようなタンパク質化合物に関す る合成または組換え核酸記号を提供するものである。該核酸はＲＮＡまたはＤＮ Ａである。

本発明の当該目的の好ましい特徴は、第１の目的に関する場合である。

本発明の第４の目的によれば、第３の目的による核酸の合成のための工程、すな わち−緒におよび／または結ばれたオリゴ−および／またはポリ−ヌクレオチド の連続のヌク１／オチドカップリングからなる工程を提供するものである。

本発明の第３の目的による組換え核酸は、ベクターの形成中の、例えば、プラス ミド、ニスミドまたはファージである。該ベクターは、原核（例えば、細菌）細 胞および／または真核（例えば、酵母または呵乳類）細胞を移入するまたは形質 転換するべく適応される。ベクターは、クローン化部位および通常、少なくとも １種の標識遺伝子からなるものである。発現ベクターは、クローン化部位に挿入 されるべき配列、そして、好ましくは、分泌されるべきタンパク質生成物を可能 にする配列に連結された活動するプロモーターを有する。（発現できるものを必 要としない）発現ベクターおよびクローン化ベクターは、本発明の範囲内に含ま れる。

任意のベクターは、特に本発明において役立つものである。本発明の第５の目的 によれば、タンパク質の遺伝情報を指定するまたはクーロン化部位を具体化する 第１核酸配列、強プロモーターおよびヒトシトメガロウイルスから誘導されるエ ンハンサ−配列を含む第２核酸配列への効力のある連鎖、ＳＶ４０から誘導され たポリアデニル化（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）配列を暗号化する第３核 酸配列およびＳＶ４０プロモーターから発現されたｇｐｔ選択可能なマーカーの ための暗号および選択可能なマーカー配列の３′末端で付加ＳＶ４０ポリアデニ ル化（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）信号を有する第４核酸配列からなるベ クターを提供するものである。

ベクターは、機能向きに本明細書中に用いられ、単独核酸分子に必然的に限定さ れてなるものとして解釈されるものではない。したがって、例えば、上記で定義 されたベクターの第１、第２および第３配列は、最初の核酸分子に包含され、第 ４配列は、第２の核酸分子に包含される。

該選択可能なマーカーは、任意の適当なマーカーである。

該グルタミン酸−ピルピン酸トランスアミラーゼ（ｇｐｔ）マーカーは、適当な ものである。

こうしたベクターは、（グルタミン酸−プラスミノーゲンおよびリシン−プラス ミノーゲンを含む）プラスミノーゲンおよびプラスミノーゲン類縁体のような前 記タンパク質の発現を可能にする、さもなければ、発現することは困難である。

本発明のこの目的は、異種の遺伝子およびｃＤＮＡｓの発現のためにおよび哺乳 類細胞中の非相同タンパク質の生成のために役立つものであるベクターの構築を 提供する。

例示された特定の実施聾様は、高レベルでプラスミノーゲンおよびプラスミノー ゲン類縁体を発現することができる安定な細胞系の構築である。

例えば、上記に記載されたようなベクターを用いる場合、プラスミノーゲンおよ びプラスミノーゲン類縁体のような非相同タンパク質は、好適に発現され、任意 の付加的な生物または化学生成物に関し要求なしに生物学的に活性な形成中に細 胞培養基中に分泌される。形質転換されるべき適当な細胞または細胞系は、連続 培養で増殖する好適な哺乳類細胞であり、標準技術により移入され、または他に 形質転換されることができる。適当な細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣 （ＣＨＯ）細胞、Ｐ３Ｘ６３〜Ａｇｅ。

６５３のようなマウスミエローマ細胞系、ニス細胞、ヒーラ−細胞、ビイエッチ ケイ（ＢＨＫ）細胞、ボーニス（Ｂｏｗｅｓ）細胞系のようなメラノーマ細胞系 、マウス　エル細胞、ヘプ　シイ２　（（Ｈｅｐ　０２）のようなヒト肝ガン細 胞系、マウス繊維細胞およびマウス　エフアイエッチ３細胞ヲ含む。

プラスミノーゲンおよびプラスミノーゲン類縁体の発現のための宿主としてＣＨ Ｏ細胞の使用が、特に有益であると思われる。本発明の第６の目的によれば、し たがって、プラスミノーゲンおよびプラスミノーゲン類縁体を発現させるために 形質転換されるべきチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を提供すること にある。

ＣＨＯまたは酵母（例えば、サツカロミセス　セレヴイシア（ｃｅｒｅｖｉｓｉ ａｅ）またはバクテリア（例えば、大腸菌）のような他の細胞は、本発明の他の タンパク質化合物の発現のために好ましいものである。本発明の第７の目的によ れば、上記に記載されたような核酸および／またはベクターにより形質転換され る細胞または細胞系を提供するものである。形質転換は、エレクトロポレーショ ン（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒｅｔｉｏｎ）が選択の方法である任意の便利な方法に より達成されるものである。

本発明のタンパク質化合物は、局部的なフィブリン溶解および／または抗凝血物 質活性を生成するために望まれる血栓症または他の状態の防止または治療に関す る医薬組成物の範囲内で使用される。前記状態には、″心筋および脳梗塞、動脈 および静脈血栓症、血栓塞栓症、外科手術後付着、静脈炎および糖尿病血管症を 含む。

本発明の第８の目的によれば、本発明の第１の目的の１またはそれ以上の化合物 からなる医薬組成物および医薬的にまたは獣医学的に許容し得る担体を提供する ものである。

前記組成物は、静脈内投薬に関して適応されるものであり、すなわち、無菌のも のである。本発明による組成物の例としては、等浸透圧の生理食塩水および／ま たは緩衝液中の無菌のプラスミノーゲン類縁体の合成を含む。該組成物は注射の 痛みを軽減するための局部麻酔薬を含む。本発明の化合物は、例えば、タンパク 質の品質を必要とするアンプルまたは１回分の分量を入れたプラスチックの袋の ような密封されている容器に乾燥粉末または水を含まない濃度の場合、単位投薬 の形で供給される。化合物が、点滴により投薬される場合に、注射用の無菌水ま たは生理食塩水または適当な緩衝液の入った点滴ボトルによること無しで済ませ ることができる。注射による投薬の場合には、注射用の水、生理食塩水または適 当な緩衝液のアンプル無しで済ませることができる。溶解しないまたは注入可能 な組成は、投与する前に成分を混合することにより調製することができる。局所 的な治療として投与することのできる場合には、安定な基剤無しで済ませること かできる。

投与すべき材料の金は、要求される凝固のフィブリン溶解または阻害量、要求さ れる活性速度、血栓塞栓症箇所の重要性および凝固の大きさによる。投与すべき 正確な用量は、とても健康な状態でなければならず、本発明の化合物は、医師に より投与され、取り扱われる事を意図するものである。しかしながら、ガイドラ インとして、成熟血栓に関する治療患者は、一般に例えば５回までの注射による がまたは注入液により、１日当りプラスミノーゲン類縁体０゜０１〜１０ｍｇ／ ｋｇ体重を摂取することができる。

本発明は、第１の目的による化合物の有効な無毒な量の投与を含む血栓症の治療 または予防に関する方法に用いられる。本発明のそれ以後の目的によれば、した がって、血栓崩壊および／または抗凝血物質剤の調製において、上記に記載され たような化合物の使用を提供するものである。

本発明は、特にＤ　Ｎ　Ａ　ｓ　、ベクター、形質転換される宿主株、プラスミ ノーゲン類縁体タンパク質、実施例に記載された場合の調製に関する工程に関係 する。

以下の図および本発明の実施例は、例として提供されるものであり、これによっ て制限されるものでない。実施例１〜３は、より高度な真核細胞からプラスミノ ーゲンおよびプラスミノーゲン変異体の発現のために用いられる発現ベクターを 記述した。それ以後の実施例は、プラスミノーゲンおよびプラスミノーゲン変異 体の発現およびそれらの性質を記述した。実施例に関する図において、図１は、 ｐＧＷＨの構築を示し、 図２は、グルタミン酸ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および予示するアミノ酸配列 を示し、 図３は、発現ベクターｐＧＷＨｇＰ１のマツプを示し、図４は、活性化されたプ ラスミノーゲン類縁体の因子Ｘａの切断部位配列を示し、 図５は、活性化されたプラスミノーゲン類縁体のトロンビンの切断部位配列を示 し、 図６は、フィブリン寒天ゲル上のトロンビンによる因子ＸａおよびＴ２によるＸ ２の活性化を示し、図７は、Ｘ３か実施例５および２１の課題であり、Ｔ１３が 実施例１３および２４の課題であり、そしてＴ１９が実施例１６および２６の課 題である（Ｘ３に関する）因子Ｘａまたは（：Ｔ１３およびＴ１９に関する）ト ロンビンによるプラスミノーゲン変異体Ｘ３、ＴｌＢおよびＴ１９の活性化を示 し、 図８は、プラスミンの分析による決定される場合の、トロンビンによるプラスミ ノ−ケン変異体Ｔ１９（実施例１６および２６）の活性化を示し、 図９は、トロンビンによる因子ＸａおよびＴ２によるＸ２の切断を示す５ＤＳ− ＰＡＧＥゲルを示；−１そして、図１０は、トロンビンに伴なうプラスミノーゲ ン変異体Ｔ１９（実施例１６および２６）の切断速度を示す。

実施例１ プラスミドｐｓｓ１は、このような配列か欠失した遺伝子の分泌シグナルを提供 するシグナル配列ベクターである。

ｐＧＷｌはこのベクター由来であり、ｐ、ＧＷＨはプロモーターを有する発現ベ クターである。

ｐｓｓｌの構築 １、プラスミドｐＵｃ１８　（図１．１）は、エシェリキア・コリ（Ｅ、　ｃｏ ｌｉ）のプラスミドＤＮＡを産生させるエシェリキア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ） の複製起点およびエシェリキア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）においてプラスミドを分 泌させるアンピシリン耐性遺伝子（図１．１）の両方を有しているので、ベクタ ーのバックボーンとして使用した。（ｐＵｃ１８は、シーン（Ｇｅｎｅ）、１９ 巻、ページ２５９〜２６８　（１９８２）およびジーン（Ｇｅｎｅ）、２６巻、 ページ１０１〜１０６　（１９８３）に記載されており、受託番号ＡＴＣＣ３７ ２５３でアメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション（Ａｍｅｒｉ、ｃａｎ 　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１．１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている。） また、ｐＵｃ１８は、合成りＮＡを挿入するポリリンカーを有しているが、この ポリリンカーは合成配列を挿入する前に欠失させなければならないＥｃｏＲ１部 位を有している。

上記は、ＥｃｏＲｌてＤＮＡを切断し、ムング　ビーン（ｌＩｌｕｎｇｂｅａ口 ）ヌクレアーゼ、つまり１本鎖のヌクレアーゼで処理（７、さらにプラスミドＤ ＮＡを再連結する（図１．２）ことによって成された。

２、　修飾ｐＵｃ１８　ＤＮＡをＨｉ　ｎ　ｄ　丁Ｉ　ＩおよびＢａｍＨＴで切 断し、これらの部位に、イムノクロプリンシグナル配列を何した（ネイチャー（ Ｎａｔｕｒｅ）、３３１巻、ページ１７３〜１７５、ロケリ（Ｒｏｇｅｌｊ）ら 、１９８８年）以下の合成りＮＡ断片： （５’　ＡＧＣＴＴＣＣＡ、ＣＣＡＴＧＡＡＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＧＴＧＡＴＣ ＴＴＣＴＴＣＣＴＧＡＴＧＧＣＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＧＣＧＴＧＡＡＣＴＣＧ ＣＧＡＧＡＴＣＴＡ　Ｇ　Ａ、　Ｇ　Ｔ　ＣＧ　Ａ　ＣＣＴ　Ｇ　ＣＡ、　Ｇ　 Ｇ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ｔ　ＣＧ　Ａ　Ａ　Ｔ　ＴＣＡＴＴ３’　（上流路）、 ５’　ＧＡＴＣＡＡ、ＴＧＡＡＴＴＣＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＧ　Ｇ　Ｔ　ＣＧ 　Ａ　ＣＴ　ＣＴ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ｔ　ＣＴ　ＣＧ　ＣＧ　Ａ、　Ｇ　Ｔ　Ｔ　Ｃ ＡＣＧ　ＣＣＧ　Ｇ　Ｔ　ＣＡ、　ＣＣＡ　ＣＧ　Ｇ　ＣＣＡ　Ｔ　ＣＡ　Ｇ　 Ｇ　Ａ、　Ａ、　ＧＡＡＧＡＴＣＡ、ＣＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＴＴＣＡＴＧＧＴ ＧＧＡ３’　（下流路）） に様々な制限酵素部位を有するポリリンカーを加え、さらにＳＶ４０　ＤＮＡよ り単離され、ポリアデニル化シグナルを有する２３７塩基対のＢｃｌ、Ｉ−Ｂａ ｍＨＩ断片を３通りの反応で連結した（図１６３）。ウシ成長ホルモン等の他の 遺伝子のポリアデニル化シグナルのこのベクターの構築に使用できる。ｐＵｃ１ ８バックボーンの残り、っまりＫｐｎ　ＩおよびＳｍａ　１部位はこの構築物中 に残り、これらの部位をＫｐｎｌおよびＢａｍＨＩでプラスミドを消化すること によって欠失させ、断片を除去（−１下流の１本鎖リンカ−（う’　ＧＡＴＣＣ ＧＴＡＣ３’　）を挿入し、ＫｐｎＩおよびＳｍａ１部位を破壊し、ＢａｍＨ１ 部位を再形成した（図１．３）。

３、このベクターをＣｏＳ細胞内で一時的に有効に発現させるために、　合成９ ０塩基対のＳＶ４０複製起点（５’　ＴＡＴＧＡＡＧＡＣＧＴＣＧＣＣＴＣＣＴ ＣＡＣＴＡＣＴＴＣＴＧＧＡＡＴＡＧＣＴＣＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣ ＴＣＧＧＣＣＴＣＴＧＣＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡ、ＡＡＡＡＴＴＡＧＴＣＡＧＧＧ Ｂ’　（上流路））、（５’　ＣＧＣＣＣＴＧＡＣＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴ ＴＴＡ、ＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＣＴＣＴＧＡＧＣ ＴＡＴＴＣＣＡＧＡＡＧＴＡＧＴＧＡＧＧＡＧＧＣＧＡＣＧＴＣＴＴＣＡ３’　 （下流路））をｐＵｃ１８のＮｄｅＥ−ＮａｒＩ部位に連結し、５３塩基対の断 片を入れた（図１．４）。

４、　＠乳類のゲノム内でたまに切断する制限酵素部位をコードし、感染前にプ ラスミドＤＮＡの環化を助ける合成りＮＡ配列ｃｅｓ’　ＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣ ＧＧＣＣＡＴＧＣＣＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＣＴＣＧＡＧＴＴ３′　（上流路）； ５’　ＡＡＣＴＣＧＡＧＡＣＴＡ、ＧＴＧＧＣＣＧＧＣＡＴＧＧＣＣＧＣＧＧＣ ＣＧＣＴＴ３’　（下流鎖））を５ｓｐＩ部位のプラスミドに連結し、プロモー ターのないベクターｐｓｓ１を形成した（図１．５）。

５、　完全なプラスミドのヌクレオチド配列を確認した。

ｐＧＷｌの構築 発現する多くのｃＤＮＡまたは遺伝子はシグナル配列を有しているので、ｐｓｓ ｌを修飾し、分泌シグナルを除去した。

６、　このＤＮＡをＨｉｎｄｌｌｌおよびＮｒｕＩで切断し、断片を除去し、Ｈ ｉｎｄＩＩＩ、３ｍａｌ、ＫｐｎｌおよびＮｒｕＩ部位を有するリンカ−（５’ 　ＡＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＡＴＡＧＧＴＡＣＣＴＣＧ３’　（下流鎖）、５’　 ＣＧＡＧＧＴＡＣＣＴＡＴＣＣＣＧＧＧＡ３’　（下流鎖））を挿入した（図１ ．６）。シグナル配列を除去した上、ポリリンカーに２つの制限酵素部位を加え 、さらに多機能にした。このプロモーターのないｐ　Ｓ　Ｗ　１と呼び、目的と する組み立てを完全なプラスミドのヌクレオチド配列分析によって確認した。

ｐＧＷＨの構築 ７、プラスミドｐｓｓ１は、プロモーターまたはエンハンサ−を有していない。

ポリリンカー、例えばＨｉｎｄＩＩＩ部位中に適当なりＮＡ断片を連結すること によって、これを便宜的に加えた。使用に適した１つのプロモーターまたはエン ハンサ−配列はヒトのサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）の初期転写調節領域で ある（ブロク、ナショ。

アカデ、サイ、ニーニス−Ｌ　−（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｌ ＩＳＡ）、８１巻、ページ６５９〜６６３、トムセン（Ｔｈｏｍｓｅｎ）ら、１ ９８４年）が、ラウス肉腫ウィルスの長末端反復（Ｒ８Ｖ　ＬＴＲ）　、ＳＶ４ ０の初期または後期プロモーターまたはエンハンサ−領域、マウス乳がんウィル ス（ＭＭＴＶ）ＬＴＲ、マウス　メタロチオネイン　プロモーター等の他の調節 領域も仕様できる。これをＨｉｎｄＩＩＩ部位のｐＧＷＩに挿入し、さらに配向 （ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）を制限酵素消化によってチェックした。さらに、５ ’ＨｉｎｄＩ１１部位をＨｉｎｄＩＩＩで部分消化することによって削除し、５ ′部位のみを切断した。さらに、この部位をムング　ビーン（ｍｕｎｇ　ｂｅａ 口〉ヌクレアーゼで処理することによって除去し、次に再連結し、ｐＧＷＨ（図 １．７）を形成した。

このベクターの目的とする組み立てを完全なプラスミドのヌクレオチド配列分析 によって確認した。

８、　選択マーカー遺伝子ｇｐｔおよびＳＶ４０初期プロモーターまたはエンハ ンサ−配列およびポリアデニル化配列を含むＤＮＡ断片をこのベクターのＢａｍ ＨＩ部位にクローニングし、ｐＧＷＨｇを形成し、安定してプラスミドＤＮＡを 組み込む細胞の選択を行った。また、Ｇ４１８またはハイグロマイシン（ｈｙｇ ｒｏｍｙｃｉｎ）に対する耐性または様々な代謝選択性をもつタンパク質をコー ドしている遺伝子を使用した。

この独特な発現機構は、効果的であり、本発明の概念を制限しないため、望まし い。文献に多くの他の哺乳類の細胞における遺伝子の発現方法が記載されており 、このような発現機構は遺伝子工学における当業者に良（知られており、また、 ゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ）によるｒＤＮＡクローニング第２巻（ＤＮＡ　Ｃｌｏ ｎｉｎｇ　Ｖｏｌ、　ＩＩ）　ニア　ブラチカル　アプローチ（Ａ　Ｐｒａｔｉ ｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ）　Ｊ　（ディー″　エム　グローバー（Ｄ、Ｍ、Ｇ ｌｏｖｅｒ）著、アイアールエル出版（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）、オックスフォー ド（１９８５年）ページ１４３〜１９０）に少なくとも一部は記載されている。

実施例２−Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの発現ｃＤＮＡの単離に仕様できる方法は 良（公表されており、プラスミノーゲンｃＤＮＡの単離に使用に用いられる方法 は以下のプロトコールに要約されている。ヒト　プラスミノーゲンｃＤＮＡはク ローニングされ、配列も分かっている（フォースグレン（Ｆｏｒｓｇｒｅｎ）ら 、エフイービーニス　レターズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、２１３巻、ペー ジ２５４〜２６０（１９８７年））。

１、グアニジン　チオシアネート法を用いて新鮮なヒト肝臓よりＲＮＡを調製し くチャーウィン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ）、１０巻、ページ５２９４　（１９７９年））　、オリゴ−ｄＴカ ラムを用いて精製した（アヴイブ（Ａｖｉｖ）およびリーダー（Ｌｅｄｅｒ）　 、ピーエヌエーエス（ＰＮＡＳ）、６９巻、ページ１４０８　（１９７２年）） 。

２、アマジャム　プロトコール（「ｃＤＮＡ　ンンテシス　アンド　クローニン グ　システム（ｃＤＮＡ　Ｓｙ口ｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｃｌｏｎｉ口ｇ　ｓｙ ｓｔｅｍ）」、アマジャム　インターナショナルピーエルシー（Ａｍｅｒｓｈａ ｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｐｌｃ）、１９８５年）に記載されているよ うにして、ｃＤＮＡライブラリーを調製した。２重鎖のｃＤＮＡをラムダベクタ ーに連結した。

３、６ＸＳＳＣ（ＳＳＣは１５０ｔｎＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナト リウム）、５Ｘデンハート溶液、０゜２％ＳＤＳおよびＱ、１ｍｇ／ｍｌサケ精 液Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｓａｌｕ。

ｎ　ｓｐｅｒｍ　ＤＮＡ）を含んだバッファー中で室温で一晩、３２Ｐでラベル されたオリゴヌクレオチド　プローブ（１７マー）を用いて、プラスミノーゲン の３′および５′末端を表わしたニトロセルロース　レプリケイト（ｎｉｔｒｏ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）へのハイブリダイゼーションによ ってプラスミノーゲンｃＤＮＡのプラークをスクリーニングした。フィルターを ５ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳを用いて４７℃で洗浄した。ポジティブなプラーク を精製し、プラスミド　レスキュー（ｐｌａｓｍｉｄｅ　ｒｅｓｃｕｅ）　シ、 ｄＡＴＰ−５’　−（Ｘ−［３５ｓ］チオホスフエイトを用い、修飾されたジデ オキシ法によって、パッケイジされた組換えプラスミドクローンまたはそのサブ クローンの配列を調べた（方法のセクションを参照）。このｃＤＮＡは、フォー スグレン（Ｆｏｒｓｇｒｅｎ）ら、（引用）で報告されているプラスミノーゲン の長さに相当する７９１アミノ酸のｇｌｕ　（グルタミン酸）−プラスミノーゲ ン　タンパク質およびタンパク質の配列によって決定されたアミノ酸（ソトラッ プージエンセン（Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ）ら、引用）と比較した場合の 余分なアミノ酸（６５番目のイソロイシン）をコードしている。このｃＤＮＡの ヌクレオチド配列およびｇｌｕ　（グルタミン酸）−プラスミノーゲンの７９１ このアミノ酸配列を図２に示す。

他の単離方法も使用できる。例えば、プラスミノーゲンを生成する細胞より単離 されたｍＲＮＡをグアニジン　チオシアネート法（チャーウィン（Ｃｈｉｒｇｖ ｉ口）ら、バイオケミストリー（Ｂｆｆｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１０巻、ペー ジ５２９４　（１９７９年））を用いて調製Ｉ５、相補的な一重鎖のＤＮＡをリ バース　トランスクリプターゼを用いて合成した。次に、ポリメラーゼ　チェイ ン　リアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉ口Ｒｅａｃｔｉｏ口）（Ｐ ＣＲ）を用いてプラスミノーゲン配列を増幅させた（サイキ　アール（Ｓａｉｋ ｉ　Ｒ，）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、２３９巻、ページ４８７〜４ ９１　（１９８８年））。また、ＰＣＲ反応は、プラスミノーゲンをコード１． ている配列を念むゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーより調製されたＤＮＡの配 列を増幅させるのに用いることができた。また、遺伝子を化学的に合成されたオ リゴヌクレオチドより組み立てることもできた。

２．５ｋｂのＢＡ、１ｌ−３ｐｈｌ　ｇｌｕ（グルタミン酸）−プラスミノーゲ ン断片をｐＵｃ１８のポリリンカーのＳｍａ　ｌ−８ｐｈ　１部位にサブクロー ニングした（図２）。さらに、プラスミノーゲンｃＤＮＡをＫｐｎ　ｌ−３ｐｈ ｌ断片上のｐＵｃ１８で切断し、ベクターｐＧＷＨに連結し、ｐＧＷＩ（Ｐ＠作 製し、ＥｃｏＲＩ−５ｐｈｌリンカ−（５’　ＡＡＴＴＣＣＡＴＧ３’　）を用 いてＫｐｈ工およびＥｃｏＲ１部位で実施例１に記載されたようにして調製した 。このようにして、プラスミノーゲンｃＤＮＡを通じた転写は、ＨＣＭＶプロモ ーターまたはエンハンサ−で開始する（図３）。選択マーカーｇｐｔは、ＳＶ４ ０プロモーターカラ発現し、３′末端でポリアデニル化シグナルを有するが、ｐ ＧＷＨＰのＢａｍ、ＨＩ部位にクローニングされ、ｐＧＷＨｇＰｌを作製（図３ ）し、配向（ｏｒｉｅｎｔ、ａｔｉｏｎ）を制限酵素ヌクレアーゼ消化によって チェックニアた。以下の方法のセクションに記載されているようにして、ｓ　ｏ 　ｏ　ｖ。

２５μＦのエレクトロポレーションによって、プラスミドＤＮＡをＣＨＯ細胞に 導入した。感染後、２４時間したら、択培地（２５０μΩ／ｍΩキサンチン、５ μｆ：！／ｍ、Ｑマイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ　ａｃｉｄ） 　、Ｉ　Ｘハイポキサンチン−チミジン（ＨＴ））を細胞に加え、培地を２から ３日毎に交換した。ｇｐｔ−耐性コロニーを産生ずるプレートをＥＬ　Ｉ　ＳＡ アッセイを用いてプラスミノーゲン生成でスクリーニングした。最も多い量の抗 原を産生じた細胞を再度クローニングし、最良の生産株をフラスコでスケールア ップし、生成を注意深く観察した。これらすべての細胞の凍結貯蔵物を貯蔵（− だ。３ｍｇ／リットルより多い１麿でｇ　１　ｕ−プラスミノーゲンを共に産生 ずる細胞株Ｃ１゜４４およびＣ１，７５をローラーボトルでスケールアップし、 プラスミノーゲンタンパク質をリシンセファロース４Ｂ　（ｌｙｓｉｎｅ　５Ｅ ＰＨＡＲＯ８Ｅ　４Ｂ）を用いて精製する条件培地を作製１−た。（セファロー ス（ＳＥＰＨＡ、ＲＯ８Ｅ）は商標である。）さらに、精製されたプラスミノー ゲンのフィブリン　アガークｏ　ット　アッセイ（ｆｉｂｒｉｎ　ａｇａｒ　ｃ ｌｏ　ａｓｓａｙ）を用いたｔＰＡまたはスＩ−１ノブトキナーゼによる切断能 を調へた。

また、チモーゲンの切断物もＳＤＳ　ＰＡＧＥを用いて確立されていた（ネイチ ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）、２２７巻、ページ６８０、ラエムリ（ＬａｅｍｌｌＩ ｌｉ）　、１９７０年）。

遺伝子操作技術、この野生型プラスミノーゲンの作製において用いられた発現お よびタンパク質の精製および以下の修飾プラスミノーゲンの実施例は、遺伝子工 学の分野における光業者には良く知られている。多くの技術は、以下の実験マニ ュアルに記載されている：ティー　マニアティス（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｊｓ）　 、イー　エフ　フリッシュ（Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｅｈ）およびジエー　サムプル ツク（Ｊ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ）による「モレキュラー　クローニング（Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　Ｊコールドスプリング　ハーバ−ラボラトリ −、ボックス　１００１ニユーヨーク（Ｃｏｌｃｌ　Ｓｐｒｉｎｇ　）ｌａｒｂ ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＢＯＸｌｏｏ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）による８ 版、またはエル　ジー　デイウ゛イス（Ｌ、Ｇ、Ｄａｖｉｓ）およびジニー　エ フ　バラティ（Ｊ、Ｐ、Ｂａｔｔｅｙ）による「ペイシック　メソッド　イン　 モレキュラーバイオロジー（Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕ ｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｊエルスヴイアー　サイエンス　パブリッシング　コ ーボレーンＢン　インク、ニューヨーク（ＥＩｓｃｖｉｃｒ　５ｃｉｃｎｃｃ　 ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ　Ｉｎｃ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）による８版。

付加および修飾の方法は、以下の方法のセクションに詳細に記載している。

実施例３〜Ｘ１の構築および発現 ５６１番目のアルギニン、５６２番目のバリンの切断部位の周りで変更されるプ ラスミノーゲン類縁体は、部位を修飾するために構築され、副酵素により認識お よび切断させる。Ｘｌは、アミノ酸残基の５５９番目のプロリンは、インロイシ ンおよびグルタミン酸（図４）により変換されるプラスミノ−ケン類縁体である 。当該部位は、プロトロンビン中の因子Ｘａ切断部位に基づくものであった。本 実施例での修飾の細心の計画は、変異誘発を促進するための単鎖バクテリオファ ージＭ１３ｍｐ１８中で、ｐＵｃ１８ベクター中のプラスミノーゲンｃＤＮＡか ら１．８７ｋｂＫｐｎｒ−ＨｉｎＣＩ！フラグメントのサブクローンまでであっ た。単鎖鋳型が調製され、該変異は不適切な変異誘発に向けられたオリゴヌクレ オチドにより成された。この場合において、２１塩基長のオリゴヌクレオチド（ ５′ＣＣＣＴＴＣＣＣＴＣＧＡＴＡＣＡＴＴＴＣＴ　３’）は、変異誘発に向け るために用いられた。該変異を運搬するりローンは、配列決定により同定され、 その後、他の変異が偶然に導入されていないことを確かめるために十分に配列を 決めた。複製型（ＲＦ）ＤＮＡは、その後調製され、該変異は、変更されたフラ グメントで野生型Ｋｐｎｌ−ＥｃｏＲＶフラグメントを交換することにより（実 施例２に記載したような）グルタミン酸プラスミノーゲンを含む発現ベクター中 に移転された。変異プラスミノーゲンを運搬する該ｐＧＷＨｇプラスミドは、そ の後、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔｌで線形にされ、電気穿孔法によりＣＨＯ 細胞中に導入された。該発現プロトコールは、その後、実施例２に記載されたも のと同様である。当該変異タンパク質の用いられる該細胞系は、Ｃ７，９，であ る。精製した因子Ｘａでの当該変異の活性化および切断は、実施例２０および２ ９に記載されたと同様に探求された。

実施例４−Ｘｌの構築および発現 用いられたプライマーが２２マー（５’　ＣＣＴＴＣＣＣＴＣＧＡＴＧＣＣＡＣ ＡＴＴＴＣ３’）であった以外は、通常、実施例３の方法によった。得られたプ ラスミノーゲン変異誘導体は、以下のアミノ酸変化、すなわち、５５９番目のプ ロリンをグリシンに、５６０番目のグリシンをイソロイシンに、そして５６１番 目のアルギニンの前にグルタミン酸およびグリシンの付加（図４）を有する。当 該切断部位は、プロトロンビン中の因子Ｘａ切断部位に基づくものである。細胞 系Ｃ８，２４は、該変異タンパク質を生成するために増やされた。他は、通常、 実施例３の方法によった。当該変異の活性化および切断は、実施例２０および２ ７に記載されたと同様に調査された。

実施例５−Ｘ３の構築および発現 Ｘ３において、５５９番目のプロリンは、４８マー（５’　ＣＣＣＣＣＣＣＡＣ ＡＡＣＣＣＴＴＣＣＣＴＣＴＡＴＴＧＣＡＣＣＡＣＡＴＴＴＣＴＴＣＧＧＣＴＣ ＣＡＣ３’）（図４）に用いるグリシン、アラニン、イソロイシンおよびグルタ ミン酸により置換される。細胞系３７．４は、プロトロピン中の因子Ｘａ切断部 位に基づいた切断部位を有する当該タンパク質を生成するために用いられる。他 は、通常、実施例３の方法によった。当該変異の活性は、以下の実施例２１に記 載した。

実施例６−Ｘ５の構築および発現 Ｘ５は、４８マー（５’　ＣＣＣＣＣＣＣＡＣＡＡＣＣＣＴＴＣＣＧＴＣＴＡＴ ＧＴＡＡＣＣＡＣＡＴＴＴＣＴＴＣＧＧＣＴＣＣＡＣ３’）（図４）に用いるグ リシン、チロシン、イソロイシンおよびアスパラギン酸により交換された５５９ 番目のプロリンを有する。細胞系Ｃ３９，７は、プロトロピン中の因子Ｘａ切断 部位に基づいた切断部位を有する当該タンパク質を生成するために用いられる。

他は、おおむね、実施例３の方法によった。当該変異の活性は、以下の実施例２ １に記載した。

実施例７−Ｘ６の構築および発現 Ｘ５中の変異に加えて、Ｘ６は、イソロイシン（図４）により変換された５６１ 番目のバリンを有する。これは、５２マー（５’　ＣＡＣＡＣＣＣＣＣＣＣＡＣ ＡＡＴＣＣＴＴＣＣＧＴＣＴＡＴＧＴＡＡＣＣＡＣＡＴＴＴＣＴＴＣＧＧＣＴＣ ＣＡＣ３’）に用いられた。細胞系Ｃ３６，１は、当該タンパク質を生成するた めに用いられる。他は、通常、実施例３の方法によった。当該変異の活性は、お おむね以下の実施例２１に記載した。

実施例８−Ｔ１の構築および発現 Ｔ１は、５５９番目のプロリンおよび５６０番目のグリシンが、５５９の位置で グリシンおよび５６０でのプロリン（図５）を与えるために交換される。当該切 断部位は、フィブリノーケンＡアルファ鎖中の１９番目のアルギニンおよび２０ 番目のバリンでのトロンビン切断部位によく似る。使用したプライマーが、２１ マー（５’　ＣＡＡＣＣＣＴＴＧＧＡＣＣＡＣＡＴＴＴＣＴ　３’）であった以 外は、おおむね実施例３の方法にしたがって行った。Ｔ１変異を生成する細胞系 は、Ｃ６，２３，である。当該変異の活性化および切断は、下記の実施例２２お よび２８に記載した。

実施例９−Ｔ２の構築および発現 Ｔ２は、Ｔ１の場合と同じ方法で野生型プラスミノーゲンから修飾されたプラス ミノーゲン誘導体であるが、特別なグリシンアミノ酸は、５５９番目のグリシン および５６０番目のプロリンの間に付加される（図５）。当該変異を作るために 使用されるプライマーが２２マー（５’　ＡＣＣＣＴＴＧＧＡＣＣＡＣＣＡＣＡ ＴＴＴＣＴ　３’）である以外は、おおむね実施例３の方法にしたがって行った 。細胞系Ｃ５，１６は、当該変異タンパク質を生成するために用いられた。当該 変異の活性化および切断を、下記の実施例２２および２８に示す。

実施例１Ｏ−Ｔ６の構築 Ｔ６タンパク質において、アミン酸変化の二つの部位である。該アミノ酸の５５ ９番目のプロリン、５６０番目のグリシン、５６１番目のアルギニン、５６２番 目のバリンは、５５９番目のグリシン、５６０番目のバリン、５６１番目のバリ ン、５６２番目のプロリン、５６３番目のアルギニン、５６４番目のグリシンに なるための６つのアミノ酸により変換される。これらの変化に加えて、５５３番 目のバリン、５５６番目のりシン、５６７番目のりシンは、６１マー（５’　Ｇ ＧＧＣＣＡＣＡＣＡＣＣＣＣＣＣＣＡＣＴＣＣＣＣＴＡＧＧＣＡＣＡＡＣＴＣＣ ＡＣＡＴＡＧＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＴＴＧＡＧＧ　３’）にそれぞれ使用す るロイシン、グルタミン酸およびロイシンにより変換される（図５）。当該修飾 は因子Ｘｌ中のトロンビン切断部位に基づくものである。細胞系Ｃ４５，１は、 当該タンパク質を生成するために用いられた。他は、おおむね、実施例３の方法 にしたがって行った。当該タンパク質の変異の活性化および切断は、下記の実施 例２３および２９に記載する。

実施例１ｌ−Ｔ７の構築および発現 因子Ｘ■中のトロンビン切断部位に基づく他の修飾において、Ｔ７は、Ｔ６、す なわち、５５９番目のグリシン、５６０番目のバリン、５６１番目のバリン、５ ６２番目のプロリン、５６３番目のアルギニン、５６４番目のグリシンとなるた めの６つのアミノ酸による５５９番目のプロジン、５６０番目のグリシン、５６ １番目のアルギニン、５６２番目のバリンの置換に関して記載された変化の第１ 組を取り入れる。さらに、５５３番目のバリン、５５６番目のりシンおよび５５ ７番目のりシンは、６０マー（５′ＧＧＣＣＡＣＡ、ＣＡＣＣＣＣＣＣＣＡＣＴ ＣＣＣＣＴＡＧＧＣＡ、　ＣＡ　Ａ、　ＣＴ　ＣＣＡ　ＣＡ　Ｔ　Ａ　Ｇ　Ｔ　 Ｔ　Ｇ　ＣＧ　Ｇ　ＣＴ　ＣＣＡＧＴＴＧＡＧＧ　３’）にそれぞれ使用するロ イシン、グルタミンおよびロイシンにより置換される（図５）。細胞系ｃ２６． ５は、当該タンパク質を生成するために用いられた。他は、おおむね、実施例３ の方法にしたがって行った。当該タンパク質の変異の活性化および切断は、下記 の実施例２３および２つに記載する。

実施例１２−Ｔ８の構築および発現 Ｔ８は、因子Ｘ■中および５５９番目のプロリン、５６０番目のグリシン、５６ １番目のアルギニン、５６２番目のバリンは、６１マー（５’　ＣＡＣＡＣＡＣ ＣＣＣＣＣＡＣＴ　ＣＣＣＣＴ　Ａ、　Ｇ　Ｇ　ＣＡ　ＣＴ　Ａ、　ＣＴ　ＣＣ Ｔ　Ｔ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ｇ　ＴＴＣＴＡＣＡＣＡＴＴＴＣＴＴＣＧＧＣＴＣＣ３’ ）に使用するバリン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、グリシン、バリン 、バリン、プロリン、アルギニン、グリシンにより置換される当該タンパク質中 ののトロンビン切断部位に基づくものである（図５）。細胞系Ｃ３４，５は、当 該タンパク質を生成するために用いられた。他は、おおむね、実施例３の方法に したがって行った。当該タンパク質の活性化および切断は、下記の実施例２３お よび２９に記載する。

実施例１３−Ｔ１３の構築および発現 プラスミノーゲン誘導体Ｔ１Ｂにおいて、５５９番目のプロリン、５６０番目の グリシンの２つのアミノ酸は、４１マー（５’　ＣＡＣＣＣＣＣＣＣＡＣＡＡＣ ＣｃＴＡＧＧＴＡＣＡＡＣＡＣＡＴＴＴＣＴＴＣＧＧＣＴＣ３’）に使用するバ リン、バリンおよびプロリンの３つのアミノ酸により置換される（図５）。細胞 系Ｃ５１，１は、当該タンパク質を生成するために用いられた。他は、おおむね 、実施例３の方法にしたがって行った。当該タンパク質の活性化および切断は、 下記の実施例２４および２９に記載する。

実施例１４−７１４の構築および発現 プラスミノーゲン類縁体Ｔ１４は、カルシトニン中のトロンビンにより切断され る部位に基づ（トロンビン切断部位部を持つ。当該変異において、グリシンおよ びチロシンのアミノ酸は、５５８番目のンステインと５５９番目のプロリンの間 に挿入され、さらに５６０番目のグリシンが欠損される（図５）。これらの変異 は、４１マー（５’　ＣＡＣＣＣＣＣＣＣＡ、ＣＡＡＣＣＣＴＡＧＧＧＴＡＴＣ ＣＡＣＡＴＴＴＣＴＴＣＧＧＣＴ　３′）に用いられる。当該タンパク質を生成 するために用いる細胞系は、Ｃ６１，１である。池は、おおむね、実施例３の方 法にしたがって行った。

実施例１５−Ｔ１７の構築および発現 タンパク質Ｔ１７は１．コレシストキニン中のトロンビンにより切断される部位 に基づく切断部位を持つ。当該タンパク質は、５５９番目のプロリンと５６０番 目のグリシンの間に挿入されるセリンを持ち、３８マー（５’　ＣＡＣＣＣＣＣ ＣＣＡ　ＣＡ、　Ａ　ＣＣＣＴ　Ｔ　ＣＣＡ、　ＣＴ　Ａ　Ｇ　Ｇ　Ａ、　ＣＡ 　ＴＴ　Ｔ　ＣＴ　Ｔ　ＣＧ　Ｇ　３　’　）に使用された（図５）。細胞系Ｃ ４９，７は、当該タンパク質を生成するために用いられた。他は、おおむね、実 施例３の方法にしたがって行った。

当該タンパク質の活性化および切断は、下記の実施例２５および２９に記載する 。

実施例１６−Ｔ１９の構築および発現 当該タンパク質の切断部位は、因子Ｘ■中のトロンビン切断部位に基づくもので ある。当該変異は、ＰＩ’アミノ酸がグリシンよりむしろバリンであるＴ８と異 なる。切断は、未変性軽鎖配列を持つ二重鎖Ｔ１９プラスミンを生成する。当該 タンパク質において、５５９番目のプロリン、５６０番目のグリシン、５６１番 目のアルギニンは、６１マー（５′ＣＡＣＡＣＣＣＣＣＣＣＡＣＡＡＣＣＣＴＴ ＧＧＧＡＣＴＡＣＴＣＣＣＴＧＣＡＡＴＴＣＴＡＣＡＣＡＴＴＴＣＴＴＣＧＧＣ ＴＣＣＡＣ３Ｍに使用するバリン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、グリ シン、バリン、バリン、プロリン、アルギニンにより置換される（図５）。

細胞系、Ｃ５３，５は、当該タンパク質を生成するために用いられた。他は、お おむね、実施ツリ３の方法にしたがって行った。当該タンパク質の活性化および 切断解析は、下記の実施例２５および２９に提示する。

実施例１７−Ｔ２０の構築および発現 当該タンパク質の切断部位は、Ｔ１９に似ているが、切断により生じた軽鎖プラ スミンのアミノ端未配列は、欠損された５６２番目のバリン、５６３番目のバリ ンを持つ。

当該タンパク質において、５５９番目のプロリン、５６０番目のグリシン、５６ １番目のアルギニン、５６２番目のバリンおよび５６３番目のバリンは、５８マ ー（５’　ＧＧＣＣＡＣＡＣＡＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＧＧＧＧＡＣＴＡＣＴＣＣ ＣＴＧＣＡＡＴＴＣＴＡＣＡＣＡＴＴＴＣＴＴＣＧＧＣＴＣＣ３’）に使用する バリン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、グリシン、バリン、バリン、プ ロリン、アルギニノにより置換される（図５）。細胞系Ｃ５４゜２は、タンパク 質を生成するために用いられた。他は、おおむね、実施例３の方法にしたがって 行った。

実施例１８−Ｔ２１の構築および発現 当該変異は、Ｐ１′アミノ酸がグリシンよりむしろバリンであるＴ６と異なる。

切断は、未変性軽鎖配列を持つ二重鎖Ｔ２１プラスミンを生成する。当該タンパ ク質を記号化するｃＤＮＡは、実施例１ｏに記載されたＴ６　ｃ　ＤＮＡ鋳型お よび２３７−　（５’　ＣＡＣＣＣＣＣＣＣＡＣＴＡＣＣＣＴＡＧＧＣＡＣ３’ 　）　に用いられた（図５）。細胞系Ｃ５５，９は、当該タンパク質を生成する ために用いられた。他は、おおむね、実施例３の方法にしたがって行った。

実施例１９−Ｔ２２の構築および発現 当該変異は、Ｐ１′アミノ酸がグリシンよりむしろバリンであるＴ７と異なる。

切断は、未変性軽鎖配列を持つ二重鎖Ｔ２２プラスミンを生成する（図５）。当 該タンパク質を記号化するｃＤＮＡは、Ｔ２１に記載された２３マーに用いる、 実施例１１に記載されたような、Ｔ７ｃＤＮＡバックグラウンドで作られる。細 胞系Ｃ５６，１１は、当該タンパク質を生成するために用いられた。他は、おお むね、実施例３の方法にしたがって行った。

実施例２Ｏ−ＸＩおよびＸ２の活性化 因子Ｘａによるプラスミンへのタンパク質のＸｌおよびＸ２の活性化は、フィブ リン溶解分析を用いて試験された。

プラスミンの発生は、方法Ｉ２．１（下記の方法の項を蚕照のこと）に記載され たようなフィブリン−アガロースゲルに発生するクリアランスゾーンの発現によ り認められた。

多くの精製したプラスミノーゲン変異（６３５μｇ／ｍＮ）２５μｇは、３７℃ で精製した因子Ｘａ　（０，３５μｇ）２．５μｇと共に温置された。プラスミ ンの発生は、フィブリン寒天ゲル中でインキュベーションから十分にサンプル１ ０μｇを添加することにより分析された。因子Ｘａで温置されたプラスミノーゲ ン変異のサンプルは、因子Ｘａで温置されていない対照サンプルに存在しないゲ ル上のクリアランスゾーンを与える。因子ＸａによるプラスミンへのＸ２の活性 化を図６に示す。

実施例２ｌ−Ｘ３、Ｘ４およびＸ６の活性化精製されたＸ３タンパク質は、連鎖 色素分析（方法１２゜３参照）を用いる活性化により分析した。当該分析の結果 は、時間と共に４０５ｎｍの吸光度での増加がプラスミン活性か因子ＸａでＸ３ のインキュベーションでの発生されることを実証することを図７に示す。同様に 、Ｘ５およびＸ６は、因子Ｘａを用いてインキュベーションにより活性化するこ とを示す。

実施例２２−ＴｌおよびＴ２の活性化 精製された変異タンパク質Ｔ１およびＴ２は、変異タンパク質が（２５５１プラ スミノーゲン変異（１２０μｇ／ｍΩ）が２．５μｇトロンビン（０，６９ユニ ツト）で温置された）トロンビンで前装置され、フィブリンゲル中の良好なもの がゲルを作るために使用されたトロンビンの活性化する効果を阻害すべくヒルジ ンで前処理された以外は実施例２０記載されたと同様に活性化につき分析した。

両変異は、ゲルーヒのクリアランスゾーンの生産されたトロンビンと共に温存さ れたサンプルと同様にトロンビンにより活性化される。クリアランスゾーンは、 トロンビンで温置されない対照サンプルでは生産されなかった。Ｔ２に関する結 果を図６に示す。

実施例２３−Ｔ６、Ｔ７およびＴ８の活性化変異タンパク質は、連鎖色素分析（ 方法１２．３参照）を使用する活性化により分析した。当該分析は、Ｔ６、Ｔ７ およびＴ８がトロンビンにより活性化されない（しかしながら、それらは分解さ れる一実施例２９参照）ことが実証された。

実施例２４−Ｔ１３の活性化 精製されたＴ１３タンパク質は、実施例２３に記載されたと同様の連鎖色素分析 を用いて分析された。当該分析の結果を、時間と共に４０５ｎｍの吸光度での増 加が、Ｔ１３はトロンビンにより活性化されることを実証することを図７に示す 。活性化は、また実施例２６に記載するような直接色素分析を使用して検出され た。

実施例２５−Ｔ１７の活性化 精製されたＴ１７タンパク質は、実施例２３に記載されたと同様の連鎖色素分析 を用いて分析された。当該分析はトロンビンがＴ１７を活性化することを実証し た。

実施例２６−Ｔ１９の活性化 精製されたＴ１９タンパク質は、実施例２３に記載されたと同様の連鎖色素分析 を用いて分析された。当該分析の結果を、時間と共に４０５ｎｍの吸光度での増 加が、Ｔ　］−９はトロンビンにより活性化されることを実証することを図７に 示す。

変異タンパク質Ｔ１９は、また活性化により発生されるプラスミン定置させる直 接色素分析を使用して分析された（方法１２．２参照）。当該分析の結果を、時 間と共にプラスミン発生が、Ｔ１９はトロンビンにより活性化されることを実証 することを図８に示す。

実施例２７−Ｘ変異の切断 Ｘプラスミノーゲン変異の２５μｇのサンプルは、０゜２５ｍｇ緩衝液中に１． ５μｇの因子Ｘａと共に温置させ、切断分析は、方法１１に記載されたと同様に 行われた。図９は、約９２ｋＤａでのＸ２プラスミノーゲンバンドが、約６６ｋ Ｄａでの重鎮プラスミンバンドを形成するために切断されたことを示す。これは 、因子Ｘａにより切断され導入される変異アミノ酸配列を示し、そかも実施例２ ０のＸ２に関し実証された活性化は、プラスミンを生産すべきプラスミノーゲン 類縁体の切断の結果である。

実施例２８−ＴｌおよびＴ２の切断 精製されたタンパク質Ｔ１およびＴ２の切断分析は、トロンビン（１，５μｇ） が因子Ｘａの変わりに用いた以外は実施例２７に記載されたと同様にして実施し た。トロンビンによるプラスミンへのＴ２の切断は、図９、すなわち、実施例２ ４に実証された活性化は、トロンビン切断の結果であることを確認したものを示 す。

実施例２９−Ｔ６、Ｔ７、Ｔ８、Ｔ１３、Ｔ１７およびＴ１９の切断 １２．５μｇプラスミノーゲン変異のサンプルは、方法１１に記載されたと同様 にしてトロンビン２．８μｇで温置された。プラスミノ−ケン変異の切断の時間 経過は、定量ケル走査により決定され、Ｔ６、Ｔ７、Ｔ８、Ｔ１３、Ｔ１７およ びＴ１９の５０％切断時間は、Ｔ１７に関する切断時間が約３０時間であった場 合に、それぞれ１３．４０１　ユ５．７０および少なくとも１０分であった。Ｔ １９の切断の関するゲル走査データ（プラスミノーゲンバンドの消滅）を図１０ に示す。

実施例３０−リシン−３の構築 ７６番目のグルタミン酸に隣接しである未変性プラスミノーゲンシグナル配列の リシン−プラスミノーゲンを記号化するｃＤＮＡは、３５７−（５’　ＣＴＧＡ ＧＡＧＡＴＡＣＡＣＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＧＡＣＣＴＧＡＴ３′）に使 用する変異誘発以外の輪状構造によりグルタミン酸−プラスミノーゲンの７５ア ミノ末端アミノ酸を欠失することにより作られる。その他は、おおむね実施例３ の方法により行った。

実施例３１−リシン−４の構築 ±該すシンープラスミノーゲンにおいて、シグナル配列の１９番目のクルシンと グルタミン酸−プラスミノーゲンのの７８番目のりシンとの間の７７アミノ酸は 、２９マー（，５’　ＣＴＧＡＧＡＧＡＴＡＣＡＣＴＴＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣＴ ＧＡＴ　３’）に使用する変異誘発以外の輪状構造により欠失された。その他は 、おおむね実施例３の方法により行った。

実施例３２−リシン−５の構築 当該リシン−プラスミノーゲンにおいて、シグナル配列の１９番目のグルシンと グルタミン酸−プラスミノーゲンのの７７番目のりシンとの間の７６アミノ酸は 、３２マー（５’　ＣＴＧＡ、ＧＡ、ＧＡＴＡ、ＣＡ、ＣＴＴＴＣＴＴＴＣＣＴ ＴＧＡＣＣＴＧＡＴ　３’）に使用する変異誘発以外の輪状構造により欠失され た。その他は、おおむね実施例３の方法により行った。

方法 １）ヤニチリヌク１ノアーゼ消化 １０ユニツトのヤエナリヌクレアーゼは、ｐＨ５，０の３０ｍ、ＭのＮａ０Ａ、 ｃ、１００ｍＭＮのＮａＣｆ１１２ｍＭのＺｎＣａ、１０％グリ七ロールを含有 する緩衝液中の制限酵素と共に消化された約１μｇＤＮＡに添加された。該ヤエ ナリヌクレアーゼは、３０分間、３７″で温置され、フェノール抽出され、そし てエタノール沈殿される前に６７″で１５分間失活された。

２）オリゴヌクレオチド合成 該オリゴヌクレオチドは、シアノエチルホスホルアミダイツ（ｐｈｏｓｐｈｏｒ ａｍｉｄｉｔｅｓ）を使用する自己増殖されるホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐ ｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）化学により合成された。

該方法論は、現在広く用いられており、（ビューゲージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ　、 −Ｔ−ス、エル、およびカルチャーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）、エム、エッチ、 テトラヒドロン　レターズ　２４．２４５（１９８１）およびカルチャーズ（Ｃ ａｒｕ＋、ｈｅｒｓ）　、エム、エッチ、サイエンス　２３０．２８１−２８５ 　（１９８５））に記載されている。

３）オリゴヌク１７オチドの精製 該オリゴヌク１７オチドは、脱防御され、濃縮されたＮＨ９中でインキユベーシ ョンによりＣＰＧ支持体から除去された。典型的に、オリゴヌクレオチドの１μ ｍｏｌを運搬するＣＰＧの５Ｑｍｇは、濃縮されたＮ　Ｈ３６０Ｏｕｌ中に７０ ’で５時間インキュベーションにより脱防御された。

該上澄みは、新しいチューブに移され、該オリゴマーは、３ボリユウムのエタノ ールで沈殿された。続いて、遠心ペレットは、乾燥され、１ｍｇの水に再懸濁さ れた。粗製オリゴマーの濃度は、その後、２６０ｎｍで吸光間測定することによ り決定された。

ゲルの精製に関し、１０の吸光度ユニッ）・の粗製オリゴヌクレオチドは、十分 に乾燥させ、指標色素（９０％脱イオンホルムアミド、１０ｍＭトリス、１０ｍ Ｍホウ酸塩、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％シンロモフェノールブルー）の１５μｇ に再懸濁された。該サンプルは、１分間、９０″′で加温され、その後、ｌ、６ ｍｍの広さの溝に１．　２ｍｍ厚の変性ポリアクリルアミドゲルを充填（５た。

該ゲルは、１５％アクリルアミド、０．６％ビスアクリルアミド、およびＩＸ　 ＴＢＥの７Ｍ尿素の株から調製され、０．１％アンモニウム過硫化物および０． ０２５％ＴＥＭＥＤと重合された。該ゲルは１時間、予備運転された。該サンプ ルは、４〜５時間、１５００Ｖで運転された。該バンドはＵＶシャドーウィング により目に見えるようにされ、十分な長さの生成物に相当するバンドが準備され 、微量試験管に移された。該オリゴマーは、−晩生、ＡＧＥＢ　（０，５Ｍ酢酸 アンモニウム、０．０１Ｍ酢酸マグネシウムおよび０゜１％Ｓ　Ｄ　Ｓ　）中に 浸漬することで該ゲル切片から溶出された。該ＡＧＢＥ緩衝液は、その後、新１ −い試験管に移され、該オリゴマーが１５分間、７０″で３ボリユウームのエタ ノールで沈殿された。該沈殿物は、１０分間エッベンドルフ　マイクロフユージ （Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　ｔｘｉｃｒｏｆｕｇｅ＞の遠心により集められ、該ベレ ットは、８０％、エタノールで洗浄され、該精製されたオリゴマーは乾燥され、 １ｍｆｆの水に再溶解され、そして最後に０．４５ミクロンの微細フィルターを 通して濾過された。（ＥＰＰＥＮＤＯＲＦは商標である。）精製された生成物の 濃度は、２６０ｎｍでのそれの吸光度を決定することで測定された。

４）オリゴマーのキナーゼ化 １０１００ｐ　１のオリゴマーは、十分に乾燥され、２０ｕｇキナーゼ緩衝液（ ７０ｍＭトリスｐＨ７，６，１０ｍＭのＭｇＣｌ２．１ｍＭのＡＴＰ、０．２ｍ Ｍスペルミジン、０．５ｍＭジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏ ｌ））に再懸濁させた。１０ｕのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼが添加され、該 混合物が３０分間、３７°で温室された。該キナーゼは、その後、１０分間、７ ０″で加温することで失活された。

５）デオキシ配列決定 使用されたプロトコールは、（ビギン（Ｂｉｇｇｉｎ）、エム、ディ０、ギプソ ン（Ｇｉｂｓｏｎ）、ティ、ジエイ０、ハング（Ｈｏｎｇ）、シイ、エフ、ビイ ６　エフ。エイ、ニス、８０　３９６Ｂ−３９６５（１９８３））に記載された ものと実施上同じであった。適当な方法は、（ギュオ（Ｇｕｏ）　、エル−エッ チ１、オウ（Ｗｕ）　アール　ネクレック　アンラド　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　１１５５２１−５５４０　（１９８３） ）に記載されたものと同様にプラスミドＤＮＡで配列決定させるべく修飾された 。

６）形質転換 形質転換は、一般の手法を用いて達成された。該株はプラスミドベクターに用い るクローン化の受容体として用いられる株は、下記の遺伝子型： ａｒａＤ１３９　（ａｒａ−１ｅｕ）ｄｅ１７６９７（１ａｃｌＰＯＺＹ）ｄｅ １７４　ｇａｉＵｇａｌＫ　ｈｓｄＲｒｐｓＬ　５ｒｌ ｒ　ｅ　ｃＡ５６ を有するＨＷ８７であった。

Ｒ２１０３２は、ＤＮＡ代謝の２つの酵素（ａ）細胞内のｄＵＴＰの高濃度で得 られるｄＵＴＡａ　ｓ　ｅ　（ｄａ　ｔ）および（ｂ）ＤＮＡから誤って取り込 まれたウラシルの除去に関与するウラシルＮ−グリコシラーゼ（ｕｎｇ）（クン ケル（Ｋｎｕｋｅｌ）ら、メソード　イン　エンザイモール（Ｍｅｔｈｏｄｓ　 ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ）、　、１５４．３６７−３８２　（１９８７））の欠け た大腸菌の誘導体である。上記の主な利点は、それらの変異が、直接型変異誘発 部位に変異体のより高い頻度をもたらすことである。Ｒ２１０３２は、下記の遺 伝子型： ＨｆｒＫＬ１６Ｐｏ／４５　［１ｙｓＡ９６１−６１）、ｄｕｔｌ、　ｕｎｇｌ 、　ｔｈｉｌ、　ｒｅ［Ａコ　、Ｚｂｄ−２７９：　：ＴｎｌＯ１ｓｕｐＥ４４ を有する。

ＪＭｌｏＢは、Ｍ１３基剤ベクターに関する操作用の一般的な受容体株である。

７）直接型変異誘発部位 キナーゼされた変異誘発プライマー（２，５μｍｏｌ）は、７０ｍＭ）リス、１ ０ｍＭのＭｇＣｌ２を含有するＨｏｎｇの最終反応混合物（１μｇ）中に、宿主 としてＲ２１０３２を用いて調製された単鎖鋳型ＤＮＡにアニールされた。ポリ プロピレン製微細試験管（ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ）中の該反応混合物は、３分間、 ７０°Ｃ１続いて３０分間、３７°Ｃの水２５０ｍｇを含有するビカーに置かれ た。該アニールされた混合物は、その後水中に置かれ、続いて試薬：１μｇの１ ０　、Ｘ　ＴＭ　（７００ｍＭトリス、１００ｍＭのＭｇＣΩ２　ｐＨ７，６） 、各々５ｍＭの４デオキシリボヌクレオチドトリホスフエートの全混合物１μｇ 、２μｇのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（１’００ｕ）　、０．５μΩのＤＮＡポリメ ラーゼのフレノウフラグメントおよび４．５μΩの水が添加された。該ポリメラ ーゼ反応混合物は、その後、４〜１６時間、１５°で温室された。反応後、完成 され、１８０μΩのＴＥ（１０ｍＭトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ　ｐＨ８，０）が 添加され、該変異誘発混合物が一２０℃で貯蔵された。

変異クローンの単離に関して、該混合物は、その後、次のように該受容体ＪＭ１ ０Ｂに移された。５ｍｇ、−晩中、２　Ｘ　ＹＴ（１，６％バクトドリブトン（ Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ）、１％酵母抽圧液、１％ＮａＣΩ）中のＪＭｌｏ Ｂの培養は、予め温められた２　Ｘ　ＹＴの５０ｍΩ中に１００分の１に希釈さ れた。該培養は、０．４に達したＡ　６０　ｏまで通気により３７°で成長させ た。該細胞は、ペレットされ、５０ｍＭのＣａＣｌ２の０．５容量（ｖｏｌ）に 再懸濁され、１５分間、水中に置かれた。該細胞は、その後、４″で再ペレット され、冷却された５０ｍＭのＣａＣ，１２２の２．５ｍｇに再懸濁された。トラ ンスフェクションに関し、０．２５．２．５．２０および５０ｕｇの変異誘発混 合物のアルコートが、３０分間、氷上に置かれた受容能のある細胞の２５０ｕｇ に添加された。該細胞は、その後、２分間、４２″′で熱ショックされた。各試 験管には、ＪＭｌｏＢの末期指数培養の１．２ｍｇを含有するＹＴソフト寒天の ３．５ｍｌ１が添加され、該内容物は、簡単に混合され、その後、１．５％寒天 で固化された２　Ｘ　ＹＴを含有する予め温められたプレートの表面上に注入し た。該ソフト寒天層は固めさせられ、該プレートは、その後、−晩中、３７°で 温室された。

一重鎖ＤＮＡは、その後、次のように単離されたクローンから調製された、すな わち、シングルプラークが２ＸＹＴ中にＪＭｌｏＢの一晩の新たな培養の１０μ Ωで実を結んだ２　Ｘ　ＹＴの４ｍＭに集められた。該培養は、６時間、激しく 振盪された。培養の０．５ｍｇが、その後、取り除かれ、−２０°で貯蔵された 基準株を得るへ＜０゜５ｍｇの５０％グリセロールに添加された。該残存培養は 、該細胞を取り除くために遠心分離され、ファージ粒子を運搬する１ｍ、ｌｅｔ の上澄みが、新しいＥＰＰＥＮＤＯＲＦ試験管に移された。２０％ＰＥＧ６００ ０．２５０ｍＭのＮａＣＩの２５０μΩが、その後、添加され、混合され、そし て該試験管は１５分間水上にｌｎ置された。該ファージは、その後、１０分間１ ０，０００ｒｐｍでベレットされ、上澄みが捨てられ、該試験管は、後で取り除 き、捨てることのできる最終の微量のＰＥＧ溶液を採取するために再遠心分離さ れた。該ファージベレットは、２００μｇのＴＥＮ（１０ｍＭトリス、１ｍＭの ＥＤＴＡ、０．３ＭのＮａ０Ａｃ）中に完全に再懸濁された。該ＤＮＡは、ｊ・ リス飽和フェノールの同容量で抽圧により単離された。波相は、簡単な遠心分離 により分離され、該水性相は、きれいな試験管に移された。該ＤＮＡは、１００ μｇフェノール、１００μΩクロロフオルムの混合物で再抽出され、波相は、再 度遠心分離により分離された。微量のフェノールが、タロロフォルムで３回連続 抽田して取除かれ、該ＤＮＡが、−２０″で一晩、２゜５ボリユウムのエタノー ルで沈殿することで最後に単離された。該ＤＮＡは、１０分間、１０゜０００Ｏ ｒｐｍでベレットされ、７０％エタノールで洗浄され、乾燥され、そして最終的 に５０μΩのＴＥに再懸濁さ　れプこ。

８）電気穿孔法 チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはマウス骨髄腫細胞系ｐ３ｘ６ Ｂ−ａｇ８．６５３が、育てられ、中間の対数増殖期に収集された。該細胞は、 洗浄され、ＰＢＳ中に再懸濁され、生存可能な細胞数が作られた。該細胞は、そ の後ペレットされ、ｌＸｌＯ７細胞／　ｍ　、Ｑで再懸濁された。４０μｇの線 形にされたＤＮＡが、１ｍＭの細胞に添加され、１５分間、水上に放置された。

８００　Ｖ／２５μＦの１パルスが、商品として入手可能な電気穿孔性装置（バ イオラッド　ジエーン　パルサー（ＢＩＯＲＡＤ　ＧＥＩすＥＰＩＪＬＳＥｌｌ ｉ’）−商標）を用いて該細胞に与えられた。該細胞は、さらに１５分間、氷と で温置され、その後、２００μｇのウェル（ｗｅｌｌ）毎に調整された培地（Ｄ ＭＥＭ、５％ＦＣ８％Ｐｅｎ／Ｓ　ｔ　ｒ　ｅｐ、グルタミン）を有す１０Ｘ９ ６のウェルプレート（ｗｅｌｌρｆａｔｅｓ）かまたは皿ごとに１５ｍｌ５の培 地を有す１０Ｘ１５の皿に塗布され、−晩生温室された。２４時間後、該培地は 、取除かれ、キサンチン（２５０，ｃｚｚ／ｍΩ）、マイコフェール酸（ｍｙｃ ｏｐｈｅｎｏｌ　１ｃ）（５μｇ　／　ｍΩ）およびＩ　Ｘ　ヒポキサンチン− チミジン（ＨＴ）を含有する選択的培地と取り替えられた。該細胞が、３日毎に 供給された。

約１４日後に、ｇｐｔ耐性コロニーは、幾つかのウェル（ｗｅｌｌｓ）中に、お よびプレート（ｐｌ、ａｔｅｓ）上に明らかにある。

該プレート（ｐｌａｔｅｓ）は、各ウェル（ｗｅｌｌ）またはプレート（ｐｌａ ｔｅ）からアリコート培地を取除くことによりプラスミノーゲン用のＥＬ　Ｉ　 ＳＡ分析を使用して分析された。プラスミノーゲンを生産するクローンは、拡大 され、該発現レベルは、最良の生産物の選択をさせるべく検査された。

９）ヒトプラスミノーゲン用ＥＬ　Ｉ　５ＡＥＬ　Ｉ　ＳＡプレー）　（ｐｌａ ｔｅｓ）　（ブローバインド（Ｐｒｐ−Ｂｊｎｄ）、ファルコン（ト’ａ　ｌ　 Ｃｏｎりは、被覆緩衝液（Ｎａ２　Ｃ０３（１０，Ｈ２０）　４．０ｇ５Ｈ２０ １す・ントル当りＮａＨｃＯ３２，９３ｇ５ｐＨ９，６）　へ１　：　１０００ に希釈された５０μ、Ｑ　／ウェル（ｗｅｌ　ｌ）の悪型抗ヒトプラスミノーゲ ン血清（シグマ）で被覆され、４°で一晩生温室された。被覆溶液は、その後取 除かれ、プレート（ｐｌａｔｅｓ）は、１５分間、室温で５０ｕ１／ウエル（ｗ ｅｌｌ）のＰＢＳｌｏ、１％カゼインで温置された。ブレーｈ　（ｐｌａｔｅｓ ）は、その後ＰＢＳ１０．０５％トウイーン２０で３回洗浄された。プラスミノ ーゲンまたはＰＢＳ／トウィーンで希釈された標準のサンプルは、該ブレー１” 　（ｐｌａｔｅ）に添加され、２時間、室温で温置された。該ブレーｈ　（ｐｉ ａｔｅｓ）が、その後ＰＢＳ／トゥイーンで３回洗浄され、さらにモノクローナ ル抗ヒトプラスミノーゲン抗体（アメリカン　ディアゴアスティカ（Ａｍｅｒｉ ｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）、ニューヨーク、ＵＳＡ）のＰＢＳ／トウイ ーンでの１　：　１０００の希釈５０μΩ／ウエル（ｗｅｌ　Ｉ）が、添加され 、１時間、室温で温置された。該ブｌノー　１・（ｐｌ　ａｔｅｓ）は、再度Ｐ ＢＳ／トウイーンで３回洗浄され、さらに悪型抗マウスＩｇＧ（シグマ）に抱合 されたセイヨウワサビベルオキシターゼの５０μｍ／ウェル（ｗｅｌｌ）が、添 加され、１時間、室温で温置された。

該プレート（ｐｌａｔｅｓ）は、ＰＢＳ／トウイーンで５回洗浄され、さらにベ ルオキシターゼ基質（０，ＩＭ酢酸ナトリウム／１００ｍｇ／リッターの３．３ ’　、５．５’　〜テトラメチルベンジジンを含有するクエン酸緩衝液　ｐＨ６ ，０および１３ｍＭのＨ２０２）１００ｐΩ／ウエル（ｗｅｌｌ）で温置された 。該反応は２．５Ｍのスルホン酸２５μｇ／ウェル（ｖｅｉｌ）の添加により約 ５分後に停止され、４５０μＭでの吸光度がプレートリーダー（ｐｌａｔｅｒｅ ａｄｅｒ）て読まれ／こ。

１０）プラスミノーゲン変異体の精製 プラスミノーゲン変異体は、リシン　セファロース　４ビイ（商品名：　５ＥＰ ＨＡＲＯ３Ｅ　４Ｂ）（７ｙ−マシカ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　）のクロマトグ ラフィーにより一段階で精製される。カラムは、０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩 衝液ｐＨ７，５の少なくとも１０カラム容積で平衡させられた。該カラムは、標 準としてヒト　グルタミン酸−プラスミノ−ケンを使用するＥＬ　Ｉ　ＳＡによ り決定される場合に０．６ｍｇのプラスミノーゲン変異体につき１ｍΩレジンの 割合で調製された培地が充填されている。典型的に、４００ｍｇのプラスミノー ゲンを含有する調製された培地は、４°で５６ｍｇ／　ｃ　ｍ、　／　ｂの一次 流速で１０ｍ、、Ｑカラム（Ｈ＋　Ｄ＝４）に適用される。充填が完了した後、 該カラムは、非特異結合タンパク質が溶離されるのが止むまで０゜５ＭのＮａＣ １を含有する０、０５Ｍ’ｌＪン酸緩衝液ｐＨ７，５の最小限５カラム容積で洗 浄された。結合タンパク質の脱着は、非イオン水　ｐＨ７，０に０，２Ｍのε− アミノ−カプロン酸の適用により達成される。溶離は、２カラム容積を必要とし 、１７ｍ（１／ｃｍ／ｈの一次流速で実行される。純度をチェックすべきＳＤＳ 　ＰＡＧＥによる分析に従い、ε−アミノ−カプロン酸が、続いて取除かれ、５ ＥＰＨＡＤＥＸ　Ｇ−２５Ｍ　（ファーマシ力（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を含有 するＰＤＩＯカラム、使い捨て商品、が予め充填されたクロマトグラフィーによ り安定な緩衝液、例えば、トリス、ＰＢＳＳＨＥＰＥＳまたは酢酸と取り替えら れた。（ここで５ＥＰＨＡＤＥＸは、商標である。）典型的に、０．３ｍｇ／ｍ Ωの濃度の各プラスミノーゲン変異体２．５ｒｔＪが製造業者の教授にしたがっ て進められた。

プラスミノーゲンを含有する分画は、Ａ２Ｂ。により決定される場合、その後、 プールされる。

１１）切断 プラスミノーゲン類縁体は、還元条件下で、ＳＤＳ　ＰＡＧＥを使用するするタ ンパク質活性化因子により切断に対する磁化率が算定される。０．１２５ｍΩの １００ｍＭトリス　ＨＣΩ　ｐＨ７，４および１ｍＭのＣａ”の典型的なインキ ュベーション容積は、実施例に示す濃度のプラスミノーゲン類縁体および実施例 に示す濃度の活性化因子Ｘａまたはトロンビンから構成される。インキュベーシ ョンは、３７°Ｃで行われる。制限インキュベーションは、活性化因子の存在し ないときと同じ条件下で行われる。該活性化反応は、２０％の最終濃度へトリク ロロ酢酸の添加により該タンパク質を沈殿すること、および４時間以上４℃で放 置することにより停止される。該沈殿物は、その後、ペレットされ、アセトンで 洗浄され、ＳＤＳ　ＰＡＧＥサンプル緩衝液（０，１ｍ）リス　ｐＨ６，８，１ ０％グリセロール、１％　ＳＤＳ、０．５％　メルカプトエタノールおよび０． ０５％　ブロモフェノール　ブルー）中に再！Ｍ！ｍされる。該サンプルは、８ −２５％勾配ゲルかまたは１２％ゲルで分析された。得られたゲルは、該ゲルを 走査し、ピーク下の面積を測定することにとりバンドのタンパク質濃度を計算す るＳＨＩＭＡＤＺＵ　ゲル　スキャナーを用いて分析された。（ここでＳＨＩＭ ＡＤＺＵは、商標である。）プラスミノーゲンの切断速度は、すなわち、約９２ ｋＤａでのプラスミノーゲンバンドの消失および約６６ｋＤａでのプラスミン重 鎮バンドの発現を測定することにより決定された。

１２）活性化 １２．１　フィブリン血餅溶解分析 フィブリン溶解分析において、プラスミン活性は、フィブリンアガロースゲルに （フィブリン溶解するために）展開するクリアランスゾーンの発現により検出さ れる。該ゲルは、１％低くゲルになる温度のアガロースゲルにされ、１ｍｇ／ｍ Ωの最終濃度に０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｇ中に溶解されたプラスミノーゲン− 遊離フィブリノーゲンを添加することにより０．１Ｍｈリス　ＨＣρ　ｐＨ７， ４，０，１５Ｍ　ＮａＣΩ、２ｍＭ　ＣａＣｌ２中で緩衝化される。６ユニツト のトロンビンが、該フィブリノーゲンをフィブリンに変えるために添加され、そ の後、ＧＥＬ−ＢＯＮＤのシート上に注がれ、放置された。（ここでＧＥＬ−Ｂ ＯＮＤは商標である。）使用する前に、ウェル（ｗｅｌｌＳ）は、該ゲル中に穴 をあけられ、そして該アガロース栓が取除かれた。５−１０Ｍｇのサンプルが、 該ウェル（ｗｅｌｌＳ）へ充填され、そして該ゲルは、−晩生（ニア−２０時間 ）、または発生するべき溶解ゾーンのため適当な時間、３７°Ｃの湿度槽に温置 された。該ゲルは、その後、１時間、７゜５％酢酸に浸漬され、１−１０分間フ ァーストグリーン（２％溶液）中で染色され、さらに、少なくとも２時間、４０ ％メタノール、１０％酢酸で着色を取除かれた。該ゲルは、その後、水気を切ら れ、乾燥するために一晩生３７℃放置された。溶解ゾーンの直径は、測定するこ とができ、該標準、例えば、ｔＰＡまたはｕ−ＰＡで活性化される野生型プラス ミノーゲンにより作られたそれらと比較させることができる。

１２．２　線状色素産生バクテリア分析および活性化経過時間 プラスミノーゲン類縁体（１２，５μｇ）は、１２５μｇの１００ｍＭ　トリス 　ＨＣ，１７ｐＨ７，４および１ｍＭＣａＣΩ２を含有する緩衝液中に３７°Ｃ でロンビン（２，８μｇ）と共に温置された。アルコートは、時々取除かれ、上 記に記載したものと同様の色素産生バクテリア分析に含まれるプラスミンについ て分析された。トロンビンが活性化剤として用いられた場合、該トロンビン阻害 剤ヒルジンが、活性化反応を停止すべく僅かにモルが過剰に添加され、そして該 サンプルは、−７０℃で貯蔵された。

因子Ｘａか活性化剤として用いられた場合、サンプルは、活性化反応を停止すべ くただちに素早く凍結される。プラスミンは、トリペプチド色素産生バクテリア 基質、５２２５１（カビ（Ｋａｂｉ））の切断を用いて測定された。アリコート サンプル（２５μｇ）は、９６ウエルプレート（ｗｅｌｌ　ｐｆａｔｅｓ）　Ｃ コスタ−（Ｃｏｓｔａｒ））中に、０．６ｍＭ　５２２５１を含有する７５μｇ 緩衝液（５０ｍＭトリス　ＨＣΩ、０．１Ｍ　ＥＤＴＡ、０．０００５％トリト ン　Ｘ１００、ｐＨ８，０）と混合された。該プレート（ｐｌａｔｅｓ）は、２ 時間、３７℃で温置された。該反応は、０，５Ｍ酢酸２５μΩを添加することに より終了し、該吸光度が、自動プレート（ｐｌａｔｅ）リーダー（ダイナチック （Ｄｙｎａｔｅｃｈ））を用いて４０５ｎｍで読まれた。測量は、標準プラスミ ン標品と比較して行われた。

１２．３　連鎖色素産生バクテリア分析色素産生バクテリア分析の修飾は、より 直接的に変異プラスミノーゲンの活性化経過時間を測定するために展開された。

当該分析において、変異プラスミノーゲンおよび活性化剤は、４０５ｎｍでの吸 光度増加に導（色素産生バクテリア基質を直接的に切断する活性により生産され る５２２５１およびプラスミンの存在と共に温室される。該分析は、総容ｆｆ１ ８８０　μｎの５０ｍＭトリス　ＨＣ，Ｑ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．００５ ％Ｉ・リドン　Ｘ１００および０．１％ＨＳ　Ａを含釘する緩衝液中で行われた 。該色素産生バクテリア基質５２２５１が、最終的な濃度０．　３５ｍｇ／ｍｊ ２まで添加され、用いられた該変異タンパク質濃度は、３μｇ／ｍΩであった。

トロンビン活性の場合に、トロンビンは、最終濃度１または０．２μｇ／ｍｌま で添加された。因子Ｘａは、最終濃度１．５または０．３μｇ／ｍｌまで添加さ れた。アリコート１００μｇの反応物は、時々取除かれ、反応を停止させるため マイクロタイタープＩ／−ト（ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ　ｐｌａｔｅｓ）に、４％ 酢酸２５μｇが添加された。経過時間の終結で、プレート（ｐｌａｔｅｓ＞は、 ４０５ｎｍの波長でマイクロブＩノーｈ　（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）レーダーが 読まれた。当該分析において、プラスミン発生を定量化する試みはなされなかっ た。

図２ 図２ ！４ＱＥＶＮＬＥＰＦＩＧＱＥＺＥＶＳＲＬＦ’ＬＡＣＡＣＣＡＡＧＡＡＧＴＧ ＭＴＣＴＣＧＡＡＣＣＧＣＡ丁ＣＧＴＣＡＧ（ａＡＡＴＡＧＡＡＧＴＣ＋ＴＣＴ ＡＧＧＣＴＧＴＴＣτＴ図２ ＱＬＰＶＩＥＮＫＶＣＮＲＹ！Ｆ’ＬＮＧＲＶＣ（ＡＧＣＴＣＣＣＴＧＴＧＡＴ ＴＧＡＱＡＡτＡＡＡＧ（’ＧでＧＣ入ＡτＣＧＣＴＡτＧＡＣ？ＴτＣＴＧＡ ＡＴＧＧＡＡＧＡＧＴＱ５Ｔｌ！ＬＣＡＧＨＬＡＧＧＴＤＳＣＱＧＤＣＣＡＡＴ 　ＣＣＡＣＣＧＡＡＣＴ　ＣＴＧＴＧＣＴＧＧＧ　ＣＡＴＴＴＧＧＣＣＧＧＡＧ Ｇ　ＣＡＣＴＧＡＣＡＧＴＴＧ（ＣＡＧＧＧ？’fＡ ＳＧＧＰＬＶＣｒＥＫＤＫＹＩＬＱＧＶＴＳＣＡＧＴＧＧＡＧＧＴＣＣＴＣＴＧ ＧＴ？ＴＧ（ＴＴＣＧＡＱＡＡＧＱＡＣ入入ＡＴＡＣＡＴ’！’τＴＡＣＡＡＧ ＧＡＧＴＣＡＣＴＴＣ２３５０２３６０２３７０２３６０２３り０　２４００Ｗ ＧＬＧＣＡＲＰＮＫＰＧＶＹＶＲＶＳＲＦ’！”１０ＧＧＧＴＣＴＴＧＧＣＴＧ ＴＧＣＡＣＧＣＣＣＣＡＡＴＡＡＧＣＣＴＧＧＴＧＴＣＴＡ’ｌ’ＧＴＴＣＧＴ ＣＴ？ＴＣＡＡＧＧＴs ＶＴＷ　工　ＥＧＶＭＲＮＮ ＴＧＴＴＡＣＴＴＧＧＡＴ？ＧＡＧＧＧＡＧＴＧＡＴＧＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴ八 八ＴτＧＧＡＣＧＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＧＡＣＧＣ２４７０へへ８０　２４９ ０　２５００　２５１０　２５２０ＧＴＴＡ？ｒＴＴＣＴＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡ ＴＴＣＴＧＴＡＧＴＪｌ！ＧＯτＧＡＣＡＴＡＧＣＴＡＴ（ＪＩＣＡ？ＴＴＯＴ ＴＡＡＡＪＩＡＴＡＡＡＣＴＣＴＧＴＡＣＴτ入八ＣＴＴＴＧＡ’ｌ’τＴＣ入 ＧτＡＡＡＴττＴＧＧＴ’ｌ−τＧＧＴＣＴＴＣ入ＡＣＡ図４ ＣＣＧ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＴＧＴ　ＧＧＴ　ＴＡＣＡＴＡ　ＧＡＣＧＧＡ　ＡＧ Ｇ　ＧＴＴ　ＧＴＧ　ＧＧＧ　ＧＧＧ　ＴＧＴ図５ トロンビン　でき Ｖａｎ　ＯＬｙ　Ｃ；Ａｙ　Ｃｙｓ τ１３ＶａＬＯ１ｌ！１ｏＬｙｓＬｙａＣｙｓｖａｌＶａＬＰｒｏ八（９Ｖａｌ ＶａＬＧコ、ｙＧｌｙＣｙｓ図５ Ｔ１４　ＶａＬ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　 Ｐｒｏ　八ｒｇ　ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　（ｙｓＴ１７ＶａｌＧｌｕ ＰｒｏＬ：）’ｓＬ’ｆＳＣＹＳｐｒｏＳｅ＋：ＧｌｙＡｒｇＶａｌＶａ１．Ｇ ｌｙＧｌｙＣｙＳＴ１９　ＶａＬ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ＣＹ！ｌ 　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　乙ｅｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｒ■ Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ＣｙｓＴ２０　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｐｌ′ｏ　 Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　ＧＬｕ　Ｌａｕ　Ｇｌｎ　ＧＩＹ　Ｖａｎ　 Ｖａｌ　ｐｒｏ　ＡｒP１ Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ Ｔ２ＬＬａｕＧＬｕＰｒｏＧｌｕＬｅｕＣｙｓＧｌｙＶａｌＶａｌＰｒｏＡｒｇ ＶａｌＶａｌＧｌｙＧＬｙＣｙｓＴ２２　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ｒ 、ａｕ　Ｃｙｓ　ＧＬｙ　ＶａＬ　Ｖａｎ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　ＶａＬ　Ｖａｌ　 Ｇｌｙ　ＧＬ凵@Ｃｙｓ ＣＴＣＧＡＧ　ＣＣＧ　ＣＡＡ　ＣＴＡ　ＴＧＴ　ＧＧＡ　ＧＴＴ　ＧＴＧ　Ｃ ＣＴ　ＡＧＧ　ＧＴＡ　ＧＴＧ　ＧＧＧ　ＧＧＧ　ＴＧＴフィブリン寒天血餅溶 解ゲル ウェルズ１および２＝Ｘ２プラス因子Ｘａウエルズ３および４＝Ｘ２マイナス因 子Ｘａウエルズ２，４．６および８はサンプルを充填する前にヒルジンで前処理 された。

図６ 時間（分） ゴ　Ｔ１９の開始濃度＝１００μｇ／ｒｒＪ図９ ＳＤＳ　ＰＡＧＥ上の切断分析 レーン１　因子Ｘａで切断されたＸ２ レーン２　Ｘ２マイナス因子Ｘａ レーン３　トロンビンで切断されなＴ２レーン４　Ｔ２マイナストロンビン レーンラ　タンパク質マーカー 図１０ トロンビンでのＴ１９の切断速度 時間（分） 要約 活性化可能なフィブリン溶解および抗血栓症タンパク質タンパク様化合物は、フ ィブリン溶解または血餅生成阻害活性を有するために凝固カスケードの酵素によ り活性化し得るものである。例えば、プラスミノーゲン類縁体は、トロンビンま たは因子Ｘａによりプラスミンに活性化し得るものである。フィブリン溶解また は血餅生成阻害活性は、そのため、血餅生成部位に直接作用が成される。

補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　４年　６月　８日 特許庁長官　深　沢　亘　殿　Ｄ笥 １、国際出願番号 ＰＣＴ／ＧＢ９０１０１９１２ ２、発明の名称 活性化可能なフィブリン溶解および抗血栓症タンパク質３、特許出願人 住　所　イギリス国　オックスフォード　オーエックス４５エルワイ。

コーレイ２　ワトリング）・ン　ロード（番地ない名　称　ブリティッシュ　バ イオテクノロジー　リミテッド代表者　リトルウッド、ポール 国　籍　イギリス国 ４、代理人 住　所　東京都千代田区二番町１１番地９ダイアパレス二番町６、添付書類の目 録 （１）補正書の写しくＨ訳文〕　１ａ 実施例２４−Ｔ１３の活性化 精製されたＴ１３タンパク質は、実施例２３に記載されたと同様の連鎖色素分析 を用いて分析された。当該分析の結果を、時間と共に４０５　ｎ、　ｍの吸光度 での増加が、Ｔ１３はトロンビンにより活性化されることを実証することを図７ に示す。活性化は、また実施例２６に記載するような直接色素分析を使用して検 出された。

実施例２５−７１７の活性化 精製されたＴ１７タンパク質は、実施例２３に記載されたと同様の連鎖色素分析 を用いて分析された。当該分析はトロンビンが７１７を活性化することを実証し た。

実施例２６−７１９の活性化 精製されＩ＝Ｔ１９タンパク質は、実施例２３に記載されたと同様の連鎖色素分 析を用いて分析された。当該分析の結果を、時間と共に４０５ｎｍの吸光度での 増加が、Ｔ１９はトロンビンにより活性化されることを実証することを図７に示 す。

変異タンパク質Ｔ１９は、また活性化により発生されるプラスミン定量させる直 接色素分析を使用して分析された（方法１２．２参照）。当該分析の結果を、時 間と共にプラスミン発生が、Ｔ１９はトロンビンにより活性化されることを実証 することを図８に示す。

請求の範囲′ １、タンパク様化合物か、プラスミン活性を得るために活性化し得るプラスミノ ーゲン類縁体であることを特徴とするフィブリン溶解活性を有すべきまたは血餅 生成を阻害すべき血液凝固に関係する酵素により活性化し得るタンパク様化合物 。

２３　血液凝固に関係する該酵素が、カリクレイン、因子ＸＩＩ　ａ、　Ｘ　Ｉ 　ａ、　ＩＸａ、■ａ、Ｘａ、　トロンビン（因子■ａ）または活性タンパク質 Ｃである請求の範囲第１項に記載の化合物。

３、血液凝固に関係する該酵素が、因子Ｘａまたはトロンビンである請求の範囲 第１項または第２項に記載の化合物。

４、血液凝固に関係する該酵素が、因子Ｘａである請求の範囲第１項または第２ 項に記載の化合物。

５、Ｐ４が疎水性残基を表１−１Ｐ３が酸性残基を表す該切断部位配列Ｐ４−Ｐ ３−グリシン−アルギニンからなる請求の範囲第４項に記載の化合物。

６、該疎水性残基が、イソロイシンである請求の範囲第５項に記載の化合物。

７、血液凝固に関係する該酵素が、Ｉ・ロンビンである請求の範囲第］、項また は第２項に記載の化合物。

８、各々Ｐ４およびＰ３が独立に疎水性残基を表し、各々ＰＩ’およびＰ２’が 非酸性残基を表す該切断部位配列Ｐ４−Ｐ３−プロリン−アルギニン−ＰＩ’− Ｐ２’からなる請求の範囲第７項に記載の化合物。

９．該残基Ｐ２およびＰ１′の一方がグリシンを表し、他方が任意のアミノ酸残 基を表す該切断部位配列Ｐ２−アルギニン−ＰＩ’　からなる請求の範囲第７項 に記載の化合物。

１０、該切断部位配列グリシン−プロリン−アルギニンからなる請求の範囲第７ 項に記載の化合物。

１１．５５５番目のプロリンから５６６番目のンステインまでの残基をすべて含 んだ１またはそれ以上のアミノ酸置換、付加または欠損を有する請求の範囲第１ 項に記載の化合物。

１２．１またはそれ以上の付加、欠損または置換である（野生型グルタミン酸− プラスミノーゲンに比べた場合）１またはそれ以上の他の修飾を含む請求の範囲 第１項または第１１項に記載の化合物。

１３、共役逐次アミノ酸残基と共におよび／または結合オリゴおよび／またはポ リペプチドからなる方法である請求の範囲第１項ないし第１２項のいずれか１つ に記載のタンパク様化合物の調製方法。

１４、請求の範囲第１項ないし第１２項のいずれか１つに記載のタンパク様化合 物の暗号化合成または組換え核酸。

１５、ベクターである請求の範囲第１４項に記載の核酸。

１６、共役逐次ヌクレオチドと共におよび／または結合オリゴおよび／またはポ リヌクレオチドからなる方法である請求の範囲第１４項に記載の核酸の調製方法 。

１７、タンパク質の遺伝情報を指定するまたはクーロン化部位を具体化する第１ 核酸配列、強プロモーターおよびヒトシトメガロウイルスから誘導されるエンハ ンサ−配列を含む第２核酸配列への効力のある連鎖、ＳＶ４０から誘導されたポ リアデニル化（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）配列を暗号化する第３核酸配 列およびＳＶ４０プロモーターから発現された選択可能なマーカーのための暗号 および選択可能なマーカー配列の３′末端で付加ＳＶ４０ポリアデニル化（ｐｏ ｌｙａｄｅｎｙ　ｌ　ａｔ　１ｏｎ）信号を有する第４核酸配列からなるベクタ ー。

１８、該第１核酸配列が、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン類縁体の遺 伝情報を指定する請求の範囲第１７項に記載のベクター。

１９、請求の範囲第１５項、第１７項または第１８項に記載のベクターで形質転 換され、または移入される細胞または細胞系。

２０、連続培養で増殖する哺乳類細胞からなる請求の範囲第１９項に記載の細胞 系。

２１、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン類縁体を発現するために形質転 換されるチャイニーズハムスター卵巣細胞。

２２、請求の範囲第１項ないし第１２項のいずれか１つに記載の１またはそれ以 上の化合物および医薬的または獣医学的に許容し得る担体からなる医薬組成物。

補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法第１８４条の８） 毛成　４年　６月　８日 特許庁長官　深　沢　亘　殿　国 １、国際出願番号 ＰＣＴ／ＧＢ９０１０１９１２ ２、発明の名称 活性化可能なフィブリン溶解および抗血栓症タンパク質３、特許出願人 住　所　イギリス国　オックスフォード　オーエックス４５エルワイ。

コーレイ、ワトリングトン　ロード（番地なし）名　称　ブリティッシュ　バイ オテクノロジー　リミテッド代表者　リトルウッド２ポール 国　籍　イギリス国 ５、補正書の提出年月日 １９９２年　３月１０日 １５、ベクターである請求の範囲第１４項に記載の核酸。

１６、共役逐次ヌクレオチドと共におよび／または結合オリゴおよび／またはポ リヌクレオチドからなる方法である請求の範囲第１４項に記載の核酸の調製方法 。

１７、タンパク質の遺伝情報を指定するまたはクーロン化部位を具体化する第１ 核酸配列、強プロモーターおよびヒトシトメガロウイルスから誘導されるエンハ ンサ−配列を含む第２核酸配列への効力のある連鎖、ＳＶ４０から誘導されたポ リアデニル化（ｐｏ　ｌ　ｙａｄｅｎｙ　Ｉ　ａｔ　１ｏｎ）配列を暗号化する 第３核酸配列およびＳＶ４０プロモーターから発現されたｇｐｔ選択可能なマー カーのための暗号および選択可能なマーカー配列の３′末端て付加ＳＶ４０ポリ アデニル化（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）信号を有する第４核酸配列から なるベクター。

１８、該第１核酸配列が、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン類縁体の遺 伝情報を指定する請求の範囲第１７項に記載のベクター。

１９、請求の範囲第１５項、第１７項または第１８項に記載のベクターで形質転 換され、または移入される細胞または細胞系。

２０、連続培養で増殖する哺乳類細胞からなる請求の範囲第１９項に記載の細胞 系。

２１、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン類縁体を発現するために形質転 換されるチャイニーズハムスター卵巣細胞。

２２．請求の範囲第１項ないし第１２項のいずれが１つに２載の１またはそれ以 上の化合物および医薬的または獣医学的に許容し得る担体からなる医薬組成物。

補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　４年　６月　８８ １、国際出願番号 ＰＣＴ／ＧＢ９０１０１９１２ ２、発明の名称 活性化可能なフィブリン溶解および抗血栓症タンパク質３、特許出願人 住　所　イギリス国　オックスフォード　オーエックス４５エルワイ。

コーレイ、ワトリングトン　ロード（番地ない名　称　ブリティッンユ　バイオ テクノロジー　リミテッド代表者　リトルウッド、ポール 国　籍　イギリス国 ４、代理人 住　所　東京都千代田区二番町１１番地９ダイアパレス二番町５、補正書の提出 年月日 １９９２年　３月１７日 ２２゜請求の範囲第１項ないし第１２項のいずれか１つに記載の１またはそれ以 上の化合物および医薬的または獣医学的に許容し得る担体からなる医薬組成物。

２３、請求の範囲第１１項ないし第１２項のいずれか１つに記載の化合物の該投 与の実効、無害な世からなる血栓性の病気の治療または予防の方法。

２４、ヒトまたは獣医薬に用いるための請求の範囲第１項ないし第１２項のいず れか１つに記載のタンパク様化合物。

２５、血栓崩壊または抗血栓剤の調製での請求の範囲第１項ないし第１２項のい ずれか１つに記載の化合物の使用。

国際調査報告 １−ｅｍｍ　Ｍｅ４ｍｌＩＭ　Ｎ＠　ＰＣＴ＋’ＧＢ　タ０１０４９１２１ａ＋ ｓｍＵｍｉ＋ｌ　Ａｓｓｖｃａｍｓ　Ｎ＠　ＰＣＴｌ’ＧＢ　９０１０１９１２ 国際調査報告 国際調査報告

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．タンパク様化合物が、プラスミン活性を得るために活性化し得るプラスミノ ーゲン類縁体であることを特徴とするフィブリン溶解活性を弄すべきまたは血餅 生成を阻害すべき血液凝固に関係する酵素により活性化し得るタンパク様化合物 。
2. ２．血液凝固に関係する該酵素が、カリクレイン、因子ＸＩＩａ、ＸＩａ、ＩＸ ａ、ＶＩＩａ、Ｘａ、トロンビン（因子ＩＩａ）または活性タンパク質Ｃである 請求の範囲第１項に記載の化合物。
3. ３．血液凝固に関係する該酵素が、因子Ｘａまたはトロンビンである請求の範囲 第１項または第２項に記載の化合物。
4. ４．血液凝固に関係する該酵素が、因子Ｘａである請求の範囲第１項または第２ 項に記載の化合物。
5. ５．Ｐ４が疎水性残基を表し、Ｐ３が酸性残基を表す該切断部位配列Ｐ４−Ｐ３ −グリシン−アルギニンからなる請求の範囲第４項に記載の化合物。
6. ６．該疎水性残基が、イソロイシンである請求の範囲第５項に記載の化合物。
7. ７．血液凝固に関係する該酵素が、トロンビンである請求の範囲第１項または第 ２項に記載の化合物。
8. ８．各々Ｐ４およびＰ３が独立に疎水性残基を表し、各々Ｐ１′およびＰ２′が 非酸性残基を表す該切断部位配列Ｐ４−Ｐ３−プロリン−アルギニン−Ｐ１′− Ｐ２′からなる請求の範囲第７項に記載の化合物。
9. ９．該残基Ｐ２およびＰ１′の一方がグリシンを表し、他方が任意のアミノ酸残 基を表す該切断部位配列Ｐ２−アルギニン−Ｐ１′からなる請求の範囲第７項に 記載の化合物。
10. １０．該切断部位配列グリシン−プロリン−アルギニンからなる請求の範囲第７ 項に記載の化合物。
11. １１．５５５番目のプロリンから５６６番目のシステインまでの残基をすべて含 んだ１またはそれ以上のアミノ酸置換、付加または欠損を有する請求の範囲第１ 項に記載の化合物。
12. １２．１またはそれ以上の付加、欠損または置換である（野生型グルタミン酸− プラスミノーゲンに比べた場合）１またはそれ以上の他の修飾を含む請求の範囲 第１項または第１１項に記載の化合物。
13. １３．共役逐次アミノ酸残基と共におよび／または結合オリゴおよび／またはポ リペプチドからなる方法である請求の範囲第１項ないし第１２項のいずれか１つ に記載のタンパク様化合物の調製方法。
14. １４．請求の範囲第１項ないし第１２項のいずれか１つに記載のタンパク様化合 物の暗号化合成または組換え核酸。
15. １５．ベクターである請求の範囲第１４項に記載の核酸。
16. １６．共役逐次ヌクレオチドと共におよび／または結合オリゴおよび／またはポ リヌクレオチドからなる方法である請求の範囲第１４項に記載の核酸の調製方法 。
17. １７．タンパク質の遺伝情報を指定するまたはクーロン化部位を具体化する第１ 核酸配列、強プロモーターおよびヒトシトメガロウイルスから誘導されるエンハ ンサー配列を含む第２核酸配列への効力のある連鎖、ＳＶ４Ｏから誘導されたポ リアデニル化（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）配列を暗号化する第３核酸配 列およびＳＶ４Ｏプロモーターから発現されたｇｐｔ選択可能なマーカーのため の暗号および選択可能なマーカー配列の３′末端で付加ＳＶ４Ｏポリアデニル化 （ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）信号を有する第４核酸配列からなるベクタ ー。
18. １８．該第１核酸配列が、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン類縁体の遺 伝情報を指定する請求の範囲第１７項に記載のベクター。
19. １９．請求の範囲第１５項、第１７項または第１８項に記載のベクターで形質転 換され、または移入される細胞または細胞系。
20. ２０．連続培養で増殖する哺乳類細胞からなる請求の範囲第１９項に記載の細胞 系。
21. ２１．プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン類縁体を発現するために形質転 換されるチャイニーズハムスター卵巣細胞。
22. ２２．請求の範囲第１項ないし第１２項のいずれか１つに記載の１またはそれ以 上の化合物および医薬的または獣医学的に許容し得る担体からなる医薬組成物。
23. ２３．請求の範囲第１項ないし第１２項のいずれか１つに記載の化合物の該投与 の実効、無害な量からなる血栓性の病気の治療または予防の方法。
24. ２４．ヒトまたは獣医薬に用いるための請求の範囲第１項ないし第１２項のいず れか１つに記載のタンパク様化合物。
25. ２５．血栓崩壊または抗血栓剤の調製での請求の範囲第１項ないし第１２項のい ずれか１つに記載の化合物の使用。