JP2014525235A - プラスミノーゲンおよびプラスミンの変異体 - Google Patents

Abstract

本発明は、プラスミンのプロテアーゼ活性の自己触媒的破壊を低減または防止する、触媒ドメイン中の１つまたは複数の点突然変異を含むプラスミノーゲンおよびプラスミンの変異体に関する。プラスミノーゲンおよびプラスミンの前記変異体を使用する組成物、用途、および方法も開示される。

Description

本発明は、プラスミンのプロテアーゼ活性の自己触媒的破壊を低減または防止する、触媒ドメイン中の１つまたは複数の点突然変異を含むプラスミノーゲンおよびプラスミンの変異体に関する。プラスミノーゲンおよびプラスミンの前記変異体を使用する組成物、用途、および方法も開示される。

酵素前駆体プラスミノーゲンの活性化は、線維素溶解活性／血栓溶解活性のあるセリンプロテイナーゼであるプラスミンの形成をもたらす。内因性プラスミノーゲンの活性化は、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、もしくはｔＰＡ、またはそれらの任意の変異体などのプラスミノーゲン活性化因子の投与によって誘発または増強することができる。活性化すると、プラスミノーゲンタンパク質は、５つのクリングルドメインを含む重鎖と触媒ドメインを含む軽鎖とにタンパク質分解的に切断される。両鎖は２つのジスルフィド結合を介して互いに対して保持される。活性化後、自己分解的切断により、重鎖からＮ末端セグメント（ヒトプラスミンの７８個のアミノ酸；ウシプラスミンの７７個のアミノ酸）が除去され、ウシプラスミン重鎖ではさらに、クリングル３と４との間で自己触媒的な切断が起こることがあり、その結果、ミディプラスミン（ｍｉｄｉｐｌａｓｍｉｎ）が生じる（非特許文献１）。ヒトプラスミノーゲン中のＲ５６１−Ｖ５６２ペプチド結合の切断により誘発される、プラスミノーゲンのプラスミンへの活性化により、軽鎖中に大きな構造変化が誘導され、前記変化により、前記軽鎖内の触媒三残基のプライミングまたは活性化がもたらされる。ストレプトキナーゼおよびスタフィロキナーゼなどの細菌性プラスミノーゲン活性化因子は、プラスミノーゲンと複合体を形成し、プラスミノーゲンのＲ５６１−Ｖ５６２ペプチド結合の切断なしで、プラスミノーゲンの触媒部位が、活性化因子−プラスミノーゲン複合体形成に際しての構造変化により活性化される（プラスミノーゲン活性化機序は、例えば、非特許文献２の緒言に要約されている）。

プラスミノーゲン活性化因子は間接的な血栓溶解剤として作用するが、その代わりにプラスミンそれ自体を直接的な線維素溶解／血栓溶解剤として使用することが提案されている。しかしながら、そのような直接使用は、プラスミンが、多くのプロテアーゼと同様に、生成物阻害を受ける二次カイネティクスの後に続く自己触媒的タンパク質分解を受けやすいという事実によって妨げられている（非特許文献３）。

１９６０年代初期に、プラスミンが酸性ｐＨで、あるいはリジンなどのアミノ酸が存在する条件下にて中性ｐＨで安定化され得ることが確立された。それにもかかわらず、プラスミンがｐＨ３．８で保存されているときでも、Ｌｙｓ１０４、Ａｒｇ１８９、およびＬｙｓ６２２（リジン−プラスミンに対する番号付け）の後の自己分解的切断が報告された（特許文献１）。プラスミンが一層低いｐＨ２．２で保存される場合には、位置Ａｓｐ６２、Ａｓｐ１５４、およびＡｓｐ３４６のＡｓｐ−Ｐｒｏ（Ｄ−Ｐ）の間で、非自己分解的酸切断が生じる（特許文献１）。これは、見かけ上自己触媒的分解がもはや生じない点までｐＨを低下させることができるが、そのｐＨでは酸加水分解が不安定化の要因になり始めることを示す。特許文献１には、プラスミンのペプチド結合が中性ｐＨで（自己触媒的）加水分解を受けやすいことについての情報はない。プラスミンの公知の安定剤としては、Ｊｅｓｐｅｒｓｅｎらにより開示された（非特許文献３）、グリセロール、十分に高いイオン強度、フィブリノーゲン、およびε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）が挙げられる。リジンおよびリジン誘導体（ＥＡＣＡおよびトラネキサム酸など）ならびにｐ−アミノメチル安息香酸（ＰＡＭＢＡ）も、公知のさらなる安定剤の一部である（非特許文献４；非特許文献５）。特許文献２には、酸性条件での保存にもかかわらず、プラスミン分解に寄与するプラスミン凝集体が形成されることが報告されている。ポリヒドロキシ化合物の添加によりこの問題を解決する方法が特許文献２に提供されている。プラスミンを安定化する他の方法には、オリゴペプチド化合物の添加が挙げられる（例えば、特許文献３）。あるいは、プラスミンの触媒部位を、誘導体化、例えばアシル化によって可逆的にブロックすることができる（特許文献４）。プラスミンのペグ化も、酵素を安定化する手段として提案されている（特許文献５）。

短縮型のプラスミン以外にプラスミン変異体がいくつか記載されており、キメラマイクロプラスミン（特許文献６）および２つの鎖の切断部位に点突然変異を有する変異体（特許文献７）または触媒三残基アミノ酸に点突然変異を有する変異体（非特許文献６；非特許文献７）が挙げられる。Ｗａｎｇら（非特許文献８）は、アミノ酸位置５４５、５４８、５５０、５５５、５５６、５５８、５６０〜５６４、５８５、７４０、および７８８における、広範な一連のマイクロプラスミノーゲン突然変異体について報告した。アミノ酸位置５５８および５６６のシステインがセリンに置換されている二重突然変異体がＬｉｎｄｅらにより報告された（非特許文献９）。Ｔａｋｅｄａ−Ｓｈｉｔａｋａら（非特許文献１０）は、アミノ酸位置６０１にあるアラニンのスレオニンへの置換を含む変異を有し、活性が減少したプラスミン変異体に言及している。上記で言及したアミノ酸位置はすべて、アミノ酸位置１のＧｌｕから始まるＧｌｕ−プラスミノーゲンに対する位置である。非切断性プラスミノーゲン変異体（重鎖と軽鎖との間に切断が生じない）が特許文献８に記載されている。Ｄａｗｓｏｎら（非特許文献１１）は、位置７１９にＡｒｇの代わりにＧｌｕがあるＧｌｕ−プラスミノーゲン変異体（Ｒ７１９Ｅ）のストレプトキナーゼへの親和性が減少していることを記載している。Ｊｅｓｐｅｒｓら（非特許文献１２）は、Ａｌａスキャンにおいて、一連のファージディスプレイマイクロプラスミノーゲンの単一部位突然変異体Ｈ５６９Ａ、Ｒ６１０Ａ、Ｋ６１５Ａ、Ｄ６６０Ａ、Ｙ６７２Ａ、Ｒ７１２Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｔ７８２Ａ、Ｒ７８９Ａを産生し、位置７１９のアルギニンがスタフィロキナーゼとの相互作用にとって重要であること；Ｄ６６０Ａ突然変異体は、発現が極めて少ないため、さらに詳細には特徴づけられないこと；Ｒ７１９Ａ突然変異体のみがさらに可溶型で産生されることを発見した。いずれの突然変異体も、タンパク質分解活性に著しい変化を示さなかった（基質Ｓ−２４０３）。非特許文献１２は、分析の中に活性部位突然変異体Ｓ７４１Ａも含めており、この突然変異体の結晶構造が、Ｗａｎｇら（非特許文献１３）に開示されている。ストレプトキナーゼ／プラスミノーゲン相互作用部位を解明するさらなる試みにおいて、Ｔｅｒｚｙａｎら（非特許文献１４）は、すでに突然変異している（Ｒ５６１Ａ）背景があるマイクロプラスミノーゲンの突然変異体をいくつか（Ｋ６９８Ｍ、Ｄ７４０Ｎ、Ｓ７４１Ａ）報告しており、Ｒ５６１Ａはプラスミノーゲンのタンパク質分解的活性化を妨げ、したがって活性マイクロプラスミンの形成を妨げる（これはストレプトキナーゼ−マイクロプラスミノーゲン複合体の接触−活性化機序の研究を複雑にするであろう）。非特許文献１４はさらに、二重突然変異体Ｒ５６１Ａ／Ｋ６９８Ｍとは明らかに機能的に差がない、「偶発性の」三重突然変異体Ｒ５６１Ａ／Ｈ５６９Ｙ／Ｋ６９８Ｍに言及している。Ｗａｎｇら（非特許文献１５）は、ストレプトキナーゼ／プラスミン（プラスミノーゲン）相互作用の研究において、Ｃｙｓ５３６ＡｌａおよびＣｙｓ５４１Ｓｅｒの背景がある、一連のマイクロプラスミノーゲン（Ｇｌｕ−プラスミノーゲンのアミノ酸５３０−７９１）変異体を産生した。これらの突然変異体には、上記のＲ５６１Ａ突然変異（非特許文献２）ならびにＲ５６１Ａ／Ｋ６９８Ｇ、Ｒ５６１Ａ／Ｋ６９８Ａ、およびＲ５６１Ａ／Ｋ６９８Ｑの二重突然変異体が含まれる。同じＣ５３６Ａ／Ｃ５４１Ｓの背景において、Ｋ６９８ＧおよびＫ６９８Ａの単一突然変異も導入されたが、そのうちのＫ６９８Ｇは、精製が困難なため、さらに詳細には特徴づけられなかった。上記の研究は、プラスミノーゲン／プラスミン分子の特徴をより一層理解することを目的としたため、プラスミノーゲン／プラスミン突然変異体の臨床上の有用性もしくは有益性または想定される臨床上の利点については、まったく報告がなされなかった。Ｐｅｉｓａｃｈら（非特許文献１６）は、Ｍ５８５Ｑ、Ｖ６７３Ｍ、およびＭ７８８Ｌ突然変異を含有するマイクロプラスミノーゲンの結晶構造の決定に成功した。

ＮｇｕｙｅｎおよびＣｈｒａｍｂａｃｈ（非特許文献１７）は、ウロキナーゼ活性化プラスミン（同種溶血素）の市販粗調製品の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいて、１０．０ｋＤａの「微量で未同定のタンパク質成分」の存在について報告した。ヒトプラスミンの自己分解がｐＨに依存して異なることが、ＳｈｉおよびＷｕ（非特許文献１８）によって詳細に記載されている。Ｏｈｙａｍａら（非特許文献１９）は、癌治療における非リジンアナログプラスミノーゲン修飾物質の使用を提案した。このような化合物は、プラスミンの自己タンパク質分解を増強し、アンジオスタチン形成の増強をもたらす（プラスミノーゲン活性化因子ウロキナーゼの存在下で）からである。非特許文献１９の表３には、自己タンパク質分解を増強する化合物に曝されたプラスミン内の１５ヵ所ほどの切断部位が収戴されている。先行研究の観点から彼らの観察を考察すると、自己タンパク質分解を増強する化合物は、多かれ少なかれ、Ｂ／軽鎖のタンパク質分解を選択的に増強しているように思われるが、自己タンパク質分解を増強する化合物の非存在下では、Ａ／重鎖およびＢ／軽鎖の両方の分解は最小限であることが見出された。

国際公開第０１／３６６０８号パンフレット 米国特許第４，４６２，９８０号明細書 米国特許第５，８７９，９２３号明細書 欧州特許第０００９８７９号明細書 国際公開第９３／１５１８９号パンフレット 国際公開第２００４／０４５５５８号パンフレット 米国特許第５，０８７，５７２号明細書 国際公開第９１／０８２９７号パンフレット

Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３０５，９７−１０２ Ｔｅｒｚｙａｎ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ５６：２７７−２８４ Ｊｅｓｐｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．１９８６，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４１，３９５−４０４ Ｕｅｈｓｉｍａ ｅｔ ａｌ．１９９６，Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ２４５，７−１８ Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ １９８５，Ｄｒｕｇｓ ２９，２３６−２６１ Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ ｅｔ ａｌ．１９９３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，５３７４−５３７７ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９５，９０３−９１４ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９５，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４，１７５８−１７６７および１７６８−１７７９ Ｌｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ，１９９８，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２５１，４７２−４７９ Ｔａｋｅｄａ−Ｓｈｉｔａｋａ ｅｔ ａｌ，１９９９，Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ ４７，３２２−３２８ Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３，１２０４２−１２０４７ Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７，６３８０−６３８６ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，２０００，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９５，９０３−９１４ Ｔｅｒｚｙａｎ ｅｔ ａｌ，２００４，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ５６，２７７−２８４ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，２０００，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６７，３９９４−４００１ Ｐｅｉｓａｃｈ ｅｔ ａｌ，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８，１１１８０−１１１８８ ＮｇｕｙｅｎおよびＣｈｒａｍｂａｃｈ，１９８１，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１，１５９−１７２ ＳｈｉおよびＷｕ，１９８８，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５１，３５５−３６４ Ｏｈｙａｍａ ｅｔ ａｌ，２００４，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２７１，８０９−８２０

上記の方法／変異体のいずれも、分子レベルで安定化したプラスミンを提供するという問題を解決しないことは明らかである。自己触媒的分解に本質的に抵抗性である触媒ドメインを有するプラスミン変異体（またはプラスミンが誘導され得る対応するプラスミノーゲン変異体）の提供は、効果的で安全な長期保存に向けた、また血栓溶解療法または眼の後部硝子体剥離もしくは硝子体液化の誘導などのプラスミンの効果的で安全な治療用途に向けた重要な前進となるであろう。

本発明は、単離したプラスミノーゲン変異体もしくはそれから得られるプラスミン変異体、または単離したプラスミン変異体、あるいは前記プラスミン変異体のいずれかのタンパク質分解活性のある誘導体または可逆的に不活性な誘導体に関するものであり、前記変異体は、活性化部位および触媒ドメインを含んでおり、前記触媒ドメインは、ヒトプラスミン触媒ドメインの位置１〜４に、または非ヒトプラスミン触媒ドメインのそれに対応する位置に１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含有することを特徴とし、前記ヒトプラスミン触媒ドメインは、ヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２に存在するバリンアミノ酸と同じである、位置１のアミノ酸バリンから始まる。より具体的には、前記触媒ドメインが位置１で突然変異している場合、（ｉ）プラスミン触媒ドメインに対して位置−１にあるアミノ酸は、アルギニン、リジン、または活性部位の機能性を維持する他のアミノ酸であり、（ｉｉ）ヒトプラスミン触媒ドメインの位置２４または非ヒトプラスミン触媒ドメインの対応する位置にあるアミノ酸は、メチオニンであり、かつ（ｉｉｉ）位置１のアミノ酸は、グリシンともプロリンとも異なるアミノ酸に突然変異している。あるいは、前記触媒ドメインが位置１および２で突然変異している場合、ヒトプラスミン触媒ドメインの位置２４または非ヒトプラスミン触媒ドメインの対応する位置にあるアミノ酸は、メチオニンである。

本発明によるプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体における１つまたは複数の変異により、発色性基質または生物学的基質による活性アッセイで測定すると、前記プラスミン変異体の自己タンパク質分解による分解の程度が、野生型プラスミンの自己タンパク質分解による分解の程度に比較して低減している。

本発明によるプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体は、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンまたはＧｌｕ−プラスミン、Ｌｙｓ−プラスミノーゲンまたはＬｙｓ−プラスミン、ミディプラスミノーゲンまたはミディプラスミン、ミニプラスミノーゲンまたはミニプラスミン、マイクロプラスミノーゲンまたはマイクロプラスミン、デルタプラスミノーゲンまたはデルタプラスミンであってもよい。

本発明によるプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体は、薬剤としての用途に特に興味が持たれており、薬学的に許容される希釈剤、担体、または補助剤の少なくとも１つをさらに含む組成物に、任意選択で含ませるおよび／または組み合わせることができる。そのような組成物は、抗凝血剤、血栓溶解剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、血管新生阻害剤、有糸分裂阻害剤、抗ヒスタミン剤、または麻酔剤の１つまたは複数をさらに含むことができる。

本発明はさらに、自己タンパク質分解に対して安定なプラスミン変異体についてスクリーニングするための方法であって、前記方法が、
（ｉ）本発明によるプラスミン変異体を準備すること、および野生型プラスミンを準備することと、
（ｉｉ）（ｉ）で準備した変異体プラスミンおよび野生型プラスミンの自己タンパク質分解に対する安定性を比較することと、
（ｉｉｉ）タンパク質分解活性を保持し、かつ野生型プラスミンの自己タンパク質分解に対する安定性と比較して、自己タンパク質分解に対する安定性が増大している変異体を、（ｉｉ）から選択することと
を含む方法に関する。

本発明はさらに、本発明によるプラスミノーゲン変異体を産生するための方法であって、前記方法が、
（ｉ）本発明によるプラスミノーゲンをコードする核酸を、前記プラスミノーゲンを発現することができる適切な宿主細胞に導入するステップと、
（ｉｉ）（ｉ）で得られた宿主細胞を、前記宿主細胞で前記プラスミノーゲンを発現するのに十分な条件および期間で増殖させるステップと、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で発現したプラスミノーゲンを回収するステップと
を含む方法に関する。

本発明はさらに、本発明によるプラスミン変異体を産生するための方法であって、前記方法が、
（ｉ）本発明によるプラスミノーゲンをコードする核酸を、前記プラスミノーゲンを発現することができる適切な宿主細胞に導入するステップと、
（ｉｉ）（ｉ）で得られた宿主細胞を、前記宿主細胞で前記プラスミノーゲンを発現するのに十分な条件および期間で増殖させるステップと、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で発現したプラスミノーゲンを回収するステップと、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）のプラスミノーゲンをプラスミンに活性化するステップと
を含む方法に関する。

本発明はまた、本発明によるプラスミノーゲン変異体またはプラスミン変異体をコードする単離した核酸配列およびそのような核酸を含む組換えベクターに関する。上記の核酸またはベクターで形質転換された宿主細胞も本発明の一部である。

野生型ヒトＧｌｕ−プラスミノーゲン（１〜７９１）およびプラスミン触媒ドメイン（１〜２３０、アミノ酸配列および番号を太字で示す）のアミノ酸位置に二重に番号を付けたアミノ酸配列を示す。本発明を実証するために使用するマイクロプラスミノーゲンはアミノ酸位置５４３（Ｇｌｕ−プラスミノーゲンに対する番号）から始まる。クリングルドメイン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ３６４５１に含まれる情報に由来する）は、四角で囲まれ、そのアミノ酸配列は、標準体とイタリック体で交互にタイプされている。触媒三残基アミノ酸は丸囲みされている。 ＧｅｎＢａｎｋから検索された哺乳動物プラスミノーゲンタンパク質のアミノ酸配列アライメントを示す。配列アラインメントは、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイトを介して利用可能であるＣＯＢＡＬＴソフトウェア（Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ−ｂａｓｅｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ；Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ ＆ Ａｇａｒｗａｌａ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３：１０７３−７９，２００７）を用いて、デフォルト設定で実行した。▼：Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの始まりの表示。アミノ酸の番号は、ヒトプラスミノーゲンに対する番号である。 図２−１に同じ。 図２−１に同じ。 図２−１に同じ。 図２−１に同じ。 図２−１に同じ。 図２−１に同じ。 図２−１に同じ。 図２−１に同じ。 図２−１に同じ。 図２−１に同じ。 図２−１に同じ。 ３０ｎｇのマイクロプラスミンＶａｌ１Ｉｌｅ変異体の注射５日後に誘導された後部硝子体剥離の写真（１０倍）を示す。

本発明は、プラスミン分子中、より具体的には、プラスミン分子の触媒ドメイン中の点突然変異の自己タンパク質分解に対する効果について研究した結果に基づいている。プラスミンによる切断を受けやすいペプチド結合は、リジンまたはアルギニンのＣ末端側に位置する（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９７２，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２５８，５７７−５９０）。プラスミン触媒ドメイン（ヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンではアミノ酸位置５６２のバリンから始まる）のアミノ酸のほぼ１０％（２３０個のうちの２２個）が、リジンまたはアルギニンである。理論的には、１つのプラスミン分子中にある、これらのリジンおよびアルギニンのＣ末端側ペプチド結合はすべて、前記リジンまたはアルギニンのＣ末端側アミノ酸の構造とは無関係に、別のプラスミン分子によりタンパク質分解的に切断され得る。さらに、理論的には、これらのリジンまたはアルギニンのいずれか１つまたは複数の非リジン非アルギニンアミノ酸への突然変異は、プラスミン分子の自己タンパク質分解による分解に対する抵抗性を高めるであろう。この理論は、国際公開第２０１１／００４０１１号パンフレットに記載されるように、正しいことが判明した。本発明は、触媒ドメインのＮ末端に位置する野生型アミノ酸、すなわち、触媒ドメインの位置１〜４にあるアミノ酸の非野生型アミノ酸への突然変異が、得られた変異プラスミンによるタンパク質分解の能力を保持させると同時に、その変異プラスミンの自己タンパク質分解による分解に対する抵抗性を大幅に増大させるという予期しない観察に基づいている。

本発明は、単離したプラスミノーゲン変異体もしくはそれから得られるプラスミン変異体、または単離したプラスミン変異体、あるいは前記プラスミン変異体のいずれかのタンパク質分解活性のある誘導体または可逆的に不活性な誘導体に関するものであり、前記変異体は、活性化部位および触媒ドメインを含んでおり、前記触媒ドメインは、ヒトプラスミン触媒ドメインの位置１〜４に、または非ヒトプラスミン触媒ドメインのそれに対応する位置に１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含有することを特徴とし、前記ヒトプラスミン触媒ドメインは、ヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２に存在するバリンアミノ酸と同じである、位置１のアミノ酸バリンから始まる。より具体的には、前記触媒ドメインが位置１で突然変異している場合、（ｉ）プラスミン触媒ドメインに対して位置−１にあるアミノ酸は、アルギニン、リジン、または活性部位の機能性を維持する他のアミノ酸であり、（ｉｉ）ヒトプラスミン触媒ドメインの位置２４または非ヒトプラスミン触媒ドメインの対応する位置にあるアミノ酸は、メチオニンであり、かつ（ｉｉｉ）位置１のアミノ酸は、グリシンともプロリンとも異なるアミノ酸に突然変異している。あるいは、前記触媒ドメインが位置１および２で突然変異している場合、ヒトプラスミン触媒ドメインの位置２４または非ヒトプラスミン触媒ドメインの対応する位置にあるアミノ酸は、メチオニンである。具体的には、上記のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体は、触媒ドメインの位置１にあるアミノ酸バリンのイソロイシンへの突然変異を含む。

本発明によるプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体における１つまたは複数の変異により、発色性基質または生物学的基質による活性アッセイで測定すると、前記プラスミン変異体の自己タンパク質分解による分解の程度が、野生型プラスミンの自己タンパク質分解による分解の程度に比較して低減している。

実施例の部で説明されるように、上記の１つまたは複数の突然変異以外の突然変異も、プラスミン触媒ドメインに存在することがある。

本発明によるプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体は、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンまたはＧｌｕ−プラスミン、Ｌｙｓ−プラスミノーゲンまたはＬｙｓ−プラスミン、ミディプラスミノーゲンまたはミディプラスミン、ミニプラスミノーゲンまたはミニプラスミン、マイクロプラスミノーゲンまたはマイクロプラスミン、デルタプラスミノーゲンまたはデルタプラスミンであってもよい。

所与の位置にあるアミノ酸の「非野生型アミノ酸」または「天然アミノ酸とは異なるアミノ酸」への突然変異は、野生型のプラスミノーゲンまたはプラスミンの前記所与の位置にあるアミノ酸の、前記野生型のプラスミノーゲンまたはプラスミンの前記所与の位置にある野生型または天然のアミノ酸とは異なる任意のアミノ酸への変化であると見なされる。突然変異の選択に関する考察をさらに続ける。

当業者ならば、野生型アミノ酸が突然変異し得る他のアミノ酸を容易に決定することができるであろう。そのような決定には、アミノ酸のサイズ、アミノ酸の電荷、アミノ酸の極性、および／またはアミノ酸の疎水性親水性指標などの基準が、必ずしも必須でないが、包含され得る（表１を参照のこと）。さらに、プラスミノーゲンおよびマイクロプラスミンの結晶構造（ＭＭＤＢ ＩＤ：１２７１７；ＰＤＢ ＩＤ：１ＤＤＪ；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９５，９０３−９１４）が利用できることは、得られる変異プラスミンまたはプラスミノーゲン分子がタンパク質分解活性を保持するような突然変異アミノ酸を同定しやすくする点で大いに価値がある。さらに、所与の位置［Ｐ＋／ｎ］および任意選択でさらに所与の位置Ｐ、Ｐ’、Ｐ”等の１つまたは複数の位置にある野生型アミノ酸を、所与の群のアミノ酸のいずれか１つに突然変異させることが同様な結果をもたらすことになると予想することができる。表１に基づいて、前記所与の群を以下のように定義することができる：
− 疎水性の脂肪族アミノ酸：Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、およびＶａｌ
− 疎水性の芳香族アミノ酸：Ｐｈｅ
− 親水性の酸性アミノ酸：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、およびＧｌｎ
− 親水性の塩基性アミノ酸：Ａｒｇ、Ｌｙｓ、およびＨｉｓ
− 中程度疎水性の脂肪族アミノ酸：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ
− 中程度疎水性の芳香族アミノ酸：ＴｙｒおよびＴｒｐ。

これらのうちで、突然変異の目的のためには、ＣｙｓおよびＰｒｏは、遊離し得るチオール基がＣｙｓにより生成するため、またはタンパク質構造がＰｒｏにより一層広範囲に撹乱されるため、野生型プラスミンまたはプラスミノーゲンアミノ酸の置換アミノ酸としては好ましくないことがある。他のアミノ酸置換としては、位置［Ｐ＋／−ｎ］にある、また任意選択でさらにプラスミン（プラスミノーゲン）触媒ドメインの位置Ｐ、Ｐ’、Ｐ”等の１つまたは複数の位置にある野生型アミノ酸の、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、またはシトルリンなど、非天然もしくは非標準アミノ酸またはアミノ酸アナログへの突然変異が挙げられる（一層広範囲なリストについては、例えば、Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００４，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７３，１４７−１７６を参照のこと）。

ヒトプラスミン（プラスミノーゲン）中のアミノ酸「に対応する」非ヒトプラスミン（プラスミノーゲン）配列中のアミノ酸の同定（すなわち、「対応する」アミノ酸の同定）には、第１に、両アミノ酸配列のアライメントが含まれる。そのようなアライメントは、最大の同一性および相同性を得るために、アライメントする配列の一方または両方にマイナーギャップを導入することなど、いくつかの最適化を必要とすることがある。第２に、ヒトプラスミン（プラスミノーゲン）中のアミノ酸にアライメントされる非ヒトプラスミン（プラスミノーゲン）中のアミノ酸が同定され、本明細書では「対応する」アミノ酸と呼ばれる。本明細書の図２に、公的に利用可能な哺乳動物プラスミノーゲンタンパク質配列のそのようなアライメントを示し、ヒトプラスミノーゲン配列（列１）中にある、本発明にとって特に興味のあるアミノ酸を、非ヒトプラスミノーゲン配列（列２〜１８）の対応するアミノ酸と共に強調して示す。特に興味のあるアミノ酸Ｐ、Ｐ’等は、位置６９８のＬｙｓ（触媒ドメインでは位置１３７、図１を参照のこと）、位置７０８のＬｙｓ（触媒ドメインでは位置１４７、図１を参照のこと）、および位置７１９のＡｒｇ（触媒ドメインでは位置１５８、図１を参照のこと）である。

「プラスミン」は、フィブリノリジンまたはリゾフィブリン（ｌｙｓｏｆｉｂｒｉｎ）としても知られるが、酵素前駆体プラスミノーゲンの活性化から生じるセリン型プロテアーゼである。活性化は、アミノ酸５６１と５６２（ヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンに対する番号）との間のタンパク質分解性の切断の結果である。プラスミンは、５つのクリングルドメインを含む重鎖と、触媒ドメインを含む軽鎖とを保持する。プラスミノーゲンは、例えばリジンアフィニティークロマトグラフィーによって、血漿から濃縮することができる（Ｄｅｕｔｓｃｈ ＆ Ｍｅｒｔｚ，１９７０，Ｓｃｉｅｎｃｅ １７０，１０９５−１０９６）。プラスミン分子の短縮（プラスミン触媒ドメインの内側および／または外側）は、触媒ドメインの機能が保持される限り可能であり、したがって、そのような短縮により、プラスミンの「タンパク質分解活性のある誘導体」が形成される。そのため、５つのクリングルドメインの１つまたは複数のドメインを、全体的にまたは部分的に欠失させることができる。したがって、１つまたは複数のクリングルドメインを欠く短縮プラスミンおよび／または１つまたは複数のクリングルドメインの一部を欠く短縮プラスミンは、プラスミンのタンパク質分解活性のある誘導体の例として、本明細書で想定される。プラスミンの短縮変異体の例としては、これらに限定されないが、「ミディプラスミン」、「ミニプラスミン」、「マイクロプラスミン」、および「デルタ−プラスミン」が挙げられる。ミディプラスミンは、基本的にクリングルドメイン１〜３を欠いている（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３０５，９７−１０２）。ミニプラスミンは、元は、エラスターゼによるプラスミンの限定消化により得られたもので、基本的にクリングルドメイン１〜４を欠いている（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ５６７，４７２−４８１；Ｐｏｗｅｌｌ ＆ Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ，１９８０，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５５，５３２９）。その後、ミニプラスミンは組換えにより作製されている（国際公開第２００２／０５０２９０号パンフレット）。マイクロプラスミンは、元は、高いｐＨでプラスミンをインキュベートすることにより得られたもので、基本的にクリングルドメインをすべて欠いている（例えば、国際公開第８９／０１３３６号パンフレット）。高いｐＨでプラスミンをインキュベートすることにより得られたマイクロプラスミンは、重鎖のカルボキシ末端アミノ酸３０〜３１個を含有しているが、組換えにより作製されたマイクロプラスミン変異体は、重鎖のカルボキシ末端アミノ酸１９個を含有している（国際公開第２００２／０５０２９０号パンフレット）。これは、マイクロプラスミン属などの所与のプラスミン属内の分子多様性の可能性を例示する（例えば、複数の種がマイクロプラスミン属を形成する）。デルタ−プラスミンは、クリングルドメイン１が触媒ドメインと直接連結している、プラスミンの組換えバージョンである（国際公開第２００５／１０５９９０号パンフレット）。プラスミンの上記の短縮変異体はそれぞれ、「ミディプラスミノーゲン」、「ミニプラスミノーゲン」、「マイクロプラスミノーゲン」、および「デルタ−プラスミノーゲン」の活性化により得られる。活性化が可能であるためには、短縮プラスミノーゲンは、クリングルドメイン（ミニプラスミンではクリングル５ドメインなど）と触媒ドメインまたはクリングルがより少ない短縮プラスミンの場合には触媒ドメインのＣ末端との間に最小限の数のリンカーアミノ酸を含む必要がある（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４，１７５８−１７６７を参照のこと）。本発明の文脈では、プラスミノーゲンは「無傷の活性化部位」を含むことが望ましい可能性があり、ここで「無傷の活性化部位」とは、プラスミノーゲンのプラスミンへの活性化／変換が、おそらく異なるカイネティックスによるものではあるが、野生型プラスミンで起こるのと同様に起こり得るように、少なくともアミノ酸５６１および５６２（ヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンに対して；または非ヒトプラスミノーゲン中の対応するアミノ酸）がなっていることを意味する。プラスミンまたはその活性短縮変異体の代わりとして、活性化可能なプラスミノーゲンまたはその短縮変異体を本発明の文脈において使用することができる（例えば、欧州特許第０４８０９０６号明細書；米国特許第５，３０４，３８３号明細書；欧州特許第０６３１７８６号明細書；米国特許第５，５２０，９１２号明細書；米国特許第５，５９７，８００号明細書；米国特許第５，７７６，４５２号明細書を参照のこと）。「プラスミノーゲン」は、プラスミノーゲンの任意の形態、例えばＧｌｕ−プラスミノーゲンまたはＬｙｓ−プラスミノーゲン（位置６８からＡｒｇで開始、または位置７７もしくは７８からＬｙｓで開始）を指す。活性化可能なプラスミノーゲンまたはその活性化可能な短縮変異体を使用する場合、プラスミンへの活性化は、遅延する可能性はあるが、典型的には、器官、組織、または体液との接触後、すなわち、被験体への投与後に生じることになる。さらに別の代替案では、本発明の文脈において、プラスミンまたはその活性短縮変異体を、プラスミノーゲン活性化因子（組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼまたはスタフィロキナーゼ、またはその任意の変異体など；例えば、米国特許第６，７３３，７５０号明細書；米国特許第６，５８５，９７２号明細書；米国特許第６，８９９，８７７号明細書；国際公開第０３／３３０１９号パンフレットを参照）と組み合せた活性化可能なプラスミノーゲンまたはその活性化可能な短縮変異体に置き換えることができる。さらにまた別の代替案では、（ｉ）プラスミンまたはその誘導体、（ｉｉ）活性化可能なプラスミノーゲンまたはその活性化可能な誘導体、および任意選択で、（ｉｉｉ）プラスミノーゲン活性化因子の任意の混合物を、本発明の文脈において使用することができる（例えば、米国特許出願公開第２００４／００８１６４３号明細書を参照のこと）。プラスミン（またはプラスミノーゲン）は、その安定性を保証するために、一般に、低温（例えば、摂氏＋４度または摂氏−２０度）で保存する。保存組成物は、低ｐＨ組成物（ｐＨ４以下；例えば、クエン酸などの酸１ｍＭ〜２５０ｍＭで得られる、例えば、Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ ＆ Ｓｏｄｅｔｚ，１９７６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ４５，２７３−２８６；国際公開第０１／３６６０８号パンフレット；国際公開第０１／３６６０９号パンフレット；国際公開第０１／３６６１１号パンフレットを参照のこと）または高グリセロール含量組成物（３０〜５０％ｖ／ｖ、例えば、Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ ＆ Ｓｏｄｅｔｚ，１９７６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ４５，２７３−２８６）などの安定化組成物であってもよく、あるいは、例えば、アミノ酸（例えば、リジンまたはＥＡＣＡまたはトラネキサム酸などのリジンアナログ）、糖（例えば、マンニトール）、または当技術分野で公知の任意の安定剤（例えば、ジペプチド、国際公開第９７／０１６３１号パンフレット）を含む１つまたは複数のさらなる安定剤組成物の中に入れても、その安定剤組成物と組み合わせてもよい。種「プラスミン」にはさらに、プラスミン（もしくはその活性短縮プラスミン変異体）の任意の活性誘導体、または活性化可能なプラスミノーゲン（もしくはその活性化可能な短縮変異体）の同様の誘導体が含まれる。そのような誘導体としては、例えば、Ｔｃ^９９−標識プラスミン（Ｄｅａｃｏｎ ｅｔ ａｌ．１９８０，Ｂｒ Ｊ Ｒａｄｉｏｌ ５３，６７３−６７７）などの標識プラスミンもしくはプラスミノーゲン（またはそれらの短縮変異体）、あるいはペグ化もしくはアシル化プラスミンもしくはプラスミノーゲン（またはそれらの短縮変異体；欧州特許第９８７９号明細書、国際公開第９３／１５１８９号パンフレット）が挙げられる。他の任意の標識（放射性、蛍光性等）も、プラスミンまたはプラスミノーゲンの誘導体を作製するために使用することができる。前記誘導体としてはさらに、例えばフィブリン結合分子（ｔＰＡのクリングル２、アポリポタンパク質のクリングル、ｔＰＡもしくはフィブロネクチンのフィンガードメイン、またはフィブリン結合抗体のＦａｂドメインなど）と融合した、例えば本発明による短縮プラスミンまたはプラスミノーゲンを含む、ハイブリッドまたはキメラのプラスミンまたはプラスミノーゲン分子が挙げられる。

自己タンパク質分解に対する抵抗性（すなわち、安定性）に関する、野生型プラスミンと、本発明によるプラスミン変異体またはプラスミン誘導体との比較は、タンパク質分解活性を比較するための方法と同様の方法、例えば、発色性の活性アッセイ、または例えばフィブリン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン、ラミニン、もしくはコラーゲンをベースとした生物学的基質アッセイで行うことができる。

自己タンパク質分解に対する抵抗性を判定するために、自己分解速度定数を決定することができる。本発明によるプラスミノーゲン変異体から得られるプラスミンを含む本発明によるプラスミン変異体、または本発明による任意のプラスミン誘導体は、野生型プラスミンの自己分解速度定数よりも少なくとも５％、または少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９９％、もしくは９９．５％低い自己分解速度定数によって、あるいは野生型プラスミンの自己分解速度定数の最大で９５％、または最大で０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、もしくは９０％である自己分解速度定数によって特徴づけることができる。指示されたパーセンテージを決定するために、その計算を絶対自己分解速度定数の値に基づいて行うことができる。例えば、野生型マイクロプラスミンについては、自己分解速度定数として１２３Ｍ^−１ｓ^−１が決定され、一方マイクロプラスミン変異体ＶＩＩについては、自己分解速度定数として３３Ｍ^−１ｓ^−１が決定された（実施例を参照のこと）。したがって、ＶＩＩ変異体の自己分解速度定数は、野生型マイクロプラスミンの自己分解速度定数の２６．８％である。

さらに、本発明によるプラスミノーゲン変異体から得られるプラスミンを含む本発明による任意のプラスミン変異体、または任意の前記プラスミンの誘導体は、野生型プラスミンのタンパク質分解活性とは異なる（高いかまたは低い）タンパク質分解活性を保持してもよく、この活性は、例えば発色性の活性アッセイ、または例えばフィブリン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン、ラミニンもしくはコラーゲンをベースとした生物学的基質アッセイで測定される。

本発明によるプラスミノーゲン変異体から得られるプラスミンを含む本発明によるプラスミン変異体、または本発明による任意のプラスミン誘導体のタンパク質分解活性は、単位時間当たりに各酵素部位が生成物に変換する基質分子の数の尺度である触媒定数ｋ_ｃａｔにより、野生型プラスミンのタンパク質分解活性と比較することができる。したがって、本発明によるプラスミノーゲン変異体から得られるプラスミンを含む本発明による任意のプラスミン変異体、または本発明による任意のプラスミン誘導体は、野生型プラスミンのｋ_ｃａｔ値の＋１００％〜−９０％または＋５０％〜−５０％の範囲にあるｋ_ｃａｔ値によって、すなわち、野生型プラスミンのｋ_ｃａｔ値の１０％〜２００％または５０％〜１５０％の範囲にあるｋ_ｃａｔ値によって特徴づけることができる。指示されたパーセンテージを決定するために、その計算を絶対ｋ_ｃａｔ値で行うことができる。例えば、野生型マイクロプラスミンのｋ_ｃａｔは４６ｓ^−１であり、一方マイクロプラスミン変異体Ｋ１３７Ｍのｋ_ｃａｔは３６ｓ^−１である（国際公開第２０１１／００４０１１号パンフレットの実施例４／表３を参照のこと）。したがって、Ｋ１３７Ｍ変異体のｋ_ｃａｔは野生型マイクロプラスミンのｋ_ｃａｔの７８．３％である。

本発明によるプラスミノーゲン変異体から得られるプラスミンを含む本発明によるプラスミン変異体、または本発明による任意のプラスミン誘導体のタンパク質分解活性を、野生型プラスミンのタンパク質分解活性と比較する別の方法には、ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍを比較することが含まれる。より高い、同等、または若干低いｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ値が好ましいが、本発明によるプラスミノーゲン変異体から得られるプラスミンを含む本発明によるプラスミン変異体、または本発明による任意のプラスミン誘導体のｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍが、野生型プラスミンのｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍと比較して、最大１０００倍または最大５００倍低下しても、なお許容され得る（以下を参照のこと）。例を挙げると、Ｖ１Ｉマイクロプラスミン変異体のｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍは１×１０^６と決定され、一方野生型のプラスミンのｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍは６．９×１０^５と決定される（実施例を参照）、すなわち、Ｖ１Ｉマイクロプラスミンのｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ値が、野生型のマイクロプラスミンのｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ値よりも１．４５倍高い。

あるいは、本発明によるプラスミノーゲン変異体から得られるプラスミンを含む本発明による任意のプラスミン変異体、または本発明による任意のプラスミン誘導体は、自己分解速度定数データとｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍデータとを組み合わせることにより、野生型プラスミンと比較することができる。例えば、野生型プラスミンと比較して自己分解速度定数が１／２０であり、かつ野生型プラスミンと比較してｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍが１／１０であるプラスミン変異体は、野生型プラスミンよりも２倍優れていることになる。明らかに最終的な用途次第であるが、低いタンパク質分解活性を有する、極めて安定なプラスミン（すなわち、自己タンパク質分解による分解がないか、ほとんどない）が、例えば、目的の臨床効果を達成するために、低いが持続性のプラスミン活性が所望されるまたは要求さえされる場合には、極めて望ましい可能性がある。そのため、低いタンパク質分解活性を有する、そのような高度に安定なプラスミン変異体は、除放性の担体または補助剤を実際に使用する現実的な必要性もなく、除放性製剤と実質的に同等になるであろう。

本発明によるプラスミノーゲン変異体から得られるプラスミンを含む本発明による任意のプラスミン変異体、または本発明による任意のプラスミン誘導体を比較するためのさらに別の代替案では、自己分解速度定数とｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍとを組み合わせることにより、野生型プラスミンと比較することができる。

さらに、本発明によるプラスミノーゲン変異体から得られるプラスミンを含む本発明による任意のプラスミン変異体、または本発明による任意のプラスミン誘導体は、上記に定義した自己分解速度定数、触媒定数ｋ_ｃａｔ、および／またはｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍの任意の組合せによって特徴づけることができる。

明らかに、上記のものなどの任意の比較測定のためには、プラスミン変異体をそれらの最も近縁な野生型プラスミンと比較すること、例えば、マイクロプラスミン変異体を野生型マイクロプラスミンと比較すること、またはミニプラスミン変異体を野生型ミニプラスミンと比較することが望ましい。さらに明らかなことには、いかなる活性測定の場合でも、本発明によるプラスミン変異体の可逆的に不活性化された誘導体は、可逆的な不活性化（例えば、アシル化または非最適ｐＨ）の原因を取り除くことにより最初に活性化されるべきである。

本発明によるプラスミノーゲン変異体またはそれから得られるプラスミン、本発明によるプラスミン変異体の任意のものは、Ｇｌｕ−プラスミンのＧｌｕ−プラスミノーゲン、Ｌｙｓ−プラスミノーゲンまたはＬｙｓ−プラスミン、ミディプラスミノーゲンまたはミディプラスミン、ミニプラスミノーゲンまたはミニプラスミン、マイクロプラスミノーゲンまたはマイクロプラスミン、デルタプラスミノーゲンまたはデルタプラスミンであってもよい。

プラスミン種にタンパク質分解活性があるか否かを判定するためのアッセイが多数存在する。容易で直接的なアッセイは、試料中に存在するプラスミンによる発色性基質の分解に基づいており；発色性基質としては、タンパク質分解性の切断と同時にｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）を放出するＳ−２４０３（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ）およびＳ−２２５１（Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ）が挙げられる。形成されたｐＮＡの量は吸光度４０５ｎｍで測定することができる。プラスミン活性を測定するための他のアッセイには電位差測定法がある。比色定量法（発色性基質を使用する）および電位差測定法は、例えば、ＣａｓｔｅｌｌｉｎｏおよびＳｏｄｅｔｚ（１９７６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ４５，２７３−２８６）に記載されている。プラスミン活性を測定するためのさらに別のアッセイは、カゼイン分解法である（例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓ ＆ Ｓｕｍｍａｒｉａ，１９７０，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １９，１８４−１９９；Ｒｕｙｓｓｅｎ ＆ Ｌａｕｗｅｒｓ，１９７８，Ｃｈａｐｔｅｒ ＩＸ − Ｐｌａｓｍｉｎ，Ｉｎ ”Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｚｙｍｅｓ”，Ｓｔｏｒｙ−Ｓｃｉｅｎｔｉａ，Ｇｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ，ｐｐ．１２３−１３１）。プラスミン活性を測定するためのさらに別のアッセイは、線維素溶解法である（例えば、Ａｓｔｒｕｐ ＆ Ｍｕｌｌｅｒｔｚ，１９５２，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ４０，３４６−３５１）。他のタンパク質基質を使用して、さらなる活性アッセイを容易に設計することができる。明らかに、そのようなアッセイはまた、酵素の自己タンパク質分解による分解に起因する、プラスミンのタンパク質分解活性の経時的な消失を追跡するために使用することができる。本発明のプラスミン変異体または任意の活性短縮変異体もしくは誘導体の安定性を評価するための代替法として、前記プラスミン変異体を野生型プラスミンの存在下でインキュベートしてもよく、野生型プラスミンによる消化に対するプラスミン変異体の抵抗性をモニターすることができる。

病変、創傷、潰瘍化した傷（縫合創の潰瘍形成など）等からの壊死成分または壊死組織片の除去におけるプラスミンの使用は、例えば米国特許第３，２０８，９０８号明細書に記載されている。同様に、熱傷治療のためのプラスミンを含む治療用製剤の局所適用が、例えば米国特許第４，１２２，１５８号明細書に開示された。壊死組織切除は、残存している健全な組織の治癒を改善、または促進するために、壊死、損傷、および／または感染した組織を除去することを指す。そのような除去は、外科的、機械的、もしくは化学的な手段により、または壊死組織を選択的に食する、特定の種の生きている蛆虫（蛆療法）により行うことができる。壊死組織切除はまた、酵素を使用して実施しても、酵素を補助的に使用してもよく、この方法は酵素的壊死組織除去と呼ばれる。壊死組織切除は、熱傷および他の重度の創傷の治癒過程の重要な一側面であり、ある種のヘビ咬傷の治療においても同様に使用される。酵素的壊死組織除去（単独で、または他のタイプの壊死組織切除との併用で）におけるプラスミン（または上記の任意のプラスミン変異体もしくは誘導体、またはその代替物）の適用は、創傷治癒の増進または促進において、また皮膚移植などの外科的処置の補助として特に有用である。

プラスミン（または上記の任意のプラスミン変異体もしくは誘導体、またはその代替物）のより広く知られた用途は、一般的に言えば、１つまたは複数の病的なフィブリン沈着の治療に関する。フィブリン沈着は身体の多種多様な病的状態に起因する。例えば、フィブリンを含有する血餅が組織内の血管で形成されると、深部静脈、冠状動脈、脳動脈、または網膜静脈の閉塞症または血栓症が起こり得る。フィブリンのわずかな蓄積は、切迫した重篤な血栓症の警告に先行するものであり、またその警告を与え得るものである。例としては、不安定狭心症が挙げられるが、これは切迫した冠状動脈血栓症および一過性脳虚血発作の警告と考えられ、脳卒中に先行することがある。フィブリンはさらに、感染、自己免疫疾患、および癌などの多くの疾患過程に付随する炎症に関連して、組織内に沈着することが多い。フィブリンが沈着する他の状況は、微生物による感染を原因とする膿瘍の周辺である。フィブリン沈着はさらに、特定の固形腫瘍に付随して見出されることが多い。フィブリン沈着はまた、例えば線維柱帯切除術を含む外科的処置から生じるものを含めて、あらゆるタイプの創傷の治癒中に起こる恐れがある。フィブリン沈着のさらに別の状況は、網膜静脈におけるフィブリン蓄積であり、これは、網膜変性、視力障害、または視力喪失にもつながる恐れがある。病的なフィブリン沈着という用語はさらに、カテーテル、カテーテルデバイス、または人工血管および合成、ヒト、もしくは動物由来でフィブリンを含む閉塞により効果的に遮蔽される移植片などの他の挿入物の中またはその先端に形成または存在するような沈着物を包含する。用語「カテーテルデバイス」は、体内に挿入できる任意のカテーテルまたはチューブ状のデバイスを指し、これには、動脈カテーテル、心臓カテーテル、中心静脈カテーテル、静脈内カテーテル、末梢挿入中心静脈カテーテル、肺動脈カテーテル、トンネル状中心静脈カテーテル、および動静脈シャントが含まれる。

血栓症、すなわち血栓または止血血栓の形成の過程を促進する種々の要因の中には、（１）罹患血管の血管内皮細胞表層の損傷（２）血中凝固特性の増大、および（３）罹患血管における血液の停滞がある。血栓症は、血管裏層の損傷部分に付着した極めて小さな塊として始まり得る。その塊の存在はさらに、血栓症の発症を促進し、血管の内径を減少させることにより血流を減速させる作用がある。最初の小さな血栓がさらに成長すると、罹患血管の全面的なまたはほぼ全面的な閉塞につながることが多い。血栓症が動脈の１つに起こると、その動脈により補給される組織では、酸素および栄養が欠乏し、その結果組織の損傷または死（壊疽）がもたらされる可能性がある。損傷の重症度は、血栓症の位置および大きさ、その増殖速度、患部には動脈が１本しかないか、または側副血管による補給があるか否かに依存する。例えば心臓または脳のような生命維持に必要な臓器への血管が冒されると、人間は重度の障害を受けるかまたは死亡する恐れがある。時として、血栓は細菌などの感染性生物体を含有することがあり、膿形成および周辺組織の感染に伴って、敗血症性血栓症が発症することがある。

プラスミン（または上記の任意のプラスミン変異体もしくは誘導体またはその代替物）のさらなる用途には、循環フィブリノーゲンレベルの低減（例えば、国際公開第９３／０７８９３号パンフレット）およびα２−抗プラスミン阻害因子としての使用（虚血性脳卒中後に脳梗塞の大きさを低減すると報告されている；国際公開第００／１８４３６号パンフレット）が含まれる。

プラスミン（または上記の任意のプラスミン変異体もしくは誘導体またはその代替物）のさらに別の用途は、機械的な硝子体切除術の代替法としてまたはその補助手段としての、眼における後部硝子体剥離（ＰＶＤ）および／または硝子体液化の誘導に関するものである（国際公開第２００４／０５２２２８号パンフレット；米国特許第６，７３３，７５０号明細書；米国特許第６，５８５，９７２号明細書；米国特許第６，８９９，８７７号明細書；国際公開第０３／３３０１９号パンフレット；国際公開第２００６／１２２２４９号パンフレット；国際公開第２００７／０４７８７４号パンフレット；米国特許第５，３０４，１１８号明細書；米国特許出願公開第２００６／００２４３４９号明細書；米国特許出願公開第第２００３／０１４７８７７号明細書）。硝子体切除および／または硝子体液化は、いくつかの眼の症状にとって利点があり、そのような症状には、例えば、硝子体浮遊物（視力を損ない得る、通常透明な硝子体液内の硝子体液の自動性細片／沈着）、網膜剥離（硝子体牽引が原因となり得る失明症状）、黄斑パッカー（網膜黄斑上の瘢痕組織；黄斑は鮮明な中心視覚に必要である；黄斑パッカーはまた、網膜上膜症もしくは網膜前膜症、セロファン黄斑症、網膜しわ、表面しわ網膜症、黄斑前線維症、または内境界膜疾患としても知られる）、硝子体出血および／または網膜上の線維性瘢痕組織の形成（網膜剥離の原因となり得る）をもたらし得る糖尿病網膜症（増殖性または非増殖性）、黄斑円孔（盲点の原因となり、硝子体の牽引、傷害、または外傷事故により発症する網膜黄斑の孔）、硝子体出血（糖尿病網膜症、傷害、網膜剥離もしくは網膜裂孔、クモ膜下出血（テルソン症候群）、または閉塞した血管を原因とする）、硝子体下出血（硝子体を覆う硝子体膜下の出血）、黄斑浮腫（眼の網膜黄斑の上または下における、体液およびタンパク質の沈着）、および黄斑変性（ドルーゼン形成と共に発症；乾燥型および湿潤型で発生する；加齢に関連する場合、加齢黄斑変性症）がある。プラスミンの眼への他の適用には、線維柱帯切除手術（眼圧を低下させるために実施）後の濾過胞の維持または救済が含まれる。例えば、国際公開第２００９／０７３４５７号パンフレットを参照のこと。

プラスミン（または上記の任意のプラスミン変異体もしくは誘導体またはその代替物）のさらに別の用途は、診断に属し、より具体的には、適切に標識された（例えば、Ｔｃ^９９標識された、上記を参照のこと）プラスミン（または上記の任意のプラスミン変異体もしくは誘導体、またはその代替物）を、病的なフィブリン沈着の検出に適用することができる。本発明による短縮プラスミンまたはプラスミノーゲン変異体をこのような診断法に適用する場合は、前記変異体がフィブリン結合部位を依然として含むか留意するべきである（プラスミン自体に由来するものであるか否か、または例えばハイブリッド分子を作製することによりプラスミン触媒ドメインに付加されたものであるか否かにかかわらず）。

本発明によるプラスミンまたはその任意の変異体もしくは誘導体、またはその代替物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、または補助剤の中に保存することができる。そのような担体、希釈剤、または補助剤は、１〜１００ｍＭの酢酸またはクエン酸などの酸性の低緩衝液からなるか、またはそれを含むことができる。酸性の場合、薬学的に許容される担体、希釈剤、または補助剤は、ｐＨ２．５〜５．０であり、例えばｐＨ２．５〜４．０、例えばｐＨ３．０〜３．５、または例えばｐＨ３．１である。有用な酸性化合物としては、酢酸、クエン酸、塩酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、または安息香酸が挙げられる。ギ酸を使用してもよいが、この化合物はＡｓｐ残基のＣ末端でのタンパク質分解性の切断を誘導しないことに留意するべきである。薬学的に許容される担体、希釈剤、または補助剤は、酸性、中性、または塩基性のいずれの場合も、セリン、スレオニン、メチオニン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、バリン、アラニン、アスパラギン酸、リジン、ヒスチジン、またはそれらの任意の誘導体またはアナログなどの１種または複数のアミノ酸を含むことができる。薬学的に許容される担体、希釈剤、または補助剤は、単糖、二糖、多糖、または多価アルコールなどの炭水化物を含むことができる。例としては、スクロース、グルコース、フルクトース、ラクトース、トレハロース、マルトースおよびマンノースなどの糖、ソルビトールおよびマンニトールなどの糖アルコール、デキストリン、デキストラン、グリコーゲン、デンプン、およびセルロースなどの多糖が挙げられる。薬学的に許容される担体、希釈剤、または補助剤は、グリセロール、ナイアシンアミド、グルコサミン、チアミン、シトルリン、無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなど）、ベンジルアルコール、または安息香酸などの化合物を含むことができる。薬学的に許容される担体、希釈剤、または補助剤は、ε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）および／またはトラネキサム酸などの化合物を含むことができる（上記および背景技術の部を参照のこと）。これらの化合物の一部は、上記のプラスミンまたはその任意の変異体もしくは誘導体、またはその代替物の安定剤として使用することができる。

上記のことを考慮すると、本発明の別の態様は、薬剤として使用するための、本発明による単離したプラスミノーゲン、プラスミン、またはその任意の変異体もしくは誘導体、またはその代替物、またはそれらの任意の組合せに関する。

本発明のさらなる態様は、本発明による単離したプラスミノーゲン、プラスミン、またはその任意の変異体もしくは誘導体、またはその代替物、またはそれらの任意の組合せ、および薬学的に許容される希釈剤、担体、または補助剤の少なくとも１つを含む組成物に関する。さらなる実施形態では、前記組成物は、抗凝血剤、さらなる血栓溶解剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、血管新生阻害剤、有糸分裂阻害剤、抗ヒスタミン剤、または麻酔剤の少なくとも１つをさらに含むことができる。

本発明の上記の２つの態様に対する一実施形態では、本発明による単離したプラスミノーゲン、プラスミン、またはその任意の変異体もしくは誘導体、またはその代替物、またはそれらの任意の組合せ、または本発明による組成物は、病的なフィブリン沈着の治療、眼の後部硝子体剥離の誘導、眼の硝子体切除術の補助および円滑化としての眼の硝子体液化の誘導、後部硝子体剥離の誘導、硝子体黄斑癒着の分離、黄斑円孔の閉鎖、酵素的壊死組織除去、循環フィブリノーゲンの低減、α２−抗プラスミンレベルの低減、または線維柱帯切除術との併用のためなどの臨床的に適切ないかなる状況でも、使用することができる。

本発明の上記の２つの態様に対する別の実施形態では、本発明による単離したプラスミノーゲン、プラスミン、またはその任意の変異体もしくは誘導体、またはその代替物、またはそれらの任意の組合せ、または本発明による組成物は、予防目的のために、または予防的治療法で使用することができる。予防的用途には、病的なフィブリン沈着の発症リスクが高い哺乳動物（肥満した哺乳動物、運動不足の哺乳動物、または大きな外科的イベントまたは手術を受ける予定のある哺乳動物など）におけるその発症リスクの低減が挙げられる。他の予防的用途には、一方の眼が後部硝子体剥離および／または硝子体液化の誘導を必要とすると診断される／された哺乳動物の見かけ上健常な方の眼における後部硝子体剥離および／または硝子体液化の誘導が挙げられる。

あるいは、本発明は、被験体の病的なフィブリン沈着を処理、分解、軟化、解離、溶解、溶解誘導、または溶解促進するための方法であって、前記方法が、本発明による単離したプラスミノーゲン、プラスミン、またはその任意の変異体もしくは誘導体、またはその代替物、またはそれらの任意の組合せの有効量を前記フィブリン沈着に接触させることを含み、前記接触が、前記病的なフィブリン沈着の処理、分解、軟化、解離、溶解、または溶解誘導もしくは溶解促進をもたらす方法に関する。

本発明はさらに、被験体において、眼における後部硝子体剥離の誘導、および／または眼における硝子体液化の誘導、または眼における外科的硝子体切除の円滑化を行うための方法であって、前記方法が、本発明による単離したプラスミノーゲン、プラスミン、またはその任意の変異体もしくは誘導体、またはその代替物、またはそれらの任意の組合せの有効量を、このような治療を必要とする前記被験体の眼に接触させることを含み、前記接触が、前記後部硝子体剥離の誘導、および／または前記硝子体液化の誘導、または外科的硝子体切除の円滑化をもたらす方法に関する。

本発明はまた、被験体の損傷した組織の酵素的壊死組織除去のための方法であって、前記方法が、本発明による単離したプラスミノーゲン、プラスミン、またはその任意の変異体もしくは誘導体、またはその代替物、またはそれらの任意の組合せの有効量を、前記損傷した組織に接触させることを含み、前記接触が、前記損傷した組織の前記酵素的壊死組織除去をもたらす方法に関する。

本発明の他の方法は、被験体の循環フィブリノーゲンの低減またはα２−抗プラスミンレベルの低減のための方法を含む、臨床的に関連する任意の他の適応症を治療または予防する方法であって、前記方法が、本発明による単離したプラスミノーゲン、プラスミン、またはその任意の変異体もしくは誘導体、またはその代替物、またはそれらの任意の組合せの有効量を、そのような治療を必要とする被験体に接触させることを含み、前記接触が、前記循環フィブリノーゲンまたは前記α２−抗プラスミンレベルの低減をもたらす方法である。

一般に、本発明によるプラスミン（またはその任意の変異体もしくは誘導体またはその代替物）を含む本発明の薬剤または組成物は、その最終的な用途および投与方法に応じて、抗凝血剤、さらなる血栓溶解剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、血管新生阻害剤、有糸分裂阻害剤、抗ヒスタミン剤、または麻酔剤などの１つまたは複数のさらなる活性成分を含むことができる。

「抗凝血剤」としては、ヒルジン、ヘパリン、クマリン、低分子量ヘパリン、トロンビン阻害剤、血小板抑制剤、血小板凝集阻害剤、凝固因子抑制因子、抗フィブリン抗体、および第ＶＩＩＩ因子阻害物質（国際公開第０１／０４２６９号パンフレットおよび国際公開第２００５／０１６４５５号パンフレットに記載されたものなど）が挙げられる。

「血栓溶解剤」としては、野生型プラスミン、野生型プラスミノーゲン、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡまたはアルテプラーゼ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、およびスタフィロキナーゼ、またはそれらの任意の変異体もしくは誘導体、例えばＡＰＳＡＣ（アニソイル化プラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化因子複合体）、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、ｓｃｕＰＡ（単鎖ｕＰＡ）、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。

「抗炎症剤」としては、ステロイド剤（例えば、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、コルチゾン、ハイドロコルチゾン、プレドニゾン、トリアムシノロン、デキサメサゾン）および非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ；例えば、アセトアミノフェン、イブプロフェン、アスピリン）が挙げられる。

「抗ウイルス剤」としては、トリフルリジン、ビダラビン、アシクロビル、バラシクロビル、ファムシクロビル、およびドクスウリジン（ｄｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）がある。

「抗菌剤」または抗生物質としては、アンピシリン、ペニシリン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、フラミセチン、ガチフロキサシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、バシトラシン、ネオマイシン、およびポリミキシンが挙げられる。

「抗糸状菌剤／静真菌剤／抗真菌剤」としては、フルコナゾール、アムホテリシン、クロトリマゾール、エコナゾール、イトラコナゾール、ミコナゾール、５−フルオロシトシン、ケトコナゾール、およびナタマイシンが挙げられる。

「血管新生阻害剤」としては、抗−ＶＥＧＦ抗体（血管内皮細胞増殖因子）または抗−ＰｌＧＦ（胎盤増殖因子）抗体などの抗体（またはその断片）、およびマクゲン（ペガプタニブナトリウム）、トリプトファニル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＴｒｐＲＳ）、酢酸アネコルタブ、コンブレタスタチンＡ４プロドラッグ、ＡｄＰＥＤＦ（色素上皮由来因子を発現できるアデノベクター）、ＶＥＧＦ−トラップ、ＶＥＧＦレセプター２の阻害剤、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、またはＴＧＦ−βの阻害剤、シロリムス（ラパマイシン）、およびエンドスタチンなどの薬剤が挙げられる。

「有糸分裂阻害剤」としては、マイトマイシンＣおよび５−フルオロウラシルが挙げられる。

「抗ヒスタミン剤」としては、フマル酸ケチトフェン（ｋｅｔｉｔｏｆｅｎ）およびマレイン酸フェニラミンが挙げられる。

「麻酔剤」としては、ベンゾカイン、ブタムベン、ジブカイン、リドカイン、オキシブプロカイン、プラモキシン、プロパラカイン、プロキシメタカイン、テトラカイン、およびアメトカインが挙げられる。

「接触させる」は、本明細書で使用する場合、薬剤などの組成物と、前記組成物が接触する組織、体液、器官、生物体等との間の相互作用をもたらす任意の投与方法を意味する。組成物と、組織、体液、器官、生物体等との間の相互作用は、組成物の投与と共に直ちに、またはほぼ直ちに開始させることも、長期間にわたり（組成物を投与すると直ちに、またはほぼ直ちに開始する）存在させることも、または組成物の投与時間に対して遅延させることもできる。

病的なフィブリン沈着に有効量のプラスミン（またはその任意の変異体もしくは誘導体、またはその代替物）を与える（直ちに、遅延させて、または長期間にわたって）、病的なフィブリン沈着に接触させる任意の方法を利用することができる。そのようなフィブリン沈着が血餅を伴う場合、注射および／または点滴および／またはカテーテルによって、プラスミン（またはその任意の変異体もしくは誘導体、またはその代替物）を動脈内、静脈内、または局所的に（血餅のすぐ近くに、または血餅の中にも）送達することができる。

酵素的壊死組織除去においてプラスミン（またはその任意の変異体もしくは誘導体、またはその代替物）を使用する場合、プラスミンは局所に適用可能なゲル様組成物の中に含まれることも、または液体形態で適用されることもある。

眼の硝子体液および／または房水に有効量のプラスミン（またはその任意の変異体もしくは誘導体、またはその代替物）を与える（直ちに、遅延させて、または長期間にわたって）、硝子体液および／または房水に接触させる任意の方法を利用することができる。硝子体液および／または房水に接触させる１つの方法として、１回または複数回の眼内注射によって、硝子体液および／または房水の中に直接入れる方法がある。あるいは、前記接触させる方法として、結膜下、筋肉内、または静脈内注射を挙げることができる。さらに別の接触方法として、ＯＣＵＳＥＲＴ（登録商標）（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）またはＶＩＴＲＡＳＥＲＴ（登録商標）（Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）などの硝子体埋め込み型デバイスの設置が挙げられる。硝子体液および／または房水に有効量のプラスミン（またはその任意の変異体もしくは誘導体、またはその代替物）を接触させる方法は、デボー剤、徐放性製剤、または任意のそれに適した埋め込み型デバイスを使用する持続形式の方法であってもよい。

用語「有効量」は、本発明による薬剤、具体的には、本発明による薬剤の活性成分、すなわち、プラスミンまたはその活性短縮変異体（または上記のその任意の代替物）の投与レジメンを指す。有効量は一般に、接触方法または投与方法および治療する症状に左右され、またそれに応じて調整する必要がある。薬剤、より具体的にはその活性成分の有効量は、顕著なまたは不要な毒性作用を引き起こすことなく、所望の臨床成績または治療効果もしくは予防効果を得るために必要とされる量である。有効量を得るためにまたは維持するために、薬剤を単回投与または複数回投与することができる。有効量はさらに、治療する必要がある症状の重症度、または予防する必要がある症状の予想される重症度に応じて異なり得るものであり；また、患者の全体的な健康状態および体調にも依存し得るものであり、通常、有効量を決定するためには、治療する医師または内科医の判断が必要となる。有効量はさらに、異なった投与形式の組合せによって得ることができる。薬剤は、溶液（液体または半液体、例えばゲル状、または分散液もしくは懸濁液で、コロイド、エマルジョンで、ナノ粒子懸濁液）として投与しても、または固体（例えば、錠剤、ミニ錠剤、ハードシェルまたはソフトシェルカプセル）として投与してもよい。

血栓溶解の目的では、プラスミン治療におけるプラスミンの投与量および治療期間は、通常、血餅の大きさおよび部位ならびに患者の身体サイズ、体重、および年齢に依存する。血餅が静脈性の場合には、プラスミンによる治療は数日間継続することがあるが、血餅が動脈性の場合には、プラスミン治療は数時間しか必要とされないことがある。心筋梗塞は、短期間の単回投与で治療することがあるが、血栓静脈炎および肺塞栓症などの症状は、長期間の複数回投与治療が必要となることがある。長期間の持続的および／または間欠的な血栓溶解プラスミン治療は、冠状動脈閉塞症の治療のために、または血栓形成を発症するリスクが高いことが知られる患者における、血栓形成のリスクを低減するための予防的治療の場合に適用することができる。プラスミン投与量に影響を及ぼすさらなる因子して、α２−抗プラスミンおよび／またはα２−マクログロブリンなどのプラスミン阻害因子の循環レベルが挙げられるが、その初期レベルは患者に依存する。効果的な血栓溶解療法を達成するためには、循環α２−抗プラスミンの残存が全量の１５％以下になるように、プラスミン投与量を調節することが望ましいことがある。血栓溶解を誘導する目的のために、血栓の近傍にプラスミンまたはその任意の変異体もしくは誘導体、またはその代替物を送達する接触方法は、血清阻害因子への曝露が減少するので有利となり得る。そのような接触方法には、通常、カテーテルデバイスを介する送達が含まれる。血栓溶解での使用の場合、典型的なプラスミン投与量は、５００マイクログラム／ｋｇ体重〜約１０ミリグラム／ｋｇ体重の範囲にあり、これらは単回ボーラスとして投与されるか、または１回の初回ボーラス注射とその後の１回もしくは複数回の反復ボーラス注射の分割投与になる。あるいは、例えば点滴または薬物送達用マイクロポンプによって、プラスミンを長期間にわたり投与することができる。持続投与のためのプラスミン投与量は、１〜１０ｍｇ／ｋｇ／時間の範囲とすることができる。

後部硝子体剥離、硝子体液化、硝子体の血液もしくは出血のクリアランス、または硝子体腔からの有毒物質もしくは異物のクリアランスを誘導するための典型的なプラスミン投与量は、片眼１用量あたり、約０．１マイクログラム〜約２５０マイクログラムの範囲とすることができ、片眼１用量あたり約５０マイクロリットル〜約３００マイクロリットルの希釈剤または担体容積内で送達することができる。希釈剤または担体は、例えば、無菌の平衡塩類溶液（ＢＳＳまたはＢＳＳ Ｐｌｕｓ）、生理食塩水、または１〜１０ｍＭのクエン酸を含有する溶液であってもよい。一実施形態では、プラスミンを、０．１ｍＬの希釈剤または担体に含有して１２５マイクログラムの用量で眼に送達する。計画された硝子体切除の場合には、前記プラスミンを、硝子体切除の１５〜３００分前、または１５〜１２０分前に眼に送達してもよい。あるいは、眼の中にプラスミンを投与する目的としては、外科的硝子体切除を回避するか、またはプラスミン処置それ自体では完全な後部硝子体剥離を達成することができない場合に、その後の外科的硝子体切除を容易にすることがある。プラスミンの代替源としてプラスミノーゲンを使用する場合（「プラスミン」の定義を参照のこと）、片眼当たり最大２５０マイクログラムのプラスミノーゲンを導入することができ、前記プラスミノーゲンに、プラスミノーゲン活性化因子として最大２０００ＩＵのウロキナーゼまたはストレプトキナーゼを、または最大２５マイクログラムのｔＰＡを併用することができる。眼に使用する場合、プラスミンまたはプラスミノーゲンの投与にさらに、空気、膨張気体、もしくは液化可能な気体、またはそれらの混合物などの気体状の補助剤を、それが眼に無毒である限り、併用することができる。他の適切な気体材料としては、ＳＦ６（六フッ化硫黄）およびＣ２Ｆ６（ヘキサフルオロエタン）、Ｃ３Ｆｓ（オクタフルオロプロパン）、Ｃ４Ｆｓ（オクタフルオロシクロブタン）などのパーフルオロカーボン、酸素、窒素、二酸化炭素、アルゴン、および他の不活性気体が挙げられる。眼の中に導入される気体材料の容積は、気体材料、患者、および所望の結果に応じて異なり得る。例えば、後眼房の中に注入される空気の容積は、約０．５ｍＬ〜約０．９ｍＬの範囲とすることができる。ＳＦ６およびパーフルオロカーボンの気体などの他の気体材料は、約０．３ｍＬ〜０．５ｍＬの範囲とすることができる。好ましくは、気体材料は、後部硝子体膜に対して硝子体液を圧縮し、眼を損傷することなく硝子体液内に空洞を形成させるのに十分な量で、眼の後眼房に導入される。好ましい実施形態では、気体状補助剤を硝子体液に導入して、眼球内腔の内部容積の約４０％〜約６０％を占める空洞を形成させる。

上記に列挙した投与量は、何ら限定を意図する指示値ではない。前記投与量はさらに、野生型プラスミンまたはプラスミノーゲン、またはその任意の活性または活性可能な短縮変異体について指す。本発明による安定性が向上したプラスミン（またはその任意の変異体もしくはその誘導体、またはその代替物）を使用する場合、本発明によるプラスミンの最終的な安定性および残存活性に依存して、野生型プラスミンで得られるものと同じかまたはより優れた全体的な臨床効果を得るために、同じか、より高いか、またはより低い投与量とすることができる。本発明によるプラスミンの投与量はまた、α２−抗プラスミンなどの内因性阻害因子による阻害速度にも依存することがある。

本発明はさらに、自己タンパク質分解に対して安定なプラスミン変異体をスクリーニングするための方法であって、前記方法が、
（ｉ）本発明によるプラスミン変異体を準備すること、および野生型プラスミンを準備することと、
（ｉｉ）（ｉ）で準備した変異体プラスミンおよび野生型プラスミンの自己タンパク質分解に対する安定性を比較することと、
（ｉｉｉ）タンパク質分解活性を保持し、かつ野生型プラスミンの自己タンパク質分解に対する安定性と比較して、自己タンパク質分解に対する安定性が増大している変異体を、（ｉｉ）から選択することと
を含む方法に関する。

上記のスクリーニング法はさらに、自己タンパク質分解に対して安定なプラスミン変異体のタンパク質分解活性を測定するステップを含むことができる。

薬物を含む多くの製品（ここでは、具体的には、使用者が利用可能な活性成分として、すなわち、患者に投与するための最終製剤の状態にあると理解される）および薬物のバルク保存された活性成分は、通常使用前に相当な時間保存される。可能な限り製品の有効期限を延長することが目的となる。有効期限とは、その製品を安全に使用することができ、かつその製品がその強力な有用性、すなわち、薬物の場合にはその活性および／またはその活性成分を保持する期間を意味する。通常、有効期限は製品またはその包装に表示される。一旦有効期限が切れると、製品の安全性と強力な有用性はもはや保証されない。製品の保存においてさらに重要な側面は、所望の有効期限を達成できる保存温度である。例えば、＋４℃または冷蔵庫の平均的な温度で保存された製品の有効期限は、１２ヶ月になる可能性があるが、−２０℃または冷凍庫の平均的な温度で保存された同じ製品の有効期限は、３６ヶ月になる可能性がある。しかしながら、論理的には、凍結温度、例えば−２０℃で低温流通システムを維持することは、＋４℃で低温流通システムを維持することより、極めて複雑かつ困難で費用もかかる。したがって、製品を＋４℃で保存できる可能性と併せて、短期間であるが十分長い有効期限を有することは、依然として魅力的であり得る。本発明は、プラスミンまたはその任意の活性断片もしくは誘導体、またはプラスミンもしくはその任意の活性誘導体を含む組成物の有効期限または長期保存安定性を延長、向上、増大させるための解決策を提供する。この解決策は、その有効期限を実質的に増加、向上、または延長する向上した安定性を有する、本明細書に記載の利用可能なプラスミン変異体を作製することにある。

本発明はまた、プラスミン含有組成物の長期保存安定性を向上させるための方法であって、前記方法が、タンパク質分解活性を著しく損失することなく、長期間にわたり保存可能である、自己タンパク質分解に対して安定なプラスミン変異体を同定するステップを含む方法に関する。長期安定性を決定するために、本発明によるプラスミン調製品をアリコートし、想定した保存期間の間、活性測定を反復して実施する。想定した保存期間が、例えば２４か月である場合、活性測定を例えば毎月実施することができる。想定した保存期間の終了時におけるタンパク質分解活性の許容可能な損失量は、想定した臨床適用に大いに依存するが、典型的には、例えば１０％〜１５％を超えない量とすることができる。

本発明はさらに、本発明によるプラスミノーゲン変異体を産生するための方法であって、前記方法が、
（ｉ）本発明によるプラスミノーゲンをコードする核酸を、前記プラスミノーゲンを発現することができる適切な宿主細胞に導入するステップと、
（ｉｉ）（ｉ）で得られた宿主細胞を、前記宿主細胞で前記プラスミノーゲンを発現するのに十分な条件および期間で増殖させるステップと、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で発現したプラスミノーゲンを回収するステップと
を含む方法に関する。

本発明はさらに、本発明によるプラスミン変異体を産生するための方法であって、前記方法が、
（ｉ）本発明によるプラスミノーゲンをコードする核酸を、前記プラスミノーゲンを発現することができる適切な宿主細胞に導入するステップと、
（ｉｉ）（ｉ）で得られた宿主細胞を、前記宿主細胞で前記プラスミノーゲンを発現するのに十分な条件および期間で増殖させるステップと、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で発現したプラスミノーゲンを回収するステップと、
（ｉｖ）（ｉｉｉ）のプラスミノーゲンをプラスミンに活性化するステップと
を含む方法に関する。

発現および産生に適した宿主細胞および方法は、例えば、国際公開第９０／１３６４０号パンフレット（昆虫細胞）、国際公開第２００２／０５０２９０号パンフレットおよび国際公開第０３／０６６８４２号パンフレット（酵母細胞）、国際公開第２００８／０５４５９２号パンフレット（細菌細胞／リフォールディング過程）、ならびに国際公開第２００５／０７８１０９号パンフレット（ウキクサ科トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物細胞）に開示されている。

本発明はまた、本発明によるプラスミノーゲン変異体またはプラスミン変異体をコードする１つまたは複数の単離した核酸配列に関する。本発明はまた、そのような核酸を含む１つまたは複数の組換えベクターに関する。本発明はまた、そのような核酸またはそのような組換えベクターで形質転換された１つまたは複数の宿主細胞に関する。

実施例１．プラスミノーゲン変異体の構築および発現、ならびにプラスミンへの活性化
発現ベクター
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入したｐＰＩＣＺαＡ分泌ベクターを、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）において組換えヒトマイクロプラスミノーゲンの発現および分泌を導くために使用した。

このベクターは、サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα−因子プレプロペプチドの分泌シグナルを含有する。ＸｈｏＩ認識配列は、α−因子分泌シグナルのＣＯＯＨ末端に存在し、成熟タンパク質から分泌シグナルを除去するようにＫｅｘ２により切断されるＬｙｓ−Ａｒｇ部位のすぐ上流にある。このＸｈｏＩ制限部位は、５’末端にＸｈｏＩおよびＫｅｘ２の認識部位を有する遺伝子を合成することにより、Ｋｅｘ２切断部位が隣接した目的の遺伝子をクローニングするために使用することができる。その後、目的の組換え遺伝子は、天然のＮＨ_２末端を有して発現することになる。異種遺伝子のクローニングを容易にするために、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳｆｉＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩＩ、およびＸｂａＩの制限部位を有する多重クローニング部位が、ｐＰＩＣＺαＡベクターのα−因子分泌シグナルのすぐ下流に作製されている。

遺伝子合成
ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるヒトマイクロプラスミノーゲンの発現を改善するために、ヒトマイクロプラスミノーゲンおよびその変異体をコードする遺伝子を、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の好ましいコドン使用頻度を考慮して、新たに合成した。

コドン最適化遺伝子配列を設計するために、ヒトマイクロプラスミノーゲンアミノ酸配列（配列番号１９）をプログラムＧｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒにインポートした。このプログラムは、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により開発され、インターネット上で自由に利用することができる。この配列は、このプログラムが提供するピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）コドン使用頻度表を使用して、ＤＮＡ配列に逆翻訳された。次いで、このヌクレオチド配列を手作業でチェックし、大腸菌コドン使用頻度に、より適合するように調整した（配列番号２０）。加えて、６塩基対パリンドローム配列およびヌクレオチド反復を可能な場合は除去した。５’末端に、ＸｈｏＩ制限部位およびＫｅｘ２切断部位を付加し、３’末端に、ＸｂａＩ制限部位を付加した。

野生型マイクロプラスミノーゲン配列に、または特定の他の１つまたは複数のアミノ酸がすでに変化した変異マイクロプラスミノーゲン配列に、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用し、部位特異的突然変異誘発により突然変異を導入した。大腸菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、部位特異的突然変異誘発混合物で形質転換し、アンピシリン抵抗性のクローンを選択した。得られたプラスミドクローンの配列決定により、標的マイクロプラスミノーゲンコード領域の正確な突然変異誘発を確認し、かつ不要な変異がコード領域にないことを確認した。

下記のプライマーを部位特異的突然変異誘発に使用した：
Ｖａｌ１Ｉｌｅ突然変異

第１の変異体では、位置１のバリンがイソロイシンに置換されている。Ｖａｌ１は位置５８〜６０のコドンＧＴＴによりコードされる。ヌクレオチドＧＴＴ（位置５８〜６０）をＡＴＴに変化させると、マイクロプラスミノーゲンタンパク質において、Ｖａｌ１がＩｌｅに変化する（ヌクレオチド配列を配列番号２３に、推定アミノ酸配列を配列番号２４に示す）。

マイクロプラスミノーゲン変異体の発現およびプラスミンへの活性化
マイクロプラスミノーゲン変異体および活性化されたマイクロプラスミン変異体は、国際公開第０２／５０２９０号パンフレットの実施例２に概説される手順に基本的に従って得られる。

活性化前に、免疫アフィニティによりピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の上清からマイクロプラスミノーゲン変異体を直接精製した。マウス抗ヒトマイクロプラスミン抗体（抗原としてマイクロプラスミンを使用して、Ｂａｌｂ／ｃマウスで産生させ；ＴｈｒｏｍｂｏＧｅｎｉｃｓ Ｎ．Ｖ．から入手可能なハイブリドーマ細胞株５Ｄ１０Ａ４により産生させた）を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのプロトコール番号７１５０００１５ＡＤに従ってセファロースビーズにカップリングした。このプロトコールに従って、免疫アフィニティ樹脂７．５ｍＬを抗体４５ｍｇから調製し、ＸＫ１６／２０カラムに充填した。粗上清２００〜４００ｍＬ（ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）培養物を０．２μで濾過／ｐＨ６．０）を、５Ｄ１０Ａ４アフィニティーカラムに直接負荷した。洗浄ステップ（１００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．２、１０カラム容量）の後に、マイクロプラスミノーゲン変異体を、０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ３．０の緩衝液で溶出した。

溶出液（分画４〜６）を中和して、２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２に対して透析した。

上記の野生型および変異マイクロプラスミノーゲン種のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を以下に記載する。
配列番号１９−野生型ヒトマイクロプラスミノーゲンのアミノ酸配列
ＡＰＳＦＤＣＧＫＰＱＶＥＰＫＫＣＰＧＲＶＶＧＧＣＶＡＨＰＨＳＷＰＷＱＶＳＬＲＴＲＦＧＭＨＦＣＧＧＴＬＩＳＰＥＷＶＬＴＡＡＨＣＬＥＫＳＰＲＰＳＳＹＫＶＩＬＧＡＨＱＥＶＮＬＥＰＨＶＱＥＩＥＶＳＲＬＦＬＥＰＴＲＫＤＩＡＬＬＫＬＳＳＰＡＶＩＴＤＫＶＩＰＡＣＬＰＳＰＮＹＶＶＡＤＲＴＥＣＦＩＴＧＷＧＥＴＱＧＴＦＧＡＧＬＬＫＥＡＱＬＰＶＩＥＮＫＶＣＮＲＹＥＦＬＮＧＲＶＱＳＴＥＬＣＡＧＨＬＡＧＧＴＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＬＶＣＦＥＫＤＫＹＩＬＱＧＶＴＳＷＧＬＧＣＡＲＰＮＫＰＧＶＹＶＲＶＳＲＦＶＴＷＩＥＧＶＭＲＮＮ
配列番号２０−ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）における発現のために最適化されたコドン使用頻度を有する人為的な核酸配列核酸配列は、配列番号１９の野生型ヒトマイクロプラスミノーゲンアミノ酸配列をコードする。
ＧＣＡＣＣＴＴＣＡＴＴＣＧＡＣＴＧＴＧＧＴＡＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＣＧＡＡＣＣＴＡＡＧＡＡＧＴＧＴＣＣＡＧＧＴＣＧＴＧＴＴＧＴＣＧＧＴＧＧＣＴＧＴＧＴＧＧＣＴＣＡＴＣＣＴＣＡＴＴＣＴＴＧＧＣＣＴＴＧＧＣＡＡＧＴＧＴＣＴＣＴＴＡＧＡＡＣＴＡＧＡＴＴＴＧＧＴＡＴＧＣＡＣＴＴＣＴＧＴＧＧＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＡＴＣＴＣＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＧＴＣＴＴＡＡＣＣＧＣＡＧＣＴＣＡＴＴＧＴＣＴＧＧＡＧＡＡＧＴＣＡＣＣＡＣＧＴＣＣＡＴＣＴＴＣＡＴＡＣＡＡＧＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＧＣＧＣＡＣＡＴＣＡＧＧＡＡＧＴＣＡＡＴＣＴＴＧＡＧＣＣＴＣＡＴＧＴＴＣＡＧＧＡＧＡＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＴＣＧＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＧＡＡＣＣＡＡＣＴＣＧＴＡＡＡＧＡＣＡＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＣＧＴＧＡＴＴＡＣＣＧＡＣＡＡＧＧＴＡＡＴＴＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＴＧＣＣＴＡＧＴＣＣＴＡＡＴＴＡＣＧＴＣＧＴＴＧＣＣＧＡＣＣＧＴＡＣＣＧＡＡＴＧＣＴＴＣＡＴＴＡＣＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＣＴＣＡＡＧＧＴＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＴＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＴＴＡＣＣＴＧＴＧＡＴＴＧＡＧＡＡＣＡＡＧＧＴＴＴＧＴＡＡＣＡＧＡＴＡＣＧＡＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＧＧＴＣＧＴＧＴＴＣＡＧＴＣＣＡＣＴＧＡＧＴＴＧＴＧＴＧＣＡＧＧＴＣＡＣＣＴＴＧＣＡＧＧＴＧＧＴＡＣＴＧＡＴＡＧＴＴＧＴＣＡＡＧＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＴＧＧＡＣＣＡＣＴＧＧＴＧＴＧＣＴＴＣＧＡＧＡＡＧＧＡＴＡＡＧＴＡＣＡＴＣＴＴＡＣＡＡＧＧＴＧＴＴＡＣＧＴＣＴＴＧＧＧＧＴＣＴＴＧＧＡＴＧＴＧＣＴＣＧＴＣＣＴＡＡＣＡＡＧＣＣＡＧＧＴＧＴＣＴＡＣＧＴＣＡＧＡＧＴＣＴＣＣＡＧＡＴＴＣＧＴＡＡＣＴＴＧＧＡＴＣＧＡＡＧＧＴＧＴＣＡＴＧＣＧＴＡＡＣＡＡＣＴＡＡ
配列番号２３−Ｖａｌ１Ｉｌｅ置換を有するマイクロプラスミノーゲン変異体（突然変異したコドンは下線付きの太字イタリック体で示す）

配列番号２４−配列番号２３の推定アミノ酸配列（導入されたアミノ酸突然変異は太字／イタリック体で、かつ下線付きで示す）

結果：
種々のマイクロプラスミン突然変異体について得られたｋｃａｔおよびＫｍを以下の表１に収載する。

実施例２．ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏモデルにおけるプラスミン変異体の治療有効性。
２．１ 脳梗塞サイズに対するプラスミン変異体の効果
国際公開第００／１８４３６号パンフレットの実施例２に記載されるように、またはＷｅｌｓｈら（１９８７，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ４９，８４６−８５１）に従って、脳梗塞サイズの低減における本発明のプラスミン変異体の有効性を、マウスの脳梗塞モデルで検討することができる。脳梗塞サイズに対する野生型プラスミンの有益な効果は、国際公開第００／１８４３６号パンフレットの実施例５で実証された。同様の実験を本発明の任意のプラスミン変異体を用いて実施し、これらのプラスミン変異体の有益な効果を測定して野生型プラスミンの有益な効果と比較する。

２．２ プラスミン変異体のｉｎ ｖｉｖｏ血栓溶解活性
ウサギの体外ループ血栓溶解モデル（国際公開第０２／５０２９０号パンフレットの実施例６；Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ５８，１０７−Ａｂｓｔｒａｃｔ ３７７）、イヌの冠動脈回旋枝の銅コイル誘導血栓症モデル（国際公開第０２／５０２９０号パンフレットの実施例８；Ｂｅｒｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０，１１８１−１１８３）、またはウサギの頚静脈血栓症モデル（Ｃｏｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ７１，３６８−３７６）を、本発明のプラスミン変異体のｉｎ ｖｉｖｏ血栓溶解活性を実証するために使用することができる。国際公開第００／１８４３６号パンフレットの実施例７および９、ならびにＣｏｌｌｅｎら（１９８３）により記載されるように、これらのモデルを用いて血栓溶解に対する野生型プラスミンの有益な効果が実証された。同様の実験を本発明の任意のプラスミン変異体を用いて実施し、これらのプラスミン変異体の有益な効果を測定して野生型プラスミンの有益な効果と比較する。

２．３ プラスミン変異体のｉｎ ｖｉｔｒｏ血栓溶解活性
末梢動脈閉塞（ＰＡＯ）のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルが、国際公開第０１／３６６０９号パンフレットの実施例６に記載されており、野生型プラスミンの血栓溶解の有効性がこのモデルで実証された。同様の実験を本発明の任意のプラスミン変異体を用いて実施し、末梢動脈閉塞の血栓溶解に対するこれらのプラスミン変異体の有益な効果を測定して野生型プラスミンの有益な効果と比較する。

２．４ プラスミン変異体により誘導される眼の硝子体液化および後部硝子体剥離
国際公開第２００４／０５２２２８号パンフレットの実施例５は、死後のブタの眼における硝子体液化に関するマイクロプラスミンの効果と、その効果を測定するためのアッセイについて開示している。国際公開第２００４／０５２２２８号パンフレットの実施例６は、死後のヒトの眼における後部硝子体剥離（ＰＶＤ）の誘導に関するマイクロプラスミンの効果と、その効果を測定するためのアッセイについて開示している。本発明のプラスミン変異体による硝子体液化およびＰＶＤの誘導を、同様の死後モデルで実証する。

２．５ プラスミン変異体により誘導されるｉｎ ｖｉｖｏのＰＶＤ
国際公開第２００４／０５２２２８号パンフレットの実施例７は、ｉｎ ｖｉｖｏネコモデルにおけるＰＶＤ誘導に関するマイクロプラスミンの効果と、その効果を測定するためのアッセイについて開示している。本発明のプラスミン変異体によるＰＶＤ誘導を、同様のｉｎ ｖｉｖｏモデルで実証する。

プラスミン変異体Ｖａｌ１Ｉｌｅ（Ｖ１Ｉ）の硝子体内注射
後部硝子体剥離（ＰＶＤ）に対するＶ１Ｉマイクロプラスミン変異体の効果を、硝子体内注射の後に調べた。手短に言えば、成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスをネンブタール（０．６ｍｇ／ｋｇの体重）で麻酔した。硝子体内注射は、眼内注射キット、３５Ｇ斜角注射針を備えた１０μｌ注射器、およびマイクロポンプ注射装置を使用して行った。野生型マイクロスプラスミンまたはＶ１Ｉミルコプラスミン変異体のいずれかを種々の濃度で含有するビヒクル１μｌの各注射を、足踏スイッチを踏みながら解剖顕微鏡下で実施した。針先を強膜後部から縁郭に通して、水晶体に接触しない位置に置いた。足踏スイッチを踏むことにより、硝子体中央の腔に注射される製品を噴出させた。

注射５日後にマウスを死なせ、その眼を１％パラホルムアルデヒドで固定した。眼をパラフィンワックスで包埋した後、薄切し、切片を過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ）試薬で染色した。ＰＶＤ誘導を評価するために、全眼の切片について、光学顕微鏡を使用して形態分析を行った。

マイクロプラスミンおよびＶ１Ｉの硝子体内注射の効果
注射５日後における、Ｖ１Ｉを注射した眼の代表的な光学顕微鏡画像を図３に示す。ＰＡＳ染色した眼球切片では、Ｖ１Ｉの注射後における、網膜表面からの硝子体の剥離が示された。マイクロプラスミンを注射した動物では、Ｖ１Ｉ注射後の約５０％のＰＶＤ誘導と比較して、約２０％のＰＶＤ誘導が示された（表２）。ＰＶＤ誘導における、この２倍〜３倍の明らかな増大は、試験したすべての濃度で観察された。

Claims (18)

1. 活性化部位および触媒ドメインを含み、前記触媒ドメインが、ヒトプラスミン触媒ドメインの位置１〜４に、または非ヒトプラスミン触媒ドメインのそれに対応する位置に、１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含有し、前記ヒトプラスミン触媒ドメインが、ヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２に存在するバリンアミノ酸と同じである、位置１のアミノ酸バリンから始まることを特徴とする、単離したプラスミノーゲン変異体もしくはそれから得られるプラスミン変異体、または単離したプラスミン変異体、あるいは前記プラスミン変異体のいずれかのタンパク質分解活性のある誘導体または可逆的に不活性な誘導体。
2. 前記触媒ドメインが位置１で突然変異している場合に、（ｉ）プラスミン触媒ドメインに対して位置−１にあるアミノ酸が、アルギニン、リジン、または活性部位の機能性を維持する他のアミノ酸であり、（ｉｉ）前記ヒトプラスミン触媒ドメインの位置２４または非ヒトプラスミン触媒ドメインの対応する位置にあるアミノ酸が、メチオニンであり、かつ（ｉｉｉ）位置１のアミノ酸が、グリシンともプロリンとも異なるアミノ酸に突然変異している、請求項１に記載のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
3. 前記触媒ドメインが位置１および２で突然変異している場合に、前記ヒトプラスミン触媒ドメインの位置２４または非ヒトプラスミン触媒ドメインの対応する位置にあるアミノ酸が、メチオニンである、請求項１に記載のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
4. 前記突然変異が、発色性基質または生物学的基質による活性アッセイで測定すると、前記プラスミン変異体の自己タンパク質分解による分解の程度を、野生型プラスミンの自己タンパク質分解による分解の程度に比較して低減する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
5. 前記突然変異が、前記触媒ドメインの位置１にあるアミノ酸バリンのイソロイシンへの突然変異である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
6. 自己分解定数が、野生型プラスミンの自己分解定数の最大で９５％であることをさらに特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプラスミン変異体またはプラスミン誘導体。
7. 触媒定数ｋ_ｃａｔが、野生型プラスミンのｋ_ｃａｔの１０％〜２００％の範囲にあることをさらに特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプラスミン変異体またはプラスミン誘導体。
8. 自己分解定数が野生型プラスミンの自己分解定数の最大で９５％であり、触媒定数ｋ_ｃａｔが野生型プラスミンのｋ_ｃａｔの１０％〜２００％の範囲にあることをさらに特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプラスミン変異体またはプラスミン誘導体。
9. 前記プラスミノーゲンまたはプラスミンが、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンまたはＧｌｕ−プラスミン、Ｌｙｓ−プラスミノーゲンまたはＬｙｓ−プラスミン、ミディプラスミノーゲンまたはミディプラスミン、ミニプラスミノーゲンまたはミニプラスミン、マイクロプラスミノーゲンまたはマイクロプラスミン、デルタプラスミノーゲンまたはデルタプラスミンである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離したプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
10. 薬剤として使用するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離したプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、もしくはプラスミン誘導体、またはそれらの任意の組合せ。
11. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離したプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、もしくはプラスミン誘導体、またはそれらの任意の組合せ、および薬学的に許容される希釈剤、担体、または補助剤の少なくとも１つを含む組成物。
12. 抗凝血剤、血栓溶解剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、血管新生阻害剤、有糸分裂阻害剤、抗ヒスタミン剤、または麻酔剤の少なくとも１つをさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
13. 自己タンパク質分解に対して安定なプラスミン変異体をスクリーニングするための方法であって、前記方法が、
    （ｉ）請求項１〜５のいずれか一項に記載のプラスミン変異体を準備すること、および野生型プラスミンを準備することと、
    （ｉｉ）（ｉ）で準備した前記変異体プラスミンおよび前記野生型プラスミンの自己タンパク質分解に対する安定性を比較することと、
    （ｉｉｉ）タンパク質分解活性を保持し、かつ野生型プラスミンの自己タンパク質分解に対する安定性と比較して、自己タンパク質分解に対する安定性が増大している変異体を、（ｉｉ）から選択することと
    を含む方法。
14. 請求項１〜９のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体を産生するための方法であって、前記方法が、
    （ｉ）請求項１〜９のいずれか一項に記載のプラスミノーゲンをコードする核酸を、前記プラスミノーゲンを発現することができる適切な宿主細胞に導入するステップと、
    （ｉｉ）（ｉ）で得られた前記宿主細胞を、前記宿主細胞で前記プラスミノーゲンを発現するのに十分な条件および期間で増殖させるステップと、
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）で発現した前記プラスミノーゲンを回収するステップと
    を含む方法。
15. 請求項１〜９のいずれか一項に記載のプラスミン変異体を産生するための方法であって、前記方法が、
    （ｉ）請求項１〜９のいずれか一項に記載のプラスミノーゲンをコードする核酸を、前記プラスミノーゲンを発現することができる適切な宿主細胞に導入するステップと、
    （ｉｉ）（ｉ）で得られた前記宿主細胞を、前記宿主細胞で前記プラスミノーゲンを発現するのに十分な条件および期間で増殖させるステップと、
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）で発現した前記プラスミノーゲンを回収するステップと、
    （ｉｖ）（ｉｉｉ）の前記プラスミノーゲンをプラスミンに活性化するステップと
    を含む方法。
16. 請求項１〜９のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体またはプラスミン変異体をコードする単離した核酸配列。
17. 請求項１６に記載の核酸を含む組換えベクター。
18. 請求項１６に記載の核酸または請求項１６に記載のベクターで形質転換した宿主細胞。

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