DE69934595T2

DE69934595T2 - Verwendung von verbindungen,die alpha2-antiplasmin in vivo reduzieren,zur herstellung einer zusammensetzung zur behandlung ischämischer schlaganfälle

Info

Publication number: DE69934595T2
Application number: DE69934595T
Authority: DE
Inventors: Nobuo Hamamatsu NAGAI; Jose Desire COLLEN
Original assignee: Katholieke Universiteit Leuven
Current assignee: Katholieke Universiteit Leuven
Priority date: 1998-09-29
Filing date: 1999-09-24
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2019-09-25
Also published as: ATE349226T1; HK1041449B; ES2276536T3; CA2344317A1; HK1041449A1; WO2000018436A1; EP1117437B1; DE69934595D1; US6946438B1; CN1191856C; JP2002525340A; CA2344317C; AU6200599A; JP4577992B2; EP1117437A1; CN1320045A; DK1117437T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Mittel zur Behandlung fokaler ischämischer Zerebralinfarkte (ischämische Schlaganfälle).
Fokale ischämische zerebrale Infarktbildung tritt auf, wenn der arterielle Blutfluss zu einem spezifischen Bereich des Gehirns unter einen kritischen Wert verringert wird, was zu neuronalem Zelltod führt. Es wird angenommen, dass neuronale Degeneration bei zentralen Nervensystem (ZNS)-Krankheiten, wie etwa Schlaganfall, Epilepsie und Alzheimer-Krankheit durch einen Überschuss der anregenden Aminosäure Glutamat stimuliert wird (2). Eine Injektion von Glutamatagonisten in das ZNS induziert tatsächlich neuronalen Zelltod im Hippokampus ähnlich dem, der bei neurodegenerativen Erkrankungen beobachtet wird (3).
Excitotoxin-induzierte neuronale Degeneration wird durch Plasminogenaktivator vom Gewebetyp (t-PA) vermittelt (4). In Übereinstimmung mit der Beobachtung sind Mäuse mit einem Mangel an t-PA resistent gegen, und Infusion von Plaminogenaktivatorinhibitor-1 (PAI-1) schützt gegen Excitotoxin-vermittelte neuronale Degeneration in Hippokampus (4–6).
Außerdem schützen ein Mangel an Plasminogen (Plg), das Zymogensubstrat von t-PA, und die Infusion von α₂-Antiplamin (α₂-AP), Mäuse gegen Excitotoxin-induzierten neuronalen Tod im Hippokampus (5). Es wurde vorgeschlagen, dass Plasmin-vermittelte Degradation von Laminin Neuronen im Hippokampus für den Zelltod sensitiviert, indem die Neuronextrazelluläre Matrixinteraktion unterbrochen wird (7). EP 0 631 786 offenbart die Verwendung von lys-Plasminogen für die Behandlung von Reperfusionsschäden.
Wang et al. (8) haben kürzlich gezeigt, dass neuronale Schädigung nach fokaler zerebraler Ischämie, die durch vorübergehenden Verschluss der mittleren Zerebralarterie hervorgerufen wurde, ebenfalls in Mäusen mit t-PA-Mangel verringert war und durch t-PA-Infusion verschlimmert wurde. Dies deutet darauf hin, dass das Plasminogensystem sowohl an der Bildung eines zerebralen ischämischen Infarkts als auch dessen Ausweitung während der thrombolytischen Therapie beteiligt sein könnte. Es wurde kürzlich gezeigt, dass der neurotoxische Effekt von t-PA auf persistierende fokale zerebrale Ischämie ebenfalls mit anderen thrombolytischen Mitteln auftrat, einschließlich Streptokinase und Staphylokinase (9). Daher könnte bei jenen Patienten mit persistierendem zerebralen Arterienverschluss eine thrombolytische Therapie für einen ischämischen Schlaganfall eine Infarktausweitung verursachen, was nicht nur teilweise die etablierte, insgesamt nutzbringende Wirkung einer arteriellen Rekanalisation aufheben würde (10, 11), sondern tatsächlich für eine Untergruppe von Patienten schädlich sein könnte. Da es nicht möglich ist, zwischen Patienten zu unterscheiden, die eine zerebrale arterielle Rekanalisation mit thrombolytischer Therapie erreichen werden, und jenen, die sie nicht erreichen werden, scheint die Entwicklung von spezifischen konjunktiven Strategien, um den neutrotoxischen Wirkungen von thrombolytischen Mitteln bei persistierender fokaler zerebraler Ischämie entgegenzuwirken, berechtigt zu sein.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neuartiges Mittel zur Verringerung der zerebralen Infarktgröße nach einem ischämischen Schlaganfall vorzusehen.
Bei der Untersuchung, die zu der vorliegenden Erfindung führte, wurde das Folgende in Erwägung gezogen. Obwohl angenommen wird, dass neuronale Schädigung während fokaler Ischämie im Gehirn primär als Wirkung einer Ansammlung von Excitotoxinen wie etwa Glutamaten auftritt, ist die Rolle von Plasmin-vermitteltem Lamininabbau oder alternativen Mechanismen bei der Pathogenese von kortikalem neuronalen Zelltod nicht gezeigt worden. Um den Beitrag der einzelnen Bestandteile des Plasminogen (fibrinolytischen)-Systems auf fokale zerebrale ischämische Infarktbildung zu skizzieren, haben die Erfinder dann die Größe von Infarkten, die durch Abbinden der linken mittleren zerebralen Arterie (MCA) in Mäusen mit gezielter Inaktivierung der Gene, die für Plg, dessen Aktivatoren Plasminogenaktivator vom Gewebetyp (t-PA) oder Plasminogenaktivator vom Urokinasetyp (u-PA) oder die fibrinolytischen Inhibitoren PAI-1 oder α₂-AP kodieren, erzeugt wurden, quantifiziert. Außerdem wurden die Wirkungen von adenoviralem Transfer der t-PA- und PAI-1-Gene und der Infusion von menschlichem α₂-AP auf zerebrale Infarktbildung untersucht.
Während die Ergebnisse von Strickland et al., dass t-PA-Mangel gegen fokale zerebrale ischämische Infarktbildung schützt, vollständig bestätigt wurden, und durch die Beobachtung, dass PAI-1-Mangel zu signifikant größeren Infarktgrößen führte, erweitert wurden, konnte die Beobachtung, dass Plg-Mangel gegen Exzitotoxin-induzierten neuronalen Zelltod schützt, nicht bestätigt werden. Stattdessen wurde herausgefunden, dass die fokale zerebrale Infarktgröße bei Mäusen mit Plg-Mangel signifikant größer war und gegenteilig bei Mäusen mit α₂-AP-Mangel signifikant kleiner.
Im Ganzen deuten diese Erkenntnisse darauf hin, dass Plasminogensystembestandteile die fokale zerebrale ischämische Infarktgröße auf zwei unterschiedlichen Stufen beeinflussen: 1) Verringerung der t-PA-Aktivität (t-PA-Geninaktivierung oder PAI-1-Gentransfer) verringert, während deren Verstärkung (t-PA-Gentransfer oder PAI-1-Geninaktivierung) die Infarktgröße erhöht, und 2) Verringerung von Plg-Aktivität (Plg-Geninaktivierung oder α₂-AP-Injektion) steigert, während deren Verstärkung (α₂-AP-Geninaktivierung oder α₂-AP-Neutralisation) die Infarktgröße verringert. Die Erkenntnisse sind mit einem einzigen verbundenen Weg, bei welchem t-PA-vermittelte Plasminerzeugung zu neuronalem Zelltod führen würde, inkompatibel, weisen jedoch auf zwei unabhängige (t-PA-vermittelte bzw. Plg-vermittelte) Mechanismen hin, die in entgegengesetzter Richtung wirken.
Die innerlich konsistenten Beobachtungen mit α₂-AP waren unerwartet, sind jedoch für die Behandlung ischämischer Schlaganfälle höchst relevant. Erstens wurde eine Korrelation zwischen Infarktgröße und Genotyp gefunden, wobei Heterozygote Infarktgrößen zwischen jenen der Wildtyp- und homozygoten Phänotypen zeigten. Zweitens verursachte eine Bolusinjektion von menschlichem α₂-AP (hα₂-AP) in α₂-AP^–/–-Mäuse eine dosisabhängige Infarktausweitung. Wichtig ist, dass Fab-Fragmente von affinospezifischen polyklonalen Kaninchen-anti-hα₂-AP-Antikörpern, intravenös 40 min nach Verschluss der MCA gegeben, die zerebrale ischämische Infarktgröße signifikant verringerten. Diese Beobachtung legt einen möglichen Weg nahe, fokaler ischämischer Infarktbildung mit der Verwendung von α₂-AP-Inhibitoren (z. B. neutralisierenden monoklonalen Antikörpern oder Verbindungen, welche die α₂-AP-Aktivität neutralisieren) entgegenzuwirken. Diese Herangehensweise wurde durch Infusion von Plasmin in Mäuse mit MCA-Verschluss bestätigt, die durch Neutralisation von α₂-AP die Infarktgröße signifikant verringerte. Die Konzentration von α₂-AP in menschlichem Plasma beträgt 1 mM (12), was einem Gesamtkörperreservoir von ungefähr 500 mg entspricht. Eine äquivalente Dosis eines monoklonalen Fab-Fragments würde ungefähr 400 mg betragen und die von Plasmin ungefähr 500 mg, was für eine einzelne therapeutische Verabreichung hoch, aber nicht übermäßig ist. Außerdem deutet die Beobachtung, dass die Infarktgröße zu dem α₂-AP-Spiegel proportional ist (die von der Gen-Dosis-Wirkung und der Dosisantwort abgeleitet wurde) darauf hin, dass eine teilweise Verringerung des Plasmaspiegels eine signifikante nutzbringende Wirkung haben könnte.
In Hinblick darauf betrifft die Erfindung daher die Verwendung von Verbindungen, welche die α₂-AP-Aktivität in vivo für die Behandlung fokaler zerebraler ischämischer Infarktbildung (ischämischer Schlaganfall) verringern.
In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung werden Verbindungen verwendet, welche die umlaufende α₂-AP-Konzentration verringern. Eine niedrigere Konzentration von α₂-AP wird zu einer niedrigeren Aktivität führen. In einer alternativen Ausführungsform wird die Aktivität von zirkulierendem α₂-AP direkt verringert.
Verbindungen, die α₂-AP neutralisieren sind zum Beispiel Plasmin, Mini-Plasmin (dem die ersten 4 Kringel fehlen) oder Mikro-Plasmin (dem alle fünf Kringel fehlen).
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen, die jedoch nicht den Schutzbereich der Erfindung einschränken sollen ausführlicher dargelegt. In den Beispielen wird Bezug auf die folgenden Zeichnungen genommen:
1 bis 3 sind Histogramme, die das Volumen (in mm³) von fokalen zerebralen ischämischen Infarkten nach Abbinden der mittleren zerebralen Arterie (MCA) in Mäusen vergleichen. Die Daten stellen Mittelwerte dar und die senkrechten Balken SEM, wobei die Zahl der Experimente in den Spalten angegeben ist.
1 zeigt die Wirkung eines Mangels an Plasminogensystembestandteilen (Genotyp in der Abszisse) auf die fokale ischämische Zerebralinarktgröße (in mm³).

WT: Wildtyp (zusammengefasste Werte von 50 % C57BL6/50 % S129, 100 % C57BL6 und 100 % S129 genetischer Hintergrund).

2 zeigt die Wirkung von adenoviralem Transfer der t-PA- oder PAI-1-Gene auf fokale ischämische Zerebralinfarktgröße in t-PA- bzw. PAI-1-defizienten Mäusen.
3 zeigt die Wirkung von α₂-AP auf die fokale ischämische Zerebralinfarktgröße.

A. Wirkung von α₂-AP-Genotyp auf Zerebralinfarktgröße.
B. Wirkung der Injektion von hα₂-AP oder von hαα₂-AP gefolgt von anti-hα₂-AP-Fab-Fragmenten auf die Zerebralinfarktgröße.

Beispiele
Beispiel 1
Murines zerebrales ischämisches Infarktbildungsmodel
1. Einführung
Alle Mäuse, die in die vorliegende Studie einbezogen sind, wurden in der speziellen pathogenfreien Einrichtung des Zentrums für transgene Technologie und Gentherapie, Campus Gasthuisberg, K. U. Leuven erzeugt und gezüchtet. Geninaktivierung wurde durch homologe Rekombination in embryonale Stammzellen erhalten, die auf die Gene gerichtet war, die für Plasminogenaktivator vom Gewebetyp (t-PA) (13), Plasminogenaktivator vom Urokinasetyp (u-PA) (13), Plasminogenaktivatorinhibitor-1 (PAI-1) (14, 15), Plasminogen (Plg) (16) oder α₂-Antiplasmin (α₂-AP) (17) kodieren, wie zuvor beschrieben. Mäuse mit inaktivierten Genen, die für den u-PA-Rezeptor (u-PAR) (18) kodieren, wurden wegen der normalen Ergebnisse, die mit u-PA-defizienten Mäusen erhalten wurden, nicht einbezogen.
2. Materialien und Methoden
2.1 Materialien
Menschliches α₂-AP wurde aus frisch eingefrorenem Plasma, wie zuvor beschrieben, hergestellt (19).
Polyklonale Antiseren wurden in Kaninchen durch subkutane Injektion von 200 mg gereinigtem menschlichen α₂-AP, suspendiert in vollständigem Freund-Adjuvans, gefolgt von Injektion des in unvollständigem Freund-Adjuvanssuspendiertem Antigen in zwei zweiwöchentlichen Intervallen erzeugt. Serum wurde durch wiederholte Ohrvenenpunktion erhalten. Vereinigte Seren wurden auf Protein-A-Sepharose chromatographiert (0,5 ml Serum pro ml nasses Gel), mit 0,1 M Tris.HCl, pH 8,1 äquilibriert und IgG-Eluiert mit 0,1 M Glycin.HCl, pH 2,8, was ungefähr 10 mg Protein pro ml Serum ergab. Affinospezifische Antikörper wurden aus dem dialysierten IgG-Zusammenschluss durch Chromatographie auf einer CNBr-aktivierten Sepharose-Säule erhalten, die mit menschlichem α₂-AP (2,5 mg/ml nasses Gel) substituiert und mit 0,1 M Glycin.HCl, pH 2,8 eluiert wurde, was ungefähr 0,1 mg spezifisches IgG pro aufgebrachtes mg ergab.
Fab-Fragmente wurden aus dem affinospezifischen IgG durch Verdauung mit Papain erhalten. Daher wurde IgG in einer Konzentration von 5 mg/ml aufgelöst und mit 1 Prozent (m/m) Papain in Gegenwart von 50 mM Cystein, 1 mM EDTA, 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0 fünf Stunden verdaut. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Jodacetamid bis zu einer Endkonzentration von 75 mM angehalten. Nach Dialyse wurde die Mischung auf einer Protein-A-Sepharose-Säule gereinigt, die mit PBS equilibriert war. Die Fab-Konzentration wurde durch ELISA, an einem IgG-Standard kalibriert, bestimmt. SDS-Gelelektrophorese zeigte im Wesentlichen homogene Fab-Fragmente (nicht gezeigt).
2.2 Herstellung von adenoviralen Vektoren
Die rekombinanten Adenoviren AdCMVt-PA und AdCMVPAI-1 wurden durch homologe Rekombination in 293-Zellen im Wesentlichen wie zuvor beschrieben erhalten (20). Für AdCMVt-PA, wurde ein XbaI-Fragment des Plasmids pSTEt-PA, das für Wildtyp-humant-PA codierte, in XbaI-verdautes pACCMVpLpA (21) ligiert, um pACCMVt-PA herzustellen. Der Adenovirusvorläufer pACCMVPAI-1 wurde durch Ligieren des 1,4-kb-EcoRI/BglII-Fragments von pPAI-1RBR, das die gesamte codierende Sequenz von menschlichem PAI-1 enthält, in EcoRI/BamHI-verdautes pACCMVpLpA erzeugt. In diesen Plasmiden sind die t-PA- und PAI-1-cDNA zwischen dem menschlichen Cytomegalovirus sofort-früh-Verstärker/Promotor und dem SV40-t-Antigen Intron/Polyadenylierungssignal angeordnet, um eine vollständige Transkriptionseinheit zu bilden.
Einschichtzellkulturen von 293-Zellen (22) wurden mit 10 mg pACCMVt-PA oder pACCMVPAI-1 und 5 mg pJM17 (20), einem Plasmid, das ein vollständiges Adenovirus-5-dl309-Genom enthält, cotransfiziert. Homologe Rekombination zwischen diesen Plasmiden führt zu der Bildung von rekombinanten viralen Genomen, in denen der Adenovirus-E1-Bereich durch die jeweiligen t-PA oder PAI-1 Transgene ersetzt ist. Die Replikation der rekombinanten Viren in kultivierten 293-Zellen wird durch E1A-Genprodukte unterstützt, die in trans von einer Kopie von E1, die in das 293-Zellen-Genom integriert ist, geliefert werden.
Nach Transfektion wurden die rekombinanten viralen Plaques geerntet und, wie beschrieben, amplifiziert (23). Die Identität der rekombinanten Viren wurde durch Restriktionsanalyse und Southern-Blotting von viraler DNA bestätigt, die aus produktiv infizierten 293-Zellen hergestellt wurde. Das rekombinante Adenovirus AdRR5, dem ein eingefügtes Gen in der E1-Position fehlt, wurde auf die gleiche Weise aus pACRR5 und pJMl7 erzeugt und wurde als Kontroll-Adenovirus verwendet (24, 25). Rekombinante Viren wurden erneut geplaqued um vor der weiteren Verwendung klonale Identität sicherzustellen. Die Herstellung des rekombinanten Adenovirus im großen Maßstab wurde durchgeführt wie beischrieben (23). Das gereinigte Virus wurde mit 0,1 mg/ml sterilem Rinderserum-Albumin (BSA), supplementiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80 °C bis zur Verwendung gelagert. Der Titer infektiöser viraler Teilchen in gereinigten Vorratslösungen wurde durch Plaque-Versuch auf Einzelschichten von 293-Zellen mit einer Stunde Adsorption bei 37 °C bestimmt. Gereinigte virale Vorratslösungen von >10¹⁰ Plaque-bildenden Einheiten (pfu) pro ml wurden routinemäßig erhalten. Die Kinetik und Organverteilung von t-PA- und PAI-1-Expression im Anschluss an adenoviralen Transfer durch intravenöse Bolusinjektion sind bereits an anderer Stelle beschrieben worden (26, 27).
2.3 Herstellung von menschlichem Plasmin
Menschliches Plasminogen wurde aus frisch gefrorenem menschlichen Blutbankplasma hergestellt, im Wesentlichen wie zuvor beschrieben (28). Menschliches Plasma (6 Liter), zu dem 20 Einheiten Aprotinin (Trasynol, Bayer, Deutschland) pro ml gegeben wurden, wurde durch Zentrifugieren bei 4.000 Upm für 15 min bei 4 °C geklärt. Lysin-Sepharose (200 g Nassgewicht, Substitutionsspiegel ungefähr 1 mg Lysin pro g nasses Sepharosegel) wurde zu dem Überstand gegeben, die Mischung eine Stunde bei 4 °C gerüht und das Gel auf einem Büchnertrichter wiedergewonnen. Dann wurden 120 g Lysin-Sepharose zu dem Filtrat gegeben, die Mischung gerührt und das Gel wie oben wieder gewonnen. Die vereinigten Gelfraktionen wurden mit 18 Liter 0,2 M K₂HPO₄/KH₂PO₄-Puffer, pH 7,5, der 10 Einheiten Aprotinin pro ml enthielt, gewaschen, dann in eine 5 × 60 cm Säule gegossen und mit 0,02 M NaH₂PO₄, 0,1 M NaCl-Puffer, pH 7,5, der 10 Einheiten/ml Aprotinin enthielt, bei 4 °C gewaschen, bis die Absorbanz der Waschflüssigkeit bei 280 nm weniger als 0,05 betrug. Die Säule wurde dann mit einem Waschpuffer, der 0,05 M 6-Aminohexansäure enthielt, eluiert, und Protein enthaltende Fraktionen wurden vereinigt. Aus 6 Liter Plasma wurden ungefähr 145 ml Flüssigkeit, die 650 mg Protein enthielt, erhalten. Die vereinigten Flüssigkeiten wurden 2,5-fach auf einem Amicon PM10-Filter konzentriert und auf einer 5 × 90 cm Säule aus Ultragel AcA44, die mit 0,02 M NaH₂PO₄, 0,1 M NaCl-Puffer, pH 7,5 äquilibriert wurde, bei einer Geschwindigkeit von 60 ml pro Stunde gelfiltriert. Der Hauptpeak, der ungefähr 590 mg Protein enthielt, wurde auf einem Amicon PM10-Filter auf eine Konzentration von 10 mg/ml konzentriert und bis zur Verwendung eingefroren.
Menschliches Plasmin wurde aus Plasminogen wie folgt hergestellt. Lysin-Sepharose (20 g nasses Gel) wurde zu menschlicher Plasminogen (200 mg)-Lösung zugegeben, die Mischung drei Stunden bei 4 °C gerührt, das Gel auf einem Büchnertrichter gewaschen und in 30 ml 0,1 M NaH₂PO₄-Puffer, pH 7,4 resuspendiert. Urokinase (500 μl einer 50 μM-Lösung, hergestellt durch Aktivierung von Saruplase (Grünenthal, Aachen, Deutschland) mit Plasmin. Sepharose wurde zugegeben und die Mischung für 15 Stunden bei 4 °C gerührt. Das Gel wurde dann auf einem Büchnertrichter mit 0,1 M NaH₂PO₄-Puffer, pH 7,4 gewaschen, in eine 1,5 × 16 cm Säule gegossen, mit 0,1 M NaH₂PO₄-Puffer, pH 7,4 gewaschen, bis die Absorbanz bei 280 nm der Waschflüssigkeit weniger als 0,05 betrug, und mit 0,1 M NaH₂PO₄-Puffer, der 0,05 M 6-Aminohexansäure enthielt, eluiert. Die Protein enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, Glyzerin wurde bis zu einer Endkonzentration von 10 Prozent zugegeben, und die vereinigten Flüssigkeiten wurden bei 4 °C gegen 0,1 M NaH₂PO₄-Puffer, der 10 Prozent Glyzerin enthielt, dialysiert. Die abschließende Wiedergewinnung war 25 ml Lösung mit einer Proteinkonzentration von 4,0 mg/ml und einer aktiven Plaminkonzentration von 25 μM.
2.4 Messung von α₂-Antiplasmin im Plasma
α₂-Antiplasminspiegel in murinem Plasma wurden durch einen chromogenen Substratversuch gemessen, basierend auf seiner schnellen Inhibierung von Plasmin (29). In Kürze, 10 μl Mäuseplasma (1/10 verdünnt in 0,05 M NaH₂PO₄-Puffer, pH 7,4, 0,01 % Tween 20 enthaltend) werden bei 37 °C mit 420 μl 0,05 Tris HCl, 0,1 M NaCl-Puffer, pH 7,4, der 0,01 % Tween 20 enthält, und mit 20 μl 0,125 μM menschlichem Plasmin (Endkonzentration 5 nM) gemischt. Nach 10 s Inkubierung werden 50 μl 3 mM S2403 (Chromogenics, Antwerpen, Belgien) zugegeben, und die Veränderung der Absorbanz wird bei 405 nm gemessen. Die Veränderung der Absorbanz beträgt ungefähr 0,18 min^–1 mit Puffer und 0,09 min^–1 mit vereinigtem murinem Plasma.
2.5 Tierversuche
Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien der Amerikanischen Physiologischen Gesellschaft und des Internationalen Komitees für Thrombose und Hämostase durchgeführt (30).
Fokale zerebrale Ischämie wurde durch andauernden Verschluss der MCA gemäß Welsh et al. erzeugt (31). In Kürze, Mäuse beider Geschlechter, die 20 bis 30 g wogen, wurden durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (75 mg/ml, Apharmo, Arnheim, Niederlande) und Xylazin (5 mg/ml, Bayer, Leverkusen, Deutschland) anästhesiert. Atropin (1 mg/kg; Federa, Brüssel, Belgien) wurde intramuskulär verabreicht, und die Körpertemperatur wurde durch Aufbewahren der Tiere auf einem Wärmekissen aufrechterhalten. Ein "U"-förmiger Einschnitt wurde zwischen dem linken Ohr und dem linken Auge gemacht. Die oberen und hinteren Segmente des Schläfenmuskels wurden durchtrennt, und der Schädel wurde durch Zurückziehen des Schläfenmuskels freigelegt. Eine kleine Öffnung (1 bis 2 mm Durchmesser) wurde in dem Bereich über der MCA mit einem handgehaltenen Bohrer hergestellt, wobei mit Kochsalzlösung übergossen wurde, um Wärmeschädigungen zu verhindern. Die Hirnhäute wurden mit einer Pinzette entfernt, und die MCA wurde durch Abschnüren mit einem 10-0 Nylonfaden (Ethylon, Neuilly, Frankreich) verschlossen und distall von dem Abschnürungspunkt durchtrennt. Schließlich wurden der Schläfenmuskel und die Haut zurück an ihrer Stelle vernäht.
AdCMVt-PA, AdCMVPAI-1 oder AdRR5 wurden als intravenöser Bolus von 1,3 × 10⁹ plaquebildenden Einheiten (p.f.u.) vier Tage vor Abschnürung der MCA gegeben. Menschliches α₂-AP (hα₂-AP) wurde intravenös in zwei Injektionen geteilt gegeben, die 1 min vor bzw. 30 min nach Abschnürung der MCA gegeben wurden. Fab-Fragmente wurden intravenös als Bolus injiziert, 10 min nach der zweiten hα₂-AP-Injektion. Menschliches Plasmin wurde intravenös als Bolus gegeben, entweder 15 min vor oder 15 min nach Abschnürung der MCA.
Man lies die Tiere sich erholen, und dann wurden sie in ihre Käfige zurückgesetzt. Nach 24 Stunden wurden die Tiere mit einer Überdosis Nembutal (500 mg/kg, Abbott Laboratories, North Chicago, IL) geopfert und enthauptet. Das Gehirn wurde entfernt und zum Zerschneiden in 1 mm Segmente in einer Matrix angeordnet. Die Schnitte wurden in 2 %-iges 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) in Kochsalzlösung getaucht (32), 30 min bei 37 °C inkubiert und in 4 %-iges Formalin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gegeben. Bei dieser Prozedur bleibt das nekrotische Infarktgebiet ungefärbt (weiß) und ist deutlich von gefärbtem (ziegelrotem) lebenden Gewebe unterscheidbar. Die Schnitte wurden photographiert und Planimetrie unterworfen. Das Infarktvolumen wurde als die Summe der ungefärbten Gebiete der Schnitte multipliziert mit ihrer Dicke definiert.
Die Daten sind als Mittelwert ± SEM von n Bestimmungen dargestellt. Die Signifikanz der Unterschiede wurde durch Anwendung einer Varianzanalyse gefolgt von dem Fisher-PLSD-Test unter Verwendung des Statview-Software-Pakets, oder durch den T-Test nach Student bestimmt.
Beispiel 2
Zerebrale ischämische Infarktgröße in Mäusen mit gezielter Inaktivierung von Genen, die für Plasminogensystembestandteile codieren.
Abschnürung der linken MCA erzeugte einen Zerebralinfarkt mit einem Volumen von 7,6 ± 1,1 mm³ (n = 11) in Wildtypmäusen mit einem gemischten (50 %) S129 und (50 %) C57BL/6 im genetischen Hintergrund, von 9,3 ± 2,7 mm³ (n = 6) in Inzucht-C57BL/6-Mäusen und von 6,4 ± 1,3 mm³ (n = 6) in Inzucht-S129-Mäusen (p = NS gegenüber gemischtem Hintergrund, Ergebnisse nicht gezeigt).
Inaktivierung des t-PA-Gens war mit einer signifikanten Verringerung der Infarktgröße auf 2,6 ± 0,80 mm³ (n = 11), (p < 0,0001 gegenüber Wildtypmäusen) verbunden, während die Inaktivierung des u-PA-Gens keinen Effekt auf die Infarktgröße hatte (7,8 ± 1,0 mm³, n = 8, p = NS gegenüber Wildtyp).
Inaktivierung des PAI-1-Gens war mit einer signifikanten Zunahme der Infarktgröße (16 ± 0,52 mm³, n = 6, p < 0,0001 gegenüber Wildtyp) verbunden (1). In Mäusen mit inakti vierten Plg-Genen war die Zerebralinfarktgröße signifikant größer als in Wildtypmäusen (12 ± 1,2 mm³, n = 9, p = 0,037 gegenüber Wildtyp), während im Gegenteil in α₂-AP-gendefizienten Mäusen die Infarktgröße merklich verringert war (2,2 ± 1,1 mm³, n = 7, p = 0,0001 gegenüber Wildtyp) (1).
Beispiel 3
Wirkung von t-PA- und PAI-1-Gentransfer auf die zerebrale Infarktgröße
Die Injektion von 1,3 × 10⁹ p.f.u. AdCMVt-PA in 6 t-PA^–/–-Mäuse vier Tage vor dem MCA-Abbinden war mit einer Zerebralinfarktgröße von 6,0 ± 1,3 mm³ verbunden, signifikant größer als die Infarkte in 5 t-PA^–/–-Mäusen, die mit dem Kontrollvirus AdRR5 injiziert wurden (1,8 ± 0,63, p = 0,028) (2A). Im Gegensatz dazu war die Injektion von 1,3 × 10⁹ p.f.u. AdCMVPAI-1 in 5 PAI-1^–/–-Mäusen mit einer Zerebralinfarktgröße von 10 ± 1,4 mm³ verbunden, was signifikant kleiner ist als die Infarkte in 5 PAI-1^–/–-Mäusen, die mit dem Kontrollvirus AdRR5 injiziert wurden (13 ± 1,0 mm³, p = 0,019) (2B).
Beispiel 4
Wirkung von α₂-Antiplasmin auf zerebrale Infarktgröße
Die Zerebralinfarktgröße korrelierte mit der α₂-AP-Gendosis, die jeweils 11 ± 2,0, 4,9 ± 2,0 und 2,2 ± 1,1 mm³ in Wildtyp-, heterozygoten und homozygoten defizienten Mäusen entsprach (3A). Die Injektion von menschlichem α₂-AP in Gruppen von 4 α₂-AP-^–/–-Mäusen steigerte die Infarktgröße auf 13 ± 2,5 mm³ (n = 4) bei einer 1 mg Gesamtdosis und auf 11 ± 1,5 mm³ (n = 6) mit einer 0,2 mg Gesamtdosis. Die Injektion von 1,7 mg affino-spezifischem Fab gegen menschliches α₂-AP in Mäusen, denen 0,2 mg menschliches α₂-AP gegeben wurde, verringerte die Zerebralinfarktgröße auf 5,1 ± 1,1 mm³ (n = 7, p = 0,0040 gegenüber 0,2 mg menschlichem α₂-AP) (3B).
Die Beispiele oben zeigen, dass eine Verringerung der α₂-AP-Aktivität (verringerte α₂-AP-Genexpression oder Verringerung des zirkulierenden α₂-AP mit Inhibitoren) die fokale zerebrale ischämische Infarktgröße verringert, wie sie während eines ischämischen Schlaganfalls auftritt.
Beispiel 5
Wirkung von Plasmin auf die Zerebralinfarktgröße
Die Injektion von 50, 100 oder 150 μg menschlichem Plasmin (Pli) in Mäuse, die ungefähr 30 g wogen, verringerte die α₂-AP-Spiegel in Blutproben, die nach 30 s genommen wurden, auf 67, 40 bzw. 31 Prozent der Basislinie (Mittel von zwei Mäusen, mit weniger als 15 Prozent Variabilität). Die Injektion von 200 μg Pli in drei Mäuse verringerte die Plasma-α₂-AP-Spiegel auf 59 ± 4,8, 67 ± 4,4 und 70 ± 2,5 Prozent nach 2, 4 bzw. 6 Stunden.
Das Abbinden der linken mittleren Zerebralarterie (MCA) rief einen Zerebralinfarkt mit einem Volumen von 27 ± 1,3 mm³ (n = 10) in Inzucht-Balb/c-Mäusen und von 16 ± 1,3 mm³ (n = 12) in Inzucht-C57BL/6-Mäusen hervor.
Die Injektion von 0,2 mg Pli in Balb/c-Mäuse verringerte die Infarktgröße auf 22 ± 1,0 mm³ (n = 9) (p = 0,006 gegenüber Kochsalzlösung). Ähnliche Abnahmen wurden beobachtet, wenn die Pli-Injektion 15 min vor oder 15 min nach Abbinden der MCA gegeben wurde (Tabelle 1). Bei C57B1/6-Mäusen verringerte die Injektion von 0,2 mg Pli die Infarktgröße auf 10 ± 1,2 mm³ (n = 12) (p = 0,004 gegenüber Kochsalzlösung).
Literatur

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Claims

Verwendung eines α₂-Antiplasmininhibitors, ausgewählt aus der Gruppe aus Plasmin, Mini-Plasmin, welchem die ersten vier Kringel fehlen, und Mikro-Plasmin, welchem alle fünf Kringel fehlen, zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung zur Verringerung der Zerebralinfarktgröße nach einem ischämischen Schlaganfall.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Inhibitor Plasmin ist und die Menge an Plasmin in der therapeutischen Zusammensetzung ungefähr 500 mg beträgt.