JP4577992B2 - 虚血性卒中の処置用の組成物を調製するための、α２抗プラスミンをインビボで減少する化合物の使用 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、焦点虚血性脳梗塞（虚血性卒中）を処置するための新しい手段に関する。
【０００２】
焦点虚血性脳梗塞は、脳の特殊な領域への動脈血流が臨界レベル以下になったときに生じ、神経細胞が死ぬ。中枢神経系（ＣＮＳ）疾患におけるニューロン変性、例えば、脳卒中、てんかん、アルツハイマー病などは、過剰の興奮性アミノ酸グルタメートにより刺激されると思われる(２)。ＣＮＳにグルタメート・アゴニストを注入すると、神経変性疾患にみられるような海馬のニューロン細胞の死が実際に起きる（３）。
【０００３】
エクサイトトキシン誘導ニューロン変性は、組織型プラスミノーゲン・アクチベーター（ｔ−ＰＡ）により仲介される（４）。この観察と同じく、ｔ−ＰＡ欠損マウスはエクサイトトキシン誘導の海馬ニューロン変性に抵抗性があり、プラスミノーゲン・アクチベーター阻害剤−１（ＰＡＩ−１）がこの変性を防御する（４−６）。
【０００４】
さらに、プラスミノーゲン（Ｐｌｇ）の欠損、ｔ−ＰＡのチモーゲン基質、α２抗プラスミン（α２−ＡＰ）の注入は、エクサイトトキシン誘導の海馬ニューロン変性からマウスを保護する(５)。ラミニンのプラスミン仲介変性が、ニューロン−細胞外マトリックスの相互作用を破壊して、海馬ニューロンの細胞死を敏感にするといわれている(７)。
【０００５】
Wang らの最近の発表（８）によると、中位脳動脈の一時的な閉塞による焦点脳虚血後のニューロン損傷もマウスにおいてｔ−ＰＡ欠損により減少し、ｔ−ＰＡ注入により悪化した。このことからすると、プラスミノーゲン系は、脳虚血性梗塞の成立と血栓溶解療法における脳虚血性梗塞の進行との両方に関与するようである。最近の発表では、治りにくい焦点脳虚血に対するｔ−ＰＡの神経毒作用も、ストレプトキナーゼやスタフィロキナーゼなどの他の血栓溶解剤で生じる（９）。このように、治りにくい脳動脈閉塞の患者において、虚血性卒中のための血栓溶解療法は梗塞を進行することがある。これは、動脈の再疎通についての確立したすべての有益な効果を部分的になくしてしまうだけでなく、ある種の患者にとっては非常に有害となりかねない。血栓溶解療法での脳動脈再疎通ができる患者とできない患者とを識別するのは不可能であるので、治りにくい焦点脳虚血に対する血栓溶解剤の神経毒作用に拮抗する具体的な総合的方策の開発が是認されるところである。
【０００６】
よって、本発明の目的は、焦点虚血性卒中を処置するための新しい手段を提供することである。
【０００７】
本発明に至った研究において、下記の事項が検討された。脳での焦点虚血における神経の損傷は、グルタメートなどのエクサイトトキシンの蓄積の結果として主に生じると推定されているが、皮質神経細胞の死についての病理におけるプラスミン仲介ラミニン変性あるいは代替メカニズムの役割は知られていない。焦点脳虚血性梗塞に対するプラスミノーゲン（フィブリノーゲン分解性）系の個々の要素の関与を描写するために、本発明者は、マウスの左の中位脳動脈（ＭＣＡ）の結紮によって生じた梗塞のサイズの定量を、Ｐｌｇ、そのアクチベーター組織型プラスミノーゲン・アクチベーター（ｔ−ＰＡ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン・アクチベーター（ｕ−ＰＡ）、フィブリノーゲン分解性阻害剤ＰＡＩ−１またはα２−ＡＰをコードする遺伝子についての不活化を標的として行った。さらに、ｔ−ＰＡおよびＰＡＩ−１の遺伝子のアデノウイルス輸送の作用および脳梗塞に対するヒトα２−ＡＰの注入の作用を調べた。
【０００８】
ｔ−ＰＡ欠損が焦点脳虚血性梗塞を防ぐとの Strickland et al.の知見を完全に確認でき、またｔ−ＰＡ欠損が有意に大きい梗塞サイズをもたらしたが、Ｐｌｇ欠損がエクサイトトキシン誘発の神経細胞死を防ぐとの観察は確認できなかった。代わりに、焦点脳梗塞のサイズがＰｌｇ欠損のマウスで有意に大きく、逆にα２−ＡＰ欠損のマウスで有意に小さいことが分かった。
【０００９】
全体として、これらのことからすると、プラスミノーゲン系の要素は焦点脳虚血性梗塞のサイズに２つの異なるレベルで影響を及ぼす。すなわち、１）ｔ−ＰＡ活性の減少（ｔ−ＰＡ遺伝子の不活性化またはＰＡＩ−１遺伝子の輸送）が梗塞サイズを減少し、その増大（ｔ−ＰＡ遺伝子の輸送またはＰＡＩ−１遺伝子の不活性化）が梗塞サイズを増加する。２）Ｐｌｇ活性の減少（Ｐｌｇ遺伝子の不活性化またはα２−ＡＰの注入）が梗塞サイズを増加し、その増大（α２−ＡＰ遺伝子の不活性化またはα２−ＡＰの中性化）が梗塞サイズを減少する。この知見は、ｔ−ＰＡ仲介プラスミン生成が神経細胞死をもたらすであろう特別のリンク経路と相容れないで、反対方向に作用する２つの独立的（ｔ−ＰＡ仲介およびＰｌｇ仲介）メカニズムを示唆する。
【００１０】
α２−ＡＰを体内で常に観察することは期待されなかったが、虚血性卒中の処置に最も関係する。第１に、梗塞サイズと遺伝子型とに相関があり、梗塞サイズを表すヘテロ接合体が野生型とホモ接合表現型の中間にある。第２に、ヒトα２−ＡＰ（ｈα２−ＡＰ）をα２−ＡＰ−１−マウスに注射すると、用量依存性梗塞の展開が生じる。重要なことに、アフィノ特異的ポリクローナルウサギ抗ｈα２−ＡＰ抗体は、ＭＣＡの閉塞４０分後の静注で、脳虚血性梗塞サイズを有意に減少する。このことは、α２−ＡＰ阻害剤（例えば、中和モノクローナル抗体またはα２−ＡＰを中和する化合物）を使用して焦点虚血性卒中に拮抗する経路の可能性を示唆している。これは、ＭＣＡ閉塞を持つマウスにプラスミンを注入することにより確認した。α２−ＡＰの中和により、梗塞のサイズが有意に減少した。ヒトの血漿中のα２−ＡＰの濃度は１ｍＭであり（１２）、対応する全身体量は約５００ｍｇである。モノクローナルＦａｂ断片の等価量は約４００ｍｇであり、プラスミンの等価量は５００ｍｇであり、これは１回の治療投与として高いが過剰ではない。さらに、梗塞のサイズがα２−ＡＰレベル（遺伝子用量効果すなわち用量応答から誘導）に比例することからして、血漿レベルの部分的な減少が顕著に有益の効果をもたらすのではないかと思われる。
【００１１】
上記の観点において、本発明は、焦点脳虚血性梗塞（虚血性卒中）の処置のためにインビボでα２−ＡＰ活性を減少する化合物の使用に関する。
【００１２】
本発明使用の具体的な実施態様において、循環するα２−ＡＰ濃度を減少する化合物をつくる。α２−ＡＰの低濃度は低活性をもたらす。別の実施態様において、循環するα２−ＡＰの活性が直接的に減少する。
【００１３】
α２−ＡＰの濃度および活性の減少に適した化合物は、例えば、α２−ＡＰ中和抗体またはその誘導体である。好ましい抗体はモノクローナル抗体である。好ましい誘導体はＦａｂ断片やｓｃＦｖ断片である。
【００１４】
α２−ＡＰを中和する化合物は、例えば、プラスミン、ミニプラスミン（最初の４クリングルを欠く）、ミクロプラスミン（全５クリングルを欠く）である。
【００１５】
本発明を下記の実施例でさらに詳細に示す。これは発明の範囲を限定する意図ではない。実施例において下記の図面を参照する。
【００１６】
図１−３は、マウス中位脳動脈（ＭＣＡ）の結紮後、焦点脳虚血性梗塞の容量（ｍｍ３）を比較した棒グラフである。平均値とＳＥＭ（水平棒）を示し、コラム中の数字は実験回数である。
【００１７】
図１は、焦点脳虚血性梗塞サイズに対するプラスミノーゲン系の要素（横線における遺伝子型）の欠損効果を示す。ＷＴ：野生型（５０％Ｃ５７ＢＬ６／５０％Ｓ１２９、１００％Ｃ５７ＢＬ６、１００％Ｓ１２９遺伝背景の蓄積値）。
【００１８】
図２は、それぞれｔ−ＰＡまたはＰＡＩ−１欠損マウスにおける焦点虚血性脳梗塞サイズに対するｔ−ＰＡまたはＰＡＩ−１遺伝子のアデノウイルス輸送効果を示す。
【００１９】
図３は、焦点脳虚血性梗塞サイズに対するα２−ＡＰの効果を示す。
Ａ．虚血性梗塞サイズに対するα２−ＡＰの効果。
Ｂ．虚血性梗塞サイズに対するα２−ＡＰまたはα２−ＡＰの注入、その後の抗α２−ＡＰのＦａｂ断片の注入の効果。
【００２０】
実施例１
ネズミの脳虚血性梗塞モデル
１．説明
本試験で使用したマウスはすべて、K.U.LeuvenのGasthuisbergキャンパスの遺伝子組換え技術・遺伝子治療センターの無菌施設で生まれ飼育した。遺伝子の不活性化は、組織型プラスミノーゲン・アクチベーター（ｔ−ＰＡ）（１３）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン・アクチベーター（ｕ−ＰＡ）（１３）、プラスミノーゲン・アクチベーター阻害剤−１（ＰＡＩ−１）（１４、１５）、プラスミノーゲン（Ｐｌｇ）（１６）、α２抗プラスミン（α２−ＡＰ）（１７）をコードする遺伝子を標的とする胚幹細胞における相同的組換えで行った。ｕ−ＰＡ受容体（ｕ−ＰＡＲ）（１８）をコードする不活性化遺伝子を有するマウスは、ｕ−ＰＡ欠損マウスで正常な結果が得られたため、含めなかった。
【００２１】
２．材料と方法
２．１．材料
ヒトα２−ＡＰを、上記したような新鮮凍結血漿から調製した（１９）。
ポリクローナル抗血清をウサギに、完全フロインド・アジュバントに懸濁した２００ｍｇ精製ヒトα２−ＡＰを皮下注入し、ついで不完全フロインド・アジュバントに懸濁した抗原の２週間間隔の２回注入で作った。血清は耳静脈の穿刺を繰り返して得た。集めた血清をタンパク質Ａセファロースのクロマトグラフィにかけた。０.１ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８.１で調整し、０.１ＭグリシンＨＣｌ、ｐＨ２.８でＩｇＧを溶出して、血清１ｍｌにつき約１０ｍｇのタンパク質を得た。アフィノ特異的抗体を透析ＩｇＧから、ヒトα２−ＡＰ（２.５ｍｇ／ｍｌ湿潤ゲル）で置換したＣＮＢｒ活性化セファロース・カラムのクロマトグラフィで得た。、０.１ＭグリシンＨＣｌ、ｐＨ２.８で溶出して、適用ｍｇにつき約０.１ｍｇの特異的ＩｇＧを得た。
【００２２】
Ｆａｂ断片をアフィノ特異的ＩｇＧからパパイン消化で得た。すなわち、ＩｇＧを濃度５ｍｇ／ｍｌに溶解し、１％（ｗ／ｗ）のパパインで、５ｍＭのシステイン、１ｍＭのＥＤＴＡ、０.１Ｍのリン酸緩衝液の存在下に、ｐＨ７.０で５時間消化した。反応の停止のためにヨードアセトアミドを最終濃度７５ｍＭまで加えた。透析後、混合物をＰＢＳで調整したタンパク質Ａセファロースカラムで精製した。Ｆａｂ濃度をＩｇＧ標準で較正したＥＬＩＳＡで決定した。ＳＤＳゲル電気泳動は基本的に相同性のＦａｂ断片を表した（表示せず）。
【００２３】
２．２．アデノウイルス・ベクターの製造
組換えアデノウイルスＡｄＣＭＶｔ−ＰＡおよびＡｄＣＭＶＰＡＩ−１を、基本的に上記した２９３細胞における相同性組換えによりつくった（２０）。ＡｄＣＭＶｔ−ＰＡについては、野生型ヒトｔ−ＰＡをコードするプラスミドｐＳＴＥｔ−ＰＡのＸｂａＩ断片をＸｂａＩ消化ｐＡＣＣＭＶｐＬｐＡ（２１）中に連結して、ｐＡＣＣＭＶｔ−ＰＡを得た。アデノウイルス前駆体ｐＡＣＣＭＶＰＡＩ−１は、ヒトＰＡＩ−１の全コード配列を含有するｐＰＡＩ−１ＲＢＲの１.４ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢｇｌII断片を、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化ｐＡＣＣＭＶｐＬｐＡ中に連結して作った。これらのプラスミドにおいて、ｔ−ＰＡおよびＰＡＩ−１のｃＤＮＡは、サイトメガロウイルス即時型初期エンハンサー／プロモーターとＳＶ４０ｔ−抗原イントロン／ポリアデニル化信号との間に位置して、完全な転写単位を形成する。
【００２４】
２９３細胞（２２）の単層培養物を、１０ｍｇのｐＡＣＣＭＶｔ−ＰＡまたはｐＡＣＣＭＶＰＡＩ−１および５ｍｇのｐＪＭ１７（２０）、完全長アデノウイルス５ｄｌ３０９ゲノムを含有するプラスミドで共トランスフェクトした。これらのプラスミド間の相同性組換えは、アデノウイルスＥ１領域がそれぞれｔ−ＰＡまたはＰＡＩ−１形質転換遺伝子で置換された組換えウイルスゲノムを形成する。培養２９３細胞における組換えウイルスの複製は、２９３細胞ゲノムに組み込まれたＥ１コピーからのトランスに供給されたＥ１Ａ遺伝子産物により支持される。
【００２５】
トランスフェクト後に組換えウイルスを採取し、（２３）記載のように増幅した。組換えウイルスの同一性は、生産的感染の２９３細胞からつくったウイルスＤＮＡについての制限分析およびサザンブロット法により決定した。組換えアデノウイルスＡｄＲＲ５は、Ｅ１位置に組込まれた遺伝子を欠いており、同様の方法でｐＡＣＲＲ５およびｐＪＭ１７からつくり、対照ウイルスとして使用できる（２４，２５）。組換えウイルスを再接種してクローナル同一性を確認してから、さらに使用する。組換えアデノウイルスの大量生産を（２３）記載のように行った。精製ウイルスに０.１ｍｇ／ｍｌの無菌ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充し、液体窒素で即時凍結して−８０℃で使用まで保存した。精製保存液中の感染ウイルス粒子の力価は、３７℃での１時間吸収で２９３細胞の単一層に対するプラーク検定法で決定した。精製ウイルス保存液は、ｍｌにつき１０１０プラーク形成ユニット（Ｐｆｕ）で通常得た。静脈ボラス注射によるアデノウイルス輸送後のｔ−ＰＡおよびＰＡＩ−１発現の反応速度および臓器分布は、別に示されている（２６、２７）
【００２６】
２．３．ヒトプラスミンの調製
ヒトプラスミノーゲンを、基本的に（２８）記載のように、新鮮な凍結ヒト血液バンク血漿から調製した。ヒト血漿（６リットル）に１ｍｌ当り２０単位のアプロチニン（Trasylol, Bayer、ドイツ）を加え、１５分間４℃、４０００ｒｐｍで遠心分離した。リシン−セファロース（２００湿重量、置換レベルがセファロースゲルｇ湿重量につき約１ｍｇのリシン）を上澄み液に加え、混合物を１時間４℃で攪拌し、ゲルをブッフネルろうとに回収した。１２０ｇのリシン−セファロースを濾液に加え、混合物を攪拌してゲルを上記のように回収した。合わせたゲルフラクションを、１０単位／ｍｌのアポチニン含有の１８リットルの０.２ＭのＫ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７.５で洗い、ついで５ｘ６０ｃｍカラムに注ぎ、１０単位のアポチニン含有の０.０２ＭのＮａＨ２ＰＯ４、０.１ＭのＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７.５、４℃で洗って、２８０ｎｍでの洗液の吸収を０.０５以下とした。カラムを０.０５Ｍの６−アミノヘキサン酸を含有する緩衝液で溶出し、タンパク質含有のフラクションを集めた。６リットルの血漿から６５０ｍｇのタンパク質含有の約１４５ｍｌの液を得た。これをAmicon PM10 フィルターで２.５倍に濃縮し、ウルトラゲルＡｃＡ４４の５ｘ９０ｃｍカラム上で濾過したゲルを０.０２ＭのＮａＨ２ＰＯ４、０.１ＭのＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７.５で、１時間につき６０ｍｌの速度で洗った。約５９０ｍｇのタンパク質を含有する主ピークをAmicon PM10 フィルター上で濃度１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、使用まで凍結した。
【００２７】
ヒトプラスミンをプラスミノーゲンから下記のように調製した。リシン−セファロース（２０ｇ湿ゲル）をヒトプラスミノーゲン（２００ｍｇ）溶液に加え、混合物を３時間４℃で攪拌し、ゲルをブッフネルろうと上で洗い、３０ｍｌの０.０１ＭのＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７.４に再懸濁した。ウロキナーゼ（５００μｌの５０μＭ溶液、Saruplase (Gruenenthal, Aachen、ドイツ）より調製）およびプラスミン・セファロースを加え、混合物を１５時間４℃で攪拌した。ゲルをブッフネルろうと上で０.１ＭのＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７.４で洗い、１.５ｘ１６ｃｍカラムに注ぎ、０.１ＭのＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７.４で洗い、２８０ｎｍでの洗液の吸収が０.０５以下とした。０.０５Ｍの６−アミノヘキサン酸を含有する０.１ＭのＮａＨ２ＰＯ４緩衝液で溶出した。タンパク質含有のフラクションを集めて、グリセロールを最終濃度１０％まで加え、集めて、１０％グリセロール含有の０.１ＭのＮａＨ２ＰＯ４に対して４℃で透析した。最終回収物は、タンパク質濃度４.０ｍｇ／ｍｌおよび活性プラスミン濃度２５μＭを有する溶液２５ｍｌであった。
【００２８】
２．４．血漿中のα２抗プラスミンの測定
ネズミ血漿中のα２抗プラスミンの測定を、プラスミンの迅速阻害（２９）に基づき色素遺伝子基質検定法により行った。簡単に言うと、１０μｌマウス血漿（０.０１％ツイン２０を含有する０.０５ＭのＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７.４に１／１０稀釈）を３７℃で４２０μｌの０.０５トリスＨＣｌ、０.０１％ツイン２０を含有する０.１ＭのＮａＣｌ緩衝液、および２０μｌの０.１２５μＭヒトプラスミン（最終濃度５ｎＭ）と混合する。１０秒インキュベートし、５０μｌの３ｍＭのＳ２４０３（Chromogenics, Antwerp、ベルギー）を加え、吸収の変化を４０５ｎｍで測定した。吸収の変化は、緩衝液で約０.１８分−１、集めたネズミ血漿で０.０９分−１であった。
【００２９】
２．５．動物実験
動物実験を、血栓症および止血についての米国生理学会および国際委員会の指針（３０）にしたがって行った。
【００３０】
焦点脳虚血を、Welsh et al.（３１）にしたがってＭＣＡの完全な閉塞によりつくった。簡単に言うと、体重２０から３０ｇの雌雄マウスをケタミン（７５ｍｇ／ｍｌ、Apharmo, Arnhem、オランダ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｍｌ、Bayer, Leverkusen、ドイツ）の腹腔内注射により麻酔した。アトロピン（１ｍｇ／ｋｇ、Federa, Brussels、ベルギー）を筋肉内注射し、マウスを熱パッド上に置いて体温を保持した。Ｕ型の切開を左耳と左目の間に行った。側頭筋肉の上部および背側の部分を切り出し、頭骨を側頭筋肉の退縮によって露出した。小さい開口（１−２ｍｍ直径）を手動ドリルでＭＣＡ上の領域につくり、塩類液の過融解で熱損傷を防いだ。髄膜を鉗子で取り出し、１０−０ナイロン糸（Ethlon, Neuilly、フランス）結紮して閉塞し、結紮点に末梢的に横断した。最後に、側頭筋肉および皮膚を背中から縫合した。
【００３１】
ＡｄＣＭＶｔ−ＰＡ、ＡｄＣＭＶＰＡＩ−１またはＡｄＲＲ５を、１.３ｘ１０９プラーク形成単位（p.f.u.）の静脈内ボラスとしてＭＣＡの結紮４日前に与えた。ヒトα２−ＡＰ（ｈα２−ＡＰ）を静脈内に２注射に分けて、それぞれＭＣＡ結紮の１分前および３０分後に与えた。第２ｈα２−ＡＰ注射の１０分後にＦａｂ断片をボラスとして静脈注射した。ヒトプラスミンをボラスとして静脈内に、ＭＣＡ結紮の１５分前および１５分後に与えた。
【００３２】
マウスを回収し、ケージに戻した。２４時間後に過剰量のネンブタール（５００ｍｇ／ｋｇ、Abbott Laboratories,North Chicago、イリノイ）で殺し、断頭した。脳を取り出し、１ｍｍの切片にするためにマトリックスに置いた。切片を２％塩化２,３,５−トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）の溶液に浸し、３０分間３７℃でインキュベートして、４％ホルマリンのリン酸緩衝液に入れた。この処理により、壊死性梗塞域は着色されない（白色）ので、着色（レンガ赤）の生存能組織と明確に区別できる。切片を撮影しプラニメトリーにかけた。梗塞容量は、切片の非着色域掛ける厚さとして算出できる。
【００３３】
データは、ｎ回測定の平均±ＳＥＭで示す。差異の有意差検定には、Statview ソフトウエアーを用いてフィッシャーＰＬＳＤ検定またはスチューデントｔ−検定による変動分析を使用した。
【００３４】
実施例２
プラスミノーゲン系要素をコードする遺伝子の標的とされた不活化を有するマウスにおける脳虚血性梗塞
左ＭＣＡを結紮すると、（５０％）Ｓ１２９と（５０％）Ｃ５７ＢＬ／６遺伝背景を有する野生型マウスで７.６±１.１ｍｍ３（ｎ＝１１）、同系交配Ｃ５７ＢＬ／６マウスで９.３±２.７ｍｍ３（ｎ＝６）、同系交配Ｓ１２９マウスで６.４±１.３ｍｍ３（ｎ＝６）の脳梗塞が生じた（背景について有意差なし、結果は表示しない）。
【００３５】
ｔ−ＰＡ遺伝子の不活性化は２.６±０.８０ｍｍ３（ｎ＝１１）への梗塞サイズの減少に関連し（ｐ＜０.０００１対野生型）、一方、ｕ−ＰＡ遺伝子の不活性化は梗塞サイズに効果がなかった（７.８±１.０ｍｍ３、ｎ＝８、ｐ＝ＮＳ対野生型)。
【００３６】
ＰＡＩ−１遺伝子の不活性化は２.６±０.８０ｍｍ３（ｎ＝１１）への梗塞サイズの有意の増加に関連した（１６±０.５２ｍｍ３、ｎ＝６、ｐ＜０.０００１対野生型）（図１）。不活性化Ｐｌｇ遺伝子を有するマウスにおいて、脳梗塞サイズが野生型マウスにおけるよりも有意に大きく（１２±１.２ｍｍ３、ｎ＝９、ｐ＝０.０３７対野生型）、一方、α２−ＡＰ遺伝子欠損マウスにおいては、逆に梗塞サイズが非常に減少した（２.２±１.１ｍｍ３、ｎ＝７、ｐ＝０.０００１対野生型）（図１）。
【００３７】
実施例３
ｔ−ＰＡおよびＰＡＩ−１の遺伝子輸送の脳梗塞サイズに対する効果
６匹のｔ−ＰＡ−１−マウスにＭＣＡ結紮前４日間ＡｄＣＭＶｔ−ＰＡの１.３ｘ１０９p.f.u.注入は脳梗塞サイズ６.０±１.３ｍｍ３に関連し、対照ウイルスＡｄＲＲ５注入の５匹のｔ−ＰＡ−１−マウスにおけるよりも有意に大きかった（１.８±０.６３、ｐ＝０.０２８）（図２Ａ）。逆に、５匹のＰＡＩ−１−１−マウスにＡｄＣＭＶＰ−ＡＩ−１の１.３ｘ１０９p.f.u.注入は脳梗塞サイズ１０±１.４ｍｍ３に関連し、対照ウイルスＡｄＲＲ５注入の５匹のＰＡＩ−１−１−マウスにおけるよりも有意に小さかった（１３±１.０、ｐ＝０.０１９）（図２Ｂ）
【００３８】
実施例４
α２抗プラスミンの脳梗塞サイズに対する効果
脳梗塞サイズはα２−ＡＰ遺伝子の量に相関し、マウスで野生型が１１±２.０、ヘテロ接合欠損が４.９±２.０、ホモ接合欠損が２.２±１.１であった（図３Ａ）。４匹のα２−ＡＰ−１−マウス群でヒトα２−ＡＰの注入で梗塞サイズが増加し、全量１ｍｇで１３±２.５ｍｍ３（ｎ＝４）、全量０.２ｍｇで１１±１.５ｍｍ３（ｎ＝６）であった。マウスにおいてヒトα２−ＡＰ（０.２ｍｇのヒトα２−ＡＰ）に対する１.７ｍｇのアフィノ特異的Ｆａｂの注入は、脳梗塞サイズを５.１±１.１ｍｍ３に減少した（ｎ＝７、ｐ＝０.００４０対０.２ｍｇのヒトα２−ＡＰ）（図３Ｂ）。
【００３９】
上記の実施例からして、α２−ＡＰ活性の減少（α２−ＡＰ遺伝子発現の減少または阻害剤による循環α２−ＡＰの減少）は、虚血性卒中にみられるような、焦点脳虚血性梗塞のサイズを減少する。
【００４０】
実施例５
プラスミンの脳梗塞サイズに対する効果
体重約３０ｇのマウスに５０、１００、１５０μｇのヒトプラスミンを注入すると、３０秒後に採取した血液サンプルにおけるα２−ＡＰレベルが出発点から６７、４０、３１％減少した（２匹のマウスの平均、１５％以下の変動）。３匹のマウスに２００μｇのＰｌｉを注入すると、血漿α２−ＡＰレベルが減少し、２時間後で５９±４.８、４時間後で６７±４.４、６時間後で７０±２.５であった。
【００４１】
左中位脳動脈（ＭＣＡ）の結紮は脳梗塞を誘導し、同系交配Ｂａｌｂ／ｃマウスで２７±１.３ｍｍ３（ｎ＝１０）、同系交配Ｃ５７ＢＬ／６マウスで１６±１.３ｍｍ３（７＝１２）であった。
【００４２】
Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける０.２ｍｇのＰｌｉの注入は梗塞サイズを２２±１.０ｍｍ３に減少した（ｎ＝９）（ｐ＝０.００６対塩類液）。同様の減少がＭＡＣ結紮の１５分前と１５分後に与えたときに観察された（表１）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける０.２ｍｇのＰｌｉの注入は梗塞サイズを１０±１.２ｍｍ３に減少した（ｎ＝１２）（ｐ＝０.００４対塩類液）。
【００４３】
参考文献
1. Collen D；スタフィロキナーゼ：強力な独得のフィブリン選択性血栓溶解剤 Nature Medicine 1998; 4: 279-284。
2.Coyle JT, Puttfarcken P；酸化ストレス、グルタメート、神経変性疾患 Science 1993; 262: 689-695。
3. Coyle JT, Molliver ME, Kuhar MJ；カイニン酸のインシトゥ注入：経路の軸索を分与する際のニューロン細胞体を選択的に損傷するための新方法 J Comp Neurol 1978; 180: 301-323。
4. Tsirka S, Gualandris A, Amaral DG, Strickland S；エクサイトトキシン誘導ニューロンの変性および発作が組織プラスミノーゲン・アクチベーターにより仲介される Nature 1995; 377: 340-344。
5. Tsirka S, Rogove AD, Bugge TH, Degen JL, Strickland S；細胞外タンパク質分解カスケードがマウスの海馬においてニューロン変性を促進する J Neurosci 1997; 17: 543-552。
【００４４】
6. Tsirka S, Rogove AD, Strikland S；ニューロン細胞死およびｔ−ＰＡ Nature 1996; 384: 123-124。
7. Chen ZL, Strickland S；海馬におけるニューロン死がラミニンのプラスミン触媒変性により促進される Cell 1997; 91: 917-925。
8. Wang YF, Tsirka SE, Strickland S, Stieg PE, Soriano SG, Lipton SA；組織プラスミノーゲン・アクチベーター（ｔ−ＰＡ）が野生型およびｔ−ＰＡ欠損型マウスにおいて焦点脳虚血後のニューロン損傷を増大する Nature Medicine 1998; 4: 228-231。
9. Nagai N, Vanlinthout I, Collen D；ハムスターのモデルにおける脳虚血性梗塞および肺血栓分解に対する組織型プラスミノーゲン・アクチベーター、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼの作用の比較：提供
10.国立神経疾患研究所、ｒｔ−ＰＡ卒中研究斑；急性虚血性卒中についての組織プラスミノーゲン・アクチベーター N Eng J Med 1995; 333: 1581-1587。
【００４５】
11. Hacke W, Kaste M, Fieschi C, Toni D, Lesaffre E, von Kummer R, Boysen G, Bluhmki E, Haxter G, Mahagne MH, Hennerici M（ECASS研究斑）；急性片側卒中についての組換え組織プラスミノーゲン・アクチベーターでの静注血栓溶解 J Am Med Ass 1995; 274: 1017-1025。
12. Collen D, Wiman B；抗プラスミンの交替、血漿の速作用プラスミン阻害剤 Blood 1979; 53: 313-324。
13. Carmeliet P, Schoonjans L, Kieckens L, Ream B, Degen J, Bronson R, De Vos R, van den Oord J, Collen D, Mulligan；マウスにおけるプラスミノーゲン・アクチベーター遺伝子機能の喪失についての生理学的考え Nature 1994; 368: 419-424。
14. Carmeliet P, Kieckens L, Schoonjans L, Ream B, Van Nuffelen A, Prendergast G, Cole M, Bronson R, Collen D, Mulligan；プラスミノーゲン・アクチベーター阻害剤−１遺伝子欠損マウス I. 相同性組換えによる生成および特性解明 J Clin Invest 1993; 92: 2746-2755。
15. Carmeliet P, Stassen JM, Schoonjans L, Ream B, Van den Oord JJ, De Mol M, Mulligan RC, Collen D； プラスミノーゲン・アクチベーター阻害剤−１遺伝子欠損マウス II 止血、血栓症、血栓溶解 J Clin Invest 1993; 92: 2756-2760。
【００４６】
16. Poplis VA, Carmeliet P, Vazirzadeh S, Van Vlaenderen I, Moons L, Plow EF, Collen D；マウスにおける血栓症、生育、健康維持に対するプラスミノーゲン遺伝子の破壊効果 Circulation 1995; 92: 2585-2593。
17. Lijnen HR, Okada K, Matsuo O, Collen D, Dewerchin M；マウスにおけるα２抗プラスミン遺伝子欠損が明白な出血なしにフィブリン分解の可能性増加に関連する Bloood 1999; 93: 2274-2281。
18. Dewerchin M, Van Nuffelen A, Wallays G, Bouche A, Moons L, Carmeliet P, Mulligan RC, Collen D；ウロキナーゼ受容体欠損マウスの生成および特性解明 J Clin Invest 1996; 97: 870-878。
19. Lijnen HR, Holmes WE, Van Hoef B, Wiman B, Rodriguez H, Collen D；ヒトα２抗プラスミンのアミノ酸配列 Eur J Biochem 1987; 166: 565-574。
20. McGrory WJ, Bautista DS, Graham FL；初期領域１変異の感染性ヒト・アデノウイルス型５へのレスキュのための簡単な技法 Virology 1988; 163: 614-617。
【００４７】
21. Gomez-Foix AM, Coats WS, Baque S, Alam T, Gerard RD, Newgard CB；筋グリコーゲン・ホスホリラーゼ遺伝子の肝細胞へのアデノウイルス仲介輸送はグリコーゲン代謝の調節を変える J Biol Chem 1992; 267: 25129-25134。
22. Graham FL, Smiley J, Russel WC, Nairn R；ヒトアデノウイルス型のＤＮＡにより形質転換されたヒト細胞系の特徴 J Gen Virol 1977; 36: 59-74。
23. Gerard RD, Meidell RS；アデノウイルス・ベクター Hames Bd, Glover D (eds)；ＤＮＡクローニング−実際的方法：哺乳動物系 Oxford, UK, 1995, p 285-307。
24. Alcorn JL, Gao E, Chen Q, Smith ME, Gerard RD, Mendelson CR；ウサギ表面活性タンパク質Ａ遺伝子の転写調節に関与する遺伝子要素 Mol Endocrinol 1993; 7: 1072-1085。
25. Kopfler WP, Willard M, Betz T, Willard JE, Gerard RD, Meidell RS；ヒト・アポリポタンパク質Ａ−Ｉをコードする遺伝子の正常マウスへのアデノウイルス仲介輸送は循環の高密度リポタンパク質コレステロールを増加する Circulation 1994; 90: 1319-1327。
【００４８】
26. Carmeliet P, Stassen JM, Van Vlaenderen I, Meidell RS, Collen D, Gerard RD；組織型プラスミノーゲン・アクチベーターのアデノウイルス仲介輸送は組織型プラスミノーゲン・アクチベーター欠損およびプラスミノーゲン・アクチベーター阻害剤−１−過剰発現のマウスにおいて血栓崩壊を増大する Blood 1997; 90: 1527-1534。
27. Carmeliet P, Moons L, Lijnen R, Janssens S, Lupu F, Collen D, Gerard RD；動脈損傷治癒および新動脈内膜形成におけるプラスミノーゲン・アクチベーター阻害剤−１の阻害役割 Circulation 1997; 96: 3180-3191。
28. Deutsch DG, Mertz Et；アフィニティクロマトグラフィ−によるヒト血漿からのプラスミノーゲン精製 Science 1970; 170: 1095-1096。
29. Edy J, De Cock F, Collen D：正常および抗プラスミン除去のヒト血漿によるプラスミンの阻害 Thromb Res. 1976; 8: 513-518。
30. Giles AR；生物医学研究における動物の使用についての指針 Thromb Haemost 1987; 58: 1078-1084。
【００４９】
31. Welsh FA, Sakamoto T, McKee AE, Sims RE；マウス脳での虚血におけるラクトアシドーシスのピリジン・ヌクレオチド安定性に対する作用 J Neurochem 1987; 49: 846-851。
32. Bederson JB et al；ラットにおける実験的脳梗塞の検出および定量のための染料としての塩化 2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム Stroke 1986; 17:472-476。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、焦点脳虚血性梗塞サイズに対するプラスミノーゲン系の要素（横線における遺伝子型）の欠損効果を示す。
【図２】 図２は、それぞれｔ−ＰＡまたはＰＡＩ−１欠損マウスにおける焦点虚血性脳梗塞サイズに対するｔ−ＰＡまたはＰＡＩ−１遺伝子のアデノウイルス輸送効果を示す。
【図３】 図３は、焦点脳虚血性梗塞サイズに対するα２−ＡＰの効果を示す。
Ａ．虚血性梗塞サイズに対するα２−ＡＰの効果。
Ｂ．虚血性梗塞サイズに対するα２−ＡＰまたはα２−ＡＰの注入、その後の抗α２−ＡＰのＦａｂ断片の注入の効果。
本発明は、焦点虚血性脳梗塞（虚血性卒中）を処置するための新しい手段に関する。
【０００２】
焦点虚血性脳梗塞は、脳の特殊な領域への動脈血流が臨界レベル以下になったときに生じ、神経細胞が死ぬ。中枢神経系（ＣＮＳ）疾患におけるニューロン変性、例えば、脳卒中、てんかん、アルツハイマー病などは、過剰の興奮性アミノ酸グルタメートにより刺激されると思われる(２)。ＣＮＳにグルタメート・アゴニストを注入すると、神経変性疾患にみられるような海馬のニューロン細胞の死が実際に起きる（３）。
【０００３】
エクサイトトキシン誘導ニューロン変性は、組織型プラスミノーゲン・アクチベーター（ｔ−ＰＡ）により仲介される（４）。この観察と同じく、ｔ−ＰＡ欠損マウスはエクサイトトキシン誘導の海馬ニューロン変性に抵抗性があり、プラスミノーゲン・アクチベーター阻害剤−１（ＰＡＩ−１）がこの変性を防御する（４−６）。
【０００４】
さらに、プラスミノーゲン（Ｐｌｇ）の欠損、ｔ−ＰＡのチモーゲン基質、α２抗プラスミン（α２−ＡＰ）の注入は、エクサイトトキシン誘導の海馬ニューロン変性からマウスを保護する(５)。ラミニンのプラスミン仲介変性が、ニューロン−細胞外マトリックスの相互作用を破壊して、海馬ニューロンの細胞死を敏感にするといわれている(７)。
【０００５】
Wang らの最近の発表（８）によると、中位脳動脈の一時的な閉塞による焦点脳虚血後のニューロン損傷もマウスにおいてｔ−ＰＡ欠損により減少し、ｔ−ＰＡ注入により悪化した。このことからすると、プラスミノーゲン系は、脳虚血性梗塞の成立と血栓溶解療法における脳虚血性梗塞の進行との両方に関与するようである。最近の発表では、治りにくい焦点脳虚血に対するｔ−ＰＡの神経毒作用も、ストレプトキナーゼやスタフィロキナーゼなどの他の血栓溶解剤で生じる（９）。このように、治りにくい脳動脈閉塞の患者において、虚血性卒中のための血栓溶解療法は梗塞を進行することがある。これは、動脈の再疎通についての確立したすべての有益な効果を部分的になくしてしまうだけでなく、ある種の患者にとっては非常に有害となりかねない。血栓溶解療法での脳動脈再疎通ができる患者とできない患者とを識別するのは不可能であるので、治りにくい焦点脳虚血に対する血栓溶解剤の神経毒作用に拮抗する具体的な総合的方策の開発が是認されるところである。
【０００６】
よって、本発明の目的は、焦点虚血性卒中を処置するための新しい手段を提供することである。
【０００７】
本発明に至った研究において、下記の事項が検討された。脳での焦点虚血における神経の損傷は、グルタメートなどのエクサイトトキシンの蓄積の結果として主に生じると推定されているが、皮質神経細胞の死についての病理におけるプラスミン仲介ラミニン変性あるいは代替メカニズムの役割は知られていない。焦点脳虚血性梗塞に対するプラスミノーゲン（フィブリノーゲン分解性）系の個々の要素の関与を描写するために、本発明者は、マウスの左の中位脳動脈（ＭＣＡ）の結紮によって生じた梗塞のサイズの定量を、Ｐｌｇ、そのアクチベーター組織型プラスミノーゲン・アクチベーター（ｔ−ＰＡ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン・アクチベーター（ｕ−ＰＡ）、フィブリノーゲン分解性阻害剤ＰＡＩ−１またはα２−ＡＰをコードする遺伝子についての不活化を標的として行った。さらに、ｔ−ＰＡおよびＰＡＩ−１の遺伝子のアデノウイルス輸送の作用および脳梗塞に対するヒトα２−ＡＰの注入の作用を調べた。
【０００８】
ｔ−ＰＡ欠損が焦点脳虚血性梗塞を防ぐとの Strickland et al.の知見を完全に確認でき、またｔ−ＰＡ欠損が有意に大きい梗塞サイズをもたらしたが、Ｐｌｇ欠損がエクサイトトキシン誘発の神経細胞死を防ぐとの観察は確認できなかった。代わりに、焦点脳梗塞のサイズがＰｌｇ欠損のマウスで有意に大きく、逆にα２−ＡＰ欠損のマウスで有意に小さいことが分かった。
【０００９】
全体として、これらのことからすると、プラスミノーゲン系の要素は焦点脳虚血性梗塞のサイズに２つの異なるレベルで影響を及ぼす。すなわち、１）ｔ−ＰＡ活性の減少（ｔ−ＰＡ遺伝子の不活性化またはＰＡＩ−１遺伝子の輸送）が梗塞サイズを減少し、その増大（ｔ−ＰＡ遺伝子の輸送またはＰＡＩ−１遺伝子の不活性化）が梗塞サイズを増加する。２）Ｐｌｇ活性の減少（Ｐｌｇ遺伝子の不活性化またはα２−ＡＰの注入）が梗塞サイズを増加し、その増大（α２−ＡＰ遺伝子の不活性化またはα２−ＡＰの中性化）が梗塞サイズを減少する。この知見は、ｔ−ＰＡ仲介プラスミン生成が神経細胞死をもたらすであろう特別のリンク経路と相容れないで、反対方向に作用する２つの独立的（ｔ−ＰＡ仲介およびＰｌｇ仲介）メカニズムを示唆する。
【００１０】
α２−ＡＰを体内で常に観察することは期待されなかったが、虚血性卒中の処置に最も関係する。第１に、梗塞サイズと遺伝子型とに相関があり、梗塞サイズを表すヘテロ接合体が野生型とホモ接合表現型の中間にある。第２に、ヒトα２−ＡＰ（ｈα２−ＡＰ）をα２−ＡＰ−１−マウスに注射すると、用量依存性梗塞の展開が生じる。重要なことに、アフィノ特異的ポリクローナルウサギ抗ｈα２−ＡＰ抗体は、ＭＣＡの閉塞４０分後の静注で、脳虚血性梗塞サイズを有意に減少する。このことは、α２−ＡＰ阻害剤（例えば、中和モノクローナル抗体またはα２−ＡＰを中和する化合物）を使用して焦点虚血性卒中に拮抗する経路の可能性を示唆している。これは、ＭＣＡ閉塞を持つマウスにプラスミンを注入することにより確認した。α２−ＡＰの中和により、梗塞のサイズが有意に減少した。ヒトの血漿中のα２−ＡＰの濃度は１ｍＭであり（１２）、対応する全身体量は約５００ｍｇである。モノクローナルＦａｂ断片の等価量は約４００ｍｇであり、プラスミンの等価量は５００ｍｇであり、これは１回の治療投与として高いが過剰ではない。さらに、梗塞のサイズがα２−ＡＰレベル（遺伝子用量効果すなわち用量応答から誘導）に比例することからして、血漿レベルの部分的な減少が顕著に有益の効果をもたらすのではないかと思われる。
【００１１】
上記の観点において、本発明は、焦点脳虚血性梗塞（虚血性卒中）の処置のためにインビボでα２−ＡＰ活性を減少する化合物の使用に関する。
【００１２】
本発明使用の具体的な実施態様において、循環するα２−ＡＰ濃度を減少する化合物をつくる。α２−ＡＰの低濃度は低活性をもたらす。別の実施態様において、循環するα２−ＡＰの活性が直接的に減少する。
【００１３】
α２−ＡＰの濃度および活性の減少に適した化合物は、例えば、α２−ＡＰ中和抗体またはその誘導体である。好ましい抗体はモノクローナル抗体である。好ましい誘導体はＦａｂ断片やｓｃＦｖ断片である。
【００１４】
α２−ＡＰを中和する化合物は、例えば、プラスミン、ミニプラスミン（最初の４クリングルを欠く）、ミクロプラスミン（全５クリングルを欠く）である。
【００１５】
本発明を下記の実施例でさらに詳細に示す。これは発明の範囲を限定する意図ではない。実施例において下記の図面を参照する。
【００１６】
図１−３は、マウス中位脳動脈（ＭＣＡ）の結紮後、焦点脳虚血性梗塞の容量（ｍｍ３）を比較した棒グラフである。平均値とＳＥＭ（水平棒）を示し、コラム中の数字は実験回数である。
【００１７】
図１は、焦点脳虚血性梗塞サイズに対するプラスミノーゲン系の要素（横線における遺伝子型）の欠損効果を示す。ＷＴ：野生型（５０％Ｃ５７ＢＬ６／５０％Ｓ１２９、１００％Ｃ５７ＢＬ６、１００％Ｓ１２９遺伝背景の蓄積値）。
【００１８】
図２は、それぞれｔ−ＰＡまたはＰＡＩ−１欠損マウスにおける焦点虚血性脳梗塞サイズに対するｔ−ＰＡまたはＰＡＩ−１遺伝子のアデノウイルス輸送効果を示す。
【００１９】
図３は、焦点脳虚血性梗塞サイズに対するα２−ＡＰの効果を示す。
Ａ．虚血性梗塞サイズに対するα２−ＡＰの効果。
Ｂ．虚血性梗塞サイズに対するα２−ＡＰまたはα２−ＡＰの注入、その後の抗α２−ＡＰのＦａｂ断片の注入の効果。
【００２０】
実施例１
ネズミの脳虚血性梗塞モデル
１．説明
本試験で使用したマウスはすべて、K.U.LeuvenのGasthuisbergキャンパスの遺伝子組換え技術・遺伝子治療センターの無菌施設で生まれ飼育した。遺伝子の不活性化は、組織型プラスミノーゲン・アクチベーター（ｔ−ＰＡ）（１３）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン・アクチベーター（ｕ−ＰＡ）（１３）、プラスミノーゲン・アクチベーター阻害剤−１（ＰＡＩ−１）（１４、１５）、プラスミノーゲン（Ｐｌｇ）（１６）、α２抗プラスミン（α２−ＡＰ）（１７）をコードする遺伝子を標的とする胚幹細胞における相同的組換えで行った。ｕ−ＰＡ受容体（ｕ−ＰＡＲ）（１８）をコードする不活性化遺伝子を有するマウスは、ｕ−ＰＡ欠損マウスで正常な結果が得られたため、含めなかった。
【００２１】
２．材料と方法
２．１．材料
ヒトα２−ＡＰを、上記したような新鮮凍結血漿から調製した（１９）。
ポリクローナル抗血清をウサギに、完全フロインド・アジュバントに懸濁した２００ｍｇ精製ヒトα２−ＡＰを皮下注入し、ついで不完全フロインド・アジュバントに懸濁した抗原の２週間間隔の２回注入で作った。血清は耳静脈の穿刺を繰り返して得た。集めた血清をタンパク質Ａセファロースのクロマトグラフィにかけた。０.１ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８.１で調整し、０.１ＭグリシンＨＣｌ、ｐＨ２.８でＩｇＧを溶出して、血清１ｍｌにつき約１０ｍｇのタンパク質を得た。アフィノ特異的抗体を透析ＩｇＧから、ヒトα２−ＡＰ（２.５ｍｇ／ｍｌ湿潤ゲル）で置換したＣＮＢｒ活性化セファロース・カラムのクロマトグラフィで得た。、０.１ＭグリシンＨＣｌ、ｐＨ２.８で溶出して、適用ｍｇにつき約０.１ｍｇの特異的ＩｇＧを得た。
【００２２】
Ｆａｂ断片をアフィノ特異的ＩｇＧからパパイン消化で得た。すなわち、ＩｇＧを濃度５ｍｇ／ｍｌに溶解し、１％（ｗ／ｗ）のパパインで、５ｍＭのシステイン、１ｍＭのＥＤＴＡ、０.１Ｍのリン酸緩衝液の存在下に、ｐＨ７.０で５時間消化した。反応の停止のためにヨードアセトアミドを最終濃度７５ｍＭまで加えた。透析後、混合物をＰＢＳで調整したタンパク質Ａセファロースカラムで精製した。Ｆａｂ濃度をＩｇＧ標準で較正したＥＬＩＳＡで決定した。ＳＤＳゲル電気泳動は基本的に相同性のＦａｂ断片を表した（表示せず）。
【００２３】
２．２．アデノウイルス・ベクターの製造
組換えアデノウイルスＡｄＣＭＶｔ−ＰＡおよびＡｄＣＭＶＰＡＩ−１を、基本的に上記した２９３細胞における相同性組換えによりつくった（２０）。ＡｄＣＭＶｔ−ＰＡについては、野生型ヒトｔ−ＰＡをコードするプラスミドｐＳＴＥｔ−ＰＡのＸｂａＩ断片をＸｂａＩ消化ｐＡＣＣＭＶｐＬｐＡ（２１）中に連結して、ｐＡＣＣＭＶｔ−ＰＡを得た。アデノウイルス前駆体ｐＡＣＣＭＶＰＡＩ−１は、ヒトＰＡＩ−１の全コード配列を含有するｐＰＡＩ−１ＲＢＲの１.４ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢｇｌII断片を、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化ｐＡＣＣＭＶｐＬｐＡ中に連結して作った。これらのプラスミドにおいて、ｔ−ＰＡおよびＰＡＩ−１のｃＤＮＡは、サイトメガロウイルス即時型初期エンハンサー／プロモーターとＳＶ４０ｔ−抗原イントロン／ポリアデニル化信号との間に位置して、完全な転写単位を形成する。
【００２４】
２９３細胞（２２）の単層培養物を、１０ｍｇのｐＡＣＣＭＶｔ−ＰＡまたはｐＡＣＣＭＶＰＡＩ−１および５ｍｇのｐＪＭ１７（２０）、完全長アデノウイルス５ｄｌ３０９ゲノムを含有するプラスミドで共トランスフェクトした。これらのプラスミド間の相同性組換えは、アデノウイルスＥ１領域がそれぞれｔ−ＰＡまたはＰＡＩ−１形質転換遺伝子で置換された組換えウイルスゲノムを形成する。培養２９３細胞における組換えウイルスの複製は、２９３細胞ゲノムに組み込まれたＥ１コピーからのトランスに供給されたＥ１Ａ遺伝子産物により支持される。
【００２５】
トランスフェクト後に組換えウイルスを採取し、（２３）記載のように増幅した。組換えウイルスの同一性は、生産的感染の２９３細胞からつくったウイルスＤＮＡについての制限分析およびサザンブロット法により決定した。組換えアデノウイルスＡｄＲＲ５は、Ｅ１位置に組込まれた遺伝子を欠いており、同様の方法でｐＡＣＲＲ５およびｐＪＭ１７からつくり、対照ウイルスとして使用できる（２４，２５）。組換えウイルスを再接種してクローナル同一性を確認してから、さらに使用する。組換えアデノウイルスの大量生産を（２３）記載のように行った。精製ウイルスに０.１ｍｇ／ｍｌの無菌ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充し、液体窒素で即時凍結して−８０℃で使用まで保存した。精製保存液中の感染ウイルス粒子の力価は、３７℃での１時間吸収で２９３細胞の単一層に対するプラーク検定法で決定した。精製ウイルス保存液は、ｍｌにつき１０１０プラーク形成ユニット（Ｐｆｕ）で通常得た。静脈ボラス注射によるアデノウイルス輸送後のｔ−ＰＡおよびＰＡＩ−１発現の反応速度および臓器分布は、別に示されている（２６、２７）
【００２６】
２．３．ヒトプラスミンの調製
ヒトプラスミノーゲンを、基本的に（２８）記載のように、新鮮な凍結ヒト血液バンク血漿から調製した。ヒト血漿（６リットル）に１ｍｌ当り２０単位のアプロチニン（Trasylol, Bayer、ドイツ）を加え、１５分間４℃、４０００ｒｐｍで遠心分離した。リシン−セファロース（２００湿重量、置換レベルがセファロースゲルｇ湿重量につき約１ｍｇのリシン）を上澄み液に加え、混合物を１時間４℃で攪拌し、ゲルをブッフネルろうとに回収した。１２０ｇのリシン−セファロースを濾液に加え、混合物を攪拌してゲルを上記のように回収した。合わせたゲルフラクションを、１０単位／ｍｌのアポチニン含有の１８リットルの０.２ＭのＫ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７.５で洗い、ついで５ｘ６０ｃｍカラムに注ぎ、１０単位のアポチニン含有の０.０２ＭのＮａＨ２ＰＯ４、０.１ＭのＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７.５、４℃で洗って、２８０ｎｍでの洗液の吸収を０.０５以下とした。カラムを０.０５Ｍの６−アミノヘキサン酸を含有する緩衝液で溶出し、タンパク質含有のフラクションを集めた。６リットルの血漿から６５０ｍｇのタンパク質含有の約１４５ｍｌの液を得た。これをAmicon PM10 フィルターで２.５倍に濃縮し、ウルトラゲルＡｃＡ４４の５ｘ９０ｃｍカラム上で濾過したゲルを０.０２ＭのＮａＨ２ＰＯ４、０.１ＭのＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７.５で、１時間につき６０ｍｌの速度で洗った。約５９０ｍｇのタンパク質を含有する主ピークをAmicon PM10 フィルター上で濃度１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、使用まで凍結した。
【００２７】
ヒトプラスミンをプラスミノーゲンから下記のように調製した。リシン−セファロース（２０ｇ湿ゲル）をヒトプラスミノーゲン（２００ｍｇ）溶液に加え、混合物を３時間４℃で攪拌し、ゲルをブッフネルろうと上で洗い、３０ｍｌの０.０１ＭのＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７.４に再懸濁した。ウロキナーゼ（５００μｌの５０μＭ溶液、Saruplase (Gruenenthal, Aachen、ドイツ）より調製）およびプラスミン・セファロースを加え、混合物を１５時間４℃で攪拌した。ゲルをブッフネルろうと上で０.１ＭのＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７.４で洗い、１.５ｘ１６ｃｍカラムに注ぎ、０.１ＭのＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７.４で洗い、２８０ｎｍでの洗液の吸収が０.０５以下とした。０.０５Ｍの６−アミノヘキサン酸を含有する０.１ＭのＮａＨ２ＰＯ４緩衝液で溶出した。タンパク質含有のフラクションを集めて、グリセロールを最終濃度１０％まで加え、集めて、１０％グリセロール含有の０.１ＭのＮａＨ２ＰＯ４に対して４℃で透析した。最終回収物は、タンパク質濃度４.０ｍｇ／ｍｌおよび活性プラスミン濃度２５μＭを有する溶液２５ｍｌであった。
【００２８】
２．４．血漿中のα２抗プラスミンの測定
ネズミ血漿中のα２抗プラスミンの測定を、プラスミンの迅速阻害（２９）に基づき色素遺伝子基質検定法により行った。簡単に言うと、１０μｌマウス血漿（０.０１％ツイン２０を含有する０.０５ＭのＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７.４に１／１０稀釈）を３７℃で４２０μｌの０.０５トリスＨＣｌ、０.０１％ツイン２０を含有する０.１ＭのＮａＣｌ緩衝液、および２０μｌの０.１２５μＭヒトプラスミン（最終濃度５ｎＭ）と混合する。１０秒インキュベートし、５０μｌの３ｍＭのＳ２４０３（Chromogenics, Antwerp、ベルギー）を加え、吸収の変化を４０５ｎｍで測定した。吸収の変化は、緩衝液で約０.１８分−１、集めたネズミ血漿で０.０９分−１であった。
【００２９】
２．５．動物実験
動物実験を、血栓症および止血についての米国生理学会および国際委員会の指針（３０）にしたがって行った。
【００３０】
焦点脳虚血を、Welsh et al.（３１）にしたがってＭＣＡの完全な閉塞によりつくった。簡単に言うと、体重２０から３０ｇの雌雄マウスをケタミン（７５ｍｇ／ｍｌ、Apharmo, Arnhem、オランダ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｍｌ、Bayer, Leverkusen、ドイツ）の腹腔内注射により麻酔した。アトロピン（１ｍｇ／ｋｇ、Federa, Brussels、ベルギー）を筋肉内注射し、マウスを熱パッド上に置いて体温を保持した。Ｕ型の切開を左耳と左目の間に行った。側頭筋肉の上部および背側の部分を切り出し、頭骨を側頭筋肉の退縮によって露出した。小さい開口（１−２ｍｍ直径）を手動ドリルでＭＣＡ上の領域につくり、塩類液の過融解で熱損傷を防いだ。髄膜を鉗子で取り出し、１０−０ナイロン糸（Ethlon, Neuilly、フランス）結紮して閉塞し、結紮点に末梢的に横断した。最後に、側頭筋肉および皮膚を背中から縫合した。
【００３１】
ＡｄＣＭＶｔ−ＰＡ、ＡｄＣＭＶＰＡＩ−１またはＡｄＲＲ５を、１.３ｘ１０９プラーク形成単位（p.f.u.）の静脈内ボラスとしてＭＣＡの結紮４日前に与えた。ヒトα２−ＡＰ（ｈα２−ＡＰ）を静脈内に２注射に分けて、それぞれＭＣＡ結紮の１分前および３０分後に与えた。第２ｈα２−ＡＰ注射の１０分後にＦａｂ断片をボラスとして静脈注射した。ヒトプラスミンをボラスとして静脈内に、ＭＣＡ結紮の１５分前および１５分後に与えた。
【００３２】
マウスを回収し、ケージに戻した。２４時間後に過剰量のネンブタール（５００ｍｇ／ｋｇ、Abbott Laboratories,North Chicago、イリノイ）で殺し、断頭した。脳を取り出し、１ｍｍの切片にするためにマトリックスに置いた。切片を２％塩化２,３,５−トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）の溶液に浸し、３０分間３７℃でインキュベートして、４％ホルマリンのリン酸緩衝液に入れた。この処理により、壊死性梗塞域は着色されない（白色）ので、着色（レンガ赤）の生存能組織と明確に区別できる。切片を撮影しプラニメトリーにかけた。梗塞容量は、切片の非着色域掛ける厚さとして算出できる。
【００３３】
データは、ｎ回測定の平均±ＳＥＭで示す。差異の有意差検定には、Statview ソフトウエアーを用いてフィッシャーＰＬＳＤ検定またはスチューデントｔ−検定による変動分析を使用した。
【００３４】
実施例２
プラスミノーゲン系要素をコードする遺伝子の標的とされた不活化を有するマウスにおける脳虚血性梗塞
左ＭＣＡを結紮すると、（５０％）Ｓ１２９と（５０％）Ｃ５７ＢＬ／６遺伝背景を有する野生型マウスで７.６±１.１ｍｍ３（ｎ＝１１）、同系交配Ｃ５７ＢＬ／６マウスで９.３±２.７ｍｍ３（ｎ＝６）、同系交配Ｓ１２９マウスで６.４±１.３ｍｍ３（ｎ＝６）の脳梗塞が生じた（背景について有意差なし、結果は表示しない）。
【００３５】
ｔ−ＰＡ遺伝子の不活性化は２.６±０.８０ｍｍ３（ｎ＝１１）への梗塞サイズの減少に関連し（ｐ＜０.０００１対野生型）、一方、ｕ−ＰＡ遺伝子の不活性化は梗塞サイズに効果がなかった（７.８±１.０ｍｍ３、ｎ＝８、ｐ＝ＮＳ対野生型)。
【００３６】
ＰＡＩ−１遺伝子の不活性化は２.６±０.８０ｍｍ３（ｎ＝１１）への梗塞サイズの有意の増加に関連した（１６±０.５２ｍｍ３、ｎ＝６、ｐ＜０.０００１対野生型）（図１）。不活性化Ｐｌｇ遺伝子を有するマウスにおいて、脳梗塞サイズが野生型マウスにおけるよりも有意に大きく（１２±１.２ｍｍ３、ｎ＝９、ｐ＝０.０３７対野生型）、一方、α２−ＡＰ遺伝子欠損マウスにおいては、逆に梗塞サイズが非常に減少した（２.２±１.１ｍｍ３、ｎ＝７、ｐ＝０.０００１対野生型）（図１）。
【００３７】
実施例３
ｔ−ＰＡおよびＰＡＩ−１の遺伝子輸送の脳梗塞サイズに対する効果
６匹のｔ−ＰＡ−１−マウスにＭＣＡ結紮前４日間ＡｄＣＭＶｔ−ＰＡの１.３ｘ１０９p.f.u.注入は脳梗塞サイズ６.０±１.３ｍｍ３に関連し、対照ウイルスＡｄＲＲ５注入の５匹のｔ−ＰＡ−１−マウスにおけるよりも有意に大きかった（１.８±０.６３、ｐ＝０.０２８）（図２Ａ）。逆に、５匹のＰＡＩ−１−１−マウスにＡｄＣＭＶＰ−ＡＩ−１の１.３ｘ１０９p.f.u.注入は脳梗塞サイズ１０±１.４ｍｍ３に関連し、対照ウイルスＡｄＲＲ５注入の５匹のＰＡＩ−１−１−マウスにおけるよりも有意に小さかった（１３±１.０、ｐ＝０.０１９）（図２Ｂ）
【００３８】
実施例４
α２抗プラスミンの脳梗塞サイズに対する効果
脳梗塞サイズはα２−ＡＰ遺伝子の量に相関し、マウスで野生型が１１±２.０、ヘテロ接合欠損が４.９±２.０、ホモ接合欠損が２.２±１.１であった（図３Ａ）。４匹のα２−ＡＰ−１−マウス群でヒトα２−ＡＰの注入で梗塞サイズが増加し、全量１ｍｇで１３±２.５ｍｍ３（ｎ＝４）、全量０.２ｍｇで１１±１.５ｍｍ３（ｎ＝６）であった。マウスにおいてヒトα２−ＡＰ（０.２ｍｇのヒトα２−ＡＰ）に対する１.７ｍｇのアフィノ特異的Ｆａｂの注入は、脳梗塞サイズを５.１±１.１ｍｍ３に減少した（ｎ＝７、ｐ＝０.００４０対０.２ｍｇのヒトα２−ＡＰ）（図３Ｂ）。
【００３９】
上記の実施例からして、α２−ＡＰ活性の減少（α２−ＡＰ遺伝子発現の減少または阻害剤による循環α２−ＡＰの減少）は、虚血性卒中にみられるような、焦点脳虚血性梗塞のサイズを減少する。
【００４０】
実施例５
プラスミンの脳梗塞サイズに対する効果
体重約３０ｇのマウスに５０、１００、１５０μｇのヒトプラスミンを注入すると、３０秒後に採取した血液サンプルにおけるα２−ＡＰレベルが出発点から６７、４０、３１％減少した（２匹のマウスの平均、１５％以下の変動）。３匹のマウスに２００μｇのＰｌｉを注入すると、血漿α２−ＡＰレベルが減少し、２時間後で５９±４.８、４時間後で６７±４.４、６時間後で７０±２.５であった。
【００４１】
左中位脳動脈（ＭＣＡ）の結紮は脳梗塞を誘導し、同系交配Ｂａｌｂ／ｃマウスで２７±１.３ｍｍ３（ｎ＝１０）、同系交配Ｃ５７ＢＬ／６マウスで１６±１.３ｍｍ３（７＝１２）であった。
【００４２】
Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける０.２ｍｇのＰｌｉの注入は梗塞サイズを２２±１.０ｍｍ３に減少した（ｎ＝９）（ｐ＝０.００６対塩類液）。同様の減少がＭＡＣ結紮の１５分前と１５分後に与えたときに観察された（表１）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける０.２ｍｇのＰｌｉの注入は梗塞サイズを１０±１.２ｍｍ３に減少した（ｎ＝１２）（ｐ＝０.００４対塩類液）。
【００４３】
参考文献
1. Collen D；スタフィロキナーゼ：強力な独得のフィブリン選択性血栓溶解剤 Nature Medicine 1998; 4: 279-284。
2.Coyle JT, Puttfarcken P；酸化ストレス、グルタメート、神経変性疾患 Science 1993; 262: 689-695。
3. Coyle JT, Molliver ME, Kuhar MJ；カイニン酸のインシトゥ注入：経路の軸索を分与する際のニューロン細胞体を選択的に損傷するための新方法 J Comp Neurol 1978; 180: 301-323。
4. Tsirka S, Gualandris A, Amaral DG, Strickland S；エクサイトトキシン誘導ニューロンの変性および発作が組織プラスミノーゲン・アクチベーターにより仲介される Nature 1995; 377: 340-344。
5. Tsirka S, Rogove AD, Bugge TH, Degen JL, Strickland S；細胞外タンパク質分解カスケードがマウスの海馬においてニューロン変性を促進する J Neurosci 1997; 17: 543-552。
【００４４】
6. Tsirka S, Rogove AD, Strikland S；ニューロン細胞死およびｔ−ＰＡ Nature 1996; 384: 123-124。
7. Chen ZL, Strickland S；海馬におけるニューロン死がラミニンのプラスミン触媒変性により促進される Cell 1997; 91: 917-925。
8. Wang YF, Tsirka SE, Strickland S, Stieg PE, Soriano SG, Lipton SA；組織プラスミノーゲン・アクチベーター（ｔ−ＰＡ）が野生型およびｔ−ＰＡ欠損型マウスにおいて焦点脳虚血後のニューロン損傷を増大する Nature Medicine 1998; 4: 228-231。
9. Nagai N, Vanlinthout I, Collen D；ハムスターのモデルにおける脳虚血性梗塞および肺血栓分解に対する組織型プラスミノーゲン・アクチベーター、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼの作用の比較：提供
10.国立神経疾患研究所、ｒｔ−ＰＡ卒中研究斑；急性虚血性卒中についての組織プラスミノーゲン・アクチベーター N Eng J Med 1995; 333: 1581-1587。
【００４５】
11. Hacke W, Kaste M, Fieschi C, Toni D, Lesaffre E, von Kummer R, Boysen G, Bluhmki E, Haxter G, Mahagne MH, Hennerici M（ECASS研究斑）；急性片側卒中についての組換え組織プラスミノーゲン・アクチベーターでの静注血栓溶解 J Am Med Ass 1995; 274: 1017-1025。
12. Collen D, Wiman B；抗プラスミンの交替、血漿の速作用プラスミン阻害剤 Blood 1979; 53: 313-324。
13. Carmeliet P, Schoonjans L, Kieckens L, Ream B, Degen J, Bronson R, De Vos R, van den Oord J, Collen D, Mulligan；マウスにおけるプラスミノーゲン・アクチベーター遺伝子機能の喪失についての生理学的考え Nature 1994; 368: 419-424。
14. Carmeliet P, Kieckens L, Schoonjans L, Ream B, Van Nuffelen A, Prendergast G, Cole M, Bronson R, Collen D, Mulligan；プラスミノーゲン・アクチベーター阻害剤−１遺伝子欠損マウス I. 相同性組換えによる生成および特性解明 J Clin Invest 1993; 92: 2746-2755。
15. Carmeliet P, Stassen JM, Schoonjans L, Ream B, Van den Oord JJ, De Mol M, Mulligan RC, Collen D； プラスミノーゲン・アクチベーター阻害剤−１遺伝子欠損マウス II 止血、血栓症、血栓溶解 J Clin Invest 1993; 92: 2756-2760。
【００４６】
16. Poplis VA, Carmeliet P, Vazirzadeh S, Van Vlaenderen I, Moons L, Plow EF, Collen D；マウスにおける血栓症、生育、健康維持に対するプラスミノーゲン遺伝子の破壊効果 Circulation 1995; 92: 2585-2593。
17. Lijnen HR, Okada K, Matsuo O, Collen D, Dewerchin M；マウスにおけるα２抗プラスミン遺伝子欠損が明白な出血なしにフィブリン分解の可能性増加に関連する Bloood 1999; 93: 2274-2281。
18. Dewerchin M, Van Nuffelen A, Wallays G, Bouche A, Moons L, Carmeliet P, Mulligan RC, Collen D；ウロキナーゼ受容体欠損マウスの生成および特性解明 J Clin Invest 1996; 97: 870-878。
19. Lijnen HR, Holmes WE, Van Hoef B, Wiman B, Rodriguez H, Collen D；ヒトα２抗プラスミンのアミノ酸配列 Eur J Biochem 1987; 166: 565-574。
20. McGrory WJ, Bautista DS, Graham FL；初期領域１変異の感染性ヒト・アデノウイルス型５へのレスキュのための簡単な技法 Virology 1988; 163: 614-617。
【００４７】
21. Gomez-Foix AM, Coats WS, Baque S, Alam T, Gerard RD, Newgard CB；筋グリコーゲン・ホスホリラーゼ遺伝子の肝細胞へのアデノウイルス仲介輸送はグリコーゲン代謝の調節を変える J Biol Chem 1992; 267: 25129-25134。
22. Graham FL, Smiley J, Russel WC, Nairn R；ヒトアデノウイルス型のＤＮＡにより形質転換されたヒト細胞系の特徴 J Gen Virol 1977; 36: 59-74。
23. Gerard RD, Meidell RS；アデノウイルス・ベクター Hames Bd, Glover D (eds)；ＤＮＡクローニング−実際的方法：哺乳動物系 Oxford, UK, 1995, p 285-307。
24. Alcorn JL, Gao E, Chen Q, Smith ME, Gerard RD, Mendelson CR；ウサギ表面活性タンパク質Ａ遺伝子の転写調節に関与する遺伝子要素 Mol Endocrinol 1993; 7: 1072-1085。
25. Kopfler WP, Willard M, Betz T, Willard JE, Gerard RD, Meidell RS；ヒト・アポリポタンパク質Ａ−Ｉをコードする遺伝子の正常マウスへのアデノウイルス仲介輸送は循環の高密度リポタンパク質コレステロールを増加する Circulation 1994; 90: 1319-1327。
【００４８】
26. Carmeliet P, Stassen JM, Van Vlaenderen I, Meidell RS, Collen D, Gerard RD；組織型プラスミノーゲン・アクチベーターのアデノウイルス仲介輸送は組織型プラスミノーゲン・アクチベーター欠損およびプラスミノーゲン・アクチベーター阻害剤−１−過剰発現のマウスにおいて血栓崩壊を増大する Blood 1997; 90: 1527-1534。
27. Carmeliet P, Moons L, Lijnen R, Janssens S, Lupu F, Collen D, Gerard RD；動脈損傷治癒および新動脈内膜形成におけるプラスミノーゲン・アクチベーター阻害剤−１の阻害役割 Circulation 1997; 96: 3180-3191。
28. Deutsch DG, Mertz Et；アフィニティクロマトグラフィ−によるヒト血漿からのプラスミノーゲン精製 Science 1970; 170: 1095-1096。
29. Edy J, De Cock F, Collen D：正常および抗プラスミン除去のヒト血漿によるプラスミンの阻害 Thromb Res. 1976; 8: 513-518。
30. Giles AR；生物医学研究における動物の使用についての指針 Thromb Haemost 1987; 58: 1078-1084。
【００４９】
31. Welsh FA, Sakamoto T, McKee AE, Sims RE；マウス脳での虚血におけるラクトアシドーシスのピリジン・ヌクレオチド安定性に対する作用 J Neurochem 1987; 49: 846-851。
32. Bederson JB et al；ラットにおける実験的脳梗塞の検出および定量のための染料としての塩化 2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム Stroke 1986; 17:472-476。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、焦点脳虚血性梗塞サイズに対するプラスミノーゲン系の要素（横線における遺伝子型）の欠損効果を示す。
【図２】 図２は、それぞれｔ−ＰＡまたはＰＡＩ−１欠損マウスにおける焦点虚血性脳梗塞サイズに対するｔ−ＰＡまたはＰＡＩ−１遺伝子のアデノウイルス輸送効果を示す。
【図３】 図３は、焦点脳虚血性梗塞サイズに対するα２−ＡＰの効果を示す。
Ａ．虚血性梗塞サイズに対するα２−ＡＰの効果。
Ｂ．虚血性梗塞サイズに対するα２−ＡＰまたはα２−ＡＰの注入、その後の抗α２−ＡＰのＦａｂ断片の注入の効果。
Claims (3)
- 血栓溶解のメカニズムによらずに虚血性脳卒中後の脳梗塞サイズを減少するための、プラスミン、最初の４クリングルを欠くミニプラスミンまたは全ての５クリングルを欠くミクロプラスミンからなる群から選択される、α２−抗プラスミン中和化合物を含む、組成物。
- α２−抗プラスミン中和化合物が、α２−抗プラスミン活性の全身体量を低下させる有効用量で投与される、請求項１記載の組成物。
- 該化合物がプラスミンであって、かつ該用量が６.７ｍｇ／ｋｇまでである、請求項２記載の組成物。
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| ES2534911T3 (es) | 2009-08-28 | 2015-04-30 | Thrombogenics N.V. | Uso de plasmina para el tratamiento de fallo de filtración después de trabeculectomía |
| BR112013017172A2 (pt) | 2011-01-05 | 2016-10-11 | Thrombogenics Nv | variantes de plasminogênio e plasmina |
| WO2013024074A1 (en) | 2011-08-12 | 2013-02-21 | Thrombogenics N.V. | Plasminogen and plasmin variants |
| AU2012304635B2 (en) * | 2011-09-06 | 2017-08-31 | Translational Sciences Inc. | SerpinF2-binding molecules and methods of use |
| WO2017101870A1 (zh) | 2015-12-18 | 2017-06-22 | 深圳瑞健生命科学研究院有限公司 | 一种预防或治疗糖尿病性视网膜病变的方法 |
| WO2017101872A1 (zh) | 2015-12-18 | 2017-06-22 | 深圳瑞健生命科学研究院有限公司 | 一种用于预防和治疗宫颈糜烂的方法 |
| CA3008186A1 (en) | 2015-12-18 | 2017-06-22 | Talengen International Limited | Novel method for preventing and treating angiocardiopathy |
| CA3008466C (en) * | 2015-12-18 | 2023-06-20 | Talengen International Limited | Method for preventing or treating radiation and chemical damage |
| US11090372B2 (en) | 2015-12-18 | 2021-08-17 | Talengen International Limited | Method of treating diabetic nephropathy comprising administering plasminogen |
| US11400142B2 (en) | 2015-12-18 | 2022-08-02 | Talengen International Limited | Treatment of diabetic nerve injury comprising administering plasminogen |
| CN106890325A (zh) * | 2015-12-18 | 2017-06-27 | 深圳瑞健生命科学研究院有限公司 | 一种预防或治疗糖尿病性神经损伤及其相关病症的方法 |
| US11311607B2 (en) | 2016-12-15 | 2022-04-26 | Talengen International Limited | Method for making glucagon and insulin restore normal balance |
| WO2021072404A1 (en) * | 2019-10-10 | 2021-04-15 | University Of Kentucky Research Foundation | A machine learning algorithm for predicting clinical outcomes and identifying drug targets in ischemic stroke |
| CN117677715A (zh) * | 2021-07-28 | 2024-03-08 | 北京沙东生物技术有限公司 | 一种骨髓瘤生物标志物serpinf2及其应用 |
| CN114736948B (zh) * | 2022-06-10 | 2022-11-08 | 深圳市帝迈生物技术有限公司 | 一种α2-抗纤溶酶活性测定试剂盒 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5520912A (en) | 1993-07-02 | 1996-05-28 | Immuno Aktiengesellschaft | Prevention and treatment of ischemic events and reperfusion injury resulting therefrom using lys-plasminogen |
| EP0941345A2 (en) * | 1996-09-20 | 1999-09-15 | The General Hospital Corporation | Chimeric, humanized and single chain antibodies to alpha-2-antiplasmin |
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