CN1253560C - 组织型纤溶酶原激活剂缺失/点突变体基因转染细胞株 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种组织型纤溶酶原激活剂突变体rPA(K)基因转染细胞株，它是以脂质体介导法将所构建成的含有t-PA cDNA的缺失/点突变体rPA(K)——rPA(KHRR296～299AAAA)基因(该突变体可逃避PAI-1的抑制)的真核表达载体pCSRK转染CHO-dhfr-，经G418及DMEM的双重选择后，获得了其稳定表达细胞株CHO-dhfr-pCSRK(保藏号：CGMCC NO.1094)。
Description
技术领域：
本发明涉及细胞生物学与分子生物学领域，其技术属于细胞生物学与分子生物学的相关实验方法与技术，特别是一种组织型纤溶酶原激活剂缺失/点突变体基因转染细胞株。
背景技术：
心血管疾病引发的血栓并发症严重威胁人类的生命与健康，是导致死亡和病残的主要疾病之一。全世界每年心血管病患者多达几千万；我国血栓性疾病的发生人数近年来也明显上升，每年高达300万，且治疗后复发率较高。而由血栓造成的急性心肌梗塞(Acutemyocardial infarction，AMI)的死亡率可高达30％。对于许多AMI患者来说，溶栓治疗是提高存活率及保持左心室功能的首选方法。故疾病发作时，进行及时有效的特效药物治疗以保证血液循环的正常畅通，对提高患者的生存率十分重要。
组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogenactivator，t-PA)是目前临床上所使用的第二代溶栓剂之一，它是血中纤溶系统中天然存在的生理性激活剂，能特异地激活纤溶酶原转变为纤溶酶，而后者能在血栓局部有效地溶解血栓中的纤维蛋白，使血管再通。但是，t-PA在血中的半衰期甚短(3～5分钟)，使得在临床治疗中为维持其有效浓度而必须大剂量静脉滴注，从而增加了引起系统性出血的危险。除此之外，溶栓治疗时，大量t-PA的使用也使其价格令人难以接受。因此设计并研制延长半衰期，降低系统出血倾向，提高特异活性，简化给药途径，价格便宜的新型t-PA愈发重要。基于此，人们努力开发研制新型溶栓试剂。
作为第三代溶栓制剂之一的rPA(Reteplase，t-PA的V4～E175缺失突变体)早在1996年就已通过FDA的认证。与野生型t-PA相比，其有许多的优点，如半衰期相对延长；对患者用药时，可以采用推注而非滴注的方式等等。但对于rPA来说，不仅其基因上仍然存在有t-PA的快速抑制剂PAI-1(plasminogen activator inhibitor-1)的作用位点，而且由于其为大肠杆菌的表达产物，需要进行大量的纯化与复性方面的工作，从而增加了生产成本，使其在国内临床上难以得到广泛的应用。
而对于真核细胞表达系统来说，由于其不仅能够正确剪接加工成熟的mRNA，提高产品正确构型的几率，且表达产物具有遗传稳定性和可重复性，可分泌到培养基中，提纯工艺简单，成本也较低。
发明内容：
本发明的目的是通过真核细胞表达方式提供一种组织型纤溶酶原激活剂缺失/点突变体基因转染细胞株
本发明的目的按下述方案实现：一种组织型纤溶酶原激活剂缺失/点突变体基因转染细胞株，它是以脂质体介导法将所构建成的t-PA的缺失/点突变体cDNA的真核表达载体pCSRK转染CHO-dhfr-，经G418及DMEM的双重选择后，首次获得了其稳定表达细胞株CHO-dhfr-pCSRK(保藏号：CGMCC NO.1094)；
上述t-PA的缺失/点突变体cDNA是在t-PA V4～E175缺失突变体cDNA的基础上，进一步进行了KHRR296～299AAAA点突变，以逃避PAI-1的抑制。
本发明对上述细胞株的生物学特性进行了鉴定。其中，FAPA检测结果表明，表达产物具有良好的溶纤活性；80℃平板灭活实验表明，产物具有特异活性；Western blotting结果表明，产物具有特异抗原性；稳定性试验表明，细胞株具有良好的稳定性。实验中，还对无血清培养基CHO-S-SFMII与常规培养基DMEM培养条件下的细胞株特性进行了比较，其中24h，48h，72h时，目的产物的表达量，前者均约为后者的2倍；SDS-PAGE显示，前者仅有少量的蛋白质条带，而后者则存在大量的蛋白质条带。
具体实施方式：
以脂质体介导法将所构建成的t-PA的缺失/点突变体cDNA的真核表达载体pCSRK转染CHO-dhfr-，经G418及DMEM的双重选择后，首次获得了其稳定表达细胞株CHO-dhfr-pCSRK(保藏号：CGMCC NO.1094)；
上述t-PA的缺失/点突变体cDNA是在t-PA V4～E175缺失突变体cDNA的基础上，进一步进行了KHRR296～299AAAA点突变，以逃避PAI-1的抑制。
并对其生物学特性进行了鉴定；实验中还首次对无血清培养基(serum free medium，SFM)在rPA突变体的生产应用方面进行了探索，从而进一步证明了SFM对于生产药用性蛋白质的广阔前景。本发明为临床上开发和应用延长半衰期，降低系统出血倾向，提高特异活性，简化给药途径和价格便宜的新型长效t-PA奠定了良好的基础。
Claims (1)
1、一种新型组织型纤溶酶原激活剂缺失/点突变体基因转染细胞株，其特征在于它是以脂质体介导法将所构建的t-PA的缺失/点突变体cDNA，即在t-PA V4～E175缺失突变体cDNA的基础上，进一步进行了KHRR296～299AAAA点突变，以逃避PAI-1抑制的真核表达载体pCSRK转染CHO-dhfr-，经G418及DMEM的双重选择后，首次获得了其稳定表达细胞株CHO-dhfr-pCSR，保藏号：CGMCC NO.1094。
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