JP4934796B2 - 可変抗体 - Google Patents
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Description
155−160;Rosendaal(1997), Thromb Haemost
78, 1−6)。
ンKアンタゴニストから構成されるが、それらは満足できるものではなく便利に使用することもできない。すべての治療には重大な出血のリスクがあり(Res, Comm. British Thoracic Soc.(1992), Lancet. 340(8824):873−6)、これは用量および治療期間のどちらも制限し、そして定期的な監視を必要とすることがある(Hylek & Singer(1994), Ann Intern Med. 120, 897−902;Cannegieterら(1995), N Engl J Med. 333, 11−17)。現在、新規薬物が開発されているが、いずれも有効性、安全性および便宜性の最高基準に適合するとは思われない。
付いている。さらに、LMWHは頻回な皮下投与を必要とし、クマリン誘導体は定期的監視を必要とする。
によって、可変最高阻害活性を有するが親和性は類似である抗体もしくはそのフラグメントを得る方法に関する。1つの実施形態では、修飾されたグリコシル化を備える抗体もしくはそのフラグメントの親和性は1nM未満である。理論によって限定せずとも、この方法は、抗原結合部位に対応する標的タンパク質のエピトープが前記タンパク質の活性もしくは相互作用部位の近位にはあるが正確には一致しない場合に、それらの抗体にとって特に適合する。グリコシル化の修飾は、任意に天然抗体もしくはそのフラグメントを炭水化物分解酵素もしくは形質転換酵素へ曝露させるステップによって得られる。あるいは、修飾されたグリコシル化を備える抗体は、適切なグリコシル化酵素を備える細胞株で抗体を産生するステップによって、または抗体を産生する細胞株のグリコシル化酵素の活性を修飾するために細胞培養条件を修飾するステップによって得られる。本発明のまた別の実施形態では、修飾されたグリコシル化を備える抗体は、例えば部位指向突然変異誘発によって、グリコシル化部位を除去または導入するために抗体を遺伝的に修飾するステップによって得られる。本発明のまた別の実施形態では、修飾されたグリコシル化を備える抗体は化学合成によって得られる。フラグメントは完全抗体から得ることができ、また当技術分野において記載された方法による組換えもしくは化学合成によって直接的に生成できる。修飾された阻害能力(および好ましくは実質的に影響を受けていない親和性)を備える抗体もしくはそのフラグメントは、天然抗体の阻害能力(および親和性)を測定するステップと、前記抗体のグリコシル化を修飾するステップと、そして修飾された抗体の阻害能力(および親和性)を再度測定するステップとによって任意に同定される。そこで、特定の実施形態によると、本発明は、前記抗体もしくはそのフラグメントが飽和濃度でFVIIIを20から85%阻害するFVIII阻害抗体もしくはそのフラグメントを産生するための方法であって:
−無傷FVIII阻害抗体もしくはそのフラグメントを提供するステップと、
−翻訳後レベルで前記抗体もしくは抗体フラグメントのグリコシル化を修飾するステップ、または前記抗体の可変領域のグリコシル化コンセンサス配列内の必須アミノ酸を改変するステップによって前記抗体もしくは抗体フラグメントのグリコシル化を修飾するステップと、を含む方法に関する。
び修飾された阻害活性を備える、本発明の方法によって得られる阻害抗体もしくはそのフラグメントに関する。本発明はさらに、前記抗体に類似するフラグメント、誘導体およびタンパク質に関する。本発明の抗体には、例えばFabフラグメント、F(ab’)2フラグメントおよびscFvなどを含むがそれらに限定されず、そのフラグメントが含まれる。本発明のより特定の実施形態では、FVIIIの可変最高阻害を示す抗体および抗体フラグメントが開示される。
後修飾、より詳細にはKrix−1、KRIX−1QもしくはKRIX−1Aの特性を備える抗体を産生する細胞株に関する。
グリコシル化部位を修飾もしくは導入できるような方法で修飾される。本発明の特定の実施形態は、抗凝固抗体もしくはそのフラグメントの最高阻害活性を変化させることに基づいて患者の臨床状態へ抗血栓療法を調整するための方法である。そこで、本発明は、患者の臨床状態を考慮に入れて、血栓症を治療もしくは予防するための、前記治療のために適切な最高阻害活性を得るための1つ以上の抗体の選択を含む医薬品の調製に関する。
配列番号1: Krix−1重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号2: Krix−1重鎖CDR領域を含むアミノ酸配列
配列番号3: Krix−1軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号4: Krix−1軽鎖CDR領域を含むアミノ酸配列
配列番号5: 組換えKrix−1フォワードプライマーの重鎖
配列番号6: 組換えKrix−1リバースプライマーの重鎖
配列番号7: 組換えKrix−1フォワードプライマーの軽鎖
配列番号8: 組換えKrix−1リバースプライマーの軽鎖
配列番号9: Krix−1Qフォワードプライマー
配列番号10: Krix−1Qリバースプライマー
配列番号11: Krix−1Aフォワードプライマー
配列番号12: Krix−1Aリバースプライマー
配列番号13: Krix−1Eフォワードプライマー
配列番号14: Krix−1Eリバースプライマー
配列番号15: Krix−1Dフォワードプライマー
配列番号16: Krix−1Dリバースプライマー
配列番号17: scFv−KRIX−1VLフォワードプライマー
配列番号18: scFv−KRIX−1VLリバースプライマー
配列番号19: scFv−KRIX−1VHフォワードプライマー
配列番号20: scFv−KRIX−1VHリバースプライマー
配列番号21: His(6)タグを含むscFv−KRIX−1VLVHのフォワードプライマー
配列番号22: His(6)タグを含むscFv−KRIX−1VLVHのリバースプライマー
配列番号23: scFv−Asn47Gln KRIX−1VLVH(His)のフォワードプライマー
配列番号24: scFv−Asn47Gln KRIX−1VLVH(His)のリバースプライマー
配列番号25: scFv−Asn47Gln KRIX−1 VLVH(His)を含むヌクレオチド配列
配列番号26: scFv−Asn47Gln KRIX−1VLVH(His)を含むアミノ酸配列
配列番号27: CHO−scFvKRIX−1VLVHQ(His)のフォワードプライマー
配列番号28: CHO−scFvKRIX−1VLVHQ(His)のリバースプライマー
配列番号29: RHD5 VH領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号30: RHD5 VH領域を含むアミノ酸配列
配列番号31: RHD5 VL領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号32: RHD5 VL領域を含むアミノ酸配列
用語の定義
本明細書で使用する用語「抗体」(「Ab」)は、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体分子を意味する。抗体の「フラグメント」には:
任意で例えば一方もしくは両方のCDRで約10アミノ酸配列までの隣接フレームワーク配列と一緒に、任意でそれらの定常領域(もしくはその部分)を含む、もしくは任意でその定常領域もしくはその部分、詳細にはその特異性決定部分、すなわち抗体の可変領域、そのサブパート、詳細にはその高可変部分、例えば少なくとも1つのCDRを含むアミノ酸の伸長部を作り上げたペプチドなどの小さな修飾(アロタイプ変異体)を含む、重鎖および軽鎖の両方(例えばFab、F(ab)2、F(ab’)2もしくはScFV)、または重鎖もしくは軽鎖の一方(例、軽鎖ダイマー)のいずれかを含む分子が含まれる。
2は、ペプシン分解後に得ることができる抗体フラグメントを意味しており、軽鎖およびヒンジ領域を介して連結された重鎖ジスルフィドの部分の両方から形成されている。Fabフラグメントは無傷抗体から、またはヒンジ領域のパパイン消化によってF(ab’)2から得ることができ、一本の軽鎖および重鎖の一部分を含有している。抗体のフラグメントは、さらに合成によって、または当技術分野において記載された組換え方法によって得ることができる。scFvフラグメントのようなフラグメントは、抗体ヌクレオチド配列の関連部分のPCR増幅およびこれらを発現ベクター内で例えばscFvフラグメントの場合にはリンカー配列などの適切な追加の配列と一緒にクローニングするステップによって得ることができる。
割った同一のヌクレオチドもしくはアミノ酸を有する位置の数が80%を超える、好ましくは少なくとも90%、いっそうより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも99%、より詳細には100%であることを意味する。2つのヌクレオチド配列のアライメントは、Wilbur and Lipmann(1983), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:726によって記載されたアルゴリズムを使用して、20ヌクレオチドのウィンドウサイズ、4ヌクレオチドのワード長、および4のギャップペナルティを用いて実施される。
専門用語:リンパ芽球様細胞株(LCL)内で産生されたモノクローナル抗体KRIX−1は、Krix−1と呼ばれている。
ix−1と呼ばれている。
って確証された。より興味深いことに、組換えmAb−Krix−1の様々な修飾形の混合は、例えば過剰に投与された場合に、FVIII阻害の様々なプラトーを備える組み合わせを得ることを可能にした。したがって、このストラテジーは、抗凝固作用と出血リスクとの間の最善比を選択することを可能にして、極めて広い治療範囲においてFVIIIを阻害する抗凝固FVIII調製物の産生を可能にする。これらの抗体の長い半減期は、長期間にわたりこれらの標的阻害を得ることを可能にする。
の要素は、タンパク質、ペプチド、リン脂質、塩、脂質、核酸、有機分子などであってよい。複合体内に含まれるタンパク質の例は、その活性を実施するとリン脂質および/またはフォン・ヴィレブラント因子と相互作用する第VIII因子(FVllla)である。
免疫化によって達成できる。抗体の選択は、その阻害活性に基づいている。次のステップは、様々な方法(酵素的分解、炭水化物の酵素的付加、突然変異など)による天然抗体の可変領域のグリコシル化を修飾するステップである。任意で、これはグリコシル化部位および抗原との相互作用の利用可能性を考慮に入れて実施される。あるいは、選択は天然抗体と比較して(または相互に比較して)影響を受けていない親和性および修飾された阻害活性に基づく。
関する。
様々な細胞株内で発現する無傷抗体、脱グリコシル化酵素を用いて処置される無傷抗体、およびグリコシル化コンセンサスサイズの部位指向突然変異誘発に関する初期データは、そのような抗体の阻害効果がグリコシル化のサイズと相関していることを証明している。本発明は、Krix−1などの阻害抗体については、抗体の阻害効果が三次元サイズに伴って減少するという概念を提示している。この概念は、無傷抗体より低い阻害レベルを有するKrix−1のFabフラグメントおよびscFvフラグメントの使用によって確証される。
マウスおよびラットを含むがそれらに限定されない様々な宿主動物を免役化することができる。宿主の種に依存して、免疫学的応答を増加させるためには、(完全および不完全)フロイント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオールなどの界面活性剤、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、アオガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびに例えばBCG(カルメットゲラン菌)およびCorynebacterium parvum(コリネバクテリウム・パルブム)を含むがそれらに限定されない様々なアジュバントを使用できる。
パターンを修飾することができる。グリコシル化は、完全もしくは部分的に増加もしくは減少させることができる。特定の実施形態では、修飾は抗体の抗原結合領域内で得られる。酵素は、様々なグリコシル化パターンを備える抗体を得るために、様々な順序および様々な状況(濃度、時間、温度、バッファなど)下で天然抗体に適用できる。
in Protein Science)」、G.Taylor編集、Unit 12.4;John Wiley & Sons, Incに記載されている。
Biochem Biophys Res Comm. 286:243−249)。エンドグリコシダーゼF2はコア領域内の2つのGlcNAc残基間の結合を開裂させて、まだ前記タンパク質に結合した1つのGlcNAcを残す。エンドグリコシダーゼF2は、糖タンパク質から二本鎖複合体型のオリゴ糖鎖を放出するが、三本鎖型もしくは四本鎖型糖鎖は開裂しない。
communis(トウゴマ)アグルチニン1は、このレクチンがガラクトースで終了するオリゴ糖に対する特異的親和性を示すために、ガラクトース残基の数によって分画化する(Youingsら(1996), Biochem J. 314, 621)。
ーゼ遺伝子を用いてトランスフェクトされたCHO−K1細胞株を使用できる(上記参照)。
cerevisiae(サッカロミセス・セレビシアエ)グリコシル化欠損性突然変異体mnn9は、mnn9細胞が過剰グリコシル化タンパク質の代わりにMan(9−13)GlcNAc(2)からなる修飾されたオリゴ糖を備えるグリコシル化タンパク質を産生する点で野生型S. cerevisiaeとは相違する(米国特許第5,135,854号におけるMackayら)。しかし、S. cerevisiae(野生型およびmnn9突然変異体)コアオリゴ糖についての特徴は、末端α−1,3−結合マンノース残基の存在である(Montesinoら(1998), Protein Expr Purif. 14, 197−207.)。P. pastorsもしくはS. cerevisiae och1mnn1内で発現したタンパク質のN−グリコシル化部位に付加されたオリゴ糖には、そのような末端α1,3−結合マンノースが欠けている(Gellissenら(2000)Appl Microbiol Biotechnol.
54, 741−750)。末端α1,3−結合マンノースはアレルゲン性であると考えられる(Jenkinsら(1996), Nat. Biotechnol. 14, 975−981)。このため、それらのオリゴ糖の末端α1,3−結合マンノース残基上に担持されているタンパク質は、おそらく診断もしくは治療目的には適合しない。
期の原因とは独立して全身性炎症では極めて類似する生理的変化が観察されるので、用語「全身性炎症性応答症候群」(以下ではSIRSという)は一般にそのような変化を意味すると一般に言われており、このため本出願ではR.C. Boneら、Chest(1992), 101,1644−1655によって考案されたアメリカ胸部医師会(American College of Chest Physicians)の勧告にしたがって使用した。SIRSの定義および病因はさらにNystrm(1998), J. Antimicrob. Chemother. 41 Suppl A, 1−7に記載されている。敗血症は、感染症に関連するSIRSを表している。ショックは、敗血症起源であろうとなかろうと、つまり(a)適正な急速輸液にもかかわらず持続する低血圧、および(b)低潅流もしくは臓器機能不全に関連する異常を特徴とする。
トロンビンの生成を生じさせ、増幅ループを活性化してより多くのトロンビン形成をもたらす。この増幅ループにおいて2つの補因子である第V因子および第VIII因子は活性化されるが、それらの機能はプロトロンビンおよび第X因子の開裂を各々数対数の大きさまで増加させることである。凝固カスケードの伝播期は、最終的にはフィブリンの形成および血餅退縮をもたらす。このため、トロンビンは他の起源の敗血症もしくはSIRSに関連するDICの発達において中心的役割を果たす。この発見は、トロンビン形成を減少させる治療的試みをもたらした。ヒトにおいては、アンチトロンビンを合成プロテアーゼ阻害剤(Makiら、Gynecol. Obstet. Invest(1987),
23:230−240)またはヘパリン(Blauhutら、Thromb. Res.(1985), 39:81−89)と比較する試験は、アンチトロンビン処置後の播種性血管内凝固症候群の有意な減弱を証明したが、いずれの試験もプラシーボコントロール群を含んでいなかった。Fourrierら、DIC, Excerpta Medica, Amsterdam(1993), 221−226によると、敗血性ショックおよびDICを有する患者を対象としてアンチトロンビンの血漿濃縮液を用いた治療を実施したプラシーボ対照二重盲験試験はDICの有意な初期補正を達成したが、統計的有意な方法で死亡率を減少させることはできなかった。近年には、Eiseleら、Intensive Care Med.(1998), 24:663−72によると、血漿由来もしくは組換えATが敗血症のコントロールにおいて試験されている。しかし、これらすべての実施形態は重篤な問題に遭遇した。天然血漿中アンチトロンビンは、トロンビンの相当に不良な阻害剤であるが(トロンビンの完全阻害を達成するが、これは極めて高い濃度の場合だけである)、しかしその阻害効果はヘパリンの存在下では10,000倍に上昇する。Bufferら、Am. J. Med.(1989), 87:44−48およびVinazzer, Clin. Appl. Thromb/Hemost(1995) 1:62−65によると、敗血症の動物モデルにおいてショックを予防するためには高濃度のアンチトロンビンが必要である。循環内でのアンチトロンビンの中等度の生存時間(Schwartzら、Am. J. Med.(1989) 87:53−60およびMenacheら、Blood(1990) 75:33−39によって約3日間の半減期が報告された)およびSIRSにおけるその消費のために、その活性は定期的に監視されなければならない。理論的には、アンチトロンビンおよびヘパリン併用療法は、ショックの管理においてアンチトロンビン単独より有効なはずであるが、あいにくなことにこの形態の治療はショックを発生した患者における転帰を改善せず、上昇した出血リスクと関連していた。
−それらはトロンビンの形成を減少させる、もしくは部分的に阻害するために十分な程度までFVIIIの機能を阻害する。トロンビンの形成の減少、しかし完全ではない抑制
は正常な血餅形成を許容しながら播種性血管内凝固症候群(DIC)の発生を予防する。DICの予防は、正常臓器潅流を維持し、臓器機能障害および不全を回避する。
KRIX−1(PBS中で0.5mg/mL)を最終濃度2U/mLとなるようにN−グリコシダーゼ−F(Roche Diagnostics Gmbh社、ドイツ国マンハイム)と混合した。この混合物を穏やかに攪拌しながら37℃で72時間インキュベートした。
IgG(Sigma社)を添加した。室温での2時間後、プレートを再び洗浄し、100μLのOPDを補給した。結果として生じたODは、Emaxマイクロプレートリーダー(Molecular Devices社、カリフォルニア州メンロパーク)内で492nmで読み取った。陰性および陽性コントロールは、各々培養培地および高力価阻害剤血友病A患者から精製したIgGであった。
血栓は、以前に記載したモデル(Singhら、2002、上記参照)を用いて成熟雄性野生型マウス(体重:18g〜31g、年齢:8〜10週齢)の下大静脈内で生成した。マウスにイソフルランを用いて麻酔し、正中開腹術を介して下大静脈を腎静脈の下方まで露出させ、神経外科用血管クリップ(Braun Medical社)を大静脈のセグメントへ30秒間あけて15秒間ずつ2回装着した。次に5/0プロレン(prolene)糸を大静脈の周囲に配置し、4/0絹縫合糸を大静脈およびプロレン糸に結び付けることによって狭窄を生成した。糸を取り除いて、血流を再開させた。腹部を閉鎖し、動物が回復するに任せた。4時間後、マウスに再度麻酔し、大静脈の1cm部分(結紮点と腸骨動脈分岐部との間)を切開し、血栓の存在について検査した。切開したセグメントを次に10% PBS中で洗浄し、1%パラホルムアルデヒド中に一晩浸漬した。血管セグメントをパラフィンろう中に包埋し、結紮部から下方へ0.5mm間隔で7×10μmの横断切片を切除した。これらの切片は、haematoxylin and eosin(ヘマトキシリン&エオシン)、Martius Scarlet Blue(マルチウス・スカーレット・ブルー:MSB)およびウサギ抗血小板抗体(Accurate Chemical & Scientific Corporation、11590ニューヨーク州ウェストベリー)によって染色した。MBSは新鮮フィブリンを赤色、もしくは成熟フィブリンを青色/灰色、赤血球を黄色、そしてコラーゲンを淡青色に染色した。血栓のサイズは、血栓の存在について7切片をスコア付けすることによって測定し、各々血栓が存在する場合は1、存在しない場合は0のスコアを付けた。次に各動物についてスコアを合計した。手術および顕微鏡分析を実施する試験者は治療群について知らされていなかった。
置した各群において血栓を発生した動物は7匹中1匹もいなかった(P<0.01)。
II型ヘパリン結合部位(HBS)アンチトロンビン欠損症を備えるマウスにおける血栓性持続勃起症モデルを用いて、CHO−recKRIX−1の抗血栓活性を評価した(Dewerchinらの提示)。
USA. 81, 289−293)。雄性マウスATm/mの交配後の持続勃起症発生の観察は、血栓性転帰の明確なエンドポイントおよび容易な等級付けを提供し、静脈血栓症の生理学的モデルの開発の根拠を提供した。
性マウスに対してフォローアップ期間内の少なくとも2匹の雌性マウスにおける膣粘液栓子の存在は、これらの雄性マウスの実際的性活動を確証した。
実施例5において概説したように、II型ヘパリン結合部位(HBS)アンチトロンビン欠損症を備えるマウスにおける血栓性持続勃起症モデルを用いて、CHO−recKRIX−1Qの抗血栓効率を評価した(Dewerchinら(2003), Circ Res 93, 1120−1126)。
CHOrecKrix−1Qは、Asn47−Thr49でのN−結合グリコシル化部位を崩壊させるためにAsn47をGln47へ改変させる重鎖内の単一アミノ酸変化を結果として生じさせるpCR4−Blunt−TOPO−Krix−1Hプラスミド上の部位指向突然変異誘発によって産生した。本発明の状況では、Krix−1抗体のコーディング配列を含む他のプラスミドを同様に使用できる。Krix−1の重鎖および軽鎖のCDRを含むアミノ酸配列は、各々配列番号2および配列番号4に提供した。Krix−
1の重鎖および軽鎖のCDRの配列をコードするヌクレオチド配列は、各々配列番号1および配列番号3に提供した。
フォワードプライマー:2つの改変ヌクレオチド(aからcおよびcからa;太字のイタリック)を含有するKrix−1重鎖配列のnt119から164(大文字)に対応する5’−CCTGCAAGACCTCTGGATACcAaTTCACCGGCTACTCTGCTTCTGG−3’(配列番号9);
リバースプライマー:2つの改変ヌクレオチド(gからtおよびtからg;太字のイタリック)を含有するKrix−1重鎖配列のnt119から164(大文字)に対応する5’−CCAGAAGCAGAGTAGCCGGTGAAtTgGTATCCAGAGGTCTTGCAGG−3’(配列番号10);
CHO−recKrix−1Aは、Asn47−Thr49でのN−結合グリコシル化部位を崩壊させるためにThr49からAla49へ改変されている単一アミノ酸変化を生じさせる部位指向突然変異誘発によって産生した。
フォワードプライマー:2つの改変ヌクレオチド(aからgおよびcからt;太字のイタリック)を含有するKrix−1重鎖配列のnt128から164(大文字)に対応する5’−CCTCTGGATACAACTTCgCtGGCTACTCTGCTTCTGG−3’(配列番号11);
リバースプライマー:2つの改変ヌクレオチド(gからaおよびtからc;太字のイタリック)を含有するKrix−1重鎖配列のnt128から164(大文字)に対応する5’−CCAGAAGCAGAGTAGCCaGcGAAGTTGTATCCAGAGG−3’(配列番号12);
CHO−recKrix−1Eは、Asn47−Thr49でのN−結合グリコシル化部位を崩壊させるためにAsn47からGlu47へ改変されている単一アミノ酸変化を生じさせる部位指向突然変異誘発によって産生した。
フォワードプライマー:2つの改変ヌクレオチド(aからgおよびcからg;太字のイタリック)を含有するKrix−1重鎖配列のnt119から164(大文字)に対応する5’−CCTGCAAGACCTCTGGATACgAgTTCACCGGCTACTCTGCTTCTGG−3’(配列番号13);
リバースプライマー:2つの改変ヌクレオチド(gからcおよびtからc;太字のイタリック)を含有するKrix−1重鎖配列のnt119から164(大文字)に対応する5’−CCAGAAGCAGAGTAGCCGGTGAAcTcGTATCCAGAGGTCTTGCAGG−3’(配列番号14);
CHO−recKrix−1Dは、Asn47−Thr49でのN−結合グリコシル化部位を崩壊させるためにAsn47からAsp47へ改変されている単一アミノ酸変化を生じさせる部位指向突然変異誘発によって産生した。
フォワードプライマー:1つの改変ヌクレオチド(aからg;太字のイタリック)を含有するKrix−1重鎖配列のnt119から164(大文字)に対応する5’−CCTGCAAGACCTCTGGATACgACTTCACCGGCTACTCTGCTTCTGG−3’(配列番号15);
リバースプライマー:1つの改変ヌクレオチド(tからc;太字のイタリック)を含有するKrix−1重鎖配列のnt119から164(大文字)に対応する5’−CCAGAAGCAGAGTAGCCGGTGAAGTcGTATCCAGAGGTCTTGCAGG−3’(配列番号16)。
Biosciences社、スウェーデン国ウプサラ)を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。濃縮後、rec−mAb−KRIX−1Q(各々、A、EおよびD)を機能性についてアッセイした(突然変異rec−mAb
Krix−1がfVIII活性を阻害する能力を評価するクロモジェニックアッセイ)。fVIIIに対する阻害能力を野生型rec−mAb Krix−1と比較した(図8および9)。これらの突然変異体によるFVIII阻害の範囲は30から40%に及んだ。
表面プラズモン共鳴(SPR)の測定
Pharmacia製バイオセンサーBIAcore(商標)設備(Pharmacia Biosensor AB社)を用いて、CHO−rec−KRIX−1Q、CHO−rec−KRIX−1Aおよび天然CHO−rec−KRIX−1へのFVIIIの会合および解離速度を分析した。精製した抗体(10mMの酢酸ナトリウムバッファ(pH5.0)中の20μg/mL)を、製造業者の取扱説明書にしたがって、CM5センサーチップの活性化表面上で固定した。すべての結合実験は、HBS内で10μL/分の一定流量で、実施した。Hepes緩衝化生理食塩液(HBS)中のFVIIIを、センサーチップ表面上にコーティングした抗体の上方に様々な濃度で注入した。各サイクルの終了時に、pH2のHClを36秒間フラッシュすることによって再生させた。コントロール実験は、FVIIIが不溶化抗体にしか結合しないことを確証した。そこで、rFVIIIは抗体の不在下ではセンサーチップに結合せず、チップへの添加前に可溶性抗体とのrFVIIIのプレインキュベーションはFVIII結合を完全に妨害した。
を用いて確立した個別曲線について得た数値を平均化することによって決定した。kdissの数値は、分析物の遊離固定リガンドへの再結合に起因する偏りを減少させるために、最高分析物濃度だけを用いて得た個別曲線から決定した。全データは、会合および解離期中に得られた反応から分析物(rfVIII)の注射前に観察された反応を減じることによってベースライン値を補正した後に分析した。
方法
プロトコール
雄性ヒヒ(Papio ursinus)を使用した。動物の体重は8〜17kgであり、少なくとも実験前6カ月間は疾患を有していなかった。すべての方法は、南アフリカにおける薬物および関連物質の研究、境域、診断および試験における動物の使用に関する国内規約に従って、自由州立大学の動物実験倫理委員会によって承認された。
ては10/秒であった。
人工血管のイメージング
自己血小板を111In−トロポロンを用いて標識し、コントロール実験の開始1時間前に動物に再注入した。これによって第0、1および2日に画像獲得が可能になった。第6もしくは14日に画像獲得を提供するために、標識手順を繰り返した。人工血管の画像獲得は、高分解能コリメータを装備したガンマシンチレーション・カメラを用いて実施した。これらの画像を保存し、シンチレーションカメラと接続されたコンピュータ・イメージングおよび分析システムを用いて分析した。動態画像獲得、血中放射能を決定するために人工血管をイメージングするたびに5mLの自己血液サンプルの3分間画像も獲得した(血液標準)。動態画像内の沈着放射能および循環中放射能を決定するために、人工血管および膨張セグメントの当該領域を選択した。人工血管材料上および膨張チャンバー内に沈着した血小板の総数を計算した。
エンドトキシンの注射は炎症促進性サイトカインの産生を誘発するが、それらの中では凝固系との相互作用を示すためにIL−6およびTNF−αが重要である。そこで、IL−6は組織因子の産生を増加させ、そして結果としてトロンビンの生成を増加させる。これはさらに、独立機序によるフィブリノーゲンの産生を増加させる。TNF−αは、プラスミノーゲン活性化阻害因子1型(PAI−1)のレベルおよびそれによってフィブリン溶解を減少させる。
野生型およびFVIIIノックアウトマウスに30および100μgの下記の抗体を静脈内注射した:
−抗体なし
−コントロール抗体(IgG4)
−CHO細胞内で発現したK−rix1抗体(CHO−recKRIX−1)
−Asn47で突然変異したKrix−1(CHO−recKRIX−1Q)
−1/4もしくはその他の比率にある(KRIX−1)/(CHO−recKRIX−1Q)
試験のために天然もしくは脱グリコシル化Krix−1のフラグメント(より詳細には、FabもしくはscFvフラグメント)を含む混合物などのKrix−1を含むその他の混合物を想定した。Krix−1および第2抗体を含む他の混合物(実施例13に開示
した)もしくはその誘導体もまた考慮の対象とした。特定の混合物は、Krix−1およびRHD5またはKrix−1および/またはRHD5のフラグメントを含んでいた。
体重20g当たり40μgのリポ多糖注射によるフィブリン溶解性経路の程度は2つの主要な経路不活性化因子、つまりPAI−1(プラスミノーゲン活性化阻害因子1)およびα2−アンチプラスミンの濃度を、評価下の分子の様々な部位に向けて立てられた2種の特異的モノクローナル抗体を用いるサンドイッチ型ELISAを使用して評価した。
チモーゲンおよび活性化タンパク質Cの決定は、例えばRichardsら(1990), Clin. Chem. 36, 1892−1896にしたがって測定できる。
LCL−およびCHO−KRIX−1(PBS中で0.5mg/mL)を最終濃度2U/mLでN−グリコシダーゼ−F(Roche Diagnostics Gmbh社、ドイツ国マンハイム)と混合した。この混合物を穏やかに攪拌しながら37℃で72時間インキュベートした。
ピチア発現ベクター内でのscFv−KRIX−1VLVHのクローニング
KRIX−1のscFvフラグメントは、KRIX−1軽鎖可変部分(VL)の3’末端と重鎖可変部分(VH)の5’末端との間のリンカー配列を付加することによって構築
した。これは、次のプライマーを用いてKRIX−1軽鎖および重鎖のPCR増幅によって得た:
軽鎖については:フォワードプライマー:Krix−1 VL配列の5’末端(大文字)に対応し、そしてXhol制限部位(下線付き)およびKEX1配列(太字のイタリック)を含有する5’−gtatctctcgagaaaagaGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGC−3’(配列番号17);リバースプライマー:KRIX−1 Jk配列の3’末端(大文字)に対応し、そしてリンカー配列の一部(イタリック)を含有する5’−cgccagagccacctccgcctgaaccgcctccaccTCGTTTGATCTCCACCTTGGTC(配列番号18)。
ピチア発現ベクター内でのHis(6)タグを用いたscFv−KRIX−1VLVHのクローニング
pPICZalphaC発現ベクター(Invitrogen社、ベルギー国メレルベーケ)内に含まれるHis(6)配列を用いてそれをフレーム内にクローニングするために、SalI制限部位をscFv−KRIX−1VLVH配列内に付加した。これはフォワードプライマーを用いるPCRによって得た:Krix−1 VL配列の5’末端(大文字)に対応し、そしてXhol制限部位(下線付き)およびKEX1配列(太字のイタリック)を含有する5’−gtatctctcgagaaaagaGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGC−3’(配列番号21);およびリバースプライマー:KRIX−1 重鎖JH配列の3’末端(大文字)に対応し、そしてSalI制限部位(下線付き)を含有する5’−catggtcgacTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCCCGGCC−3’(配列番号22)。
ピチア発現ベクター内でのHis(6)タグを用いたscFv−KRIX−1VLVHQのクローニング
scFv−KRIX−1VLVHQ(His)は、Asn47−Thr49でのN−結合グリコシル化部位を崩壊させるためにAsn47がグルタミンに置換されている単一アミノ酸変化を結果として生じさせるpPICZalphaC−scFv−KRIX−1V
LVH(His)上の部位指向突然変異誘発によって産生した。
フォワードプライマー:2つの改変ヌクレオチド(aからcおよびcからa;太字のイタリック)を含有するKRIX−1重鎖配列のnt119から164(大文字)に対応する5’−CCTGCAAGACCTCTGGATACcAaTTCACCGGCTACTCTGCTTCTGG−3’(配列番号23);
リバースプライマー:2つの改変ヌクレオチド(gからtおよびtからg;太字のイタリック)を含有するKRIX−1重鎖配列のnt119から164(大文字)に対応する5’−CCAGAAGCAGAGTAGCCGGTGAAtTgGTATCCAGAGGTCTTGCAGG−3’(配列番号24);
His(6)タグを備えるscFv−KRIX−1VLVHQの全長配列は、配列番号25および26に記載した。
CHO発現ベクター内でのHis(6)タグを用いたscFv−KRIX−1VLVHおよびscFvKRIX−1VLVHQ(His)のクローニング
KRIX−1軽鎖リーダー配列は、リーダー配列を含有するpCR4−KRIX−1LのHindIII/Pstl制限フラグメントをHindIII/Pstl消化pPICZαC−scFv−KRIX−1VLVHおよびpPICZαC−KRIX−1VLVHQ各々の中にクローニングすることによってpPICZalphaC−scFv−KRIX−1VLVH(His)およびpPICZalphaC−scFv−KRIX−1VLVHQ(His)内へ挿入した。結果として生じたscFv配列は、次の特異的プライマーを使用するPCRによってクローニングおよび発現目的のために適応させた:
フォワードプライマー:KRIX−1軽鎖配列の5’末端(大文字)に対応し、そしてHindIII部位(下線付き)およびKozak配列(太字のイタリック)を含有する5’−cccaagcttgccgccaccATGGAAACCCCAGCKCAGCTTC−3’(配列番号27);
リバースプライマー:KRIX−1重鎖JH配列の3’末端(大文字)に対応し、そしてEcoR1部位(下線付き)、停止シグナル配列(太字のイタリック)およびHis(6)タグ配列(イタリック)を含有する5’−ccggaattctcaatgatgatgatgatgatgTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC−3’(配列番号28);
結果として生じたPCR産物をpGEM−T−Easyベクター(Promega社、オランダ国ライデン)内にクローニングした。配列検証後に、scFvKRIX−1VLVH(His)およびscFv−KRIX−1VLVHQ(His)をpEE14.4ベクター(Lonza Biologics社、ニューハンプシャー州ポーツマス)内にクローニングした。結果として生じたベクターは、トランスフェクション前にSalIを用いて直鎖状化した。
少させることによって適応させた。
ヒトリンパ芽球様細胞株RHD5は、(Jacqueminら(1998), Blood 92,496−506)に記載された方法によってFVIIIに対する自己免疫応答を発生した患者からのBリンパ球の不死化に由来した。手短には、107個の末梢血単核球を2mLの培養培地中に再懸濁させ、200μLのエプスタイン・バーウイルス(B95−8株)上清と一緒に37℃で2時間インキュベートした。次に細胞はフィーダー細胞(7.000ラッドを用いて照射された3T6−TRAP細胞)を含有する96ウエルマイクロタイタープレート(Nunc社)内に5,000cells/ウエルで播種した。150μLの培養上清は、新鮮培養培地と毎週取り替えた。6週間後、抗FVIII抗体の存在について酵素結合免疫吸着アッセイにおいて培養上清を試験した。陽性細胞株を24ウエルプレートへ移し、直ちにフィーダー細胞を有していない96ウエルプレート1枚につき60cellsでクローニングした。RHD5と呼ばれる抗体を産生する1個のクローンを選択した。
SD)。このため100μg/mLのRHD5の最終濃度に到達したFVIII活性の阻害は98%であった。
Devices社、カリフォルニア州メンロパーク)内で490nmで読み取った。
本実施例では、Krix−1などの第1阻害抗体から出発して、Krix−1などの第1阻害抗体の結合と競合するという事実に基づいて追加の第2抗体を同定できる方法について記載する。好ましくは、この方法で同定した抗体は阻害性であり、さらにプラトー効果(FVIIIに比してモル過剰(5、10、20、50、もしくは100倍さえのモル過剰)での部分的阻害)を有する。以下に記載する方法は、Krix−1の代わりにRHD5を用いて同様に実施できる。
抗体が一緒に混合され、その後にKrix−1のFVIIIへの残留結合がアッセイされた。
227, 381−388;Vaughanら(1996), Nat Biotechnol. 14, 309−314;Tomlinsonら(1992), Hum Mol Genet. 3, 853−860;Nissimら(1994), EMBO J. 13, 692−698;Griffithsら(1994), EMBO J. 12, 725−734)。可変重鎖(VH)および可変軽鎖(VL)免疫グロブリンライブラリーはファージ内で開発されてきた。これらのファージは、抗体をパニングするステップによって選択できる。コードされた抗体フラグメントは、次に感染した細菌からの可溶性フラグメントとして分泌させることができる。ファージ上の抗体のこの提示および抗原を用いた選択は免疫選択を模倣しており、単一ファージライブラリーから出発する免疫を行わずに抗体を作製するために使用できる(Hoogenboom and Winter(1992), J Mol Biol. 227, 381−388)。ヒト合成VHおよびVscFvライブラリーはloxライブラリーベクターからの重鎖および軽鎖可変領域を再クローニングすることによって作製したが、このとき重鎖および軽鎖V遺伝子は無作為にシャッフリングし、線維状ファージの表面上のFv(scFv)フラグメントとしての提示についてファージミドベクターpHEN2内へクローニングした(Griffithsら(1994), EMBO J. 12, 725−34)Dr.G. Winterのタンパク質エンジニアリングセンター、LMB−MRC、英国ケンブリッジ])。
定されたscFvフラグメントおよび対応する抗体のグリコシル化もまた、本発明に記載した技術を用いて修飾することができる。
Claims (14)
- FVIIIに対する阻害抗体の修飾された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
修飾されていない阻害抗体は、配列番号2の45−64、79−95および128−145のアミノ酸によってそれぞれ表わされるアミノ酸配列を可変重鎖のCDR1、CDR2およびCDR3領域として含み、配列番号4の44−55、71−77および110−119のアミノ酸によってそれぞれ表わされるアミノ酸配列を可変軽鎖をCDR1、CDR2およびCDR3領域として含み、
修飾されていない阻害抗体は、ヒトリンパ芽球様細胞株中での発現により産生され、
前記修飾は、配列番号2の位置47での可変重鎖の完全なまたは部分的な脱グリコシル化である、抗体もしくはそのフラグメント。 - 可変重鎖のグリコシル化部位が、配列番号2の位置47でのAsnの変異、および/または、配列番号2の位置49のThrのセリンとは異なる他のアミノ酸への変化によって変異される、請求項1に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
- 前記変異は、配列番号2の位置47のAsnのGln、GluまたはAspへの変化、および/または、配列番号2の位置49のThrのAlaへの変化である、請求項2に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
- 完全なまたは部分的な脱グリコシル化は、配列番号2の位置47のAsnの脱グリコシル化である、請求項1に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
- FVIIIに対する前記阻害抗体が、アクセッション番号LMBP5089CBで寄託された細胞株で産生されたKrix−1である、請求項1または2に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
- scFvフラグメント、FabフラグメントもしくはF(ab’)2フラグメントである、請求項1〜3のいずれかに記載の抗体もしくはそのフラグメント。
- 配列番号26のアミノ酸21〜282によって表されるscFvフラグメントである、請求項4に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
- 配列番号2のアミノ酸20〜165との少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖を含み、かつ、配列番号4のアミノ酸21〜143との少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含む、請求項1〜5のいずれかに記載の抗体もしくはそのフラグメント。
- 配列番号1のヌクレオチド58〜495との少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる配列を含む免疫グロブリン重鎖を含み、かつ、配列番号3のヌクレオチド61〜429との少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含む、請求項1〜5のいずれかに記載の抗体もしくはそのフラグメント。
- 請求項1〜7のいずれかに記載の修飾された阻害抗体もしくはそのフラグメントと、
修飾されていない阻害抗体は、配列番号2の45−64、79−95および128−145のアミノ酸によってそれぞれ表わされるアミノ酸配列を可変重鎖のCDR1、CDR2およびCDR3領域として含み、配列番号4の44−55、71−77および110−119のアミノ酸によってそれぞれ表わされるアミノ酸配列を可変軽鎖をCDR1、CDR2およびCDR3領域として含み、ヒトリンパ芽球様細胞株中での発現により産生される、修飾されていない阻害抗体もしくはその抗原結合フラグメントとの混合物。 - 請求項1〜7のいずれかに記載の抗体または請求項8の混合物を含む医薬組成物。
- 血栓塞栓性障害の治療もしくは予防において使用するための請求項1〜7のいずれかに記載の抗体もしくはそのフラグメントまたは請求項8に記載の混合物を含む組成物。
- 前記血栓塞栓性障害が深部静脈血栓症、肺動脈塞栓症、栓友病、脳梗塞、心房細動、非Q波心筋梗塞、非ST上昇性心筋梗塞、不安定狭心症、敗血症もしくはSIRSである、請求項10に記載の組成物。
- 前記抗体が、飽和濃度で20から85%のFVIII活性阻害を達成するための比率で混合される、請求項1〜7のいずれかに記載の2つ以上の抗体もしくはそのフラグメントの混合物。
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