JP2007502250A - 可変抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、酵素的脱グリコシル化または部位指向突然変異誘発のいずれかによって修飾されたグリコシル化を備える、第ＶＩＩＩ因子に対する阻害抗体を開示する。修飾されたグリコシル化を備える前記抗体は、ＦＶＩＩＩに対して同等の親和性を有するが、相違する阻害特性を示す。前記抗体の１つもしくは１つの混合物の使用は、第ＶＩＩＩ因子の阻害を４０から９５％の間のレベルまで変調することを可能にする。本発明は、修飾されたグリコシル化を備える第ＶＩＩＩ因子に対する阻害抗体、これらの抗体の組み合わせを含む医薬組成物、および前記抗体および抗体混合物を使用して止血障害を治療するための方法を開示する。

Description

本発明は、可変最高阻害活性を達成するための阻害抗体の修飾および抗血栓薬を開発する際のその適用ならびに当該抗体を含む医薬組成物および混合物に関する。

血餅の形成は、傷害の症例において出血を制限する（止血）だけではなく、重要な動脈もしくは静脈を閉塞させて重篤な臓器障害や死亡を引き起こすことがある。そこで血栓症とは不適切な時点および場所での血餅形成である。

血管が損傷すると、凝固（凝血）系はトロンビンおよびマトリクスタンパク質へ付着する血小板の産生を開始し、これは順に、血液中のフィブリノーゲンから不溶性フィブリンへの転換と呼応してどんどん大きくなる血小板栓子への追加の血小板凝集を引き起こす。

凝固サイクルの各段階では、凝固因子であるチモーゲンは限定されたタンパク質溶解を受け、それ自体が活性プロテアーゼになる。この凝固因子酵素は、フィブリノーゲンを不溶性フィブリン塊へ結び付けるトロンビンが生成されるまで次の凝固因子チモーゲンを活性化する。血液凝固因子には、第Ｉ因子（フィブリノーゲン）、第ＩＩ因子（プロトロンビン）、組織因子（以前は第ＩＩＩ因子と呼ばれていた）、第ＩＶ因子（Ｃａ^２＋）、第Ｖ因子（不安定因子）、第ＶＩＩ因子（プロコンベルチン）、第ＶＩＩＩ因子（抗血友病グロブリン、もしくは１１ＡＨＧ１１）、第ＩＸ因子（クリスマス因子）、第Ｘ因子（スチュアート因子）、第ＸＩ因子（血漿トロンボプラスチン前駆体、もしくは「ＰＴＡ」）、第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）、第ＸＩＩＩ因子（フィブリン安定化因子）、およびＨＭＷＫ因子（高分子量キニノーゲン、もしくはフィッツジェラルド因子）、ＰＲＥＫ（プレカリクレイン、もしくはフレッチャー因子）、Ｋａ（カリクレイン）、およびＰＬ（リン脂質）が含まれる。

フィブリノーゲンは、プロトロンビン（第ＩＩ因子）である循環しているチモーゲンの活性化によって凝固プロセス中に形成されるプロテアーゼである酵素トロンビン（第ＩＩａ因子）にとっての基質である。プロトロンビンは、活性化第Ｖ因子、Ｃａ^２＋およびリン脂質の存在下で活性化された第Ｘ因子によって活性酵素トロンビンへ変換される。「内因系」および「外因系」と呼ばれる２つの別個の経路は、活性化された第Ｘ因子の形成をもたらす。内因系では、凝固のために必要なすべてのタンパク質因子が循環血中に存在する。外因系では、循環血液中に存在しない組織因子は、損傷した内皮上で活性化された単球、アテローム硬化性プラーク内の細胞または血管壁の外側の細胞によって発現する。組織因子は、次に第ＶＩＩ因子の結合のための受容体および必須補因子として作用し、結果として凝固の外因系経路を開始させるための生体分子酵素第ＶＩＩａ組織因子を生じさせる。この機序は、凝固の内因系経路も活性化する。

これらを要約すると、凝固系は循環血タンパク質（凝固因子）、血液細胞（特に血小板）および損傷した血管壁の要素の間の複雑かつ調節された生化学反応のカスケードを含んでいる。静脈血栓塞栓疾患（深部静脈血栓症、肺動脈塞栓症、心房細動）は、年間１，０００人当たり１から３人の発生率および高い初期死亡率を伴う依然として重要な健康問題である（Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍら（１９９２）， Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ． ２３２，
１５５−１６０；Ｒｏｓｅｎｄａａｌ（１９９７）， Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ
７８， １−６）。

現在の抗凝固剤療法は、主としてヘパリン（もしくは低分子量ヘパリン）およびビタミ
ンＫアンタゴニストから構成されるが、それらは満足できるものではなく便利に使用することもできない。すべての治療には重大な出血のリスクがあり（Ｒｅｓ， Ｃｏｍｍ． Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｓｏｃ．（１９９２）， Ｌａｎｃｅｔ． ３４０（８８２４）：８７３−６）、これは用量および治療期間のどちらも制限し、そして定期的な監視を必要とすることがある（Ｈｙｌｅｋ ＆ Ｓｉｎｇｅｒ（１９９４）， Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ． １２０， ８９７−９０２；Ｃａｎｎｅｇｉｅｔｅｒら（１９９５）， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３３３， １１−１７）。現在、新規薬物が開発されているが、いずれも有効性、安全性および便宜性の最高基準に適合するとは思われない。

近年、抗凝固薬として凝固因子に向けられた抗体が開発された。第ＩＸ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩａ因子、第Ｖ因子、第Ｖａ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、トロンビン、フォン・ヴィレブラント因子、組織因子に対して向けられた抗体およびその他の凝固サイクルの要素については既に記載されている。

ＰＣＴ国際特許第９７／２６０１０号は、その中で「自己限定性方法」として記載されている凝固を阻害する抗体を開示している。これらの抗体は、高濃度のそのような抗体は限定された方法でのみＡＰＴＴなどの凝固試験を延長させ、ヘパリンなどの高用量の抗凝固薬とは対照的に血液を凝固不能にはしないであろうという事実を特徴としている。しかし、ＡＰＴＴにおける限定された増加は出血のリスクを排除しない。いわゆる「自己限定性中和活性」を有するこれらの抗体が、それらの標的凝固因子を完全に中和し、それによって患者を高い出血リスクに曝露することを回避できることは証明されていない。実際に、例えばＦＶＩＩＩもしくはＦＩＸなどの凝固因子の完全な欠損症を有する患者においては、ＡＰＴＴもまた極めて限定的方法でしか延長されない。そのような患者の血液もまた、高用量ヘパリンを用いて処置された血液とは対照的に凝固不能ではない。しかし、重度のＦＶＩＩＩもしくはＦＩＸ欠損症を有するそのような患者は、血友病ＡもしくはＢと呼ばれる劇的な出血性疾患に苦しんでいる。「自己限定性方法」で凝固因子を阻害する抗体はこれらの患者における血液欠陥を模倣する生物活性を有するので、それらは患者を高い出血リスクに曝す可能性がある。

ＰＣＴ国際特許第０１／０４２６９号は、ＦＶＩＩＩに比して抗体がたとえ（モル）過剰であってもＦＶＩＩＩ活性を部分的にのみ阻害するヒトモノクローナル抗体Ｋｒｉｘ−１を開示している。ＦＶＩＩＩのこの限定された不活性化は「プラトー作用」と呼ばれた。「自己限定性中和活性」を有する抗体と比較すると、Ｋｒｉｘ−１などの抗体は、それらが標的凝固因子を完全には不活性化できないという長所を有する。ＰＣＴ国際特許出願第０１／０４２６９号は、限定されたこのＦＶＩＩＩ不活性化にもかかわらず、Ｋｒｉｘ−１が静脈血栓症のハムスターモデルにおける血栓症を予防する際に有効であったことを開示している。この抗体は、大静脈血栓症のマウスモデルにおいても有効であった（Ｓｉｎｇｈら（２００２）， Ｂｌｏｏｄ ９９， ３２３５−３２４０．）。Ｋｒｉｘ−１は、正常ヒト血漿中で約９０％のＦＶＩＩＩ活性（範囲：８５〜９５％）を阻害する。

このため因子ＦＶＩＩＩは、抗凝固薬のための潜在的標的であると思われる。しかし、抗ＦＶＩＩＩ抗体の使用に関連する出血傾向は標的凝固因子の阻害度に関連するであろうと思われる。このため、有効性（抗血栓作用）と安全性（低出血傾向）の間の最適比を備える抗体調製物を生成するための方法を確立することが重要である。

これまで、臨床試験において試験されたすべての抗凝固剤には重要な出血リスクが結び
付いている。さらに、ＬＭＷＨは頻回な皮下投与を必要とし、クマリン誘導体は定期的監視を必要とする。

このため、静脈血栓塞栓性疾患を予防および治療するためのより安全およびより効果的方法が望ましい。理想の抗凝固薬は、出血性合併症または過量投与のリスクを有していてはならない。それらは定期的監視を必要とせず、容易に投与することができ、そして良好に忍容できなければならない。最後に、解毒剤を利用できなければならない。

これらをまとめると、より良好な安全性／有効性比を備える優れた抗凝固療法に対する逼迫した必要が依然として存在する。

本発明は、好ましくは親和性に重大な影響を及ぼすことなく、抗体の阻害活性を修飾するための方法に関する。本発明はさらに、そのような方法によって得られた抗体もしくはそのフラグメント、およびそれらのタンパク質標的の可変最高阻害活性を備える抗体混合物を開発する際におけるそれらの使用に関する。より詳細には、本発明は、様々な最も効果的な方法で凝固因子を部分的に阻害できるように抗体のサイズには影響を及ぼすがその親和性には影響を及ぼさない様々な方法で修飾されたヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントに関する。これらは抗血栓薬として使用できる。本発明はさらに、医薬調製物中において当該抗体および当該抗体のフラグメントを使用するステップに関する。

そこで、本発明は、可変最高阻害活性および実質的に同一の親和性を備える、第ＶＩＩＩ因子に対する少なくとも２つの阻害抗体のライブラリーを得るための方法に関する。本方法は、ＦＶＩＩＩに対する阻害抗体もしくはそのフラグメントのサイズを、前記阻害抗体の可変領域内のグリコシル化を修飾するステップ、もしくは前記抗体を抗原結合フラグメントへ縮小させるステップのいずれかによって修飾するステップを含んでおり、修飾後には、ＦＶＩＩＩに対する親和性が実質的に影響を受けていない前記抗体もしくはフラグメントが選択される。

本発明の第１実施形態によると、阻害抗体もしくはそのフラグメントの阻害活性を、例えば前記抗体の可変領域内のグリコシル化の修飾によって修飾するための方法が提供される。それらの標的タンパク質に対する前記抗体の親和性は、限定された方法でしか影響を受けない可能性がある。詳細には、本発明の第１の局面によると、修飾された抗体もしくはそのフラグメントの解離定数は、３未満、好ましくは２未満、最も好ましくは１．５未満の係数によって修飾される。本発明は、抗体の可変領域内のグリコシル化の修飾によって、修飾された阻害能力を備えるが、親和性が類似である抗体もしくはそのフラグメントを開発できることを証明している。より詳細には、本発明は、脱グリコシル化によって阻害抗体もしくはそのフラグメントの阻害活性を減少させる方法に関する。これらの抗体は、凝固の分野におけるような、標的タンパク質の可変もしくは準最大阻害が必要とされる状況において有用である。本発明の第２の局面によると、抗体フラグメントの産生を使用して阻害活性のさらなる変調が得られるが、そのフラグメント自体を脱グリコシル化によって修飾することができる。そのような方法で、様々な最高阻害活性を備える一連の様々な抗体が得られる。

ＦＶＩＩＩに対するヒトモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントについての現在の限界は、血栓症を治療もしくは予防するために安全性と有効性の間の最適比を備える抗体もしくはそのフラグメントの選択を許容するであろう、所定の「プラトー阻害」を備える抗体の産生を可能にする方法がないことにある。

本発明のさらなる局面は、より詳細には可変領域内のグリコシル化を修飾するステップ
によって、可変最高阻害活性を有するが親和性は類似である抗体もしくはそのフラグメントを得る方法に関する。１つの実施形態では、修飾されたグリコシル化を備える抗体もしくはそのフラグメントの親和性は１ｎＭ未満である。理論によって限定せずとも、この方法は、抗原結合部位に対応する標的タンパク質のエピトープが前記タンパク質の活性もしくは相互作用部位の近位にはあるが正確には一致しない場合に、それらの抗体にとって特に適合する。グリコシル化の修飾は、任意に天然抗体もしくはそのフラグメントを炭水化物分解酵素もしくは形質転換酵素へ曝露させるステップによって得られる。あるいは、修飾されたグリコシル化を備える抗体は、適切なグリコシル化酵素を備える細胞株で抗体を産生するステップによって、または抗体を産生する細胞株のグリコシル化酵素の活性を修飾するために細胞培養条件を修飾するステップによって得られる。本発明のまた別の実施形態では、修飾されたグリコシル化を備える抗体は、例えば部位指向突然変異誘発によって、グリコシル化部位を除去または導入するために抗体を遺伝的に修飾するステップによって得られる。本発明のまた別の実施形態では、修飾されたグリコシル化を備える抗体は化学合成によって得られる。フラグメントは完全抗体から得ることができ、また当技術分野において記載された方法による組換えもしくは化学合成によって直接的に生成できる。修飾された阻害能力（および好ましくは実質的に影響を受けていない親和性）を備える抗体もしくはそのフラグメントは、天然抗体の阻害能力（および親和性）を測定するステップと、前記抗体のグリコシル化を修飾するステップと、そして修飾された抗体の阻害能力（および親和性）を再度測定するステップとによって任意に同定される。そこで、特定の実施形態によると、本発明は、前記抗体もしくはそのフラグメントが飽和濃度でＦＶＩＩＩを２０から８５％阻害するＦＶＩＩＩ阻害抗体もしくはそのフラグメントを産生するための方法であって：
−無傷ＦＶＩＩＩ阻害抗体もしくはそのフラグメントを提供するステップと、
−翻訳後レベルで前記抗体もしくは抗体フラグメントのグリコシル化を修飾するステップ、または前記抗体の可変領域のグリコシル化コンセンサス配列内の必須アミノ酸を改変するステップによって前記抗体もしくは抗体フラグメントのグリコシル化を修飾するステップと、を含む方法に関する。

本発明のまたさらなる局面によると、本発明の方法は、複合体に含有されるタンパク質、すなわちその生物学的機能のために他のタンパク質との相互作用を必要とするタンパク質に対して向けられた抗体の開発に適用される。特定の実施形態によると、本発明の方法は、血液凝固への可変阻害効果を備える抗体を得るために、止血系の要素に対して、または止血系の要素へ結合するポリペプチドもしくは他の分子、またはさらにより詳細には凝固カスケードの因子に対して向けられた抗体もしくはそのフラグメントの阻害活性を修飾するために使用される抗体に関する。そこで、可変最高抗凝固活性を備える抗体を得ることができるように、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩｌ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、トロンビン、フォン・ヴィレブラント因子、または他の凝固カスケードの要素に対して向けられた阻害抗体の阻害効果を修飾する際に特に有用である方法が提供される。

より特定の実施形態では、グリコシル化の修飾は、ＦＶＩＩＩに対する抗体もしくはそのフラグメント、より詳細にはＫｒｉｘ−１モノクローナル抗体もしくはそのフラグメントに適用される。本発明の方法は、ＦＶＩＩＩの可変最高阻害を示す修飾されたＫｒｉｘ−１抗体もしくはそのフラグメントを得るために使用される。より詳細には、２０％から９０％、より詳細には２０％から８０％、さらにより詳細には２０％から７０％、およびいっそうより詳細には２０％から６０％の阻害能力を備える修飾されたＫｒｉｘ−１抗体を得る方法が記載される。

本発明はさらに、前記抗体もしくはそのフラグメントのそれらの標的タンパク質に対する親和性が実質的に影響を受けていないことを特徴とする、修飾されたグリコシル化およ
び修飾された阻害活性を備える、本発明の方法によって得られる阻害抗体もしくはそのフラグメントに関する。本発明はさらに、前記抗体に類似するフラグメント、誘導体およびタンパク質に関する。本発明の抗体には、例えばＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントおよびｓｃＦｖなどを含むがそれらに限定されず、そのフラグメントが含まれる。本発明のより特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩの可変最高阻害を示す抗体および抗体フラグメントが開示される。

本発明は、ＦＶＩＩＩ活性を約８５、５０、４０、３０および２０％まで阻害する抗体もしくはそのフラグメントを開示する。より詳細には、本発明は、ＦＶＩＩＩ活性の６５％未満を阻害して血栓症の哺乳動物モデルにおける血栓症を予防する抗凝固因子モノクローナル抗体に関する。

本発明はさらに、Ｋｒｉｘ−１と比較して、改変されたグリコシル化がＦＶＩＩＩ活性の様々な最高阻害を生じさせるように修飾されたモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントに関する。より詳細には、本発明は、ＦＶＩＩＩ活性の６５％未満を阻害して血栓症の哺乳動物モデルにおける血栓症を予防する抗凝固因子モノクローナル抗体である修飾されたＫｒｉｘ−１抗体もしくはそのフラグメントに関する。

本発明はさらに、修飾された阻害活性を備えるがＦＶＩＩＩに対してＫｒｉｘ−１と類似の親和性を維持している、Ｋｒｉｘ−１と呼ばれる細胞株由来のＦＶＩＩＩに対して向けられた阻害性もしくは抗凝固性の抗体およびそのフラグメントに関する。より特定の実施形態では、前記抗体はＫｒｉｘ−１もしくはそのフラグメントまたはそのような修飾された抗体の組換え産生アナログ由来であり、より詳細には前記抗体の可変領域はＫｒｉｘ−１抗体もしくはそのフラグメントとの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％以上のアミノ酸類似性を有する。そのような抗体には、配列番号２との少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列相同性を有する配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む抗体もしくはそのフラグメントが含まれるが、このとき４７位のＡｓｎはグルタミン、アスパラギン酸、もしくはグルタミン酸へ組換えられている、または４９位のＴｈｒがアラニンへ組換えられている。

そのような抗体には、それによって抗体の抗原結合部位が修飾されたＫｒｉｘ−１のエピトープ特異性を有する、例えばＫＲＩＸ−１ＱもしくはＫＲＩＸ−１Ａのエピトープ特異性を有する鎖シャッフリングによって得られる抗体が含まれる。そのような抗体には、それらが抗凝固活性を有することを前提に、修飾されたＫｒｉｘ−１のフラグメントもしくは本発明によって修飾されたＫｒｉｘ−１のフラグメントが含まれる。そこで、本発明はさらに重鎖および軽鎖を含むキメラ抗体に関するが、このとき前記抗体の可変領域はＮ−グリコシル化部位を導入もしくは除去するように修飾され、前記抗体は限定された方法で凝固因子の機能を阻害することによって特徴付けられ、それによって血栓が阻害され、そして凝固の部分的阻害が達成される。

本発明の特定の実施形態では、前記抗体は、いずれか適切な宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞中で産生した、Ｋｒｉｘ−１の組換え抗体もしくはそのフラグメントである。いっそうより特定の実施形態では、前記抗体は可変領域内の修飾されたＮ−グリコシル化を備える、より詳細にはＡｓｎ４７位からＴｈｒ４９位で突然変異グリコシル化部位を備える、さらにより詳細にはＡｓｎ４７がＧｌｎ４７（ＫＲＩＸ−１Ｑ）、Ｇｌｕ４７（ＫＲＩＸ−１Ｅ）もしくはＡｓｐ４７（ＫＲＩＸ−１Ｄ）へ組換えられたおよび／またはＴｈｒ４９がＡｌａ４９（ＫＲＩＸ−１Ａ）へ組換えられたＫｒｉｘ−１の突然変異体である。

さらに、本発明は、本発明による抗体を産生する細胞株、より詳細には変更された翻訳
後修飾、より詳細にはＫｒｉｘ−１、ＫＲＩＸ−１ＱもしくはＫＲＩＸ−１Ａの特性を備える抗体を産生する細胞株に関する。

本発明のまた別の局面によると、リガンドの相違する最高阻害を備える２つ以上の抗体もしくは抗体フラグメントを組み合わせて中間阻害活性を備える混合物を生じさせることができる。本発明の特定の実施形態は、ＦＶＩＩＩに対して抗体の混合物がたとえ過剰であってもＦＶＩＩＩの所定の最高阻害を保証する、ＦＶＩＩＩに対する２つ以上の阻害抗体もしくはそのフラグメントの混合物である。特定比率にある相違する阻害抗体および／またはそのフラグメントの組み合わせを使用すると、ＦＶＩＩＩの特異的阻害活性を備える混合物を得ることができる。そこで、本発明は相違する最高阻害活性を備える２つ以上の抗体もしくは抗体フラグメントの組み合わせに関する。特定実施形態によると、天然抗体がより低い阻害活性を有する１つ以上の抗体もしくはそのフラグメントと結合される。さらにまた別の実施形態によると、天然抗体は、天然抗体に関して修飾されたグリコシル化を備える抗体もしくは抗体フラグメントと組み合わされる。そのような組み合わせもしくは混合物は、例えば本明細書に記載する患者特異的医薬品の開発におけるように、抗体の阻害活性をさらに調整するために重要である。

本発明はさらに、より詳細には治療用途における生物学的プロセスの調節された阻害のための本発明の抗体および抗体フラグメントの使用に関する。本発明はさらに、治療用組成物としてのＦＶＩＩＩの様々な最高阻害活性を備える抗体もしくはそのフラグメントの組み合わせの使用に関する。本発明の特定実施形態は、それらの共通リガンドの調節された阻害のために、修飾されたグリコシル化を有する本発明の１つ以上の抗体もしくはフラグメントと対応する未修飾抗体もしくはフラグメントとの混合物の使用に関する。そこで、本発明の別の局面は、１つ以上の抗体もしくはそのフラグメント、より詳細には修飾されたグリコシル化を有する１つ以上の抗体もしくはそのフラグメントおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物である。

より詳細には、修飾された阻害活性を備える抗体の有用性は、凝固障害の分野において証明されている。本発明による抗体およびそのフラグメントは、凝固の調節された阻害のために有用である。そこで、本発明は、凝固障害、より詳細には静脈血栓塞栓性疾患に苦しんでいる被験者を治療するために有用な医薬品の製造における、凝固因子の修飾された阻害活性を備える抗体もしくはそのフラグメントの使用に関する。本発明はさらに、前記抗体もしくはフラグメントを使用することによって凝固障害を治療するための方法に関する。本発明の特定の目的は、動物における、詳細にはヒトにおける出血のリスクが減少している有効な抗血栓療法を提供することである。これは、凝固因子の修飾された最高阻害活性を備える本発明の抗体もしくはフラグメントおよびそれらの混合物を使用して、より詳細には修飾された最高阻害活性を備えるＦＶＩＩＩに対して向けられた阻害抗体もしくはフラグメントを使用して達成される。

したがって、本発明の１つの局面は、前記抗体が前記抗体によって認識されるリガンドの活性および／または相互作用における前記抗体の阻害効果を、前記リガンドと相互作用する他のタンパク質もしくは試薬を用いて修飾するために、前記抗体のグリコシル化部位を修飾もしくは導入するような方法で修飾された有効量の治療用モノクローナル抗体もしくはそのフラグメントを投与するステップを含む治療方法である。

詳細には、本発明によると、有効量の凝固に関係する因子を阻害する１つ以上のモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントを投与するステップを含む、血栓症を阻害するための方法が提供される。本発明の特定実施形態では、前記抗体によって認識されるリガンドの相互作用における前記抗体の阻害効果を、前記リガンドと相互作用する他のタンパク質もしくは試薬を用いて修飾するために、抗体もしくは少なくとも１つの抗体が抗体内の
グリコシル化部位を修飾もしくは導入できるような方法で修飾される。本発明の特定の実施形態は、抗凝固抗体もしくはそのフラグメントの最高阻害活性を変化させることに基づいて患者の臨床状態へ抗血栓療法を調整するための方法である。そこで、本発明は、患者の臨床状態を考慮に入れて、血栓症を治療もしくは予防するための、前記治療のために適切な最高阻害活性を得るための１つ以上の抗体の選択を含む医薬品の調製に関する。

したがって、本発明の１つの局面は、患者の臨床的必要に基づいて調整できる、有効量の、任意で未修飾Ｋｒｉｘ−１との混合物中において可変領域内のグリコシル化が修飾されているＫｒｉｘ−１由来の抗凝固モノクローナル抗体もしくはそのフラグメントを含む血栓症を阻害するための医薬調製物である。

あるいは、そのような医薬組成物は、天然Ｋｒｉｘ−１、天然Ｋｒｉｘ−１のフラグメント、可変領域内の修飾されたグリコシル化を備えるＫｒｉｘ−１および可変領域内の修飾されたグリコシル化を備えるＫｒｉｘ−１のフラグメントからなる群から選択される２つの化合物の混合物である。

より詳細には、本医薬化合物は、Ａｓｎ４７−Ｔｈｒ４９の領域内のグリコシル化が修飾されている１つ以上のモノクローナル抗体を含んでいる。任意で、この修飾は、より詳細にはＡｓｎ４７がＧｌｎ４７（ＫＲＩＸ−１Ｑ）、Ｇｉｕ４７（ＫＲＩＸ−１Ｅ）もしくはＡｓｐ４７（ＫＲＩＸ−１Ｄ）へ組換えられたおよび／またはＴｈｒ４９がＡｌａ４９（ＫＲＩＸ−１Ａ）へ組換えられた突然変異である。あるいは、この修飾は天然Ｋｒｉｘ−１抗体もしくはそのフラグメントを、Ａｓｎ４７−４９でのグリコシル化の修飾を保証する条件と接触させるステップによって得られる（脱グリコシル化酵素の上昇したレベルもしくはグリコシル化に関係する酵素の上昇したレベル、抗体を発現させるための様々な細胞株または細胞株の培養に使用される培地調製物など）。

したがって、本発明の１つの局面はＦＶＩＩＩの可変最高阻害能力を備えるがＦＶＩＩＩに対する類似の親和性を備える少なくとも２つの抗凝固抗体を含むライブラリーである。特定の実施形態によると、前記ライブラリーは、Ｋｒｉｘ−１の可変領域のグリコシル化の変調によるＫｒｉｘ−１由来の抗体を含む。本発明はさらに、本発明のライブラリーからのＫｒｉｘ−１由来の前記１つ以上の抗凝固モノクローナル抗体のうちの１つ以上を選択するステップを含む、血栓症の治療における調節された治療もしくは凝固の阻害のための医薬品を製造するための方法に関する。詳細には、本ライブラリーは、Ａｓｎ４７−Ｔｈｒ４９に位置するグリコシル化部位の脱グリコシル化によるＫｒｉｘ−１由来の抗体を含んでいる。

本発明のさらにまた別の局面は、ＦＶＩＩＩ阻害抗体と競合する抗体を同定するための方法であって、ＦＶＩＩＩもしくはＣ１ドメインを含むＦＶＩＩＩのフラグメントを第１阻害抗体および候補阻害抗体と接触させるステップと、前記候補抗体がＦＶＩＩＩ阻害抗体の前記ＦＶＩＩＩもしくはＦＶＩＩＩのフラグメントへの結合に競合する能力をアッセイするステップと、を含む方法に関する。本発明の特定の実施形態では、新規の競合抗体を同定するために使用される既知のＦＶＩＩＩ阻害抗体はＫｒｉｘ−１である。本発明の特定の実施形態によると、そのような方法で得られた抗体は、それらのＦＶＩＩＩ阻害活性についてさらにスクリーニングされる。そこで本発明はさらに、Ｋｒｉｘ−１もしくは本発明によるその修飾を一緒に備える混合物中で、そして医薬組成物の生成において使用できる、この方法から得られた（精製された）抗体に関する。

本明細書および実施例では、以下の配列を参照されたい。
配列番号１： Ｋｒｉｘ−１重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号２： Ｋｒｉｘ−１重鎖ＣＤＲ領域を含むアミノ酸配列
配列番号３： Ｋｒｉｘ−１軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号４： Ｋｒｉｘ−１軽鎖ＣＤＲ領域を含むアミノ酸配列
配列番号５： 組換えＫｒｉｘ−１フォワードプライマーの重鎖
配列番号６： 組換えＫｒｉｘ−１リバースプライマーの重鎖
配列番号７： 組換えＫｒｉｘ−１フォワードプライマーの軽鎖
配列番号８： 組換えＫｒｉｘ−１リバースプライマーの軽鎖
配列番号９： Ｋｒｉｘ−１Ｑフォワードプライマー
配列番号１０： Ｋｒｉｘ−１Ｑリバースプライマー
配列番号１１： Ｋｒｉｘ−１Ａフォワードプライマー
配列番号１２： Ｋｒｉｘ−１Ａリバースプライマー
配列番号１３： Ｋｒｉｘ−１Ｅフォワードプライマー
配列番号１４： Ｋｒｉｘ−１Ｅリバースプライマー
配列番号１５： Ｋｒｉｘ−１Ｄフォワードプライマー
配列番号１６： Ｋｒｉｘ−１Ｄリバースプライマー
配列番号１７： ｓｃＦｖ−ＫＲＩＸ−１ＶＬフォワードプライマー
配列番号１８： ｓｃＦｖ−ＫＲＩＸ−１ＶＬリバースプライマー
配列番号１９： ｓｃＦｖ−ＫＲＩＸ−１ＶＨフォワードプライマー
配列番号２０： ｓｃＦｖ−ＫＲＩＸ−１ＶＨリバースプライマー
配列番号２１： Ｈｉｓ（６）タグを含むｓｃＦｖ−ＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨのフォワードプライマー
配列番号２２： Ｈｉｓ（６）タグを含むｓｃＦｖ−ＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨのリバースプライマー
配列番号２３： ｓｃＦｖ−Ａｓｎ４７Ｇｌｎ ＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨ（Ｈｉｓ）のフォワードプライマー
配列番号２４： ｓｃＦｖ−Ａｓｎ４７Ｇｌｎ ＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨ（Ｈｉｓ）のリバースプライマー
配列番号２５： ｓｃＦｖ−Ａｓｎ４７Ｇｌｎ ＫＲＩＸ−１ ＶＬＶＨ（Ｈｉｓ）を含むヌクレオチド配列
配列番号２６： ｓｃＦｖ−Ａｓｎ４７Ｇｌｎ ＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨ（Ｈｉｓ）を含むアミノ酸配列
配列番号２７： ＣＨＯ−ｓｃＦｖＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨＱ（Ｈｉｓ）のフォワードプライマー
配列番号２８： ＣＨＯ−ｓｃＦｖＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨＱ（Ｈｉｓ）のリバースプライマー
配列番号２９： ＲＨＤ５ ＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号３０： ＲＨＤ５ ＶＨ領域を含むアミノ酸配列
配列番号３１： ＲＨＤ５ ＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号３２： ＲＨＤ５ ＶＬ領域を含むアミノ酸配列
用語の定義
本明細書で使用する用語「抗体」（「Ａｂ」）は、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体分子を意味する。抗体の「フラグメント」には：
任意で例えば一方もしくは両方のＣＤＲで約１０アミノ酸配列までの隣接フレームワーク配列と一緒に、任意でそれらの定常領域（もしくはその部分）を含む、もしくは任意でその定常領域もしくはその部分、詳細にはその特異性決定部分、すなわち抗体の可変領域、そのサブパート、詳細にはその高可変部分、例えば少なくとも１つのＣＤＲを含むアミノ酸の伸長部を作り上げたペプチドなどの小さな修飾（アロタイプ変異体）を含む、重鎖および軽鎖の両方（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆ（ａｂ’）_２もしくはＳｃＦＶ）、または重鎖もしくは軽鎖の一方（例、軽鎖ダイマー）のいずれかを含む分子が含まれる。

任意で、本発明によると、抗体はＩｇＧ抗体、詳細にはＩｇＧ１である。Ｆ（ａｂ’）
_２は、ペプシン分解後に得ることができる抗体フラグメントを意味しており、軽鎖およびヒンジ領域を介して連結された重鎖ジスルフィドの部分の両方から形成されている。Ｆａｂフラグメントは無傷抗体から、またはヒンジ領域のパパイン消化によってＦ（ａｂ’）_２から得ることができ、一本の軽鎖および重鎖の一部分を含有している。抗体のフラグメントは、さらに合成によって、または当技術分野において記載された組換え方法によって得ることができる。ｓｃＦｖフラグメントのようなフラグメントは、抗体ヌクレオチド配列の関連部分のＰＣＲ増幅およびこれらを発現ベクター内で例えばｓｃＦｖフラグメントの場合にはリンカー配列などの適切な追加の配列と一緒にクローニングするステップによって得ることができる。

本明細書で使用する用語「天然抗体」は、グリコシル化阻害抗体を意味する。「天然抗体」のグリコシル化は、前記抗体を産生するリンパ芽球様細胞株の標準培養下で観察される、すなわち酵素の添加もしくは突然変異によって修飾されていないグリコシル化である。好ましくは、そのような天然抗体は野生型抗体であるが、それはグリコシル化コンセンサス配列とは相違する部位で修飾された抗体であってよいことは想定されている。さらに、Ｆ（ａｂ）フラグメントもしくは抗体の他のフラグメントは、無傷抗体上に存在するグリコシル化パターンを含有しているので、この定義の状況における「天然」抗体フラグメントであってよい。本発明の状況では、天然Ｋｒｉｘ−１抗体と比較してＫｒｉｘ−１由来の抗体のグリコシル化について言及する場合は、標準培養条件下で、Ｋｒｉｘ−１細胞株（ＬＭＢＰ ５０８９ＣＢとして寄託されている）由来の抗体との比較が企図されている。

本明細書で使用する用語「誘導体」は、その長さもしくは可変領域内のグリコシル化には影響を及ぼさない方法で化学的または遺伝的に改変されている抗体もしくはそのフラグメントを意味する。

本明細書で使用する「修飾された抗体」もしくは「修飾された抗体フラグメント」は、野生型抗体と比較して、そのサイズに関して相違する、より詳細には、そのグリコシル化に関して相違するが、そのリガンドに対して野生型抗体と類似の親和性を備える抗体を意味する。本発明のまた別の実施形態によると、抗体の阻害活性は、親和性を修飾せずに抗体のサイズを縮小させるステップによって、例えばフラグメント（例、ＦａｂフラグメントおよびＳｃＦＶフラグメントなどの組換え発現フラグメント）を産生するステップによって修飾される。

ジスルフィド架橋によって連結された重鎖および軽鎖の両方を有する（すなわち、野生型抗体と同一のサイズを有する）抗体は、（そのグリコシル化状態とは無関係に）「無傷」抗体であると言われる。

本発明の概念は無傷抗体および抗体フラグメントの両方に適用できる、すなわち（本明細書に記載した様々な方法によって得ることができる）抗体のフラグメントは、さらなるフラグメント化もしくは脱グリコシル化のいずれかによってその阻害活性にさらに影響を及ぼすために修飾できることは理解されている。

本明細書で使用する用語「修飾されたグリコシル化を備える抗体（もしくは抗体フラグメント）」は、それらのグリコシル化が天然抗体のグリコシル化とは相違する方法で設計された、もしくは産生された抗体もしくはそのフラグメントを意味するが、これはある種の余分な炭水化物が存在する、または相違する位置で天然抗体もしくはその組み合わせに比較してある種の炭水化物が欠失していることを意味する。本発明の状況では、抗体のグリコシル化における修飾は抗体の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）において発生する。

本明細書で使用する「阻害抗体」もしくは「阻害活性を備える抗体」は、少なくとも部分的にその標的タンパク質の活性を阻害する抗体を意味する。本発明の特定の実施形態によると、阻害抗体はそれらの標的タンパク質と他のタンパク質との相互作用を阻害する。阻害抗体の特定の実施形態は、抗ＦＶＩＩＩ抗体、より詳細にはＦＶＩＩＩの例えばｖＷＦおよび／またはリン脂質などの他の因子への結合を阻害する抗体である。好ましくは、抗体はＦＶＩＩＩのＣ１ドメインに対して向けられる。阻害抗体は、外因性ＦＶＩＩＩに対する同種（異系）抗体であってよい。阻害抗体は、ヒトもしくは動物起源であってよい。本明細書では抗凝固抗体とも呼ばれる凝固カスケードの因子の活性を阻害する抗体の状況では、抗体の最高阻害は危機的であることがあり、凝固の完全な阻害は調節されない出血などの副作用を引き起こすことがある。

本明細書で使用する可変最高阻害活性は、本発明による抗体もしくは抗体の混合物について規定したような、修飾できる最高阻害活性を意味する。例えば、本発明によると、ＦＶＩＩＩに対する抗体の最高阻害活性は、グリコシル化の修飾によって、より詳細には可変領域の脱グリコシル化によって減少させられる。そこで、可変最高阻害活性を備える抗体が得られる。本発明の状況では、阻害性と考えられる抗体については、その阻害効果は少なくとも１％でなければならないと理解されている。

あるいは、本発明のまた別の実施形態では、ＦＶＩＩＩに対する抗体の最高阻害活性は、グリコシル化の修飾によって、より詳細には様々な細胞株もしくは細胞培養条件を用いる可変領域の過剰グリコシル化によって、そしてトランスジェニックグリコシル化酵素を有する細胞型において細胞を発現するステップによって増強される。そのような抗体は、多くとも９７％、もしくは多くとも９８％もしくは多くとも９９％の阻害効果を有しているはずである。

本発明における「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、抗原上でエピトープと相互作用する抗体可変領域内の高可変性アミノ酸配列を意味する。本発明の１つの実施形態では、ＣＤＲ領域は、凝固サイクルの要素に対して向けられた抗体の可変軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）各々のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域（各々、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＨ１、Ｈ２、Ｈ３）である。

本明細書で使用する「ヒト化抗体」は、ヒト抗体により密接に近付けるために、アミノ酸が非抗原結合領域内で置換されている非ヒト抗体分子を意味する。

本明細書で使用する「再構築されたヒト抗体」もしくは「ヒトハイブリッド抗体」は、抗原結合領域におけるアミノ酸が本発明による配列、例えばＣＤＲ、もしくはヒト抗体のレパートリー由来の可変領域の他の部分と置換されているヒト抗体を意味する。

配列の比較。タンパク質もしくはヌクレオチド配列の比較は、配列同一性もしくは配列類似性によって指令される。本発明によって２つのＶＨ領域もしくは２つのＶＬ領域のアミノ酸配列間の比較が行なわれる場合は、またはＣＤＲをコードする、もしくはＣＤＲを含む２つのヌクレオチド配列間で比較が行なわれる場合は、２つの配列間の配列同一性もしくは類似性のレベルは、２つの配列間の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８０％以上、より好ましくは少なくとも９０％、いっそうより好ましくは少なくとも９５％、および最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性もしくは類似性を有することが含まれる。

「同一」であるヌクレオチドもしくはアミノ酸配列は、２つの配列をアライメントしたときに、配列同一性率、すなわち短い方の配列内のヌクレオチドもしくはアミノ酸の数で
割った同一のヌクレオチドもしくはアミノ酸を有する位置の数が８０％を超える、好ましくは少なくとも９０％、いっそうより好ましくは少なくとも９５％、および最も好ましくは少なくとも９９％、より詳細には１００％であることを意味する。２つのヌクレオチド配列のアライメントは、Ｗｉｌｂｕｒ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎｎ（１９８３）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８０：７２６によって記載されたアルゴリズムを使用して、２０ヌクレオチドのウィンドウサイズ、４ヌクレオチドのワード長、および４のギャップペナルティを用いて実施される。

２つのアミノ酸は、それらが次の群：ＧＡＳＴＣＰ；ＶＩＬＭ；ＹＷＦ；ＤＥＱＮ；ＫＨＲのうちの１つに属する場合は「類似である」と考えられる。そこで、「類似」である配列は、２つのタンパク質配列をアライメントしたときに、短い方の配列内のヌクレオチドもしくはアミノ酸の数で割った同一もしくは類似のヌクレオチドもしくはアミノ酸を有する位置の数が８０％を超える、好ましくは少なくとも９０％、いっそうより好ましくは少なくとも９５％、および最も好ましくは少なくとも９９％、より詳細には１００％であることを意味する。

用語「修飾された」は、単一もしくは多数のアミノ酸がいずれか他のアミノ酸残基によって置換されている、もしくは欠失しているあらゆるタンパク質（もしくはポリペプチド）分子を意味する。そのようなアミノ酸置換もしくは欠失は、タンパク質分子内のあらゆる場所に位置していてよい。これはさらにまた、アミノ酸残基が２つ以上の場所で置換されている、および／または欠失しているタンパク質分子を意味する。後者の場合は、あらゆる置換および欠失の組み合わせを考慮に入れることができる。これはさらに多形性も意味する（すなわち、よりまれな対立遺伝子の頻度が、反復突然変異単独によって説明できるより高い場合、典型的には１％を超える場合は、遺伝子の２つ以上の対立遺伝子の単一異種交配集団内での規則的かつ同時の発生によって説明することができる）。

用語「翻訳後レベルで抗体のグリコシル化を修飾するステップ」は、抗体もしくは抗体の一部を発現する細胞内で、またはこれらの酵素を用いて無傷抗体もしくはその一部を処理するステップのいずれかによって、抗体を発現する細胞の培養条件を変化させるステップ、抗体を発現するための細胞型を変化させるステップ、および脱グリコシル化および／またはグリコシル化酵素の使用などの修飾を意味する。

本明細書で使用する用語「炭水化物分解酵素もしくは形質転換酵素」は、炭水化物、炭水化物構造の一部および／またはそれに結合した様々な分子（例、Ｎ−アセチル）をタンパク質、ペプチドもしくはその中のある種のアミノ酸から分解することができる、またはタンパク質もしくはペプチド上で炭水化物をアミノ酸もしくは他の炭水化物へ共有結合させることのできる酵素を意味する。そのような分解酵素の例は、Ｎ−グリコシダーゼＦとも呼ばれるペプチドＮ−４（Ｎ−アセチル−β−グルコサミニル）アスパラギンアミダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）、β−ガラクトシダーゼ、シアリダーゼ、α−およびβ−マンノシダーゼ、α−フコシダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ、およびヒアルロニダーゼである。グリコシル化酵素には、シアリルトランスフェラーゼおよび他のグリコシルトランスフェラーゼが含まれる。

本明細書で使用する「抗原結合領域」は、抗原の結合に関係する抗体の領域を意味する。より詳細には、抗原結合領域は、非共有結合を介して標的タンパク質のアミノ酸もしくは分子に接触するアミノ酸およびそれらの置換基であると決定できる。
専門用語：リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）内で産生されたモノクローナル抗体ＫＲＩＸ−１は、Ｋｒｉｘ−１と呼ばれている。

ＣＨＯ細胞株内で産生されたモノクローナル抗体ＫＲＩＸ−１は、ＣＨＯ−ｒｅｃＫｒ
ｉｘ−１と呼ばれている。

Ａｓｎ４７からＧｌｎへの置換を備えるモノクローナル抗体ＫＲＩＸ−１は、Ａｓｎ４７Ｇｌｎ Ｋｒｉｘ−１もしくはＫｒｉｘ−１Ｑと呼ばれている。

Ａｓｎ４７からＡｓｐへの置換を備えており、ＣＨＯ細胞内で産生されたモノクローナル抗体ＫＲＩＸ−１抗体は、Ａｓｎ４７Ａｓｐ Ｋｒｉｘ−１もしくはＫｒｉｘ−１Ｄと呼ばれている。

Ａｓｎ４７からＧｌｕへの置換を備えており、ＣＨＯ細胞内で産生されたモノクローナル抗体ＫＲＩＸ−１抗体は、Ａｓｎ４７Ｇｌｕ Ｋｒｉｘ−１もしくはＫｒｉｘ−１Ｅと呼ばれている。

Ｔｈｒ４９からＡｌａへの置換を備えており、ＣＨＯ細胞内で産生されたモノクローナル抗体ＫＲＩＸ−１抗体は、Ａｓｎ４７Ｇｌｎ Ｋｒｉｘ−１もしくはＫｒｉｘ−１Ａと呼ばれている。

例として挙げたが本発明を特定実施形態に限定することは意図していない上記で詳述した説明は、参照して本明細書に組み込まれる添付の図面を結び付けると理解することができる。

所定の実施形態および所定の図面を参照しながら本発明を説明するが、本発明はそれらには限定されず、特許請求項によってのみ限定される。

近年、ＣＨＯ細胞内で産生された組換え抗体が、ヒトリンパ芽球様細胞内で産生された抗体とは相違してＦＶＩＩＩを有意に阻害することが観察された。この予想外の観察所見は、翻訳後修飾がＦＶＩＩＩに対して向けられた抗体、より詳細にはＫｒｉｘ−１の阻害活性を変調できることを示した。Ｋｒｉｘ−１の可変領域内のグリコシル化部位の同定は、さらに前記可変領域のグリコシル化がＫｒｉｘ−１の活性を変調できることも示した。

このため炭水化物構造を除去する酵素を用いて処理されたＫｒｉｘ−１の活性について調査した。Ｋｒｉｘ−１の脱グリコシル化は、その阻害活性を劇的に修飾した（約６０％へ減少させた）。しかし、ＦＶＩＩＩに対するＫｒｉｘ−１の親和性は、有意には変化しなかった。これらの観察所見は、グリコシル化が親和性もしくは特異性を改変することによる以外に抗体の機能を変調できることは以前に報告されていなかったので、予想外であった。さらに、受容体のためのリガンドとして作用するグリカンは構造特異的方法で結合し、結果として、変調の影響を受けていないオン／オフシグナルを生じさせる。その特異性もしくは親和性を重大に修飾することなく抗体の活性を修飾する能力は、阻害活性を調整する、例えば抗凝固抗体の場合におけるように、可能性のある副作用を抑制するために阻害活性を制限することを可能にする。さらに、抗原に対する同一の親和性を有するが相違する阻害活性を備える抗体の選択が得られる可能性は、相違する（および極めて特異的な）最高阻害活性（「プラトー」）を備える抗体調製物を生成するために様々な「グリカン修飾」抗体を混合するステップを可能にする。さらに、可変領域へのグリコシル化の修飾の制限は、定常領域のグリコシル化によって影響を受けることが知られている抗体の他の特徴（例、半減期）が影響を受けないことを保証する。

抗体の抗原結合部位のグリコシル化がそれらの親和性を重大に修飾することなくそれらの阻害能力を改変させることができたという事実は、グリコシル化部位において点突然変異を有する組換え抗体がＦＶＩＩＩ活性を４０％しか阻害しなかったという観察所見によ
って確証された。より興味深いことに、組換えｍＡｂ−Ｋｒｉｘ−１の様々な修飾形の混合は、例えば過剰に投与された場合に、ＦＶＩＩＩ阻害の様々なプラトーを備える組み合わせを得ることを可能にした。したがって、このストラテジーは、抗凝固作用と出血リスクとの間の最善比を選択することを可能にして、極めて広い治療範囲においてＦＶＩＩＩを阻害する抗凝固ＦＶＩＩＩ調製物の産生を可能にする。これらの抗体の長い半減期は、長期間にわたりこれらの標的阻害を得ることを可能にする。

理論に限定されなくとも、本発明は、ＫＲＩＸ−１のグリコシル化が標的凝固因子に対する親和性を重大に変化させず、それによって標的凝固因子への結合を改変させないことを証明しており、これはそれによってＫＲＩＸ−１のグリコシル化がＫＲＩＸ−１の阻害活性に影響を及ぼす機序が可変領域内の１つの部位での標的凝固因子と凝固カスケードの他のタンパク質との相互作用を改変させることによるものであることを示している。本発明は、抗体の可変領域のグリコシル化部位の修飾に基づく方法であって、１つの抗体によって認識される１つ以上のリガンドと前記リガンドと相互作用する他のタンパク質もしくは試薬との相互作用への前記抗体の阻害効果の修飾を生じさせる方法を含んでいる。本発明のまた別の実施形態によると、リガンド上の抗体の阻害効果は、前記リガンドに対する親和性を改変させずに前記抗体のサイズを変化させることによって修飾される。これは、阻害抗体のフラグメントの産生によって達成できる。

そこで本発明は、任意でそれらの標的タンパク質に対する親和性もしくは特異性を重大に改変させることなく抗体によって発揮される最高阻害活性の修飾を生じさせる、天然抗体の抗原結合部位のグリコシル化の修飾により特徴づけられる様々な抗体およびそのフラグメントを提供する。本発明の所定の実施形態では、抗体は凝固系の１つの要素、より詳細には第ＶＩＩＩ因子に対して向けられている。さらに、任意にそれと組み合わせたまた別の阻害活性のバリエーションは、抗体のサイズを修飾するステップによって、すなわち抗体フラグメントを提供するステップによって得られる。

本発明の１つの局面によると、その修飾は必ずしも前記抗原に対する親和性に重大な影響を及ぼさない。より詳細には、本発明の第１の局面によると、前記抗体の親和性は、前記抗体の解離定数（Ｋｄ）が抗体の抗原に対する実質的に影響を受けていない親和性であると考えられる３未満の係数によって修飾されるような方法でグリコシル化における修飾のために変化させられる；好ましくは抗体のＫ_Ｄは２．５未満、より好ましくは２未満、特に好ましくは１．５未満の係数によって修飾される。そこで抗原に対して実質的に同一の親和性を有する抗体は、抗体のＫ_Ｄが２．５未満、より好ましくは２未満、特に好ましくは１未満の係数によって相違する抗体である。その抗原に対する抗体の親和性は、当業者に知られている様々な方法で測定できる。本発明の特定の実施形態によると、抗体の抗原に対する親和性は、本明細書に記載したように、表面プラズモン共鳴分析によって測定される。本発明の特定の実施形態によると、抗原に対する修飾された抗体のＫ_Ｄは、１×１０^−９Ｍ未満、好ましくは０．５×１０^−９Ｍ未満である。

そこで本発明は、修飾されたグリコシル化、修飾された阻害活性およびそれらの標的タンパク質に対する実質的に影響を受けていない親和性を備える抗体に関する。本発明はさらに、薬剤としての前記抗体の使用に関する。本発明はさらに、そのような抗体を調製するための方法、そのような抗体を選択するための方法、およびそれらを含む医薬組成物に関する。本発明はさらに、他の抗体との、例えばそれらの天然抗体との混合物中の前記抗体に関する。

本発明の特定の実施形態では、抗体は、「複合体内に含まれるタンパク質」に対して向けられる。複合体に含まれるタンパク質は、それらの特異的活性の遂行中にそれらの標的の隣にある１つの他の要素と相互作用するタンパク質であると規定できる。そのような他
の要素は、タンパク質、ペプチド、リン脂質、塩、脂質、核酸、有機分子などであってよい。複合体内に含まれるタンパク質の例は、その活性を実施するとリン脂質および／またはフォン・ヴィレブラント因子と相互作用する第ＶＩＩＩ因子（ＦＶｌｌｌａ）である。

本発明のより特定の実施形態では、抗体は止血系の１つの要素に対して向けられている。止血系の要素には、凝固カスケードの因子が含まれ、そして例えば第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、トロンビン、フォン・ヴィレブラント因子ならびに凝固サイクルの他の要素およびそれらの活性誘導体が含まれる。本発明のより特定の実施形態では、抗体は第ＶＩＩＩ因子に対して、より詳細には第ＶＩＩＩ因子のＣ１もしくはＣ２ドメインに対して向けられるが、それらに限定はされない。

本発明はさらに、複合体内に含まれるタンパク質（第ＶＩＩ因子など）が関係している所定の障害に苦しんでいる被験者を治療するために有用である医薬品の製造における前記抗体およびフラグメントの使用に関する。そのような疾患は、心血管疾患、癌、自己免疫疾患もしくは免疫関連障害、炎症性疾患、代謝性疾患、血液疾患もしくは呼吸器疾患から選択できる。本発明はさらに、より詳細には凝固障害、より詳細には静脈血栓塞栓性疾患に苦しんでいる被験者の前記抗体を用いた治療に関する。静脈血栓塞栓性疾患には、静脈血栓症、肺塞栓症および心房細動などの深部障害が含まれる。本発明はさらに、前記抗体を使用することによって凝固障害を治療する方法に関する。本発明の特定の実施形態によると、本発明の抗体およびフラグメントは、敗血症もしくはＳＩＲＳを治療するための医薬品の製造において有用である。

このため本発明は、修飾されたグリコシル化、修飾された最高阻害を備えるがそれらの標的タンパク質に対する親和性が実質的に影響を受けていない抗体もしくはそのフラグメントに関する。抗体は、完全に、または部分的に脱グリコシル化されていてよい。抗体は、様々な部位で様々な炭水化物を有するように修飾することができ、また増加したグリコシル化を有していてよい。本発明の特定の実施形態では、抗体の最高阻害能力は減少もしくは増加させることができる。あるいは、最高阻害活性は、親和性が実質的に影響を受けないことを前提に、抗体もしくはフラグメントのサイズを減少させるステップによって減少させられる。本発明の特定の実施形態では、本発明の抗体の阻害能力は準最大（≦９９％）であり、２０％から９９％の範囲に及んでよい。より詳細には、前記抗体の阻害活性は、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％もしくは２０％であってよい。前記抗体の阻害活性は、当技術分野において知られているいずれかの方法によって測定できる。凝固の分野のためには、例えばＦＶＩＩＩに対する抗体の阻害活性はＢｅｔｈｅｓｄａアッセイを用いて決定できる。

本発明はさらに、（天然）阻害抗体から、修飾されたグリコシル化、修飾された阻害能力および実質的に類似の親和性を備える修飾された抗体から調製するための方法であって、前記方法が天然抗体の阻害能力および親和性を測定するステップと、前記抗体のグリコシル化を修飾するステップと、および修飾された抗体の阻害能力および親和性を再度測定するステップと、を含むことを特徴とする方法に関する。

本発明はさらに、相違するグリコシル化、相違する阻害能力および実質的に類似の親和性を備える少なくとも２つの阻害抗体を開発する方法に関する。本発明の抗体を開発する方法は、所定の標的タンパク質に対する（天然）阻害抗体の調製および開発から開始される。本発明の特定の実施形態によると、天然抗体は標的タンパク質の活性部位もしくは標的タンパク質の活性にとって重要なタンパク質の部位に近い抗原に向けられる、または前記抗原に効果的に「結合」する。より詳細には、抗体は標的タンパク質の生理的に機能的な（例えば、複合体の他のタンパク質への標的タンパク質の結合）部位から所定の間隔をあけて位置するエピトープに対して向けることができる。これはこのエピトープを用いた
免疫化によって達成できる。抗体の選択は、その阻害活性に基づいている。次のステップは、様々な方法（酵素的分解、炭水化物の酵素的付加、突然変異など）による天然抗体の可変領域のグリコシル化を修飾するステップである。任意で、これはグリコシル化部位および抗原との相互作用の利用可能性を考慮に入れて実施される。あるいは、選択は天然抗体と比較して（または相互に比較して）影響を受けていない親和性および修飾された阻害活性に基づく。

本発明の特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩに対して向けられた、可変領域内の相違するグリコシル化、相違する阻害能力および実質的に類似の親和性を備える少なくとも２つの抗体のライブラリーが提供される。そこで、本発明は天然阻害抗体の、修飾された阻害能力および天然抗体と比較して実質的に影響を受けていない親和性を備えるが、修飾された阻害能力を備える修飾された抗体の産生に関する。本発明の特定の実施形態では、（前記ライブラリー内で使用するための）前記修飾された抗体は、例えばＣＨＯ細胞などの適切な宿主細胞内の組換え抗体として天然抗体を産生するステップによって得られる。あるいは、前記抗体もしくは抗体フラグメントは、部位指向突然変異誘発によって調製され、より詳細には前記抗体は可変領域内でＮ−グリコシル化を有していない。また別の実施形態では、前記抗体もしくは抗体フラグメントは抗体を炭水化物分解酵素へ曝すステップによって調製される。さらにまた別の実施形態では、前記抗体もしくは抗体フラグメントは化学合成によって生成される。特定の実施形態によると、前記抗体もしくは抗体フラグメントは、２０％から９０％、より詳細には３０％から８０％、さらにより詳細には４０％から７０％、およびいっそうより詳細には５０％から６０％またはそのいずれかの組み合わせの第ＶＩＩＩ因子阻害能力を有する。

本発明のまた別の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子に対して向けられた修飾された抗体は、Ｋｒｉｘ−１と呼ばれる細胞株もしくは同一特性を備える抗体を産生する細胞株によって産生される。より特定の実施形態では、前記抗体はＫｒｉｘ−１もしくはそのフラグメントである天然抗体または修飾されたＫｒｉｘ−１の組換え産生アナログに由来し、より詳細には前記抗体はＫｒｉｘ−１抗体もしくはそのフラグメントとの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸類似性を有する。本発明のさらにより特定の実施形態では、前記抗体は、ＣＨＯ細胞中で産生された約８４％の阻害活性を備える組換え抗体Ｋｒｉｘ−１もしくはそのフラグメントである。コンセンサスグリコシル化配列Ａｓｎ４７−Ｘ−Ｔｈｒ４９−Ｙ内のＡｓｎ４７でのＫｒｉｘ−１のグリコシル化の除去は、数種の方法で達成できる。Ａｓｎ４７からいずれかのアミノ酸への突然変異またはＴｈｒ４９からセリンとは相違するいずれかのアミノ酸への突然変異は、グリコシル化の不在を生じさせるであろう。突然変異Ｔｈｒ４９Ｓｅｒはグリコシル化へ何の影響も及ぼさないが、タンパク質配列中で発生するあらゆる潜在的コンセンサスグリコシル化部位が発現したタンパク質中で効果的にグリコシル化されるわけではないので、同様に修飾されたグリコシル化パターンまたはグリコシル化の不在さえ生じさせることができよう。あるいは、４８位もしくは５０位でのプロリンへのアミノ酸の突然変異はグリコシル化を防止するが、しかしそれに加えて抗体の三次構造の局所的歪みを引き起こすことがある。いっそうより特定の実施形態では、前記抗体は、突然変異したＡｓｎ４７位からＴｈｒ４９位を備える、より詳細にはＡｓｎ４７からＧｌｎ４７（ＫＲＩＸ−１Ｑ）、Ｇｌｕ４７（ＫＲＩＸ−１Ｅ）もしくはＡｓｐ４７（ＫＲＩＸ−１Ｄ）への変化および／またはＴｈｒ４９からＡｌａ４９（ＫＲＩＸ−１Ａ）への変化を備えるＫｒｉｘ−１の突然変異体である。本発明はさらに、天然抗体をＮ−グルコシダーゼ−Ｆなどの炭水化物分解酵素と一緒にインキュベートするステップによってＫｒｉｘ−１由来の抗体、より詳細にはこの方法で得られて約５０％の阻害活性を備える抗体に関する。Ｋｒｉｘ−１由来の抗体は、少なくとも２０％、より詳細には少なくとも４０％、５０％もしくは８０％の阻害活性を有していてよい。

組換えテクノロジーによって発現したフラグメント（例、ｓｃＦｖフラグメント）が使用される場合は、脱グリコシル化型はグリコシル化欠損酵母株内にグリコシル化コンセンサス配列を含むタンパク質の発現によって、またはグリコシル化を全く実施しない細菌内での発現によって得ることができる。

可変領域内、任意でＣＤＲ内もしくはＣＤＲの近位で修飾されたグリコシル化を有するこれらの抗体およびそのフラグメントは、天然抗体と同様に抗体がモル過剰にある場合でさえ標的タンパク質を部分的にのみ不活性化させながら、それらが天然抗体とは相違する治療的に有用な最高阻害活性を示すという有益な特性を有している。このためこれらのグリカン修飾抗体およびそのフラグメントは、標的タンパク質の部分的阻害のみを得るための薬剤として、より詳細には凝固系における要素に対して向けられた抗体の場合には天然抗体の届かないところで凝固因子の所望の部分的阻害を達成することを可能にする抗凝固剤として有用である。同様に、無傷抗体と同一の親和性を有するが、より低い阻害活性を有する未修飾フラグメントは、特定の阻害を保証する混合物を得るために任意で修飾された無傷抗体と組み合わせて使用できる。そこで、本発明は、特定阻害能力を備える抗体の選択もしくは開発によって、凝固を明確に規定された方法で調節するための医薬品の調製を可能にする。

本発明の修飾された抗体の親和性が重大には変化していないという事実は、混合物中でそれらを使用するために極めて重要であり、修飾された抗体は、天然抗体と類似して天然リガンドを置換するであろうことを意味する。これは、明確に規定された阻害活性を得るために抗体の混合物の調製を可能にする。より詳細には、これは、最高阻害活性が極めて重要である抗凝固抗体の分野において重要である。例えば、一部の臨床状況では、相違する阻害活性を備える抗第ＶＩＩＩ因子抗体が必要とされることがあろう。例えば、外科的インターベンション後の血栓症の短期間の予防は、例えば心房細動などの慢性状態を治療するために必要とされる力価とは相違する力価を備える薬物で最適に処置することができる。

そこで、本発明の特定の実施形態によると、修飾された抗体もしくは抗体フラグメントが同一標的タンパク質に対して向けられた他の抗体、さらにより詳細には同一抗原に対して特に向けられた、または同一細胞株由来の他の抗体との混合物中で使用される。この混合物は、同一標的タンパク質に対して向けられた修飾された抗体と一緒に天然抗体を含んでいてよい、またはこの混合物はそれらのグリコシル化パターンが相違する方法で修飾された２つの抗体を含んでいてよい。混合物の相違する部分は、いずれか望ましい阻害活性を得られるような量で混合することができる。

本発明は、修飾されたグリコシル化および修飾された最高阻害を備えるが、それらの標的タンパク質に対する親和性もしくは特異性が改変されていない抗体を調製するための方法に関する。このため本発明は、抗体を炭水化物分解酵素もしくは形質転換酵素へ曝すステップを含む、前記抗体を産生するための方法に関する。あるいは、本発明の調製方法は、適切なグリコシル化酵素を備える細胞株内で抗体を産生するステップ、または抗体を産生する細胞株のグリコシル化酵素の活性を修飾するための細胞培養条件を修飾するステップを含む。本発明のまた別の実施形態では、前記抗体を調製するための方法は、例えば部位指向突然変異誘発によって、グリコシル化部位を除去もしくは導入するために、抗体の抗原結合部位を遺伝的に修飾するステップを含んでいる。

本発明の特定の実施形態では、抗体のグリコシル化はその可変領域内または抗原結合領域の近位にあるアミノ酸内で修飾される。

そこで本発明は、天然抗体に比較して修飾されたグリコシル化パターンを有する抗体に
関する。

天然抗体は、当技術分野において知られている方法によって調製できる。
様々な細胞株内で発現する無傷抗体、脱グリコシル化酵素を用いて処置される無傷抗体、およびグリコシル化コンセンサスサイズの部位指向突然変異誘発に関する初期データは、そのような抗体の阻害効果がグリコシル化のサイズと相関していることを証明している。本発明は、Ｋｒｉｘ−１などの阻害抗体については、抗体の阻害効果が三次元サイズに伴って減少するという概念を提示している。この概念は、無傷抗体より低い阻害レベルを有するＫｒｉｘ−１のＦａｂフラグメントおよびｓｃＦｖフラグメントの使用によって確証される。

本発明は、同一天然無傷抗体に由来する、相違する個別阻害活性を備える阻害抗体の混合物が、中間阻害活性が得られる混合物を生じさせることをさらに示す。これは同様に、例えばＫｒｉｘ−１モノクローナル抗体（第１抗体）とＲＨＤ５細胞株から得られた第２モノクローナル抗体の混合物などの、相互に競合性である相違する天然および無傷抗体の混合物にも当てはまる。

本発明のさらにまた別の局面は、Ｋｒｉｘ−１などの既知の阻害抗体と競合するそれらの能力に基づいて、本発明によって使用できるまた別の阻害抗体を単離するための方法を提供する。そこで本発明は、Ｋｒｉｘ−１から出発して、Ｋｒｉｘ−１結合と競合する追加の抗体を同定するための方法およびツールを提供する。そのような抗体は、任意に阻害性であり、そしてさらに任意でプラトー効果を有する。そのような方法の実験構成については実施例１３に記載する。

所定の標的タンパク質に対するモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎによって最初に開発されたハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）， Ｎａｔｕｒｅ ２５６， ４９５−４９７）、ならびにｔｒｉｏｍａ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ４，７２）、ヒトモノクローナル抗体などを産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５）、「モノクローナル抗体および癌療法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）」、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．、第７７〜９６頁）などの培養中での連続継代細胞株による抗体分子の産生を提供するいずれかの技術によって産生できるが、それらはすべて本発明の範囲内に含まれる。

モノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体もしくはキメラヒト−マウス（もしくは他の種）モノクローナル抗体であってよい、または例えばラクダもしくはラマ由来などの、当技術分野において知られているいずれか他の種類由来でさえあってよい。ヒトモノクローナル抗体は、当技術分野において知られているいずれか多数の技術から作製することができる（例、Ｔｅｎｇら（１９８３）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８０， ７３０８−７３１２；Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ４， ７２−７９， Ｏｌｓｓｏｎら（１９８２）， Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ９２， ３−１６）。ヒト定常領域とともにマウス抗原結合ドメインを含有するキメラ抗体分子を調製できる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ８１， ６８５１；Ｔａｋｅｄａら（１９８５）， Ｎａｔｕｒｅ ３１４，４５２）。

当技術分野において知られている様々な方法を使用すると、標的タンパク質のエピトープに対するポリクローナル抗体を産生することができる。抗体を産生するために、特異的タンパク質、またはそのフラグメントもしくは誘導体を注射することによって、ウサギ、
マウスおよびラットを含むがそれらに限定されない様々な宿主動物を免役化することができる。宿主の種に依存して、免疫学的応答を増加させるためには、（完全および不完全）フロイント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオールなどの界面活性剤、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、アオガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびに例えばＢＣＧ（カルメットゲラン菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ（コリネバクテリウム・パルブム）を含むがそれらに限定されない様々なアジュバントを使用できる。

選択されたタンパク質エピトープに対する抗体の分子クローンは、既知の技術によって調製できる。組換えＤＮＡ方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）、「分子クローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨークを参照されたい）を使用すると、モノクローナル抗体分子、もしくはその抗原結合領域をコードする核酸配列を構築することができる。

本発明は、抗体分子ならびにそのような抗体分子のフラグメントを提供する。本発明の特定の局面は、無傷抗体と同一の親和性を備える抗体フラグメントを提供するが、しかし分子のイディオタイプを含有する抗体フラグメントは知られている技術によって生成できる。例えば、そのようなフラグメントには抗体分子のペプシン消化によって生成できるＦ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントのジスルフィド架橋を減少させるステップによって生成できるＦａｂ’フラグメントならびにパパインおよび還元剤を用いて抗体分子を処理するステップによって生成できるＦａｂフラグメントが含まれるが、それらに限定されない。抗体分子は、既知の技術、例えば免疫吸着もしくはイムノアフィニティクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）などのクロマトグラフィー法またはそれらの組み合わせなどによって精製できる。

本発明の抗体は、限定された最高阻害活性を備える新規抗体を生成するための従来型ハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ、コンビナトリアルライブラリー、免疫グロブリン鎖シャッフリング、部位指向突然変異誘発およびヒト化技術によって調製できる。

本発明は、ＰＣＴ国際特許第９７／２６０１０号および／または第０１／０４２６９号に記載されたように、例えばマウスにヒト第ＶＩＩＩ因子を注射するステップと、次に脾臓リンパ球とマウス骨髄腫細胞株とを融合させるステップと、さらに抗第ＶＩＩＩ因子抗体を産生する細胞培養を同定かつクローニングするステップとによって、動物、好ましくはマウスにおいて意図的ヒト化によって生成される天然モノクローナル抗体に由来する修飾された抗体を提供する。より詳細には、本発明の状況では、前記抗原の「活性」もしくは「相互作用性」（例えば、複合体の他の因子と結合する）部位に隣接している抗原のエピトープは、抗体の阻害効果がＣＤＲを通して抗原の結合へ直接的には連結されていない抗体の開発を促進する目的で、免疫化のために使用できる。

本発明の１つの局面は、それらのグリコシル化パターンで修飾される抗体を提供する。天然抗体のグリコシル化の修飾は、当技術分野において知られている様々な方法を通して得られる。本発明の抗体の抗原結合部位におけるグリコシル化パターンの修飾は、精製された抗体の酵素処理によって達成できる。あるいは、本発明の抗体のグリカンの修飾は、適切なグリコシル化酵素を備える細胞株内で抗体を産生するステップ、または抗体を産生する細胞株のグリコシル化酵素の活性を修飾するために細胞培養条件を修飾するステップによって達成できる。あるいは、本発明の抗体は、グリコシル化部位を除去する、または導入するために抗体の抗原結合部位を遺伝的に修飾するステップによっても産生できる。

多数の炭水化物分解酵素もしくは形質転換酵素を適用すると、天然抗体のグリコシル化
パターンを修飾することができる。グリコシル化は、完全もしくは部分的に増加もしくは減少させることができる。特定の実施形態では、修飾は抗体の抗原結合領域内で得られる。酵素は、様々なグリコシル化パターンを備える抗体を得るために、様々な順序および様々な状況（濃度、時間、温度、バッファなど）下で天然抗体に適用できる。

例えばＮ−グリコシダーゼＦとも呼ばれるペプチド、Ｎ−４（Ｎ−アセチル−β−グルコサミニル）アスパラギンアミダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）などの酵素を使用できる。この酵素は広範囲の特異性を有しており、タンパク質からほぼすべての知られているＮ−結合オリゴ糖鎖を放出する（Ｐｌｕｍｍｅｒ ＴＨ Ｊｒら（１９８４）， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２５９， １０７００−１０７０４）。この酵素は、四本鎖型および五本鎖型糖鎖を放出する。酵素の活性は、グリコシル化が完全に変性している場合にしか予測できないことは注目すべきことである。したがって、無傷抗体へ前記酵素が及ぼす活性は各々の場合に調節されなければならない。抗体の脱グリコシル化を調節するための方法は、「タンパク質科学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、Ｇ．Ｔａｙｌｏｒ編集、Ｕｎｉｔ １２．４；Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃに記載されている。

詳細には、グリコシル化および脱グリコシル化抗体が等電点分画電気泳動法によって比較される。

ＩｇＧの短縮型グリコフォームは、Ｍｉｍｕｒａら（２００１）， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７６， ４５５３９−４５５４７に記載されており、図１および図２に要約した連続的酵素処理によって生成できる。

シアル酸は、多数のＮ−およびＯ−結合オリゴ糖上の末端糖である。シアル酸を除去するためには、酢酸バッファ（ｐＨ５．０）中の天然ｌｇＧがシアリダーゼ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ、 Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、英国イーストサセックスからのシアリダーゼなど）へ３７℃で２４時間にわたり曝露させる。シアル酸の除去は、タンパク質の等電点の上昇を生じさせる。このため、ＩＥＦを使用するとシアル酸の除去を調節することができる。

シアル酸を除去すると、酢酸バッファ中でβ−ガラクトシダーゼ（Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）を用いた３７℃での２４時間にわたる処理によってガラクトースを除去できる。シアル酸およびガラクトースの除去に続いて、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（Ｄ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）を用いた３７℃での２４時間にわたる処理によってＮ−アセリルグルコサミンを分解することができる。マンノース残基は、次にα−マンノシダーゼ（ｊａｃｋ ｂｅａｎ、Ｇｌｙｋｏ社、英国オックスフォードシャー）を用いた３７℃での４８時間にわたる処理によって除去することができる（Ｍｉｍｕｒａ Ｙ．ら、上記）。

様々なタイプのシアリダーゼについてもまた記載されている。Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ由来のシアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）は、α２，３−およびα２，６−結合シアル酸の両方を放出するが、他方ニューカッスル病ウイルス由来のシアリダーゼはα２，３−結合シアル酸しか放出しない（Ｊａｓｓａｌら（２００１），
Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ． ２８６：２４３−２４９）。エンドグリコシダーゼＦ２はコア領域内の２つのＧｌｃＮＡｃ残基間の結合を開裂させて、まだ前記タンパク質に結合した１つのＧｌｃＮＡｃを残す。エンドグリコシダーゼＦ２は、糖タンパク質から二本鎖複合体型のオリゴ糖鎖を放出するが、三本鎖型もしくは四本鎖型糖鎖は開裂しない。

エンドグリコシダーゼＦ３は、狭い基質範囲を備えるまた別のエンドグリコシダーゼである：これは三本鎖型糖鎖を開裂する。コアフコシル化二本鎖型糖鎖は、唯一のまた別の証明された基質である。これは高マンノースハイブリッドの非フコシル化二本鎖型もしくは四本鎖型糖鎖を開裂しない。エンドグリコシダーゼＦ２およびＦ３によって開裂できる全結合は、成熟抗体では曝露させられない。抗体をこれらのエンドグリコシダーゼによって有用に修飾できるかどうかを判定するために適切な方法には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、上述したようにトウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）アグルチニン−１およびＩＥＦを用いるレクチン結合法が含まれる。

これとは逆に、グリカン残基は、抗体の可変部分内で発現した炭水化物へ酵素を使用して付加することができる。例えば、上述したようにシアリダーゼを用いた処理後には、適切なバッファ中のガラクトシル−トランスフェラーゼおよびＵＤＰ−Ｇａｌを用いた処理を続けることができる（Ｋｒａｐｐら（２００３）， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ３２５， ９７９−９８９）。修飾された抗体は、その後は炭水化物鎖のガラクトシル化のために均質である（二本鎖型ジガラクトシル化グリコフォーム）。

相違するオリゴ糖を有する抗体の精製についても、当業者には知られている。相違するオリゴ糖を有する抗体は、コンカナバリンＡなどのレクチンアフィニティークロマトグラフィーによって精製できる（二等分ＧｌｃＮＡｃへの結合）。Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ（ヒイロチャワンタケ）はコアフコシル化に基づいて分化する。Ｒｉｃｉｎｕｓ
ｃｏｍｍｕｎｉｓ（トウゴマ）アグルチニン１は、このレクチンがガラクトースで終了するオリゴ糖に対する特異的親和性を示すために、ガラクトース残基の数によって分画化する（Ｙｏｕｉｎｇｓら（１９９６）， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ３１４， ６２１）。

すべての炭水化物残基が成熟抗体内で露出させられるのではない。抗体が上記のレクチンを用いて陽性的もしくは陰性的に精製できるかどうかを決定するために適切な方法は、当業者にはよく知られている。未結合抗体が第ＶＩＩＩ因子に及ぼす阻害活性を決定するためには、Ｂｅｔｈｅｓｄａ法を用いて試験できる（Ｋａｓｐｅｒら（１９７５）， Ｔｈｒｏｍｂ Ｄｉａｔｈ Ｈａｅｍｏｒｒｈ ３４， ６１２）。同様に、カラム上に捕捉されて適切なバッファを用いて溶離された抗体の活性は、Ｂｅｔｈｅｓｄａ法を用いて試験できる（上記参照）。

抗体のグリコシル化を修飾するためのまた別の方法は、それらのレパートリーのグリコシル化酵素の機能として選択された細胞株内で組換え抗体を産生するステップによって修飾されたグリコシル化パターンを備える組換え抗体を生成するための方法である。チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）は、そのような細胞株のよく知られた例である。

ＣＨＯ細胞はヒトレパートリーのグリコシル化酵素のほとんどを有するが、それらには特定グリコシルトランスフェラーゼが欠けている。詳細には、α２，６−シアリル−トランスフェラーゼ遺伝子（１，２）はＣＨＯ細胞内では内因性で発現しない。この酵素は、Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ配列上のα２，６位置において末端ガラクトース糖にシアル酸を付加する。しかし、ＣＨＯ細胞は、末端シアル酸がガラクトースへのα２，３結合内にあるように機能的α２，３−シアリル−トランスフェラーゼを発現する。α−３／４フコシルトランスフェラーゼもまたこれらの細胞によって合成もされない（Ｇｒａｂｅｎｈｏｒｓｔら（１９９９）， Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ． Ｊ． １６， ８１）。

修飾されたグリコシル化パターンを備える組換え抗体を産生するまた別の方法は、他の株由来のグリコシル化酵素を発現するように遺伝的に修飾された細胞株を使用する方法である。詳細には、また別の株からクローニングされたα２，６−シアリルトランスフェラ
ーゼ遺伝子を用いてトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞株を使用できる（上記参照）。

修飾されたグリコシル化パターンを備える組換え抗体を生成するためには、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（サッカロミセス）、Ｐｉｃｈｉａ（ピチア）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ（ハンゼヌラ））、昆虫細胞（バキュロウイルス発現）、植物細胞もしくは植物、または哺乳動物細胞などのあらゆる発現系が適合する可能性がある。抗体のフラグメントを発現させるためには、酵母の発現は昆虫もしくは哺乳動物細胞の発現のための代替物を提供する。グリコシル化が全く必要とされない場合は、細菌内の発現が考慮に入れられる。

酵母に関しては、メチロトローフ酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓが平均８〜１４マンノース単位、すなわち１グリコシル化部位につきＭａｎ（８−１４）ＧｌｃＮＡｃ（２）を付加させることが報告されており（Ｔｓｃｈｏｐｐによる欧州特許第０２５６４２１号）、そしてＮ−結合オリゴ糖の約８５％はＭａｎ（８−１４）ＧｌｃＮＡｃ（２）のサイズ範囲内にある（Ｇｒｉｎｎａ ａｎｄ Ｔｓｃｈｏｐｐ（１９８９）， Ｙｅａｓｔ ５， １０７−１１５．）。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（黒色アスペルギルス）は、Ｎ−グリコシル化部位へＭａｎ（５−１０）ＧｌｃＮＡｃ（２）を付加する（Ｐａｎｃｈａｌ ａｎｄ Ｗｏｄｚｉｎｓｋｉ（１９９８）， Ｐｒｅｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２８， ２０１−２１７）。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロミセス・セレビシアエ）グリコシル化欠損性突然変異体ｍｎｎ９は、ｍｎｎ９細胞が過剰グリコシル化タンパク質の代わりにＭａｎ（９−１３）ＧｌｃＮＡｃ（２）からなる修飾されたオリゴ糖を備えるグリコシル化タンパク質を産生する点で野生型Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとは相違する（米国特許第５，１３５，８５４号におけるＭａｃｋａｙら）。しかし、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（野生型およびｍｎｎ９突然変異体）コアオリゴ糖についての特徴は、末端α−１，３−結合マンノース残基の存在である（Ｍｏｎｔｅｓｉｎｏら（１９９８）， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ． １４， １９７−２０７．）。Ｐ． ｐａｓｔｏｒｓもしくはＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｏｃｈ１ｍｎｎ１内で発現したタンパク質のＮ−グリコシル化部位に付加されたオリゴ糖には、そのような末端α１，３−結合マンノースが欠けている（Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎら（２０００）Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
５４， ７４１−７５０）。末端α１，３−結合マンノースはアレルゲン性であると考えられる（Ｊｅｎｋｉｎｓら（１９９６）， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４， ９７５−９８１）。このため、それらのオリゴ糖の末端α１，３−結合マンノース残基上に担持されているタンパク質は、おそらく診断もしくは治療目的には適合しない。

グリコシル化酵素のレパートリーは、細胞型毎に相違する。所望のグリコシル化パターンを得るために、１つ以上のグリコシル化酵素を一過性もしくは安定性トランスフェクションによって（過剰）発現させることができる。同様に、１つ以上のグリコシル化酵素を一時的に（例えばアンチセンスもしくはｓｉＲＮＡテクノロジーによって）または永久的に（遺伝子不活性化によって）阻害することができる。所定の実施形態では、グリコシル化に関係する限定されたレパートリーの酵素を有する酵母細胞が使用される。この場合は、所望のグリコシル化パターンを得るために、グリコシル化に関係する１つ以上のヒト遺伝子を導入できる。

一般に、グリコシル化はしばしばタンパク質の溶解度を向上させる。所定の実施形態では、広範囲のグリコシル化（および優れた溶解度）を備える組換えタンパク質を発現する、そして脱グリコシル化酵素を用いて組換えタンパク質を後向きに処理することが有益である。

所定の実施形態では、増殖培地内にタンパク質を差し向ける（開裂可能な）分泌シグナルを備える組換えタンパク質を発現させるのが有益である。これは、例えば溶解させるのが困難な酵母細胞の場合である。さらに、組換えタンパク質は、精製を促進するためにタグ（例、Ｈｉｓタグ）または追加のドメインを有していてよい。前記タグもしくはドメインもまた（例えば、トロンビンもしくは第Ｘ因子によって）開裂可能である。

本発明の特定の実施形態では、これらの発現系のいずれかにおいて産生した組換え抗体の第ＶＩＩＩ因子阻害活性は次に、上述したように修正Ｎｉｊｍｅｇｅｎ法を使用するＢｅｔｈｅｓｄａアッセイにおいて評価できる。

さらに、組換え抗体のグリコシル化を修飾するために培養条件を活用することもできる。血清無含有培地中の定常状態で溶解した酸素の濃度は、抗体のグリコシル化に影響を及ぼす。グリコシル化の程度は、溶解酸素濃度が減少するに伴って低下する（Ｋｕｎｋｅｌら（１９９８）， Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６２， ５５−７１）。培地に２０ｍＭを越えるＮ−アセチルグリコサミンを補給すると、さらに新規抗体グリコフォームも誘導することができる（Ｔａｃｈｉｂａｎａら（１９９２）， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ． １８９， ６２５−３２；Ｔａｃｈｉｂａｎａら（１９９６）， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ａｎｉｍ． ３２， １７８−１８３）。グルココルチコイドホルモンおよびインターロイキン６はタンパク質グリコシル化の変調に関係している（Ｃａｎｅｌｌａ ａｎｄ Ｍａｒｇｎｉ（２００２）， Ｈｙｂｒｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ ２１， ２０３）。グリコシル化に影響を及ぼすその他の因子は、培地のｐＨにおける変化ならびに前駆体および栄養素の適合性である。

このため、細胞株および細胞培養条件の選択は、グリコシル化パターンに大きな影響を及ぼす可能性がある。

酵素的修飾および抗体の組換え産生にとってのまた別の代替法は、（部位指向）突然変異誘発を使用する方法である。この技術を用いて、新規グリコシル化部位を導入できる、または既存グリコシル化部位を除去できる。抗体の可変領域内の部位指向突然変異誘発によってＮ−グリコシル化部位を導入することができる。好ましくは、抗原に対する抗体の親和性へアミノ酸置換が及ぼす効果を最小限に抑えるために、突然変異は単一アミノ酸変化として導入される。Ｎ−グリコシル化部位の付加は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列の作製によって、最も一般的にはＡｓｎをコードするようにコドンを突然変異させることによって実施される。さらに、追加のグリコシル化のための部位は、グリコシルトランスフェラーゼに接近可能であると予測された位置で選択されることが好ましい。あるいは、Ｎ−グリコシル化部位を含有するアミノ酸ストレッチは、可変領域内でグリコシル化された抗体の公表された配列内で選択できる。所望の方法でのＦＶＩＩＩ活性を阻害する抗体の選択は、Ｂｅｔｈｅｓｄａアッセイを用いて行なうことができる（Ｋａｓｐｅｒら（１９７５）、上記参照）。タンパク質構造は、グリコシル化を間接的に修飾するために修飾することもできる（Ｌｕｎｄら（１９９６）， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７， ４９６３、Ｌｕｎｄら（２０００）， Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６７， ７２４６）。部位指向突然変異誘発は当業者によく知られた方法であり、Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ方法を含んでいる（Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９８７）， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４：３２９−５０）。

本発明は、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、ＣＤＲ、単一可変ドメインならびにこれらの誘導体、ホモログおよび組み合わせなどの上述したモノクローナル抗体のいずれかのフラグメントをさらに提供する。

本発明の特定実施形態では、抗体は凝固系の要素に対して、より詳細には第ＶＩＩＩ因子に対して向けられている。

このため本発明は、Ｋｒｉｘ−１に由来する抗体、より詳細にはＫｒｉｘ−１に由来するそれらのグリコシル化パターンが修飾されていて修飾された第ＶＩＩＩ因子阻害活性を備える抗体に関する。詳細には、グリカン修飾抗体はヒトモノクローナル抗体Ｋｒｉｘ−１、そのフラグメントに由来する、それの１つもしくは数個の相補性決定領域を含有する。修飾されたグリコシル化部位を備える代表的な抗体は、Ｎ−グリコシダーゼＦを用いたＫｒｉｘ−１の処理によって産生した抗体である。詳細には、Ｋｒｉｘ−１の重鎖のＣＤＲ１内に突然変異Ａｓｎ４７Ｇｌｕ（Ｋｒｉｘ−１Ｅ）およびＴｈｒ４９Ａｌａ（Ｋｒｉｘ−１Ａ）を含有する遺伝的に修飾された抗体である。

グリコシル化の修飾は、ｍＡｂ−Ｋｒｉｘ−１の第ＶＩＩＩ因子阻害活性を修飾する。修飾されたグリコシル化パターンを備える抗体の阻害活性を評価するための特定の方法は、修正Ｎｉｊｍｅｇｅｎ法（Ｖｅｒｂｒｕｇｇｅｎら（１９９５）， Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ． ７３， ２４７−２５１）を用いたＢｅｔｈｅｓｄａ法である（Ｋａｓｐｅｒら（１９７５）、上記を参照）。このアッセイでは、ＦＶＩＩＩ源として使用される正常プール血漿が等量の抗体と混合される。抗体を用いた２時間のインキュベーション後に、残留ＦＶＩＩＩ活性が因子クロモジェニックアッセイもしくはクロッティングアッセイによって測定された。

Ｋｒｉｘ−１と名付けられた細胞株はＰＣＴ国際特許第０１／０４２６９号の中で開示されており、Ｄｒ． Ｍａｒｃ Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ、（分子血管生物学センター（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｏｎｄｅｒｗｉｊｓ ＆ Ｎａｖｏｒｓｉｎｇ、３０００ベルギー国ルーバン、ヘラストラート通り４９）によって１９９９年７月１日にアクセッション番号ＬＭＢＰ５０８９ＣＢを付けてＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ（Ｂｅｌｇｉａｎ Ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ／Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ ｖｏｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｅ、 Ｂ−９０００ Ｇｎｅｎｔ， ＢＥ、Ｋ．Ｌ． Ｌｅｄｅｇａｎｃｋｓｔｒａａｔ ３５）に寄託された。

ＦＶＩＩＩ活性の部分的阻害は、所定の抗体による第ＶＩＩＩ因子活性の最高阻害が、例えばＢｅｔｈｅｓｄａアッセイなどの適切な試験方法を用いて決定したときに９９％以下であることを意味している。残留第ＶＩＩＩ因子活性は、次に凝固もしくは第ＶＩＩＩ因子クロモジェニックアッセイを用いて測定される。適切なクロモジェニックアッセイは、例えばＣｏａｔｅｓｔ（登録商標）（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＳｐＡ、イタリア国ミラノ）である。

本発明に記載した抗体は、様々な疾患の治療もしくは予防において有用であり得る。凝固系の要素に対して向けられた抗体の場合には、これらの抗体は、心筋梗塞、不安定狭心症、心房細動、脳梗塞、腎障害、肺塞栓症、深部静脈血栓症、経皮経管的冠動脈形成術、播種性血管内凝固症候群、敗血症、臓器移植、シャントに関連する血栓性障害のための治療用医薬組成物中において有用である。

本発明は、一方では第ＶＩＩＩ因子の部分的阻害が所望であるが、他方では所定レベルの残留第ＶＩＩＩ因子活性が前記障害もしくは症候群の治療もしくは予防において有益である障害もしくは症候群を治療および予防するための医薬組成物の生成を可能にする。その１つの例は、膵炎、虚血、多発外傷および組織傷害、出血性ショック、免疫媒介性臓器障害および感染症を含む多数の臨床状態の可能性のある終点である全身性炎症である。初
期の原因とは独立して全身性炎症では極めて類似する生理的変化が観察されるので、用語「全身性炎症性応答症候群」（以下ではＳＩＲＳという）は一般にそのような変化を意味すると一般に言われており、このため本出願ではＲ．Ｃ． Ｂｏｎｅら、Ｃｈｅｓｔ（１９９２）， １０１，１６４４−１６５５によって考案されたアメリカ胸部医師会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｓｔ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ）の勧告にしたがって使用した。ＳＩＲＳの定義および病因はさらにＮｙｓｔｒｍ（１９９８）， Ｊ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４１ Ｓｕｐｐｌ Ａ， １−７に記載されている。敗血症は、感染症に関連するＳＩＲＳを表している。ショックは、敗血症起源であろうとなかろうと、つまり（ａ）適正な急速輸液にもかかわらず持続する低血圧、および（ｂ）低潅流もしくは臓器機能不全に関連する異常を特徴とする。

Ｂｏｎｅら、Ｃｈｅｓｔ（１９９７）１１２， ２３５−４３によると、ＳＩＲＳから切り離せない部分である早期全身性炎症は、通常は後期抗炎症性応答によって補償される。炎症促進性事象と抗炎症性事象との間の平衡は好都合な臨床転帰をもたらす。しかし、これらの２つの拮抗事象間の平衡は、多くの相互作用性メディエーターが関係するために、脆弱で容易に崩壊させられる。近年、ＳＩＲＳの病理生理学および関連性敗血正ショックの発生に関しては多くの知識が蓄積されてきており、そのパラダイムはグラム陰性細菌による感染症のためである。そこでこのような細菌から遊離したエンドトキシンは、多数の宿主細胞、そして詳細には単球およびマクロファージを活性化する。これは腫瘍壊死因子（以下ではＴＮＦと呼ぶ）、インターロイキン１、６および８（以下ではＩＬ−１、ＩＬ−６およびＩＬ−８と呼ぶ）を含む炎症促進性サイトカインの産生を生じさせる。同一細胞によって産生された酵素は、凝固系、補体系およびブラジキニン系の活性化をもたらす。血小板活性化因子（以下ではＰＡＦと呼ぶ）を含むスーパーオキシドラジカルおよびアラキドン酸の代謝産物は、Ｐａｒｉｌｌｏら、Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ（１９９０）， １１３， ２２７−２４２にしたがって産生される。

凝固系の活性化は、微小血管構造内での血栓の形成を生じさせるために、血管内皮への多形白血球および血小板の接着とともに、ＳＩＲＳの病因において不可欠である。血栓は、臓器潅流を損傷させ、最終的には臓器機能障害もしくは不全を生じさせる。腸レベルでは、これは腸内細菌叢由来のエンドトキシンの上昇した吸収を産生し、さらに炎症促進性サイトカインの遊離および臓器機能障害を増大させる。播種性血管内凝固症候群（以下では、ＤＩＣと呼ぶ）は、このため敗血症および敗血性ショックの病態生理の必須成分である。

後期に補償性抗炎症性応答が出現するが、敗血症の臨床転帰はそれに左右されるであろう。弱すぎる、または強すぎる応答はＤＩＣを調節する失敗によって、またはさらに感染症に対する上昇した感受性を備える調節されない出血および免疫抑制をもたらすことによって臨床状態を悪化させる可能性がある。この抗炎症相に介入する個別の因子はすべてが確実に同定されている訳ではないが、多数の分子が明確に関係すると見なされている。そこで凝固カスケードにおける様々なステップで作用する３種の強力な阻害剤であるアンチトロンビン（以下ではＡＴと呼ぶ、３μｍｏｌ／Ｌの正常血漿中濃度を備える血漿中セリンプロテアーゼ阻害剤）、活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）および組織因子経路阻害剤（以下ではＴＦＰＩと呼ぶ、また別の内皮結合タンパク質）は、Ｅ．Ｆ． Ｍａｍｍｅｎ， Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．（１９９８）， ２４， ６４９−５０によると、敗血症中には重度に減少し、それらの血漿中濃度は不良な臨床的予後と逆相関している。そのような減少したレベルは、つまり肝臓による消費の増加および合成の減少の両方に起因する。

凝固系は現在、開始期、増幅期および伝播期に分けられている。開始は、組織因子（ＴＦ）上の第ＶＩＩ因子の活性化または第ＸＩＩ接触因子によって発生する。これは少量の
トロンビンの生成を生じさせ、増幅ループを活性化してより多くのトロンビン形成をもたらす。この増幅ループにおいて２つの補因子である第Ｖ因子および第ＶＩＩＩ因子は活性化されるが、それらの機能はプロトロンビンおよび第Ｘ因子の開裂を各々数対数の大きさまで増加させることである。凝固カスケードの伝播期は、最終的にはフィブリンの形成および血餅退縮をもたらす。このため、トロンビンは他の起源の敗血症もしくはＳＩＲＳに関連するＤＩＣの発達において中心的役割を果たす。この発見は、トロンビン形成を減少させる治療的試みをもたらした。ヒトにおいては、アンチトロンビンを合成プロテアーゼ阻害剤（Ｍａｋｉら、Ｇｙｎｅｃｏｌ． Ｏｂｓｔｅｔ． Ｉｎｖｅｓｔ（１９８７），
２３：２３０−２４０）またはヘパリン（Ｂｌａｕｈｕｔら、Ｔｈｒｏｍｂ． Ｒｅｓ．（１９８５）， ３９：８１−８９）と比較する試験は、アンチトロンビン処置後の播種性血管内凝固症候群の有意な減弱を証明したが、いずれの試験もプラシーボコントロール群を含んでいなかった。Ｆｏｕｒｒｉｅｒら、ＤＩＣ， Ｅｘｃｅｒｐｔａ Ｍｅｄｉｃａ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９３）， ２２１−２２６によると、敗血性ショックおよびＤＩＣを有する患者を対象としてアンチトロンビンの血漿濃縮液を用いた治療を実施したプラシーボ対照二重盲験試験はＤＩＣの有意な初期補正を達成したが、統計的有意な方法で死亡率を減少させることはできなかった。近年には、Ｅｉｓｅｌｅら、Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．（１９９８）， ２４：６６３−７２によると、血漿由来もしくは組換えＡＴが敗血症のコントロールにおいて試験されている。しかし、これらすべての実施形態は重篤な問題に遭遇した。天然血漿中アンチトロンビンは、トロンビンの相当に不良な阻害剤であるが（トロンビンの完全阻害を達成するが、これは極めて高い濃度の場合だけである）、しかしその阻害効果はヘパリンの存在下では１０，０００倍に上昇する。Ｂｕｆｆｅｒら、Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ．（１９８９）， ８７：４４−４８およびＶｉｎａｚｚｅｒ， Ｃｌｉｎ． Ａｐｐｌ． Ｔｈｒｏｍｂ／Ｈｅｍｏｓｔ（１９９５） １：６２−６５によると、敗血症の動物モデルにおいてショックを予防するためには高濃度のアンチトロンビンが必要である。循環内でのアンチトロンビンの中等度の生存時間（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ．（１９８９） ８７：５３−６０およびＭｅｎａｃｈｅら、Ｂｌｏｏｄ（１９９０） ７５：３３−３９によって約３日間の半減期が報告された）およびＳＩＲＳにおけるその消費のために、その活性は定期的に監視されなければならない。理論的には、アンチトロンビンおよびヘパリン併用療法は、ショックの管理においてアンチトロンビン単独より有効なはずであるが、あいにくなことにこの形態の治療はショックを発生した患者における転帰を改善せず、上昇した出血リスクと関連していた。

治療有効量は、アンチトロンビンおよび／または活性化タンパク質Ｃおよび／または組織因子経路阻害剤の血漿中レベルを回復する量であると規定できる。そのような血漿レベルは、例えばＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ（１９８９）、Ｃｈａｎａｒｉｎ編集、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅおよび「血栓症における実験技術、マニュアル；ＥＣＡＴアッセイ方法の改訂第二版（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ， ａ ｍａｎｕａｌ；（２^ｎｄ ｒｅｖｉｓｅｄ ｅｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ＥＣＡＴ ａｓｓａｙ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）」、Ｊｅｓｐｅｒｓｅｎら編集、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９９）の中で開示された方法を使用することによって当業者であれば容易かつ直接的に測定できる。大多数のヒトＩｇＧ抗体の長い半減期を考えると、前記クラスのモノクローナル抗体である本発明の部分阻害剤が、ほとんどの場合に、単回投与で効率的な予防および／または治療を提供するであろうことは理解されるであろう。

本発明において使用した修飾されたグリコシル化を備える第ＶＩＩＩ因子の部分阻害剤は、以下の長所を示す：
−それらはトロンビンの形成を減少させる、もしくは部分的に阻害するために十分な程度までＦＶＩＩＩの機能を阻害する。トロンビンの形成の減少、しかし完全ではない抑制
は正常な血餅形成を許容しながら播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の発生を予防する。ＤＩＣの予防は、正常臓器潅流を維持し、臓器機能障害および不全を回避する。

−トロンビンの形成をコントロールより下に維持すると、補償性抗炎症性応答の活性化が減少する。そこで、活性化タンパク質Ｃは直接的トロンビン分解によって生成され、組織因子経路阻害剤の効果は、その活性化が第ＶＩＩＩ因子補因子活性に直接的に左右される第Ｘ活性化因子の存在に左右される。トロンビンと直接的に結合する循環中アンチトロンビン（ＡＴ）の限定された枯渇もまた発生する。これを言い換えると、炎症促進性および抗炎症性両方の補償性応答が、トロンビンの形成速度を調節するステップによってコントロールより下に維持される。

プラトー効果は、グリコシル化パターンを備え、このためその阻害プラトーが改変された単一抗体を用いることによって、または個別化合物のプラトー効果間に位置する所望のプラトー効果を得るためにそのような比率で抗体混合物を用いることによってのいずれかで本発明の抗体のグリコシル化を修飾することによって、微調整することができる。炎症誘導性障害に対しては、改変されたグリコシル化を備える阻害抗体は、第ＶＩＩＩ因子活性をトロンビン情報の阻害と活性化タンパク質Ｃの生成との間で適切な平衡が得られるレベルまで阻害することを可能にする。

本発明は、動物、より詳細にはヒトにおいて凝固障害を予防もしくは治療するための医薬組成物であって、有効成分として修飾されたグリコシル化パターンおよび阻害活性を備えるが親和性は影響を受けていない、上記で開示したような抗体およびその修飾バージョンを医薬上許容される担体との混合物中に含む医薬組成物をさらに提供する。

本発明の医薬組成物中において使用するために適切な医薬担体は、例えばレミントンの製薬科学第１６版（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ ｅｄ．（１９８０））に記載されており、それらの処方は当業者にはよく知られている。それらにはいずれかおよびすべての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤（例えば、フェノール、ソルビン酸、クロロブタノール）、等張剤（例、糖もしくは塩化ナトリウム）などが含まれる。組成物中のモノクローナル抗体有効成分の作用期間を調節するために追加の成分を含むことができる。

放出制御型組成物は、例えばポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレン−酢酸ビニルコポリマー、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミンなどの適切なポリマー担体を選択することによって得ることができる。薬物放出速度および作用期間は、モノクローナル抗体有効成分をヒドロゲル、ポリ乳酸、ヒドロキシメチルセルロース、ポリメチルメタクリレートおよびその他の上述したポリマーなどのポリマー物質の微粒子内、例えばマイクロカプセル内に組み込むことによっても調節できる。そのような方法には、リポソーム、マイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、ナノカプセルなどのようなコロイド状薬物送達システムが含まれる。投与経路に依存して、有効成分を含む医薬組成物は保護コーティングを必要とすることがある。注射使用のために適切な医薬形状には、無菌水溶液もしくは分散液およびその即時の調製のための無菌粉末が含まれる。このため、典型的な担体には、生体適合性水性バッファ、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物が含まれる。

以下では、特定の非限定的実施例を参照しながら本発明を説明する。

Ｋｒｉｘ−１によるＦＶＩＩＩ阻害に脱グリコシル化の効果
ＫＲＩＸ−１（ＰＢＳ中で０．５ｍｇ／ｍＬ）を最終濃度２Ｕ／ｍＬとなるようにＮ−グリコシダーゼ−Ｆ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｇｍｂｈ社、ドイツ国マンハイム）と混合した。この混合物を穏やかに攪拌しながら３７℃で７２時間インキュベートした。

天然および脱グリコシル化ＫＲＩＸ−１の阻害活性をＢｅｔｈｅｓｄａアッセイにおいて評価した（Ｋａｓｐｅｒら（１９７５）、上記参照）。このため、ＴＢＳ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中の様々な希釈率の１容量の抗体を１容量の正常ヒトプール血漿と混合し、３７℃で２時間インキュベートした。正常プール血漿は、１０人の健常者由来の血漿が混合され、最終濃度１０ｍＭとなるようにＨｅｐｅｓ（１００ｍＭ）の添加によって緩衝されていた。次に修正ＤＡＤＥ ＦＶＩＩＩクロモジェニックアッセイ（Ｄａｄｅ ＡＧ社、ドイツ国マールブルク）を用いて残留ＦＶＩＩＩ活性を測定した。このアッセイでは、トロンビン活性化ＦＶＩＩＩは第ＩＸａ因子、ＰＬおよびカルシウムイオンの存在下で第Ｘ因子から第Ｘａ因子への転換を促進した；第Ｘａ因子活性を次にｐ−ニトロアニリド基質の加水分解によって評価した。製造業者の取扱説明書にしたがって再構成した試薬は、ウシ第Ｘ因子（１ｍＭ）、第ＩＸａ因子（０．３ｍＭ）およびトロンビン（０．３ｍＭ）；ＣａＣｌ_２（３０ｍＭ）、ＰＬ（６０ｍＭ）、クロモジェニック第Ｘａ因子基質（ＣＨ_３ＯＣＯ−Ｄ−ＣＨＧ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ．ＡｃＯＨ；３．４ｍＭ）、およびトロンビン阻害剤（Ｌ−アミジノフェニルアラニンピペリジン）を含んでいた。２時間のインキュベーション時間の終了後に３０μＬの血漿／抗体混合物を回収し、マイクロタイトレーションプレート内へ広げた；３０μＬの第Ｘ因子および第ＩＸａ因子／トロンビン試薬を連続的に添加した。９０秒後、６０μＬのクロモジェニック基質を添加し、インキュベーションを３７℃で１０分間延長した。次に３０μＬのクエン酸（１Ｍ）の添加により反応を遮断し、４０５ｎｍでＯＤを測定した。残留ＦＶＩＩＩ活性は、試験サンプルのＯＤ_{４０５ｎｍ}と既知の濃度のＦＶＩＩＩ溶液を用いて得られたＯＤ_{４０５ｎｍ}とを比較することによって決定した。残留ＦＶＩＩＩ活性は、全実験を通して試験サンプルとして正確に取扱い、希釈した血漿アリコート中で測定した活性のパーセンテージとして表した。

天然ＫＲＩＸ−１はＦＶＩＩＩ活性の９０％まで阻害した。対照的に、脱グリコシル化ＫＲＩＸ−１を用いた場合は５０％の最高阻害（プラトー阻害）しか達成されなかった（図３）。

天然および脱グリコシル化ＫＲＩＸ−１を混合すると、様々なレベルまでＦＶＩＩＩを阻害する抗体混合物の選択を可能にする。

相違する比率のＮ−グリコシダーゼーＦを用いた脱グリコシル化対天然ＫＲＩＸ−１を含有する混合物を調製した。各混合物を０．０５から２５μｇ／ｍＬの範囲内の様々な抗体濃度へ希釈した。１容量の各希釈液を１容量の正常ヒトプール血漿と混合した。３７℃で２時間のインキュベーション後、クロモジェニックアッセイ（第ＶＩＩＩ因子クロモジェニックアッセイ、Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ社、ドイツ国マールブルク）を用いて残留ＦＶＩＩＩを評価した。天然および脱グリコシル化ＫＲＩＸ−１は、ＦＶＩＩＩ活性を各々約９０％および５０％阻害した（図４）。これとは対照的に１の脱グリコシル化抗体に対して４．５の天然抗体の混合物は約８０％の最高ＦＶＩＩＩ阻害を生じさせたが、他方１の天然抗体に対して１．５の天然ＫＲＩＸ−１を含有する混合物はＦＶＩＩＩ活性を約６５％阻害した（図４）。５０から９０％のいずれかのレベルへＦＶＩＩＩ活性を阻害する混合物は、天然および脱グリコシル化ＫＲＩＸ−１の比率を変動させることによって同様に得ることができる。

ＣＨＯ細胞中で産生した組換えＫｒｉｘ−１（ＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１）は、Ｋｒｉｘ−１（ヒトリンパ芽球様細胞株によって産生）より低いＦＶＩＩＩ阻害活性を有した。

ＫＲＩＸ−１ ＥＢＶ−不死化ヒトＢ細胞由来のＲＮＡは、製造業者（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）の取扱説明書にしたがってＴＲＩｚｏｌ試薬を用いて単離した。ｃＤＮＡは、第１鎖ｃＤＮＡ合成のためのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ予備増幅システムを用いて合成した。

重鎖もしくは軽鎖をコードする配列は、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ（登録商標）Ｍｉｃｒｏ ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、オランダ国ローゼンダール）を使用してＫＲＩＸ−１細胞から調製したｍＲＮＡについてのＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。重鎖のための特異的ＰＣＲプライマーは次のとおりであった：フォワードプライマー：ｃＤＮＡ配列（ＰＣＴ国際特許出願第０１／０４２６９号）の（ｎｔ）１から２１ヌクレオチド（大文字）に対応し、そしてクローニングのためのＫｐｎｌ部位（下線付き）およびＫｏｚａｋ配列（太字のイタリック）を含有する５’−ｃｇｇｇｇｔａｃｃｃｃａｃｃＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣ−３’（配列番号５）；リバースプライマー：ヒトγ４−定常領域の３’末端のｎｔ１８００−１７８０（大文字）（アクセッション番号Ｋ０１３１６）に対応し、停止コドン（太字のイタリック）およびクローニングのためのＳａｌＩ部位（下線付き）を含有する、５’−ｔａｔｇｇｃｃｇａｃｇｔｃｇａｃｔｃＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧ−３’（配列番号６）。軽鎖のための特異的プライマーは次のとおりであった：フォワードプライマー：ｃＤＮＡ配列（ＰＣＴ国際特許出願第０１／０４２６９号）のｎｔ１から２０（大文字）に対応し、そしてクローニングのためのＨｉｎｄＩＩＩ部位（下線付き）およびＫｏｚａｋ配列（太字のイタリック）を含有する５’−ｃｃｃａａｇｃｔｔｃｃａｃｃＡＴＧＧＡＡＡＣＣＣＣＡＧＣＫＣＡＧＣＴ−３’（配列番号７）；リバースプライマー：ヒトκ定常領域の３’末端のｎｔ６５３−６３５（アクセッション番号Ｖ００５５７）に対応し、停止コドン（太字のイタリック）およびクローニングのためのＸｂａｌ部位（下線付き）を含有する、５’−ａａａｃａｇｃｃｔｃｔａｇａｃｔａＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧ−３’（配列番号８）であった。配列検証後、重鎖および軽鎖配列は、上記に記載した制限部位を使用してＥＦ１−αおよびＣＭＶプロモーター各々の制御下で真核細胞中での二重遺伝子発現のために設計されたｐＢｕｄＣＥ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ベルギー国メレルベーケ）内へ連続的にクローン化した。ＦｕＧＥＮＥ６系（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、ベルギー国ブルッセル）を製造業者の取扱説明書にしたがって用いて、ＣＫＯ−Ｋ１細胞の安定性トランスフェクションのために最終ベクターを使用した。トランスフェクトした細胞は、ゼオシン（０．７ｍｇ／ｍＬの選択濃度もしくは０．３５ｍｇ／ｍＬの維持濃度；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の存在下で１０％ ＦＣＳ、４ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミンおよび８０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシン（Ｇｅｏｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ社、ベルギー国ヘイスト・オブ・デン・ベルフ）を補給したＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、英国ペイズリー）中で培養し、ＥＬＩＳＡによって抗体産生について検証した（下記参照）。細胞は、０％へのＦＣＳの段階的減少によって血清無含有培地中での増殖に適応させ、クローン希釈後、機能性（ｈｕＦＶＩＩＩについてのＥＬＩＳＡ）ならびに発現（抗ヒトＩｇＧ４検出抗体を用いたＥＬＩＳＡ）に関してバッチ産生のための最高プロデューサーを使用した。抗ＦＶＩＩＩ抗体を検出するために、グリシン緩衝化生理食塩液（ＧＢＳ）中で希釈した５０μＬのｒｆＶＩＩＩ（１μｇ／ｍＬ）を直接的に用いて４℃で２時間プレートをインキュベートすることによってｒｆＶＩＩＩを不溶化した。これらのプレートを上述したように洗浄し、さらに４℃で２時間インキュベートするために５０μＬの培養上清を添加した。洗浄後、Ｔｒｉｓ−カゼイン中で１，０００倍に希釈した５０μＬのペルオキシダーゼ標識抗ヒトＦｃガンマヤギ
ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社）を添加した。室温での２時間後、プレートを再び洗浄し、１００μＬのＯＰＤを補給した。結果として生じたＯＤは、Ｅｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社、カリフォルニア州メンロパーク）内で４９２ｎｍで読み取った。陰性および陽性コントロールは、各々培養培地および高力価阻害剤血友病Ａ患者から精製したＩｇＧであった。

組換え抗体は、固定タンパク質Ａ（Ｈｉｇｈ−ＴＲＡＰ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、スウェーデン国ウプサラ）上の吸着によって細胞培養上清から精製した。培養上清は、１ｍＬ／分の流量でＨｉｇｈ−ＴＲＡＰ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、スウェーデン国ウプサラ）を通過させた。結合したＩｇＧは１００ｍＭのクエン酸（ｐＨ３）を用いて溶出した。Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）を用いたｐＨ中和後、リン酸緩衝化生理食塩液（ＰＢＳ）に対してＩｇＧを透析した。タンパク質の濃度はＢｉｏ−Ｒａｄアッセイ（Ｂｉｏｒａｄ社）を用いて決定した。

ＣＨＯ細胞中で産生した組換え抗体をＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１と呼んだ。興味深いことに、大きく過剰なこの抗体中で観察された最高阻害は７５−８５％のＦＶＩＩＩ活性にしか到達せず、これはＦＶＩＩＩがＫＲＩＸ−１（ヒトリンパ芽球様細胞株によって産生した）と一緒にインキュベートしたときに観察された８５−９５％の最高（プラトー）阻害より低かった（図５）。

マウスにおけるＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１を用いた大静脈血栓症の予防
血栓は、以前に記載したモデル（Ｓｉｎｇｈら、２００２、上記参照）を用いて成熟雄性野生型マウス（体重：１８ｇ〜３１ｇ、年齢：８〜１０週齢）の下大静脈内で生成した。マウスにイソフルランを用いて麻酔し、正中開腹術を介して下大静脈を腎静脈の下方まで露出させ、神経外科用血管クリップ（Ｂｒａｕｎ Ｍｅｄｉｃａｌ社）を大静脈のセグメントへ３０秒間あけて１５秒間ずつ２回装着した。次に５／０プロレン（ｐｒｏｌｅｎｅ）糸を大静脈の周囲に配置し、４／０絹縫合糸を大静脈およびプロレン糸に結び付けることによって狭窄を生成した。糸を取り除いて、血流を再開させた。腹部を閉鎖し、動物が回復するに任せた。４時間後、マウスに再度麻酔し、大静脈の１ｃｍ部分（結紮点と腸骨動脈分岐部との間）を切開し、血栓の存在について検査した。切開したセグメントを次に１０％ ＰＢＳ中で洗浄し、１％パラホルムアルデヒド中に一晩浸漬した。血管セグメントをパラフィンろう中に包埋し、結紮部から下方へ０．５ｍｍ間隔で７×１０μｍの横断切片を切除した。これらの切片は、ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ（ヘマトキシリン＆エオシン）、Ｍａｒｔｉｕｓ Ｓｃａｒｌｅｔ Ｂｌｕｅ（マルチウス・スカーレット・ブルー：ＭＳＢ）およびウサギ抗血小板抗体（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、１１５９０ニューヨーク州ウェストベリー）によって染色した。ＭＢＳは新鮮フィブリンを赤色、もしくは成熟フィブリンを青色／灰色、赤血球を黄色、そしてコラーゲンを淡青色に染色した。血栓のサイズは、血栓の存在について７切片をスコア付けすることによって測定し、各々血栓が存在する場合は１、存在しない場合は０のスコアを付けた。次に各動物についてスコアを合計した。手術および顕微鏡分析を実施する試験者は治療群について知らされていなかった。

血栓症は、１５０μｇの抗体もしくは生理食塩液の皮下注射１６時間後に３群の野生型マウスにおいて誘導した。Ｆｉｓｃｈｅｒの直接確率検定（両側）を用いて、血栓の存在もしくは不在に関して群間の統計的有意差を評価した。血栓サイズに及ぼす効果は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ（マン・ホイットニー）Ｕ検定を用いて血栓スコアを比較することによって試験した。生理食塩液を注射したマウス１４匹中１０匹は肉眼で見える血栓を発生したが、これに比してＫＲＩＸ−１もしくはＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１を用いて前処
置した各群において血栓を発生した動物は７匹中１匹もいなかった（Ｐ＜０．０１）。

組織学的分析はコントロール動物１４匹中１１匹においてそして、ＫＲＩＸ−１もしくはＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１を用いて処置した動物では各々１、１および２例の血栓を同定した（図６）。したがって、ＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１はＫＲＩＸ−１より有意に低くＦＶＩＩＩ活性を阻害したが、ＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１は血栓を極めて効率的に阻害するので、このため天然ＫＲＩＸ−１抗体より優れた安全性／有効性プロファイルを提供する。

ＩＩ型ヘパリン結合部位（ＨＢＳ）アンチトロンビン欠損症（ＡＴ^ｍ／ｍ）を備えるマウスにおけるＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１の抗血栓活性
ＩＩ型ヘパリン結合部位（ＨＢＳ）アンチトロンビン欠損症を備えるマウスにおける血栓性持続勃起症モデルを用いて、ＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１の抗血栓活性を評価した（Ｄｅｗｅｒｃｈｉｎらの提示）。

マウスはＲ４８Ｃ突然変異の標的化ノックインによって事前に生成した（ヒトにおける「Ｔｏｙａｍａ」Ｒ４７Ｃ突然変異に対応する、結果として生命を脅かす、様々な部位、最も顕著には心臓、肝臓、および眼血管、胎盤血管および陰茎血管における特発性血栓を生じさせる（Ｄｅｗｅｒｃｈｉｎら、公表のために提出済み）、アンチトロンビンのＨＢＳ（ＡＴ）（ＡＴ^ｍ／ｍマウス）中で硫酸ヘパリン／ヘパラン結合および補因子活性を取り除く（Ｋｏｉｄｅら（１９８３）， Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ． ３１， ３１９−３２８；Ｋｏｉｄｅら（１９８４）， Ｎａｔｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ＵＳＡ． ８１， ２８９−２９３）。雄性マウスＡＴ^ｍ／ｍの交配後の持続勃起症発生の観察は、血栓性転帰の明確なエンドポイントおよび容易な等級付けを提供し、静脈血栓症の生理学的モデルの開発の根拠を提供した。

性的に成熟した雄性マウスの年齢適合群（２〜４月齢）に１００μＬの生理食塩液、または１００μＬのＫｒｉｘ−１、１００μＬのＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１ＱもしくはＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１の１ｍｇ／ｍＬ溶液を２回（交配３日前および交配当日）皮下注射した。第２回注射後、各雄性マウスを２匹の野生型Ｓｗｉｓｓ系雌性マウスと交配させ、交配３日後には新しい２匹の雌性マウスと取り替えて交配させた。全雌性マウスについて最近の交配を示す膣粘液栓子の形成を毎日記録し、確認された性活動を示した雄性マウスについて得られた結果だけを分析に組み入れた。雄性マウスを持続勃起症の発生について毎日検査し、持続勃起症が観察された時点、または実験が終了する初期交配８日後に致死させた。致死時に、上述したように残留ＦＶＩＩＩ活性およびヒトＩｇＧレベルの決定のために血液サンプルを採取した。陰茎を解剖し、目視検査によって背側陰茎静脈および海綿体静脈内の血栓の存在を決定した。

致死後、解剖した陰茎をパラホルムアルデヒドにより固定し、パラフィン包埋し、組織学分析のために処理した。ヘマトキシリン／エオシンを用いて顕微鏡分析のために７μｍの横断切片を染色した。

スコア付け：血栓性転帰は４つのカテゴリーを用いてスコア付けした：０、血栓なし；１、顕微鏡による陰茎静脈の血栓；２、肉眼で見える陰茎静脈の血栓；３、不可逆性血栓性持続勃起症。肉眼で見える血栓が観察されず、技術的理由から陰茎静脈の組織学検査結果を得ることができなかった場合も、動物は１とスコア付けした。注射およびマウスの監視を実施する試験者は処置群について遮蔽されていた。血栓スコア間の統計的有意差は、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ（クルスカル・ウォリス）もしくはＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を用いて試験した。抗体もしくは生理食塩液を用いて処置したこれらの各雄
性マウスに対してフォローアップ期間内の少なくとも２匹の雌性マウスにおける膣粘液栓子の存在は、これらの雄性マウスの実際的性活動を確証した。

ＫＲＩＸ−１、ＣＨＯ−ｒｅｃ−ＫＲＩＸ−１は、試験した全マウスにおいて持続勃起症を予防できた（生理食塩液に対して、ｐ＜０．０５）（図７）。２×１００μｇのＫＲＩＸ−１抗体を注射した群では、５匹の雄性マウスはいずれも持続勃起症を発生しなかったそれらのうち４匹は目視監査および実験終了時の顕微鏡分析でも血栓を有していなかった；残り１匹は肉眼的血栓を示さなかった。技術的理由から、組織学的分析を実施することができなかったので、このためこれらの動物は、分析が実施されていれば判定された可能性がある最高スコアの１とスコア付けした（図７）。

組換えＣＨＯ−ｒｅｃ−ＫＲＩＸ−１抗体についても類似の結果が観察された：処置された雄性マウス７匹中持続勃起症を発生したマウスはいなかった；５匹のマウスは肉眼的血栓も顕微的血栓も有していなかった（図７）；１匹は顕微鏡検査で検出可能な血栓だけを示し（スコア１）（図７）、１匹は肉眼で見える血栓は有していなかったが、顕微鏡検査により分析できなかったために、このため同様に１とスコア付けした（図３）。

ＩＩ型ヘパリン結合部位（ＨＢＳ）アンチトロンビン欠損症（ＡＴ^ｍ／ｍ）を備えるマウスにおけるＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１Ｑの抗血栓活性
実施例５において概説したように、ＩＩ型ヘパリン結合部位（ＨＢＳ）アンチトロンビン欠損症を備えるマウスにおける血栓性持続勃起症モデルを用いて、ＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１Ｑの抗血栓効率を評価した（Ｄｅｗｅｒｃｈｉｎら（２００３）， Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ９３， １１２０−１１２６）。

本実施例では、性的に成熟した雄性マウスの年齢適合群に１００μＬの生理食塩液、または１００μＬのＫｒｉｘ−１、１００μＬのＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１Ｑの１ｍｇ／ｍＬ溶液、ＦＶＩＩＩを認識しないコントロールヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体、またはビヒクル（ＰＢＳ）を２回（交配３日前および交配当日）皮下注射した。

ＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１は、血栓の発生を減少させることができた（ＰＢＳおよびコントロールＩｇＧ４に対してｐ＜０．０５）（図１２）。２×１００μｇのＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１Ｑ抗体を注射した群では、死亡した、あるいは持続勃起症を発生した雄性マウスは１匹もいなかった。ＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１Ｑを用いて処置した全動物もまた、目視検査では血栓を有していなかった。技術的理由から組織学的分析を実施することができなかったので、このため動物は、分析が実施されていれば判定される可能性のあった最高スコアの１とスコア付けした（図１２）。これとは対照的に、ＰＢＳもしくはコントロールヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体を用いて処置した群では、数匹の動物が死亡した、または持続勃起症を発生した（ｐ＜０．０１、ＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１Ｑ群対ＰＢＳおよびコントロールＩｇＧ４群）。

抗原結合部位におけるＮ−グリコシル化部位が欠けているＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１の変異体の産生および特徴づけ
ＣＨＯｒｅｃＫｒｉｘ−１Ｑは、Ａｓｎ４７−Ｔｈｒ４９でのＮ−結合グリコシル化部位を崩壊させるためにＡｓｎ４７をＧｌｎ４７へ改変させる重鎖内の単一アミノ酸変化を結果として生じさせるｐＣＲ４−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ−Ｋｒｉｘ−１Ｈプラスミド上の部位指向突然変異誘発によって産生した。本発明の状況では、Ｋｒｉｘ−１抗体のコーディング配列を含む他のプラスミドを同様に使用できる。Ｋｒｉｘ−１の重鎖および軽鎖のＣＤＲを含むアミノ酸配列は、各々配列番号２および配列番号４に提供した。Ｋｒｉｘ−
１の重鎖および軽鎖のＣＤＲの配列をコードするヌクレオチド配列は、各々配列番号１および配列番号３に提供した。

Ａｓｎ４７での突然変異誘発は、次の特異的ＰＣＲプライマーと組み合わせて部位指向突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州、ラ・ホーヤ）を使用して得た：
フォワードプライマー：２つの改変ヌクレオチド（ａからｃおよびｃからａ；太字のイタリック）を含有するＫｒｉｘ−１重鎖配列のｎｔ１１９から１６４（大文字）に対応する５’−ＣＣＴＧＣＡＡＧＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＡＣｃＡａＴＴＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＴＣＴＧＣＴＴＣＴＧＧ−３’（配列番号９）；
リバースプライマー：２つの改変ヌクレオチド（ｇからｔおよびｔからｇ；太字のイタリック）を含有するＫｒｉｘ−１重鎖配列のｎｔ１１９から１６４（大文字）に対応する５’−ＣＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＴＡＧＣＣＧＧＴＧＡＡｔＴｇＧＴＡＴＣＣＡＧＡＧＧＴＣＴＴＧＣＡＧＧ−３’（配列番号１０）；
ＣＨＯ−ｒｅｃＫｒｉｘ−１Ａは、Ａｓｎ４７−Ｔｈｒ４９でのＮ−結合グリコシル化部位を崩壊させるためにＴｈｒ４９からＡｌａ４９へ改変されている単一アミノ酸変化を生じさせる部位指向突然変異誘発によって産生した。

これは、次の特異的ＰＣＲプライマーと組み合わせて部位指向突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州、ラ・ホーヤ）を使用して得た：
フォワードプライマー：２つの改変ヌクレオチド（ａからｇおよびｃからｔ；太字のイタリック）を含有するＫｒｉｘ−１重鎖配列のｎｔ１２８から１６４（大文字）に対応する５’−ＣＣＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＡＣＴＴＣｇＣｔＧＧＣＴＡＣＴＣＴＧＣＴＴＣＴＧＧ−３’（配列番号１１）；
リバースプライマー：２つの改変ヌクレオチド（ｇからａおよびｔからｃ；太字のイタリック）を含有するＫｒｉｘ−１重鎖配列のｎｔ１２８から１６４（大文字）に対応する５’−ＣＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＴＡＧＣＣａＧｃＧＡＡＧＴＴＧＴＡＴＣＣＡＧＡＧＧ−３’（配列番号１２）；
ＣＨＯ−ｒｅｃＫｒｉｘ−１Ｅは、Ａｓｎ４７−Ｔｈｒ４９でのＮ−結合グリコシル化部位を崩壊させるためにＡｓｎ４７からＧｌｕ４７へ改変されている単一アミノ酸変化を生じさせる部位指向突然変異誘発によって産生した。
フォワードプライマー：２つの改変ヌクレオチド（ａからｇおよびｃからｇ；太字のイタリック）を含有するＫｒｉｘ−１重鎖配列のｎｔ１１９から１６４（大文字）に対応する５’−ＣＣＴＧＣＡＡＧＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＡＣｇＡｇＴＴＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＴＣＴＧＣＴＴＣＴＧＧ−３’（配列番号１３）；
リバースプライマー：２つの改変ヌクレオチド（ｇからｃおよびｔからｃ；太字のイタリック）を含有するＫｒｉｘ−１重鎖配列のｎｔ１１９から１６４（大文字）に対応する５’−ＣＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＴＡＧＣＣＧＧＴＧＡＡｃＴｃＧＴＡＴＣＣＡＧＡＧＧＴＣＴＴＧＣＡＧＧ−３’（配列番号１４）；
ＣＨＯ−ｒｅｃＫｒｉｘ−１Ｄは、Ａｓｎ４７−Ｔｈｒ４９でのＮ−結合グリコシル化部位を崩壊させるためにＡｓｎ４７からＡｓｐ４７へ改変されている単一アミノ酸変化を生じさせる部位指向突然変異誘発によって産生した。
フォワードプライマー：１つの改変ヌクレオチド（ａからｇ；太字のイタリック）を含有するＫｒｉｘ−１重鎖配列のｎｔ１１９から１６４（大文字）に対応する５’−ＣＣＴＧＣＡＡＧＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＡＣｇＡＣＴＴＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＴＣＴＧＣＴＴＣＴＧＧ−３’（配列番号１５）；
リバースプライマー：１つの改変ヌクレオチド（ｔからｃ；太字のイタリック）を含有するＫｒｉｘ−１重鎖配列のｎｔ１１９から１６４（大文字）に対応する５’−ＣＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＴＡＧＣＣＧＧＴＧＡＡＧＴｃＧＴＡＴＣＣＡＧＡＧＧＴＣＴＴＧＣＡＧＧ−３’（配列番号１６）。

配列を検証した後、突然変異型重鎖および野生型（天然）Ｋｒｉｘ−１軽鎖を各々ｐＥＥ６．４およびｐＥＥ１４．４ベクター（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社、ニューハンプシャー州ポーツマス）内へクローン化した。２つのベクターは、両方のベクター内に存在するＮｏｔＩおよびＳａｌＩ制限部位を用いて重鎖および軽鎖の両方を含有する二重遺伝子ベクターへ結合した。真核細胞内での重鎖および軽鎖発現は、ｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター（ｐＥＥ１４．４およびｐＥＥ６．４内に存在する）のコントロール下にある。二重遺伝子ベクターは、トランスフェクション前にＳａｌＩを用いて直鎖状化した。

ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、ベルギー国ブルッセル）を製造業者の取扱説明書にしたがって用いてＣＫＯ−Ｋ１細胞の安定性トランスフェクションのために直鎖状ベクターを使用した。トランスフェクトした細胞は、選択のために１０％のＦＢＳ、ＧＳ補給剤（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カンザス州レネクサ）および２５μＭのＬ−メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ベルギー国ボーネン）を補給したグルタミン無含有ＤＭＥＭ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カンザス州レネクサ）中で培養した。

最高のプロデューサーは、２５μＭのＭＳＸおよびＧＳ補給剤を補給した血清無含有培地（ＥＸ−ＣＥＬＬ ３０２血清無含有培地ｗ／ｏ Ｌ−グルタミン、ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カンザス州レネクサ）中で増殖させるためにＦＢＳを０％へ段階的に減少させることによって適応させた。接着性もしくは懸濁性細胞株のいずれかを使用して、突然変異ｒｅｃ−ｍＡｂ−Ｋｒｉｘ−１のバッチ生産のために、最高に発現する（抗ヒトＩｇＧ４検出抗体を用いたＥＬＩＳＡ）機能的細胞株を使用した。

組換え抗体は、ＨｉＴｒａｐ ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、スウェーデン国ウプサラ）を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。濃縮後、ｒｅｃ−ｍＡｂ−ＫＲＩＸ−１Ｑ（各々、Ａ、ＥおよびＤ）を機能性についてアッセイした（突然変異ｒｅｃ−ｍＡｂ
Ｋｒｉｘ−１がｆＶＩＩＩ活性を阻害する能力を評価するクロモジェニックアッセイ）。ｆＶＩＩＩに対する阻害能力を野生型ｒｅｃ−ｍＡｂ Ｋｒｉｘ−１と比較した（図８および９）。これらの突然変異体によるＦＶＩＩＩ阻害の範囲は３０から４０％に及んだ。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の測定
Ｐｈａｒｍａｃｉａ製バイオセンサーＢＩＡｃｏｒｅ（商標）設備（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ社）を用いて、ＣＨＯ−ｒｅｃ−ＫＲＩＸ−１Ｑ、ＣＨＯ−ｒｅｃ−ＫＲＩＸ−１Ａおよび天然ＣＨＯ−ｒｅｃ−ＫＲＩＸ−１へのＦＶＩＩＩの会合および解離速度を分析した。精製した抗体（１０ｍＭの酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．０）中の２０μｇ／ｍＬ）を、製造業者の取扱説明書にしたがって、ＣＭ５センサーチップの活性化表面上で固定した。すべての結合実験は、ＨＢＳ内で１０μＬ／分の一定流量で、実施した。Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩液（ＨＢＳ）中のＦＶＩＩＩを、センサーチップ表面上にコーティングした抗体の上方に様々な濃度で注入した。各サイクルの終了時に、ｐＨ２のＨＣｌを３６秒間フラッシュすることによって再生させた。コントロール実験は、ＦＶＩＩＩが不溶化抗体にしか結合しないことを確証した。そこで、ｒＦＶＩＩＩは抗体の不在下ではセンサーチップに結合せず、チップへの添加前に可溶性抗体とのｒＦＶＩＩＩのプレインキュベーションはＦＶＩＩＩ結合を完全に妨害した。

会合および解離速度定数は、ＢＩＡ評価２．１ソフトウエア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、スウェーデン国ウプサラ）を用いて個別センサーグラムデータ（Ｏ’Ｓｈａｎｅｓｓｙら、１９９３， Ａｎａｌｙｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２１２：４５７）の非線形当てはめによって決定した。ｋ_ａｓｓおよびｋ_ｄｉｓｓの数値は、様々な分析物濃度
を用いて確立した個別曲線について得た数値を平均化することによって決定した。ｋ_ｄｉｓｓの数値は、分析物の遊離固定リガンドへの再結合に起因する偏りを減少させるために、最高分析物濃度だけを用いて得た個別曲線から決定した。全データは、会合および解離期中に得られた反応から分析物（ｒｆＶＩＩＩ）の注射前に観察された反応を減じることによってベースライン値を補正した後に分析した。

ＣＨＯ−ｒｅｃ−ＫＲＩＸ−１Ｑ、ＣＨＯ−ｒｅｃ−ＫＲＩＸ−１Ａおよび天然ＣＨＯ−ｒｅｃ−ＫＲＩＸ−１からのＦＶＩＩＩの解離定数（Ｋ_Ｄ）は極めて類似していた（表１）。したがって、ｍＡｂ Ｋｒｉｘ−１の抗原結合部位のグリコシル化部位は抗体阻害活性に影響を及ぼすが、ＦＶＩＩＩへの結合には有意には寄与しない。

ヒヒにおける動脈および静脈血栓の予防
方法
プロトコール
雄性ヒヒ（Ｐａｐｉｏ ｕｒｓｉｎｕｓ）を使用した。動物の体重は８〜１７ｋｇであり、少なくとも実験前６カ月間は疾患を有していなかった。すべての方法は、南アフリカにおける薬物および関連物質の研究、境域、診断および試験における動物の使用に関する国内規約に従って、自由州立大学の動物実験倫理委員会によって承認された。

永久的ポリテトラフルオロエチレン（Ｔｅｆｌｏｎ）およびシリコンゴム（Ｓｉｌａｓｔｉｃ）動静脈（ＡＶ）シャントをヒヒ大腿血管内に移植した。シャントを通る血流量は１００から１２０ｍＬ／分の間で変動した。ヒヒの取扱いは、塩酸ケタミンを用いた麻酔を通して達成した（Ａｎａｋｅｔ−Ｖ。Ｃｅｎｔａｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。

各実験では、血液−空気界面を回避するために生理食塩液が充填されたトロンボゲン形成装置をＴｅｆｌｏｎ製コネクタによって永続的動静脈シャント内への延長セグメントとして組み込んだ（Ｋｏｔｚｅら（１９８３）， Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ． ７０， ６７２−６７５）。Ｈａｎｓｏｎら（１９８５）， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ５， ５９５−６０３にしたがってＳｉｌａｓｔｉｃ製チューブ（内径：３ｍｍ）の壁の中にＤａｃｒｏｎを挿入することによって血小板依存性動脈血栓を誘導した（図１０）。

Ｄａｃｒｏｎ製人工血管材料（１．２６ｃｍ^２）が血小板依存性動脈型血栓の発生装置として機能した。凝固依存性静脈血栓を生成するためには膨張チャンバー（３．７７ｃｍ^２）を使用した。血液は約１２０ｍＬ／分の速度でトロンボゲン形成装置の中を流れた。初期剪断応力は、Ｄａｃｒｏｎ区域に対しては３１８／秒であり、膨張チャンバーに対し
ては１０／秒であった。

コントロール試験では、これらの装置を６０分間もしくはそれらが閉塞するまでそのままで維持し、その後それらを取り除き、永続的ＡＶシャントを通る血流を再確立させた。次に１．２５もしくは５ｍｇ／ｋｇのＣＨＯ−ｒｅｃ−Ｋｒｉｘ−１Ｑの単回静脈内ボーラス投与によりヒヒを処置した。トロンボゲン形成装置は抗体注射１時間後から６０分間にわたり配置し、その後で装置を取り除き、永続的ＡＶシャント内を通る血流を再確立した。さらに抗体ボーラス注射の２４時間後および４８時間後に６０分間の試験を実施した。最後の血栓実験後に、体外シャントを取り除いた。血液サンプルは、シャントから直接的に、もしくは静脈穿刺のいずれかによってサンプリングスケジュールにしたがって採取した。ＦＶＩＩＩ活性、ｍＡｂ Ｋｒｉｘ−１濃度を監視し、ＰＴ、ＡＰＴＴ、フィブリノーゲンを全サンプル上で測定した。
人工血管のイメージング
自己血小板を^１１１Ｉｎ−トロポロンを用いて標識し、コントロール実験の開始１時間前に動物に再注入した。これによって第０、１および２日に画像獲得が可能になった。第６もしくは１４日に画像獲得を提供するために、標識手順を繰り返した。人工血管の画像獲得は、高分解能コリメータを装備したガンマシンチレーション・カメラを用いて実施した。これらの画像を保存し、シンチレーションカメラと接続されたコンピュータ・イメージングおよび分析システムを用いて分析した。動態画像獲得、血中放射能を決定するために人工血管をイメージングするたびに５ｍＬの自己血液サンプルの３分間画像も獲得した（血液標準）。動態画像内の沈着放射能および循環中放射能を決定するために、人工血管および膨張セグメントの当該領域を選択した。人工血管材料上および膨張チャンバー内に沈着した血小板の総数を計算した。

ＣＨＯ−ｒｅｃ−ＫＲＩＸ−１Ｅを用いて処置した動物６匹では、血小板沈着は、静脈および動脈血栓チャンバーのどちらにおいても生理食塩液で処置したコントロール動物におけるより低かった（図１１）。

修飾されたグリコシル化を備える第ＶＩＩＩ因子に対する阻害抗体を用いた、敗血症関連状態の治療
エンドトキシンの注射は炎症促進性サイトカインの産生を誘発するが、それらの中では凝固系との相互作用を示すためにＩＬ−６およびＴＮＦ−αが重要である。そこで、ＩＬ−６は組織因子の産生を増加させ、そして結果としてトロンビンの生成を増加させる。これはさらに、独立機序によるフィブリノーゲンの産生を増加させる。ＴＮＦ−αは、プラスミノーゲン活性化阻害因子１型（ＰＡＩ−１）のレベルおよびそれによってフィブリン溶解を減少させる。

各処置に対してマウス６匹（Ｃ５７ＢＩ／６）の群を構成した。
野生型およびＦＶＩＩＩノックアウトマウスに３０および１００μｇの下記の抗体を静脈内注射した：
−抗体なし
−コントロール抗体（ＩｇＧ４）
−ＣＨＯ細胞内で発現したＫ−ｒｉｘ１抗体（ＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１）
−Ａｓｎ４７で突然変異したＫｒｉｘ−１（ＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１Ｑ）
−１／４もしくはその他の比率にある（ＫＲＩＸ−１）／（ＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１Ｑ）
試験のために天然もしくは脱グリコシル化Ｋｒｉｘ−１のフラグメント（より詳細には、ＦａｂもしくはｓｃＦｖフラグメント）を含む混合物などのＫｒｉｘ−１を含むその他の混合物を想定した。Ｋｒｉｘ−１および第２抗体を含む他の混合物（実施例１３に開示
した）もしくはその誘導体もまた考慮の対象とした。特定の混合物は、Ｋｒｉｘ−１およびＲＨＤ５またはＫｒｉｘ−１および／またはＲＨＤ５のフラグメントを含んでいた。

抗体の投与６０分後に、様々なマウス集団に体重２０ｇ当たり４μｇもしくは４０μｇもしくは４００μｇいずれかのリポ多糖（Ｅ． ｃｏｌｉ血清型０：１１１：Ｂ４から）を腹腔内注射した。９０分後に、各実験設定のために心穿刺によって、サイトカインの評価および凝固因子レベルを評価するために集団の一部から血液をクエン酸バッファ内に採取した。血漿は、５，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって得た。

残りのマウスの生存について１週間追跡した。
体重２０ｇ当たり４０μｇのリポ多糖注射によるフィブリン溶解性経路の程度は２つの主要な経路不活性化因子、つまりＰＡＩ−１（プラスミノーゲン活性化阻害因子１）およびα_２−アンチプラスミンの濃度を、評価下の分子の様々な部位に向けて立てられた２種の特異的モノクローナル抗体を用いるサンドイッチ型ＥＬＩＳＡを使用して評価した。

血漿中フィブリノーゲン濃度の展開をフィブリンへの転換の示度として使用した。
チモーゲンおよび活性化タンパク質Ｃの決定は、例えばＲｉｃｈａｒｄｓら（１９９０）， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３６， １８９２−１８９６にしたがって測定できる。

本実験は、エンドトキシン関連性敗血症を予防するために適切な抗体もしくは抗体混合物の同定を可能にした。他の成分、または炎症性サイトカインＩＬ−６および／またはＴＮＦ−αのアップレギュレーションを引き起こす状態に対しても類似の実験を想定できた。

天然および脱グリコシル化Ｋｒｉｘ−１の抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）の産生
ＬＣＬ−およびＣＨＯ−ＫＲＩＸ−１（ＰＢＳ中で０．５ｍｇ／ｍＬ）を最終濃度２Ｕ／ｍＬでＮ−グリコシダーゼ−Ｆ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｇｍｂｈ社、ドイツ国マンハイム）と混合した。この混合物を穏やかに攪拌しながら３７℃で７２時間インキュベートした。

Ｆａｂフラグメントは、リン酸バッファ（０．０３９ＭのＫＨ_２ＰＯ_４、０．０６８ＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．０）中のＬＣＬ−およびＣＨＯ−ＫＲＩＸ−１（０．５ｍｇ／ｍＬ）をシステイン（０．０５Ｍ）、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）およびパパイン（１０μｇ／ｍＬ）と一緒にインキュベートするステップによって生成した。３７℃での３時間のインキュベーション後に、０．０７５Ｍのヨードアセトアミンの添加によって反応を停止させた。

２０℃での３０分後、混合物をリン酸緩衝化生理食塩液（ＰＢＳ）に対して透析した。未消化抗体は、ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）上への吸着によって除去した。

天然および脱グリコシル化ＫＲＩＸ−１の阻害活性をＢｅｔｈｅｓｄａアッセイ（Ｋａｓｐｅｒら（１９７５）、上記参照）において評価し、図１３に示した。

ＫＲＩＸ−１およびＫＲＩＸ−１Ｑ ｓｃＦｖフラグメントの産生および特徴づけ
ピチア発現ベクター内でのｓｃＦｖ−ＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨのクローニング
ＫＲＩＸ−１のｓｃＦｖフラグメントは、ＫＲＩＸ−１軽鎖可変部分（ＶＬ）の３’末端と重鎖可変部分（ＶＨ）の５’末端との間のリンカー配列を付加することによって構築
した。これは、次のプライマーを用いてＫＲＩＸ−１軽鎖および重鎖のＰＣＲ増幅によって得た：
軽鎖については：フォワードプライマー：Ｋｒｉｘ−１ ＶＬ配列の５’末端（大文字）に対応し、そしてＸｈｏｌ制限部位（下線付き）およびＫＥＸ１配列（太字のイタリック）を含有する５’−ｇｔａｔｃｔｃｔｃｇａｇａａａａｇａＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣ−３’（配列番号１７）；リバースプライマー：ＫＲＩＸ−１ Ｊｋ配列の３’末端（大文字）に対応し、そしてリンカー配列の一部（イタリック）を含有する５’−ｃｇｃｃａｇａｇｃｃａｃｃｔｃｃｇｃｃｔｇａａｃｃｇｃｃｔｃｃａｃｃＴＣＧＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣ（配列番号１８）。

重鎖については：フォワードプライマー：Ｋｒｉｘ−１ ＶＨ配列の５’末端（大文字）に対応し、そしてリンカー配列の一部（イタリック）を含有する５’−ｃａｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｃｔｃｔｇｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｔｃｇＣＡＧＧＴＭＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧ−３’（配列番号１９）；リバースプライマー：ＫＲＩＸ−１ ＪＨ配列の３’末端（大文字）に対応し、そしてＸｂａｌ制限部位（下線付き）を含有する５’−ｇａｔｃｔｃｔａｇａＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣ（配列番号２０）。

ＰＣＲ産物をアニーリングし、軽鎖のためのフォワードプライマー（配列番号１７）および重鎖のためのリバースプライマー（配列番号２０）を用いて第２回ＰＣＲを実施した。結果として生じたｓｃＦｖ−ＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨをｐＰＩＣＺａｌｐｈａＣ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ベルギー国メレルベーケ）内にクローニングした。
ピチア発現ベクター内でのＨｉｓ（６）タグを用いたｓｃＦｖ−ＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨのクローニング
ｐＰＩＣＺａｌｐｈａＣ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ベルギー国メレルベーケ）内に含まれるＨｉｓ（６）配列を用いてそれをフレーム内にクローニングするために、ＳａｌＩ制限部位をｓｃＦｖ−ＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨ配列内に付加した。これはフォワードプライマーを用いるＰＣＲによって得た：Ｋｒｉｘ−１ ＶＬ配列の５’末端（大文字）に対応し、そしてＸｈｏｌ制限部位（下線付き）およびＫＥＸ１配列（太字のイタリック）を含有する５’−ｇｔａｔｃｔｃｔｃｇａｇａａａａｇａＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣ−３’（配列番号２１）；およびリバースプライマー：ＫＲＩＸ−１ 重鎖ＪＨ配列の３’末端（大文字）に対応し、そしてＳａｌＩ制限部位（下線付き）を含有する５’−ｃａｔｇｇｔｃｇａｃＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣＣＣＧＧＣＣ−３’（配列番号２２）。

ｓｃＦｖ産生のためにＸ３３細胞を形質転換させるために最終ｐＰＩＣＺａｌｐｈａＣ−ｓｃＦｖ−ＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨ（Ｈｉｓ）ベクターを使用した。機能的ｓｃＦｖフラグメントの存在を証明するために上清を試験した。

ｓｃＦｖフラグメントはＨｉｓＴｒａｐキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、スウェーデン国ウプサラ）を用いて精製した。濃縮後、ｓｃＦｖＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨ（Ｈｉｓ）がＦＶＩＩＩ活性を阻害する能力を評価するために、ＦＶＩＩＩクロモジェニックアッセイにおいてｓｃＦｖＫＲＩＸ−１ ＶＬＶＨ（Ｈｉｓ）を試験した。ＦＶＩＩＩ阻害能力は、実施例１に記載の方法によってＢｅｔｈｅｓｄａアッセイにおいて評価し、図１４に示した。
ピチア発現ベクター内でのＨｉｓ（６）タグを用いたｓｃＦｖ−ＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨＱのクローニング
ｓｃＦｖ−ＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨＱ（Ｈｉｓ）は、Ａｓｎ４７−Ｔｈｒ４９でのＮ−結合グリコシル化部位を崩壊させるためにＡｓｎ４７がグルタミンに置換されている単一アミノ酸変化を結果として生じさせるｐＰＩＣＺａｌｐｈａＣ−ｓｃＦｖ−ＫＲＩＸ−１Ｖ
ＬＶＨ（Ｈｉｓ）上の部位指向突然変異誘発によって産生した。

これは、次の特異的ＰＣＲプライマーと組み合わせて部位指向突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州、ラ・ホーヤ）を使用して得た：
フォワードプライマー：２つの改変ヌクレオチド（ａからｃおよびｃからａ；太字のイタリック）を含有するＫＲＩＸ−１重鎖配列のｎｔ１１９から１６４（大文字）に対応する５’−ＣＣＴＧＣＡＡＧＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＡＣｃＡａＴＴＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＴＣＴＧＣＴＴＣＴＧＧ−３’（配列番号２３）；
リバースプライマー：２つの改変ヌクレオチド（ｇからｔおよびｔからｇ；太字のイタリック）を含有するＫＲＩＸ−１重鎖配列のｎｔ１１９から１６４（大文字）に対応する５’−ＣＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＴＡＧＣＣＧＧＴＧＡＡｔＴｇＧＴＡＴＣＣＡＧＡＧＧＴＣＴＴＧＣＡＧＧ−３’（配列番号２４）；
Ｈｉｓ（６）タグを備えるｓｃＦｖ−ＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨＱの全長配列は、配列番号２５および２６に記載した。
ＣＨＯ発現ベクター内でのＨｉｓ（６）タグを用いたｓｃＦｖ−ＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨおよびｓｃＦｖＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨＱ（Ｈｉｓ）のクローニング
ＫＲＩＸ−１軽鎖リーダー配列は、リーダー配列を含有するｐＣＲ４−ＫＲＩＸ−１ＬのＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐｓｔｌ制限フラグメントをＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐｓｔｌ消化ｐＰＩＣＺαＣ−ｓｃＦｖ−ＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨおよびｐＰＩＣＺαＣ−ＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨＱ各々の中にクローニングすることによってｐＰＩＣＺａｌｐｈａＣ−ｓｃＦｖ−ＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨ（Ｈｉｓ）およびｐＰＩＣＺａｌｐｈａＣ−ｓｃＦｖ−ＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨＱ（Ｈｉｓ）内へ挿入した。結果として生じたｓｃＦｖ配列は、次の特異的プライマーを使用するＰＣＲによってクローニングおよび発現目的のために適応させた：
フォワードプライマー：ＫＲＩＸ−１軽鎖配列の５’末端（大文字）に対応し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ部位（下線付き）およびＫｏｚａｋ配列（太字のイタリック）を含有する５’−ｃｃｃａａｇｃｔｔｇｃｃｇｃｃａｃｃＡＴＧＧＡＡＡＣＣＣＣＡＧＣＫＣＡＧＣＴＴＣ−３’（配列番号２７）；
リバースプライマー：ＫＲＩＸ−１重鎖ＪＨ配列の３’末端（大文字）に対応し、そしてＥｃｏＲ１部位（下線付き）、停止シグナル配列（太字のイタリック）およびＨｉｓ（６）タグ配列（イタリック）を含有する５’−ｃｃｇｇａａｔｔｃｔｃａａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣ−３’（配列番号２８）；
結果として生じたＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社、オランダ国ライデン）内にクローニングした。配列検証後に、ｓｃＦｖＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨ（Ｈｉｓ）およびｓｃＦｖ−ＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨＱ（Ｈｉｓ）をｐＥＥ１４．４ベクター（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社、ニューハンプシャー州ポーツマス）内にクローニングした。結果として生じたベクターは、トランスフェクション前にＳａｌＩを用いて直鎖状化した。

ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、ベルギー国ブルッセル）を製造業者の取扱説明書にしたがって用いてＣＫＯ−Ｋ１細胞の安定性トランスフェクションのために直鎖状ベクターを使用した。トランスフェクトした細胞は、選択のために１０％のＦＢＳ、ＧＳ補給剤（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カンザス州レネクサ）および５０μＭのＬ−メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ベルギー国ボーネン）を補給したグルタミン無含有ＤＭＥＭ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カンザス州レネクサ）中で培養した。

最高のプロデューサーは、ＧＳ補給剤およびＭＳＸを各濃度で補給した血清無含有培地（ＥＸ−ＣＥＬＬ ３０２血清無含有培地ｗ／ｏ Ｌ−グルタミン、ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カンザス州レネクサ）中で増殖させるためにＦＢＳを０％へ段階的に減
少させることによって適応させた。

実施例において記載したようにＦＶＩＩＩクロモジェニックアッセイにおいてｓｃＦｖ−ＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨ（Ｈｉｓ）およびｓｃＦｖ−ＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨＱ（Ｈｉｓ）の産生について上清をアッセイした。培養上清のＦＶＩＩＩ阻害能力は図１５に示した。

ヒトモノクローナル抗体ＲＨＤ５とＫＲＩＸ−１との間の競合
ヒトリンパ芽球様細胞株ＲＨＤ５は、（Ｊａｃｑｕｅｍｉｎら（１９９８）， Ｂｌｏｏｄ ９２，４９６−５０６）に記載された方法によってＦＶＩＩＩに対する自己免疫応答を発生した患者からのＢリンパ球の不死化に由来した。手短には、１０^７個の末梢血単核球を２ｍＬの培養培地中に再懸濁させ、２００μＬのエプスタイン・バーウイルス（Ｂ９５−８株）上清と一緒に３７℃で２時間インキュベートした。次に細胞はフィーダー細胞（７．０００ラッドを用いて照射された３Ｔ６−ＴＲＡＰ細胞）を含有する９６ウエルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ社）内に５，０００ｃｅｌｌｓ／ウエルで播種した。１５０μＬの培養上清は、新鮮培養培地と毎週取り替えた。６週間後、抗ＦＶＩＩＩ抗体の存在について酵素結合免疫吸着アッセイにおいて培養上清を試験した。陽性細胞株を２４ウエルプレートへ移し、直ちにフィーダー細胞を有していない９６ウエルプレート１枚につき６０ｃｅｌｌｓでクローニングした。ＲＨＤ５と呼ばれる抗体を産生する１個のクローンを選択した。

モノクローナル抗体ＲＨＤ５を産生するこの細胞株は、２００４年８月にＤ． Ｃｏｌｌｅｎ研究財団（Ｏｎｄｅｒｗｉｊｓ ＆ ｎａｖｏｒｓｉｎｇ、Ｂ−３０００ ベルギー国ルーベンＨｅｒｅｓｔｒａａｔ ４９、Ｃａｍｐｕｓ Ｇａｓｔｈｕｉｓｂｅｒｇ）を寄託者としてゲント大学Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｐａｒｋ ９２７， Ｂ−９０５２ Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ所在のＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ（Ｂｅｌｇｉａｎ Ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ／Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ ｖｏｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｅに寄託された（アクセッション番号ｘｘｘｘｘｘｘ）。

ＲＨＤ５をコードする再配列された免疫グロブリン遺伝子の配列解析は上述したＪａｃｑｕｅｍｉｎら、Ｂｌｏｏｄ １９９８に記載されたとおりに実施した。

ＲＨＤ５重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は配列番号２９から３２に列挙した。

培養上清中に存在する抗体は、ＨｉＴＲＡＰタンパク質Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）上への吸着によって精製した。

実施例１に記載したように、天然および脱グリコシル化ＫＲＩＸ−１の阻害活性をＢｅｔｈｅｓｄａアッセイにおいて評価した（Ｋａｓｐｅｒら（１９７５）、上記参照）。ＲＨＤ５は、試験した最高濃度までＦＶＩＩＩ活性を部分的にしか阻害しなかった。２００μｇ／ｍＬでの１容量の抗体またはコントロールバッファを１容量の血漿と混合することによって実施したＢｅｔｈｅｓｄａアッセイでは、残留ＦＶＩＩＩレベルは各々７．０±０．２および２５１．９±１８．８ｎｇ／ｍＬであった（３回の試験の平均ＳＤ）。このため１００μｇ／ｍＬのＲＨＤ５の最終濃度に到達したＦＶＩＩＩ活性の阻害は９７％であった。同様に、２００μｇ／ｍＬでの１容量の抗体またはコントロールバッファを１容量の全長組換えＦＶＩＩＩ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ社）と混合することによって実施したＢｅｔｈｅｓｄａアッセイでは、残留ＦＶＩＩＩレベルは各々８．０±０．２および３９９．７±１８．８ｎｇ／ｍＬであった（３回の試験の平均
ＳＤ）。このため１００μｇ／ｍＬのＲＨＤ５の最終濃度に到達したＦＶＩＩＩ活性の阻害は９８％であった。

ＫＲＩＸ−１がＦＶＩＩＩ結合に対してＲＨＤ５と競合する能力をＥＬＩＳＡにおいて試験した。ポリスチレン製マイクロタイトレーションプレートは、リン酸緩衝化生理食塩液（ＰＢＳ）中で２μｇ／ｍＬの５０μＬのＲＨＤ５と４℃で一晩インキュベートした。プレートはＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて４回洗浄した。Ｔｒｉｓ−ＢＳＡ−Ｔｗｅｅｎ中のビオチニル化組換えＦＶＩＩＩ（０．５μｇ／ｍＬ）は、ＲＨＤ５コーティングプレートへ添加する前に様々な濃度でＲＨＤ５もしくはＫｒｉｘ−１と混合した。

４℃での２時間のインキュベーション期間後、プレートを４回洗浄し、結合ビオチニル化ＦＶＩＩＩを１μｇ／ｍＬのアビジンペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ社）の添加によって検出した。室温での３０分間後、プレートを再び洗浄し、１００μＬのＯＰＤを補給した。結果として生じたＯＤは、Ｅｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｄｅｖｉｃｅｓ社、カリフォルニア州メンロパーク）内で４９０ｎｍで読み取った。

上記の実験で使用したビオチニル化ＦＶＩＩＩは、Ｈｅｐｅｓバッファ（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ８．５）中で透析した組換えＦＶＩＩＩ（１００μｇ／ｍＬ）を１μｇ／ｍＬのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ社）と一緒に室温で２時間インキュベートすることによって調製した。調製物を次にＨｅｐｅｓバッファに対して透析し、―８０℃で保存した。

図１６に示したように、Ｋｒｉｘ−１はＲＨＤ５へのＦＶＩＩＩ結合を完全に防止することができた。Ｋｒｉｘ−１とＲＨＤ５との間のこの競合は、実施例２におけるＫｒｉｘ−１およびＫｒｉｘ−１Ｑを混合することによって達成された様々な阻害活性に類似して、様々な比率での２種の抗体の混合がＣＨＯ−Ｋｒｉｘ−１（８５％）を用いて達成される阻害活性とＲＨＤ５（９７〜９８％）を用いて達成される阻害活性の間の範囲内の阻害活性を備える抗体混合物の産生を可能にする。同様に、ＲＨＤ５およびＫＲＩＸ−１Ｑの混合は、４５％から９８％の範囲内の極めて広範囲の阻害活性を備える抗体混合物の産生を可能にすると予想される。さらにまた、ＫＲＩＸ−１ＱのＦａｂフラグメントをＲＨＤ５を混合するステップは、２０％から９８％の範囲内のいっそうより広範囲の阻害性混合物さえ産生することを可能にすると予測できる。

ＦＶＩＩＩに対するまた別の阻害抗体の同定
本実施例では、Ｋｒｉｘ−１などの第１阻害抗体から出発して、Ｋｒｉｘ−１などの第１阻害抗体の結合と競合するという事実に基づいて追加の第２抗体を同定できる方法について記載する。好ましくは、この方法で同定した抗体は阻害性であり、さらにプラトー効果（ＦＶＩＩＩに比してモル過剰（５、１０、２０、５０、もしくは１００倍さえのモル過剰）での部分的阻害）を有する。以下に記載する方法は、Ｋｒｉｘ−１の代わりにＲＨＤ５を用いて同様に実施できる。

これは例えば、標識Ｋｒｉｘ−１（放射標識もしくはビオチンもしくは発色団を用いて標識された）が第ＶＩＩＩ因子へ結合させられるアッセイを用いて達成される。多数の特徴づけられていない抗体をそれらがＫｒｉｘ−１のＦＶＩＩＩへの結合を崩壊させる能力についてスクリーニングした。

あるいは、特徴づけられていない抗体が最初にマイクロタイタープレート上で不溶化されたＦＶＩＩＩと一緒にインキュベートされ、その後に標識Ｋｒｉｘ−１が添加されて、それのＦＶＩＩＩへの結合についてアッセイされた。あるいは、Ｋｒｉｘ−１および第２
抗体が一緒に混合され、その後にＫｒｉｘ−１のＦＶＩＩＩへの残留結合がアッセイされた。

これらのアッセイで使用したＫｒｉｘ−１は、グリコシル化、部分グリコシル化もしくは完全脱グリコシル化することができる（グリコシル化コンセンサス配列における必須位置での広範囲の酵素処理もしくは部位指向突然変異誘発）。これらのアッセイにおいて使用されるＫｒｉｘ−１は無傷、Ｆ（ａｂ）_２フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメント、ｓｃＦｖｓｃＦｖフラグメントまたはＦＶＩＩＩのＣ１ドメインに結合する能力を備えるＫｒｉｘ−１のまた別のフラグメントであってよい。

これらのアッセイを用いて、ＦＶＩＩＩのＣ１ドメインへのＫｒｉｘ−１の結合を損傷させる抗体を同定できる。この損傷は、Ｋｒｉｘ−１に対するなどのＣ１ドメイン内の同一エピトープに向けられた抗体、Ｃ１ドメイン内のＫｒｉｘ−１の１つであるまた別のエピトープに向けられた抗体、またはＣ１ドメインの外側にあるがＣ１ドメイン内のそのエピトープへのＫｒｉｘ−１抗体の結合と立体的に競合する抗体によって達成できる。この状況では、重度にグリコシル化されている無傷Ｋｒｉｘ−１が使用されるアッセイは、Ｋｒｉｘ−１もしくは脱グリコシル化Ｋｒｉｘ−１のフラグメントよりＫｒｉｘ−１干渉抗体を生成する可能性が高いと思われる。

抗体についてのスクリーニングは、まず最初にヒトＦＶＩＩＩへ結合する、そしてより詳細には第ＶＩＩＩ因子のＣ１ドメインへ結合するｓｃＦｖフラグメントについてのｓｃＦｖライブラリーをスクリーニングすることによって開始できる。この技術については、抗体フラグメントは抗体遺伝子をコードする線維状ファージの表面上に提示されている（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．
２２７， ３８１−３８８；Ｖａｕｇｈａｎら（１９９６）， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４， ３０９−３１４；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９２）， Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ． ３， ８５３−８６０；Ｎｉｓｓｉｍら（１９９４）， ＥＭＢＯ Ｊ． １３， ６９２−６９８；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９４）， ＥＭＢＯ Ｊ． １２， ７２５−７３４）。可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）免疫グロブリンライブラリーはファージ内で開発されてきた。これらのファージは、抗体をパニングするステップによって選択できる。コードされた抗体フラグメントは、次に感染した細菌からの可溶性フラグメントとして分泌させることができる。ファージ上の抗体のこの提示および抗原を用いた選択は免疫選択を模倣しており、単一ファージライブラリーから出発する免疫を行わずに抗体を作製するために使用できる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２２７， ３８１−３８８）。ヒト合成ＶＨおよびＶｓｃＦｖライブラリーはｌｏｘライブラリーベクターからの重鎖および軽鎖可変領域を再クローニングすることによって作製したが、このとき重鎖および軽鎖Ｖ遺伝子は無作為にシャッフリングし、線維状ファージの表面上のＦｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントとしての提示についてファージミドベクターｐＨＥＮ２内へクローニングした（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９４）， ＥＭＢＯ Ｊ． １２， ７２５−３４）Ｄｒ．Ｇ． Ｗｉｎｔｅｒのタンパク質エンジニアリングセンター、ＬＭＢ−ＭＲＣ、英国ケンブリッジ］）。

そのようなライブラリーを用いると、Ｋｒｉｘ−１などの抗体のＦＶＩＩへの結合と競合する抗体フラグメントを同定できる。その後、これらのフラグメントをそれらがＦＶＩＩＩへ結合する親和性について、引き続いてそれらがＦＶＩＩＩ活性を阻害する能力およびモル過剰でＦＶＩＩＩ活性を阻害するプラトー効果の存在についてスクリーニングすることができる。フラグメントのサイズを考慮に入れると、これらのフラグメントのサイズを拡大すると、これらのｓｃＦｖフラグメントを完全抗体内へクローニングすることによって、上昇した阻害活性を生じさせることが想定されている。本発明によると、新しく同
定されたｓｃＦｖフラグメントおよび対応する抗体のグリコシル化もまた、本発明に記載した技術を用いて修飾することができる。

あるいは、血友病患者から単離された抗体またはより一般的にはいずれか存在する抗体をＫｒｉｘ−１もしくはＲＨＤ５などの抗体と競合する能力についてアッセイできる。

上述したアッセイを用いて得られている抗体もしくはフラグメントは、ＦＶＩＩＩ活性へのそれらの阻害効果および／またはＦＶＩＩＩおよび例えばｖＷＦとの複合体を崩壊させるそれらの能力について試験される。さらに、阻害抗体もしくはフラグメントは、次に生理学的過剰での部分的ＦＶＩＩＩ阻害の存在（「プラトー効果」）についてスクリーニングされる。

Ｋｒｉｘ−１結合と競合するいずれかの第２抗体は、第２抗体が阻害活性を有していない、またはＫｒｉｘ−１より低いプラトー効果を有している場合は、Ｋｒｉｘ−１より低いＦＶＩＩＩ活性阻害を得るために、天然Ｋｒｉｘ−１もしくはＫｒｉｘ−１の天然フラグメント、または修飾されたグリコシル化を備えるＫｒｉｘ−１もしくはフラグメントとの混合物中に使用できる。あるいは天然Ｋｒｉｘ−１もしくはＫｒｉｘ−１の天然フラグメント、またはＫｒｉｘ−１もしくは修飾されたグリコシル化を備えるフラグメントと第２抗体との混合物は、第２抗体が十分な阻害活性を有している、またはＫｒｉｘ−１より高いプラトー効果を有している場合は、Ｋｒｉｘ−１もしくはそのフラグメントより高いＦＶＩＩＩ活性阻害を生じさせる。同様に、これらの混合物中では、第２抗体はＦ（ａｂ）_２、Ｆａｂ、ｓｃＦｖもしくは他のフラグメントと置換できる、またはそのような第２抗体上で発生する場合は、可変領域内で修飾されたグリコシル化を有している可能性がある。

抗体の抗原結合部分において最も一般的に見いだされる二本鎖型構造の略図である。ＮｅｕＡｃ＝Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）；Ｇａｌ＝ガラクトース；ＧｌｃＮａｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミン；Ｍａｎ＝マンノース；Ｆｕｃ＝フコース；Ａｓｎ＝アスパラギン。 連続的酵素処理によるグリカンの除去の略図。シアル酸を除去するためには、天然ＩｇＧをシアリダーゼに曝露させる。シアル酸を除去すると、β−ガラクトシダーゼを用いた処理によってガラクトースを除去することができる。シアル酸およびガラクトースの除去後に、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼを用いた処理によってＮ−アセチルグルコサミンを分解することができる。マンノース残基は、次にα−マンノシダーゼを用いた処理によって除去できる。 本発明の１つの実施形態による、天然および脱グリコシル化ＫＲＩＸ−１の阻害活性を示している実験結果のグラフである。ＫＲＩＸ−１はＮ−グリコシダーゼ−Ｆを用いた処理によって脱グリコシル化した。天然（ＮＡＴ；黒塗り記号）および脱グリコシル化ＫＲＩＸ−１（ＤＥＧ；白抜き記号）の阻害活性を評価するために、様々な希釈率の１容量の抗体を１容量の正常ヒトプール血漿と混合し、３７℃で２時間インキュベートした。次に残留ＦＶＩＩＩ活性をクロモジェニックアッセイにおいて測定した。 本発明の１つの実施形態による、脱グリコシル化ＫＲＩＸ−１と天然ＫＲＩＸ−１を混合するステップがＦＶＩＩＩの最高「プラトー」阻害を減少させることを示している実験結果のグラフである。正常血漿を３７℃で２時間、様々な濃度のＫｒｉｘ−１、脱グリコシル化Ｋｒｉｘ−１、および４．５：１．５の天然対脱グリコシル化抗体の比率にある天然および脱グリコシル化Ｋｒｉｘ−１の混合物と一緒にインキュベートした。３７℃で２時間のインキュベーション期間後、残留ＦＶＩＩＩ活性をＦＶＩＩＩクロモジェニックアッセイにおいて測定した。 本発明の１つの実施形態による、血漿中のＦＶＩＩＩ活性に及ぼすＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１およびＫＲＩＸ−１の阻害活性を示している実験結果のグラフである。ヒト細胞株によって産生した抗体（ＫＲＩＸ−１）およびＣＨＯ内で産生した組換え抗体（ＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１）の阻害活性を評価するために、様々な希釈率の１容量の抗体を１容量の正常ヒトプール血漿と混合し、３７℃で２時間インキュベートした。次に残留ＦＶＩＩＩ活性をクロモジェニックアッセイにおいて測定した。 本発明の１つの実施形態による、マウスにおける大静脈血栓症に及ぼすＫＲＩＸ−１およびＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１の効果を示している実験結果のグラフである。１５０μｇのＫＲＩＸ−１およびＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１もしくは生理食塩液の皮下投与１６時間後に下大静脈内で血栓が誘導された。動物は４時間後に致死させた。腎臓下大静脈を通して０．５ｍｍの間隔をあけて５つの横断セグメントを、血栓が存在する場合は１，存在しない場合は０と記録し、このスコアを合計した。 本発明の１つの実施形態による、ＫＲＩＸ−１、ＣＨＯ−ｒｅｃ−ＫＲＩＸ−１が交配した雄性マウスＡＴ^ｍ／ｍにおける陰茎血栓症および持続勃起症から保護することを示している実験結果のグラフである。雄性マウスにはビヒクル（ＰＢＳ）、または１００μｇの抗体ｍＡｂ Ｋｒｉｘ−１もしくはｒｅｃ−ｍＡＢ Ｋｒｉｘ−１を交配の３日前および交配当日に２回皮下注射した。血栓性転帰は、８日間のフォローアップ期間終了時にマウスに血栓が見られない場合は０、持続勃起症を伴わない顕微的血栓症が観察された場合は１、持続勃起症を伴わない肉眼的血栓が発生した場合は２、そして雄性マウスが不可逆性持続勃起症を伴う重度血栓症を発生した場合は３とスコア付けした。（＃）ｍＡｂ Ｋｒｉｘ−１もしくはｒｅｃ−ｍＡｂ Ｋｒｉｘ−１処置群中の各１匹のマウスには実験の終了時に肉眼的血栓は見られなかったが、顕微鏡で分析することができなかったので、このため１とスコア付けした。 本発明の１つの実施形態による、ＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１および可変領域内のＮ−グリコシル化部位を伴う突然変異した抗体の阻害活性を示している実験結果のグラフである。抗体の阻害活性を評価するために、様々な希釈率の１容量の抗体を１容量の正常ヒトプール血漿と混合し、３７℃で２時間インキュベートした。次に残留ＦＶＩＩＩ活性をクロモジェニックアッセイにおいて測定した。 本発明の１つの実施形態による、ＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１およびＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１Ｑの阻害活性を示している実験結果のグラフである。抗体の阻害活性を評価するために、様々な希釈率の１容量の抗体を１容量の正常ヒトプール血漿と混合し、３７℃で２時間インキュベートした。次に残留ＦＶＩＩＩ活性をクロモジェニックアッセイにおいて測定した。 ヒヒにおける体外血栓症についての実験プロトコールを表している図である。動脈およびトロンボゲン形成装置。動静脈シャントを雄性ヒヒ大腿血管内に移植した。生理食塩液を充填したトロンボゲン形成装置が永続的動静脈シャント内への伸長セグメントとして組み込んだ。Ｓｉｌａｓｔｉｃ製チューブの壁の中にＤａｃｒｏｎを挿入することによって血小板依存性動脈血栓を誘導した。凝固依存性静脈血栓が膨張チャンバー内で生成された。ガンマシンチレーション・カメラを用いて自己由来放射標識血小板の沈着を追跡した。 本発明の１つの実施形態による、ＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１Ｑの投与前後の動脈および静脈血栓チャンバー内の血小板沈着の阻害を示している実験結果のグラフである。血小板沈着は、大腿血管間に移植された体外動静脈シャント内に組み込まれた膨張（「静脈」）血栓チャンバー（Ａ）およびＤａｃｒｏｎ（「動脈」）血栓チャンバー（Ｂ）内の時間の関数として記録した。コントロール試験では、装置は６０分間、またはカテーテルが閉塞するまでそのままで維持した。次に抗体の単回静脈内ボーラス投与によりヒヒを処置した。次に新しいトロンボゲン形成装置をボーラス注射後６０分間、１時間、２４時間にわたって配置した。次に、体外シャントを取り外した。 本発明の１つの実施形態による、ＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１Ｑが交配した雄性ＡＴ^ｍ／ｍマウスにおける陰茎血栓症および持続勃起症から保護することを示している実験結果のグラフである。雄性マウスにはビヒクル（ＰＢＳ）、または１００μｇの抗体ＣＨＯ−ｒｅｃＫＲＩＸ−１ＱもしくはコントロールＩｇＧ４ヒトモノクローナル抗体（ＩｇＧ４）を交配の３日前および交配当日に２回皮下注射した。血栓性転帰は、８日間のフォローアップ期間終了時にマウスに血栓が見られない場合は０、持続勃起症を伴わない顕微的血栓症が観察された場合は１、持続勃起症を伴わない肉眼的血栓が発生した場合は２、そして雄性マウスが不可逆性持続勃起症を伴う重度血栓症を発生した場合は３とスコア付けした。（＃）実験終了時に顕微的血栓症を有していないが顕微鏡で分析できなかった動物は１とスコア付けした。 本発明の１つの実施形態による、ＬＣＬ−ＫＲＩＸ−１およびＣＨＯ−ＫＲＩＸ−１の天然および脱グリコシル化Ｆａｂフラグメントの阻害活性を示している実験結果のグラフである。ＫＲＩＸ−１はＮ−グリコシダーゼ−Ｆを用いた処理によって脱グリコシル化し、そしてパパインを用いた消化によってＦａｂを生成した。天然および脱グリコシル化Ｆａｂの阻害活性を評価するために、様々な希釈率の１容量の抗体を１容量の正常ヒトプール血漿と混合し、３７℃で２時間インキュベートした。次に残留ＦＶＩＩＩ活性をクロモジェニックアッセイにおいて測定した。 本発明の１つの実施形態による、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ内で生成したＫＲＩＸ−１のｓｃＦｖフラグメント（ｓｃＦｖ−ＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨ（Ｈｉｓ））の阻害活性を示している実験結果のグラフである。ｓｃＦｖ−ＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨ（Ｈｉｓ）の阻害活性を評価するために、様々な濃度のｓｃＦｖＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨ（Ｈｉｓ）を含む１容量のバッファを１容量の正常ヒトプール血漿と混合し、３７℃で２時間インキュベートした。次に残留ＦＶＩＩＩ活性をクロモジェニックアッセイにおいて測定した。 本発明の１つの実施形態による、ＫＲＩＸ−１およびＫＲＩＸ−１ＱのｓｃＦｖフラグメントのＦＶＩＩＩ阻害活性を示している実験結果のグラフである。ＫＲＩＸ−１およびＫＲＩＸ−１ＱのｓｃＦｖフラグメントの阻害活性を評価するために、様々な希釈率のｓｃＦｖ−ＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨ（Ｈｉｓ）（白抜き記号）もしくはｓｃＦｖ−ＫＲＩＸ−１ＶＬＶＨＱ（Ｈｉｓ）（黒塗り記号）に対する発現ベクターを用いてトランスフェクトした１容量のＣＨＯ細胞の培養上清を１容量の正常ヒトプール血漿と混合し、３７℃で２時間インキュベートした。次に残留ＦＶＩＩＩ活性をクロモジェニックアッセイにおいて測定した。 Ｋｒｉｘ−１およびＲＨＤ５によるＲＨＤ５へのＦＶＩＩＩ結合の阻害を示している実験結果のグラフである。ＲＨＤ５塗布プレートへ添加する前に、ビオチニル化ｒＦＶＩＩＩを様々な濃度のＲＨＤ５（黒塗り記号）もしくはＫｒｉｘ−１（白抜き記号）と混合した。プレートを次に４℃で２時間インキュベートし、アビジンペルオキシダーゼおよびＯＰＤの添加によってＦＶＩＩＩの結合を検出した。 Ｋｒｉｘ−１可変重鎖および軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列である（グリコシル化コンセンサス部位のＡｓｎおよびＴｈｒ残基を星印で示した）。 Ｋｒｉｘ−１ＱのｓｃＦｖフラグメントのヌクレオチドおよびアミノ酸配列である。突然変異Ｇｌｎ４７残基を示した。 ＲＨＤ５可変重鎖および軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（推定グリコシル化コンセンサス部位のＡｓｎおよびＴｈｒ残基を星印で示した）。

Ｔｈｒ４９からＡｌａへの置換を備えており、ＣＨＯ細胞内で産生されたモノクローナル抗体ＫＲＩＸ−１抗体は、Ｔｈｒ４９Ａｌａ Ｋｒｉｘ−１もしくはＫｒｉｘ−１Ａと呼ばれている。

モノクローナル抗体ＲＨＤ５を産生するこの細胞株は、２００４年８月にＤ． Ｃｏｌｌｅｎ研究財団（Ｏｎｄｅｒｗｉｊｓ ＆ ｎａｖｏｒｓｉｎｇ、Ｂ−３０００ ベルギー国ルーベンＨｅｒｅｓｔｒａａｔ ４９、Ｃａｍｐｕｓ Ｇａｓｔｈｕｉｓｂｅｒｇ）を寄託者としてゲント大学Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｐａｒｋ ９２７， Ｂ−９０５２ Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ所在のＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ（Ｂｅｌｇｉａｎ Ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ／Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ ｖｏｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｅに寄託された（アクセッション番号ＬＭＢＰ６１６５ＣＢ）。

Claims (33)

1. ＦＶＩＩＩに対する阻害抗体の修飾された抗体であって、その可変領域のグリコシル化が修飾されていること、そしてそれが天然抗体と比較して実質的に同一の親和性を有することを特徴とする抗体もしくはそのフラグメント。
2. グリコシル化の前記修飾が、その可変領域内の保存されたＮ−グリコシル化コンセンサスパターンを備える抗体のグリコシル化を変調するステップによって得られる、請求項１に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
3. グリコシル化の前記修飾が、前記可変領域内のＮ−グリコシル化コンセンサス配列のアミノ酸配列を修飾するステップによって得られる、請求項１に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
4. グリコシル化の前記修飾が、前記抗体の可変領域内のグリコシル化コンセンサス配列の導入によって得られる、請求項１に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
5. ＦＶＩＩＩに対する前記阻害抗体がＫｒｉｘ−１である、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
6. 前記抗体の親和性が１ｎＭ未満である、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
7. ＫＲＩＸ−１ＱもしくはＫＲＩＸ−１Ａ、またはモノクローナル抗体ＫＲＩＸ−１ＱもしくはＫＲＩＸ−１ＡのｓｃＦｖフラグメント、ＦａｂフラグメントもしくはＦ（ａｂ’）_２フラグメントである、請求項５に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
8. ｓｃＦｖフラグメントが配列番号２６によって表される、請求項５に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
9. 配列番号２との少なくとも７０％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖を含む、請求項５に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
10. 配列番号１との少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる配列を含む免疫グロブリン重鎖を含む、請求項５に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
11. 配列番号４との少なくとも７０％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含む、請求項５に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
12. 配列番号３との少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含む、請求項５に記載の抗体もしくはそのフラグメント。
13. ＦＶＩＩＩに対する天然阻害抗体および請求項１から１２のいずれか一項に記載の修飾された抗体からなる群から選択される２つ以上の抗体もしくは抗体フラグメントの混合物。
14. 請求項１から１２のいずれか一項に記載の抗体または請求項１３に記載の混合物を含む医薬組成物。
15. 前記抗体が前記抗体によって認識される１種以上のリガンドの１つ以上の相互作用に及ぼす阻害効果を、前記リガンドと相互作用する他のタンパク質もしくは試薬を用いて修飾するために、前記抗体の抗原結合部位におけるグリコシル化部位を修飾もしくは導入するような方法で修飾された有効量の治療用モノクローナル抗体もしくはそのフラグメントを投与するステップを含む治療方法。
16. 外科的介入、固定または慢性遺伝性もしくは後天性栓友病に続発性の深部静脈血栓症および肺動脈塞栓症の予防、ならびに深部静脈血栓症、肺動脈塞栓症、脳梗塞、心房細動、非Ｑ波心筋梗塞、非ＳＴ上昇性心筋梗塞、不安定狭心症、敗血症もしくはＳＩＲＳの治療を含むがそれらに限定されない、有効量の請求項１から１２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体もしくはそのフラグメント、または請求項１３に記載の混合物を投与するステップを含む、血栓塞栓性障害を治療および予防するための方法。
17. 有効量の請求項１から１２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体もしくはそのフラグメント、または請求項１３に記載の混合物および同時に投与されるアスピリンなどの血小板凝集を阻害する１種以上の薬物を投与するステップを含む、血栓塞栓性障害を治療および予防するための方法。
18. 有効量の請求項１から１２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体もしくはそのフラグメント、または請求項１３に記載の混合物、および同時に投与されるアブシキシマブ（Ｒｈｅｏｐｒｏ（登録商標））もしくは抗血栓溶解薬（組織プラスミノーゲン活性化因子、スタフィロキナーゼもしくはマイクロプラスミンを含む）などの血小板凝集を阻害する１種以上の薬物を投与するステップを含む、急性心筋梗塞を治療するための方法。
19. 前記モノクローナル抗体がＫｒｉｘ−１に由来する抗凝固性モノクローナル抗体であり、抗原結合部位のＮ−グリコシル化部位において突然変異を有する、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 可変最高阻害活性および実質的に同一の活性を備える、第ＶＩＩＩ因子に対する少なくとも２つの阻害抗体からなるライブラリーを得るための方法であって、前記方法が、前記阻害抗体の可変領域内のグリコシル化を修飾するステップによってＦＶＩＩＩに対する阻害抗体もしくはそのフラグメントのサイズを修飾するステップと、およびそれに対する親和性が実質的に影響を受けていない少なくとも１つの抗体もしくはそのフラグメントを選択するステップと、を含む方法。
21. 前記方法が、ＦＶＩＩＩに対する阻害抗体もしくはそのフラグメントの可変領域内のグリコシル化を修飾するステップと、およびそれに対する親和性が実質的に影響を受けていない抗体を選択するステップと、を含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記第ＶＩＩＩ因子阻害抗体がＦＶＩＩＩのＣ１ドメインに対して向けられている、請求項２０もしくは２１に記載の方法。
23. 前記第ＶＩＩＩ因子阻害抗体がＫｒｉｘ−１である、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 請求項２０から２３に記載の方法によって得られた第ＶＩＩＩ因子阻害抗体のライブラリー。
25. 前記抗体もしくはそのフラグメントが飽和濃度でＦＶＩＩＩを２０から８５％阻害する
    ＦＶＩＩＩ阻害抗体もしくはそのフラグメントを産生するための方法であって：
    −無傷ＦＶＩＩＩ阻害抗体もしくはそのフラグメントを提供するステップと、および
    −翻訳後レベルで前記抗体もしくは抗体フラグメントのグリコシル化を修飾するステップ、または前記抗体の可変領域のグリコシル化コンセンサス配列内の必須アミノ酸を変化させるステップによって前記抗体もしくは抗体フラグメントのグリコシル化を修飾するステップと、を含む方法。
26. ＦＶＩＩＩ阻害抗体と競合する抗体を同定するための方法であって：
    −ＦＶＩＩＩもしくはＣ１ドメインを含むＦＶＩＩＩのフラグメントを第１阻害抗体および候補阻害抗体と接触させるステップと、および
    −前記候補抗体がＦＶＩＩＩ阻害抗体の前記ＦＶＩＩＩもしくはＦＶＩＩＩのフラグメントへの結合に競合する能力をアッセイするステップと、を含む方法。
27. 前記第１阻害抗体がＫｒｉｘ−１である、請求項２６に記載の方法。
28. 前記第２抗体がＦＶＩＩＩ活性を阻害する能力を決定するステップをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
29. 前記第２抗体がモル過剰で存在する場合に、前記第２抗体のＦＶＩＩＩ活性に及ぼす部分的阻害効果の存在を決定するステップをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
30. 請求項２６から２９のいずれか一項に記載の方法によって得られる、Ｋｒｉｘ−１もしくはその誘導体のＦＶＩＩＩへの結合に競合する、ＦＶＩＩＩに対する精製された抗体。
31. ＦＶＩＩＩ活性に対して阻害性である、請求項３０に記載の精製された抗体。
32. ＦＶＩＩＩに比して抗体の混合物がたとえ過剰であっても、ＦＶＩＩＩ活性の所定の最高阻害を達成するために適切な比率で一緒に混合された、請求項３０もしくは３１に記載の１つ以上の精製された抗体もしくはその誘導体と、１つ以上のＫｒｉｘ−１抗体もしくはその誘導体との混合物。
33. 可変最高阻害活性および実質的に同一の活性を備える第ＶＩＩＩ因子に対する少なくとも２つの阻害抗体からなるライブラリーを得るための方法であって、前記方法が、前記阻害抗体の可変領域内のグリコシル化を修飾するステップおよび／または前記阻害抗体の抗体フラグメントを精製するステップとによってＦＶＩＩＩに対する阻害抗体もしくはそのフラグメントのサイズを修飾するステップと、それに対する親和性が実質的に影響を受けていない少なくとも１つの抗体もしくはそのフラグメントを選択するステップと、を含む方法。

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