NO305562B1

NO305562B1 - FremgangsmÕte for fremstilling av en plasminogenanalog, syntetisk eller rekombinant nukleinsyre som koder for den, vektorer som omfatter en slik nukleinsyresekvens, samt celler eller cellelinjer som kan fremstille plasminogenanalogen

Info

Publication number: NO305562B1
Application number: NO922238A
Authority: NO
Inventors: Keith Martyn Dawson; Richard Mark Edwards; Joan Mabel Forman
Original assignee: British Biotech Pharm
Priority date: 1989-12-07
Filing date: 1992-06-05
Publication date: 1999-06-21
Also published as: PT96103A; ZA909854B; CA2069085C; EP0502968A1; GB8927722D0; HU211628A9; FI105202B; WO1991009118A2; PT96103B; KR920703818A; ES2106073T3; GR3024990T3; IE81046B1; FI922610A; PT96104A; AU6965691A; EP0504241A1; IL96601A0; AU644399B2; NZ236330A

Description

Foreliggende oppfinnelse gjelder fremgangsmåte for fremstilling av en plasminogenanalog som er aktiverbar ved hjelp av et enzym som er involvert i blodkoagulasjon, slik at den får plasminaktivitet. Den gjelder også syntetiske eller rekombinante nukleinsyrer (DNA og RNA) som koder for en slik plasminogen-analog, samt vektorer som omfatter slike nuklein-syresekvenser, og celler eller cellelinjer som kan fremstille en slik plasminogenanalog.

Plasminogen er en nøkkelbestanddel i det fibrinolytiske system som er den naturlige motpart til koagulasjonssystemet i blodet. Under blodkoaguleringen er en kaskade av enzymaktiviteter involvert i dannelsen av et fibrinnettverk som danner skjelettet i et koagel eller en trombe. Degradering av fibrinnettverket (fibrinolyse) oppnås ved virkningen av enzymet plasmin. Plasminogen er den inaktive forgjenger for plasmin, og overføring av plasminogen til plasmin oppnås ved kløyving av peptidbindingen mellom arginin 561 og valin 562 i plasminogen. Under fysiologiske betingelser katalyseres denne kløyving av vevstypeplasminogenaktivator (tPA) eller av uro-kinasetypeplasminogenaktivator (uPA).

Dersom balansen mellom koagulasjonssystemet og det fibrinolytiske system forstyrres lokalt, kan intravaskulære koagler dannes på uegnede steder, noe som fører til tilstander som koronar trombose og myokardialt infarkt, dyp venetrombose, slag, perifer arteriell okklusjon og emboli. I slike tilstander har tilførsel av fibrinolytiske stoffer vist seg å være en gunstig terapi for å fremme oppløsning av koagler.

Fibrinolytisk terapi er blitt relativt vanlig ved tilgjengeligheten av en rekke plasminogenaktivatorer som tPA, uPA, streptokinase og det anisoylerte plasminogen-strepto-kinaseaktivatorkompleks APSAC. Hvert av disse stoffer har vist seg å fremme lysis av koagler, men alle har mangler i sine aktivitetsprofiler som gjør dem mindre godt egnet som tera-peutiske stoffer for behandling av trombose (se oversikt av Marder og Sherry, New England Journal of Medicine, 1989, 318:1513-1520). Ett av hovedproblemene med tPA for behandling av akutt myokardialt infarkt eller andre trombotiske forstyr-relser er at det lett fjernes fra sirkulasjonen med en plasma-halveringstid i mennesket på tilnærmet 5 minutter (Bounameaux et al. i "Contemporary Issues in Haemostasis and Thrombosis", bind 1, s. 5-91, 1985, Coilen et al., red. Churchill Living-stone). Dette medfører et behov for tilførsel av tPA ved infusjon i store doser. Behandlingen er følgelig dyr og for-sinkes, da pasienten må innlegges på sykehus før behandlingen kan fortsette. Urokinase, både i enkeltkjedet form (scuPA) eller i tokjedeform (tcuPA), fjernes tilsvarende raskt fra plasma og krever også tilførsel ved kontinuerlig infusjon.

Et hovedproblem som deles av alle disse stoffer er at de ved klinisk anvendelige doser ikke er trombespesifikke, siden de aktiverer plasminogen i det generelle kretsløp. Hovedvirkningen av dette er at proteiner som fibrinogen, som er involvert i blodkoagulasjonen, ødelegges, og farlige blød-ninger kan oppstå. Dette forekommer også med tPA trass i at tPA i fysiologiske konsentrasjoner bindes til fibrin og viser fibrinselektiv plasminogenaktivering.

En annen viktig mangel ved virkningen av eksisterende plasminogenaktivatorer er at reokklusjon av det reperfuserte blodkar ofte forekommer etter opphørt tilførsel av det trombo-lytiske stoff. Dette antas å skyldes gjenværende trombogent materiale på det sted hvor tromben er oppløst.

En alternativ vei for å oppnå økt fibrinolyse som er basert på bruk av molekyler som kan aktiveres så de får fibrinolytisk aktivitet, eller inhiberer koageldannelse, er nå blitt utformet. Aktiveringen (som kan involvere kløyving) kan katalyseres av ett eller flere endogene enzymer som er involvert i blodkoagulasjon. En fordel ved denne fremgangsmåten er at trombeselektivitet av fibrinolytisk aktivitet eller den koageldannelseshemmende aktivitet oppnås ved hjelp av den trombespesifikke lokalisering av de aktiverende enzymer.

Ifølge en første side ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en fremgangsmåte for fremstilling av en plasminogenanalog som er aktiverbar ved hjelp av et enzym som er involvert i blodkoagulasjon, valgt fra gruppen bestående av faktor Xa og thrombin (faktor Ila), hvor plasminogenanalogen har et kløyvingssete som kan kløyves av ett av de ovenfor nevnte enzymer slik at den får plasminaktivitet, og hvor plasminogenanalogen eventuelt inneholder en eller flere andre modifikasjoner (sammenlignet med villtype-Glu-plasminogen) som kan være en eller flere addisjoner, delesjoner eller substitusjoner. Fremgangsmåten er kjennetegnet ved at en vertscelle transfekteres eller transformeres med en ekspresjonsvektor som inneholder en DNA-sekvens som koder for plasminogenanalogen, cellen dyrkes under betingelser og i et egnet dyrkningsmedium som muliggjør ekspresjon av plasminogenanalogen, og plasminogenanalogen utvinnes fra dyrkningsmediet.

Analyse av villtypeplasminogenmolekylet har vist at det er et glykoprotein som består av et serinproteasedomene, fem "kringle"-domener og en N-terminal sekvens på 78 aminosyrer som kan fjernes ved kløyving med plasmin. Plasminkløy-ving medfører hydrolyse av Arg(68)-Met(69)-, Lys(77)-Lys(78 )-eller Lys(78)-Val(79)-bindinger slik at plasminogenformer med en N-terminal metionin-, lysin- eller valinrest, som alle vanligvis kalles Lys-plasminogen, dannes. Intakt plasminogen kalles Glu-plasminogen, da det har en N-terminal glutaminsyre-rest. Glykosylering foregår på rest Asn(289) og Thr(346), men glykosyleringsgraden og sammensetningen varierer, noe som fører til forekomsten av en rekke plasminogenformer med forskjellige molekylvekter i plasma. Serinproteasedomenet kan gjenkjennes ved dets homologi med andre serinproteaser, og er ved aktivering til plasmin det katalytisk aktive domene som er involvert i fibrindegradering. De fem "kringle"-domener er homologe til dem i andre plasmaproteiner, som tPA og protrombin, og er involvert i fibrinbinding og følgelig lokalisering av plasminogen og plasmin til tromber. Plasminogen er et zymogen som vanligvis sirkulerer i blodet som en enkelt polypep-tidkjede, og som overføres til det tokjedede enzym plasmin ved kløyving av en peptidbinding mellom aminosyre 561 (Arg) og 562 (Val). Denne kløyving katalyseres spesifikt av plasminogenaktivatorer som tPA og uPA. En oversikt over dette finnes i: Castellino, F.J., 1984, Seminars in Thrombosis and Haemostasis, 10: 18-23. I foreliggende spesifikasjon nummereres plasminogen ifølge proteinsekvensundersøkelsene til Sottrup-Jensen et al. (i: Atlas of Protein Sequence and Structure (Dayhoff, M.O., red.), 5. suppl., 3, s. 95 (1978)), som viste at plasminogen var et protein med 790 aminosyrer, og at kløy-vingssetet var peptidbindingen mellom Arg(560) og Val(561). Et egnet plasminogen-cDNA som kan anvendes i denne utførelse av oppfinnelsen, og som ble isolert av Forsgren et al. (FEBSLetters, 223, 254-260 (1987)), koder imidlertid for et protein med 791 aminosyrerester, med en ekstra Ile i posisjon 65. I denne spesifikasjon tilsvarer nummereringen av aminosyrene i plasminogen den til det benyttede cDNA. Det kan være polymor-fier i strukturen av plasminogen, og det kan være plasminogenformer i hvilke nummereringen av kløyvingssetet avviker, men det er hensikten at slike varianter skal omfattes i utførel-sen.

Begrepet "plasminogenanalog" som benyttet i denne spesifikasjon, betyr følgelig et molekyl som avviker fra villtypeplasminogen, og som har evnen til å kløyves eller på annet vis påvirkes slik at det dannes et molekyl med plasminaktivitet.

Halveringstiden i plasma av Glu-plasminogen er blitt målt til 2,2 dager, og den til Lys-plasminogen til 0,8 dager (Claeys, H. og Vermylen, J., 1974, Biochim; Biophys. Acta, 342: 351-359; Wallen, P. og Wiman, B. i: "Proteases and Biological Control", 291-303, Reich, E. et al., red., Cold Spring Harbor Laboratory).

Plasminogenanaloger som ligger innenfor denne ut-førelse av oppfinnelsen, har i tilstrekkelig grad bibeholdt den fibrinbindende aktivitet til villtypeplasminogen, men har endrede aktiveringskarakteristika; foretrukne plasminogenanaloger har en halveringstid i plasma som er minst like stor som den til villtypeplasminogen, men denne egenskap er ikke avgj ørende.

Blodkoagulasjonsmekanismen omfatter en serie med enzymreaksjoner som kulminerer i dannelsen av uløselig fibrin som danner det nettlignende proteinskjelett i blodkoagler.Trombin er enzymet som er ansvarlig for overføring av løselig fibrinogen til fibrin. Overføringen av protrombin, den inaktive forgjenger for trombin, til trombin katalyseres av aktivert faktor X (faktor Xa). (Trombin er også kjent som faktor Ila og protrombin som faktor II.)

Faktor Xa dannes fra faktor X på ekstrinsisk eller intrinsisk måte. I den ekstrinsiske vei aktiveres faktor VII til faktor Vila, som genererer faktor Xa fra faktor X. I den intrinsiske vei katalyseres aktiveringen av faktor X til faktor Xa av faktor IXa. Faktor IXa dannes fra faktor IX ved påvirkning av faktor Xla, som i sin tur dannes ved påvirkning av faktor Xlla på faktor XI. Faktor Xlla dannes fra faktor XII ved påvirkning av kallikrein. Faktorene Villa og Va antas å virke som kofaktorer i aktiveringen av henholdsvis faktor X og

II.

Når det dannes fra fibrinogen, er fibrin i løselig form. Løselig fibrin omdannes til uløselig fibrin ved påvirkning av faktor Xllla, som kryssbinder fibrinmolekyler.

Aktivert protein C er en serinprotease med antikoa-gulasjonsaktivitet som dannes i området for koageldannelse ved påvirkning av trombin sammen med trombomodulin på protein C. Aktivert protein C regulerer koageldannelse ved kløyving og inaktivering av de prokoagulante kofaktorer Va og VIIIa.

Begrepet "enzym involvert i blodkoagulasjon" som benyttet i denne spesifikasjon, omfatter følgelig faktor Xa og trombin (faktor Ila), som er direkte involvert i dannelsen av fibrin.

Dannelse og aktivitet av faktor Xa og trombin regule-res nøye for å sikre at trombedannelse begrenses til setet for den trombogene stimulus. Denne lokalisering oppnås ved den kombinerte virkning av i det minste to kontrollmekanismer: blodkoagulasjonsenzymene virker som komplekser som er nøye forbundet med fosfolipidcellemembranene i blodplater og endotelceller på vevsskadestedet (Mann, K.G., 1984, i "Progr-ess in Hemostasis and Thrombosis", 1-24, red. Spaet, T.H. Grune og Stratton); videre inaktiveres fritt trombin eller faktor Xa som frigjøres fra trombesetet inn i sirkulasjonen raskt grunnet virkningen av proteinaseinhibitorer som antitrombin III.

Aktiviteten av det nest siste (faktor Xa) og det siste (trombin) enzymet i koagulasjonskaskaden er således spesielt nøye lokalisert til setet for trombedannelse, og er av denne grunn foretrukne.

Trombin er blitt vist å forbli assosiert med tromber og å bindes ikke-kovalent til fibrin. Ved oppslutning av tromber med plasmin frigjøres aktivt trombin, som antas å bidra til den gjendannelse av tromber og reokklusjon av blodkar som ofte forekommer etter trombolytisk behandling med plasminogenaktivatorer (Bloom, A.L., 1962, Br. J. Haematol, 82, 129; Francis et al., 1983, J. Lab. Clin. Med., 202, 220; Mirshahi et al., 1989, Blood, 74, 1025).

Av disse grunner foretrekkes det i visse utførelser av oppfinnelsen å modifisere plasminogen eller en annen mulig aktiverbar proteinforbindelse, slik at den kan aktiveres avtrombin eller faktor Xa, slik at en foretrukket klasse av trombeselektive proteiner med fibrinolytisk aktivitet eller som hemmer koageldannelse, dannes. De mest foretrukne plasminogenanaloger bibeholder det opphavlige plasminogenmolekyls fordelaktige, lange halveringstid i plasma, og viser trombeselektivitet ved en kombinasjon av to mekanismer, nemlig fibrinbinding via "kringle"-domenene, og den nye egenskap at de kan overføres til trombin på steder hvor nye tromber dannes ved virkning av ett av enzymene som er involvert i trombe-dannelsen, og som fortrinnsvis er lokalisert der.

Faktor Xa (E.C.3.4.21.6) er en serinprotease som overfører humant protrombin til trombin ved selektiv kløyving avArg(273)-Thr(274)- og Arg(322)-Ile(323)-peptidbindingene (Mann et al., 1981, Methods in Enzymology, 80, 286-302). I humant protrombin ligger tripeptidet Ile-Glu-Gly foran Arg-(273)-Thr(274)-setet, mens tripeptidet Ile-Asp-Gly ligger foran Arg(322)-Ile(323)-setet. Strukturen som kreves for gjenkjenning av faktor Xa, synes å bestemmes av den lokale aminosyresekvens som ligger foran kløyvingssetet (Magnusson et al., 1975, i "Proteases and Biological Control", 123-149, red. Reich et al., Cold Spring Harbor Laboratory, New York). Spesi-fisiteten for Ile-Glu-Gly-Arg- og Ile-Asp-Gly-Arg-sekvensen er ikke absolutt, da faktor Xa er blitt vist å kløyve andre proteiner, f.eks. faktor VIII i posisjonene 336, 372, 1689 og 1721, hvor de foregående aminosyresekvenser avviker i vesentlig grad fra dette format (Eaton et al., 1986, Biochemistry, 25, 505-512). Da det viktigste naturlige substrat for faktor Xa er protrombin, er foretrukne gjenkjenningssekvenser dem i hvilke arginin og glysin besitter henholdsvis Pl- og P2-posi-sjonen, en sur rest (asparaginsyre eller glutaminsyre) besit ter P3-posisjonen, og isoleucin eller en annen liten, hydrofob rest (som alanin, valin, leucin eller metionin) besitter P4-posisjonen. Da faktor Xa kan kløyve sekvenser som avviker fra dette format, kan imidlertid andre sekvenser som kan kløyves av faktor Xa benyttes i oppfinnelsen, likeledes andre sekvenser som kan kløyves av andre enzymer i koagulasjonskaskaden.

Overføringen av plasminogen til plasmin ved tPA og uPA omfatter kløyving av peptidbindingen mellom arginin 561 og valin 562, slik at et protein med to disulfidforbundne kjeder med en aminoterminal valin på den lette (proteasedomenet) kjeden og en karboksyterminal arginin på den tunge kjeden dannes. Plasminogen kløyves og aktiveres ikke i vesentlig grad av trombin eller faktor Xa, og for å fremstille plasminogenanaloger som kan kløyves av disse foretrukne enzymer må kløy-vingssetet Pro(559), Gly(560), Arg(561), Val(562), som gjenkjennes av tPA og uPA, endres. For å fremstille plasminogenanaloger som kan kløyves av f.eks. faktor Xa må en aminosyresekvens som kan kløyves av faktor Xa substitueres inn i plasminogenmolekylet. Sekvensen Ile-Glu-Gly-Arg, som forekommer på ett av de steder i protrombin som kløyves av faktor Xa, kan være en slik sekvens. Andre muligheter ville være sekvenser eller etterligninger av sekvenser som kløyves av faktor Xa i andre proteiner eller peptider. En plasminogen-analog i hvilken Pro(558) er fjernet og erstattet med Ile-Glu, kan få Arg(561)-Val(562)-peptidbindingen (villtypeplasminogen-nummerering) kløyvd av faktor Xa slik at en plasminanalog med to disulfidforbundne kjeder med en aminoterminal valin på den lette (proteasedomenet) kjeden og en karboksyterminal arginin på den tunge kjeden dannes. DNA som koder for Ile-Glu-Gly-Arg-sekvensen som den karboksyterminale del av en kløyvbar linker som et hjelpemiddel for fremstilling av proteiner, beskrives i britisk patentsøknad GB-A-2160206, men bruk av en Ile-Glu-Gly-Arg- sekvens for å oppnå en endret aktiveringsprosess for et zymogen er ikke beskrevet i denne spesifikasjon.

Kløyving og aktivering av plasminogenvarianter ved hjelp av et enzym fra koagulasjonskaskaden, som trombin eller faktor Xa, kan måles på en rekke måter, f.eks. ved SDS-PAGE-analyse eller ved analyse av plasmindannelse ved bruk av S2251 kromogen analyse eller en fibringellysisanalyse.

Trombin (E.C.3.4.21.5) er en serinprotease som kata-lyserer proteolyse av en rekke proteiner, heriblant fibrinogen (A-a- og B-p-kjeder), faktor XIII, faktor V, faktor VII, faktor VIII, protein C og antitrombin III. Strukturen som kreves for trombingjenkjenning, synes delvis å bestemmes av den lokale aminosyresekvens rundt det kløyvbare sete, men bestemmes også i varierende grad av sekvens(er) fjernt fra det kløyvbare sete. I fibrinogen A-a-kjede er f.eks. restene P2 (Val), P9 (Phe) og P10 (Asp) essensielle for a-trombinkata-lysert kløyving av peptidbindingen mellom Arg(16) og Gly(17)

(Ni, F. et al., 1989, Biochemistry, 28, 3082-3094). Sammen-lignende undersøkelser av en rekke proteiner og peptider som kløyves av trombin, har ført til forslaget om at optimale kløyvingsseter for a-trombin kan ha strukturen (i) P4-P3-Pro-Arg-Pl'-P2', hvor P3 og P4 uavhengig av hverandre er en hydrofob aminosyre (som f.eks. valin), og Pl' og P2' uavhengig av hverandre er en ikke-sur aminosyre, f.eks. en hydrofob aminosyre som valin, eller (ii) P2-Arg-Pl', hvor P2 eller Pl' er glysin (Chang, J., 1985, Eur. J. Biochem., 151, 217-224). Det finnes imidlertid unntak fra disse generelle strukturer som kløyves av trombin og som kan benyttes i oppfinnelsen.

For fremstilling av en plasminogenanalog som kan kløyves og aktiveres av trombin, kan et sete som gjenkjennes og kløyves av trombin settes inn i plasminogenmolekylet på et passende sted. En aminosyresekvens som den som kløyves av trombin i fibrinogen A-a-kjede kan benyttes. Andre mulige sekvenser omfatter dem involvert i trombinkløyving av fibrinogen B-p, faktor XIII, faktor V, faktor VII, faktor VIII, protein C, antitrombin III og andre proteiner hvis kløyving katalyseres av trombin. Et eksempel på en trombinkløyvbar plasminogenanalog kan være en i hvilken sekvensen Pro(559), Gly(560) er endret til Gly(559), Pro(560), som gir sekvensen Gly(559)-Pro(560)-Arg(561)-Val(562), som er identisk med den som finnes i posisjoner 17-20 i fibrinogen A-a. Dette er ikke det viktigste trombinkløyvingssete i fibrinogen A-a, men trombin kan kløyve Arg(19)-Val(20)-peptidbindingen.

Slike subtile endringer er viktige dersom viktige egenskaper som full aktivitet og stabilitet skal bibeholdes i

det mutante derivat, noe som foretrekkes.

En foretrukket utførelse av oppfinnelsen gjelder plasminogenanaloger med enkle eller multiple aminosyresubsti-tusjoner, -addisjoner eller -delesjoner mellom restene Pro-(555) og Cys(566). Slike plasminogenanaloger kløyves av trombin, faktor Xa eller andre enzymer involvert i blodkoagulasjon, slik at plasminanaloger med fibrinolytisk aktivitet produseres.

Plasminogenanaloger fremstilt ifølge den foretrukne utførelse av oppfinnelsen kan inneholde andre modifikasjoner (sammenlignet med villtype-Glu-plasminogen), som kan være én eller flere addisjoner, delesjoner eller substitusjoner. Et eksempel på en slik modifikasjon kan være addisjon, fjerning, substitusjon eller endring av ett eller flere "kringle"-domener for å gi økt fibrinbindende aktivitet.

Et eksempel på en modifikasjon som involverer delesjon, kan være Lys-plasminogenvarianter av plasminogenanaloger i hvilke de aminoterminale 68, 77 eller 78 aminosyrer er blitt deletert. Slike varianter kan ha økt fibrinbindende aktivitet, som observert for Lys-plasminogen sammenlignet med villtype-Glu-plasminogen (Bok, R.A. og Mangel, W.F., 1985, Biochemistry 24, 3279-3286).

Plasmininhibitoren a-2-antiplasmin forekommer i blodet og blir innbygd i fibrinmatriksen i blodkoagler. Denne inhibitors rolle er å begrense plasminaktiviteten i koagelet og i sirkulasjonen. For de meget koagelselektive plasminogenanaloger fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan det være en fordel å innføre en mutasjon i serinproteasedomenet som forstyrrer plasmininhibitorbinding. Denne mutasjon kan være i en posisjon analog til den vist å hindre inhibitorbinding til vevsplasminogenaktivator (Madison, E.L. et al., 1989, Nature 339, 721-724).

Andre flermodifiserte plasminogenanaloger fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte én eller flere modifikasjoner for å hindre, redusere eller endre glykosyle-ringsmønstre. Plasminogenanaloger med slike modifikasjoner kan ha lengre halveringstid, redusert fjerning fra plasma og/eller høyere spesifikk aktivitet.

Plasminogenanalogene fremstilles altså i samsvar medforeliggende oppfinnelse ved bruk av rekombinant DNA-teknologi. DNA som koder for plasminogen, kan være fra en cDNA-eller genomisk klon, eller kan syntetiseres. Aminosyresubsti-tusjoner, -addisjoner eller -delesjoner innføres fortrinnsvis ved setespesifikk mutagenese. Egnede DNA-sekvenser som koder for Glu-plasminogen, Lys-plasminogen og plasminogenanaloger og andre forbindelser fremstilt innen oppfinnelsens område, kan erholdes ved fremgangsmåter velkjente for fagfolk innen genmanipulering. For flere proteiner, heriblant f.eks. vevsplasminogenaktivator, er det en rutinemessig fremgangsmåte å erholde rekombinant protein ved å sette den kodende sekvens inn i en ekspresjonsvektor og transfektere vektoren inn i en egnet vertscelle. En egnet vert kan være en bakterie som E. coil, en eukaryot mikroorganisme som gjær, eller en høyere eukaryot celle. Plasminogen er imidlertid uvanlig vanskelig å uttrykke, og flere mislykkede forsøk er blitt gjort på fremstilling av rekombinant plasminogen i pattedyrceller (Busby, S. et al., 1988, Fibrinolysis 2, suppl. 1, 64;Whitefleet-Smith et al., 1989, Arch. Bioc. Biop. 272, 390-399). Det kan være mulig å uttrykke plasminogen i E. coil, men proteinet ville produseres i en uløselig tilstand, og ville måtte renatureres. Tilfredsstillende renaturering ville være vanskelig med nåværende teknologi. Plasminogen er blitt uttrykt i insektceller ved hjelp av et baculovirusvektorinfisert cellesystem ved nivåer på 0,7-1,0 ug/10<6>celler (målt 66 timer etter infeksjon) (Whitefleet-Smith et al., ibid), men denne fremgangsmåten gir ikke en stabil cellelinje som produserer plasminogen, og mulige posttranslasjonelle modifikasjoner,f.eks. glykosylering, vil ikke nødvendigvis være autentiske.

Ifølge en andre side ved oppfinnelsen tilveiebringes syntetisk eller rekombinant nukleinsyre som koder for en plasminogenanalog fremstilt som beskrevet ovenfor.Nukleinsyren kan være RNA eller DNA. Foretrukne egenskaper for denne side av oppfinnelsen er som for den første side.

En fremgangsmåte for fremstilling av nukleinsyre i samsvar med den andre side av oppfinnelsen, omfatter sammenkobling av på hverandre følgende nukleotider og/eller

ligering av oligo- og/eller polynukleotider.

Rekombinant nukleinsyre i samsvar med den andre side ved oppfinnelsen kan være i form av en vektor, som f.eks. kan være et plasmid, et kosmid eller en fag. Vektoren kan være tilpasset transfeksjon eller transformasjon av prokaryote (f.eks. bakterielle) celler og/eller eukaryote (f.eks. gjær-eller pattedyr-)celler. En vektor vil omfatte et kloningssete og vanligvis minst ett markørgen. En ekspresjonsvektor vil ha en promoter operativt knyttet til sekvensen som skal settes inn i kloningssetet, og fortrinnsvis en sekvens som tillater proteinproduktet å utskilles. Ekspresjonsvektorer og klonings-vektorer (som ikke nødvendigvis må være i stand til ekspresjon) er omfattet i oppfinnelsens område.

Visse vektorer er spesielt anvendbare ved foreliggende oppfinnelse. Ifølge en tredje side ved oppfinnelsen tilveiebringes en vektor som omfatter en første nukleinsyresekvens som koder for en plasminogenanalog fremstilt ifølge krav 1 eller 2, operativt knyttet til en andre nukleinsyresekvens som inneholder en sterk promoter- og enhancersekvens avledet fra humant cytomegalovirus, en tredje nukleinsyresekvens som koder for en polyadenyleringssekvens avledet fra SV40, og en fjerde nukleinsyresekvens som koder for den selekterbare markør gpt uttrykt fra en SV40-promoter, og med ytterligere et SV40-polyadenyleringssignal i 3'-enden av sekvensen til den selekterbare markør, idet plasminogenanalogen er i stand til å bli uttrykt i en vertscelle som inneholder vektoren.

Det må forstås at begrepet "vektor" benyttes i denne spesifikasjon i en funksjonell betydning og ikke skal oppfat-tes som nødvendigvis begrenset til ett enkelt nukleinsyremolekyl. Således kan f.eks. den første, annen og tredje sekvens i vektoren definert ovenfor foreligge i et første nukleinsyremolekyl og den fjerde sekvens i et annet nukleinsyremolekyl.

Den selekterbare markør kan være enhver egnet markør, gpt-markøren er passende.

En slik vektor tillater ekspresjon av plasminogenanaloger (heriblant Glu-plasminogen og Lys-plasminogen) som ellers ville være vanskelig å uttrykke.

Denne side ved oppfinnelsen tilveiebringer konstruksjon av en vektor som er anvendelig for ekspresjon av fremmede gener og cDNA, og for fremstilling av heterologe proteiner i pattedyrceller. Den spesielle utførelse som eksemplifiseres, er fremstilling av stabile cellelinjer som kan uttrykke plasminogen og plasminogenanaloger i store mengder.

Ved bruk av en vektor, f.eks. som beskrevet ovenfor, uttrykkes og utskilles plasminogenanaloger ut i celledyr-kingsmediet i en biologisk aktiv form uten behov for ytterligere biologiske eller kjemiske fremgangsmåter. Egnede celler eller cellelinjer for transformasjon er fortrinnsvis pattedyrceller som vokser i kontinuerlig kultur og som kan transfekteres eller på annet vis transformeres ved gjengse teknikker. Eksempler på egnede celler omfatter "Chinese hamster ovary" (CHO)-celler, musemyelomcellelinjer som P3X63-Ag8.653, COS-celler, HeLa-celler, BHK-celler, melanomcelle-linjer som Bowes-cellelinjen, muse-L-celler, humane hepatom-cellelinjer som Hep G2, musefibroblaster og muse-NIH-3T3-celler.

Det synes som om bruk av CHO-celler som verter for ekspresjon av plasminogen og plasminogenanaloger er spesielt fordelaktig. Ifølge en fjerde side ved oppfinnelsen tilveiebringes følgelig en celle eller cellelinje som er i stand til å fremstille plasminogenanalogen fremstilt ifølge krav 1 eller 2, kjennetegnet ved at den er blitt fremstilt ved en fremgangsmåte som omfatter transformering eller transfektering av en celle eller cellelinje med nukleinsyre ifølge krav 3 eller en vektor ifølge krav 4. Transformasjon kan oppnås ved enhver passende fremgangsmåte, elektroporering foretrekkes.

Plasminogenanaloger fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan benyttes i farmasøytiske preparater for forebyggelse eller behandling av trombose og andre tilstander hvor det er ønskelig å oppnå lokal fibrinolytisk og/eller antikoagulant aktivitet. Slike tilstander omfatter myokardialt og cerebralt infarkt, arteriell og venøs trombose, tromboem-boli, postkirurgiske adhesjoner, tromboflebitt og diabetiske karsykdommer.

Et farmasøytisk preparat omfatter én eller flere forbindelser fremstilt i samsvar med den første side ved oppfinnelsen, og en farmasøytisk eller veterinærmedisinsk aksepterbar bærersubstans. Et slikt preparat kan tilpasses intravenøs tilførsel og kan således være sterilt. Eksempler på preparater omfatter preparater med steril(e) plasminogen-analog (er) i isotont, fysiologisk saltvann og/eller buffer. Preparatet kan omfatte et lokalt bedøvelsesmiddel for å lette injeksjonssmerten. Forbindelser fremstilt ifølge oppfinnelsen kan leveres i enhetsdoseform, f.eks. som et tørt pulver eller et vannfritt konsentrat i en hermetisk forseglet beholder, som en ampulle eller pute som angir mengden av protein. Når en forbindelse skal tilføres ved infusjon, kan den oppløses i en infusjonsflaske som inneholder sterilt vann for injeksjoner, saltvann eller en egnet buffer. Når den skal tilføres ved injeksjoner, kan den oppløses i en ampulle med vann for injeksjon, saltvann eller en egnet buffer. Det infiserbare eller injiserbare preparat kan tillages ved å blande bestanddelene før tilførsel. For bruk i lokalbehandling kan den fordeles i et egnet basisstoff.

Mengden av materialet som skal tilføres, vil avhenge av den påkrevde fibrinolyse eller hemming av koagulasjon, den ønskede virkningshastighet, plasseringen av tromboembolien og koagelets størrelse. Den nøyaktige dose som skal tilføres vil, grunnet naturen av den tilstand som forbindelser fremstilt ifølge oppfinnelsen er tiltenkt å behandle, avgjøres av legen. Som en rettesnor vil imidlertid en pasient som behandles for en moden trombe, generelt motta en daglig dose av en plasminogenanalog på fra 0,01 til 10 mg/kg kroppsvekt enten ved injeksjon i f.eks. opptil 5 doser eller ved infusjon.

Plasminogenanalogene kan således benyttes i en fremgangsmåte for behandling eller forebygging av trombose som omfatter tilførsel av en effektiv, ikke-giftig mengde av en forbindelse fremstilt ifølge oppfinnelsens første side.

De følgende figurer og eksempler på oppfinnelsen gis for å illustrere den. Eksemplene 1-3 beskriver ekspresjonsvektoren som benyttes for ekspresjon av plasminogen og plasminogenvarianter i høyere eukaryote celler. Påfølgende eksempler beskriver ekspresjon av plasminogen og plasminogenvarianter og deres egenskaper. Figurene som det vises til i eksemplene, kan beskrives som følger: Figur 1 viser konstruksjonen av pGWH;

figur 2 viser nukleotidsekvensen av Glu-plasminogen-cDNA og den utledede aminosyresekvens;

figur 3 viser et kart over ekspresjonsvektoren pGWHgPl;

figur 4 viser kløyvingssetesekvenser i faktor Xa-aktiverte plasminogenanaloger;

figur 5 viser kløyvingssetesekvenser i trombinakti-verte plasminogenanaloger;

figur 6 viser aktivering av X2 med faktor Xa og T2 med trombin på en fibrinagargel;

figur 7 viser aktivering av plasminogenmutantene X3, T13 og T19 med faktor Xa (for X3) eller trombin (for T13 og T19); X3 er behandlet i eksemplene 5 og 21, T3 er behandlet i eksemplene 13 og 24, og T19 er behandlet i eksemplene 16 og 26;

figur 8 viser aktivering av plasminogenmutant T19 (eksemplene 16 og 26) med trombin, som bestemt ved analyse av plasmin;

figur 9 viser en SDS-PAGE-gel som viser kløyving av X2 med faktor Xa og T2 med trombin; og

figur 10 viser kløyvingshastigheten av plasminogenmutant T19 (eksemplene 16 og 26) med trombin.

Eksempel 1

Plasmidet pSSl er en signalsekvensvektor som tilveiebringer et sekresjonssignal for ethvert gen som mangler en slik sekvens. pGWl er avledet fra denne vektor, og pGWH er en ekspresjonsvektor som inneholder en promoter.

Konstruksjon av pSSl

1. Plasmidet pUC18 (figur 1.1) ble benyttet som ut-gangspunkt for vektoren, da det inneholder både et E. coli-replikasjonsorigo som tillater produksjon av plasmid-DNA i E. coli og et ampicillinresistensgen som tillater seleksjon av plasmidet i E. coli (figur 1.1). (pUC18 er beskrevet i Gene, 19, 259-268 (1982) og Gene, 26, 101-106 (1983), og er deponert hos the American Type Culture Collection under deponerings-

betegnelsen ATCC 37253.) pUC18 inneholder også en polylinker i hvilken det syntetiske DNA ble innsatt, men denne polylinker har et EcoRI-sete som det var nødvendig å fjerne før innsetting av den syntetiske sekvens. Dette ble gjort ved kløyving av DNA med EcoRI og behandling med "mung bean"-nuklease, en enkelttrådet nuklease, og så religering av plasmid-DNA (figur 1.2). 2. Det modifiserte pUC18-DNA ble kuttet med ffindlll og BamHI. Inn i disse seter ble et syntetisk DNA-fragment:

3' (nedre tråd)) som inneholder en immunoglobulinsignalsekvens (Nature, 331, 173-175, Rogelj et al., 1988) samt en polylinker med en rekke restriksjonsenzymseter, og i tillegg et 237 bp stort Bc2l-BaznHI-fragment isolert fra SV40-DNA som inneholder et polyadenyleringssignal, ligert inn i en treveisreaksjon (figur 1.3). Polyadenyleringssignaler fra andre gener, f.eks. veksthormon fra storfe, kunne også benyttes i konstruksjon av denne vektor. Rester av pUCl8-ryggraden, nemlig Kpnl- og Smal-setene, var fortsatt til stede i dette konstrukt, disse seter ble følgelig fjernet ved kutting av plasmid-DNA med Kpnl og BamHI, fjerning av fragmentet og innsetting av en nedre tråd-linker (5'GATCCGTAC 3') som ødelegger Kpnl- og Smal-setene, men gjendanner BamHI-setet (figur 1.3).

3. For å gjøre denne vektor anvendbar for forbi-gående ekspresjon i COS-celler ble et syntetisk, 90 bp stort SV40-replikasjonsorigo (5'TATGAAGACGTCGCCTCCTCACTACTTCTGGAATA-GCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCCTCTGCATAAATAAAAAAAATTAGTCAGGG 3'

(øvre tråd), 5'CGCCCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCT-CGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCGACGTCTTCA 3' (nedre tråd)) ligert inn i NdeX- Narl-setene i pUC18, slik at det erstattet et 53 bp stort fragment (figur 1.4).

4. En syntetisk DNA-sekvens (5'AAGCGGCCGCGGCCATGCCG-GCCACTAGTCTCGAGTT 3' (øvre tråd); 5'AACTCGAGACTAGTGGCCGGCATGG-

CCGCGGCCGCTT 3' (nedre tråd)) som koder for seter for restrik-sjonsenzymer som kutter sjelden i pattedyrgenomet og som letter linearisering av plasmid-DNA før transfeksjon, ble ligert inn i plasmidet i Sspl-setet, slik at den promoterfrie vektor pSSl ble dannet (figur 1.5). 5.Nukleotidsekvensen av det fullstendige plasmid ble bekreftet.

Konstruksjon av pGWl

Mange cDNA eller gener som skal uttrykkes, har alle-rede en signalsekvens, pSSl ble følgelig modifisert ved å fjerne sekresjonssignalet. 6. DNA ble kuttet med Hindlll og Wrul, fragmentet fjernet, og en linker (5'AGCTTCCCGGGATAGGTACCTCG 3' (øvre tråd), 5'CGAGGTACCTATCCCGGGA 3' (nedre tråd)) som inneholder Hindlll-, Smal-, Kpnl- og Wrul-setene ble innsatt (figur 1.6). I tillegg til å fjerne signalsekvensen adderte dette to restriksjonsenzymseter til polylinkeren, noe som gjør den mer anvendbar. Denne promoterfrie vektor kalles pGWl, og dens korrekte sammensetning ble bekreftet ved nukleotidsekvensanalyse av det fullstendige plasmid.

Konstruksjon av pGWH

7. Plasmidet pSSl har ingen promoter- eller enhancersekvens. Denne kan enkelt innsettes ved å ligere passende DNA-fragmenter inn i polylinkeren, f.eks. i HindiII-setet. En promoter-/enhancersekvens som er egnet for bruk, er "immediate early" transskripsjonsreguleringsområdet i humant cytomegalovirus (HCMV) (Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81, 659-663, Thomsen et al., 1984), selv om andre regulatoriske områder kunne benyttes, f.eks. det lange terminale repeat fra Rous sarkomvirus (RSV LTR), tidlig eller sent promoter-/enhancerområde fra SV40, LTR fra musebrysttumorvirus ("mouse mammary tumour virus", MMTV) og metallotioneinpromoteren fra mus. Denne ble innsatt i pGWl i Hindlll-setet, og orienteringen ble kontrollert ved restriksjonsendonukleasekutting. Det 5' Hindlll-sete ble så deletert ved en partiell kutting med Hindlll, slik at bare det 5' sete ble kuttet. Dette sete ble så fjernet ved behandling med "mung bean"-nuklease og påfølgende religering, slik at pGWH ble dannet (figur 1.7). Den korrekte sammensetning av vektoren ble bekreftet ved nukleotidsekvensanalyse av det fullstendige plasmid. 8. Et DNA-fragment som omfatter det selekterbare markørgen gpt og tidlig promoter-/enhancersekvens og polyadenyleringssekvens fra SV40 ble klonet inn i vektorens BamHI-sete, slik at pGWHg ble dannet; dette fragment tillater seleksjon av celler som stabilt har integrert plasmid-DNA. Gener som koder for proteiner som gir resistens mot G418 eller hygromycin, eller en rekke forskjellige metabolske selek-sjoner, kunne også benyttes.

Dette spesielle ekspresjonssystem foretrekkes grunnet dets effektivitet, men dets bruk er ikke påtenkt å begrense foreliggende oppfinnelses område. I litteraturen er det beskrevet en rekke alternative fremgangsmåter for ekspresjon av gener i pattedyrceller, og slike ekspresjonssystemer er velkjent for fagfolk innen genmanipulering og er i det minste delvis blitt dokumentert av Gorman i "DNA Cloning, Vol. II: APractical Approach" (D.M. Glover, red. IRL Press, Oxford

(1985), s. 143-190).

Eksempel 2

Ekspresjon av Glu- plasminogen

Fremgangsmåter som kan benyttes for isolering av cDNA, er veldokumentert, og en fremgangsmåte som er blitt benyttet for isolering av plasminogen-cDNA, er oppsummert i følgende fremgangsmåte. Den humane plasminogen-cDNA er blitt klonet og sekvensert (Forsgren et al., FEBS Letters, 213, 254-260 (1987). 1. RNA ble fremstilt fra fersk human lever ved bruk av guanidintiocyanatmetoden (Chirgwin et al., Biochemistry, 10:5294 (1979)), og renset ved bruk av en oligo-dT-kolonne (Aviv og Leder, PNAS, 69:1408 (1972)). 2. cDNA-biblioteket ble fremstilt som beskrevet i Amershams protokoll ("cDNA Synthesis and Cloning System",Amersham International plc, 1985). Det dobbelttrådete cDNA ble ligert inn i en lambdavektor. 3. Plakk ble screenet for plasminogen-cDNA ved hyb-ridisering til nitrocellulosereplikater med<32>P-merkede oligo-nukleotidprober (17-merer), som representerer den 3' og den 5' ende av plasminogen, i en buffer som inneholder 6 x SSC (SSC er 150 mM NaCl, 15 mM natriumsitrat), 5 x Denhardts, 0,2 % SDS og 0,1 mg/ml laksemelke-DNA ved værelsestemperatur over natten. Filtrene ble vasket med 6 x SSC, 0,1 % SDS ved 47 °C. Positive plakk ble renset, utsatt for plasmidredding, og de pakkede rekombinante plasmidkloner eller deres subkloner sekvensert ved en modifikasjon av dideoksymetoden hvor dATP-5 '-a-[35S]-tiofosfat ble benyttet (se metodeseksjonen). Denne cDNA koder for et Glu-plasminogenprotein med 791 aminosyrer, som tilsvarer lengden av plasminogen, beskrevet av Forsgren et al. (iiid), og som inneholder en ekstra aminosyre (Ile65) sammenlignet med aminosyresekvensen bestemt ved proteinsekven-sering (Sottrup-Jensen et al., ibid). Nukleotidsekvensen av cDNA og den 791 aminosyrer lange sekvens av Glu-plasminogen er vist i figur 2.

Andre isoleringsfremgangsmåter kan benyttes, f.eks. kan mRNA isolert fra celler som produserer plasminogen fremstilles ved bruk av guanidintiocyanatmetoden (Chirgwin et al., Biochemistry, 10:5294 (1979)), og en komplementær første DNA-tråd syntetiseres med revers transskriptase. Polymerasekjede-reaksjonen (PCR) kan så benyttes for amplifisering av plas-minogensekvensen (Saiki, R. et al.. Science, 239, 487-491

(1988)). PCR-reaksjonen kan også benyttes for amplifisering av sekvensen fra DNA fremstilt fra et genomisk eller cDNA-biblio-tek som inneholder sekvenser som koder for plasminogen. Alter-nativt kan genet sammensettes med kjemisk syntetiserte oligo-nukleotider.

Det 2,5 kb store BalI- SphI-fragment fra Glu-plasminogen ble subklonet i polylinkeren i pUC18 i Smal- og Sphl-setene (figur 2). Plasminogen-cDNA ble så kuttet ut av pUC18 på et Kpnl-Sphl-fragment og ligert inn i vektoren pGWH, fremstilt som beskrevet i eksempel 1, i Kpnl- og EcoRI-setene med en EcoRI-Sphl-linker (5'AATTCCATG 3'), slik at pGWHP ble dannet. Transskripsjon gjennom plasminogen-cDNA kan således initieres ved HCMV-promoteren/enhanceren (figur 3). Den selek terbare markør gpt, uttrykt fra SV40-promoteren og med et polyadenyleringssignal i den 3' ende, ble klonet inn i BamHI-setet i pGWHP, slik at pGWHgPl ble dannet (figur 3), og orienteringen kontrollert ved restriksjonsenzymnukleasekutting.Plasmid-DNA ble ført inn i CHO-celler ved elektroporering ved 800 V og 25 uF, som beskrevet i metodeseksjonen nedenfor. Selektivt medium (250 pl/ml xantin, 5 ug/ml mykofenolsyre, 1 x hypoxantin-tymidin (HT)) ble tilsatt cellene 24 timer etter transfeksjonen og mediet byttet hver annen eller hver tredje dag. Skåler som gav gpt-resistente kolonier, ble screenet for plasminogenproduksjon ved bruk av en ELISA-analyse. Cellene som produserte de høyeste nivåer av antigen, ble reklonet og de beste produsenter oppskalert i flasker med nøye oppfølging av produksjonen. Nedfrosne lagersuspensjoner av alle disse cellelinjer ble fremstilt. Cellelinjene Cl.44 og Cl.75, som begge produserer Glu-plasminogen i en konsentrasjon på >3mg/l, ble oppskalert i "roller"-flasker for fremstilling av kondisjonert medium, fra hvilket plasminogenprotein ble renset ved bruk av lysin-"Sepharose 4B". (Ordet Sepharose er et varemerke. ) Det rensede plasminogen ble så analysert for dets evne til å kløyves til plasmin av tPA eller streptokinase ved bruk av fibrinagarkoagulasjonsanalysen. Kløyving av zymogenet ble også påvist ved bruk av SDS-PAGE (Nature, 227, 680, Laemmli, 1970).

Teknikkene for genmanipulering, ekspresjon og pro-teinrensing som benyttes i fremstillingen av dette villtypeplasminogen, så vel som dem benyttet i eksemplene med modifisert plasminogen som følger, er velkjent for fagfolk innen genmanipulering. En beskrivelse av de fleste av disse teknikker kan finnes i en av følgende laboratoriemanualer: "Molecular Cloning" av T. Maniatis, E.F. Fritsch og J. Sambrook, utgitt av Cold Spring Harbor Laboratory, box 100, New York, eller "Basic Methods in Molecular Biology" av L.G. Davis, M.D.Dibner og J.F. Battey, utgitt av Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York.

Ytterligere fremgangsmåter og modifiserte fremgangsmåter er beskrevet i detalj i metodeseksjonen nedenfor.

Eksempel 3

Konstruksjon og ekspresjon av XI

Plasminogenanaloger som er endret rundt Arg(561)-Val(562)-kløyvingssetet er blitt fremstilt for å modifisere setet og tillate gjenkjenning og kløyving av alternative enzymer. XI er en plasminogenanalog i hvilken aminosyrerestenPro(559) er erstattet med Ile og Glu (figur 4). Dette sete ble basert på et faktor Xa-kløyvbart sete i protrombin. Modifika-sjonsstrategien i dette eksempel var å subklone det 1,87 kb store Kpnl-HincII-fragment fra plasminogen-cDNA i en pUC18-vektor, inn i den enkelttrådete bakteriofag M13mpl8 for å for-enkle mutagenesen. Enkelttrådet templat ble fremstilt og muta-sjonene utført ved oligonukleotidstyrt "mismatch"-mutagenese. I dette tilfellet ble et 21 baser langt oligonukleotid (5'CCC-TTCCCTCGATACATTTCT 3') benyttet for å styre mutagenesen. Kloner som bar mutasjonen, ble identifisert ved sekvensering og deretter fullstendig sekvensert for å sikre at ingen annen mutasjon utilsiktet var blitt innført. Replikativ form(RF)-DNA ble så fremstilt, og mutasjonen ført inn i ekspresjonsvektoren som inneholder Glu-plasminogen (som beskrevet i eksempel 2) ved erstatning av villtype-Kpnl-EcoRV-fragmentet med det muterte fragment. pGWHg-plasmidet med det muterte plasminogen ble så linearisert med restriksjonsendonukleasen Noti og ført inn i CHO-celler ved elektroporering. Ekspresjonsprotokollen var den samme som beskrevet i eksempel 2. Cellelinjen benyttet for fremstilling av dette mutante protein er C7.9. Aktivering og kløyving av denne mutanten med renset faktor Xa ble under-søkt som beskrevet i eksemplene 20 og 29.

Eksempel 4

Konstruksjon og ekspresjon av X2

Fremgangsmåten i eksempel 3 ble generelt fulgt, bortsett fra at den benyttede primer var 22-meren (5'CCTTCCCTCGAT-GCCACATTTC 3'). Det resulterende muterte plasminogenderivat har følgende aminosyreendringer: Pro(559) til Gly, Gly(560) til Ile og addisjon av Glu og Gly foran Arg(561) (figur 4). Dette kløyvingssete er basert på et faktor Xa-kløyvbart sete i protrombin. Cellelinjen C8.24 ble oppskalert for fremstilling av dette mutante protein. Ellers ble fremgangsmåten i eksempel 3 generelt fulgt. Aktivering og kløyving av denne mutant ble undersøkt som beskrevet i eksemplene 20 og 27.

Eksempel 5

Konstruksjon og ekspresjon av X3

I X3 er Pro(559) blitt erstattet med Gly, Ala, Ile og Glu ved bruk av 48-meren (5'CCCCCCCACAACCCTTCCCTCTATTGCACCA-CATTTCTTCGGCTCCAC 3') (figur 4). Cellelinjen C37.4 er blitt benyttet for fremstilling av dette protein, som har et kløy-vingssete basert på et faktor Xa-kløyvbart sete i protrombin. Ellers er fremgangsmåten i eksempel 3 generelt blitt fulgt. Aktivering av denne mutant er beskrevet i eksempel 21 nedenfor.

Eksempel 6

Konstruksjon og ekspresjon av X5

I X5 er Pro(559) erstattet med Gly, Tyr, Ile og Asp ved bruk av en 48-mer (5' CCCCCCCACAACCCTTCCGTCTATGTAACCACATTT-CTTCGGCTCCAC 3') (figur 4). Cellelinjen C39.7 er blitt benyttet for fremstilling av dette protein, som har et kløyvings-sete basert på et faktor Xa-kløyvbart sete i protrombin. Ellers ble fremgangsmåten i eksempel 3 generelt fulgt. Aktivering av denne mutant er beskrevet i eksempel 21 nedenfor.

Eksempel 7

Konstruksjon og ekspresjon av X6

I tillegg til mutasjonen i X5 har X6 Val(561) erstattet med Ile (figur 4). Dette ble utført ved bruk av 52-meren

( 5'CACACCCCCCCACAATCCTTCCGTCTATGTAACCACATTTCTTCGGCTCCAC 3 ' ) .

Cellelinjen C36.1 er blitt benyttet for fremstilling av dette protein. Ellers ble fremgangsmåten i eksempel 3 generelt fulgt. Aktivering av denne mutant er beskrevet i eksempel 21 nedenfor.

Eksempel 8

Konstruksjon og ekspresjon av Tl

Tl er et plasminogenderivat i hvilket Pro(559) og Gly(560) har byttet plass, slik at Gly er i posisjon 559 og

Pro i posisjon 560 (figur 5). Dette kløyvingssete etterligner trombinkløyvingssetet ved Arg(19)-Val(20) i fibrinogen A-a-kjeden. Fremgangsmåten i eksempel 3 ble generelt fulgt, bortsett fra at den benyttede primer var 21-meren (5'CAACCCTTG-GACCACATTTCT 3'). Cellelinjen som produserer Tl-mutanten, er C6.23. Aktivering og kløyving av dette protein er beskrevet i eksemplene 22 og 28 nedenfor.

Eksempel 9

Konstruksjon og ekspresjon av T2

T2 er et plasminogenderivat som er endret relativt til villtypeplasminogen på samme måte som Tl, men en ekstra Gly-aminosyre er blitt innsatt mellom Gly(559) og Pro(560)

(figur 5). Fremgangsmåten i eksempel 3 ble generelt fulgt, bortsett fra at primeren som ble benyttet for fremstilling av denne mutant, er en 22-mer (5'ACCCTTGGACCACCACATTTCT 3'). Cellelinjen C5.16 ble benyttet til fremstilling av dette muterte protein. Aktivering og kløyving av denne mutant er vist i eksemplene 22 og 28 nedenfor.

Eksempel 10

Konstruksjon av T6

I T6-proteinet er det to seter hvor aminosyrene er endret. Aminosyrene Pro(559), Gly(560), Arg(561) og Val(562) er blitt erstattet med seks aminosyrer til å bli Gly(559), Val(560), Val(561), Pro(562), Arg(563) og Gly(564). I tillegg til disse endringer er Val(553), Lys(556) og Lys(567) blitt erstattet med henholdsvis Leu, Glu og Leu ved bruk av en 61-mer ( 5 ' GGGCCACACACCCCCCCACTCCCCTAGGCACAACTCCACATAGCTCCGGCTCCA-GTTGAGG 3') (figur 5). Denne modifisering er basert på et trombinkløyvingssete i faktor XIII. Cellelinjen C45.1 ble benyttet til fremstilling av dette protein. Ellers ble fremgangsmåten i eksempel 3 generelt fulgt. Aktivering og kløyving av dette protein er beskrevet i eksemplene 23 og 29 nedenfor.

Eksempel 11

Konstruksjon og ekspresjon av T7

Som en annen modifikasjon basert på et trombin-kløyvingssete i faktor XIII inneholder T7 det første sett med endringer beskrevet for T6, nemlig erstatningen av Pro(559), Gly(560), Arg(561) og Val(562) med seks aminosyrer til å bli Gly(559), Val(560), Val(561), Pro(562),Arg(563) og Gly(564). I tillegg er Val(553), Lys(556) og Lys(557) blitt erstattet med henholdsvis Leu, Gin og Leu ved bruk av 60-meren (5'GGCCA-CACACCCCCCCACTCCCCTAGGCACAACTCCACATAGTTGCGGCTCCAGTTGAGG 3')

(figur 5). Cellelinjen C26.5 ble benyttet til fremstilling av dette protein. Ellers ble fremgangsmåten i eksempel 3 generelt fulgt. Aktivering og kløyving av dette protein er beskrevet i eksemplene 23 og 29 nedenfor.

Eksempel 12

Konstruksjon og ekspresjon av T8

T8 er basert på trombinkløyvingssetet i faktor XIII, og i dette protein er Pro(559), Gly(560), Arg(561) og Val(562) blitt erstattet med Val, Glu, Leu, Gin, Gly, Val, Val, Pro, Arg, Gly ved bruk av en 61-mer (5'CACACACCCCCCCACTCCCCTAGGCAC-TACTCCTTGTAGTTCTACACATTTCTTCGGCTCC 3') (figur 5). Cellelinjen C34.5 er blitt benyttet til fremstilling av dette protein. Ellers ble fremgangsmåten i eksempel 3 generelt fulgt. Aktivering og kløyving av dette protein er beskrevet i eksemplene 23 og 29 nedenfor.

Eksempel 13

Konstruksjon og ekspresjon av T13

I plasminogenderivåtet T13 er de to aminosyrer Pro-(559) og Gly(560) blitt erstattet med de tre aminosyrene Val,

Val og Pro ved bruk av en 41-mer (5'CACCCCCCCACAACCCTAGGTACAA-CACATTTCTTCGGCTC 3') (figur 5). Cellelinjen C51.1 ble benyttet til fremstilling av dette protein. Ellers ble fremgangsmåten i eksempel 3 generelt fulgt. Aktivering og kløyving av dette

protein er beskrevet i eksemplene 24 og 29 nedenfor.

Eksempel 14

Konstruksjon og ekspresjon av T14

Plasminogenanalogen T14 har et trombinkløyvingssete basert på et sete som kløyves av trombin i kalsitonin. I denne mutant er aminosyrene Gly og Tyr innsatt mellom Cys(558) og Pro(559), og i tillegg er Gly(560) fjernet (figur 5). Disse mutasjoner ble utført ved bruk av en 41-mer (5'CACCCCCCCACAAC-CCTAGGGTATCCACATTTCTTCGGCT 3'). Cellelinjen som ble benyttet til fremstilling av dette protein, var C61.1. Ellers ble fremgangsmåten i eksempel 3 generelt fulgt.

Eksempel 15

Konstruksjon og ekspresjon av T17

Proteinet T17 har kløyvingssete basert på et sete som kløyves av trombin i kolecystokinin. Dette protein er Ser innsatt mellom Pro559 og Gly560, og ble fremstilt ved bruk av en 38-mer (5'CACCCCCCCACAACCCTTCCACTAGGACATTTCTTCGG 3') (figur 5). Cellelinjen C49.7 ble benyttet til fremstilling av dette protein. Ellers ble fremgangsmåten i eksempel 3 generelt fulgt. Aktivering og kløyving av dette protein er beskrevet i eksemplene 25 og 29 nedenfor.

Eksempel 16

Konstruksjon og ekspresjon av Tl9

Kløyvingssetet i dette protein er basert på et trombinkløyvingssete i faktor XIII. Denne mutant avviker fra T8 ved at Tl'-aminosyren er Val snarere enn Gly. Kløyving gir tokjedet T19-plasmin med en nativ lettkjedesekvens. I dette protein er Pro(559), Gly(560) og Arg(561) blitt erstattet med Val, Glu, Leu, Gin, Gly, Val, Val, Pro, Arg ved bruk av en 61-mer (5'CACACCCCCCCACAACCCTTGGGACTACTCCCTGCAATTCTACACATTTCTTCG-GCTCCAC 3') (figur 5). Cellelinjen C53.5 ble benyttet til fremstilling av dette protein. Ellers ble fremgangsmåten i eksempel 3 generelt fulgt. Aktivering og kløyvingsanalyse av dette protein er vist i eksemplene 26 og 29 nedenfor.

Eksempel 17

Konstruksjon og ekspresjon av T20

Kløyvingssetet i dette protein ligner det i T19, men den aminoterminale sekvens av plasminlettkjede som dannes ved kløyving har Val(562) og Val(563) deletert. I dette protein erPro(559), Gly(560), Arg(561), Val(562) og Val(563) blitt erstattet med Val, Glu, Leu, Gin, Gly, Val, Val, Pro, Arg ved bruk av en 58-mer (5'GGCCACACACCCCCCCCTTGGGACTACTCCCTGCAATTCT-ACACATTTCTTCGGCTCC 3') (figur 5). Cellelinjen C54.2 ble benyt tet til fremstilling av dette protein. Ellers ble fremgangsmåten i eksempel 3 generelt fulgt.

Eksempel 18

Konstruksjon og ekspresjon av T21

Denne mutant avviker fra T6 ved at Pl' -aminosyren er Val snarere enn Gly. Kløyving gir tokjedet T21-plasmin med en nativ lettkjedesekvens. cDNA som koder for dette protein, ble fremstilt ved bruk av T6-cDNA-templatet beskrevet i eksempel 10, og 23-meren (5'CACCCCCCCACTACCCTAGGCAC 3') (figur 5). Cellelinjen C55.9 er blitt benyttet til produksjon av dette protein. Ellers ble fremgangsmåten i eksempel 3 generelt fulgt.

Eksempel 19

Konstruksjon og ekspresjon av T22

Denne mutant avviker fra T7 ved at Pl'-aminosyren er Val snarere enn Gly. Kløyving gir tokjedet T22-plasmin med en nativ lettkjedesekvens (figur 5). cDNA som koder for dette protein, ble lagd ut fra T7-CDNA som beskrevet i eksempel 11, ved bruk av 21-meren beskrevet for T21. Cellelinjen C56.ll er blitt benyttet til fremstilling av dette protein. Ellers ble fremgangsmåten i eksempel 3 generelt fulgt.

Eksempel 20

Aktivering av XI og X2

Aktivering av XI- og X2-proteinene til plasmin ved faktor Xa ble undersøkt ved bruk av en fibrinlysisanalyse. Dannelse av plasmin påvises ved forekomst av en klaringssone som utvikles i en fibrinagarosegel, som beskrevet i metode 12.1 (se metodeseksjonen nedenfor). 25 pl uttak av renset mutant plasminogen (635 ug/ml) ble inkubert med 2,5 pl renset faktor Xa (0,35 pg) ved 37 °C. Dannelse av plasmin ble analysert ved tilsetning av 10 pl uttak fra inkubasjonen til brønner i en fibrinagargel. Prøver av mutert plasminogen inkubert med faktor Xa gav en klaringssone i gelen som ikke var til stede i kontrollprøver som ikke var blitt inkubert med faktor Xa. Aktivering av X2 til plasmin med faktor Xa er vist i figur 6.

Eksempel 21

Aktivering av X3, X5 og X6

Renset X3-protein ble analysert for aktivering ved bruk av en koblet kromogen analyse (se metode 12.3). Resul-tater av denne analyse er vist i figur 7, hvorøkningen i absorbans ved 405 nm med tiden viser at plasminaktivitet dannes ved inkubering av X3 med faktor Xa. Tilsvarende ble X5 og X6 vist å aktiveres ved inkubering med faktor Xa.

Eksempel 22

Aktivering av Tl og T2

De rensede mutante proteiner Tl og T2 ble analysert for aktivering som beskrevet i eksempel 20, bortsett fra at de mutante proteiner ble preinkubert med trombin (25 pl plasminogenmutant (120 pg/ml) ble inkubert med 2,5 pl trombin (0,69 enheter)), og brønnene i fibringelen ble forbehandlet med hirudin for å hemme mulig aktiverende effekt av det trombin som ble benyttet til fremstilling av gelen. Begge mutanter ble aktivert av trombin, da prøver inkubert med trombin gav klaringssoner i gelen. Klaringssoner ble ikke produsert av kontrollprøver som ikke var blitt inkubert med trombin. Resul-tatene for T2 er vist i figur 6.

Eksempel 23

Aktivering av T6, T7 og T8

.De mutante proteiner ble analysert for aktivering ved bruk av den koblede kromogene analyse (se metode 12.3). Denne analyse viste at T6, T7 og T8 ikke aktiveres av trombin (selv om de kløyves - se eksempel 29).

Eksempel 24

Aktivering av T13

Renset T13-protein ble analysert ved bruk av den koblede kromogene analyse, som beskrevet i eksempel 23. Resul-tater av denne analyse er vist i figur 6, hvor økningen i absorbans ved 405 nm med tiden viser at T13 aktiveres av trombin. Aktivering ble også påvist ved bruk av den direkte kromogene analyse, som beskrevet i eksempel 26.

Eksempel 25

Aktivering av Tl7

Renset Tl7-protein ble analysert ved bruk av den koblede kromogene analyse, som beskrevet i eksempel 23. Denne analyse viste at trombin aktiverer T17.

Eksempel 26

Aktivering av Tl9

Renset Tl9-protein ble analysert ved bruk av den koblede kromogene analyse, som beskrevet i eksempel 23. Resul-tatene av denne analyse er vist i figur 7, hvor økningen i absorbans ved 405 nm med tiden viser at T19 aktiveres av trombin.

Det mutante protein T19 ble også analysert ved bruk av en direkte kromogen analyse som tillater kvantitering av plasmin som dannes ved aktiveringen (se metode 12.2). Resul-tater av denne analyse er vist i figur 8, hvor dannelse av plasmin med tiden viser at T19 aktiveres av trombin.

Eksempel 27

Kløyving av X- mutanter

Prøver på 25 ug av X-plasminogenmutanter ble inkubert med 1,5 ug faktor Xa i 0,25 ml buffer og kløyvingsanalyse ut-ført som beskrevet i metode 11. Figur 9 viser at X2-plasminogenbåndet ved tilnærmet 92 kDa ble kløyvd, slik at et tung-kjedeplasminbånd ved tilnærmet 66 kDa ble dannet. Dette viser at den mutante aminosyresekvens som vi har innført, kløyves av faktor Xa, og at aktiveringen vist for X2 i eksempel 20 er et resultat av kløyving av plasminogenanalogen, slik at plasmin produseres.

Eksempel 28

Kløyving av Tl og T2

Kløyvingsanalyser av de rensede proteiner Tl og T2 ble utført som beskrevet i eksempel 27, bortsett fra at trombin (1,5 ug) ble benyttet i stedet for faktor Xa. Kløyving av T2 til plasmin med trombin er vist i figur 9, som bekrefter at aktiveringen vist i eksempel 24 er et resultat av trombin-kløyving.

Eksempel 29

Kløyving av T6.T7, T8, T13, T17 oa T19

Prøver med 12,5 ug plasminogenmutant ble inkubert med 2,8 ug trombin, som beskrevet i metode 11. Tidsforløpet for kløyving av plasminogenmutantene ble bestemt ved kvantitativ gelscanning, og tidspunktene for 50 % kløyving av T6, T7, T8,T13 ogT19 var henholdsvis 13, 40, 15, 70 og mindre enn

10 minutter, mens kløyvingstiden for T17 var tilnærmet

30 timer. Gelscanningsdata for kløyving av T19 (forsvinning av plasminogenbåndet) er vist i figur 10.

Eksempel 30

Konstruksjon av Lys- 3

Et cDNA som koder for et Lys-plasminogen i hvilket den native plasminogensignalsekvens ligger ved siden av Glu-(76)-resten, er blitt fremstilt ved delesjon av de 75 aminoterminale aminosyrer i Glu-plasminogen ved "loop out"-mutagenese med en 35 mer (5'CTGAGAGATACACTTTCTTTTCTCCTTGACCTGAT 3'). Ellers ble fremgangsmåten i eksempel 3 generelt fulgt.

Eksempel 31

Konstruksjon av Lys- 4

I dette Lys-plasminogen ble 77 aminosyrer mellom Gly-(19) i signalsekvensen og Lys(78) i Glu-plasminogen deletert ved "loop out"-mutagenese med en 29-mer (5'CTGAGAGATACACTTTTC-CTTGACCTGAT 3' ). Ellers ble fremgangsmåten i eksempel 3 generelt fulgt.

Eksempel 32

Konstruksjon av Lys- 5

I dette Lys-plasminogen ble 76 aminosyrer mellom Gly-(19) i signalsekvensen og Lys(77) i Glu-plasminogen deletert ved "loop out"-mutagenese med en 32-mer (5'CTGAGAGATACACTTTCT-TTCCTTGACCTGAT 3'). Ellers ble fremgangsmåten i eksempel 3 generelt fulgt.

Metoder

1) " Mung bean"- nukleasekutting

10 enheter "mung bean"-nuklease ble tilsatt tilnærmet 1 ug DNA som var blitt kuttet med et restriksjonsenzym, i en buffer som inneholder 30 mM NaOAc, pH 5,0, 100 mM NaCl, 2 mMZnCl og 10 % glyserol. "Mung bean"-nukleasen ble inkubert ved 37 °C i 30 minutter og inaktivert i 15 minutter ved 67 °C før fenolekstraksjon og etanolpresipitering.

2) Oligonukleotidsvntese

Oligonukleotidene ble syntetisert ved automatisert fosforamidittkjemi ved bruk av cyanetylfosforamiditter. Meto-dikken er nå vanlig brukt, og er blitt beskrevet (Beaucage, S.L. og Caruthers, M.H., Tetrahedron Letters, 24, 245 (1981), og Caruthers, M.H., Science, 230, 281-285 (1985)).

3 ) Rensing av oliqonukleotider

Oligonukleotidene ble avbeskyttet og fjernet fra CPG-støttemediet ved inkubering i konsentrert NH3. Typisk ble 50 mg CPG som var 1 mikromol oligonukleotid, avbeskyttet ved inkubering i 5 timer ved 70 °C i 600 pl konsentrert NH3. Supernatanten ble overført til et nytt rør og oligomeren felt med 3 volumer etanol. Etter sentrifugering ble bunnfallet tørket og resuspendert i 1 ml vann. Konsentrasjonen av råoligomer ble så bestemt ved måling av absorbansen ved 260 nm.

For gelrensing ble 10 optiske enheter av råoligo-nukleotidet tørket og resuspendert i 15 pl markørfargeløsning (90 % deionisert formamid, 10 mM tris, 10 mM borat, 1 mM EDTA, 0,1 % bromfenolblått). Prøvene ble oppvarmet ved 90 °C i 1 minutt og så satt på en 1,2 mm tykk, denaturerende poly-akrylamidgel med 1,6 mm brede brønner. Gelen ble fremstilt fra en løsning av 15 % akrylamid, 0,6 % bisakrylamid og 7 M urea i 1 x TBE og ble polymerisert med 0,1 % ammoniumpersulfat og 0,025 TEMED. Gelen ble prekjørt i 1 time. Prøvene ble kjørt ved 1500 volt i 4-5 timer. Båndene ble synliggjort ved UV-skygging og de som tilsvarte fullengdeproduktet kuttet ut og overført til mikroreagensrør. Oligomerene ble eluert fra gel-biten ved utvasking med AGEB (0,5 M ammoniumacetat, 0,01 M magnesiumacetat og 0,1 % SDS) over natten. AGEB-bufferen ble så overført til nye rør og oligomeren felt med 3 volumer etanol ved 70 °C i 15 minutter. Bunnfallet ble oppsamlet ved sentrifugering i en Eppendorf-mikrosentrifuge i 10 minutter, bunnfallet vasket i 80 % etanol, den rensede oligomer tørket, gjenoppløst i 1 ml vann og endelig filtrert gjennom et 0,45 pm mikrofilter. (Ordet Eppendorf er et varemerke.) Konsentrasjonen av renset produkt ble målt ved å bestemme absorbansen ved 260 nm.

4) Kinaserinq av oliqomerer

100 pmol oligomer ble tørket og resuspendert i 20 pl kinasebuffer (70 mM tris, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 0,2 mM spermidin, 0,5 mM ditiotreitol). 10 U T4-polynukleotidkinase ble tilsatt og blandingen inkubert ved 37 "C i 30 minutter. Kinasen ble så inaktivert ved oppvarming ved 70 °C i 10 minutter .

5) Dideoksvsekvenserinq

Den benyttede fremgangsmåte var vesentlig den som er beskrevet av Biggin, M.D., Gibson, T.J., Hong, G.F., P.N.A.S., 80, 3963-3965 (1983). Om nødvendig ble metoden modifisert til å tillate sekvensering av plasmid-DNA som beskrevet (Guo, L-H., Wu, R., Nucleic Acids Research, 12, 5521-5540 (1983).

6) Transformering

Transformering ble oppnådd ved gjengse fremgangsmåter. Stammen som ble benyttet som mottaker i kloningen med plasmidvektorer, var HW87, som har følgende genotype:

araD139(ara-leu)del7697 (lacIPOZY)del74 galU

galK hsdR rpsL srl recA56

RZ1032 er et E. coli-derivat som mangler to enzymer i DNA-metabolismen: (a) dUTPase (dut), som gir høy konsentrasjon av intracellulært dUTP, og (b) uracil N-glykosylase (ung), som er ansvarlig for fjerning av feilinkorporerte uraciler fra DNA (Kunkel et al., Methods in Enzymol., 254, 367-382 (1987)). Den viktigste fordelen er at disse mutasjoner gir høyere mutant-frekvens ved setedirigert mutagenese. RZ1032 har følgende genotype:

HfrKL16PO/45[lysA961-62], dutl, ungrl, thil,

re[A], Zbd-279::TnlO, supE44

JM103 er en vanlig benyttet mottakerstamme for mani-puleringer som omfatter M13-baserte vektorer.

7) Setediriqert mutagenese

Kinasert mutageneseprimer (2,5 pmol) ble annealet til det enkelttrådete templat-DNA som var fremstilt med RZ1032 som vert (1 ug), i en reaksjonsblanding med sluttvolum 10 ul som inneholdt 70 mM tris, 10 mM MgCl2. Reaksjonsblandingen i et polypropylenmikrosentrifugerør (Eppendorf) ble plassert i et begerglass med 250 ml vann ved 70 °C i 3 minutter, fulgt av 37 "C i 30 minutter. Den annealte blanding ble så plassert på is og følgende reagenser tilsatt: 1 ul 10 x TM (700 mM tris, 100 mM MgCl2, pH 7,6), 1 ul av en blanding av de fire deoksy-ribonukleotidtrifosfater, hvert ved 5 mM, 2 pl T4-DNA-ligase (100 U), 0,5 pl Klenow-fragment av DNA-polymerase og 4,5 pl vann. Polymerasereaksjonsblandingen ble så inkubert ved 15 °C 1 4-16 timer. Etter at reaksjonen var fullført ble 180 pl TE (10 mM tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) tilsatt, og mutageneseblandingen ble lagret ved -20 °C.

For isolering av mutante kloner ble blandingen så transformert inn i mottakeren JM103 som følger: En 5 ml overnattskultur av JM103 i 2 x YT (1,6 % Bactotrypton, 1 % gjær-ekstrakt, 1 % NaCl) ble fortynnet 1 til 100 i 50 ml forvarmet 2 x YT. Kulturen ble dyrket ved 37 °C med luftgjennomstrømning til A600nådde 0,4. Cellene ble nedsentrifugert og resuspendert i 0,5 volumer 50 mM CaCl2og lagret på is i 15 minutter. Cellene ble så nedsentrifugert ved 4 °C og resuspendert i 2,5 ml kaldt 50 mM CaCl2. For transfeksjonen ble 0,25, 1, 2, 5, 20 og 50 pl uttak av mutageneseblandingen tilsatt 200 pl kompetente celler, som ble holdt på is i 30 minutter. Cellene fikk så et varmesjokk ved 42 °C i 2 minutter. Til hvert rør ble så tilsatt 3,5 ml YT softågar med 0,2 ml av en JM103-kultur fra sen eksponentiell fase, det ble blandet raskt og så helt ut på overflaten av en forvarmet skål med 2 x YT med 1,5 % agar. Softagarlaget fikk stivne, og skålene ble inkubert ved 37 °C

over natten.

Enkelttrådet DNA ble så fremstilt fra isolerte kloner som følger: Enkle plakk ble plukket i 4 ml 2 x YT som var blitt tilsatt 10 ul av en fersk overnattskultur av JM103 i 2 x YT. Kulturen ble ristet kraftig i 6 timer. 0,5 ml av kulturen ble så fjernet og tilsatt 0,5 ml 50 % glyserol for å gi en referansekultur som ble lagret ved -20 °C. Den gjenværende kultur ble sentrifugert for å fjerne cellene, og 1 ml super-natant med fagpartikler ble overført til et nytt Eppendorf-rør. 250 ul 20 % PEG6000, 250 mM NaCl ble så tilsatt, blandet og rørene inkubert på is i 15 minutter. Bakteriofagen ble så nedsentrifugert ved 10.000 rpm i 10 minutter, supernatanten fjernet og rørene sentrifugert på ny for å oppsamle de siste spor av PEG-løsning, som så kunne fjernes. Den nedsentri-fugerte fag ble grundig resuspendert i 200 yl TEN (10 mM tris, 1 mM EDTA, 0,3 M NaOAc). DNA ble isolert ved ekstraksjon med et volum tris-mettet fenol. Fasene ble separert ved en rask sentrifugering og vannfasen overført til et rent rør. DNA ble reekstrahert med en blanding av 100 ul fenol, 100 ul kloroform, og fasene igjen separert ved sentrifugering. Fenolspor ble fjernet ved tre på hverandre følgende ekstraksjoner med kloroform, og DNA endelig isolert ved felling med 2,5 volumer etanol ved -20 °C over natten. DNA ble nedsentrifugert ved 10.000 rpm i 10 minutter, vasket med 70 % etanol, tørket og endelig resuspendert i 50 pl TE.

8) Elektroporerinq

"Chinese hamster ovary" (CHO)-celler eller musemye-lomcellelinjen p3x63-Ag8.653 ble dyrket og høstet midt i den logaritmiske vekstfase. Cellene ble vasket og resuspendert i PBS, og antall levende celler ble målt. Cellene ble så nedsentrifugert og resuspendert ved 1 x IO<7>celler/ml. 40 ul linearisert DNA ble tilsatt 1 ml celler og satt på is i 15 minutter. En puls på 800 V/25 uF ble tilført cellene ved bruk av et kommersielt tilgjengelig elektroporeringsapparat (BIORAD GENE PULSER - varemerke.) Cellene ble inkubert på is i ytterligere 15 minutter og så utsådd enten i 10 x 96-brønners plater med 200 ul kondisjonert medium pr. brønn (DMEM, 5 % FCS, Pen/ Strep, glutamin) eller 10 x 15 cm skåler med 15 ml medium i

hver skål, og inkubert over natten. Etter 24 timer ble mediet fjernet og erstattet med selektivt medium som inneholdt xantin (250 ug/ml), mykofenolsyre (5 ug/ml) og 1 x hypoxantin-tymidin (HT). Mediet ble skiftet hver tredje dag.

Etter tilnærmet 14 dager kan gpt-resistente kolonier ses i noen av brønnene og på skålene. Skålene ble screenet for plasminogen ved å ta et uttak av medium fra hver brønn eller plate og analysere med en ELISA-analyse. Kloner som produserte plasminogen, ble oppskalert og ekspresjonsnivået målt for å tillate valg av den beste produsent.

9) ELISA for humant plasminogen

ELISA-skåler (Pro-Bind, Falcon) belegges med 50 ul/ brønn av antihumant plasminogenserum fra geit (Sigma) fortynnet 1:1000 med beleggingsbuffer (4,0 g Na2C03(10-H20),

2,93 g NaHC03pr. liter H20, pH 9,6) og inkubert over natten ved 4 °C. Beleggingsløsningen fjernes så, og platene blokkeres ved inkubasjon med 50 pl/brønn av PBS/0,1 % kasein ved værelsestemperatur i 15 minutter. Skålene vaskes så tre ganger med PBS/0,05 % Tween 20. Plasminogenprøver eller standarder fortynnet med PBS/Tween tilsettes skålen og inkuberes ved værelsestemperatur i 2 timer. Skålene vaskes så tre ganger med PBS/Tween, hvoretter 50 ul/brønn av en 1:1000 fortynning i PBS/Tween av et monoklonalt antistoff mot humant plasminogen (American Diagnostica, New York, USA) tilsettes og inkuberes ved værelsestemperatur i 1 time. Skålene vaskes på ny tre ganger med PBS/Tween, hvoretter 50 ul/brønn med pepperrot-peroksidasekonjugert antimuse-IgG fra geit (Sigma) tilsettes og inkuberes ved værelsestemperatur i 1 time. Skålene vaskes fem ganger med PBS/Tween og inkuberes så med 100 pl/brønn av peroksidasesubstrat (0,1 M natriumacetat/sitronsyrebuffer, pH 6,0, med 100 mg/l 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin og 13 mM H202. Reaksjonen stoppes etter tilnærmet 5 minutter ved tilsetning av 25 pl/brønn 2,5 M svovelsyre, og absorpsjonen ved 450 nm måles på en plateleser.

10) Rensing av plasminogenvarianter

Plasminogenvarianter renses i ett enkelt trinn ved kromatografi på lysin-"Sepharose 4B" (Pharmacia). En kolonne ekvilibreres med minst 10 kolonnevolumer 0,05 M natriumfosfat-buffer, pH 7,5. Kondisjonert medium påsettes kolonnen ved et forhold på 1 ml kolonnemateriale pr. 0,6 mg plasminogen-variant, bestemt ved ELISA med humant Glu-plasminogen som standard. Typisk påsettes 400 ml kondisjonert medium med plasminogen en 10 ml kolonne (H:D=4) ved en lineær strømnings-hastighet på 56 ml/cm/time ved 4 °C. Etter påsetting vaskes kolonnen med minst 5 kolonnevolumer 0,05 M fosfatbuffer, pH 7,5 med 0,5 M NaCl inntil uspesifikt bundet protein opphører å elueres. Frigjøring av bundet plasminogen oppnås ved påsetting av 0,2 M epsilon-aminokapronsyre i deionisert vann, pH 7,0.Elueringen krever 2 kolonnevolumer og utføres ved en lineær strømningshastighet på 17 ml/cm/time. Etter analyse med SDS-PAGE for å kontrollere enheten fjernes epsilon-aminokapronsyre og erstattes med en egnet buffer, f.eks. tris, PBS, HEPES eller acetat, ved kromatografi på ferdigpakkede PD10-kolonner for engangsbruk med "Sephadex G-25M" (Pharmacia). (Ordet Sephadex er et varemerke.) Typisk prosesseres 2,5 ml av hver plasminogenmutant ved en konsentrasjon på 0,3 mg/ml, i samsvar med produsentens instruksjoner. Fraksjoner som inneholder plasminogen, som bestemt ved A280, slås så sammen.

11) Kløyving

Plasminogenanaloger undersøkes så for evnen til å kløyves av proteolytiske aktivatorer ved bruk av SDS-PAGE under reduserende betingelser. Typiske inkubasjonsvolumer på 0,125 ml i 100 mM tris-HCl, pH 7,4, og 1 mM Ca<2+>består av plasminogenanalog ved konsentrasjoner som vist i eksemplene, og aktivatorene faktor Xa eller trombin ved konsentrasjoner som vist i eksemplene. Inkubasjonene utføres ved 37 °C.Kontrollinkubasjoner utføres under de samme betingelser i fra-vær av aktivatorer. Aktiveringsreaksjonene stoppes ved felling av protein ved tilsetning av trikloreddiksyre til en sluttkonsentrasjon på 20 % og oppbevaring ved 4 °C i >4 timer.Bunnfallene ble så nedsentrifugert, vasket med aceton og resuspendert i SDS-PAGE-prøvebuffer (0,1 M tris, pH 6,8, 10 % glyserol, 1 % SDS, 0,5 % merkaptoetanol og 0,05 % bromfenolblått). Prøvene ble analysert enten på 8-25 % gradientgeler eller 12 % geler. Gelene ble analysert ved bruk av en SHIMADZU gelscanner som scanner gelen og beregner proteinkonsentra-sjonen i bånd ved å bestemme arealet under toppene. (Ordet Shimadzu er et varemerke.) Kløyvingshastigheten for plasminogen ble således bestemt ved å måle forsvinningen av plasminogenbåndet ved tilnærmet 92 kDa og fremkomsten av plasmintung-kjedebåndet ved tilnærmet 66 kDa.

12) Aktivering

12. 1. Fibrinkoagellvsisanalvse

I fibrinlysisanalysen påvises plasminaktivitet ved dannelsen av en klaringssone som utvikles (grunnet oppløsning av fibrin) i en fibrinagarosegel. Gelen lages i 1 % agarosegel med lav geldanningstemperatur bufret med 0,1 M tris-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 2 mM CaCl2, ved tilsetning av plasminogen-fritt fibrinogen oppløst i 0,9 % (vekt/vol) NaCl til en sluttkonsentrasjon på 1 mg/ml. Seks enheter trombin tilsettes for å overføre fibrinogen til fibrin, og løsningen helles så ut på et GEL-BOND-ark og får stivne. (GEL-BOND er et varemerke.) Før bruk utstemples brønner i gelen, og agaroseproppene fjernes. Prøver på 5-10 pl fylles i brønnene, og gelen inkuberes i et kammer med høy luftfuktighet ved 37 °C over natten (17-20 timer), eller i et passende tidsrom for fremkomst av en lysissone. Gelen vaskes så med 7,5 % eddiksyre i 1 time, farges med "fast green" (2 % løsning) i 1-10 minutter og av-farges så med 40 % metanol, 10 % eddiksyre i minst 2 timer. Væsken fjernes, og gelen plasseres ved 37 °C over natten for tørking. Diameteren på lysissonene kan måles og sammenlignes med dem oppnådd med standardene, f.eks. villtypeplasminogen aktivert med tPA eller uPA. 12. 2. Direkte kromogen analyse og tidsforløp for

aktivering

Plasminogenanalog (12,5 pg) ble inkubert med trombin (2,8 pg) ved 37 °C i 125 pl buffer med 100 mM tris-HCl, pH 7,4, og 1 mM CaCl2. Aliquoter ble fjernet ved passende tidsrom og analysert for plasmininnhold i en kromogen analyse, som beskrevet nedenfor. Når trombin ble benyttet som aktivator, ble trombininhibitoren hirudin tilsatt i et svakt molart over-skudd for å stoppe aktiveringsreaksjonen, og prøvene ble lagret ved -70 °C. Når faktor Xa ble benyttet som aktivator, ble prøvene umiddelbart frosset for å stoppe aktiveringsreaksjonen. Plasmin ble målt ved å måle kløyvingen av det kromogene tripeptidsubstrat S2251 (Kabi). Aliquoter av prøven (25 yl) ble blandet med 75 yl buffer (50 mM tris-HCl, 0,1 M EDTA, 0,0005 % Triton X100, pH 8,0) med 0,6 mM S2251 i 96-brønners plater (Costar). Platene ble inkubert ved 37 °C i 2 timer. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 25 yl 0,5 M eddiksyre og absorbansen lest ved 405 nm med en automatisk plateleser (Dynatech). Kvantitering ble utført ved sammen-ligning med et standard plasminpreparat.

12. 3. Koblet kromogen analyse

En modifikasjon av den kromogene analyse ble utviklet for å måle tidsforløpet for aktiveringen av mutante plasmino-gener mer direkte. I denne analyse inkuberes mutant plasminogen og aktivator sammen i nærvær av S2251, og plasmin som produseres ved aktivering kløyver direkte det kromogene substrat, noe som fører til en økt absorbans ved 405 nm. Analysen ble utført i et totalvolum på 880 yl i en buffer med 50 mM tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,005 % Triton X100 og 0,1 % HSA. Det kromogene substrat S2251 ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,35 mg/ml, og den benyttede konsentrasjon av mutant protein var 3 yg/ml. For trombinaktivering ble trombin tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 1 eller 0,2 yg/ml. Faktor Xa ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 1,5 eller 0,3 yg/ml. Aliquoter på 100 yl av reaksjonen ble fjernet ved passende tidsrom og tilsatt 25 yl 4 % eddiksyre i mikrotiterplater for å stoppe reaksjonen. Etter fullført tidsforløp ble platene lest i en mikro-plateleser ved 405 nm. Ingen forsøk ble gjort på å kvantitere plasmindannelse i denne analyse.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en plasminogen-analog som er aktiverbar ved hjelp av et enzym som er involvert i blodkoagulasjon, valgt fra gruppen bestående av faktor Xa og thrombin (faktor Ila), hvor plasminogenanalogen har et kløyvingssete som kan kløyves av ett av de ovenfor nevnte enzymer slik at den får plasminaktivitet, og hvor plasminogenanalogen eventuelt inneholder en eller flere andre modifikasjoner (sammenlignet med villtype-Glu-plasminogen) som kan være en eller flere addisjoner, delesjoner eller substitusjoner, karakterisert vedat en vertscelle transfekteres eller transformeres med en ekspresjonsvektor som inneholder en DNA-sekvens som koder for plasminogenanalogen, cellen dyrkes under betingelser og i et egnet dyrkningsmedium som muliggjør ekspresjon av plasminogenanalogen, og plasminogenanalogen utvinnes fra dyrkningsmediet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor plasminogenanalogen omfatter en spaltingssetesekvens valgt fra gruppen bestående av: a) P4-P3-Gly-Arg, hvor P4 er en hydrofob rest og P3 er en sur rest, og som kan spaltes av enzymet faktor Xa, b) P4-P3-Pro-Arg-Pl'-P2', hvor hver av P4 og P3 uavhengig av hverandre er en hydrofob rest, og hver av Pl' og P2' uavhengig av hverandre er en ikke-sur rest, og som kan spaltes av thrombin, c) P2-Arg-Pl', hvor en av restene P2 og Pl' er glysin, og den andre er hvilken som helst aminosyrerest, og som kan spaltes av thrombin, og d) Gly-Pro-Arg, som kan spaltes av thrombin,karakterisert vedat det anvendes en vertscelle med en ekspresjonsvektor som inneholder en passende DNA-sekvens.

3. Syntetisk eller rekombinant nukleinsyre,karakterisert vedat den koder for en plasminogenanalog fremstilt ifølge krav 1 eller 2.

4. Vektor, karakterisert vedat den omfatter en første nukleinsyresekvens som koder for en plasminogenanalog fremstilt ifølge krav 1 eller 2, operativt knyttet til en andre nukleinsyresekvens som inneholder en sterk promoter- og enhancersekvens avledet fra humant cytomegalovirus, en tredje nukleinsyresekvens som koder for en polyadenyleringssekvens avledet fra SV40, og en fjerde nukleinsyresekvens som koder for den selekterbare markør gpt uttrykt fra en SV40-promoter, og med ytterligere et SV40-polyadenyleringssignal i 3'-enden av sekvensen til den selekterbare markør, idet plasminogenanalogen er i stand til å bli uttrykt i en vertscelle som inneholder vektoren.

5. Celle eller cellelinje som er i stand til å fremstille plasminogenanalogen fremstilt ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat den er blitt fremstilt ved en fremgangsmåte som omfatter transformering ellertransfektering av en celle eller cellelinje med nukleinsyre ifølge krav 3 eller en vektor ifølge krav 4.