DE3883453T2

DE3883453T2 - Hybride Plasminogenaktivatoren.

Info

Publication number: DE3883453T2
Application number: DE88305973T
Authority: DE
Inventors: Michael Joseph Beecham Browne; Sarkis Barret Kalindjian; Jeffery Hugh Beecham Robinson; Richard Anthony Godwin B Smith
Original assignee: Beecham Group PLC
Current assignee: Beecham Group PLC
Priority date: 1987-07-01
Filing date: 1988-06-29
Publication date: 1994-03-17
Anticipated expiration: 2008-06-30
Also published as: AU615919B2; EP0297882A2; DK359888A; AU1853388A; EP0297882A3; NZ225215A; FI883146A; PT87869B; NO882886D0; DE3883453D1; JPS6480287A; EP0297882B1; PT87869A; NO882886L; DK359888D0; FI883146A0; HUT47151A; IL86909A0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein hybrides fibrinolytisches Enzym, seine Herstellung, Arzneimittel, die es enthalten, und seine Verwendung bei der Behandlung von thrombotischen Erkrankungen, und sie betrifft Enzymderivate zur Verwendung in der Behandlung von thrombo-embolytischen Erkrankungen, insbesondere von akutem Herzinfarkt.
Das Europäische Patent 0 009 879 offenbart Derivate von in vivo fibrinolytischen Enzymen, die nützliche theraeutische Wirkstoffe zur Behandlung venöser Thrombose sind. Die Derivate sind durch die aktive katalytische Stelle auf den Enzymen gekennzeichnet, die durch eine durch Hydrolyse entfernbare Gruppe blockiert ist, wobei die Geschwindigkeitskonstante pseudoerster Ordnung der Hydrolyse im Bereich von 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;³ sec&supmin;¹ liegt.
EP 0155387 offenbart ein fibrinolytisch aktives Hybridprotein, das eine Kette einer aus zwei Ketten bestehenden Protease umfaßt, die mit einer Kette einer davon verschiedenen aus zwei Ketten bestehenden Protease oder mit derselben Kette derselben Protease verknüpft ist, wobei mindestens eine der Ketten in dem Hybridprotein von einer fibrinolytisch aktiven Protease abgeleitet ist, so daß das Hybridprotein eine für die fibrinolytische Aktivität essentielle Stelle aufweist, die gegebenenfalls durch eine entfernbare Blockierungsgruppe blockiert ist.
Beispiele des Hybridproteins schließen die mit der Gewebetyp-Plasminogenaktivator- (tissue-type plasminogen activator, t-PA-) B-Kette oder der Urokinase-B-Kette, verknüpfte Plasmin-A-Kette ein.
Die Hybridproteine können durch Mischen einer Kette der einen Protease mit einer Kette der anderen Protease, gegebenenfalls unter Dialyse unter oxidativen Bedingungen hergestellt werden.
Alternativ kann man die Hybridproteine dadurch herstellen, daß man die genetische Information (DNA-Sequenz) jedes Proteins nimmt, sie schneidet und ligiert, um eine neue DNA-Sequenz zu konstruieren, die das Hybridprotein codiert und diese DNA in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirten exprimiert.
Die Sequenz der Aminosäuren, aus denen sich das Enzym Gewebetyp-Plasminogenaktivator- (tissue-type plasminogen activator, t-PA) zusammensetzt und die Nucleotidsequenz der cDNA, die t-PA codiert sind bekannt (vgl. Pennica et al., Nature 301 (1983), 214). Von t-PA weiß man, daß es fibrinolytische Aktivität besitzt.
Der Begriff Gewebetyp-Plasminogenaktivator (t-PA), wie er hier verwendet wird, bezeichnet einen Plasminogenaktivator der Gruppe, die die für t-PA auf dem XXVIII Treffen des Internationalen Komitees für Thrombose und Haemostasie, Bergamo, Italien, 27. Juli 1982, definierten immunologischen Eigenschaften aufweist.
Die Aminosäuresequenze einer Reihe von t-PA-Formen sind bekannt. Die vorstehend erwähnte "Nature (1983)"-Referenz offenbart die Sequenz der L-Kette- und der reifen S- Ketten-Formen von t-PA, die ebenfalls von Vehar et al. diskutiert werden in Biotechnology 2 (1984), 1051-7, worin über die Prozessierung berichtet wird, durch die sich aus dem anfangs gebildeten t-PA durch Entfernen einer Pro-Sequenz die S-Ketten-Form ergibt. Pohl et al. FEBS Letters, Vol. 168 Nr. 1 (1984), 29-32 beschreibt die N-terminale Multiplizität von t-PA und offenbart die U-Ketten-Form. Das hier verwendete Numerierungssystem für die Aminosäuresequenz von t-PA ist das in der "Nature-(1983)"-Referenz für den reifen (S-Ketten)-t-PA beschriebene, in dem das N-terminale Serin mit 1 beziffert ist. Nach diesem System hat der L-Ketten-t-PA einen N-terminalen Glycinrest in der Position -3 und der U-Ketten-t-PA ein N-terminales Valin in der Position 4. Wenn hier auf t-PA Bezug genommen wird, sollen dabei alle solche Varianten Formen eingeschlossen sind.
Nativer t-PA setzt sich aus einer B- oder leichten (light, L)- und einer A- oder schweren (heavy, H)-Kette zusammen. Die B-Kette enthält die aktive Stelle des Enzyms. Die Spaltstelle zur Überführung des t-PAs aus der einkettigen in die zweikettige Form liegt zwischen den Resten arg- 275 und ile-276. In der Form mit zwei Ketten werden die Ketten durch Disulfidbrücken, die sich zwischen den Resten cys- 264 in der A-Kette und cys-395 in der B-Kette gebildet haben, zusammengehalten.
Es ist gezeigt worden (Ny, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 3555), daß die A-Kette eine Anzahl von strukturellen und funktionellen Domänen aufweist, die zu anderen in Plasmaproteinen gefundenen Strukturen homolog sind: zwei dreifach durch Disulfid verknüpfte Strukturen oder Kringle, eine wachstumsfaktorartige Domäne und eine fibronectinfinger-artige Domäne.
Der Bereich vom Aminosäurerest 44 bis zum Aminosäurerest 91 ist mit "Wachstumsfaktordomäne" bezeichnet worden (Banyai, L. et al. FEBS Lett. 163 (1983), 37). Die genetische Information, die den größten Teil dieser Domäne, die Reste 51 bis einschließlich 86 und zum Teil die Reste 50 bis 87 codiert, befindet sich auf einem einzelnen Exon. Der Bereich vom ersten bis zum letzten Cysteinrest innerhalb dieses Bereiches, einschließlich der Reste 51 bis 84, definiert eine dreifach über Disulfid verknüpfte Struktur, die hier als t-PA-Wachstumsfaktor-Domäne bezeichnet wird.
Fibronectin weist zwölf für die Fibrinaffinität verantwortliche Finger-Domänen pro Monomer auf (Eur. J. Biochem. 154 (1986), 15-29). Die Aminosäuresequenzen dieser Fingerdomänen sind bekannt (EMBO J. 4 (1985), 1755-1759; Eur. J. Biochem. 128 (1982), 605-623; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 137-141). Es ist gezeigt worden (J. Biol. Chem. 260 (1985), 5328-5341 und 13666-13676), daß ein Teil von Faktor XII eine strukturelle Homologie mit den Fingerdomänen von Fibronectin aufweist. Es ist ferner gezeigt worden (B nvai, L. et al., FEBS Lett. 163 (1983), 37), daß ein Teil des t-PA-Enzyms eine strukturelle Homologie mit den Fingerdomänen von Fibronectin aufweist. Dieser Bereich vom Aminosäurerest 6 bis zum Aminosäurerest 43 ist als die t-PA-Fingerdomäne bezeichnet worden. Die genetische Information für diese Domäne liegt auf einem einzelnen Exon (Ny, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81 (1984), 5355). Der Ausdruck "Fingerdomäne" wird hier nachstehend verwendet, um auf eine Aminosäuresequenz Bezug zu nehmen, die eine strukturelle Homologie mit den Fingerdomänen von Fibronectin aufweist, ohne die Sequenz einer Fibronectin-Fingerdomäne selbst zu besitzen.
Die Aminosäuresequenzen, aus denen sich das Enzym Plasminogenaktivator vom Urokinasetyp (u-PA) in seiner einzelkettigen und zweikettigen Form zusammensetzt (Verstraete, M. und Collen, D.; Blood 67 (1986), 1529), und die Nucleotidsequenz der cDNA, die menschlichen u-PA codiert (Holmes, W. E. et al., Bio/technology 3 (1985), 923-929) sind bekannt. Es ist bekannt, daß Plasminogenaktivator vom Urokinasetyp eine fibrinolytische Aktivität aufweist. Die beiden Ketten von u-PA werden mit A- und B-Kette bezeichnet. Die B- Kette enthält die aktive Stelle des Enzyms. Die Spaltstelle für die Überführung von u-PA aus der einzelkettigen in die zweikettige Form liegt zwischen den Resten lys-158 und ile- 159. In der zweikettigen Form werden die Ketten durch eine Disulfidbrücke zusammengehalten, die sich zwischen den Resten cys-148 in der A-Kette und cys-279 in der B-Kette ausgebildet hat. So wie er hier verwendet wird, kennzeichnet der Begriff "Plasminogenaktivator vom Urokinasetyp (u-PA)" einen Plasminogenaktivator der Gruppe, die die für u-PA auf dem XXVIII Treffen des Internationalen Komitees für Thrombose und Haemostasie, Bergamo, Italien, 27. Juli 1982, definierten immunologischen Eigenschaften aufweist.
Das hier verwendete Numerierungssystem für die Aminosäure- und Nucleotidsequenz von u-PA ist das von Holmes, W. E. et al., 1985 (s. oben) beschriebene, in dem der N-terminale Serinrest mit 1 beziffert ist.
Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen nativen Formen von t-PA und u-PA sind ferner eine Reihe von Muteinen bekannt, vgl. z.B. EP-A-0201153, EP-A-0233013. EP-A-0199574, WO 86/01538, EP-A-0227462, EP-A-0253582, WO 86/04351, EP-A- 0236040, EP-A-0200451, EP-A-0238304, EP-0225286, DE 3537176, WO 87/04722 und EP-A-0236289.
Hier vorgenommene Bezugnahmen auf t-PA- und u-PA-Arten schließen sowohl native Formen als auch Muteine ein.
Plasmin ist eine zweikettige Serinprotease, die sich durch Spaltung der einzelkettigen Vorstufe, Plasminogen, an einer spezifischen internen Peptidbindung erhalten läßt. Die Aminosäuresequenz von menschlichem Plasminogen ist bekannt (Wiman and Walters (1975) Eur. J. Biochem. 50, 489-494 und 58, 539-547; Wiman, Eur. J. Biochem. 76 (1977), 129-137; Sottrup-Jensen et al., Fibrinolysis and Throbolysis Vol. 3 (1978), 191-209, Raven Press, New York; und Sottrup-Jensen et al., Atlas of Protein Sequence and Structure Vol. 5, Suppl. 3 (1978), S. 91, National Biomedical Research Foundation, Silver Spring, MD). Es ist ebenfalls eine Teil-Nucleotidsequenz, die die Aminosäurereste 272 bis 790 von menschlichem Plasminogen codiert, beschrieben worden (Malinowski, D.P. et al., Biochemistry 23 (1984), 4243- 4250). Die Spaltstelle von menschlichem Plasminogen befindet sich zwischen den Resten arg-560 und val-561 (nach der Sequenznumerierung von Sottrup-Jensen et al., Atlas of Protein Sequence (1978) (op.cit.)). Es sind zwei Arten von Plasminogen identifiziert worden (F.J. Castellino, Chemical Reviews Vol. 81 (1981), S. 431): glu&sub1;, das einen N-terminalen Glutaminsäurerest in der Position 1 aufweist und lys&sub7;&sub7;, das einen N-terminalen Lysinrest (Position 77) hat. Glu-Plasminogen ist ferner leicht durch limitierten plasmatischen Abbau in andere modifizierte Formen mit N-terminalem Valin (val&sub7;&sub8;) oder Methionin (met&sub6;&sub8;) überführbar (C. Mivashita, E. Wenzel und M. Heiden, Haemostasis 18, supp. 1 (1988), S. 7-13). Die hier vorgenommene Bezugnahmen auf Plasmin sollen all diese Arten einschließen.
Kürzlich ist eine vollständige Nucleotidsequenz beschrieben worden (Forsgren, M. et al., FEBS Letters 213 (1987), 254-260). Die Nucleotidsequenz sagt das Vorhandensein eines vorher nicht bekannten zusätzlichen Isoleucinrestes nahe des N-Terminus der A-Kette voraus. Dieser Befund wurde davon unabhängig bestätigt (McLean, J.N. et al., Nature 330 (1987), 132-137). Damit übereinstimmend folgt die gesamte nachfolgend vorgenommene Sequenznumerierung (Aminosäure und Nucleotid) Forsgren et al. (1987). In dieser Sequenznummerierung liegt die Plasminogenspaltstelle zwischen den Resten arg-561 und val- 562 und die N-terminal modifizierten Formen sind mit met&sub6;&sub9;, lys&sub7;&sub8; und val&sub7;&sub9; bezeichnet.
Plasminogen hat fünf Kringle-Strukturen. Der Bereich vom ersten bis zum letzten Cysteinrest jeder Kringle- Struktur, Reste 84 bis einschließlich 162, Reste 166 bis einschließlich 243, Reste 256 bis einschließlich 333, Reste 358 bis einschließlich 435 und Reste 462 bis einschließlich 541 werden hier mit K1P-, K2P-, K3P-, K4P- bzw. K5P-Domänen bezeichnet.
Erfindungsgemäß wird ein hybrider Plasminogenaktivator bereitgestellt, der die fünf Kringle-Domänen von Plasmiflogen umfaßt, die verknüpft sind mit der B-Kette von t-PA oder u-PA mittels einer Aminosäuresequenz, umfassend die t-PA-Spaltstelle zwischen den Resten 275 und 276 und den t-PA-Cysteinrest 264, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus:
1. [AAPSTCGLRQYSQPQFR]
2. [AAPSTCGLRQYSQPQFQ]
3. [STCGLRQYSQPQFR]
bzw. die u-PA-Spaltstelle zwischen den Resten 158 und 159 und den u-PA-Cysteinrest 148, wobei die Sequenz wie folgt lautet: [AAPSFPSSPPEELKFQCGQKTLRPRFK] (Aminosäurekennzeichnung durch einzelne Buchstaben).
Es wird darauf hingewiesen, daß mit dem Ausdruck "B- Kette" mindestens der Teil der B-Kette gemeint ist, der das funktionelle aktive Zentrum von t-PA oder u-PA enthält und bevorzugt die Reste 276-527 bzw. 159-411 umfaßt.
Die verbindende Aminosäuresequenz kann man synthetisch während der Herstellung des hybriden Plasminogenaktivators (PA) einführen und/oder aus nativen Sequenzen ableiten.
Natives Plasminogen enthält in den Positionen 548 und 558, C-terminal zum Plasminogen-Kringle Nr. 5 Cysteinreste, die an den Disulfidbrücken zwischen den Ketten des Plasmins in der Zwei-Ketten-Form Anteil haben. In der bevorzugten Ausführungsform sind diese Reste in der verbindenden Sequenz nicht vorhanden.
Es ist klar, daß man zur Verhinderung der Abspaltung der Plasminogenkringle von der t-PA- oder u-PA-B-Kette in vivo die verbindende Sequenz so wählen sollte, daß die Gegenwart einer gegen trypsinartige proteolytische Spaltung N-terminal zum cys-264-Rest von t-PA bzw. cys-148-Rest von u-PA suszeptiblen Stelle vermieden wird.
Wenn man die B-Kette von t-PA verwendet, umfaßt die verbindende Aminosäuresequenz bevorzugt die t-PA-Reste 264 bis einschließlich 275 und bevorzugter die Reste 162 bis einschließlich 275. Wenn man die B-Kette von u-PA verwendet, umfaßt die verbindende Aminosäuresequenz bevorzugt die u-PA- Reste 148 bis einschließlich 158, bevorzugter die Reste 137 bis einschließlich 158.
In bevorzugten Ausführungsformen kann man den hybriden PA durch
(Y-)m(KP-Zt-)&sub5;Bt
sybolisieren, wobei Bt die Reste 276-527 von t-PA umfaßt, in 0 oder 1, bevorzugt 1 ist, jeder der 5 Werte von KP eine von Plasminogen in der Sequenz abgeleitete Kringle-Domäne darstellt und Y und jeder der 5 Werte von Zt unabhängig voneinander eine Bindung oder eine verbindende Aminosäuresequenz repräsentiert, die synthetisch während der Herstellung des hybriden PAs eingeführt und/oder von nativen Plasminogen- und/oder t-PA-Sequenzen abgeleitet sein kann, und die Sequenz Z&sub5;t die vorstehend definierte verbindende Aminosäuresequenz ist.
In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform kann der hybride PA als
(Y-)m(KP-Zu)&sub5;Bu
symbolisiert werden, wobei Bu die Reste 159-411 von u-PA umfaßt, Y und ieder der 5 Werte von Zu unabhängig voneinander eine Bindung oder eine verbindende Aminosäuresequenz darstellt, die während der Herstellung des hybriden PAs synthetisch eingeführt und/oder von nativen Plasminogen- und/oder u-PA-Sequenzen abgeleitet sein kann, und die Sequenz Z&sub5;u die vorstehend definierte verbindende Aminosäuresequenz ist und in und jeder der fünf Werte von KP wie vorstehend definiert sind.
Wenn m 1 ist, kann die Sequenz Y einen Wert annehmen, wie er in verschiedenen Formen von nativem Plasminogen wie der glu&sub1;- oder der lys&sub7;&sub8;-Form vorkommt, d.h. den Plasminogenresten 1 bis 83 bzw. 78 bis 83 entsprechen.
Gegebenenfalls kann die Sequenz Y, wie EP-A-0241210 ganz allgemein lehrt, mit einer oder mehreren Fingerdomänen beginnen, die hier als eine Aminosäuresequenz definiert sind, die eine strukturelle Homologie mit den Fingerdomänen von Fibronectin aufweist, z.B. eine Fibronectin-Fingerdomäne selbst oder eine t-PA-Fingerdomäne, bevorzugt eine t-PA-Fingerdomäne.
Wenn eine Fingerdomäne von t-PA abgeleitet ist, kann die Sequenz der Fingerdomäne gegebenenfalls am N-Terminus so erweitert sein, daß sie die dem Rest Nr. 6 von nativem t-PA vorangehende Reste einschließt, z.B. die Reste 4 und 5, 1 bis 5 bzw. -3 bis 5 der U-, S- bzw. L-Ketten-Formen von nativem t-PA. Bevorzugt erstreckt sich die Sequenz der Fingerdomäne am N-Terminus so weit, daß sie die Reste 1 bis 5 von nativem t-PA umfaßt.
Jede Sequenz einer Fingerdomäne kann gegebenenfalls mit einer zweiten Aminosäuresequenz verknüpft sein, die der Wachstumsfaktor-Domäne von nativem t-PA entspricht. Somit umfaßt Y, wenn die Sequenz der Fingerdomäne (z.B. die Reste 6 bis 43 von t-PA) als F dargestellt und die Sequenz der Wachstumsfaktor-Domäne (Reste 51 bis 84 von t-PA) als G darbestellt werden, eine oder mehrere N-terminale Einheiten der Form A-F-X&sub1;- und/oder A-F-X&sub2;-G-X&sub3;-, wobei X&sub1;, X&sub2; und X&sub3; Bindungen oder verbindende Aminosäuresequenzen repräsentieren, die während der Herstellung des hybriden PAs synthetisch eingeführt und/oder von t-PA-Sequenzen abgeleitet sein können, die sich an die F- und G-Domänen anschließen, und wobei A eine mögliche N-terminale Verlängerung der F-Domäne ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die verknüpfende Sequenz X&sub1; Aminosäurereste, die aus den Resten 44 bis 50 und 85 bis 91 ausgewählt sind und umfaßt bevorzugter die Reste 44 bis 50 und 88 bis 91 von nativem t-PA, die gegebenenfalls am C-Terminus mit einer Aminosäuresequenz, wie -pro-gly- verknüpft sind. Die verknüpfende Sequenz Z&sub2; umfaßt bevorzugt Reste, die aus den Resten 44 bis 50 von nativem t-PA ausgewählt sind, und sie umfaßt bevorzugter die Reste 44 bis 50. Die verknüpfende Sequenz X&sub3; umfaßt die Reste, die aus den Resten 85 bis 91 von nativem t-PA ausgewählt sind, und sie umfaßt bevorzugter die Reste 85 bis 91, die gegebenenfalls am C-Terminus mit einer Aminosäuresequenz wie -pro-gly-verknüpft sind.
Es versteht sich von selbst, daß die verknüpfenden Sequenzen zwischen den Domänen und die verknüpfenden Sequenzen zwischen der (den) zusätzlichen Domäne(n) und dem Plasminogenaktivator-Molekül so gewählt sein sollten, daß die Anwesenheit einer gegen proteolytische Spaltung suszeptiblen Stelle vermieden wird, um eine Spaltung der zusätzlichen Domäne(n) voneinander oder von dem Rest des hybriden Plasminogenaktivators in vivo zu verhindern. Somit wird insbesondere die Verknüpfungssequenz X&sub1; oder X&sub3; bevorzugt mit einem Rest enden, der weder Arginin noch Lysin ist.
Y umfaßt bevorzugt bis zu 6, bevorzugter bis zu 2 und am meisten bevorzugt 1 zusätzliche Fingerdomäne(n), von denen jede einzelne gegebenenfalls mit einer Wachstumsfaktor-Domäne verbunden sein kann.
Z&sub1;, Z&sub2;, Z&sub3; und Z&sub4; repräsentieren die nativen Plasminogen-Interdomän-Sequenzen zwischen den Plasminogen-Kringledomänen 1 und 2, 2 und 3, 3 und 4, bzw. 4 und 5.
Geeignete Sequenzen (Z&sub5;t), die die C-terminale Plasminogen-Kringledomäne mit der t-PA-B-Kette verbinden, sind
1. [AAPSTCGLRQYSQPQFR]
2. AAPSTCGLRQYSQPQFQ]
3. [STCGLRQYSQPQFR]
(Aminosäurebezeichnung in der Einzelbuchstaben-Darstellung), woraus sich ersehen läßt, daß die Sequenzen 1 und 2 aus den über einen Serinrest verknüpften Plasminogen- und t-PA- Resten 542-544 bzw. 263 bis 275 bestehen. Der dazwischen gesetzte Serinrest kann als Plasminogen-Ser-545 oder t-PA-Ser- 262 identifiziert werden. In der Sequenz 2 ist gemäß EP-A- 0233013 der t-PA-Rest 275 durch Glutamin ersetzt worden. Die Sequenz 3 besteht aus den t-PA-Resten 262 bis 275.
Das die C-terminale Plasminogen-Kringle-Domane mit der u-PA-B-Kette verbindende (Z&sub5;u) ist:
[AAPSFPSSPPEELKFQCGQKTLRPRFK]
(Aminosäurebezeichnung in der Einzelbuchstaben-Darstellung), woraus zu ersehen ist, daß die Sequenz aus den Plaminogenresten 542 bis 546 und den u-PA-Resten 137 bis 158 besteht.
Die bevorzugten erfindungsgemäßen hybriden PAs haben die folgenden Strukturen:
1. Plg 1-541[AAPSTCGLRQYSQPQFR]Bt
2. Plg 1-541[AAPSTCGLRQYSQPQFQ]Bt
3. Plg 1-541 [STCGLRQYSQPQFR]Bt
wobei Plg 1-541 die Reste 1 bis 541 von Plasminogen darstellt (d.h. die Kringle 1 bis 5 einschließt), Bt wie vorstehend definiert ist und die Symbole in eckigen Klammern Aminosäurereste in der Einzelbuchstaben-Darstellung kennzeichnen, einschließlich von Ein- und Zwei-Ketten-Varianten, lys&sub7;&sub8;- und glu&sub1;-Varianten und ihren Gemischen.
Der erfindungsgemäße hybride PA kann derivatisiert werden, um pharmazeutisch nützliche Konjugate in Analogie zu bekannten PA enthaltenden Konjugaten bereitzustellen, z.B.:
(a) ein in EP-A-0 155 388 offenbartes Enzym-Proteinkonjugat, in dem die für die katalytische Aktivität verantwortliche katalytische Stelle auf dem Enzym durch ein an sie über eine reversible verknüpfende Gruppe angeheftetes menschliches Protein blockiert ist;
(b) ein in EP-A-O 152 736 offenbartes Konjugat, das mindestens ein gegebenenfalls blockiertes fibrinolytisches Enzym enthält, das mit mindestens einem menschlichen Protein über eine Stelle verknüpft ist, die von der für die fibrinolytische Aktivität verantwortlichen katalytischen Stelle verschieden ist;
(c) ein in EP-A-0183503 offenbartes Protein-Polymer- Konjugat, das ein pharmazeutisch nützliches Protein umfaßt, das mit mindestens einem wasserlöslichen Polymer mittels einer reversiblen Verknüpfungsgruppe verbunden ist; oder
(d) ein in EP-A-0184363 offenbartes Konjugat, das ein Vielfaches von fibrinolytischen Enzymen umfaßt, die miteinander durch ihre aktiven Zentren über eine entfernbare Blockierungsgruppe verbunden sind.
Der erfindungsgemäße Hyprid-PA ist geeignet, die Stelle eines PAs als Enzym- (oder menschliche) Proteinkomponente in iedem der vorstehend beschriebenen Konjugate einzunehmen.
Die vorstehend genannten Derivate des hybriden PAs können in jedem nachstehend beschriebenen Verfahren und in allen nachstehend beschriebenen Zusammensetzungen anstelle des hybriden PAs selbst verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßem hybriden Plasminogenaktivator bereit, wobei das Verfahren eine Expression einer den hybriden Plasminogenaktivator codierenden DNA in einer rekombinanten Wirtszelle und ein Gewinnen des hybriden Plasminogenaktivator-Produktes umfaßt.
Das DNA-Polymer, das eine den hybriden PA codierende Nucleotidsequenz umfaßt, stellt ebenfalls einen Teil der Erfindung dar.
Das ertindungsgemäße Verfahren kann man durch herkömmliche Rekombinationstechniken. wie sie in Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982 und DNA Cloning Bände I, II und III (D.M. Glover Herausgeber, IRL Press Ltd.) beschrieben sind, ausführen.
Insbesondere kann das Verfahren die nachfolgenden Schritte umfassen:
i) Herstellen eines replizierbaren Expressionsvektors, der in einer Wirtszelle fähig ist zur Expression eines DNA-Polymers, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die den hybriden Plasminogenaktivator codiert;
ii) Transformieren einer Wirtszelle mit dem Vektor;
iii) Züchten der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des DNA-Polymers erlauben, um den hybriden Plasminogenaktivator zu produzieren; und
iv) Gewinnen des hybriden Plasminogenaktivators.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung des DNA-Polymers durch die Kondensation der geeigneten mono-, di- oder oligomeren Nucleotideinheiten bereit.
Die Herstellung kann in geeigneter Weise chemisch, enzymatisch oder durch Kombination der beiden Verfahren in vitro oder in vivo ausgeführt werden. So kann das DNA-Polymer durch enzymatische Ligation geeigneter DNA-Fragmente nach herkömmlichen Verfahren, wie denen von D. M. Roberts et al. in Biochemistry 24 (1985), 5090-5098, beschriebenen, hergestellt werden.
Die DNA-Fragmente können durch Spaltung von DNA, die die benötigten Nucleotidsequenzen enthält, mit geeigneten Restriktionsenzymen, durch chemische Synthese, durch enzymatische Polymerisation oder durch eine Kombination dieser Verfahren erhalten werden.
Eine Spaltung mit Restriktionsenzymen kann man in einem geeigneten Puffer bei einer Temperatur von 20ºC bis 70ºC, gewöhnlich in einem Volumen von 50 ul oder weniger mit 0,1 bis 10 ug DNA durchführen.
Eine enzymatische Polymerisation von DNA kann man in vitro unter Verwendung einer DNA-Polymerase, z.B. DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) in einem geeigneten Puffer, der die benötigten Nucleosidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP enthält, bei einer Temperatur von 10º bis 37ºC, gewöhnlich in einem Volumen von 50 ul oder weniger ausführen.
Eine enzymatische Ligation von DNA-Fragmenten kann man unter Verwendung einer DNA-Ligase, z.B. T4-DNA-Ligase in einem geeigneten Puffer bei einer Temperatur von 4ºC bis Raumtemperatur, gewöhnlich in einem Volumen von 50 ul oder weniger ausführen.
Die chemische Synthese des DNA-Polymers oder yon Fragmenten kann man mit herkömmlicher Phosphotriester-, Phosphit- oder Phosphoramidit-Chemie unter Anwendung von Festphasen-Techniken ausführen, wie sie z.B. beschrieben sind in "Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual" (Herausgeber H.G. Gassen und A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982), oder in anderen wissenschaftlichen Publikationen, z.B. M.J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B.S. Sproat and R.C. Titmas, Nucleic Acids Research 10 (1982), 6243; B.S. Sproat and W. Bannwarth, Tetrahedron Letters 24 (1983), 5771; M.D. Matteucci und M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 21 (1980), 719; M.D. Matteucci and M.H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society 103 (1981), 3185; S.P. Adams et al., Journal of the American Chemical Society 105 (1983), 661; N.D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus and H. Koester, Nucleic Acids Research 12 (1984), 4539; und H.W.D. Matthes et al., EHBO Journal 3 (1984), 801. Bevorzugt wird ein autornatischer DNA-Synthesizer verwendet.
Das DNA-Polymer wird bevorzugt durch Ligieren zweier oder mehrerer DNA-Moleküle hergestellt, die zusammen eine DNA-Sequenz umfassen, die den hybriden PA codieren.
Die DNA-Moleküle können unter Verwendung von geeigneten Restriktionsenzymen durch Spaltung von Vektoren, die die benötigten codierenden Sequenzen enthalten, erhalten werden.
Die genaue Struktur der DNA-Moleküle und der Weg, auf denen sie erhalten werden, hängt von der Struktur des gewünschten hybriden PA-Produktes ab. Der Entwurf einer geeigneten Strategie zur Konstruktion des den hybriden PA codierenden DNA-Moleküls ist für den Fachmann eine Routineangelegenheit.
In der bevorzugten Ausführungsform läßt sich das DNA- Molekül vorteilhaft durch Ligieren eines ersten die Plasminogen-Kringle 1 bis 5 codierenden DNA-Moleküls mit einem oder mehreren DNA-Molekülen präparieren, die zusammen mit dem ersten DNA-Molekül die B-Kette von t-PA oder u-PA codieren, so daß das ligierte Molekül die verbindende Aminosäuresequenz codiert, die die t-PA-Spaltstelle zwischen den Resten 275 und 276 und den t-PA-Cysteinrest 264 bzw. die u-PA-Spaltstelle zwischen den Resten 158 und 159 und den u-PA-Cysteinrest 148 umfaßt.
Als Beispiel und zur Orientierung sind nachstehend zwei Strategien zur Konstruktion von DNA-Molekülen beschrieben, die zwei spezifische hybride Plasminogenaktivatoren codieren.

Strategie A

Das erste DNA-Molekül kann man durch Spaltung eines ersten Vektors erhalten, der den benötigten Teil der Plasminogen codierenden Sequenz enthält. Vorteilhafterweise wird die native Plasminogensequenz so modifiziert, daß eine neue NarI-Stelle 3'-seitig zum K&sub5;P-codierenden Bereich, bevorzugt in der Nucleotidposition 1758 eingeführt wird, und alle vorher im Vektor vorhandenen NarI-Stellen zerstört werden. Der erste Vektor trägt außerdem bevorzugt mindestens einen Teil der t-PA codierenden Sequenz einschließlich der SstI-Stelle in der Nucleotidposition 1417 (Pennica et al., 1983, op. cit.) im B-Ketten codierenden Bereich und den Teil des B- Ketten codierenden Teils 3'-seitig davon. Eine Spaltung des ersten Vektors mit den Restriktionsenzymen NarI und SstI liefert somit ein DNA-Molekül, das die Plasminogenkringle 1 bis 5 und einen Teil der t-PA-Kette codiert und Vektorfunktionen enthält.
Ein zweites DNA-Molekül kann man durch Spaltung eines weiten Vektors erhalten, der die die t-PA-B-Kette codierende Sequenz trägt. Eine Spaltung des zweiten Vektors mit einem geeigneten Restriktionsenzym (mit geeigneten Restriktionsenzymen wie z.B. Banil liefert ein DNA-Molekül, das einen Teil der t-PA-B-Kette codiert. Das kohäsive BanII-Ende ist mit dem kohäsiven SstI-Ende des ersten DNA-Moleküls kompatibel.
Das erste und das zweite DNA-Molekül werden über einen Oligonucleotid-Linker verknüpft, der geeignete kohäsive Enden aufweist, die init den kohäsiven NarI- und BanII- Enden der DNA-Moleküle kompatibel sind, und der solch eine Struktur hat, daß bei einer Ligation des ersten und zweiten DNA-Moleküls mit dem Linker das resultierende Molekül eine verbindende Aminosauresequenz codiert, die die t-PA-Spaltstelle zwischen den Resten 275-276 und den t-PA-Cysteinrest 264 umfaßt. Vorteilhafterweise hat der Oligonucleotid-Linker die nachfolgende Struktur:
Die Ligation des ersten und des zweiten DNA-Moleküls mit dem vorstehenden Linker kann nacheinander oder bevorzugter in einem einzigen Schritt ausgeführt werden. Die Ligation der kohäsiven Banll- und SstI-Enden der Moleküle bildet von neuem den t-PA-B-Ketten codierenden Bereich. Es wird angenommen, daß die resultierende Sequenz an der rekonstruierten NarI-Stelle die folgende ist:
Die mit 542-544 bezeichneten Aminosäuren sind die C- terminalen Reste einer Peptidseauenz, die die Reste 1 bis 544 von Plasminogen umfassen. Der mit * bezeichnete Serinrest kann als Plasminogen-Serin 545 oder als t-PA-Serin 262 identifiziert werden. Die mit 263-266 bezeichneten Aminosäuren sind die N-terminalen Reste einer Peptidsequenz, die die t-PA-Reste 263-527 umfassen.
Der erste Vektor, der den benötigten Teil der Plasminogen codierenden Sequenz, d.h. die Kringle 1 bis 5 trägt, und in den eine NarI-Stelle in der Nucleotidposition 1758 eingeführt ist, kann auf vorteilhafte Weise durch die Spaltung mit den Restriktionsenzymen HindIII und AhaII und davon getrennt AhaII und DdeI eines Vektors erhalten werden, der die Plasminogen-Gene trägt wobei jede vorhandene NarI- Stelle im Vektor durch herkömmliche Verfahren entfernt worden ist. Die HindIII-Stelle liegt im 5'-untranslatierten Bereich, und die AhaII-Stelle in der Nucleotidposition 1572 und die DdeI-Stelle in der Nucleotidposition 1748 befinden sich im den Kringle 5 codierenden Bereich des Plasminogen- Gens. Die HindIII-AhaII und AhaII-DdeI-Fragmente können miteinander und mit einem ein kohäsives DdeI-Ende aufweisenden Oligonucleotid-Linker, der den Rest des Kringle 5- codierenden Bereichs codiert und eine NarI-Stelle enthält, ligiert werden. Der Linker ist bevorzugt ebenfalls mit einem kohäsiven BgIII-Ende ausgestattet, so daß das resultierende die Plasminogen-Kringle 1 bis 5 codierende DNA-Molekül ein kohäsives HindIII- und BgIII-Ende aufweist und in einem geeigneten Vektor, wie pTRE12 (EP-A-0 201 153) zwischen dessen HindIII- und BglII-Stellen gehalten werden kann, wodurch der Vektor (A) erzeugt wird.
Um den Teil der t-PA-B-Kette codierenden Sequenz, der 3'-seitig zur SstI-Stelle liegt in den Vektor einzuführen, der den Plasminogen-K&sub1;P-K&sub5;P codierenden Bereich trägt, wird das das reife t-PA-Polypeptid codierende BglII-Fragment, das aus einem geeigneten solch ein t-PA-Polypeptid codierenden Vektor (B) wie pTRE15 (EP-A-0 201 153) erhalten wurde, in die BglII-Stelle des Vektors (A) inseriert. Der nicht gewünschte Anteil des resultierenden Vektors kann dann durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen NarI und SstI herausgeschnitten werden, um so das erste DNA-Molekül zu gewinnen, das die Plasminogen-Kringle 1 bis 5, die t-PA-B- Kette 3'-seitig von der SstI-Stelle und Vektorfunktionen codiert.
Der zweite Vektor, der den benötigten Teil der t-PA codierenden Sequenz, d.h. der t-PA-Kette trägt, kann beispielsweise ein Vektor (B) sein, der das reife t-PA-Polypeptid codiert, wie z.B. pTRE15 (EP-A-0 201 153).

Strategie B

Das erste DNA-Molekül kann man durch Spalten eines ersten Vektors, der den benötigten Teil der Plasminogen codierenden Sequenz trägt, erhalten. Vorteilhafterweise wird die native Plasminogensequenz modifiziert, um eine neue NarI-Stelle 3'-seitig zum K&sub5;P-codierenden Bereich, bevorzugt in der Nucleotidposition 1758 einzuführen, und jede vorher im Vektor vorhandene NarI-Stelle wird zerstört. Der erste Vektor weist ferner vorteilhafterweise eine BglII-Stelle auf, die so positioniert ist, daß die Spaltung des ersten Vektors mit den Restriktionsenzymen NarI und BglII ein die Plasminogen-Kringle 1 bis 5 codierendes und Vektorfunktionen tragendes DNA-Molekül bereitstellt.
Ein zweites DNA-Molekül kann man durch Spalten eines zweiten die u-PA-B-Kette codierende Sequenz tragenden Vektors erhalten. Vorteilhafterweise wird die native u-PA-Sequenz zuerst durch Einführen einer SstI-Stelle 5-seitig vom u-PA-B-Kette codierenden Bereich modifiziert. Der zweite Vektor trägt ferner bevorzugt mindestens einen Teil der u- PA-A-Kette codierenden Sequenz 5'-seitig zur B-Kette codierenden Sequenz und weist vorteilhafterweise eine BglII- Stelle 3'-seitig von der 3-Kette codierenden Sequenz auf. Eine Spaltung des zweiten Vektors mit den Restriktionsenzymen BglII und SstI stellt somit ein DNA- Molekül bereit. das die u-PA-B-Kette und einen Teil der A- Kette codiert.
Das erste und das zweite DNA-Molekül werden über einen Oligonucleotid-Linker miteinander verknüpft, der geeignete kohäsive Enden, bevorzugt ein kohäsives NarI-5'-Ende und ein kohäsives SstI-3'-Ende aufweist und solch eine Struktur hat, das bei der Ligation des ersten und des zweiten DNA-Moleküls mit dem Linker das resultierende Molekül eine verbindende Aminosäuresequenz codiert, die die u-PA- Spaltstelle zwischen den Resten 158 und 159 und den u-PA-Cysteinrest 148 umfaßt. Vorteilhafterweise hat der Oligonucleotid-Linker die folgende Struktur:
5' CG CCT TCA TTT CCC TCC TCT CCT CCA GAA GAG CT 3'
3' GGA AGT AAA GGG AGG AGA GGA GGT CTT C 5'
Das Ligieren des ersten und zweiten DNA-Moleküls mit dem vorstehenden Linker kann nacheinander oder bevorzugter in einem einzigen Schritt ausgeführt werden. Es wird angenommen, daß die resultierende Sequenz an den rekonstruierten NarI- und SstI-Stellen die folgende ist:
Die mit 541-546 gekennzeichneten Aminosäuren sind die C-terminalen Reste einer Peptidsequenz, die die Plasminogen- Reste 1 bis 546 umfaßt. Die mit 137-145 gekennzeichneten Aminosäuren sind die N-terminalen Reste einer Peptidsequenz, die die u-PA-Reste 137-411 umfaßt.
Die mit * markierten Nucleotide sind diejenigen Nucleotide, mit denen im Verlauf der Erzeugung der NarI- und SstI-Restriktionsstellen ohne eine Veränderung der codierten Aminosäuren die nativen Nucleotide substituiert worden sind.
Der erste Vektor, der den benötigten Teil der Plasmiflogen codierenden Sequenz (Kringle 1 bis 5) trägt und in den in der Nucleotidposition 1758 eine NarI-Stelle eingeführt ist, läßt sich vorteilhafterweise nach der vorstehend beschriebenen Strategie A erhalten.
Der zweite Vektor, der den benötigten Teil der u-PA codierenden Sequenz, d.h. die B-Kette trägt, und der eine SstI-Stelle 5'-seitig zum B-Ketten codierenden Bereich aufweist, kann günstig durch herkömmliche Mutagenesetechniken zur Einführung der SstI-Stelle in einen das u-PA-Polypeptid codierenden Vektor (C), vorteilhafterweise in der Nucleotidposition 563, eingeführt werden. Es ist günstig, daß u-PA- Polypeptid zwischen die HindIII- und BglII-Stelle eines geeigneten Vektors, wie z.B. pTRE12 (EP-A-0 201 153) zu setzen.
Die Expression des den Hybrid-PA codierenden DNA-Polymers in einer rekombinanten Wirtszelle kann mit Hilfe eines replizierbaren Expressionsvektors ausgeführt werden, der fähig ist, das DNA-Polymer in der Wirtszelle zu exprimieren. Der Expressionsvektor ist neu und stellt einen Teil der Erfindung dar.
Der replizierbare Expressionsvektor kann erfindungsgemäß hergestellt werden durch Spalten eines mit der Wirtszelle kompatiblen Vektors, um so einen linearen DNA-Abschnitt bereitzustellen, der ein intaktes Replikon aufweist, und durch Kombinieren des linearen Abschnittes unter Ligationsbedingungen mit einem oder mehreren DNA-Molekülen, die zusammen mit dem linearen Abschnitt den hybriden PA codieren.
Das Ligieren des linearen Abschnittes mit mehr als einem DNA-Molekül kann nach Wunsch gleichzeitig oder nacheinander ausgeführt werden.
Somit kann das DNA-Polymer je nach Wunsch vorgebildet sein oder während der Konstruktion des Vektors erzeugt werden.
Die Wahl des Vektors ist zum Teil durch die Wirtszelle bestimmt, die prokaryontisch wie E. coli oder eukaryontisch wie Maus C127, Maus myeloma, Ovarzellen des Chinesischen Hamsters oder Hefe sein kann. Geeignete Vektoren schließen Plasmide, Bakteriophagen, Cosmide und rekombinante Viren ein.
Die Herstellung des replizierbaren Expressionsvektors kann man auf herkömmliche Weise mit den geeigneten Enzymen zur Restriktion, Polymerisation und Ligation der DNA nach Verfahren ausführen, die z.B. in Maniatis et al., wie vorstehend zitiert, beschrieben sind. Die Polymerisation und Ligation kann man, wie vorstehend für die Herstellung des DNA-Polymers beschrieben ist, durchführen. Eine Spaltung mit Restriktionsenzymen kann in einem geeigneten Puffer bei einer Temperatur von 20 bis 70ºC, normalerweise in einem Volumen von 50 ul oder weniger mit 0,1 bis 10 ug DNA durchgefühlt werden.
Erfindungsgemäß wird die rekombinante Wirtszelle durch Transformieren einer Wirtszelle mit einem erfindungsgemäßen replizierbaren Expressionsvektor unter Transformationsbedingungen hergestellt. Geeignete Bedingungen für die Transformation sind die herkömmlichen. Sie sind beschrieben, z.B. in Maniatis et al. (siehe oben) oder "DNA Cloning", Vol. II, D.M. Glover, Herausgeber, IRL Press Ltd., 1985.
Die Wahl der Transformationsbedingungen wird durch die Wirtszelle bestimmt. So kann ein Bakterienwirt wie E. coli mit einer Lösung von CaCl&sub2; behandelt werden (Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69 (1973), 2110) oder mit einer Lösung, die eine Mischung von RbCl, MnCl&sub2;, Kaliumacetat und Glycerin enthält, und danach mit 3-[N-Morpholino]- propan-sulfonsäure, RbCl und Glycerin. In Kultur gehaltene Säugerzellen können durch Calcium-Co-Präzipitation der Vektor-DNA auf die Zellen transformiert werden.
Die Erfindung erstreckt sich ferner auf eine mit einem erfindungsgemäßen replizierbaren Expressionsvektor transformierte Wirtszelle.
Das Züchten der transformierten Wirtszelle wird auf herkömmliche Weise, wie z.B. in der im vorstehend zitierten Maniatis et al. und "DNA Cloning" beschriebene Weise, unter Bedingungen ausgeführt, die eine Expression des Polymers erlauben. So wird die Zelle bevorzugt mit Nährstoffen versorgt und bei einer Temperatur unter 45 ºC gezüchtet.
Das hybride PA-Expressionsprodukt wird aus der Wirtszelle durch herkömmliche Verfahren gewonnen. So kann man, wenn die Wirtszelle ein Bakterium, wie E. coli ist, diese physikalisch, chemisch oder enzymatisch lysieren und das Protein-Produkt aus dem resultierenden Lysat isolieren. Wenn es sich bei der Wirtszelle um eine Säugerzelle handelt, kann man das Produkt im allgemeinen aus dem Nährmedium isolieren.
Das DNA-Polymer kann in Vektoren montiert werden, die zum Isolieren stabiler transformierter Säugerzell-Linien, die hybriden PA exprimieren, entworfen sind; z.B. Rinder- Papillomavirus-Vektoren oder amplifizierte Vektoren in Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (DNA Cloning Vol. II D.M. Glover, Herausgeber, IRL Press, 1985; Kaufman, R.J. et al., Molecular and Cellular Biology 5, 1750-1759, 1985; Pavlakis G.N. und Hamer, D.H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 397-401; Goeddel, D.V. et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 0093619, 1983).
Es ist einzusehen, daß je nach Wirtszelle der erfindungsgemäß hergestellte hybride PA in einem unterschiedlichen Ausmaß glykosyliert sein kann. Ferner kann man, wie von Pohl et al., Biochemistry 23 (1984), 3701-3707 beobachtet wurde, in unmodifiziertem, natürlich vorkommendem t-PA ebenfalls unterschiedliche Glykosylierungsgrade finden. Plasminogen zeigt ebenfalls unterschiedliche Glykosylierungsgrade (Hayes M.L., J. Biol. Chem. 254 (1979), 8768). Es werden ebenfalls mutante Formen des hybriden PAs in Betracht gezogen, in denen durch DNA- Rekombinationstechniken, wie z.B. EP-A-0238304, EP-A- 0225286, DE-3537176, WO 87/04722 oder EP-0236289 lehren, Glykosylierungsstellen entfernt worden sind. Es wird darauf hingewiesen, daß der erfindungsgemäße hybride PA solche glykosylierten Variationen einschließt.
Es ist ebenfalls selbstverständlich, daß in Abhängigkeit von den Expressionsbedingungen der erfindungsgemäß hergestellte hybride PA in der Ein- oder Zwei-Ketten-Form oder als Gemische daraus vorkommen kann. Die Erfindung betrifft all solche Formen.
Der erfindungsgemäße hybride PA umfaßt die B-Kette von nativem t-PA oder u-PA, die mit einer A-Kette verknüpft ist, die fünf von Plasminogen abgeleitete Kringle-Domänen und die verbindende Sequenz von Aminosäuren, enthaltend die t-PA-Reste 264 und 275 oder die u-PA-Reste 158 und 148, umfaßt.
Diese hybride PA-A-Kette kann man, wie in EP- 0 155 387 offenbart ist, als eine Kette eines fibrinolytisch aktiven Hybridproteins verwenden. Die hybride A-Kette, die diese hybride A-Kette codierende DNA und ein hybrides Protein, das die hybride A-Kette, verknüpft mit der B-Kette einer fibrinolytisch aktiven Protease, deren katalytische Stelle gegebenenfalls durch eine entfernbare Blockierungsgruppe blockiert ist, umfaßt, sind alle Teil der Erfindung.
Die hybride A-Kette kann man durch Abtrennung von der B-Kette durch milde Reduktion herstellen. Alternativ kann man die hybride A-Kette durch die Expression der sie codierenden DNA in einer rekombinanten Wirtszelle und Gewinnen des hybriden A-Ketten-Produktes herstellen. Das hybride Protein, das die mit der B-Kette einer fibrinolytisch aktiven Protease verknüpfte hybride A-Kette enthält, kann man herstellen durch
(a) Vermischen der A- und B-Kette unter oxidativen Bedingungen; oder
(b) Ligieren der die A-Kette codierenden DNA mit der DNA, die die B-Kette codiert, und Exprimieren der ligierten DNA in einen prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt; und
gegebenenfalls nachfolgendes Blockieren der katalytischen Stelle des hybriden Proteins mit einer entfernbaren Blockierungsgruppe.
Die Oxidations- und Reduktionsbedingungen entsprechen denen allgemein in EP-A-0 155 387 beschriebenen.
Das resultierende hybride Protein kann in allen für den hybriden PA selbst nachstehend beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen verwendet werden.
Der erfindungsgemäße PA oder Konjugate davon können weiter so derivatisiert werden, daß jede für die fibrinolytische Aktivität essentielle katalytische Stelle fakultativ durch eine entfernbare Blockierungsgruppe blockiert wird.
In der hier verwendeten Weise schließt der Ausdruck "entfernbare Blockierungsgruppe" Gruppen ein, die durch Hydrolyse in isotonem wäßrigen Medium bei 37ºC bei einem pH- Wert von 7,4 mit solch einer Geschwindig entfernbar sind, daß die Geschwindigkeitskonstante pseudoerster Ordnung für die Hydrolyse im Bereich von 10&supmin;&sup6; sec&supmin;¹ bis 10&supmin;² sec&supmin;¹, bevorzugter 10&supmin;&sup6; sec&supmin;¹ bis 10&supmin;³ sec&supmin;¹ ist.
Solche Blockierungsgruppen sind im Europäischen Patent Nr. 0009879 beschrieben und schließen Acylgruppen, wie gegebenenfalls substituierte Benzoyl- oder gegebenenfalls substituierte Acryloylgruppen ein.
Geeignete mögliche Substituenten für Benzoyl-Blockierungsgruppen schließen Halogen-, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl-, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkoxy-, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkanoyloxy-, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkanoylamino-, Amino-, oder p-Guanidino-Reste bzw. -Gruppen ein.
Geeignete mögliche Substituenten für Acrylovl-Blockierungsgruppen schließen C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl-, Furyl-, Phenyl- oder C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylphenylgruppen ein.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die entfernbare Blockierungsgruppe eine in der 3- oder 4-Position mit einem Halogenatom substituierte 2-Aminobenzoylgruppe, die gegebenenfalls weiter mit einer oder mehreren schwach elektronenziehenden oder elektronenschiebenden Gruppen substituiert ist, wobei die Geschwindigkeitskonstante pseudoerster Ordnung für die Hydrolyse des Derivats im Bereich 6,0 x 10&supmin;&sup5; bis 4,0 x 10&supmin;&sup4; sec&supmin;¹ liegt, wenn sie in einem Puffersystem (37ºC, pH-Wert 7,4) gemessen wird. das aus 0,05 M Natriumphosphat, 0,1 M Natriumchlorid, 0,01 % (Vol./Vol) Detergents, enthaltend Polyoxyethylensorbitanmonoleat mit einem Molekulargewicht von ungefähr 1300, besteht.
Die Geschwindigkeitskonstante pseudoerster Ordnung für die Hydrolyse des Derivats liegt im Bereich 6,0 x 10&supmin;&sup5; bis 2,75 x 10&supmin;&sup4; s&supmin;¹ bevorzugt im Bereich 6,0 x 10&supmin;&sup5; bis 2,5 x 10&supmin;&sup4; s&supmin;¹, bevorzugter bei 6,0 x 10&supmin;&sup5; bis 2,0 x 10&supmin;&sup4; s&supmin;¹, noch bevorzugter bei 6,0 x 10&supmin;&sup5; bis 1,5 x 10&supmin;&sup4; s&supmin;¹ und am bevorzugtesten bei 7,0 x 10&supmin;&sup5; bis 1,5 x 10&supmin;&sup4; s&supmin;¹.
Bevorzugt ist die 2-Aminobenzoylgruppe in der 4-Position mit einem Halogenatom substituiert.
Bevorzugt ist das Halogenatom ein Fluor-, Chlor- oder Bromatom.
Wenn die Gruppe weiter substituiert ist, schließen die bevorzugten Gruppen C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl-, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkoxy- und C&sub1;&submin;&sub6;- Alkenylsubstituenten in den 3- oder 5-Positionen des Rings ein.
Bevorzugt ist die Blockierungsgruppe 4-Fluor-2-aminobenzoyl, 4-Chlor-2-aminobenzyvl oder 4-Brom-2-aminobenzoyl.
Die vorstehend erwähnten substituierten 2- Aminobenzoyl-Blockierungsgruppen können zur Derivatisierung jedes Plasminogenaktivators, der die Serinprotease-Domäne von t-PA oder u-PA enthält, verwendet werden. Es wurde gefunden, daß diese neue Gruppe blockierter Enzyme, die unter den breite Umfang von EP-0009879 fallen, dort allerdings nicht spezifisch offenbart sind, eine Regeneration der funktionell aktiven Zentren mit Geschwindigkeitsraten eingehen, die Geschwindigkeitskonstanten pseudoerster Ordnung von 6 x 10&supmin;&sup5; bis 4 x 10&supmin;&sup4; sec&supmin;¹ entsprechen. Der letztere Bereich von Geschwindigkeitskonstanten ist besonders für die Bereitstellung fibrinolytischer Aktivität während der Behandlung von akutem Herzinfarkt mit thrombolytischen Mitteln geeignet.
Ein geeignetes Detergenz für den Puffer ist das Produkt mit dem Handelsnamen Tween 80.
Bevorzugte erfindungsgemäße Derivate schließen die nachfolgend genannten ein:
4-Chlor-2-aminobenzoyl plg 1-544/t-PA 262-527 (zwei Ketten) einschließlich glu&sub1; und lys&sub7;&sub8;-Varianten und Gemische davon, und
4-Chlor-2-aminobenzoyl plg 1-541/t-PA 262-527 (zwei Ketten) einschließlich der glu&sub1;- und lys&sub7;&sub8;-Varianten und Gemische davon.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Derivates bereit, wobei das Verfahren die Umsetzung des Plasminogenaktivators mit einem Blockierungsmittel JK umfaßt, wobei J eine Positionierungs-Gruppe, die die Bindung des Agens an die katalytische Stelle des Enzyms vermittelt, und K eine 2-Aminobenzoylgruppe darstellt, die in der 3- oder 4-Position mit einem Halogenatom und gegebenenfalls weiter mit einer oder mehreren schwach elektronenziehenden oder elektronenschiebenden Gruppen substituiert ist.
Beispiele für die Gruppe J schließen 4-Amidinophenyl und 2-Chlor-4-amidinophenyl ein.
Bevorzugte Agentien JK sind 4-Amidinophenyl-2'-amino- 4'-fluorbenzoat; 4-Amdinophenyl-2'-amino-4'-chlorbenzoat und 4-Amidinophenyl-2'-amino-4'-brombenzoat.
Die Blockierungsreaktionen werden bevorzugt im wäßrigen Medium bei einem pH-Wert im Bereich von 7,0 bis 8,5 und bei Temperaturen im Bereich 0ºC bis 30ºC ausgeführt. Der bevorzugte Konzentrationsbereich für das Blockierungsmittel ist 0,01 bis 2,0 millimolar, und der bevorzugte Konzentrationsbereich für das Enzym ist 1 bis 500 mikromolar.
In gewissen Fällen, insbesondere bei Plasminogenaktivatoren wie t-PA, und bei solchen, die strukturell mit Plasminogen verwandt oder davon abgeleitet sind, ist es erwünscht, die Blockierungsreaktion in Gegenwart von enzymsolubilisierenden oder -stabilisierenden Zusätzen, wie 1-Arginin, 1-Lysin oder 6-Aminohexansäure auszuführen. Es wurde festgestellt, daß diese Materialien mit den Blockierungsmitteln JK kompatibel sind.
Die Blockierungsmittel JK kann man durch Umsetzung der geeigneten substituierten Benzoesäure mit dem geeigneten Alkohol in einer organischen Base, wie Pyridin und in Gegenwart eines kondensierenden Agens, wie Dicyclohexylcarbodiimid herstellen. Die Kondensationsreaktion kann ohne vorherigen Schutz des 2-Aminosubstituenten in der Säurekomponente durchgeführt werden.
Die Vorstufe - substituierte Anthranilsäuren - kann man nach einer Reihe bekannter Verfahren herstellen. Im allgemeinen werden die relativen Positionen der gewünschten Substituenten das gewählte Ausgangsmaterial bestimmen. Wenn ein fakultativer Substituent, wie Methyl oder Methoxy benötigt wird, ist dieser im allgemeinen im Ausgangsmaterial vorhanden. Die Halo-, Amino- und Carboxyl-Gruppen werden durch herkömmliche aromatische Substitution nacheinander, wenn notwendig, in irgendeiner geeigneten Reihenfolge eingeführt. Amino- und Carboxylgruppen können in ihrer Vorstufenform bereitgestellt werden. Aminogruppen können durch Reduktion von Nitrogruppen erhalten werden. Carboxylgruppen kann man durch Oxidation von Methylgruppen oder durch Hydrolyse von Ester- oder Thioestergruppen erhalten. Während der sukzessiven Einführung von Substituenten kann es notwendig sein, Amino- und/oder Carboxylgruppen zu schützen.
Eine bevorzugte Route umfaßt die Herstellung eines geeigneten Aminotoluolderivats durch Reduktion des korrespondierenden Nitrotoluols, Schutz der Aminogruppe (z.B. durch Acetylierung), Oxydation der Methylfunktion zu einer Carboxylgruppe (z.B. mit Kaliumpermanganat) und ein Entfernen der Schutzgruppe durch Hydrolyse.
4-Halo-5-methylanthranilsäuren können hergestellt werden, indem man zuerst das Carboxylat in 4-Amino-m-toluolsäure mit Thionylchlorid-Dimethylamin (woraus sich das Dimethylamid ergibt) schützt, dann den Ring in der 2-Position mit einem Überschuß von Butyllithium/Acetylnitrat nitriert, die freie Aminogruppe diazotiert und durch ein Halogenatom mittels der Sandmeyer-Reaktion substituiert, die Nitrogruppe reduziert, wodurch sich das Amin in der 2-Position ergibt und schließlich das Dimethylamid zur freien Säure hydrolysiert. Dieselben Verbindungen (oder z.B. die entsprechenden 5-Methoxyderivate) können ebenfalls aus 4- Nitrotoluol oder 4-Nitroanisol hergestellt werden, indem man in der 2-Position mit Chlor/Aluminiumchlorid halogeniert, zum Amin, das dann durch Acetylierung geschützt wird, reduziert, eine Carboxylvorstufe durch elektrophile Substitution mit Aluminiumchlorid und Chlorameisensäureester oder -thioester inseriert und schließlich sowohl die Acetyl- als auch die Ester/Thioestergruppen hvdrolysiert, um die ungeschützten Amin- und Carboxylfunktionen freizusetzen.
Der erfindungsgemäße hybride PA und Derivate werden in Form eines Arzneimittels in geeigneter Weise verabreicht.
Dementsprechend stellt die Erfindung ein Arzneimittel bereit, das einen erfindungsgemäßen hybriden PA oder dessen Derivate in Kombination mit einer pharmazeutisch verträglichen Trägersubstanz umfaßt.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können nach Routineverfahren wie Arzneimittel, die für die intravenöse Verabreichung an Menschen adaptiert sind, formuliert werden.
Typische Zusammensetzungen für eine intravenöse Verabreichung sind Lösungen des sterilen Enzyms in sterilem, isotonem wäßrigen Puffer. Falls notwendig, kann die Zusammensetzung außerdem ein Lokalanaesthetikum, wie Lignocain zur Milderung des Schmerzes an der Injektionsstelle und ein solubilisierendes Agens enthalten, um den hybriden PA oder dessen Derivat in Lösung zu halten. Gewöhnlich wird der hybride PA oder dessen Derivat in der Form von Einheitsdosierungen, z.B. als ein trockenes Pulver oder als wasserfreies Konzentrat in einem hermetisch versiegelten Behälter, wie einer Ampulle oder einem Plastikbeutel, mit einer Kennzeichnung der Proteinmenge (in Aktivitätseinheiten geliefert. Wenn die Zusammensetzung ein erfindungsgemäßes Derivat umfaßt oder wenn der hybride PA eine entfernbare Blockierungsgruppe einschließt kann die Zeit angegeben sein, innerhalb derer das freie Protein freigesetzt wird. Wenn das Protein durch Infusion verabreicht werden soll, wird es mit Hilfe einer Infusionsflasche verabreicht, die steriles "Wasser zur Injektion" mit pharmazeutischem Gütegrad oder Kochsalzlösung enthält. Wenn das Protein durch Injektion verabreicht werden soll, wird es in einer Ampulle mit sterilem Wasser für die Injektion oder Kochsalzlösung geliefert. Die injizierbare oder zur Infusion geeignete Zusammensetzung kann durch Vermischen der Bestandteile vor der Verabreichung hergestellt werden.
Die Menge des verabreichten Materials hängt von der Menge der erforderlichen Fibrinolyse und ihrer erforderlichen Geschwindigkeit, der Schwere des thrombo-embolytischen Zustands und der Lage und der Größe des Gerinnsels ab. Die genaue zu verwendende Dosis und die Art der Verabreichung muß notwendigerweise in Hinsicht auf die Natur der Krankheit den Umständen gemäß durch die Behandlung des beaufsichtigenden Arztes erfolgen. Im allgemeinen wird jedoch ein Patient, der bezüglich eines Thrombus behandelt wird, eine tägliche Dosis von 0,01 bis 10 mg/kg Körpergewicht, z.B. 0,10 bis 2 mg/kg erhalten, entweder durch Injektion in beispielsweise bis zu fünf Dosierungen oder durch Infusion.
Innerhalb des oben angegebenen Dosierungsbereiches sind keine abträglichen toxikologischen Wirkungen der erfindungsgemäßen Verbindungen indiziert.
Demgemäß wird unter einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung ein Verfahren zur Behandlung thrombotischer Erkrankungen bereitgestellt, das ein Verabreichen einer wirksamen nicht-toxischen Menge von erfindungsgemäßem Hybrid-PA an den Leidenden umfaßt.
Ferner stellt die Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen hybriden PAs zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung thrombotischer Krankheiten bereit.
Die Erfindung stellt ebenfalls einen erfindungsgemäßen hybriden PA zur Verwendung als aktive therapeutische Substanz und insbesondere zur Verwendung bei der Behandlung thrombotischer Erkrankungen bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Behandlung von thrombo-ebolytischen Erkrankungen, insbesondere von akutem Herzinfarkt bereit, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen nicht-toxischen Menge eines erfindungsgemäßen Derivats umfaßt.
Die Erfindung stellt ferner die Verwendung eines erfindungsgemäßen Derivats zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von thrombo-embolytischen Erkrankungen, insbesondere von akutem Herzinfarkt bereit.
Unter einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein erfindungsgemäßes Derivat zur Verwendung als eine aktive therapeutische Substanz, insbesondere zur Behandlung thrombo-embolytischer Erkrankungen wie dem akutem Herzinfarkt bereit.
Die nachfolgenden Verfahren und Beispiele erläutern die Erfindung.

I. Allgemeine in den Beispielen verwendete Verfahren

(i) DNA-Spaltung

Im allgemeinen wurde die Spaltung von ungefähr 1 ug Plasmid-DNA oder von DNA-Fragmenten mit ungefähr 5 Einheiten eines Restriktionsenzyms (oder mit -enzymen) in ungefähr 20 ul einer geeigneten Pufferlösung ausgeführt.

(ii) Erzeugung glatter Enden:

Wenn glatte Enden benötigt werden, stellt man sie durch Behandlung der DNA-Präparation mit DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment, wie bei Maniatis et al., (Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) beschrieben, oder alternatuv (wenn angegeben) durch Spaltung mit Mung Bean-Nuclease (Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) her.

(iii) Erzeugung 'kohäsiver Enden' unter Verwendung von Linkern:

Kurze. durch Kinase phosphorylierte Oligonucleotid- Linker, die einzelne oder vielfache Restriktionsstellen codieren, wurden an glattendige Fragmente ligiert; der (die) Linker wurde(n) mit dem geeigneten Restriktionsenzym gespalten, um das für weitere Manipulationen notwendige 'kohäsive Ende' zu produzieren (Molecular Cloning-A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).

(iv) Ligation von DNA-Fragmenten:

Ligationsreaktionen wurden, wie in Maniatis et al., (Molecular Cloning - A Laboratory Marnial, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) beschrieben, ausgeführt.
(v) Zur Transformation von E.coli HB101 oder E.coli DH5α-Zellen mit Plasmid-DNA wurden von Gibco BRL (Paisley, Schottland) gelieferte kompetente HB101- oder DH5α-Zellen nach den Anweisungen des Herstellers verwendet.

(vi) Plasmidpräparation:

Eine Herstellung von Plasmid-DNA in großem Maßstab und Plasmid-Minipräparationen wurden wie in Maniatis et al. (Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1982)) beschrieben, ausgeführt.

(vii) Isolieren von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen mit niedrigem Schmelzpunkt (LMP, low-melting-point):

DNA-Fragmente wurden wie von Maniatis et al. (Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) beschrieben aus LMP-Agarosegelen isoliert. Alternativ wurde die ausgeschnittene Gel-Bande unter Verwendung von GENECLEAN (Stratech Scientific, London) nach Anweisungen des Herstellers gereinigt.

(viii) Oligonucleotide:

Oligonucleotide wurden nach den Anweisungen des Herstellers auf einem 381A-DNA-Synthesizer von Applied Biosystems hergestellt und, wie in Maniatis et al. (siehe oben) beschrieben, mit Kinase phosphoryliert. Wenn die Oligonucleotide bei der Plasmidkonstruktion verwendet wurden, wurden sie durch gemeinsames 5 minütiges Erhitzen auf 95ºC und langsames Abkühlen auf Raumtemperatur aneinandergelagert. Die aneinandergelagerten Oligonucleotide standen dann für die Ligation bereit. Wenn vier Oligonucleotide aneinandergelagert werden sollten, wurde die Aneinanderlagerungs- Reaktion wie vorstehend beschrieben, ausgeführt, aber sie wurde in Form zweier Reaktionen, von denen jede ein Paar komplementärer Oligonucleotide enthielt, durchgeführt. Nach dem Abkühlen wurden die beiden Reaktionen vor der Ligation vermischt.

(ix) DNA-Sequenzierung

(a) Einzelstrangverfahren

Die Bestimmung der Nucleotidsequenz wurde nach dem Didesoxy-Kettenabbruch-Verfahren nach Sanger, wie in S. Sanger, S. Nicklen und Coulson A.R. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467) beschrieben ist, unter Verwendung von ³&sup5;S markiertem dATP durchgeführt.

(b) Doppelstrangverfahren

Die Sequenzierung wurde unter Verwendung von 'Sequenase ' (United States Biochemmical Corporation) im wesentlichen nach den Anweisungen des Herstellers ausgeführt.

(x) Transiente Expression von Plasminogenaktiyatoren in HeLa-Zellen

(a) Kleiner Maßstab

Präparation der Zellen: Die Zellen wurden mit Trypsin behandelt und mit ungefähr 2,4 x 10&sup5; Zellen pro 35 mm-Schale ausplattiert und in 1,5 ml Wachstumsmedium (Wachstumsmedium ist Hepes-gepuffertes RPMI 1640-Medium (041-2400), das 10 % Serum (021-6010), 1 % Ausgangslösung von Penicillin/Streptomycin (043-5070), 2 % Natriumbicarbonatlösung (043-5080), 1 % Glutamin (stock) (043-5030) enthielt; Gibco, Paisley, Schottland) bei 37ºC in einem luftfeuchten Inkubator in einer Atmosphäre von 5 % CO&sub2;/95 % Luft inkubiert. Nach 72 Stunden wurden die Zellen wieder mit Nährstoff versorgt und 24 Stunden später zur Transfektion verwendet.
Transfektionsprozedur: 3 Stunden vor der Transfektion wurden die Kulturen in geändertes Medium (Eagle's MEM (041- 1095), 10 % Serum, 1 % Penicillin/Streptomycin, 1 % Glutamin und 1 % nicht-essentielle Aminosäuren (043-1140)) überführt. Wie in 'DNA Cloning', Herausgeber D.M. Glover (Kapitel 15, C. Gorman) beschrieben, wurden die Transfektionen durch Calcium-Copräzipitation vorgenommen. Glycerinschock- und 5 millimolar Butyrat-Behandlungen wurden angewandt. Der (die) von den transfizierten Zellen sekretierte(n) Plasminogenaktivator(en) wurde(n) in 1,0 ml RPMI 1640-Medium (wie vorstehend, aber serumfrei; enthaltend 4 % Sojabohnenpepton (Sigma)) nach 24 Stunden geerntet und die Aktivität wurde mit Hilfe von Fibrinplatten mit Bezugnahme auf normales t-PA gemessen (J.H. Robinson, Thromb. Res., 33 (1984), 155).
Alternativ wurden die HeLa-Zellen mit einer Dichte von 5 x 10&sup5; pro Platte plattiert. In diesem Fall wurden die Zellen nach nur 24 Stunden wieder mit Nährstoff versorgt und dann wie vorstehend verwendet.

(b) Großer Maßstab

Präparation der Zellen: Die Zellen wurden mit Trypsin behandelt und mit einer Dichte von ungefähr 2,5 x 10&sup6; Zellen pro 175 cm²-Kolben in 30 ml Wachstumsmedium (wie vorstehend) ausplattiert. Nach 72 Stunden wurden 25 ml zusätzliches Wachstumsmedium zugegeben und die Zellen wurden 24 Stunden später (wie vorstehend) zur Transfektion durch DNA verwendet. Pro Kolben wurden 25 ml Ernte-Medium verwendet.
Alternativ wurden die Zellen mit einer Dichte von ungefähr 2,0 x 10&sup6; Zellen pro Kolben ausplattiert, und nach 96stündiger Inkubation wurden 25 ml Wachstumsmedium zugegeben und die Zellen wie vorstehend verwendet.
Die beiden in den Protokollen für den kleinen und den großen Maßstab verwendeten Impfraten und Fütterungszeiten wurden so vorgenommen, daß sie eine günstige Zeitabfolge der Experimente erlaubten. Beide Sätze von Protokollen erlaubten eine effiziente Expression des Aktivators (der Aktivatoren).

(xi) Westernblotting/Immungold-Silberanfärbung

Nach SDS-PAGE wurden die Proteine durch elektrophoretischen Transfer bei 4ºC mit 40 V, 100 mA in 25 mM Tris/192 mM Glycin/20 % (Vol./Vol.) Methanol (pH-Wert von 8,3) über Nacht auf Nitrocellulose (NC) übertragen (blotted onto NC). Nicht abreagierte Stellen auf der NC wurden 1 Stunde mit 5 % Rinderserumalbumin (bovine serum albumin = BSA)/phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,2, blockiert.
Anschließend wurde 2 Stunden mit Kaninchen anti-t-PA-B-Ketten-IgG (48 ug/ml) in 1 % BSA/0,5 % Tween 80/PBS, pH 7,2 (Verdünnungsmittel) inkubiert. Die NC wurde dreimal 5 Minuten in 0,5 % Tween 80/PBS, pH 7,2, gewaschen und dann 1 Stunde mit einem zweiten biotinylierten Antikörper (Janssen; 2 ug/ml in Verdünnungsmittel) inkubiert. Die NC wurde wie vorstehend gewaschen und in Auroprobe BL plus Streptavidin (Janssen) 1:100 in Verdünnungsmittel 2 Stunden inkubiert. Die NC wurde wie vorstehend, danach 1 x 1 Minute in entionisiertem Wasser gewaschen und anschließend 15 bis 20 Minuten unter Verwendung des IntenSE II-Kits (Janssen) "Silber-verstärkt" (silver enhanced). Alle Schritte wurden unter sanftem Schütteln bei Raumtemperatur ausgeführt.

(xii) Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten

Die Geschwindigkeitskonstante mit pseudoerster Ordnung wird durch Hydrolysieren des Acyl-Enzyms unter physiologischen Bedingungen, d.h. in isotononem wäßrigem Medium bei einem pH-Wert von 7,4 und einer Temperatur von 37ºC bestimmt. In regelmäßigen Abständen werden Aliquots entnommen und mit einem chromogenen Substrat inkubiert, und die Umwandlungsgeschwindigkeit des Substrates wird, wie vorstehend angegeben, gemessen.
Die Hydrolyse wird bis zu dem Zeitpunkt verfolgt, an dem die Umwandlungsgeschwindigkeit des Substrates ein Maximum erreicht. Die Geschwindigkeitskonstante k läßt sich dann durch Auftragen von
Loge(1-At/Amax) gegen t
kalkulieren, wobei Amax die maximale Geschwindigkeit, mit der ein Aliquot das Substrat umwandelt und At die Geschwindigkeit ist, mit der ein Aliquot das Substrat zum Zeitpunkt t umwandelt.
Bevorzugt werden solche Geschwindigkeitskonstanten durch computerisierte nicht-lineare Regressionsanalyse kalkuliert, in dem die At- und Zeitergebnisse der Gleichung:
At = Ao + (Amax-A0 (1-e-kt)
angepaßt werden, wobei Ao die Aktivität der Acyl-Enzym-präparation vor der Deacylierung ist.

II. Identifizierung von Nucleotiden. Aminosäureresten, N-Termini, Proteindomänen und der Ketten-Natur in den Beispielen

(i) Sequenzen

Die gesamte Bezifferung von t-PA ist so wie in Pennica et al. (1983) (siehe oben) vorgenommen; die Bezifferung der Plasminogenaminosäuren basiert auf Sottrup- Jensen et al., Atlas of Protein Sequence and Sructure, Bd. 5, Suppl. 3 (1978), S. 91, National Biomedical Research Foundation, Silver Spring, MD, ist aber auf den neuesten Stand gebracht, um die von Forsgren, M. et al. FEBS Letters 213 (1987), 254-260 identifizierten Extraaminosäurereste zu berücksichtigen. Die Plasminogennucleotidsequenzen entsprechen denen in Forsgren et al. (siehe oben). Die gesamte Urokinasebezifferung entspricht Holmes et al, Bio Technology 3 (1985), 923-929.

(ii) N-Termini

1. t-PA:

Man nimmt normalerweise an, daß der reife N-Terminus mit dem ser&sub1; äquivalent ist (Pennica et al., 1983). Es gibt ebenfalls andere Formen, z.B. gly&submin;&sub3; oder val&sbplus;&sub4; (Pohl et al., FEBS Letters 168 (1986), 29-32).

2. Plasminogen:

glu&sub1; kennzeichnet das Protein, von dem man annimmt, daß es den nativen (naszierenden) Plasminogen N-Terminus, d.h. die Aminosäurereste von 1 aufwärts umfaßt.
lys&sub7;&sub8; kennzeichnet das Protein, von dem man annimmt, daß es den prozessierten lys&sub7;&sub8; N-Terminus umfaßt. Alternativ prozessierte N-Termini z.B. met&sub6;&sub9; und val&sub7;&sub9; sind in der Natur bekannt (Miyashita et al., 1988).

(iii) Protein-Domänen

Die in den Beispielen beschriebenen Protein-Domänen sind aus Bequemlichkeitsgründen abqekürzt und wie folgt definiert.

1. t-PA:

Ft = Aminosäurereste 6 bis 43 einschließlich
Gt = Aminosäurereste 51 bis 84 einschließlich
Bt = Aminosäurereste 276 bis 527 einschließlich

2. Plasminogen:

K1P = Aminosäurereste 84 bis 162 einschließlich
K2P = Aminosäurereste 166 bis 243 einschließlich
K3P = Aminosäurereste 256 bis 333 einschließlich
K4P = Aminosäurereste 358 bis 435 einschließlich
K5P = Aminosäurereste 462 bis 541 einschließlich
Die 5 Plasminogenkringle K&sub1;-K&sub5;
= Aminosäurereste 84 bis 541 einschließlich

(iv) Ketten-Natur

sc (single chain) kennzeichnet das Protein in der Einzel-Ketten-Form.
tc (two chains) kennzeichnet das Protein in der Zwei-Ketten-Form.

(v) Vektoren

pTRE12 - (EP-0201153) - Basisexpressionsvektor
pTRE15 - (EP-0201153) - codiert Wildtyp-t-PA
pTRE24 - (EP-0207589) - codiert des(cys&sub5;&sub1;-asp&sub8;&sub7;)-t-PA
pTR6F - (EP-0241208) - codiert eine t-PA-Fingerdomäne

III. Konstruktion und Expression hybrider Proteine

Die Expression der Proteine der Beispiele 1 bis wird in HeLa-Zellen ausgeführt.

Beispiel 1

Plasminogen 1-544/t-PA 262-527 (H204)

1.1 Konstruktion eines Plasminogen-cDNA tragenden Plasmids

Ein Plasminogen-cDNA-Clon wurde aus einer menschlichen Leber cDNA-Bank erhalten nach Screening mit einer Oligonucleotid-Sonde der Sequenz (A):
5' CC CCT CAC ACA CAT AAC AGG 3' (A),
die den Nucleotiden 49 bis 68 der in Malinowski et al., Biochemistry 23 (1984), S. 4243 beschriebenen Sequenz entspricht.
Die DNA-Sequenz des Teils des Plasminogen-cDNA-Clons, der die A-Kette des Proteins codiert, wurde bestimmt, und es wurden zwei Unterschiede zur Plasminogen-cDNA-Sequenz von Forsgren et al. (1987) festgestellt.
Das Nucleotid in der Position 846 ist T, das Nucleotid in der Position 948 ist G.
Es wurde gezeigt, daß das 5'-Ende des Clons dem Nucleotid 27 der Sequenz von Forsgren et al. (1987) entspricht.
Die Plasminogen-cDNA wurde in den Vektor pUC8 (Vieira and Messing, Gene 19 (1982), 259) zwischen die HincII- und die EcoRI-Stelle subcloniert, wodurch das Plasmid pTRH6 (Fig. 1a) erzeugt wurde.

1.2 Modifikation von pTRE12

Die einzige vorher im Plasmid pTRE12 (EP-A-0201 153) vorhandene NarI-Stelle wurde durch Restriktionsspaltung, Herstellung glatter Enden und der Re-Ligation zerstört, wodurch das Plasmid pTRE12 D Nar erzeugt wurde. Ein Entfernen der NarI-Stelle war bei der weiteren Manipulation hilfreich.

1.3 Konstruktion eines hybriden Plasminogen: t-PA cDNA-Moleküls (Plasmid pTRH204)

Die gesamte Bezifferung der Plasminogennucleotide entspricht Forsgren et al., (1987) (siehe oben).
Drei Fragmente wurden durch Restriktionsspaltung und Agarosegel-Elektrophorese präpariert. Diese Fragmente sind die folgenden:
Ungefähr 1.6 kb: Aus der Spaltung von pTRH6 mit HindIII plus AhaII (HindIII 5'-seitig der Plasminogen Codierenden Sequenzi bis AhaII(1572)).
II: Ungefähr 0,18 kb: aus einer Ahall plus DdeI-Spaltung von pTRH6 (AhaII (1572) bis DdeI (1748)).
III: Ungefähr 5,3 kb: größtes Fragment aus einer HindIII plus BglII-Spaltung von pTRE12D Nar. Dieses Fragment trägt pTRE12D Nar-Vektorfunktionen.
Die Fragmente (I, II, III) wurden mit einem durch Kinase phosphorylierten Oligonucleotid-Linker (Linker IV) ligiert, der zwei Oligonucleotide der Sequenz:
5' TCAGTGTGCGGCGCCTGGTACCA 3' (B)
5' GATCTGGTACCAGGCGCCGCACAC 3' (C)
umfaßt.
Nach der Transformation von E.coli HB101 wurde das Plasmid pTRH9 (Fig. 2) isoliert.
Die DNA im Plasmid pTRH9 codiert die Hauptmenge der Plasminogen-A-Kette bis hin und einschließlich von Prolin 544, d.h. die Kringle 1 bis 5; die DNA, die die Plasminogen- B-Kette und den Rest der A-Kette codiert, war nicht vorhanden. Die Verwendung von Linker IV in der Konstruktion von pTRH9 führt eine einzig vorkommende NarI-Stelle ein, wie man aus Tabelle 1 ersehen kann (diese zeigt die Verknüpfungsstelle der Fragmente II und III und den Linker IV). Tabelle 1 Verknüpfungsstelle der Fragmente II und III und des Linkers IV im Plasmid pTRH9 Fragment LinkerDie Plasminogen-Aminosäuresequenz ist gezeigt * Dieser Rest ist in der Plasminogen-cDNA ein C Die Nucleotidbezifferung ist oberhalb der Sequenz vorgenommen.
Das Plasmid pTRH9 wurde mit dem Restriktionsenzym BglII gespalten und mit dem aus pTRE15 (EP-A-0 201 153) isolierten 2 kb BglII-Fragment ligiert, das das reife t-PA- Polypeptid codiert.
Ein E. coli HB101-Clon, der die t-PA-Insertion in der selben Orientierung (5'-> 3') trägt wie die Plasminogen 'A'- Ketten-DNA, wurde isoliert; dieses Plasmid wurde mit pTRH20 bezeichnet (siehe Fig. D.)
Das Plasmid pTRH20 codiert ein Molekül, umfassend die fünf Kringle von Plasminogen (Reste 1 bis 544), die mit dem N-Terminus von reifem t-PA über das Tripeptid gly-thr-arg verknüpft sind. Die Verknüpfungsstelle der Plasminogen-A- Ketten-DNA und der t-PA-A-Ketten DNA des Plasmids pTRH20 ist in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Verknüpfungsstelle der Plasminogen-A-Ketten-DNA und der t-PA-A-Ketten DNA im Plasmid DTRH20 Plasminogensequenzen verknüpfendes Tripeptid t-PA-Sequenzen
Die die t-PA-A-Kette und einen Teil der B-Kette codierende DNA wurde von pTRH20 durch Restriktion mit NarI und SstI (befindet sich - wie von Pennica et al. 1983 beschrieben - beim t-PA-Nucleotid 1417) entfernt. Das SstI-NarI- Fragment (7,9 kb) wurde isoliert (Fragment V).
Aus pTRE15 wurde ein ungefähr 0,4 kb BanII-Fragment (Fragment VI) isoliert. Die beiden relevanten BanII-Stellen liegen bei den Nucleotiden 1024 und 1417 in der von Pennica et al. (1983) beschriebenen t-PA-cDNA-Sequenz, BanII hat eine degenerierte Erkennungsstelle, d.h.:
5' .... G Pu GC Py C 3'
3' .... C Py CG Pu G 5'
Es wird darauf hingewiesen, daß die BanII-Stelle bei 1417 mit der SstI-Stelle bei 1417 identisch ist, und das außerdem das erzeugte kohäsive Ende mit einem kohäsiven SstI-Ende kompatibel ist. Das 0,4 kb BanII-Fragment codiert den Hauptteil der t-PA-B-Kette.
Zwei Oligonucleotide (D) und (E):
wurden synthetisiert, mit Kinase phosphoryliert und kombiniert, um so den Linker VII zu erzeugen.
Der Linker VII hat ein kohäsives 5'-NarI-Ende, das mit dem kohäsiven NarI-Ende von Fragment V kompatibel ist und ein kohäsives 3'-BanII-Ende, das mit dem kohäsiven BanII-Ende (Nucleotid 1024) von Fragment VI kompatibel ist.
Die Fragmente V und VI wurden zusammen mit dem Linker VII ligiert und zur Transformation von E.coli HB101 verwendet. Es wurde ein Plasmid (pTRH204) mit der in Fig. 4 gezeigten Struktur isoliert.
Die Verbindungsstelle zwischen Fragment V und Linker VII ist in Tabelle 3 gezeigt.
Ein Verbinden der Fragmente V und VI über die kohäsiven BanII-(1417) und SstI-Enden vervollständigte die Rekonstruktion des die t-PA-B-Kette codierenden Bereichs. Tabelle 3 Verbindungsstelle zwischen dem Fragment V und dem Linker VII im Plasmid DTRH204 Plasminogensequenz t-PA-Sequenzen
Die Plasminogen- und t-PA-Aminosäuresequenzen der Verbindungsstelle sind gezeigt (Plasminogenbezifferung 539- 544 und t-PA-Bezifferung 263-266). Der mit * bezeichnete Serinrest kann als Äquivalent des Plasminogenserins 545 oder des t-PA-Serins 262 angesehen werden.
Das Plasmid pTRH204 wurde zur Transfektion menschlicher HeLa-Zellen verwendet (wie im Abschnitt Methoden beschrieben). Es produzierte einen neuen Plasminogenaktivator (H204), von dem angenommen wird, daß er die Struktur Plasminogen 1-544/t-PA 262-527 hat.

1.4 Alternative Prozedur für das Plasmid pTRH9

Der aus einer menschlichen Leber cDNA-Bank nach Screening mit der Oligonucleotid-Sonde (A) erhaltene Plasminogen-cDNA-Clon wird in den Vektor pTRE12 (EP-A-0 201 153) zwischen der HindIII- und BglII-Stelle subcloniert, wodurch das Plasmid pTRH3 (Fig. 1(b)) erzeugt wird. Die vorher im Plasmid pTRE12 vorhandene einzelne NarI-Stelle wird durch Restriktionsspaltung, durch glattendig machen und durch Re- Ligation zerstört. Ein Entfernen der NarI-Stelle erleichtert die weitere Manipulation.
Drei Fragmente von pTRH3 werden durch Restriktionsspaltung und Agarosegel-Elektrophorese präpariert. Diese Fragmente sind wie folgt:
I: Ungefähr 1,6 kb: Aus einer HindIII plus AhaII- Spaltung (HindIII [5'-seitig der Plasminogen codierenden Sequenz] bis AhaII(1572)).
II: Ungefähr 0,18 kb: aus einer AhaII plus DdeI-Spaltung (AhaII (1572) bis DdeI (1748)).
III: Ungefähr 5,3 kb: Größtes Fragment aus einer HindIII plus BglII-Spaltung, trägt die Vektorfunktionen von pTRH3.
Diese Fragmente (I, II, III) werden mit dem vorstehend beschriebenen mit Kinase phosphorylierten Oligonucleotid-Linker IV ligiert.

Beispiel 2

Plasminogen 1-544/t-PA 262-527 (arg&sub2;&sub7;&sub5;-> gln) (H205) Konstruktion des Plasmids pTRH205

Ein zu dem in Beispiel 1 hergestellten ähnliches Hybrid-Plasminogenaktivator-Molekül, das sich nur im t-PA-Aminosäurerest 275 unterscheidet, der anstelle von Arginin ein Glutamin ist, ist ebenfalls Teil dieser Erfindung.
Die diesen Plasminogenaktivator codierende DNA wurde im allgemeinen, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt, mit dem einzigen Unterschied in der Nucleotidsequenz des Linkers, in dem das arg-275 codierende Triplett CGC in Linker VII durch das gln-275 codierende CAG ersetzt wurde. Das resultierende Plasmid pTRH205 wurde zur Transfektion menschlicher HeLa-Zellen (wie in Methoden beschrieben) verwendet, und es produzierte einen neuen Plasminogenaktivator (H205), von dem angenommen wird, daß er die Struktur Plasminogen 1-544/t-PA 262-527 (arg&sub2;&sub7;&sub5;-> gln) besitzt.

Beispiel 3

Plasminogen 1-541/t-PA 262-527(H37)

Konstruktion des Plasmids pTRH37

Das Plasmid pTRH37 wurde konstruiert durch Ligieren zweier Fragmente von pTRH204 (Beispiel 1) mit dem Fragment VI aus pTRE15 und einem Oligonucleotid-Linker (Linker XI):

Fragment IX:

Ein 7,2 kb-Fragment von pTRH204 von der SstI-Stelle in dem die t-PA-B-Kette codierenden Bereich (Nucleotid 1417 in der t-PA-Sequenz) bis zur BstXI-Stelle in dem die Plasminogen-A-Kette codierenden Bereich (Nucleotid 1209 in der Plasminogensequenz (Fragment IX enthält somit alle Vektorsequenzen).

Fragment X:

Ein 484 bp-Fragment von pTRH204 von der BstXI-Stelle (1209) bis zur AvaII-Stelle in dem die Plasminogen A-Kette codierenden Bereich bei Nucleotid (1693).

Fragment VI:

(SstI-BanII) ist früher (Beispiel 1) beschrieben worden.
Der Linker XI wurde durch Aneinanderlagern von 4 Oligonucleotiden (H, I, J und K) mit den nachfolgenden Sequenzen erzeugt:
Ein Plasmid (pTRH37) mit der in Fig. 5 gezeigten Struktur wurde isoliert. Das Plasmid steuert, wenn es in menschliche HeLa-Zellen eingeführt wird, die Expression eines neuen Plasminogenaktivators (H37), der eine mit dem Protein H204 (Beispiel 1) identische Aminosäuresequenz hat, außer, daß er eine Deletion der Aminosäurereste Alanin (542), Alanin (543) und Prolin (544) unmittelbar C-terminal von der Kringle-Domäne Nr. 5, aufweist. Die Struktur des hybriden Proteins zwischen Kringle 5 und der Protease-Spaltstelle ist nachstehend in Einzelbuchstaben-Schreibweise aufgeführt: t-PA-B-Kette
Der Rest 541 ist das letzte Cystein in Kringle 5. Das mit einem Stern markierte Serin kann als Plasminogen- Serin&sub5;&sub4;&sub5; oder t-PA-Serin&sub2;&sub6;&sub2; angesehen werden.

Beispiel 4

Plasminogen 78-544/t-PA 262-527(HOO)

4.1 Konstruktion des 'lys&sub7;&sub8;-Kassetten'-Plasmids

Das lys&sub7;&sub8;-Kassetten-Plasmid ist eine Form des Plasmids pTRE12. Es enthält ein synthetisches DNA-Stück, das dazu benutzt werden kann, einen Plasminogen-Clon von der glu&sub1;-Form (glu&sub1; ist der normale sekretierte N-Terminus) in die lys&sub7;&sub8;-Form (lys78 ist dann die N-terminale Aminosäure) zu überführen.
Ein Paar der mit Kinase phosphorylierten Oligonucleotid-Linker (R+S und T+V), enthaltend die vier Oligonucleotide
wurde hergestellt und mit dem großen HindIII-BglII-Fragment aus pTRE12 ligiert.
Das resultierende Plasmid enthielt einen durch die Oligonucleotide gebildeten Bereich, der die Nucleotide 65 bis einschließlich 132 umfaßte, die verknüpft sind mit den Nucleotiden 364 bis einschließlich 450 von nativem Plasminogen. Diese Nucleotide codieren die von Forsgren et al. (1987) beschriebene Signalsequenz aus 19 Aminosäuren und die Aminosäuren 78 bis einschließlich 106 der Plasminogen-A- Kette. Eine einzig vorkommende KpnI-Stelle wurde eingeführt (Tabelle 4). Die Struktur der Oligonucleotid-Insertion wurde durch DNA-Sequenzierung verifiziert. Tabelle 4 Struktur der lys&sub7;&sub8;-Kassetten-Insertion
Die kohäsiven HindIII- und BglII-Enden wurden zur Clonierung in die HindIII-BglII-Stellen in pTRE12 benutzt. SfaN1 spaltet an einer Stelle, die abseits von seiner Erkennungsseguenz liegt. gly* kennzeichnet den letzten Rest der Signalsequenz; cys&spplus; ist der erste Rest der K&sub1;P-Domäne.

4.2 Konstruktion des Plasmids pTRH34 (Plasminogen 1- 561/t-PA 276-527)

Das Plasmid pTRH34 wurde im wesentlichen analog zum Plasmid pTRH204 (Beispiel 1) durch Ligation der Fragmente V und VI zusammen mit einem Linker konstruiert. Anstelle des Linkers VII wurde jedoch der Linker VIII verwendet. Der Linker VIII wurde durch Aneinanderlagern zweier Oligonucleotide (F und G) gebildet:
Es wurde das Plasmid pTRH34 mit der in Fig. 6 gezeigten Struktur isoliert. Das Plasmid pTRH34 steuert, wenn es zur Transfektion menschlicher HeLa-Zellen verwendet wird, die Synthese eines neuen Plasminogen-Aktivators, der die gesamte direkt mit der vollständigen t-PA-B-Kette (ile&sub2;&sub7;&sub6;- pro&sub5;&sub2;&sub7;) verknüpfte Plasminogen-A-Kette (glu&sub1;-arg&sub5;&sub6;&sub1;) umfaßt.

4.3 Konstruktion des Plasmids pTRH00

Das Plasmid pTRH00 ist eine Form des Plasmids pTRH204 (Beispiel 1), in dem die Nucleotidsequenz, die die Aminosäuren glu&sub1;-lys&sub7;&sub7; des Plasminogenproteins codiert, deletiert worden ist.
Die folgenden DNA-Fragmente wurden durch Restriktionsendonuclease-Spaltung und Agarosegel-Elektrophorese präpariert.
Fragment I: Umgefähr 160 bp; aus einer HindIII plus SfaN1-Spaltung des lys&sub7;&sub8;-Kassetten-Plasmids von Beispiel 4.1 [d.h. von der HindIII-Stelle am 5'-Ende der Oligonucleotid- Linker-Sequenz bis zur internen SfaN1-Stelle - vgl. Tabelle 4]. Es trägt eine Nucleotidsequenz, codierend die Signalsequenz von 19 Aminosäuren, wie sie bei Forsgren et al. (1987) beschrieben ist, die mit den Aminosäuren 78 bis einschließlich 104 (das SfaN1-überstehende Stück erstreckt sich bis zu den Aminosäuren 105 und 106) der Plasminogen A-Kette verknüpft ist.
Fragment II: Ungefähr 772 bp; aus einer SfaN1 plus BstXI-Spaltung von pTRH34 von Beispiel 4.2 [SfaN1(437) bis BstXI(1209)]. Es trägt den größten Teil von K1P, das gesamte K2P und K3P und den N-terminalen Abschnitt von K4P.
Fragment III: Ungefähr 7 kb; aus einer BstXI- und HindIII-Spaltung von pTRH204 (BstXI spaltet bei (1209) und HindIII liegt 5'-seitig zur Plasminogen codierenden Sequenz). Es enthält von K4P den größten Teil, und enthält vollständig K5P, Bt und die Vektorfunktionen von pTRE12. Diese Fragmente wurden ligiert, und nach ihrer Verwendung zur Transformation von E.coli HB101 wurde das Plasmid pTRH00 isoliert (Fig. 7). pTRH00 wurde zur Expression des neuen hybriden Plasminogenaktivators HOO in HeLa-Zellen verwendet.

Beispiel 5

t-PA 1-50/t-PA 88-91/pro-gly-ser/Plasminogen 84- 544/t-PA 262-527 (H01)

Das Plasmid pTRH01 wurde so entworfen, daß es ein reifes Protein codiert, in dem die Ft-codierende Domäne von t-PA mit dem 5'-Ende der K1P-codierenden Domäne des Plasmids pTRH00 (Beispiel 4) verknüpft ist; die schematische Domänenstruktur des codieren nativen Proteins kann wie folgt abgekürzt werden:
FtK&sub1;PK&sub2;PK&sub3;PK&sub4;PK&sub5;PBt

Konstruktion des Plasmids pTRH01

Zwei DNA-Fragmente wurden durch Restriktionsendonuclease-Spaltung und Agarosegel-Elektrophorese präpariert. Diese Fragmente waren die folgenden:
Fragment I: Ungefähr 360 bp: Aus einer HindIII- plus BamHI-Spaltung des Plasmids pTR6F (offenbart in EP-0241208). Die Insertion in pTR6F enthält den 5'-untranslatierten Bereich und die Signal/Pro-Bereiche ebenso wie die Ft-Domäne.
Fragment II: Ungefähr 8 kb: Aus einer HindIII- plus KpnI-Spaltung des Plasmids pTRH00 (Beispiel 4); es enthält K&sub1;P beinahe vollständig und enthält vollständig K&sub2;P, K&sub3;P, K&sub4;P, K&sub5;P, Bt und die Vektorfunktionen von pTRE12.
Diese Fragmente wurden mit einem durch Kinase phosphorylierten Oligonucleotid-Linker ligiert, der zwei Oligonucleotide (W und X) mit den nachfolgenden Sequenzen umfaßte:
Nach Transformation von E.coli wurde das Plasmid pTRH01 (Fig. 8) isoliert. Eine DNA-Sequenzierung bestätigte die Struktur der Ft/K&sub1;P-Verknüpfung (Tabelle 5).
pTRH01 wurde verwendet, um in HeLa-Zellen einen neuen hybriden Plasminogenaktivator (H01) zu exprimieren, von dem angenommen wurde, daß er die Sequenz t-PA 1-50/t-PA 88- 91/pro-gly-ser/Plasminogen 84-544/t-pA 262-527 aufwies. Tabelle 5 Verknüpfung der Fragmente I und II und des Linkers (W + X) im Plasmid pTRH01 Fragment Linker

Beispiel 6

t-PA 1-91/pro-gly-ser/Plasminogen 84-544/t-PA 262-527 (H02)

Das Plasmid pTRH02 wurde entworfen, um ein reifes Protein zu codieren, in dem die Ft- und Gt-codierenden Domänen von t-PA mit dem 5'-Ende der K&sub1;P-codierenden Domäne aus Plasmid pTRH00 (Beispiel 4) verknüpft sind; die schematische Domänenstruktur des codierten nativen Proteins kann man wie folgt abkürzen:
FtGtK&sub1;PK&sub2;PK&sub3;PK&sub4;PK&sub5;PBt

6.1 Präparation der DNA, die die t-PA-Finger- und Wachstumsfaktor-Domänen (plus die t-PA Signal/pro- und 5'- untranslatierten Bereiche) codiert

6 ug des Plasmids pTRE15 (beschrieben in EP-A- 0 201 153) wurden mit MaeII gespalten. Die MaeII gespaltene DNA wurde glattendig gemacht, und mit Kinase phosphorylierte BamHI-Linker (0,1 A&sub2;&sub6;&sub0; Einheiten; Amersham DC1203) der Sequenz 5'CCCGGATCCGGG3' wurden mit 5 ug der glattendigen MaeII-Fragmente ligiert. Nach der Ligation wurde der Überschuß der Linker entfernt und kohäsive, "klebrige" Enden durch Spaltung mit BamHI erzeugt. Die BamHI-Spaltung wurde auf einem 1%igen, niedrigschmelzenden Agarosegel elektrophoretisiert. Auf diesem Gel gab es eine Gruppe von drei Banden mit Beweglichkeiten zwischen denen der Fragmente mit 1353- und 872-Basenpaaren, die in einer Lambda DNA-HindIII/X174RF-HaeIII-Spaltung (Drigest TMIII, Parmacia) zu finden sind. Die größte dieser drei Banden mit ungefähr 1200 bp wurde gewonnen (es wurde kein besonderer Versuch unternommen, sicherzustellen, daß die anderen Banden mit einer ähnlichen Beweglichkeit diese Präparation nicht kontaminierten, da unerwünschte Moleküle bei der Clonierungsstrategie eliminiert wurden). Das 1200 bp-Fragment wurde mit HindIII gespalten, um das gewünschte ungefähr 470 bp-Fragment mit einem kohäsiven 5'-HindIII-Ende und einem kohäsiven 3'- BamHI-Ende (aus der MaeII-Stelle umgewandelt) zu erzeugen.
Diese eine Finger-plus-Wachstumsfaktor-Domäne codierende DNA wurde zwischen die HindIII- und BanHI-Stellen in das Plasmid pTRE12 (EP-A-0207589) subcloniert, wodurch das Plasmid pTR6FG erzeugt wurde. PTR6FG trägt ebenfalls den 5'-untranslatierten Bereich und die Signal/Pro-Bereiche.

6.2 Konstruktion von pTRH02

Zwei DNA-Fragmente wurden durch Restriktionsendonuclease-Spaltung und Agarosegel-Elektrophorese präpariert. Diese Fragmente waren die folgenden:
Fragment I: ungefähr 470 bp: aus einer HindIII- plus BamHI-Spaltung des Plasmids pTR6FG.
Fragment II: Ungefähr 8 kb: aus einer HindIII- plus KpnI-Spaltung des Plasmids pTRH00 (Beispiel 5). Es trägt beinahe das gesamte K&sub1;P, vollständig K2P, K3P, K4P, K5P, Bt und die Vektorfunktionen von pTRE12.
Diese Fragmente wurden mit einem mit Kinase phosphorylierten Oligonucleotid-Linker ligiert, der die beiden Oligonucleotide (W) und (X) von Beispiel 5 umfaßte.
Nach Transformation von E.coli wurde das Plasmid pTRH02 isoliert (Fig. 9).
Das Plasmid pTRH02 wurde in HeLa-Zellen zur Expression eines neuen hybriden Plasminogenaktivators (H02) verwendet, von dem angenommen wurde, daß er die Sequenz t-PA 1- 91/pro-gly-ser/Plasminogen 84-544/t-PA 262-527 hatte.

Beispiel 7

Plasminogen 1-546/u-PA 137-411(H25)

Konstruktion des Plasmids pTRH25

Ein menschlicher Urokinase-cDNA-Clon wird mit Hilfe einer Oligonucleotid-Sonde identifiziert und durch herkömmliche Verfahren isoliert (Homes et al., Bio Technology 3 (1985), 923-929). Um eine SstI-Stelle beim Nucleotid 563 und eine BglII-Stelle im 3'-untranslatierten Bereich einzubauen, wird der cDNA-Clon durch herkömmliche in vitro-Mutagenese- Techniken modifiziert. Die Aminosäuren 143 und 144 werden dann durch die Nucleotid-Tripletts GAG CTC statt durch die nativen GAA TTA (Plasmid pTRU2) codiert.
Zur Erzeugung der das Hybridenzym codierenden Sequenz wird das Plasmid pTRH9 (Beispiel 1) mit NarI und BglII gespalten und das Fragment I mit ungefähr 7 kb (das Vektorfunktionen und den größten Teil des die Plasmin-A- Kette codierenden Bereichs trägt) wird isoliert. Das Plasmid pTRU2 wird mit SstI und BglII gespalten und das die Urokinase-B-Kette codierende Fragment II isoliert. Ein aus den beiden mit Kinase phosphorylierten Oligonucleotiden Y und Z zusammengesetzter Oligonucleotid-Linker III wird hergestellt.
Die Fragmente I und II und der Linker III werden ligiert und E. coli HB101 wird transformiert, und das Plasmid pTRH25 wird isoliert (Fig. 10). Das neue Plasmid codiert ein neues hybrides Enzym. Es wird angenommen, daß die Struktur im Bereich der Verbindung zwischen Fragment I, Fragment II und dem Linker III so ist, wie sie in Tabelle 6 gezeigt wird. Tabelle 6 Plasminogen-Sequenzen Urokinase-Sequenzen
Das Plasmid pTRH25 wird zur Transfektion menschlicher HeLa-Zellen verwendet und produziert einen neuen Plasminogen-Aktivator

Beispiel 8

Expression von Plasminogen 1-544/t-PA 262-527 (H204) in Ovarzellen des Chinesischen Hamsters

Das Plasmid pSV&sub2;dhfr wurde von der American Type Culture Collection erhalten (ATCC 37146 : Molec. Cell. Biol. 1: (1981), 854-864). Das Plasmid BPV-MT-Xho wurde von D. Hamer (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland) erhalten. Es enthält eine Version des Mäuse-Metallothionein-I- Gens (Hamer and Walling; J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 273- 288), in dem die direkte 5'-seitig vom Translationsstartpunkt liegende BglII-Stelle durch Verwendung von Linkern in eine XhoI-Stelle überführt worden ist. Das t-PA-Mutein-Plasmid pTRE24 wurde früher (EP 0 207 589) beschrieben.

8.1 Konstruktion eines amplifizierbaren Expressionsvektors

a. Konstruktion von pTRH69

Das Plasmid pTRH69 wurde aus den beiden Fragmenten A und B, die aus dem Plasmid PSV&sub2;dhfr bzw. dem Plasmid BPV-MT- XhoI isoliert worden waren, erhalten.
Fragment A: Das Plasmid PSV&sub2;dhfr (Fig. 11) wurde mit EcoRI linearisiert, durch Auffüllen glattendig gemacht und mit XhoI-Linkern versehen. Das linearisierte Plasmid wurde dann mit XhoI und BglII gespalten, wodurch das Fragment A (ein 3,4 kb-Fragment, das die Dihydrofolat-Reduktase cDNA und frühe Promotorsequenzen von SV&sub4;&sub0; codiert) freigesetzt wurde.
Fragment B: Das Plasmid BPV MT-XhoI wurde mit SstI linearisiert, durch Nucleaseverdau glattendig gemacht und mit BglII-Linkern versehen. Das linearisierte Plasmid wurde dann mit HindIII gespalten, durch Auffüllreaktion glattendig gemacht und mit XhoI-Linkern versehen. Das Plasmid wurde dann mit BglII und XhoI gespalten, wodurch das Fragment B (0,3 kb, die 3'-Metallothionein-Polyadenylierungssequenzen codierend) freigesetzt wurde (Fig. 12).
Die Fragmente A und B wurden durch LMP-Aqarose-Elektrophorese isoliert und miteinander ligiert. Mit der ligierten DNA wurde E.coli HB101 transformiert und das Plasmid PTRH69 erhalten (Fig. 13).

b. Konstruktion von pTRH71

Das Plasmid pTRH69 wurde mit XhoI linearisiert und mit Phosphatase behandelt. Das über LMP-Agarose gereinigte Fragment wurde mit einem aus dem Plasmid pTRE24 abgeleiteten 3,3 kb XhoI-Fragment ligiert, das ein modifiziertes t-PA- Protein codiert. Mit der ligierten DNA wurde E.coli HB101 transformiert, und das Plasmid pTRH71 wurde erhalten (Fig. 14).

c. Konstruktion von pTRH11

Das Plasmid pTRH71 wurde mit MluI und BamHI gespalten; ein 4,5 kb-Fragment, das die Vektorfunktionen enthält, wurde durch LMP-Agarosegel-Reinigung isoliert und ligiert mit einem aus pTRH204 (Beispiel 1) isolierten 4,1 kb MluI/BamHI-Fragment, das das hybride Protein H204 codiert. Mit der ligierten DNA wurde E.coli HB101 transformiert, und das Plasmid pTRH11 wurde erhalten (Fig. l5).

8.2 Expression von hybridem Protein

a. Zellpräparation

CHO-Zellen wurden mit Trypsin behandelt und mit 5 x 10&sup5; pro 60 mm Platte ausplattiert und in einem luftfeuchten Inkubator bei 37ºC in einer Atmosphäre von 5 % CO&sub2;/95 % Luft in inkubiert Wachstumsmedium (Hams F12-Nährmedium (041-1765) mit 1 % Glutamin (stock) (043-5030), 1 % Penicillin/Streptomycin (stock) (043-5070) und 10 % fötalem Kälberserum (013-6290); Gibco, Paisley, Schottland). Nach 18 Stunden wurden die Zellen erneut mit Nährstoff versorgt, nach weiteren 3 Stunden wurden die Zellen zur Transfektion mit DNA verwendet.

b. Transfektionsprozedur

Die Transfektionsprozedur wurde in Wachstumsmedium, wie in DNA Cloning, Herausgeber D.M. Glover (Kapitel 15, C. Gorman) beschrieben, durch Calcium-Co-Präzipitation und Glycerin-Schock ausgeführt. Nach der Transfektion wurden die Zellen vor der Selektionsprozedur 46 Stunden unter Wachstumsbedingungen (wie vorstehend) in Wachstumsmedium gehalten.

c. Selektion und Co-Amplifikation

Die Selektions- und Co-Amplifikationsprozedur wurde im wesentlichen nach R.J. Kaufman, Molecular and Cellular Biology 5 (1985), 1750-1759 ausgeführt. 46 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit anderem Medium versehen. Sie wurden in Selektivmedium (Eagles MEM (041-1095) mit 1 % Natriumpyruvat (stock) (043-1360), 1 % Glutamin (stock) (043-5030), 1 % Vorrats-Penicillin/Streptomycin (043-5070) 0,35 % Prolin (22 mq/ml) und 10 % dialysiertem fötalem Kälberserum (063-6300) (Gibco, Paisley, Schottland) gebracht. Die Zellen wurden 8 bis 10 Tage in Selektiv-Medium gehalten, bis Kolonien von dhfr&spplus;-Zellen erschienen. Sobald sich Kolonien herausgebildet hatten, wurde das Medium gewechselt, und die Zellen in Selektivmedium gebracht, das Methotrexat (A6770; Sigma, England) enthielt. Nach 6 Tagen in Methotrexat enthaltendem Selektivmedium wurde das Selektivmedium durch Ersetzen der Eagles MEM-Natriumpyruvat-Bestandteile gegen α MEM (041-02561) modifiziert. Die Methotrexatkonzentration betrug anfangs 0,02 uM und wurde schrittweise auf 0,05 uM erhöht.

d. Nachweis des hybriden Proteins H204

Während der Amplifikationsprozedur wurden Aliquots des Wachstumsmediums der wachsenden Zellen auf die Produktion von Plasminogenaktivator hin durch Fibrinplatte und Zymographie, wie von Dodd et al., Thrombosis and Haemostasis, 55 (1986), 94-96 beschrieben, analysiert. Die Zymographie enthüllte ein fibrinolytisch aktives Protein mit einem apparenten Mr von ungefähr 100 000, was mit dem erwarteten Molekulargewicht des hybriden Proteins H204 konsistent ist.

IV. Reinigung und post-synthetische Modifikation der hybriden Proteine

Beispiel A

Reinigung von Plasminogen 1-544/t-PA 262-527 (H204)

200 ml konditioniertes Erntemedium, das aus mit dem Plasmid pTR H204 (Beispiel 1) transfizierten HeLa-Zellkulturen erhalten wurde, wurde 30 Minuten bei 9000 g zentrifugiert, und der Überstand wurde verwendet. Er wurde auf eine Säule (Innendurchmesser 90 mm; Höhe 220 mm) von Sephadex G25*, die in PBS (Dulbecco A)/0,01 % Tween 80, pH 7,4 (PBS/TW) äquilibriert war. Die ersten ungefähr 0,35 vt wurden verworfen. Die folgenden 500 ml wurden weiter verwendet. Sie wurden auf Zinkchelatsepharose (Vt=80 ml) und Lysin-Sepharose (Vt= 20 ml) in der im wesentlichen wie früher beschriebenen Weise (Dodd, I. et al. FEBS Lett 209 (1986a), 13) chromatographiert. Der Hauptunterschied war, daß der gereinigte Aktivator von der zweiten Säule mit 0,05 Natriumphosphat/0,1 M Natriumchlorid/0,01 % Tween 80, pH 7,4 (PST), enthaltend 0,02 M &epsi;-Aminocapronsäure (E-ACA) dissoziiert wurde. Aktive durch den PST/&epsi;-ACA-Puffer eluierte Fraktionen wurden mit dem chromogenen Substrat H-D- ile-pro-arg-p-nitroanilid identifiziert (Dodd, I. et al., Thromb. Haem. 55 (1986b), 94) und durch Ultrafiltration mit einer gerührten Zelle (stirred-cell ultrafiltration (YM10, Amicon)), konzentriert. Das ultrafiltrierte Retentat (2,0 ml) enthielt 14400 IU und 4800 SU (Dodd, I., et al. (1986b). Eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel- Elektrophorese (SDS-PAGE) mit nachfolgender Fibrin- Zymographie (Dodd, I. et al., 1986b) zeigte, daß das Produkt eine fibrinolytische Hauptspezies mit einem apparenten Mr von ungefähr 100 000 enthielt, was mit der Isolierung einer glu&sub1;-Form des hybriden Aktivators konsistent ist. * Sephadex und Sepharose sind Warenzeichen

Beispiel B

Synthese des lys&sub7;&sub8;-tc-H204-Proteins (Zwei-Ketten- Plasminogen 78-544/t-PA 262-527)

Eine Präparation des gereinigten H204-Proteins aus Beispiel A, bei dem ein Pufferaustausch zu PST/10 mg ml&supmin;¹ Mannit/50 uM &epsi;-ACA vorgenommen war (89 000 IU, 1,9 ml), wurde mit einem 0,01-fachem molaren Überschuß von Plasmin 16 Stunden bei 25ºC behandelt und dann bei -40ºC gelagert. Eine nachfolgende Analyse des Produktes zeigte, daß es 68 000 IU und 32 000 SU enthielt. Der Aktivator hat ein apparentes Mr von ungefähr 90 000 nach SDS-PAGE mit anschließender Fibrin- Zymographie. Die lys-, tc-Natur des Produktes wurde durch SDS-Page bestätigt, auf die ein Immunbloting unter Verwendung eines polyclonalen Antikörpers gegen die t-PA-B-Kette folgte (vgl. Methodenabschnitt).

Beispiel C

Präparation von 2-Amino-4-chlorbenzoylplasminogen 78- 544/t-PA 262-527 (zwei Ketten- aus HeLa-Zellen

Gereinigtes lys&sub7;&sub8;-tc-H204-protein aus Beispiel B (3900 SU) in PST/12,5 uM &epsi;-ACA/2,5 mg ml&supmin;¹ Mannit (1 ml) wurde mit einer 5 mM-Lösung von 4-Amidinophenyl-2'-amino-4'- chlorbenzoat-hydrochlorid (nachstehendes Beispiel 11) in Dimethylsulfoxid (2 ul, 20 eq) behandelt. Nach 1stündiger Inkubation bei 25ºC wurde eine 40%-ige Inhibition festgestellt. Ein weiteres Aliquot (4 ul, 40 eq) Acylierungsmittel-Lösung wurden zugegeben, und nach einer weiteren Stunde bei 25ºC erhielt man 93 % Inhibition. Mit einer Sephadex G25 (PD 10)-Säule wurde der Puffer des Materials gegen PST/166 uM &epsi;-ACA/1,66 mg ml&supmin;¹ Mannit (1,35 ml) ausgetauscht, und das Material wurde bei -40ºC eingefroren.
Das Material wurde durch Verdünnung einer Vorratslösung (0,3 ml) mit PST (0,2 ml) deacyliert, wodurch sich am Ende eine Lösung von PST/100 uM &epsi;-ACA/1 mg ml&supmin;¹ Mannit ergab. Die Deacylierungsgeschwindigkeit im vorstehenden Puffersystem betrug 1,05 x 10&supmin;&sup4; sec&supmin;¹ bei 37ºC, d.h. die t1/2 betrug 110 Minuten.

Beispiel D

Reinigung von Plasminogen 1-544/t-PA 262-527 (arg&sub2;&sub7;&sub5;-> gln) (H205)

515 ml konditioniertes Erntemedium, das aus mit pTRH205 (Beispiel 2) transfizierten HeLa-Kulturen erhalten wurde, wurde im wesentlichen analog zu Beispiel A gereinigt. Der Hybrid-Aktivator wurde von der Lysin-Sepharose-Säule mit PST/20mM &epsi;-ACA eluiert, durch Ultrafiltration konzentriert und dann durch Pufferaustausch in PST/10 mg ml&supmin;¹ Mannit/50 uM &epsi;-ACA (2,0 ml) gebracht. Das Produkt enthielt 18 000 TU und 6600 SU. Eine Analyse durch SDS-PAGE mit nachfolgender Fibrinzymographie zeigte, daß die Präparation 2 fibrinolytische Hauptspezies enthielt mit apparenten Mr von ungefähr 100 000 und 90 000. Es wird angenommen, daß es sich um die glu&sub1;- und lys&sub7;&sub8;-Formen des hybriden Aktivators handelt.

Beispiel E

Reinigung von Plasminogen 1-541/t-PA 262-527 (H37)

510 ml geklärtes, konditioniertes Erntemedium, das aus mit dem Plasmid pTR H37 (Beispiel 3) transfizierten HeLa-Zellkulturen erhalten worden war, wurde im wesentlichen analog zum im Beispiel A beschriebenen H204 gereinigt. Der Hybrid-Aktivator wurde von der Lysin-Sepharose-Säule mit PST/20 uM &epsi;-ACA dissoziiert, durch Ultrazentrifugation konzentriert und dann durch Pufferaustausch in PST/10 mg ml&supmin;¹ Mannit/50 uM &epsi;-ACA (2,0 ml) gebracht. Das Produkt enthielt 36 000 IU und 15 000 SU. Eine Analyse durch SDS-PAGE mit nachfolgender Fibrinzymographie zeigte, daß die Präparation zwei fibrinolytische Hauptspezies mit apparentem Mr von ungefähr 100 000 und 90 000 enthielt. Es wird angenommen, daß es sich hierbei um die glu&sub1;- und lys&sub7;&sub8;-Formen des Aktivators handelt. Eine SDS-PAGE, gefolgt von einer Silberanfärbung des nicht-reduzierten Aktivators zeigte, daß die Präparation Hauptproteinbanden mit einem ungefähren Molekulargewicht von 90 000 enthielt.
Eine Analyse durch SDS-PAGE mit nachfolgendem Immunblotting unter Verwendung eines polyclonalen Antikörpers gegen die t-PA-B-Kette stützte die Zymographie-Ergebnisse, die das Vorhandensein der glu&sub1;- und lys&sub7;&sub8;-Formen zeigten, und verdeutlichten ferner, daß das gesamte Produkt zweikettig war.

Beispiel F

Herstellung des lys&sub7;&sub8; tc-H37-Proteins (Zwei-Ketten- Plasminogen 78-541/t-PA 262-527)

Entsprechend Beispiel E hergestelltes gereinigtes H37-Protein (0,28 ml, 7400 SU/ml), das gleiche Mengen der glu&sub1;- und lys&sub7;&sub8;-Formen enthielt, wurde 17 Stunden bei 37ºC entweder mit einem 0,03-fach molaren Überschuß von Plasmin oder ohne einen solchen behandelt. Die Amid hydrolysierende Aktivität (SU) beider Produkte war dieselbe, wie die einer Kontroll-Präparation, die bei -40ºC gelagert worden war. Eine Analyse durch SDS-PAGE mit nachfolgender Fibrinzymographie, zeigte, daß das mit Plasmin behandelte H37-Protein und - in einem geringeren Ausmaß - das plasminunbehandelte H37- Protein in die lys&sub7;&sub8;-Form überführt worden waren.

Beispiel G

Synthese von 2-Amino-4-chlorbenzoyl-Plasminogen 1- 541/t-PA 262-527 (zwei Ketten) und Plasminogen 78-541/t-PA 262-527 (zwei Ketten)

Gereinigtes H37-Protein aus Beispiel F (10 nMol) in PST/10 mg ml&supmin;¹ Mannit/50 uM &epsi;-ACA (2,0 ml) wurde bei 25ºC mit 4-Amidinophenyl-2'-amino-4'-chlorbebenzoat HCl (2 uMol, 40 ul) behandelt. Nach 60 Minuten war die amidhydrolysierende Aktivität der Präparation auf < 2 % der Originalaktivität abgesunken. Das Material wurde in PST/10 mg ml&supmin;¹ Mannit/50 ug &epsi;-ACA (3,0 ml) umgepuffert und bei -40ºC gelagert.
Ein Aliquot des acylierten Produktes wurde später mit 5 Volumina PST/10 mg ml&supmin;¹ Mannit/50 uM &epsi;-ACA verdünnt und seine Deacylierung bei 37ºC zugelassen.

Beispiel H

Reinigung von Plasminogen 78-544/t-PA 262-527 (H00)

500 ml konditioniertes Erntemedium, das aus mit dem Plasmid pTR H00 (Beispiel 4) transfizierten HeLa-Zellkulturen erhalten worden war, wurden durch Zentrifugation (9000 g/30 min) geklärt und, wie in Beispiel A für das H204-Protein beschrieben, gereinigt. Der Hybrid-Aktivator wurde von der Lysin-Sepharosesäule (Vt, 49 ml) mit PST/20 mM &epsi;-ACA eluiert, durch Ultrafiltration konzentriert und dann in einen anderen Puffer (PST/10 mg ml&supmin;¹ Mannit/50 uM &epsi;-ACA (2,1 ml)) gebracht. Das Produkt enthielt 5700 TU und 2700 SU. SDS-PAGE mit nachfolgender Fibrinzymographie zeigte die Anwesenheit einer hauptfibrinolytischen Spezies mit einem apparenten Mr von ungefähr 90 000. SDS-PAGE mit nachfolgender Proteinanfärbung oder nachfolgendem Immunblotting unter Verwendung eines polyclonalen Antikörpers gegen die t-PA-B-Kette zeigte, daß das Material in der Zwei-Ketten-Form vorlag. Diese Ergebnisse sind mit dem Isolieren des lys&sub7;&sub8;-tc-Hybrid-Plasminogenaktivators konsistent.

Beispiel I

Reinigung von t-PA 1-91/pro-gly-ser/Plasminogen 84- 544/t-PA 262-527 (H02)

380 ml konditioniertes Erntemedium, das aus mit dem Plasmid pTR H02 (Beispiel 6) transfizierten HeLa-Zellkulturen erhalten wurde, wurde durch Zentrifugation (9000 g/30 min) geklärt und im wesentlichen analog zum H204-Protein in Beispiel A gereinigt. Der hybride Aktivator wurde von der Lysin-Sepharose-Säule (Vt, 55 ml) mit PST/20 mM &epsi;-ACA dissoziiert. Das Eluat wurde durch Ultrazentrifugation konzentriert und dann in PST/10 mg ml&supmin;¹ Mannit/50 uM &epsi;-ACA (2,0 ml) umgepuffert, wodurch das Produkt bereitgestellt wurde. Dieses enthielt 42 000 TU und 20 400 SU. SDS-PAGE mit anschließender Fibrinzymographie zeigte eine fibrinolytische Haupt-Spezies bei einem Molekulargewicht von ungefähr 100 000. SDS-PAGE mit anschließender Proteinanfärbung oder anschließendem Immunblotting unter Verwendung eines polyclonalen Antikörpers gegen die t-PA-B-Kette zeigte, daß das hybride Enzym in der Zwei-Ketten-Form vorlag.

Beispiel J

Synthese von 2-Amino-4-chlorbenzoyl-t-PA 1-91/pro- gly-ser/Plasminogen 84-544/t-PA 262-527 (zwei Ketten)

Nach Beispiel I gereinigtes H02-Protein (1 ml, 0,25 nMol) wurde bei 25ºC mit 4-Amidinophenyl-2'-amino-4'-chlorbenzoat HCl (1,25 ul, 25 nMol) behandelt. Nach 1 Stunde waren 93 % der amidhydrolysierenden (S2288) Aktivität der Präparation verloren. Nach Zugabe von weiteren 25 nMol acylierendem Agens und einer weiteren Inkubation von 15 Minuten wurde das Material in PST/10 mg ml&supmin;¹ Mannit/50 uM &epsi;-ACA (2,2 ml) umgepuffert, aliquotiert und bei -70ºC gelagert. Anschließend wurde ein Aliquot des Produktes mit 1 Volumen 0,1 M Tris/0,15 M NaCl/20 % (Vol./Vol.) Glycerin/0,01 % Tween 80, pH 7,4 verdünnt und zur Deacylierung bei 37ºC stehengelassen. Die Deacylierungsgeschwindigkeit wurde durch Testen der S2288-Aktivität der Lösung bestimmt. Die Geschwindigkeitskonstante der Deacylierung des acylierten Proteins betrug unter den beschriebenen Bedingungen 3,9 x 10&supmin;&sup4;sec&supmin;¹.

Beispiel K

Reinigung von t-PA 1-50/t-PA 88-91/pro-gly- ser/Plasminogen 84-544/t-PA 262-527 (H01)

2,0 ml konditioniertes Erntemedium aus mit dem Plasmid pTR H01 (Beispiel 5) transfizierten HeLa-Zellkulturen wurden in PST/10 mg ml&supmin;¹ Mannit/50 uM &epsi;-ACA (3,0 ml) umgepuffert und durch Ultrafiltration (Centricon* 10, Amicon) auf ungefähr 0,45 ml konzentriert. Das Konzentrat enthielt 520 IU/ml; eine Analyse durch SDS-PAGE mit anschließender Fibrinzymographie ergab eine fibrinolytische Haupt-Spezies mit einem apparenten Mr von ungefähr 100 000.
Der hybride Aktivator wurde gereinigt, indem die 0,45 ml-Lösung mit 0,2 ml Lysin-Sepharose-Suspension inkubiert, der Überstand entfernt, das Gel mit PST gewaschen und der adsorbierte Aktivator schließlich mit PST/20 mM &epsi;-ACA eluiert wurde, wodurch ungefähr 0,8 ml einer Lösung gewonnen *Centricon ist ein Warenzeichenwurde, die 60 IU/ml partiell gereinigtes H01-Protein enthielt.

Beispiel L

Reinigung von Plasminogen 1-544/t-PA 262-527(H204), das von Ovarzellen des Chinesischen Hamsters produziert ist.

Mit pTRH11 (Beispiel 8.1c.) transfizierte CHO-Zellen, die auf ihr Überleben in 0,05 uM Methotrexat selektioniert sind (Beispiel 8), wurden 24 Stunden lang in αMEM (041- 02561), das 1 % Penicillin/Streptomycin (043-5070) 1 % Glutamin (043-5030) (Gibco, Paisley, Schottland) und 3 mM Natriumbutyrat (9686730F; BDH Chemical Ltd., Poole, England) enthielt, gehalten und abgeerntet. Es wurden 1400 ml Erntemedium gesammelt.
Das Erntemedium wurde durch Zentrifugation (9000 g/30 min) geklärt und auf Zinkchelat-Sepharose (Vt, 230 ml) und Lysin-Sepharose (Vt, 46 ml) gereinigt, indem im wesentlichen dasselbe Verfahren angewandt wurde wie für das Protein H204 in Beispiel A. Der Hauptunterschied war der, daß die Lysin- Sepharosesäule nicht mit einem E-ACA-enthaltendem Puffer eluiert wurde, sondern nacheinander mit folgendem:
a. 0,02 M Tris/0,5 M NaCl/0,01 % Tween 80, pH 7,4
b. wie a, enthaltend aber zusätzlich 0,1 M L-Arginin
c. wie a, enthaltend aber zusätzlich 0,2 M L-Arginin
d. wie a, enthaltend aber zusätzlich 0,3 M L-Arginin
e. wie a, enthaltend aber zusätzlich 0,4 M L-Arqinin
f. wie a, enthaltend aber zusätzlich 0,5 M L-Arginin
Eine Analyse der individuell gesammelten Fraktionen zeigte, daß sowohl endogenes CHO-Zellen-t-PA als auch Protein H204 an die Lysin-Sepharosesäule adsorbiert hatten, und daß beide durch Arginin enthaltende Puffer dissoziiert worden waren. Eine Analyse durch SDS-Page mit nachfolgender Fibrinzymographie zeigte ferner, daß die Hauptmenge des gereinigten Proteins H204 klar von endogenem CHO-Zellen-t-PA abgetrennt worden war, wobei das letztere durch eine niedrigere Konzentration Arginin dissoziiert wurde. Das apparente Mr von H204 betrug nach SDS-PAGE mit nachfolgender Fibrinzymographie ungefähr 100 000 (mit einer Nebenfraktion bei ungefähr 90 000) und unterschied sich damit klar von dem endogenen CHO-t-PA mit einem Mr von ungefähr 65 000.
Eine weitere Analyse des H204-Proteins durch Wester- Blotting unter Verwendung eines polyclonalen Antikörpers gegen t-PA-B-Kette zeigte, daß die Hauptmenge des Proteins in der Zwei-Ketten-Form vorlag.

Beispiel M

Synthese von 2-Amino-4-chlorbenzoylplasminogen 1- 544/t-PA 262-527 und 2-Amino-4-chlorbenzoylplasminogen 78- 544/t-PA 262-527 aus CHO-Zellen

10 000 TU gereinigtes Zwei-Ketten-H204-Protein aus CHO-Zellen (Beispiel L) in PST/10 mg ml&supmin;¹ Mannit/50 uM &epsi;-ACA (1 ml) wurden mit 4-Amindinophenyl-2'-amino-4'-chlorbenzoat HCl (20 mM, 2,5 ul) 1 Stunde bei 25ºC und anschließend weitere 20 Minuten mit einem zusätzlichen 2,5 ul-Aliquot behandelt. Das acylierte H204 wurde unter Verwendung von Sephadex G25 in PST/10 mg ml&supmin;¹ Mannit/50 uM &epsi;-ACA (1,5 ml) umgepuffert und aliquotiert. Der Fibrinplattenassay zeigte, daß das Acylprodukt 3600 IU/ml enthielt. Die Geschwindigkeitskonstante der Deacylierung wurde bestimmt, sie betrug 1,2 x 10&supmin;&sup4; sec&supmin;¹.
Eine Analyse des acylierten Produktes durch SDS-PAGE mit anschließender Fibrinzymographie zeigte zwei definierte Spezies mit apparenten Mr von ungefähr 100 000 und 90 000. Bei der ersteren handelt es sich wahrscheinlich um die glu&sub1;- Form von acyliertem H204, die letztere ist sehr wahrscheinlich die lys&sub7;&sub8;-Form.

Beispiel 9

4'-Amidinophenyl-2-amino-4-fluorbenzoat

(a) 2-Methyl-5-fluoracetanilid

5-Fluor-2-methylanilin (6,26 g, 50 mMol) und Triethylamin (7,26 g, 10 ml, 72 mMol) wurden in Dichlormethan (50 ml) gelöst. Dieses Gemisch wurde unter Stickstoff-Atmosphäre tropfenweise zu einer eisgekühlten Lösung von Acetylchlorid (3,925 g, 3,55 ml, 50 mMol) in Dichlormethan (100 ml) gegeben. Es wurde zugelassen, daß sich die Lösung auf Raumtemperatur erwärmte, und sie wurde 3 Stunden gerührt.
Die organische Schicht wurde dann sukzessiv mit 10 % Natriumhydrogencarbonatlösung (50 ml), 2 M Salzsäure (50 ml) und gesättigter Natriumsulfatlösung (50 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet, filtriert und verdampft, und der zurückbleibende Feststoff wurde durch Säulenchromatographie (70 g Kieselsäure in Dichlormethan 10 % Essigsäureethylester/90 % Dichlormethan) gereinigt, wodurch die im Titel genannte Verbindung (5,41 g, 65 %) rückblieb.
Schmp.: 127ºC aus Ethanol und Wasser
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ: 6,5-7,8 (4H, m, Aryl-H + N-H), 2,15 (6H, S CH&sub3; + COCH&sub3;)
IR νmax (Nujol): 3270, 1650, 1600, 1530, 1285, 1250, 860, 800 und 610 cm&supmin;¹
C&sub9;H&sub1;&sub0;NOF ber.: O 64,66 H 6,03 N 8,27 %
gef.: O 64,40 H 6,26 N 8,27 %

(b) 2-(Methylcarbonylamino)-4-fluorbenzoesäure

2-Methyl-5-fluoracetanilid (Beispiel 9(a)) (2,0 g, 10 mMol) wurden in 50 ml Wasser gelöst, und Kaliumpermanganat (2,25 g, 14 mMol) wurde hinzugegeben. Die Reaktion wurde gerührt und unter Rückfluß erhitzt, bis die purpurne Farbe verschwand. Zwei weitere Aliquots des Oxidationsmittels (2 x 1,125 g) wurden in ungefähr 2stündigen Intervallen hinzugegeben.
Nach 6 Stunden ließ man die Reaktion abkühlen, und die Lösung wurde auf einen basischen pH-Wert eingestellt. Dann wurde durch Kieselgur filtriert und die wäßrige Lösung angesäuert. Die wäßrige Phase wurde mit Essigsäureethylester (50 ml) extrahiert, der dann getrocknet, filtriert und eingedampft wurde, wobei die im Titel genannte Verbindung (0,5 g, 22 %) zurückblieb.
Schmp.: (sublimiert oberhalb 140ºC) aus Ethanol und Wasser
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ: 11,4 (1H, br s, CO&sub2;H), 8,2 (2H, m, Aryl-H), 6,8 (1H, m, Aryl-H), 2,15 (3H, s, COCH&sub3;)
IR νmax (Nujol): 3470, 3410, 2500-3400, 1705, 1670 und 1615 cm&supmin;¹
C&sub9;H&sub3;NFO&sub3;: ber.: C 54,83 H 4,09 N 7,10 %
gef.: C 54,49 H 4,34 N 6,38

(c) 4-Fluoranthranilsäure

2-(Methylcarbonylamino)-4-fluorbenzoesaure (Beispiel 9(b)) (0,45 g, 2,3 mMol) wurde in 15 ml Wasser suspendiert und 5 M Natriumhydroxidlösung (1,8 ml, 9 mMol) wurde hinzugeben. Die Lösung wurde 24 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Dann ließ man sie abkühlen. Die basische Lösung wurde mit Dichlormethan, das verworfen wurde, extrahiert und dann angesäuert. Die saure Lösung wurde mit Essigsäureethylester (2 x 25 ml) extrahiert. Dieser wurde dann getrocknet, filtriert und eingedampft, wobei die im Titel genannte Verbindung (0,36 g, 100 %) zurückblieb.
Schmp: 193-5ºC aus Ethanol und Wasser
¹H NMR (CDCl&sub3;/d&sup6;DMSO) δ: 8,0 (4H, m auf br Höcker (on br hump), Aryl-H + 2 x NH und CO&sub2;H), 6,5 (2H, m, Aryl-H)
IR νmax (Nujol): 3500, 3380, 2500-3400, 1665, 1600, 1570, 1490, 1225, 1180, 1145, 980, 890, 835, 760 und 620 cm&supmin;¹
C&sub7;N&sub6;NO&sub2;F: ber. C 54,20 H 3,90 N 9,03 %
gef.: C 54,19 H 3,94 N 8,83

(d) 4'-Amidinophenyl-2-amino-4-fluorbenzoat

2-Amino-4-fluorbenzoesäure (Beispiel 9(c)) (320 mg) wurde in 2 ml Pyridin gelöst, und 364 mg 4-Amidinophenol wurden hinzugegeben. Dicyclohexylcarbodiimid (425 mg) wurde hinzugegeben, und das Gemisch wurde unter Stickstoff 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch aus Produkt und Dicyclohexylharnstoff wurde gefällt. Es wurde mit Ethanol (10 ml) trituriert und filtriert. Das Produkt wurde durch Zugabe von Diethylether zur alkoholischen Lösung präzipitiert. Die im Titel genannte Verbindung (133 mg, 21 %) wurde in Form flockiger weißer Kristalle isoliert.
Schmp.: > 250ºC aus Ethanol und Ether
¹H-NMR (d&sup6;DMSO) δ: 9,5 (4H, br s, Amidin-NH), 8,0 (3H, m, Amidin-aryl-H + Benzoat-aryl-H), 7,5 (2H, d, J=8Hz, Amidin-aryl-H), 7,0 (2H, s, Aryl-NH&sub2;), 6,6 (1H, m, Aryl-H), und 6,2 (1H, m, Aryl-H)
IR νmax (Nujol): 3470, 3370, 3330, 2500-3500, 1700, 1680, 1630, 1580, 245, 1210, 1180, 1040, 745, 700 cm&supmin;¹
C&sub1;&sub4;H&sub1;&sub3;N&sub3;O&sub2;FCl 1/4H&sub2;O: ber.: C 53,51 H 4,33 N 13,37 %
gef.: C 53,76 H 4,23 N 13,35

Beispiel 10

4'-Amidinophenyl-2-amino-4-chlorbenzoat

Umkristallisierte, käuflich erhältliche 2-Amino-4- chlorbenzoesäure (345 mg) und 4-Amindinophenol (345 mg) wurden in 5 ml Pyridin gelöst. Dicyclohexylcarbodiimid (824 mg, 2 eq) wurde hinzugegeben, und das Gemisch wurde unter einer Atmosphäre von trockenem Stickstoff 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Während dieser Zeit bildete sich ein Feststoff. Dieser wurde durch Filtration isoliert, und es erwies sich, daß es sich dabei um ein Gemisch der im Titel genannten Verbindung mit Dicyclohexylharnstoff handelte. Das Material wurde mit 6 x 10 ml Chloroform trituriert, um den Harnstoff zu entfernen. Dabei blieb die im Titel genannte Verbindung (81 mg, 12 %) zurück.
Schmp.: 230-2ºC
¹H-NMR (d&sup6;DMSO) δ: 9,20 (4H, s, Aryl-amidin-NH), 7,90 (3H, m, Aryl-H), 7,52 (2H, d, J=9Hz, Aryl-H), 6,95 (3H, m, Aryl-H +NH&sub2;), 6,65 (1H, m, Aryl-H)
IR νmax (Nujol): 3460, 3160, 1710, 1680, 1610, 1220, 1180, 1040 cm&supmin;¹.
C&sub1;&sub4;H&sub1;&sub3;N&sub3;Cl&sub2;O&sub2;: ber.: C 51,55 H 4,02 N 12,88
gef.: C 51,79 H 4,19 N 12,57

Beispiel 11

4'-Amindinophenyl-2-amino-4-brombenzoat

(a) 2-Amino-4-bromtoluol

4-Brom-2-nitrotoluol (13,5 g, 62,5 mMol) und granuliertes Zinn (11,25 g, 95 mMol) wurden in einem Rundkolben vorgelegt, und 25 ml konzentrierte Salzsäure wurden in kleinen Aliquots (ca. 5 ml) hinzugegeben. Während der Dauer dieser Zugabe war eine sanfte Reaktion zu beobachten. Nach Zugabe der gesamten Säure wurde das Reaktionsgemisch erhitzt und 4 Stunden bei umgefähr 100ºC gerührt. Die Lösung wurde zum Abkühlen stehengelassen, und es wurde eine Lösung von Natriumhydroxid (18,75 g) in 32 ml Wasser hinzugegeben. Die Lösung wurde 1 Stunde auf 100ºC erhitzt. Nach dem Abkühlen wurden 200 ml Wasser hinzugegeben, und die Lösung wurde filtriert. Das wäßrige Filtrat wurde mit Diethylether (200 ml) extrahiert. Die abfiltrierten Salze wurden ebenfalls mit Diethylether (200 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden getrocknet, filtriert und verdampft, wobei ein Öl zurückblieb. Dieses wurde durch Destillation (112ºC bei 4 mm Hg) gereinigt, wodurch sich die im Titel genannte Verbindung (6,76 g, 58 %) ergab.
¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ: 6,8 (3H, m, Aryl-H), 3,6 (2H, s, NH&sub2;),und 2,1 (3H, s, CH&sub3;).

(b) 2-Methyl-5-bromacetanilid

Dieses wurde in derselben Weise wie das Fluoranalog (Beispiel 9(a)) in 96%-iger Ausbeute aus 2-Amino-4-bromtoluol (Beispiel 11(a)) synthetisiert. Die Präparation benötigte keinerlei Säulenchromatographie.
Schmp.: 108-110ºC aus Dichlormethan und 40 bis 60ºC aus Petrolether,
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ: 7,8 (2H, m, Aryl-H + N-H), 7,1 (2H, m, Aryl-H), 2,15 (6H, s, CH&sub3; und COCH&sub3;)
IR νmax (Nujol): 3250, 1670, 1650, 1580, 1530, 1400, 1380, 1290, 1230, 1190, 1130, 860, 800 und 700 cm&supmin;¹
C&sub9;H&sub1;&sub0;NOBr: ber: C 47,39 H 4,42 N 6,14 %
gef.: C 48,00 H 4,43 M 6,16

(c) 2-(Methylcarbonylamino)-4-brombenzoesäure

Dieses Material wurde im 10 mMol Maßstab aus 2-Methyl-5-bromacetanilid (Beispiel 11(b)) in derselben Weise wie das Fluor-Analog (Beispiel 9(b)) hergestellt. Die Ausbeute betrug 58 %.
Schmp.: 212-5ºC aus Methanol und Wasser
¹H-NMR (CDCl&sub3;/d&sup6;DMSO) δ: 11,4 (2H, br s, NH und CO&sub2;H), 9,3 (1H, m, Aryl-H), 8,2 (1H, m, Aryl-H), 7,4 (1H, m, Aryl-H), 2,3 (3H, s, Aryl-CH&sub3;)
IR νmax (Nujol): 3250, 1670, 1650, 1580, 1520, 1290, 860 und 800 cm&supmin;¹
C&sub9;H&sub8;BrNO&sub3;: ber.: C 41,89 H 3,12 N 5,43 %
gef.: C 41,43 H 3,08 N 5,31

(d) 4-Bromanthranilsäure

Die im Titel genannte Verbindung wurde in 48%-iger Ausbeute aus 2-(Methylcarbonylamino)-4-brombenzoesäure (Beispiel 11(c)) in derselben Weise hergestellt wie das Fluor-Analog (Beispiel 9(c)).
¹H-NMR (CDCl&sub3;/d&sup6;DMSO) δ: 8,1 (3H, s, CO&sub2;H + NH&sub2;), 7,6 (1H, d, J=8Hz, Aryl-H), 6,8 (1H, m, Aryl-H), 6,6 (1H, m, Aryl-H).

(e) 4'-Amidinophenyl-2-amino-4-brombenzoat

2-Amino-4-brombenzoesäure (Beispiel 11(d)) (0,90 g) und 4-Amidinophenol (0,718 g) wurden in 10 ml Pyridin gelöst. Dicyclohexylcarbodiimid (1,71 g, 2 Eq) wurde hinzugegeben. Die Reaktion wurde unter einer Atmosphäre von trockenem Stickstoff 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde sie filtriert, und es erwies sich, daß der erhaltene Feststoff ein Gemisch der im Titel genannten Verbindung mit Dicyclohexylharnstoff war. Das Material wurde wiederholt mit Ohloroform (6 x 20 ml) trituriert, bevor es durch Filtration und Verdampfung isoliert wurde. Es wurden 144 mg (9 %) der gereinigten im Titel genannten Verbindung erhalten.
¹H NMR (d&sup6;DMSO) δ: 9,20 (4H, 6r s, Amidin-NH), 7,90 (3H, m, Aryl-H), 7,55, (2H, d, J=6Hz, Aryl-H), 7,1 (1H, s, Aryl-H), 6,95 (2H, br s, NH&sub2;), 6,80 (1H, m, Aryl-H)
IR νmax (Nujol): 3450, 3200, 1710, 1680, 1610, 1230, 1180, 1040 cm&supmin;¹

Legenden zu den Figuren: (Nicht maßstabsgerecht)

Fig. 1a Struktur von pTRH6

= pUC8-Sequenzen
__ = Plasminogen cDNA-Sequenzen
E = Restriktionsstellen

Fig. 1b Struktur von pTRH3

= pTRE12-Sequenzen
__ = Plasminogen cDNA-Sequenzen (Hind III am 5'-Ende, BglII am 3'-Ende)
= in der Konstruktion verwendete Restriktionsstellen

Fig. 2 Struktur von pTRH9

Die Fragmente (I) bis (III) und der Linker (IV) sind gekennzeichnet.
= pTRE12 D Nar-Sequenzen
__ = Insertionsequenzen
PlgnA = codierender Bereich für die Plasminogen A-Kette
= in der Konstruktion verwendete Restriktionsstellen
E = andere Restriktionsstellen
= Protein codierende Bereiche

Fig. 3 Struktur von pTRH20

= Vektor-Sequenzen
__ = Insertions-DNA
= In der Konstruktion verwendete Restriktionsstellen
E = Andere Restriktionsstellen
* = Verbindende Aminosäuresequenz
= Protein codierende Bereiche
Plgn A = Plasminogen-A-Ketten codierender Bereich
tA = t-PA-A-Ketten codierender Bereich
tB = t-PA-B-Ketten codierender Bereich

Fig. 4 Struktur von pTRH204

Die Fragmente (V) (SstI-NarI), (VI) (BanII-SstI) und der Linker (VII) (NarI-BanII) sind gekennzeichnet.
= Vektorsequenzen
__ = Insertions-DNA
= In der Konstruktion verwendete Restriktionsstellen
E = Andere Restriktionsstellen
* = Serin entsprechend dem Plasminogen-Serin 545/t-Pa-Serin 262 an der Verknüpfungsstelle
= Protein codierende Bereiche
PlgnA = Plasminogen-A-Ketten codierender Bereich (glu-1 bis pro-544)
t-PA = t-PA-codierender Bereich (thr-263 bis pro-527)

Fig. 5 Struktur von pTRH37

Die Fragmente (IX)(SstI-BstXI), (X) (BstXI-AvaII) und der Linker (XI) (AvaII-BanII) sind gekennzeichnet.
= Vektor-Sequenzen
__ = Insertions-DNA
= In der Konstruktion verwendete Restriktionsstellen
E = Andere Restriktionsstellen
= Protein-codierende Bereiche
Plgn = Plasminogen codierende Sequenzen (glu&sub1;-cys&sub5;&sub4;&sub1;)
t-PA = t-PA codierende Sequenzen (thr&sub2;&sub6;&sub3;-pro&sub5;&sub2;&sub7;)
* = Serin, äquivalent mit Plasminogen-Serin545/t-Pa- Serin&sub2;&sub6;&sub2; an der Ververknüpfungsstelle

Fig. 6 Struktur von pTRH34

Fragment (V) (SstI-NarI), (VI)(BanII-SstI) und der Linker (VII) (NarI-BanII) sind gekennzeichnet.
= Vektorsequenzen
__ = Insertions-DNA
= In der Konstruktion verwendete Restriktionsstellen
E = Andere Restriktionsstellen
= Protein codierende Bereiche
PlgnA = Plasminogen-A-Kette codierender Bereich (glu-1 bis arg-561)
t-PA B = t-PA-B-Kette codierender Bereich (ile-276 bis pro-527)

Fig. 7 Konstruktion von pTRH00

Fragment I : ist ein HindIII/SfaN1-Fragment aus dem lys&sub7;&sub8;- Kassetten-Plasmid.
Fragment II : ist ein SfaN1/BstXI-Fragment aus pTRH34, das den größten Teil von K&sub1;P, die vollständigen K&sub2;P und K&sub3;P und den N-terminalen Abschnitt von K&sub4;P enthält.
Fragment III: ist ein BstXI/HindIII-Fragment aus pTRH204, das den größten Teil von K&sub4;P, das vollständige K&sub5;P, Bt und die Vektorsequenzen von pTRE12 enthält.

Fig. 8 Konstruktion von pTRH01

Fragment I : ist ein HindIII/BamHI-Fragment aus pTR6F, codierend die t-PA-Fingerdomäne und assoziierte N-terminale und C-terminale Aminosäuresequenzen, d.h. [SYQVI] Ft [HSVPVKSTRATPGS], zuzüglich des 5'-untranslatierten Bereichs und der Signal/Pro-Bereiche.
Fragment II : ist ein HindIII/KpnI-Fragment aus pTRH00, das einmal das gesamte K&sub1;P, die vollständigen K&sub2;P, K&sub3;P, K&sub4;P, K&sub5;P, Bt und die Vektorfunktionen von pTRE12 enthält.
Linker: wie in Beispiel 5 beschrieben.

Fig. 9 Konstruktion von pTRH02

Fragment II : ist ein HindIII/BamHI-Fragment aus pTR6FG, das die t-PA-Ft- und -Gt-Domänen und die assoziierten verknüpfenden N/C-terminalen Sequenzen, d.h. [SYQVI]Ft[HSVPVKS]Gt- [EIDTRATPGS] codiert, zuzüglich des 5'-nichttranslatierten Bereiches und der Signal/Pro- Bereiche.
Fragment I : ist ein HindIII/KpnI-Fragment aus pTRH00. Es enthält beinahe vollständig K&sub1;P, vollständig K&sub2;P, K&sub3;P, K&sub4;P, K&sub5;P, Bt und die Vektorfunktionen von pTRE12.
Linker (W + X): wie in Beispiel 6 beschrieben.

Fig. 10 Struktur von pTRH25

Fragment I = BglII-NarI-Fragment aus pTRH9
Fragment II = SstI-BglII-Fraqment, die Urokinase-B-Kette codierend
III = Oligonucleotide Y + Z
= pTRE12-Sequenzen.
__ = Insertionssequenzen
E = In der Konstruktion verwendete Restriktionsstellen
Plgn = Plasminogen codierender Bereich (glu-1 bis phe-546)
u = Urokinase codierender Bereich (pro-137 bis leu-411) Fig. 11 Plasmid PSV&sub2;dhfr Simian Virus-Polyadenylierungssequenz Simian Virus&sub4;&sub0;-Intronsequenz
DH = Dihydrofolat-Reduktase cDNA
SV&sub4;&sub0;E = früher Promotor von Simian Virus&sub4;&sub0;
EcoRI = Restriktionsenzymstelle: EcoRI, mit XhoI-Linkern versehen.
BglII - Restriktionsenzymstelle: BglII

Fig. 12 Plasmid BPV-MT-XhoI

BPV = Rinder-Papillom-Virus- (Bovine Papillomavirus) -Sequenzen
MT-I = Maus-Metallothionein-Gensequenzen - einschließlich der 3'-Polyadenylierungssequenz (0,3 kb-Fragment B)
SstI = Restriktionsenzyinstelle: SstI, mit BglII-Linkern versehen.
HindIII = Restriktionsenzymstelle: HindIII, mit XhoI-Linkern versehen

Fig. 13 Plasmid pTRH69

MMT 3' = Maus-Metallothionein-Polyadenylierungssequenzen: Aus dem Plasmid BPV-MT-XhoI ausgeschnittenes Fragment B. Dihydrofolat-Reduktase cDNA früher Promotor von Simian Virus&sub4;&sub0; Fragment A aus dem Plasmid pSV&sub2;dhfr herausgeschnitten
XhoI = Restriktionsenzymstelle XhoI
BglII = Restriktionsenzymstelle BglII Fig. 14 Plasmid pTRH71 long terminal repeat von Rous Sarcom Virus Introl und Polyadenylierung sequenzen von Simian Virus&sub4;&sub0; t-PA-Mutein-cDNA 3,3 kb Fragment aus pTRE24
MMT3' = Maus-Metallothionein-Polyadenylierungssequenzen
DH = Dihydrofolatreduktase cDNA
SV&sub4;&sub0;E = früher Promotor von Siman Virus Fig. 15 Plasmid pTRH11 long terminal repeat von Rous Sarcom Virus Introl und Polyadenylierungsequenzen von Simian Virus&sub4;&sub0; cDNA des H204-Hybridproteins 4,1 kb Fragment aus pTRH204
MMT3' = Maus-Metallothionein-Polyadenylierungssequenzen
DH = Dihydrofolat-Reduktase cDNA
SV&sub4;&sub0;E = früher Promotor von Simian Virus&sub4;&sub0;.

Claims

1. Hybridplasminogenaktivator, der die fünf Kringle-Domänen von Plasminogen umfaßt, die an die 8-Kette von t-PA bzw. u-PA über eine Aminosäuresequenz geknüpft sind, die die t-PA-Spaltstelle zwischen den Resten 275 und 276 und den Cysteinrest 264 von t-PA umfaßt, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus:

bzw. die u-PA-Spaltstelle zwischen den Resten 158 und 159 und den Cysteinrest 148 von u-PA umfaßt, wobei die Sequenz ist:

[AAPSFPSSPPEELKFQCGQKTLRPRFK]

(Einbuchstabencode für Aminosäuren)

2. Hybridplasminogenaktivator nach Anspruch 1 mit der Formel:

(Y-)m(Kp-Zt-)&sub5;Bt

wobei Bt die Reste 276-527 von t-PA umfaßt, in 1 ist, die fünf Werte für Kp jeweils eine Kringle-Domäne darstellen und in Folge von Plasminogen abstammen, und Y und jeder der 5 Werte für zt unabhängig voneinander eine Bindung oder eine verknüpfende Aminosäuresequenz darstellt, die während der Herstellung des Hybridplasminogenaktivators synthetisch eingeführt werden und/oder von nativem Plasminogen und/oder t-PA-Sequenzen abstammen kann, wobei die Sequenz Z&sub5;t der in Anspruch 1 definierten verknüpfenden Aminosäuresequenz entspricht.

3. Hybridplasminogenaktivator nach Anspruch 2, wobei Y die Plasminogenreste 1 bis 83 bzw. 78 bis 83 darstellt.

4. Hybridplasminogenaktivator nach Anspruch 2 oder 3, wobei Z&sub1;t, Z&sub2;t, Z&sub3;t und Z&sub4;t die nativen Plasminogenzwischendomänsequenzen zwischen den Plasminogenkringle-Domänen 1 und 2, 2 und 3, 3 und 4 bzw. 4 und 5 darstellen.

5. Plasminogen 1-544/t-PA 262-527, einschließlich Ein- und Zwei-Kettenvarianten, lys&sub7;&sub8;- und glu&sub1;-Varianten und Gemische davon,

Plasminogen 1-544/t-PA 262-527 (arg275 -> gln) , einschließlich Ein- und Zwei-Kettenvarianten, lys&sub7;&sub8;- und glu&sub1;-Varianten und Gemische davon,

t-PA 1-50/t-PA 88-91/pro-gly-ser/Plasminogen 84-544/t-PA 262-527, einschließlich Ein- und Zwei-Kettenvarianten, gly-&sub3;-, ser&sub1;- und val&sub4;-Varianten und Gemische davon,

t-PA 1-91/pro-gly-ser/Plasminogen 84-544/t-PA 262-527, einschließlich Ein- und Zwei-Kettenvarianten, gly-&sub3;-, ser&sub1;- und val&sub4;-Varianten und Gemische davon, oder

Plasminogen 1-546/u-PA 137-411, einschließlich Ein- und Zwei-Kettenvarianten, lys&sub7;&sub8;- und glu&sub1;-Varianten und Gemische davon.

6. Plasminogen 1-541/t-PA 262-527, einschließlich Ein- und Zwei-Kettenvarianten, lys&sub7;&sub8;- und glu&sub1;-Varianten und Gemische davon.

7. Hybridplasminogenaktivator nach einem der vorstehenden Ansprüche, exprimiert unter Verwendung von Ovarzellen des Chinesischen Hamsters.

8. Hybridplasminogenaktivator nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der für die fibrinolytische Aktivität essentielle Katalyseort durch eine entfernbare blockierende Gruppe blockiert ist.

9. Hybridplasminogenaktivator nach Anspruch 8, wobei die entfernbare blockierende Gruppe eine 2-Aminobenzoylgruppe ist, die an der 3- oder 4-Position mit einem Halogenatom und außerdem wahlweise mit einer oder mehreren schwach elektronenentziehenden oder elektronenspendenden Gruppe(n) substituiert ist, wobei die Geschwindigkeitskonstante pseudoerster Ordnung der Hydrolyse des Derivats im Bereich von 6,0 x 10&supmin;&sup5; bis 4,0 x 10&supmin;&sup4; sec&supmin;¹ liegt bei Messung in einem Puffersystem bestehend aus 0,05 M Natriumphosphat, 0,1 M Natriumchlorid, 0,01 % (Vol./Vol.) Detergens, das Polyoxyethylensorbitanmonooleat mit einem Molekulargewicht von etwa 1300 umfaßt, bei einem pH-Wert von 7,4 bei 37ºC.

10. Hybridplasminogenaktivator nach Anspruch 9, wobei die entfernbare blockierende Gruppe 4-Fluor-2-aminobenzoyl, 4-Chlor-2-aminobenzoyl oder 4-Brom-2-aminobenzoyl ist.

11. 2-Amino-4-chlorbenzoylplasminogen 1-544/t-PA 262-527 (zwei Ketten), einschließlich glu&sub1;- und lys&sub7;&sub8;-Varianten und Gemische davon,

2-Amino-4-chlorbenzoylplasminogen 1-541/t-PA 262-527 (zwei Ketten), einschließlich glu&sub1;- und lys&sub7;&sub8;-Varianten und Gemische davon, oder

2-Amino-4-chlorbenzoyl-t-pA 1-91/pro-gly-ser/Plasminogen 84-544/t-PA 262-527 (zwei Ketten), einschließlich gly-&sub3;-, ser&sub1;- und val&sub4;-Varianten und Gemische davon.

12. Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Hybridplasminogenaktivator nach einem der vorangegangenen Ansprüche in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.

13. Hybridplasminogenaktivator nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Verwendung als aktive therapeutische Substanz.

14. Hybridplasminogenaktivator nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Verwendung bei der Behandlung von thrombotischen Krankheiten.

15. Verwendung eines Hybridplasminogenaktivators nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von thrombotischen Krankheiten.

16. Verfahren zur Herstellung eines Hybridplasminogenaktivators nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Verfahren die Expression der den Hybridplasminogenaktivator codierenden DNA in einer rekombinanten Wirtszelle und die Gewinnung des Hybridplasminogenaktivatorprodukts umfaßt.

17. DNA-Polymer, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die einen Hybridplasminogenaktivator nach einem der Ansprüche 1 bis 7 codiert.

18. Verfahren zur Herstellung eines Derivats nach Anspruch 8, wobei das Verfahren die Blockierung des für die fibrinolytische Aktivität in dem Hybridplasminogenaktivator nach einem der Ansprüche 1 bis 7 essentiellen Katalyseorts mit einer entfernbaren blockierenden Gruppe umfaßt.

19. Verfahren zur Herstellung eines Derivats nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei das Verfahren die Umsetzung des Plasminogenaktivators mit einem blockierenden Mittel JK umfaßt, wobei J eine lokalisierende Gruppe darstellt, die die Bindung des Mittels an den Katalyseort des Enzyms vermittelt und K eine an der 3- oder 4-Position mit einem Halogenatom und außerdem wahlweise mit einer oder mehreren schwach elektronenentziehenden oder elektronenspendenden Gruppe(n) substituierte 2-Aminobenzoylgruppe darstellt.