DE68922859T2 - Trombolytischer wirkstoff mit modifikation der domäne der kringle. - Google Patents
Trombolytischer wirkstoff mit modifikation der domäne der kringle.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft Analogons von thrombolytischen Agenzien mit einer modifizierten Kringel-Domäne. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verbindungen des tPA- Typs, bei denen Veränderungen in den Kringel 1- und Kringel 2- Domänen auftreten. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Analogons mit einer oder mehreren Veränderungen in der Kringel-Domäne von Verbindungen des Urokinase-Typs. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind pharmazeutisch geeignet und können insbesondere in derselben Weise wie tPA und Urokinase verwendet werden.
- Plasminogen-Aktivatoren (PA's) spielen bekanntermaßen eine zentrale Rolle bei der Fibrinolyse. Ihre Wirkungsweise umfaßt eine Umwandlung des inaktiven Proenzyms Plasminogen zu Plasmin, einer aktiven Serinprotease, welche ihrerseits das Fibrinnetzwerk eines Blutgerinnsels abbaut. Es existieren zwei bekannte Typen von physiologisch relevanten PA's: Plasminogen-Aktivatoren des Urokinase-Typs (uPA) und Plasminogen-Aktivatoren des Gewebe-Typs (tPA). Es hat sich herausgestellt, daß die tPA's in ihrer Wirkungsweise sehr viel spezifischer sind als die uPA's und verglichen mit den uPA's eine höhere Affinität für Fibrin sowie eine Spezifität für das Blutgerinnsel selbst aufweisen.
- Der Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA) ist eine glykosylierte, 527 Aminosäurereste umfassende Serumprotease von 66 000 Dalton, die von den vaskulären Endothelzellen gebildet wird. Sie ist eine einzelne Polypeptidkette bestehend aus fünf Hauptdomänen: der Fibronektin-Finger-Domäne (Ft), der Wachstumsfaktor-Domäne (Gt), den Kringel 1 (Kt1)- und Kringel 2 (Kt2)-Domänen und der aktiven Stelle (At). Es ist ferner bekannt, daß tPA bei der Bindung an Fibrin aktiviert wird. Im Falle der Spaltung mit Plasmin wird der einkettige tPA an einer einzigen Stelle (Arg 275-Ile 276) gespalten, wodurch er in eine zweikettige Form überführt wird, in der eine leichte und eine schwere Kette über eine Disulfidbrücke verknüpft sind. Die vom Carboxyterminus stammende leichte Kette enthält die katalytische Stelle. Sie weist eine hohe Homologie mit anderen Serinproteasen auf und bindet nicht an Fibrin. Die vom Aminoterminus stammende schwere Kette ist eine Einheit mit mehreren Domänen mit Homologie zu verschiedenen anderen Serinproteinen. Sie enthält eine Finger-Domäne, eine Wachstumsfaktor-Domäne und zwei Kringel-Domänen. Die Kringel-Domänen sind dreifache Disulfidstrukturen. Man hat gefunden, daß die schwere Kette an Fibrin bindet. Der tPA wird von der Leber durch die schwere Kette geklärt.
- Unsere vor kurzem erzielten Ergebnisse haben gezeigt, daß die Fibrinbindung von tPA in zwei Domänen lokalisiert ist. Die Finger-Domäne enthält eine Fibrinbindungsstelle mit hoher Affinität und die Kringel 2-Domäne eine Fibrinbindungsstelle mit geringer Affinität. Die Affinität der letztgenannten Stelle wird durch Plasminogen gesteigert. Die Stimulierung durch Fibrin und Fibrinogen-Fragmente konzentriert sich jedoch hauptsächlich auf die Kringel 2-Domäne. Die von einer anderen Gruppe (van Zonneveld und Pannekoek, CLB, Amsterdam) erhaltenen Ergebnisse legen nahe, daß eine Stimulierung durch Fibrin unterbleibt, wenn K1 direkt mit der leichten Kette verknüpft ist. Diese Ergebnisse führten zu der Schlußfolgerung, daß die Position von Kringel 2 (in Nachbarschaft zur leichten Kette) und ihre Struktur für ihre Funktion bei der durch Fibrin vermittelten Stimulierung der Aktivität entscheidend sind. Aus einem Vergleich der Aminosäurensequenzen von tPA K2 mit tPA K1, der uPA-Kringel-Domäne, und den fünf Plasminogen-Kringel-Domänen, ergibt sich, daß für tPA K2 lediglich eine beschränkte Anzahl von Aminosäuren einmalig sind. In diesem Zusammenhang ist insbesondere eine Gruppe von Aminosäuren um die Position 250 der inneren Schleife der Kringel Domäne herum interessant.
- Urokinase wurde zuerst aus Urin isoliert. Sie wurde anschließend von kultivierten Zellen wie z.B. Nierenzellinien und kürzlich durch Expression von cDNA in E. coli oder kultivierten Säugerzellen isoliert. Im Falle der Expression in E. coli muß die Urokinase renaturiert werden.
- Die Urokinase ist ein einzelnes Polypeptid von 411 Aminosäureresten mit einem Molekulargewicht von 55 000 Dalton. Diese einzelkettige Form, auch pro-Urokinase (pro-u-PA) oder einzelkettige Urokinase (scu-PA) genannt, besitzt eine geringe Aktivität, aber sie kann z.B. durch Plasmin in eine zweikettige (tuc-PA) Form überführt werden. Die beiden Ketten sind über eine einzige Disulfidbrücke miteinander verbunden. Bei u-PA können drei Domänen unterschieden werden - eine Wachstumsfaktor-Domäne (Gu), eine Kringel-Domäne (Ku) und eine Protease-Domäne (Pu)
- Die Gu-Domäne kann mit einem zellulären Rezeptor interagieren. Die Pu-Domäne enthält die Reste der aktiven Stelle Serin, Histidin und Asparagin, welche gewöhnlich in Serinproteasen gefunden werden. Die Funktion der ku-Domäne ist unbekannt.
- Homologe Kringel-Domänen tauchen ebenfalls in Plasminogen, Faktor XII, Prothrombin und Lipoprotein auf. Sowohl bei t-PA als auch bei Plasminogen sind eine oder mehrere Kringel-Domänen bei der Fibrinbindung beteiligt. Dies ist bei u-PA nicht beobachtet worden. Wie bei t-PA katalysiert u-PA die Umwandlung des inaktiven Proenzyms Plasminogen zu der aktiven Protease Plasminogen. Im Falle von t-PA wird diese Umwandlung durch Fibrin stark unterstützt, wohingegen dies bei u-PA nicht der Fall ist. Trotzdem ist die Fibrin-Spezifität von u-PA beobachtet worden. Diese Beobachtung ist durch die Annahme erklärt worden, daß u-PA bevorzugt Fibrin-gebundenes Plasminogen aktiviert.
- Da die Fibrin-Spezifitäten von t-PA und u-PA auf unterschiedlichen Mechanismen beruhen, sollte es grundsätzlich möglich sein, die gewünschten Eigenschaften beider Moleküle in einem einzelnen Hybridmolekül zu kombinieren. Derartige Hybride, die lange Stücke von u-PA und die Fibrin-bindenden Domänen von t-PA oder Plasminogen enthalten, sind hergestellt worden. Die Ergebnisse sind enttäuschend. Obgleich manche Hybride eine gewisse Fibrinaffinität aufweisen, sind sie nicht mit derjenigen von t-PA vergleichbar.
- Benötigt werden daher neue t-PA- und u-PA-Analogons mit einer größeren Affinität für Fibringerinnsel und einer längeren Halbwertszeit.
- Die am 2. Juli 1987 veröffentlichte Patentanmeldung PCT WO 87/03906 beschreibt tPA-Analogons, die eine aktive Stelle, d.h die Protease-Domäne, und eine oder mehrere Domänen, ausgewählt aus der Finger-Domäne, der Wachstumsfaktor-Domäne, der Kringel 1-Domäne, und der Kringel 2-Domäne, umfassen, wobei die Domänen-Regionen gegenüber ihrem nativen Arrangement hinsichtlich ihrer Reihenfolge, ihres Auftretens, oder beidem verändert worden sind, vorausgesetzt, daß das Gesamtmolekulargewicht des Proteins 90 000 Dalton nicht übersteigt und keine Domäne mehr als zweimal auftaucht. Die erfindungsgemäßen Verbindungen unterscheiden sich von den Verbindungen gemäß WO 87/03906 dadurch, daß die Kringelt 1- und Kringelt 2-Domänen modifiziert sind und eine Aminosäurensequenz aufweisen, die von der für tPA gefundenen abweicht. Ferner werden in der PCT WO 87/03906 keine Urokinase-Analogons offenbart.
- Durch die vorliegende Erfindung werden thrombolytische Agenzien mit einer oder mehreren modifizierten Kringel-Domänen bereitgestellt.
- Ferner werden durch die vorliegende Erfindung Oligonukleotide bereitgestellt, die die folgenden Nukleotidsequenzen aufweisen:
- Mit der vorliegenden Erfindung werden ferner tPA-analoge Verbindungen bereitgestellt, bei denen die Kringelt-Domänen wie folgt modifiziert sind: in der Kringelt 1-Domäne sind die Aminosäuren an den Positionen 160 bis 165 durch die an den Positionen 248 bis 253 der Kringelt 2-Domäne gefundenen Aminosäuren ersetzt; in der Kringelt 2-Domäne sind die Aminosäuren an den Positionen 248 bis 253 durch die an den Positionen 160 bis 165 der Kringelt 1-Domäne gefundenen Aminosäuren ersetzt. Genauer gesagt, wird Kringelt 1 modifiziert durch Substitution von Asparagin (N), Arginin (R), Arginin (R), Leucin (L), Threonin (T) bzw. Tryptophan (W) an den Positionen 160 bis 165. Genauer gesagt, wird Kringelt 2 modifiziert durch Substitution von Alanin (A), Glycin (G), Lysin (K), Tyrosin (Y), Serin (S) bzw. Serin (S) an den Positionen 248 bis 253. Demgemäß werden die normalerweise an den Positionen 160 bis 165 in Kringelt 1 auftauchenden Aminosäuren, d.h. A, G, K, Y, S, S, ersetzt durch N, R, R, L, T, W, und die normalerweise an den Positionen 248 bis 253 von Kringelt 2 vorhandenen Aminosäuren, d.h. N, R, R, L, T, W, werden durch A, G, K, Y, S, S ersetzt. Nachfolgend werden die wie oben beschrieben modifizierten Kringelt 1 und Kringelt 2 bezeichnet mit kt1 bzw. kt2, um diese modifizierten Kringelt-Domänen von den natürlicherweise vorkommenden Domänen Kt1 und Kt2 zu unterscheiden.
- Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft tPA-analoge Verbindungen, die eine aktive oder Protease-Stelle (A) und eine oder mehrere Domänen umfassen, die ausgewählt sind aus der Finger-Domäne (F), der Wachstumsfaktor-Domäne (Gt), der modifizierten Kringel 1-Domäne (kt1) und der modifizierten Kringel 2-Domäne (kt2), wobei die Domänen-Regionen gegenüber dem nativen Arrangement hinsichtlich ihrer Reihenfolge, ihres Auftretens oder beidem verändert worden sind, vorausgesetzt, daß keine Domäne mehr als zweimal auftaucht. Natives Arrangement bedeutet die Beziehung der Domänen, die für den nativen oder den natürlicherweise vorkommenden tPA identifiziert wurden, welcher bekanntermaßen FGK1K2A ist.
- Die vorliegende Erfindung beschreibt die Entwicklung eines humanen tPA-Analogons, das insofern ein besseres thrombolytisches Agens als der native tPA ist, als es eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften aufweist: (1) eine längere Halbwertszeit als nativer tPA; (2) eine verstärkte Af finität für FibringerinnseI; und (3) eine geringere oder keine Bindung an endogene Inhibitoren wie Plasminogen-Aktivator-Inhibitor Nr. 1.
- Die vorliegende Erfindung konzentriert sich auf beide der Kringel-Strukturen von t-PA, welche relativ konservierte Aminosäurensequenzen aufweisen. Lediglich Kt2 scheint für die Effektivität von tPA zur Fibrin-gesteigerten Aktivität vital zu sein. Die längste Ausdehnung von nicht-konservierter Sequenz zwischen Kringelt 1 und Kringelt 2 beträgt 6 Aminosäuren. Es wird davon ausgegangen, daß dieser Bereich für die Fibrinbindungsaffinität von Kt2 gegenüber Kt1 verantwortlich sein könnte. Daher wird diese Region zwischen Kringelt 1 und Kringelt 2 und umgekehrt ausgetauscht. Hierfür müssen beide Kringelt-Strukturen von Oligonukleotiden wieder aufgebaut werden, die die gewünschten Austäusche enthalten.
- Die modifizierten Kringelt-Strukturen werden enzymatisch von Oligonukleotidfragmenten zusarnmengesetzt, die unter Anwendung einer Festphasen-Phasphoramidit-Triester-Kopplung chemisch synthetisiert werden. Nach dem enzymatischen Zusammenfügen der Oligonukleotidfragmente wird jede Kringelt-Struktur einzeln kloniert und unter Anwendung der Didesoxy-Sequenzierung sequenziert.
- Die wichtigsten Ausgangsmaterialien zur Herstellung der Verbindungen (zur Verwendung bei der Herstellung modifizierter Kringelt-Domänen) der vorliegenden Erfindung sind in der am 2. Juli 1987 veröffentlichten Patentanmeldung PCT WO 87/03906 beschrieben, auf die hiermit Bezug genommen wird.
- In der vorliegenden Erfindung werden kleine Austäusche in der Ku- Domäne von u-PA beschrieben, durch die die Fibrinbindungseigenschaften verbessert, die Struktur des Moleküls aber nicht wesentlich verändert werden. Ein u-PA-Molekül wie dieses ist möglicherweise besser für eine thrombolytische Therapie als beide natürlicherweise vorkommenden t-PA oder u-PA und kann zu einer geringeren Dosierung (und kostengünstigeren Behandlung) mit geringeren Nebenwirkungen führen.
- Vorliegend werden die Domänen von t-PA durch die Fußnote t und die Domänen für u-PA durch die Fußnote u bezeichnet.
- Wie oben bereits ausgeführt worden ist, sind die wichtigsten Ausgangsmaterialien für die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen in der Patentanmeldung PCT WO 87/03906 beschrieben. Diese wichtigsten Ausgangsmaterialien sind zwei Prototyp-Gene mit einmaligen Endonuklease-Restriktionsstellen zwischen den Domänen von TPA, die vorliegend mit Ft1 Gt, Kt1, Kt2 und At für die Finger-, die Wachstumsfaktor-, die Kringel 1-, die Kringel 2-, bzw. die Protease- oder aktive Stelle-Domänen bezeichnet werden. Es sollte beachtet werden, daß die Kringel 1 (Kt1) und Kringel 2 (Kt2)-Domänen in den beiden Prototyp-Genen eine Nukleotidsequenz aufweisen, die zu der bei tPA gefundenen natürlichen Aminosäurensequenz führen würde. Diese beiden Prototyp-Gene sind nach den Bestiininungen des Budapester Vertrages hinterlegt worden. Die Wirtsorganismen sind E. coli-Stämme, die Plasmide enthalten, welche mit pTPA-B1,2,3,4(a) und pTPA-B1,2,3,4 bezeichnet und in den Diagrammen 1 bzw. 2 dargestellt sind. Die Hinterlegungen erfolgten beim Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, USA. pTPA-BI,2,3,4(a) wurde am 29. August 1986 unter der Zugriffsnummer NRRL B-18106 hinterlegt. pTPA-B1,2,3,4 wurde am 28. November 1986 unter der Zugriffsnummer NRRL B-18142 hinterlegt.
- Die Ausgangsmaterialien für die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen sind die DNA-Anteile für die modifizierten Kringelt-Strukturen, die enzymatisch von Oligonukleotid-Fragmenten zusammengefügt worden sind, welche unter Anwendung einer Festphasen-Phosphoramidit-Triester-Kopplung chemisch synthetisiert wurden. Nach dem enzymatischen Zusammenfügen der Oligonukleotidfragmente wurde jede Kringelt-Struktur einzeln kloniert und unter Anwendung der Didesoxy-Sequenzierung sequenziert. Die DNA-Sequenz der modifizierten Kringel 1 (kt1)-Domäne (Block 3') ist im Diagrainm 3 dargestellt, in dem die Unterschiede zwischen den DNA-Sequenzen der modifizierten Kringelt 1-Domäne und der natürlichen Kringelt 1-Domäne durch Unterstreichung hervorgehoben sind. Die DNA-Sequenz der modifizierten Kringel 2-Domäne (kt2) (Block 4') ist imDiagramm 4 dargestellt. Zusätzlich zurNodifizierung der für die Aminosäuren an den Positionen 248 bis 253 der Kringelt 2-Domäne kodierenden DNA wurden langgestreckte Bereiche von Guanosinen (G) und Cytidinen (C) beseitigt. Jeder Nukleotidaustausch ist durch ein Sternchen (*) hervorgehoben.
- Der unterbrochen unterstrichene Bereich der Sequenz kennzeichnet am 3'-Ende der Sequenz einen Linker für Klonierungszwecke.
- Die zur Herstellung der modifizierten Kringelt-Domänen verwendeten Materialien und Enzyme wurden wie folgt erhalten. Sämtliche Reagenzien zur Oligonukleotidsynthese wurden von Applied BioSystems (ABI) bezogen mit Ausnahme von Acetonitril und Methanol (HPLC grade), welche von Burdick und Jackson bezogen wurden. Acetonitril wird getrocknet durch Refluxieren über Calciumhydrid und anschließendem Destillieren. Acrylamid, Bis-Acrylamid, Bromphenolblau, Xylencyanol und TEMED (Tetramethylendiamin) werden von BioRad bezogen. Harnstoff stammt von Bethesda Research Laboratories. Lysozym, Glukose und Ampicillin werden von Sigma bezogen. T4 Polynukleodid-Kinase und T4 DNA-Ligase sowie sämtliche Restriktionsenzyme werden von New England BioLabs bezogen. Die RNase A stammt von Pharmacia und die Reverse Transkriptase von Seikagaku America, Inc. Die dNTP's und ddNTP's werden von Pharmacia bezogen. γ-³²P ATP und α-³²P dATP werden bei Amershain bestellt. Die kompetenten E. coli AGl-Zellen stammen von Stratagene. Sowohl das Trypton als auch der Hefeextrakt für die Lennox Broth wie auch das antibiotische Medium 2 für die Agarplatten werden bei Difco Labs bezogen. Die Nitrocellulosefilter kommen von Schleicher und Schuell.
- Sämtliche neuen, für das Zusammenfügen der modifizierten Kringel 1 (kt1) und Kringel 2 (kt2)-Domänen erforderlichen Oligonukleotide (P106, P107, P108-P112, P114-118, P120-P123) werden unter Anwendung der Festphasen-Phosphoramidit-Triester-Kopplung auf einem ABI 380B DNA-Synthetisiergerät synthetisiert (S.L. Beaucage, M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22:1859-1862, 1981). Die Oligonukleotide werden vom Träger abgespalten und partiell entschützt, indem das Entschützungsprogramm des Synthetisiergerätes und eine nachfolgende Behandlung mit konzentriertem Ammoniumhydroxid bei 50 ºC über Nacht angewendet wurden. Sie werden mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen gereinigt, wie zuvor detailliert beschrieben wurde (N.Y. Theriault et al., Nucleosides and Nucleotides 5:15-32, 1986). Die Größenbestimmung der Oligonukleotide erfolgte durch Markierung mit γ-³²P ATP in Gegenwart von T4 Polynukleotid-Kinase und durch Anwendung eines Polyacrylamidgels unter denaturierenden Bedingungen gegen bekannte Standards.
- Die Herstellung der kt1-DNA (Block 3') erfolgte unter Anwendung derselben Oligonukleotide, wie sie für die Kringelt 1-DNA gemäß Darlegung in PCT WO 87/03906 verwendet wurden, mit der Abweichung, daß die Nukleotide P32 und P42 durch P106 bzw. P107 ersetzt werden, um die sechs Aminosäuren wie oben dargelegt auszutauschen. Der modifizierte kt1-Block 3' wird aufgebaut aus insgesamt 20 Oligonukleotiden, die in ihrer Länge von einem 21-mer bis zu einem 33-mer variieren, und weist die im Diagramm 4 dargestellten Strukturen auf. Die Herstellung der kt2-DNA (Block 4') erfolgte unter Verwendung von insgesamt 12 Oligonukleotiden, die in ihrer Länge von einem 41-mer bis zu einem 50-mer variieren. Die Strukturen der Oligonukleotide sind im Diagramm 4 dargestellt. Die Oligonukleotide P24 bis P31, P33 bis P41 und P43 werden von New England BioLabs bezogen. Alle anderen Oligonukleotide P106, P107, P108-P112, P114-P118, P120-P123 mit Längen zwischen einem 30-mer und einem 50-mer werden mit sehr guten Ausbeuten synthetisiert (99,0 % + pro Kopplung).
- Die Oligonukleotide werden entschützt und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter Anwendung der von N.Y. Theriault et al., Ebd., veröffentlichten Bedingungen gereinigt. Sie werden über Waters SepPak C-18-Packungen entsalzt. Ihre Größen und Reinheiten werden bestimmt durch Markierung mit γ-³²P ATP und Polynukleotid-Kinase und Auftrennen derselben in einem Polyacrylamidgel gegen bekannte Standards.
- kt1 (Block 3') wird gemäß der im Diagramm 5 dargestellten Strategie zusammengefügt. Die Fragmente werden in zwei Gruppen unterteilt und zum Erhalt von I121 J125 und K148 L146 ligiert. Nach Reinigung und Isolierung werden diese anneliert und ligiert, um den Block 3' zu erhalten. Nach Reinigung durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (10 %) unter nicht-denaturierenden Bedingungen und Isolierung wird der Block 3' erfolgreich in pBR322 kloniert und durch die Didesoxy-Methode (E.Y. Chen, P.H. Seeburg, DNA 4:165-170, 1985; A.M. Maxam, W. Gilbert, Methods in Enzymol., 65:499-560, 1980) sequenziert.
- Der enzymatische Zusammenbau von kt2 (Block 4') erfolgt gemäß Darlegung im Diagramrn 6 und ergab M-182 N-185 und 0-133 P-130. Nach Reinigung und Isolierung werden diese anneliert und ligiert, um den Block 4' zu erhalten. Nach Reinigung durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (10 %) unter nicht-denaturierenden Bedingungen und Isolierung wird der Block 4' in pBR322 kloniert und wie oben beschrieben sequenziert.
- Bei der Klonierung der modifizierten Kringelt 1- und der modifizierten Kringelt 2-DNA werden die Plasmide pBR322/Bam H1 und Cla 1 und pBR322/Bam H1 und Hind III hergestellt. Das zirkuläre pBR322 wird mit den geeigneten Restriktionsenzymen nach den Angaben des Herstellers für die verwendeten Enzyme geschnitten. Die Reinigung erfolgt anschließend in einem horizontalen präparativen 1%igen Agarosegel in 1 x E-Puffer (0,04 M Tris-Acetat, 0,002 M EDA) bei 30 V über Nacht. Die DNA wurde aus der Agarose- Bande in 0,5 x E-Puffer bei 50 V für 4 Stunden elektroeluiert, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt.
- Nach dem enzymatischen Zusainmenfügen der Oligonukleotide zur Herstellung der gewünschten Sequenz wird jede der Kringelt-Strukturen mit seinem entsprechenden linearen Plasmid ligiert unter Verwendung von T4 DNA-Ligase, 100 ng plasmidärer DNA und einem ungefähr 100fachen molaren Überschuß an Insert-DNA. Das Ligieren erf olgt in 20 ul Ligationspuffer (0,5 M Tris-HCl, pH-Wert 7,4;0,1 M MgCl&sub2;; 0,1 M DTT; 10 mM ATP) bei 15 ºC über Nacht. Äquimolare Mengen (0,2 nmol) der Genfragmente werden markiert, anneliert, ligiert, und die resultierenden ligierten Produkte werden wie zuvor detailliert beschrieben gereinigt (N.Y. Theriault et al., ebda., und Biotechniques 6:470-474 (1988); Jay et al., J. Biol. Chem. 259:6311-6317, (1984).
- Die kompetenten E. coli AGl-Zellen von Stratagene werden verwendet zur Transformation der Plasmid/Insert-Ligationsreaktionsmischung. Die Transformationen erfolgen für jede Ligationsreaktionsmischung unter Verwendung von 5 ng DNA der Reaktionsmischung für jede Transformation. Die Transformationen erfolgen auf Eis für eine Zeitdauer von 30 Minuten, gefolgt von einem Hitzeschock für 45 Sekunden bei 42 ºC und anschließender Kultivierung in L-Brühe bei 37 ºC für 1 Stunde vor dem Ausplattieren auf Ampicillin enthaltenden Agarplatten. Hinsichtlich der Einzelheiten des Vorgehens wird auf Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, und auf die Produktinformationen von Stratagene verwiesen.
- Sämtliche positiven Transformanten werden identifiziert durch Hybridisierungsexperimente mit Oligos, die bei der Herstellung der Kringelt-Strukturen verwendet wurden. Die zur Hybridisierung ausgewählten Oligos besitzen eine Länge von weniger als 25 Basen und weisen eine Basenzusammensetzung von ungefähr 50 % G/C auf. Die Hybridisierungen und Filterwäschen erfolgen bei unterschiedlichen Temperaturen in Abhängigkeit der Länge der verwendeten Oligonukleotide. Im Falle der modifizierten Kringelt 1 beträgt die Zeitdauer 12 Stunden bei 42 ºC, und es wird gewaschen mit 0,1 x SSC bei 50 ºC für 30 Minuten und bei 55 ºC für 30 Minuten mit frischer SSC. Das verwendete Oligonukleotid ist P25, welches ein 24-mer ist und einen G/C-Gehalt von 63 % aufweist. Bei der modifizierten Kringelt 2 beträgt die Zeitdauer 72 Stunden bei 42 ºC mit P48, einem 23-mer mit einem G/C-Gehalt von 43 %. Die Waschungen erfolgen wie für die modifizierte Kringelt 1. Schließlich wird einmal gewaschen mit 0,2 x SSC bei 42 ºC. Hinsichtlich der Einzelheiten dieser Protokolle wird verwiesen auf Maniatis et al., ebda. Die positiven Transformanten werden mittels Autoradiographie identifiziert.
- Um sicherzustellen, daß die identifizierten positiven Transformanten die korrekte Sequenz ohne irgendwelche Mutationen enthalten, wird zumindest jeweils ein Klon der modifizierten Kringel 1 (ktl) und der modifizierten Kringel 2 (kt2) vollständig nach dem Didesoxy-Sequenzierungsverfahren sequenziert (R.B. Wallace et al., Gene 16:21-26, 1981, E.Y.Chen, P.H. Seeburg, ebda.). Die Positiven aus der Autoradiographie werden über Nacht bei 37 ºC in 5 ml L-Brühe enthaltend Ampicillin kultiviert. Die Plasmid-DNA wird von diesen Übernacht-Kulturen durch das Verfahren der alkalischen Lyse isoliert. Hinsichtlich weiterer Einzelheiten wird auf Maniatis et al., ebda., verwiesen. Von jeder dieser Übernacht-Kulturen wird ausreichend DNA (etwa 250 ng) isoliert, um drei Ansätze der Sequenzierungsreaktionen durchzuführen. Die DNA von diesen Mini-Präparationen wird mit DNase-freier pankreatischer RNase (unter Verwendung von 10 ug in 40 ul Gesamtvolumen) 1 Stunde lang bei 37 ºC behandelt. Die RNase wird durch Extraktion mit Phenol entfernt und die DNA wird mit Ethanol gefällt. Die DNA wird mit 2 N NaOH/2 mM EDTA für eine Zeitdauer von 10 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur denaturiert. Das Priming mit den Sequenzierungstemplates erfolgt während der Ethanolfällung. Die Didesoxy-Sequenzierung erfolgt mit reverser Transkriptase nach Standardverfahren zur Sequenzierung von doppelsträngiger DNA. Die Primer zur Sequenzierung sind solche, die von New England BioLabs erhältlich sind, und/oder Oligonukleotide, die zum Zusammenfügen der Blöcke 3' und 4' verwendet wurden.
- Die nachfolgend dargelegten spezifischen Beispiele veranschaulichen die Herstellung von Plasmiden, die cDNA enthalten, welche für illustrative tPA-Analogons kodieren, die die modifizierte Kringel 1 (kt1) oder die modifizierte Kringel 2 (kt2) enthalten. Die Begriffe zur Bezeichnung der Plasmide und Fragmente in den Diagrammen 1-7 sollen synonym mit den herkömmlichen Bezeichnungen von Plasmiden und deren Fragmenten sein. Im Unterschied zu der herkömmlichen kreisförmigen Darstellung kennzeichnen die einzeiligen Darstellungen der Diagramme sowohl zirkuläre als auch lineare doppelsträngige DNA. Unter Bezugnahme auf die Orientierung der Renin-Sequenz wird lediglich die Initiation der Transkription als von links nach rechts (5' zu 3') auftretend hervorgehoben. Die Sternchen (*) bezeichnen die Überbrückung von Nukleotiden zur Vervollständigung der zirkulären Form der Plasmide. Die Fragmente weisen keine Sternchen auf, da sie lineare Stücke der doppelsträngigen DNA sind. Die Endonuklease-Restriktionsstellen sind oberhalb der Linie angegeben. Die Genmarker sind unterhalb der Linie angegeben.
- Die verschiedenen in den Diagrammen 1-7 verwendeten Symbole besitzen im Hinblick auf t-PA die folgende Bedeutung:
- F - Finger-Domäne
- G - Wachstumsfaktor-Domäne
- K1 - Kringel 1-Domäne
- K2 - Kringel 2-Domäne
- N nicht-kodierende 3'-Sequenz
- k1 - Modifizierte Kringel 1-Domäne
- k2 - Modifizierte Kringel 2-Domäne
- A = aktive Stelle
- L = tPA-Leadersequenz
- T = 5'-Region der tPAcDNA
- P = mittlere Region der tPAcDNA
- a = Polyadenylierungs-Signalsequenz
- AmpR - Ampicillinresistenz
- Ori = pBR322-Replikationsursprung
- SV40 = Replikationsursprung vom Affenvirus
- dhfr = Mäuse-Dihydrofolat-Reduktase-Marker
- CMV = Promotor des Cytomegalovirus
- Das Plasmid pTPA-Bl,2,3,4 (s. Diagramm 2) wird mit Hpa I und Mst I partiell gespalten und das 4 Kb große Fragment wird isoliert. Diese Spaltung deletiert die K2-Region. Das Fragment von 4 Kb wird anschließend ligiert, um das Plasmid FGK1A zu ergeben. Das Plasmid FGK1A wird mit Cla I und Bam HI gespalten, wodurch ein Fragment von 3,8 Kb mit deletierter K1-Region erhalten wird. Die deletierte K1-Region kann nun durch das Cla/Bam HI k1-Fragment ersetzt werden, indem es mit dem Fragment von 3,8 Kb (mit der deletierten K1-Region) ligiert wird, wodurch das Analogon FGk1A entsteht.
- Das Plasmid pTPA-B1,2,3,4 wird gespalten mit EcoRV und Xma III. Das Fragment von 4 Kb wird isoliert und ligiert mit dem 230 Bp langen k2-Fragment, welches durch Spaltung des den Block 4' enthaltenden Plasmids (pBR322 Bam HI/Hind III) mit Hpa I und Xma III erhalten wurde. Das resultierende Plasmid enthält das Konstrukt FGk2A.
- Das Plasmid pTPA-B1,2,3,4 wird mit Cla I und Bam HI gespalten, und das Fragment von 4 Kb wird isoliert. Das den Block 3' enthaltende Plasmid wird mit Cla 1 und Bam HI gespalten, und das die kt1 enthaltende Fragment mit einer Länge von 270 Bp wird isoliert. Das 4 Kb große ClaI/Bam HI-Fragment wird anschließend ligiert mit dem 270 Bp langen Clal/Bam HI-Fragment, um das FGk1K2A enthaltende Plasmid zu ergeben.
- Die Herstellung von pTPAOIE-FGk1A ist ein zweistufiges Verfahren. Die Stufe 1 beinhaltet die Bildung von pTPA-FGk1A, welches das gewünschte tPA-Analogon, die Polyadenylierungs-Signalsequenz von BGH und die selektierbaren Marker und Replikons von pSVCOW enthält, und Stufe 2 beinhaltet das Insertieren des CMV I.E.- Promotors. Obgleich das folgende Beispiel die Insertion des tPA- Analogons FGk1A beschreibt, können andere Analogons (z.B. FGk1K2A oder FGk2A) unter Anwendung derselben Enzyme und Vorgehensweisen insertiert werden (s. Diagramm 7).
- Das Plasmid pTPA-CDNA (beschrieben in Figur 21, Seite 77 von PCT/US86/02684) wird mit Bam HI und Bgl II geschnitten, um ein 120 Basenpaar langes Fragment zu erhalten, welches mittels eines Gels isoliert wird. Das Plasmid pSVCOW7 (beschrieben in Figur 20, Seite 76 von PCT/US86/02684) wird mit Eco RI und Pvu II geschnitten, um ein 600 Basenpaare langes Fragment zu erhalten, welches die Polyadenylierungssequenz des bovinen Wachstumshormons enthält und mit Hilfe eines Gels isoliert wird. Die Sequenz des tPA-Analogons wird erhalten durch Spaltung des Plasmids pFGk1A (obiges Beispiel 1) mit Bgl II und Bal I, um ein 1,7 Kb langes Fragment zu erhalten, welches mit einem Gel isoliert wird. Eine zweite Probe von pSVCOW7 wird mit Eco RI und Bam HI gespalten, um ein 5,8 Kb langes Fragment zu erhalten, welches die Marker und Replikons von pSVCOW7 enthält und mit einem Gel isoliert wird. Die vier isolierten Fragmenten werden unter Verwendung von T4 Ligase ligiert zum Erhalt des Plasmids pTPA-FGk1A (8,2 Kb), welches anschließend mit Bam HI geschnitten wird, und der Promotor CMV-IE (760 Bp) wird insertiert, um das Plasmid pTOA-IE-FGk1A zu ergeben. Der Promotor CMV-IE wird erhalten aus einem Verdau des humanen CMV-Genoms mit Pst I und Sau 3A.
- Chinesische Hamsterovarial (CHO)-Zellen, die hinsichtlich Dihydrofolatreduktase (dhfr) defizient sind, werden mit dem Plasmid pTPA-IE-FGk1A transfiziert unter Anwendung der Calciumphosphat-Methode zur Transfektion von DNA in Zellen, detailliert beschrieben von Graham et al. (in Introduction of Macromolecules into Vaible Mammalian Cells, Alan R. Liss, Inc., New York, 1980, S. 3-25). Die verwendete Zellinie ist die Mutante DXB-11, ursprünglich erhältlich von L. Chasin der Columbia University und vollständig beschrieben in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216- 54220 (1980). Die obige Methode zur Transfektion basiert auf der Tatsache, daß Zellen, die die transfizierten Plasmide inkorporieren, nicht länger eine Defizienz für dhfr aufweisen und in Dulbecco's modified Eagle's Medium plus Prolin wachsen können.
- Von den mit pTPA-IE-FGk1A transfizierten Zellen werden Klone isoliert, die, im Falle der Kultivierung in einem Monolayer für zwei Tage, mindestens 10 ng FGk1A pro Millionen Zellen synthetisieren. Von den Zellen mit pIETPA-FGk1A-dhfr werden Klone isoliert, die mindestens 100 ng tPA pro Millionen Zellen synthetisieren. Die Expression des tPA-Analogons kann mittels Radioimmunoassay, enzymatischem Assay oder Western Blot-Techniken nachgewiesen werden.
- Die folgende Tabelle 1 veranschaulicht die Bildung der tPA-Analogons durch CHO-Zellen. Die folgende Tabelle 2 zeigt, daß wir kt1 durch den Austausch der 6 Aminosäuren von Kringelt 1 mit den 6 Aminosäuren von Kringelt 2 Eigenschaften ähnlich Kt2 verliehen haben, d.h. die FGk1A-Aktivität wird nunmehr in Gegenwart von Fibrin stimuliert. TABELLE 1 Analogon Kontrollmedium * Bestimmt durch Anwendung eines chromogenen Assays einschließlich Plasminogen, synthetischem Substrat S-2251, und CNBr-gespaltenes Fibrinogen. Tabelle 2 Fibrinogen Verstärkung Analogon Fragmente Faktor
Claims (5)
1. Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA) -Verbindung, umfassend die
tPA-aktive Stelle (At) und eine modifizierte tPA-Kringel-
Domäne, wobei die modifizierte tPA-Kringel-Domäne ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus
(a) einer tPA-Kringel 1-Domäne, bei der die
Aminosäurensequenz Ala Gly Lys Tyr Ser Ser an den Positionen 160 - 165
durch die Aminosäurensequenz Asn Arg Leu Thr Trp ersetzt
ist, und
(b) einer tPA-Kringel 2-Domäne, bei der die
Aminosäurensequenz Asn Arg Arg Leu Thr Trp an den Positionen 248 - 253
durch die Aminosäurensequenz Ala Gly Lys Tyr Ser Ser ersetzt
ist.
2. Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Verbindung nach Anspruch 1,
ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
Ft kt1 At,
Ft kt2 At,
Ft Gt kt1 At,
Ft Gt kt2 At,
kt1 kt2 At,
Ft kt1 kt2 At,
Ft Gt kt1 Kt2 At, und
Gt kt1 kt2 At,
wobei
Ft die tPA-Finger-Domäne ist,
Gt die tPA-Wachstumsfaktor-Domäne ist,
kt1 eine tPA-Kringel 1-Domäne ist, bei der die
Aminosäurensequenz Ala Gly Lys Tyr Ser Ser an den Positionen 160 -
165 durch die Aminosäurensequenz Asn Arg Arg Leu Thr
Trp ersetzt ist, und
kt2 eine tPA-Kringel 2-Domäne ist, bei der die
Aminosäurensequenz Asn Arg Arg Leu Thr Trp an den Positionen 160 -
165 durch die Aminosäurensequenz Ala Gly Lys Tyr Ser
Ser ersetzt ist,
Kt2 eine tPA-Kringel-2-Doinäne ist, und
At die tPA-aktive Stelle ist.
3. Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Verbindung nach Anspruch 1,
ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
Ft kt2 kt2 At,
Ft Gt kt2 kt2 At,
Ft Gt kt1 kt1 At,
Ft Gt kt2 kt1 At,
Ft Ft kt1 kt2 At, und
Ft Ft Gt kt1 kt2 At,
wobei
Ft die tPA-Finger-Domäne ist,
Gt die tPA-Wachstumsfaktor-Domäne ist,
kt1 eine tPA-Kringel 1-Domäne ist, bei der die
Aminosäurensequenz Ala Gly Lys Tyr Ser Ser an den Positionen 160 -
165 durch die Aminosäurensequenz Asn Arg Arg Leu Thr
Trp ersetzt ist, und
kt2 eine tPA-Kringel 2-Domäne ist, bei der die
Aminosäurensequenz Asn Arg Arg Leu Thr Trp an den Positionen 160 -
165 durch die Aminosäurensequenz Ala Gly Lys Tyr Ser
Ser ersetzt ist, und
At die tPA-aktive Stelle ist.
4. Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Verbindung nach einem der
vorhergehenden Ansprüche mit einem Molekulargewicht von nicht
mehr als 90 kD.
5. DNA-Verbindung mit einer Nukleotidsequenz, die für eine
Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Verbindung gemäß Definition in
einem der vorhergehenden Ansprüche kodiert.
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