JP2567536B2 - Ｐａｉー２の変異体 - Google Patents
Ｐａｉー２の変異体Info
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- JP2567536B2 JP2567536B2 JP3501647A JP50164791A JP2567536B2 JP 2567536 B2 JP2567536 B2 JP 2567536B2 JP 3501647 A JP3501647 A JP 3501647A JP 50164791 A JP50164791 A JP 50164791A JP 2567536 B2 JP2567536 B2 JP 2567536B2
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- Japan
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- pai
- cells
- dna molecule
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- dna
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8121—Serpins
- C07K14/8132—Plasminogen activator inhibitors
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、プラスミノーゲン活性化因子インヒビタ
ー、PAI-2の遺伝子工学的に製造された変異体に関す
る。
ー、PAI-2の遺伝子工学的に製造された変異体に関す
る。
微生物の寄託 E.コリ株BTA1445を、1987年２月11日、寄託番号ATCC5
3585として、ブダペスト条約の規定に従って、12301 Pa
rklawn Drive,Rockrille MD 20852,U.S.A.のAmerican T
ype Culture Collectionに寄託した。
3585として、ブダペスト条約の規定に従って、12301 Pa
rklawn Drive,Rockrille MD 20852,U.S.A.のAmerican T
ype Culture Collectionに寄託した。
技術背景 プラスミノゲーン活性化因子（PA）は、豊富な細胞外
チモーゲン、すなわちプラスミノーゲンをプラスミンに
転換するセリンプロテアーゼ、すなわち細胞外マトリッ
クスのすべての成分の分解を促進することができる活性
プロテアーゼである。（Danoなど.Adv Cancer Res.44:1
39〜266,1985）。
チモーゲン、すなわちプラスミノーゲンをプラスミンに
転換するセリンプロテアーゼ、すなわち細胞外マトリッ
クスのすべての成分の分解を促進することができる活性
プロテアーゼである。（Danoなど.Adv Cancer Res.44:1
39〜266,1985）。
２種の異なったタイプのPAが哺乳類組織に認識され
る： （ｉ）組織タイプのプラスミノーゲン活性化因子（t-P
A）． t-PAは、527個のアミノ酸を含む１つのポリペプチド
類から構成される、約70,000の分子量を有するセリンプ
ロテアーゼである。プラスミンによる制限された消化に
基づいて、分子は１つのジスルフィド結合により結合さ
れる２つの鎖活性化因子に転換される。これは、その分
子のＮ末端部分に由来するＨ鎖（Mr38,000）及びCOOH−
末端領域を含んで成るＬ鎖（Mr32,000）を生成するArg2
75-I1e276ペプチド結合の分割により生じる。t-PAのＬ
鎖に位置する触媒部位は、His322,Asp371及びSer478か
ら成る。t-PAはプラスミノーゲンにおけるArg560-Va156
1結合の加水分解を特異的に触媒する。フィブリンは、t
-PAによりプラスミノーゲン活性化因子を強く刺激する
ことが見出された。
る： （ｉ）組織タイプのプラスミノーゲン活性化因子（t-P
A）． t-PAは、527個のアミノ酸を含む１つのポリペプチド
類から構成される、約70,000の分子量を有するセリンプ
ロテアーゼである。プラスミンによる制限された消化に
基づいて、分子は１つのジスルフィド結合により結合さ
れる２つの鎖活性化因子に転換される。これは、その分
子のＮ末端部分に由来するＨ鎖（Mr38,000）及びCOOH−
末端領域を含んで成るＬ鎖（Mr32,000）を生成するArg2
75-I1e276ペプチド結合の分割により生じる。t-PAのＬ
鎖に位置する触媒部位は、His322,Asp371及びSer478か
ら成る。t-PAはプラスミノーゲンにおけるArg560-Va156
1結合の加水分解を特異的に触媒する。フィブリンは、t
-PAによりプラスミノーゲン活性化因子を強く刺激する
ことが見出された。
（ii）ウロキナーゼタイプのプラスミノーゲン活性化因
子（u-PA）． u-PAは、50,000のMrを有し、そして１つのポリペプチ
ド及び２つのポリペプチド鎖形で存在する。１つの鎖形
は不活性プロ酵素であり、そして２つの鎖形は活性酵素
である。u-PAは、フィブリンの不在下で実質的なプラス
ミノーゲン活性化因子活性を有し、そしてその存在によ
り刺激されない。フィブリンに対するt-PAの高い親和性
は、それが繊維素溶解機能に最っとも関与され、そして
u-PAは細胞外タンパク質分解出来事、たとえば組織改造
及び破壊（すなわち、器官退縮、炎症反応及び特に悪性
腫瘍の侵入的増殖及び転移性広がり）に関与されること
を示唆する。
子（u-PA）． u-PAは、50,000のMrを有し、そして１つのポリペプチ
ド及び２つのポリペプチド鎖形で存在する。１つの鎖形
は不活性プロ酵素であり、そして２つの鎖形は活性酵素
である。u-PAは、フィブリンの不在下で実質的なプラス
ミノーゲン活性化因子活性を有し、そしてその存在によ
り刺激されない。フィブリンに対するt-PAの高い親和性
は、それが繊維素溶解機能に最っとも関与され、そして
u-PAは細胞外タンパク質分解出来事、たとえば組織改造
及び破壊（すなわち、器官退縮、炎症反応及び特に悪性
腫瘍の侵入的増殖及び転移性広がり）に関与されること
を示唆する。
ヒトにおける血栓崩壊剤としてt-PA及び一本鎖u-PAの
実験的な使用が有望である。しかしながら、PAは、いく
つかの動物モデルから予測されるよりも、ヒトにおいて
より低い明白なフィブリン特異性を有することが明らか
になっており、臨床的な血栓崩壊治療において前記分解
剤又はそれらの投与スケムの追加の改良のための必要性
を示唆する。１つの可能性は、PAの全身性フィブリン溶
解効果を調整するためにPAの特異的に早い活性タンパク
質インヒビターの使用である。
実験的な使用が有望である。しかしながら、PAは、いく
つかの動物モデルから予測されるよりも、ヒトにおいて
より低い明白なフィブリン特異性を有することが明らか
になっており、臨床的な血栓崩壊治療において前記分解
剤又はそれらの投与スケムの追加の改良のための必要性
を示唆する。１つの可能性は、PAの全身性フィブリン溶
解効果を調整するためにPAの特異的に早い活性タンパク
質インヒビターの使用である。
最近の出来事は、ウロキナーゼ介在のプラスミノーゲ
ン活性化因子はまた、悪性細胞の侵入挙動に役割を演じ
ることができることを示唆する。少々の例外を伴って、
悪性細胞は、異常に高い量、PAを放す。Ossowski and R
eich（Cell,35;611〜619,1983）は、抗−ウロキナーゼ
抗体がニワトリの胚の漿尿膜上に接種されたヒト類表皮
癌細胞の転移を阻害したことを報告した。Bergmanなど
（Proc.Natl.Acad.Sci.83:966〜1000,1986）は、プロテ
アーゼネクシンＩ、すなわちウロキナーゼ及びプラスミ
ンの繊維芽細胞−分泌インヒビターが、ヒト繊維肉腫
（HT1080）細胞による細胞外マトリックス（ECM）の細
胞介在分解を効果的に阻害することを示した。最後に、
Sullivan and Quigley（Cell 45;905〜915,1986）は、P
Aに対するモノクローナル抗体がRous肉腫ウィルス−形
質転換性ニワトリ繊維芽細胞によるECMの分解を阻止す
ることを示す。ウロキナーゼの特異的プロテアーゼイン
ヒビターは、腫瘍組織における活性腫瘍細胞PAのレベル
を変えることにおいて臨界的な役割を演じ、そして従っ
て、インビボでの腫瘍の増殖及び侵入に影響を及ぼすこ
とが観察される〔Mignattなど.,Cell47;487（1986）;Os
sowski,Cell 52:321（1988）;Reichなど,Cancer Res.4
8:3307（1988）〕。
ン活性化因子はまた、悪性細胞の侵入挙動に役割を演じ
ることができることを示唆する。少々の例外を伴って、
悪性細胞は、異常に高い量、PAを放す。Ossowski and R
eich（Cell,35;611〜619,1983）は、抗−ウロキナーゼ
抗体がニワトリの胚の漿尿膜上に接種されたヒト類表皮
癌細胞の転移を阻害したことを報告した。Bergmanなど
（Proc.Natl.Acad.Sci.83:966〜1000,1986）は、プロテ
アーゼネクシンＩ、すなわちウロキナーゼ及びプラスミ
ンの繊維芽細胞−分泌インヒビターが、ヒト繊維肉腫
（HT1080）細胞による細胞外マトリックス（ECM）の細
胞介在分解を効果的に阻害することを示した。最後に、
Sullivan and Quigley（Cell 45;905〜915,1986）は、P
Aに対するモノクローナル抗体がRous肉腫ウィルス−形
質転換性ニワトリ繊維芽細胞によるECMの分解を阻止す
ることを示す。ウロキナーゼの特異的プロテアーゼイン
ヒビターは、腫瘍組織における活性腫瘍細胞PAのレベル
を変えることにおいて臨界的な役割を演じ、そして従っ
て、インビボでの腫瘍の増殖及び侵入に影響を及ぼすこ
とが観察される〔Mignattなど.,Cell47;487（1986）;Os
sowski,Cell 52:321（1988）;Reichなど,Cancer Res.4
8:3307（1988）〕。
ウロキナーゼタイプのプラスミノーゲン活性化因子の
特異的インヒビターは近代医学に役割を有する他の指摘
が存在する。PAは、広範囲の炎症状態、たとえば関節炎
に関与される。プラスミンは、軟骨を分解することがで
き〔Lack,CH ＆ Rogers,HJ（1958）Nature 182:948〕、
そしてプラスミンによる低レベルのフィブリン溶解活性
が滑膜に組織学的に検出された。PA/プラスミンシステ
ムは、リウマチ様細胞培養で検出され〔Werb,Zなど．
（1977）Na Engl J Med 296,10117）、そして高レベル
のuPAがリウマチ様滑液に示された〔Mochan,E ＆ Uhl,
J.（1984）J.Rheumato1 11,123〕。従って、関節におけ
るuPAの特異的インヒビターの使用は、この疾病に関与
される組織破壊を阻止することができる。
特異的インヒビターは近代医学に役割を有する他の指摘
が存在する。PAは、広範囲の炎症状態、たとえば関節炎
に関与される。プラスミンは、軟骨を分解することがで
き〔Lack,CH ＆ Rogers,HJ（1958）Nature 182:948〕、
そしてプラスミンによる低レベルのフィブリン溶解活性
が滑膜に組織学的に検出された。PA/プラスミンシステ
ムは、リウマチ様細胞培養で検出され〔Werb,Zなど．
（1977）Na Engl J Med 296,10117）、そして高レベル
のuPAがリウマチ様滑液に示された〔Mochan,E ＆ Uhl,
J.（1984）J.Rheumato1 11,123〕。従って、関節におけ
るuPAの特異的インヒビターの使用は、この疾病に関与
される組織破壊を阻止することができる。
特異的PAインヒビターの適用が用いられ得る他の状態
は、疾病又は変形性関節炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸
炎、SLE様疾患、乾癬、天疱瘡、角膜潰瘍、胃十二指腸
潰瘍、紫斑病、歯周炎、出血及び筋ジストロフィーのよ
うな状態を包含する。最後に、PAインヒビターは、２種
のトリプシンインヒビターが創傷組織の高められた引張
強さを有する結合組織の形成を高めることが示され〔Kw
aan,HC and Astrup,T（1969）Exp.Molec.Path.11,8
2〕、そしてケラチン細胞がuPA及びtPAの両者を生成す
ることが知られているので〔Giondahl-Hansen,J.など．
（1988）J.Invest Dermatal〕、特に皮膚創傷の治癒な
ど組織修復において有意な役割を有する。
は、疾病又は変形性関節炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸
炎、SLE様疾患、乾癬、天疱瘡、角膜潰瘍、胃十二指腸
潰瘍、紫斑病、歯周炎、出血及び筋ジストロフィーのよ
うな状態を包含する。最後に、PAインヒビターは、２種
のトリプシンインヒビターが創傷組織の高められた引張
強さを有する結合組織の形成を高めることが示され〔Kw
aan,HC and Astrup,T（1969）Exp.Molec.Path.11,8
2〕、そしてケラチン細胞がuPA及びtPAの両者を生成す
ることが知られているので〔Giondahl-Hansen,J.など．
（1988）J.Invest Dermatal〕、特に皮膚創傷の治癒な
ど組織修復において有意な役割を有する。
PAインヒビター、すなわちセルピン遺伝子種類のメン
バー（Sprengers and Kluft,Blood 69:381〜387,1987）
は、４種の免疫学的に異なるグループに分類された： １）内皮細胞タイプのインヒビター、PAI-1、 ２）胎盤タイプのPA−インヒビター、PAI-2、 ３）尿タイプのPA−インヒビター、PAI-3、 ４）プロテアーゼネキシンＩ、DNI。
バー（Sprengers and Kluft,Blood 69:381〜387,1987）
は、４種の免疫学的に異なるグループに分類された： １）内皮細胞タイプのインヒビター、PAI-1、 ２）胎盤タイプのPA−インヒビター、PAI-2、 ３）尿タイプのPA−インヒビター、PAI-3、 ４）プロテアーゼネキシンＩ、DNI。
PAI-2（Mr約46,000）は、胎盤組織、単球及びヒト単
球細胞系U937から精製された。これらの異なった源から
のPAI-2インヒビターは、免疫学的に関係し、そしてヒ
ト胎盤及びヒトU937細胞系に由来するPAI-2の最近のcDN
A配列分析は、それらが同一であり、但し分子の２つの
形はたった３個の単一のアミノ酸残基において異なって
存在することを確証した。両cDNA形は、U937細胞から単
離された。（Schleuningなど.Mol.Cell.Biol.7:4564〜4
567,1987;Antalisなど.Proc.Natl.Acad.Sci 85:985〜98
9,1988）。PAI-2はu-PA及びt-PAの両者と反応し（一本
鎖のt-PAとよりも二本鎖t-PAとより反応する）、SDS安
定複合体を形成する。PAI-2はフィブリン又はフィブリ
ン結合t-PAに結合しない。
球細胞系U937から精製された。これらの異なった源から
のPAI-2インヒビターは、免疫学的に関係し、そしてヒ
ト胎盤及びヒトU937細胞系に由来するPAI-2の最近のcDN
A配列分析は、それらが同一であり、但し分子の２つの
形はたった３個の単一のアミノ酸残基において異なって
存在することを確証した。両cDNA形は、U937細胞から単
離された。（Schleuningなど.Mol.Cell.Biol.7:4564〜4
567,1987;Antalisなど.Proc.Natl.Acad.Sci 85:985〜98
9,1988）。PAI-2はu-PA及びt-PAの両者と反応し（一本
鎖のt-PAとよりも二本鎖t-PAとより反応する）、SDS安
定複合体を形成する。PAI-2はフィブリン又はフィブリ
ン結合t-PAに結合しない。
最っとも可能性ある生物学的に活性的なタンパク質に
良くあることだが、PAI-2は、インビボにおいてひじょ
うに少量生成され、そしてそれ自体、従来の生化学的ア
プローチにより精製し、そして特徴づけることは困難で
ある。細菌細胞におけるPAI-2の最近の発現（Antalisな
ど.Proc.Natl.Acad.Sci. 85:985〜989,1988;Bunnなど,A
bstracts of the Second International Workshop on t
he Molec.and Cell.Biol.of Plasminogen Activation,B
rookhaven National Lab.,4月、1989）は、上記の種々
の可能性ある臨床的適用におけるその生物学的効率を評
価するために必要とされる精製されたPAI-2の量の生成
を可能にする。
良くあることだが、PAI-2は、インビボにおいてひじょ
うに少量生成され、そしてそれ自体、従来の生化学的ア
プローチにより精製し、そして特徴づけることは困難で
ある。細菌細胞におけるPAI-2の最近の発現（Antalisな
ど.Proc.Natl.Acad.Sci. 85:985〜989,1988;Bunnなど,A
bstracts of the Second International Workshop on t
he Molec.and Cell.Biol.of Plasminogen Activation,B
rookhaven National Lab.,4月、1989）は、上記の種々
の可能性ある臨床的適用におけるその生物学的効率を評
価するために必要とされる精製されたPAI-2の量の生成
を可能にする。
発明の開示 PAI-2の完全なヌクレオチド配列の知識は、天然の分
子に比べて改良された性質を示すことができるPAI-2の
変異体を生成する特定の遺伝的操作を可能にする。
子に比べて改良された性質を示すことができるPAI-2の
変異体を生成する特定の遺伝的操作を可能にする。
所望の改良された性質は、高められたインビボ半減
期、高められた又は変更された特異性及び／又は改良さ
れた医薬効果を包含する。
期、高められた又は変更された特異性及び／又は改良さ
れた医薬効果を包含する。
変更は、新しい適用分野を開く種々の性質又は産業上
の製造により従う変異体を供給し、従って改良された生
成方法を導びく。
の製造により従う変異体を供給し、従って改良された生
成方法を導びく。
PAI-2と他のセルピンとの間のユニークな差異は、C1
‐Ｄらせん間領域における33個の残基（66〜98）の追加
の拡張である〔Huber,R and Correll RW（1989）Bioche
mistry 28 8951〜8966〕。この領域は一般的に、オボア
ルブミンにおけるように短い９−残期の拡張に制限され
るか又は超科の他のメンバー（たとえばヒトα１−抗ト
リプシン、ヒト抗トロンビンIII）におけるように不在
である。この構造の有意性は未知である。本発明者は、
この領域がプロテアーゼに対して敏感であり、生成の
間、PAI-2の37kD形の発生を導びくことを発見した。PAI
-2調製物における37kDの汚染物の存在は、規定する権威
にたぶん許容されない。さらに、PAI-2の37kD形は、u-P
Aに結合できない。
‐Ｄらせん間領域における33個の残基（66〜98）の追加
の拡張である〔Huber,R and Correll RW（1989）Bioche
mistry 28 8951〜8966〕。この領域は一般的に、オボア
ルブミンにおけるように短い９−残期の拡張に制限され
るか又は超科の他のメンバー（たとえばヒトα１−抗ト
リプシン、ヒト抗トロンビンIII）におけるように不在
である。この構造の有意性は未知である。本発明者は、
この領域がプロテアーゼに対して敏感であり、生成の
間、PAI-2の37kD形の発生を導びくことを発見した。PAI
-2調製物における37kDの汚染物の存在は、規定する権威
にたぶん許容されない。さらに、PAI-2の37kD形は、u-P
Aに結合できない。
従って、タロテアーゼに対して敏感でない生物学的に
活性的なPAI-2分子を供給することが所望される。所望
しない特徴を欠く特定のタンパク質の変異体を供給する
場合、その変異体が、特に変更が有意である場合、親タ
ンパク質の所望する生物学的活性を維持するであろうか
どうかを予測することは不可能である。PAI-2の66〜98
のアミノ酸領域がPAI-2にユニークである場合、分子の
この領域への変更が、たぶん、得られる分子を不活性化
にし又はその活性に対して逆効果を少なくとも有するこ
とが予測される。驚くべきことには、本発明の変異体
は、天然のPAI-2の生物学的活性を保持するが、プロテ
アーゼ感受性を欠く。
活性的なPAI-2分子を供給することが所望される。所望
しない特徴を欠く特定のタンパク質の変異体を供給する
場合、その変異体が、特に変更が有意である場合、親タ
ンパク質の所望する生物学的活性を維持するであろうか
どうかを予測することは不可能である。PAI-2の66〜98
のアミノ酸領域がPAI-2にユニークである場合、分子の
この領域への変更が、たぶん、得られる分子を不活性化
にし又はその活性に対して逆効果を少なくとも有するこ
とが予測される。驚くべきことには、本発明の変異体
は、天然のPAI-2の生物学的活性を保持するが、プロテ
アーゼ感受性を欠く。
PAI-2への変化は、本発明の変異体を供給するため
に、DNAの特定部位突然変異誘発によりPAI-2の個々のア
ミノ酸を変性することによって又はDNA欠失又は挿入に
より大量に再構成することによって製造され得る。DNA
の実際の操作は一般的に、当業界における標準技法に従
って行なわれ得る。例示される特定の変化は、DNA欠失
により再構成することによって生成される。
に、DNAの特定部位突然変異誘発によりPAI-2の個々のア
ミノ酸を変性することによって又はDNA欠失又は挿入に
より大量に再構成することによって製造され得る。DNA
の実際の操作は一般的に、当業界における標準技法に従
って行なわれ得る。例示される特定の変化は、DNA欠失
により再構成することによって生成される。
本発明の第１の態様によれば、PAI-2の66-98アミノ酸
残基領域が少なくとも１つのプロテアーゼ感受性部位を
排除するために変更されているが、PAI-2の生物学的活
性及びPAI-2の65まで及び99からのアミノ酸は整合して
維持しているPAI-2変異体が供給される。好ましくは、
変異体は欠失変異体である。
残基領域が少なくとも１つのプロテアーゼ感受性部位を
排除するために変更されているが、PAI-2の生物学的活
性及びPAI-2の65まで及び99からのアミノ酸は整合して
維持しているPAI-2変異体が供給される。好ましくは、
変異体は欠失変異体である。
本発明は特に、本明細書に定義されるようなPAI-2変
異体Δ66-98を提供し、ここでΔ66-98は、欠失されたPA
I-2アミノ酸配列（SEQ ID No.1）のアミノ酸66〜98を有
する。本発明はまた、特に、本明細書に定義されるよう
な変異体Δ74-96を提供し、ここでΔ74-96は欠失された
PAI-2アミノ酸のアミノ酸74〜96を有する。
異体Δ66-98を提供し、ここでΔ66-98は、欠失されたPA
I-2アミノ酸配列（SEQ ID No.1）のアミノ酸66〜98を有
する。本発明はまた、特に、本明細書に定義されるよう
な変異体Δ74-96を提供し、ここでΔ74-96は欠失された
PAI-2アミノ酸のアミノ酸74〜96を有する。
本発明の第３の態様によれば、DNA分子が提供され、
この配列は第１の態様のPAI-2変異体をコードする。
この配列は第１の態様のPAI-2変異体をコードする。
本発明の第４の態様によれば、第３の態様のDNA分子
及びベクターDNAを含んで成る組換えDNA分子が提供され
る。
及びベクターDNAを含んで成る組換えDNA分子が提供され
る。
典型的には、ベクターDNAは、プラスミドDNAである。
本発明の好ましいプラスミドベクターは、E.コリ発現
ベクター、たとえばPLプロモーター、lacプロモータ
ー、tacプロモーター又はtrpプロモーターに基づくベク
ター、pGEM4Z及びそれに由来するベクター、pSp70及び
それに由来するベクター、バキュロウィルストランスフ
ァーベクター、たとえばpAc373、pAc360及びそれらに由
来するベクター、哺乳類発現ベクター、たとえばpBPV-
1,pBPV-BV1,pdBPV-MMTneo,SV40に基づく発現ベクター、
たとえばpBTA613及びそれらに由来するベクター、ワク
シニアウィルス発現ベクター、レトロウィルス発現ベク
ター及び相同又は異種宿主における組換えDNA分子の発
現のために使用される他のベクターを包含する。
ベクター、たとえばPLプロモーター、lacプロモータ
ー、tacプロモーター又はtrpプロモーターに基づくベク
ター、pGEM4Z及びそれに由来するベクター、pSp70及び
それに由来するベクター、バキュロウィルストランスフ
ァーベクター、たとえばpAc373、pAc360及びそれらに由
来するベクター、哺乳類発現ベクター、たとえばpBPV-
1,pBPV-BV1,pdBPV-MMTneo,SV40に基づく発現ベクター、
たとえばpBTA613及びそれらに由来するベクター、ワク
シニアウィルス発現ベクター、レトロウィルス発現ベク
ター及び相同又は異種宿主における組換えDNA分子の発
現のために使用される他のベクターを包含する。
これらのベクターに由来するベクターは、これらのベク
ターに構造的な変更を行なうことによって得られるこれ
らのベクターである。変更のタイプの例は、特定のベク
ターからの発現を高めるために製造されるものを包含す
る。
ターに構造的な変更を行なうことによって得られるこれ
らのベクターである。変更のタイプの例は、特定のベク
ターからの発現を高めるために製造されるものを包含す
る。
pBTA613は哺乳類細胞発現ベクターである。外来性遺伝
子は、SV40初期プロモーターを上流に及びSV40ポリアデ
ニル化シグナルを下流に有する複数のクローニング部位
中にクローン化することによって発現される。pBTA613
は、次のフラグメントを順に含んで成る。SV40起原から
の345bpのPVuII-HindIIIフラグメント、pUC18からの51b
pのHindIII-EcoRI複数クローニング部位、pBR327からの
75bpのEcoRI-AatIIフラグメント、両端に結合されるAat
IIリンカーを有するpMSGからの853bpのBamHI-XhoIフラ
グメント、27bpのオリゴヌクレオチド（GGCCCATATGATAT
CTCGAGACTAGTC:配列識別番号４）、pBR327からの288bp
のEagI-SalIフラグメント、SV40起原からの345bpのPvuI
I-HindIIIフラグメント、pSV2-DHFRからのマウスジヒド
ロ葉酸レダクターゼをコードする743bpのHindIII-BalII
フラグメント、SV40の小さなｔイントロン領域からの14
lbpのSau3Aフラグメント及びSV40初期ポリアデニル化領
域からの293bpのSau3Aフラグメント。dhfr遺伝子の５′
末端でのHindIII部位がSlヌクレアーゼを用いて欠失さ
れ、他の不和合端はSlヌクレアーゼを用いてフラッシュ
され、又はdNTP及びDNAポリマラーゼＩ（クレノウ）に
よりフィルインされた。
子は、SV40初期プロモーターを上流に及びSV40ポリアデ
ニル化シグナルを下流に有する複数のクローニング部位
中にクローン化することによって発現される。pBTA613
は、次のフラグメントを順に含んで成る。SV40起原から
の345bpのPVuII-HindIIIフラグメント、pUC18からの51b
pのHindIII-EcoRI複数クローニング部位、pBR327からの
75bpのEcoRI-AatIIフラグメント、両端に結合されるAat
IIリンカーを有するpMSGからの853bpのBamHI-XhoIフラ
グメント、27bpのオリゴヌクレオチド（GGCCCATATGATAT
CTCGAGACTAGTC:配列識別番号４）、pBR327からの288bp
のEagI-SalIフラグメント、SV40起原からの345bpのPvuI
I-HindIIIフラグメント、pSV2-DHFRからのマウスジヒド
ロ葉酸レダクターゼをコードする743bpのHindIII-BalII
フラグメント、SV40の小さなｔイントロン領域からの14
lbpのSau3Aフラグメント及びSV40初期ポリアデニル化領
域からの293bpのSau3Aフラグメント。dhfr遺伝子の５′
末端でのHindIII部位がSlヌクレアーゼを用いて欠失さ
れ、他の不和合端はSlヌクレアーゼを用いてフラッシュ
され、又はdNTP及びDNAポリマラーゼＩ（クレノウ）に
よりフィルインされた。
本発明の好ましい組換えDNA分子は、pBTA829,pBTA84
0,pMINDEL 74-96及びこれらの組換えDNA分子の誘導体を
含む。
0,pMINDEL 74-96及びこれらの組換えDNA分子の誘導体を
含む。
これらの組換えDNA分子の誘導体は、これらの分子に
由来する分子であり、そして変更がコードされたPAI-2
変異体の発現の制御を改良し又は変えるためにDNA構造
体になされた分子を含む。本発明の組換えDNA分子誘導
体は、親分子の領域をコードするPAI-2変異体を維持す
る。
由来する分子であり、そして変更がコードされたPAI-2
変異体の発現の制御を改良し又は変えるためにDNA構造
体になされた分子を含む。本発明の組換えDNA分子誘導
体は、親分子の領域をコードするPAI-2変異体を維持す
る。
本発明の第５態様によれば、第４態様の組換えDNA分
子により形質転換された形質転換宿主細胞が提供され
る。
子により形質転換された形質転換宿主細胞が提供され
る。
典型的には、宿主細胞系が適切なE.コリK-12株から誘
導される。それらはまた、真核生物から誘導され得、そ
してCOS細胞、CHO細胞、U937細胞、BHK-21細胞、Vero細
胞、CVl細胞、C127細胞及び昆虫スポドプテルスフルギ
ペルダ（Spodoptera frugiperde）及びボンビックスモ
リ（Bombyx mori）に由来する細胞系を包含する。
導される。それらはまた、真核生物から誘導され得、そ
してCOS細胞、CHO細胞、U937細胞、BHK-21細胞、Vero細
胞、CVl細胞、C127細胞及び昆虫スポドプテルスフルギ
ペルダ（Spodoptera frugiperde）及びボンビックスモ
リ（Bombyx mori）に由来する細胞系を包含する。
本発明の第６態様によれば、第１態様のPAI-2変異体
を製造するための方法が提供され、この方法は、99から
65までのアミノ酸が整合して存続し、そして得られる変
異体がPAI-2の生物学的活性を保持するように、PAI-2を
コードするDNA分子の66-98アミノ酸残基領域からヌクオ
レチドを欠失することを含んで成る。
を製造するための方法が提供され、この方法は、99から
65までのアミノ酸が整合して存続し、そして得られる変
異体がPAI-2の生物学的活性を保持するように、PAI-2を
コードするDNA分子の66-98アミノ酸残基領域からヌクオ
レチドを欠失することを含んで成る。
本発明の第７態様によれば、第４態様の組換えDNA分
子を製造するための方法が提供され、前記方法は、第３
態様のDNA分子をベクターDNA中に挿入することを含んで
成る。
子を製造するための方法が提供され、前記方法は、第３
態様のDNA分子をベクターDNA中に挿入することを含んで
成る。
本発明の第８態様によれば、第５態様の形質転換され
た宿主細胞を製造するための方法が提供され、前記方法
は、形質転換のために適切な宿主コンピテント細胞を製
造し、そして第４態様の組換えDNA分子により前記コン
ピテント宿主細胞を形質転換することを含んで成る。
た宿主細胞を製造するための方法が提供され、前記方法
は、形質転換のために適切な宿主コンピテント細胞を製
造し、そして第４態様の組換えDNA分子により前記コン
ピテント宿主細胞を形質転換することを含んで成る。
本発明の第９態様によれば、第１態様の少なくとも１
種のPAI-2変異体の有効量、並びに医薬的に許容できる
キャリヤー、賦形剤及び／又は希釈剤を含んで成る治療
用及び／又は診断用組成物が提供される。使用され得る
医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤及び賦形剤は、
医薬製剤の調製に標準的に使用されるものから選択され
得る。診断目的のために使用される場合、前記物質はラ
ベルされた形で少なくとも１種の変異体を含んで成る。
PAI-2変異体は、放射性同位体、たとえばI131によりラ
ベルされ得、又は適切な酵素又は他の化学物質に接合さ
れ得る。少なくとも１種の変異体が、本明細書で定義さ
れる場合、Δ66-98及び／又はΔ74-96を含んでなるよう
な物質が特に供給される。抗体の生成のために使用され
る場合、組成物はアジュバントを含むことができる。
種のPAI-2変異体の有効量、並びに医薬的に許容できる
キャリヤー、賦形剤及び／又は希釈剤を含んで成る治療
用及び／又は診断用組成物が提供される。使用され得る
医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤及び賦形剤は、
医薬製剤の調製に標準的に使用されるものから選択され
得る。診断目的のために使用される場合、前記物質はラ
ベルされた形で少なくとも１種の変異体を含んで成る。
PAI-2変異体は、放射性同位体、たとえばI131によりラ
ベルされ得、又は適切な酵素又は他の化学物質に接合さ
れ得る。少なくとも１種の変異体が、本明細書で定義さ
れる場合、Δ66-98及び／又はΔ74-96を含んでなるよう
な物質が特に供給される。抗体の生成のために使用され
る場合、組成物はアジュバントを含むことができる。
本発明の第10態様によれば、腫瘍侵入を阻害しそして
／又は腫瘍を処理するための方法が提供され、前記方法
は、第１態様のPAI-2変異体の治療的に効果的な量及び
／又は第９態様の組成物をそのような処理を必要とする
患者に投与することを含んで成る。
／又は腫瘍を処理するための方法が提供され、前記方法
は、第１態様のPAI-2変異体の治療的に効果的な量及び
／又は第９態様の組成物をそのような処理を必要とする
患者に投与することを含んで成る。
本発明の第11態様によれば、炎症疾患、たとえばリウ
マチ様関節炎、変形性関節炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大
腸炎、乾癬又は天疱瘡の処理方法が提供され、前記方法
は、第１態様のPAI-2変異体の治療的に有効な量及び／
又は第９態様の組成物をそのような処理を必要とする患
者に投与することを含んで成る。
マチ様関節炎、変形性関節炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大
腸炎、乾癬又は天疱瘡の処理方法が提供され、前記方法
は、第１態様のPAI-2変異体の治療的に有効な量及び／
又は第９態様の組成物をそのような処理を必要とする患
者に投与することを含んで成る。
本発明の第12態様によれば、フィブリン溶解疾患、た
とえば全身性フィブリン溶解の処理方法が提供され、前
記方法は、第１態様のPAI-2変異体の治療学的に有効な
量及び／又は第９態様の組成物をそのような処理を必要
とする患者に投与することを含んで成る。
とえば全身性フィブリン溶解の処理方法が提供され、前
記方法は、第１態様のPAI-2変異体の治療学的に有効な
量及び／又は第９態様の組成物をそのような処理を必要
とする患者に投与することを含んで成る。
本発明の第13態様によれば、多発性硬化症、角膜又は
胃十二指腸潰瘍、紫斑病、歯周炎、出血及び筋ジストロ
フィーのような状態の処理方法が提供され、前記方法
は、第１態様のPAI-2変異体の治療的に有効な量及び第
９態様の組成物をそのような処理を必要とする患者に投
与することを含んで成る。
胃十二指腸潰瘍、紫斑病、歯周炎、出血及び筋ジストロ
フィーのような状態の処理方法が提供され、前記方法
は、第１態様のPAI-2変異体の治療的に有効な量及び第
９態様の組成物をそのような処理を必要とする患者に投
与することを含んで成る。
本発明の第14態様によれば、組織学的検体又はインビ
ボでの腫瘍の境界を見出し、そして／又は定義するため
の方法が提供され、前記方法は、第２態様のラベルされ
たPAI-2変異体の有効量を検体に適用し、又はインビボ
イメージングの必要な宿主にそれを投与し、そしてイメ
ージングによりラベルの濃度の位置を決定することを含
んで成る。
ボでの腫瘍の境界を見出し、そして／又は定義するため
の方法が提供され、前記方法は、第２態様のラベルされ
たPAI-2変異体の有効量を検体に適用し、又はインビボ
イメージングの必要な宿主にそれを投与し、そしてイメ
ージングによりラベルの濃度の位置を決定することを含
んで成る。
本発明の第15態様によれば、血栓症のPA処理の臨床学
的効力を改良するための方法が提供され、前記方法は、
フィブリン溶解及び付随するフィブリン／ブィブリノー
ゲン分解の全身活性化を中和するために第１態様のPAI-
2変異体の治療的に有効な量及び第９態様の組成物をそ
のような処理を必要な宿主に投与することを含んで成
る。
的効力を改良するための方法が提供され、前記方法は、
フィブリン溶解及び付随するフィブリン／ブィブリノー
ゲン分解の全身活性化を中和するために第１態様のPAI-
2変異体の治療的に有効な量及び第９態様の組成物をそ
のような処理を必要な宿主に投与することを含んで成
る。
本発明の第16態様によれば、第１態様のPAI-2変異体
に対する抗体が提供される。その抗体はモノクローナル
又はポリクローナル抗体のいづれかであり得る。
に対する抗体が提供される。その抗体はモノクローナル
又はポリクローナル抗体のいづれかであり得る。
本発明の抗体は、PAI-2を検出するために使用され
得、そして従って、多くの疾病状態、たとえば単球白血
病、癌、胎児発育及び慢性炎症疾患の検出又はモニター
することに有用である。
得、そして従って、多くの疾病状態、たとえば単球白血
病、癌、胎児発育及び慢性炎症疾患の検出又はモニター
することに有用である。
本発明の第17態様によれば、第16態様の抗体を調製す
るための方法が提供され、前記方法は、第１態様のPAI-
2変異体の有効量及び／又は第９態様の組成物により免
疫適格宿主を感作することを含んで成る。
るための方法が提供され、前記方法は、第１態様のPAI-
2変異体の有効量及び／又は第９態様の組成物により免
疫適格宿主を感作することを含んで成る。
本発明の第18態様によれば、第16態様の抗体並びに医
薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤及び／又は賦形剤
を含んで成る抗体組成物が提供される。
薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤及び／又は賦形剤
を含んで成る抗体組成物が提供される。
本発明の抗体組成物は、第16態様の抗体が使用され得
る疾患状態の検出又はモニターに使用される。
る疾患状態の検出又はモニターに使用される。
本発明の第19態様によれば、第16態様の抗体及び／又
は第18態様の抗体組成物を含んで成る診断試薬が提供さ
れる。
は第18態様の抗体組成物を含んで成る診断試薬が提供さ
れる。
本発明の第20態様によれば、細胞毒素に結合される第
１態様の変異体を含んで成る接合体が提供される。本発
明の接合体の調製に使用され得る細胞毒素の例は：アビ
リン；リシン；メリチン；ゲロニン；及びジフテリア
（Diphtheria）、破傷風、クロストリジウム属、ペルツ
シス（Pertussis）、シゲラ（Shigella）、プスードモ
ナス（Pseudomonas）、コレラ又はE.コリ不安定毒素を
包含する。
１態様の変異体を含んで成る接合体が提供される。本発
明の接合体の調製に使用され得る細胞毒素の例は：アビ
リン；リシン；メリチン；ゲロニン；及びジフテリア
（Diphtheria）、破傷風、クロストリジウム属、ペルツ
シス（Pertussis）、シゲラ（Shigella）、プスードモ
ナス（Pseudomonas）、コレラ又はE.コリ不安定毒素を
包含する。
これまでの研究は、ヒト結腸癌が隣接する無関係な組
織に存在するよりも有意に多量のウロキナーゼタイププ
ラスミノーゲン活性化因子を生成することを示した。PA
I-2は、この潰瘍関連プラスミノーゲン活性化因子に結
合し、そして阻害することができることが見出された
（Stephensなど.Blood 66 333〜337,1985）。従って、
生物学的に活性的なPAI-2変異体は、インビボ及び組織
学的検体の両者において潰瘍を同定し、そして定義する
ための試薬として適用される。腫瘍をインビボでイメー
ジ化するためには、本発明のPAI-2変異体は、適切な同
位体、たとえばTc-99m（Richardson,V.J.Brit.J.Cancer
40;35,1979）又はI-131（Begent,R.H.J.Lancet.10月２
日、1982）によりラベルされ得る。PAI-2変異体調製物
の投与の後、腫瘍の位置及び境界は、既知の放射性同位
体法、たとえばγ−カメライメージングにより決定され
得る。従って、PAI-2変異体は、小さな転移性癌、特に
手術介入の後に生じる癌の同定を可能にする敏感な方法
を提供する。組織学的検体の分析において、PAI-2変異
体又はそこに発生する抗体は、同位体、たとえばI131に
よりラベルされ、又は適切な酵素又は他の化学試薬に接
合され得る。組織学的検体、たとえばバイオプシー断片
との接触に基づいて、本発明のPAI-2変異体は、分泌の
その場所で腫瘍タイププラスミノーゲン活性化因子に結
合し、それによって腫瘍の境界及びたぶん腫瘍の転移状
態を同定する。診断的適用の他に、PAI-2変異体はま
た、腫瘍の直接的な処理への使用のためにも向けられ
る。酵素の特定的インヒビターが、腫瘍がまわりの組織
に侵入する工程に包含される場合（Dano,k.など.,Adv.i
n Cancer Res.44,139,1985）、腫瘍増殖及び転移の制御
及び特に阻害が達成され得る。さらに、PAI-2変異体
は、増殖する腫瘍に直接レクチン又は毒素を運ぶ薬物投
与システムとして使用され得る。このシステムは、特異
性及びひじょうに可能性ある殺腫瘍能力についての多く
の利点を提供する。
織に存在するよりも有意に多量のウロキナーゼタイププ
ラスミノーゲン活性化因子を生成することを示した。PA
I-2は、この潰瘍関連プラスミノーゲン活性化因子に結
合し、そして阻害することができることが見出された
（Stephensなど.Blood 66 333〜337,1985）。従って、
生物学的に活性的なPAI-2変異体は、インビボ及び組織
学的検体の両者において潰瘍を同定し、そして定義する
ための試薬として適用される。腫瘍をインビボでイメー
ジ化するためには、本発明のPAI-2変異体は、適切な同
位体、たとえばTc-99m（Richardson,V.J.Brit.J.Cancer
40;35,1979）又はI-131（Begent,R.H.J.Lancet.10月２
日、1982）によりラベルされ得る。PAI-2変異体調製物
の投与の後、腫瘍の位置及び境界は、既知の放射性同位
体法、たとえばγ−カメライメージングにより決定され
得る。従って、PAI-2変異体は、小さな転移性癌、特に
手術介入の後に生じる癌の同定を可能にする敏感な方法
を提供する。組織学的検体の分析において、PAI-2変異
体又はそこに発生する抗体は、同位体、たとえばI131に
よりラベルされ、又は適切な酵素又は他の化学試薬に接
合され得る。組織学的検体、たとえばバイオプシー断片
との接触に基づいて、本発明のPAI-2変異体は、分泌の
その場所で腫瘍タイププラスミノーゲン活性化因子に結
合し、それによって腫瘍の境界及びたぶん腫瘍の転移状
態を同定する。診断的適用の他に、PAI-2変異体はま
た、腫瘍の直接的な処理への使用のためにも向けられ
る。酵素の特定的インヒビターが、腫瘍がまわりの組織
に侵入する工程に包含される場合（Dano,k.など.,Adv.i
n Cancer Res.44,139,1985）、腫瘍増殖及び転移の制御
及び特に阻害が達成され得る。さらに、PAI-2変異体
は、増殖する腫瘍に直接レクチン又は毒素を運ぶ薬物投
与システムとして使用され得る。このシステムは、特異
性及びひじょうに可能性ある殺腫瘍能力についての多く
の利点を提供する。
ウロキナーゼタイプのプラスミノーゲン活性化因子が
包含される他の生物学的方法は、侵入及び組織破壊、た
とえば慢性炎症状態、たとえばリウマチ様関節炎に関係
する生理学的出来事を包含する。PAI-2変異体は、その
ような状態を改良することにおいて、インビボで投与さ
れる場合、治療効果を有することが示される。
包含される他の生物学的方法は、侵入及び組織破壊、た
とえば慢性炎症状態、たとえばリウマチ様関節炎に関係
する生理学的出来事を包含する。PAI-2変異体は、その
ような状態を改良することにおいて、インビボで投与さ
れる場合、治療効果を有することが示される。
本発明の第21態様によれば、第20態様の接合体並びに
医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤及び／又は賦形
剤を含んで成る細胞毒性組成物が提供される。
医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤及び／又は賦形
剤を含んで成る細胞毒性組成物が提供される。
本発明の第22態様によれば、細胞毒性物質を腫瘍に運
ぶ方法が提供され、前記方法は、第20態様の接合体の有
効量及び／又は第21態様の細胞毒性組成物をそのような
処理の必要な宿主に投与することを含んで成る。
ぶ方法が提供され、前記方法は、第20態様の接合体の有
効量及び／又は第21態様の細胞毒性組成物をそのような
処理の必要な宿主に投与することを含んで成る。
本発明の第23態様によれば、対照として第１態様の変
異体及び／又は第９態様の組成物及び第16態様の抗体、
第17態様の抗体組成物及び／又は第19態様の診断試薬を
含んで成る診断キットが提供される。
異体及び／又は第９態様の組成物及び第16態様の抗体、
第17態様の抗体組成物及び／又は第19態様の診断試薬を
含んで成る診断キットが提供される。
本発明の診断キットは、本発明の抗体が使用され得る
疾病及び状態の検出又はモニターに使用される。
疾病及び状態の検出又はモニターに使用される。
図面の簡単な説明 第１図 PAI-2cDNA及びアミノ酸配列（配列識別番号
１）。矢印は、これまで同定された特異的切断点を示
す。
１）。矢印は、これまで同定された特異的切断点を示
す。
第２図 それぞれE.コリK-12及び昆虫細胞におけるPA
I-2及びその変異体の発現に使用される細菌性（pBTA64
1）及びバキュロウィルストランスファーベクター（pAc
372）。
I-2及びその変異体の発現に使用される細菌性（pBTA64
1）及びバキュロウィルストランスファーベクター（pAc
372）。
第３図 誘発されていない（レーン１及び２）及び誘
発された（レーン３及び４）、プラスミドpBTA641を含
むE.コリK-12細胞に由来するPAI-2の免疫学的検出。
発された（レーン３及び４）、プラスミドpBTA641を含
むE.コリK-12細胞に由来するPAI-2の免疫学的検出。
第４図 欠失変異体Δ66-98（配列識別番号３）及び
Δ74-96（配列識別番号２）を創造するためにPAI-2内で
の特異的ヌクレオチド及びアミノ酸変化。変更された領
域は、66-98のために配列識別番号5;74-96のために配列
識別番号６に記載され；そして配列識別番号18における
天然の配列と比較される。
Δ74-96（配列識別番号２）を創造するためにPAI-2内で
の特異的ヌクレオチド及びアミノ酸変化。変更された領
域は、66-98のために配列識別番号5;74-96のために配列
識別番号６に記載され；そして配列識別番号18における
天然の配列と比較される。
第５図 pBTAB29における欠失変異体Δ74-96を創造す
るために使用される、オリゴヌクレオチドA1（配列識別
番号７）及びA2（配列識別番号８）の配列。
るために使用される、オリゴヌクレオチドA1（配列識別
番号７）及びA2（配列識別番号８）の配列。
第６図 欠失変異体Δ74-96を含むプラスミドpBTA829
の構成。（使用される略語:B,BgI II;H,HinfI;P,PstI;
E,EcoRI;PL、バクテリオファージλの左側のプロモータ
ー；T7、バクテリオファージT7からのプロモーター；
AP、耐アンピシリン遺伝子;CIAP、ウシ腸アルカリホス
ファターゼ） 第７図 u-PA結合実験において検出されるPAI-2特異
的バンド（第７図Ａ）及びウロキナーゼ特異的バンド
（第７図Ｂ）の代表的な図。
の構成。（使用される略語:B,BgI II;H,HinfI;P,PstI;
E,EcoRI;PL、バクテリオファージλの左側のプロモータ
ー；T7、バクテリオファージT7からのプロモーター；
AP、耐アンピシリン遺伝子;CIAP、ウシ腸アルカリホス
ファターゼ） 第７図 u-PA結合実験において検出されるPAI-2特異
的バンド（第７図Ａ）及びウロキナーゼ特異的バンド
（第７図Ｂ）の代表的な図。
第８図 pBTA840における欠失変異体Δ66-98を創造す
るために使用される、オリゴヌクレオチドA134/301（配
列識別番号９）、A134/304（配列識別番号10）及びA134
/305（配列識別番号11）の配列。PAI-2コード領域内で
のオリゴヌクレオチドの位置は、添付する番号により示
される。塩基の番号付けは第１図における通りである。
るために使用される、オリゴヌクレオチドA134/301（配
列識別番号９）、A134/304（配列識別番号10）及びA134
/305（配列識別番号11）の配列。PAI-2コード領域内で
のオリゴヌクレオチドの位置は、添付する番号により示
される。塩基の番号付けは第１図における通りである。
オリゴヌクレオチドA134/301及び134/305は、欠失さ
れる塩基244〜342を伴って、塩基235〜541のPAI-2コー
ド領域を拡張するDNAフラグメントを生成するためにPCR
反応に使用された。オリゴヌクレオチドA134/304及びSp
6配列プライマーは、欠失される塩基244〜342を伴っ
て、塩基49〜351のPAI-2コード領域を拡張するDNAフラ
グメントを生成するためにPCR反応に使用された。オリ
ゴヌクレオチドA134/301及びSp6配列プライマーは、欠
失される塩基244〜342を伴って、塩基49〜541のPAI-2コ
ード領域を拡張するDNAフラグメントを生成するために
上記２種のPCR反応に使用された。
れる塩基244〜342を伴って、塩基235〜541のPAI-2コー
ド領域を拡張するDNAフラグメントを生成するためにPCR
反応に使用された。オリゴヌクレオチドA134/304及びSp
6配列プライマーは、欠失される塩基244〜342を伴っ
て、塩基49〜351のPAI-2コード領域を拡張するDNAフラ
グメントを生成するためにPCR反応に使用された。オリ
ゴヌクレオチドA134/301及びSp6配列プライマーは、欠
失される塩基244〜342を伴って、塩基49〜541のPAI-2コ
ード領域を拡張するDNAフラグメントを生成するために
上記２種のPCR反応に使用された。
第９図 欠失変異体、Δ66-98を含むプラスミドpBTA8
40の構成。（使用される略語:B,BgI II;E,EcoRI;P,Pst
I;PL、バクテリオファージλの左側のプロモーター;Sp
6、バクテリオファージSp6からのプロモーター；T7、バ
クテリオファージT7からのプロモーター；AP、耐アンピ
シリン遺伝子;CIAP、ウシ腸アルカリホスファターゼ;PC
R、ポリマラーゼ鎖反応）。
40の構成。（使用される略語:B,BgI II;E,EcoRI;P,Pst
I;PL、バクテリオファージλの左側のプロモーター;Sp
6、バクテリオファージSp6からのプロモーター；T7、バ
クテリオファージT7からのプロモーター；AP、耐アンピ
シリン遺伝子;CIAP、ウシ腸アルカリホスファターゼ;PC
R、ポリマラーゼ鎖反応）。
第10図 精製されたPAI-2Δ66-98のSDS-PAGE分析。PA
I-2欠失突然変異体66-98の12％ポリアクリルアミドゲル
（ａ）及びウェスターン（ｂ）（抗−PAI-2ポリクロー
ナル抗体）。
I-2欠失突然変異体66-98の12％ポリアクリルアミドゲル
（ａ）及びウェスターン（ｂ）（抗−PAI-2ポリクロー
ナル抗体）。
第11図 U-PA、二本鎖t-PA及び１本鎖t-PAによる結合
実験において検出されるPAI-2特異的バンドの代表的な
図。
実験において検出されるPAI-2特異的バンドの代表的な
図。
発明を実施するための最良の態様 本発明の組換えDNA分子及び形質転換された宿主が分
子生物学の標準技法を用いて調製される。
子生物学の標準技法を用いて調製される。
本発明の変異体を、特定の宿主に適切な標準条件下で
本発明の形質転換された宿主を培養し、そして標準技法
によりその培養物から変異体を分離することによって得
る。その変異体は、PAI-2への変化は、DNAの特定部位突
然変異誘発により又はDNA欠失又は挿入よる全体の再構
成によりPAI-2の個々のアミノ酸を変性することによっ
て行なわれ得る。これらの変化は、当業者によく知られ
ている種々の方法で達成され〔たとえば“Molecular Cl
oning,A Laboratory Manual"チャプター15“Site-direc
ted Mutagenesis of cloned DNA"J.Sambrook,E.F.Friys
ch,T.Maniatis（版）1989;“Current Protocols in Mol
ecular Biology"チャプター８“Mutagenesis of cloned
DNA"Ausubel,Brent,Kingston,Moore,Seidman,Smith an
d Struhl（版）1989〕、そしていづれか所望する変化に
より遺伝子又は遺伝子セグメントを創造するために、点
挿入及び欠失突然変異誘発のためのオリゴヌクオレチ
ド、ネスティド突然変異のための変性オリゴヌクオレチ
ド、長いオリゴヌクオレチドの組合せの使用；欠失突然
変異体を創造するためにBal31、DNアーゼＩ又はエキソ
ヌクレアーゼIIIの使用；化学物質の使用及びポリマラ
ーゼ鎖反応（PCR）の使用を包含する。これらの技法
は、PAI-2変異体を生成するために、PAI-2分子の66-98
アミノ酸残基領域を変更するために使用され得る。次
に、生成されるPAI-2変異体は、例１及び２に記載され
る技法によりスクリーンされ、37kD形の不在により明ら
かであり、そして例１及び２に記載されるようにΔ66-9
8及びΔ74-96のためにPAI-2の生物学的活性の維持につ
いて試験されるように、特定の変異体が、66-98のアミ
ノ酸残基領域におけるPAI-2のプロテアーゼ感受性を欠
くかどうかが決定され得る。
本発明の形質転換された宿主を培養し、そして標準技法
によりその培養物から変異体を分離することによって得
る。その変異体は、PAI-2への変化は、DNAの特定部位突
然変異誘発により又はDNA欠失又は挿入よる全体の再構
成によりPAI-2の個々のアミノ酸を変性することによっ
て行なわれ得る。これらの変化は、当業者によく知られ
ている種々の方法で達成され〔たとえば“Molecular Cl
oning,A Laboratory Manual"チャプター15“Site-direc
ted Mutagenesis of cloned DNA"J.Sambrook,E.F.Friys
ch,T.Maniatis（版）1989;“Current Protocols in Mol
ecular Biology"チャプター８“Mutagenesis of cloned
DNA"Ausubel,Brent,Kingston,Moore,Seidman,Smith an
d Struhl（版）1989〕、そしていづれか所望する変化に
より遺伝子又は遺伝子セグメントを創造するために、点
挿入及び欠失突然変異誘発のためのオリゴヌクオレチ
ド、ネスティド突然変異のための変性オリゴヌクオレチ
ド、長いオリゴヌクオレチドの組合せの使用；欠失突然
変異体を創造するためにBal31、DNアーゼＩ又はエキソ
ヌクレアーゼIIIの使用；化学物質の使用及びポリマラ
ーゼ鎖反応（PCR）の使用を包含する。これらの技法
は、PAI-2変異体を生成するために、PAI-2分子の66-98
アミノ酸残基領域を変更するために使用され得る。次
に、生成されるPAI-2変異体は、例１及び２に記載され
る技法によりスクリーンされ、37kD形の不在により明ら
かであり、そして例１及び２に記載されるようにΔ66-9
8及びΔ74-96のためにPAI-2の生物学的活性の維持につ
いて試験されるように、特定の変異体が、66-98のアミ
ノ酸残基領域におけるPAI-2のプロテアーゼ感受性を欠
くかどうかが決定され得る。
本発明の組成物は、変異体並びに医薬的に許容できる
キャリヤー、希釈剤及び／又は賦形剤を医薬調製の標準
の方法を用いて混合し、好ましくは均等に混合すること
によって調製される。
キャリヤー、希釈剤及び／又は賦形剤を医薬調製の標準
の方法を用いて混合し、好ましくは均等に混合すること
によって調製される。
単一投与形を生成するために必要とされる変異体の量
は、処理される条件、処理される宿主及び投与の特定の
態様に依存して異なるであろう。いづれかの特定の患者
のための特定の投与レベルは、種々の要因、たとえば使
用される変異体の活性、年齢、体重、一般的な健康、性
別及び患者の栄養状態、投与の時間、投与路、排出の速
度、薬物の組合せ及び処理下の条件の厳正さに依存する
であろう。必要とされる量は、標準の医薬技法に従って
決定され得る。
は、処理される条件、処理される宿主及び投与の特定の
態様に依存して異なるであろう。いづれかの特定の患者
のための特定の投与レベルは、種々の要因、たとえば使
用される変異体の活性、年齢、体重、一般的な健康、性
別及び患者の栄養状態、投与の時間、投与路、排出の速
度、薬物の組合せ及び処理下の条件の厳正さに依存する
であろう。必要とされる量は、標準の医薬技法に従って
決定され得る。
組成物は、従来の非毒性で、医薬的に許容できるキャ
リヤー、希釈剤及び／又は所望により賦形剤を含む単位
投与配合で非経口投与され得る。
リヤー、希釈剤及び／又は所望により賦形剤を含む単位
投与配合で非経口投与され得る。
本発明の変異体の注射可能製剤、たとえば滅菌された
注射可能な水性又は油性懸濁液が、適切な分散及び湿潤
剤及び懸濁剤を用いて当業界で知られている技法により
配合され得る。滅菌された注射可能製剤はまた、たとえ
ば1,3−ブタンジオールにおける溶液として、非毒性非
経口性許容希釈剤又は溶媒中、滅菌された注射可能溶液
又は懸濁液でもあり得る。使用され得る許容できるビー
クル及び溶媒の中には、水、リンガー溶液、及び等張塩
化ナトリウム溶液が存在する。さらに、滅菌された固定
油が従来、溶媒又は懸濁媒体として使用される。この目
的のためには、いづれかの無刺激性固定油、たとえば合
成モノ−又はジグリセリドが使用され得る。さらに、脂
肪酸、たとえばオレイン酸は、注射可能物の調製に使用
され得る。
注射可能な水性又は油性懸濁液が、適切な分散及び湿潤
剤及び懸濁剤を用いて当業界で知られている技法により
配合され得る。滅菌された注射可能製剤はまた、たとえ
ば1,3−ブタンジオールにおける溶液として、非毒性非
経口性許容希釈剤又は溶媒中、滅菌された注射可能溶液
又は懸濁液でもあり得る。使用され得る許容できるビー
クル及び溶媒の中には、水、リンガー溶液、及び等張塩
化ナトリウム溶液が存在する。さらに、滅菌された固定
油が従来、溶媒又は懸濁媒体として使用される。この目
的のためには、いづれかの無刺激性固定油、たとえば合
成モノ−又はジグリセリドが使用され得る。さらに、脂
肪酸、たとえばオレイン酸は、注射可能物の調製に使用
され得る。
適切な投与システムが開発される場合、本発明の変異
体を経口的に又は局所的に投与することが可能であるこ
とが予測される。
体を経口的に又は局所的に投与することが可能であるこ
とが予測される。
抗体は、適切な宿主における標準の接種法を用いて発
生せしめられる。宿主は、本発明の変異体又は組成物に
より接種される。接種目的のために使用される組成物
は、アジュバントを含むことができる。
生せしめられる。宿主は、本発明の変異体又は組成物に
より接種される。接種目的のために使用される組成物
は、アジュバントを含むことができる。
動物の接種のための適切なアジュバントは、油エマル
ジョン、たとえばMarcol 52:Montanido 888（MarcolはE
ssoの商標であり、MontanideはSEPPIC,Parisの商標であ
る）、スクアラン又はスクアレン、アジュバント65（ピ
ーナッツ油、マンニドモノオレエート及びアルミニウム
モノステアレートを含む）、鉱物ゲル、たとえばアルミ
ニウムヒドロキシド、アルミニウムホスフェート、カル
シウムホスフェート及びみょうばん、界面活性剤、たと
えばヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リゾレ
シチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミ
ド、N,N−ジオクタデシル−Ｎ′,N′−ビス（２−ヒド
ロキシエチル）−プロパンジアミン、メトキシヘキサデ
シルグリセロール及びプルロニックポリオール、ポリア
ニオン、たとえばピラン、デキストランスルフェート、
ポリアクリル酸及びカルボポール、ペプチド及びアミノ
酸、たとえばムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、
タフトシン及びトレハロースジミコレートを包含する
が、但しこれだけには限定されない。本発明の変異体は
また、リポソーム又は他の微小キャリヤー中への導入に
続いて、又は多糖類、タンパク質又はポリマーへの接合
の後、投与され得る。本発明に使用するために適切な他
のアジュバントは、変異体並びに原核又は真核生物起原
の膜タンパク質、たとえばTraTを含んで成る接合体を含
む。
ジョン、たとえばMarcol 52:Montanido 888（MarcolはE
ssoの商標であり、MontanideはSEPPIC,Parisの商標であ
る）、スクアラン又はスクアレン、アジュバント65（ピ
ーナッツ油、マンニドモノオレエート及びアルミニウム
モノステアレートを含む）、鉱物ゲル、たとえばアルミ
ニウムヒドロキシド、アルミニウムホスフェート、カル
シウムホスフェート及びみょうばん、界面活性剤、たと
えばヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リゾレ
シチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミ
ド、N,N−ジオクタデシル−Ｎ′,N′−ビス（２−ヒド
ロキシエチル）−プロパンジアミン、メトキシヘキサデ
シルグリセロール及びプルロニックポリオール、ポリア
ニオン、たとえばピラン、デキストランスルフェート、
ポリアクリル酸及びカルボポール、ペプチド及びアミノ
酸、たとえばムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、
タフトシン及びトレハロースジミコレートを包含する
が、但しこれだけには限定されない。本発明の変異体は
また、リポソーム又は他の微小キャリヤー中への導入に
続いて、又は多糖類、タンパク質又はポリマーへの接合
の後、投与され得る。本発明に使用するために適切な他
のアジュバントは、変異体並びに原核又は真核生物起原
の膜タンパク質、たとえばTraTを含んで成る接合体を含
む。
投与のための路、投与される投与形及び注射の頻度
は、当業者により最適化され得るすべての要因である。
典型的には、初めの接種後、数週間後、１又は複数回の
追加免疫が行なわれ、その効果は、変異体に対する高い
力価の抗体の生成である。
は、当業者により最適化され得るすべての要因である。
典型的には、初めの接種後、数週間後、１又は複数回の
追加免疫が行なわれ、その効果は、変異体に対する高い
力価の抗体の生成である。
本発明の変異体に対するモノクローナル抗体は、モノ
クローナル抗体生成のための標準技法を用いて調製され
得る。
クローナル抗体生成のための標準技法を用いて調製され
得る。
抗体組成物は、抗体並びに医薬的に許容できるキャリ
ヤー、希釈剤及び／又は賦形剤を医薬調製の標準方法を
用いて混合し、好ましくは均質混合することによって調
製される。
ヤー、希釈剤及び／又は賦形剤を医薬調製の標準方法を
用いて混合し、好ましくは均質混合することによって調
製される。
接合体組成物は、接合体並びに医薬的に許容できるキ
ャリヤー、希釈剤及び／又は賦形剤を医薬調製の標準方
法を用いて混合し、好ましくは均質混合することによっ
て調製される。
ャリヤー、希釈剤及び／又は賦形剤を医薬調製の標準方
法を用いて混合し、好ましくは均質混合することによっ
て調製される。
接合体は、接合体合成のための標準技法を用いて調製
され得る。接合体は、細胞毒性薬物に結合される本発明
のPAI-2変異体を供給するために、必要な場合、結合剤
を用いて化学的に又は組換えDNA技法により調製され
る。
され得る。接合体は、細胞毒性薬物に結合される本発明
のPAI-2変異体を供給するために、必要な場合、結合剤
を用いて化学的に又は組換えDNA技法により調製され
る。
単一投与形を調製するために必要とされる接合体の量
は、処理される条件、処理される宿主及び投与の特定の
態様に依存して異なるであろう。いづれか特定の患者の
ための特定の投与レベルは、種々の要因、たとえば使用
される接合体の活性、年齢、体重、一般的な健康、性別
及び患者の栄養状態、投与の時間、投与の経路、排出の
速度、薬物の組合せ、及び処理下の条件の厳正さに依存
するであろう。使用される量は、標準の医薬技法により
決定され得る。
は、処理される条件、処理される宿主及び投与の特定の
態様に依存して異なるであろう。いづれか特定の患者の
ための特定の投与レベルは、種々の要因、たとえば使用
される接合体の活性、年齢、体重、一般的な健康、性別
及び患者の栄養状態、投与の時間、投与の経路、排出の
速度、薬物の組合せ、及び処理下の条件の厳正さに依存
するであろう。使用される量は、標準の医薬技法により
決定され得る。
接合体組成物は、従来の非毒性で、医薬的に許容でき
るキャリヤー、希釈剤及び／又は所望により賦形剤を含
む単位投与配合で非経口投与される。
るキャリヤー、希釈剤及び／又は所望により賦形剤を含
む単位投与配合で非経口投与される。
診断キットは、適切な濃度での抗体並びに医薬的に許
容できるキャリヤー、希釈剤及び／又は賦形剤を配合す
ることによって調製される。本発明の既知濃度の変異体
の陽性対照は同様にして調製される。陰性対照は、キャ
リヤー、希釈剤及び／又は賦形剤のみを含んで成る。診
断キットの例は、腫瘍診断を包含し、ここで試薬は、本
発明の抗体を含んで成り、そして陽性対照は本発明の変
異体を含んで成る。
容できるキャリヤー、希釈剤及び／又は賦形剤を配合す
ることによって調製される。本発明の既知濃度の変異体
の陽性対照は同様にして調製される。陰性対照は、キャ
リヤー、希釈剤及び／又は賦形剤のみを含んで成る。診
断キットの例は、腫瘍診断を包含し、ここで試薬は、本
発明の抗体を含んで成り、そして陽性対照は本発明の変
異体を含んで成る。
プラスミド 本研究に使用される種々のプラスミドは、pBTA438に
由来した。プラスミドpBTA438は、pUC18にクローンされ
たPAI-2をコードする1.6KbのcDNAから成る〔Yanisch-Pe
rronなど,Gene 33:103〜119（1985）〕。pBTA438を用い
て、E.コリ株JM109〔Yanisch-Perronなど,Gene 33:103
〜119（198）〕を形質転換し、株BTA1445を生成し、こ
れを、1987年２月11日、寄託番号第53585号としてAmeri
can Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,R
ockuille,MD 20852、USAに寄託した。
由来した。プラスミドpBTA438は、pUC18にクローンされ
たPAI-2をコードする1.6KbのcDNAから成る〔Yanisch-Pe
rronなど,Gene 33:103〜119（1985）〕。pBTA438を用い
て、E.コリ株JM109〔Yanisch-Perronなど,Gene 33:103
〜119（198）〕を形質転換し、株BTA1445を生成し、こ
れを、1987年２月11日、寄託番号第53585号としてAmeri
can Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,R
ockuille,MD 20852、USAに寄託した。
プラスミドpBTA641を、次のようにしてpBTA438から誘
導することができる。pBTA438を、XhoII及びDraIにより
部分消化し、そして1550bpのフラグメントを単離し、そ
してBglII及びSmaIにより切断されたベクターpLK58に連
結する。得られたプラスミドpBTA446をBglIIにより線状
化し、そして配列GATCT(N)16ATGGAG（配列識別番号12）
（Ｎはいづれかのヌクオレチドを表わす）を有し、細菌
リボソーム結合部位及び天然のPAI-2遺伝子の初期ヌク
オレチドを含む合成二本鎖の27マーのオリゴヌクオレチ
ドに連結し、プラスミドpBTA641を生成する。プラスミ
ドpBTA447はpBTA641と同一であるが、但し、配列GATCT
(N)15ATGGAG（配列識別番号13）を有する細菌リボソー
ム結合部位を含む26マーのオリゴヌクオレチドが前記27
マーの代わりに使用された。
導することができる。pBTA438を、XhoII及びDraIにより
部分消化し、そして1550bpのフラグメントを単離し、そ
してBglII及びSmaIにより切断されたベクターpLK58に連
結する。得られたプラスミドpBTA446をBglIIにより線状
化し、そして配列GATCT(N)16ATGGAG（配列識別番号12）
（Ｎはいづれかのヌクオレチドを表わす）を有し、細菌
リボソーム結合部位及び天然のPAI-2遺伝子の初期ヌク
オレチドを含む合成二本鎖の27マーのオリゴヌクオレチ
ドに連結し、プラスミドpBTA641を生成する。プラスミ
ドpBTA447はpBTA641と同一であるが、但し、配列GATCT
(N)15ATGGAG（配列識別番号13）を有する細菌リボソー
ム結合部位を含む26マーのオリゴヌクオレチドが前記27
マーの代わりに使用された。
プラスミドpMINS71を次のようにして誘導した:pBTA64
1からのBglII-EcoRIのPAI-2遺伝子フラグメントを、Bgl
II/EcoRI部位でpSp72（Promega）中に挿入し;27ベクタ
ーからのBglII-SacIのPAI-2遺伝子フラグメントを、付
着HindIII-BglII末端を有する合成アダプターによる三
段階連結でpGEM4Z（Promega）のHindIII/SacI部位に挿
入し、pMIMS71を得た。
1からのBglII-EcoRIのPAI-2遺伝子フラグメントを、Bgl
II/EcoRI部位でpSp72（Promega）中に挿入し;27ベクタ
ーからのBglII-SacIのPAI-2遺伝子フラグメントを、付
着HindIII-BglII末端を有する合成アダプターによる三
段階連結でpGEM4Z（Promega）のHindIII/SacI部位に挿
入し、pMIMS71を得た。
予備例１ A.PAI-2の細菌発現 pBTA447及びpBTA641を含む、誘発された（42℃での細
胞のインキュベーションにより）及び誘発されていない
（30℃でのインキュベーション）E.コリK-12宿主細胞の
細胞抽出物を、ヒトPAI-2に対する親和性精製モノクロ
ーナル（Biopool）又はポリクローナル抗体を用いてPAI
-2の存在についてスクリーンした。ウロキナーゼ−PAI-
2複合体の形成を特徴とする生物学的活性を、ウロキナ
ーゼの存在下で電気泳動移動度のシフトにより評価し
た。第３図に示されるように、ヒト胎盤インヒビターに
対するモノクローナル抗体及び沃素化されたプロテイン
Ａを用いてウェスターントランスファーにより可視化さ
れたPAI-2タンパク質バンド（Mr46kD）が、誘発された
（42℃）サンプルに存在する。低分子量（Mr37,000）の
免疫学的に交差反応するタンパク質バンドがまた観察さ
れ、それはPAI-2分子の可能性あるタンパク質分解性切
断を示す。
胞のインキュベーションにより）及び誘発されていない
（30℃でのインキュベーション）E.コリK-12宿主細胞の
細胞抽出物を、ヒトPAI-2に対する親和性精製モノクロ
ーナル（Biopool）又はポリクローナル抗体を用いてPAI
-2の存在についてスクリーンした。ウロキナーゼ−PAI-
2複合体の形成を特徴とする生物学的活性を、ウロキナ
ーゼの存在下で電気泳動移動度のシフトにより評価し
た。第３図に示されるように、ヒト胎盤インヒビターに
対するモノクローナル抗体及び沃素化されたプロテイン
Ａを用いてウェスターントランスファーにより可視化さ
れたPAI-2タンパク質バンド（Mr46kD）が、誘発された
（42℃）サンプルに存在する。低分子量（Mr37,000）の
免疫学的に交差反応するタンパク質バンドがまた観察さ
れ、それはPAI-2分子の可能性あるタンパク質分解性切
断を示す。
B.37kD形の精製 （ｉ）細胞増殖及び溶解 プラスミドpBTA447を有するE.コリK-12細胞を、10lの
発酵器において38℃で24時間、熱誘発し、そして次に細
胞を、17,000×ｇで20分間の遠心分離により回収した。
合計524gの湿量の細胞を、発酵ブイヨン8lから回収し
た。
発酵器において38℃で24時間、熱誘発し、そして次に細
胞を、17,000×ｇで20分間の遠心分離により回収した。
合計524gの湿量の細胞を、発酵ブイヨン8lから回収し
た。
細胞（524g）を、1mMのEDTA及び1mMのPMSFを４℃で含
む0.1MのNaホスフェート緩衝液（pH7.0）溶液1500ml中
に懸濁し、そして8000psiでMartin-Gaulinプレスを通し
ての４回の通過により溶解した。このプレスを上記緩衝
液300mlにより洗浄し、そして溶解物及び洗浄液を組合
した。この溶液に、MgCl2を添加し、2mMの最終濃度に
し、そしてその溶液を17,700×ｇで60分間、遠心分離し
た。この遠心分離から得られる上清液（1600ml）を、3
0,100×ｇで60分間、再遠心分離し、残る不溶性物質を
除去し、そして上清液を回収した。この上清液（1570m
l）に、固体硫酸アンモニウム574.6gを添加し、60％飽
和溶液を得、その溶液を15分間攪拌し、そして次に、3
0,000×ｇで30分間、遠心分離した。PAI-2を含む、その
得られたペレットを８当分し、そして−20℃で貯蔵し
た。
む0.1MのNaホスフェート緩衝液（pH7.0）溶液1500ml中
に懸濁し、そして8000psiでMartin-Gaulinプレスを通し
ての４回の通過により溶解した。このプレスを上記緩衝
液300mlにより洗浄し、そして溶解物及び洗浄液を組合
した。この溶液に、MgCl2を添加し、2mMの最終濃度に
し、そしてその溶液を17,700×ｇで60分間、遠心分離し
た。この遠心分離から得られる上清液（1600ml）を、3
0,100×ｇで60分間、再遠心分離し、残る不溶性物質を
除去し、そして上清液を回収した。この上清液（1570m
l）に、固体硫酸アンモニウム574.6gを添加し、60％飽
和溶液を得、その溶液を15分間攪拌し、そして次に、3
0,000×ｇで30分間、遠心分離した。PAI-2を含む、その
得られたペレットを８当分し、そして−20℃で貯蔵し
た。
（ii）DEAE-Sephacelクロマトグラフィー ０〜60％の硫酸アンモニウム沈殿物の1/8アリコート
を、1mMのEDTA及び0.1MのDTTを含む0.1MのNaホスフェー
ト緩衝液（pH7.0）200mlに溶解し、そして37℃で90分間
インキュベートした。次にこの溶液を、1mMのEDTA及び
0.05％の２−メルカプトエタノールを含む0.1MのNaホス
フェート緩衝液（pH7.0）により500mlに希釈し、そして
同じ緩衝液に対して４℃で48時間、透析した。次にその
透析された溶液を、上記緩衝液で平衡化されたDEAE-Sep
hacelカラム（4.4cm×10cm）に適用し、そして280nmで
の吸光度が低線に戻るまで、溶出した。同じ緩衝液にお
ける０〜0.5MのNaClの2lの線状グラジェントを適用し、
そしてカラムを2ml/分の流速で溶出した。10mlの画分を
集め、そして200μｌのアリコートをSDS-PAGEにより分
析し、そしてウェスターン分析した。PAI-2を、これら
の条件下で、58mM〜81mMのNaClの間で溶出し、そしてこ
れらの画分をプールし、そして0.05％の２−メルカプト
エタノールを含む1mMのNaホスフェート緩衝液（pH7.0）
に対して４℃で48時間透析した。
を、1mMのEDTA及び0.1MのDTTを含む0.1MのNaホスフェー
ト緩衝液（pH7.0）200mlに溶解し、そして37℃で90分間
インキュベートした。次にこの溶液を、1mMのEDTA及び
0.05％の２−メルカプトエタノールを含む0.1MのNaホス
フェート緩衝液（pH7.0）により500mlに希釈し、そして
同じ緩衝液に対して４℃で48時間、透析した。次にその
透析された溶液を、上記緩衝液で平衡化されたDEAE-Sep
hacelカラム（4.4cm×10cm）に適用し、そして280nmで
の吸光度が低線に戻るまで、溶出した。同じ緩衝液にお
ける０〜0.5MのNaClの2lの線状グラジェントを適用し、
そしてカラムを2ml/分の流速で溶出した。10mlの画分を
集め、そして200μｌのアリコートをSDS-PAGEにより分
析し、そしてウェスターン分析した。PAI-2を、これら
の条件下で、58mM〜81mMのNaClの間で溶出し、そしてこ
れらの画分をプールし、そして0.05％の２−メルカプト
エタノールを含む1mMのNaホスフェート緩衝液（pH7.0）
に対して４℃で48時間透析した。
（iii）ヒドロキシルリ灰石クロマトグラフィー 前段階からの透析されたPAI-2を、0.05％の２−メル
カプトエタノールを含む1mMのNaホスフェート緩衝液（p
H7.0）で平衡化されたBiogel HPTの3.2cm×15cmカラム
に適用し、そしてそのカラムを同じ緩衝液により、280n
mでの吸光度が低線に戻るまで、洗浄した。1mM〜200mM
のNaホスフェートの１の線状グラジェントを適用し、
そしてカラムを1ml/分の流速で溶出した。6mlの画分を
集めた。カラムから溶出するPAI-2をSDS-PAGE及びウェ
スターンブロットを用いて検出し、そして還元条件下
で、２つの明確な免疫学的に交差反応するタンパク質バ
ンドを示した。これらのPAI-2の２種の形の分子量は、
約46kD及び約37kDであった。
カプトエタノールを含む1mMのNaホスフェート緩衝液（p
H7.0）で平衡化されたBiogel HPTの3.2cm×15cmカラム
に適用し、そしてそのカラムを同じ緩衝液により、280n
mでの吸光度が低線に戻るまで、洗浄した。1mM〜200mM
のNaホスフェートの１の線状グラジェントを適用し、
そしてカラムを1ml/分の流速で溶出した。6mlの画分を
集めた。カラムから溶出するPAI-2をSDS-PAGE及びウェ
スターンブロットを用いて検出し、そして還元条件下
で、２つの明確な免疫学的に交差反応するタンパク質バ
ンドを示した。これらのPAI-2の２種の形の分子量は、
約46kD及び約37kDであった。
（iv）高圧液体クロマトグラフィー PAI-2のこれらの２種の形を分解するために、PAI-2を
含むBiogel HPTカラムからのアリコートを、0.1％TFA
中、アセトニトリルのグラジェントを用いてVydac C4 H
PLCカラム上でクロマトグラフィー処理した。このクロ
マトグラフィーは２つの主要ピークを示し、非還元性SD
S-PAGEにより決定される場合、前者はPAI-2の37kD形を
含み、そして後者はPAI-2の46kD形を含む。PAI-2の約37
kD形のアミノ酸配列は、配列−Lys Gly Ser Tyr Pro As
p Ala Ile Leu Gln Ala Gln Ala Ala Asp（配列識別番
号14）を示した。
含むBiogel HPTカラムからのアリコートを、0.1％TFA
中、アセトニトリルのグラジェントを用いてVydac C4 H
PLCカラム上でクロマトグラフィー処理した。このクロ
マトグラフィーは２つの主要ピークを示し、非還元性SD
S-PAGEにより決定される場合、前者はPAI-2の37kD形を
含み、そして後者はPAI-2の46kD形を含む。PAI-2の約37
kD形のアミノ酸配列は、配列−Lys Gly Ser Tyr Pro As
p Ala Ile Leu Gln Ala Gln Ala Ala Asp（配列識別番
号14）を示した。
この配列は、PAI-2の成熟形の残基87で出発するPAI-2
の形に対応し、そしてグルタミン86−リシン87（Q86-K8
7）ペプチド結合はタンパク質分解に対してひじょうに
敏威であることを示唆する。約37kDの類似する免疫学的
交差反応性形がまた、U937細胞からの天然に存在するPA
I-2の精製の間；観察され、Q86-K87ペプチド結合でのタ
ンパク質分解性切断が哺乳類及び細菌細胞の両者で生じ
ることを示唆し、そしてこの結合がひじょうに不安定で
ある概念を支持する。
の形に対応し、そしてグルタミン86−リシン87（Q86-K8
7）ペプチド結合はタンパク質分解に対してひじょうに
敏威であることを示唆する。約37kDの類似する免疫学的
交差反応性形がまた、U937細胞からの天然に存在するPA
I-2の精製の間；観察され、Q86-K87ペプチド結合でのタ
ンパク質分解性切断が哺乳類及び細菌細胞の両者で生じ
ることを示唆し、そしてこの結合がひじょうに不安定で
ある概念を支持する。
C.37kD形の精製 プラスミドpBTA641を有するE.コリ細胞を、10lの発酵
器において38℃で24時間、熱誘発し、そして次に細胞
を、17,000×ｇで20分間の遠心分離により回収した。
器において38℃で24時間、熱誘発し、そして次に細胞
を、17,000×ｇで20分間の遠心分離により回収した。
（ｉ）細胞溶解 この発酵5lから得られた細胞ペレットを、1mMのEDT
A、10mMのε−アミノカプロン酸（ε−ACA）及び10mMの
２−メルカプトエタノールを含む50mMのNaホスフェート
緩衝液（pH6.6）800mlに懸濁し、そして9000psiでMarti
n-Gaulin15MRホモジナイザーを通しての６回の通過によ
り溶解した。この得られた溶解物（900ml）に、MgCl2を
添加し、2mMにし、そしてその懸濁液を17,700×ｇで１
時間、４℃で遠心分離した。
A、10mMのε−アミノカプロン酸（ε−ACA）及び10mMの
２−メルカプトエタノールを含む50mMのNaホスフェート
緩衝液（pH6.6）800mlに懸濁し、そして9000psiでMarti
n-Gaulin15MRホモジナイザーを通しての６回の通過によ
り溶解した。この得られた溶解物（900ml）に、MgCl2を
添加し、2mMにし、そしてその懸濁液を17,700×ｇで１
時間、４℃で遠心分離した。
（ii）硫酸アンモニウム沈殿 上記遠心分離からの上清液に、固体硫酸アンモニウム
を添加し、30％飽和溶液を得た。その溶液を４℃で30分
間攪拌し、そして次に、沈殿物を、17,700×ｇで１時
間、４℃での遠心分離により除いた。上清液（760ml）
を、追加の固体硫酸アンモニウムの添加により50％飽和
に調整し、そして４℃で30分間の攪拌に続いて、その上
清液を17,700×ｇで１時間、４℃で遠心分離した。この
沈殿段階から回収されたペレットを、緩衝液Ｂ（50mMの
クエン酸ナトリウム、1mMのEDTA、10mMのε−ACA及び10
mMの２−メルカプトエタノール、pH5.5）に溶解し、200
mlの最終体積を得た。次に、この溶液を、４℃で一晩、
緩衝液B20体積に対して透析した。
を添加し、30％飽和溶液を得た。その溶液を４℃で30分
間攪拌し、そして次に、沈殿物を、17,700×ｇで１時
間、４℃での遠心分離により除いた。上清液（760ml）
を、追加の固体硫酸アンモニウムの添加により50％飽和
に調整し、そして４℃で30分間の攪拌に続いて、その上
清液を17,700×ｇで１時間、４℃で遠心分離した。この
沈殿段階から回収されたペレットを、緩衝液Ｂ（50mMの
クエン酸ナトリウム、1mMのEDTA、10mMのε−ACA及び10
mMの２−メルカプトエタノール、pH5.5）に溶解し、200
mlの最終体積を得た。次に、この溶液を、４℃で一晩、
緩衝液B20体積に対して透析した。
（iii）フェニルセファロースクロマトグラフィー 透析された溶液を、硫酸アンモニウム中で1Mにし、そ
してそのサンプル（286ml）を、緩衝液Ａ（これは1Mの
硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ｂである）で平衡化され
たフェニルセファロースカラム（5cm×19cm;Vt＝373m
l）に、100ml/時の流速で適用した。サンプルの負荷に
続いて、カラムを、280nm（A280）での吸光度が低線に
戻るまで、緩衝液Ａにより洗浄し、そして次に、800ml
の緩衝液Ａ〜800mlの緩衝液Ｂの線状グラジェントを適
用した。10mlの画分を集めた。グラジェントの完結後、
カラムを50mMのグリシン（pH9.0）により、A280が低線
に戻るまで洗浄した。Coleman and Green（Methods in
Enzymology80:408〜418,1981）のウロキナーゼ阻害によ
り及び免疫学的ドットブロットアッセイにより決定され
るように、PAI-2を画分75〜150に溶出した。これらの画
分をプールし（850ml）、そして硫酸アンモニウムの添
加により60％飽和にし、沈殿せしめた。ペレットを、1
7,700×ｇで30分間、４℃での遠心分離により回収し、
そして緩衝液Ｃ（25mMの硼酸ナトリウム、1mMのEDTA、1
0mMのε−ACA、10mMの２−メルカプトエタノール、pH9.
0）に溶解した。
してそのサンプル（286ml）を、緩衝液Ａ（これは1Mの
硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ｂである）で平衡化され
たフェニルセファロースカラム（5cm×19cm;Vt＝373m
l）に、100ml/時の流速で適用した。サンプルの負荷に
続いて、カラムを、280nm（A280）での吸光度が低線に
戻るまで、緩衝液Ａにより洗浄し、そして次に、800ml
の緩衝液Ａ〜800mlの緩衝液Ｂの線状グラジェントを適
用した。10mlの画分を集めた。グラジェントの完結後、
カラムを50mMのグリシン（pH9.0）により、A280が低線
に戻るまで洗浄した。Coleman and Green（Methods in
Enzymology80:408〜418,1981）のウロキナーゼ阻害によ
り及び免疫学的ドットブロットアッセイにより決定され
るように、PAI-2を画分75〜150に溶出した。これらの画
分をプールし（850ml）、そして硫酸アンモニウムの添
加により60％飽和にし、沈殿せしめた。ペレットを、1
7,700×ｇで30分間、４℃での遠心分離により回収し、
そして緩衝液Ｃ（25mMの硼酸ナトリウム、1mMのEDTA、1
0mMのε−ACA、10mMの２−メルカプトエタノール、pH9.
0）に溶解した。
（iv）Sephacryl S200クロマトグラフィー PAI-2を含む溶液（25ml）を、緩衝液Ｃで平衡化され
たSephacryl S200カラム（3.3cm×95cm）に適用し、そ
して40ml/時の流速で溶出した。6mlの画分を集め、そし
てウロキナーゼ阻害、SDS-PAGE及びドットブロットアッ
セイにおける免疫学的交差反応性によりPAI-2について
分析した。PAI-2を含む画分（画分52-90）をプールし、
そして60％飽和硫酸アンモニウムにより沈殿せしめた。
ペレットを、17,700×ｇで30分間、４℃での遠心分離に
より回収し、そして緩衝液Ａに再溶解した。この溶液の
pHをHClにより5.5に調整し、そして進行した沈殿物を、
17,700×ｇで30分間、４℃での遠心分離により除去し
た。
たSephacryl S200カラム（3.3cm×95cm）に適用し、そ
して40ml/時の流速で溶出した。6mlの画分を集め、そし
てウロキナーゼ阻害、SDS-PAGE及びドットブロットアッ
セイにおける免疫学的交差反応性によりPAI-2について
分析した。PAI-2を含む画分（画分52-90）をプールし、
そして60％飽和硫酸アンモニウムにより沈殿せしめた。
ペレットを、17,700×ｇで30分間、４℃での遠心分離に
より回収し、そして緩衝液Ａに再溶解した。この溶液の
pHをHClにより5.5に調整し、そして進行した沈殿物を、
17,700×ｇで30分間、４℃での遠心分離により除去し
た。
（ｖ）２回目のフェニルセファロースクロマトグラフィ
ー 上清液をフェニルセファロースカラム（5cm×10cm）
に60ml/時の流速で適用した。負荷の後、カラムを緩衝
液Ａにより洗浄し、そして次に、緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂ
の線状グラジェントを、上記（iii）に記載されるよう
にして適用した。グラジェントの完結後、カラムを、50
mMのグリシン（pH9）により洗浄し、そしてPAI-2を含む
画分をSDS-PAGE及びウェスターンブロットにより同定し
た。PAI-2を含む画分15-27をプールし、60％硫酸アンモ
ニウムにより沈殿せしめ、そして緩衝液C15mlに再溶解
した。
ー 上清液をフェニルセファロースカラム（5cm×10cm）
に60ml/時の流速で適用した。負荷の後、カラムを緩衝
液Ａにより洗浄し、そして次に、緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂ
の線状グラジェントを、上記（iii）に記載されるよう
にして適用した。グラジェントの完結後、カラムを、50
mMのグリシン（pH9）により洗浄し、そしてPAI-2を含む
画分をSDS-PAGE及びウェスターンブロットにより同定し
た。PAI-2を含む画分15-27をプールし、60％硫酸アンモ
ニウムにより沈殿せしめ、そして緩衝液C15mlに再溶解
した。
（vi）２回目のSephacryl S200クロマトグラフィー 上記２回目のフェニルセファロースカラムからのPAI-
2含有サンプルを、緩衝液Ｃにより平衡化されたSephacr
yl S200カラム（2.5cm×95cm）に適用し、そして30ml/
時の流速で溶出した。2.6mlの画分を集め、そしてSDS-P
AGEによりPAI-2について分析した。
2含有サンプルを、緩衝液Ｃにより平衡化されたSephacr
yl S200カラム（2.5cm×95cm）に適用し、そして30ml/
時の流速で溶出した。2.6mlの画分を集め、そしてSDS-P
AGEによりPAI-2について分析した。
（vii）逆相HPLC ２回目のSephacryl S200カラムからの画分のSDS-PAGE
は、２−メルカプトエタノールの存在下で電気泳動され
る場合、約46kD及び37kDの分子量を有する２種のタンパ
ク質の存在を示した。これらのタンパク質のバンドは、
“B.37kD形の精製”で観察されたバンドに類似する。こ
れらの２種の形を分解するために、上記２回目のSephac
ryl S200カラムからの画分106のアリコート90μｌを、
0.1％のTFA中、アセトニトリルのグラジェントを用い
て、Vydac C4逆相HPLCカラム上でクロマトグラフィー処
理した。このカラムから溶離される主要吸光度ピークの
前縁は主に37kDのタンパク質を含んだ。この画分のアミ
ノ酸配列は、アミノ酸残基81で出発するPAI-2の配列に
相当するFMQQIQKGSY（Pha Met Gln Gln Ile Gle Lys Gl
y Ser Tyr:配列識別番号15）のＮ−末端配列を示した。
従って、このPAI-2の形は、グリシン80−フェニルアラ
ニン81結合でPAI-2の成熟形のタンパク質分解から生じ
たことが結論づけられた。
は、２−メルカプトエタノールの存在下で電気泳動され
る場合、約46kD及び37kDの分子量を有する２種のタンパ
ク質の存在を示した。これらのタンパク質のバンドは、
“B.37kD形の精製”で観察されたバンドに類似する。こ
れらの２種の形を分解するために、上記２回目のSephac
ryl S200カラムからの画分106のアリコート90μｌを、
0.1％のTFA中、アセトニトリルのグラジェントを用い
て、Vydac C4逆相HPLCカラム上でクロマトグラフィー処
理した。このカラムから溶離される主要吸光度ピークの
前縁は主に37kDのタンパク質を含んだ。この画分のアミ
ノ酸配列は、アミノ酸残基81で出発するPAI-2の配列に
相当するFMQQIQKGSY（Pha Met Gln Gln Ile Gle Lys Gl
y Ser Tyr:配列識別番号15）のＮ−末端配列を示した。
従って、このPAI-2の形は、グリシン80−フェニルアラ
ニン81結合でPAI-2の成熟形のタンパク質分解から生じ
たことが結論づけられた。
この方法によりE.コリ中に過剰発現されたPAI-2の精
製及び特に、リシン特異的プロテアーゼのインヒビター
としてのε−ACAの包含は、Q86-K87結合で切断からPAI-
2を保護するが、しかしこの部位の上流でのたった６個
のアミノ酸領域で切断からそれを保護しない観察は、そ
の分子のこの領域がプロテアーゼ切断に対してひじょう
に敏感である観点を強化する。
製及び特に、リシン特異的プロテアーゼのインヒビター
としてのε−ACAの包含は、Q86-K87結合で切断からPAI-
2を保護するが、しかしこの部位の上流でのたった６個
のアミノ酸領域で切断からそれを保護しない観察は、そ
の分子のこの領域がプロテアーゼ切断に対してひじょう
に敏感である観点を強化する。
D.37kD形の精製 上記で観察されるタンパク質分解が他の宿主における
発現より妨げられるかいづれかを決定するために、PAI-
2をバクュロウィルス昆虫細胞系において過剰発現せし
めた〔Lucknow and Summers,Biotechnology 6:47〜55,1
988）。発現された生成物を、段階（ｉ）〜（iv）を用
いて、“C.37kD形の精製”に記載されているようにして
実質的に精製した。但し、（ii）における50％硫酸アン
モニア沈殿段階が排除された。Sephacryl S-200カラム
から溶出するPAI-2を、還元条件下でSDS-PAGE及びウェ
スターンブロットにより検出した。この分析は、PAI-2
の46kD及び37kD形の両者の存在を示し、これは前で観察
されたように、分子のタンパク質分解が生じることを示
唆する。この切断の部位をさらに定義するために、Seph
acryl S-200クロマトグラフィー段階から得られたPAI-2
プールを、20mMのグリシン、10mMのEDTA及び10mMの２−
メルカプトエタノール（pH9.0）溶液に対して透析し、
そして次に、そのサンプル（30ml）を、Ｑ−セファロー
スカラム（0.9cm×24cm）に60ml/時の流速で適用した。
このカラムから阻止されないで溶出され及びSDS-PAGE上
でのPAI-2は、Mr約37kD及び約46kDの２種のクーマシー
ブリリアントブルー染色バンドを示した。この物質のア
ルコートのＮ−末端アミノ酸配列は、下記に示されるよ
うに一本の配列を示した:GFMQQIQKGSYDDAI（すなわちGl
y Phe Met Gln Gln Ile Gln Lys Gly Ser Try Pro Asp
Ala Ile:配列識別番号16）。十分な長さのPAI-2のため
の確実なＮ−末端配列は観察されず、これは、昆虫細胞
に発現される場合、PAI-2の46kD形がブロックされたＮ
−末端を含むことを示唆する。類似する結果が、U937細
胞（Kruithofなど.J.Biol.Chem 216:11207〜11213,198
6）及び胎盤Andreasenなど．261:7644〜7651,1986）か
ら単離された十分な長さのPAI-2に関して観察された。
その観察された配列は、システイン79とグリシン80との
間に生じるタンパク質分解に適合し、G80-F81切断部位
からの上流のたった１つのペプチド結合が、“C.37kD形
の精製”においてE.コリから精製されるPAI-2に関して
観察された。
発現より妨げられるかいづれかを決定するために、PAI-
2をバクュロウィルス昆虫細胞系において過剰発現せし
めた〔Lucknow and Summers,Biotechnology 6:47〜55,1
988）。発現された生成物を、段階（ｉ）〜（iv）を用
いて、“C.37kD形の精製”に記載されているようにして
実質的に精製した。但し、（ii）における50％硫酸アン
モニア沈殿段階が排除された。Sephacryl S-200カラム
から溶出するPAI-2を、還元条件下でSDS-PAGE及びウェ
スターンブロットにより検出した。この分析は、PAI-2
の46kD及び37kD形の両者の存在を示し、これは前で観察
されたように、分子のタンパク質分解が生じることを示
唆する。この切断の部位をさらに定義するために、Seph
acryl S-200クロマトグラフィー段階から得られたPAI-2
プールを、20mMのグリシン、10mMのEDTA及び10mMの２−
メルカプトエタノール（pH9.0）溶液に対して透析し、
そして次に、そのサンプル（30ml）を、Ｑ−セファロー
スカラム（0.9cm×24cm）に60ml/時の流速で適用した。
このカラムから阻止されないで溶出され及びSDS-PAGE上
でのPAI-2は、Mr約37kD及び約46kDの２種のクーマシー
ブリリアントブルー染色バンドを示した。この物質のア
ルコートのＮ−末端アミノ酸配列は、下記に示されるよ
うに一本の配列を示した:GFMQQIQKGSYDDAI（すなわちGl
y Phe Met Gln Gln Ile Gln Lys Gly Ser Try Pro Asp
Ala Ile:配列識別番号16）。十分な長さのPAI-2のため
の確実なＮ−末端配列は観察されず、これは、昆虫細胞
に発現される場合、PAI-2の46kD形がブロックされたＮ
−末端を含むことを示唆する。類似する結果が、U937細
胞（Kruithofなど.J.Biol.Chem 216:11207〜11213,198
6）及び胎盤Andreasenなど．261:7644〜7651,1986）か
ら単離された十分な長さのPAI-2に関して観察された。
その観察された配列は、システイン79とグリシン80との
間に生じるタンパク質分解に適合し、G80-F81切断部位
からの上流のたった１つのペプチド結合が、“C.37kD形
の精製”においてE.コリから精製されるPAI-2に関して
観察された。
これらの結果は、PAI-2分子のこの領域のタンパク質
分解敏感性の高い程度をさらに確証する。
分解敏感性の高い程度をさらに確証する。
E.PAI-2のK87A変異体の精製 アミノ酸残基87がLysからAlaに変えられた変異体PAI-
2の創造と、PAI-2コード領域からファージM13ベクターm
p18にトランスファーした後、特定部位突然変異誘発に
より達成した。一本鎖ファージDNAの調製及び使用、並
びに突然変異誘発された配列を含む２つのオリゴヌクオ
レチド〔（５′‐CAG CAG ATC CAG GCA GGT AGT TAT CC
T-3′（配列識別番号17）、配列識別番号17の５′‐AGG
ATA ACT ACC TGC CTG GAT CTG CTG-3′補体）〕の使用
を、前に記載のように行なった（Amezsham:オリゴヌク
オレチド指図のインビトロ突然変異誘発システム）。
2の創造と、PAI-2コード領域からファージM13ベクターm
p18にトランスファーした後、特定部位突然変異誘発に
より達成した。一本鎖ファージDNAの調製及び使用、並
びに突然変異誘発された配列を含む２つのオリゴヌクオ
レチド〔（５′‐CAG CAG ATC CAG GCA GGT AGT TAT CC
T-3′（配列識別番号17）、配列識別番号17の５′‐AGG
ATA ACT ACC TGC CTG GAT CTG CTG-3′補体）〕の使用
を、前に記載のように行なった（Amezsham:オリゴヌク
オレチド指図のインビトロ突然変異誘発システム）。
PAI-2のK87A変異体を、プラスミドpBTA674を有するE.
コリK-12細胞の１培養物から精製した。このプラスミ
ドは、pBTA641と同一であるが、しかしPAI-2DNAがPAI-2
の変異体形により置換されている。
コリK-12細胞の１培養物から精製した。このプラスミ
ドは、pBTA641と同一であるが、しかしPAI-2DNAがPAI-2
の変異体形により置換されている。
精製を、“C.37kD形の精製”、段階（ｉ）〜（iv）に
記載されるようにして実質的に行なったが、但し、段階
（ii）における50％硫酸アンモニウム沈殿が排除され
た。還元SDS-PAGE及びウェスターンブロットによる、Se
phacryl S-200カラムから溶出される画分の分析は、PAI
-2の46kD及び37kDの両者の存在を示し、これはリシン87
からアラニン残基への突然変異誘発が、敏感なプロテア
ーゼとして前で同定された領域におけるPAI-2分子の切
断を妨害するのに失敗したことを示唆する（B.37kD形の
精製を参照のこと。） 実施例１ プロテアーゼ感受性部位の削除 PAI-2中のプロテアーゼ感受性部位を含むHinfI-PstI
セグメントを、HinfIおよびPstI粘着末端を有する合成
オリゴヌクオレチド（図５参照）により置き換え、アミ
ノ酸74〜96（74と94を含む）が除去された変異体PAI-2
を作製した。この欠失変異体の作製に含まれる出来事を
図６に記載する。本質的には、pBTA641からのBglII-Hin
fI断片、pMINS71からのPstI-BglII断片、およびアニー
リングしたオリゴヌクオレチドA1（配列番号７）とA2
（配列番号７）の間の三部連結により中間ベクター中に
欠失変異体を構築せしめた。構築された欠失PAI-2を中
間ベクターから切り出し、そしてpBTA641中の生体のPAI
-2と交換してpBTA829を作製した。
記載されるようにして実質的に行なったが、但し、段階
（ii）における50％硫酸アンモニウム沈殿が排除され
た。還元SDS-PAGE及びウェスターンブロットによる、Se
phacryl S-200カラムから溶出される画分の分析は、PAI
-2の46kD及び37kDの両者の存在を示し、これはリシン87
からアラニン残基への突然変異誘発が、敏感なプロテア
ーゼとして前で同定された領域におけるPAI-2分子の切
断を妨害するのに失敗したことを示唆する（B.37kD形の
精製を参照のこと。） 実施例１ プロテアーゼ感受性部位の削除 PAI-2中のプロテアーゼ感受性部位を含むHinfI-PstI
セグメントを、HinfIおよびPstI粘着末端を有する合成
オリゴヌクオレチド（図５参照）により置き換え、アミ
ノ酸74〜96（74と94を含む）が除去された変異体PAI-2
を作製した。この欠失変異体の作製に含まれる出来事を
図６に記載する。本質的には、pBTA641からのBglII-Hin
fI断片、pMINS71からのPstI-BglII断片、およびアニー
リングしたオリゴヌクオレチドA1（配列番号７）とA2
（配列番号７）の間の三部連結により中間ベクター中に
欠失変異体を構築せしめた。構築された欠失PAI-2を中
間ベクターから切り出し、そしてpBTA641中の生体のPAI
-2と交換してpBTA829を作製した。
オリゴヌクオレチド（図５の配列番号７と８）をAppl
ied BiosystemsのDNA合成装置（モデル380A）上で合成
し、ポリアクリルアミドゲルから精製した。相補性オリ
ゴヌクオレチド（A1:配列番号７およびA2:配列番号８）
を1:1のモル比で混合し、５単位のT4ポリヌクレオチド
キナーゼを使って65mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl2、5
mM ジチオトレイトール、1mM ATP中でリン酸化した。
混合物を65℃で10分間加熱し、次いで室温までゆっくり
冷却してアニーリングさせた。次のようにして種々の制
限断片を調製した。精製プラスミドDNAの制限酵素消化
は製造業者により推奨される緩衝液中で行った。Tris−
酢酸塩緩衝液中の0.8-1.5％Sea-Plaque アガロース（F
MC Corporation）上でのゲル電気泳動によりプラスミド
から必要なDNA断片を分離した（Maniatisら、1982）。
臭化エチジウムでの染色およびUV照射により断片を可視
化した。適当な断片を含むアガロースのバンドをゲルか
ら切り取り、65℃で融解し、そしてDNAをフェノール／
クロロホルム／イソアミルアルコールで３回抽出した。
次いでエタノールでDNAを沈澱させた。
ied BiosystemsのDNA合成装置（モデル380A）上で合成
し、ポリアクリルアミドゲルから精製した。相補性オリ
ゴヌクオレチド（A1:配列番号７およびA2:配列番号８）
を1:1のモル比で混合し、５単位のT4ポリヌクレオチド
キナーゼを使って65mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl2、5
mM ジチオトレイトール、1mM ATP中でリン酸化した。
混合物を65℃で10分間加熱し、次いで室温までゆっくり
冷却してアニーリングさせた。次のようにして種々の制
限断片を調製した。精製プラスミドDNAの制限酵素消化
は製造業者により推奨される緩衝液中で行った。Tris−
酢酸塩緩衝液中の0.8-1.5％Sea-Plaque アガロース（F
MC Corporation）上でのゲル電気泳動によりプラスミド
から必要なDNA断片を分離した（Maniatisら、1982）。
臭化エチジウムでの染色およびUV照射により断片を可視
化した。適当な断片を含むアガロースのバンドをゲルか
ら切り取り、65℃で融解し、そしてDNAをフェノール／
クロロホルム／イソアミルアルコールで３回抽出した。
次いでエタノールでDNAを沈澱させた。
ベクターは典型的には次のように調製した。プラスミ
ドDNAを適当な制限酵素で消化し、消化物を同容量のフ
ェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出
し、そして2.5容のエタノールでDNAを沈澱させた。消化
したDNAを50mM Tris-HCl pH9.0、1mM MgCl2、0.1mM ZnC
l2、1mMスペルミジン中に再懸濁し、１〜２単位の子ウ
シ腸アルカリホズファターゼ（Boehringer Mannheim）
と共に37℃にて30〜60分間インキュベートした。酵素を
70℃で15分間熱不活性化し、次いでDNAをフェノール／
クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、そして
エタノールで沈澱させた。
ドDNAを適当な制限酵素で消化し、消化物を同容量のフ
ェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出
し、そして2.5容のエタノールでDNAを沈澱させた。消化
したDNAを50mM Tris-HCl pH9.0、1mM MgCl2、0.1mM ZnC
l2、1mMスペルミジン中に再懸濁し、１〜２単位の子ウ
シ腸アルカリホズファターゼ（Boehringer Mannheim）
と共に37℃にて30〜60分間インキュベートした。酵素を
70℃で15分間熱不活性化し、次いでDNAをフェノール／
クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、そして
エタノールで沈澱させた。
連結は次のようにして行った。ベクターと挿入DNAと
を1:1〜1:5（挿入断片が100bpより小さい場合には1:1
0）のモル比で20μｌの容量の1mM ATP、10mM MgCl2、5m
M DTT、65mM Tris-HCl pH7.5中に混合した。0.1〜１単
位のT4DNAリガーゼ（Boehringer Mannheim）を用いて16
℃にて一晩連結を行った。コンピテント大腸菌（E.col
i）K2宿主（Hanahan,J.Mol.Biol.166:557-580、1983）
中への形質転換用に連結混合物から５〜10μｌを取っ
た。100μg/mlのアンピシリンを含むトリプトン−大豆
寒天プレート上へ塗布することにより、形質転換体を選
択した。
を1:1〜1:5（挿入断片が100bpより小さい場合には1:1
0）のモル比で20μｌの容量の1mM ATP、10mM MgCl2、5m
M DTT、65mM Tris-HCl pH7.5中に混合した。0.1〜１単
位のT4DNAリガーゼ（Boehringer Mannheim）を用いて16
℃にて一晩連結を行った。コンピテント大腸菌（E.col
i）K2宿主（Hanahan,J.Mol.Biol.166:557-580、1983）
中への形質転換用に連結混合物から５〜10μｌを取っ
た。100μg/mlのアンピシリンを含むトリプトン−大豆
寒天プレート上へ塗布することにより、形質転換体を選
択した。
個々のコロニーからプラスミドDNAを抽出し、制限分
析により正しい組換えプラスミドを同定した。欠失が作
られたPAI-2遺伝子の領域を配列決定し、変化を確かめ
た。配列決定は、取扱い説明書に記載されたようにして
Sequenase DNA Sequemsing Kit（USB）を使って二本鎖
プラスミドDNA上で行った。使用したプライマーはT7プ
ライマー（Promega）であった。
析により正しい組換えプラスミドを同定した。欠失が作
られたPAI-2遺伝子の領域を配列決定し、変化を確かめ
た。配列決定は、取扱い説明書に記載されたようにして
Sequenase DNA Sequemsing Kit（USB）を使って二本鎖
プラスミドDNA上で行った。使用したプライマーはT7プ
ライマー（Promega）であった。
細菌構成物および発現 ベクターpLK58中のラムダPLプロモーターの支配下にP
AI-2の完全コード配列および欠失変異体を配置し、ATG
の上流の合成オリゴヌクオレチドは該開始コドンから適
当な距離のところに細菌性リボソーム結合部位を提供
し、生来のPAI-2配列をコードするプラスミドpBTA641と
欠失変異体Δ74-96をコードするプラスミドpBTA829を得
た。
AI-2の完全コード配列および欠失変異体を配置し、ATG
の上流の合成オリゴヌクオレチドは該開始コドンから適
当な距離のところに細菌性リボソーム結合部位を提供
し、生来のPAI-2配列をコードするプラスミドpBTA641と
欠失変異体Δ74-96をコードするプラスミドpBTA829を得
た。
それらのプラスミドを用いて、ラムダの熱不安定性リ
プレッサーcI857を含む大腸菌K-12ΔHIΔtrpを形質転換
せしめた。形質転換細胞をTSB培地（Oxoid）中で28℃に
て一晩増殖させた。次いで細胞をMEM培地（Mottら、Pro
c.Natl.Acad.Sci.82:88-92,1985）中に希釈し、1.0のOD
600まで28℃にて一晩増殖させ、予め温めた（48℃）MEM
培地を同体積添加し温度を38℃に平衡化した。38℃で４
時間増殖させた後、8000×ｇでの15分間の遠心により細
胞を収得した。細胞ペレットをBehs緩衝液（10mM P−ク
ロロ水銀安息香酸、10mM EDTA(Na)2、10mM 1,10−フェ
ナチオリン、100mM リン酸塩、pH7.0）中に再懸濁し、
そして16,000psiでのフレンチプレスへの２回の通過
（氷上）により溶解せしめた。溶解細胞からの上清を80
00×ｇでの15分間の遠心により清澄化し、そしてヒトPA
I-2に対するアフィニティー精製モノクローナル抗体（B
iopool）またはポリクローナル抗体を使って、PAI-2の
存在について試験した。後述のようにして、ウロキナー
ゼ−PAI-2の形成の特徴を示すウロキナーゼの存在下で
の電気泳動移動度のシフトにより、生物活性を評価し
た。
プレッサーcI857を含む大腸菌K-12ΔHIΔtrpを形質転換
せしめた。形質転換細胞をTSB培地（Oxoid）中で28℃に
て一晩増殖させた。次いで細胞をMEM培地（Mottら、Pro
c.Natl.Acad.Sci.82:88-92,1985）中に希釈し、1.0のOD
600まで28℃にて一晩増殖させ、予め温めた（48℃）MEM
培地を同体積添加し温度を38℃に平衡化した。38℃で４
時間増殖させた後、8000×ｇでの15分間の遠心により細
胞を収得した。細胞ペレットをBehs緩衝液（10mM P−ク
ロロ水銀安息香酸、10mM EDTA(Na)2、10mM 1,10−フェ
ナチオリン、100mM リン酸塩、pH7.0）中に再懸濁し、
そして16,000psiでのフレンチプレスへの２回の通過
（氷上）により溶解せしめた。溶解細胞からの上清を80
00×ｇでの15分間の遠心により清澄化し、そしてヒトPA
I-2に対するアフィニティー精製モノクローナル抗体（B
iopool）またはポリクローナル抗体を使って、PAI-2の
存在について試験した。後述のようにして、ウロキナー
ゼ−PAI-2の形成の特徴を示すウロキナーゼの存在下で
の電気泳動移動度のシフトにより、生物活性を評価し
た。
u-PA結合実験 ウロキナーゼに結合する前記PAI-2欠失変異体の能力
を、ウロキナーゼ結合実験において測定した。Δ74-96
変異体は生来のPAI-2に比較してかなり変わった分子で
あるので、変異体が生物活性を有するか否かを予測する
ことは不可能である。生来の（即ちpBTA641から発現さ
れるもの）もしくはΔ74-96変異体（即ちpBTA829から発
現されるもの）を発現する溶解細胞、または全くPAI-2
を発現しない細胞（即ちpBTA836を含む細胞）からの透
明な上清に、ウロキナーゼ（LMW,American Diagnostic
a）を添加した。負の対照として、ウロキナーゼを添加
しない溶解物を使った。プラスミドpBTA836は、BglIIお
よびEcoRIでの消化によりPAI-2を切除し、次にクレノウ
酵素を使ったフィルイン反応および連結反応によりPAI-
2遺伝子を欠くプラスミドを再形成することからpBTA641
から誘導した。
を、ウロキナーゼ結合実験において測定した。Δ74-96
変異体は生来のPAI-2に比較してかなり変わった分子で
あるので、変異体が生物活性を有するか否かを予測する
ことは不可能である。生来の（即ちpBTA641から発現さ
れるもの）もしくはΔ74-96変異体（即ちpBTA829から発
現されるもの）を発現する溶解細胞、または全くPAI-2
を発現しない細胞（即ちpBTA836を含む細胞）からの透
明な上清に、ウロキナーゼ（LMW,American Diagnostic
a）を添加した。負の対照として、ウロキナーゼを添加
しない溶解物を使った。プラスミドpBTA836は、BglIIお
よびEcoRIでの消化によりPAI-2を切除し、次にクレノウ
酵素を使ったフィルイン反応および連結反応によりPAI-
2遺伝子を欠くプラスミドを再形成することからpBTA641
から誘導した。
室温で90分間反応を進行させた。次いでSDSおよび２
−メルカプトエタノールを含む緩衝液を添加した後、試
料を３分間煮沸し、そしてPAI-2に対するヤギポリクロ
ーナル抗体（図7A）またはウロキナーゼに対するウサギ
ポリクローナル抗体（７図Ｂ）のいずれか一方を使っ
て、SDS-PAGEおよびウエスタンブロッティングにより分
析した。第一抗体に対して向けられた第二抗体−HRP接
合体を使って、結合した抗体を検出した。
−メルカプトエタノールを含む緩衝液を添加した後、試
料を３分間煮沸し、そしてPAI-2に対するヤギポリクロ
ーナル抗体（図7A）またはウロキナーゼに対するウサギ
ポリクローナル抗体（７図Ｂ）のいずれか一方を使っ
て、SDS-PAGEおよびウエスタンブロッティングにより分
析した。第一抗体に対して向けられた第二抗体−HRP接
合体を使って、結合した抗体を検出した。
図７はそのような実験の結果を示す。生来のまたはΔ
74-96変異体のPAI-2を含む溶解物へのウロキナーゼの添
加は、PAI-2に対して向けられたポリクローナル抗体
（図7A、レーンｃおよびｅ）またはウロキナーゼに対し
て向けられたポリクローナル抗体（図7B、レーンｃおよ
びｅ）と反応する約69kDのSDS安定性複合体の形成をも
たらした。ウロキナーゼの不在下、またはPAI-2を欠く
細胞溶解物においては、PAI-2に対する抗体（図7A、レ
ーンb,d,f,g）またはウロキナーゼに対する抗体（図7
B、レーンb,d,f,g）を使って、そのような複合体は検出
できなかった。それらの結果はウロキナーゼ−PAI-2複
合体の形成に特有であり、生来のPAI-2と変異Δ74-96PA
I-2の両方がウロキナーゼを結合することができ、よっ
て両者が生物活性を有することを示す。
74-96変異体のPAI-2を含む溶解物へのウロキナーゼの添
加は、PAI-2に対して向けられたポリクローナル抗体
（図7A、レーンｃおよびｅ）またはウロキナーゼに対し
て向けられたポリクローナル抗体（図7B、レーンｃおよ
びｅ）と反応する約69kDのSDS安定性複合体の形成をも
たらした。ウロキナーゼの不在下、またはPAI-2を欠く
細胞溶解物においては、PAI-2に対する抗体（図7A、レ
ーンb,d,f,g）またはウロキナーゼに対する抗体（図7
B、レーンb,d,f,g）を使って、そのような複合体は検出
できなかった。それらの結果はウロキナーゼ−PAI-2複
合体の形成に特有であり、生来のPAI-2と変異Δ74-96PA
I-2の両方がウロキナーゼを結合することができ、よっ
て両者が生物活性を有することを示す。
タンパク質分解感受性の除去 生来のPAI-2（即ちpBTA641由来）を発現する大腸菌細
胞において、SDS-PAGEおよびウエスタン移行後にPAI-2
特異抗体により検出された主要生産物は、生来のPAI-2
を表す46kD形、および分解産物を表す37kD形である（図
３、レーン３および4;図7A、レーンｂ）。特異Δ74-96P
AI-2（即ちpBTA829由来）を発現する細胞においては、3
7kDの分解産物は検出できなかった（図7A、レーン
ｄ）。それらの結果は、変異体Δ74-96PAI-2が生来のPA
I-2のタンパク質分解感受性を有さないことを示す。
胞において、SDS-PAGEおよびウエスタン移行後にPAI-2
特異抗体により検出された主要生産物は、生来のPAI-2
を表す46kD形、および分解産物を表す37kD形である（図
３、レーン３および4;図7A、レーンｂ）。特異Δ74-96P
AI-2（即ちpBTA829由来）を発現する細胞においては、3
7kDの分解産物は検出できなかった（図7A、レーン
ｄ）。それらの結果は、変異体Δ74-96PAI-2が生来のPA
I-2のタンパク質分解感受性を有さないことを示す。
実施例２ プロテアーゼ感受性部位の除去 オーバーラップ伸長による部位特異的突然変異誘発の
ポリメラーゼチェーン反応（PCR）技術（Hoら、Gene77:
51-59,1989）を使って、PAI-2コード領域から、アミノ
酸66-98（66と98を含む）をコードするDNA配列を除去し
た。PCR反応において使用したオリゴヌクオレチドは図
８に示され（配列番号9,10および11）、そしてこの欠失
変異体の作製の概略を図９に示す。
ポリメラーゼチェーン反応（PCR）技術（Hoら、Gene77:
51-59,1989）を使って、PAI-2コード領域から、アミノ
酸66-98（66と98を含む）をコードするDNA配列を除去し
た。PCR反応において使用したオリゴヌクオレチドは図
８に示され（配列番号9,10および11）、そしてこの欠失
変異体の作製の概略を図９に示す。
簡単に言えば、PCR反応において使用した中間ベクタ
ーにPAI-2DNAを移行し、アミノ酸66-98（66と98を含
む）をコードする配列が除去されているBglII/PstI断片
を作製した。PCR生成BglII/PstI断片を中間ベクター中
の生来の断片と交換し、そして独立した５つの形質転換
体からの全BglII/PstI領域を配列決定した。生来のPAI-
2との唯一の相違がアミノ酸66-98（66と98を含む）をコ
ードする配列の欠失であるそれらの形質転換体のうちの
１つから、PAI-2DNAを回収し、そしてベクターpLK58中
に連結せしめ、pBTA840を作製した。
ーにPAI-2DNAを移行し、アミノ酸66-98（66と98を含
む）をコードする配列が除去されているBglII/PstI断片
を作製した。PCR生成BglII/PstI断片を中間ベクター中
の生来の断片と交換し、そして独立した５つの形質転換
体からの全BglII/PstI領域を配列決定した。生来のPAI-
2との唯一の相違がアミノ酸66-98（66と98を含む）をコ
ードする配列の欠失であるそれらの形質転換体のうちの
１つから、PAI-2DNAを回収し、そしてベクターpLK58中
に連結せしめ、pBTA840を作製した。
オリゴヌクオレチド（図8:配列番号9,10および11）を
Applied BiosystemsのDNA合成装置（モデル380A）上で
合成し、トリチル基を残しておき、製造業者の教示に従
ってオリゴヌクオレチド精製カートリッジ（Applied Bi
osystems,カタログ番号400771）上で精製した。１つの
オリゴSp6プライマーはPromega社から購入した。
Applied BiosystemsのDNA合成装置（モデル380A）上で
合成し、トリチル基を残しておき、製造業者の教示に従
ってオリゴヌクオレチド精製カートリッジ（Applied Bi
osystems,カタログ番号400771）上で精製した。１つの
オリゴSp6プライマーはPromega社から購入した。
PCR反応は、100ピコモルのオリゴヌクオレチドおよび
0.35ピコモルのEcoRI線状化PAI-2プラスミドを使って、
50mM KCl、10mM Tris-HCl pH8.3、1.5mM MgCl2、0.01％
（v/v）ゼラチン、200μM dNTP、2.5U amplitaq（Perki
n-Elmer Cetus）中で実施した。１分間の変性（94
℃）、１分間のアニーリング（50℃）および１分間の伸
長（74℃）を伴う25サイクルに設定されたGene Machine
（Innovonics）上でPCR反応を行った。PCR生成物をSeph
acryl S-200カラム上で、またはTris−酢酸緩衝液（Man
iatisら、1982）中での1.5％sea-plaqueアガロース（FM
C Corporation）上でのゲル電気泳動、次いで臭化エチ
ジウム染色、UV照射による可視化、および製造業者の教
示に従ったNACSカラム（BRL）上でのアガロースゲル切
片からの精製により精製した。
0.35ピコモルのEcoRI線状化PAI-2プラスミドを使って、
50mM KCl、10mM Tris-HCl pH8.3、1.5mM MgCl2、0.01％
（v/v）ゼラチン、200μM dNTP、2.5U amplitaq（Perki
n-Elmer Cetus）中で実施した。１分間の変性（94
℃）、１分間のアニーリング（50℃）および１分間の伸
長（74℃）を伴う25サイクルに設定されたGene Machine
（Innovonics）上でPCR反応を行った。PCR生成物をSeph
acryl S-200カラム上で、またはTris−酢酸緩衝液（Man
iatisら、1982）中での1.5％sea-plaqueアガロース（FM
C Corporation）上でのゲル電気泳動、次いで臭化エチ
ジウム染色、UV照射による可視化、および製造業者の教
示に従ったNACSカラム（BRL）上でのアガロースゲル切
片からの精製により精製した。
他の必要なDNA断片は、0.8-1.5％のsea-plaqueアガロ
ース上でのゲル電気泳動によりプラスミドDNAから分離
し、そしてPCR生成物について上述したようにして精製
した。
ース上でのゲル電気泳動によりプラスミドDNAから分離
し、そしてPCR生成物について上述したようにして精製
した。
ベクターは典型的には次のようにして調製した。プラ
スミドDNAを適当な制限酵素で37℃にて１〜２時間消化
した。制限消化物に子ウシ腸アルカリホスファターゼ
（CIAP Boehringer Mannheim、１〜２単位）を直接添加
し、37℃にて１時間インキュベーションを続けた。或る
場合、平滑末端または、３′突出末端を生じる制限酵素
を使用する時、CIAPとのインキュベーションを37℃で30
分間そして50℃で30分間行った。CIAP酵素を70℃で15分
間熱不活性化し、そしてDNAをフェノール／クロロホル
ム／イソアミルアルコールで抽出し、次いでエタノール
で沈澱させた。
スミドDNAを適当な制限酵素で37℃にて１〜２時間消化
した。制限消化物に子ウシ腸アルカリホスファターゼ
（CIAP Boehringer Mannheim、１〜２単位）を直接添加
し、37℃にて１時間インキュベーションを続けた。或る
場合、平滑末端または、３′突出末端を生じる制限酵素
を使用する時、CIAPとのインキュベーションを37℃で30
分間そして50℃で30分間行った。CIAP酵素を70℃で15分
間熱不活性化し、そしてDNAをフェノール／クロロホル
ム／イソアミルアルコールで抽出し、次いでエタノール
で沈澱させた。
連結および大腸菌K12宿主の形質転換は実施例１に記
載した通りに行った。或る場合には、連結は４℃で48時
間または16℃で４〜６時間であった。
載した通りに行った。或る場合には、連結は４℃で48時
間または16℃で４〜６時間であった。
アルカリ変性後、Mutiwell Microtitre Sequencing S
ystem Kit（Amercham）を使って、取扱い説明書に記載
されたようにして、二本鎖プラスミドDNA上でBglII/Pst
I領域の配列決定を行った。
ystem Kit（Amercham）を使って、取扱い説明書に記載
されたようにして、二本鎖プラスミドDNA上でBglII/Pst
I領域の配列決定を行った。
この作業に使用したプラスミドは上記のようにして誘
導した。
導した。
大腸菌（E.coli）中での発現 プラスミドpBTA840を用いて、ラムダの熱不安定性リ
プ レッサーcI857を含む大腸菌ΔH1Δtrp宿主を形質転
換せしめた。単一の形質転換体をTSB培地中で28℃にて
一晩増殖させ、得られた培養物を用いて10lの醗酵槽に
接種した。大腸菌細胞を38℃にて24時間熱誘導し、17,0
00×ｇでの20分間の遠心により細胞を回収した。
プ レッサーcI857を含む大腸菌ΔH1Δtrp宿主を形質転
換せしめた。単一の形質転換体をTSB培地中で28℃にて
一晩増殖させ、得られた培養物を用いて10lの醗酵槽に
接種した。大腸菌細胞を38℃にて24時間熱誘導し、17,0
00×ｇでの20分間の遠心により細胞を回収した。
Δ66-98およびΔ74-96PAI-2の精製 PAI-2変異体Δ66-98およびΔ74-96は、該分子を発現
する大腸菌細胞から、生来の分子の精製において使用さ
れる方法、即ちPhenyl-Sepharoseクロマトグラフィー、
Sephacryl S200クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィーおよび／または逆相HPLCを含む方法によ
り、精製することができる。それらの方法は国際特許出
願PCT/AU85/00191（WO 86/01212）および国際特許出願P
CT/AU87/00067（WO 87/05628）において記載されてお
り、そしてΔ66-98の精製の結果を図10に示す。
する大腸菌細胞から、生来の分子の精製において使用さ
れる方法、即ちPhenyl-Sepharoseクロマトグラフィー、
Sephacryl S200クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィーおよび／または逆相HPLCを含む方法によ
り、精製することができる。それらの方法は国際特許出
願PCT/AU85/00191（WO 86/01212）および国際特許出願P
CT/AU87/00067（WO 87/05628）において記載されてお
り、そしてΔ66-98の精製の結果を図10に示す。
u-PA、二本鎖t-PAおよび一本鎖t-PA結合実験 u-PA、二本鎖t-PAおよび一本鎖t-PAに結合する変異体
Δ66-98の能力を、実施例１に記載したものと同様な結
合実験において調べた。Δ66-98PAI-2（配列番号３）の
結合特性を生来のPAI-2（即ちpBTA641から発現されたも
の）（配列番号１）、Δ74-96変異体（即ちpBTA829から
発現されたもの）（配列番号２）、およびpBTA641から
発現されたPAI-2と３つのアミノ酸が異なる生来のPAI-2
の第二の形（Shleuningら、Mol.Cell Biol.7:4564-456
7,1987）により示されたものと比較した。別の生来のPA
I-2はpBTA683から発現された。PAI-2の第二の形におい
て見つかる３アミノ酸に変更する部位特異的突然変異誘
発によりpBTA641からプラスミドpBTA683を誘導した〔Sh
leuningら、Mol.Cell Biol.7:4564-4567 1987）〕。
Δ66-98の能力を、実施例１に記載したものと同様な結
合実験において調べた。Δ66-98PAI-2（配列番号３）の
結合特性を生来のPAI-2（即ちpBTA641から発現されたも
の）（配列番号１）、Δ74-96変異体（即ちpBTA829から
発現されたもの）（配列番号２）、およびpBTA641から
発現されたPAI-2と３つのアミノ酸が異なる生来のPAI-2
の第二の形（Shleuningら、Mol.Cell Biol.7:4564-456
7,1987）により示されたものと比較した。別の生来のPA
I-2はpBTA683から発現された。PAI-2の第二の形におい
て見つかる３アミノ酸に変更する部位特異的突然変異誘
発によりpBTA641からプラスミドpBTA683を誘導した〔Sh
leuningら、Mol.Cell Biol.7:4564-4567 1987）〕。
種々のPAI-2（各々0.25μｇ）を、25mM Tris-HCl pH
7.5、75mM MaCl、2.5mM EDTAおよび0.5％ TX-100中で、
u-PA（3.75μｇ、Behring）、二本鎖t-PAまたは一本鎖t
-PA（各々3.75μｇ、American Diagnostica）と共に室
温で160分間インキュベートした。試料を10％SDS−ポリ
アクリルアミドゲル上で分析し次いでウエスタンブロッ
ティングした。ブロットをPAI-2に対するヤギポリクロ
ーナル抗体で探索し、結合した抗体を抗−ヤギ−HRP接
合体により検出した（図11）。
7.5、75mM MaCl、2.5mM EDTAおよび0.5％ TX-100中で、
u-PA（3.75μｇ、Behring）、二本鎖t-PAまたは一本鎖t
-PA（各々3.75μｇ、American Diagnostica）と共に室
温で160分間インキュベートした。試料を10％SDS−ポリ
アクリルアミドゲル上で分析し次いでウエスタンブロッ
ティングした。ブロットをPAI-2に対するヤギポリクロ
ーナル抗体で探索し、結合した抗体を抗−ヤギ−HRP接
合体により検出した（図11）。
全PAI-2（２種の生来形および２種の欠失変異体）が
同等な結合特性を示した。u-PA、二本鎖t-PAまたは一本
鎖t-PAとインキュベートすると、PAI-2の高分子量SDS安
定成形が認められた。そのような高分子量形は、PAI-2
とそれらのプラスミノーゲン活性化因子との間の複合体
の形成の特徴を示す。
同等な結合特性を示した。u-PA、二本鎖t-PAまたは一本
鎖t-PAとインキュベートすると、PAI-2の高分子量SDS安
定成形が認められた。そのような高分子量形は、PAI-2
とそれらのプラスミノーゲン活性化因子との間の複合体
の形成の特徴を示す。
タンパク質分解感受性の除去 変異体Δ74-96と同様に、生来のPAI-2の精製時に観察
された37kDの分解産物は、変異体Δ66-98の精製調製物
中に検出されなかった（図10）。
された37kDの分解産物は、変異体Δ66-98の精製調製物
中に検出されなかった（図10）。
産業上の利用可能性 本発明のPAI-2変異体は、腫瘍を有する患者または慢
性炎症状態、例えば関節リウマチを患っている患者にお
いて、治療薬および診断薬として使用することができ
る。
性炎症状態、例えば関節リウマチを患っている患者にお
いて、治療薬および診断薬として使用することができ
る。
特異的PA阻害剤の適用が利用可能である他の状態とし
ては、変形性関節症、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、SL
E様疾患、乾癬、天疱瘡、角膜潰瘍、胃十二指腸潰瘍、
紫斑、歯周炎、出血および筋ジストロフィーといった症
状および疾患が挙げられる。特異的PA阻害剤は、PAを伴
う血栓崩壊療法への補助剤として用いることができる。
というのは、そのような処置の副作用、即ち全身性フィ
ブリン溶解現象の発生率および過酷さを減少させるから
である。最後に、２種のトリプシン阻害剤が結合組織の
形成を増強し、創傷組織の破断強さを増加させることが
示されており〔Kwaan,HCおよびAstrup,T（1969）Exp.Mo
lec.Path.11,82〕、そして、角質細胞がuPAとtPAの両方
を生産することが知られている〔Grondahl-Hansen,Jら
（1988）J.Invest.Dermatol.〕ので、PA阻害剤は皮膚創
傷の治癒および組織の修復において重要な役割を有する
ことができる。
ては、変形性関節症、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、SL
E様疾患、乾癬、天疱瘡、角膜潰瘍、胃十二指腸潰瘍、
紫斑、歯周炎、出血および筋ジストロフィーといった症
状および疾患が挙げられる。特異的PA阻害剤は、PAを伴
う血栓崩壊療法への補助剤として用いることができる。
というのは、そのような処置の副作用、即ち全身性フィ
ブリン溶解現象の発生率および過酷さを減少させるから
である。最後に、２種のトリプシン阻害剤が結合組織の
形成を増強し、創傷組織の破断強さを増加させることが
示されており〔Kwaan,HCおよびAstrup,T（1969）Exp.Mo
lec.Path.11,82〕、そして、角質細胞がuPAとtPAの両方
を生産することが知られている〔Grondahl-Hansen,Jら
（1988）J.Invest.Dermatol.〕ので、PA阻害剤は皮膚創
傷の治癒および組織の修復において重要な役割を有する
ことができる。
本発明の変異体に対する抗体は、単球性白血病、ガ
ン、胎児発達および慢性炎症性疾患といった病的状態ま
たは状態の検出もしくは追跡において有用であろう。
ン、胎児発達および慢性炎症性疾患といった病的状態ま
たは状態の検出もしくは追跡において有用であろう。
配列の列挙 （１）一般的情報 （ｉ）出願者:Goss,Neil Howard（アメリカ） Richard
son,Michael Andrew（アメリカ） Biotech Australia
Pty Limited（アメリカ以外の国） （ii）発明の表題:PAI-2の変異体 （iii）配列の数:18 （iv）通信先： （Ａ）住所:Griffith Hack ＆ Co （Ｂ）通り:71 York Street （Ｃ）市:Sydney （Ｄ）州:New South Wales （Ｅ）国:AUSTRALIA （Ｆ）郵便番号:2000 （ｖ）コンピューター読み取りフォーム （Ａ）媒体タイプ:3 1/2インチの2DDフロッピーディス
ク （Ｂ）コンピューター:Macintosh （Ｃ）操作システム:Macintosh,6.04及びそれ以上 （Ｄ）ソフトウェアー:Microsoft word 4 （vi）現出願日：入手できない （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）前出願日： （Ａ）出願番号:AU PJ7924 （Ｂ）出願日:1989年12月20日 （２）配列識別番号１についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:1610個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA〜mRNA （Ａ）説明：ヒトプラスミノーゲン活性化因子インヒビ
タータイプ２タンパク質をコードする （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型:N/A （vi）起源： （Ａ）生物名：ホモサピエンス （Ｂ）株名： （Ｃ）個体・単離クローン名： （Ｄ）分化の程度： （Ｅ）ハプロタイプ （Ｆ）組織の種類： （Ｇ）細胞の種類：単球 （Ｈ）セルライン:U937 （Ｉ）オルガネラ名： （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名： （Ｂ）クローン名:BTA 1445 （viii）ゲノム内での位置： （Ａ）染色体／セグメント名:18 （Ｂ）染色体上の位置:18q21-q23 （Ｃ）単位： 配列識別番号２についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:1512個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA〜mRNA （Ａ）説明：アミノ酸74-96が欠失されているヒトプラ
スミノーゲン活性化因子インヒビタータイプ２タンパク
質をコードする （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型:N/A （vi）起源： （Ａ）生物名：ホモサピエンス （Ｂ）株名： （Ｃ）固体・単離クローン名： （Ｄ）分化の程度： （Ｅ）ハプロタイプ （Ｆ）組織の種類： （Ｇ）細胞の種類：単球 （Ｈ）セルライン:U937 （Ｉ）オルガネラ名： （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名： （Ｂ）クローン名:BTA 1916 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー PAI-2変異体 （Ｂ）位置：アミノ酸74-96 （Ｃ）同定方法：実験による （Ｄ）他の情報：プロテアーゼ感受性部位の除去の生成
物はウロキナーゼ組織プラスミノーゲン活性化因子に結
合する 配列識別番号３についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:1482個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA〜mRNA （Ａ）説明：アミノ酸66-98が欠失されているヒトプラ
スミノーゲン活性化因子インヒビタータイプ２タンパク
質をコードする （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型:N/A （vi）起源： （Ａ）生物名：ホモサピエンス （Ｂ）株名： （Ｃ）個体・単離クローン名： （Ｄ）分化の程度： （Ｅ）ハプロタイプ （Ｆ）組織の種類： （Ｇ）細胞の種類：単球 （Ｈ）セルライン:U937 （Ｉ）オルガネラ名： （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名： （Ｂ）クローン名:BTA 1922 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー PAI-2変異体 （Ｂ）位置：欠失されたアミノ酸66-98 （Ｃ）同定方法：実験による （Ｄ）他の情報：プロテアーゼ感受性部位の除去、生成
物はウロキナーゼ組織プラスミノーゲン活性化因子に結
合する 配列識別番号４についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:27個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 説明：合成DNAオリゴヌクオレチド （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列の説明：配列識別番号４ GGCCCATATG ATATCTCGAG ACTAGTC 27 配列識別番号５についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:9個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA〜mRNA （Ａ）説明:66-98アミノ酸欠失変異体における欠失され
たアミノ酸を示すPAI-2分子における塩基対241〜348の
コード領域 （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型：中間部 （xi）配列の説明：配列識別番号５ 配列識別番号６についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:39個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA〜mRNA （Ａ）説明:74〜96アミノ酸欠失変異体における欠失さ
れたアミノ酸を示すPAI-2分子における塩基対241〜348
のコード領域 （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型：中間部 （xi）配列の説明：配列識別番号６ 配列識別番号７についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:18個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明:74-96アミノ酸コード領域欠失変異体におけ
るPAI-2遺伝子のHinfI/PstI領域を置換するための合成D
NAアダプター （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型：中間部 （xi）配列の説明：配列識別番号７ 配列識別番号８についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:11個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明:74-96アミノ酸コード領域欠失変異体におけ
るPAI-2遺伝子のHinfI/PstI領域を置換のための配列識
別番号７のアダプターへの相補的配列 （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:Yes （ｖ）フラグメント型： （xi）配列の説明：配列識別番号８ GCT TGT GCT GG 11 配列識別番号９についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:22個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明:PAI-2の66-98アミノ酸欠失変異体をコード
する遺伝子を創造するためにPCR反応への使用のための
合成DNAオリゴヌクオレチド （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:Yes （ｖ）フラグメント型： （xi）配列の説明：配列識別番号９ CCT CTT CTG CAG ATT CTA GGA A 22 配列識別番号10についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:29個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明:PAI-2の66-98アミノ酸欠失変異体をコード
する遺伝子を創造するためにPCR反応への使用のための
合成DNAオリゴヌクオレチド （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:Yes （ｖ）フラグメント型： （xi）配列の説明：配列識別番号10 AT CTG CAG CGG CTC CCA CTT CAT TAA ACT 29 配列識別番号11についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:28個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明:PAI-2の66-98アミノ酸欠失変異体をコード
する遺伝子を創造するためにPCR反応への使用のための
合成DNAオリゴヌクオレチド （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型： （xi）配列の説明：配列識別番号11 GTG GGA GCC GCT GCA GAT AAA ATC CAT T 28 配列識別番号12についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:27個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：合成DNAオリゴヌクオレチド （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型： （xi）配列の説明：配列識別番号12 GATCTNNNNN NNNNNNNNNN NATGGAG 27 配列識別番号13についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:26個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：合成DNAオリゴヌクオレチド （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列の説明：配列識別番号13 GATCTNNNNN NNNNNNNNNN ATGGAG 26 配列識別番号14についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:15個の塩基対 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型:N−末端フラグメント （xi）配列の説明：配列識別番号14 配列識別番号15についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:10個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型:N−末端フラグメント （xi）配列の説明：配列識別番号15 配列識別番号16についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:15個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型:N−末端フラグメント （xi）配列の説明：配列識別番号16 配列識別番号17についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:27個の塩基対 （Ｂ）型：ヌクオレチド （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：合成DNAオリゴヌクオレチド （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列の説明：配列識別番号17 配列識別番号18についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:108個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA〜mRNA （Ａ）説明:PAI-2の欠失変異体のための領域における差
異を示す天然のPAI-2コード配列の塩基241〜348 （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型： （xi）配列の説明：配列識別番号18
son,Michael Andrew（アメリカ） Biotech Australia
Pty Limited（アメリカ以外の国） （ii）発明の表題:PAI-2の変異体 （iii）配列の数:18 （iv）通信先： （Ａ）住所:Griffith Hack ＆ Co （Ｂ）通り:71 York Street （Ｃ）市:Sydney （Ｄ）州:New South Wales （Ｅ）国:AUSTRALIA （Ｆ）郵便番号:2000 （ｖ）コンピューター読み取りフォーム （Ａ）媒体タイプ:3 1/2インチの2DDフロッピーディス
ク （Ｂ）コンピューター:Macintosh （Ｃ）操作システム:Macintosh,6.04及びそれ以上 （Ｄ）ソフトウェアー:Microsoft word 4 （vi）現出願日：入手できない （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）前出願日： （Ａ）出願番号:AU PJ7924 （Ｂ）出願日:1989年12月20日 （２）配列識別番号１についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:1610個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA〜mRNA （Ａ）説明：ヒトプラスミノーゲン活性化因子インヒビ
タータイプ２タンパク質をコードする （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型:N/A （vi）起源： （Ａ）生物名：ホモサピエンス （Ｂ）株名： （Ｃ）個体・単離クローン名： （Ｄ）分化の程度： （Ｅ）ハプロタイプ （Ｆ）組織の種類： （Ｇ）細胞の種類：単球 （Ｈ）セルライン:U937 （Ｉ）オルガネラ名： （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名： （Ｂ）クローン名:BTA 1445 （viii）ゲノム内での位置： （Ａ）染色体／セグメント名:18 （Ｂ）染色体上の位置:18q21-q23 （Ｃ）単位： 配列識別番号２についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:1512個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA〜mRNA （Ａ）説明：アミノ酸74-96が欠失されているヒトプラ
スミノーゲン活性化因子インヒビタータイプ２タンパク
質をコードする （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型:N/A （vi）起源： （Ａ）生物名：ホモサピエンス （Ｂ）株名： （Ｃ）固体・単離クローン名： （Ｄ）分化の程度： （Ｅ）ハプロタイプ （Ｆ）組織の種類： （Ｇ）細胞の種類：単球 （Ｈ）セルライン:U937 （Ｉ）オルガネラ名： （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名： （Ｂ）クローン名:BTA 1916 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー PAI-2変異体 （Ｂ）位置：アミノ酸74-96 （Ｃ）同定方法：実験による （Ｄ）他の情報：プロテアーゼ感受性部位の除去の生成
物はウロキナーゼ組織プラスミノーゲン活性化因子に結
合する 配列識別番号３についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:1482個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA〜mRNA （Ａ）説明：アミノ酸66-98が欠失されているヒトプラ
スミノーゲン活性化因子インヒビタータイプ２タンパク
質をコードする （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型:N/A （vi）起源： （Ａ）生物名：ホモサピエンス （Ｂ）株名： （Ｃ）個体・単離クローン名： （Ｄ）分化の程度： （Ｅ）ハプロタイプ （Ｆ）組織の種類： （Ｇ）細胞の種類：単球 （Ｈ）セルライン:U937 （Ｉ）オルガネラ名： （vii）直接の起源： （Ａ）ライブラリー名： （Ｂ）クローン名:BTA 1922 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー PAI-2変異体 （Ｂ）位置：欠失されたアミノ酸66-98 （Ｃ）同定方法：実験による （Ｄ）他の情報：プロテアーゼ感受性部位の除去、生成
物はウロキナーゼ組織プラスミノーゲン活性化因子に結
合する 配列識別番号４についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:27個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 説明：合成DNAオリゴヌクオレチド （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列の説明：配列識別番号４ GGCCCATATG ATATCTCGAG ACTAGTC 27 配列識別番号５についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:9個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA〜mRNA （Ａ）説明:66-98アミノ酸欠失変異体における欠失され
たアミノ酸を示すPAI-2分子における塩基対241〜348の
コード領域 （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型：中間部 （xi）配列の説明：配列識別番号５ 配列識別番号６についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:39個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA〜mRNA （Ａ）説明:74〜96アミノ酸欠失変異体における欠失さ
れたアミノ酸を示すPAI-2分子における塩基対241〜348
のコード領域 （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型：中間部 （xi）配列の説明：配列識別番号６ 配列識別番号７についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:18個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明:74-96アミノ酸コード領域欠失変異体におけ
るPAI-2遺伝子のHinfI/PstI領域を置換するための合成D
NAアダプター （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型：中間部 （xi）配列の説明：配列識別番号７ 配列識別番号８についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:11個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明:74-96アミノ酸コード領域欠失変異体におけ
るPAI-2遺伝子のHinfI/PstI領域を置換のための配列識
別番号７のアダプターへの相補的配列 （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:Yes （ｖ）フラグメント型： （xi）配列の説明：配列識別番号８ GCT TGT GCT GG 11 配列識別番号９についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:22個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明:PAI-2の66-98アミノ酸欠失変異体をコード
する遺伝子を創造するためにPCR反応への使用のための
合成DNAオリゴヌクオレチド （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:Yes （ｖ）フラグメント型： （xi）配列の説明：配列識別番号９ CCT CTT CTG CAG ATT CTA GGA A 22 配列識別番号10についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:29個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明:PAI-2の66-98アミノ酸欠失変異体をコード
する遺伝子を創造するためにPCR反応への使用のための
合成DNAオリゴヌクオレチド （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:Yes （ｖ）フラグメント型： （xi）配列の説明：配列識別番号10 AT CTG CAG CGG CTC CCA CTT CAT TAA ACT 29 配列識別番号11についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:28個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明:PAI-2の66-98アミノ酸欠失変異体をコード
する遺伝子を創造するためにPCR反応への使用のための
合成DNAオリゴヌクオレチド （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型： （xi）配列の説明：配列識別番号11 GTG GGA GCC GCT GCA GAT AAA ATC CAT T 28 配列識別番号12についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:27個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：合成DNAオリゴヌクオレチド （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型： （xi）配列の説明：配列識別番号12 GATCTNNNNN NNNNNNNNNN NATGGAG 27 配列識別番号13についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:26個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：合成DNAオリゴヌクオレチド （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列の説明：配列識別番号13 GATCTNNNNN NNNNNNNNNN ATGGAG 26 配列識別番号14についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:15個の塩基対 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型:N−末端フラグメント （xi）配列の説明：配列識別番号14 配列識別番号15についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:10個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型:N−末端フラグメント （xi）配列の説明：配列識別番号15 配列識別番号16についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:15個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型:N−末端フラグメント （xi）配列の説明：配列識別番号16 配列識別番号17についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:27個の塩基対 （Ｂ）型：ヌクオレチド （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：合成DNAオリゴヌクオレチド （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列の説明：配列識別番号17 配列識別番号18についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:108個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA〜mRNA （Ａ）説明:PAI-2の欠失変異体のための領域における差
異を示す天然のPAI-2コード配列の塩基241〜348 （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （ｖ）フラグメント型： （xi）配列の説明：配列識別番号18
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 リチャードソン，マイケル アンドリュ ー オーストラリア国，ニュー サウス ウ ェールズ，2085，ベルローズ，ベノーラ プレイス １ (56)参考文献 特開 昭63−276491（ＪＰ，Ａ) 特表 平１−500640（ＪＰ，Ａ)
Claims (21)
- 【請求項１】66-98アミノ酸残基領域が少なくとも１つ
のプロテアーゼ感受性部位を排除するために変更されて
いるPAI-2変異体であって、PAI-2の生物学的活性を維持
していることを特徴とするPAI-2変異体。 - 【請求項２】前記変異体が、66-98アミノ酸残基領域に
おける少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失されている
欠失変異体である請求の範囲第１項記載のPAI-2変異
体。 - 【請求項３】PAI-2のアミノ酸74-96（74及び96を包含す
る）が欠失されているPAI-2変異体。 - 【請求項４】PAI-2のアミノ酸66-98（66及び98を包含す
る）が欠失されているPAI-2変異体。 - 【請求項５】ラベルされた形で存在する請求の範囲第１
〜４項のいづれか１項記載のPAI-2変異体。 - 【請求項６】ラベルが放射性同位体、酵素及び科学物質
から成る群から選択される請求の範囲第５項記載のPAI-
2変異体。 - 【請求項７】DNA分子であって、その配列が請求の範囲
第１〜４項のいづれか１項記載のPAI-2変異体をコード
することを特徴とするDNA分子。 - 【請求項８】請求の範囲第７項記載のDNA分子及びベク
ターDNAを含んで成る組換えDNA分子。 - 【請求項９】前記ベクターDNAがプラスミドDNAである請
求の範囲第８項記載の組換えDNA分子。 - 【請求項１０】前記プラスミドDNAが、E.コリ発現ベク
ター、バキュロウィルストランスファーベクター、哺乳
類発現ベクター、ワクシニアウィルス発現ベクター及び
レトロウィルス発現ベクターから成る群から選択される
請求の範囲第９項記載の組換えDNA分子。 - 【請求項１１】前記E.コリ発現ベクターが： PLプロモーターに基づくE.コリ発現ベクター； lacプロモーターに基づくE.コリ発現ベクター； tacプロモーターに基づくE.コリ発現ベクター； trpプロモーターに基づくE.コリ発現ベクター； pGEM4Z及びそれに由来するプラスミド；及び pSp70及びそれに由来するプラスミドから成る群から選
択される請求の範囲第10項記載の組換えDNA分子。 - 【請求項１２】前記バキュロウィルストランスファーベ
クターが、pAc373,pAc360及びそれらに由来するプラス
ミドから成る群から選択される請求の範囲第10項記載の
組換えDNA分子。 - 【請求項１３】前記哺乳類発現ベクターが： pBPV-1;pBPV-BV1;pdBPV-MMTneo;SV40基礎の発現ベクタ
ー、たとえばpBTA613;及びそれらに由来するプラスミド
から成る群から選択される請求の範囲第10項記載の組換
えDNA分子。 - 【請求項１４】PAI-2の74-96のアミノ酸残基が欠失した
アミノ酸配列をコードするDNAを含有する組換えベクタ
ーがpBTA829。 - 【請求項１５】PAI-2の66-98のアミノ酸残基が欠失した
アミノ酸配列をコードするDNAを含有する組換えベクタ
ーがpBTA840。 - 【請求項１６】請求の範囲第８項記載の組換えDNA分子
により形質転換された形質転換宿主細胞。 - 【請求項１７】前記宿主細胞が、E.コリK12株、真核生
物に由来する細胞及び昆虫スポドプテラ フルギペルダ
（Spodopterafrugiperde）及びボンビックス モリ（Bo
mbyx mori）に由来する細胞系から成る群から選択され
る請求の範囲第16項記載の形質転換宿主細胞。 - 【請求項１８】前記真核生物に由来する細胞が、COS細
胞、CHO細胞、U937細胞、BHK-21細胞、Ver細胞、CVI細
胞及びC127細胞から成る群から選択される請求の範囲第
17項記載の形質転換宿主細胞。 - 【請求項１９】請求の範囲第８項記載の組換えDNA分子
を生成するための方法であって、請求の範囲第７項記載
のDNA分子をベクターDNA中に挿入することを含んで成る
方法。 - 【請求項２０】請求の範囲第16項記載の形質転換宿主を
生成するための方法であって、形質転換のための適切な
宿主細胞をコンピテントにし、そして請求の範囲第８項
記載の組換えDNA分子により前記宿主コンピテント細胞
を形質転換することを含んで成る方法。 - 【請求項２１】組織学的検体での腫瘍の境界を位置決定
し、そして／又は定義するための方法であって、請求の
範囲第５項記載のラベルされたPAI-2変異体を検体に適
用し、そしてラベルの集中の位置を像化することによっ
て決定することを含んで成る方法。
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