KR900007649B1

KR900007649B1 - 폴리-크링글 플라스미노겐 활성화제의 제조방법

Info

Publication number: KR900007649B1
Application number: KR1019860006663A
Authority: KR
Inventors: 포어웬 흥 폴; 쿠마 카리얀 나렌더; 린 리 쇼광
Original assignee: 아메리칸 홈 프로덕츠 코포레이션; 조오지 데모트
Priority date: 1985-08-14
Filing date: 1986-08-13
Publication date: 1990-10-17
Also published as: IL79644A; GB8619154D0; JPH07147984A; PT83170A; IL79644A0; EP0213794B1; DK385686D0; DK175420B1; HU200795B; GB2179948B; DE3676760D1; EP0213794A1; AU6110286A; IE862178L; IE59380B1; AU596369B2; KR870002264A; JPS62104577A; DK385686A; CA1341449C

Abstract

내용 없음.

Description

폴리-크링글 플라스미노겐 활성화제의 제조방법

제1도는 본 원에 개시된 방법에 의해 제조된 3개의 트리스-크링글 플라스미노겐 활성화제와 1개의 테트라-크링글 폴라스미노겐 활성화제의 도식적 배열도[도시된 구조물 1(a-c)의 굵은 선 부분은 유로키나제크링글(UKK)을 함유하는 유로키나제 부분을 나타낸다[제1도에서 a, b 및 c 폴리펩티이드 코드화 DNA를 함유하는 이 콜라이 MM 294 ATCC 33625가 1986년 8월 5일 ATCC에 기탁되어 기탁번호 각각 ATCC 67175-p 438, ATCC 67174-p 504 및 ATCC 67176-p 113(한국기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1987년 1월 6일, 기탁번호 KCTC 8214p, 8215p 및 8213p)을 부여 받았음]. 구조물 1(d)의 굵은 선 부분은 프로트롬빈의 이중 크링글 영역(ptk1 및 PTK2)을 나타낸다. 약자 tPK1 및 PTK2는 각기 조직 플라스미노겐 활성화제 크링글 1 및 2를 나타낸다]이다.

제2도는 조직 플라스미노겐 활성화제 재조합체 클론 pWP-42의 제한부위 지도를 나타낸다.

제3도는 pWP-42로부터 플라스미드 ptPBM-1을 제조하는 기술을 나타낸다. ptPBM-1은 완전 t-PA분자를 제조하는데 필요한 유전정보를 지니고 있다.

제4도는 플라스미스 pUK-53으로부터 플라스미드 pUKBM을 제조하는 기술을 나타낸다. pUKBM은 완전 유로키나제 단백질을 제조하는데 필요한 유전정보를 지닌다.

제5도는 제1(a)도에 되시된 트리스-크링글 생성물을 코드화하는 유전자를 제조하는 방법의 과정일람표를 나타낸다.

제6도는 유로키나제의 아미노산 51-131(u-PA 51-131)을 코드화하는 유전자를 제조하는 방법의 과정일람표를 나타낸다.

제7도는 제1(b)도에 도시된 트리스-크링글 생성물을 코드화하는 유전자를 제조하는 방법의 과정일람표를 나타낸다.

제8도는 제1(c)도에 도시된 트리스-크링글 생성물을 코드화하는 유전자를 제조하는 방법의 과정일람표를 나타낸다.

제9도는 유로키나제 단일 펩타이드 영역(20 아미노산), UKK 영역(유로키나제 아미노산 1-131), 헥사펩타이드 링커 및 t-PA의 잔여부분(아미노산 92-527)에 대한 제1(a)도 생성물을 코드화하는 유전자의 DNA 서열을 나타낸다.

제10도는 t-PA 단일 펩타이드(35 아미노산), t-PA의 N-말단부분(아미노산 1-91), UKK(유로키나제 아미노산 50-131), 헥사펩타이드 링커 및 t-PA의 C-말단부분(아미노산 92-527)에 대한 제1(b)도 생성물을 코드화하는 유전자의 DNA 서열을 나타낸다.

제11도는 t-PA 단일 펩타이드(35 아미노산), t-PA의 N-말단부분(아미노산 1-261), 헥사펩타이드링커, UKK(유로키나제 아미노산 50-131) 및 t-PA의 C-말단부분(아미노산 262-527)에 대한 제1(c)도 생성물을 고도화하는 유전자의 DNA 서열을 나타낸다.

제12도는 프로트롬빈의 이중 크링글 영역을 고도화하는 유전자를 제조하는 방법의 과정일람표를 나타낸다.

제13도는 제1(d)도에 도시된 테트라-크링글 생성물을 코드화하는 유전자를 제조하는 방법의 과정일람표를 나타낸다.

제14도는 포유류 세포라인 C-127(마우스)에서 플라스미노겐 활성화제 하이브리드 A(제1(a)도에 상응함) 및 하이브리드 B(제1(b)도에 상응함)를 발현시키도록 구상된 BPV-1 기본 발현 벡터계를 나타낸다. 발현될 유전자들을 마우스 메탈로티오닌 전사 프로모터 부위와 SV 40 초기영역 전사진행 시그널 사이에 삽입시킨다.

제15(a)도는 웰(well)당 배양 매질 10μl을 적용시키고 웰 주위에 선명한 대역이 나타날 때까지(레인 2내지 7) 37℃에서 배양하여 피브린 한천판상에서 PA-생성세포 또는 좌를 선별함을 나타낸다. 레인 1은 위에서부터 아래로 효소농도(단위/ml) 500, 250, 100, 50, 25 및 0을 갖는 표준 t-PA를 나타낸다.

제15(b)도는 폴리아크릴아미드 겔(PAGE)중에서 전기영동에 의해 하이브리드-PA를 분리한 후 피브린 한천판상에서의 하이브리드 B, 하이브리드 A 및 조직형 플라스미노겐 활성화제의 효소도를 나타낸다.

제15(c)도는 항 t-PA항 혈청을 함유하는 방사선 파동 매질을 면역 침전시킨 후 비환원 나트륨 도데실 설페이트(SDS)/PAGE상에서 전기영동시킨 후의³⁵S-표지된 플라스미노겐 활성화제, 하이브리드 A 및 하이브리드 B의 방사능도를 나타낸다. 공지의 분자량을 갖는 단백질 표지물(오본쪽 레인)을 사용하여 동시에 수행하였다.

본 발명은 DNA 재조합 기술에 의해 제조된, 다수의 이종 폴리펩타이드 크링글(kringle)을 함유하는 제3세대 하이브리드 플라스미노겐 활성화제, 뿐만 아니라 활성화제를 코드화하는 유전자 및 이를 유전자를 함유하는 벡터의 제조방법에 관한 것이다.

플라스미노겐 활성화제(plasminogen activators)는 플라스미노겐을 플라스민으로 전환시키는 세린 프로테아제군이다. 플라스민은 혈액응고의 섬유소 기질을 분해하여, 내부 현관 사고가 혈전증 또는 혈전색전증(thromboembolism)을 일으킨 후 개방 혈관계의 혈액동력 조건을 유지한다. 플라스미노겐 활성화제로 치유가능한, 혈관의 부분적 또는 전체적 차단을 포함하는 혈관질환 상태는 뇌일혈(Stroke), 폐동맥색전증, 심근경색증, 뿐만 아니라 심한 절상 및 말초동맥장애 등이다.

인체 혈장 및 기타 체액에서 발견되는 플라스미노겐 활성화제는 면역학적으로 크게 두가지 형태가 있다. 유로키나제형 플라스미노겐 활성화제(u-PA; Mr, 55, 000) 및 조직형 플라스미노겐 활성화제(t-PA ; Mr, 68, 000). 조직형 플라스미노겐 활성화제의 작용은 섬유소에 의해 가능하게 된다. 이 효소는 혈전 위치에서 작용하여 유로키나제형 플라스미노겐 활성화제보다 섬유소에 대해 높은 친화성을 나타낸다(Haylaeriset al., J. Biol.Chem., 257, 2912, 1982). 그러므로 조직형 플라스미노겐 활성화제는 생리학적으로 적절한 혈전 용해제로 사료된다.

두가지 활성화제 u-PA 및 t-PA는 다음과 같은 공통의 특성을 가지고 있다 : 즉, 1) 이들은 그들의 디설파이드 결합된 2-쇄 분자 구조를 분해시키지 않으면서 플라스민 또는 트립신에 의해 분해될 수 있는 단일쇄 전효소로서 합성된다. 환원시키면, 각 플라스미노겐 활성화제는 중쇄 및 경쇄(heavy and light chain) (u-PA의 경우에는 Mr 33,000; t-PA의 경우에는 Mr 35,000)로 분해된다; 2) 두 효소는 모두, 디이소프로필 플루오로 포스페이트와 같은 세린-특이적 시약에 의해 불활성화될 수 있는 세린 프로테아제이다; 3) 두 효소는 모두 분자내에서 루프(loop) 또는 크링글(kringle)을 형성하는, 3중 디설파이트-결합된 아미노산 서열을 함유한다. 유로키나제 플라스미노겐 활성화제는 단일 크링글을 갖는다. 조직 플라스미노겐 활성화제는 헥사펩타이드 링커(linker) 서열에 의해 연결된 2개의 크링글을 갖는다. 이들 크링글은 섬유소(fibrin)에 대한 효소의 결합에 대해 관여하는 것으로 믿어진다(Thorsen, Biochem.Biophys.Acta., 393, 55, 1975).

t-PA의 DNA 서열분석과 아미노산 서열은 문gjs[Pennica et al., Nature 301, 214(1983); Ny et al., Proc Natl, Acad.Sci, U.S.A.81, 5355(1984); 및 Genentech Inc. 의 유럽특허원 제93, 619호]에 기술되어 있다. u-PA의 DNA 서열분석과 아미노산 서열은 유럽특허원 제92,182호(Genentech Inc.)에 기술되어있으며, 유로키나제 cDNA는 문헌[Verde et al., Proc.Natl, Acad.Sci, U.S.A.81, 4727 (1984)]에 검토 되어 있다.

본 발명에 따라, 다수의 이종(heterologous) 폴리펩타이드 크링글을 함유하는 제3세대 하이브리드 플라스미노겐 활성화제의 그룹이 제공된다. 본 발명의 폴리펩타이드는 2 내지 6개의 크링글을 함유할 수 있다. 이종 크링글'이란 폴리펩타이드 생성물이 상이한 천연적으로 존재하는 공급원에 존재하는 것에 상응하는 크링글 적어도 하나, 또는 천연 플라스미노겐 활성화제에 존재하는 것에 대해 통상적이거나 그에 대해 부가되는 추가의 크링글 구조를 함유하는 것을 의미한다. 통상의 크링글 구조가 천연 플라스미노겐 활성화제에 부가되어 본 발명의 하이브리드 플라스미노겐 활성화제를 생성하는 경우에, DNA는 화학적으로 합성되며, 이러한 통상의 크링글의 제조에 사용되는 DNA 코돈은, 천연 크링글의 목적하는 아미노산 서열은 생성시키면서 재조합(looping out)은 피하도록 천연 플라스미노겐 활성화제에 대한 DNA 코드화 서열에 존재하는 것과는 반드시 달라야 한다. 본 발명의 하이브리드 플라스미노겐 활성화제에 존재하는 크링글은, 상동(homology)의 면에서 별개의 것이지만, 본질적으로 이종이며, 그 결과로 본 발명의 플라스미노겐 활성화제는 그들의 크링글 조합의 관점에서, 천연 플라스미노겐 활성화제에 존재하는 것과는 아미노산 서열, 수 및/또는 크기의 면에서 상이하다. 또한, 본 발명은 하이브리드 플라스미노겐 활성화제 및 그의 주요 단편에 대한 코드화 유전자, 완전 폴리펩타이드 및 그의 주요 단편의 DNA 생성을 위한 발현 벡터, 발현 벡터로 형질전환된 미생물 또는 세모배양물, 및 하이브리드 플라스미노겐 활성화제를 사용하는 방법을 제공한다.

크링글은 3개의 디설파이드 결합에 의해 형성된 3중 루프된 폴리펩타이드 구조이다. 크링글은 길이가 약 79 내지 82 아미노산 그룹으로 다르다. 고도의 서연 상동성은 인체 유로키나제의 단일 크링글(Gunzler et al., Hoppe-Seyler's Z.Physiol.Chem. 363, 1155, 1982), 인체 조직 플라스미노겐 활성화제의 2개의 크링글(Pennica, et al., Nature, 301, 214, 1983), 인체 프로트롬빈의 2개의 크링글(Wolt, et al., Proc.Nat'1, Acad.Sci, USA., 74, 1969, 1977), 및 인체 플라스미노겐의 5개의 크링글(Sottrup-Jensen et al., in Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis(eds.Davidson et al., 3, 191, 1978) 사이에 존재한다. 크링글내(intra-kringle) 디설파이드 브리지에 포함되는 6개의 시스테인의 상대위치는 모든 크링글내에서 보존된다. 본원에서 사용된 '크링글(들)'이란 용어는 상기 언급된 단백질내의 이러한 구조(들)중의 어느 것이나를 의미할 수 있다. 또한 하나 이상의 아미노산이 첨가되거나 제거되거나 치환될 수 있는 경우에, 본질적으로 이들 단백질의 크링글 부위에서 다형성 형태가 존재할 수 있다. 단백질내에서의 이러한 유사한 변화는 또한 최근의 1점 돌연변이 기술의 출현에 의해 또는 목적하는 서열을 갖는 유전자의 화학적합성에 의해 시험관내에서 일으킬 수도 있다.

이하에서는 3중 크링글(트리스-크링글) 플라스미노겐 활성화제 및 테트라-크링글 플라스미노겐 활성화제의 제조방법을 구체적으로 기술한다. 사용되는 방법은 본 발명의 다른 폴리펩타이드의 제조에 적용할 수있는 방법중의 대표적인 것이다.

유로키나제의 적절한 유전자 코드화 서열과 t-PA 클론으로부터 재조합 DNA 기술에 의해 작재된 본 발명의 트리스-크링글 플라스미노겐 활성화제는, 천연 플라스미노겐 활성화제와 비교하여, 증가된 안정성, 섬유소에 대해 증가된 결합 친화성 및 생체내에서의 증가된 반감기의 이점을 제공한다. 이러한 트리스-크링글 플라스미노겐 활성화제의 특성은 증가된 생물학적 효력 및 증가된 저장수명을 제공한다. 트리스-크링글-PA 분자는 천연 t-PA에 비해 제조 및 정제 과정에서 취급이 훨씬 더 용이한데, 이는 배양액과 여러정제단계에 존재하는 천연 t-PA 폴리펩타이드가 저분자량의 중쇄 및 경쇄 단편을 가지고 있기 때문이다. 테트라-크링글 플라스미노겐 활성화제와 다른 폴리-크링글 플라스미노겐 활성화제들도 이러한 특성들을 보유하고 있다.

본 발명의 트리스-크링글 플라스미노겐 활성화제는 유로키나제의 N-말단 부위를 그의 단일 크링글 영역을 통해 t-PA의 N-말단 부위와 적절한 링커에 의해 이중 크링글 영역의 개시부에서 또는 그 전부분에서 결합시켜 제조한다. 유로키나제의 단일 크링글은 131번 아이노산 위치의 글리신 잔기 앞에 위치하는 것으로 알려져 있다. t-PA의 이중 크링글은 91번 위치의 트레오닌 뒤의 시스테인에서 시작하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 131번 글리신 잔기에서 말단화된 유로키나제의 말단 부위를, 임의로는 t-PA의 두 크링글 사이에 헥사펩타이드 결합물을 결합시키는 적절한 링커를 사용하여, 처음 91 N-말단 아미노산이 제거된 t-PA 분자에 결합시킨다. 생성된 하이브리드 분자는 t-PA 보다 46 아미노산이 크고, 사용된 특정 링커에 따라 분자량 약 73,000의 단백질을 제공한다(t-PA는 68,000의 분자량을 갖는다). 마찬가지로, 유로키나제의 단일 크링글(UKKaa 50-131)을 크링글 링커와 함께 아미노산 91-92 또는 261-262 사이에 t-PA 폴리머에 삽입시켜 트리스-크링글 플라스미노겐 활성화제를 제조하는 두가지의 다른 유전자를 얻는다. 마찬가지로, 표준 기술에 의해 u-PA 크링글을 적절한 링커를 사용하여 두개의 t-PA 크링글 사이에 삽입시킬 수 있다. 또한, 프로트롬빈 또는 플라스미노겐에서 발견되는 크링글을 상기 언급된 t-PA의 어느 위치에서나 분리 또는 삽입시킬 수 있다. 본 발명의 폴리-크링글 플라스미노겐 활성화제 어느 것이나 그의 제조는 언급된 단백질로부터 단일 또는 이중 크링글 영역을 분리하고 그를을 t-PA 분자 골격에 삽입시키는 동일한 기본 방식에 따른다.

유로키나제의 단일 크링글 부위(UKK)를 t-PA의 이중 크링글 영역(t-PK1 및 t-PK2)에 결합시키는데 사용되는 크링글 링커는 6 내지 10개의 천연 아미노산 부위를 함유하는 폴리펩티드이다. 바람직하게는 크링글 링커가 t-PA의 두개의 크링글 사이의 배위와 유사한 공간 배위를 유지하도록 선택된다. 그에따라, t-PA중에서 t-PK1과 t-PK2를 결합시키는 것과 동일한 L-Ser-L-Glu-Gly-L-Asn-L-Ser-L-Asp가 바람직한 링커이다. 그러나, 헥사펩타이드 L-Thr-L-Asp-L-Ala-L-Glu-L-Thr-L-Glu는 다른 사용가능한 헥사펩타이드 링커로써, 이 헥사펩타이드 링커의 N-말단 또는 C-말단상에 L-Ala, Gly, L-Ser, L-Glu, L-Thr 및 L-Asp가 어떠한 결합으로든지 사용되어 t-PA 크링글과 UK 크링글 사이에 헵타, 옥타, 노나 또는 데카펩타이드 결합물로서 더욱 허용된 구조물을 형성시킬 수 있다. 기타의 링커는 화학자에게는 자명할 것이다. 편의상, 본원의 나머지 부분에서 특정하게 언급되는 크링글 링커를 상기한 바람직한 링커로 제한하였다.

트리스-크링글 플라스미노겐 활성화제는 유로키나제와 t-PA 코드 서열을 선택된 제한효소로 제한분해시켜 목적하는 u-PA 및 t-PA 단편을 얻는 방법에 의해 제조한다. 이 단편들은 아가로즈 또는 아크릴아미드 겔상에서 분획화시키고 함께 연결시켜 클로닝 및 계속되는 발현에 적합한 벡터 또는 벡터들에 도입시킨다.

방법 및 물질

a) 효소반응

유보물질 및 DNA 변형 효소를 보관기관(New England Biolabs Inc., Beverly, MA 또는 International Biotechnologies, New Heaven, CT)으로부터 수득하였다. 대표적 제한효소 반응을 총량 50μl로 실시하였고 이어서 효소공급 기관이 추천한 방법을 따랐다. 접착 말단 DNA의 연결반응은 주로 100내지 200ng DNA 및 400단위의 T₄DNA 리게이스(N.E.Biolabs)를 함유하는 20μl 완충액중에서 15℃로 하룻밤 실시한다. 평활말단의 연결반응은 상기 반응 혼합물에 4단위의 T₄RNA 리게이스(N.E.Biolab)를 포함시킨다(참조 : Goodman, H.M , 및 MacDonald, R.J., Method.Enzymol.68, 75, 1979). 사용 완충액은 저장용 10X용액 즉, 0.5M Tris·HCl(pH 7.6), 0.1M MgCl₂및 0.1M DTT(디티오트레이톨)로서 조제한다.

b) 올리고뉴클레오타이드의 합성

본원에서 기술하는 모든 올리고뉴클레오타이드는 포스포트리에스테르 방법(참조 : Crea et al., Proc, Nat'l, Acad.Sci.USA 75, 5765, 1978)에 따라 유전자 기기(Gene Machin Model 380A, 제공기관은 캘리포니아주 포스터시 소재 Biosystems Inc.)를 사용하여 합성하였다. 이들을 연결반응에 사용하기 전에, 200내지 500ng DNA, 10단위의 T₄DNA 키내이스, 0.5mM ATP 및 키내이스 완충액(0.05M Tris·HCl, pH 7.6, 10mM MgCl₂5mM DTT)을 함유하는 용량 50μl중에서 가인산 반응시킨 후 37℃에서 반시간 유지시켰다. 하이브리드화 프로우부(hybridization probe) 용도를 위해서는 올리거머를 100μ Ci γ³²p-ATP(5,000Ci/m mol, Amersham, Arlington Heights, II.)로 방사능 식별(radio label)시킨다(참조 : the procedure of Maxam, A, M. 및 Gilbert, W.Method Enzymol 65, 499(1980).

c) DNA 절편의 분리

DNA 절편을 0.5 내지 1.5% 아가로우스 겔(agarose gel)을 통한 전기영동으로 처음 분리하였다. 전기영동은 트리-보레이트-EDTA(TBE) 완충액(0.089M Tris, 0. 089M 붕산, 2mM EDTA, pH 8.0)중에서 약 100볼트로 2 내지 4시간 실시하였다. DNA 밴드는 겔을 0.5μg/ml 에티디움 브로마이드 용액으로 염색처리하여 자외선등으로 가시화(可視化)한다(참조 : Sharp et al., Biochem 12, 3055, 1973). DNA 밴드를 포함하는 아가로우스를 가위로 비어내어 겔로부터 전기 용출시켰다(참조 : Maniatis et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual.P.164, 1982). DNA를 일류 팁-디 컬럼(Elutip-d column)을 통해 정제하였다(참조 : Schlcicher and Schnell, Keene, NH) DNA를 에탄올로 침전시킨다. 원심분리기(Eppendrf microfuge)로 15분간 처리한 후, 펠리트 70% 에탄올로 1회 세척하고 진공하에 건조시켜 50μl의 탈이온화한 물에 용해시킨다.

d) 미니 플라스미드 제조

적당한 항생제를 함유하는 2ml의 LB(Luria Bertani) 매체에 단일 박테리아 군락을 접종시키고 격렬하게 진탕시키면서 37℃로 하룻밤 유지시킨다. 약 1.5ml의 배양기를 사용하여 자비방법(boiling method, 참조 : Maruiatis et al., loc, Cit p.366)으로 플라스미드 DNA를 분리한다. 잔류 배양은 추후 사용을 위해 -20℃에서 15% 글리세롤중에 보존한다. DNA를 10μg RNase/ml의 물 40μl에 용해시킨다. 1회 제한효소분석에 있어 약 8μl 정도면 충분하다.

e) 플라스미드 DNA의 대규모 제조

대표적으로 1l의 LB 매체를 단일 박테리아 군락으로 접종시킨다. 플라스미드 DNA를 클로람페니콜로 중량시킨 후, 박테리아 세포를 수확하고 자비방법(참조 : Holmes, D.S 및 Quigley, M.Anal Biochem 114, 193, 1981)에 따라 분쇄한다. 플라스미드 DNA를 염화세시움 구배원심분리(gradient centrifugation)이나 세파로스 4B 컬럼; (Pharmacia, Uppsala, Sweden)의 컬럼 크로마토그라피로 정제한다(참조 : Maniatis et al., loc, Cit, pp, 93-96); 통상 배양기 1l당 약 400μg의 DNA를 회수한다.

f) 벡터

dG-부가 pBR 322 플라스미드 DNA(Bethesta Research Laboratories, Inc., Gaithers burg, MD)을 사용하여 t-PA 및 u-PA를 위한 cDNA를 클로운 성장시켰다.

pBR 322의 상세한 분자구조는 문헌(참조 : Maniatis et al., loc, cit, pp 5 및 488)에 기재되어 있다. 재조합 pBR 322로 형질전환 시키는데 사용되는 E. Coli류는 HB1이 또는 MM 294이다(Maniatis et al., loc cit, p. 504) t-PA 및 u-PA 유전자로부터 DNA 절편을 서브 클로우닝(subclonlng)한 모든 것은, puc 플라스미드-lac z 및 암프실리네이스 유전자를 함유하는 일련의 pBR 322 유도 벡터 중에서 실시한다. 또한 플라스미드는 아래 보이는 바와 같이 lac z에 서열-복수클로우닝 또는 제한 부위를 함유한다.

II 부위상의 클로우닝은 어느거나 X-갈(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 β-D-갈락토사이드 함유 지시판상의 청색 벡터 군락을 배경으로 하는 백색 재조합 군락의 형태를 보아 감식할 수 있다(참조 : Ruther, Mol. Gem Gemetics 178, 475, 1980). 재조합 puc 플라스미드로 형질전환시키는데 사용되는 E, Coli류는 JM 103이다. puc 플라스미드 및 이 콜라이 JM 103는 파르마치아 파엘 바이오케미칼스(Pharmacia Biochemicals, Milwaaukee, W.I.)로부터 입수하였다.

g) 숙주/벡터 계

1. 미생물계

본 명세서에 기술된 조작은, 이 콜라이 K-12군주 JM 103(PL-Biochemicals) 및 이.콜라이 K-12군주 MM 294(ATCC 제33625호) (한국 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1987년 1월 6일, 기탁번호 : KCTC 8213P, 8214P 및 8215P) 미생물을 사용하여 수행한다. 본 발명의 조작에 사용될 수 있는 다른 미생물에는 다른 유용한 이.콜라이 균주 및 바실러스속(Bacilli), 예를 들면 바실러스 섭틸리스(Bacillus Subtilis)가 포함된다. 이들 미생물은 모두 이종 유전자 서열을 복제하고 발현시킬 수 있는 플라스미드를 이용한다.

효모에서의 발현계는 이.콜라이 및/또는 효모(Saccharomyces cerevisiae)에서 선별 및 복제할 수 있는 플라스미드를 이용한다. 효모에서 선별하는 경우에, 플라스미드는 트립토판의 원 영양체인 형질 전환된 trp-효모 균주(RH 218)를 제공하는 TRP 1 유전자를 함유한다. 효모 발현용 벡터는 효모와 이.콜라이 사이를 왕복한다. 이 플라스미드는 다음의 성분들을 함유한다 : 1) 복제원 및 암피실릴 내성 유전자를 함유하는 PBR 322로부터 유도된 DNA 단편, 2) 효모 TRP 1 유전자, 3) 플라스미드를 효모내에서 고도의 안정성으로 복제할 수 있도록 하는 효모 2μ DNA, 4) 효모 유전자로부터의 프로모터(promoter) 영역, 예를 들면 알코올 탈수소 효소, α 인자 글리세르알데히드-3-인산 탈수소 효소등, 및 5) 발현계에서 적절한 종결 및 mRNA의 폴리아데닐화에 사용될 수 있는 해독 개시 및 전사 종결 서열.

2. 포유류의 세포 배양계

본 발명에는 이종 단백질의 생성에 허용되는 벡터를 복제하고 발현시킬 수 있는 포유류의 세포라인(cell line)을 사용할 수 있다. 포유류의 세포 라인으로는 예를 들면, Cos-7, WI 38, 3T 3, CHO, 헬라 세포 및 C 127 세포가 있다. 사용된 벡터는 1) 바이러스(SV 40, 아데노, 폴리오마, BPV) 또는 세모 염색체 DNA로부터 유도된 복제원, 2) 프로모터, 3) 리보좀 결합 부위와 같은 해독 개시 시그널, 및 4) RNA 진행(processing)시그널, (RNA 스플리싱(splicing), 폴리아데닐화 및 전사 종결서열)을 함유한다. 본 발명의 발현용 벡터의 특정 예에는 BPV 바이러스성 복재원, 마우스 메틸로티오네인 프로모터 및 SV 40 RNA 진행 시그널이 사용된다. 벡터는 또한 포유류 세포 배양물과 이.콜라이 사이를 왕복할 수 있다. 이는 이.콜라이 DNA 복제원 뿐만 아니라, 이.콜라이 암피실린 내성의 선택가능한 표지물(marker)을 제공하는 PBR 322 서열의 유도체를 함유한다. 이들 서열은 플라스미드 pML-2d로부터 유도된다.

Bam H1 접착 말단을 함유하는 편집된 하이브리드 플라스미노겐 활성화제 유전자(edited hybrid plasminogen activator gene)를 먼저 플라스미드 341-3(Low MF et al., Md, Cell, Bid F 3, 2110, 1983)의 Bg 1II 부위에서 마우스 메탈로티오네인 전사 프로모터 요소와 SV 40초기영역 전사 진행 시그널사이에 삽입한다. 플라스미드 142-6(ATCC 제37134호)를 Bam H1으로 분해시킨 후에 수득된 완전한 BPV 제놈을 유일한 Bam H1 부위에 연결시킨다. 플라스미드 341-3은 또한 PML 2, 즉 세균 세포에서 플라스미드 복제를 허용하는 pBR 322 유도체를 함유한다. 본 발명에서 작제된 발현용 플라스미드는 염색체 외성 에피좀으로서만 마우스 C-127세포에서 복제할 수 있다. 발현용 벡터는, 예를 들어 유전자에 고도의 발현도 또는 삽입 약제 내성(예 : 네오마이신 내성)을 위한 특이 증진 요소를 첨가함으로써 더 변형시킬수 있다.

트리스-크링글 플라스미노겐 활성화제

조직 플라스미노겐 활성화제(t-PA) m RNA

정상인의 섬유아세포(WI-38세포)로부터 이소티오시아네이트 방법(Maniatis et al., loc, cit, p. 196)에 의해 전 RNA를 분리시키는데, 이 세포는 내피세포 성장 인자(ECGF) 및 헤파린에 의해 자극되어 t-PA를 생성하였다. 동일하게 자극된 세포는 유로키나제를 생성한다. 전 RNA로부터 올리고-데옥시티미딘(dT)-셀룰로즈 칼럼 상에서 크로마토그라피하여 mRNA를 수득한다(Aviv et al., Proc. Nat'l, Acad. Sci. USA 69, 1408, 1972). mRNA를 15 내지 30% 자당 밀도 구배로 원심분리하여 더 분별하고 개개의 mRNA 분획은³²P-프로우브로 하이브리드화한다(후술하는 바와 같이). t-PA 메시지(약 20 내지 24s)를 함유하는 분획을 모아 상보 DNA(cDNA)의 제조에 사용한다.

상보 DNA

전술한 바와 같이 모은 mRNA(5μg)를 사용하여 2본쇄 cDNA를 수득하고, cDNA를 말단 뉴클레오타이드 전이효소를 사용하여 폴리데옥시사이티딜레이트(폴리 dc)로 호모폴리머 말단 부가한다. 생성물은, Pst1로 분해하여 폴리데옥시구아닐레이트(Poly dG)로 말단부가된 pBR 322와 아닐링시킨다. 아닐링된 DNA를 사용하여 적당한 이.콜라이 294 세포를 형질 전환시키고 배양하여 약 10⁵개 클론을 수득한다(Maniatis et al., loc cit., P 229).

t-PA 클론의 선별 및 동정

32p-ATP로 방사 표지한 후 마음 3개의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 재조합 클론의 도서관(library)을 선별한다. 이들 올로고머는 t-PA 분자의 아미노산 서열 34 내지 39(17mer), 253 내지 258(18mer) 및 523 내지 527(15mer)에 해당한다(Pennica, D. et al., Nature, 301 214, 1983) :

17mer : 5'-CCACTGTTGCACCAGCA-3'-,

18mer : 5'-CACATCACAGTACTGCCA-3'-,

15mer : 5'-CGGTCGCATGTTGTC-3'

약 20개의 콜로니가 합쳐진 탐침과 강한 동족관계에 적절한 것으로 나타났다. 이들 콜로니를 재평판 도말하고 재 하이브리드화하면 양성 시그널을 갖는 16개의 클론이 수득된다. 이들 클론으로부터 제조된 플라스미드 DNA를 니트로셀룰로즈 상에 블로팅하고 개개의 탐침으로 하이브리드화한다. 2개의 클론(42와 62a)에 중간(18mer) 및 3'말단(15mer) 탐침 둘다에 대해 하이브리드화 된다. 플라스미드를 Pst 1로 효소 분해하면 제42번 클론이 2kb 이상의 최대 삽입체를 1.1, 0.6 및 0.4kb의 단편 3개의 형태로 함유하는 것으로 나타난다. 클론(pWP 42)의 완전한 제한 지도는 첨부된 도면 제2도에 도시하였다. 이러한 클론은 5'- 및 3'- 비해독된 영역을 함유하는 2600개 염기쌍의 t-PA 유전자에 대한 전장서열을 함유한다.

t-PA 유전자의 편집

대략 10μg의 pWP 42 플라스미드 DNA를 37℃에서 2시간 동안 9단위 xhO II로 분해시킨다.

반응 혼합물을 1.2% 아가로즈 겔 위에 번지게 하고 1618bp DNA 단편을 아가로즈 겔 속에서 전기영동으로 분리한다. 이.콜라이 폴리머라제 1(클레노우 단편)과 d NTPs(4개의 데옥시 뉴클레오타이드 트리포스페이트-dATPs, dGTP, dCTP 및 dTTP)로 접착말단을 채운 후, 1μg의 개질된 DNA를 300mg의 포스포릴화 Sal 1링커로 밤새 연결시킨다. 페놀/클로로포름 추출 및 에탄을 침전 후, DNA를 Sou의 Sal 1로 4시간 동안 분해하고 반응 혼합물을 1% 아가로즈 겔에 가하여 목적하는 DNA 단편을 분리한다.

Sal 1말단이 있는 DNA를 Sal 1로 절단한 pUC 13에 연결시키고 이.콜라이 JM 103 세포를 형질전환시키는데 사용하며 세포를 암피실린과 x-gal 평판상에 도달한다. 8개의 암피실린 내성 백색 콜로니를 선별하고 성장시켜 미니-플라스미드 제제를 제조한다. 2개의 클론(pt PS 34B 및 pt PS 39)는 필요한 DNA단편을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 10μg의 pt PS 39 플라스미드 DNA를 Bam H1로 완전히 분해시키고 Nal 1을 아가로스 겔 위에 퍼지게 하여 t-PA의 c-종결 말단을 코드화하는 1288bP 단편을 수득한다.

t-PA 유전자의 5' 말단은 10μg의 pWP 42을 37℃에서 8시간 동안 Hga 1의 4단위로 분해시켜 수득한다. 515bP 단편은 1% 아가로즈 겔 속에서 전기 영동으로 분리한다. 이 DNA 단편의 접착말단을 DNA 폴리머라제 1(클레노우 단편)과 dNTPs 속에 충진시킨 다음, 생성물을 Sma 1절단 pUC 13에 연결시킨다. 이.콜라이 JM 103 세포를 형질환시킨 후, 대략 75암피실린 내성 백색 콜로니를 수득한다. 24개의 콜로니를 성장시켜 미니플라스미드 제제를 제조한다. 미니 플라스미드 대형을 Nar 1로 분해하여 클론 17개는 어느배향에도 필요한 삽입물을 갖는 것을 밝혀졌다. 비등법을 이용하여 암피실린을 함유하는 1.0l의 LB 배지에서 클론(pt PHga 4) 1개를 성장시켜 다량의 플라스미드 DNA를 수득한다. Pt PHga 4 플라스미드 DNA를 Bam H1과 Nar 1로 분해한 다음, 1.2% 아가로즈 겔 상에서 전기영동시켜 t-PA의 N-종결말단을 코드화하는 434bP DNA 단편을 분리한다.

1288bP DNA(300ng)와 434bp DNA(100ng)를 밤새 연결시켜 1722bp DNA 단편을 수득한다. Bam 1 절단 pUC 13에 연결시킨 후 이 JM 103를 사용하여 이.콜라이 103세포를 형질 전환시킨다. 1000 이상의 암피실린 내성 콜로니를 수득한다. 12개의 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 비등법으로 제조한다. 플라스미드 DNA는 각각 Bam H1, Nar 1 및 Xho로 절단하여 동정한다. 생성된 모든 플라스미드는 필요한 1722bP DNA 단편을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 플라스미드(pt PBM 1) 1개를 대규모 플라스미드 DNA 제제에 사용한다. 이 플라스미드 Bam H1로 절단하는 경우 완전한 t-PA 분자를 코드화하는 1722bP DNA로 된다. pt PBM 1클론 제한지도와 이의 제형의 도식도는 제3도에 도시되어 있다.

유로키나제 플라스미노겐 활성화제(u-PA)

u-PA 클론의 선별 및 동정

t-PA 유전자가 유도된 10⁵재조합 세균성 클론의 도서관을 문헌의 방법에 의해 방사능 표지된 18량체 탐침자로 선별한다[참조 : Grunstein et. al., Proc. Nat'1, Acad. Sci, U.S.A., 72, 3961, (1975)]

Gene Machine(바이오시스템 적용)을 이용하는 표준 포스포트리 에스테르 방법으로 합성한 탐침은 유로키나제 유전자(aa 173-179)의 중간 부위에 상응하는 올로고머 서열(5'-GTAGATGGCCGCAAACCA-3')을 나타낸다. 약 13개의 클론은 강한 하이브리드화 시그널에 적절한다. 이들 클론을 테트라사이클린을 함유하는 2ml의 LB 배지에서 성장시켜 미니 플라스미드 제형을 제조한다. 미니플라스미드 제제를 10μg/ml의 RNAse를 함유하는 40μl의 H₂O에 용해시킨다. 이렇게 제조된 약 8μl의 DNA를 1단위의 Pst 1로 분해시키고, 생성물을 1% 아가로즈겔 상에서 진기영동으로 분리한다. 하나의 클론(PUK 53)은 길이가 1.2, 0.4 및 0.1kb인 3개의 삽입물 형태로 1.7kb의 커다란 삽입물을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 유로키나제의 완전한 3'-말단뉴클로타이드 서열은 Pst 1로 절단한 1.2kb DNA 단편에 존재한다. 유전자의 5' 말단 서열은 문헌에 의한 뉴클레오타이드 서열화를 통하여 유로키나제 단백질의 시그널 단백질 코드영역의 첫번째 10아미노산에 상응하는 대략 30개의 뉴클레오타이드가 없는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 상실된 뉴클레오타이드에 상응하는 이중 DNA 서열을 합성하여 현존하는 유전자에 연결시킨다.

유로키나제 유전자의 편집

유로키나제 플라스미드(pUK 53) DNA를 Nco 1 및 Mst II로 절단하고 생성물은 1% 아가로즈겔 상에서 전기영동에 의해 분리한다. 1198bp의 DNA 단편은 전기 용출에 의해 분리시킨다. Nco 1절단 부분에 상응하는 DNA 단편의 5' 돌출 말단은 dNTP's 및 이.콜라이 DNA 폴리머라제(클레노우 단편)으로 충진시킴으로써 평활 말단화한다. 다음에 DNA를 Sma 1 절단 pUC 13에 연결시키고 형질전환된 플라스미드를 적절한 이.콜라이 JM 103 세포를 형질전환시키는데 사용한다. 삽입물의 Nco 1부위는 DNA가 pUC 13의 Sma 1부위에 연결될 때 재생된다. 세포를 암피실린 및 x-gal 평판상에 도말하여 미니플라스미드 제제를 백색콜로니로부터 제조한다. 미니플라스미드 DNA 제제를 Nco 1 및 Sal 1으로 분해시켜 약 1200bp의 DNA단편을 수득한다. 양성 클론(pUKNM-3')으로부터의 대규모 플라스미드 DNA 제제가 제조되며, 이를 Nco 1 및 Sal 1으로 분해시켜 다량의 약 1200bp의 DNA 단편을 수득한 다음 이를 예비 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분리시킨다.

유로키나제 단백질의 5' 시그널 펩타이드 코드화 영역의 첫번째 10개의 아미노산에 상응하는 약 30개의 뉴클레오타이드를 제조하기 위하여 pUK 53 플라스미드 DNA를 먼저 Pst 1으로 분해시킨 다음 400bp DNA 단편을 분리시킨다. 다음에 DNA를 ScrFI로 처리하여 DNA의 242bp 단편을 수득한다. DNA의 접착말단을 dNTP's 및 이.콜라이 DNA 폴리머라제 1(클레노우 단편)으로 충진시킨다.

2개의 상보 올리고뉴클레오타이드 서열, 38 및 42염기(길이)는 부족한 아미노보조제(-9 내지 -20)에 대비하기 위하여 Gene machine상에서 합성시킨다. 이때 적절한 해독 판독 프레임을 보유하며 Sal 1로 절단한 pUC 13내에 아클로닝시키기 위하여 DNA의 양말단상에 Sal 1서열을 제공한다. 2개의 올리고머를 리가제 완충액 (50mM 트리스 HCl, ph 7.6, 10mM MgCl₂, 10mM 디티오트레이톨)중에서 동몰량으로 혼합하고 80℃로 5분 동안 가열하고 약 1시간 동안에 실온으로 냉각시킨다. 이와같이 형성된 이중의 2개의 상보 뉴클레오타이드 서열(약 1μg)을 리가제 완충액중, 4℃에서 400단위의 T₄DNA 리가제를 사용하여 16시간 동안 약 300ng의 242 bP DNA 단편에 연결시킨다. 연결된 혼합물을 1.2%의 아가로즈 겔상에서 전기 영동에 의해 분리시키고 약 320 bp DNA 단편은 전기용출에 의해 분리한다. 이 단편(약 20ng)을 100ng의 Sal 1로 절단한 pUC 13에 연결시키고 벡터를 사용하여 적절한 이.콜라이 JM 103세포를 형질 전환시킨다. 세포는 암피실린 X갈 평판상에 도말한다. 12개의 백색 콜로니를 선별하여 성장시켜 미니플라스미드 제제를 제조한다. 미니 플라스미드 제제는 Sal 1으로 절단한다. 예상 320 bp DNA 삽입물을 함유하는 1개의 클론은 플라스미드 DNA의 대규모 제제로 성장한다. DNA를 Sal 1 및 Nco 1으로 절단하여 예비 아가로즈 겔 전기영동시켜 260 bp DNA 단편을 수득한다.

유전자의 333 bp 부위에 통상적인 Nco 1제한 부위를 갖는 260 bp DNA 및 1200 bp DNA 단편을 연결시키기위해, 동몰량으로 혼합한다. 연결된 생성물을 Sal 1으로 절단하고, 반응 혼합물은 예비 1% 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분리한다. 1460 bp DNA 단편은 전기용출에 의해 분리시킨다. 이 DNA를 Sal 1로 절단한 pUC 13에 연결시키고 이 플라스미드를 사용하여 암피실린 및 X-gal 평판상에 도말한 적절한 이.콜라이 JM 103 세포를 형질 전환시킨다. 12개의 백색 콜로니를 선별하여 성장시켜 비등법에 의해 미니플라스미드 제제를 제조한다. 미니플라스미드 제제를 Sal 1으로 절단하면, 1개의 클론(pUKBM)은 목적하는 1460 bp DNA 삽입물을 함유한다. pUKBM을 곧 용적으로 상장시키면 플라스미드 DNA가 제조된다. 합성링커를 함유하는 5' 말단으로 부터 올리고뉴클레오타이드 서열은 Maxam-Gilbert법에 의해 서열화하여 동정한다.

pUKBM 플라스미드 중의 DNA 삽입물은 번역 개시 코돈 AUG(리이더 서열에서 -20aa) 및 말단 코돈 TGA를 함유하도록 설치한다. 이 완전한 유전자는 시그널 펩타이드의 20개 아미노산(-1 내지 -20) 및 완전 유로키나제 단백질의 411 아미노산을 코드화 한다.

실시예 1

(UKaa^1-131-Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp)^1-91t-PA

제1도의 화합물(a)에서 시그널 펩타이드(a·a·-35 내지 -1) 및 n-말단 펩타이드(a·a·1 내지 91)영역을 함유하는 t-PA 서열을 시그널 펩타이드 (a·a·-20 내지 -1) 및 유로키나제의 첫번째 131개의 아미노산을 함유하는 아미노산 서열로 대체한다. u-PA 서열은 헥사펩타이드 L-Ser-L-Glu-Gly-L-Asn-L-Ser-L-Asp를 코드화하는 올리고뉴클레오타이드서열을 통해 t-PA의 첫번째 크링글(tPK1)에 연결시킨다.

약 10μg의 플라스미드 pUKBM을 표준 조건하에서 EcoR 1 및 Mst 1으로 분해시킨다. 반응 혼합물은 150볼트에서 3시간 동안 1.2% 아가로즈 겔을 통해 전기영동 시킨다. DNA 밴드를 가시화하기 위하여 에티듐 브로마이드로 겔을 염색한 후 452 bp DNA 단편을 분리시키고 정제시킨다. 이 DNA 단편은 리이더 또는 시그널 펩타이드(20개의 아미노산)에 대한 코드화 정보 및 유로키나제유전자의 N-말단 및 크링글 영역(a·a·1 내지 131)에 대한 코드화 정보도 함유한다.

t-PA-des a·a 1-91 서열을 얻기위해서, 약 10μg의 재조합 플라스미드 pt PBM-1을 Ava II로 완전히 분해시키고 1.2% 아가로즈 겔 상에서 전기영동에 의해 749 bp DNA 단편을 분리시킨다. 이 단편을 올리고머 링커를 가한후 EcoR 1으로 분해시켜 354 bp DNA 단편을 수득한다(참조 : 실시예 2 및 제7도) 354 bp DNA는 헥사펩타이드 링커와 t-PA 펩타이드(a·a·92-204)-118 아미노산 서열을 코드화한다. 동몰량의 전단락에서 제조된 452 bp DNA 단편과 354 bp DNA 단편을 T₄DNA 리가아제를 사용하여 15℃에서 16시간 동안 연결시킨다. 반응 혼합물을 1.2% 아가로즈 겔 상에서 전기영동에 의해 분리시키고 806 bp 크기에 상응하는 DNA 밴드를 용출 및 정제한다. 약 100ng의 806 bp DNA 단편을 약 20μl의 용적으로 EcoR 1 pUC 13(위스콘신주 밀워키소재의 Pharmacia P-L Biochemicals, Inc)으로 처리된 BAP(세균성 알칼리성 포스파타제) 약 300ng과 연결시킨다. 용액 약 1/4을 사용하여 이.콜라이 JM 103 세포를 형질 전환시킨다.[참조 : Viera, J. 및 Messing, J., Gene 19, 259(1982)]. 12개의 백색 재조합 콜로니로 부터 제조된 미니플라스미드 DNA를 표준 조건하에서 EcoR 1으로 분해시킨다. 필요한 삽입물을 함유하는 1개의 클론, pt pUK-806을 Bam H1 및 Nar 1으로 분해시키고 1. 2% 아가로즈 겔 상에서 전기 영동에 의해 분리시킨다. 519 bp 단편에 상응하는 DNA 밴드를 절단하여 용출 및 정제한다.

동일한 과정에 따라, pt PBM-1을 Bam H1 및 Nar 1으로 분해시켜 1300 bp DNA 단편을 수득한다. 동몰량의 519 bp 와 1300 bp DNA 단편을 사용하여 하기 문헌에 기술된 표준 공정에 따라 연결시킨다[참조 : Goodman, H.M., 및 MacDonald, R.J., Method. Enzymol 68, 75, (1979)]. 연결된 혼합물을 페놀 : 클로로포름(1 : 1) 혼합물로 2회 추출하고 DNA를 2배 용적의 무수에탄올을 사용하여 침전시킨다. 펠렛을 50μl의 H₂O에 용해시킨 후, DNA를 표준시험 조건하에 Bam H1으로 분해시키고 1% 아가로즈 겔 상에서 전기영동에 의해 분리시킨다. 1819 bp -함유 DNA 단편을 절단하여 겔로부터 용출시키고 정제한다. 이 DNA 단편은, UKaa^1-131-Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp)^1-91-t-PA (제1(a)도 참조)에 상응하는 573개의 아미노산으로된 완전 하이브리드 또는 트리스-크링글 PA 분자와 단일 펩타이드(20개의 아미노산)에 필요한 모든 코드화 정보를 함유한다.

이어서, 트리스-크링글 유전자를, 완전 발현 벡터로 작용하는 Bgl Ⅱ로 절단한 발현 벡터인 소의 파팔로와 바이러스(BPV)에 연결시킨다. 통상의 배양에 의해 제1(a)도의 트리스-크링글 플라스미노겐 활성화제가 수득된다.

유로키나제 크링글 서열의 제조

실시예 2 및 3에서는, 유로키나제의 크링글 부분(a·a·50-131)만을 이용하여 t-PA의 이중 크링글 부위전 또는 후에 삽입한다. 제6도에는 재조합 플라스미드 pUK 53으로부터 a·a·51-131을 코드화하는 뉴클레오타이드 서열의 제조방법이 도술되어 있다. 아미노산 131에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 바로 뒤에 적절한 제한부위 Mst 1이 존재한다. 그러나, a·a·50 주위에서는 아무것도 발견할 수 없다. 따라서, a·a·50(실시예 1에서 Nde 1)주위의 제한부위 형성을 위한 도식은 제6도와 같다. 유로키나제의 크링글 부위는 bp 284(a·a·50)에서부터 bp 530(a·a·131)까지의 뉴클레오타이드 서열에 상당한다.

약 10μg의 pUK 53 플라스미드 DNA를 Sca 1으로 분해시키는데, 유로키나제 서열중 bp 204에서 절단한다. 페놀 추출 및 에탄을 침전시킨후, DNA 펠렛을 50μl의 완충용액[10mM의 CaCl₂, 12mM의 MgCl₂, 0.2M의 NaCl, 20mM의 트리스, HCl(ph 8.0), 1mM의 EDTA]에 용해시킨다. 이 반응 혼합물에 1μl(2단위)의 뉴클레아제 Bal 31을 가하고 혼합물을 30℃에서 15초동안 배양시킨다.[참조 : Legerski, R.J., J.L.Hodnett 및 H.B.Gray, Jr., Nucleic Acid Res. 5, 145, 1978]. 5μl의 0.4M EGTA를 가하여 반응을 중지시킨다. 반응 시간은 DNA 단편의 각 말단으로 부터 약 80bb를 제거하기에 충분한 것으로 나타났다. 페놀 추출 및 에탄을 침전시킨 후, DNA를 표준반응 조건하에 올리고뉴클레오타이드 링커(10 bp )에 연결시킨다. TGGAATTCCA 서열을 갖는 올리고머 링커(EcoR 1/Nde 1링커)는 a·a·51에 상응하는 TATG서열-함유 DNA 단편 말단에 연결시, Nde 1부위(CATATG)를 생성한다. 덧붙여, 제한 부위 EcoR 1은 링커에 혼입되어 pUC 13벡터에서 후속 클로닝을 제공한다. 페놀 추출 및 에탄올 침전시킨 후, DNA를 EcoR 1으로 분해시키고 1% 예비 아가로즈 겔 상에서 전기영동에 의해 분리시킨다. 340 bp 에 상응하는 DNA 밴드를 절단하여 용출시키고 에탄올을 사용하여 침전시킨다. 이 DNA 약 40ng을 약 0.4μg의 EcoR1로 절단한 pUC 13 벡터 DNA와 연결시키고 이를 사용하여 이.콜라이 JM 103 세포를 형질 전환시킨다[참조 : Maniatis 등의 loc. cit.P.250]. 약 1000개의 재조합 콜로니를 10개의 판으로 부터 수득한다. 세균성 콜로니를 니트로-셀룰로오즈 종이 상에 놓고 방사성 올리고 뉴클레오타이드 탐침(probe)을 사용하여 동일반응계내에서 하이브리드화시킴으로써 선별한다[참조 : Grunstein 등의, Proc. Nat'l. Acad. Sci USA 72, 3961, 1975].

사용된 올리고 뉴클레오타이드는 18 bp 길이(TTCCATATGAGGGGAATC)이며, EcoR 1/Nde 1링커로부터 처음 5개의 뉴클레오타이드와 a·a·51-54에 상응하는 유로키나제 서열로부터 다음 13개의 염기를 함유한다. 약 12개의 클론은 X-선 필름상에 중간 내지 강한 시그널을 나타낸다. 이 12개의 클론으로 부터 제조된 미니플라스미드 DNA를 Nde 1으로 분해시키고 1% 아가로즈 겔 상에서 전기영동에 의해 분리시킨다. 1개의 클론, pUKKNd 16은 새로 발생된 Nde 1부위를 함유하는 것으로 나타났다. 이 플라스미드 DNA를 Nde 1 및 Mst 1으로 분해시킨 후, 1.4% 아가로즈 겔 상에서 전기영동에 의해 분리시킨다. 이 DNA 단편은 a·a·51 내지 131을 코드화 하는 유로키나제 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 빠진 a·a·50(Cys)에 대한 DNA 서열을 올리고머 링커에 혼입시킨다[참조 : 제7 및 8도].

실시예 2

91(UKaa^5-131-Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp)-92-t-PA

제1(b)도에 나타낸 바와같은 유로키나제 크링글 서열을 t-PA의 이중 크링글 영역 앞에 (즉, a·a·91과 92사이) 삽입시킨다. 전 단락에 기술된 바와같이 pUKKNd 16 플라스미드 DNA의 Nde 1 및 Mst 1분해로 유로키나제의 a·a·51 내지 131에 상응하는 246 bp 서열이 생성된다. UK 크링글 서열(246 bp )의 양 말단을, 두개의 올리고뉴글레오타이드 링커의 사용에 의해 뉴클레오타이드 462(a·a·91)과 463(a·a·92)사이의 t-PA 유전자에로 삽입한다. 후속과정이 제7도에 나타나있다.

pt PBM-1 플라스미드 DNA 약 50μg을 EcoR 1으로 분해시키고 740 bp DNA 단편을 1% 아가로즈 겔 상에서 전기영동에 의해 분리시킨다. 그다음, 이 DNA를 385 bp DNA 단편의 분리 및 정제를 위해 Sau 961(Asu 1의 이소스키죠머)를 사용하여 부분적으로 분해시킨다.

두개의 상보 올리고뉴클레오타이드 서열을, t-PA의 아미노산 91(Thr) 및 유로키나제 크링글의 아미노산 50(Cys)를 코드화하는 포스포트리에스테르 방법(Crea et al., Proc. Nat'l Acad. Sci(USA) 75, 5765, 1978)에 의해 합성한다.

올리고뉴클레오타이드 링커는 ASu 1 및 Nde 1 제한 부위에 의해 플랭킹 된다. 상부 올리고뉴클레오타이드(GGCCACCTGC)만을 그의 5' 말단에서 포스포릴화 시킨다.

385 bp DNA 단편 약 1μg을 올리고머 링커 약 1μg으로 밤새 연결시킨다. 페놀 추출 및 에탄올 침전후, DNA를 EcoR 1으로 2시간 동안 분해시키고 1.2% 아가로즈 겔 상에서 전기영동에 의해 분리시키고 394 bp DNA 단편을 수득한다. 이 DNA 단편은 t-PA의 시그널 펩타이드(35 a·a·) 및 N-말단 펩타이드 a·a·1-91를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 또한, 그것은 그의 246 bp DNA 단편에 존재하지 않는 크링글의 a·a·50(Cys)에 대한 DNA 서열을 복원한다(제6도).

C-말단 t-PA 서열, 아미노산 92 전방을 수득하기 의해서는, pt PBM-1 플라스미드 DNA 약 50μg을 Ava II로 분해시키고 747 bp DNA 단편을 1% 아가로즈 겔로부터 분리시킨다. 27 및 30 bp 길이의 두개의 상은 DNA 단편을 포스포트리에스테르 방법에 의해 합성한다. 제7도에 타나낸 바와같이, 이 DNA 링커는 헥사펩타이드 Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp를 코드화하고 또한 Ava II로 절단한 747 bp DNA중의 부족한 a·a·92 내지 94(Cys-Tyr-Glu)를 복원한다. 단지 저 올리고머(30 mer)를 그것의 5' 말단에서 포스포릴화시킨다. 747 bp DNA 약 1μg 및 올리고머 링커 1μg을 15℃에서 밤새 연결시킨다. 페놀 추출 및 에탄올 침전후, DNA를 EcoR 1으로 2시간 동안 분해시켜 1.4% 아가로즈 겔로부터 354 bp DNA 단편을 수득한다. 3개의 DNA 단편, 394 bp , 246 bp (UK 크링글) 및 354 bp 각각 약 500ng을 T₄DNA 리가제를 사용하여 밤새 연결시킨다. 페놀 추출 및 에탄올 침전후, DNA를 EcoR 1으로 분해시키고 994 bp DNA 단편을 1% 아가로즈 겔로부터 분리시키고 정제한다. 동몰량의 EcoR 1로 절단한 pUC 13벡터로 연결시킨 후, 이 DNA를 적당한 이.콜라이 JM 103 세포를 형질 전환시키는데 사용한다. 12개의 재조합 클론으로부터의 미니플라스미드 DNA제제를 EcoR 1으로 분해시킨다. 994 bp 의 필요한 삽입물을 함유하는 하나의 클론을 1l LB 배지중에서 성장시켜 플라스미드 DNA의 대규모 제제를 제조한다. 이 플라스미드 DNA 약 10μg을 Bam H1 및 Nar 1으로 분해시키고 700 bp 크기에 상응하는 DNA 단편을 1% 아가로즈겔로부터 정제한다.

t-PA 유전자의 3' 말단을, pt PBM-1 플라스미드 DNA 약 10μg을 BamH1 및 Nar 1으로 분해시킴으로써 수득한다. 1% 아가로즈 겔상의 전기영동에 의해 반응 혼합물을 분리시킨 후, 약 1300 bp DNA 단편을 전기용출에 의해 분리시키고 정제한다.

700 bp 및 1300 bp 크기의 두개의 DNA 단편 거의 동몰량을 밤새 연결시키고 2000 bp DNA 단편을 1%아가로즈 겔로부터 회수한다. 제한효소 Bam H1 서열에 의해 플랭킹된 이 DNA를 BPV 발현 벡터의 BgLII 부위에 삽입한다. 이 DNA는 전체 650 아미노산-시그널 펩타이드에 대한 35 아미노산 및 완전 단백질에 대한 615 아미노산을 합유하는 단백질을 코드화한다. 통상적인 배양, 회수, 분리 및 정제 방법으로 제1(b)도의 트리스-크링글 플라스미도노겐 활성화제를 수득한다.

실시예 3

261-(Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp-UKaa^50-131)-262-tPA

이 실시예에서는, 유로키나제 크링글 서열을 t-PA 유전자의 이중 크링글 영역 뒤, 즉, a·a·261(Cys)와 262(Ser)에 상응하는 서열들 사이에 삽입한다. 제8도는 이 트리스-크링글 PA의 제조에 관련된 여러단체를 설명하는 도면이다.

pwP 42플라스미드 DNA의 약 10μg을 Hga 1로 분해시키고 400bp DNA단편을 1% 아가로즈 겔로부터 분리시킨다. 이 DNA단편은 t-PA의 크링글 영역, 즉, 아미노산 135-261의 부분에 상응하는 서열을 함유한다.

t-PA의 이중 크링글 영역은 2개의 크링글에 연결된 헥사펩타이드와 함께 아미노산 92 내지 261 범위이라는 것을 인지할 수 있다. 2개의 DNA 서열-제8도에 나타낸 24mer 및 21mer-로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 링커를 포스포트리에스테르 방법을 사용하여 합성한다. 이 올리고머 링커를 헥사펩타이드 링커 뿐만 아니라 uk 크링글의 부족한 아미노산 50(Cys)을 코드화하고 Hga 1 및 Nde 1에 대해 제한 효소 서열에 의해 플랭킹된다. 단지 상부 올리고뉴클레오타이드 23mer를 그것의 5'말단에 포스포릴화시키고 그것을 t-PA로부터 400pb DNA단편의 Hga 1말단에 연결시킨다. 421bp DNA 생성물을 예비 1% 아가로즈겔로부터 분리시킨다.

t-PA의 크링글 부분을, pwP 42 플라스미드 DNA 10μg을 RSA 1로 분해시킨 후 1.2% 아가로즈겔로부터 501 bp DNA를 분리시킴으로써 수득한다. 제8도에 나타낸 바와같이 22염기의 2개의 상보 올리고뉴클레오타이드 서열을 포스포트리에스테르 방법에 의해 합성한다. 이 DNA 링커는 그것의 5' 말단에서 501bp DNA에 연결되는 경우 262 내지 268로부터 부족한 아미노산을 복원한다.

501pb DNA 약 1μg 및 링커 DNA 1μg을 밤새 연결시키고 523bp크기에 상응하는 DNA 밴드를 1% 아가로즈겔로부터 정제한다.

크기 421bp, 246bp(UK 크링글) 및 523bp의 DNA 단편 3개를 15℃에서 16시간 거의 동몰량으로 연결시킨다. 페놀추출 및 에탄올 침전후, DNA를 Eco R1으로 절단한 다음 741bp의 DNA 단편을 분리한다. 두개의 Eco R1 제한 부위에 의해 플랭킨된 이 DNA를 상술한 바와같은 pUC 13벡터계로 증폭시킨다.

다수의 클로닝부위에서 Eco R1 부위가 제거된 pt PBM-1플라스미드 DNA 10μg을 Eco R1으로 완전히 분해시킨 다음 약 4.0kb의 더 큰 벡터 DNA 단편을 1% 아가로즈겔로 부터 분리시킨다. 거의 동몰량의 Eco R1 절단한 벡터 DNA 및 741 bp DNA를 연결시키고 그 생성물을 사용하여 적절한 이.콜라이 JM 103세포를 형질 전환시킨다. 12개의 재조합 클론으로부터 제조된 미니플라스미드 DNA를 BamH 1으로 분해시켜 약 1.8kb의 목적하는 삽입물을 얻었다. 삽입물중의 741bp DNA의 정확한 배향은 플라스미드 DNA를 Nar 1 및 Mst 1으로 분해시켜 측정한다. 하나의 클론, pt puHYc는 Nar 1 및 Mst 1로 분해시키는 경우, 정확한 배향에서 약 700bp의 단편을 함유하는 것으로 밝혀졌다.

pt puHYC 플라스미드 DNA를 BamH 1로 분해시킴에 의해 수득된 1.8kb DNA는 제1(c)도의 생성물에 상응하는 완전 단백질에 대한 615아미노산 및 시그널 펩타이드에 대한 35 아미노산-650 아미노산의 단백질 하이브리드 c를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하며, pHyb-AMTBPV-113(한국 기탁기관 : 한국 과학기술원, 기탁일 : 1987년 1월 6일, 기탁번호 : KCTC 8213P)은 BPV발현 벡터에 있다.

그후 트리스-크링글 유전자는 완전한 발현 벡터로서 작용하는 Bgl II로 절단한 소의 파팔로마 바이러스(BPV)로 연결시킨다. 통상의 배지는 제1도(C)의 트리스-크링글 플라스미노겐 활성화제를 수득한다.

테트라-크링글 플라스미노겐 활성화제 프로트롬빈 cDNA

프로트롬빈 유전자용 cDNA클론을 프라이즈너 등의 문헌(Friezner et al., Biochemistry, 22, 2087, 1983)의 방법에 따라 인체간의 cDNA 도서관으로부터 분리시킨다. 클론 pPTR은 579아미노산의 완전단백질에 대한 완전한 코드화정도를 함유한다. 프로트롬빈의 이중 크링글부위는 아미노산 65(bp 319)로부터 아미노산 248(bp 840)까지, 184 아미노산 펩타이드로 증폭된다.

두개의 크링글 PTK 1(아미노산 65-143) 및 PTK 2(아미노산 170-248) 각각은 79 아미노산 길이이며 또한 26 아미노산 길이의 펩타이드(아미노산 144-169)에 의해 연결된다.

프로트롬빈 이중크링글 서열의 제조

이중크링글 영역을 나타내는 DNA 서열은 프로트롬빈 cDNA로부터 2단계로 분리된다(제12도).

제1단계에서, pPTR 플라스미드 DNA 10μg을 AVal으로 분해시킨 다음 706bp DNA를 1% 아가로즈겔로부터 분리시킨다. 이 DNA를 Bal 31로 7.5초간 처리하여 DNA의 한 말단으로부터 약 38bp를 제거한다(Legerski et al., Nucleic Acid Res., 5, 145, 1978). 페놀추출 및 에탄올 침전후, DNA를 Eco R1 링커, GGAATTCC에 4℃에서 15시간 연결시킨다. 이 링커는 서열 CTGAG 또는 TGAG(아미노산 67, Glu)로 끝나는 DNA로 연결하는 경우 이중 크링글(아미노산 67)의 N-말단에서 Mst II (CCTGAGG)에 대해 새로운 제한 서열을 생기게 할 것이다. EcoRI로 절단한 후, 630bp크기의 DNA단편을 분리시킨다. 이어서 이 DNA는 Eco RI/pUC 13과 동몰량으로 연결시킨 후, 적절한 이.콜라이 JM 103세포를 형질변환시키는데 사용된다. 목적하는 클론에 대한 초기 스크리닝은 아미노산 66 내지 68의 뉴클레오타이드 서열을 함유하는,³²p 표시탐침, GAATTCCTGAGGGTCTG와 하이브리드화에 의해 수행한다. x-레이 필름상에 강한 시그널을 나타내는 12개의 클론은 미니플라스미드 제조시에 성장한다. 플라스미드 DNA를 Mst II 및 Bam H1로 분해시킨 후, 하나의 클론, pPTK5는 필요한 약 630bp와 322bp에서 새로 생긴 Mst II 부위를 함유하는 것으로 밝혀졌다.

제2단계는 상술한 바와같이 유사한 시도를 사용하여, 아미노산 248 주위에 크링글영역의 3'r 말단의 편집을 포함한다. pPTK-5' 플라스미드 DNA 약 10μg은 Bam H1으로 완전히 분해시킨다. 그후 DNA를 Bal으로 30℃에서 15초간 처리하여 DNA의 양 말단으로부더 약 82bP를 제거한다. 페놀추출 및 에탄올 침전후, DNA를 Eco R1/Fsp 1링커, CGCAGAATTCTGCG로 연결시킨다. 이들이 암시하는 바와같이 링커는 TG-로 끝나는 모든 DNA 서열에서 Fsp 1 서열(TGCGCA)을 생기게 한다. Eco R1으로 완전히 절단한후, 546bp DNA를 1.2% 아가로즈겔로부터 분리한 다음 Eco R1로 절단한 pUC 13에 연결시킨다. 그후 재조합 플라스미드를 사용하여 적절한 이.콜라이 JM 103 세포를 형질 전환시킨다. 약 1000재조합 클론을³²P-표지 올리고머를 사용하여 서열 CTCAACTATTGCGCAGAA(아미노산 245 내지 248)로 그위치에서 스크리닝한다. 12잠재클론으로부터 제조된 플라스미드 DNA는 Mst II 및 Fsp 1로 절단한 다음 1% 아가로즈겔상에 계속 수행한다. 하나의 클론, pPT 2k는 546bp크기의 목적하는 삽입물을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이 DNA는 이중 크링글 부위에 총 182 아미노산, 아미노산 57-248을 코드화한다. 65(Cys) 및 66(Ala)부위에서 나머지 2개의 아미노산의 뉴클레오타이드 서열은 제13도에 도시한 바와같이 올리고머 링커를 통해 가한다.

실시예 4

91(PTKaa^65-248-Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp)-92-t-PA

프로트롬빈의 이중 크링글 서열, 아미노산 65-248을 t-PA의 이중 크링글 부위앞에(아미노산 91과 92사이에) 삽입하여 테트라크링글- PA를 생기게 한다.

전술한 바와같이, pPT 2k 플라스미드 DNA의 MST II+Fsp I 또는 EcoR1 분해로 프로트롬빈의 아미노산 67 내지 248을 코드화하는 546bP DNA 단편을 수득한다. 두개의 올리고뉴클레오타이드 링커를 사용하여, 246bp DNA의 양 말단을 뉴클레오타이드 462(아미노산 91) 및 463(아미노산 92)사이의 t-PA 유전자에 삽입한다.

펩타이드 링커-Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp는 물론 t-PA의 아미노산 92 내지 204에 대한 뉴클레오타이드 서열을 함유하는, 354bp DNA는 실시예 2 및 제7도에 기술된 바와같이 제조된다. 동몰량의 354bp DNA 및 546bp DNA(프로트롬빈 크링글)을 40℃에서 16시간 연결시킨다. DNA를 EcoR1으로 절단한 다음 900bp DNA단편을 아가로즈겔로부터 분리시킨다.

Eco R1로 절단한 pUK 13벡터로 연결시킨 후 이 DNA를 사용하여 이.콜라이 JM 103세포를 형질전환시킨다. 12개의 재조합 클론으로부터 수득된 미니플라스미드 제제를 Eco R1 및 Mst II로 분해시킨다. 하나의 클론, pPT 2k TPK는 900bp의 필요한 삽입물을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이 DNA는 프로트롬빈에 대한 아미노산 182개(아미노산 67-248)헥사펩타이드 서열 및, t-PA에 대한 아미노산 112개(아미노산 92-1204), 즉 총 300개의 아미노산을 코드화한다.

pt PBM-1 플라스미드를 Eco R1 및 Asu 1으로 분해시켜 수득된 385bp DNA의 제제는 제7도에 기술되어 있다. 각각 12bp의 2개의 상보 올리고뉴클레오타이드 서열을 포스포트리에스테르 방법에 의해 합성한다. 이 링커는 프로트롬빈 크링글 영역의 손실로 아미노산, Cys 및 Ala를 복원하며, Asu1 및 Mst II 인식 서열에 의해 플랭킹된다. 약 500ng의 DNA(385bP)를 제13도에 도시한 포스포릴화 링커 1μg으로 연결시킨다. Eco R1으로 절단한 다음, 402bp DNA단편을 분리시킨다. 약 동몰량의 402bp DNA와 900bp DNA를 연결시키고, Eco R1으로 절단한 다음, 1302bp DNA 단편을 1% 아가로즈 겔로부터 분리시킨다. 이 DNA를 Eco R1 절단 pUC 13벡터중에 아클로닝시킨다. 12개의 재조합 클론으로부터 분리된 플라스미드 DNA를 Eco R1으로 분해시킨다. 필요한 삽입물을 함유하는 클론 pNPT 2KPAK를, 플라스미드의 대규모제제를 위하여 성장시켰다. 플라스미드 DNA를 Bam H1으로 완전히 분해시킨 다음, Nar 1으로 부분적으로 분해시켜 986bp DNA단편을 수득한다.

마찬가지로, pt PBM -1을 Bam H1 및 Nar 1으로 분해시켜 1300 bp DNA단편을 수득한다. 2개의 DNA 단편 986bp와 1300bp 등몰량을 연결시키고 Bam H1으로 절단한 다음 2286bp DNA 단편을 1% 아가로즈 겔 전기영동으로부터 분리시킨다.

Bam H1서열에 의해 플랭킹된 DNA를 BPV 발현벡터의 Bgl II부위에 삽입시킨다. 이 DNA는 총 752의 아미노산-시그널 펩타이드에 대하여 35의 아미노산 및 완전 단백질에 대하여 717의 아미노산을 코드화한다. 약 92, 000의 개략적인 분자량을 갖는 완전 단백질은 프로트롬빈 이중 크링글 영역, 헥사 펩타이드 링커 및 527아미노산의 완전 t-PA 서열로부터의 184의 아미노산을 함유한다.

하이브리드 플라스미노겐 활성화제의 발현 및 생화학적 특성

제1(a)도 및 제1(b)도에 도시된 2개의 하이브리드 플라스미노겐 활성화제(h-PA)를 BPV-I 기본발현 벡터계에서 발현되도록 제조한다. 이를 h-PA'S를 각각 본 명세서에서는 하이브리드 A 및 하이브리드 B로 칭한다.

하이브리드 A(1.8kb, 제5도) 및 하이브리드 B(2.0kb, 제7도)에 대해 Bam HI에 플랭킹된 완전 유전자서열을 Bgl II절단 플라스미드 P 341-3(구체적으로는 "방법 및 재료"를 참조)에 삽입시킨다. 12개의 재조합 클론으로부터의 미니플라스미드 제제를 제조하고 각각 Nar I, Bgl II 또는 Bam HI 및 Ava I으로 분해시킨다. 이를 사용하여 하이브리드 유전자의 존재를 확인하고 삽입배향을 측정한다. 단 하나의 유전자배양, 즉 메탈로티오네인 프로모터의 방향은, 이것이 유전자 발현을 프로모터의 제어하에 위치시키기 때문에 바람직하다. 또한, 유전자 직후방에 위치한 SV 40 폴리-A 서열은 유전자의 효과적인 해독을 위하여 이의 3'-말단에서의 폴리아데닐화에 의해 유전자의 RNA 전사를 진행시키게 될 것이다. 2개의 제조합 클론 pHyb AMT-43(하이브리드 A의 경우) 및 pHyb BMT-50(하이브리드 B의 경우)을 수득한다.

전술된 클론으로부터 수득된 약 1μg의 플라스미드 DNA를 Bam HI으로 분해시킨 다음, 세균성 알칼리포스파타제로 탈-포스포릴화시킨다. 여기에 완전 8.0kb Bam HI 절단 BPV-1 제놈을 삽입한다.

하이브리드 A와 하이브리드 B를 코드화하는 유전자를 함유하는 2개의 발현 플라스미드 pHyb-AMTBV-438 및 pHyb-BMTBPV-504[간단하게는 p 438 및 p 504(한국 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1987년 1윌 6일, 기탁번호 : KCTC 8214 P 및 8215P)로 칭한다]를 수득한다. 발현 플라스미드의 다양한 성분들의 상대적인 위치를 보여주는 완전지도는 제14도에 도시되어 있다.

하이브리드 t-pA/유로키나제 분자를 코드화하는 유전자를 함유하는 두 발현 플라스미드를 마우스 c 127세포내로 인산 칼슘 침전법에 의해 형질 전이시킨다[참조 : Graham 등의 virology, 52, 456(1973)]. 다형적으로 형질 전환시킨 세포의 좌를 제대 배양시키고 유전자 발현에 대해 스크리닝한다.

배지에서 섬유소 용해활성에 대한 초기 스크리닝은 제15(a)도에서 보는 것처럼 섬유소-한천 평판상에서 행한다. [참조 : Ploug등의 Biochim. Biophys. Acta, 24, 278(1957)] 각 형질전이로부터, P 504(한국기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1987년 1월 6일, 기탁번호 : KCTC 8215P) (하이브리드 B)를 갖는 형질전환된 좌 평균 50% 및 P 438(한국기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1987년 1월 6일, 기탁번호 : KCTC 8214p) (하이브리드 A)를 갖는 형질 전환된 좌 5%는 배양배지에서 양성 섬유소용해 활성을 나타낸다. 여러 고 생산자를 선별하고 개개의 좌로부터 세포 라인을 증폭시킨다. 유전자 생성물의 대부분의 예비의 생화학적 및 면역학적 특성화를 수행할 두 세포라인을 하이브리드 B에 대해 클론 5 A 5 및 하이브리드 B에 대해 클론 16C 1로 표지한다.

생화학적 특성학

하이브리드 분자의 효소활성을 섬유소-한천 분석 및 합성 기질 s-2444 및 s-2251을 사용하는 아미돌]분해 활성 분석에 의해 평가한다[참조 : Shimoda 등의 Thromb. Haemostas., 46, 507(1981)]. 약 1 내지 5단위/μl의 활성효소가 16 내지 18시간에 배지로 분비된다. 천연 t-PA 및 유로키나제가 전구체로 합성되고, 시그널 서열이 완전한 단백질이 되게 떨어진 후에 세포로부터 분비된다. 또한, t-PA 및 유로키나제 둘다는 글리코실화된다. 형질전이된 마우스 세포에 의해 분비된 h-PA'S가 천연 t-PA 및 유로키나제와 유사한 방식으로 진행되는지를 측정하기 위해, 하이브리드 분자를 SDS/폴리아그릴아미드 겔(PAGE) 전기영동 및 이어서 섬유소-한 중첩에 의해 분석한다[참조 : Granelli-Piperno 등의 J.Exp.Med., 148, 223, (1978)]. 제15(b)도에서 보여주는 것처럼, 하이브리드 B-함유 배지로부터의 활성 효소가 76,000의 분자량을 갖고 하이브리드 A로부터의 효소는 71,000의 분자량을 갖는다. 이것은 삽입된 유전자로부터 계산된 분자량에 잘 일치한다.

하이브리드 B는 t-PA정제에 사용한 방법과 유사하게 수득 배지로부터 정제한다. 아미노산 서열 분석으로, 하이브리드 B의 N-말단이, 완전한 t-PA의 N-말단 영역과 동일한 서열 : Ser-Tyr-Gln-을 가지므로 정확하게 진행되고, 또한 활성화 절단부위 Arg-I le의 아미노산에 상응하는 N-말단 서열, I le-Lys-Gly가 존재하는 것이 나타난다. 결론적으로, 수득 배지로부터 정제된 하이브리드 B가 주로, 활성화된 두개의 쇄(Chain)형태로 존재한다. 수득 배지에 프로테아제 억제제[아프로티닌(Aprotinin))을 가하면, 단일 쇄의 h-PA분자가 수득된다.

^3sS-표지된 수득 배지의 SDS/PAGE에 의한 면역침전은, 비-환원 조건하에서, 조절시료에서가 아닌 세포라인 5 A 5(하이브리드 B) 및 16C 1(하이브리드 A) 각각으로부터의 시료에서, 명백한 분자량 71, 000내지 76, 000에 상응하는 위치에서 밴드가 관찰됨을 보인다. 정제된 t-PA와 마찬가지로 5 A 5 세포로부터의 배양 배지의 섬유소 용해 활성은 항-유로키나제 항혈청에 의해서가 아닌 항-t-PA 항혈청에 의해 중화되며, 이것은 비록 하이브리드 B가 t-PA외에 유로키나제 크링글을 함유한다해도 하이브리드 B은 항-t-PA에 의해 프로테아제 영역이 인식되며, 중화됨을 제시한다. 항-유로키나제 항체는 하이브리드 분자의 유로키나제 크링글 부위에 결합될 수 있지만, 이 결합은 하이브리드 분자의 C-말단에서 프로테아제 영역에 의해 주어지는 단백질 분해 활성을 저해하지는 않는다[American Diagnostics, Inc., Greenwith, CT].

본 발명의 폴리 크링글 플라스미노겐 활성화제는 같은 방법으로 그리고 t-PA 그 자체와 같은 전달 비히클을 통해 포유동물의 혈관 이상의 치료에 사용한다. 따라서 본 발명의 폴리-크링글 플라즈미노겐 활성화제는, t-PA와 관련된 분야에 공지된 적합한 약제학적으로 허용되는 비히클에 폴리펩티드를 용해하거나 현탁시켜 약제학적 조성물로 제형화할 수 있다. 이의 혈관내 주사액 또는 침제로의 치료할 포유동물에 투여는 t-PA 자체에 이미 설정된 다음의 기술로 행한다. 체중에 대해 약 440IU/kg을 정맥내 처음 투여량으로 적당하며, 계속해서, 약 6 내지 12시간 동안 약 440IU/kg/hr을 침제로 투여하는 것이 t-PA를 사용할 때 통상적인 실행이다.

Claims

다수의 이종 폴리펩타이드 크링글을 함유하는 하이브리드 플라스미노겐 활성화제를 코드화하는 DNA서열을 함유하는 복제가능한 발현 벡터를 재조합 DNA기술로 제조한 다음, 적절한 숙주세포에 상기 발현벡터를 도입하여 형질전환시켜 형질전환된 숙주세포를 수득하고, 상기 형질전환체를 배양하여 하이브리드 플라스미노겐 활성화제를 발현시킨 다음, 하이브리드 플라스미노겐 활성화제를 회수함을 특징으로 하여, 다수의 이종 폴리펩타이드 크링글(kringles)을 함유하는 하이브리드 플라스미노겐 활성화제를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 복제가능한 발현벡터가 하이브리드 플라스미노겐 활성화제를 코드화하는 DNA 서열을 함유하고, 회수된 하이브리드 플라스미노겐 활성화제가 이종 크링글 2 내지 6개를 함유하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 복제가능한 발현벡터가 하이브리드 플라스미노겐 활성화제를 코드화하는 DNA 서열을 함유하고, 회수된 하이브리드 플라스미노겐 활성화제가 (유로키나제 아미노산^1-131-Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp)^1-91-조직 플라스미노겐 활성화제인 방법.
제1항에 있어서, 상기 복제가능한 발현벡터가 하이브리드 플라스미노겐 활성화제를 코드화하는 DNA 서열을 함유하고, 회수된 하이브리드 플라스미노겐 활성화제가 91-(유로키나제 아미노산^50-131-Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp)-92-조직 플라스미노겐 활성화제인 방법.
제1항에 있어서, 상기 복제가능한 발현벡터가 하이브리드 플라스미노겐 활성화제를 코드화하는 DNA 서열을 함유하고, 회수된 하이브리드 플라스미노겐 활성화제가 261-(Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp)-유로키나제 아미노산 50-131-조직 플라스미노겐 활성화제인 방법.
제1항에 있어서, 상기 복제가능한 발현벡터가 하이브리드 플라스미노겐 활성화제를 코드화하는 DNA 서열을 함유하고, 회수된 하이브리드 플라스미노겐 활성화제가 91-(프로트롬빈 크링글 아미노산^65-248Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp)-92-조직 플라스미노겐 활성화제인 방법.
다수의 이종 폴리펩타이드 크링글(여기서, 하나 이상의 크링글은 이종이며, 하나 이상의 크링글은 동종이다)을 함유하는 하이브리드 플라스미노겐 활성화제.
제7항에 있어서, 크링글 2 내지 6개를 함유하는 플라스미노겐 활성화제.
제7항에 있어서, 테트라-크링글 플라스미노겐 활성화제인 플라스미노겐 활성화제.
제9항에 있어서, 식 91-[PTKaa^65-248Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp)-92-t-PA인 플라스미노겐 활성화제.
제7항에 있어서, 트리스-크링글 플라스미노겐 활성화제인 플라스미노겐 활성화제.
제11항에 있어서, 식(UKaa^1-131-크링글 링커)^1-19t-PA(여기에서 크링글 링커는 6 내지 10개의 천연 아미노산을 함유하는 폴리펩타이드 잔기이다)인 플라스미노겐 활성화제.
제12항에 있어서, 크링글 링커가 L-Ser-L-Glu-Gly-L-Asn-L-Ser-L-Asp인 플라스미노겐 활성화제.
제11항에 있어서, 식 91-(UKaa^50-131-크링글링커)-92 t-PA(여기에서 크링글 링커는 6 내지 10개의 천연 아미노산을 함유하는 폴리펩타이드 잔기이다)인 플라스미노겐 활성화제.
제14항에 있어서, 크링글 링커가 L-Ser-L-Glu-Gly-L-Asn-L-Ser-L-Asp인 폴라스미노겐 활성화제.
제11항에 있어서, 식 261-(크링글 링커-UKaa^50-131)-262 t-PA(여기에서 크링글 링커는 6 내지 20개의 천연 아미노산을 함유하는 폴리펩타이드 잔기이다)인 플라스미노겐 활성화제.
제16항에 있어서, 크링글 링커가 L-Ser-L-Glu-Gly-L-Asn-L-Ser-L-Asp인 플라스미노겐활성화제.
제7항 내지 제17항중 어느 하나의 폴리펩타이드를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA단위.
유로키나제의 아미노산 1-131에 상응하는 단백질을 코드화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 DNA 단위.
유로키나제의 아미노산 51-131에 상응하는 단백질을 코드화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 DNA단위.
t-PA의 아미노산 1-261에 상응하는 폴리펩타이드를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 DNA단위.
t-PA의 아미노산 92-527에 상응하는 폴리펩타이드를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 DNA단위.
프로트롬빈의 아미노산 65-248에 상응하는 폴리펩타이드를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 DNA단위.
플라스미노겐을 제7항의 폴리펩타이드와 접촉시킴을 특징으로 하여, 플라스미노겐을 플라스민으로 전환시키는 방법.
제7항의 폴리펩타이드 유효량을 이를 필요로 하는 동물의 혈관계에 투여함을 특징으로 하여, 포유동물의 혈액응고를 방지하는 방법.