HU200795B

HU200795B - Process for producing plasminogene activators comprising multiple hooks

Info

Publication number: HU200795B
Application number: HU863509A
Authority: HU
Inventors: Paul Porwen Hung; Narender Kumar Kalyan; Shawguang Lin Lee
Original assignee: American Home Prod
Priority date: 1985-08-14
Filing date: 1986-08-08
Publication date: 1990-08-28
Also published as: GB2179948A; KR870002264A; JPH0829086B2; GB8619154D0; IL79644A; HUT41443A; EP0213794A1; PT83170B; IE59380B1; US4916071A; IE862178L; JPH07147984A; DK385686A; JP2610783B2; EP0213794B1; JPS62104577A; KR900007649B1; PT83170A; DK175420B1; PH26199A

Description

A találmány. tárgya eljárás több heterológ polipeptid horgot tartalmazó hibrid plazminogén aktivátor előállítására.

A plazminogén aktivótorok a szerint proteázok egy osztályát képezik, ezek alakítják a plazminogént plazminná. A pla2min elroncsolja a vérrögök fibrin-mátrixát, ezáltal helyreállítja egy nyitott érrendszer hemodinamikus körülményeit, miután egy belső érsérülés trombózist vagy tromboembóliát idézett elő. Az érbetegségek - beleértve a véredények részleges és teljes elzáródását amelyek plazminogén aktivótorokkal végzett kezeléssel irányíthatók, például a hűdést, tűdőembóliát, miokardiális infarktust, valamint a mélyvénás és perifériás artériás elzáródásokat.

A humán plazmában és más testfolyadékokban található plazminogén aktivátoroknak két immunológiailag elkülönült típusa van az urokináz típusú plazminogén aktivátor (uPA; Mr, 55000) és a szövet-típusú plazminogén-aktivátor (t-PA; M_r; 68000). A szövet-típusú plazminogén-aktivátor aktivitását a fibrin potencírozza. Az enzim egy vérrög helyénél működik, és nagyobb affinitást mutat a fibrinhez, mint az urokináz típusú plazminogén aktivátor [Haylaeris és munkatársai: J. Bioi. Chem., 257, 2912 (1982)). Ezért a szövet-típusú plazminogén-aktivátort tekinthetjük a fiziológiailag megfelelő trombolitikus szernek.

Mindkét aktivátorra, az u-PA-ra és a t-PA-ra jellemző, hogy 1.) egyedi láncú proenzimként szintetizálódnak, amelyeket plazminnal vagy tripszinnel el lehet hasítani anélkül, hogy diszulfid-hiddal öszekötött kétláncú molekulaszerkezetük elroncsolódna; redukció hatására mindegyik plazminogén-aktivátor elhasad egy nehéz és egy könnyű láncra (Mr 33 000 az u-PA-nál; Mr 35 000 t-PA-nál); 2.) mindkét enzim szerin-proteáz, amelyeket szerinre fajlagos reagensekkel, pl. diizopropil-fluorofoszfáttal inaktiválni lehet;

3.) mindkét enzim tartalmaz aminosavaknak egy olyan hármas diszulfid-hiddal összekötött szekvenciáját, amely hurkot vagy horgot képez a molekulában. Az urokináz plazminogén altivótornak egy egyedi horga van. A szöveti plazminogén-aktivótornak két horga van, amelyeket egy hexapeptid kapcsoló-szekvencia köt össze. Ezeket a horgokat vélik felelősnek az enzimek kötéséért a fibrinhez [Thorsen: Biochem. Biophys. Acta., 393, 55 (1975)).

A t-PA DNS szekvencia elemzését és aminosav-szekvenciáját Pennica és munkatársai [Natúré, 301, 214 (1983)], Ny és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5355 (1984)), valamint a Genentech Inc. (93,619 számú Európa szabadalmi bejelentés) közölték. Az u-PA DNS szekvencia elemzését és aminosav-szekvenciáját a Genetech Inc. közölte a 92,182 számú Európa szabadalmi bejelentésben, az urokináz cDNS-t pedig Verde és munkatársai tárgyalták [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4727 (1984)].

A találmány tárgya eljárás hibrid, harmadik generációs plazminogén aktivátorok előállítására, amelyek többszörös, heterológ polipeptid horgokat tartalmaznak. A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek 2-6 horgot tartalmazhatnak. A heterológ horgokon olyan polipeptid terméket értünk, amely legalább egy olyan horgot tartalmaz, amely egy eltérő, természetben előforduló forrásban található, vagy egy olyan további horogszerkezetet, amely azonos ezzel, és egy natív plazminogén aktivátorban . található horgokon felül található. Nyilvánvaló, hogy amikor az a cél, hogy egy közös horog-szerkezetet adjunk egy natív plazminogénaktivótorhoz a találmány szerinti hibrid plazminogén aktivátorok előállítására, a DNS-t kémiailag szintetizáljuk és a közős horoghoz tartozó DNS kodonnak különböznie kell attól, amely a natív plazminogén aktivátorhoz tartozó kódoló DNS szekvenciában található, hogy elkerüljük a rekombinációt (kihurkolódós), miközben a natív horog kívánt aminosav-szekvenciáját alkotjuk meg. A találmány szerinti eljárással előállított hibrid plazminogén aktivátorokban jelen levő horgok, bár külön-külön homológ területeket tartalmaznak, természetükben heterológok, és ennek eredményeképpen a találmány szerinti eljárással előállított plazminogén aktivátorok horgaik kombinációiban bármilyen natív plazminogén aktivátorban található kombinációktól, vagy aminosav-szekvenciájukban, aminosav-szómukban és/vagy méretükben különböznek. A találmány tárgya továbbá eljárás a hibrid plazminogén aktivátorokat kódoló gének és kulcs-fragmenseik a teljes polipeptideket kódoló DNS-t és annak kulcsfragmenseit tartalmazó kifejező vektorok, ezekkel a kifejező vektorokkal transzformáit mikroorganizmusok vagy sejttenyészetek előállítására, valamint eljárás a hibrid plazminogén aktivátorok alkalmazására.

A horog egy háromszor hurkolt polipeptid-szerkezet, amelyet három diszulfid-kötés alakít ki. A horgok hosszúsága változó, mintegy 79-82 aminosavból állnak. A humán urókinóz egyedi horga [Gunzler és munkatársai: Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 363, 1155 (1982)], a humán szöveti plazminogén-aktivátor két horga [Pennica és munkatársai: Natúré, 301, 214 (1983)], a humán protrombin két horga [Walz és munkatársai: Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 74, 1969 (1977)] és a humán plazminogén öt horga [Sottrup-Jensen és munkatársai: a Progress in Chemical fibrinolysis and Thrombolysis c.' kiadványban (szerkesztők: Davidson és munkatársai), 3, 191 (1978)] között, nagymértékű szekvencia-homológia áll fenn. A horgon belüli diszulfid hidakban jelen levő hát cisztein relatív helyzete megőrződik minden horogban. A .horog', .horgok' kifejezést ebben a bejelentésben úgy értelmezzük, mint olyan szerke3

HU 200795 Β zeteket, amelyek a fent említett fehérjékben találhatók. Az is nyilvánvaló, hogy a horog-területen polimorf formák is létezhetnek természetes formában, ahol egy vagy több aminosav van hozzáadva, törölve vagy helyettesítve. Hasonló változásokat a fehérjékben is in vitro létre lehet hozni a gén pont-mutációjával vágy bármilyen kivánt szekvenciával rendelkező gén kémiai szintézisével. Ezek a módosított szerkezetek ezért szintén beleértendők a .horog’, .horgok’ kifejezésekbe, ahogyan ebben a bejelentésben értelmezzük.

A továbbiakban részletesen bemutatjuk egy hármas horgot tartalmazó plazminogén aktivátor, valamint egy négyes horgot tartalmazó plazminogén aktivátor előállítását. Az alkalmazott módszerek azokat a módszereket illusztrálják, amelyek alkalmazhatók a találmány szerinti más polipeptidek előállításához is.

A találmány szerinti eljárással előállított hármas horgot tartalmazó plazminogén aktivátorok, amelyeket rekombináns DNS technikákkal urokináz és t-PA kiónok megfelelő genetikai kódoló szekvenciáiból alkotunk bármely natív plazminogén aktivátorral öszszevetve megnővekedett stabilitást, a fibrinhez való megnövekedett kötő-affinitást és megjavult fél-élettartamot mutatnak. A hármas horgot tartalmazó plazminogén aktiváto-roknak ezek a tulajdonságai megjavult biológiai potenciált és megjavult tárolási élettartamot eredményeznek. A hármas-horog-PA molekulát könnyebb kezelni az előállítás és tisztítás közben, mint a natív t-PA-t, mivel az utóbbi, tenyészfolyadékokban és különböző tisztítási stádiumokban található polipeptid, kis molekulatömeggel rendelkezik, és nehéz és könnyű lánc fragmensekkel társul. A négyes horgot tartalmazó plazminogén aktivátor, valamint a többi többszörös horgot tartalmazó plazminogén aktivátorok szintén ezeket a tulajdonságokat mutatják.

A találmány szerinti eljárással előállított hármas horgot tartalmazó plazminogén aktivátort az urokináz N-terminális részéből alkotjuk meg, egyedi horog területén keresztül t-PA-nak olyan részével kombinálva, amely a kettős horog terület kezdeténél vagy az előtt kezdődik, és megfelelő kapcsolón (linkeren, át történik az összekombinálás. Az urokináz egyedi horgáról ismeretes, hogy megelőzi a 131. számú aminosav helynél levő glicin gyököt, A t-PA kettős horgáról ismeretes, hogy a ciszteinnél kezdődik, amely egy 91. helyzetnél levő treonin gyököt követ. így az urokináz N-terminális vége, amely a 131. számnál levő glicin gyöknél fejeződik be, adott esetben megfelelő kapcsolón keresztül (amely kapcsoló a t-PA két hurka közti hexapeptid-kapcsolatot utánozza, egy t-PA molekulához kapcsolódik, amelyből az első 91 N-terminális aminosavat töröltük. Az így lét— 4 rejőtt hibrid molekula 46 aminosav-gyökkel nagyobb, mint a t-PA, olyan fehérje, amelynek molekulatömege mintegy 73000 (a t-PA molekulatömege 68000), az alkalmazott kapcsolótól (linker) függően. Hasonlóképpen, az urokináz egyedi horgát (UKKaa 50-131), egy horog-kapcsolóval összekötve, a t-PA polimerbe a 91-92 vagy 261-262 aminosavak közé iktatjuk be, így két különböző gént hozunk létre a hármas horgot tartalmazó plazminogén aktivátorok előállításához. Hasonlóképpen, standard módszerekkel, megfelelő kapcsolókkal a két t-PA hurok közé az u-PA horgot be lehet iktatni. Ezen kívül a protrombinban vagy plazminogénben található horgokat izolálni lehet, és a fentebb említett t-PA bármely helyére be lehet iktatni. A többszörös horgokat tartalmazó plazminogén aktivátorok bármelyikének találmány, szerinti megalkotása az említett alapon történik úgy, hogy fehérjéből egyedi vagy kettős horog területeket izolálunk, és ezeket a t-PA molekula-gerincébe beiktatjuk.

Az urokináz (UKK) egyedi horog-részének a t-PA kettős horog-területéhez (t-PKl és t-PK2, történő kötéséhez alkalmazott horog-kapcsolók olyan polipeptidek, amelyek 6-10 természetes aminosavgyökőt tartalmaznak.

A horog-kapcsolót előnyösen ügy választjuk ki, hogy ahhoz hasonló térbeli elrendeződést tartson fenn, mint amilyen a t-PA két horga között fennáll. Ilyen előnyös kapcsoló pl. az L-Ser-L-Glu-Gly-L-Asn-L-Ser-L-Asp, mivel ez azonos azzal, amely a t-PKl-et at-PK2-vel összeköti a t-PA-ban. Az L-Thr-L-Asp-L-Ala-L-Glu-L-Thr-L-Glu hexapeptid pl. egy másik alkalmazható hexapeptid kapcsoló, és L-Ala,

Gly, L-Ser, L-Glu, L-Thr és L-Asp bármilyen kombinációját lehet alkalmazni a hexapeptid kapcsoló N-terminális vagy C-terminális végeinél, hogy hepta-, okta-, nona- vagy dekapeptid kapcsolat nyitottabb szerkezetét biztosítsuk a t-PA horgok és az UK horog között. Más kapcsolók is nyilvánvalók a vegyészek számára. Egyszerűség kedvéért a továbbiakban említett horog-kapcsolóknál a fentebb említett előnyös kapcsolókra szorít- i ΐ

kozunk. í

A hármas horgot tartalmazó plazminogén 1 aktivátorokat úgy állítjuk elő, hogy uroki- !

názt és t-PA-t kódoló szekvenciákat korlátozott emésztésnek vetünk alá kiválasztott restrikciós enzimekkel, hogy a kivánt u-PA és t-PA fragmenseket nyerjük. A fragmenseket agaróz vagy akrilamid gélen végzett frakcionálással izoláljuk, ligáljuk, és klónozáshoz és az ezt követő kifejeződéshez megfelelő vektorba vagy vektorokba vezetjük be.

A továbbiakban röviden ismertetjük a bejelentés ábráit.

Az 1. ábra a találmány szerinti eljárással előállított három hármas-horgot tartalmazó plazminogén aktivátor és egy négyes-hor-35

HU 200795 Β

A 2. ábra

A 3. ábra

A 4. ábra

Az 5. ábra

A 6. ábra

A 7. ábra

A 8. ábra

A 9. ábra

A 10. ábra got tartalmazó plazminogén aktivátor vázlatos elrendezését mutatja be. A bemutatott 1. szerkezetek (a-c) sötétített része az urokináznak az uro- 5 kinéz horgot (UKK) tartalmazó részét jelenti. Az l(d, szerkezet sötétített része a protrombin (PTK1 és PTK2) kettős horog területét jelenti. A tPKl 10 és tPK2 rövidítések a szöveti plazminogén aktivátor 1. illetve 2. horgait jelentik, a pWP-42 szöveti plazminogén aktivátor rekombináns klón 15 restrikciós térképét mutatja be.

a ptPBM-1 plazmidnak a pWP42-ből való előállításánál követett technikát mutatja be. A 20 ptPBM-1 tartalmazza a teljes t-PA molekula előállításához szükséges genetikai információt.

a pUKBM plazmidnak a pUK-53 25 plazmidból való előállításánál követett techikát mutatja be.

A pUKBM tartalmazza a teljes urokináz fehérje előállításához szükséges genetikai informáci- 30 ót.

az l(a) ábrán vázolt hármas-horgot tartalmazó terméket kódoló gén előállításánál követett módszer folyamatábráját 35 mutatja be.

az urokináz 51-131, aminosavait kódoló gén (u-PA⁵¹-131) elóálUtásánál követett módszer folyamatábráját mutatja be. 40 az l(b, ábrán vázolt hármas-horgot tartalmazó terméket kódoló gén előállításánál követett módszer folyamatábráját mutatja be. 45 az l(c) ábrán vázolt hármas-horgot tartalmazó terméket kódoló gén előállításánál követett módszer folyamatábráját mutatja be. 50 az l(a) ábra termékét kódoló gén DNS szekvenciáját mutatja be, jelölve az urokináz szignál peptid területet (20 aminosav), az UKK területet (az urokináz 55 1-131. aminosavai), a hexapeptid kapcsolót és a t-PA molekula további részét (92-527. aminosavak).

az l(b) ábra termékét kódoló 60 gén DNS szekvenciáját mutatja be, jelölve a t-PA szignál peptidjét (35 aminosav), a t-PA N-terrainális részét (1-91. aminosavak), az UKK-t (az 65

A 11. ábra

A 12. ábra

A 13. ábra

A 14. ábra

A 15(a) ábra

A 15(b) ábra

A 15(c) ábra urokináz 50-131. aminosavai), a hexapeptid kapcsolót és a t-PA C-terminális részét (92— -527. aminosavak).

az l(c) ábra termékét kódoló gén DNS szekvenciáját mutatja be, jelölve a t-PA szignál peptidet (35 aminosav), a t-PA N-terminális részét (1-261. aminosavak), a hexapeptid kapcsolót, az UKK-t (az urokináz 50-131. aminosavai), és a t-PA C-terminális részét (262— -527. aminosavak,.

a protrombin kettős-horog területét kódoló gén előállításában követett módszer folyamatábráját mutatja be. az l(d) ábrán bemutatott négyes-horgot tartalmazó terméket kódoló gén előállításában követett módszer folyamatábráját mutatja be.

az A Hibrid plazminogén aktivétor [az l(a, ábrának mefelelő] és a B Hibrid plazminogén aktivátor [az l(b) ábrának megfelelő] gének C-127(egér) emlős sejtvonalban való kifejeződéséhez tervezett BPV-I alapú kifejeződő vektorrendszert mutatja be. A kifejezni kívánt gének az egér. metallotionein transzkipciós promotor elem és az SV40 korai transzkripciós szignál közé vannak beiktatva.

a PA-termeló sejtek vagy gócok átvizsgálását mutatja be fibrin agar lemezen, 10 μΐ tenyésztő tápközeget alkalmazva üregenként és 37 °C hőmérsékleten inkubálva mindaddig, amíg a tiszta zónák az üregek körül feltűnnek (2. és 7. vonalak). Az 1. vonal mutatja a standard t-PA-t a következő enzim-koncentrációkkal (egység/ml) felülről lefelé: 500; 250; 100; 50; 25; és 0.

B Hibrid, A Hibrid és szöveti típusú plazminogén aktivátorok fibrin-agar lemezen készített zimogrammját mutatja a PA-hibridek poliakrilamid gélen (PAGE) elektroforéziesel végzett elválasztása után. ³⁵S-sel jelzett A Hibrid, B Hibrid plazminogén aktivátorok autoradiogramját mutatja be radio-impulzusos közeg anti-t-PA antiszérummal végzett immuno-kicsapása és nem redukáló nátrium-dode-47

HU 200795 Β cil-szulfáton végzett elektroforézise (SDS/PAGE) után. Ismert molekulasúlyú fehérje-jelzőket (jobb oldali vonal) futtattunk egyidejűleg.

Anyagok és módszerek

a. ) Enzimreakciók.

A restrikciós ás DNS módosító enzimeket a New England Biolabs Inc.-től (Beverly, Massachussets) vagy az International Biotechnologies Inc.-től (New Heaven, Connecticut) szereztük be. Egy tipikus restrikciós enzim reakciót 50 μΐ térfogatban hajtottunk végre, követve az enzim szállítójának javasolt eljárásait.

A .ragadós végű DNS-sel végzett ligálási reakciót tipikusan 15 °C hőmérsékleten hajtottuk végre egy éjszakán át 20 μΐ pufferolt oldatban, amely. 100-200 ng DNS-t és 400 egység T4 DNS ligázt (N.E. Biolabs) tartalmazott. A tompa végű ligáláshoz 4 egység T4 DNS ligázt (N.E. Biolabs) alkalmaztunk a fenti reakciókeverékben [Goodman, H.M.; és MacDonald, R.J.: Method. Enzymol. 68, 75 (1979)]. Az alkalmazott pufferoldatot 10-szeres törzsoldatként készítettük el: 0,5 mól/liter Trisz-HC1 (pH 7,6), 0,1 mól/1 MgCh és 0,1 mól/1 DTT (ditriotreitol). .

b. ) Oligonukleotidok szintézise.

Az ebben a bejelentésben említett öszszes oligonukleotidot a foszfotriészter módszerrel szintetizáltuk [Crea és munkatársai: Proc. Nat’l. Acad. Sci. (USA), 75, 5765 (1978)], a Gene Machine 380A modellt (Applied Biosystems Inc., Foster City, California) alkalmazva. Ezek ligálési reakciókban történő használata előtt az oligomereket. 5’ végüknél foszforileztük 50 μΐ térfogatban, amely 200-500 ng DNS-t, 10 egység T4 DNS kinázt, 0,5 mmól/1 ATP-t és kinéz puffért (0,05 mól/1 Trisz-HCl, pH 7,6, 10 mmól/1 MgCh, 5 mmól/1 DTT) tartalmazott, 37 °C hőmérsékleten inkubálva fél órán át. Hibridizálási vizsgáló mintaként való alkalmazáshoz az oligomereket radioaktív jelzéssel látjuk el 100 uCi gamma³²P-ATP-vel (5000 Ci/mmól, Amersham, Arlington Heights, Illinois), Maxam, A.M. és Gilbert, W. módszerét alkalmazva [Method. Enzymol. 65, 499 (1980)].

c. ) DNS fragmensek izolálása.

A DNS fragmenseket először elektroforézissel 0,5-1,5%-os agaróz gélen elkülönítettük. Az elektroforézist mintegy 100 Voltnál, 2-4 órán át, trisz-borát-EDTA (TBE) pufferban (0,089 mól/1 trisz, 0,089 mól/1 bórsav, 2 mmól/1 EDTA, pH 8,0) végeztük. A DNS csikókat UV lámpa alatt tettük láthatóvá, a gélt 0,5 ug/ml etidium-bromid oldatban megfestve [Sharp és munkatársai: Biochem. 12, 3055 (1973)]. A DNS-t tartalmazó agaróz-csikot bo6 rotvapengével kivágtuk. A DNS-t elektroelűcióval kiszabadítottuk a gélből [Maniatis és munkatársai: Molecular Cloning, a Laboratory Manual (Molekuláris klónozás: Laboratóriumi Kézikönyv) 164. oldal /1982/]. A DNS-t tovább tisztítottuk, átengedve egy Elutip-d oszlopon (Schleicher és Schuell, Keene, New Hampshire). A DNS-t etanollal kicsaptuk. Miután Eppendorf mikrocentrifugában 15 percen át centrifugáltunk, az üledéket egyszer mostuk 70%-os etanollal, vákuumban szárítottuk és feloldottuk 50 μΐ ionmentesített vízben.

d. ) Miniplazmid DNS előállítása.

Mintegy 2 ml LB (Luria Bertani) tápközeget, amely megfelelő antibiotikumokat tartalmazott, inokuláltunk egyedi baktérium-telepekkel, és inkubáltunk 37 °C hömérséklerí egy éjszakán át élénk rázatás mellett. A tenyésztő tápközeg mintegy 1,5 ml-ét alkalmaztuk plazmid DNS izolálására forralésos módszerrel, amint ezt Maniatis és munkatársai leírták (lásd fentebb idézett munka, 366. oldal). A tenyészet maradékát 15%-os glicerinben tároltuk -20 °C hőmérsékleten későbbi alkalmazáshoz. A DNS-t 40 μΐ, 10 ug/ml RNÁ-zt tartalmazó H2O-ban feloldottuk. Mintegy 8 μΐ elegendő egy restrikciós enzimes elemzéshez.

e. ) Plazmid DNS nagyléptékű előállítása.

Tipikusan 1 liter LB tápközeget inokuláltunk egy egyedi baktérium-telepekkel. A plazmid DNS klóramfenikollal végzett sokszorozása után a bakteriális sejteket összegyűjtöttük, és ’lizáltuk a forralésos módszer szerint [Holmes, D.S. és. Quigley, M.: Anal. Biochem. 114, 193 (1981)]. A plazmid DNS-t tovább tisztítottuk vagy cézium-klorid gradiens centrifugálással, vagy oszlopkromatográfiával Sepharoee 4B oszlopon (Pharmacia, Uppsala, Svédország), amint ezt Maniatis és munkatársai leírták (fentebb idézett munka, 93-96 oldal). A kitermelés rendszerint mintegy 400 μβ DNS/liter tenyészet.

f. ) Vektor.

dG-farokkal ellátott pBR322 plazmid DNS-t (Bethesda Research Laboratories, Inc., Gaithersburg, Maryland) alkalmaztunk- a t-PA-hoz és u-PA-hoz szolgáló cDNS klónozásához. A pBR322 részletes molekulaszerkezetét Maniatis és munkatársai írják le (fentebb idézett munka, 5. és 488. oldal). A rekombináns pBR322-vel végzett transzformáláshoz E. coli HB101 vagy MM294 törzset használtunk (Maniatis és munkatársai, fentebb idézett munka, 504.oldal).

A t-PA és u-PA génekből származó DNS fragmensek szubklónozását pUC plazmidokban hajtottuk végre - ezek pBR322 eredetű vektorok, amelyek lac Z, valamint ampicillináz géneket tartalmaznak [Viera, J. és Meseing,

J.: Gene, 19, 259 (1982)]. Ezen kívül a plaz-59

HU 200795 Β midok a lac Z génen belül egy, a következő többszörös klónozó vagy restrikciós helyet tartalmazó szekvenciát tartalmazzák:

---ACGCCAAGCTTGGGCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGCGAGCTCGAATTCACTG---

A 11 hely bármelyikében való klónozást fehér rekombináns telepek megjelenésével lehet megfigyelni a kék vektor-telepek hátterében egy X-gal-t (5-bróm-4-klór-3-indolil-β-D-galaktozid) tartalmazó indikátor-lemezen [Ruther: Mól. Gén. Genetics 178, 475 (1980)]. A rekombináns pUC plazmiddal való transzformáláséhoz alkalmazott E. coli törzs a JM103. A pUC plazmidot és az E. coli JM103 törzset a Pharmacia P-L Biochemicals-tól (Milwaukee, Wisconsin) szerezzük be.

g.) Gazda/vektor rendszer

1. ) Mikrobiológiai rendszer

Az itt leírt munkát az E. coli K-12 JM103 (PL Biochemicals) és az E. coli K-12 MM294 (ATCC 33625) törzsekkel hajtottuk végre. Az eljárásban alkalmazhatunk egyéb E. coli törzseket és Baciliusokat, mint pl. Bacillus subtilist. Mindezek a mikroorganizmusok olyan plazmidokat hasznosítanak, amelyek replikálódni és heterológ génszekvenciákat kifejezni képesek.

Az élesztőben levő kifejeződő rendszerhez olyan plazmidot alkalmazhatunk, amely képes kiválasztódni és replikálódni E. coli-ban és/vagy élesztőben (Saccharomyces cerevisiae). Az élesztőben való kiválasztódáshoz a plazmid a TRP 1 gént tartalmazza, amely triptofánra prototróffá teszi a transzfornált trp* élesztőtörzset (RH 218). Az élesztő kifejeződő vektor ingázhat az élesztő és az E. coli között. A plazmid a következő alkotórészekkel rendelkezik: 1.) pBR322-ből származó DNS szegmens, amely a replikációs origót és az ampicillin rezisztencia gént tartalmazza;

2. ) az élesztő TRP 1 gén; 3.) az élesztő 2 μ DNS, amely képessé teszi a plazmidot, hogy nagy stabilitással replikálódjék élesztőben;

4.) egy promotor terület az élesztő génből, pl. alkohol dehidrogenáz, gliceraldehid-3-foszfát-dehídrogenáz, stb.; 5.) transzlációs rajt és átírási stop szekvenciák, amelyeket az mRNS kifejeződő rendszerben történő megfelelő befejezéséhez és poliadenilezéséhez lehet alkalmazni.

2. )'Emlós sejttenyészet rendszer

Heterológ fehérjék termeléséhez összeférhető vektor replikálására és kifejezésére képes emlős sejtvonalakat alkalmazhatunk a találmány szerinti eljárásban. Ilyenek pl.: Cos-7; W138; 3T3; CHO; Hela sejtek, és a C127 sejtek. Az alkalmazott vektorok tartalmaznak: 1·) egy vírusból (SV40, adeno, polyoma, BPV) vagy celluléris kromoszómáiig DNS-ből származó replikációs origót; 2.) egy promotort;

3. ) a transzlációs beindító szignálokat, mint pl. a riboszomális kötőhelyek'; és 4.) RNS kezelő szignálokat (RNS összesodró poliadenílező és átirás-befejező szekvenciák.) A találmány szerinti eljárásban alkalmazott kifejeződő vektorok előnyösen egy BPV vírus replikációs origót, egy egér metallotionein promotort és SV40 RNS kezelő szignálokat tartalmaznak. A vektor ingázhat is emlős sejttenyészet és E. coli között. Ez a pBR322 szekvenciák származékait tartalmazza, igy az E. coli ampicillin rezisztencia szelektálható markereit, valamint a DNS replikálódás E. coli origóját tartalmazza. Ezek a szekvenciák a pML-2d plazmidból származnak.

A BamHI .ragadós’ véget tartalmazó, összeszerkesztett hibrid plazminogén aktivátor gént először beiktatjuk 0,341-3 plazmid (Law M.F. és munkatársai: Mól. Cell Bioi. F 3, 2110 (1983)] BglII helyre az egér metallotionein átírási promotor elem és az SV40 korai terület átírási szignáljai közé. A 142-6 plazmid (ATCC 37134) BamHI-vel végzett emésztése után nyert terjes BPV genomot ligáljuk az egyedi BamHI helyre. A 341-3 plazmid szintén tartalmaz pML2-t, amely egy pBR322 származék, és amely lehetővé teszi a plazmid replikálódását baktériumsejtekben. Az itt megalkotott kifejeződő plazmid kizárólag C-127 7

-611

HU 200795 Β egér-sejtekben tud replikálódni, extrakromoszomális episzómaként. A fertőzött sejteket a transzformált fenotípusra nézve lehet kiválogatni. A kifejeződő vektor további módosítása is lehetséges, pl. a nagyobb aranyu kifejeződés érdekében fajlagos fokozó elemek hozzáadása, vagy gyógyszerrezisztencia (pl. neomicin rezisztencia) beiktatása a génbe.

HÁRMAS-HURKOT TARTALMAZÓ PLAZMINOGÉN ÁKTIVÁTOR

Szöveti plazminogén áktivátor Hírvivő (messenger) RNS

Teljes RNS-t izoláltunk izotiocianátos módszerrel (Maniatis és munkatársai, fentebb idézett munka, 196. oldal) normál humán fibroblaszt sejtekből (WI-38 sejtek), amelyeket előzőleg stimuláltunk endotelíális sejtnővekedési faktorral (ECGF) és heparinnal t-PA termelése érdekében. Ugyanezek a stimulált sejtek termelnek urokinázt. Hírvivő RNS-t (mRNS) nyertünk a teljes RNS-ből egy oligo-dezoxitimidin (dT)-cellulóz oszlopon végzett kromatográfiával [Aviv és munkatársai: Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 69, 1408 (1972)]. Az mRNS további frakcionálását 15-30%-os szacharóz gradiensben végzett centrifugálással végeztük, és az egyes mRNS frakciókat ^P-vizsgáló mintákkal hibridizáljuk (amint ezt alább leírjuk). A t-PA .üzenetet' tartalmazó frakciókat (kb. 20-24 S) összegyűjtöttük a komplementer DNS (cDNS) előállításához.

Komplemeneter DNS

Az előző pontban leírt módon összegyűjtött mRNS-t (5 ng) használtuk kétszálú cDNS előállítására, és a cDNS homopolimer, polidezoxieitidil (poli-dC) farkakkal láttuk el terminális nukleotid transzferázt alkalmazva. A terméket összeforrasztottuk Pstl-el emésztett, polidezoxi-guanilát (poli-dG) farkakkal ellátott pBR322-vel. Az összeforrasztott DNS-t alkalmaztuk kompetens E. coli 249 törzsek transzformálására, amelyeket tenyésztettünk, hogy mintegy 10* bakteriális kiónt nyerjünk (Maniatis és munkatársai, fentebb idézett munka, 229. oldal).

t-PA klón átvizsgálása és azonosítása ³²P-ATP-vel · végzett radioaktív jelzés után a kővetkező három oligonukleotidot alkalmaztuk rekombináns kiónok könyvtárának átvizsgálásához. Ezek az oligomerek a t-PA molekula [Pennica, D. és munkatársai: Natúré, 301, 214 (1983)] 34-39. aminosavainak (17-mer), 253-258. aminoavainak (18-mer), és 523-527, aminosavainak (15-mer) felelnek meg: a 17-mer: 5'-CCACTGTTGCACCAGCA-3’; a 18-mer: 5’-CACATCACAGTACTCCCA-3’; a 15-mer: 5’-CGGTCGCATGTTGTC-3’. Mintegy 20 telep mutatott mérsékelttől-erősig terjedő homológiát az 'összegyűjtött vizsgáló minták8 kai. Ezeknek a telepeknek az újból lemezre helyezése és újra-hibridizálása 16 pozitív jelt mutató kiónt adott. Az ezekből a kiónokból készített plazmid DNS-t nitrocellulóz lemezre itattuk és egyedi vizsgáló mintákkal hibridizáltuk. Két klón (42 és 62a) hibridizálódott mind a középső (18-mer), mind a 3’-vég (15-mer) vizsgáló mintákkal. A plazmid DNS Pstl-gyel végzett, enzimes emésztése azt mutatta, hogy a 42. számú klón tartalmazta a több, mint 2 kilobázis (Kb) nagyságú legnagyobb beiktatást három fragmens (1,1; 0,6 és 0,4 Kb) formájában. A klón (pWP42) teljes restrikciós térképét a 2. ábra mutatja be. Ez a klón tartalmazza a t-PA génhez tartozó teljes hosszúságú szekvenciát, amely 2600 bp-t tartalmaz, és amely magában foglalja az 5'és 3'- le nem fordított területekét.

A t-PA-gén összeszerkeaztése . Mintegy 10 Mg pWP42 plazmid DNS-t emésztettünk 9 egység XhoII-vel 37 °C hőmérsékleten 2 órán át. A reakciókeveréket 1,2%-os preparatív agaróz gélen futtattuk, és egy 1618 bp-s · DNS fragmenst izoláltunk elektroforézissel. Miután a kohéziv végeket kitöltöttük E. coli polimeráz I-el (Klenow-fragmens) és a dNTP-kel (a négy dezoxinukleotid trifoszfát: dATP, dGTP, dCTP és dTTP), 1 Mg igy módosított DNS-t ligáltunk egy éjszakán át 300 ng foszforilezett Sáli línkerrel. Fenol/kloroformos extrakció és etanoios kicsapás után a DNS-t 50 egység Sall-el emésztettük 4 órán át, és a reakciókeveréket 1%-os preparatív agaróz gélre tápláltuk, hogy izoláljuk a kivánt DNS fragmenst.

A Sáli végekkel rendelkező DNS-t Sall-el hasított pUC 13-hoz ligáltuk, · és ezt a terméket felhasználtuk E. coli JM 103 sejtek transzformálására; az így nyert sejteket ampicillint és X-galt tartalmazó lemezekre szélesztettük. Nyolc ampicillin rezisztens, fehér telepet különítettünk el és növesztettünk, hogy miniplazmid készítményt készíthessünk. Két kiónról (ptPS34B és ptPS39) úgy találtuk, hogy tartalmazza a kívánt DNS fragmenst. 10 Mg ptPS39 plazmid DNS-t emésztettünk teljes mértékben BamHI-vel és Narl-el, és ezt a terméket preparatív agaróz gélen futtattuk, igy egy 1288 bp-s fragmenst nyertünk, amely a t-PA C-terminélisát kódolja.

A t-PA gén 5’ végét úgy nyertük, hogy 10 Mg pWP42-t emésztettünk 4 egység Hgal-el 37 °C hőmérsékleten 8 órán ét. Egy 515 bp-s frgmenst izoláltunk 1%-os agaróz gélen végzett elektroforézissel. Ennek a DNS fragmensnek a kohéziv végeit betöltöttük DNS polímerázzal (Klenow-fragmens) és a dNTP-kkel, és az igy nyert terméket Smal-el hasított pUC 13-hoz ligáltuk. Miután az így nyert teméket E. coli JM 103 sejtekbe transzformáltuk, mintegy 75 ampicillin-rezisz-713

HU 200795 Β tens, fehér telepet nyertünk. Ezekből a telepekből 24 telepet növesztettünk abból a célból, hogy mini-plazmid készítményt állítsunk elő. A mini-plazmid készítményt Narl-el emésztettük, és 17 kiónról találtuk azt, hogy rendelkezik és kivént beiktatással, valamelyik orientációban. Egy kiónt (pt PHga 4) növesztettünk 1,0 liter, ampicillint is tartalmazó LB tápközegben, hogy nagy mennyiségű plazmid DNS-t nyerjünk, a plazmid DNS-t a forralásos módszerrel nyertük ki. A pt PHga 4 plazmid DNS-t BamHI-vel és Narl-el emésztettük, és 1,2%-os agaróz gélen elektroforézisnek vetettük alá, Így izoláltuk egy 434 bp-s DNS fragmenst, amely a t-PA N-terminálisát kódolja.

A fenti 1288 bp-s DNS-t (300 ng) és ezt a 434 bp-s DNS-t (100 ng) egy éjszakán át ligáltuk, igy egy 1722 bp-s DNS fragmenst kaptunk. Ezt a DNS-t BamHI-vel hasított pUC 13-mal ligáltuk, és az igy nyert terméket használtuk E. coli JM 103 sejtek transzformálására. Több, mint 1000 ampicillin rezisztens telepet nyertünk. 20 telepből plazmid DNS-t nyertünk a forralásos módszerrel. A plazmid DNS-t BamHI, NarI és XhoII enzimekkel egyenként végzett hasításokkal azonosítottuk. Az összes így létrejött plazmidról azt találtuk, hogy tartalmazzák a kívánt 1722 bp-s DNS fragmenst. Az egyik plazmidot (pt PBM1) alkalmaztuk nagy léptékű plazmid DNS előállításához. Ez a plazmidból BamHI-vel végzett hasítással kaptuk az 1722 bp-s DNS-t, amely a teljes t-PA molekulát kódolja. A pt PBM1 klón restrikciós térképét és előállításának vázlatos diagramját a 3. ábra mutatja be.

Urokináz plazminogén aktivátor (u-PA)

Az u-PA klón átvizsgálása és azonosítása

10⁵ rekombináns baktérium klón, amelyekből a t-PA gén származik (lásd fentebb), könyvtárát átvizsgáltuk egy radioaktívan jelzett 18-mer vizsgáló mintával Grunstein és munkatársai módszere szerint [Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 72, 3961 (1975)). A vizsgáló minta, amelyet a standard foszfotriészter módszerrel állítottunk elő Gene Machine (Applied Biosystems) berendezést alkalmazva, az 5’-GTA GAT GGC CGC AAA CCA-3’ oligomer szekvenciát mutatta, amely megfelel az urokináz gén középső részének (aa^173-179,. Mintegy 13 klón mutatott mérsékelttől erősig terjedő hibridizálási jelet. Ezeket a kiónokat 2 ml, tetraciklint is tartalmazó LB tápközegben növesztettük, és miniplazmid készítményt állítottunk elő ezekből. A miniplazmid készítményt feloldottuk 40 μΐ HzO-ban, amely 10 Mg/ml RN-ázt is tartalmaz. Mintegy 8 μΐ így előállított DNS-t emésztettünk 1 egység Pstl-el, és a terméket elektroforézissel különítettük el 1%-os agaróz gélen. A kiónról (pUK 53) úgy találtuk, hogy tartalmazza az

1,7 Kb-s legnagyobb beiktatást három beiktatás (1,2; 0,4 és 0,1 Kb hosszú) formájában. Az urokináz teljes 3’-vég nukleotid szekvenciája a Pstl-el hasított 1,2 Kb-s DNS fragmensben volt jelen. A gén 5’-végí szekvenciáját Maxam és Gilbert módszere [Methods Enzimol. 65, 1499 (1980)] szerint végzett nukleotid szekvencia elemzéssel határoztuk meg, és kiderült, hogy az urokináz fehérje szignál peptid kódoló terület első 10 aminosavának megfelelő mintegy 30 nukleotidja hiányzik. Ezért a hiányzó nukleotidoknak megfelelő kettős DNS szekvenciát szintetizáltuk és meglevő génhez ligáltuk.

Az urokináz gén ősszeszerkesztése

Az urokináz plazmid (pUK 53) DNS-t Ncol-el és MstXI-vel elhasítottuk, és a termékeket elektroforézissel elkülönítettük 1%-os agaróz gélen. Egy 1198 bp-s DNS fragmenst izoláltunk elektroelúcióval. A DNS fragmens 5’-kinyúló végét, amely az Ncol hasításnak felel meg, tompa végűvé tettük, dNTP-kkel és E. coli DNS- polimerázzal (Klenow fragmens) betöltve. A DNS-t azután Smal-el hasított pUC13-hoz ligáltuk, és ezt a módosított plazmidot alkalmaztuk kompetens E. coli JM 103 sejtek transzformálására. A beiktatott rész Ncol helyét regeneráltuk, amikor a DNS-t a pUC 13 Smal helyéhez ligáltuk. A sejteket ampicillint és X-galt tartalmazó lemezekre szélesztettük, és a fehér telepekből ’ mini-plazmid készítményeket termeltünk. A mini-plazmid DNS készítmény emésztése Ncol-el és Sall-el egy mintegy 1200 bp-s DNS fragmenst eredményezett. Egy pozitív klónböl (pUKNM-3’) nagy léptékű plazmid DNS készítést végeztünk, az igy nyert terméket pedig Ncol-el és Sall-el emésztettük, hogy nagy mennyiségű, mintegy 1200 bp-s DNS fragmenst nyerjünk, amelyet preparatív agaróz gél elektroforézissel különítettünk el.

Hogy az urokináz fehérje 5' szignál-peptidje első 10 aminosavat kódoló területnek megfelelő, mintegy 30 nukleotidot tudjuk előállítani, pUK 53 plazmid DNS-t először Pstl-el emésztettük, . és egy 400 bp-s DNS fragmenst izoláltunk. Ezt a DNS-t azután ScrFI-el kezeltük, így a DNS egy 242 bp-s fragmensét állítottuk elő. A DNS kinyúló végeit dNTP-kkel és DNS polimeráz I-el (Klenow-fragmens) töltöttük be.

Két komplementer oligonukleotid szekvenciát, 38 és 42 bázis hosszúságúakat, szintetizáltunk Gene Machine berendezésen, hogy a hiányzó aminosavhoz (-9-tól -20-ig) a megfelelő leolvasó keret megtartása és a Sall-el hasított pUC 13-ban való szubklónozáshoz a DNS mindkét végén Sáli szekvencia biztosítása mellett. A két oligomert ekvimoláris menynyiségben ligáz pufferban (50 mmól/1 trisz-HC1, pH 7,6; 10 mmól/1 MgClz, 10 mmól/1 ditiotreitol) összekevertük, és melegítettük 80 °C hőmérsékleten 5 percen át, majd hagytuk lehűlni szobahőmérsékletre mintegy 1 óra 9

-815

HU 200795 Β alatt. A két komplementer nukleotid szekvencia igy kialakított duplexét (kb. 1 pg) ligái— tűk mintegy 300 ng 242 bp-s DNS fragmenshez ligáz pufferban 4 °C hőmérsékleten 16 órán ét, 400 egység T4 DNS ligázt alkalmazva. A ligáit keveréket 1,2%-os agaróz gélen végzett elektroforézissel szeparáltuk, és egy mintegy 320 bp-s DNS fragmenst izoláltunk elektroelúcióval. Ezt a fragmenst (mintegy 20 ng) ligáltuk 100 ng, Sall-elhasitott pUC 13-hoz, és az így nyert vektort alkalmaztuk kompetens E. coli JM 103 sejtek transzformálására. A sejteket ampicillines X-gal lemezekre szélesztettük. 12 fehér telepet különítettünk el és növesztettünk, hogy mini-plazmid készítményt állíthassunk elő. A mini-plazmid készítményt Sall-el hasítottuk. Egy kiónt, amely a várt 320 bp-s DNS beiktatást tartalmazta, növesztettünk plazmid DNS nagy léptékű előállításához. A DNS-t Sall-el és Ncol-el hasítottuk, így 260 bp-s DNS fragmenst termelve preparatív agaróz gél elektroforézis után.

A 260 bp-s DNS és 1200 bp-s DNS fragmenseket, amelyek egy közös Ncol restrikciós helyet tartalmaztak a gén 333 bp helyzeténél, ekvimoláris mennyiségben összekevertük ligálásboz. A ligáit terméket Sall-el hasítottuk és a reakciókeveréket 1%-os preparatív agaróz gél elektroforézissel szeparáltuk, Egy 1460.bp-s DNS fragmenst izoláltunk elektroelúcióval. Ezt a DNS-t Sall-el hasított pUC 13-hoz ligáltuk, és az így nyert plazmidot alkalmaztuk kompetens E. coli JM 103 sejtek transzformálására; a transzformáló keveréket ampicillint és X-galt tartalmazó lemezekre szélesztettük. 12 fehér telepet választottunk ki és növesztettünk, hogy mini-plazmid készítményt állítsunk elő, az előállítást forralásos módszerrel végezve. A mini-plazmid készítményt Sall-el hasítottuk, és egy klónról (pUKBM) úgy találtuk, hogy tartalmazza a kivánt 1460 bp-s DNS beiktatást. A pUKBM-et nagy térfogatban növesztettük, hogy plazmid DNS-t kapjunk. A szintetikus kapcsolót tartalmazó 5’ végből származó oligonukleotid-szekvenciát szekvencia-elemzésnek vetettük alá Maxam és Gilbert módszere szerint, hogy bebizonyítsuk ennek valódiságát.

A pUKBM plazmidban levő DNS beiktatásról ezáltal megállapítottuk, hogy tartalmazza az AUG iniciációs kodont (met, -20 aminosav a vezető szekvenciában), valamint a TGA befejező kodont. Ez a komplett gén kódolja a szignál peptid 20 aminosavát (-1-tól -20-ig) és az érett urokináz fehérje 411 aminosavát.

1. példa (UKaa-P--^13l-Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-AspP-^3lt-PA

Az l(a) ábrán bemutatott vegyületben a szignál peptid (a.a. -35-től -1-ig) és az N-terminális peptid-(a.a. l-91)-területeket tartalmazó t-PA szekvenciát helyettesítettük egy olyan aminosav szekvenciával, amely az urokináz szignál peptidjét ía.a. -20-tól -1-ig) és az első 131 aminosavát tartalmazta. Az u-PA szekvencia a t-PA első horgához (tPKl) egy olyan oligonukleotid szekvencián keresztül kapcsolódik, amely az L-Ser-L-Glu-Gly-L-Asn-L-Ser-L-Asp hexapeptidet kódolja.

Mintegy 10 jug pUKBM plazmidot emésztettünk EcoRI-vel és Mstl-el standard körülmények között. A reakciókeveréket elektroforézisnek vetettük alá 1,2%-os agaróz gélen, 150 Voltnál 3 órán át. A gél etidium-bromiddal végzett festése után - hogy láthatóvá tegyük a DNS csíkokat -, egy 452 bp-s DNS fragmenst izoláltunk és tisztítottunk. Ez a DNS fragmens kódoló információkat tartalmaz a vezető vagy szignál pepiidre (20 aminosav), valamint az urokináz gén N-terminális és horog területére (a.a 1-131) vonatkozóan.

Abból a célból, hogy a t-PA-dez-a.a. 1-91 szekvenciát nyerjük, mintegy 10 pg ptPBM-1 rekombináns plazmidot emésztettünk teljességig Avall-vel, és · elektroforézisnek vetettük alá 1,2%-os agaróz gélen, hogy izoláljuk egy 747 bp-s DNS fragmenst Egy oligomer kapcsoló hozzáadását ehhez a fragmenshez, majd az ezt követó emésztést EcoRI-vel, hogy egy 354 bp-s DNS fragmenst nyerjünk, a 2. példában írjuk le, és a 7. ábrán ábrázoljuk. A 354 bp-s DNS a hexapeptid kapcsolót és a t-PA peptidet (a.a. 92-204) kódolja, vagyis egy 118 aminosavból álló szekvenciát. Az előző fejezetben előállított 452 bp-s DNS fragmens és a fenti 354 bp-s DNS fragmens ekvimoláris mennyiségeit ligáltuk, T4 DNS ligázt alkalmazva 15 °C hőmérsékleten 16 órán át. A reakciókeveréket elektroforézissel szeparáltuk 1,2%-os agaróz gélen, és egy DNS csíkot, amely 806 bp méretnek felel meg, eluáltunk és tisztítottunk. Mintegy 100 ng 806 bp-s DNS fragmenst ligáltunk mintegy 300 ng, BAP-pal (bakteriális alkalikus foszfatáz) kezelt EcoRI pUC 13-al (Pharmacia P-L Biochemicals, Inc., Milwaukee, Wisconsin) mintegy 20 pl reakciótérfogatban. Az oldat mintegy 1/4-ét alkalmaztuk kompetens E· coli JM 103 törzsek transzformálására Viera J. és Messing J. eljárása szerint [Gene, 19, 259(1982)]. 12 rekombináns fehér telepből készített mini-plazmid DNS-t hasítottunk EcoRI-vel standard körülmények között. Egy kiónt, a ptPUK-806-ot, amely a kivánt beiktatási tnrtnlmnzta, emésztettük BamHI-vei és Narl-el, és az igy nyert terméket elektroforézissel szeparáltuk 1,2%-os agaróz gélen. Egy 519 bp-s fragmensnek megfelelő DNS

-917

HU 200795 Β sávot elhasítottunk, eluáltunk és tisztítottunk. Azonos eljárást követve, egy 1300 bp-s DNS fragmenst nyertünk ptPBM-1 emésztésével BamHi-vel és Narl-el. Az 519 bp-s és 1300 bp-s DNS fragmensek ekvimoláris menynyiségeit alkalmaztuk ligáláshoz, Goodman H. M. és MacDonald R.J. standard módszerét [Method, Enzymol. 68, 75 (197-9)] követve. A ligációs keveréket kétszer extraháltuk fenol/kloroform 1:1 eleggyel, és a DNS-t kétszeres térfogatú abszolút etanollal kicsaptuk. Az üledéket feloldottuk 50 μΐ HíO-ban, majd a DNS-t BamHI-vel emésztettük standard meghatározási körülmények között, és elkülönítettük elektroforézissel 1%-os agaróz gélen. Egy 1819 bp-s DNS fragmenst kihasítottunk, eluáltuk a gélről és tisztítottuk. Ez a DNS fragmens tartalmazza az összes kódoló információt, amely a szignál peptidhez (20 aminosav) és az 573 aminosavból álló érett hibridhez vagy hármas-horgot tartalmazó PA molekulához szükséges, ez a molekula megfelel az l(a) ábrán bemutatott (UKaa¹ ¹³¹-Ser-GluGly-Asn-Ser-Asp)¹'⁹¹-t-PA-nak.

A hármas-horog gént ezután BglII-vel hasított szarvasmarha papilloma vírus (BPV) kifejeződő vektorhoz ligáltuk, amely mint komplett kifejeződő vektor szolgál. Hagyományos tenyésztés az l(a) ábra szerinti hármas-horgot tartalmazó plazminogén aktivátort eredményezi.

Urokináz horog szekvencia megalkotása

A 2. és 3. példákban csak az urokináz horog-részét (a.a. 50-131) használjuk és iktatjuk be a t-PA kettős horog területe előtt vagy után. A 6. ábra mutatja be egy olyan nukleotid szekvencia megalkotását a pUK 53 rekombináns plazmidból, amely az 51-131 aminosavakat kódolja. Itt van egy kellemes restrikciós hely, az MstI, éppen a 131. aminosavnak megfelelő nukleotid szekvencia után. Semmi sem található azonban az 50. aminosav körül. így az 50. aminosav körül egy restrikciós helyet alakítottunk ki (ebben a példában Ndel), amit vázlatosan, a 6. ábra szemléltet. Az urokináz horog-területe megfelel a 284 bp-től (50. aminosav) az 530 bp-ig (131. aminosav) terjedő nukleotid szekvenciának.

Mintegy 10 ug pUK 53 plazmid DNS-t emésztettünk teljességig Scal-el, amely a 204 bp-nál hasítja az urokináz szekvenciát. Fenolos extrakció és etanolos kicsapás után a DNS üledéket feloldottuk 50 μΐ pufferoldatban [10 mmól/1 CaCk, 12 mmól/1 MgClz; 0,2 mól/1 NaCl:. 1,20 mmól/1 trisz-HCL (pH 8,0), 1 mmól/1 EDTA]. A reakciókeverékhez 1 μΐ (2 egység) Bal 31 nukleázt adtunk, és a keveréket 30 °C hőmérsékleten inkubáltuk 15 másodpercen át [Legerski R.J., Hadnett J.L. és Gray H.B.Jr.: Nucleic Acid Rés. 5, 145 (1978)]. A reakciót 5 μΐ 0,4 mól/l-es EGTA hozzáadásával állítottuk le. Ezt a reakcióidőt alkalmasnak találtuk kb. 80 bp eltávolítására a DNS fragmens mindegyik végéről. Fenolos extrahálás és etanolos kicsapás után a DNS-t egy oligonukleotid kapcsolóhoz (10 bp) ligáltuk standard reakciókörülmények között. A TGGAATTCCA szekvenciájú oligomer kapcsolót (EcoRI)Ndel kapcsoló) úgy terveztük meg, hogy egy Ndel hely (CATATG) alakuljon ki, amikor a TATG szekvenciát (amely az 51. aminosavnak felel meg) tartalmazó DNS fragmens véghez ligáljuk. Ezen felül a EcoRI restrikciós helyet is beépítettük a kapcsolóba a későbbi pUC 13 vektorba történő klórozáshoz. Fenolos extrahálás és etanolos kicsapás után a DNS-t EcoRI-vel emésztettük, ée 1%-os preparatív agaróz gélen végzett elektroforézissel szeparáltuk. Egy 340 bp-nek megfelelő DNS csikót kivágtunk, eluáltunk és etanollal kicsaptuk. Mintegy 40 ng ilyen DNS-t ligáltunk mintegy 0,4 ug, EcoRI-vel hasított pUC 13 vektor DNS-hez, és ezt használtuk kompetens E. coli JM 103 sejtek transzformálására (Maniatis fentebb idézett munkája, 250. oldal). Mintegy 1000 rekombináns telepet nyertünk 10 lemezről. A bakteriális telepeket replika-lemez módszerrel nitro-cellulóz papírra vittük, és in situ hibridizálással átvizsgáltuk, radioaktív oligonükleotid vizsgáló mintát alkalmazva [Grunstein és munkatársai: Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 72, 3961 (1975)]. Az alkalmazott oligonukleotid vizsgáló minta 18 bp hosszúságú (TTCCATATGAGGGGAATG) volt, és az Eco RI/Ndel kapcsolóból származó első öt nukleoditot és az urokináz szekvenciából származó következő 13 bázist (amely az 51-54 aminosavaknak felel meg) tartalmazta. Mintegy 12 klón mutatott mérsékelttól-erös jelet röntgenfilmen. Ebből a 12 kiónból készített miniplazmid DNS-t Ndel-el emésztettük, és elektroforézissel szeparáltuk 1%-os agaróz gélen. Egy klónról, a pUKKNdl6-ról azt találtuk, hogy tartalmazza az újonnan létrehozott Ndel helyet. Ezt a plazmid DNS-t, Ndel-el- és Mstl-el végzett emésztés után, elektroforézissel szeparáltuk 1,4%-os agaróz gélen, és igy egy 246 bp-s DNS fragmenst nyertünk. Ez a DNS fragmens tartalmazza az 51-131 aminosavakat kódoló urokináz nukleotid szekvenciát. A hiányzó 50. (Cys) aminosavhoz tartozó DNS szekvencia beépül az oligomer kapcsolóba, amint ezt a 7. és 8, ábra mutatja.

2. példa

91-(UKaa?°-'^í31-Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp)-92-t-Pa

Az l(b) ábrán bemutatott urokináz horog szekvenciát beiktatjuk a t-PA kettős horog területe elé, vagyis a 91. és 92. aminosavak közé. Amint az előző példában leírtuk, a pUKKNd 16 plazmid DNS Ndel és MstI emésztése egy 246 bp-s szekvenciát hoz létre, 11

-1019

HU 200795 Β amely az urokináz 51-131. aminosavainak felel meg. Az UK horog szekvencia (246 bp) két végét két oligonukleotid kapcsolón keresztül beiktattuk a t-PA génbe a 462. (91. aminosav) és 463. (92. aminosav) nukleotidok közé. A követett eljárást a 7. ábra mutatja be.

Mintegy 50 pg ptPBM-1 plazmid DNS-t emésztettünk EcoRI-vel, és egy 740 bp-s DNS fragmenst izoláltunk elektroforézissel 1%-os agaróz gélen. Ezt a DNS-t azután Sau 961-el (az Asu 1 izoskizomerje) részlegesen emésztettük egy 385 bp-s DNS fragmens izolálásához és tisztításához.

Két komplementer oligonukleotid szekvenciát szintetizáltunk a foszfotriészter módszerrel (Crea és munkatársai: Proc. Nat’l. Acad. Sci. (USA), 75, 5765 (1978)], amely oligonukleotidok a t-PA 91. aminosavát (Thr) és az urokináz horog 50. aminosavát (Cys) kódolják:

	Thr	Cys
GGCC	ACC	TGC ·
G	TGG	ACGAT	- 5’
Asul			Ndel

Az oligonukleotid kapcsoló Asul és Ndel restrikciós helyekkel van szegélyezve. Csak a felső oligonukleotid (GGCCACCTGC) van foszforilezve 5’ végénél.

Mintegy 1 pg 385 bp-s DNS fragmenst ligáltunk egy éjszakán át mintegy 1 pg oligomer kapcsolóval. Fenolos extrahálás és etanolos kicsapás után a DNS-t 2 órán át emésztettük EcoRI-vel, és elektroforézissel 1,2%-os agaróz gélen, egy 394 bp-s DNS fragmenst választottunk el. Ez a DNS fragmens tartalmazza a szignál pepiidet (35 aminosav) és a t-PA N-terminális 1-91. aminosavait kódoló nukleotid szekvenciákat. Ezen kívül helyreállítja az UK horog 50. aminosavóhoz (Cys) tartozó DNS szekvenciát amely nincs jelen 246 bp-s DNS fragmensében' (6. ábra).

Abból a célból, hogy a t-PA szekvencia C-terminálisát megkapjuk, 92 aminosavval előre, mintegy 50 pg ptBM-1 plazmid DNS-t emésztettünk Avall-vel, és egy 747 bp-s DNS fragmenst izoláltunk 1%-os agaróz gélről. Két komplementer 27 illetve 30 bázispár hosszúságú DNS fragmenst, szintetizáltunk foszfotriészter módszerrel. Amint a 7. ábrából látható, ez a DNS kapcsoló a Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp hexapeptidet kódolja, és .szintén helyreállítja a hiányzó 92-94. aminosavakat (Cys-Tyr-Glu) az Avall-vel hasított 747 bp-s DNS-ben. Csak az alsó oligomer (30-mer) van foszforilezve 5’ végénél. Mintegy 1 pg 747 bp-s DNS-t és 1 pg oligomer kapcsolót ligáltunk egy éjszakán át 15 °C hőmérsékleten. Fenolos extrakció és etanolos kicsapás után a· DNS-t 2 órán át emésztettük EcoRI-vel, igy egy 354 bp-s DNS fragmenst nyertünk 1,4%-os agaróz gélről. A három fenti 12

DNS fragmens, 394 bp, 246 bp (UK horog) és 354 bp, mindegyikéből mintegy 500 ng-ot ligáltunk egy éjszakén át, T4 DNS ligázt alkalmazva. Fenolos extrahálás és etanolos kicsapás után a DNS-t EcoRI-vel emésztettük, és egy 994 bp-s DNS fragmenst izoláltunk és tisztítottunk 1% agaróz gélről. Ezt a DNS-t, ekvimoláris mennyiségű, EcoRI-vel hasított pUC 13 vektorral végzett ligálás után alkalmaztuk kompetens E. coli JM 103 sejtek transzformálására. 12 rekombináns kiónból készült mini-plazmid DNS készítményt emésztettünk EcoRI-vel. Egy kiónt, amely tartalmazza a kívánt .994 bp-s beiktatást, 1 liter LB tápközegben növesztettünk a plazmid DNS nagy léptékű előállításához. Mintegy 10 pg ilyen plazmid DNS-t emésztettünk BamHI-vel és Narl-el, és egy 700 bp méretnek megfelelő DNS fragmenst tisztítottunk az 1%-os agaróz gélből.

A t-PA gén 3’ végét úgy nyertük, hogy mintegy 10 pg ptPMM-1 plazmid DNS-t emésztettünk BamHI-vel és Narl-el. A reakciókeverék szeparálása után 1%-os agaróz gélen, egy mintegy 1300 bp-s DNS fragmenst izoláltunk elektroelúcióval, és tisztítottunk.

A két DNS fragmens (700 bp és 1300 bp méretű) mintegy ekvimoláris mennyiségét ligáltuk egy éjszakén át, és egy 2000 bp-s DNS fragmenst nyertünk ki 1%-os agaróz gélből. Ezt a BamHI restrikciós enzim szekvencia által szegélyezett DNS-t beiktattuk a BPV kifejeződő vektor BglII helyére. Ez a DNS egy olyan fehérjét kódol, amely összesen 650 aminosavat tartalmaz - 35 aminosavat a szignál peptidhez és 615 aminosavat az érett fehérjéhez. A hagyományos tenyésztési, kinyerési, izolálási és tisztítási technikák az l(b) ábra szerinti hármas-horog plazminogén aktivátort eredményezik.

3. példa

261-(Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp-UKa^°~ⁱ³¹)-262-t-PA

Ebben a példában az urokináz horog szekvenciát éppen a t-PA gén kettős horog területe után iktatjuk be, vagyis a 261. aminosavnak (Cys) és 262. aminosavnak (Ser) megfelelő szekvenciák közé. A 8. ábra mutatja be a különböző, ennek a hármas-horog PA-nak termelésében érdekelt lépéseket részletező vázlatot.

Mintegy 10 pg pWP42 plazmid DNS-t emésztettünk Hgal-el és egy 400 bp-s DNS fragmenst izoláltunk 1%-os agaróz gélről. Ez a DNS fragmens tartalmazza a t-PA horog-területe egy részének, azaz a 135-261-aminosavnak megfelelő szekvenciát. Meg kell jegyezni, hogy a t-PA kettős területe a 92. aminosavtól a 261-ig terjed, a két hurok között egy hexapeptid összekötéssel (174-179. aminosavak). Foszfotriészter módszerrel szin-1121

HU 200795 Β tetizáltunk egy oligonukleotid kapcsolót, amely két DNS szekvenciát - 24-mer és 21-mer - tartalmaz, amint ezt a 8. ábrán bemutatjuk. Ez az oligomer kapcsoló kódolja a hexapeptid kapcsolót, valamint az UK horog hiányzó 50. (Cys) aminosavát, és Hgal és Ndel restrikciós enzim szekvenciákkal van szegélyezve. Csak a felső oligonukleotid, a 23-mer van foszforilezve 5’ végénél. Ezt ligáltuk a t-PA-ból származó 400 bp-s DNS fragmens Hgal végéhez. A 421 bp-s DNS terméket izoláltuk 1%-os agaróz gélen.

A t-PA horog utáni részét olyan módon nyertük, hogy 10 pg pWP 42 plazmid DNS-t Rsal-el emésztettünk, ezt követően egy 501 bp-s DNS-t izoláltunk 1,2%-os agaróz gélen. Ez a DNS képviseli a t-PA molekula 269-435. aminosavait. Két komplementer, 22 bázis hosszúságú oligonukleotid szekvenciát, amelyek a 8. ábrán láthatók, szintetizáltunk a foszfotriészter módszerrel. Ez a DNS kapcsoló, amikor 5’ végénél az 501 bp-s DNS-hez ligáljuk, helyreállítja a 262-268. hely közötti hiányzó aminosavakat.

Mintegy 1 pg 501 bp-s DNS-t és 1 pg kapcsoló DNS-t ligáltunk egy éjszakán át, és egy 523 bp méretnek megfelelő DNS csíkot tisztítottunk 1%-os agaróz gélről.

A három 421 bp, 246 bp (UK horog) és 523 bp méretű DNS fragmenst, ligáltuk mintegy ekvimoláris mennyiségben 15 °C hőmérsékleten 16 órán át. Fenolos extrahálás és etanolos kicsapás után a DNS-t EcoRI-vel elhasitottuk, és egy 741 bp-s DNS fragmenst izoláltunk. Ezt a DNS-t, amely két EcoRI restrikciós hellyel van szegélyezve, sokszorozzuk pUC 13 vektor-rendszerben, amint ezt fentebb leírtuk.

pg ptPBM-1 plazmid DNS-t, amelyben az EcoRI helyet a többszörös klónozó helyen eltávolítottuk, emésztettünk teljes mértékben EcoRI-vel, és a mintegy 4,0 Kb méretű nagyobb vektor DNS fragmenst izoláltuk 1%-os agaróz gélről.

EcoRI-vel hasított vektor DNS-t és a 741 bp-s DNS-t ligáltuk mintegy ekvimoláris mennyiségben, és az így létrejött terméket használtuk kompatens E. coli JM 103 sejtek transzformálására. 12 rekombináns kiónból készitett mini-plazmid DNS-t emésztettünk BamHI-vel, hogy megkeressük a mintegy

1,8 Kb méretű kívánt beiktatást. A 741 bp-s DNS korrekt orientációját a beiktatásban olyan módon határoztuk meg, hogy a plazmid DNS-t Narl-el és Mstl-el emésztjük. Egy klónról, a ptPUHYC-ról, amikor Narl-el és Mstl-el emésztjük, úgy találtuk, hogy tartalmaz egy mintegy 700 bp-s fragmenst korrekt orientációban.

A ptPUHYC plazmid DNS BamHI-vel végzett emésztésével nyert 1,8 Kb méretű DNS tartalmazza a 650 aminosavból álló fehérjét kódoló nukleotid szekvenciát - a fehérjéből 35 aminosav felel meg a szignál pepiidnek és

615 aminosav az l(c) ábra termékének megfelelő érett fehérjének.

A hármas-horog gént azután BglII-vel hasított szarvasmarha papilloma vírushoz (BPV) ligáltuk, amely komplett kifejeződő vektorként szolgált. A hagyományos tenyésztéssel az l(c) ábra szerinti hármas-horgot tartalmazó plazminogén aktivátort lehet termelni.

NÉGYES-HORGOT TARTALMAZÓ PLAZMINOGÉN AKTIVÁTOR

Protrombin cDNS

A protrombin génhez szolgáló cDNS kiónt izoláltunk emberi máj cDNS könyvtárból, Friezner és munkatársai módszerét követve [Biochemistry, 22, 2087 (1983)]. A pPTR klón tartalmazza az 579 aminosavból álló érett fehérjéhez szolgáló teljes kódoló információt. A protrombin kettős horog területe a 65. aminosavtól (319. bp) a 248. aminosavig (840. pb) terjed, vagyis egy 248 aminosavból álló peptid. A két horog, a PTK1 (65-143. aminosavak) és PTK2 (170-248 aminosavak) mindegyike 79 aminosav hosszúságú, és egy 26 aminosav hosszúságú pepiiden (144-169. aminosavak) át kapcsolódnak.

A protrombin kettős horog szekvencia előállítása

A kettős horog területet képviselő DNS szekvenciát a protrombin cDNS-ból két lépésben izoláltuk (12. ábra).

Az 1. lépésben 10 Mg pPTR plazmid DNS-t emésztettünk Aval-el, és egy 706 bp-s DNS-t izoláltunk 1%-os agaróz gélről· Ezt a DNS-t kezeltük Bal 31-el 7,5 másodpercen át, hogy eltávolitsunk mintegy 38 bp-t a DNS mindegyik végéről [Legerski és munkatársai: Nucleic Acid Rés. 5, 145 (1978)]. Fenolos extrahálás és etanolos kicsapás után a DNS-t GGAATTCC EcoRI kapcsolóhoz ligáltuk 4 °C hőmérsékleten 15 órán át. Ez a kapcsoló, amikor a CTGAG vagy TGAG (67. aminosav, Glu) szekvenciával végződő DNS-hez ligáljuk, egy új restrikciós szekvenciát hoz létre MstlI-höz (CCTGAGG) a kettős horog N-terminálisánál (67. aminosav). EcoRI-vel végzett hasítás után egy 630 bp méretű DNS fragmenst izoláltunk. Ezt a DNS-t, miután ekvimoláris mennyiségű EcoRI/pUC13-al ligáltuk, alkalmaztuk kompetens E. coli JM 103 sejtek transzformálására. A kívánt kiónra való kezdeti átvizsgálást in situ hibridizálással hajtottuk végre egy ³²P jelzett GAATTCCTGAGGGTCTG vizsgáló mintával, amely tartalmazza a 66-68. aminosavnak megfelelő nukleotid szekvenciákat. 12 kiónt, amely erős jelet mutatott röntgenfilmen, növesztettünk, hogy mini-plazmid készítményt állítsunk elő. A plazmid DNS MstlI-vel és BamHI-vel végzett emésztése után egy kiónról, a pPTK-5’-röl azt találtuk, hogy tartalmazza a mintegy 630 bp-s 13

-1223

HU 200795 Β kívánt beiktatást, valamint az újonnan megalkotott MstlI helyet is 322 bp-nél.

A második lépés magában foglalja a horog-terület 3’ végének összeszerkesztését a 248. aminosav körül, hasonló megközelítést alkalmazva, mint ahogyan fentebb leírtuk. Mintegy 10 pg pPTK-5’ plazmid DNS-t emésztettünk teljes mértékben BamHI-vel. A DNS-t azután Bal 31-el 15 másodpercen át kezeltük 30 °C hőmérsékleten, hogy eltávolitsunk mintegy 82 bp-t a DNS mindkét végéről. Fenolos extrahálás és etanolos kicsapás után a DNS-t a CGCAGAATTCTGCG EcoRI/FspI kapcsolóhoz ligáltuk. Amint ezt neve is jelzi, a kapcsoló egy Fsp I szekvenciát (TGCGCA) alakit ki bármely olyan DNS szekvenciánál, amely TG-ben végződik. Miután EcoRI-vel alaposan elhasitottuk, egy 546 bp-s DNS-t izoláltunk 1,2%-os agaróz gélről, majd ezt ligáltuk EcoRI-vel hasított pUC 13-hoz. Az így nyert rekombináns plazmidot alkalmaztuk azután kompetens E. coli JM 103 sejtek transzformálására. Mintegy 1000 rekombináns kiónt vizsgáltunk át in situ, ³²P-vel jelzett CTCAACTATTGCGCAGAA szekvenciájú oligomerrel (245-248. amiosavak). 12 potenciális klónból készített plazmid DNS-t hasítottunk MstlI-vel és Fspl-el, és az így nyert terméket 1%-os agaróz gélen futtattuk. Egy klónról, a pPT2K-ról, ügy találtuk, hogy tartalmazza a kivánt, 546 bp méretű beiktatást. Ez a DNS kódolja a teljes 182 aminosavat, a kettős-horog terület 67-248. aminosavait. A fennmaradó két aminosavhoz [a 65. helyzetnél (Cys) és a 66. helyzetnél (Ala)] tartozó nukleotid szekvenciát egy oligomer kapcsolón keresztül adtuk hozzá, amint ezt a 13. ábrán bemutatjuk.

4. példa (PTKaeP*-²*⁶-Ser-Gl u-Gly-Asn-Ser-Asp) - 92-t-PA

A protrombin kettős-horog szekvenciáját (a 65-248. aminosavakat) beiktattuk a t-PA kettős-horog területe elé (vagyis a 91-92. aminosavak közé), hogy létrehozzuk a négyes-horgot tartalmazó PA-t. Amint az előző példában leírtuk, a pPT2K plazmid DNS MstlI + Fspl vagy EcoRI emésztése egy 546 bp-s DNS fragmenst hoz létre, amely a protrombin 67-248. aminosavait kódolja. A két oligonukleotid kapcsoló alkalmazása révén az 546 bp-s DNS két végét beiktatjuk· a t-PA génbe a 462. nukleotid (91. aminosav) és 463. nukleotid (92. aminosav) közé. A követett eljárás vázlatát a 13. ábrában mutatjuk be.

A 354 bp-s DNS-t, amely a Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp peptidkapcsolóhoz, valamint a t-PA 92-204. aminosavaihoz tartozó nukleotid szekvenciát tartalmazza, olyan módon készítettük el, ahogyan azt a 2. példában leírtuk és a 7. ábrában bemutattuk. A 354 bp-s DNS 14 és az 546 bp-s DNS (protrombin horgok, ekvimoláris mennyiségét ligáltuk 4 °C hőmérsékleten 16 órán át. A DNS-t EcoRI-vel hasítottuk, és egy 900 bp-s DNS fragmenst izoláltunk agaróz gélről. Ezt a DNS-t EcoRI-vel hasított pUK 13 vektorhoz ligáltuk, az igy nyert terméket alkalmaztuk E. coli JM 103 sejtek transzformálására. 12 rekombináns klónból nyert mini-plazmid készítményt emésztünk EcoRI-vel és MstlI-vel. Egy klónról, a pPT2KTPK-ról úgy találtuk, hogy tartalmazza a kivánt 900 bp-s beiktatást. Ez a DNS kódolja a teljes 300 aminosavat, 182 aminosavat a protrombinhoz (67-248. aminosavak,, egy hexapeptidet, és 112 aminosavat a t-PA-hoz (92-204. aminosavak).

A ptPBM-1 plazmid EcoRI-vel és Asul-el végzett emésztése révén nyert 385 bp-s DNS előállítását a 7. ábrán írjuk le. Két komplementer, egyaránt 12 bp-s oligonukleotid szekvenciát szintetizáltunk foszfotriészter módszerrel. Ez a kapcsoló helyreállítja a protrombin horog terület hiányzó aminosavait (Cys és Ala), és ez Asul és MstlI felismerő szekvenciákkal van szegélyezve. Mintegy 500 ng DNS-t (385 bs-s) ligáltunk 1 pg foszforilezett kapcsolóval, amint ezt a 13. ábrán bemutatjuk. EcoRI-vel végzett hasítás után egy 402 bs-DNS fragmenst izoláltunk. Mintegy ekvimoláris mennyiségű 402 bp-s DNS-t és 900 bp-s DNS-t ligáltunk, az igy nyert terméket EcoRI-vel hasítottuk · és egy 1302 bp-s DNS fragmenst izoláltunk 1%-os agaróz gélről. Ezt a DNS-t szubklónoztuk EcoRI-vel hasított pUC 13 vektorban. 12 rekombináns klónból izolált plazmid DNS-t emésztettünk EcoRI-vel. Egy kiónt, a pNPT2KPAK-t, amely a kívánt beiktatást tartalmazta, növesztettünk plazmid DNS nagy léptékű előállításához. A plazmid DNS-t emésztettük teljességig BamHI-vel, majd részlegesen Narl-el, igy kapva egy 986 bp-s DNS fragmenst. Hasonló módon kaptunk egy 1300 bp-s DNS fragmenst ptPBM emésztésével BamHI-vel és Narl-el. A két DNS fragmenst, a 986 bp és az 13000 bp méretűt, ekvimoláris mennyiségben ligáltuk, az így nyert terméket BamHI-vel hasítottuk, és egy 2286 bp-s DNS fragmenst izoláltunk 1%-os agaróz gélen végzett elektroforézis után. A BamHI szekvenciákkal szegélyezett DNS-t beiktattuk *a BPV kifejeződő vektorba Bglll helyénél. Ez a DNS kódolja a teljes 752 aminosavat - 35 aminosavat a szignál pepiidből és 717 aminosavat az érett fehérjéből. Az érett fehérje mintegy 92000 becsült molekulatömeggel 184 aminosavat tartalmaz a protrombin kettős-horog területéből, valamint tartalmaz egy hexaheptid kapcsolót és a teljes t-PA szekvencia 527 aminosavát.

A hibrid plazminogén aktivátorok kifejeződése és biokémiai jellemzése

Az l(a) és l(b) ábrában bemutatott két hibrid plazminogén aktivátort előállítottuk a

-1325

HU 200795 Β

BPV-I-alapú kifejeződő vektor rendszerben való kifejeződéshez. Ezeket a h-PA-kat a továbbiakban A Hibrid-ként, illetve B Hibridként nevezzük.

A BamHI-vel szegélyezett komplett gén-. -szekvenciákat A Hibridhez (1,8 Kb, 5. ábra) és B Hibridhez (2,0 Kb, 7. ábra) BglII-vel hasított p341-3 plazmid ba iktattuk (a részletekkel kapcsolatban lásd: Anyagok és Módszerek). 12 rekombináns klónböl mini-plazmid készítményt állítottunk elő, és ezt egyenként emésztettük Narl-el, BglII-vel agy BamHI-vel, és Aval-el. Ezt azért végeztük el, hogy igazoljuk a hibrid gének' jelenlétét, valamint meghatározzuk a beiktatás orientációját. A génnek csak egy orientációja (a metallotionein promotor nak az irányában) kívánatos, mivel ez helyezi a' gén kifejeződését ennek a promotornak az ellenőrzése alá. Ezen túl, az éppen a gén mögött elhelyezkedő SV40 poli-A szekvencia a gén RNS-átirását úgy irányítja, hogy a gén 3’ végének poliadenilezésével a gén hatásos transzlációja menjen végbe. Két rekombináns kiónt (pHyb AMT-43, az A Hibridhez, és pHyb BMT-50, a B Hibridhez) kaptunk.

Mintegy 1 pg, a fentebb emlitett kiónokból nyert plazmid DNS-t emésztettünk BamHI-vel, majd az igy nyert terméket defoszforileztük bakteriális alkalikus foszfatázzal. Ebbe iktattunk be egy teljes, 8,0 Kb-s, BamHI-vel hasított BPV-I genomot. Két kifejeződő plazmidot, a pHyb-AMTBPV-438-at és a pHyb-BMTBPV-504-et (ezeket később röviden p438-nak és p504-nek nevezzük) kaptunk, amelyek az A Hibridet, illetve B Hibridet kódoló géneket tartalmazzák. A kifejeződő plazmidok teljes térképét, amely a különböző komponensek relatív elhelyezkedését is bemutatja, a 14. ábrán ábrázoljuk.

A hibrid t-PA/urokináz molekulát kódoló géneket tartalmazó két kifejeződő plazmidot egér C127 sejtekbe juttatjuk kalciumfoszfát kicsapásos módszerrel (Graham és munkatársai: Virology, 52, 456 (1973)]. Morfológiailag transzformált sejtek gócaiból altenyészeteket készítettünk, és átvizsgáltuk ezeket gén-kifejezódésre. A tápközeg kezdeti átvizsgálását fibrinolitikus aktivitásra fibrin-agar lemezen végeztük, amint ezt a 15(a) ábrán bemutatjuk [Plong és munkatársai: Biochem. Biophys. Acta, 24, 278 (1957)]. Az egyes fertőzésekből a p504-el (B Hibrid) transzformált gócok átlagosan 50%-a, és a p438-al (A Hibrid) transzformált gócok 5%-a mutatott pozitív fibrinolitikus aktivitást a tenyészközegben. Több nagy termelőt választottunk ki, és sejtvonalakat fejlesztettünk ki az egyes gócokból. A két sejtvonalat, amelyekkel a géntermékek előzetes biokémiai és immunológiai jellemzésének többségét elvégeztük, 5A5 klónként (B Hibrid), illetve 16C1 klónként (A Hibridnek) nevezzük.

Biokémiai jellemzés

A hibrid molekulák enzimatikus aktivitásait fibrin-agar méréssel és amidolitikus méréssel határoztuk meg, S-2444 és S-2251 szintetikus szubsztrátumokat alkalmazva [Shimoda és munkatársai: Thromb. Haemostas. 46, 507 (1981)]. Mintegy 1-5 egység/pl aktív enzim választódott ki a tápközegbe 16-18 óra alatt. Természetes t-PA és urokináz szintetizálódott, mint prekurzor, és választódott ki a sejtekből, miután a szignál szekvencia lehasadt, hogy érett fehérje alakuljon ki. Ezen kívül mind a t-PA, mind az urokináz glikozilezódött. Hogy meghatározzuk, vajon a fertőzött egérsejtek által kiválasztott h-PA-k hasonló módon alakulnak-e ki, mint a temészetes t-PA és az urokináz, a hibrid molekulákat SDS/poliakrilamid gél (PAGE) elektroforézissel elemeztük, amelyet fibrin-agaros felülrétegezés követett [Granelli-Piperno és munkatársai: 3. Exp. Med. 148, 223 (1978)]. Amint a 15(b) ábrán látható, a B Hibridet tartalmazó tápközegből nyert aktív enzim 76000 molekulatömegű, mig az A · Hibridet tartalmazó tápközegböl nyert aktív enzim 71000 molekulatömegű. Ezek az adatok jó' egyezésben vannak a beiktatott génből kalkulált molekulatömeggel.

A B Hibridet a kinyert tápközegből hasonló módon tisztítottuk, mint amelyet a t-PA tisztításnál alkalmaztunk. Az aminosav szekvencia elemzés azt jelzi, hogy a B Hibrid N-terminálisa korrekt módon alakult ki, az érett t-PA N-terminális területével azonos szekvenciával (Ser-Tyr-Gln-) rendelkezik; ezen kívül egy Ile-Lys-Gly-N-terminális, amely az Arg-Ile aktivációs hasitási helynél levő aminosavaknak felel meg, is jelen van. Arra a következtetésre lehet jutni, hogy £ kinyert tápközegből tisztított B Hibrid főleg aktivált, kétláncos formában létezik. Ha proteáz inhibitor (Aprotinin) adunk a kinyert tápközeghez, egy egyláncos h-PA molekulát nyerünk.

A ³⁵S-jelzett kinyert tápközeg immun-kicsapása, amelyet SDS/PAGE követ, azt mutatta, hogy nem redukáló körülmények között egy 71000-76000 látszólagos molekulatömegnek megfelelő helyzetnél csík figyelhető meg az 5A5 (B Hibrid), illetve 16C1 (A Hibrid) sejtvonalakból származó mintákban, a kontroll mintákban viszont nem. Az 5A5 sejtekből származó tápközeg, valamint . a tisztított t-PA (American Diagnostics, Inc., Greenwich, Connecticut) fibrinolitikus aktivitását anti-t-PA antiszérum semlegesített, de az anti-urokináz antiszérum nem, ez a jelenség azt sugallja, hogy bár a B Hibrid tartalmaz egy urokináz horgot a t-PA-n kívül, a Hibrid B proteáz-terét az anti-t-PA ismeri fel és semlegesíti. Anti-urokináz antitest kötődhet a hibrid molekula urokináz horog-területéhez, de ez a kötés, ha egyáltalán létezik, nem avatkozik be a hibrid-molekula C-terminálisánál levő 15

-1427 proteáz tér által adott proteolitikus aktivitásba.

A találmány szerinti eljárással előállított sok-horgos plazminogén aktivátorokat az emlősökben előforduló érrendszeri rendellenességek kezelésében ugyanolyan módon és ugyanolyan kiszerelési segédanyagokkal alkalmazzuk, mint a t-PA-t magát, igy a jelen találmány szerinti sok-horgos plazminogén aktivátorokat gyógyszerészeti kompozíciókba olyan módon lehet kiszerelni, hogy a polipeptideket feloldjuk vagy szuszpendáljuk megfelelő gyógyászatilag elfogadható hordozókban, amelyekről a szakterületen ismeretes, hogy t-PA-hoz alkalmazhatók. A beadást emlősökbe szükség esetén intravaszkuláris injekció vagy infúzió formájában a t-PA-nál magánál már megállapított technikát követve hajtjuk végre. Intravénás primer dózisként mintegy 440 nemzetközi egység/testtömeg kg a normális, ezt követi a folyamatos infúzió mintegy 440 nemzetközi egység/kg/óra sebességgel 6-12 órán át; ez a hagyományos gyakorlat, amikor t-PA-t alkalmaznak.

Claims

1. Eljárás

a. ) (urokináz ^1_131aminqsav-Ser-Glu-Gly-Asn5 -Ser-Asp)-⁹²-szöveti plazminogén .aktivátor;'

b. ) 91-(urokináz ^^aminosav-Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp)-⁹²-szöveti plazminogén- aktivátor;

c. ) 261-(Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp)-urokináz

10 ^50_l31aminosav-262 szöveti plazminogén aktivátor, vagy

d. ) 91-{protrombin horog ⁶⁵ ²⁴⁸aminosav-Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp)-^9Z-szöveti plazminogén aktivátor heterológ polipeptid horgo15 kát tartalmazó hibrid plazminogén aktivátor előállítására, azzal jellemezve, hogy az a.) hibrid plazminogén aktivátor előállítására a szöveti plazminogén aktivátort kódoló DNS szakaszból az 1-91 aminosavakat kódoló DNS

20 szakaszt kiiktatjuk, és ennek helyére az urokináz 1-131. aminosavait kódoló DNS-t és a Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp összekötő tagot kódoló DNS-t beépítjük, majd az előállított DNS-t megfelelő vektorba építjük, a

25 b.) hibrid plazminogén aktivátor előállítására a szöveti plazminogén aktivátort kódoló DNS 91. és 92. aminosavát kódoló szakaszai közé az urokináz 50-131. amainosavait kódoló DNS-t és a Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp összekötő

30 tagot kódoló DNS-t beiktatjuk, majd az előállított DNS-t megfelelő vektorba építjük,, a

c. ) hibrid plazminogén aktivátor előállítására a szöveti plazminogén aktivátort DNS 261. és 262. aminosavakat kódoló szakaszai közé az

35 urokináz 50-131. aminosavait kódoló DNS-t és a Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp Összekötő tagot kódoló DNS-t beiktatjuk, majd az előállított DNS-t megfelelő vektorba építjük, a __________

d. ) hibrid plazminogén aktivátor előállítására

40 a szöveti plazminogén aktivátort kódoló DNS

91. és 92. aminosavát kódoló szakaszai.közé a protrombin 65-248. aminosavait kódoló DNS-t beiktatjuk, majd az előállított DNS-t megfelelő vektorba építjük,

45 az így kapott rekombináns vektorral emlős szővettenyészet gazdasejteket transzformálunk, a transzformált gazdasejtek tenyésztésével a fentebb említett hibrid plazminogén aktivátort kifejezzük, és kívánt esetben a

50 keletkezett hibrid plazminogén aktivátort kinyerjük.

2. Eljárás emlősök vérében lévő vérrögök széthasitására alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy Va55 lamely, az 1. igénypont szerint előállított polipeptid hatékony mennyiségét a gyógyszerkészítésben szokásos vivőanyaggal és kivént esetben egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítunk.