JPH0655152B2 - ミナクチビンの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、ある種の細胞から分離した新しい蛋白質ミ
ナクチビンの製造方法に関するものであり、この蛋白質
は、ウロキナーゼタイプのプラスミノーゲンアクチベー
ターの特異的な不活性化因子として作用するものであ
る。

この発明は、人血の単核細胞、ある種のマクロファージ
及び単核細胞由来の形質転換細胞を付着単層培養するこ
とにより分離、同定された、ウロキナーゼ タイプのプ
ラスミノーゲン アクチベーターの特異的不活性化因子
の製造方法に関するものである。この不活性化因子を
「ミナクチビン」と名付け、この物質について当該明細
書中ではこの名前を用いることとする。

〔従来の技術〕

プラスミノーゲン アクチベーターは、多くの動物組織
及び分泌液中に存在する蛋白質分解酵素である。最も広
く知られているプラスミノーゲン アクチベーターの機
能は、プラスミノーゲンをその活性型であるプラスミン
へ転換する触媒作用である。プラスミンの主な役割は、
線維素の溶解又は凝血塊の溶解作用である。分子量、ア
ミノ酸配列及び免疫反応性を異にする二つのタイプの哺
乳類プラスミノーゲン アクチベーターに大別され、ウ
ロキナーゼ タイプのプラスミノーゲン アクチベータ
ーと、組織タイプのプラスミノーゲン アクチベーター
に特徴付けられる。乳房、肺臓、結腸及び前立腺の癌腫
を含む人の主要な癌は、異常な高レベルでウロキナーゼ
タイプのプラスミノーゲン アクチベーターを生産す
ることが知られており、また、一連の証拠によって、こ
のことは腫瘍が隣接組織へ侵入する過程と関係すること
が分っている。

〔発明が解決しようとする課題〕

この発明は、人血の単核細胞を付着単層培養して得た上
澄が、ウロキナーゼ タイプのプラスミノーゲン アク
チベーターの有力な不活性化因子であるミナクチビンを
含有することを発見したことを基礎としている。ミナク
チビンは、侵入する腫瘍と深く関連するプラスミノーゲ
ン アクチベーターの天然の不活性化因子であり、それ
故に、腫瘍の侵入及び転移に対する体内の通常の防御
に、決定的な役割を持つものであることが示唆されてい
る。ミナクチビンは、更に、医学の領域、種々のタイプ
の癌腫の生体内及び生体外診断、そしてそれらの症状の
治療などにおける臨床上の試薬として広く応用し得る可
能性を有している。ミナクチビンは、マクロファージ及
び単核細胞由来の形質転換細胞の培養によっても分離、
同定された。

この発明の第一点として、ウロキナーゼ タイプのプラ
スミノーゲン アクチベーターの特異的不活性化因子で
あるミナクチビンが、著しく精製することができる方法
を提供できる。この発明は、また、ウロキナーゼ タイ
プのプラスミノーゲン アクチベーターの特異的不活性
化因子であるミナクチビンを含む培養上澄を提供するも
のであり、この培養上澄は、ミナクチビン生産性細胞を
培養することにより得られる。この発明は、更に、ミナ
クチビンを含む培養上澄から得られた、少なくとも部分
精製されたミナクチビン生産物を提供するものである。
その他のミナクチビンの特徴については、後に詳しく記
述する。

〔課題を解決するための手段〕

この発明は、ミナクチビンの製造方法を提供することで
あり、それは、ミナクチビン生産性細胞の培養と、培養
上澄の回収から成る。ミナクチビンは、少なくとも部分
精製生産物として培養上澄から回収される。ミナクチビ
ン生産性細胞には、人血の単核細胞、ある種のマクロフ
ァージ及び人の形質転換セルラインが含まれるが、特に
詳細に説明する。細胞から分泌されたミナクチビンを含
む培養上澄は、含まれるミナクチビンを濃縮すべくそし
て、少なくとも部分精製されたミナクチビンを生産すべ
く処理され、他の培養上澄の成分は除去される。この濃
縮及び精製は、例えば、フェニル−セファロース又はＤ
ＥＡＥ−セファロースを用いたハイドロフォービックイ
ンターラクションクロマトグラフィーを利用し、目的生
産物を溶出させることにより実施される。この生産物
は、更に、アフィニティー クロマトグラフィー（例え
ば、シバクロンブルー−セファロース又はハイドロキシ
ル アパタイト）又は予備的非変性ゲル電気泳動を用い
て他の不純物を除去することにより実施される。

研究によると、ミナクチビンは、分子サイズが約６０〜
７０，０００（ゲルろ過クロマトグラフィーによる）で
あり、その阻害効果は、Ｍｒ５２，０００（ＨＰＡ５
２）及び３６，０００（ＨＰＡ３６）のプラスミノーゲ
ン アクチベーター（ウロキナーゼの如き）に特異的で
あり、そのことは、（ａ）プラスミノーゲン依存性の線
維素溶解作用の阻害、（ｂ）比色定量アッセイで見られ
るプラスミノーゲン賦活レベルでの阻害、及び（ｃ）プ
ラスミノーゲン賦活化活性の不可逆的消失、によって示
されるが、これらは、培養基で前培養した後、電気泳動
させると明白である。ミナクチビンとＨＰＡ３６型のプ
ラスミノーゲン アクチベーターの複合体は、界面活性
剤耐性を示し、Ｍｒ７０〜７５，０００で特徴付けられ
る（ミナクチビン−ＨＰＡ３６複合体）。

更に、ミナクチビンは、ウロキナーゼ タイプのプラス
ミノーゲン アクチベーターを選択的に阻害し、トリプ
シン、プラスミン又は組織タイプのプラスミノーゲン
アクチベーター（ＨＰＡ６６又は６６，０００Ｍｒ ア
クチベーター）は阻害しないことが明らかとなった。

ミナクチビンは、人の単核細胞のみならず、ある種のマ
クロファージ及びマクロファージ直系の形質転換細胞に
よっても生産されることが見い出された。特に、腹膜マ
クロファージ及び骨髄質マクロファージは、付着単層培
養することにより、相当量のミナクチビンを生産し、分
泌することが見い出された。人マクロファージセルライ
ンのＵ９３７は、デキサメタゾン（dexamethasone）を
添加して培養すると、ミナクチビンを生産することが見
い出された。この点については、更に、付着単層培養に
よってミナクチビンを人血の単核細胞から生産する場
合、ムラミル ジペプチド（アジュバンド ペプチ
ド）、バクテリアのリポポリサッカライド又は活性化し
たリンパ球の培養物のリンホカイン含有上澄、を用いて
細胞を活性化することによって、生産を刺激し又は増強
することができることが分かった。

人結腸の癌腫セルラインのＣＯＬＯ３９４の培養物に添
加すると、ミナクチビンは、特異的にプラスミノーゲン
アクチベーター（ＨＰＡ５２）を不活性化すること
が、比色定量アッセイ及び電気泳動によって確認され
た。更に、ミナクチビンは、外科的に切除して得た人腫
瘍の組織ホモジエネートにおけるプラスミノーゲン ア
クチベーター活性を、特異的に不活性化することができ
る。プラスミノーゲン アクチベーターのレベルは腫瘍
組織においては、相当する結腸の正常組織と比較して著
しく高いことが証明された。同様の観察は、広範囲の充
実性腫瘍に関して、他の研究者によっても実証されてい
る。

それ故に、ウロキナーゼ タイプのプラスミノーゲン
アクチベーターに対するミナクチビンの特異性及び腫瘍
組織におけるこのプラスミノーゲン アクチベーターの
著しく増強されたレベルの観点から、当該生産物は、組
織学的標本及び生体における腫瘍の境界の位置を定め、
特定するための試薬として応用できる。このように、ミ
ナクチビンは、生体内の腫瘍を仮想するのに使用し得
る。特に、乳房、前立腺、結腸及び肺臓のような、プラ
スミノーゲン アクチベーターを生産する充実性腫瘍
は、ミナクチビンによって標的となり得る。このような
癌腫は一般的に、外科的処置で直るので、そのような腫
瘍を仮想する際のミナクチビンの利用は、外科的処置の
後に生起する小さい転移性癌を確認するのに特に有用で
ある。ミナクチビンは、天然生産物であるので、抗原性
がなく、体内での排除の問題を回避し出る長所があるこ
とももちろん評価されよう。そのような腫瘍を生体内で
仮想する場合、ミナクチビンを、ラベルした形例えば、
適当な放射性同位体（テクネチウム⁹⁹など）でラベルし
て、投与した後、ミナクチビンにより仮想される腫瘍の
位置と境界は、通常のラジオアイソトープの操作手段で
決定することができる。

組織学的標本における腫瘍の境界の位置の決定と特定に
おいて、ミナクチビンは、上記した放射性同位体と結合
するか、又は、標準的な操作手段を用いて、適当な酵素
（又は他の適当な試薬）と結合させてラベル化できる。
組織学的標本がミナクチビン−酵素複合体と接触する
と、ミナクチビンは、ウロキナーゼと、それが分泌され
て高濃度である位置において反応し、それによって、腫
瘍の境界が確認される。この高濃度の位置において見い
出されるミナクチビン−酵素複合体の検出は、通常の方
法、例えば、酵素の基質を利用して、基質に対する酵素
の反応を検知する指示薬によって実施される。

腫瘍を仮想することに加えて、ミナクチビンは、また、
腫瘍のプラスミノーゲン アクチベーター活性を減ずる
ので直接腫瘍の治療に用いられ、この活性は、腫瘍が隣
接組織に侵入する過程に関連していることから、腫瘍の
侵入を規制し、特に阻害することが可能となる。

ミナクチビンの一般的性質 ミナクチビンは、５６℃以上の温度で不安定であり、−
２０℃の冷凍及び解凍に対しては安定である（一サイク
ルすると０〜５％の活性を失う）。無菌条件下で採取し
た上澄を含みミナクチビンは、４℃においてゲンタマイ
シンの存在下で、著しく活性が低下することなく、２ケ
月間保存できる。

プラスミノーゲン アクチベーターとミナクチビンの相
互作用は、イオン強度がプラスミノーゲンの活性化に逆
の効果を有するにもかかわらず〔後述の19の文献参照、
以下（ ）内の数字は、後述の文献番号を示す〕、イオ
ン強度に依存しないようである。ウロキナーゼ活性は、
比色定量アッセイにおいて、塩濃度により著しく阻害さ
れるが、減少したウロキナーゼ活性に対するミナクチビ
ンの効果は、比例的に同じである。

ミナクチビンは、pH５〜９で４℃において比較的安定で
ある。塩の存在下でセファクリルＳ ３００（Pharmaci
a）によるミナクチビン標品のゲルろ過によると、ミナ
クチビンの分子サイズは、血清アルブミンを標準とし
て、６０〜７０，０００（第１０図）と同定された。こ
のカラムから得た濃縮ミナクチビン標品の特異性をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ−線維素カラムで分析したところ、単核細
胞培養から得たミナクチビン上澄について第６図で得た
結果と同じであった。しかしながら、ウロキナーゼの不
活性化は、以下の点で血清アルブミンの特性と異なる。
すなわち、（ａ）人血清アルブミンは、ウロキナーゼの
比色定量アッセイに効力を有しない。（ｂ）ミナクチビ
ン活性は、ブルー−セファロース（Pharmacia）のアル
ブミン アフィニティーカラムにより保持されない、
（ｃ）人血清アルブミンの培地濃度は、ムラミル ジペ
プチド又は前記の誘導実験における細胞タイプで変化し
得ない、（ｄ）アルブミン又は血清の補充なしで単核細
胞はミナクチビンを生産する。

腫瘍の診断及び治療におけるミナクチビンの役割 ある種の主要な人癌腫が、ウロキナーゼ タイプのプラ
スミノーゲン アクチベーター（ＨＰＡ５２）を正常の
組織に見られるレベルより著しく高レベルで生産するこ
とが立証された。Markus及び共同研究者らの最近の研究
では、酵素の含有量と種類につき、短期間の組織培養に
よる分泌割合（３４〜３５）と同様に留意しており、肺
臓、前立腺、乳房及び結腸の腫瘍が含まれている（３０
〜３２）。更に、ＨＰＡ５２は、異なる遺伝子の生産物
であり(36)、結腸の内皮性食細胞のような全ての血管新
生組織中に偏在する組織タイプのプラスミノーゲン ア
クチベーター（ＨＰＡ６６）の蛋白質分解又は他の修飾
によって得られるものではないことが確認された。遺伝
子発現の変化は、人結腸癌の発達の間に上皮細胞で起こ
り、高レベルのＨＰＡ５２が生じることは明らかであ
る。

細胞のプラスミノーゲン アクチベーターが関連する生
物学的過程は、炎症反応及び腫瘍の転移のような侵入及
び組織破壊と関連するこれらの生理学上の結果を含んで
いる(38)。腫瘍の侵入の媒介者としての役割に関係する
プラスミノーゲン アクチベーターの特異的作用は、細
胞分裂を刺激すること(39)、細胞表面を修飾すること(4
0)、細胞転移を促進すること(41)、腫瘍に隣接した線維
素を消化すること(42)、そして、コラーゲナーゼを活性
化すること(43)などを含んでいる。

ミナクチビンは、ウロキナーゼ タイプのプラスミノー
ゲン アクチベーター（ＨＰＡ５２及びＨＰＡ３３）の
有力な特異的阻害因子であるので、慢性の炎症及び種々
のタイプの癌腫の診断、臨床試薬として、これらの症状
の治療と同様に、応用される。ＨＰＡ５２の生体内活性
を特異的に調節することによって、ミナクチビンは、組
織タイプのプラスミノーゲン アクチベーター（ＨＰＡ
６６）の役割に、止血の維持の点で、影響を持たない。
更に、ミナクチビンは、天然生産物であるので、抗原性
が無い長所があり、また、体内での排除の問題を回避し
得る。

ミナクチビンは、それ故に、炎症的病状の指標として応
用できる。最近、慢性的炎症は、ステロイドで処理され
るが、一般的に、治療の経過をモニターすることは困難
である。ミナクチビンに対する抗体を用いて、体液又は
組織中のマクロファージの活性状態がモニターされ、治
療の経過もモニターされる。炎症又は慢性的潰瘍及び粘
膜状の表面細胞層又は上皮に対する損傷は、多量の血液
の単核細胞の損傷領域への浸潤をもたらす。この際に、
単核細胞は、炎症の広がりに応じてミナクチビンを生産
すべく刺激される。

更に、ミナクチビンは、組織学的標本及び生体内におけ
る腫瘍の境界を確認し、決定するための試薬として応用
される。充実性腫瘍は、一般的に、外科的処置により除
かれるので、ミナクチビンの使用は、外科的処置に続い
て生起する小さい転移性癌の確認を可能とする。組織学
的標本の分析において、ミナクチビン又はその抗体は、
１¹³¹のようなアイソトープでラベルされるか、又は、
適当な酵素又は他の化学試薬に結合される。組織学的標
本に接触して、ミナクチビンは、腫瘍タイプのプラスミ
ノーゲン アクチベーターとその分泌位置において結合
し、それによって腫瘍の境界が確認される。複合体のミ
ナクチビンは、公知の操作手段（４４〜４７）によっ
て、目で観察し得る。生体内の腫瘍を仮想するために、
テクネチウム⁹⁹のような適当なアイソトープでミナクチ
ビンをラベルし、投与した後腫瘍の位置及び境界が公知
のラジオアイソトープ法（４７〜５０）によって決定さ
れる。更に、ミナクチビンは、プラスミノーゲン アク
チベーターの活性型とのみ結合するので、生長又は侵入
段階の腫瘍細胞を標的とし得る。

診断上の応用に加えて、ミナクチビンは、腫瘍の直接治
療いおいても使用される。腫瘍が隣接組織に侵入する過
程に関連する酵素の特異的阻害因子として、腫瘍の生長
及び転移を規制し特に、阻害することができる。更に、
ミナクチビンは、生育する腫瘍に直接レクチン又は毒素
を運搬する医薬運搬システムとして使用される。このこ
とは、特異的で著しく有力な抗腫瘍効力の見地から、多
くの長所をもたらすものであることを認識させる。

〔実施例〕

ミナクチビンの生産、精製及び同定についての詳細は、
以下の実施例により、添付した図面と関連させて開示す
るが、これは、この発明の範囲を限定するものではな
い。

この発明の好ましい具体例 実施例１ ミナクチビンの生物学的な同定及び特徴 方法 １）プラスミノーゲン アクチベーターの比色定量アッ
セイ いくつかのタイプのプラスミノーゲン アクチベーター
酵素を、０．１％トライトンＸ−１００及び０．１％ゼ
ラチンを含む５０ｍＭグリシン緩衝液、pH７．８、中
で、Coleman及びGreenの方法(12)を用いて分析した。２
〜８mPlough単位（ｍＰＵ）の活性範囲を保つように希
釈した。酵素（１０μｌ）、プラスミノーゲン（０．１
mg/ml、２０μｌ）及び分析緩衝液（２０μｌ）を４５
分間、３７℃で培養し、次いで、プラスミン分析試薬
（１ml、参考文献１２参照）を加え、３０分間、３７℃
で培養した。反応をトラシロールを加えて停止し（０．
３mg/mlで２０μｌ）、４１２nmの吸収をモニターし
た。単核細胞培養で補充的に用いた人血清アルブミン
（１％）は、この方法では、ウロキナーゼの分析に影響
しなかった。

人プラスミノーゲンは、リジン−セファロース（Pharma
cia）カラム(13)のアフィニテイークロマトグラフィー
で、保存新鮮血漿より精製を２度繰り返し、最終濃度
０．３μＭで分析に用いた。人プラスミノーゲン アク
チベーターの利用可能な市販製品、すなわち、Calbioch
em-Behring Corp.La Jolla、CA.のCalboiochemの資料の
標準品のウロキナーゼ（lot 103285,1700 Plough単位／
小ビン）及びSigmaウロキナーゼ（lot 101F-05991、約4
0,000Plough単位／mg蛋白）を使用した。これらは、こ
こでは、ＣＵＫ及びＳＵＫと、各々、する。これらの標
品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びそれに線維素を付加して展
開させることにより、Ｍｒ５２，０００（ＨＰＡ５２）
のプラスミノーゲン アクチベーターとＭｒ３６，００
０（ＨＰＡ３６）の蛋白質分解生産物の混合物であるこ
とが分かった。ラットの乳腺癌ライン１３７６２（Dr
I.Ramshaw,Dept.Experimental Pathology,JCSMRより入
手）を、０．５％トライトンＸ−１００を含むpH７．８
の５０ｍＭグリシン中でホモゲナイズした。牛のトリプ
シン（１Ｘタイプ）、牛のトロンビン（グレード１）及
び豚の血漿は、Sigmaから入手した。

２）ミナクチビンの比色定量アッセイ 培養上澄及び細胞溶解質中のミナクチビンの量は、ウロ
キナーゼ標準品の比色定量アッセイ(12)における阻害作
用により決定した。試料（２０μｌ）は、プラスミノー
ゲンの添加に先立って４ｍＰＵのウロキナーゼと９０分
間、２３℃に前培養した。阻害作用は、プラスミノーゲ
ン活性作用のレベルであってプラスミンの阻害作用では
ないことを実証するために、ミナクチビンを相当するプ
ラスミンの分析に直接添加することによるコントロール
を実施した。１単位のミナクチビンが、ウロキナーゼの
１Plough単位を阻害する量であることが判明した。

３）ラジアル ディフュージョン アッセイ フィブリノーゲン（SigmaタイプＸ）、人プラスミノー
ゲン及びトロンビン（Sigma１グレート）を１．２５％
のアガロース（Plaque、FMC Corp.,Rockland、ME USA）の
ゲルの１．２mm厚の基質に投じた。３７℃で固まった
後、ゲルを４℃で固化させ、ウロキナーゼ／ミナクチビ
ン混合物（５μｌ）を適用させるために３mmにカットし
た。

４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び線維素オーバーレイによるプ
ラスミノーゲン アクチベーター活性の展開 ＳＤＳ電気泳動ゲルに供する試料は、分析緩衝液中プラ
スミノーゲン アクチベーター酵素のみか、あるいは、
培養上澄及び／又はプロテアーゼ阻止因子と９０分間、
２３℃で前培養した酵素を含み、最終体積を１００μｌ
とすべくＳＤＳ試料緩衝液を加える。用いたプロテアー
ゼ阻止因子は、トラシロール、α₁−アンチトリプシン
（Sigma）、大豆トリプシン阻害剤（Sigma）、ヨードア
セトアミド、ＥＤＴＡ、ＳＤＳ、トラネキサミン酸（Al
drich Chemicals.Milwaukee WI）及びベンズアミジンで
あった。ゲルの平板は、１１％ポリアクリルアミドであ
り、垂直に位置させ、トライトンＸ−１００で洗浄し、
Granelli-Piperno & Reichの方法(13)に従って、線維素
／アガロースゲルの接触溶解により展開した。線維素溶
解の展開時間は、通常、３７℃で５〜８時間であった。
酵素的溶解バンドの分子量は、市販酵素の場合と比較し
て、アクリルアミドゲル中の標準蛋白質の発色位置（Ph
armacia LMW Kit）により決定した。

５）形態学及び細胞化学 位相差顕微鏡検出法のために、付着した単核細胞又はマ
クロファージの単層を２回洗浄し、０．１Ｍカコジル酸
塩緩衝液（pH７．４）中で１．５％グルタールアルデヒ
ド(9)に実験に先立ち少なくとも室温で３０分間固定し
た。細胞遠心分離標品を、Shandon Southern遠心機で調
製した。詳しくは、１０％牛胎児血清中に５０，０００
細胞を含む０．２mlの標品を５００rpmで３分間回転さ
せた。標品は、続いて、ドライヤーで直ちに乾燥し、こ
れをMay-Grunwald Giemsaで発色させた。

非特異的なエステラーゼの存在は、基質としてα−ナフ
チルアセテート（10,11）を用いて評価した。

食細胞活性は、付着単核細胞又は細胞懸濁液１０％人Ａ
Ｂ血清及び１．１μｍラテックス ビーズ（Sigma）を
細胞当たり１００ビーズの濃度で含むＲＰＭＩ−１６４
０中にて、３７℃、６０分間培養することにより評価し
た。非摂取のビーズは、単層又は細胞懸濁液をＲＰＭＩ
−１６４０で３回、２０℃、１５０ｇにて１０分間洗浄
することにより除去した。２以上のラテックスビーズを
摂取している細胞を食細胞と判定した。

６）単核細胞及びマクロファージ細胞標品 人単核細胞の白血球を、Ficoll-Hypaque(Pharmacia Fin
e Chemicals.Sydney.Australia）グラジエントにより、
Woden Valley病院の赤十字血液輸血サービスにおいて除
去された軟層から分離した。混在する血小板を除去する
ために、４℃でＰｉ／ＮａＣｌ中で４回洗浄した後、細
胞ペレットを６０単位／mlのゲンタマイシンを含むＲＰ
ＭＩ−１６４０（Gibco、Grand Island、N.Y.）中に懸濁
させた。精製単核細胞の単層は、１０⁷単核細胞を、人
ＡＢ血清２mlを３０分間プレコートした３０mmのウエル
（Linbro multiwell plates.Cat.No.7605805）中、１０
％ＡＢ血清とＲＰＭＩ−１６４０にて平板培養すること
によって得られた。単核細胞は、空気中５％のＣＯ₂条
件で、３７℃にて６０分間付着させた。非付着細胞は、
３７℃にて、ＲＰＭＩ−１６４０で単層を６回洗浄する
ことにより除去した。

付着した単核細胞は、いくつかの基準により８５％の単
核細胞より多いことが分かった。単核細胞をホリクロー
ム酸塩で発色することにより、９４±６％の細胞は、好
塩基性細胞質を有する円形又はへこんだ大きな核を有す
る単核細胞であることが示された。細胞質の酵素の発色
により、非特異的エステラーゼは単核細胞の８５±２％
がこの単核細胞マーカーに対して陽性であることを示し
た。９１％の付着細胞がラテックスビーズを食したこと
は、単核食細胞の形態学的、組織学的外観を示す付着細
胞集団がこの特徴的な機能特性をも表わすことを確認さ
せるものである。

生体外培養の間に、単核細胞は細胞サイズ及び形態学的
に著しい変化を被る。培養単核細胞の細胞遠心分離標品
は、単核細胞が培養期間中そのサイズを増加させ、７日
目の終わりには見かけサイズは倍以上になる。時々、二
核化した細胞も見られる。単核細胞はサイズを増し、そ
の細胞質は空胞の生じた状態になり、細胞質の顆粒が顕
在化する。更に培養すると多核の大型細胞の形成が増加
する。

ｂ）腹膜マクロファージ 慢性の腎不全のため日常的に腹膜透析を受けている患者
から得た２リットルの透析液を、２０℃、３００ｇに
て、１０分間遠心分離した。細胞ペレットを５０mlのＲ
ＰＭＩ−１６４０に再懸濁し２０℃、２００ｇにて１０
分間再遠心した。細胞を、次いで、ml当たり約２×１０
⁶の最終濃度にすべくＲＰＭＩ−１６４０中に再懸濁
し、腹膜細胞懸濁液６mlをFicoll-Hypaque３mlと２０
℃、４００ｇにて２０分間遠心分離した。細胞を１０％
人ＡＢ血清を含むＲＰＭＩ−１６４０中に１×１０⁶/ml
の濃度まで再懸濁した。

高収率の単核細胞が、腹膜洗浄物のFicoll-Hypaqueグラ
ジエントにより得られた。細胞の４７％は、形態学的基
準から判定するとマクロファージであった。単核細胞の
フラクションの細胞遠心分離標品は、マクロファージ集
団は不均質であって、豊富な細胞質及び時として二核を
持つ成熟細胞を、へこんだ核及び細胞質の割合に応じた
仁を有する単核細胞に特徴的な小さい細胞と同様に、含
んでいることを示した。

腹膜マクロファージは、更に、単核細胞について前記し
たように、プラスチックの培養トレイに付着させて精製
した。非付着性の細胞層を除去した後、培地を２〜３日
毎に取り変えて、生存する腹膜マクロファージを、３週
間に至るまで培養維持できた。腹膜マクロファージは、
非特異的エステラーゼで発色させて決定した８７％のマ
クロファージよりも通常的に大きかった。

ｃ）骨髄質由来のマクロファージ 新鮮な人腸骨稜及び肋骨髄質を整形外科的処理により得
てこれを１０％の巨大細胞腫瘍（ＧＣＴ）培養上澄（Gi
bo-Biocult、Grand Island、NY、USA）及び１０％牛胎児血
清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中に分散させた。この
第一培養は、ゼラチンをコーティングしたフラスコ
（１）で７日間続けた。その後、血液の単核細胞の場合
と同じ培養皿に付着させて、単核細胞／マクロファージ
を精製し、ミナクチビン測定のために、第二付着培養を
実施した。得られた細胞は、非特異的エセテラーゼの９
０％の陽性細胞より大きかった。

ｄ）結腸粘膜マクロファージ これらの細胞は、Golder及びDoeの方法（２）により結
腸粘膜の酵素的分離によって、切除された結腸から得
た。これらは、単核細胞として、ＲＰＭＩ−１６４０中
で付着単層として生育した。得られた細胞は、８５％非
特異的エステラーゼ陽性細胞より大きく、ヒツジ赤血細
胞を食する。

７）細胞培養 ａ）単核細胞及びマクロファージ 単核細胞又はマクロファージ単層は、１％人血清アルブ
ミン（Commonwealth Serum Labs.,Melbourne、Australi
a）を含むＲＰＭＩ−１６４０中で培養した。前記
（ａ）〜（ｄ）起源の細胞の培養は、３×１０⁶cells/m
l培地の割合まで出来る限り高密度に保って行なった。

以下の試剤を、細胞培養実験で用いた。

（ａ）ムラミル ジパプチド（Ｎ−アセチル−ムラミル
−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、Peninsula Labo
ratories.San Carlos.CA.USA）を５μｇ／ml、（ｂ）Sa
lmonella minnesota R595の細胞壁リポポリサッカライ
ド（３）。後者は０．１％トリエチルアミン中水溶解性
抽出物を超音波処理し、Ｐｉ／ＮａＣｌに対して透析し
て調製した。培養物中の最終濃度は０．１μｇ／mlであ
る。デキサメタゾン及びフォルボール ミラステイト
アセテイト（Sigma Chemical Co.,St.Louis.MO.USA）
は、最終濃度０．１μＭ及び１０ｎｇ／mlで各々用い
た。

ｂ）形質転換セルライン 人マクロファージ様セルライン Ｕ９３７（４）及びＨ
Ｌ６０（５）は、Drs RUlevitich及びR G Painter(Scri
pps Clinic.and Research Foundation.La Jolla.CA.US
A）から入手した。Ｕ９３７ セルラインは、ＡＴＣＣ
（Rockville.Maryland.USA）からも入手した。ＲＣ２Ａ
（６）は、Dr N Kraft(Prince Henry's Hosopital.Melb
ourne.Australia）から入手した。ＭＬＡ１４４は、手
長ザルのＴ−リンパ球ライン（７）である。人赤血球ラ
インＫ５６２（８）は、Dr H S Warren.Cancer Reserch
Unit.Woden Valley Hospitalから入手した。ＣＯＬＯ
３９４は、人結腸癌腫細胞セルラインであり、Dr R Whi
tehend.Ludwig Institute of Cancer Reserch.Royal Me
lbourne Hosopital.Melbourneより入手した。これらの
細胞は、分析のための上澄の採取に先立って、全て、血
清なしにＲＰＭＩ−１６４０培地で生育した。細胞溶解
質は、酵素研究のために０．５％トライトンＸ−１００
の存在下で調製した。

ミナクチビンの生物学的特徴 結果 細胞集団におけるミナクチビンの生産 ａ）人血の単核細胞 ミナクチビンは、Coleman及びGreenの比色定量アッセイ
(12)（第１図）におけるウロキナーゼ活性の阻害作用に
より、付着性の人単核細胞から血清の存在しない培地条
件で生産されることが示された。この阻害作用は、人血
清によって細胞の初期的付着化が促進されるか否かにか
かわらず観察される。付着性単層の調製の間に得られる
非付着性単核フラクションは、培養中、全くミナクチビ
ンを生産しない。

最大限のミナクチビン活性は、単核細胞の培養の最初の
２４時間の培養上澄を用いて得られた。継続する各２４
時間の阻害因子生産率は、４日後にわずかになるまで減
少を示した。このことは、培養上澄及び細胞溶解質の双
方に見られた。しかしながら、ムラミル ジペプチド又
はバクテリアのリポポリサッカライドによって単核細胞
の生体外の活性化し、ミナクチビンの生産及び分泌を促
進させた（第１Ａ及び１Ｂ図）。最初の２４時間の期間
の培養上澄における阻害因子の量は、細胞数と相関関係
を示す（第２図）。ミナクチビンの最大レベルは、細胞
濃度が１０⁶cells/mlより大きい培養条件で生産され
う。少い量のミナクチビンが（細胞当たり）、高い細胞
濃度において生産される。人の線維芽細胞の培養におい
てプラスミノーゲン アクチベーターの阻害因子の合成
を誘導することが以前に示されたデキサメタゾンと単核
細胞を培養しても（１０^-6〜１０^-8Ｍ）ミナクチビンの
生産上影響を示さなかった。

ｂ）人腹膜マクロファージ 新鮮に分離した血液単核細胞の溶解質は、ミナクチビン
を含有していないが（第１Ｂ図参照）、新鮮に分離した
付着性の腹膜マクロファージの溶解質は、全て、著しい
レベルのミナクチビンを含んでおり（約３０％の阻害作
用）、続いて培養中に増加する（第３図）。このミナク
チビンの持続的生産は、相当する培養上澄中で測定され
る分泌生産物のレベルにも反映される。コントロールの
単核細胞培養と違って、腹膜マクロファージ溶解質のミ
ナクチビンのレベルは、３日間の培養期間中高レベルを
保持した。この細胞集団は、形態学的にみて大部分新し
く増加した単核細胞から成ると考えられ、繰り返される
透析によって誘導される軽い炎症による生体内での刺激
は、腹膜腔内においてミナクチビンを生産するための単
核細胞を増加させ、活性化するに充分なものであること
が示される。腹膜マクロファージは、溶解質又は上澄中
でのミナクチビンの生産に対してムラミル ジペプチド
の添加が影響しないことから、更に活性作用を高めるこ
とはないと考えられた（第３図）。

ｃ）骨髄質由来マクロファージ 骨髄質マクロファージは、最初の骨髄質培養で生育を刺
激してＧＣＴ（giantcellの腫瘍培養上澄）の７日後の
付着性細胞として得た。この細胞は、組織の７日間の最
初の培養の後の第二培養として研究が行なわれたので、
それらの最初のミナクチビン生産及び分泌は、新鮮に分
離した血液単核細胞又は腹膜マクロファージと直接比較
できない。

それにもかかわらず、７日間の最初の培養の後、第二培
養の間に得た付着性骨髄質マクロファージの溶解質は、
ムラミル ジペプチドの存否にかかわらず減少を示した
ミナクチビン活性を高レベルで示した（第４図）。これ
らの骨髄質細胞は、上澄に高レベルのミナクチビンを分
泌することが見い出され、そのレベルは溶解質で観察さ
れたように、ムラミル ジペプチドの影響は受けなかっ
た（第４図）。

ｄ）結腸粘膜マクロファージ 切除した人結腸の酵素的分離粘膜から分離したマクロフ
ァージは、培養中きわめて限られた活性のミナクチビン
を生産し、そのレベルは、前記の３種の場合と比較する
とわずかであった（４つの実験で２４時間の上澄の阻害
作用の平均値は４％）。この低レベルは、Salmonella m
innesotaのリポポリサッカライドを培養物に添加しても
（０．１μｇ／ml）、増加しなかった。

腸のマクロファージの反応の不足は、それらの分離に際
して用いた分解酵素（コラゲナーゼ及びＤＮＡ ase）
に長くさらしたことによるかどうか確認するために、正
常の人血単核細胞を腸のマクロファージ標品からの上澄
培地で数時間培養させた。血液単核細胞を処理した酵素
は、続く培養中ミナクチビンを生産し、分泌する機能を
保持していた（表１）。

表１ コントロール単核細胞 酵素処理 溶解質 ９０％ １００％ 上澄 ６７％ ７２％ ＤＮＡase及びコラゲナーゼを含む結腸分解物の上澄で
培養した前又は後の人血単核細胞によるミナクチビンの
生産。結果は、単核細胞上澄によるウロキナーゼアッセ
イの阻害％として示した。

このように、血液単核細胞は、ミナクチビンの分泌を可
能とする理想的生育段階にあることが示される。この可
能性は、ムラミル ジペプチドで生体外で活性化される
か、又は生体内の炎症部位に対して活性が増加すること
で実現される。一方、腸粘膜から分離された成熟組織の
マクロファージは、刺激にかかわらず、分泌ミナクチビ
ンを生産する能力を欠乏しているように見える。

ｅ）人マクロファージ セルラインＵ９３７ ミナクチビン活性は、Coleman及びGreenの方法(12)によ
って評価した場合、人マクロファージ セルラインＵ９
３７から得た上澄中に見い出すことができなかった。し
かしながら、このセルラインをデキサメタゾン（１μ
Ｍ）の存在下で培養した場合、著しいレベルのミナクチ
ビンが培養上澄中で測定された。このことは、生産され
たミナクチビンと実際上結合したＵ９３７細胞によるプ
ラスミノーゲン アクチベーターの付随した生産によっ
て説明され、従って、比色定量アッセイでは、隠れて探
知し得ない。実際に、Ｕ９３７細胞を７２時間培地を含
むデキサメタゾンで処理すると、高レベルの細胞内のプ
ラスミノーゲン アクチベーター活性が、０．５％トラ
イトンＸ−１００の細胞抽出物中のプラスミノーゲン
アクチベーター活性の評価によって測定されるものとし
て誘導された。デキサメタゾンなしで７日間以上培養し
たＵ９３７細胞は、完全に、ミナクチビン生産能を失っ
た。デキサメタゾンの付加は、最終濃度１０μＭに至る
と、ミナクチビン生産を回復しえなかった。

Ｕ９３７細胞により本質的に分泌されるミナクチビンの
レベルは、培養中ムラミル ジペプチドで誘導される単
核細胞による生産レベルの約４倍低かった。しかしなが
ら、Ｕ９３７細胞により分泌されるミナクチビンのレベ
ルは、フォルボール ミラステート アセテートのよう
なフォルボール エステルを培養中の細胞に添加するこ
とによって１６倍に増強された。ミナクチビン活性は、
人のマクロファージ様セルラインＲＣ２Ａ又は人（Jurk
at）及び手長ザル（MLA144）由来のＴ−リンパ球セルラ
インから得た上澄中には見い出せなかった。

２）ミナクチビンの特異性 ａ）線維素溶解の阻害作用 プロテアーゼのミナクチビンによる阻害作用の特異性
は、単核細胞の培養上澄を含むミナクチビンをフィブリ
ン／アガロース ゲルを入れたマイクロウェル中にて種
々の酵素と培養することによって研究された。プラスミ
ノーゲン（２０μｇ／ml）を、プラスミノーゲン アク
チベーター活性を発現し得るべくゲル混合物中に含有さ
せ、３７℃、２０時間の培養後に比較し得る溶解性を与
えるべく適当な酵素濃度が選ばれた（第５図の記載参
照）。

ミナクチビンは、明らかにプラスミン又はトリプシンの
阻害因子でないことが、２３℃、２時間これらの酵素と
前培養して判明した（第５図）。人のプラスミノーゲン
アクチベーターの内、ミナクチビンで処理した場合、
ウロキナーゼの二種の標品（ＣＵＫ及びＳＵＫ）が、全
て、線維素溶解能を失った。しかしながら、ほぼ全てが
組織タイプのプラスミノーゲン アクチベーター（ＨＰ
Ａ６６）（以下参照）である人メラノーマの培養上澄に
よる線維素溶解活性は、ミナクチビンによって、前培養
の後でも阻害されなかった。トロンビンによるフィブリ
ノーゲンの凝血化も、ミナクチビンの影響を受けなかっ
た。

ｂ）比色定量アッセイによる阻害作用 Coleman及びGreen(12)の評価方法を、ミナクチビン阻害
作用の特異性を研究するために、更に、利用した。プラ
スミノーゲンの不存在下でプラスミン アッセイ試薬と
培養する方法が(12)、プラスミンと同様のトリプシンの
高感度の評価法として使用され、一方、プラスミノーゲ
ンの存在下で、数タイプのプラスミノーゲン アクチベ
ーターが評価された。しかしながら、記載すべき例外
は、人のメラノーマの培養物中のＨＰＡ６６であり、こ
れは、おそらくフィブリンの欠乏によって(16)、この評
価においては不活性であった。

ミナクチビンは、トリプシン又はプラスミンのリジン
チオエステラーゼ活性を阻害しなかった（表２）。しか
しながら、ウロキナーゼ タイプのプラスミノーゲン
アクチベーター、ＣＵＫ、ＳＵＫ及び手長ザルのＴ−リ
ンパ球ライン（MLA144）のＡＰＡ５２、のプラスミノー
ゲン依存活性は、ミナクチビンによって著しく阻害され
た。更に、ウロキナーゼの阻害は、ミナクチビンが、プ
ラスミノーゲンと培養する間に存在する場合にのみ観察
され、プラスミンアッセイ段階でミナクチビンを添加し
ても起こらなかった。

希釈したラット１３７６２腫瘍のホモジエネート中に存
在するラット プラスミノーゲン アクチベーター活性
（ＲＰＡ４８、おそらくＨＰＡ５２と同類体）は、ミナ
クチビンに影響されなかった。

表２はミナクチビンによるプロテアーゼ比色定量アッセ
イの阻害作用を示す。非希釈ミナクチビン培養上澄（２
０μｌ）を、最終体積が４０μｌとなるようにして酵素
と２３℃、２時間前培養した。

プラスミノーゲン（２０μｌ、１００μｇ／ml）を、次
いで、アクチベーターに添加し、プラスミンアッセイ試
薬（１ml）を、他のプロテアーゼに添加し、各々発色評
価を行なった。

ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び線維素オーバーレイ Granelli-Piperno & Reichの線維素オーバーレイ方法(1
4)をミナクチビンの阻害作用の特異性を立証し、ミナク
チビンによって種々のプラスミノーゲン アクチベータ
ーが不可逆的に不活性化されるかどうか確認するため利
用した。

酵素のミナクチビンとの前培養は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
より行ない、残余の酵素活性は、プラスミノーゲンを補
充したフィブリン／アガロースゲルの溶解領域として観
察した。

アクリルアミド及びフィブリン ゲルを一緒に５時間培
養して、コントロール（未処理）のウロキナーゼ（ＣＵ
Ｋ）による顕著なバンドが形成された。一つは、ＨＰＡ
５２の特徴を示し、他は、その蛋白質分解生産物、ＨＰ
Ａ３６の特徴を示した(17)（第９図レ−ン１）。しかし
ながら、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの前に、ＣＵＫをミナクチビ
ンと前培養すると、わずかに溶解した一本のバンドが、
５時間後に、オーバーレイしたゲル中に見い出され、こ
れはＨＰＡ５２よりも高分子量の位置に位置していた。
（第９Ａ図、レーン１０）。ゲルを２０時間培養する
と、このバンドは、著しく増加し、ＨＰＡ３６として観
察されたものよりも高分子量の位置にバンドが加わった
（第６図、レーン２）。これらの結果は、最終的に残っ
た活性が未処理の酵素のものより高分子量のものを生起
させる形で、ミナクチビンがＨＰＡ５２及びＨＰＡ３６
を不活性化することを示す。このように、ミナクチビン
とウロキナーゼの相互作用の形態は、複合体の形成又は
ウロキナーゼの構造上のラジカルな変化であり、これが
電気泳動の移動度に影響すると考えられる（後述の３、
参照）。ＨＰＡ３６は、ＨＰＡ５２よりも不活性化を受
け易いと考えられる。

手長ザル セルラインＭＬＡ１４４は、血清の存在しな
い培地中にプラスミノーゲン アクチベーターを分泌さ
せるが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び線維素で展開すると、こ
の活性は、人ウロキナーゼのＨＰＡ５２と同じ分子量上
に二つに分離したバンドを形成した（第６図、レーン
３）。これらのバンドは、いずれも、ＭＬＡ１４４の培
養上澄をミナクチビンと前培養しても影響を受けなかっ
た（第６図、レーン４）。人メラノーマの培養のＭｒ６
６，０００のプラスミノーゲン アクチベーター及びラ
ット腫瘍のＭｒ４８，０００のプラスミノーゲン アク
チベーターは、ミナクチビンで処理しても影響を受けな
かった（第６図、レーン７＆８）、これらの結果は、ミ
ナクチビンは、人ウロキナーゼ タイプのプラスミノー
ゲン アクチベーター（ＨＰＡ５２及びＨＰＡ３６）を
特異性に阻害し、人組織タイプのプラスミノーゲン ア
クチベーター（ＨＰＡ６６）及び、他の（少なくともあ
る種の）哺乳動物のプラスミノーゲン アクチベーター
を阻害しないことを示している。

３）ミナクチビンとウロキナーゼ タイプのプラスミノ
ーゲン アクチベーターの相互作用 ミナクチビンとウロキナーゼの相互作用を、プラスミノ
ーゲンの存在下でミナクチビン及びＣＵＫを前培養し
て、続いて、前記した比色定量アッセイにおける残余の
プラスミノーゲン アクチベーター活性を評価すること
により、分析した。不活性化は、２３℃で２時間以上の
時間を要し、残余のプラスミノーゲン アクチベーター
活性の最終レベルは、ウロキナーゼ、ミナクチビン及び
プラスミノーゲンを混合したゼロ時間の半分以下であっ
た（第７図）。２時間の前培養の間に、不活性化は、当
初、急速で、それ以降、一定となり、更に、前培養して
も残余のウロキナーゼは不活性化しなかった。この結果
は、反応が、例えばウロキナーゼがプロテアーゼで分解
されるというよりも化学量論的に行なわれたことを示唆
した。培養上澄を含むミナクチビンの希釈液でウロキナ
ーゼを滴定して、第８図に示す相互作用曲線を得た。４
ｍＰＵのウロキナーゼ（ＣＵＫ）活性は、この実験で用
いた培養上澄１．５μｌの等量で、５０％不活性化され
た。

この実験で用いた培養上澄は、前記の線維素溶解実験に
おけるコントロールで示されるように（第５図）、一般
的な蛋白分解活性を、高感度比色定量アッセイにおける
リジン チオエステラーゼ活性を欠くことからして、示
さなかった。しかしながら、ミナクチビンによるウロキ
ナーゼの不活性化に、これら二つの分子のいずれかの蛋
白分解活性が含まれるか否か確認するために、ＣＵＫを
ミナクチビンなしで、広範囲のプロテアーゼ阻害剤の存
在下で、前培養した。プロテアーゼ阻害剤及びその最終
濃度は、次の通りであった。トラシロール０．２mg/m
l、α₁−抗トリプシン１６μｇ／ml、大豆トリプシン阻
害剤０．１６mg/ml、ヨードアセトアミド３ｍＭ，ＥＤ
ＴＡ６ｍＭ，ＳＤＳ０．６％、トラネキサミン酸３ｍＭ
及びベンズアミジン３ｍＭ。これらの前培養物を次いで
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで処理し、ウロキナーゼ活性を、前記
のように線維素溶解により観察した。ミナクチビンの存
在下における各プロテアーゼ阻害剤によるコントロール
の前培養によって、大豆トリプシン阻害剤のみが、電気
泳動後に見られる通常のＨＰＡ５２及びＨＰＡ３６のバ
ンドを消失させることが示された。ミナクチビンの存在
下で各前培養を行なった場合、他のどのプロテアーゼ阻
害剤も、ミナクチビンによるウロキナーゼの不活性化を
防ぐことはできなかった。しかしながら、ＳＤＳは、ミ
ナクチビンの添加の前後のウロキナーゼに添加すると、
その不活性化を防止した（第９図、レーン８）。このよ
うに、ミナクチビンはプラスミノーゲン アクチベータ
ーの阻害剤というよりも、不活性化因子であるといえよ
う。

更に、これらの結果は、ミナクチビンとウロキナーゼの
反応形態として、先ず可逆的な複合体の形成段階、次い
で、酵素とミナクチビンの１：１の複合体の分子量より
も小さく、酵素自体よりも高分子量の不可逆的生産物を
生じるＳＤＳ−感受性段階（プロテアーゼ阻害剤に対し
ては非感受性）のあることを示す。このように、前培養
のゼロ時間にＳＤＳを添加すると、完全に、ミナクチビ
ンの阻害効果を消失させ、ミナクチビンによる前培養に
次いでＳＤＳで処理すると、ＨＰＡ５２及びＨＰＡ３６
を完全に、阻害する。わずかの活性が、長時間展開させ
ると、高分子量の位置に見られたが、これは、ミナクチ
ビンを添加すると阻害された。これらは、少量の一部活
性化した酵素か又は当初の可逆的複合体からの解離によ
ることを示す。

人マクロファージ直系の形質転換細胞から得た多くのプ
ラスミノーゲン アクチベーターについて、比色定量ア
ッセイによりそのミナクチビンの不活性化作用をテスト
した。ミナクチビンは人マクロファージ プレカーサー
セルライン（ＨＬ６０）及び人マクロファージ様白血
球セルライン（ＲＣ２Ａ）のプラスミノーゲン アクチ
ベーターを著しく阻害した（表３）。人赤血球セルライ
ン（Ｋ５６２）及び霊長類のＴ−リンパ球セルライン
（MLA144）によって分泌されるプラスミノーゲン アク
チベーターは、阻害されたが、マウスの尿のウロキナー
ゼは阻害されなかった。

表３ ＰＡ起源 ウロキナーゼと等価にした阻害率％ ウロキナーゼ ９５ 単核細胞 １８ ＲＣ２Ａ ８０ ＨＬ６０ ７８ Ｋ５６２ ７５ ＭＬＡ１４４ ６０ マウスの尿 ４ 人の変換セルラインを含む、種々の起源から得たプラス
ミノーゲン アクチベーターの単核細胞ミナクチビンに
よる阻害。

４）他の細胞集団から得たミナクチビンの特異性 他のマクロファージ細胞集団によって生産されるミナク
チビンは、単核細胞によって生産されるミナクチビンと
同じく、人ウロキナーゼ タイプのプラスミノーゲン
アクチベーターに著しい特異性を示すことが、フィブリ
ン ラジアルディフュージョン アッセイにより確認さ
れた。

プロテアーゼ、プラスミノーゲン アクチベーター、プ
ラスミン、トリプシン、ＨＰＡ６６（メラノーマ培養上
澄から得た組織タイプのアクチベーター）及び人ウロキ
ナーゼ（ＨＰＡ５２及びＨＰＡ３６）を選択して、各細
胞集団で生産されるミナクチビンによる阻害作用を検査
した。

ウロキナーゼ タイプのプラスミノーゲン アクチベー
ターの特異的阻害作用は、腹膜マクロファージ及び血液
単核細胞の培養上澄に観察された（第１１図）。これら
の細胞で生産されたミナクチビンは、プラスミン、トリ
プシン又はＨＰＡ６６の活性に影響を示さなかった。腹
膜マクロファージ、血液単核細胞、骨髄マクロファージ
のトライトンＸ−１００で溶解した全細胞溶解質は、全
て、ウロキナーゼ タイプのプラスミノーゲン アクチ
ベーターを阻害し、プラスミン又はトリプシンを阻害し
なかった。しかしながら、血液単核細胞及び腹膜マクロ
ファージの溶解質は、ＨＰＡ６６に弱い阻害作用を示し
た（第１１図）。

Ｕ９３７セルにより生産されるミナクチビンは、その一
般的特徴において、単核細胞由来のミナクチビンと同じ
であった。Ｕ９３７及び単核細胞の精製ミナクチビンを
用いたフィブリンラジアル デュフュージョン アッセ
イにより特異性を比較して、これらのミナクチビンは、
ウロキナーゼ タイプのプラスミノーゲン アクチベー
ター、ＣＵＫ及びＳＵＫを特異的に阻害し、組織タイプ
のプラスミノーゲン アクチベーター（ＨＰＡ６６）を
阻害しないことが確認された（第１２図）。プラスミン
及びマウスのウロキナーゼでは、阻害作用が見られなか
った。

単核細胞及びＵ９３７セル由来のミナクチビン標品の電
気泳動における移動度は、非変性、不連続性ポリアクリ
ルアミドゲル システムで比較すると、非常に似たもの
であった（第１３図）。Ｕ９３７セルラインのミナクチ
ビン標品は、単核細胞のミナクチビンより、わずかに大
きい電気泳動上の移動度を示した（第１３図）。このわ
ずかの差異は、ゲル上の溶解の量的差異又はこの異なる
起源のミナクチビンのグリコシレーションの差異によろ
う。

Ｕ９３７セル又は単核細胞から分離したミナクチビン
は、フィブリン ラジアル デュフュージョン アッセ
イによると、人胎盤から分離したプラスミノーゲン ア
クチベーター阻害因子(23)と特異性を異にする（第１２
図）。人胎盤阻害因子（Calbiochem）は、ウロキナーゼ
タイプ及び組織タイプのプラスミノーゲン アクチベ
ーターの両者を、ミナクチビンの阻害作用は前者を特異
的に不活性化すると考えられる。

実施例２ ミナクチビンの製造方法 １）人単核細胞培養からのミナクチビンの精製 人血を、先ず白血球の白い「軟層」を赤血球層の上部に
形成させるべく遠心分離して、単核細胞を分離した。Fi
coll-Hypaque上で層を形成させて、白血球を、顆粒球単
核細胞を含むリンパ球に分離した。単核細胞は、リンパ
球より、遠心分離溶出法により分離した。

精製単核細胞（通常、３〜４リットルの血液から５〜８
×１０⁸細胞が得られる）は、０．２０〜０．３４×１
０⁶cells/cm²の密度で１５cmのプラツチック皿（ゼラチ
ンで前処理し、人血清で洗浄する）に付着させ、０．０
５μｇ／mlのムラミル ジペプチド（アジュバンド ペ
プチド）を含む血清不存在のＲＰＭＩ−１６４０（０．
５０〜０．７５ml/10⁶cells）で培養した。培養を３時
間続けた後、培地を採取し、遠心分離により清澄化し
た。次いでＮａＣｌを上澄に２Ｍまで添加し、これを４
℃でフェニル−セファロース アフィニティー（Pharma
cia）にかけた。カラムを２Ｍ ＮａＣｌを含む、pH
７．８の５０ｍＭグリシンで洗浄して蛋白質を除去し、
そして同じ緩衝液中ＮａＣｌの下降グラジエントにより
固着した蛋白質を溶出させた。このグラジエントのフラ
ンクションを用いて、Coleman及びGreenの方法(12)によ
り、ミナクチビン活性を評価した。蛋白質濃度は、Lowr
y法(24)により決定した。代表的結果を第１４図に示
す。最も活性の高いフラクションを保管し、pH７．８の
５０ｍＭグリシンで透析し同じ緩衝液で平衡にしたCiba
cron Blue−セファロース（Phermacia）のアフィニティ
カラムに、そのまま又はCentricon 30(Amico）で濃縮
して、かけた。ミナクチビンは、吸着されないが、他の
不純蛋白質は、カラム中に残った。この操作によって得
られた精製度合は、蛋白質（Lowry法）及びウロキナー
ゼ阻害作用の比色定量アッセイにおけるミナクチビン活
性の滴定を基礎として、１，０００倍のオーダーであっ
た。ミナクチビン生産物とウロキナーゼの相互作用は、
ミナクチビン培養上澄について観察されたように（第８
図）、化学量論的であった。ミナクチビン生産物は、２
００〜５００単位／mlのミナクチビンを含むが、ミナク
チビン成分は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動によっても明確に同定し得なかった。

この方法によるミナクチビンの精製に続いて、培養中生
体内にラベルした（³⁵Ｓ−メチオニン）単核細胞標品を
用いてＳＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル電気泳動を行
なった。３日間で多くの蛋白質が血清不存在の培養基中
に分泌され、続くフェニル−セファロース クロマトグ
ラフィーにより、著しく比活性が増加した（第１５
図）。他の不純蛋白質は、更に、Blue−セファロース
クロマトグラフィにより除去した（第１６図）。ウロキ
ナーゼ（ＨＰＡ３６）を、これらのミナクチビン標品と
培養したところ、分子量の移動が観察され、Ｍｒ７０〜
７５，０００のウロキナーゼ−ミナクチビン複合体が得
られた（第１６図）。電気泳動の移動度におけるこの変
化は、ミナクチビンとしての蛋白質の分子量を同定する
ために利用可能である。この移動はＭｒ３９〜４８，０
００のミナクチビン標品中の主要な蛋白質バンドの消失
と相互に関係する。Ｍｒ６０，０００及び３２，０００
のバンドも観察された。単一の蛋白質バンドは、分子量
３０〜３５，０００に相当するものであった。

２）人マクロファージ セルライン Ｕ９３７のミナク
チビンの精製 細胞培養 非付着性の人マクロファージ セルライン Ｕ９３７
を、１０％牛胎児血清及び１μＭデキサメタゾンを含む
ＲＰＭＩ１６４０中で、Ｔ１７５培養フラスコ又は１０
リットルBraunファーメンターを用いて培養した。細胞
濃度は、１〜３×１０⁶cells/mlに保持した。生長期の
間に、細胞によってミナクチビンが分泌されるが、細胞
は、ミナクチビン精製のための上澄を得るべく血清不存
在の培地に移した。細胞ペレットを、洗浄し、１μＭの
デキサメタゾンを含むＲＰＭＩ１６４０中に懸濁させ、
３日間培養した。細胞の生育力を高めるために、０．７
％ゼラチンを血清不存在培地に添加した。ゼラチンの添
加により、ミナクチビンの活性は、４〜８倍に増加し
た。（第１７図）。

細胞を採取し、上澄を精製の実施例に用いた。実施例
は、精製ミナクチビン標品を得るために、適宜の組み合
わせ及び順序で行ない得る。

精製実施例１ ステップpH溶出法によるフェニル−セフ
ァロース クロマトグラフィー ０．７％ゼラチンの存在下で培養したＵ９３７細胞から
得た上澄を用いてミナクチビンを精製した。５０mlのフ
ェニル−セファロース カラムを、２Ｍ ＮａＣｌを含
む、pH５．５の５０ｍＭクエン酸塩で平衡にした。Ｕ９
３７培養上澄１．６リットルについて、クエン酸でpH
５．５に調節し、カラムにかける前に、ＮａＣｌを２Ｍ
濃度まで添加した。カラムは、同等の緩衝液で、充分、
洗浄し、次いで、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む、pH５．５
の５０ｍＭ クエン酸塩で洗浄した。次いで、ミナクチ
ビンを５０ｍＭ グリシン、pH７．８で溶出し、Colema
n及びGreenの比色定量法(12)により活性を評価した。蛋
白質含有量は、Bradford法(25)により決定した。結果
を、第１８図に示す。

回収率は、３，３６０ミナクチビン単位、又は、比活性
では１４０単位／mgで、６６％であった。これは、２１
４倍の比活性の増加を意味する。

精製実施例２ 塩溶出法によるバッチ式フェニル セフ
ァロース クロマトグラフィー Ｕ９３７細胞をゼラチン不存在下で培養して得た上澄を
用いてミナクチビンを精製した。

ａ）血清不存在ミナクチビン上澄の濃縮 ４〜５リットルの上澄を、３０，０００ＭＷカットオフ
カートリッジを装備したAmicon DC2 Hollow Fiber Di
alysis/Concentrationユニットを用いて、１０倍濃度に
濃縮した。濃縮物は、次いで、全ての着色物を除去する
ために、pH７．８の５０ｍＭグリシンで透析した。

ｂ）ミナクチビン濃縮物の遠心分離 透析した濃縮物を、JALOロータ中で、残余の細胞の破片
及び透析中に沈澱した蛋白質を除去すべく、４℃、８，
０００rpmで３０分間遠心分離した。清澄化した上澄を
分画し、−２０℃に凍結して続く精製処理に備えた。こ
の段階では、当初のミナクチビン活性が１００％回収さ
れ、比活性２０単位／mgで１０〜２０，０００単位のミ
ナクチビンが得られた。

ｃ）バッチ式 フェニル−セファロース クロマトグラ
フィー ミナクチビンは、濃縮培養上澄（０．７ゼラチンの存在
下で培養した細胞から得た。比活性は、１単位／mg）を
用いて、更に、フェニル−セファロースを使用したバッ
チ式塩溶出法により、精製を行なった。上澄（750mls）
のイオン強度を、ＮａＣｌで２Ｍに調節した。２Ｍ Ｎ
ａＣｌを含む、pH７．８の５０ｍＭグリシンで平衡させ
たフェニル−セファロースを、上澄に対して１：７．５
（ｗ／ｖ）の割合で添加した。懸濁液を室温で２時間又
は４℃で一夜、攪拌下で培養した。フェニル−セファロ
ースを、グラスフィルターで除去し、次いで、同じ緩衝
液を用いて完全に洗浄し、不純蛋白質を除去するべく、
１．４Ｍ ＮａＣｌを含むpH７．８の５０ｍＭグリシン
で洗浄した。ミナクチビンは、次いで、pH７．８、５０
ｍＭグリシンによりカラムから溶出した。

この方法によるミナクチビン活性の収量は、４，８００
単位であり、これは、出発物質の３５％収率に相当す
る。ミナクチビン生産物の比活性は、９６単位／mgで約
１００倍増加した。

精製実施例３ ステップpH溶出法によるＤＥＡＥ−セフ
ァロース クロマトグラフィー 細胞不存在の上澄について、実施例２に記載のステップ
（ａ）及び（ｂ）に従って、pH溶出を行なった。濃縮し
たミナクチビンの上澄（４０ml、６．５単位／ml）を、
pH７．８、５０ｍＭグリシンで平衡にしたＤＥＡＥ−セ
ファロース カラムにかけた。非吸着の蛋白質を除くた
めに、同等の緩衝液で完全に洗浄後、ミナクチビンを、
pH５．０、２５ｍＭクエン酸−リン酸塩で溶出させた。
次いで、残余の蛋白質を除去するために、２Ｍ ＮａＣ
ｌを含む、pH５．０、２５ｍＭクエン酸−リン酸塩で洗
浄した。結果を第１９図に示す。

この方法によって生成されたミナクチビンは、比活性が
６３単位／mgで、３５％の収率で回収された。これは、
比活性で１０倍の増加を意味する。

精製実施例４ 予備的な非変性ゲル電気泳動 細胞不存在の上澄について、実施例２に記載のステップ
（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）に従って、ミナクチビン
（３．５単位、比活性２５単位／mg）及び適当な標準蛋
白質を電気泳動に先立って、等量の緩衝液で混合した。
緩衝液は、０．０２５％ブロモフェノール ブルー、
０．０２５％キシレン−シアノール、５０ｍＭトリス−
ＨＣｌ、pH７．５、１８％シュクロース及び１％トライ
トンＸ−１００から成る。ゲルは、５〜１５％直線ビス
−アクリルアミドグラジエントで構成され、ゲルシステ
ムは、基本的には、ナトリウム ドデシル−サルフェー
トを無添加として、Laemmliの方法(26)を用いた。緩衝
液槽のランニング緩衝液としては０．１５％トライトン
Ｘ−１００をＳＤＳの代用に用いた。サンプルをゲルに
供して、１００ｍＡにて電気泳動を行なった。温度は、
水冷システムにより２５℃以下に保持した。低移動性の
キシレン−シアノールの発色が、ゲルの全長を移動した
後に、ゲルを取り除いた。ゲルをセクション（約０．５
×１cm）にカットし、pH７．８、５０ｍＭグリシン１５
０μｌを添加し、サンプルをBranson Soifier cell dis
rupterを用いて、１０〜２０秒間、４℃、ソニック パ
ワー２０で超音波処理した。蛋白質は、ゲルセクション
より攪拌下で一夜溶出させた。サンプルを１４，９３０
ｇ、１０分間遠心分離して、ゲルをペレット化し、上澄
を分離してミナクチビン活性の評価に用いた。蛋白質の
含有量を発色させて観察させるために、重複してサンプ
ルを処理した。結果を、第２０図に示す。

ゲルからのミナクチビンの回収率は高く、一回の抽出
で、当初活性の６４％が回収された。更に１３％が第二
回の抽出で回収された。銀白色に発色した蛋白質の状況
から、ミナクチビン活性は、標品中の不純蛋白質からな
り分離していることが分った。得られたミナクチビンの
比活性は、２３２３単位／mgで、これは、このステップ
で９３倍精製されたことを意味する。

精製実施例５ Blue−アガロース クロマトグラフィー 細胞不存在の上澄について、実施例２に記載にステップ
（ａ）及び（ｂ）に従って、１０mlの濃縮上澄（６００
単位、２０．０mg、比活性３０．０）を、pH７．０、１
００ｍＭ Ｎａ フォスフェートで平衡にした３．２cm
×２．８cmのBlue−アガロース カラムに供した。カラ
ムを、同じ緩衝液で洗浄し、８．１mlのフラクションを
集めた。フラクションを７グループに分けて保管し、pH
７．８、５０ｍＭグリシンで４℃、一夜透析し、次い
で、蛋白質含有量及びミナクチビン活性について評価し
た。ミナクチビンは、カラムから溶出され、その比活性
は１２０単位／mgで、４倍の増加を示した。

精製実施例６ 塩グラジエント溶出法によりＤＥＡＥ−
セファセル クロマトグラフィー 細胞不存在の上澄について、実施例２に記載のステップ
（ａ）及び（ｂ）に従って、１０mlの濃縮上澄（６４０
単位、２０．０mg、比活性３２．０単位／mg）を、pH
７．８、５０ｍＭグリシンで平衡にした２．６cm×６cm
のＤＥＡＥ−セファセル カラムに供した。カラムを、
pH７．８、５０ｍＭグリシン５０mlで洗浄し、次いで同
じ緩衝液で、０から０．５Ｍに至るＮａＣｌの直線グラ
ジエントを５００ml ＮａＣｌで行なった。完了後、グ
ラジエント カラムを、１Ｍ ＮａＣｌを含むpH７．
８、５０ｍＭグリシン９０mlで、更に、洗浄した。６ml
のフラクションを集めた。１０フラクションを保管し、
pH７．８、５０ｍＭグリシンで４℃、一夜透析を行な
い、ミナクチビン活性及び蛋白質含有量を評価した。結
果を第２１図に示す。ミナクチビンは、０．２４Ｍ Ｎ
ａＣｌで溶出され、最大活性を示すフラクションは、比
活性２１６単位／mgで、回収率７９％であった。これ
は、６．７５倍に精製されたことを意味する。

精製実施例７ pHグラジエント溶出法によるＤＥＡＥ−
セファセル クロマトグラフィー 細胞不存在の上澄について、実施例２に記載のステップ
（ａ）及び（ｂ）に従って、１０mlの濃縮培地（４００
単位、２０mg、比活性２０．０単位／mg）を、pH６．
９、２０ｍＭ ＮＨ₄Ａｃで平衡にした２．６cm×６cm
のＤＥＡＥ−セファセル カラムに供した。カラムを、
pH６．９、２０ｍＭ ＮＨ₄Ａｃ ３０mlで洗浄し、次
いで２０ｍＭ ＮＨ₄Ａｃから２０ｍＭ酢酸に至る５０
０mlのグラジエントによりミナクチビンを溶出させた。
完了後、カラムを２０ｍＭ酢酸で、２７５nmの吸収がベ
ースラインに至るまで、洗浄した。５．５mlのフラクシ
ョンを集めた。１０グループのフラクションを保管し、
ＮａＯＨでpHを７及び８の間に調節した。５．０mlの各
保管標品を、pH７．８、５０ｍＭ グリシンで一夜透析
し、次いで、ミナクチビン活性及び蛋白質含有量を評価
した。結果を第２２図に示す。pH５．３で溶出された最
大活性を示すフラクションは、出発材料と比較して７４
％の活性を示した。比活性は、１９６６単位／mgで、９
８倍に精製されたことを示した。各保管フラクションよ
り７０μｇの蛋白質が回収され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで評
価した。結果を第２３図に示す。

精製実施例８ ハイドロキシル アパタイト クロマト
グラフィー 細胞不存在の上澄について、実施例２に記載のステップ
（ａ）及び（ｂ）に従って、１０mlの濃縮上澄〔５２０
単位、１６．６mg、比活性３１．０単位（mg〕を、pH
７．８、５０ｍＭ グリシンで平衡にしたハイドロキシ
ルアパタイト カラム（２．６cm×４．５cm）に供し
た。カラムを、pH７．８、５０ｍＭグリシンで洗浄し、
次いで、５０ｍＭグリシン、pH７．８から０．５Ｍナト
リウム フォスフェート、pH７．０に至る５００mlのグ
ラジエントを行なった。１０グループのフラクションに
保管し、４℃、一夜透析した。これらのミナクチビン活
性及び蛋白質含有量につき評価した。第２４図による
と、ミナクチビンは、グラジエントの最終段階で溶出さ
れ、最大活性フラクションは、５０％の回収率を示し
た。比活性は、６５１単位／mgで、２１倍に精製された
ことを示す。各フラクションから７０μｇの蛋白質を回
収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した。その結果を第２５
図に示す。

実施例３ 腫瘍組織のミナクチビンの効果 この実施例では、結腸腫瘍細胞に対するミナクチビンの
効果について検討するに際して使用した方法について詳
しく説明する。

方法 １）組織サンプル及び均質化 人結腸のサンプルは、外科的に切除して入手した。粘膜
筋より解剖操作で結腸粘膜を取り出し、これをHank's溶
液で洗浄した。肉眼的にみて正常な粘膜及び直性癌腫を
各結腸から採取し、凍結貯蔵した。一部を解凍し、計量
され、mg組織当り（含水重量）１０μｌの緩衝液を用い
て、０．５％トライトンＸ−１００を含むpH７．８、５
０ｍＭグリシンで静かにホモゲナイズした。

２）プラスミノーゲン アクチベーターの比色定量アッ
セイ 組織均質物及び細胞培養上澄のプラスミノーゲン アク
チベーター含有量を、Coleman及びGreenの評価方法(12)
によって実施例１と同様にして測定した。前記のように
して調製した均質物は、評価に先立って、１：１０に希
釈した。

３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び線維素オーバーレイ Granelli-Piperno及びReichの方法(13)を、実施例１に
記載した如く、当該分離技術のめに利用した。組織均質
物を、１１％アクリルアミド ゲルに、（ａ）そのまま
未処理で、（ｂ）アフィニティーで精製した人プラスミ
ノーゲンと、３７℃、３０分間培養した後、（ｃ）単核
細胞ミナクチビンと、２３℃、９０分間培養した後、又
は（ｄ）先ず、プラスミノーゲンと、次いで、ミナクチ
ビンと培養した後、通した。上記培養物の未処理サンプ
ル（６０μｌ）を、ＳＤＳサンプル緩衝液（４０μｌ）
を用いて、ゲルに通した。

４）ラジアル ディフュージョン アッセイ 実施例１に記載した通りに、ラジアル ディフュージョ
ンアッセイを行なった。培養に用いたプロテアーゼは、
カリクレイン（１．５μｇ）、プラスミン（１５０μ
ｇ）、マウス ウロキナーゼ（２．５ｍＰＵ）ＨＰＡ６
６（メラノーマ培養上澄）、人ウロキナーゼ（１２．５
ｍＰＵ）及びＣＯＬＯ３９４上澄（１．３ｍＰＵ ＨＰ
Ａ５２を含む）である。これらの酵素は、過剰量のミナ
クチビンと、２３℃で９０分間培養し、次いで、ゲルに
供した。

５）結腸腫瘍細胞の培養 人結腸腫瘍セルラインＣＯＬＯ３９４(28)を、１０％牛
胎児血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０中で培養し、２
週間経過させた。

ミナクチビン及び腫瘍細胞の酵素の効果を研究するため
に、約３×１０⁶cells/wellを、６−place multi-well
plate(Linbro No.76-058-05）に供した。一夜付着培養
させた後、細胞を洗浄し、４８時間、血清不存在のＲＰ
ＭＩ−１６４０で培養した。三つの実験用培地として、
１）人プラスミノーゲン（１５μｇ／ml）、２）プラス
ミノーゲンとミナクチビン（１ＰＵのウロキナーゼと等
価）、３）プラスミノーゲン、ミナクチビン及びトラシ
ロール（１８μｇ／ml）、を更に用いた。

６）ミナクチビン標品 この実験で用いたミナクチビンは、実施例６に記載され
た通り、人血単核細胞の培養上澄から調製した。プラス
チック皿上での単核細胞の付着培養は、ムラミル ジペ
プチド０．０５μｇ／mlを含むＰＲＭＩ１６４０で３時
間行なった。

結果 腫瘍組織均質物のミナクチビンの効果 １）正常及び腫瘍結腸組織のプラスミノーゲン アクチ
ベーター含有量の比較 ａ）比色定量アッセイ 結腸粘膜の希釈ホモジエネートのプラスミノーゲンアク
チベーターについて、Coleman及びGreenの方法(12)で評
価を行なった。この評価では、用いたプラスミノーゲン
基質が前酵素の活性化に充分な量で含まれていることか
ら、プラスミノーゲン アクチベーター酵素（すなわ
ち、前酵素及び活性化酵素）の全量を測定した。希釈ホ
モジエネート中のプラスミノーゲン非依存性の天然プロ
テアーゼによるリジン チオエステル プラスミン基質
の直接的加水分解は、発色展開に著しい影響を示さなか
った。癌化した結腸の組織学上の正常領域と、直性結腸
癌組織について、第２６図に示した如くプラスミノーゲ
ン アクチベーター活性を評価した。

正常組織ホモジエネートの活性は、平均値０．５±０．
１６の範囲に集中していた。サンプルの一部がＳＤＳ−
ＰＡＧＥ 線維素オーバーレイでウロキナーゼ活性バン
ドを示したが、より高感度の比色定量アッセイでは、正
常組織のホモジエネートは全てプラスミノーゲン アク
チベーターを含んでいた。これは低レベルのウロキナー
ゼ タイプのプラスミノーゲン アクチベーター（ＨＰ
Ａ５２）によるものであって、偏在する組織タイプのプ
ラスミノーゲン アクチベーター（ＨＰＡ６６）による
ものではないと考えられる(29)。

しかしながら、腫瘍ホモジエネートは、１０倍の吸収レ
ンジをカバーするプラスミノーゲン アクチベーター活
性の広いスペクトルを示した。平均吸収値は、１．１５
±０．５６であり、正常の組織ホモジエネートの平均値
の２倍以上であった。しかしながら、この割合は、全て
の材料サンプルを包含するものであり、腫瘍サンプル
を、各結腸の正常組織の相当するサンプルと組み合わせ
た場合（第２７図）は、５倍以上の組み合わせもあり、
平均値は３倍以上に増加した。

ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び線維素オーバーレイ 癌化した結腸の組織学的に正常な領域から得た結腸粘膜
は、人メラノーマ培養上澄の組織タイプ プラスミノー
ゲン アクチベーター（ＨＰＡ６６）に相当する、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥの線維素−アガロース ツイモグラム上で
の、唯一の主要溶解バンドを形成した（第２８Ａ図）。
分子量約９６，０００及び１１０，０００に相当する他
のバンドも形成された。しかしながら、正常組織のホモ
ジエネートは、高分子量のウロキナーゼ、すなわちＨＰ
Ａ５２に相当する溶解バンドを形成した（以下参照）。
代表的な正常な結腸の非希釈ホモジエネートをアッセイ
緩衝液中で人プラスミノーゲンと培養すると、プラスミ
ノーゲンの活性化が起こりプラスミンのバンドがツイモ
グラム上のＭｒ８５，０００上に形成された（第２８Ａ
図、レーン２）。サンプルを取り除き、プラスミノーゲ
ンと２時間培養すると、ＨＰＡ６６の活性は、消失し
た。９６，０００及び１１０，０００の主要バンドもす
みやかに消失した。

癌組織のホモジエネートは、ＨＰＡ５２の主要バンド
と、相対強度を異にした第２のＨＰＡ６６ バンドを形
成した（時として、ほとんどわずかである）（第２８
Ｂ）。前記した副次的なバンドは、通常、きわめてわず
かであるか又は形成されない。プラスミノーゲンと前培
養すると、３７℃、２時間後に消失した（第２８Ｂ図、
レーン２〜４）。生産されたプラスミン（Ｍｒ８５，０
００の溶解）は、ＨＰＡ５２を分解して約Ｍｒ３３〜３
６，０００の活性分解物を生産した。

２）ウロキナーゼ タイプのプラスミノーゲン アクチ
ベーターとミナクチビンの結腸粘膜ホモジエネート中で
の相互作用 正常結腸組織ホモジエネートを電気泳動に先立ってミナ
クチビンで処理しても、組織タイプのプラスミノーゲン
アクチベーターによって形成される溶解バンドに影響
を与えないが、副次的なＨＰＡ５２バンドは、ほとんど
すべて消失させる（第２９Ａ）。

ホモジエネートをプラスミノーゲンと前培養すると、Ｈ
ＰＡ５２ バンドを消失させ、その活性分解物のＭｒ３
３〜３６，０００に相当するわずかなバンドを形成させ
る、プラスミンが生産された。プラスミノーゲンと前培
養し、ミナクチビンで処理すると、ＨＰＡ５２ バンド
及び３３〜３６，０００のわずかなバンドは消失した。

腫瘍ホモジエネートは、ミナクチビンと培養することに
よって消失される、顕著なＨＰＡ５２の溶解バンドを形
成した（第２９Ｂ図）。電気泳動に先立ってプラスミノ
ーゲンと前培養すると、プラスミンが生産され、これ
は、正常組織ホモジエネートで観察されたように、ＨＰ
Ａ５２をＨＰＡ３３〜３６に、順次、変換された。この
ように、ミナクチビンはＨＰＡ６６に影響を与えない
が、腫瘍結腸組織及びこれらの正常結腸組織のホモジエ
ネート中のＭｒ５２，０００バンドを形成する酵素は、
人単核細胞ミナクチビンと培養すると影響を受ける。ホ
モジエネートを、当初、プラスミノーゲンで、次いでミ
ナクチビンで処理すると電気泳動の後に通常見られるＨ
ＰＡ５２バンドは消失し、ＨＰＡ３３〜３６に相当する
バンドも無くなった（第２９Ｂ図）。このように、ＨＰ
Ａ５２をミナクチビンで不活性化も、次いでプラスミノ
ーゲンで処理すると、未処理ホモジエネートの場合より
も著しく効果的であるように見える。このことは、組織
中のＨＰＡ５２の形は、実際には、前酵素であり、ミナ
クチビンとの反応は、おそらくプラスミンによる。活性
酵素への変換に関することを示唆している。

３）ウロキナーゼ タイプのプラスミノーゲン アクチ
ベーターの前酵素体についてのミナクチビンの特異性
（比色定量アッセイ） ミナクチビンとウロキナーゼの化学量論的な相関関係
は、ウロキナーゼ濃度の広い範囲、すなわち、１０ｍＰ
Ｕから１０００ｍＰＵにわたって適用される（第３０
図）。しかしながら、結腸粘膜の希釈ホモジエネート中
のプラスミノーゲン アクチベーターのミナクチビンに
よる阻害作用を滴定定量してみると、このような特性は
示されない（第３１図）。実際には、腫瘍組織ホモジエ
ネート中の増強された活性を阻害する場合よりも、正常
組織中のＨＰＡ５２の低レベルの活性を阻害する場合
は、より多くのミナクチビンが必要とされる。このこと
は、組織ホモジエネート中のＨＰＡ５２の前酵素体の存
在と矛盾するものではない。

このＨＰＡ５２前酵素体の存性は、結腸腫瘍の形質転換
セルラインＣＯＬＯ３９４を培養して得た血清不存在の
上澄を用いて示される。このセルラインにより分泌され
るプラスミノーゲン アクチベーターは、本質的に、わ
ずかのより高分子量のバンドを伴ったＨＰＡ５２から成
り、これは、腫瘍組織ホモジエネートと非常に類似した
パターンを示す（第３２図）。プラスミノーゲンが培地
中に含まれていると、ＨＰＡ５２のＨＰＡ３６への変換
を促進するプラスミン（第３３図、比色定量アッセイで
示される）が生産される。培地に、ミナクチビンとプラ
スミノーゲンが加えられると、培養中に生産されるプラ
スミノーゲン アクチベーターは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及
び線維素オーバーレイ展開（第３２図）、及び比色定量
アッセイ（第３３図）に見えられる如く、不活性化され
る。しかしながら、プラスミンの有力な阻害剤であるト
ラシロールを、プラスミノーゲン及びミナクチビンと一
緒に培地に添加すると、不活性化は起らない（第３２
図）。トラシロールは、ミナクチビンとウロキナーゼの
反応に直接影響を与えないので、これらの結果は、ＣＯ
ＬＯ３９４により生産されるＨＰＡ５２は、活性の発現
及びミナクチビンとの反応にプラスミンを必要とする前
酵素体であること示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ線維素オーバ
ーレイシステムにおいては、活性化は、プラスミノーゲ
ン基質中に存在するわずかのプラスミンにより生じる。
これは、プラスミンがトラシロールにより阻害されると
生じない。

これらの結果は、主要な人癌腫が、隣接する組織の場合
よりも著しく多量のウロキナーゼタイプのプラスミノー
ゲン アクチベーターを生産することを示すものであ
る。ミナクチビンは、直接、組織ホモジエネートに添加
すると、人ウロキナーゼタイプのプラスミノーゲン ア
クチベーター、ＨＰＡ５２を少なくとも部分的に阻害す
る。この不活性化作用は、ウロキナーゼ タイプのプラ
スミノーゲン アクチベーター、ＨＰＡ５２に特異的で
ある。ミナクチビンは、ＨＰＡ５２前酵素体には作用し
ないこと、ミナクチビンと反応する前にＨＰＡ５２を活
性型に変換するためにプロテアーゼ活性が必要とされる
こと（この場合、プラスミン）、が確認された。

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【図面の簡単な説明】

第１図 血液の単核細胞培養にるミナクチビンの生産。 単核細胞の付着培養において、△−△は、リポポリサッ
カライド（０．１mg/ml）、○−○は、ムラミル ジペ
プチド（１０μｇ／ml）を含むコントロール培地。□−
□は、Ａ：培養上澄をウロキナーゼで評価し、２４時間
毎に新鮮培地に置き換えた。 Ｂ：細胞溶解質中のミナクチビンのコントロール。 第２図 単核細胞の培養中のミナクチビン活性度合。２４時間培
養した上澄を希釈して評価した。 △−△、１：５希釈、□……□、１：１０、 ○−○又は……、１：２０ 第３図 人腹膜マクロファージの培養によるミナクチビンの生産
及び分泌。付着マクロファージは、コントロール培地△
−△、又はムラミル ジペプチド（１０μｇ／ml）含有
培地□−□で生長した。下の２本の曲線は、溶解質を、
上の２本の曲線は上澄を示す。 第４図 人骨髄質マクロファージの第２培養におけるミナクチビ
ンの生産及び分泌。条件は、第３図と同じ。 第５図 線維素溶解におけるミナクチビンの効果。 プロテアーゼ溶液（１０μｌ）を、ミナクチビン培養上
澄（１０μｌ）と共に（上の二列）又は、加えることな
く（下の列）と前培養し、混合物（５μｌ）を、プラス
ミノーゲンを補足した線維素／アガロース ゲルに供し
た。２０μｌの前培養当たり用いた酵素とその量は、
２．トリプシン１００ｎｇ、プラスミン６００ｎｇ、
４．ＣＵＫ（Calbiochemウロキナーゼ）５０ｍＰＵ、
５．ＳＵＫ（Sigmaウロキナーゼ）１００ｍＰＵ、及び
６．メラノーマ培養上澄の希釈物、であり、コントロー
ル ウエル １及び７は、緩衝液及びミナクチビン上澄
を、各々含有する。ゲルは、３０℃で２０時間培養し
た。 第６図 ミナクチビン前培養後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理。 ＣＵＫ（３０ｍＰＵ、レーン１及び２）、ＭＬＡ１４４
（３０μｌ希釈培養上澄、レーン３及び４）、人メラノ
ーマ（２０μｌ培養上澄、レーン５及び６）、及びラッ
ト１３７６２腫瘍（２０μｌ １％ホモジエネート、レ
ーン７及び８）のプラスミノーゲン アクチベーター
を、ミナクチビン培養上澄の存在下（偶数番号）及び不
存在下（奇数番号）でＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理に先立って
前培養した。３７℃で２０時間培養して線維素オーバー
レイ ゲルで展開した。 第７図 ミナクチビンと前培養することによるＣＵＫの不活性
化。ウロキナーゼ（４ｍＰＵ）標品を、単核細胞培養上
澄（６μｌ）と、２３℃で、種々の時間前培養し、次い
で、テストに示した如く比色定量アッセイを行なった。
上の曲線は、緩衝液で前培養したウロキナーゼである。 第８図 ＣＵＫのミナクチビンによる滴定定量 ウロキナーゼ標品（４ｍＰＵ）を、希釈ミナクチビン上
澄（２０μｌ）と前培養し、次いで、比色定量アッセイ
を行った。 第９Ａ図 ミナクチビンでＣＵＫを不活性化するためのプロテアー
ゼ阻害剤コントロール。 ウロキナーゼ標品（２０ｍＰＵ）を、以下のプロテアー
ゼ阻害剤と前培養した。すなわち、レーン１：コントロ
ール、レーン２：トラシロール（０．２mg/ml）、レー
ン３：α₁−抗トリプシン（１６μｇ／ml）、レーン
４：トラネキサミン酸（３ｍＭ）、レーン５：ヨードア
セトアミド（３ｍＭ）、レーン６：ＥＤＴＡ（６ｍ
Ｍ）、レーン７：大豆トリプシン阻害剤（０．１６mg/m
l）、レーン８：ＳＤＳ（０．６％）、レーン９：ベン
ズアミジン（３ｍＭ）及びレーン１０：ミナクチビン培
養上澄（２０μｌ）。 第９Ｂ図 プロテアーゼ阻害剤の存在下におけるＣＵＫのミナクチ
ビンによる不活性化。 第９Ａ図の前培養を、各々プロテアーゼ阻害剤前培養に
含まれるミナクチビン培養上澄（２０μｌ）で繰り返し
た（レーン２〜９）。 第１０図 ２．５mlのアルブミンを含まないミナクチビン培養上澄
−、及び１．０mlの１％血清アルブミンを含む未調整Ｒ
ＰＭＩ……の溶出について、ウロキナーゼ阻害作用及び
蛋白質を評価した。 セファクリル Ｓ ３００（９５×１．５cm）をカラム
に詰め、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭグリシン
（pH７．８）で６ｍ／hrの速度で溶出させた。矢印は、
ボイド ボリューム及びベッド ボリュームを示す。 第１１図 プロテアーゼ阻害作用のラジアル ディフュージョン線
維素ゲル アッセイ。 Ａ列：ＨＰＡ６６を含む人メラノーマ セル ラインの
上澄、Ｂ列：ＨＰＡ５２及びＨＰＡ３６を含むウロキナ
ーゼ、Ｃ列：トリプシン、Ｄ列：プラスミン。カラム１
及び２は、人腹膜マクロファージ及び血液単核細胞の上
澄を、各々、含み、カラム４〜６は、骨髄質マクロファ
ージ、腹膜マクロファージ及び血液単核細胞の溶解質を
各々含む。カラム３及び７は、培地及び溶解緩衝液を含
むコントロールを示す。 第１２図 プロテアーゼ阻害作用のラジアル ディフュージョン線
維素ゲル アッセイ。 Ａ列：緩衝液コントロール、Ｂ列：単核細胞のフェニル
−セファロース精製ミナクチビン、Ｃ列；Ｕ９３７細胞
のフェニル−セファロース精製ミナクチビン、Ｄ列：胎
盤阻害剤（Calbiochem）、カラム１：豚プラスミン６０
μｇ／ml(Sigma）、カラム２：ＨＰＡ５２を含むウロキ
ナーゼ、ＣＵＫ：５ＰＵ／ml、カラム３：ＨＰＡ３６を
含むウロキナーゼ、ＳＵＫ：５ＰＵ／ml、カラム４：人
メラノーマ セルライン上澄、ＭＭ１７０：ＨＰＡ６６
含有、カラム５：マウス ウロキナーゼ、１／１０希釈
のマウスの尿。 第１３図 ミナクチビンによって生じるＵ９３７及び単核細胞の電
気泳動移動度。 サンプルを６〜１６％グラジエントの未変性（非ＳＤ
Ｓ）ポロアクリルアミドゲルで電気泳動し、１０mlのＳ
ＵＫ、１ＰＵ／mlで、２３℃、１時間培養し、線維素／
アガロースゲルにオーバーレイし、一夜展開させた。同
一サンプルを、電気泳動し、Comassie Blueで発色させ
た。レーン４：標準分子量、レーン３：フェニル−セフ
ァロース精製Ｕ９３７ミナクチビン、レーン２：フェニ
ル−セファロース精製単核細胞ミナクチビン、レーン
１：レーン３と同じ。 第１４図 フェニル−セファロースによる単核細胞ミナクチビンの
精製状況 フェニル−セファロース カラムを、２Ｍ ＮａＣｌを
含むpH７．８の５０ｍＭグリシン緩衝液で平衡にした。
２Ｍ ＮａＣｌに合わせた単核細胞上澄を通した後、グ
リシン−ＮａＣｌを用いて洗浄した。グリシン緩衝液中
ＮａＣｌの下降グラジエントによってミナクチビンが溶
出された。−：蛋白質（Lowryアッセイによる、ＯＤ７
５０nm）、……：ＮａＣｌ濃度、……：ミナクチビンの
ウロキナーゼ阻害作用（逆ピーク状）。 第１５図 単核細胞ミナクチビンの生体外ラベリング。 付着単核細胞を、ムラミル ジペプチドの存在下で³⁵Ｓ
−メチオニン（１mCi、８００Ci/mmol、Amersham）を添
加して培養した。上澄標品を３日経過の時点で取り除い
た。ミナクチビンをフェニル−セファロースを用いて精
製した。各標品をCentricon３０（Amicon）を用いて５
０倍に濃縮し、５〜１５％アクリルアミド グラジエン
トによるＳＤＳ−ＰＡＧＥで、その３０μｌについて解
析した。ラベル化された蛋白質をフルオロ グラフィー
（Amplify、Amersham）により探知し、Kodak O-MATＸ線
フィルム上に、ゲルを１０日間さらした。レーン２〜６
は、示された時間に取り除いたサンプル、レーン７は、
フェニル−セファロース精製ミナクチビン標品、レーン
１及び８は、高及び低分子量の標準を、各々、示す。 第１６図 生体内でラベル化した単核細胞ミナクチビン及びウロキ
ナーゼ複合体の精製。 条件は、基本的には、第１５図及び明細書に記載したの
と同様。各サンプルを、ゲルに３０μｌ通す前に、１０
倍に濃縮した。１８日間さらした。レーンＡは、フェニ
ル−セファロース精製ミナクチビン、レーンＢは、Blue
セファロース精製ミナクチビン、レーンＣは、電気泳動
の直前にサンプルに０．１％２−メルカプトエタノール
を添加することを除き、Ｂと同様。各サンプルは、２７
ＰＵ ＳＵＫによる２３℃、９０分間の（−）又は
（＋）前培養で示される。外側のレーンは、標準分子量
を示す。 第１７図 ミナクチビン生産に対するゼラチンの効果 Ｕ９３７細胞（１．３×１０⁶cells/ml）を血清不存在
培地でデキサメタゾンと、０．７％ゼラチンの存在下
（×−×）及び不存在下（・−・）で、培養した。 第１８図 ステップpH溶出法によるフェニル−セファロース クロ
マトグラフィー 実施例１記載の如く行なった。Ａ部分は、溶出を５０ｍ
Ｍクエン酸塩、pH５．０、０．５Ｍ ＮａＣｌに、Ｂ部
分は、５０ｍＭグリシン、pH７．８に変えた。 第１９図 ステップ式pH溶出法によるＤＥＡＥ−セファロース ク
ロマトグラフィー ミナクチビン含有上澄を、ＤＥＡＥ−セファロースを用
いて、精製実施例３記載の如く、フラクションに分画し
た。ミナクチビン活性は、カラム外に示す。 第２０図 予備的な未変性ゲル電気泳動 フェニル−セファロース精製ミナクチビン標品を、精製
実施例４記載の如く、更に、未変性ゲル電気泳動で分画
した。ゲル切片から溶出したミナクチビン活性は、カラ
ム外に示す。下に、シルバー発色法による発色ゲルのレ
ーンを示す。 第２１図 塩グラジエント溶出法によるＤＥＡＥ−セファロース
クロマトグラフィー ミナクチビン含有上澄を、精製実施例６の如く、ＤＥＡ
Ｅ−セファセル カラムで分画した。生物活性の単位
は、カラム外に示す。……：Ａ２７５、……：ＮａＣｌ
濃度。 第２２図 pHグラジエントによるＤＥＡＥ−セファセル クロマト
グラフィー ミナクチビン含有上澄を精製実施例７の如く分画した。
生物活性の単位は、カラム外に示す。蛋白質含有量は、
カラム内に示す。……：Ａ２７５、……：pH。 第２３図 ＤＥＡＥ−セファセル フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ処理 第２２図に示したＤＥＡＥ−セファセル クロマトグラ
フィーのフラクションから得た蛋白質７０μｌを、Laem
mli法(26)によりＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理した。レーン
１：分子量マーカー、レーン４：フラクション３０〜４
０、レーン５：フラクション４０〜５０、レーン６：５
０〜６０、レーン７：６０〜７０、レーン８：７０〜８
０、レーン９：８０〜９０、レーン１０：９０〜１０
０。 第２４図 ハイドロキシアパタイト クロマトグラフィー ミナクチビン含有上澄を、精製実施例８の如く、分画し
た。生物活性単位は、カラム外に示す。蛋白質含有量
は、カラム内に示す。……：Ａ２７５、……：Ｎａフォ
スフェート濃度。 第２５図 ハイドロキシアパタイト クロマトグラフィーのフラク
ションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理 第２４図のハイドロキ
シアパタイト クロマトグラフィーのフラクションから
得た蛋白質７０μｇを、Laemmli法(26)の如く、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥで解析した。レーン：８フラクション７０〜
８０、レーン９：フラクション８０〜９０、レーン１
０：９０〜１００。 第２６図 人結腸粘膜ホモジエネート中のプラスミノーゲン アク
チベーターの比色定量アッセイの結果を、ヒストグラム
は示す。プラスミノーゲン基質は、わずかのプラスミン
を含んでおり、前酵素と活性酵素の総和を、結果は示し
ている。活性は、４１２nmの吸収を示す。同じ評価条件
で、４ｍＰＵの市販ウロキナーゼは、４１２nmで０．９
の吸収を示した。 第２７図 １５の結腸腫標品（斜線の長方形）のプラスミノーゲン
アクチベーター活性を、同じ結腸由来の正常組織（長
方形）の活性と比較した。サンプルは、左から右へ、腫
瘍：正常の割合（Ｔ／Ｎ）値で増加するように並べた。 第２８Ａ図 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理後の線維素アガロース オーバー
レイで示される、正常結腸粘膜のホモジエネート中に存
在するプラスミノーゲン アクチベーターの種類。 レーン１は、未処理サンプル、レーン２〜４は、ホモジ
エネートを人プラスミノーゲンと３７℃で、３０、６０
及び１２０分間培養した場合の効果を示す。溶解ゾーン
は、ａ）１１，０００のプラスミノーゲン アクチベー
ター、ｂ）Ｍｒ９６，０００のプラスミノーゲン アク
チベーター、ｃ）プラスミン、Ｍｒ８５，０００及び
ｄ）ＨＰＡ６６、Ｍｒ６６，０００。 第２８Ｂ図 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理後の線維素アガロース オーバー
レイで示される代表的な結腸癌標本ホモジエネート中に
存在するプラスミノーゲン アクチベーターの種類。 レーン１は、未処理サンプル、レーン２〜４は、人プラ
スミノーゲンと３７℃で、３０、６０及び１２０分間培
養した場合。ゾーンＡ〜Ｄは、正常結腸、ゾーンＥは、
ＨＡＰ５２（Ｍｒ５２，０００）及びゾーンＦは、ＨＰ
Ａ３３〜３５（Ｍｒ３３〜３６，０００）。 第２９Ａ図 代表的なＨＰＡ５２活性を示す。組織学的に正常結腸サ
ンプルのホモジエネート中のプラスミノーゲン アクチ
ベーターに対するミナクチビンの効果。 レーン１は、コントロールの処理したサンプル、レーン
２は、ミナクチビンと２３℃で６０分間前培養した場合
の効果、レーン３は、ミナクチビンと３７℃で３０分間
前培養し、次いで、コントロール緩衝液と２３℃で３０
分間培養した場合の効果、レーン４は、ホモジエネート
をプラスミノーゲンと３７℃で３０分間前培養し、次い
で、２３℃で６０分間ミナクチビンにさらした場合。溶
解ゾーンは、Ａ−プラスミン、Ｍｒ８５，０００、Ｂ−
ＨＰＡ６６、Ｍｒ６６，０００、Ｃ−ＨＰＡ５２、Ｍｒ
５２，０００及びＤ−ＨＰＡ３３〜３６、Ｍｒ３３〜３
６，０００。 第２９Ｂ図 結腸腫瘍ホモジエネートを、第２９Ａ図の如く処理し
た。 第３０図 人ウロキナーゼのミナクチビンによる比色定量滴定アッ
セイ ウロキナーゼを、適宜の範囲に希釈する前に２３
℃で９０分間ミナクチビンと前培養した。三つの曲線
は、左から右へ、１０００ｍＰＵ、１００ｍＰＵ及び１
０ｍＰＵのウロキナーゼを、各々、示す。 第３１図 結腸細胞及び組織の人プラスミノーゲン・アクチベータ
ーのミナクチビンによる比色定量滴定アッセイ 三つの曲線は、左から右へ、正常粘膜抽出物（約０．５
ｍＰＵ）及び結腸腫瘍抽出物（約１０ｍＰＵ）を示す。
後者は、後に前酵素であることが分かった。 第３２図 腫瘍細胞培養プラスミノーゲン アクチベーターに対す
るミナクチビンの効果。 レーン１は、未添加による培養、レーン２は、プラスミ
ノーゲン添加、レーン３は、プラスミノーゲン及びミナ
クチビン添加、レーン４はプラスミノーゲン、トラシロ
ール及びミナクチビン添加。 第３３図 第３２図と同じ実験で得た培養上澄の比色定量アッセ
イ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 999999999 ジ・オーストラリアン・ナシヨナル・ユニ バーシテイー オーストラリア国 オーストラリアン・キ ヤピタル・テリトリー 2601、アクシヨン （番地なし) (72)発明者 ステフエン，ロス・ウエントワース オ−ストラリア国 オーストラリアン・キ ヤピタル・テリトリー 2616、ホルダー、 ハインズ・クレツセント ６ (72)発明者 ゴルダー，ジエフレイ・フイリツプ オ−ストラリア国 ニユ−・サウス・ウエ −ルズ 2106、ニユーポート、ウオルワー ス・ストリート 38 (72)発明者 ゴス，ネイル・ホワード オ−ストラリア国 ニユ−・サウス・ウエ −ルズ 2176、ワールーンガ、キヤンベ ル・ドライブ 118 (72)発明者 アンタリス，トニー・マリー オ−ストラリア国 ニユ−・サウス・ウエ −ルズ 2047、ドラモイン、ヘンレイ・ス トリート 48 (56)参考文献 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，136, 517−522（1983)

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】細菌のリポポリサッカライド、デキサメタ
   ゾン又はフォルボールエステルを使用し生体外でミナク
   チビン生産性細胞を刺激し、次いで該培養上澄みからハ
   イドロフォービック インターラクション クロマトグ
   ラフィー、次いでアフィニテイークロマトグラフィー或
   いは予備的非変性ゲル電気泳動により回収することを特
   徴とする、以下の特性を有するタンパク質ミナクチビン
   の製造方法。 ｉ）フィブリン存在下において、ウロキナーゼタイプの
   プラスミノーゲンアクチベーターは特異的に阻害する
   が、組織タイプのプラスミノーゲンアクチベーターは阻
   害しない； ii）５６℃以上の温度で不安定である； iii）−２０℃での冷凍及びその解凍に対して安定であ
   る； iv）４℃においてのpH範囲５〜９で安定である； ｖ）人ウロキナーゼ或いは人ウロキナーゼタイプのプラ
   スミノーゲンアクチベーターと耐界面活性剤性複合体を
   形成する能力を有する； vi）非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、分子量３２ｋ
   Ｄ、３９−４８ｋＤ或いは６０ｋＤの少なくとも１つの
   バンドを形成し、該バンドはウロキナーゼとインキュベ
   ートされると消失する。
2. 【請求項２】ミナクチビン生産性細胞が、人血の単核細
   胞、ミナクチビン生産性マクロファージ又は単核細胞由
   来の形質転換細胞から選択される特許請求の範囲第１項
   記載のタンパク質ミナクチビンの製造方法。
3. 【請求項３】フォルボールエステルがフォルボール ミ
   ラステート アセテートである特許請求の範囲第１項又
   は第２項記載のタンパク質ミナクチビンの製造方法。
4. 【請求項４】ハイドロフォービック インターラクショ
   ン クロマトグラフィーがフェニルセファロースクロマ
   トグラフィーである特許請求の範囲第１項、第２項又は
   第３項記載のタンパク質ミナクチビンの製造方法。
5. 【請求項５】アフィニテイークロマトグラフィーがシバ
   クロンブルーセファロースクロマトグラフィーである特
   許請求の範囲第１項、第２項、第３項又は第４項記載の
   タンパク質ミナクチビンの製造方法。