CN1019355B - 泯活素的制备方法及其应用 - Google Patents

泯活素的制备方法及其应用

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Abstract

本发明是关于制备泯活素(Minactivin)的方法，泯活素是尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化剂的天然蛋白质钝化剂，这种血纤维蛋白溶酶原活化剂与侵入性肿瘤有关。因此，泯活素是身体内防御肿瘤的入侵和转移的关键因素。将能产生泯活素的细胞在体外培养，然后回收细胞培养的上清液，便可制备出泯活素。经控制培养条件，便可生产出部分纯化的蛋白质泯活素，该泯活素可用于诊断和治疗肿瘤。

Description

本发明是基于发现了在人血单核细胞的粘附单层培养的上清液中含有泯活素（原译“茗萘酊”），这是尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化剂的有效钝化剂。已证明泯活素是这种血纤维蛋白溶酶源活化剂的天然钝化剂，而这种血纤维蛋白溶酶原活化剂与侵入性的肿瘤有关，因此，泯活素是体内防御肿瘤的入侵和转移的关键因素。另外，泯活素还有其他潜在的用途，可在人类的医药范围内作为临床药剂，亦可用于各类癌症的体内外诊断和治疗。泯活素亦已从巨噬细胞和源自单核细胞的转化细胞的培养中分离和鉴定出来。
本发明的第一部分是提供一种基本纯化的产品，泯活素，它是尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化剂的特异性钝化剂。本发明还提供一种含泯活素（尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化剂的特异性钝化剂）的培养上清液，该上清液是由产生泯活素的细胞体外培养得来的。本发明还进一步提供一种由含泯活素的培养上清液得来的产品，在此培养上清液中泯活素至少已部分纯化。泯活素另外的特点将于下详述。
本发明的另一部分是，提供泯活素的生产方法，包括体外培养生成泯活素的细胞及回收培养上清液，从该上清液中可回收得到至少部分纯化的泯活素。经培养可产生泯活素的细胞包括人血的单核细胞、某些巨噬细胞和转化的人细胞系，下面将详尽地介绍这些细胞。含有这些细胞所分泌出来的泯活素的培养上清液经过处理以浓缩泯活素，然后进一步处理以除去上清液中其他组分，从而获得至少部分纯化的泯活素。这种 浓缩和纯化可以靠，例如，苯基-琼脂糖疏水作用层析或二乙胺基乙基-琼脂糖离子交换层析来达到，然后把所需的产物洗脱。这产物可在Cibacron蓝色琼脂糖或羟基磷灰石上进行亲和层析，以便从含有泯活素的产物中除去更多的杂质。
试验证实泯活素是一种蛋白质，其特征是表观分子量约为60-70000（用凝胶过滤层析来测定），而它的抑制作用对Mr52，000（HPA52）和36，000（HPA36）的血纤维蛋白溶酶原活化剂（如尿激酶）具有特异性，表现在：1）抑制依赖于血纤维蛋白溶酶原的纤维蛋白溶解，ⅱ）在比色测定中在血纤维蛋白溶酶原活化的水平上起抑制作用，和ⅲ）在培养介质中预温育后，会不可逆地丧失激活血纤维蛋白溶酶原的活性（可用电泳现象来证明）。由泯活素和HPA36型血纤维蛋白溶酶原活化剂所形成的复合物对洗涤剂具有抗性，其Mr在70-75，000的范围内（泯活素-HPA36复合物）。
已进一步证明泯活素优先抑制尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化剂，而不是胰蛋白酶、血纤维蛋白酶或“组织型”的血纤维蛋白溶酶原活化剂（HPA66，或Mr66，000的活化剂）。
泯活素不只由人单核细胞产生，还可由某些巨噬细胞和巨噬细胞系的转化细胞产生。特别是粘附单层培养的腹腔和骨髓巨噬细胞，可产生和分泌出相当大量的泯活素。在培养液中有地塞米松存在的条件下，人巨噬细胞系U937亦可产生泯活素。在本发明在这方面的进一步发展中，粘附单层培养的血单核细胞产生泯活素可被胞壁酰二肽（佐剂肽）、细菌脂多糖或含淋巴因子的活化人淋巴细胞培养上清液所刺激或增强。
当人结肠癌细胞系COLO    394的培养中加入泯活素时，它特异性地抑制血纤维蛋白溶酶原活化剂（HPA52），从比色测定的电泳可证明之。另外，泯活素亦可特异地抑制外科切除的人肿瘤组织匀浆中血纤维蛋白溶酶原活化剂的活性。已经证明在结肠肿瘤组织中比正常组织中的血纤维 蛋白溶酶原活化剂水平高出相当多。其他的研究者从很多的实体瘤中亦记录到相似的观测结果。
因此，由于泯活素对尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化剂的专一性和在肿瘤组织内明显升高的血纤维蛋白溶酶原活化剂水平，这种产物可用于肿瘤造影，特别是那些产生血纤维蛋白溶酶原活化剂的实体瘤如乳房、前列腺、结肠和肺的肿瘤可用泯活素来确定。虽然这类癌症通常可以用外科手术切除，但用泯活素作肿瘤造影特别有利于检出外科切除后的小转移病灶。由于泯活素是一种天然的产物，它的优点是没有抗原性，可避免体内的排斥问题。在体内对这些肿瘤造影时，可用标记的泯活素（例如用适宜的放射性同位素，如锝99），当施用后，用泯活素所描绘的肿瘤的位置和界限可用熟知的放射性同位素方法测定。
在组织标本中肿瘤的定位和确定界限时，泯活素可以与上述放射性同位素结合，也可按标准的方法用适宜的酶（或其他适宜的试剂）与泯活素结合而标记之。当泯活素-酶复合物与组织标本接触时，泯活素在尿激酶的分泌处和高浓度处与其反应，从而确定肿瘤的界限。在尿激酶高浓度处测定泯活素-酶复合物，可用熟知的方法，例如采用酶的底物，然后用一种指示剂检测酶对底物的作用。
除了用作肿瘤造影外，泯活素亦可用来减低肿瘤的血纤维蛋白溶酶原活化剂活性以直接治疗肿瘤。由于在肿瘤侵袭周围组织的过程中亦涉及这种活性，因此泯活素可调控和抑制肿瘤的侵袭。
图1用血液中单核细胞的培养来生产泯活素。
粘附的单核细胞培养于：对照介质△-△中，加上脂多糖（0.1μg/ml）○……○或胞壁酰二肽（10μg/ml）□……□。A，收集培养上清液，并用尿激酶来测定，每24小时换一次新鲜介质。B，细胞溶解物中泯活素的含量。
图2泯活素活性对培养中单核细胞数目的依赖性。
以图中所示各种细胞数培养着24小时后，上清液在未稀释△-△，或按1∶5□……□，1∶10○……○，1∶20……稀释的条件下测定。
图3人腹腔巨噬细胞培养产生和分泌的泯活素。
粘附的巨噬细胞生长对照介质△-△或加胞壁酰二肽（10μg/ml）的介质□……□中。
下面两条曲线代表细胞溶解物，上面两条线代表上清液。
图4在二次培养中人骨髓巨噬细胞产生和分泌的泯活素。
条件同图3所示。
图5泯活素对纤维蛋白溶解的影响。
蛋白酶溶液（10μl）与含（上面两排）或不含（最下一排）泯活素的培养上清液（10μl）预先温育，将此混合液加入到含血纤维蛋白溶酶原的纤维蛋白/琼脂糖凝胶板上的小孔内。所采用的酶及其在每20μl预温育液中的加入量是：2.胰蛋白酶，100ng;3.血纤维蛋白溶酶，600ng;4.CUK（Calbiochem公司的尿激酶），50mPU;5.SUK（Sigma公司的尿激酶），100mPU;6.未稀释的黑素瘤培养上清液。对照孔1和7分别含有测定用缓冲液和泯活素上清液。该凝胶于37℃温育20小时。
图6与泯活素预温育后的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电脉（SDS-PAGE）。
来自CUK（30mPU，第1和第2行），MLA    144（30μl未稀释的培养上清液，第3和第4行），人黑素瘤（20μl培养上清液，第5和第6行）和大鼠13762肿瘤（20μl1%均浆，第7和第8行）的血纤维蛋白溶酶原活化剂用含（双数）或不含（单数）泯活素的培养上清液（30μl）预先温育，然后进行SDS-PAGE，在凝胶上涂纤维蛋白后在37℃温育20小时即显示区带。
图7预先用泯活素温育以钝化CUK。
尿激酶（4mPU）与单核细胞培养上清液（6μl）于23℃预先温育，温育 时间如图示，然后按正文所述的比色法测定。上面一条曲线是与缓冲液预先温育的尿激酶。
图8用泯活素来滴定CUK。
尿激酶（4mPU）与不同稀释度的泯活素上清液（20μl）预先温育，然后按正文所述的方法比色测定。
图9A泯活素对CUK的钝化作用的蛋白酶抑制剂对照。
尿激酶（20mPU）与下列蛋白酶抑制剂预温育：第1行，缓冲液对照;第2行，抑肽酶（0.2mg/ml）;第3行，抗胰蛋白酶α1（16μg/ml）;第4行，4-氨甲基环己酸（Tranexamic acid）（3mM）;第5行，碘乙酰胺（3mM）;第6行，乙二胺四乙酸;第7行，大豆胰蛋白酶抑制剂（0.16mg/ml）;第8行，十二烷基硫酸钠（0.6%）;第9行，苯甲脒（3mM）;第10行，泯活素培养上清液（20μl）。
图9B在有蛋白酶抑制剂的情况下泯活素对CUK的钝化作用。
重复图9A所述的预温育，但在每个有蛋白酶抑制剂的预温育液中（第2至第9行）加入泯活素培养上清液（20μl）。
图10    2.5ml不含白蛋白的泯活素培养上清液-及1.0ml含1%人血清白蛋白的非条件化RPMI培养液……的洗脱图，分别测定尿激酶活性抑制和蛋白质量。
Sephacryl    S    300柱（95×1.5cm），用含0.15M    NaCl的50mM甘氨酸（pH7.8）洗脱，流速6ml/hr。箭头表示间隙体积和床体积。
图11蛋白酶抑制的径向扩散纤维蛋白凝胶测定。
A排，含HPA66的人黑素瘤细胞系上清液;B排，含HPA52和HPA36的尿激酶;C排，胰蛋白酶;D排，血纤维蛋白溶酶。第1行和第2行分别是人腹腔巨噬细胞和血单核细胞的培养上清液;第4-6行分别是骨髓巨噬细胞、腹腔巨噬细胞和血单核细胞的溶解物;第3和第7分别是培养介质和溶细胞用的缓冲液对照。
图12蛋白酶抑制的径向扩散纤维蛋白凝胶测定。
A排，缓冲液对照;B排，用苯基-琼脂糖纯化的单核细胞泯活素;C排，苯基-琼脂糖纯化的U937细胞泯活素;D排，胎盘抑制剂（Calbiochem公司产品）。
第1行，猪血纤维蛋白溶酶（Sigma公司产），60μg/ml;第2行，含HPA52的尿激酶，CUK，5PU/ml;第3行，含HPA36的尿激酶，SUK，5PU/ml;第4行，含HPA66的人黑素瘤细胞系的上清液，MM170;第5行，小鼠尿激酶，稀释至1/10的小鼠尿。
图13    U937和单核细胞泯活素的电泳迁移率。
样品在梯度为6-16%的非变性（没有SDS）的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，并用10ml的SUK（1PU/ml）于23℃温育1小时，然后铺在纤维蛋白/琼脂糖凝胶上，显影过夜。另一份相同的样品电泳后用Coomassie蓝染色。第4行，分子量标准;第3行，苯基-琼脂糖纯化的U937泯活素;第2行，苯基-琼脂糖纯化的单核细胞泯活素;第1行同第3行。
图14单核细胞泯活素在苯基-琼脂糖上的纯化图谱。
苯基-琼脂糖（床体积110ml）首先用含2M    NaCl的50mM甘氨酸缓冲液（pH7.8）平衡。然后将NaCl浓度已调节到2M的单核细胞上清液上柱，再用另一份甘氨酸-NaCl冲洗。当甘氨酸缓冲液中NaCl梯度下降时，结合在柱上的泯活素被洗脱下来。各曲线是：蛋白质含量（Lowry法，OD750nm）-，NaCl浓度……，和泯活素对尿激酶的抑制（倒峰）……。
图15活体标记单核细胞泯活素。
粘附的单核细胞在有胞壁酰二肽的条件下培养如正文所述，另加35S-甲硫氨酸（1mCi，800Ci/mmol，Amersham公司产品）。在3天过程中，按图示的时间取上清液样品，然后如正文所述用苯基-琼脂糖纯化上清液中的泯活素。用Centricon 30（Amicon公司产品）将其浓缩50 倍，然后取30μl在丙烯酰胺梯度为5-15%的SDS-PAGE上分析。放射性同位素标记的蛋白质可用荧光图象仪（Amplify，Amersham产）检定，凝胶在Kodak    O-MAT    X-线感光上曝光10天。第2至第6行是在所示的时间取的样品，第7行是苯基-琼脂糖纯化的泯活素，第1行是高分子量标准，第8行是低分子量标准。
图16活体标记的单核细胞泯活素的纯化和尿激酶复合物的形成。
实验条件基本上同图15，并如正文所述。先将每个样品浓缩10倍，然后取30μl加载在凝胶上，曝光时间为18天。A行，苯基-琼脂糖纯化的泯活素;B行，蓝色琼脂糖纯化的泯活素;C行，电泳前立即在样品中加入0.1%的2-巯基乙醇，其余同B行。每个样品都标明是（+）否（-）与27PU的SUK一起预温育90分钟（23℃）。外面各行是分子量标准。
图17白明胶对泯活素生成的影响。
U937细胞（1.3×106细胞/ml）在加地塞米松的无血清介质中培养如正文所述，有（×-×）和没有（。-。）0.7%白明胶。
图18用阶式pH洗脱的苯基-琼脂糖层析。
按例1所述的方法进行层析。在位置A，洗脱液换成50mM柠檬酸，pH5.0，0.5M    NaCl;在位置B，洗脱液换成50mM甘氨酸，pH7.8。
图19用附式pH洗脱的二乙胺基乙基-琼脂糖层析。
含泯活素的上清液在二乙胺基乙基-琼脂糖凝胶柱上分离纯化，如纯化例3所述。空心直方条代表泯活素的活性，蛋白质的A275以代表。
图20制造性非变性凝胶电泳。
经苯基-琼脂糖纯化的泯活素样品，按纯化例4所述的过程，用非变性凝胶电泳再进一步分离。空心的直方条代表从凝胶片洗脱的泯活素活性，其下为银染法染色的相同的凝胶条。
图21
盐梯度洗脱的二乙胺基乙基-Sephacel层析。
含泯活素的上清液在二乙胺基乙基-Sephacel柱上分离，方法如纯化例6。空心的直方条代表生物活性单位;……代表A275。……代表NaCl浓度。
图22pH梯度的二乙胺基乙基-Sephacel层析。
含泯活素的上清液按纯化例7所述的方法分离。空心的直方条代表生物活性单位，实心的直方条代表蛋白质含量;……代表A275，……代表pH。
图23二乙胺基乙基-Sephacel层析组分的SDS-PAGE。
把图22所示的二乙胺基乙基-Sephacel层析所得的各组分合并，从中取出相当于70μg蛋白质的样品，然后按Laemmli法（26）用SDS-PAGE来分析：第1行，分子量标记;第4行是组分第30至第40;第5行，组分第40至第50;第6行，组分第50至第60;第7行，组分第60至第70;第8行，组分第70至第80;第9行，组分第80至第90;第10行，组分第90至第100。
图24羟基磷灰石层析。
含泯活素的上清液按纯化例8的方法分离。空心的直方条代表生物活性单位;实心的直方条代表蛋白质含量;……代表A275;……代表磷酸钠浓度。
图25羟基磷灰石层析组分的SDS-PAGE。
选择一部分图24所示的羟基磷灰石层析组分予以合并，取相当于70μg蛋白质的样品，然后按Laemmli法（26）用SDS-PAGE来分析。第8行，组分第70至80;第9行，组分第80至90;第10行，组分第90-100。
图26频率分布直方图示人结肠粘膜匀浆内血纤维蛋白溶酶原活化剂的比色分析结果。
血纤维蛋白溶酶原底物内含有痕量血纤维蛋白溶酶，因此所得的结果是酶原和活性酶的总和。活性以412nm吸光度表示。在同一测定条件下，4mPU商售尿激酶在412nm的吸光度为0.9。
图27    15个结肠肿瘤样品的血纤维蛋白溶酶原活化剂的活性（条纹直方条）与同一结肠中正常组织的血纤维蛋白溶酶原活化剂的活性（实心直方条）。
按肿瘤：正常组织的比值（T/N）的增长从左至右排列这些样品。
图28A在SDS-PAGE后纤维蛋白/琼脂糖涂层上显示的典型的正常结肠粘膜匀浆中存在的血纤维蛋白溶酶原活化剂的类型。
第1行代表未经处理的样品，第2-4行示匀浆与人血纤维蛋白溶酶原在37℃共孵30，60和120分钟的结果。溶解的区带是：a）Mr110，000的血纤维蛋白溶酶原活化剂;b）Mr96，000的血纤维蛋白溶酶原活化剂;c）Mr85，000的血纤维蛋白溶酶;d）HPA66，Mr66，000。
图28B在SDS-PAGE后纤维蛋白/琼脂糖涂层上显示的典型的结肠癌标本匀浆内存在的血纤维蛋白溶酶原活化剂的类型。
第1行代表未处理的样品，第2-4行是与人血纤维蛋白溶酶原在37℃温育30，60和120分钟后的结果。区带A至D同正常结肠，区带E是Mr52，000的HPA52，区带F是Mr33-36，000的HPA33-35。
图29A泯活素对一个组织学上正常、HPA52活性呈非典型水平的结肠样品匀浆内血纤维蛋白溶酶原活化剂活性的影响。
第1行表示对照处理样品;第2行表示与泯活素在23℃预温育60分钟的影响;第3行表示与血纤维蛋白溶酶原在37℃预温育30分钟，然后再与对照缓冲液在23℃预温育60分钟的影响;第4行，匀浆与血纤维蛋白溶酶原于37℃预温育30分钟，然后在23℃与泯活素接触60分钟。溶解的区带是：A-Mr85，000的血纤维蛋白溶酶;B-Mr66，000的HPA66;C-Mr52，000的HPA52;D-Mr33-36，000的HPA33-36。
图29B结肠肿瘤匀浆，处理同图29A所示。
图30用泯活素滴定人尿激酶的比色活性。
尿激酶与泯活素在23℃预温育90分钟，然后稀释至适合于测定的范围。三条曲线自左至右分别代表1000mPU、100mPU和10mPU的尿激酶。
图31用泯活素滴定结肠细胞和细胞内人血纤维蛋白溶酶原活化剂的比色活性。
三条曲线自左至右分别代表正常粘膜提取液（约0.5mPU）和结肠肿瘤提取液（约10mPU）。后者后来知道是酶原。
图32泯活素对肿瘤细胞培养中血纤维蛋白溶酶原活化剂的影响。
第1行，无任何外加物的培养;第2行，加血纤维蛋白溶酶原;第3行，加血纤维蛋白溶酶原和泯活素;第4行，加血纤维蛋白溶酶原、抑肽酶和泯活素。
图33与图32相同的实验中培养上清液的比色测定。
泯活素的一般特性
泯活素在56℃以上时不稳定，但在-20℃下冻结和融化仍能保持稳定（一个循环丧失活性0-5%）。无菌条件下收集的泯活素上清液，有庆大霉素存在时在4℃储藏两个月活性无明显损失。
虽然离子强度对血纤维蛋白溶酶原的活化作用确有负影响（19），但泯活素与血纤维蛋白溶酶原活化剂的相互作用似不依赖离子强度。虽然尿激酶的活性在比色测定时随盐浓度的增高而被强烈地抑制，但泯活素使尿激酶活性降低的比例仍相同。
泯活素在pH5-9的范围内和4℃下是比较稳定的。丙醇和甲醇（大于10%）可完全消除泯活素的活性。
泯活素在有盐的情况下经Sephacryl    S    300（Pharmacia出品）凝胶过滤，显示泯活素的表观分子量与标准血清白蛋白相同，在60-70，000之间（图10）。由此柱制备所得的富含泯活素的样品经SDS-PAGE-纤 维蛋白涂层分析其特异性（如上述），其结果同图6所示单核细胞培养上清液中泯活素的结果一样。不过，所见到的对尿激酶的钝化作用并不是血清白蛋白的特性，这是由于（a）人血清白蛋白对尿激酶的比色测定没有影响，（b）在蓝色琼脂糖凝胶（Pharmacia）白蛋白亲和层析柱上不能保留泯活素活性，（c）在上述诱导实验中，介质内血清白蛋白的浓度不会随胞壁酰二肽或细胞种类而变化，（d）不加白蛋白或血清时单核细胞也产生泯活素。
泯活素在肿瘤诊断和治疗中的作用
在多种人的主要癌瘤中，尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化剂（HPA52）水平远比正常组织内高。最近Markus和他的同事进行了广泛的研究，研究范围包括肺、前列腺、乳房和结肠的肿瘤（30-32），特别注意了酶的含量和种类，以及短期培养的组织块的分泌率（34-35）。进一步确定了HPS52是另一种基因的产物，不是从组织型血纤维蛋白溶酶原活化剂（HPA66）经蛋白水解或其他修饰后生成的，这类组织型活化剂是所有血管丰富的组织如结肠内皮细胞中普遍存在的（37）。很清楚，在人结肠癌的发展过程中，上皮细胞内的基因表达发生变化，导致更高水平的HPA52。
与细胞血纤维蛋白溶酶原活化剂有关的各种生物过程，包括那些与侵入和组织破坏有关的生理变化，例如炎症反应和肿瘤的转移（38）。与作为肿瘤侵袭的媒介有关的血纤维蛋白溶酶原活化剂参与的特异作用，包括刺激细胞分裂（39）、修饰细胞表面（40）、增强细胞迁移（41），消化包围在肿瘤周围的纤维蛋白（42）和活化胶原酶的能力。
泯活素是尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化剂（HPA52和HPA33）的强效专一性钝化剂，因而，泯活素有很多用途，可作为临床药剂，诊断和治疗炎症和各种癌症。在体内，专一性地调节HPA52的活性，故泯活素不会对组织型血纤维蛋白溶酶原活化剂（HPA66）在维持止血的作用中有任 何影响。另外，由于泯活素是一种天然产物，它的优点是没有抗原性，可避免体内的排斥问题。
因此，泯活素可作为炎症状态的指征。目前，慢性炎症用类固醇治疗，但通常很难控制治疗进程。用泯活素的抗体可以控制体液和组织内巨噬细胞的活化状态，从而控制治疗进程。炎症或慢性溃疡和对粘膜表面的细胞层或上皮的损伤，引致大量的血单核细胞渗入损伤区。在这种环境中，单细胞被刺激而产生泯活素，其产量与炎症的严重程度有关。
另外，泯活素亦可作为组织标本和体内检定肿瘤和确定其界限的试剂。虽然实体瘤通常可用外科手术切除，但用泯活素可以检出手术后产生的小转移灶。在分析组织标本时，泯活素（或其抗体）可用同位素（如I131）来标记，也可与适当的酶或其他化学剂结合。当与组织标本接触时，泯活素会与肿瘤型血纤维蛋白溶酶原活化剂结合于其分泌处。因此，可确定肿瘤的范围。为使结合的泯活素显影，可用已知的方法来完成（44-47）。为体内肿瘤造影，先用一种适当的同位素（如锝99）标记泯活素，施入体内后，用已知的测定放射性同位素的方法（47-50）来定位和确定肿瘤的界限。另外，由于泯活素只与活性型的血纤维蛋白溶酶原活化剂结合，因此泯活素以生长中的或入侵期的肿瘤细胞为靶子。
除了用于诊断外，泯活素也可直接用于肿瘤治疗。泯活素是肿瘤侵入周围组织时涉及到的酶的专一性抑制剂，因此可调控，尤其是抑制肿瘤的生长和转移。另外，泯活素也可用于药物的释放系统，把外源凝集素或毒素直接输送到生长中的肿瘤中，有利于提高专一性和保持特强的抑瘤能力。
以下的例子与附图进一步详细说明泯活素生产、纯化和检定的方法，但这并不意味本发明的范围局限于这些例子。
实例1    泯活素的生物学检定及其特征
方法
1.血纤维蛋白溶酶原活化剂的比色测定
用Coleman和Green的方法（12）测定各种血纤维蛋白溶酶原活化酶，测定缓冲液是含0.1%    Triton    X-100和0.1%白明胶的50mM甘氨酸（pH7.8）。经稀释使每个测定管的活性控制在2-8m    Plough    units（mPU）之间。把10μl酶、20μl血纤维蛋白溶酶原（0.1mg/ml）、20μl测定缓冲液在37℃温育45分钟，然后加1ml血纤维蛋白溶酶测定试剂（参阅参考文献12），再于37℃温育30分钟。该反应在加入20μl抑肽酶（0.3mg/ml）后终止，在412nm处测吸光度。在单核细胞培养时外加于RPMI的人血清白蛋白（1%）对这种方法测定尿激酶是没有影响的。
由新鲜血浆经两次赖氨酸-琼脂糖（Pharmacia）柱亲和层析纯化得到的人血纤维蛋白溶酶原用于测定，终浓度为0.3μM。采用两种商售的人血纤维蛋白溶酶原活化剂：Calbiochem-Behring    Corp.（La    Jolla，CA）出品的尿激酶参考标准（批号103285，1700PU/瓶）和Sigma公司出品的尿激酶（批号101F-05991，约40，000PU/mg蛋白质），在本说明书内，这两种尿激酶分别写成CUK和SUK。SDS-PAGE和纤维蛋白涂层（参阅下文）显示这两种产品都是Mr52，000血纤维蛋白溶酶原活化剂（HPA52）及其分子量为36，000的蛋白水解产物的混合物。取大鼠乳腺腺癌细胞系13762的肿瘤细胞（JCSMR实验病理学系的I.Ramshaw博士赠）在含0.5%Triton    X-100的50mM甘氨酸（pH7.8）中制成匀浆。牛胰蛋白酶（Ⅸ类）、牛凝血酶（1级）和猪血浆为Sigma产品。
2.泯活素的比色测定
培养上清液和细胞溶解物内泯活素的量由尿激酶参考标准样品比色测定时的抑制来确定（12）。这些样品（20μl）与4mPU尿激酶（20μl）在23℃预温育90分钟，然后再加入血纤维蛋白溶酶原。将泯活素直接加入 预先形成的血纤维蛋白溶酶中作为对照，可证明该抑制是在血纤维蛋白溶酶原活化的水平上，而不是简单地抑制血纤维蛋白溶酶。1个单位的泯活素定义为抑制1PU尿激酶所需的量。
3.径向扩散测定
纤维蛋白原（Sigma，X型）、人血纤维蛋白溶酶原和凝血酶（Sigma，1级）被浇铸于1.2mm厚的1.25%琼脂糖（Sea    Plaque，FMC    Corp.，Rochlard，ME，USA）凝胶板上。在37℃凝结，再于4℃硬化，然后挖出许多直径3mm的小孔，以便加入尿激酶和泯活素的混合物（5μl）。凝胶板置于一个湿化的盒内，在37℃温育20小时，然后用盐水充分冲洗以增强其溶解，再用酰胺黑染色。
4.血纤维蛋白溶酶原活化剂活性的SDS-PAGE和纤维蛋白涂层显影
加在SDS电泳凝胶上的样品包括单独溶于测定缓冲液内的血纤维蛋白溶酶原活化酶或与培养上清液和/或蛋白酶抑制剂在23℃预温育90分钟后的酶，再加上SDS样品缓冲液，使终体积为100μl。所用的蛋白酶抑制剂包括抑肽酶、α1-抗胰蛋白酶（Sigma）、大豆胰蛋白酶抑制剂（Sigma）、碘乙酰胺、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠、4-氨甲基环己酸（Aldrich Chemicals，Milwaukee，WI）和苄脒。那些凝胶板由11%聚丙烯酰胺制成，垂直放置，用Triton X-100清洗，然后按Granelli-Piperno & Reich的方法（13）用纤维蛋白/琼脂糖凝胶接触溶解以显示。在37℃，纤维蛋白溶解的显影时间通常是5-8小时。溶解区带中酶的分子量，可以与商售的酶和染色的标准蛋白质（Pharmacia，低分子量试剂盒）在聚丙烯酰胺凝胶上的位置相比较而确定。
5.形态学和细胞化学
为了用相差显微镜检查，粘附的单核细胞或单层的巨噬细胞经两次清洗，在检查之前用1.5%戊二醛（溶于0.1M二甲胂酸缓冲液，pH7.4）在室温下至少固定30分钟（9）。
在Shandon    Southern离心机中离心制备细胞。简述之，取0.1ml样品，内含50，000个细胞，悬浮于10%胎牛血清中，500rpm离心3分钟。然后用理发用吹风机快速吹干，再作May-Grunwald    Giemsa染色。
用α-乙酸萘酯为底物测定非特异性酯酶存在与否（10，11）。
为测定吞噬活性，将粘附的单层细胞或细胞悬液在含10%人AB血清和1.1μm胶乳珠（Sigma）（其浓度为每个细胞100粒）的RPMI-1640内在37℃温育60分钟。将该单层细胞或悬浮的细胞用RPMI-1640清洗3次，每次在20℃以150xg离心10分钟，去除未被摄入的胶乳珠。摄入胶乳珠2粒以上的细胞判定为具有吞噬性。
6.单核细胞和巨噬细胞的制备
a）人血单核细胞
Woden Valley医院的红十字会输血组织把人单个核白血球用梯度Ficoll-Hypaque（Pharmacia fine Chemicals出品，Sydeny，Australia）从淡黄层中分离出来。在Pi/NaCl中于4℃清洗4次，去除污染的血小板，然后将细胞再悬浮于含60单位/毫升庆大霉素的RPMI-1640（Gibco，Grand Island，NY）中。Linbro多孔板（货号7605805）预先用人AB血清2ml包被30分钟，取悬浮于RPMI-1640液（含10%AB血清）中的107单个核细胞置多孔板的30mm孔内，可获纯化的单核细胞层。单核细胞在37℃在含5%CO2的空气中粘附60分钟。用37℃预温的RPMI-1640冲洗6次单层以去除不粘附的细胞。
按多种标准均可视该粘附单层所含的单核细胞超过85%。单层细胞的多色染色显示94±6%的细胞是单核细胞，具有大而圆或锯齿状的细胞核和嗜碱性细胞浆。胞浆非特异性酯酶染色显示该单层中单核细胞标志阳性者占85±2%。91%的粘附细胞吞噬了胶乳珠进一步证实具有单核巨噬细胞形态和组织化学特征的细胞也呈现这种特色的功能。
当体外培养时，单核细胞在大小和形态上发生很大的变化。培养 的单核细胞经离心分离后的样品证明在整个培养过程中，直至7天培养终止时，单核细胞体积不断增大，很多细胞的外观尺寸比从前大一倍以上，偶而可见双核细胞。当单核细胞的体积增大时，细胞浆内大量形成空泡，而胞浆颗粒也越来越明显。进一步培养可形成更多的多核巨噬细胞。
b）腹腔巨噬细胞
为慢性肾衰竭病人进行常规腹膜透析时，抽取多批2公升的透析液，在20℃以300xg离心10分钟，所得的细胞再悬浮于50ml的RPMI-1640液中，然后再于20℃ 200xg离心10分钟。把那些细胞再悬浮于RPMI-1640中，使终浓度约为每毫升2×106个细胞。取6ml腹腔细胞悬液置于3ml Ficoll-Hypaque液上面，然后在20℃以400xg离心20分钟，再把那些细胞悬浮于含10%人AB血清的RPMI-1640液中，使浓度为1×106/ml。
腹腔清洗液经Ficoll-Hypaque梯度分离便可得到高产量的单个核细胞，按形态标准可判断有47%的细胞是巨噬细胞。单个核细胞的离心分离样品显示该巨噬细胞群是不均一的，包括大而成熟的细胞，含大量胞浆，偶而含两个细胞核，也包括具有更多单核细胞特征的较小的细胞，有锯齿状的核和较高的核/浆比。
如上述的单核细胞一样，将腹腔巨噬细胞粘附在塑料培养盘内以进一步纯化之。除去不粘附的细胞层后，每2-3天更换一次培养液，便可在培养液中将活的腹腔巨噬细胞维持达3星期之久。用非特异性酯染色可证明腹腔单层通常含有的巨噬细胞超过87%。
c）骨髓巨噬细胞
从矫形外科手术中得到的新鲜人骼骨嵴和肋骨骨髓悬浮于含10%巨细胞肿瘤（GCT）培养上清（Gibco-Biocult，Grand    Island，NY，USA）和10%胎牛血清的RPMI-1640培养液内。这个初次培养在涂有明胶的瓶内 维持7天（1）。在这段时间后，像单核细胞那样把单核/巨噬细胞粘附在培养碟上以纯化之。这第二次粘附培养物用于泯活素测定。所得的细胞非特异性酯酶阳性者超过90%。
d）结肠粘膜巨噬细胞
按Golder和Doe的方法（2），从切除的结肠将粘膜用酶解聚，获得巨噬细胞。如上述单核细胞那样，这些细胞在RPMI-1640中生长形成粘附单层，所得的细胞非特异性酯酶阳性和吞噬有羊红血球者超过85%。
7.细胞培养
a）单核细胞和巨噬细胞
将单层的单核细胞或巨噬细胞培养于加1%人血清白蛋白（Common-wealth Serum Labs.，Melbourne，Australia）的RPMI-1640中。上述来源于a）-d）的细胞，培养时细胞/介质的比例尽可能接近每毫升介质3×106细胞。
下列试剂用于细胞培养实验。
（a）胞壁酰二肽（N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺，Peninsula    Laboratories，San    Carlos，CA，USA），5μl/ml，（b）沙门氏菌（Salmonella    minnesota）R595的细胞壁脂多糖（3）。为制备后者，把不溶于水的提取物在0.1%三乙胺中用声波处理，然后对Pi/NaCl充分透析。在培养液中终浓度为0.1μg/ml。地塞米松和佛波醇豆蔻酸乙酸酯（phorbol    myristate    acetate，Sigma，St.Louis，MO，USA）的终浓度分别为0.1μM和10ng/ml。
b）转化的细胞系
人巨噬细胞样细胞系U937（4）和HL60（5）由S.Ulevitch博士和R.G.Painter博士（Scripps    Clinic，and    Research    Foundation，La    Jolla，CA，USA）供给。U937亦得自American    Type    Culture    Collection，Rockville，Maryland。RC2A（6）由N.Kraft博士 （Prince    Henry's    Hospital，Melbourne，Australia）供给。MLA144是长臂猿T淋巴细胞系（7）。人的类红细胞系K562（8）是H.S.Warren博士（Cancer    Research    Unit，Woden    Valley    Hospital）的赠品。COLO394是人结肠癌细胞系，由R.Whitehead（Ludwig    Institute    of    Cancer    Research，Royal    Melbourne    Hospital，Melbourne）提供。在抽取上清液来分析之前，上述细胞都生长在无血清的RPMI-1640液中。细胞溶解物是在有0.5%    Triton    X100的条件下制备的，用于酶的研究。
泯活素的生物学特征
结果
1.各细胞群中泯活素的产生
a）人血单核细胞
在Coleman    and    Green的比色测定（12）中，尿激酶活性的抑制证明泯活素存在于粘附的人单核细胞的无血清条件介质中（图1）。无论细胞的起始粘附是否被人血清促进，都可观察到这种抑制。在制备粘附单层时那部分不粘附的单个核细胞在培养中不产生任何可检出的泯活素。
采用前24小时单核细胞培养上清液可得到最高的泯活素活性，以后几个24小时抑制剂的产生速度下降，直至4天后已无明显的生成。此效果在培养上清液和细胞溶解物中均可观察到。不过，用胞壁酰二肽或细菌脂多糖在体外活化单核细胞，可使其持续生产和分泌泯活素（图1A和1B）。在前24小时内培养上清液中抑制剂的量与细胞数目相关（图2）。密度大于106细胞/毫升时，培养产生的泯活素量最高。细胞密度更高时，泯活素的产量（每个细胞）反而较低。用地塞米粉（10-6-10-8M）处理单核细胞培养对泯活素的产生没有影响，而地塞米松以前曾被用来诱导人纤维母细胞培养中一种血纤维蛋白溶酶原活化剂的抑制剂的合成。
b）人腹腔巨噬细胞
虽然新分离出来的血单核细胞的溶解物不含泯活素（参阅图1B），但所有新分离出来的粘附腹腔巨噬细胞的溶解物含有显著水平的泯活素（约30%的抑制），而且在培养过程中继续增多（图3）。泯活素的持续生产亦可由相应的培养上清液中测得的高水平的分泌产物反映出来。与对照的单核细胞培养不同的是，在3天的培养期间，腹腔巨噬细胞的溶解物内泯活素量始终保持着高水平。这个细胞群从形态上看好像大多数是由新近补充的单核细胞组成的，提示在体内反复透析引起的轻微炎症刺激足以补充和活化单核细胞从而在腹腔内产生泯活素。由于加入胞壁酰二肽不会进一步使细胞溶解物或上清液增加泯活素的生产（图3），腹腔巨噬细胞好像对进一步的活化作用没有反应。
c）骨髓巨噬细胞
用GCT（巨细胞肿瘤培养上清液）刺激的初次骨髓培养7天后可得到粘附的骨髓巨噬细胞。由于这些细胞只能在7天的初次培养后才能作为第二次培养来研究，因此，这些细胞在起始时的泯活素生产和分泌不能直接与新分离的血单核细胞或腹腔巨噬细胞比较。
尽管如此，在7天的初次培养后，二次培养中所得的粘附骨髓巨噬细胞的溶解物具有高水平的泯活素活性，但无论在有或无胞壁酰二肽的条件下泯活素的活性都会下降（图4）。这些骨髓细胞也会分泌大量的泯活素到上清液中，如细胞溶解物一样，泯活素的水平不受胞壁酰二肽影响。
d）结肠粘膜巨噬细胞
从人结肠切除后经酶解聚的粘膜中分离出来的巨噬细胞在培养中只有很有限的生产泯活素的能力，与上述三个来源的细胞产生的量相比，其水平是不显著的（在四个独立实验中，24小时上清液平均抑制4%）。这些低水平的泯活素并不因加入沙门氏菌脂多糖（0.1μg/ml）至培养中 而增多。
为确定肠巨噬细胞缺乏反应是否因长时间暴露于分离时所用的降解酶（胶原酶和脱氧核糖核酸酶）所致，将一些正常人血单核细胞放入肠巨噬细胞制备的上清液介质中温育数小时。这种酶处理过的血单核细胞在以后的培养中仍保持它们生产和分泌泯活素的能力（参阅表1）。
表1    用含脱氧核糖核酸酶和胶原酶的结肠解聚
上清液培养前后人血单核细胞的泯活素生产
对照的单核细胞    用酶处理
细胞溶解物    90%    100%
上清液    67%    72%
表内结果是单核细胞对尿激酶测定的抑制百分比。
因此，血单核细胞好像是处于理想的发育阶段，有分泌泯活素的潜能。这种潜能可以在体外用胞壁酰二肽活化或在体内主动进入炎症部位时得以实现。另一方面，从肠粘膜分离出来的成熟的组织巨噬细胞似已失去产生和分泌泯活素的能力，即使经刺激也不能产生和分泌泯活素。
e）人巨噬细胞系U937
用Coleman    and    Green的方法（12）测定人巨噬细胞系U937的上清液，测不到泯活素活性。不过，当这个细胞系在存在地塞米松（1μM）的条件下培养，在上清液中可测到显著水平的泯活素。这个结果可以用已产生的泯活素被U937细胞伴随产生的血纤维蛋白溶酶原活化剂有效地结合来解释，因而比色法不能检出。其实，将U937细胞从含地塞米松的介质中取出后72小时，即可诱导出高水平的细胞内血纤维蛋白溶酶原活化剂，测定0.5%    Triton    X100细胞提取物中血纤维蛋白溶酶原活化剂活性可确定之。在无地塞米松的条件下培养U937细胞超过7天就完全失去生产泯活素的能力。外加地塞米松，即使终浓度达10μM，也不能恢复泯活素的生产。
由U937细胞分泌的泯活素量大约比胞壁酰二肽诱导的单核细胞产生的泯活素量低4倍。不过，将佛波醇酯（如，佛波醇豆蔻酸乙酸酯）加到U937培养中，可使其分泌泯活素的量增加16倍。在人巨噬细胞系RC2A或人（Jurkat）和长臂猿（MLA144）的T淋巴细胞系上清液中测不到泯活素的活性。
2.泯活素的特异性
a）抑制纤维蛋白的溶解
将含泯活素的单核细胞培养上清液与不同的酶加在纤维蛋白/琼脂糖凝胶小孔内一起温育以研究泯活素抑制蛋白酶的特异性。凝胶混合液中含20μg/ml的血纤维蛋白溶酶原，以使血纤维蛋白溶酶原活化剂的活性能够表达。选择适当的酶浓度以便在37℃温育20小时后显出可比的溶解区（参阅图5的描述）。
巨噬细胞显然不是血纤维蛋白溶酶或胰蛋白酶的抑制剂，即使泯活素与这些酶在23℃预温育2小时后才加入小孔。在人血纤维蛋白溶酶原活化剂中，有两种尿激酶制剂（CUK和SUK），经泯活素处理后均失去全部溶纤维蛋白活性。不过，人黑素瘤培养上清液的溶纤维蛋白活性即使经过预温育也不受泯活素抑制，因为这种活性几乎完全属于组织型的血纤维蛋白溶酶原活化剂（HPA66）（参阅下文）。凝血酶引起的纤维蛋白原凝结亦不受泯活素影响。
b）用比色法测定抑制作用
Coleman    and    Green检测法被进一步用于研究泯活素抑制的特异性。在没有血纤维蛋白溶酶原的条件下，与血纤维蛋白溶酶测定试剂一起温育可作为检测胰蛋白酶和血纤维蛋白溶酶的高灵敏的方法。当存在血纤维蛋白溶酶原的条件下，可测定多种血纤维蛋白溶酶原活化剂。一个值得注意的例外是在人黑素瘤条件化介质中的HPA66，在此测定中无活性，可能由于缺少纤维蛋白（16）。
泯活素不抑制胰蛋白酶或血纤维蛋白溶酶的赖氨酸硫酯酶活性（表2）。不过依赖血纤维蛋白溶酶原的尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化剂CUK和SUK以及长臂猿T淋巴细胞系（MLA144）的APA52可被泯活素强烈抑制。再则，只有当与血纤维蛋白溶酶原一起温育时有泯活素存在的条件下才能观察到尿激酶的抑制，如果泯活素在血纤维蛋白溶酶测定阶段加入则见不到这种抑制。
在稀释的大鼠13762肿瘤匀浆中大鼠血纤维蛋白溶酶原活化剂（RPA48，可能与HPA52同种）的活性不受泯活素影响。
酶或血纤维蛋白    对照的活    用泯活素    占对照活性
溶酶原活化剂来源    量    性A412    处理A412    的百分比
胰蛋白酶    6ng    0.32    0.31    97
血纤维蛋白溶酶    180ng    0.94    0.98    104
CUK    4mPU    0.72    0.00    0
SUK    8mPU    0.88    0.00    0
黑素瘤    20μl上清液    0.05    0.07    -
MLA144    20μl上清液    0.69    0.08    12
大鼠肿瘤13762    20μl  1%的匀浆    0.53    0.50    94
泯活素对蛋白酶比色测定的抑制。未稀释的泯活素培养上清液（20μl）与表内所示的酶于23℃预温育2小时，终体积40μl。取20μl血纤维蛋白溶酶原（100μg/ml）加在这些活化剂中，而1ml血纤维蛋白溶酶测定试剂则加于其他蛋白酶中，各测定管继续进行直至显色。
c）SDS-PAGE和纤维蛋白涂层
Granelli-Piperno    &    Reich的纤维蛋白涂层法（14）用于鉴定泯活素抑制的特异性和测定各种不同的血纤维蛋白溶酶原活化剂是否不可逆地被泯活素钝化。酶与泯活素预先温育，然后进行SDS-PAGE，剩余的酶活 性可由加了血纤维蛋白溶酶原的纤维蛋白/琼脂糖凝胶上的溶解面积看出。
当丙烯酰胺和纤维蛋白凝胶在一起温育5小时后，对的（未经处理的）尿激酶给出两条显著的区带，一条代表HPA52，另一条代表其水解产物（17），HPA36（图9，第1行）。不过，如果在SDS-PAGE之前将CUK与泯活素预先温育，5小时后在凝胶涂层上出现单一的弱溶解区带，位于比HPA52分子量更高的地方（图9，第10行）。
当这些凝胶在一起温育20小时后，该区带的强度增加，在比HPA36表观分子量更高处可见到另一条区带（参阅图6，第2行）。这些结果证明泯活素钝化HPA52和HPA36的方式是使最终残存的活性属于比未经处理的酶分子量更高的酶。因此，泯活素与尿激酶相互作用的方式包括复合物的形成或尿激酶结构上基团的变化，从而影响它的电泳迁移性（参阅下面第3节）。HPA36似比HPA52更容易钝化。
长臂猿细胞系MLA144将血纤维蛋白溶酶原活化剂分泌到无血清培养介质中，在SDS-PAGE和纤维蛋白层显影后，这一活性成分分解为两条紧邻的区带，均位于人尿激酶中HPA52的分子量区域内（图6，第3行）。把MLA144培养上清液与泯活素预先温育对两条区带都无影响（图6，第4行）。经泯活素处理亦不影响人黑素瘤培养上清液中Mr66，000的血纤维蛋白溶酶原活化剂（图6，第5和第6行）和大鼠肿瘤中的Mr48，000的血纤维蛋白溶酶原活化剂（图6，第7和第8行）。这些结果证明泯活素特异地抑制人尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化剂（HPA52和HPA36），但不抑制人组织型血纤维蛋白溶酶原活化剂（HPA66）或（至少某些）其他哺乳动物的血纤维蛋白溶酶原活化剂。
3.泯活素与尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化剂的相互作用
在没有血纤维蛋白溶酶原的条件下将泯活素和CUK预温育，再按上述比色法测定剩余的血纤维蛋白溶酶原活化剂的活性，以分析泯活素与 尿激酶的相互作用。钝化反应在23℃进行两小时，剩余血纤维蛋白溶酶原活化剂的活性最终水平比尿激酶、泯活素和血纤维蛋白溶酶原混合的零时所观察到的低一半以上（图7）。在两小时预温育过程中，钝化作用在起始时很快然后持平，再进一步温育就不能使剩余的尿激酶钝化。这结果揭示该反应是化学计量性的，而不是另一种情况，例如，尿激酶被蛋白酶分解。用稀释的含泯活素培养上清液来滴定尿激酶，得到一条简单的相互作用曲线，示于图8。4mPU尿激酶（CUK）的活性可被相当于这实验所用的1.5μl培养上清液钝化一半。
在这些实验中所用的培养上清液中没有任何可检出的一般蛋白水解活性，这可从上述纤维蛋白溶解实验中的对照孔看出（图5），在高度灵敏的比色测定中，测不到赖氨酸硫酯酶活性亦可表明这点。不过，为确定泯活素对尿激酶的钝化是否包括对这两个分子中的任何一个有部分的蛋白水解活性，将CUK在有或无泯活素的条件下，与许多种蛋白酶抑制剂中的一种一起预温育，所用的蛋白酶抑制剂及其终浓度为：抑肽酶，0.2mg/ml;α1-抗胰蛋白酶，16μg/ml;大豆蛋白酶抑制剂，0.16mg/ml;碘乙酰胺，3mM;乙二胺四乙酸，6mM;十二烷基硫酸钠，0.6%;4-氨甲基环己酸，3mM;苄脒，3mM。以这些预培养液作SDS-PAGE，然后用上述纤维蛋白溶解来显示尿激酶活性。在无泯活素的条件下，在各种蛋白酶抑制剂预温育对照中，只有大豆胰蛋白酶抑制剂可消除原来在电泳时见到的HPA52和HPA36的区带（图9A）。当预温育液含有泯活素时，没有任何一种其他蛋白酶抑制剂能阻止泯活素催化尿激酶的钝化（图9B）。不过，如果在泯活素加入前或加入后立即将SDS加到尿激酶中，便可防止尿激酶钝化（图9，第8行）。由此证明，泯活素是血纤维蛋白溶酶原的钝化剂，而不是抑制剂。
总之，这些结果揭示泯活素与尿激酶之间的作用方式包括在开始时迅速形成一种可逆的复合物，接着是一个较慢的对SDS敏感的阶段（对 蛋白酶抑制剂不敏感），此时产生一种较游离的酶分子量更高，而较酶-泯活素1∶1复合物应有的分子量低的不可逆产物。因此，在零时加入预培养液的SDS可以完全逆转泯活素的抑制作用，但先与泯活素温育，再用SDS来处理则HPA52和HPA36完全被抑制。延长显影时间，在较高分子量的位置可出现微量的活性，但如果在纤维蛋白涂层中加泯活素，这活性即被抑制。这些可能代表小量部分活化的酶或起始形成的可逆复合物的解离产物。
很多人巨噬细胞系转化细胞的血纤维蛋白溶酶原活化剂亦曾用比色测定法来测试泯活素的钝化作用。已明确泯活素强烈抑制人巨噬细胞前体细胞系（HL60）和人的类巨噬细胞白血病细胞系（RC2A）的血纤维蛋白溶酶原活化剂（图3）。人红血球细胞系（K562）和灵长类动物T淋巴细胞系（MLA144）所分泌的血纤维蛋白溶酶原活化剂亦受抑制，但小鼠尿的尿激酶则不受抑制。
血纤维蛋白溶酶    对2mPU尿激酶当量
原活化剂的来源    的抑制百分比
尿激酶    95
单核细胞    18
RC2A    80
HL60    78
K562    75
MLA144    60
小鼠尿    4
单核细胞的泯活素对不同来源的，包括人转化
细胞系的，血纤维蛋白溶酶原活化剂的抑制。
4.其他细胞群的泯活素的特异性
用纤维蛋白径向扩散测定法可确定其他巨噬细胞产生的泯活素与单 核细胞产生的相同，对人尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化剂是高度专一的。
挑选不同的蛋白酶和血纤维蛋白溶酶原活化剂，包括血纤维蛋白溶酶、胰蛋白酶、HPA66（人黑素瘤培养上清液中的组织型活化剂）和人尿激酶（HPA52和HPA36），用于测试每种细胞群产生的泯活素的抑制作用。
取腹腔巨噬细胞和血单核细胞培养上清液观察尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化剂的特异性抑制作用（图11）。这些细胞产生的泯活素对血纤维蛋白溶酶、胰蛋白酶或HPA66的活性都没有影响。腹腔巨噬细胞、血单核细胞和骨髓巨噬细胞在Triton    X100中的溶解物，对尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化剂都产生抑制作用，但对血纤维蛋白溶酶或胰蛋白酶无可检出的抑制。不过，血单核细胞和腹腔巨噬细胞的溶解物对HPA66有一些弱抑制作用（参阅图11）。
U937产生的泯活素与单核细胞产生的泯活素在一般特性上相同。用纤维蛋白径向扩散法比较它们的特异性，表明这两个来源的泯活素都专一地抑制尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化剂（CUK和SUK），不抑制组织型血纤维蛋白溶酶原活化剂（HPA66）（图12）。对血纤维蛋白溶酶和小鼠尿激酶对照没有抑制。
单核细胞和U937细胞的泯活素制备，在非变性不连续聚丙烯酰胺凝胶系统上的电泳迁移率很相近（参阅图13）。以尿激酶与凝胶一起温育，然后涂敷纤维蛋白/琼脂糖凝胶，可见到泯活素的抑制区带。U937细胞系的泯活素制备好像比单核细胞的泯活素电泳迁移率稍大（图13）。这种小的差异可能是反映凝胶上可见的溶解量的差异，亦可能是由于两种不同来源的泯活素糖基化的不同。
用纤维蛋白径向扩散法可证明从U937细胞或诱导过的单核细胞分离得到的泯活素，与人胎盘分离得到的血纤维蛋白溶酶原活化剂的抑制剂有不同的特异性（23）（图12）。人胎盘的抑制剂（Calbiochem公司可 钝化尿激酶型和组织型血纤维蛋白溶酶原活化剂二者，但泯活素只对前者有特异性抑制作用。
实例2    泯活素的纯化方法
1.人单核细胞培养中泯活素的纯化
从人血中分离单核细胞，经首次离心在红血球上方形成一层白血球“淡黄层”，然后用Ficoll-Hypaque液将白血球分为粒细胞和淋巴细胞加单核细胞，再用离心淘洗法把单核细胞从淋巴细胞中分离出来。
纯化的单核细胞（3-4L的血液通常可得5-8×108个细胞）以0.20-0.34×106细胞/cm2的密度粘附在15cm的塑料碟上，该碟先用白明胶、再用人血清预处理和清洗。在含0.05μg/ml胞壁酰二肽（佐剂肽）的无血清RPMI-1640（0.50-0.75ml/106细胞）中持续培养3天，然后收集培养上清液，离心使之澄清。然后加固体的氯化钠于上清液中，使其浓度达2M，再将此液在4℃上苯基-琼脂糖亲和层析柱（Pharmacia）。用两倍床体积的含2M NaCl的50mM甘氨酸（pH7.8）清洗，以除去未结合的蛋白质，然后用NaCl梯度递减的同一缓冲液将结合的蛋白质洗脱。梯度洗脱的各组分按Coleman & Green法（12）测定泯活素的活性。图14是该柱的典型洗脱图。把活性最强的部分合并，用50mM甘氨酸（pH7.8）透析，不经过进一步处理，或用Centricon 30（Amicon产）浓缩后，上Cibacron蓝色琼脂糖亲和层析柱（Pharmacia），该柱事先用同一种缓冲液平衡过。泯活素不被吸附，但其他杂蛋白留在柱上。按蛋白质浓度（Lowry法）和以尿激酶抑制的比色测定所滴定的泯活素活性计，用此法总共可纯化约1000倍。泯活素产物和尿激酶的相互作用是化学计量的，已如前见于泯活素培养上清液（参阅图8）。虽然典型的泯活素产品中每毫升含200-500单位的泯活素，在SDS-PAGE后，并不一定能检出泯活素组分。
用此法将泯活素纯化后，再用在培养中活体标记（35S-甲硫氨酸） 的单核细胞制备作SDS-PAGE。在3天时间内很多蛋白质被分泌到无血清的培养介质中，经苯基-琼脂糖层析，比活性显著提高（图15）。通过蓝色琼脂糖层析，进一步去除一些杂蛋白（图16）。当尿激酶（HPA36）与这些泯活素制备一起温育后，可见到分子量的变化，生出一种相当于Mr70-75，000的尿激酶-泯活素复合物（图16）。这种电泳迁移率的变化可用于鉴定泯活素这个蛋白质的分子量。这种变化与泯活素制备中的一个表观Mr为39-48，000的主要蛋白质区带的消失相关。在还原条件下，只显示一条蛋白质区带，相当于30-35，000的分子量。
2.人巨噬细胞系U937中泯活素的纯化
细胞培养：不粘附的人巨噬细胞系U937在含10%胎牛血清和1μM地塞米松的RPMI-1640中培养，在T175培养瓶中或10公升的Braun发酵罐中，保持每毫升1-3×106个细胞的密度。虽然泯活素是由这生长期的细胞分泌的，但要把这些细胞转入无血清的介质中，以便得到可供纯化泯活素用的上清液。将这些细胞压实后，清洗一次，再悬浮于含1μM地塞米松的RPMI-1640中培养3天。在下面所举的一些纯化例子中，在无血清介质中加0.7%的白明胶，以提高细胞存活率。在有白明胶的条件下，泯活素活性通常增高4-8倍（图17）。
收集这些细胞，其上清液用于下列纯化例子中。这些例子可以按任何的组合或次序被应用，以便提供一种基本纯化的泯活素产品。
纯化例1：采用阶式pH洗脱的苯基-琼脂糖层析
从含0.7%白明胶的U937细胞培养上清液中纯化泯活素。一根50ml的苯基-琼脂糖柱用含2M    NaCl的50mM柠檬酸（pH5.5）平衡。在上柱前用1M柠檬酸将1.6L的U937培养上清液的pH调到5.5，并加入固体的NaCl使之达2M的浓度。上柱后用平衡缓冲液充分清洗，再用含0.5M    NaCl的50mM柠檬酸（pH5.0）清洗。用50mM的甘氨酸（pH7.8）洗脱泯活素，按Coleman    &    Green比色法（12）测定性，Bradford法（25）测定蛋白质含 量。图18示典型的柱层析图。
泯活素产量为3，360单位或66%，比活性为140单位/毫克，比活性提高214倍。
纯化例2：用盐液洗脱的批次苯基-琼脂糖层析
除非另有说明，U937细胞都在无白明胶的条件下培养，从培养上清液中纯化泯活素。
a）无血清泯活素上清液的浓缩
用Amicon    DC2空心纤维透析/浓缩装置（Amicon  DC2  Hollow  Fiber  Dialysis/Concentration  Unit），配备截留限为分子量30，000的膜片，将4-5L的培养上清液浓缩10倍。至少用等体积的50mM甘氨酸（pH7.8）将浓缩物透析，以便除去所有的染料。
b）泯活素浓缩的离心
透析过的浓缩物在JA10转头内在4℃以8，000rpm离心30分钟，使透析时沉淀的细胞残渣和蛋白质压实。将澄清的上清液分装，冻结于-20℃，待以后纯化用。
这阶段可100%回收泯活素活性，产量10-20，000单位，比活性20单位/毫克。
c）批次苯基-琼脂糖层析
从浓缩的培养上清液（存在0.7%白明胶条件下的细胞培养，比活性1单位/毫克）进一步纯化泯活素，采用批次盐液洗脱的苯基-琼脂糖层析。用固体NaCl把750ml上清液的离子强度调到2M。将预先经50mM甘氨酸（pH7.8）和2MNaCl平衡过的苯基-琼脂糖按w/v比为1∶7.5加入上清液中。将此悬液在振荡中室温温育2小时或4℃温育过夜。在真空中用玻璃垂熔滤器滤出苯基-琼脂糖，然后在同一滤器中用平衡缓冲液充分清洗苯基-琼脂糖，再用含50mM甘氨酸（pH7.8）和1.4M  NaCl的缓冲液洗去杂蛋白。用50mM甘氨酸（pH7.8）把泯活素从苯基-琼脂糖上洗脱 下来。
用此法可得泯活素4，800单位，相当于原材料中35%的量，泯活素产品的比活性提高约100倍，达96单位/毫克。
纯化例3：用阶式pH洗脱的二乙胺基乙基-琼脂糖层析
按纯化例2中所述的步骤（a）和（b）把不含细胞的上清液用pH洗脱。以浓缩的泯活素上清液（40ml，6.5单位/毫克）上二乙胺基乙基-琼脂糖柱，该柱预先已用50mM甘氨酸（pH7.8）平衡。用平衡缓冲液充分清洗以除去未结合的蛋白质，用pH5.0的25mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液洗脱泯活素，然后再用含2M  NaCl的25mM柠檬酸磷酸盐（pH5.0）清洗，以便除去残留的蛋白质。图19示典型的柱层析图。
用此法生产的泯活素比活性为63单位/毫克，回收率35%，这说明比活性增加了10倍。
纯化例4：制备性非变性凝胶电泳
按纯化例2所述的步骤（a）、（b）和（c）处理不含细胞的上清液。在电泳之前，将泯活素（3.5单位，比活性25单位/毫克）和适当的标准蛋白质与等体积的样品缓冲液混合，该样品缓冲液含0.025%溴酚蓝、0.025%Xylenecyanol、50mM  Tris·HCl（pH7.5）、18%蔗糖和1%  Triton  X100。该凝胶由5-15%的双-丙烯酰胺线性梯度组成，所用的凝胶系统基本同Laemmli（26）所述，但不加十二烷基硫酸钠，在缓冲液贮罐中以0.15%  Triton  X100取代SDS。将样品加入凝胶中，以稳定的100mA电流电泳。用水套冷却系统把温度维持在25℃以下。当低迁移率的示踪染料Xylenecyanol行毕凝胶全长时，取下凝胶，切成约0.5×1cm的小段，加150μl    50mM甘氨酸（pH7.8），然后用Branson声波细胞破碎器在4℃下以声波功率20将样品处理10至20秒。恒速振荡过夜以使蛋白质从凝胶中洗脱下来。凝胶经14，930xg离心10分钟后，取上清液测泯活素活性。复份样品经银染以显示凝胶的适当片段的蛋白质含量 （27）。结果示于图20。
从凝胶中回收的泯活素水平很高，第一次洗脱可回收原初活性的64%，同法第二次洗脱还可回收另外13%。蛋白质银染图谱示，泯活素活性与该制备中的主要杂蛋白分离良好。泯活素的比活性为2323单位/毫克，这步骤使泯活素纯化了93倍。
纯化例5：蓝色琼脂糖层析
按纯化例2所述的步骤（a）和（b）处理不含细胞的上清液。取10ml浓缩上清液（600单位，20.0毫克，比活性30.0单位/毫克），上3.2cm×2.8cm的蓝色琼脂糖柱，该柱已用100mM的磷酸钠（pH7.0）平衡。用同一种缓冲液清洗后，按每份8.1ml分部收集。每七份合并成一组，然后用50mM甘氨酸（pH7.8）在4℃透析过夜，测定蛋白质含量和泯活素活性。不滞留在柱上的泯活素被洗脱，可定量回收，比活性提高到4倍，达120单位/毫克。
纯化例6：盐梯度洗脱的二乙胺基乙基-Sephacel层析
按纯化例2的步骤（a）和（b）处理不含细胞的上清液。取10ml浓缩上清液（640单位，20.0毫克，比活性32.0单位/毫克）上2.6cm×6cm的二乙胺基乙基-Sephacel柱，该柱已用50mM甘氨酸（pH7.8）平衡。用50ml的50mM甘氨酸（pH7.8）冲洗，再用线性梯度0-0.5M的NaCl    500ml冲洗。当完成梯度冲洗后，再用90ml含1M    NaCl的50mM甘氨酸（pH7.8）冲洗。按每份6ml分部收集。每十份一组合并在一起，用50mM甘氨酸（pH7.8）在4℃透析过夜，测定泯活素活性和蛋白质含量，其结果示于图21。以0.24M    NaCl洗脱的泯活素及洗脱峰管合并后的总回收率达79%，比活性为216单位/毫克，纯化了6.75倍。
纯化例7：pH梯度洗脱的二乙胺基乙基-Sephacel层析
按纯化例2所示的步骤（a）和（b）处理不含细胞的上清液。取10ml浓缩的介质（400单位，20毫克，比活性20.0单位/毫克）上2.6cm× 6cm的二乙胺基乙基-Sephacel柱，该柱已用20mM的NH4Ac（pH6.9）平衡。用30ml 20mM NH4Ac（pH6.9）清洗该柱，然后以20mM NH4Ac到20mM乙酸的梯度液500ml洗脱泯活素。当梯度洗脱完成后，用20mM乙酸洗涤该柱，直至275nm吸光度回到基线。按每份5.5ml分部收集，将十份合并成一组，用NaOH将pH调到7-8之间。从每个合并管取5.0ml样品用50mM的甘氨酸（pH7.8）在4℃透析过夜，测定泯活素和蛋白质含量，结果示于图22。在pH5.3洗脱的泯活素活性最高，此峰管合并后泯活素活性占上柱时原材料活性的74%，比活性1966单位/毫克，纯化了98倍。从每个合并管取相当于70μg蛋白质的样品作SDS-PAGE分析，其结果示于图23。
纯化例8：羟基磷灰石层析
按纯化例2所述的步骤（a）和（b）处理不含细胞的上清液。取10ml浓缩上清液（520单位，16.6毫克，比活性31.0单位/毫克）上2.6cm×4.5cm的羟基磷灰石柱，该柱已用50mM的甘氨酸（pH7.8）平衡。经50mM甘氨酸（pH7.8）清洗后，用50mM甘氨酸（pH7.8）到0.5M磷酸钠（pH7.0）的梯度液500ml洗脱。按每份5.75ml分部收集，每十份合并成一组，取样于4℃透析过夜，测定泯活素活性和蛋白质量。图24示梯度洗脱末时的泯活素，峰管内泯活素量为上柱量的50%，比活性为651单位/毫克，纯化21倍。取70μg泯活素样品作SDS-PAGE分析，示于图25。
实例3    泯活素对肿瘤组织的影响
本例提供了所用方法的详情，并描述了泯活素对结肠肿瘤细胞的影响。
方法
1.组织样品和匀浆化
外科手术切除后立刻取人结肠样品，将结肠粘膜剥离，与肌粘膜分开，用Hanks液清洗。从每段结肠取下低倍放大镜下见到的正常粘膜和 明显的癌组织的样品，冷冻保存。以后取化冻的部分组织称重，每毫克湿重组织加10μl含0.5%Triton  X100的50mM甘氨酸缓冲液（pH7.8），慢慢地手工研磨成匀浆。
2.血纤维蛋白溶酶原活化剂的比色测定
按例1所述的Coleman    and    Green法（12）测定组织匀浆和细胞培养上清液中血纤维蛋白溶酶原活化剂含量。测定前，用匀浆缓冲液将如上制得的匀浆作1∶10稀释。
3.SDS-PAGE和纤维蛋白涂层酶谱
按例1所述，在分离技术中采用Granelli-Piperno    &    Reich的方法（13）。将组织匀浆分别按下列条件加在非还原性的11%丙烯酰胺凝胶中：（a）没有进一步处理，（b）与亲和法纯化的人血纤维蛋白溶酶原在37℃温育30分钟，（c）与单核细胞泯活素在23℃温育90分钟，或（d）先与血纤维蛋白溶酶原温育，再与泯活素温育。将上述温育液中未经处理的样本（60μl）与SDS样品缓冲液（40μl）一起加入凝胶。
4.径向扩散测定
按例1的方法进行径向扩散测定。培养时用的蛋白酶有激肽释放酶（1.5μg）、血纤维蛋白溶酶（150ng）、小鼠尿激酶（2.5mPU）、HPA66（黑素瘤培养上清液）、人尿激酶（12.5mPU）和COLI    394上清液（含1.3mPU    HPA52）。这些酶与过量的泯活素在23℃温育90分钟，然后再加入扩散凝胶的小孔中。
5.结肠癌细胞的培养
人结肠癌细胞系COLO394（28）培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640中，每周传代两次。
为研究泯活素和肿瘤细胞培养中酶的影响，在多孔板（Linbro No.76-058-05）上每孔加3×106个细胞。粘附过夜后，冲洗这些细胞，然后用无血清的RPMI-1640培养48小时。在3个试验性培养中分别加：
（1）人血纤维蛋白溶酶原（15μg/ml）;（2）血纤维蛋白溶酶原和泯活素（相当于1PU的尿激酶）;或（3）血纤维蛋白溶酶原、泯活素和抑肽酶（18μg/ml）。
6.泯活素制备
按例6所述的方法从人血单核细胞培养上清液制备的泯活素用于这些实验。塑料碟上粘附的单核细胞在含0.05μl/ml胞壁酰二肽的RPMI-1640中培养3天。
结果
泯活素对肿瘤组织匀浆的影响
1.正常与肿瘤结肠组织的血纤维蛋白溶酶原活化剂含量比较
（a）比色测定
稀释的结肠粘膜匀浆按Coleman    &    Green法（12）测定血纤维蛋白溶酶原活化剂。此法测得的是血纤维蛋白溶酶原活化剂酶的总含量（包括酶原和活化酶），因为所用的血纤维蛋白溶酶原底物内含微量的血纤维蛋白溶酶，足以活化酶原。在稀释的匀浆中不依赖血纤维蛋白溶酶原的中性蛋白酶对赖氨酸硫酯血纤维蛋白溶酶底物的直接水解对显色不起明显的作用。图26示，对荷癌结肠上组织学正常区域和明显的结肠癌组织，都测定了血纤维蛋白溶酶原活化剂活性。
正常组织匀浆的活性很集中，平均值为0.51±0.16。虽然在RPMI-1640纤维蛋白涂层上只有少数样品显示活性尿激酶区带（参阅下文），但更灵敏的比色测定显示全部正常组织匀浆都含有一些血纤维蛋白溶酶原活化剂，构成一定的测定值。在没有外加纤维蛋白的条件下，这部分测定值很可能来自低水平的尿激酶血纤维蛋白溶酶原活化剂（HPA52），而不是来自普遍存在的组织型血纤维蛋白溶酶原活化剂（HPA66）（29）。
不过，肿瘤的匀浆显示广范围的血纤维蛋白溶酶原活化剂活性，吸光度跨度达十倍。平均吸光度为1.15±0.56，超过正常组织匀浆平均值 一倍以上。不过，这个比值包括全部取样的材料，如果按每条结肠以肿瘤样品与相应的正常组织成对比较（图27），其平均比值可增高到3以上，有的甚至超过5。
（b）SDS-PAGE和纤维蛋白涂层
荷癌结肠上组织学正常区粘膜匀浆经SDS-PAGE后，在纤维蛋白-琼脂糖酶谱上只有一条主要的溶解区带，相当于人黑素瘤培养上清液中的组织型血纤维蛋白溶酶原活化剂（HPA66）（图28A），次要的区带位于分子量约96，000和110，000之处。不过，有些正常组织匀浆也要相当于高分子量型的尿激酶（即HPA52）的位置产生溶解区带（见下文）。如果把典型的正常结肠未稀释的匀浆与人血纤维蛋白溶酶原在测定缓冲液中一起温育，血各级蛋白溶酶原有一些被活化，在酶谱Mr85，000处可出现一条血纤维蛋白溶酶区带（图28A，第2行）。与血纤维蛋白溶酶原温育2小时后取样时，HPA66的活性逐渐消失，96，000和110，000处的次要区带也迅速消失。
癌组织匀浆通常都产生一条HPA52的主要区带，伴有第2条相对强度不一的HPA66区带（有时几乎不存在）（图28B）。上面提到的其他次要区带常很弱或不存在。与血纤维蛋白溶酶原在37℃温育2小时后，逐渐失去HPA66（图28B，第2-4行）。所产生的血纤维蛋白溶酶（在Mr85，000处溶解）影响着HPA52转化为它的活性裂解产物，该产物的Mr约33-36，000。
2.结肠粘膜匀浆中尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化剂与泯活素的相互作用
在电泳之前，用泯活素处理正常结肠组织匀浆，对组织型血纤维蛋白溶酶原活化剂HPA66所产生的溶解区带无影响，却使几乎全部HPA52的次要活性区带消失（图29A）。
将该匀浆与血纤维蛋白溶酶原一起预温育，产生血纤维蛋白溶酶， 它使HPA52的区带减弱，并出现一些微弱的区带，代表Mr为33-36，000的活性降解产物。预先与血纤维蛋白溶酶原活化剂温育后，再用泯活素处理，HPA52区带和33-36，000处的微弱区带均消失。
肿瘤组织匀浆产生显著的HPA52溶解区带，与泯活素一起温育会使其减弱（图29B）。电泳前用血纤维蛋白溶酶原预处理可产生血纤维蛋白溶酶，它转而使HPA52转化为HPA33-36，如前述正常组织匀浆中所见。因此，虽然泯活素对HPA66没有影响，但肿瘤结肠组织和那些产生Mr52，000区带的正常结肠组织的匀浆中的酶，与人单核细胞泯活素一起温育时，都会受到相似的影响。如果开始时用血纤维蛋白溶酶原处理匀浆，然后再用泯活素处理，在电泳后通常可见的HPA52区带基本消失，代表HPA33-36的区带也消失（图29B）。因此，很明显，经血纤维蛋白溶酶原处理后泯活素对HPA52的钝化作用比未经处理的匀浆中所见者更强。这提示存在于组织中的HPA52的主要形式事实上是酶原，而HPA52与泯活素的反应有赖于其转化为活性酶，可能靠血纤维蛋白溶酶。
3.泯活素对酶原型尿激酶类血纤维蛋白溶酶原活化剂的特异性
比色测定
在很广的尿激酶浓度范围内，从10mPU到1000mPU，尿激酶与泯活素的反应具有化学计量关系（图30）。然而，在稀释的结肠粘膜匀浆中滴定泯活素对血纤维蛋白溶酶原活化剂的抑制并不显示这种特征性表现（图31）。确实，在正常组织中抑制低水平的HPA52活性，比抑制肿瘤组织匀浆中高得多的活性，需要更多的泯活素，这与组织匀浆中存在着酶原型的HPA52相符。
用转化的结肠肿瘤细胞系COLO394的无血清培养上清液可证明这种HPA52酶原的存在。由这细胞系所分泌的血纤维蛋白溶酶原活化剂主要是HPA52，还有一些较高Mr的区带，与上述肿瘤组织匀浆的谱型很相似（图32）。当培养介质中含血纤维蛋白溶酶原时，可产生一些血纤维 蛋白溶酶（比色测定可证明，图33），它加速某些HPA52转化为HPA36。如果将泯活素和血纤维蛋白溶酶原加于该介质中，在培养时所产生的全部血纤维蛋白溶酶原活化剂都被钝化，这可由SDS-PAGE和纤维蛋白涂层显影（图32）和比色测定（图33）来证明。不过，如果将一种快速和强效的血纤维蛋白溶酶抑制剂抑肽酶与血纤维蛋白溶酶原和泯活素一起加入，就不发生钝化作用（图32）。由于抑肽酶并不直接影响泯活素与尿激酶之间的反应，这些结果说明COLO394产生的HPA52是酶原型，其活性的表达及与泯活素的反应都需要血纤维蛋白溶酶。在SDS-PAGE纤维蛋白涂层系统中，存在于血纤维蛋白溶酶原底物的中的微量血纤维蛋白溶酶导致活化作用的发生。当血纤维蛋白溶酶被抑肽酶抑制时，就不再发生活化作用。
这些结果显示多种主要的人体癌瘤比邻近未受累的组织产生的尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化剂明显地多。把泯活素直接加入组织匀浆中时，它至少可以部分抑制人尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化剂HPA52。这种钝化作用对尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化剂HPA52是特异的。这就进一步确认泯活素不影响酶原型的HPA52，但在HPA52与泯活素作用前，需要蛋白酶的活性（在本例，由血纤维蛋白溶酶来提供）把HPA52转化为活性型。

Claims (2)

1、一种制备蛋白质泯活素的方法，其中制得的泯活素的特征为：
a)在血纤维蛋白存在下，能够特别抑制人尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化剂，但不能抑制组织型血纤维蛋白溶酶原活化剂；
b)在56℃以上温度下是热不稳定的；
c)冷冻至-20℃及解冻时是稳定的；
d)在4℃，在pH5-9范围内是稳定的；
e)pI值在5.0-7.8之间；
f)能与人尿激酶或人尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化剂形成一种抗去污剂复合物，
g)在未还原的SDS-PAGE上产生至少一个Mr为35.5±3.5KD、43.5±4.5KD或55.5±6KD的染色带，当该蛋白质与尿激酶一起培养时，该染色带消失，
该方法包括：
在体外培养能产生泯活素的细胞，这些能产生泯活素的细胞来自人类血液单核细胞、能产生泯活素的巨噬细胞和单核细胞源的转化细胞的单层培养物；从培养的上层清液中用苯基琼脂糖层析紧接着用Cibacron蓝色琼脂糖层析或制备非变性凝胶电泳回收泯活素，制得基本上纯的泯活素。
2、按权利要求1所述制备泯活素的方法，其特征是在体外用例如胞壁酰基二肽，脂多糖，地塞米松或佛波醇酯例如12-0-四癸烷酰佛波醇-13-乙酸酯的化学试剂刺激可产生泯活素的细胞以产生泯活素。
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