CN1335887A - 血管抑制素∶一种Cys－Ser－Val－Thr－Cys－Gly特异性肿瘤细胞粘附受体 - Google Patents

血管抑制素∶一种Cys－Ser－Val－Thr－Cys－Gly特异性肿瘤细胞粘附受体 Download PDF

Info

Publication number
CN1335887A
CN1335887A CN00801745A CN00801745A CN1335887A CN 1335887 A CN1335887 A CN 1335887A CN 00801745 A CN00801745 A CN 00801745A CN 00801745 A CN00801745 A CN 00801745A CN 1335887 A CN1335887 A CN 1335887A
Authority
CN
China
Prior art keywords
acceptor
cys
cell
ser
cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN00801745A
Other languages
English (en)
Inventor
G·图沙伊斯基
T·威廉姆斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
INCAN PHARMACEUTICAL Inc
Philadelphia Health and Education Corp
Original Assignee
INCAN PHARMACEUTICAL Inc
Philadelphia Health and Education Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by INCAN PHARMACEUTICAL Inc, Philadelphia Health and Education Corp filed Critical INCAN PHARMACEUTICAL Inc
Publication of CN1335887A publication Critical patent/CN1335887A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6425—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a receptor, e.g. CD4, a cell surface antigen, i.e. not a peptide ligand targeting the antigen, or a cell surface determinant, i.e. a part of the surface of a cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明提供一种对血小板反应蛋白的Cys－Ser－Val－Thr－Cys－Gly(SEQ IDNO:1)区具有特异性的细胞基质受体的序列。本发明还提供纯化、克隆和表达方法。该受体蛋白可广泛用于诊断、预防和治疗领域。

Description

血管抑制素：一种Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly特异性肿瘤细胞粘附受体
技术领域
本发明提供了血管抑制素(angioeidin)，对肿瘤细胞表面表达的血小板反应蛋白Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly区具有特异性的一种细胞基质受体，还提供了纯化血管抑制素的方法及其抗体和抑制剂。血管抑制素可用于各种诊断和治疗，例如癌症的诊断和治疗。
优先权信息
本申请要求1999年6月21日的美国临时专利申请60/140,309和2000年1月19日的60/176,626的优先权。
发明背景
细胞与基底膜的相互作用机制很有意义，因为癌细胞必须穿过基底膜才能转移。普遍存在的基底膜是一种特化的胞外基质，将器官实质细胞与间质胶原基质隔开。正常细胞和致瘤细胞以不同的方式与这种基质相互作用。大多数正常细胞(非转移细胞)似乎必需一种胞外基质才能存活、增殖和分化，而转移细胞，不论是正常的还是致瘤的，在组织之间转移时都必须穿过基底膜。具体地说，鳞状上皮或腺上皮内生成的转移性癌细胞必须穿过基底膜进入循环和淋巴细胞(内渗)。循环性致瘤细胞被截留在另一器官的毛细管层中，侵入血管壁，并穿过基底膜进入血管外组织(外渗)，于是形成继发性肿瘤。
细胞与胞外基质的相互作用依赖于细胞与基质的附着力。正常和致瘤细胞的附着似乎都由特异性糖蛋白介导，这些糖蛋白使细胞与基质中的特种胶原蛋白结合。例如，成纤维细胞、成肌细胞和平滑肌细胞通过纤连蛋白与I型和II型间质胶原相互作用而附着于细胞外基质，软骨细胞通过软骨粘连蛋白与II型软骨胶原相互作用而附着。正常细胞和致瘤细胞通过相似的机制附着于基底膜。基底膜的主要成分是IV型胶原，糖蛋白和蛋白聚糖。糖蛋白层粘连蛋白通过使细胞与IV型胶原结合而介导上皮细胞和致瘤细胞附着于基底膜。
转移性肿瘤细胞必须在转移过程的多个阶段穿越基底膜，这种穿越从与基底膜的附着开始。因此，阐明这一机制并鉴定促进或抑制肿瘤细胞附着于基底膜的特殊附着因子，对于癌症的诊断、预防和治疗具有重要意义。
血小板反应蛋白(TSP-1)是存在于血管基底膜肿瘤基质中，由血小板分泌的一种细胞粘附蛋白和基质分子。它介导肿瘤细胞的入侵和转移。理论所述之外，据信，肿瘤细胞通过TSP-1的粘附区定居，该区含有氨基酸序列Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)，与一种称为血管抑制素(angiocidin)的新的Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)特异性肿瘤细胞受体结合。该受体是一种跨膜受体，游离，或与细胞结合。
TSP-1由3条通过二硫键相连的相同链构成，各链含有1152个氨基酸(MW145000)。每条多肽链主要由重复性同源氨基酸序列区域构成。这些区域是一个NH2-末端的球状区；前胶原同源区；I型或备解素重复区(由3段与备解素序列同源的重复序列构成)；2型重复区，由3段与上皮生长因子序列同源的重复序列构成；3型重复区，由7段Ca2+结合重复序列构成；和一段COOH-末端球状区。
TSP-1具有以下特殊活性：促细胞粘附活性，促细胞有丝分裂活性，细胞趋化活性，止血活性，以及由这些活性衍生的活性，例如肿瘤细胞、微生物或寄生物转移活性，血小板凝聚活性，溶纤活性和免疫调节作用。
根据多项研究，血小板反应蛋白可与同一细胞上的多种细胞表面受体结合，或与不同细胞上的不同受体结合。例如血小板可通过GPIIb-IIIa、GPIa-Iia结合TSP-1(Karczewski等，生物化学杂志264：21332-21326(1989)和Tuszynski等，临床研究杂志87：1387-11394(1991))，和玻连蛋白受体(Tuszynski等，实验细胞研究182：481(1989))。平滑肌细胞、内皮细胞、U937单核细胞样细胞和黑素瘤细胞可通过一种玻连蛋白样受体与TSP-1结合。鳞状细胞癌通过一种并非整连蛋白或CD36的Mw80,000/105,000分子与TSP-1结合(Yabkowitz等，癌症研究51：3648-3656(1991))。
血小板反应蛋白抗体的作用证明了该蛋白的活性和重要性。研究显示，抗血小板反应蛋白抗体能抑制血小板凝聚，说明血小板反应蛋白在该系统中起着重要作用(Tuszynski等，血液72：109-115(1988))。此外，抗血小板反应蛋白抗体抑制细胞与涂有血小板反应蛋白的培养板粘附，但不抑制与未涂血小板反应蛋白的培养板粘附，这说明了细胞粘附作用。这进一步证明，血小板反应蛋白参与细胞粘附和相关的癌症转移。G.Tuszyski，癌症研究47：4130-33(1987)。
已分离得到其他胞外基质蛋白的受体。Liotta等的美国专利4,565,789描述了层粘连蛋白受体的分离。Mecham等，生物化学杂志264：16652-7(1989)描述一种弹性蛋白受体，具有与67KD层粘连蛋白相似的结构和功能。曾提出，CD36结合血小板反应蛋白的Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)序列。Asch等，生物化学生物物理学研究通讯182：1208-1217(1992)。然而，CD36是一种88KD的蛋白质。本发明的Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)特异性受体与以往所分离的胞外基质蛋白受体是不同的。
本发明参考了在此引用的所有文献。
发明概述
本发明目的之一是提供一种纯化的受体，它具有对血小板反应蛋白Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)特定区域的特异性结合亲和力，宜含有序列SEQID NO：2或SEQ ID NO：3，或它们的片段或突变体，还提供这些受体的抗体和抑制剂。
本发明的目的还在于提供用SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的受体，或它们的片段或突变体，或其抗体或配体治疗或诊断疾病的方法。
附图简述
图1(血管抑制素序列)是血管抑制素的序列，这是一种Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly特异性受体蛋白(SEQ ID NO：2)。
图2(血管抑制素序列)是血管抑制素的序列，这是一种Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly特异性受体蛋白(SEQ ID NO：3)。
图3(序列比较)比较图1和图2两种受体的DNA序列(SEQ ID NO：4和SEQID NO：5)。
图4(血管抑制素的SDS-PAGE凝胶)是血管抑制素，Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly特异性受体蛋白的SDS-PAGE凝胶。泳道1是非还原蛋白质(染色)。泳道2是还原蛋白质(染色)。泳道3是非还原蛋白质(标记)。泳道4是还原蛋白质(标记)。泳道5是非还原表面标记蛋白质。
图5(重组血管抑制素)是对重组受体的SDS-PAGE和Western印迹。对含有表达的受体、空载体对照和纯化his-受体的细菌提取物进行SDS-PAGE分析，并用抗受体抗体进行印迹染色。为了进行Western印迹，膜在受体抗体血清的TBS-Tween(含0.05％Tween-20的tris缓冲液)1∶2000稀释液中处理2小时，用TBS-Tween洗膜，加入1∶15,000稀释的辣根过氧化物酶偶联抗兔IgG检测1小时，洗膜，然后ECL(增强化学发光)显示，Amersham，Arlington Heights，IL。各板和各泳道如下：A板：染色凝胶，B板：抗受体抗体印迹；泳道1：预染色MW标准品，2：无基因插入细菌的除垢剂提取物，3：带有插入片段细菌的除垢剂提取物，4：还原的his尾纯化受体，5：非还原的his尾纯化受体，6：预染色MW标准品。
图6(TSP-1和肽与血管抑制素的结合)显示TSP-1和Cys(Acm)-Ser-Val-Thr-Cys(Acm)-Gly(SEQ ID NO：6)与重组受体的结合。含表达的受体(泳道2，4，7)或不含表达的受体的对照裂解液(泳道1，3，6)用以下物质染色：抗受体抗体(泳道1，2)，生物素化的TSP-1(泳道3，4)，或生物素化的Cys(Acm)-Ser-Val-Thr-Cys(Acm)-Gly(SEQ ID NO：6)(泳道6，7)。
图7(受体与血小板反应蛋白-1的结合)是受体-TSP-1结合常数的测定。用亲和力检测系统，一种共振镜面生物传感器系统，通过相互作用分析测定受体与TSP-1的结合。将TSP-1结合于比色杯上，加如入受体。该图是仪器反应对时间做图(图8)所得的拟一级速度常数图。
图8(与血小板反应蛋白-1结合的受体)显示用来测定受体-TSP-1结合常数的原始数据。用共振镜面生物传感器系统通过相互作用分析测定受体与TSP-1的结合。该图显示样品的仪器反应对时间图，用于绘制图7中的数据点。仪器反应与受体-TSP-1复合物的浓度成比例关系。
图9(受体肽对受体与TSP-1结合的影响)显示用亲和力检测系统测得的受体肽对受体与TSP-1结合的影响，将TSP-1结合于比色杯上，测定受体与它的结合。加入单独的受体，或受体加肽(两种摩尔比)。试验了受体肽以及一种随机阴性对照，测定它们抑制结合的能力。
图10(受体和肽与TSP-1的结合)显示单独的受体和单独的各种肽与比色杯上固定化TSP-1的结合。受体和受体肽都与TSP-1结合，随机阴性对照肽则不。
图11(受体与TSP-1和Cys(Acm)-Ser-Val-Thr-Cys(Acm)-Gly的结合)显示TSP-1和肽Cys(Acm)-Ser-Val-Thr-Cys(Acm)-Gly(SEQ ID NO：6)都与比色杯上的固定化受体结合。
图12(受体在乳房肿瘤内的定位)显示受体在乳房肿瘤内的定位。在图的中央，可以看到围绕肿瘤细胞边界的着色受体。
图13(模拟和受体转染牛主动脉内皮细胞的粘附)显示用与板上TSP-1结合的受体转染细胞或阴性对照BSA进行的细胞粘附研究。受体转染的细胞与TSP-1板的结合比BSA更强。
图14(B16-F10黑素瘤细胞与受体肽的粘附)显示用固定于板上的TSP-1、受体肽和对照进行的细胞粘附研究。受体转染的细胞与纤连蛋白(阳性对照)、TSP-1和受体肽板强烈粘附。这说明在TSP-1相互作用中还有另一种蛋白参与。
图15(TSP-1转染的MDA-MB435乳房癌细胞与固定化重组受体的粘附)显示用TSP-1转染的细胞(和载体转染的对照细胞)进行的细胞粘附研究。TSP-1转染的细胞与受体板的结合比对照细胞更强。
图16(抗TSP-1抗体对TSP-1转染的MDA-MB-435乳房癌细胞与固定化重组受体粘附的影响)显示用TSP-1转染的细胞进行的细胞粘附研究。该图显示，抗TSP-1和抗Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)抗体抑制与受体板的结合。
图17(重组受体对MDA-MB-435乳房癌粘附的作用)显示用TSP-1转染的细胞进行的细胞粘附研究。加入的游离TSP-1以浓度依赖性方式抑制细胞与板上固定化受体的粘附。
图18(受体对血管生成的作用)显示血管抑制素对血管生成的作用。该图显示，血管抑制素抑制微管的形成。
图19(受体对微血管稳定性的作用)显示血管抑制素对微血管稳定性的作用。该图显示，在体外，血管抑制素破坏形成后的微管。
图20(受体对牛主动脉内皮细胞形态的作用)显示血管抑制素对牛主动脉内皮细胞形态的作用。血管抑制素浓度提高使细胞变长，从板上脱离，聚集，并死亡。
图21(受体对细胞活力的作用)显示血管抑制素对细胞活力的作用。在受体存在下，BAEC和HUVEC细胞系活力降低，说明TSP为这些细胞系生存所必需。成纤维细胞、A549、MB231和MCF7细胞系的活力没有显著差异，说明TSP不是这些细胞系生存所必需。
图22(受体对牛主动脉内皮细胞(BAEC)和牛平滑肌细胞(BSM)活力的作用)显示血管抑制素对BAEC和BSM细胞活性的作用。血管抑制素降低BAEC细胞的活力，但不影响BSM细胞。
图23(受体对牛主动脉内皮细胞(BAEC)和小鼠Lewis肺癌的作用)显示血管抑制素对BAEC和小鼠Lewis肺癌细胞活力的作用。血管抑制素降低BAEC细胞的活力，但不影响Lewis肺癌细胞。
图24(受体对人脐静脉内皮细胞活力的作用)显示血管抑制素降低HUVEC细胞活力的作用。
图25(受体对人脐静脉内皮细胞活力的作用)显示TSP-1存在下血管抑制素对HUVEC细胞活力的作用。
图26(受体介导的牛主动脉内皮细胞活力)显示TSP-1存在下血管抑制素对牛主动脉内皮细胞活力的作用。
图27(受体结合试验)以图形方式说明生物素-亲和素受体结合试验。
图28(受体与固定化TSP-1的结合)显示血管抑制素与固定化TSP-1结合。该图显示KD为9nm的可饱和结合。
图29(受体对生物素-受体与TSP-1结合的作用)显示血管抑制素对生物素-血管抑制素复合物与TSP-1结合的竞争作用。
图30(TSP-1受体结合的肽竞争)显示肽对生物素-血管抑制素复合物与板上固定化TSP-1结合的竞争作用。
图31(由噬菌体展示文库得到的受体结合肽)显示通过噬菌体展示文库筛选得到的血管抑制素结合肽。
图32(TSP-1受体结合的肽(1mg/ml)竞争)显示肽对TSP-1与血管抑制素结合的竞争作用。Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)和Lys-Val-Trp-Val-Leu-Pro-Ile(SEQ ID NO：14)这两种肽都抑制结合。
图33(血管抑制素对人主动脉内皮细胞(HAEC)和人肺微血管内皮细胞(HMVEC-L)活力的作用)显示血管抑制素降低HAEC和HMVEC-L细胞活力的作用。
图34(血管抑制素及其片段对牛主动脉内皮细胞活力的作用)显示血管抑制素及其片段降低牛主动脉内皮细胞活力的作用。
图35(血管抑制素对Lewis肺癌生长的作用)定量显示血管抑制素对小鼠侧腹Lewis肺癌肿瘤生长的体内作用。
图36(血管抑制素促进肿瘤坏死)显示血管抑制素在细胞水平对侧腹肿瘤坏死的作用。
图37(血管抑制素对Lewis肺癌生长的体内作用)定量显示血管抑制素对小鼠侧腹Lewis肺癌生长的体内作用。
图38(血管抑制素治疗对患Lewis肺癌小鼠存活率的作用)显示血管抑制素治疗对患Lewis肺癌小鼠存活率的作用。
图39(活力研究)显示血管抑制素对牛主动脉内皮细胞活力的作用。
图40(抗血管抑制素抗体对血管抑制素介导的BAEC活力抑制的作用)显示抗血管抑制素抗体对血管抑制素介导的牛主动脉内皮细胞活力抑制的作用。
图41(血管抑制素对BAEC与底物粘附的作用)显示血管抑制素对牛主动脉内皮细胞粘附的作用。
图42(血管抑制素氨基末端和羧基末端部分的功能)显示血管抑制素蛋白的N-末端部分，就TSP-1结合性和抗内皮细胞活性而言，具有全长血管抑制素蛋白的全部活性。C末端部分的活性则近似+99*于阴性对照。
发明详述
本发明提供纯化的血小板反应蛋白(TSP-1)受体蛋白(或称血管抑制素)的序列。此类受体的序列可参见图1和2(SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)。两段序列的区别在于Gly-Glu-Arg三个氨基酸，它们DNA序列之间的差异参见图3。
此类受体具有对血小板反应蛋白Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)区的特异性。此类受体蛋白可用于，例如，产生可用于包括癌症诊断或治疗等各种治疗领域的抗体。还可借助对Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)特异性受体结合位点的计算机造型设计新的可体内抑制或结合Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)特异性受体位点的化合物。该受体蛋白与癌症相关，且在癌症细胞中被上调。该受体蛋白在本文中称为血管抑制素。
无Gly-Glu-Arg受体的序列(图2)与两种已知非相关蛋白质：抗分泌因子和人26S蛋白酶的遍在蛋白结合亚基具有序列同源性。抗分泌因子是一种垂体制造的蛋白质，与结肠内皮细胞结合并抑制水向结肠内皮细胞内的运输。因此，该蛋白可调节流入肠腔的水量。抗分泌因子在感染条件下产生，例如当宿主被霍乱菌感染时。Johansson，E.，“抗分泌因子蛋白内活性位点的鉴定”，生物化学和生物物理学学报1362：177-82(1997)。另一方面，人26S蛋白酶的遍在蛋白结合亚基与遍在蛋白结合，协助细胞内老化蛋白质的降解。Ferrell，K.，“人26S蛋白酶的多价遍在蛋白链结合亚基的分子克隆和表达”，FEBS Letters381：143-48(1996)。
出人意料的是，血小板反应蛋白受体序列与这两种已知蛋白具有序列同源性。从未将这两种已知蛋白质与癌症相关联，或发现他们在癌细胞中上调。两蛋白质没有任何相同的功能，而且在体内作用的部位也不同。本发明的受体位于细胞表面，而抗分泌因子在血液中循环，遍在蛋白结合亚基则含于细胞内。本发明受体具有与两种已知蛋白不同的翻译后修饰方式。所述的修饰包括：糖基化，磷酸化，异位(ecto)磷酸化，亚基结构(单体，二聚体或四聚体)和不同的构象结构，包括巯基的结合。
据信，本发明受体的抗体和配体不会干扰抗分泌因子和遍在蛋白结合亚基的作用。遍在蛋白结合亚基位于一张酶复合物内，隐藏在细胞内，因此得到保护而不会发生任何交叉反应。抗分泌因子似乎只在机体受感染，特别是胃肠感染时，才产生。因此，一般情况下，它不存在于血液中，应该不会与本发明受体的抗体发生交叉反应。而且，抗体的特异性依赖于翻译后修饰，而这三种蛋白质的这种修饰是不同的。同样，因为这些蛋白质之间的翻译后修饰不同，加入竞争性受体蛋白也不会干扰其他的系统。
本发明的受体还包括SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3中有修饰或称突变的受体，这些肽仍能结合血小板反应蛋白肽Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)，亲和力约10-6-10-10，约10-7-10-9为佳，10-8最好。突变体可含有不影响二级结构或蛋白质功能的保守性取代，这包括同类疏水性、亲水性、碱性和酸性氨基酸取代。具体地说，这包括但不限于以下取代对：缬氨酸和苏氨酸，甘氨酸和异亮氨酸，赖氨酸和精氨酸，谷氨酸和天冬氨酸，苯丙氨酸和色氨酸，丝氨酸和苏氨酸，以及甲硫氨酸和半胱氨酸。较好的是，对羧基末端区Ile248-Lys380(SEQ IDNO：25)进行修饰。该区似乎不会影响血管抑制素的活性。然而，也可以对其他区域进行修饰。熟练技术人员不难看出还可进行其他保守性取代。
此外，本发明可使用含氨基末端区(Met1-Lys132)的片段，以及氨基末端区片段的突变体。氨基末端片段(Met1-Lys132)参见SEQ ID NO：24。定义和缩写
“血管抑制素”，“Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)特异性受体蛋白”，“血小板反应蛋白受体蛋白”，“TSP-1受体”和“受体”都指包括但不限于人、猪、马、牛和小鼠等任意哺乳动物来源的天然血小板反应蛋白受体蛋白，它表现出对肽Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)的特异性结合亲和力。该受体的序列为SEQ ID NO：2和3。该术语也包括合成的TSP-1受体蛋白，即用重组法产生或直接化学合成的蛋白质。TSP-1受体蛋白存在于血小板、内皮细胞、上皮(肺)细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、角化细胞、单核巨噬细胞、神经胶质细胞，尤其是大多数癌组织中，这包括但不限于黑素瘤细胞和肺癌细胞。
“血管生成活性”在此指抑制或增强血管或淋巴管形成的能力。
“抗内皮细胞活性”在此指降低内皮细胞，例如牛主动脉内皮细胞活力的能力。
“抗疟疾活性”在此指抑制被疟疾感染的血细胞粘附于内皮细胞，疟原虫孢子识别和进入肝细胞，或疟疾合子识别和进入红细胞的能力。抗疟疾活性可表现为疫苗或能抑制细胞粘附的治疗剂的形式。
“抗转移活性”在此指预防或显著减弱肿瘤细胞转移程度或范围，或抑制或引起原发实体肿瘤退化的能力。
“动脉粥样硬化活性”在此指血小板反应蛋白促进或抑制动脉粥样硬化性损伤形成的能力。动脉粥样硬化性损伤定义为含脂物质的恶性累积，尤其是动脉壁上的累积。
“细胞粘附活性”在此指促进或抑制细胞，尤其是哺乳动物细胞附着于底物的能力。
“糖尿病性视网膜病理活性”在此指抑制糖尿病引起的眼内血管生成异常的能力。
“生长因子活性”在此指抑制或促进细胞增殖的能力。
“黄斑变性活性”在此指抑制黄斑变性中视网膜和黄斑下血管异常生长的能力。
“血小板反应蛋白样活性”在此指各种与抑制血小板反应蛋白生物活性类似的活性。这些活性包括促细胞粘附活性，细胞有丝分裂活性，细胞趋化活性和止血活性，以及由这些活性衍生的活性，例如肿瘤细胞、微生物或寄生物转移活性、血小板凝聚活性、溶纤活性和免疫调节能力。优选实施方式
本发明的优选受体蛋白具有图1-2所示的序列(SIQ ID NO：2和SEQ IDNO：3)。本发明的其他受体蛋白含有，如前所述，这些序列的突变体。一种优选片段包含氨基末端(Met1-Lys132)(SEQ ID NO：24)。
Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)特异性受体，血管抑制素，来自癌组织，例如黑色瘤细胞或肺癌细胞。受体的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析显示，它在非还原性条件下的表观分子量为50kD。有些制备物中，可能存在少量分子量100kD以上的二聚体。在还原性条件下，该蛋白质迁移出两条紧靠在一起的主要多肽条带，表观分子量分别为50和60kD，其中50kD的可能是60kD多肽的降解或修饰形式。这符合这样的解释，即，该蛋白质由通过链间二硫键相连的两条多肽链构成，当二硫键结合时形成更紧密的构型。
该蛋白质与整连蛋白抗体或CD36抗体无交叉反应。Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)特异性受体蛋白，血管抑制素，是一种糖蛋白，因为它能与半乳糖、甘露糖和糖胺特异性外源凝集素结合。和糖的存在相一致的是，纯化受体蛋白具有高260nm吸光度。
为了进一步描述纯化的天然血管抑制素蛋白的特征，研究了其在体外作为受体的活性。该受体以离子依赖性方式与血小板反应蛋白相互作用，但不与纤连蛋白(FN)或牛血清白蛋白(BSA)相互作用。血管抑制素的用涂
本发明的TSP-1受体蛋白具有多种用途。(1)可产生该受体的抗体或配体。这些抗体或配体可模拟血小板反应蛋白的作用，或干扰该受体从而抑制血小板反应蛋白活性。(2)可利用对受体序列的知识测定患者血液、活检组织样品或其他组织中该受体的水平。非侵袭性肿瘤不表达该受体，或只低水平地表达，侵袭性肿瘤则高水平地表达该受体。该受体的水平可指示患者的诊断或预后。这可以提供可靠的肿瘤标志，将可能永远不会扩散的非侵袭性肿瘤细胞与转移并致死的侵袭性表型相区别。这有助于恶性肿瘤的检测和治疗。(3)可利用该受体设计模拟或抑制血小板反应蛋白活性的药物。(4)可将该受体或其片段给予患者作为血小板反应蛋白活性的竞争性抑制剂。可用该受体的修饰形式代替受体或其片段。就此而言的可接受的片段宜含有可以10-6-10-8M的亲和力与TSP-1结合的TSP-1结合区或该区的修饰形式。(5)可将细胞毒性药物、激素、造影剂或放射性部分与该受体的抗体或配体(作为靶向部分)偶联，用于癌症等的治疗。(6)可用该受体的抗体或配体涂覆或结合生物医学器具，用于分离在细胞表面带有血小板反应蛋白的受体的细胞，例如血小板。(7)可用该受体或其片段抑制肿瘤的生长，减小肿瘤体积，或防止肿瘤生长。(8)可用该受体或其片段预防、抑制或逆转血管生成。本领域技术人员还可以看出本发明受体的其他用途。
这些组合物都可以与无毒的其加成盐、酰胺和酯一起给予患者，在单用时提供上述疗效。这样的组合物还可以含有可生理耐受的液体、凝胶或固体稀释剂、佐剂和赋形剂。标准制剂是本领域熟练技术人员已知的。优选的给药方式包括：静脉内、肌内和皮下给药。另一种优选给药方式通过(例如)将该组合物与某种靶向试剂相连，将组合物直接导向机体患区。适合其他给药方式的其他制剂包括栓剂、鼻内喷雾，有时还包括口服制剂。
例如，本发明抗体可在患者体内介导血小板反应蛋白样活性。可将具有抑制或模拟完整血小板反应蛋白作用的本发明的抗体或含所述抗体的组合物用于各种治疗或预防性用途，例如癌症治疗，动脉粥样硬化、疟疾治疗或预防，血栓形成和血栓溶解，血管生成，或细胞附着。这些抗体还可以用作诊断试剂、治疗药物或其他化合物的载体。这些抗体还可以用于生物医学装置中。
这些抗体和组合物可在兽医上给予动物，例如家养或畜养的动物或牲畜，也可在临床上象其他治疗性抗体药物一样用于人。
在理论所述之外，本发明的抗体被认为是天然血小板反应蛋白的激动剂或拮抗剂。这些抗体还被认为是环子孢子蛋白、血小板反应蛋白相关无名蛋白和备解素补体蛋白的激动剂或拮抗剂。含有TSP-1的1型重复序列的其他配体，例如METH-1和METH-2，以及属于ADAMTS类蛋白质的相关蛋白能与血管抑制素相互作用。Vasquez，F.，“METH-1，ADAMTS-1的人直向同源体，和METH-2是具有血管抑制活性的一个新蛋白家族的成员”，生物化学杂志274：233349-23357(1999)。该受体配体的应用与抗体相同。还可将该受体或其片段作为血小板反应蛋白的竞争性配体给予患者。该受体的突变体(即受体的修饰形式)也可以作为血小板反应蛋白的竞争性配体给予患者。
可用多种体外或体内试验证明抗体是否具有血小板反应蛋白样活性。这些试验包括但不限于：抗体-受体结合试验，细胞粘附试验，血小板凝聚试验，和细胞增殖试验。可用一种高处理量的结合试验筛选具有血小板反应蛋白样结合性的受体的抗体。可以将该受体固定在测试板上，与标记的TSP-1结合，加入待测化合物，测定它是否抑制TSP-1与该受体的结合。其他试验，例如以下所述，可用来测定待测抗体的功能性活性。
转移
转移是疾病从机体的一个部位扩散到不相关的另一部位，例如恶性肿瘤细胞通过血液流或淋巴流转移中所发生的那样。转移被认为通过一种级联机制发生，包括：肿瘤细胞粘附于内皮，内皮收缩，基底膜的基质降解和肿瘤细胞侵入血流。对该级联中任一阶段的干扰都有利于治疗或预防转移性癌症。
已知天然血小板反应蛋白分子能促进肿瘤细胞的转移。Tuszynski等，癌症研究47：4130-4133(1987)。目前对于血小板反应蛋白的促进机制还不完全清楚。
抗转移活性可通过化合物体外结合黑素瘤细胞的能力(Tuszynski等，生物学年报184：189-91(1990))，和体内减小肿瘤集落的大小或减少其数量的能力(Tuszynski等，癌症研究47：4130-4133(1987))来鉴定。
受体的抗体或配体可用作抗转移剂，尤其是用作抗肺癌转移剂。这样的试剂抑制转移性肿瘤细胞，特别是响应血小板反应蛋白的那些细胞的粘附。他们还减少和缩小肿瘤集落。这些抗体和配体的特殊优点是循环半寿期长。
可以通过多种机制产生上述抗转移活性。抗体或配体可以是细胞毒性的或抑制细胞增殖。作为细胞增殖抑制剂的试剂能够：1)抑制有丝分裂，2)抑制血管生成或3)激活补体途径和相关的杀伤细胞。这些机制通过抗体或配体与该受体的结合而起效。
本发明的抗体和配体还可用在生物医学装置中。因为抗体和配体能够促进转移性肿瘤细胞的附着，可以用它们涂覆生物医学装置，从而去除血液或淋巴液中循环的肿瘤细胞。这样的生物医学装置还可以用来捕捉肝细胞瘤或其他恶性肿瘤。
抗体和受体的另一用途是作为载体用于将毒素、药物、激素、造影剂或放射性部分的定向于转移性肿瘤细胞，用于诊断或治疗。这些载体也结合肝细胞瘤或其他恶性肿瘤。受体本身或其片段/突变体可用于竞争性地抑制血小板反应蛋白活性。具体地说，本发明包括治疗癌症的组合物和方法，其中将TSP-1的配体或抗体与放射性部分相连。还包括放射性检测和诊断癌症的组合物和方法，其中将TSP-1的配体或抗体与放射性部分相连。用于治疗、检测和诊断癌症的放射性部分是本领域所熟知的。最后，本发明包括用于MRI检测、诊断和定量对癌症治疗的疗效应答的组合物和方法，其中将TSP-1的配体或抗体与MRI增强剂相连。用于检测、诊断和定量癌症疗效应答的MRI增强剂是本领域所熟知的，包括但不限于：钆、锰、铁、锝、GASTROGRAPHINTM、ISOVUETM、HEPATOLYTETM和NEUROLYTETM。熟练技术人员知道，还有其他可用的MRI增强剂。
动脉粥样硬化
动脉粥样硬化是一种疾病，其特征在于动脉内壁上小脂肪瘤的沉积，常伴有患区的变性。
给予TSP-1受体的抗体、配体，或受体或其片段/突变体可降低血小板反应蛋白活性，从而抑制动脉损伤的发展。这一结果已经在饲以高胆固醇饮食的兔中得到了证实。
糖尿病性视网膜病
糖尿病性视网膜病中，视网膜内的血管被损坏，渗液或出血，造成视网膜损伤。在增殖性视网膜病中，视网膜表面形成新的脆弱血管。这些新血管，或新血管化，会造成严重的视力问题，因为它们会破裂、渗漏或出血渗入晶状体。当晶状体被血液遮挡时，光线就无法透过眼睛进入视网膜，由此造成视力模糊和扭曲。新血管还会造成疤痕组织，将视网膜从眼后拉离，造成视网膜脱落。视网膜脱落会导致失明。最后，异常血管会在虹膜上生长，造成青光眼。TSP被认为参与了糖尿病性视网膜病中的异常血管生长。
黄斑变性
在“湿”型黄斑变性中，异常血管(又称视网膜下新血管化)在视网膜和黄斑下生长。然后，这些新血管可能破裂和渗液，因而引起黄斑膨胀或抬升，造成中心视力扭曲或损伤。这种情况下，视力的丧失会很快，很严重。TSP被认为参与了黄斑变性中的异常血管生长。
疟疾
疟疾是一种传染病，由寄生在红血球中的多种原虫(疟原虫属)引起，由被感染的蚊子叮咬传播给哺乳动物。本发明的抗体、配体、受体或其片段/突变体可用作治疗剂抑制细胞粘附。
这些试剂抑制血小板反应蛋白活性，因此抑制疟疾感染红血球与内皮细胞粘附，抑制疟原虫孢子识别和进入肝细胞，或抑制疟原虫合子识别和进入红血球。
血管生成
血管生成指血管和淋巴管的形成。本发明的抗体、配体、受体或其片段/突变体可用于血管生成的调节，特别是促进愈创，抑制或防止肿瘤生长、糖尿病性视网膜病、黄斑变性和类风湿性关节炎。标准血管生成试验是本领域所熟知的。此类试验包括但不限于：用各种细胞系进行的增殖和迁移研究，胶原酶抑制，和鸡尿囊绒膜上的体内新血管化(CAM试验)。
粘附调节
本发明的抗体、配体、受体或其片段/突变体可调节细胞粘附，抑制TSP-1及其他蛋白与含有TSP-1受体位点的细胞，例如血小板的结合。
诊断
本发明的抗体和配体可作为试剂用于各种癌症的诊断/预后，包括但不限于：胃肠道(胃、结肠和直肠)癌、乳房癌、肝癌和黑素瘤。可用TSP-1的水平进行患者预后或诊断。对该受体序列的进一步了解可直接用于测定患者样品中该受体的水平。
载体
可将细胞毒性药物、激素、造影剂或放射性部分与抗体或配体偶联，用于癌症等的治疗。
生物医学装置
可用抗体或配体涂覆或结合于生物医学装置，以分离在细胞表面带有血小板反应蛋白受体的细胞，例如血小板。鉴定血小板反应蛋白受体的相应配体
相应配体包括血小板反应蛋白，其突变体或片段(含肽Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1))，其他结合本发明受体的肽或蛋白质。
可用噬菌体展示肽文库试剂盒(例如New England Biolabs，Beverly，MA的产品)产生和鉴定这样的配体。噬菌体展示是一种选择技术，其中，肽或蛋白质表达为与噬菌体包膜蛋白形成的融合蛋白，使得融合蛋白展示在噬菌体的外表面，而融合蛋白的编码DNA则留在病毒颗粒内。噬菌体展示可用来建立随机肽序列大型文库与各序列的编码DNA之间的物理关联，从而可通过一种称为生物筛选的体外选择过程迅速鉴定多种靶分子(包括受体)的肽配体。这一技术的实施是通过：用涂有靶受体的板(或微珠)培养噬菌体展示肽文库，洗去不结合的噬菌体，洗脱特异性结合的噬菌体。然后扩增洗脱的噬菌体，通过多轮生物筛选和扩增，成功富集含有结合最牢固序列的噬菌体。3-4轮后，通过DNA测序和ELISA鉴定各克隆。
然后，可用编码肽的寡核苷酸作为探针鉴定含有鉴定所得肽序列的蛋白质。然后，用后文实施例中的任一结合技术评价它们与受体的结合能力。
血管抑制素的表达
血管抑制素或其片段或突变体都可以在已知表达系统内表达，这些系统包括哺乳动物细胞系，昆虫细胞，酵母细胞和大肠杆菌之类的细菌。
就异源蛋白质的表达而言，哺乳动物细胞系具有许多优点。哺乳动物细胞内产生的真核蛋白将是功能性的，因为转录、翻译和翻译后修饰在高等真核生物之间是保守的。哺乳动物细胞系还适合许多重组蛋白研究，包括结构-功能试验和分析蛋白质对细胞功能的生理学效应。
昆虫细胞是很好的重组蛋白表达宿主。因为作为高等真核细胞，它们的翻译后修饰与哺乳动物细胞类似，但生长更快，且不需要CO2培养箱，所以常选用它们来生成蛋白质。此外，昆虫细胞很容易适应悬浮培养，从而可进行大规模表达。
已证明，许多酵母菌株对于表达和分析真核蛋白十分有用。对于酵母的基因已十分清楚，并已知它们进行许多类似哺乳动物的翻译后修饰。在特定的培养基中，这些单细胞真核生物生长迅速，比用哺乳动物细胞更容易，更便宜。因此，酵母是适合大规模生成重组真核蛋白的理想表达系统。
大肠杆菌内的重组蛋白表达迅速而且产量高。然而，因为细菌不能将蛋白质糖基化或进行正确折叠，所以，细菌系统无法产生具有最适活性的蛋白质。但是，因为使用方便，仍然常选用细菌表达系统。
实施例
以下实施例说明本发明但不限定本发明的范围。在使用重组血管抑制素的实施例中，使用的是SEQ ID NO：2序列。但是，本发明使用SEQ ID NO：3序列、以及以上两序列的突变体和片段，同样效果良好。实施例1：受体的纯化
从细胞中纯化Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)特异性受体蛋白包括2个基础步骤：制备细胞，和通过亲合层析纯化受体。细胞来源优选小鼠黑素瘤细胞和人肺癌细胞，这些已可为公众获得。与大多数组织来源相比，培养细胞另外具有无蛋白酶的优点。这有利于活性受体蛋白的稳化和纯化。
制备细胞提取物，在受体可与Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)肽结合的条件下，通过固定有Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)肽的层析柱。然后，从柱上洗脱纯形式的Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)特异性受体。
具体地说，从4.0×107个B16-F10小鼠黑素瘤细胞或A549肺癌细胞中制备细胞提取物：将细胞体溶于5ml结合缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5，含0.5％(NON-PRECENDENTIAL)*-40除垢剂，1mM CaCl2，1mM MgCl2，100μM亮抑酶肽，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，10μg/ml抑蛋白酶肽)。4℃，4,000×g离心20分钟，去除样品中的不溶物。
组装Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)亲合柱：4mg Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)与1ml CN-活化琼脂糖偶联，充填成5ml的柱，以HEPES缓冲液pH7.35平衡。将提取物加到已用50ml结合缓冲液洗过的Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)柱上。用50ml结合缓冲液洗柱，洗去非特异性结合蛋白质。用以下缓冲液洗脱特异性吸附的蛋白质：0.1M Tris，pH10.2，含0.05％(NON-PRECENDENTIAL)*-40除垢剂，1mM CaCl2，1mM MgCl2，100μM亮抑酶肽，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和10μg/ml抑蛋白酶肽。在试管中收集10ml洗脱液，试管中含有700μl用于中和Tris的1N HCl。将试管中的洗脱峰组分加到以阴离子交换柱缓冲液(20mM Tris HCl，pH8.0，含5mM辛基葡糖苷)平衡过的阴离子交换柱(Mono Q，Pharmacia)上。用20ml NaCl梯度(100％1M NaCl)洗脱结合的物质，以280nm和260nm检测柱。结合物质通常从0.3M NaCl开始洗出，维持该梯度，使得蛋白质等梯度洗脱，得到一个在260nm处高吸光度的均一峰。
将洗脱组分和未结合的组分浓缩，用标准技术，在8％聚丙烯酰胺凝胶上对浓缩物进行SDS-凝胶分析，用考马斯蓝染色显示。峰组分在非还原性条件下的SDS-凝胶电泳是一条表观分子量50kD的主条带，在还原性条件(5％β巯基乙醇)下则是50和60kD的两条多肽带，参见图4(泳道1和2)。从1×107个细胞回收到约100μg蛋白质。按标准方法(Karczewski等，生物化学杂志264：21322-6(1989))，用125I标记Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)特异性受体。简而言之，将12μg纯化蛋白质溶于100μl辛基葡糖苷缓冲液，与碘珠共培养5分钟。按已知方法(Tuszynski等，生物化学年报106：118-122(1980))，在以辛基葡糖苷缓冲液平衡的Sephadex G-25小柱上去除未反应的碘。典型实验所得蛋白质的特异性活性为104cpm/μg。对标记物质进行SDS-凝胶电泳，然后的放射性自显影显示，在还原性条件下，主要是60kD分子量的多肽条带。图4，泳道3和4是这种标记物质的放射性自显影照片。实施例2：对Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)特异性TSP-1受体cDNA的分子克隆和序列分析
制备抗体或寡核苷酸探针和DNA文库，以及用抗体或核酸杂交对它们进行筛选的基本策略是本领域熟练技术人员所熟知的。参见，例如，DNA克隆：第一卷(D.M.Glover编，1985)：核酸杂交(B.D.Hames和J.Higgins编辑，1985：寡核苷酸合成(M.J.Gate编，1984)：T.Maniatis，E.F.Fisch & J.Sambrook，分子克隆：实验室手册(1982)。本发明按照这些已知方法进行本发明受体的克隆和测序。
用由A549人肺癌细胞分离的受体的多克隆抗血清筛选λUni-ZAP(Stratagene，La Jolla，CA)前列腺癌细胞(PC3-NI)文库，该文库由MCP-Hahneman大学的MarkSteams博士和Min Wang博士提供。按照PicoBlue免疫染色试剂盒(Stratagene，LaJolla，CA)的方法，用吸附噬菌体和细菌的抗受体抗血清的1∶1000稀释液筛选了200,000个空斑。分离出4个抗体阳性空斑，克隆，并用ExAssist抗干扰辅助噬菌体法(Stratagene，LaJolla，CA)将噬菌粒转移到XL1蓝细菌中。用Wizard plusminiprep(Promega，Madison，WI)纯化质粒DNA，用Sequenase2.0(U.S.BiochemicalCorp.)，用T7/T3引物组通过双脱氧链终止法测序。所得序列见图1和2(SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3)。图3是这两种受体DNA序列的比较(SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5)。实施例3：重组血管抑制素的表达
将全长受体cDNA亚克隆入含有PBK-CMV启动子的XL-1蓝细菌中，用目前分子生物学中的方法，用IPTG(异丙基-b-D-硫半乳糖吡喃糖苷)诱导表达蛋白质。用B-Per细菌蛋白质抽提剂(Pierce Chemical Co.Rockfort，III)裂解细菌。
也可以在其他细菌、杆状病毒和哺乳动物细胞(例如COS细胞)表达系统中表达该重组受体。本领域熟练技术人员知道，细菌因为不能将蛋白质糖基化或进行正确折叠，可能无法产生最佳的活性蛋白质。但是，杆状病毒表达系统能产生大量的表达蛋白质，而且该系统还能够进行许多翻译后修饰，例如糖基化、折叠、磷酸化和分泌。可将受体cDNA插入杆状病毒转移载体(MaxBac 2.0试剂盒+pBlueBacHis2 Xpress试剂盒，Invitrogen，Carlsbad，CA)。对重组病毒进行3次纯化，用Western印迹法估测Sf11细胞在无血清培养基中产生的受体量。此外，也可以用pcDNA3.1/His载体(Invitrogen)在COS细胞表达系统中表达受体。这是一种哺乳动物表达系统，其中，用受体cDNA转染COS细胞，用CMV启动子构建物诱导表达蛋白质。COS细胞易用多种方法进行转化，例如脂质转染法。实施例4：带His-尾重组血管抑制素的表达与纯化
用Express蛋白质表达系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)制备氨基末端连有6个组氨酸残基的重组受体。以克隆在PBK-CMV载体中的全长cDNA作为模板产生含有正确限制性位点的PCR产物，这些位点使得DNA可连接于带His尾的载体pTrcHISA。这是用rTth DNA聚合酶XL(Perkin Elmer，Foster City，CA)，分别含有Bgl II和EcoRl限制性位点的正向引物GGG AGA TCT ATG GTG TTG GAA AGCACT(SEQ ID NO：12)和反向引物GGG GAA TTC TCA CTT CTT GTC TTCCTC(SEQ ID NO：13)进行PCR完成的。所得的1.1kb产物含有一个5′端的Bgl II限制性位点和一个3′端的EcoR1位点，用T4 DNA连接酶将其连入用BamH1和EcoR1消化的载体。实施例5：Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly和TSP-1与重组血管抑制素的结合
用还原和非还原性SDS-PAGE分析含受体cDNA插入片段和空载体对照以及纯化His尾重组受体的细菌裂解液。将凝胶电印迹到硝酸纤维素纸上，印迹在室温下用1％BSA封闭1小时。
为了进行Western印迹，膜在受体抗体血清的TBS-Tween(含0.05％Tween-20的tris缓冲液)1∶2000稀释液中处理2小时，用TBS-Tween洗膜，加入1∶15,000稀释的辣根过氧化物酶偶联抗兔IgG检测1小时，洗膜，然后ECL(增强化学发光)显示，Amersham，Arlington Heights，IL，见图5。
为了进行配体印迹，膜用生物素化的TSP-1或生物素化的Cys(Acm)-Ser-Val-Thr-Cys(Acm)-Gly(SEQ ID NO：6)(5μg)室温下处理1小时，用TBS-Tween洗膜，加入1∶2,000稀释的辣根过氧化物酶-亲和素检测1小时，洗膜，然后ECL(增强化学发光)显示，Amersham，Arlington Heights，IL，见图6。
用Pierce蛋白质生物素化法(EZ-连接的硫代-NHS-LC-生物素，PierceChemical Co Rockfort III)将TSP-1和Cys(Acm)-Ser-Val-Thr-Cys(Acm)-Gly(SEQ IDNO：6)生物素化。透析去除未反应的生物素。实施例6：非变性血管抑制素结合TSP-1的评价
用亲和力检测系统(Cambridge，UK)评价非变性(以上配体印迹法中，受体因SDS而变性)重组受体与TSP-1的结合。这是一种光学结合法，用共价偶联了配体或受体的比色杯。用激光束检测与蛋白质衍生的比色杯表面结合的蛋白质。该方法具有高灵敏度，而且既可测定配体受体相互作用的结合速度常数，也可测定其解离速度常数。仪器假设一分子受体结合一分子TSP-1，根据以下关系计算解离常数KD：
1.平衡时，kass＝[R][TSP-1]＝kdiss[R-TSP-1]，其中kass是结合的二级速度常数，kdiss是解离的一级速度常数；
2. KD＝[R][TSP-1]/[R-TSP-1]＝kdiss/kass
3. [R-TSP-1]t＝[R-TSP-1]eq[1-exp(-kont)]，其中，仪器反应测定值弧光秒与受体-TSP-1复合物[R-TSP-1]成正比。
4.kon＝kass[L]+kdiss，其中kon是受体与TSP-1相互作用的拟一级速度常数。
将1μg TSP-1通过其氨基与比色杯表面的COOH基团与比色杯偶联。然后用乙醇胺和白蛋白封闭比色杯表面上未反应的基团。在HEPES缓冲液pH7.00中浓度189nM以上的受体在7分钟后显示为可饱和结合，这样的结合可用缓冲液部分解离，或用低pH缓冲液完全解离。将拟一级结合速度常数对受体浓度做图，计算出解离常数为44nm，见图7。用图8的仪器反应对时间读数来绘制图7中的数据点，其中，仪器反应与受体-TSP-1复合物浓度成比例关系。
在缓冲液中加入除垢剂Tween20不改变特异性结合。此外，10倍摩尔过量TSP-1的1型重复区Cys(Acm)-Ser-Val-Thr-Cys(Acm)-Gly(SEQ ID NO：6)存在下，受体的结合程度为缓冲液对照的47％，10倍乱序肽(scrambled)Val-Cys(Acm)-Thr-Gly-Ser-Cys(Acm)(SEQ ID NO：7)存在下，是缓冲液对照的88％，这说明含有Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)序列的肽能够部分竞争结合。以上结果证明克隆了一种结合TSP-1的蛋白质。实施例7：评价血管抑制素和肽与固定化TSP-1的结合
按照实施例6的方法，但将TSP-1固定在比色杯上，然后加入以下溶液之一：单独的受体，肽加受体(肽：受体等于1000和100摩尔比)。所用的肽是Val-Cys-His-Ser-Lys-Thr-Arg(SEQ ID NO：8)，Val-Cys(Acm)-His-Ser-Lys-Thr-Arg(SEQ IDNO：9)和Pro-His-Ser-Arg-Asn(SEQ ID NO：10)。前两种肽来自受体与TSP-1的Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)部分结合的部分。第三种肽是对照。
图9显示，肽Val-Cys-His-Ser-Lys-Thr-Arg(SEQ ID NO：8)通过与TSP结合，从而竞争性抑制受体与固定化TSP-1的结合。比较不同的肽与受体摩尔比可以看出，这种相互作用与浓度相关。
此外，图10显示受体衍生肽与比色杯上固定化的TSP-1直接结合。以受体为阳性对照，以Pro-His-Ser-Arg-Asn(SEQ ID NO：10)为阴性对照可以看出，肽Val-Cys-His-Ser-Lys-Thr-Arg(SEQ ID NO：8)和肽Val-Cys(Acm)-His-Ser-Lys-Thr-Arg(SEQ ID NO：9)直接结合固定化的TSP-1。
以上三图显示，本发明受体上的Val-Cys-His-Ser-Lys-Thr-Arg(SEQ ID NO：8)区与TSP-1蛋白结合。实施例8：血管抑制素与固定化TSP-1和C(Acm)SVTC(Acm)G(SEQ ID NO：6)结合的评价
按照实施例6的方法，但将TSP-1和Cys(Acm)-Ser-Val-Thr-Cys(Acm)-Gly(SEQ ID NO：6)固定在比色杯上，然后加入受体。在本实验中，用肽的Acm版用来提高其稳定性。
图11显示，TSP-1和所述肽都与本发明受体结合。这证明，TSP-1的Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)区与本发明受体结合。实施例9：血管抑制素的表面标记
如Tuszynski等，生物化学年报106：118-122(1980)所述，用乳过氧化物酶以125I表面标记完整的生长期的A549肺癌细胞。简而言之，几乎长满细胞单层的75mm烧瓶用10ml DMEM洗涤3次。然后，用5ml含0.2单位/ml乳过氧化物酶和500μCi 125I的DMEM覆盖细胞单层。每隔1分钟，温和搅拌加入1μl30％H2O2，共加5份。然后加入5μl 1mM NaN3终止反应，用DMEM洗涤细胞单层3次，收获细胞，用于纯化Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)结合性蛋白质。
对被标记物质进行SDS-凝胶电泳分析而后放射性自显影显示，非还原条件下Mw为50,000的多肽经体外碘化而被标记(图4，泳道5)。
受体先以时间依赖性方式结合TSP-1，但在60分钟后不再依赖于时间。当1mM CaCl2和1mM MgCl2同时存在时，结合最强，1mM EDTA存在下，结合量显著但很少。本实施例说明，受体与TSP-1不仅以时间依赖性方式结合，而且受体表达在细胞表面。实施例10：血管抑制素的免疫组织化学
图12显示受体在乳房肿瘤内的定位。肿瘤位于图中央大垂直条，右侧有两个岛。左右两侧较小的细胞是炎性细胞，大的白色细胞是脂肪组织。为了进行比较，在图的左下方显示了一簇正常的乳腺管。
组织在冷的95％乙醇中固定10分钟，用石蜡包埋。切成5μm的切片，贴到显微镜载玻片上。对载玻片进行去石蜡处理，并在二甲苯-乙醇分级溶液中重新水合。用3％H2O2处理5分钟以猝灭内源性过氧化物酶的活性，接着用水洗。然后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤载玻片，并以5-20μg/ml的第—IgG(免疫或非免疫IgG)含0.1％BSA PBS(PBS-BSA)溶液处理30分钟。PBS-BSA洗涤后，用Vectastain ABC免疫过氧化物酶染色试剂盒(Vector Laboratories，Burlingame，CA)的方法，载玻片以生物素化第二抗体的1∶250稀释液处理30分钟，洗涤并显影。然后，用苏木精对载玻片进行反染色，盖上盖玻片，用明场显微镜检视。
可以看到，被染色的受体围绕在肿瘤细胞的周围，但在左下角正常细胞的周围则没有。这说明，受体结合于细胞膜，并且，在肿瘤细胞中更多。
实施例11：瞬时转染和细胞粘附试验
用Wizard Plus试剂盒(Promega，WI)，以纯化的受体编码DNA转染牛主动脉内皮细胞(BAEC)和MDA-MB-231细胞，乳房癌细胞。用Superfect转染剂(Qiagen，CA)使DNA进入细胞。将细胞接种在6孔培养板上，在长至80％铺满时进行转染。用12μl的转染剂和2.5μg DNA(最低浓度为0.1μg/ml)。在无血清、无抗生素的培养基中形成Superfect-DNA复合物。细胞在37℃培养3-4小时。更换培养基，转染后48小时，收获细胞进行粘附试验。
为了进行粘附试验，在96孔板上，每两孔涂以TSP-1(40μg/ml)、纤连蛋白(40μg/ml)或1％牛血清白蛋白(BSA)。孔过夜干燥，然后用BSA封闭。在涂有蛋白质的孔中加入100μl含2×105个细胞的悬浮液，37℃培养20分钟至1小时。去除没有粘附的细胞，用Hepes缓冲液洗孔。用2.5％戊二醛固定粘附细胞10分钟，并用0.2％Giemsa染色。洗去染剂，清点1mm区域内的细胞数。以粘附BSA的细胞为背景，以粘附纤连蛋白的细胞为阳性对照。参见图13。实施例12：瞬时转染和细胞粘附试验
按照实施例11的方法，但将受体肽Val-Cys-His-Ser-Lys-Thr-Arg(SEQ IDNO：8)和Val-Cys(Acm)-His-Ser-Lys-Thr-Arg(SEQ ID NO：11)固定在培养板上。培养板上还固定以TSP-1和纤连蛋白，作为阴性对照的肽(Ala-Ser-Val-Thr-Ala-Arg(SEQ ID NO：11)和Pro-His-Ser-Arg-Asn(SEQ ID NO：10))和牛血清白蛋白。该实验的结果图14显示，受体肽引起细胞与培养板粘附，对阳性对照纤连蛋白和对TSP-1的亲和力相近。这支持这样的观点：可能有另一种蛋白质与TSP-1或其受体结合，或者，受体因另一种蛋白质的作用而被释放并与细胞膜重新结合。实施例13：瞬时转染和细胞粘附试验
按照实施例12的方法，但将完整受体蛋白固定在培养板上，并加入以TSP-1 cDNA或载体对照转染的细胞。原本低水平表达TSP-1的细胞经转染后超量表达该蛋白质。图15显示，与对照细胞系相比，TSP-1cDNA转染细胞与涂有受体的培养板结合更多(多2.5倍，p＜0.001)。分别以纤连蛋白和BSA作为细胞粘附的阳性和阴性对照。这支持这样的观点：本发明受体结合血小板反应蛋白。
在该系统中加入抗TSP-1抗体，抗Cys-Ser-Val-Cys-Thr-Cly(SEQ ID NO：1)抗体和对照IgG证实了这一特异性相互作用。图16显示，抗TPS-1抗体和抗Cys-Ser-Val-Cys-Thr-Cly(SEQ ID NO：1)抗体都抑制TSP-1表达细胞与结合于培养板上的受体粘附。
而且，在此粘附系统内加入非结合受体溶液减少细胞与培养板的粘附。图17显示，本发明受体本身竞争性抑制非转染天然TSP-1表达细胞与结合于培养板的受体粘附，进一步说明是这一相互作用导致粘附。实施例14：抗血管抑制素(TSP-1受体)抗体的产生
可用天然或合成(重组)Cys-Ser-Val-Cys-Thr-Cly(SEQ ID NO：1)特异性受体蛋白来产生多克隆和单克隆抗体。如果需要多克隆抗体，可用纯化的受体蛋白免疫选定动物(例如小鼠、兔、山羊、马等)，然后收集免疫动物的血清按照已知方法进行检测。将含有针对受体蛋白之外多种抗原的多克隆抗体的组合物通过一结合了该受体的柱，可基本去除非针对受体蛋白的抗体。洗涤后，可从柱上洗脱受体的多克隆抗体。本领域技术人员也不难制备出抗受体蛋白单克隆抗体。用杂交瘤制备单克隆抗体的一般方法是众所周知的。也可以用融合以外的方法，例如用致癌DNA直接转化B淋巴细胞或用EB病毒转染，制得无限繁殖的抗体产生细胞系。参见，M.Schreier等，“杂交瘤技术”(1980)；Hammerling等，“单克隆抗体和T细胞杂交瘤”(1981)；Kennett等，“单克隆抗体”(1980)等。
用TSP-1受体蛋白(天然或合成)作为抗原免疫生产单克隆抗体的无限繁殖化B细胞的来源，可得到识别受体蛋白分子上不同位点表位的一组单克隆抗体。通过抗体与TSP-1的竞争试验可方便地鉴定出识别受体蛋白结合区一表位的抗体。此类抗体如能在体内抑制TSP-1与其受体的结合而不激起与TSP-1肽结合相关的生理反应，则可能具有治疗潜力。
具体地说，按照标准方法，每3-4周一次50μg注射，在兔中产生Cys-Ser-Val-Cys-Thr-Cly(SEQ ID NO：1)特异性受体的多克隆抗血清。第一次注射采用完全Freund佐剂，以后用不完全Freund佐剂。通过ELISA测定抗体的效价和特异性。本实施例使用天然的纯化受体。
按照标准方法进行ELISA试验。简而言之，在微滴板上涂以2μg Cys-Ser-Val-Cys-Thr-Cly(SEQ ID NO：1)特异性受体、纤连蛋白或BSA，用1％BSA封闭1小时。各孔与50μl不同稀释度的第一抗体溶液(10mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，含150mM NaCl和0.05％Tween-20(PBS-T))共培养1小时，用PBS-1洗涤3次，然后与碱性磷酸酯酶偶联的兔抗羊IgG的PBS-T1∶800稀释液一起培养1小时，用PBS-T溶液洗孔3次，接着用不含的Tween-20的PBS-T缓冲液洗3次，然后用50μl碱性磷酸酯酶的底物溶液(以0.10M甘氨酸配制的1mg/ml磷酸对硝基苯酯溶液，pH10.4，含1mM ZnCl2和1mM MgCl2)处理。30分钟后，加入5μl 1N NaOH终止显色，测定405nm处的吸光度。
如表1所示，直接ELISA显示该抗体是单特异性的。
                               表1：血管抑制素抗体的单特异性吸光度(405nm)
     BSA    纤连蛋白   抗Cys-Ser-Val-Cys-Thr-Cly(SEQ ID NO：1)特异性受体
       免疫前血清  0.123±0.005  0.135±0.006      0.130±0.007
  抗Cys-Ser-Val-Cys-Thr-Cly(SEQ ID NO：1)特异性受体  0.134±0.007  0.176±0.004      0.665±0.003
实施例15：抗体对粘附的抑制
以下实施例是为了测定抗Cys-Ser-Val-Cys-Thr-Cly(SEQ ID NO：1)特异性受体抗体抑制癌细胞与TSP-1结合的能力。A549癌细胞表达血小板反应蛋白的受体蛋白。拆卸式微滴孔(Immulon 4 Removawell)内涂以TSP-1、纤连蛋白或层粘连蛋白以20mM bis-tris-丙烷(pH6.5)配制的40μg/ml溶液50μl，4℃过夜，用200μl1％BSA封闭1小时。A549细胞与200μg/ml抗Cys-Ser-Val-Cys-Thr-Cly(SEQ IDNO：1)特异性受体的IgG或非免疫血清共培养30分钟，离心去除不结合的抗体。将沉淀重悬于DMEM，细胞在涂有蛋白质的孔内37℃培养60分钟。清点与微滴孔表面粘附的细胞数。表2中的结果是非免疫IgG处理的粘附细胞百分比。表2显示，抗Cys-Ser-Val-Cys-Thr-Cly(SEQ ID NO：1)特异性受体抗体抑制A549细胞与涂有TSP-1表面的粘附，但对细胞与纤连蛋白或层粘连蛋白的粘附没有作用。该抗体还抑制TSP-1与组织培养块的粘附。
        表2：抗体对粘附的抑制
    蛋白质底物     ％粘附细胞
    血小板反应蛋白     10.5％
    纤连蛋白     101％
    层粘连蛋白     103％
实施例16：血管抑制素对血管生成的作用
实验评价了血管抑制素对血管生成的作用。将牛主动脉内皮细胞(BAEC)接种在胶原基质上。接着，在细胞上覆盖一层胶原。在处理板内细胞上加血管抑制素(37μg/ml)，对照板则只加缓冲液。24小时后，拍摄相衬显微照片(200×)。结果见图18。对照板内，BAEC细胞自身重排成微血管网络。但在血管抑制素处理板内，没有形成微血管，发生细胞死亡。
该胶原试验是一种被广泛认可的血管生成模型。Qian等，“血小板反应蛋白-1在体外通过上调内皮细胞内的基质金属蛋白酶-9来调节血管生成”，实验细胞研究235：403-412(1997)。以上结果证明血管抑制素是有效的血管生成抑制剂。实施例17：血管抑制素对微血管稳定性的作用
按照实施例16进行本实施例的实验，但起初不对细胞进行处理。24小时后，两种样品中都有微血管形成，且外观与对照板类似，图19。然后在对照和处理板中分别加入缓冲液和血管抑制素。又24小时后，拍摄Hoffman干扰光学显微照片。该实验中，对照没有受到影响。但是，血管抑制素的加入破坏了处理板中已形成的微血管。结果见图19。这表明血管抑制素不仅防止血管生成，而且可逆转血管的形成。实施例18：血管抑制素对牛主动脉内皮细胞形态的作用
该实验中，将BAEC细胞单层培养物接种在含1％BSA的无血清培养基中，在递升浓度血管抑制素(对照＝0，0.37μg/ml，3.7μg/ml，37μg/ml)存在下，培养24小时。用Hoffman干扰光学显微镜拍摄细胞照片。随着血管抑制素浓度升高，BAEC细胞变长，从板上脱落，聚集，死亡。结果见图20。实施例19：血管抑制素对细胞活力的作用
用37μg/ml受体或仅缓冲液处理牛主动脉内皮细胞(BAEC)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、成纤维细胞、A549人肺癌细胞(A549)、MDA-MB231人乳房癌细胞(MB231)、MCF7人乳房癌细胞(MCF7)24小时。用ALAMAR BLUETM试验测定细胞活力，该试验测定的是细胞代谢ALAMAR BLUETM颜料的能力。ALAMARBLUETM试验(购自Biosource International，Camarillo，CA)定量测定细胞系的增殖，可以确认化学试剂的相对细胞毒性。该试验采用一种依赖于代谢活性检测的荧光测定/比色测定生长指示剂。此系统采用氧化-还原(氧还)指示剂，在细胞生长引起的生长培养基还原反应中产生荧光和变色反应。这使得氧还指示剂由其被氧化非荧光兰色形式转变成被还原荧光红色形式。可用荧光检测设备(530-560nm激发波长，590nm发射波长)或吸光度检测设备(570nm和600nm)收集数据。
在本发明受体存在下，BACE和HUVEC细胞系活力降低，说明TSP为这些细胞系的活力所必需，见图21。用血管抑制素处理后，内皮细胞活力降低70-80％。成纤维细胞、A549、MB231和MCF7细胞系中没有显著差异，说明TST不为这些细胞系的活力所必需。实施例20：血管抑制素对牛主动脉内皮细胞(BAEC)和牛平滑肌细胞(BSM)活力的作用
用递升浓度血管抑制素(0，0.625，1.25，2.5，5，15，26和37μg/ml)处理BAEC和BSM细胞24小时。用ALAMAR BLUETM试验测定细胞活力。血管抑制素剂量依赖性地抑制BAEC细胞的活力，表现为一条一级单常数指数衰减曲线，图22。相反，BSM细胞未受影响。
类似的，用同样方法比较了受体对BAEC细胞和小鼠Lewis肺癌细胞活力的作用。血管抑制素降低BAEC细胞的活力，但对Lewis肺癌细胞没有作用，见图23。这表明血管抑制素不直接影响Lewis肺癌细胞的活力。对HUVEC细胞进行了相同的实验，细胞活力降低。结果见表24。实施例21：血管抑制素对人脐静脉内皮细胞活力的作用
评价血管抑制素对HUVEC细胞活力的作用，并且加入FGF和TSP-1以确定它们是否削弱血管抑制素对细胞活力的作用。FGF(成纤维细胞生长因子)是一种促内皮细胞分裂素，促进细胞的生长。单独的FGF(2ng/ml)和TSP-1(20μg/ml)都刺激细胞生长高于对照。然而，加入FGF或TSP-1都不能逆转血管抑制素(37μg/ml)的抑制作用。结果见图25。本以为TSP-1能逆转血管抑制素的抑制作用；然而，加入的量可能不足以提供合适的摩尔比。实施例22：受体介导的牛主动脉内皮细胞活力
按照实施例21的方法进行，但使用BAEC细胞。此外，加入20μg/ml和5μg/ml的TSP-1。图26的结果显示，与对照相比，TSP能部分改善血管抑制素的抑制作用。实施例23：受体结合试验
图27以图形形式显示受体结合试验。在以下实验中，TSP-1与一基质共价结合，在培养板中加入生物素化的血管抑制素，然后加入亲和素-过氧化物酶来测定有多少生物素化的血管抑制素与TSP-1结合。用分光光度计测定450nm吸光度来测定亲和素-过氧化物酶。
图28显示血管抑制素与TSP-1的结合。显示为KD＝9nM的可饱和结合。用BSA作为阴性对照。
在此系统中加入游离血管抑制素，与生物素化的血管抑制素竞争。图29显示血管抑制素对于生物素-血管抑制素复合物结合TSP-1的竞争作用。用固定化BSA作为阴性对照。随着血管抑制素与生物素-血管抑制素复合物之比升高，结合呈线性减少。
在此系统中加入TSP-1肽Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)，与培养板上的TSP-1竞争与生物素化血管抑制素的结合。如图30所示，Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)能够与TSP-1竞争与生物素-血管抑制素复合物的结合。用作阴性对照的乱序肽Val-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys(SEQ ID NO：15)没有作用。实施例24-血管抑制素结合肽的鉴定
用New England Biolabs(Beverly，MA)的噬菌体展示肽文库试剂盒鉴定结合血管抑制素的肽。用涂有靶受体的培养板(珠)培养噬菌体展示肽文库，洗去不结合的噬菌体，洗脱特异性结合的噬菌体。然后扩增洗脱的噬菌体，进一步进行生物筛选和扩增循环，从而成功富集含有最强结合序列的噬菌体。3轮后，用DNA测序和ELISA进行各个克隆的鉴定。
如图31所示，噬菌体展示文库鉴定到一系列受体结合肽，它们是：
Lys-Ser-Trp-Val-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO：16)；
Lys-Leu-Trp-Val-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO：17)；
Lys-Val-Trp-Val-Leu-Pro-Ile(SEQ ID NO：18)；
Lys-Val-Trp-Val-Leu-Ile-Pro(SEQ ID NO：19)；
Lys-Val-Trp-Val-Leu-Pro-Ile(SEQ ID NO：18)和
Lys-Val-Trp-Ile-Val-Ser-Thr(SEQ ID NO：20)。
图31中的每条线都代表被测序的8个克隆之一。这些肽之间的差异很小，只是就电荷和类别(例如疏水性、芳香性或亲水性)而言的保守性氨基酸取代。
因为这些序列不是来自TSP-1的线性序列，它们被认为代表TSP-1折叠蛋白质内的一个活性位点。或者，它们可能代表结合血管抑制素的另一种蛋白质的序列。实施例25：肽对TSP-1与血管抑制素结合的竞争
用前述亲和素-生物素系统来评价多种肽对TSP-1与血管抑制素结合的竞争作用。如图32所示，实施例24中用噬菌体展示所鉴定的肽Lys-Val-Trp-Val-Leu-Pro-Ile(SEQ ID NO：18)抑制结合。此外，Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ IDNO：1)肽能有效抑制结合。更稳定的乙酰化肽Cys(Acm)-Ser-Val-Thr-Cys(Acm)-Gly(SEQ ID NO：6)也能抑制结合。镜像乙酰化肽d-Gly-Cys(Acm)-Thr-Val-Ser-Cys(Acm)(SEQ ID NO：23)能抑制结合，很可能是因为它具有相同的立体构型。以乱序肽Val-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Gly(SEQ ID NO：21)和d取向肽d-Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：22)作为阴性对照。实施例26：血管抑制素对HAEC和HMVEC-L细胞活力的作用
如实施例19所述，将血管抑制素加入人主动脉内皮细胞(HAEC)和肺人微血管内皮细胞(HMVEC-L)。根据ALAMAR BLUETM试验测定，如图33所示，血管抑制素对这两个细胞系的活力都不利。实施例27：血管抑制素及其片段对牛主动脉内皮细胞活力的作用
如实施例19所述，将血管抑制素加入BAEC细胞。同样地加入血管抑制素片段。图34显示，血管抑制素及其氨基末端片段Met1-Lys132(表达为GST融合蛋白，GST偶联在氨基末端一侧)能抑制细胞活力。血管抑制素的中段及其羧基末端对细胞活力没有作用。用GST作为阴性对照。V36-R42即抗分泌因子的活性位点没有作用，说明血管抑制素的作用与抗分泌因子不同。实施例28：血管抑制素对Lewis肺癌细胞侧腹肿瘤生长的作用
向动物侧腹内皮下注射106个Lewis肺癌细胞。侧腹肿瘤评价是一个已被普遍认可的血管生成模型，因为侧腹肿瘤高度依赖于血管生成。O′Reilly，M.S.，“Angiostatin：一种新的血管生成抑制剂，介导对Lewis肺癌细胞转移的抑制作用”，细胞79：315-28(1994)。9天后，当可以看到肿瘤形成时，将小鼠分成2组，一组5只。一组接受50μg血管抑制素以Hepes缓冲液所配溶液的IV注射。对照组用Hepes缓冲液处理。在分组后的第1、3和5天进行处理，在第7天杀死。
图35显示对照和处理组的侧腹肿瘤发展。去除皮肤以露出肿瘤，肿瘤以方框标出。血管抑制素处理小鼠的肿瘤比对照的小得多。而且，血管抑制素处理小鼠的肿瘤软，棉，坏死，受压时破裂。对照小鼠的肿瘤则实，突，硬，健康，而且生长迅猛。
将肿瘤包在石蜡中，切成5μm的切片。切片以苏木精和曙红染色。苏木精将DNA染成蓝色，曙红则把蛋白质染成分红色。图36显示了对照(分图A和C)与血管抑制素处理(分图B和D)细胞之间的差异。分图A和B是光显微镜下放大400倍的照片，分图C和D则是明光微镜下放大200倍的照片。血管抑制素处理组显示明显的坏死和细胞死亡。
图37显示相对肿瘤体积，如下测定：
Figure A0080174500311
7天处理内进行全程测定。对照肿瘤呈对数生长，而受处理肿瘤只以线性速度略有生长。这说明血管抑制素对肿瘤生长和血管生成具有显著作用。
结合实施例20，本实施例证明：血管抑制素直接影响血管生成，但不作用于Lewis肺癌细胞本身。因此，对肿瘤生长和肿瘤活力的作用来自于对血管生成的作用。没有所需的供血来确保气体交换和营养，依赖于血管化的2mm3以上的侧腹肿瘤无法存活。实施例29-患Lewis肺癌小鼠的存活研究
给10只小鼠IV注射106个Lewis肺癌细胞。培养3天后，将小鼠分成两组。一组的5只小鼠接受50μg血管抑制素Hepes缓冲液制剂IV注射处理。对照组的5只接受Hepes缓冲液处理。在第1、3、5、7和9天进行处理。
评价两组的存活。即使只接受中等水平的处理(隔天处理，第9天结束)，血管抑制素组中值存活期(19天)仍比对照组(16天)长，参见图38。
肺肿瘤不是很好的血管生成模型，因为肺是一个高度血管化的部位，因此，肿瘤不必如此显著地依赖于附加的血管化。但是，它显示血管抑制素能有效治疗癌性肺肿瘤，在此过程中延长寿命。
实施例30：血管抑制素在人乳房癌组织中的定位
用免疫过氧化物酶染色法染色入侵袭性乳房肿瘤样品，以及作为对照的良性和正常组织样品。用抗TSP-1和血管抑制素的多克隆抗体标记样品，然后加入抗第一抗体的第二抗体。第二抗体与过氧化物偶联，然后与底物DAB混合，形成棕色。所有原发性乳房导管癌瘤样品(n＝11)呈TSP-1和血管抑制素染色阳性。相反，所有良性肿瘤和正常乳房组织呈TSP-1和血管抑制素染色阴性，但发生增生的两份纤维变性乳房样品例外。
在癌瘤样品中，TSP-1着色位于肿瘤附近致密的基质胶原中，血管抑制素染色则位于肿瘤细胞内。以上结果显示，导管上皮内TSP-1和血管抑制素的表达增强与肿瘤的转移有关。实施例31：血管抑制素在人头及颈部肿瘤组织中的定位
用苏木精、曙红和血管抑制素抗体染色人头及颈部肿瘤样品。用计算机图象显微镜分析被染色的肿瘤，该显微镜发射单波长光(620nm)，测定染色肿瘤区的光密度。还分析了每份样本的附近正常粘膜。各样品特异性染色的目标抗体阈值确定为：分析阴性对照(对照IgG)切片，从血管抑制素染色区的值中扣除该值。如此，可以精确定量受体染色阳性细胞百分比。用此图象分析技术，我们发现，阳性染色值高的患者其微血管密度也高，会在开始治疗后的12个月内因转移而死亡。阳性染色值低的患者其微血管数也少，能至少保持2年不发病。数据见表3。
                             表3：头及颈部肿瘤
    位置   组织学分化 血管抑制素密度    血管生成(血管/mm2)    2年存活
    扁桃体     中等     5     52     存活
    口底     差     5     24     存活
    咽喉     差     9     15     存活
    舌     中等     14     10     存活
    颊     好     73     140     死亡
    舌     差     82     213     死亡
实施例32：内毒素研究
用Sigma(St.Louis，MO)的计时凝胶形成内毒素试剂盒分析血管抑制素样品中内毒素的存在，以确保没有会影响细胞培养的污染性内毒素存在。血管抑制素样品的测得值是0.0076pg内毒素/mg蛋白质。1ng以下认为是对组织培养安全的。所以，显然是血管抑制素本身具有抑制细胞活力的作用。实施例33：活力研究
将带His尾的血管抑制素与带His尾的对照GST蛋白比较，以证明His尾对细胞活力没有任何影响。牛主动脉内皮细胞(BAEC)在含37μg His尾血管抑制素或His尾GST的无血清培养基中培养过夜。血管抑制素和GST都在pTrcHisA表达载体转化的细菌内表达，通过非还原镍亲合性层析纯化。用ALAMARBLUETM试验测定细胞活力。
图39显示，血管抑制素对细胞活力具有剂量依赖性作用，细胞活力随着血管抑制素浓度的升高而降低。GST对细胞活力没有任何作用。该研究显示，在非变性条件下(即比变性条件更接近生理条件)，His尾对细胞活力没有影响。实施例34：抗血管抑制素抗体对血管抑制素介导的BAEC活力抑制的作用
该研究检测抗血管抑制素抗体对血管抑制素介导的BAEC活力抑制的作用。BAEC在含5μg/ml血管抑制素，5μg/ml血管抑制素加100μg/ml对照IgG，或5μg/ml血管抑制素加100μg/ml抗血管抑制素IgG的无血清培养基中培养过夜。如前所述，用ALAMAR BLUETM试验测定细胞活力。
图40显示，抗血管抑制素IgG几乎完全消除血管抑制素对BAEC活力的抑制。对照IgG没有明显作用。该实施例显示，血管抑制素的作用是特异性的，不是由于制剂中的污染。实施例35：血管抑制素对BAEC与基质粘附的作用
该实施例评价了血管抑制素对BAEC与基质粘附的作用。处理组的细胞用血管抑制素(37μg/ml)预处理。对照组的细胞不接受预处理。立即将细胞(50,000)接种到涂有2μg纤连蛋白、TSP-1或BSA的微滴孔中。纤连蛋白是很强的细胞外基质蛋白，它吸引BAEC，以其作为阳性对照，BSA不是粘附蛋白，作为阴性对照。30分钟后，将非粘附细胞吸出，用PBS洗孔，用2.5％戊二醛固定，用Giemsa染色，清点每1mm2上的粘附细胞数。
图41显示该研究的结果。在没有用血管抑制素处理过的细胞内，纤连蛋白组显示很强的粘附，TSP-1组显示强粘附。用血管抑制素处理细胞后，纤连蛋白组细胞的粘附不变(很强的粘附)，TSP-1组细胞的粘附则急遽降低。
这说明，加入血管抑制素显著降低BAEC与涂在板上的TSP-1的粘附，但对作为阳性对照的纤连蛋白板则没有作用。血管抑制素与TSP-特异性地相互作用，即破坏其粘附机制。实施例36：血管抑制素氨基末端和羧基末端的功能
该研究检测血管抑制素的氨基末端(Met1-Lys132)和羧基末端部分(Ile248-Lys380)(分别为SEQ ID NO：24和25)。将非变性重组血管抑制素片段的结合与全长血管抑制素相比。用GST作为阴性对照。用光学结合法评价结合，该方法使用共价偶联了TSP-1的比色杯。用极光束来检测被测蛋白质(片段、血管抑制素或GST)是否与TSP-1衍生的比色杯表面结合。用1μg TSP-1衍生比色杯。用1％BSA封闭比色杯表面，以防非特异性结合。加入以PBS缓冲液配制的被测蛋白质10nM溶液。图42的结果显示，血管抑制素与其氨基末端片段(Met1-Lys132)的结合性非常近似，都是nmol级的。图42显示了与血管抑制素相比的活性百分比。GST和羧基末端片段没有结合活性。实施例37：血管抑制素氨基末端和羧基末端部分的功能
该研究检测血管抑制素的氨基末端(Met1-Lys132)和羧基末端(Ile248-Lys380)(分别为SEQ ID NO：24和25)。将片段的抗内皮活性与全长血管抑制素蛋白的相比。
内皮细胞与37μg/ml血管抑制素、其片段和GST共培养过夜。用ALAMARBLUETM试验测定细胞活力。
结果也显示在图42中，表示为片段与血管抑制素相比的抗内皮活性百分比。结果显示，氨基末端具有与全长血管抑制素相同的抗内皮活性。而且，此结合与氨基末端的抗内皮活性具有良好的关联性。
序列表<110>Tuszynski，George
  Williams，Taffy<120>血管抑制素：一种CYS-SER-VAL-THR-CYS-GLY特异性肿瘤细胞粘附受体<130>07206.0028<140><141><150>60/140，309<151>1999-06-21<150>60/176，626<151>2000-01-19<160>26<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>6<212>PRT<213>智人<400>1Cys Ser Val Thr Cys Gly1               5<210>2<211>380<212>PRT<213>智人<220><223>Xaa代表未知氨基酸<400>2Met Val Leu Glu Ser Thr Met Val Cys Val Asp Asn Ser Glu Tyr Met1               5                  10                  15Arg Asn Gly Asp Phe Leu Pro Thr Arg Leu Gln Ala Gln Gln Asp Ala
         20                  25                  30Val Asn Ile Val Cys His Ser Lys Thr Arg Ser Asn Pro Glu Asn Asn
     35                  40                  45Val Gly Leu Ile Thr Leu Ala Asn Asp Cys Glu Val Leu Thr Thr Leu
 50                  55                  60Thr Pro Asp Thr Gly Arg Ile Leu Ser Lys Leu His Thr Val Gln Pro65                  70                  75                  80Lys Gly Lys Ile Thr Phe Cys Thr Gly Ile Arg Val Ala His Leu Ala
             85                  90                  95Leu Lys His Arg Gln Gly Lys Asn His Lys Met Arg Ile Ile Ala Phe
        100                 105                 110Val Gly Ser Pro Val Glu Asp Asn Glu Lys Asp Leu Val Lys Leu Ala
    115                 120                 125Lys Arg Leu Lys Lys Glu Lys Val Asn Val Asp Ile Ile Asn Phe Gly
130                 135                 140Glu Glu Glu Val Asn Thr Glu Lys Leu Thr Ala Phe Val Asn Thr Leu145                 150                 155                 160Asn Gly Lys Asp Gly Thr Gly Ser His Leu Val Thr Val Pro Pro Gly
            165                 170                 175Pro Ser Leu Ala Asp Ala Leu Ile Ser Ser Pro Ile Leu Ala Gly Glu
        180                 185                 190Gly Gly Ala Met Leu Gly Leu Gly Ala Ser Asp Phe Glu Phe Gly Val
    195                 200                 205Asp Pro Ser Ala Asp Pro Glu Leu Ala Leu Ala Leu Arg Val Ser Met
210                 215                 220Glu Glu Gln Arg Gln Arg Gln Glu Glu Glu Ala Arg Arg Ala Ala Ala225                 230                 235                 240Ala Ser Ala Ala Glu Ala Gly Ile Ala Thr Thr Gly Thr Glu Gly Glu
            245                 250                 255Arg Asp Ser Asp Asp Ala Leu Leu Lys Met Thr Ile Ser Gln Gln Glu
        260                 265                 270Phe Gly Arg Thr Gly Leu Pro Asp Leu Ser Ser Met Thr Glu Glu Glu
    275                 280                 285Gln Ile Ala Tyr Ala Met Gln Met Ser Leu Gln Gly Ala Glu Phe Gly
290                  295                300Gln Ala Glu Ser Ala Asp Ile Asp Ala Ser Ser Ala Met Asp Thr Ser305                 310                 315                 320Glu Pro Ala Lys Glu Glu Asp Asp Tyr Asp Val Xaa Gln Asp Pro Glu
            325                 330                 335Phe Leu Gln Ser Val Leu Glu Asn Leu Pro Gly Val Asp Pro Asn Asn
        340                 345                 350Glu Ala Ile Arg Asn Ala Met Gly Ser Leu Ala Ser Gln Ala Thr Lys
    355                 360                 365Asp Gly Lys Lys Asp Lys Lys Glu Glu Asp Lys Lys
370                 375                 380<210>3<211>377<212>PRT<213>智人<220><223>Xaa代表未知氨基酸<400>3Met Val Leu Glu Ser Thr Met Val Cys Val Asp Asn Ser Glu Tyr Met1               5                  10                  15Arg Asn Gly Asp Phe Leu Pro Thr Arg Leu Gln Ala Gln Gln Asp Ala
         20                  25                  30Val Asn Ile Val Cys His Ser Lys Thr Arg Ser Asn Pro Glu Asn Asn
     35                  40                  45Val Gly Leu Ile Thr Leu Ala Asn Asp Cys Glu Val Leu Thr Thr Leu
 50                  55                  60Thr Pro Asp Thr Gly Arg Ile Leu Ser Lys Leu His Thr Val Gln Pro65                  70                  75                  80Lys Gly Lys Ile Thr Phe Cys Thr Gly Ile Arg Val Ala His Leu Ala
             85                  90                  95Leu Lys His Arg Gln Gly Lys Asn His Lys Met Arg Ile Ile Ala Phe
        100                 105                 110Val Gly Ser Pro Val Glu Asp Asn Glu Lys Asp Leu Val Lys Leu Ala
    115                 120                 125Lys Arg Leu Lys Lys Glu Lys Val Asn Val Asp Ile Ile Asn Phe Gly
130                 135                 140Glu Glu Glu Val Asn Thr Glu Lys Leu Thr Ala Phe Val Asn Thr Leu145                 150                 155                 160Asn Gly Lys Asp Gly Thr Gly Ser His Leu Val Thr Val Pro Pro Gly
            165                 170                 175Pro Ser Leu Ala Asp Ala Leu Ile Ser Ser Pro Ile Leu Ala Gly Glu
        180                 185                 190Gly Gly Ala Met Leu Gly Leu Gly Ala Ser Asp Phe Glu Phe Gly Val
    195                 200                 205Asp Pro Ser Ala Asp Pro Glu Leu Ala Leu Ala Leu Arg Val Ser Met
210                 215                 220Glu Glu Gln Arg Gln Arg Gln Glu Glu Glu Ala Arg Arg Ala Ala Ala225                 230                 235                 240Ala Ser Ala Ala Glu Ala Gly Ile Ala Thr Thr Gly Thr Glu Asp Ser
            245                 250                 255Asp Asp Ala Leu Leu Lys Met Thr Ile Ser Gln Gln Glu Phe Gly Arg
        260                 265                 270Thr Gly Leu Pro Asp Leu Ser Ser Met Thr Glu Glu Glu Gln Ile Ala
    275                 280                 285Tyr Ala Met Gln Met Ser Leu Gln Gly Ala Glu Phe Gly Gln Ala Glu
290                 295                 300Ser Ala Asp Ile Asp Ala Ser Ser Ala Met Asp Thr Ser Glu Pro Ala305                 310                 315                 320Lys Glu Glu Asp Asp Tyr Asp Val Xaa Gln Asp Pro Glu Phe Leu Gln
            325                 330                 335Ser Val Leu Glu Asn Leu Pro Gly Val Asp Pro Asn Asn Glu Ala Ile
        340                 345                 350Arg Asn Ala Met Gly Ser Leu Ala Ser Gln Ala Thr Lys Asp Gly Lys
    355                 360                 365Lys Asp Lys Lys Glu Glu Asp Lys Lys
370                 375<210>4<211>1259<212>DNA<213>智人<220><221>CDS<222>(1)..(1140)<223>n/Xaa代表未知碱基/氨基酸<400>4atg gtg ttg gaa agc act atg gtg tgt gtg gac aac agt gag tat atg   48Met Val Leu Glu Ser Thr Met Val Cys Val Asp Asn Ser Glu Tyr Met1               5                  10                  15cgg aat gga gac ttc tta ccc acc agg ctg cag gcc cag cag gat gct   96Arg Asn Gly Asp Phe Leu Pro Thr Arg Leu Gln Ala Gln Gln Asp Ala
         20                  25                  30gtc aac ata gtt tgt cat tca aag acc cgc agc aac cct gag aac aac   144Val Asn Ile Val Cys His Ser Lys Thr Arg Ser Asn Pro Glu Asn Asn
     35                  40                  45gtg ggc ctt atc aca ctg gct aat gac tgt gaa gtg ctg acc aca ctc   192Val Gly Leu Ile Thr Leu Ala Asn Asp Cys Glu Val Leu Thr Thr Leu
 50                  55                  60acc cca gac act ggc cgt atc ctg tcc aag cta cat act gtc caa ccc   240Thr Pro Asp Thr Gly Arg Ile Leu Ser Lys Leu His Thr Val Gln Pro65                  70                  75                  80aag ggc aag atc acc ttc tgc acg ggc atc cgc gtg gcc cat ctg gct   288Lys Gly Lys Ile Thr Phe Cys Thr Gly Ile Arg Val Ala His Leu Ala
             85                  90                  95ctg aag cac cga caa ggc aag aat cac aag atg cgc atc att gcc ttt   336Leu Lys His Arg Gln Gly Lys Asn His Lys Met Arg Ile Ile Ala Phe
        100                 105                 110gtg gga agc cca gtg gag gac aat gag aag gat ctg gtg aaa ctg gct   384Val Gly Ser Pro Val Glu Asp Asn Glu Lys Asp Leu Val Lys Leu Ala
    115                 120                 125aaa cgc ctc aag aag gag aaa gta aat gtt gac att atc aat ttt ggg   432Lys Arg Leu Lys Lys Glu Lys Val Asn Val Asp Ile Ile Asn Phe Gly
130                 135                 140gaa gag gag gtg aac aca gaa aag ctg aca gcc ttt gta aac acg ttg   480Glu Glu Glu Val Asn Thr Glu Lys Leu Thr Ala Phe Val Asn Thr Leu145                 150                 155                 160aat ggc aaa gat gga acc ggt tct cat ctg gtg aca gtg cct cct ggg   528Asn Gly Lys Asp Gly Thr Gly Ser His Leu Val Thr Val Pro Pro Gly
            165                 170                 175ccc agt ttg gct gat gct ctc atc agt tct ccg att ttg gct ggt gaa   576Pro Ser Leu Ala Asp Ala Leu Ile Ser Ser Pro Ile Leu Ala Gly Glu
        180                 185                 190ggt ggt gcc atg ctg ggt crt ggt gcc agt gac ttt gaa ttt gga gta   624Gly Gly Ala Met Leu Gly Leu Gly Ala Ser Asp Phe Glu Phe Gly Val
    195                 200                 205gat ccc agt gct gat cct gag ctg gcc ttg gcc ctt cgt gta tct atg   672Asp Pro Ser Ala Asp Pro Glu Leu Ala Leu Ala Leu Arg Val Ser Met
210                 215                 220gaa gag cag cgg cag cgg cag gag gag gag gcc cgg cgg gca gct gca   720Glu Glu Gln Arg Gln Arg Gln Glu Glu Glu Ala Arg Arg Ala Ala Ala225                 230                 235                 240gct tct gct gct gag gcc ggg att gct acg act ggg act gaa ggt gaa   768Ala Ser Ala Ala Glu Ala Gly Ile Ala Thr Thr Gly Thr Glu Gly Glu
            245                 250                 255aga gac tca gac gat gcc ctg ctg aag atg acc atc agc cag caa gag   816Arg Asp Ser Asp Asp Ala Leu Leu Lys Met Thr Ile Ser Gln Gln Glu
        260                 265                 270ttt ggc cgc act ggg ctt cct gac cta agc agt atg act gag gaa gag   864Phe Gly Arg Thr Gly Leu Pro Asp Leu Ser Ser Met Thr Glu Glu Glu
    275                 280                 285cag att gct tat gcc atg cag atg tcc ctg cag gga gca gag ttt ggc   912Gln Ile Ala Tyr Ala Met Gln Met Ser Leu Gln Gly Ala Glu Phe Gly
290                 295                 300cag gcg gaa tca gca gac att gat gcc agc tca gct atg gac aca tcc   960Gln Ala Glu Ser Ala Asp Ile Asp Ala Ser Ser Ala Met Asp Thr Ser305                 310                 315                 320gag cca gcc aag gag gag gat gat tac gac gtg atn cag gac ccc gag   1008Glu Pro Ala Lys Glu Glu Asp Asp Tyr Asp Val Xaa Gln Asp Pro Glu
            325                 330                 335ttc ctt cag agt gtc cta gag aac ctc cca ggt gtg gat ccc aac aat   1056Phe Leu Gln Ser Val Leu Glu Asn Leu Pro Gly Val Asp Pro Asn Asn
        340                 345                 350gaa gcc att cga aat gct atg ggc tcc ctg gcc tcc cag gcc acc aag   1104Glu Ala Ile Arg Asn Ala Met Gly Ser Leu Ala Ser Gln Ala Thr Lys
    355                 360                 365gac ggc aag aag gac aag aag gag gaa gac aag aag tgagactgga        1150Asp Gly Lys Lys Asp Lys Lys Glu Glu Asp Lys Lys
370                 375                 380gggaaagggt agctgagtct gcttagggga ctgcatggga agcacggaat atagggttag 1210atgtgtgtta tctgtaacca ttacagccta aataaagctt ggcaacttt             1259<210>5<211>1250<212>DNA<213>智人<220><221>CDS<222>(1)..(1131)<223>n/Xaa代表未知的碱基/氨基酸<400>5atg gtg ttg gaa agc act atg gtg tgt gtg gac aac agt gag tat atg   48Met Val Leu Glu Ser Thr Met Val Cys Val Asp Asn Ser Glu Tyr Met1               5                  10                  15cgg aat gga gac ttc tta ccc acc agg ctg cag gcc cag cag gat gct   96Arg Asn Gly Asp Phe Leu Pro Thr Arg Leu Gln Ala Gln Gln Asp Ala
         20                  25                  30gtc aac ata gtt tgt cat tca aag acc cgc agc aac cct gag aac aac   144Val Asn Ile Val Cys His Ser Lys Thr Arg Ser Asn Pro Glu Asn Asn
     35                  40                  45gtg ggc ctt atc aca ctg gct aat gac tgt gaa gtg ctg acc aca ctc   192Val Gly Leu Ile Thr Leu Ala Asn Asp Cys Glu Val Leu Thr Thr Leu
 50                  55                  60acc cca gac act ggc cgt atc ctg tcc aag cta cat act gtc caa ccc   240Thr Pro Asp Thr Gly Arg Ile Leu Ser Lys Leu His Thr Val Gln Pro65                  70                  75                  80aag ggc aag atc acc ttc tgc acg ggc atc cgc gtg gcc cat ctg gct   288Lys Gly Lys Ile Thr Phe Cys Thr Gly Ile Arg Val Ala His Leu Ala
             85                  90                  95ctg aag cac cga caa ggc aag aat cac aag atg cgc atc att gcc ttt   336Leu Lys His Arg Gln Gly Lys Asn His Lys Met Arg Ile Ile Ala Phe
        100                 105                 110gtg gga agc cca gtg gag gac aat gag aag gat ctg gtg aaa ctg gct   384Val Gly Ser Pro Val Glu Asp Asn Glu Lys Asp Leu Val Lys Leu Ala
    115                 120                 125aaa cgc ctc aag aag gag aaa gta aat gtt gac att atc aat ttt ggg   432Lys Arg Leu Lys Lys Glu Lys Val Asn Val Asp Ile Ile Asn Phe Gly
130                 135                 140gaa gag gag gtg aac aca gaa aag ctg aca gcc ttt gta aac acg ttg   480Glu Glu Glu Val Asn Thr Glu Lys Leu Thr Ala Phe Val Asn Thr Leu145                 150                 155                 160aat ggc aaa gat gga acc ggt tct cat ctg gtg aca gtg cct cct ggg   528Asn Gly Lys Asp Gly Thr Gly Ser His Leu Val Thr Val Pro Pro Gly
            165                 170                 175ccc agt ttg gct gat gct ctc atc agt tct ccg att ttg gct ggt gaa   576Pro Ser Leu Ala Asp Ala Leu Ile Ser Ser Pro Ile Leu Ala Gly Glu
        180                 185                 190ggt ggt gcc atg ctg ggt ctt ggt gcc agt gac ttt gaa ttt gga gta   624Gly Gly Ala Met Leu Gly Leu Gly Ala Ser Asp Phe Glu Phe Gly Val
    195                 200                 205gat ccc agt gct gat cct gag ctg gcc ttg gcc ctt cgt gta tct atg   672Asp Pro Ser Ala Asp Pro Glu Leu Ala Leu Ala Leu Arg Val Ser Met
210                 215                 220gaa gag cag cgg cag cgg cag gag gag gag gcc cgg cgg gca gct gca   720Glu Glu Gln Arg Gln Arg Gln Glu Glu Glu Ala Arg Arg Ala Ala Ala225                 230                 235                 240gct tct gct gct gag gcc ggg att gct acg act ggg act gaa gac tca   768Ala Ser Ala Ala Glu Ala Gly Ile Ala Thr Thr Gly Thr Glu Asp Ser
            245                 250                 255gac gat gcc ctg ctg aag atg acc atc agc cag caa gag ttt ggc cgc   816Asp Asp Ala Leu Leu Lys Met Thr Ile Ser Gln Gln Glu Phe Gly Arg
        260                 265                 270act ggg ctt cct gac cta agc agt atg act gag gaa gag cag att gct   864Thr Gly Leu Pro Asp Leu Ser Ser Met Thr Glu Glu Glu Gln Ile Ala
    275                 280                 285tat gcc atg cag atg tcc ctg cag gga gca gag ttt ggc cag gcg gaa   912Tyr Ala Met Gln Met Ser Leu Gln Gly Ala Glu Phe Gly Gln Ala Glu
290                 295                 300tca gca gac att gat gcc agc tca gct atg gac aca tcc gag cca gcc   960Ser Ala Asp Ile Asp Ala Ser Ser Ala Met Asp Thr Ser Glu Pro Ala305                 310                 315                 320aag gag gag gat gat tac gac gtg atn cag gac ccc gag ttc ctt cag   1008Lys Glu Glu Asp Asp Tyr Asp Val Xaa Gln Asp Pro Glu Phe Leu Gln
            325                 330                 335agt gtc cta gag aac ctc cca ggt gtg gat ccc aac aat gaa gcc att   1056Ser Val Leu Glu Asn Leu Pro Gly Val Asp Pro Asn Asn Glu Ala Ile
        340                 345                 350cga aat gct atg ggc tcc ctg gcc tcc cag gcc acc aag gac ggc aag   1104Arg Asn Ala Met Gly Ser Leu Ala Ser Gln Ala Thr Lys Asp Gly Lys
    355                 360                 365aag gac aag aag gag gaa gac aag aag tgagactgga gggaaagggt         1151Lys Asp Lys Lys Glu Glu Asp Lys Lys
370                 375agctgagtct gcttagggga ctgcatggga agcacggaat atagggttag atgtgtgtta 1211tctgtaacca ttacagccta aataaagctt ggcaacttt                        1250<210>6<211>6<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的说明：合成肽<220><221>MOD_RES<222>(1)<223>Cys(Acm)<220><221>MOD_RES<222>(5)<223>Cys(Acm)<400>6Cys Ser Val Thr Cys Gly1               5<210>7<211>6<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的说明：合成肽<220><221>MOD_RES<222>(2)<223>Cys(Acm)<220><221>MOD_RES<222>(6)<223>Cys(Acm)<400>7Val Cys Thr Gly Ser Cys1               5<210>8<211>7<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的说明：合成肽<400>8Val Cys His Ser Lys Thr Arg1               5<210>9<211>7<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的说明：合成肽<220><221>MOD_RES<222>(2)<223>Cys(Acm)<400>9Val Cys His Ser Lys Thr Arg1               5<210>10<211>5<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的说明：合成肽<400>10Pro His Ser Arg Asn1               5<210>11<211>6<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的说明：合成肽<400>11Ala Ser Val Thr Ala Arg1               5<210>12<211>27<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的说明：引物<400>12gggagatcta tggtgttgga aagcact                                    27<210>13<211>27<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的说明：引物<400>13ggggaattct cacttcttgt cttcctc                                     27<210>14<211>7<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的说明：合成肽<400>14Lys Val Trp Val Leu Pro Ile1               5<210>15<211>6<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的说明：合成肽<400>15Val Cys Thr Gly Ser Cys1               5<210>16<211>7<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的说明：合成肽<400>16Lys Ser Trp Val Ile Pro Gln1               5<210>17<211>7<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的说明：合成肽<400>17Lys Leu Trp Val Ile Pro Gln1               5<210>18<211>7<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的说明：合成肽<400>18Lys Val Trp Val Leu Pro Ile1               5<210>19<211>7<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的说明：合成肽<400>19Lys Val Trp Val Leu Ile Pro1               5<210>20<211>7<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的说明：合成肽<400>20Lys Val Trp Ile Val Ser Thr1               5<210>21<211>7<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的说明：合成肽<400>2lVal Cys Thr Gly Ser Cys Gly1               5<210>22<211>6<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的说明：合成肽<400>22Cys Ser Val Thr Cys Gly1               5<210>22<211>6<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的说明：合成肽<220><221>MOD_RES<222>(2)<223>Cys(ACm)<220><221>MOD_RES<222>(6)<223>Cys(Acm)<400>23Gly Cys Thr Val Ser Cys1               5<210>24<211>132<212>PRT<213>智人<400>24Met Val Leu Glu Ser Thr Met Val Cys Val Asp Asn Ser Glu Tyr Met1               5                  10                  15Arg Asn Gly Asp Phe Leu Pro Thr Arg Leu Gln Ala Gln Gln Asp Ala
         20                  25                  30Val Asn Ile Val Cys His Ser Lys Thr Arg Ser Asn Pro Glu Asn Asn
     35                  40                  45Val Gly Leu Ile Thr Leu Ala Asn Asp Cys Glu Val Leu Thr Thr Leu
 50                  55                  60Thr Pro Asp Thr Gly Arg Ile Leu Ser Lys Leu His Thr Val Gln Pro65                  70                  75                  80Lys Gly Lys Ile Thr Phe Cys Thr Gly Ile Arg Val Ala His Leu Ala
             85                  90                  95Leu Lys His Arg Gln Gly Lys Asn His Lys Met Arg Ile Ile Ala Phe
        100                 105                 110Val Gly Ser Pro Val Glu Asp Asn Glu Lys Asp Leu Val Lys Leu Ala
    115                 120                 125Lys Arg Leu Lys
130<210>25<211>133<212>PRT<213>智人<220><223>Xaa代表未知氨基酸<400>25Ile Ala Thr Thr Gly Thr Glu Gly Glu Arg Asp Ser Asp Asp Ala Leu1               5                  10                  15Leu Lys Met Thr Ile Ser Gln Gln Glu Phe Gly Arg Thr Gly Leu Pro
         20                  25                  30Asp Leu Ser Ser Met Thr Glu Glu Glu Gln Ile Ala Tyr Ala Met Gln
     35                  40                  45Met Ser Leu Gln Gly Ala Glu Phe Gly Gln Ala Glu Ser Ala Asp Ile
 50                  55                  60Asp Ala Ser Ser Ala Met Asp Thr Ser Glu Pro Ala Lys Glu Glu Asp65                  70                  75                  80Asp Tyr Asp Val Xaa Gln Asp Pro Glu Phe Leu Gln Ser Val Leu Glu
             85                  90                  95Asn Leu Pro Gly Val Asp Pro Asn Asn Glu Ala Ile Arg Asn Ala Met
        100                 105                 110Gly Ser Leu Ala Ser Gln Ala Thr Lys Asp Gly Lys Lys Asp Lys Lys
    115                 120                 125Glu Glu Asp Lys Lys
130<210>26<211>7<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的说明：合成肽<220><221>MOD_RES<222>(2)<223>Cys(Acm)<220><221>MOD_RES<222>(6)<223>Cys(Acm)<400>26Val Cys Thr Gly Ser Cys Gly1               5

Claims (26)

1.一种纯化的受体蛋白，对血小板反应蛋白(TSP-1)的Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly(SEQ ID NO：1)区具有特异性结合亲和力。
2.根据权利要求1所述的受体，含有的序列选自SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3，及它们的片段和突变体。
3.根据权利要求2所述的受体，其中的片段含有SEQ ID NO：24或其片段或突变体。
4.一种使用模拟血小板反应蛋白活性的抗体的治疗方法，包括：分离权利要求1或2所述的受体，产生此受体的抗体，用此抗体治疗患者。
5.一种使用抑制血小板反应蛋白活性的抗体的治疗方法，包括：分离权利要求1所述的受体，产生此受体的抗体，用此抗体治疗患者。
6.一种使用抑制血小板反应蛋白活性的配体的治疗方法，包括：分离权利要求1所述的受体，产生此受体的配体，用此配体治疗患者。
7.一种检测恶性肿瘤的方法，包括检测权利要求1所述受体的存在，判断是否存在恶性肿瘤。
8.一种用模仿血小板反应蛋白活性的配体的治疗方法，包括分离权利要求1所述的受体，产生此受体的配体，用此配体治疗患者。
9.一种用权利要求1所述受体的治疗方法，包括将此受体给予患者，让该受体竞争性抑制血小板反应蛋白的活性。
10.根据权利要求8所述的方法，该方法抑制或逆转血管生成。
11.根据权利要求8所述的方法，该方法抑制、预防或逆转肿瘤生长。
12.根据权利要求8所述的方法，该方法延长患者的生命。
13.一种用权利要求1所述受体的片段的治疗方法，包括将该受体的片段给予患者，让该片段竞争性抑制血小板反应蛋白的活性。
14.一种诊断肿瘤患者或确定其预后的方法，包括测定权利要求1所述受体的水平，相对转移性和非转移性肿瘤的已知水平进行评估。
15，一种治疗癌症的组合物，含有与靶向部分连接的化疗药物，靶向部分选自针对权利要求1所述受体的抗体或针对权利要求1所述受体的配体。
16.一种治疗癌症的组合物，含有与靶向部分连接的放射性部分，靶向部分选自针对权利要求1所述受体的抗体或针对权利要求1所述受体的配体。
17.一种治疗癌症的方法，包括给予治疗有效量的权利要求16所述组合物，可以用药学上认可的载体，让靶向部分导向癌症，让放射性部分治疗癌症。
18.一种用于放射性检测癌症，诊断癌症和定量评价对癌症治疗方法的疗效应答的组合物，含有与靶向部分连接的放射性部分，靶向部分选自针对 1所述受体的抗体或针对权利要求1所述受体的配体。
19.一种用于放射性检测癌症，诊断癌症和定量评价对癌症治疗方法的疗效应答的方法，包括：给予治疗有效量的权利要求18所述组合物，可以用药学上认可的载体，让靶向部分导向癌症，让放射性部分标记癌症，然后检测癌症、诊断癌症或定量评价对癌症治疗方法的疗效应答。
20.一种用于MRI检测癌症，诊断癌症和定量评价对癌症治疗方法的疗效应答的组合物，含有与靶向部分连接的MRI增强剂，靶向部分选自针对 1所述受体的抗体或针对权利要求1所述受体的配体。
21.根据权利要求18所述的组合物，其中MRI增强剂选自钆、锰和铁。
22.一种用于MRI检测癌症，诊断癌症和定量评价对癌症治疗方法的疗效应答的方法，包括给予治疗有效量的权利要求20所述组合物，可以用药学上认可的载体，让靶向部分导向癌症，用MRI检测癌症、诊断癌症或定量评价对癌症治疗方法的疗效应答，让MRI增强剂增强MRI。
23.一种生物医学设备，包括获取细胞的工具，该细胞获取工具与靶向部分连接，该靶向部分选自针对权利要求1所述受体的抗体或针对权利要求1所述受体的配体。
24.一种设计模拟或抑制血小板反应蛋白活性的药物的方法，包括开发一种候选药物，评价其与权利要求1所述受体的结合能力。
25.一种降低内皮细胞活力的方法，包括给予药学上可接受量的权利要求1所述纯化受体蛋白，让它与内皮细胞相互作用从而降低内皮细胞活力。
26.一种降低细胞粘附活性的方法，包括给予药学上可接受量的权利要求1所述纯化受体蛋白，让它与内皮细胞相互作用从而降低细胞粘附活性。
CN00801745A 1999-06-21 2000-06-21 血管抑制素∶一种Cys－Ser－Val－Thr－Cys－Gly特异性肿瘤细胞粘附受体 Pending CN1335887A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14030999P 1999-06-21 1999-06-21
US60/140,309 1999-06-21
US17662600P 2000-01-19 2000-01-19
US60/176,626 2000-01-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1335887A true CN1335887A (zh) 2002-02-13

Family

ID=26838062

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN00801745A Pending CN1335887A (zh) 1999-06-21 2000-06-21 血管抑制素∶一种Cys－Ser－Val－Thr－Cys－Gly特异性肿瘤细胞粘附受体

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20030180295A1 (zh)
EP (1) EP1109900A1 (zh)
JP (1) JP2004513066A (zh)
KR (1) KR20010072825A (zh)
CN (1) CN1335887A (zh)
AU (1) AU5627000A (zh)
CA (1) CA2340721A1 (zh)
EA (1) EA200100264A1 (zh)
MX (1) MXPA01001885A (zh)
WO (1) WO2001005968A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106885908A (zh) * 2015-12-23 2017-06-23 中国人民解放军第二军医大学 血清psmd4蛋白的检测试剂盒及其检测方法与应用

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5498100A (en) * 1999-06-21 2001-01-09 Paul Actor Compositions for treating chemotherapy-resistant tumor cells and targeted chemotherapy compositions
US6380161B1 (en) 1999-06-21 2002-04-30 Inkine Pharmaceutical Company, Inc. Compositions for treating chemotherapy-resistant tumor cells and targeted chemotherapy compositions
US7655411B2 (en) 2002-08-23 2010-02-02 W2 Holdings, Inc. Thrombospondin fragments and binding agents in the detection, diagnosis and evaluation of cancer
PT1554305E (pt) * 2002-10-23 2007-05-31 Ct For Res And Technology Hell Sequências peptídicas que se ligam à proteína de priões
GB0322645D0 (en) * 2003-09-26 2003-10-29 Melacure Therapeutics Ab Use of antisecretory factor peptides
WO2005094422A2 (en) * 2004-02-20 2005-10-13 Kevin Jon Williams Angiocidin fragments and uses thereof in clinical assays for cancer and other diseases
JP5284948B2 (ja) * 2006-04-27 2013-09-11 ラントメネン・アーエス−ファクトール・アーベー 眼内高血圧を治療するための新たなアプローチ
CA2683137A1 (en) * 2006-10-10 2008-04-17 Squicor Compositions and methods for treating and diagnosing cancers
WO2010065342A1 (en) * 2008-11-25 2010-06-10 Temple University Angiocidin inhibition of tumor cell growth
CN105102479B (zh) 2012-12-12 2019-06-28 瓦斯库劳克斯有限公司 治疗性cd47抗体
US9221908B2 (en) 2012-12-12 2015-12-29 Vasculox, Inc. Therapeutic CD47 antibodies
SG2013090626A (en) * 2013-12-06 2015-07-30 Mastercard Asia Pacific Pte Ltd System and method for conducting a transaction using a fuel dispensing nozzle
US20170174734A1 (en) * 2014-03-12 2017-06-22 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education DR6 Receptor Mediates the Leukemia Differentiation Activity of Angiocidin: A Potent Anti-Tumor Peptide
EP3349787A4 (en) 2015-09-18 2019-03-27 Arch Oncology, Inc. THERAPEUTIC CD47 ANTIBODIES
WO2018075960A1 (en) 2016-10-21 2018-04-26 Tioma Therapeutics, Inc. Therapeutic cd47 antibodies

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4565789A (en) * 1983-04-04 1986-01-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Cell matrix receptor system and use in cancer diagnosis and management
US5190920A (en) * 1990-09-24 1993-03-02 W. R. Grace & Co.-Conn. Method for using synthetic analogs of thrombospondin for inhibiting metastasis activity
US5367059A (en) * 1992-05-14 1994-11-22 W. R. Grace & Co.-Conn. Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly specific tumor cell adhesion receptor
GB9509957D0 (en) * 1995-05-17 1995-07-12 Khalil Nasreen Post-translational activation of tgf-›1 involving the tsp-1 receptor cd36
SE508609C2 (sv) * 1995-08-24 1998-10-19 Rural Patent Svenska Ab Antisekretorisk faktor - dess aminosyrasekvens, nubleinsyrasekvens och användning
JP2000506375A (ja) * 1996-01-26 2000-05-30 エイチエスシー リサーチ アンド デベロップメント リミテッド パートナーシップ アルツハイマー病に関連する核酸およびタンパク質、ならびにその使用
KR19990087802A (ko) * 1996-03-15 1999-12-27 길리스 스티브 전립선암의 면역치료 및 면역진단을 위한 화합물 및 방법

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106885908A (zh) * 2015-12-23 2017-06-23 中国人民解放军第二军医大学 血清psmd4蛋白的检测试剂盒及其检测方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP1109900A1 (en) 2001-06-27
KR20010072825A (ko) 2001-07-31
EA200100264A1 (ru) 2001-10-22
AU5627000A (en) 2001-02-05
WO2001005968A9 (en) 2001-05-03
MXPA01001885A (es) 2002-04-24
WO2001005968A1 (en) 2001-01-25
US20030180295A1 (en) 2003-09-25
CA2340721A1 (en) 2001-01-25
JP2004513066A (ja) 2004-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1335887A (zh) 血管抑制素∶一种Cys－Ser－Val－Thr－Cys－Gly特异性肿瘤细胞粘附受体
CN1173991C (zh) 作为血管内皮生长因子受体的f1k-1
CN1214044C (zh) ErbB3抗体
CN1267452C (zh) 单克隆抗体、抗原和恶性疾病的诊断和治疗
CN1589279A (zh) 有效治疗肿瘤和其它需要除去或破坏细胞的疾病的肽
CN1244921A (zh) 癌症的治疗和诊断
CN1183117A (zh) 用于预防或治疗恶性肿瘤的HER－2/neu蛋白胞内区
CN1186518A (zh) 人血管内皮生长因子2
CN1606453A (zh) Cripto阻断抗体及其用途
JPH06506697A (ja) ヒトｐｆ４ａ受容体とその使用
CN1165539A (zh) 肽及蛋白质的修饰
CN1649895A (zh) 有效治疗肿瘤和其它需要除去或破坏细胞的疾病的肽
CN1214050A (zh) 人肿瘤坏死因子δ和ε
CN1602207A (zh) 抑制眼病理过程的方法
CN1150804A (zh) 成纤维细胞生长因子-10
CN1582301A (zh) 有效治疗肿瘤和其它需要除去或破坏细胞的疾病的肽
JPH08503463A (ja) Ｃ−ｃｃｋｒ−１，ｃ−ｃケモカインレセプター
CN1357046A (zh) 几丁质酶几丁质－结合片段
CN1284134A (zh) 利用毕赤氏酵母表达系统生产抗生血管蛋白质∶制管张素,内抑制素或静息蛋白的方法
CN1262689A (zh) 分离树突状细胞膜蛋白基因
CN1221428A (zh) Pigr生物大分子特征性高级结构和相关配体的细胞内化作用
CN1061623A (zh) 睫状神经营养性因子受体
CN1044125A (zh) 猴转化生长因子β1的克隆和表达
CN1245533A (zh) 哺乳动物趋化因子
CN1492926A (zh) 神经丝蛋白的优选区段及其使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication