PT1554305E - Sequências peptídicas que se ligam à proteína de priões - Google Patents
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Description
1
DESCRIÇÃO
SEQUÊNCIAS PEPTÍDICAS QUE SE LIGAM À PROTEÍNA DE PRIÕES A presente invenção refere-se a compostos proteicos que se ligam à proteina do prião e à utilização profiláctica e terapêutica destes compostos para inibir a conversão da proteina normal do prião (PrPc) na isoforma associada aos distúrbios, resistente à protease, PrPsc.
Os distúrbios por priões são uma familia de distúrbios neurodegenerativos fatais que pertencem ao grupo das encefalopatias espongiformes subagudas transmissíveis (TSE). Presentemente, a doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), o kuru, o síndroma da insónia familiar fatal e a doença de Gertmann-Straussler-Scheinker são as formas que afectam os humanos. Entre estas, a CJD é a mais dominante, afectando cerca de uma pessoa por milhão da população por ano, em todo o mundo (Johnson and Gibbs, (1998) N. Engl. J. Med. 339:1994-2004). Os distúrbios por priões em animais incluem a encefalopatia espongiforme bovina (BSE) nas vacas, "scrapie" em ovelhas e cabras, e o distúrbio definhante crónico de mulas, veados e alces. A BSE, que foi primeiro identificada em 1986 no Reino Unido, tornou-se a maior epidemia na Europa nos anos 90. Em Abril de 2001, 181 500 bovinos infectados com a BSE tinham sido identificados na Europa, predominantemente na Grã-Bretanha (World Health Organization, 2001, Official Journal of the European Communities, Special Report No. 14/2001 C324/1 from the Court of Auditors, 2001). Fora da Europa foi reportado gado infectado com a BSE no Canada, nas Ilhas Falkland, Oman e, mais recentemente, no Japão. Pensou-se que um novo distúrbio por priões, variante CJD, tinha emergido como uma infecção inter-espécies a partir do consumo de gado 2 infectado com a BSE por humanos. Mais de cem casos da variante de CJD em humanos tinham sido diagnosticados desde Junho de 2001 (World Health Oraganization, 2001, vide supra). Actualmente não há tratamento ou profilaxia eficazes para distúrbios por priões.
Uma caracteristica comum a todas as doenças TSE é a acumulação de uma isoforma aberrante da proteina normal do prião (designada por PrP ou PrPc) . A proteina do prião celular (PrPc) é uma sialoglicoproteina codificada por um gene que nos humanos está localizado no cromossoma 20 (Oesch, B. et al., Cell 40:735-746 (1985); Basler, K. et al., 46:417-428 (1986); Liao, Y. J. et al., Science 233:364-367 (1986); Meyer, R. K. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:2310-2314 (1986); Sparkes, R. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:7358-7362 (1986); Bendheim, P. E. et al., J. Infect. Dis. 158:1198-1208 (1988); Turk, E. et al., Eur. J. Biochem. 176:21-30 (1988). O gene PrP é expresso em tecidos neurais e não neurais, sendo a maior concentração de mRNA em neurões (Chesebro, B. et al., Nature 315:331-333 (1985); Kretzschmar, Η. A. et al., Am. J. Pathol. 122:1-5 (1986), Brown, H. R. et al., Acta
Neuropathol. 80:1-6 (1990); Cashman, N. R. et al., Cell 61:185-192 (1990); Bendheim, P. E., Neurology 42:149-156 (1992) ) . O produto da translação do gene PrP consiste em 253 aminoácidos em humanos (Kretzschmar, Η. A. et al., DNA 5:315-324 (1986); Pucket, C. et al., Am. J. Hum. 49:320-329 (1991)), 254 no hamster e ratos ou 256 aminoácidos no borrego e sofrendo várias modificações pós-translacional. Nos hamsters, um peptideo sinal de 22 aminoácidos é clivado no términus N, 23 aminoácidos são removidos do términus C por adição de uma âncora de glicosil-fosfatidilinositol 3 (GPI), e oligos-sacarídeos ligados à asparagina são ligados aos resíduos 181 e 197 num anel formado por uma ligação de dissulfureto (Turk, E. et al., Eur. J. Biochem. 176:21-30 (1988); Hope, J. et al., EMBO J. 5:2591-2597 (1986); Stahl, N. et al., Cell 51:229-240 (1987); Stahl, N. et al., Biochemistry 29: 5405-5412 (1990); Safar, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:6377 (1990).
Nas encefalopatias relacionadas com priões, o PrPc é convertido numa forma alterada designada PrPsc, que se distingue do PrPc pelo facto de o PrPsc (i) se agregar; (ii) ser resistente à proteinase K, pelo facto de apenas os 67 D-aminoácidoso términus N serem removidos por digestão da proteinase K em condições nas quais o PrPc é completamente degradado; e (iii) tem uma alteração na conformação da proteína desde α-helicoidal para PrPc até uma forma alterada (Oesch B. et al., Cell 40:735-746 (1985); Bolton, D. C. et ai., Science 218:1309-1311 (1982); McKinley, Μ. P. et al., Cell 35:57-62 (1982); Bolton, D. C. et al., Biochemistry 23:5898-5905 (1984); Prusiner, S. B. et al., Cell 38:127-134 (1984); Bolton, D. C. et al., Arch. Biochem. Biophys. 258:1515-22 (1987)). Várias linhas de evidência sugerem que o PrPsc possa ser um componente chave do agente transmissível responsável pelas encefalopatias relacionadas com priões (Prusiner, S. B. Science 252:1515-22 (1991)) e foi estabelecido que o seu núcleo resistente à protease é a principal proteína estrutural de fibrilos de tipo asilóide que se acumulam intracerebral-mente em algumas destas condições (Brendheim, P. E. et al., Nature 310:418-421 (1984); DeArmond, S. J. et al., Cell 41:221-235 (1985); Kitamoto, T. et al., Ann. Neurol. 20:204-208 (1986); Robert, G. W. et al., N. Engl. Med. 315;1231-1233 (1986); Ghetti, B. et al., Neurology 4 39:1453-1461 (1989); Tagliavini, F. et al., EMBO J. 10:513-519 (1991); Kitamoto, T. et al., Neurology 41:306-310 (1991) ) .
Resumindo, a configuração anormal da proteína do prião (PrPsc) é considerada infecciosa e resistente à proteólise (Prusiner, S. B. (1991) Science 252:1515-1522; Prusiner, S. B. (1998) Proc. Natl. Acad. USA 95:13363-13383). A proteína PrP normal (PrPc) é expressa na maioria dos tecidos do corpo, mostrando os tecidos nervosos os maiores níveis de expressão de PrPc (Bendheim et al. (1992), Neurology 42, 149-156, Horiuchi et al. (1995) J. Gen. Virol. 76:2583-258 7) . Ao contrário da PrPsc, a forma normal de PrP é sensível à protease e não é infecciosa. Pensou-se, contudo, que a PrPsc é derivada da isoforma celular normal (Prusiner, S. B. (1991) Science 252:1515-1522). A conversão In vltro de PrPc para PrPsc catalisada por PrPsc isenta de células (como foi inicialmente descrito em 1994 por Kocisko, D. A. Come, J. H., Priola, S. A., Chesebro, B., Raynond, C. J., Lansbury, P. T. e Caughey, B. (1994) Nature 370:471-474) deu suporte a esta teoria.
Um objectivo principal para potenciais intervenções terapêuticas em distúrbios neurodegenerativos, em particular distúrbios por priões, é a conversão de PrPc em PrPsc. Foi examinada uma variedade de inibidores da formação de PrPsc, incluindo antraciclinas, vermelho do Congo, glucosminoglicanos polissulfatado e heparina, quanto à possível utilidade terapêutica no tratamento ou na prevenção de distúrbios por priões (Ehlers, B. e Dirringer, H. (1984) J. Gen. Virol. 65:1325-1330; Caughey, B. e Race, R. E. (1992) J. Neurochem. 59:768-771; Caspi, S., Sasson, S. B., Taraboulos, A. e Gabizon, R. (1998) J. Biol. Chem. 273:3483-3489; Kimberlin, R. H. e Walker, C. A. (1986) 5
Antimicrob. Agents Chemother. 30:309-413; Caughey, B. e Raymond, G. J. (1993) J. Virol. 67:643-650). Têm sido também sugeridos peptideos inibidores com homologia ao PrP como potenciais agentes terapêuticos para o tratamento de distúrbios por priões (Chesebro, B. et al., Publicação de Patente US 2001/0041790; Kapumiotou, A. et al., Publicação de Patente US 2001/0007015; Cashman et al., Cashman, N. et al., WO 00/78344; Collinge, J. et al., WO 01/07479; Soto-Jara, C. et al., Patente US 5 948 763). Mais recentemente o grupo de Prusiner seleccionou um painel de drogas conhecidas por penetrarem na barreira sanguínea cerebral para determinar se podiam inibir a formação de PrPsc (Korth, C. May. B. C. H., Cohen, F. E. e Prusiner, S, B. (2001) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98:9836-9841). Descobriram dois tipos de drogas, derivados de acridina e fenotiazina, que são inibidores razoavelmente potentes da formação de PrPsc nas células neuroblastomas.
Uma abordagem para a prevenção de distúrbios por priões seria uma vacina contra PrP. Para muitas infecções virais e bacterianas as vacinas demonstraram ser bastante eficazes, conferindo imunidade contra uma variedade de distúrbios, tanto para humanos como para animais domésticos. Contudo, a pouca imunogenicidade do PrP tem dificultado o desenvolvimento de uma vacina eficaz contra distúrbios por priões. Contudo, a potencial utilização de anticorpos para a profilaxia de distúrbios por priões está sob investigação activa em muitos laboratórios. Alguns grupos referiram efeitos positivos na aplicação de anticorpos anti-PrP. Os desenvolvimentos recentes incluíram a demonstração tanto da prevenção como também do atraso na formação do prião resistente à protease em células de cultura (Enari, M. e Weissmann, C. (2001) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98:9295-9299), e em alguns casos uma inversão na formação do PrPsc 6 em células infectadas de prião (Peretz, D. et al., (2001) Nature 412:739:743).
Apesar de ter sido tomada uma diversidade de tentativas no sentido do objectivo da prevenção e/ou da terapia para distúrbios por priões, não existem tratamentos terapêuticos ou profilácticos que tenham demonstrado ser eficazes para estes distúrbios, quer em humanos, quer em animais.
Alguns dos compostos mencionados acima mostraram atrasar o aparecimento de sintomas clínicos e aumentar o tempo de sobrevivência para animais infectados experimentalmente com "scrapie", mas nenhum provou ainda ser uma terapia eficaz para distúrbios por priões. Além disso, algumas destas moléculas têm um risco tão alto de efeitos tóxicos potenciais que não seriam escolhas apropriadas para agentes terapêuticos para tratar quer humanos quer animais. Os efeitos colaterais tóxicos podem ser a comum toxicidade, que é critica, por exemplo, para a acridina e fenotiazina. Além disso, para os peptideos e proteínas conhecidos na técnica anterior as respostas alérgicas como resultado de uma administração das drogas são muitas vezes um problema sério.
Baseado no trabalho realizado até ao presente com modelos de cultura de células, a utilização de anticorpos para tratar distúrbios por priões tem potencial, mas está ainda nos primeiros estágios de desenvolvbimento. Há inconvenientes nesta abordagem terapêutica, sendo um a curta semi-vida dos anticorpos, e sendo outro a dificuldade de fazer passar os anticorpos através da barreira cerebral sanguínea para alcançar as áreas alvo no cérebro. 7
Yehiely F. et al., "Identification of Candidate Binding to Prion Protein", Neurobiology of Disease, 1997, páginas 339-355, descrevem a identificação de proteínas que se ligam ao PrP utilizando uma proteína de fusão contendo PRP e fosfatase alcalina para ensaios de selecção. A patente US 6 365 359 descreve proteínas e faramacóforos funcionalmente equivalentes e métodos para a criação e/ou detecção de inibidores da formação de priões.
Assim, o problema técnico subjacente à invenção é providenciar compostos que tanto possam penetrar na barreira cerebral sanguínea como ser capazes de se ligar ao PrP com alta afinidade e que, portanto, possam ser usados como um potente inibidor para a formação de PrPsc no cérebro. Adicionalmente, um problema ulterior para ser resolvido é fornecer compostos com efeitos colaterais tóxicos reduzidos. Isto inclui especialmente a redução da resposta alérgica após a administração a um paciente ou animal. Um outro objectivo da invenção é fornecer compostos que sejam mais resistentes contra a inactivação enzimática. 0 problema técnico acima é resolvido pelas formas de realização caracterizadas nas revindicações. A invenção refere-se particularmente a um composto proteico que consiste na fórmula B-[G3-B]X, em que cada B é escolhido independentemente de um grupo que consiste nas SEQ ID NO: 1 a 24, G3 representa três resíduos de glicina, e x é um inteiro de 1 a 20, sendo o referido composto capaz de se ligar ao PrP. O termo "composto proteico" refere-se a um composto compreendendo pelo menos uma primeira parte estrutural que 8 é um polímero ou um oligómero de L-aminoácidos e/ou D-amino-ácidos que estão ligados por pontes peptídicas, e uma ou mais segundas partes opcionais que não compreendem um ou mais aminoácidos, tais como oligómeros ou polímeros de aminoácidos, e que estão ligadas à primeira parte ou partes por ligações covalentes ou não covalentes. Os aminoácidos que formam a primeira parte incluem os vinte D-aminoácidose ocorrência natural, aminoácidos modificados ou D-aminoácidose ocorrência natural mas raros. Os aminoácidos podem ser modificados, por exemplo, por glicosilação. As modificações estão geralmente localizadas nos términus da primeira parte do composto proteico. As modificações preferidas são um grupo amida no términus C e/ou um resíduo formilo ou piroglutamilo no términus N. Os compostos proteicos assim modificados podem ser mais estáveis contra o ataque proteolítico de carboxi-peptidases e aminopeptidases, respectivamente. 0 termo "capaz de se ligar ao PrP" implica que a ligação do composto respectivo seja mensurável no seguinte ensaio. Albumina de soro de bovino (BSA), a proteína de ligação da maltose (MBP) e uma proteína de fusão de MBP e o PrP humano são imobilizados numa placa de microtítulo. 0 composto a ser ensaiado é denominado como ligando-se ao PrP se a ligação à proteína de fusão exceder significativamente a ligação tanto à BSA como ao MBP. Uma ligação não específica é suprimida por bloqueio com 5 mg/ml de BSA, 0,02% de NaN3, 0,1 M de NaHC03, pH 8,6 e por lavagem com TBS/0,5% v/v de Tween-20 três vezes (TBS: 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl). Se o composto for um peptídeo, então o ensaio é executado com 5xlOn fagos que exibem o peptídeo, em vez do próprio peptídeo. A expressão "capaz de se ligar ao PrP" significa que a constante de dissociação para a ligação ao 9
PrP é (geralmente) menor do que 1 μΜ, preferivelmente menor que 300 nM, mais preferivelmente menor que 100 nM.
Os termos "derivados biologicamente activos" e "derivados funcionalmente activos ou parte dos mesmos" compreendem um derivado de um peptídeo escolhido de um grupo que consiste nas SEQ ID NO: 1 a 24 e que é também capaz de se ligar ao PrP e, deste modo, estabilizar o PrP contra a mudança de conformação para PrPsc e perurba a concomitante formação da placa amilóide.
As primeiras três sequências SEQ ID NO: 19 a 24 são motivos de sequências comuns que se ligam a PrP, compreendendo 5 a 6 aminoácidos que conferem a capacidade de ligação ao PrP a compostos proteicos e, desta forma, impedem a transição PrP/PrPsc e a concomitante formação da placa amilóide.
As sequências SEQ ID NO: 1 e 12 são uma selecção preferida para a SEQ ID NO: 19, que elas compreendem, as sequências SEQ ID NO: 2 e 4 são uma selecção particularmente preferida para a sequência SEQ ID NO: 20 e, analogamente, as SEQ ID NO: 9 e 15 para a sequência SEQ ID NO: 21. As sequências SEQ ID NO: 22 a 24 abrangem as sequências de acordo com as SEQ ID NO: 10 e 11. X representa um aminoácido com uma ligação de hidrogénio, escolhido de um grupo que consiste em C, W, N, Q, S, T, Y, K, R, H, D, E. Z é um aminoácido aromático escolhido de um grupo que consiste em F, W e Y.
As sequências SEQ ID NO: 1 a 24 exibem uma imuno-genecidade particularmente pobre. 10
Os compostos proteicos compreendendo estas sequências ligam-se muito fortemente ao PrP e, desta forma, estabilizam o PrP contra a mudança de conformação para PrPsc e perturbam a formação concomitante da placa amilóide e impedem, param ou invertem o desenvolvimento de distúrbios neurodegenerativos, em particular o desenvolvimento das doenças TSE.
Adicionalmente, os compostos proteicos especificados podem atravessar facilmente a barreira sanguínea do cérebro. Isto é um requisito prévio para a utilização de peptideos como agentes terapêuticos, porque a formação de amilóides a ser prevenida tem lugar no sistema nervoso central.
Uma outra forma de realização da presente invenção refere-se a compostos proteicos nos quais pelo menos um dos resíduos de aminoácido é um resíduo de D-aminoácido. A incorporação de D-aminoácidos conduz a uma resistência melhorada contra a clivagem proteolítica, sem afectar a afinidade da ligação à proteína PrP. O resíduo de D-aminoácido pode estar localizado em qualquer posição do composto proteico. Uma forma de realização particularmente preferida da presente invenção são compostos proteicos compreendendo 3 resíduos de D-aminoácidos, mais preferivelmente 5 resíduos de D-aminoácidos, e mais preferivelmente ainda 7 resíduos de D-aminoácidos. O composto proteico, como foi definido acima, consiste na fórmula B-[G3-B]X, em que cada B é escolhido independentemente de um grupo que consiste nas SEQ ID NO: 1 a 24, G3 representa três resíduos de glicina (que formam uma charneira G3), e x é um inteiro de 1 a 20, B pode ser 11 escolhido independentemente, e tem a seguinte estrutura, se, por exemplo, x = 20: B°- [G3-B1] -G3-B2] - [G3-B3] - [G3-B4] [G3-B20] , em que todos os B°, B1, B2, . . . até B20 podem ter significados iguais ou diferentes. Descobriu-se que estes compostos proteicos podem penetrar a barreira cerebral sanguínea numa extensão suficiente. A disponibilidade das drogas pode ser aumentada ainda mais utilizando-se partículas coloidais sólidas denominadas nanoparticulas (NP) e microparticulas (MP), tendo um diâmetro de 30 a 500 nm (NP) ou maior do que 0,5 pm (MP) como agente intensificador da penetração. As NP e MP são preparadas a partir de ácido polilactido-poliglicólico (PGLA), polialquilcianoacrilato (PACA) ou quitosano e resistem aos fluidos gástricos e intestinais. Podem ser utilizados adicionalmente meios tensioactivos, ferro-transferrina ou toxinas biológicas que atravessam a barreira cérebro-sangue para facilitar o fornecimento ao cérebro de NP que transportam a droga. Para um exemplo ver Schroeder et al., Life Sei. 66, 495-502 (2000). A resistência dos compostos proteicos face à clivagem proteolitica é ainda melhorada mesmo na ausência de quaisquer modificações ou de quaisquer resíduos de aminoácidos modificados ou de resíduos de D-aminoácidos.
Por outro lado a afinidade do composto proteico ao PrP e o efeito inibitório da formação de PrPsc e a concomitante formação da placa amilóide são preservados ou mesmo melhorados por causa da flexibilidade do grupo B-[G3-B]X. 12 . η 19 / ? Ω α
Preferivelmente, todos os Β , Β , Β , ... ate Β tem ο mesmo significado. Em virtude do facto de, neste caso, a sequência da primeira parte estrutural do composto proteico ser altamente redundante, a imunogenicidade do composto proteico pode ser ainda mais reduzida.
Os compostos proteicos de acordo com a presente invenção podem ser modificados tanto como os peptideos conhecidos na técnica, por exemplo, no, términus, por um grupo amida e/ou formilo ou piroglutamilo (ver acima).
De acordo com a invenção, o composto proteico pode ser um composto peptidomimético, como um derivado biologicamente activo de um peptídeo escolhido de um grupo que consiste nas SEQ id NO: 1 a 24 que também seja capaz de se ligar ao PrP e, desta forma, estabilizar o PrP contra a mudança de conformação para PrPsc e perturbar a concomitante formação da placa amilóide. Os compostos peptidomiméticos são definidos como estruturas que servem como substitutos apropriados de peptideos em interacções com outras macromoléculas. A descoberta dos compostos peptidomiméticos é exequível pesquisando bibliotecas de compostos puros. Alternativamente, são usados modelos de computador para designar análogos da molécula original. Esta abordagem resultará num número de substitutos peptídicos com bioestabilidade melhorada e uma função biológica normal ou melhorada.
Os compostos proteicos da presente invenção podem ser produzidos por expressão de um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica a sequência primária de aminoácidos de um composto de acordo com a presente invenção ou de um derivado funcionalmente activo ou de uma parte do mesmo. Derivados funcionalmente activos ou partes do composto proteico são derivados e partes dos 13 compostos proteicos de acordo com a presente invenção que são capazes de se ligar ao PrP. Uma outra forma de realização da presente invenção é um ácido nucleico, como foi definido acima. Deverá ser entendido que os compostos de acordo com a presente invenção também podem ser produzidos por síntese química.
Além disso, o composto proteico da presente invenção pode ser utilizado para tratar um mamífero com necessidade de um tratamento farmacêutico profiláctico ou terapêutico de um distúrbio neurodegenerativo, especialmente uma doença TSE. Isto implica a utilização de um composto proteico de acordo com a presente invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento profiláctico ou terapêutico de um distúrbio neurodegenerativo, especialmente de uma doença TSE. Em termos mais gerais, a invenção refere-se a um método para a supressão ou inversão da transição de PrP para PrPsc, pondo-se em contacto quer PrP, quer PrPsc, com um composto proteico de acordo com a presente invenção.
Como utilização do composto proteico da presente invenção para a prevenção ou o tratamento de um distúrbio neurodegenerativo ou distúrbio associado com depósitos amilóides ou de tipo amilóide, o referido composto proteico de acordo com a presente invenção é administrado numa quantidade eficaz a um paciente com necessidade do mesmo, podendo o paciente ser humano ou animal, em particular um mamífero. Do mesmo modo, um método para detectar os referidos distúrbio ou distúrbios também inclui a administração de uma quantidade suficiente do composto proteico como uma prova para visualizar a sua ligação aos depósitos fibrilares por técnicas de imagiologia bem conhecidas. Como os compostos proteicos de acordo com a presente invenção penetram rapidamente na barreira cerebral 14 sanguínea, o método de diagnóstico pode ser realizado não somente in vitro (por exemplo, por ensaios em partes do sistema nervoso central com o composto marcado e a investigação microscópica do resultado), mas também in vivo (por exemplo, por administração oral do composto proteico marcado e a obtenção das imagens da distribuição dos compostos no sistema nervoso central).
Tal como é usado agui, o termo "tratamento profiláctico" de um estado, tal como uma doença TSE ou outros distúrbios de amiloidose num paciente, envolve a administração de um peptídeo, polipeptídeo ou composto peptidomimético de acordo com a presente invenção, antes do ataque clínico do distúrbio. 0 "tratamento terapêutico" envolve a administração de um peptídeo, polipeptídeo ou composto peptidomimético de acordo com a presente invenção depois do ataque clínico do distúrbio. Por exemplo, a administração com sucesso do peptídeo da presente invenção, depois do desenvolvimento do distúrbio ou distúrbio compreende o "tratamento terapêutico" do distúrbio. A invenção é útil no tratamento de humanos, bem como também para usos veterinários em animais.
Os compostos proteicos de acordo com a presente invenção podem ser administrados por quaisquer meios que alcancem os propósitos desejados. Por exemplo, a administração pode ser realizada por diferentes vias parentéricas incluindo, mas sem limitação, as vias subcutânea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intracerebral, intranasal, oral, transdérmica, ou vias bucais. A administração parentérica pode ser a injecção rápida ou por perfusão gradual ao longo do tempo. 15
Um regime típico para a prevenção, a supressão ou o tratamento de um estado associado com depósitos amilóides ou de tipo amilóide compreende quer (1) a administração de uma quantidade eficaz numa ou duas doses, de uma alta concentração dos compostos proteicos de acordo com a presente invenção, na gama de 0,5 a 10 mg do respectivo composto por kg de peso corporal, mais preferivelmente 0,5 a 5 mg, quer (2) a administração de uma quantidade eficaz do respectivo composto administrado em múltiplas doses de baixas concentrações, na gama de 10-1000 pg por kg de peso corporal, mais preferivelmente 50-500 pg durante um período de tempo até, inclusive, vários meses a vários anos.
Deve ser entendido que a dosagem administrada dependerá da idade, sexo, estado de saúde e peso do paciente, natureza do tratamento concorrente, se houver algum, frequência do tratamento, e a natureza do efeito desejado. A dose total requerida para cada tratamento pode ser administrada por doses múltiplas ou numa dose simples. Por "quantidade eficaz" entende-se uma concentração de um composto proteico de acordo com a presente invenção que seja capaz de retardar ou inibir a formação de depósitos amilóides ou de tipo amilóide, ou de dissolver depósitos fibrilares previamente formados. Estas concentrações podem ser correntemente determinadas pelos peritos na técnica. Será também de notar pelos peritos na técnica que a dosagem pode ser dependente da estabilidade do composto proteico administrado. Um composto proteico menos estável pode requerer a administração em doses múltiplas.
As preparações para a administração parentérica incluem soluções, suspensões e emulsões estéreis, aquosas ou não aquosas, que podem conter agentes auxiliares ou excipientes que são conhecidos na técnica. Composições farmacêuticas, 16 tais como comprimidos e cápsulas, podem também ser preparadas de acordo com os métodos de rotina.
As composições farmacêuticas compreendendo os peptideos da invenção incluem todas as composições em que os compostos proteicos de acordo com a presente invenção estejam presentes numa quantidade eficaz para se atingirem os fins desejados. Além disso, as composições farmacêuticas podem conter veículos farmaceuticamente aceitáveis apropriados, que compreendem excipientes e auxiliares que facilitem o processamento dos compostos activos nas preparações que podem ser usadas farmaceuticamente. Os veiculos farmaceuticamente aceitáveis adequados são bem conhecidos na técnica e estão descritos, por exemplo, em Gennaro, Alfonso, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition 1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa., um texto de referência convencional neste campo. Habitualmente os veiculos farmaceuticamente aceitáveis podem ser escolhidos de acordo com o modo de administração e a solubilidade e a estabilidade dos peptideos. Por exemplo, as formulações para administração intravenosa podem incluir soluções aquosas estéreis que podem também conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados.
As formulações adequadas para a administração parentérica incluem soluções aquosas dos compostos activos na forma solúvel em água, por exemplo, sais solúveis em água. Adicionalmente, podem ser administradas suspensões do composto activo como suspensões em óleo para injecções apropriadas. Os solventes ou veiculos lipófilos adequados incluem óleos gordos, por exemplo, óleo de sésamo, ou ésteres de ácidos gordos sintéticos, por exemplo, oleato de etilo, ou triglicéridos. As suspensões injectáveis aquosas que podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da 17 suspensão incluem, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, sorbitol e/ou dextrano. Eventualmente, a suspensão também pode conter estabilizadores.
Os distúrbios neurodegenerativos ou distúrbios associados com a transformação anormal de proteínas em depósitos amilóides ou de tipo amilóide para serem tratados ou prevenidos por administração da composição farmacêutica da invenção incluem a doença de Alzheimer, FAF, síndroma de Down, outros distúrbios de amiloidose do tipo das doenças TSE, distúrbios neurodegenerativos humanos associados aos priões, tal como Kuru, doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), síndroma de Gerstmann-Straussier-Scheinker (GSS), asim como distúrbios por priões em animais, tal como "scrapie", encefalopatia espongiforme, encefalopatia de martas transmissível e doença definhante crónica das mulas, veados e alces.
Além dos tratamentos profilácticos e terapêuticos, os respectivos compostos da presente invenção podem também ser administrados para detectar e diagnosticar a presença ou ausência de depósitos amilóides ou de tipo amilóide in vivo. Um peptídeo designado, capaz de se ligar a determinantes estruturais num correspondente depósito amilóide ou de tipo amilóide, marcado não radioactivamente ou com um radioisótopo, como é bem conhecido na técnica, pode ser administrado a um paciente para o diagnóstico do ataque ou da presença de um distúrbio ou distúrbios associado com a anormal transformação da proteína em depósitos fibrilares amilóides ou de tipo amilóide. A ligação do referido peptídeo marcado, após a administração aos depósitos amilóides ou de tipo amilóide, pode ser detectada por técnicas de imagiologia in vivo conhecidas na técnica. 18
As figuras mostram:
As figs. 1 e 2 ilustram o resultado de um ensaio de ligação dos peptideos exibidos por fagos de acordo com a invenção e o PrP a ser fundido com a proteína que se liga à maltose (MBP); ordenada: OD405 nm abcissa: A legenda é a seguinte: primeira barra de proteina de fusão da uma barra tripla: pegunda barra de um barra tripla: terceira barra de um barra tripla: proteina que se liga à maltose e PrP proteina de ligação à maltose albumina de soro de bovino
Os peptideos são abreviados como se segue: pi SEQ ID NO: 1 p2 SEQ ID NO: 2 p3 SEQ ID NO: 3 p4 SEQ ID NO: 4 p5 SEQ ID NO: 5 p6 SEQ ID NO: 6 p7 SEQ ID NO: 7 p8 SEQ ID NO: 8 p9 SEQ ID NO: 9 plO SEQ ID NO: 10 pll SEQ ID NO: 11 pl2 SEQ ID NO: 12 pl3 SEQ ID NO: 13 p!4 SEQ ID NO: 14 19 pl5 SEQ ID NO: 15 pl6 SEQ ID NO: 16 pl7 SEQ ID NO: 17 pl8 SEQ ID NO: 18 0 fago DE tipo selvagem que tem a sequência heptapeptídicA normal do fago no términus N da sua proteína de cobertura menor é abreviado como "controle".
Nas fig. 1 e fig. 2, derivados do bacteriófago Ml3 que transportam peptideos foram ensaiados quanto à sua ligação às proteínas indicadas, que tinham sido imobilizadas nas cavidades individuais de uma placa de microtitulo. A quantidade do fago que permaneceu ligado após a lavagem extensiva foi determinada por um ensaio ELISA, utilizando um anticorpo monoclonal acoplado a uma peroxidase de rábano que reconhece a principal proteína de cobertura do fago M13 (ABTS como substrato para dar origem a um produto verde, cuja absorvância é lida a 405 nanómetros). As experiências foram realizadas como é descrito no exemplo 2.
Tendo agora sido descrita a invenção na generalidade, a mesma será melhor compreendida com referência aos exemplos que se seguem, que são fornecidos como meio de ilustração e não sendo limitativos da presente invenção.
Exemplos
Exemplo 1: Isolamento de sequências que se ligam ao PrP, utilizando o fago revelador: A biblioteca PhD7 foi adquirida à New England Biolabs (Califórnia, USA). Esta biblioteca tem uma diversidade de 2,8xl09 heptapeptídeos aleatórios fundidos ao términus N da 20 proteína de cobertura menor pin do bacteriófago M13 filamentoso. Para a experiência de exibição do fago foram revestidas duas placas de petri de poliestireno de 94x16 mm (Greiner, Alemanha), a primeira com 3,5 ml de MBP-6xHis 100 pg/ml em NaHCCh 0,1 M pH 8,6 (MBP: proteína de ligação à maltose), e a outra com a mesma quantidade e concentração de rhMBP-PrP-6xHis (rh: recombinante humano). O revestimento foi realizado durante a noite (> 16 h) a 4°C com agitação suave, num recipiente humedecido. Após o revestimento, as placas de petri foram bloqueadas com BSA 5 mg/ml (Sigma A-3059) em NaHC03 0,1 M pH 8,6 durante lha 4°C e lavados seis vezes com TBST (50 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,1% v/v Tween-20). Foram adicionadas 2 χ 1011 pfu (unidades de formação de placa) da biblioteca PhD7, diluídas em 2 ml TBST, à placa de petri revestida com MBP-6xHis. Após 1 h de incubação à temperatura ambiente com agitação suave, o sobrenadante contendo o fago não ligado foi cuidadosamente pipetado para a placa de petri revestida com rhMBP-PrP-6xHis e foi incubado durante 1 h à temperatura ambiente, com agitação suave. Foi adicionado MBP-6xHis livre numa concentração final de 100 pg/ml para bloquear os fagos remanescentes com afinidade para MBP-6xHis. A placa de petri foi então lavada dez vezes com TBST e os clones ligados ao fago limite foram eluídos com 2 ml de glicina 0,2 M pH 2,2, 1 mg/ml BSA durante 10 min. e neutralizados com 300 μΐ de tris-HCl 1 M pH 9,1. Os fagos eluídos foram propagados na estirpe F+ E. coli ER2537 e foram titulados de acordo com as instruções recomendadas pelo fabricante. 2x1o11 pfu do fago amplificado foram utilizadas para a segunda de cinco passagens de realização de lavagens. As passagens seguintes de lavagem foram realizadas da mesma maneira, com as seguintes excepções: (1) o tempo de incubação do fago na placa de petri revestida com rhMBP-PrP-6xHis foi reduzido para 30 min., 21 (2) a concentração de Tween-20 no TBS foi aumentada em 0,5% v/v. A segunda experiência de exibição do fago foi levada a cabo com as seguintes modificações: (1) foram utilizadas placas de petri de poliestireno com 60x15 mm (Greiner, Alemanha); os volumes das soluções utilizados foram ajustados devidamente, (2) a concentração de BSA na solução de bloqueio foi aumentada para 10 mg/ml, (3) foram realizados dois passos de eluição; os fagos foram eluidos especificamente, primeiro com 1 ml de rhMBP-PrP-6xHis 100 pg/ml durante 1 hora, à temperatura ambiente, e em seguida não especificamente como foi descrito acima, (4) foram realizadas 3 passagens de lavagem. O DNA dos clones de fago das 3a, 4a e 5a passagens da primeira experiência de lavagem e as 2a e 3a passagens da segunda experiência de exibição de fago foram isoladas de acordo com as instruções recomendadas pelo fabricante e sequenciadas por MWG-Biotech (Alemanha).
Exemplo 2: Caracterização dos peptideos escolhidos
exibidos pelos fagos para ligação ao PrP por ELISA
Placas de microtitulo de 96 cavidades, de fundo chato (Greiner), foram preparadas para o ensaio ELISA (ensaio imunosorvente ligado ao enzima) por revestimento prévio ou com 100 pg/ml de rhMBP-PrP-6xHis, ou com 100 pg/ml de MBP-6xHis, ambos em NaHCCb 0,1 M pH 8,6, durante a noite, a 4°C, numa câmara humedecida agitada com balanço suave. Após três lavagens com TBS/0,5% Tween-20, as cavidades das placas foram subsequentemente bloqueadas durante 2 h com o tampão de bloqueio contendo 5 mg/ml de BSA (Sigma A-3059), 0,02% NaN3 em NaHCCb 0,1 M pH 8,6. Após a lavagem seis vezes com TBS/0,5% Tween-20 as placas foram incubadas com 22 IO12 pfu de cada um dos clones de fagos isoladoss obtidos dos passos de apresentação de fagos anteriores. Após 1 h de incubação à temperatura ambiente, os fagos não ligados foram subsequentemente removidos por seis lavagens com TBS/0,5% Tween-20. Em seguida as placas foram incubadas com anticorpo monoclonal anti M13 conjugado com peroxidase de rábano (Pharmacia 27-9411-01) 1:5000 em tampão de bloqueio. Após a incubação, e durante 1 hora, à temperatura ambiente, as placas foram lavadas seis vezes com TBS/0,5% Tween-20 e o complexo fago-anticorpo ligado foi detectado por adição de solução de ABTS (Sigma A-1888) [citrato de sódio 0,05 M pH 4,0, 0,22 mg/ml de ácido 2',2'-azino-bis-(3 '-etilbenzotiazolino-6-sulfónico) e 0,05% de H2O2] e foi incubado à temperatura ambiente durante 30 min. A absorvância a 405 nm foi então quantificada por um leitor de microplacas automático Elx800 (BIO-TEK INSTRUMENTS, INC.). Os resultados destes ensaios são mostrados na figura 1. 23
LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> MSP - Molecular Services & Products S.A.
Centre for Research and Technology Hellas Institute of Agrobiotechnology
<120> Novos heptapeptídeos que se ligam a PRP <130> M4639 <160> 24 <170> Patentln versão 3.3
<210> 1 <211> 7 <212> PRT uma <213> Sequência artificial: obtida pesquizando
biblioteca quanto à actividade de ligação a PrP <400> 1
Leu Pro Leu Thr Pro Leu Pro 1 5
<210> 2 <211> 7 <212> PRT uma <213> Sequência artificial: obtida pesquizando
biblioteca quanto à actividade de ligação a PrP <400> 2
Ser Thr Phe Thr His Pro Arg 24 1 5
< 210 > 3 <211> 7 <212> PRT uma <213> Sequência artificial: obtida pesquizando
biblioteca quanto à actividade de ligação a PrP <400> 3
Trp Asn Asn Tyr Thr His Pro 1 5
<210> 4 <211> 7 <212> PRT uma <213> Sequência artificial: obtida pesquizando
biblioteca quanto à actividade de ligação a PrP <400> 4
His Leu Pro Pro Asn Ser Arg 1 5
<210> 5 <211> 7 <212> PRT uma <213> Sequência artificial: obtida pesquizando
biblioteca quanto à actividade de ligação a PrP <400> 5
Phe Gin Pro Pro Pro Asn Pro 1 5 25 25 < 210 > <211 > < 212 > β 7
PRT uma <213> Sequência artificial: obtida pesquizando
biblioteca quanto à actividade de ligação a PrP < 4 0 0 > 6
Phe Ala Leu Asn Glu Leu Arg 1 5
<210> 7 <211> 7 <212> PRT uma <213> Sequência artificial: obtida pesquizando
biblioteca quanto à actividade de ligação a PrP <400> 7
Trp Asn Ser Pro Asn Leu Arg 1 5
<210> 8 <211> 7 <212> PRT uma <213> Sequência artificial: obtida pesquizando
biblioteca quanto à actividade de ligação a PrP <400> 8
Ser Vai Pro Thr Ile Ile Phe 1 5 <210> 9 26
<211> 7 <212> PRT uma <213> Sequência artificial: obtida pesquizando
biblioteca quanto à actividade de ligação a PrP <400> 9
Ala Thr Thr Arg Thr Leu Pro 1 5
<210> 10 <211> 7 <212> PRT uma <213> Sequência artificial: obtida pesquizando
biblioteca quanto à actividade de ligação a PrP <400> 10
Lys Leu Trp Gin Ile Pro Lys 1 5
<210> 11 <211> 7 <212> PRT uma <213> Sequência artificial: obtida pesquizando
biblioteca quanto à actividade de ligação a PrP <400> 11
Lys Leu Trp Vai Ile Pro Gin 1 5 <210> 12 <211> 7 27
<212> PRT uma <213> Sequência artificial: obtida pesquizando biblioteca quanto à actividade de ligação a PrP <400> 12
Gly Thr Leu Trp Gin Leu Pro 1 5
<210> 13 <211> 7 <212> PRT uma <213> Sequência artificial: obtida pesquizando
biblioteca quanto à actividade de ligação a PrP < 4 0 0 > 13
Lys Cys Cys Tyr Pro Vai Pro 1 5
<210> 14 <211> 7 <212> PRT uma <213> Sequência artificial: obtida pesquizando
biblioteca quanto à actividade de ligação a PrP <400> 14
Thr Gin Trp Pro Thr Ile Pro 1 5
<210> 15 <211> 7 <212> PRT 28 28 uma <213> Sequência artificial: obtida pesquizando
biblioteca quanto à actividade de ligação a PrP <400> 15
Gin Ala Thr His Arg Ser His 1 5
<210> 16 <211> 7 <212> PRT uma <213> Sequência artificial: obtida pesquizando
biblioteca quanto à actividade de ligação a PrP <400> 16
Glu Pro Leu Gin Leu Lys Met 1 5
<210> 17 <211> 7 <212> PRT uma <213> Sequência artificial: obtida pesquizando
biblioteca quanto à actividade de ligação a PrP <400> 17
Ala His Pro Gin Leu Ala Thr 1 5
<210> 18 <211> 7 <212> PRT 29 <213> Sequência artificial: obtida pesquizando uma
biblioteca quanto à actividade de ligação a PrP <400> 18
His Ala Ile Tyr Pro Arg His 1 5 <210> 19 <211> 5
<212> PRT <213> Sequência artificial: obtida pesquizando uma
biblioteca quanto à actividade de ligação a PrP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(3) <223> X é um aminoácido com uma ponte de hidrogénio
escolhido entre C, W, N, Q, S, T, Y, K, R, H, D, E < 4 0 0 > 19
Leu Xaa Xaa Leu Pro 1 5
<210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência artificial: obtida pesquizando uma
biblioteca quanto à actividade de ligação a PrP <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2)
<223> X é um aminoácido com uma ponte de hidrogénio escolhido entre C, W, N, Q, S, T, Y, K, R, H, D, E 30 <220> <221> ΜΙSC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X é um aminoácido aromático escolhido entre F, W, Y <400> 20
Xaa Xaa Xaa Thr His Pro 1 5
<210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial: obtida pesquizando uma
biblioteca quanto à actividade de ligação a PrP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X é um aminoácido com uma ponte de hidrogénio
escolhido entre C, W, N, Q, S, T, Y, K, R, H, D, E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X é um aminoácido com uma ponte de hidrogénio
escolhido entre C, W, N, Q, S, T, Y, K, R, H, D, E <400> 21
Ala Thr Xaa Arg Xaa 1 5 <210> 22 <211> 4
<212> PRT 31 <213> Sequência artificial: obtida pesquizando uma
biblioteca quanto à actividade de ligação a PrP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> qualquer aminoácido (G, A, V, L, I, P, F, Y, W, S, T, N, Q, C, M, D, E, Η, K, R) <400> 22
Lys Leu Trp Xaa 1
<210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência artificial: obtida pesquizando uma
biblioteca quanto à actividade de ligação a PrP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> qualquer aminoácido (G, A, V, L, I, P, F, Y, W, S, T, N, Q, C, M, D, E, Η, K, R) <400> 23
Lys Leu Trp Xaa lie Pro 1 5
<210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial: obtida pesquizando uma
biblioteca quanto à actividade de ligação a PrP <220> 32 <221> ΜΙSC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> qualquer aminoácido (G, A, V, L, I, P, F, Y, W, S, T, N, Q, C, M, D, E, Η, K, R) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> aminoácido polar/hidrófilo (N, Q, S, T, K, R, H, D, E, C, Y) <400> 24
Lys Leu Trp Xaa lie Pro Xaa 1 5
Lisboa, 14 de Maio de 2007
Claims (8)
- REIVINDICAÇÕES 1. Composto proteico que consiste na fórmula B-[G3-B]X, em que cada B é escolhido independentemente de um grupo que consiste nas SEQ ID NO: 1 a 24, G3 representa três resíduos de glicina, e x é um inteiro de 1 a 20, sendo o referido composto capaz de se ligar ao PrP.
- 2. Composto de acordo com a reivindicação 1, compreendendo pelo menos um resíduo de um D-aminoácido.
- 3. Ácido nucleico que consiste numa sequência nucleotídica que codifica para a sequência de aminoácido primária de um composto de acordo com a reivindicação 1.
- 4. Composição farmacêutica contendo um composto, tal como foi definido em qualquer das reivindicações 1 ou 2, e eventualmente um veiculo farmaceuticamente aceitável.
- 5. Utilização de um composto de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2 para a preparação de um medicamento para o tratamento profilático ou terapêutico de um distúrbio neurodegenerativo.
- 6. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que o distúrbio neurodegenerativo é uma doença TSE.
- 7. Utilização de um composto de acordo com as reivindicações 1 ou 2, como uma sonda para o diagnóstico ex vivo de um distúrbio neurodegenerativo.
- 8. Utilização de acordo com a reivindicação 7, em que o distúrbio neurodegeneratico é uma doença TSE. Lisboa, 14 de Maio de 2007
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