JP2004513066A - アンジオシジン:cys−ser−val−thr−cys−gly特異的腫瘍細胞付着受容体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、トロンボスポンジンのCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)領域に対して特異的な細胞マトリックス受容体の配列を提供する。また、精製、クローニング及び発現方法も提供される。受容体タンパク質は、多くの診断、予防及び治療分野において有用である。
Description
【0001】
技術分野:
アンジオシジン(angiocidin)、すなわち腫瘍細胞の表面上に発現されるトロンボスポンジン(thrombospondin)のCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)領域に対して特異的な細胞マトリックス受容体が、アンジオシジン、並びにアンジオシジンに対する抗体及びインヒビターを精製するための方法と共に提供される。アンジオシジンは、多くの診断及び治療状態、例えば癌診断、管理及び処理において有用である。
【0002】
発明の背景:
癌細胞は、それらが転移できる前、基礎膜を移動すべきであるので、基礎膜(basement membrane)との細胞相互作用の機構は非常に興味あるものである。偏在する基礎膜は、間隙性コラーゲン支質から器官実質細胞を分離する特定タイプの細胞外マトリックスである。正常及び腫瘍性細胞は、このマトリックスと、異なって反応する。
【0003】
ほとんどの正常細胞(非移動性細胞)は、生存、増殖及び分化のために細胞外マトリックスを必要とするように思われ、そして移動性細胞(正常及び腫瘍性の両者)は、1つの組織からもう1つの組織に移動することにおいて基礎膜を横切るべきである。特に、鱗状又は腺上皮は、基礎膜を横切り、循環及びリンパ系に侵入する(血管内異物侵入)。循環性悪性細胞は典型的には、他の器官の細管層において拘束され、血管壁を侵入し、そして基礎膜を管外組織まで透過し(管外遊出)、ここで二次悪性が確立される。
【0004】
細胞と細胞外マトリックスとの相互作用は、マトリックスにそれら自体結合する細胞の能力に依存する。正常及び悪性細胞の両者における結合は、マトリックスに存在するある型のコラーゲンタンパク質に細胞を結合する特定の糖タンパク質により介在されるように思える。例えば、線維芽細胞、筋芽細胞及び平滑筋細胞は、間隙性タイプI及びIIIコラーゲンとフィブロネクチンとの相互作用を通して細胞外マトリックスに結合し、そしてタイプII軟骨コラーゲンとコンドロネクチンとの相互作用を通して軟骨細胞に結合する。正常及び悪性細胞の両者は、類似する機構により基礎膜に結合する。基礎膜の主要成分は、タイプIVコラーゲン、糖タンパク質及びプロテオグリカンである。糖タンパク質ラミニンは、基礎膜への上皮及び悪性細胞の両者の結合に介在し、タイプIVコラーゲンに細胞を結合する。
【0005】
転移性腫瘍細胞は、転移性工程における複数段階で基礎膜を移動し、基礎膜に結合することによってこの移動を開始する。従って、この膜への腫瘍細胞結合を促進するか又は阻害する特定の結合因子の同定及びこの機構の解明は、癌診断、予防、管理及び処理のために重要な関係を有する。
【0006】
トロンボスポンジン(TSP−1)は、血管基礎膜、すなわち腫瘍支質に存在する細胞付着タンパク質及びマトリックス分子であり、そして血小板により分泌される。それは、腫瘍細胞侵入及び転移を仲介する。理論により結びつけられることは所望されないが、腫瘍細胞コロニー化は、アンジオシジンとして命名されている、新規のCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的腫瘍細胞受容体に結合する、アミノ酸配列Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)を含むTSP−1の付着性ドメインを通して進行すると思われる。この受容体は、トランスメンブラン受容体であり、自由であり、又は細胞結合され得る。
【0007】
TSP−1は、1,152個のアミノ酸(MW 145,00)からそれぞれ成る、3種の同一のジスルフィド−結合された鎖から構成される。個々のポリペプチド鎖は、反復する相同アミノ酸配列から成るドメインから主に構成される。それらのドメインは、NH2−末端球状ドメイン;プロコラーゲン相同ドメイン;プロペルジンに見出される配列に対して相同の3種の反復配列から成る、タイプ1又はプロペルジン反復体ドメイン;上皮増殖因子における配列に対して相同の3種の反復配列から成るタイプ2反復体ドメイン;7種の反復Ca2+−結合配列から成るタイプ3反復体ドメイン;及びCOOH−末端球状ドメインである。
【0008】
TSP−1は、次の活性により特徴づけられる:細胞付着促進活性、細胞ミトゲン活性、細胞走化性活性及び止血活性、並びにそれらの活性、例えば腫瘍細胞、微生物又は寄生体転移活性、血小板凝集活性、フィブリン溶解活性及び免疫変性に由来するいずれかの活性。
【0009】
トロンボスポンジンは、いくつかの研究によれば、同じ細胞上の複数の細胞表面受容体に結合し、又は異なった細胞上の異なった受容体に結合することができる。例えば、血小板は、GPIIb−IIIb, GPIa−IIa(Karczewskiなど., J. Biol. Chem. 264: 211332−21326 (1989) 及びTuszynskiなど., J. Clin. Invest. 87: 1387−1394 (1991))、及びビトロネクチン−受容体(Tuszynskiなど., Exp. Cell Res. 182: 481 (1989))を通してTSP−1を結合することができる。平滑筋細胞、内皮細胞、内皮細胞、U937単球様細胞及びメラノーマ細胞は、ビトロネクチン様受容体を通してTSP−1を結合することができる。鱗状細胞癌は、インテグリン又はCD36ではないMw80,000/105,000を通してTSP−1を結合する(Yabkowitzなど., Cancer Res. 51: 3648−3656 (1991))。
【0010】
トロンボスポンジンの活性及び重要性は、それに対して生成された抗体の機能により示されて来た。抗トロンボスポンジン抗体は、血小板凝集を阻害することが示されており、このことは、トロンボスポンジンがそのシステムにおいてある役割を演じることを確かにする(Tuszynskiなど., Blood 72: 109−115 (1988))。さらに、抗トロンボスポンジン抗体は、細胞付着を示す、抗体を有さないスライドに比較して、トロンボスポンジンにより被覆された培養スライドへの細胞付着を阻止する(G. Tuszynski, Cancer Research 47: 4130−33 (1987))。
【0011】
他の細胞外マトリックスタンパク質のための受容体は単離されている。Liottaなど., アメリカ特許第4,565,789号は、ラミニン受容体の単離を記載している。Mechamなど., J. Biol. Chem. 264: 16652−7 (1989)は、67kDのラミニン受容体に対して構造的及び機能的類似性を示すエラスチン受容体を記載する。CD36は、トロンボスポンジンのCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)配列を結合するものとして包含されて来た(Aschなど., Biochem. Biophys. Res. Comm. 182: 1208−1217 (1992))。しかしながら、CD36は、88kDのタンパク質である。本発明のCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体は、それらの前に単離された細胞外マトリックスタンパク質受容体とは異なる。
本明細書に引用されるすべての資料は、引用により本明細書に組み込まれる。
【0012】
発明の要約:
トロンボスポンジン(TSP−1)のCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的領域のための特異的結合親和性を有する精製された受容体、好ましくは配列番号2及び配列番号3、それらのフラグメント及び突然変異体を含んで成る受容体、及びそれらの受容体に対する抗体及びインヒビターを提供することが本発明の目的である。
配列番号2及び3の受容体、そのフラグメント、変異体、又はそれに対して向けられた抗体及びリガンドを用いて、疾病を処理し又は診断するための方法を提供することが本発明のさらなる目的である。
【0013】
発明の特定の記載:
本発明は、他方では、アンジオシジンとして記載される、精製されたトロンボスポンジン(TSP−1)受容体タンパク質の配列を提供する。受容体の配列は、図1及び2(配列番号2及び3)に見出され得る。それらの配列は3種のアミノ酸Gly−Glu−Argにより異なり、そしてそれらのDNA配列間の差異は図3に見出され得る。
【0014】
受容体は、トロンボスポンジンのCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)領域に対して特異的である。受容体タンパク質は、例えば多くの治療分野、例えば癌診断又は管理において有用である抗体を生成するために使用され得る。Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体結合部位のコンピューターモデリングはまた、Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体部位をインビボで阻止するか又は結合する新規化合物の企画においても助力となる。この受容体タンパク質は、癌と相互関係し、そして癌細胞においてアップレギュレートされる。この受容体はアンジオシジンとして本明細書において言及される。
【0015】
Gly−Glu−Argを有さない受容体の配列(図2)は、次の2種の既知であるが、しかし関連しないタンパク質と配列相同性を共有する:抗分泌因子及びヒト26Sプロテアーゼのユビキチン−結合サブユニット。抗分泌因子は、下垂体により製造されるタンパク質であり、そして結腸上皮を結合し、そして結腸上皮中への水の輸送を阻害する。従って、このタンパク質は、腸における水の流れの身体による調節を可能にする。抗分泌因子は、感染の条件下で、例えば宿主がコレラにより感染される場合に生成される。
【0016】
Johansson, E., Identification of an Active Site in the Antisecretory Factor Protein, Biochimica et Biophysica Acta 1362: 177−82 (1997). 他方では、ヒト26Sプロテアーゼのユビキチン−結合サブユニットは、ユビキチン化されたタンパク質を結合し、そして細胞における古いタンパク質を分解する工程において助力する。Ferrell, K., Molecular Cloning and Expression of a Multiubiquitin Chain Binding Subunit of the human 26S Protease, FEBS Letters 381: 143−48 (1996)。
【0017】
トロンボスポンジン受容体配列がそれらの既知タンパク質の両者と配列相同性を共有することは驚くべきことである。それらの既知タンパク質は、いずれも、癌と相互作用しておらず、又は癌細胞においてアップレギュレートされることも知られていない。そのタンパク質は、いずれの機能も共有せず、そして身体の同じ領域においてさえ作用しない。
【0018】
本発明の受容体は細胞表面上に位置し、そして抗分泌因子は血液において循環し、そしてユビキチン−結合サブユニットは細胞内に含まれる。受容体は2種の従来の既知タンパク質とは異なった後−翻訳修飾を有することは可能である。それらの修飾は次のものを包含することができる:糖化、リン酸化、エクトリン酸化、サブユニット構造(モノマー対ダイマー、又はテトラマー構造)、及びスルフヒドリル基の結合を包含する異なったコンホメーション構造。
【0019】
本発明の受容体に対する抗体及びリガンドは、抗分泌因子及びユビキチン−結合サブユニットの作用を妨げないであろうと思われる。ユビキチン−結合サブユニットは、細胞内に隠された酵素複合体に位置し、そしてたぶんいずれの交差反応性からも保護される。抗分泌因子は、感染、特に胃腸感染の条件下でのみ、身体において生成されると思われる。従って、それは、一般的に、血液において存在せず、そして従って、本発明の受容体に対する抗体と交差反応すべきではない。さらに、抗体特異性は、3種のタンパク質間で異なることができる後−翻訳修飾に依存することができる。競争受容体タンパク質の付加は同様に、タンパク質の後−翻訳差異のために、それらの他のシステムを妨害すべきではない。
【0020】
本発明の受容体はまた、約10−6M〜約10−10M、好ましくは約10−7M〜約10−9M、最も好ましくは約10−8Mの親和性を伴って、トロンボスポンジンペプチドCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)への結合をまだ可能にする、配列番号2及び3の修飾を有する受容体(他方では、突然変異体としても知られている)も包含する。その変異体は、二次構造又はタンパク質機能に影響を及ぼさないいずれかの保存性置換を含んで成り、それらは、同じ種類、例えば疎水性、親水性、塩基性及び酸性のアミノ酸の置換を包含する。
【0021】
特に、それらは、次の置換対を包含するが、但しそれらだけには限定されない:バリン及びトレオニン、グリシン及びイソロイシン、リシン及びアルギニン、グルタミン酸及びアスパラギン酸、フェニルアラニン及びトリプトファン、セリン及びトレオニン、及びメチオニン及びシステイン。好ましくは、修飾は、カルボキシ末端領域、すなわちIle248−Lys380 (配列番号25)に対して行われる。この領域は、アンジオシジンの活性に影響を及ぼすとは思われない。しかしながら、修飾は他の領域に対しても行われ得る。他の保存性置換は、当業者に明らかであろう。
【0022】
さらに、アミノ末端領域を包含するフラグメント(Met1−Lys132)、及びそのアミノ末端フラグメントを包含するフラグメントの突然変異体が、本発明に使用され得る。アミノ末端フラグメントMet1−Lys132は、配列番号24に見出され得る。
【0023】
定義及び略語
“アンジオシジン” Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体のタンパク質“、“トロンボスポンジン受容体タンパク質”、“TSP−1受容体”、及び“受容体”は、ペプチドCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)に対する特異的結合親和性を示すいずれかの哺乳類源、例えばヒト、ブタ、ウマ、ウシ及びマウス(但し、それらだけには限定されない)からの天然のトロンボスポンジン受容体タンパク質を言及する。
【0024】
受容体は、配列番号2及び3に見出される配列を有する。前記用語はまた、合成TSP−1受容体タンパク質、すなわち組換え手段又は直接的化学合成により生成されるタンパク質を包含する。TSP−1受容体タンパク質は、血小板、内皮細胞、上皮(肺)細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、単球マクロファージ、グリア細胞、及び最も特定には、癌組織、例えばメラノーマ細胞及び肺癌細胞(但し、それらだけには限定されない)に見出されるタンパク質である。
【0025】
“脈管形成活性”とは、血管又はリンパ管の形成を阻害するか又は増強する能力として、本明細書において定義される。
“抗−内皮活性”とは、内皮細胞、例えばウシ大動脈内皮細胞生存性を低める能力として、本明細書において定義される。
“抗マラリア活性”とは、内皮細胞へのマラリア−感染された赤血球細胞の細胞付着、マラリアスポロゾイト認識及び肝細胞中への侵入、又はマラリアメロゾイト認識及び赤血球中への侵入のいずれかを阻害する能力として、本明細書において定義される。抗マラリア活性は、細胞付着を阻止するワクチン又は治療の形で示され得る。
【0026】
“抗転移活性”とは、腫瘍細胞転移の程度又はサイズを妨げるか又は非常に低める能力、又は一次固形腫瘍の回帰を阻害するか又は引き起こす能力として、本明細書において定義される。
“アテローム硬化症活性”とは、アテローム硬化性病変形成を促進するか又は阻害するトロンボスポンジンの能力として、本明細書において定義される。アテローム硬化症病変は、特に動脈壁における脂質−含有材料の変性蓄積として定義される。
【0027】
“細胞付着活性”とは、支持体への細胞、好ましくは哺乳類細胞の付着を促進するか又は阻害する能力として、本明細書において定義される。
“糖尿病性網膜症活性”とは、糖尿病により引き起こされる眼における血管の異常形成を阻害する能力として、本明細書において定義される。
“増殖因子活性”とは、細胞増殖を阻害するか又は促進する能力として、本明細書において定義される。
“黄斑変性活性”とは、黄斑変性における網膜及び黄斑下で血管の異常増殖を阻害する能力として、本明細書において定義される。
【0028】
“トロンボスポンジン−様活性”とは、トロンボスポンジンの既知の生物学的活性を模倣するいずれかの活性として、本明細書において定義される。それらの活性は、細胞−付着促進活性、細胞ミトゲン活性、細胞走化性活性及び止血活性、及び腫瘍細胞、微生物又は寄生体転移活性、血小板凝集活性、フィブリン溶解活性及び免疫変性のようなそれらの活性に由来するいずれかの活性を包含する。
【0029】
好ましい態様
本発明の好ましい受容体タンパク質は、図1−2に示される配列(配列番号2及び3)を有する。本発明の追加の受容体タンパク質はまた、上記のように、それらの配列の変異体も包含する。1つの好ましいフラグメントは、アミノ末端(Met1−Lys132)(配列番号24)を包含する。
【0030】
Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体、すなわちアンジオシジンは、癌組織、例えばメラノーマ細胞又は肺癌細胞に由来する。ドデシル硫酸ナトリウム ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)による受容体の分析は、それが非還元条件下で、50kDの見掛け分子量を有することを示す。いくつかの調製においては、100kD以上の分子量を有する少量のダイマーが観察される。還元条件下で、タンパク質は、50及び60kDの見掛け分子量を有する、密接して存在する2つの主要ポリペプチドバンドとして移動し、ここで50kD種は60kD種の変性又は修飾された形で存在する。これは、タンパク質が、ジスルフィド結合される場合、より密集した配置を仮定する2種の鎖間ジスルフィド−結合されたポリペプチド鎖から成る解釈と一致する。
【0031】
タンパク質は、インテグリン、ラミニン又はCD36に対する抗体と交差反応しない。Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体タンパク質、すなわちアンジオシジンは、それがガラクトース、マンノース及びグルコサミン特異的レクチンを結合するので、糖タンパク質である。精製された受容体タンパク質の高い260nm吸光度は、炭水化物の存在と一致する。
精製された生来のアンジオシジンタンパク質を特徴づけるために、インビトロでの受容体としての追加のその活性が研究された。受容体は、イオン依存性態様でトロンボスポンジンと相互作用するが、しかしフィブロネクチン(FN)又はウシ血清アルブミン(BSA)とは相互反応しない。
【0032】
アンジオシジンの使用
本発明のTSP−1受容体は、いくつかの態様で使用され得る。
(1)受容体に対する抗体又はリガンドが生成され得る。それらの抗体又はリガンドはトロンボスポンジンの効果を模倣するか、又はトロンボスポンジン活性を阻止するために受容体と相互作用することができる。
【0033】
(2)受容体配列の知識は、血液、生検又は他の組織において患者の受容体レベルを測定するために使用され得る。非侵入性腫瘍は、この受容体を発現しないか、又はわずかに低レベルで発現し、そして侵入性腫瘍は高レベルで受容体を発現する。受容体のレベルは、患者の診断又は予後を示す。これは、転移し、そして死亡を引き起こす侵入性表現型から、決して広がらない非侵入性腫瘍細胞を区別するであろう信頼できる腫瘍マーカーを提供するであろう。これは、悪性癌の検出及び処理を助けることができる。
【0034】
(3)受容体は、トロンボスポンジン活性を模倣するか又は阻害する薬剤を企画するために使用され得る。
(4)受容体又はそのフラグメントは、トロンボスポンジン活性の競争インヒビターとして患者に投与され得る。受容体の修飾された形が、受容体又はそのフラグメントの代わりに使用され得る。これに関する許容できるフラグメントは好ましくは、約10−5M〜10−10Mの親和性でTSP−1を結合する、TSP−1結合ドメイン又はこのドメインの修飾を含んで成る。
【0035】
(5)細胞毒性薬剤、ホルモン、造影剤、又は放射性成分が、癌処理又は他の治療への使用のために、受容体に向けられた抗体又はリガンド(標的化成分として作用する)に結合され得る。
(6)生物医学装置が、細胞表面、例えば血小板上のトロンボスポンジンのための受容体を担持する細胞を除去するために、受容体に対する抗体又は、受容体に対するリガンドにより被覆され得るか又はそれらに結合され得る。
【0036】
(7)受容体又はそのフラグメントは、腫瘍増殖を阻害し、腫瘍のサイズを低め又は腫瘍増殖を妨げるために使用され得る。
(8)受容体又はそのフラグメントは、脈管形成を妨げ、阻害し、又は逆転するために使用され得る。当業者は、本発明の受容体の他の使用を理解するであろう。
【0037】
それらの組成物のいずれかが、上記の治療有益性を提供するために、単独で作用することができる、その非毒性付加塩、アミド及びエステルと共に患者に投与され得る。そのような組成物はまた、生理学的に耐性の液体、ゲル又は固体希釈剤、アジュバント及び賦形剤と共に供給され得る。標準の製剤は当業者に知られている。好ましい投与態様は、静脈内、筋肉内及び皮下投与を包含する。もう1つの好ましい投与態様は、例えば標的化剤に組成物を連結することによって、身体の影響された部分に組成物を向けるであろう。他の投与態様のために適切である追加の製剤は、坐剤、鼻腔内エアロゾル及び多くの場合、経口製剤を包含する。
【0038】
例えば、本発明の抗体は、患者におけるトロンボスポンジン様活性を仲介することができる。多くの治療及び予防用途、例えば癌治療、アテローム硬化症、マラリア処理又は予防、血栓又は血栓崩壊状態、脈管形成又は細胞結合において、損なわれていないトロンボスポンジンの効果を阻害し、又は模倣することの生理学的効果を有する、本発明の抗体及びそれらを含む組成物を使用することができる。抗体はまた、診断試薬、治療剤又は他の化合物のキャリヤーとしても有用である。抗体はまた、生物医学装置においても使用され得る。
それらの抗体及び組成物は、例えば家畜及び牧畜に関しての獣医学的使用のために、及びヒトへの臨床学的使用のために、他の治療用抗体剤に類似する態様で、動物に投与され得る。
【0039】
いずれかの理論により結びつけられることを所望しないが、本発明の抗体は、生来のトロンボスポンジンに対するアゴニスト又はアンタゴニストとして作用すると思われる。それらの抗体はまた、スポロゾイト周囲(circumsporozoite)タンパク質、トロンボスポンジン関連の無名タンパク質及びプロパージン補体タンパク質に対するアゴニスト又はアンタゴニストとして作用するとも思われる。
【0040】
TSP−Tタイプ1反復体配列、例えばMETH−1及びMETH−2、及びタンパク質のADAMTS種類に属する関連タンパク質を含む他のリガンドは、アンジオシジンと相互作用することができる。Vasquez. F., METH−1, a Human Ortholog of ADAMTS−1, and METH−2 are Members of a New Family of Proteins with Angio−Inhibitory Activity, J. Biol. Chem. 274: 23349−23357 (1999)。受容体に向けられたリガンドは、抗体と同じ手段で使用され得る。受容体又はそのフラグメントはまた、トロンボスポンジンのための競争リガンドとしても投与され得る。受容体の変異体(すなわち、受容体の修飾された形)もまた、トロンボスポンジンのための競争リガンドとして投与され得る。
【0041】
多くのインビトロ及びインビボアッセイが、抗体がトロンボスポンジン様活性をもたらすことを示すために使用され得る。それらのアッセイは次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない:抗体−受容体結合アッセイ、細胞付着アッセイ、血小板凝集アッセイ及び細胞増殖アッセイ。高処理能力の結合アッセイが、トロンボスポンジン様結合により受容体に対する抗体をスクリーンするために使用され得る。受容体をプレートに付着することができ、ラベルされたTSP−1を結合することができ、試験されるべき化合物を添加することができ、そしてそれが受容体に対するTSP−1結合性を阻害するかどうかを決定することができる。下記に論じられるような他のアッセイが、試験されるべき抗体の機能的活性を決定するために使用され得る。
【0042】
転移:
転移は、血流又はリンパによる悪性腫瘍の細胞の移行におけるように、身体の1つの部分から、それに関連しないもう1つの部分への疾病の広がりである。転移は、内皮への腫瘍細胞の付着、内皮の収縮、基礎膜のマトリックス変性及び血流中への腫瘍細胞の侵入を包含するカスケード機構を通してもたらされると思われる。このカスケードにおけるいずれかの相での介入が、転移性癌の処理又は予防に有益であり得る。
【0043】
生来のトロンボスポンジン分子は、腫瘍細胞転移を増強することが示されている。Tuszynskiなど., Cancer Research, 47: 4130−4133 (1987)。トロンボスポンジン増強が生じる機構は、現在十分には理解されていない。
抗転移活性は、インビトロでメラノーマ細胞に結合する化合物の能力(Tuszynskiなど., Anal. Biol., 184: 189−91 (1990))、及びインビボで腫瘍コロニーのサイズ及び数を低める能力(Tuszynskiなど., Cancer Research, 47: 4130−4133 (1987))により特徴づけられる。
【0044】
受容体に向けられた抗体又はリガンドは、抗転移剤として有用であり、特に抗−肺転移剤として有用である。それらの剤は、転移性腫瘍細胞、特にトロンボスポンジンに対して応答性であるそれらの細胞の付着を阻害する。それらはまた、腫瘍コロニー数及び腫瘍コロニーサイズも低める。抗体及びリガンドの特定の利点は、長い循環性半減期である。
そのような抗転移活性が生じる多くの機構が存在する。抗体及びリガンドは、細胞毒性であり、又は細胞増殖を阻害することができる。細胞増殖のインヒビターとして、それらの剤は、1)有糸分裂を阻害し、2)脈管形成を阻害し、又は3)補足経路及び関連するキラー細胞を活性化するよう作用することができる。それらの機構は、受容体への抗体又はリガンドの結合により作用する。
【0045】
本発明の抗体及びリガンドはまた、生物医学的装置にも使用され得る。抗体及びリガンドは、転移性腫瘍細胞の結合を促進する能力を有するので、血液又はリンパからの循環性腫瘍細胞の除去をもたらす剤により生物医学的装置を被覆することが可能である。生物医学的装置は、肝癌又は他の癌を妨げるためにも有用である。
【0046】
抗体及びリガンドのもう1つの使用は、診断又は治療目的のために転移性腫瘍細胞に、毒素、薬剤、ホルモン、造影剤又は放射性成分を標的化するためのキャリヤーとしてである。それらのキャリヤーはまた、肝癌又は他の癌にも結合する。受容体自体又はそのフラグメント/変異体は、トロンボスポンジン活性を競争的に阻害するために使用され得る。特に、本発明は、TSP−1に対して向けられたリガンド又は抗体が放射性成分に結合される、癌を処理するための組成物及び方法を包含する。それはまた、TSP−1に対して向けられたリガンド又は抗体が放射性成分に結合されている、癌の放射性検出及び診断のための組成物及び方法も包含する。
【0047】
癌を処理し、検出し、そして診断するための放射性成分は、当業界において良く知られている。最後に、TSP−1に対して向けられたリガンド又は抗体がMRI増強剤に連結されている、癌の処理に対する治療応答のMRI検出、診断、及び定量化のための組成物及び方法を包含する。癌の治療応答を検出し、診断し、そして定量化するためのMRI増強剤は、当業界において良く知られており、そしてガドリニウム、マンガン、鉄、テクネチウム、GASTROGRAPHINTM, ISOVUETM, HEPATOLYTETM及びNEURULYTETM を包含するが、但しそれらだけには限定されない。他の許容できるMRI増強剤は、当業者に知られている。
【0048】
アテローム硬化症:
アテローム硬化症は、影響される部分の変性によりしばしば付随される、動脈の内壁上への小さな脂肪節の付着により特徴づけられる疾病状態である。
TSP−1受容体に対する抗体、TSP−1受容体に対するリガンド、又は受容体又はそのフラグメント/変異体の投与は、トロンボスポンジン活性を低め、そして動脈損傷の進行を阻害することができる。この結果は、高コレステロールの食事を与えられたウサギにおいて示された。
【0049】
糖尿病性網膜症:
糖尿病性網膜症においては、網膜における血管が損傷を受け、流体が漏れ又は出血し、網膜損傷を引き起こす。増殖性網膜症においては、新規のもろい血管が網膜の表面上で増殖する。それらの新規血管又は新生血管形成は、それらが破壊し、漏れ又はガラス体中に出血するので、重度の視力阻害を導く。ガラス体が血液により曇るので、光は眼を通して網膜に通過することを妨げられ、かすみ、又は視力をゆがめる。新規血管はまた、眼の裏から網膜を分離する瘢痕組織を引き起こし、網膜剥離を引き起こす。網膜剥離は失明を導く。最後に、異常血管が、虹彩上で増殖し、緑内障を導く。TSPは、糖尿病性網膜症における異常血管増殖においてある種の役割を演じると思われる。
【0050】
黄斑変性:
“湿潤”タイプの黄斑変性においては、異常血管(網膜下新生血管形成として知られている)が、網膜及び黄斑下で増殖する。次に、それらの新規血管が出血し、そして流体が漏れ、それにより黄斑の膨張又は隆起を引き起こし、従って中心視力を曲げ又は破壊する。それらの状況下で、視力低下が急速且つ重度になる。TSPは黄斑変性における異常血管増殖において役割を演じると思われる。
【0051】
マラリア:
マラリアは、赤血球において寄生し、そして感染された蚊により刺されることにより哺乳類に伝達される種々の原生動物(プラスモジウム属)のいずれかにより引き起こされる感染性疾病である。本発明の抗体、リガンド、又は受容体又はそのフラグメント/変異体が、細胞付着を阻止する治療剤として使用され得る。
それらの剤は、トロンボスポンジン活性を阻止し、そして従って、マラリアにより感染された赤血球細胞の内皮細胞への細胞付着、マラリアスポロゾイト認識及び肝細胞中への侵入、又はマラリアメロゾイト認識及び赤血球細胞中への侵入を阻害する。
【0052】
脈管形成:
脈管形成は、血管及びリンパ管の形成である。本発明の抗体、リガンド、及び受容体又はそのフラグメント/変異体は、脈管形成の調節、特に創傷治癒の増強、腫瘍増殖、糖尿病性網膜症、黄斑変性及びリウマチ様関節炎の阻害又は予防において有用である。標準の脈管形成アッセイは、当業界において良く知られている。
それらのアッセイは、種々の細胞系を用いての増殖及び移動研究、コラゲナーゼ阻害、及び鶏漿尿膜上でのインビボ新規血管形成(CAMアッセイ)を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【0053】
付着調節:
抗体、リガンド、及び受容体又はそのフラグメント/変異体は、細胞付着を調節し、そしてTSP−1受容体部位を含む細胞、例えば血小板へのTSP−1及び他のタンパク質の結合を阻害することができる。
【0054】
診断:
本発明の抗体及びリガンドは、種々のタイプの癌、例えば胃腸(胃、結腸及び直腸)癌、乳癌、肝癌及びメラノーマ(但し、それらだけには限定されない)についての診断/予後アッセイにおける試薬として有用である。TSP−1受容体のレベルは、患者に予後又は診断を提供するために使用され得る。受容体の配列のさらなる知識は、患者サンプルにおける受容体のレベルを決定するために直接的に使用され得る。
【0055】
キャリヤー:
細胞毒性薬剤、ホルモン、造影剤又は放射性成分が、癌又は他の治療への使用のために抗体又はリガンドに結合され得る。
【0056】
生物医学的装置:
生物医学的装置は、細胞表面上にトロンボスポンジンのための受容体を担持する細胞、例えば血小板を除去するために抗体又はリガンドにより被覆され又はそれらに結合され得る。
トロンボスポンジン受容体に対する適切なリガンドの同定
適切なリガンドは、トロンボスポンジンタンパク質、その変異体及びフラグメント(ペプチドCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)を包含する)、及び本発明の受容体に結合する他のペプチド又はタンパク質を包含する。
【0057】
そのようなリガンドは、ファージ表示ペプチドライブラリーキット、例えばNew England Biolabs (Beverly, MA) から入手できるキットを用いることによって開発され、そして同定され得る。ファージ表示は、選択技法を説明し、ここでペプチド又はタンパク質がバクテリオファージのコートタンパク質との融合体として発現され、ファージビリオンの外表面上に前記融合されたタンパク質の表示をもたらし、そして前記融合体をコードするDNAはビリオン内に存在する。
【0058】
ファージ表示は、個々の配列をコードするDNAへのランダムペプチド配列の莫大なライブラリー間での物理的結合を創造するために使用され得、バイオパンニングと呼ばれるインビトロ選択方法による種々の標的分子(受容体を包含する)ためのペプチドリガンドの急速な同定を可能にする。
【0059】
この技法は、標的受容体により被覆されたプレート(又はビーズ)と共にファージ表示されたペプチドのライブラリーをインキュベートし、結合されなかったファージを洗浄し、そして特異的に結合されたファージを溶出することによって行われる。次に、溶出されたファージが、増幅され、そして最も強い結合配列のためにファージのプールを連続的に富化するために、バイオパンニング及び増幅の追加のサイクルが取られる。3〜4サイクルの後、個々のクローンが、DNA配列決定及びELISAにより特徴づけられる。
【0060】
次に、ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドは、同定されたペプチド配列を含むタンパク質を同定するためにプローブとして使用され得る。次に、それらのタンパク質は、下記例に開示される結合技法のいずれかを用いて、受容体に対するそれらの結合能力について評価され得る。
【0061】
アンジオシジンの発現
アンジオシジン、又はそのフラグメント又は変異体のいずれかが、既知の発現システム、例えば哺乳類細胞系、昆虫細胞、酵母株及び細菌、例えばE.コリにおいて発現され得る。
哺乳類細胞系は、異種タンパク質の発現のためにいくつかの利点を提供する。哺乳類細胞において生成される真核タンパク質は、転写、翻訳、及び後翻訳修飾工程が高等真核生物間に保存されるので、機能的であろう。哺乳類細胞系は、構造体−機能アッセイを包含する種々の組換えタンパク質研究のために、及び細胞機能に対するタンパク質の生理学的効果の分析のために十分に適切にされる。
【0062】
昆虫細胞は、組換えタンパク質の発現のための卓越した宿主である。それらはしばしば、高等真核生物として、それらは哺乳類細胞に類似する後翻訳修飾を行うが、しかし早く増殖し、そしてCO2インキュベーターを必要としないので、タンパク質生成のために選択される。さらに、昆虫細胞は、大規模発現のための懸濁培養に容易に適合され得る。
【0063】
種々の酵母株は、真核タンパク質の発現及び分析のために非常に有用であることがわかっている。酵母は、遺伝子的に十分に特徴づけられており、そして多くの哺乳類−様後翻訳修飾を行うことが知られている。それらの単細胞真核生物は、定義された培地においてすばやく増殖し、哺乳類細胞によりも、研究するのに容易で且つ安価であり、そして発酵に容易に適合される。従って、酵母発現系は、組換え真核タンパク質の大規模生成のために理想的に適合される。
【0064】
E.コリにおける組換えタンパク質の発現は、早く且つしばしば、高い収率をもたらす。しかしながら、細菌はタンパク質を糖化せず、又はタンパク質を最適に折りたたまないので、細菌系は、最適に活性的なタンパク質を生成することができない。それにもかかわらず、細菌発現システムは、しばしば、それらの使用の容易さのために好ましい。
【0065】
〔実施例〕
次の例は、単なる例示目的のためであって、そして本発明の範囲を制限するものではない。組換えアンジオシジンを用いる例においては、配列番号2に提供される配列を使用した。それにもかかわらず、配列番号3で提供される配列、及び両配列の変異体及びフラグメントは、本発明において効果的に十分に作用する。
【0066】
例1:受容体の精製
細胞からのCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体のタンパク質の精製は、次の2つの基本的段階を含んで成る:細胞の調製、及び親和性クロマトグラフィーによる受容体の精製。好ましい細胞源は、マウスメラノーマ細胞、及び容易に入手できるヒト肺癌細胞を包含した。培養された細胞は、ほとんどの組織源に比較して、比較的少ないプロテアーゼを有する追加の利点を有する。これは、活性受容体タンパク質の安定化及び精製を促進する。
【0067】
細胞抽出物を調製し、そして受容体がCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)ペプチドに結合するであろう条件下で、固定されたCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)ペプチドを含むクロマトグラフィーカラムに通した。次に、Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体を、カラムから、精製された形で溶出する。
【0068】
特に、細胞抽出物を、約4.0×107個のB16−F10マウスメラノーマ細胞又はA549ヒト肺癌細胞から、5mlの結合緩衝液(10mMのトリス−HCl, pH7.5, 0.5%の(NON−PRECEDENTIAL)−40洗浄剤、1mMのCaCl2, 1mMのMgCl2, 100μMのロイペプチン、1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)、10μg/mlのアプロチニン)に前記細胞ペレットを溶解することによって調製した。溶解されなかった材料は、40℃で20分間、4,000×gで遠心分離することによって、サンプルから除去された。
【0069】
Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)親和性カラムを、HEPES緩衝溶液(pH7.35)により平衡化された、1mlのCN−活性化されたセファロースに結合された、4mgのCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)を含む5mlカラムを充填することによって構成した。非特異的に吸着されたタンパク質を、50mlの結合緩衝液によりカラムを洗浄することによって、カラムから除去した。特異的に吸着されたタンパク質を、0.10Mのトリス−HCl, pH10.2, 0.05%の(NON−PRECEDENTIAL)−40洗浄剤、1mMのCaCl2, 1mMのMgCl2, 100μMのロイペプチン、1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)、10μg/mlのアプロチニンの緩衝液により溶出した。
【0070】
10mlの画分を、トリスを中和するために700μlの1NのHClを含む管に集めた。管におけるピーク画分を、アニオン交換カラム緩衝液(20mMのトリスHCl、pH8.0、5mMのオクチルグルコシド)により平衡化されたアニオン交換カラム(Mono Q, Pharmacia)に適用した。結合された材料を、NaCl(100%の1MのNaCl)のグラジエント20mlにより溶出し、そしてカラムを280及び260nmでモニターした。結合された材料は通常、0.3MのNaClで溶出し始め、そしてグラジエントを維持し、タンパク質を溶出し、260nmで高い吸光度を有する単一の相同ピークを生成した。
【0071】
溶出された画分及び結合されなかった画分を濃縮し、そしてその濃縮された材料を、8%ポリアクリルアミドゲル上でのSDS−ゲル上で分析し、そして標準技法を用いてクーマシーブルー染色により可視化した。ピーク画分を、図4(レーン1及び2)に示されるように、50kDの見掛け分子量を有する主要バンドとして、非還元条件下で、及び50及び60kDの2つのポリペプチドバンドとして、還元条件(5%のβ−メルカプトエタノール)下で、SDS−ゲル電気泳動に基づいて分析した。
【0072】
約100μgのタンパク質を、1×107個の細胞から回収した。Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体を、Karczewskiなど., J. Biol. Chem. 264: 21322−6 (1989) の標準方法を用いて、125Iによりラベルした。手短には、100μlのオクチルグルコシド緩衝液に溶解された、12μg の精製されたタンパク質を、1つのヨードビーズと共に5分間インキュベートした。反応されなかったヨウ化物を、Tuszynski など., Anal. Biochem. 106: 118−122 (1980) により記載されたように、オクチルグルコシド緩衝液により平衡化されたSephadex G−25の小カラム上で除去した。
【0073】
典型的な実験により得られたタンパク質の比活性は、104cpm/μgであった。SDS−ゲル電気泳動、続くオートラジオグラフィーによる、ラベルされた材料の分析は、還元条件下で、60kDの分子量のポリペプチドバンドが有力であったことを示した。このラベルされた材料のオートラジオグラムは、図4、レーン3及び4に示される。
【0074】
例2:Cys − Ser − Val − Thr − Cys − Gly (配列番号1)−特異的 TSP −1受容体 cDNA の分子クローニング及び配列分析
抗体又はオリゴヌクレオチドプローブ及びDNAライブラリーの調製、及び抗体又は核酸ハイブリダイゼーションによるそれらのスクリーニングのための基本的手段は、当業者に良く知られている。たとえばDNA Cloning: Volume I (D.M. Glover ed. 1985); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames and S.J. Higgins eds. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gate ed. 1984); T. Manietis, E.F. Frisch & J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) を参照のこと。それらの既知方法は、本発明の受容体をクローニングし、そして配列決定するために使用された。
【0075】
A549ヒト肺癌から単離された受容体に対するポリクローナル抗血清を用いて、Drs. Mark Steams and Min Wang, MCP−Hahnemann University により供給されるλUni−ZAP (Stratagene, La Jolla, CA) 前立腺癌細胞(PC3−NI)ライブラリーをスクリーンした。約200,000のプラークを、PicoBlue Immunostaining キット(Stratagene, La Jolla, CA)により提供される方法に従って、ファージ及び細菌により吸着された抗−受容体抗血清の1:1000希釈溶液によりスクリーンした。
【0076】
4個の抗体陽性プラークを単離し、そしてクローン化し、そしてファーゲミドを、ExAssist Interference−Resistant Helper phage プロトコール(Stratagene, La Jolla, CA)を用いて、XL1ブルー細菌に移した。プラスミドDNAを、Wizard plus miniprep (Promega, Madison, WI)を用いて精製し、そしてSequenaseバージョン2.0 (U.S. Biochemical Corp.)を用いて、ジデオキシ鎖終結方法により設定されたT7/T3プライマーを用いて配列決定した。その得られる配列は、図1及び2(配列番号2及び3)に見出され得る。それらの2種の受容体についてのDNA配列の比較は、図3(配列番号4及び5)に見出され得る。
【0077】
例3:組換えアンジオシジンの発現
PBK−CMVプロモーターを含むXL1−ブルー細菌においてサブクローン化された十分な長さの受容体cDNAを、分子生物学における現在のプロトコールに記載のようにして、IPTG(イソプロピル−b−D−チオガラクトピラノシド)によりタンパク質を発現するために誘発した。細菌を、B−Per Bacterial Protein Extraction Reagent (Pierce Chemical Co. Rockfort, Ill) により溶解した。
【0078】
組換え受容体はまた、他の細菌、バキュロウィルス及び哺乳類細菌(例えば、COS細菌)発現システムにおいて発現することができる。当業者は、細菌がタンパク質を糖化せず、又はタンパク質を最適に折りたたまないので、細菌システムは最適な活性タンパク質を生成することができないことを知っている。しかしながら、バキュロウィルス発現システムは、多量の発現されたタンパク質を生成し、そしてこのシステムはまた、多くの後−翻訳修飾、例えば糖化、折りたたみ、リン酸化及び分泌を実施することもできる。
【0079】
受容体cDNAを、バキュロウィルストランスファーベクター中に挿入することができる(MaxBac 2.0キット+pBlueBacHis2 Xpress キット、Invitrogen, Carlsbad, CA)。組換えウィルスを3度、精製し、そして血清フリーの培地においてSf11細胞により生成される受容体の量を、ウェスターンブロットにより推定することができる。さらに、受容体を、pcDNA3.1/Hisベクター(Invitrogen)を用いて、COS細胞発現システムにおいて発現することができる。これは、COS細胞が受容体cDNAによりトランスフェクトされ、そしてCMVプロモーター構造体を用いてタンパク質を発現するために誘発され得る哺乳類発現システムである。COS細胞は、種々の方法、例えばリポフェクチンを用いて、容易にトランスフェクトすることができる。
【0080】
例4:His −標識された組換えアンジオシジンの発現及び精製
アミノ末端に結合された6個のヒスチジン残基を含む組換え受容体を、発現タンパク質発現システム(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて調製した。PBK−CMVベクターにクローン化された十分な長さのcDNAを鋳型として使用し、His標識ベクターpTrcHISA中へのDNAの連結を可能にする正しい制限部位を含むPCR生成物を生成した。
【0081】
これは、それぞれBgl II及びEco RI制限部位を含む、前方向プライマーGGG AGA TCT ATG GTG TTG GAA AGC ACT(配列番号12)及び逆方向プライマーGGG GAA TTC TCA CTT CTT GTC TTC CTC(配列番号13)を用いて、rTth DNAポリメラーゼ、XL(Perkin Elmer, Foster City, CA)によるPCRにより達成された。得られる1.1kbの生成物は、T4 DNAリガーゼを用いて、Bam H1 及びEcoR1により消化されたベクター中に連結される、5’末端でBgl II制限部位及び3’末端でEcoR1部位を含んだ。
【0082】
例5:組換えアンジオシジンへの Cys − Ser − Val − Thr − Cys − Gly (配列番号1)の結合
受容体cDNA挿入体及び空のベクター対照、並びに精製されたHis−標識組換え受容体を含む細菌溶解物を、還元及び非還元条件下でSDS−PAGEにより分析した。ゲルをニトロセルロース紙上に電気ブロットし、そしてブロットを、図5に示されるように、室温で1時間、1%BSAにより阻止した。
【0083】
ウェスターンブロットのために、膜を、TBS−Tween(0.05%のTween−20TM を含むトリス−緩衝溶液)中、1:2000の受容体抗体血清により2時間、処理し、TBS−Tweenにより洗浄し、1:15,000のホースラディシュペルオキシダーゼ−接合された抗−ウサギIgGにより1時間プローブし、洗浄し、そして次に、図5に示されるようにして、ECL(Enhanced Chemiluminescence)、Amersham, Arlington Heights, ILにより示した。
【0084】
リガンドブロットのために、膜を、室温で1時間、ビオチニルされたTSP−1(5μg/ml)又はビオチニル化されたCys (Acm)−Ser−Val−Thr−Cys(Acm)−Gly(配列番号6)(5μg/ml)により処理し、TBS−Tweenにより洗浄し、1:2000のホースラディシュペルオキシダーゼ−アビジンにより1時間プローブし、洗浄し、そして次に、図6に示されるように、ECL(Enhanced Chemiluminescence), Amersham, Arlington Heights, ILにより示した。
【0085】
TSP−1及びCys (Acm)−Ser−Val−Thr−Cys(Acm)−Gly(配列番号6)の両者を、Pierce タンパク質ビオチニル化プロトコール(EZ−Link Sulto−NHS−LC−Biotin, Pierce Chemical Co. Rockfort, Ill)を用いてビオチニル化した。反応しなかったビオチンは、透析により除去された。
【0086】
例6:TSP −1への変性されていないアンジオシジン結合の評価
TSP−1への変性されていない(上記のリガンドブロットプロトコールにおいて、受容体はSDSにより変性される)組換え受容体の結合を、Affinity Sensor System, Cambridge, UKを用いて評価した。それは、リガンド又は受容体のいずれかが共有結合されているキュベットを用いる光学結合方法である。レーザー線を用いて、タンパク質−誘導体化されたキュベット表面に結合されるタンパク質を検出する。この方法は非常に敏感であり、そしてリガンド受容体相互作用のための会合及び解離速度定数の両者を測定する。この計測器は、受容体の1つの分子がTSP−1の1つの分子を結合することを想定し、そして次の関係に従って、解離定数(KD)を計算する:
【0087】
1)平衡でのkass [R] [TSP−1]=kdiss [R−TSP−1], ここでkassは会合のための2次速度定数であり、そしてkdissは解離のための1次速度定数であり;
2)KD=[R] [TSP−1]/[R−TSP−1]=kdiss/kass;
3)[R−TSP−1]l=[R=TSP−1]eq [1−exp (−kont)], ここでアーク秒での計測器応答測定は、受容体−TSP−1複合体R−TSP−1に比例し;
4)kon=kass [L] +kdiss、ここでkonは受容体TSP−1相互作用のための擬似−1次速度定数である。
【0088】
約1μgのTSP−1を、キュベット表面上のCOOH基側のそのアミノ基を通してキュベットに結合した。次に、キュベット表面上の未反応基を、エタノールアミン及びアルブミンにより阻止した。HEPE緩衝溶液(pH7.00)における189nM以上の濃度での受容体は、7分後、飽和できる結合を示し、そして結合が緩衝液により部分的に解離され、又は図7に示されるように、解離のための擬似−1次速度定数−対−受容体の濃度のプロットから計算した。図8に示される、計測器応答−対−時間読み取り(ここで、計測器応答は受容体−TSP−1複合体の濃度に比例する)を用いて、図7上のデータ点をプロットした。
【0089】
緩衝液への洗浄剤Tween20の添加は、特異的結合と一致する結合を変更しなかった。さらに、10倍モル過剰のCys (Acm)−Ser−Val−Thr−Cys(Acm)−Gly(配列番号6)、すなわちTSP−1タイプ1反復体ドメインの存在下での受容体結合の程度は、緩衝液対照の47%であり、ところが10倍モル過剰のスクランブルペプチド、すなわちVal−Cys(Acm)−Thr−Gly−Ser−Cys(Acm)(配列番号7)は、緩衝液対照の88%であり、このことは、結合がCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)配列を含むペプチドと部分的に競争できることを示唆する。それらの結果は、TSP−1を結合するタンパク質のクローニングを示す。
【0090】
例7:固定された TSP −1へのアンジオシジン及びペプチド結合の評価
例6に示される方法に従った。但し、TSP−1をキュベット上に固定し、そして次の溶液の1つを添加した:受容体のみ、ペプチド+受容体(ペプチド:受容体、1000モル比及び100モル比)。使用されるペプチドは、次のものであった:Val−Cys−His−Ser−Lys−Thr−Arg(配列番号8)、Val−Cys(Acm)−His−Ser−Lys−Thr−Arg(配列番号9)及びPro−His−Ser−Arg−Asn(配列番号10)。最初の2種のペプチドは受容体の結合部分に由来し、ここでそれは、TSP−1タンパク質のCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)部分と相互反応する。第3のペプチドは対照である。
【0091】
図9は、ペプチドVal−Cys−His−Ser−Lys−Thr−Arg(配列番号8)が、TSPに結合し、そして受容体の結合を競争的に阻害することによって、固定されたTSP−1による受容体の結合を阻害することを示す。この相互作用は、異なったモル比のペプチド:受容体を比較することによって見出されるように、濃度と相互関係する。
【0092】
さらに、図10は、キュベットに固定されたTSP−1への受容体−由来のペプチドの直接的な結合を示す。正の対照として受容体及び負の対照としてPro−His−Ser−Arg−Asn(配列番号10)を用いれば、ペプチドVal−Cys−His−Ser−Lys−Thr−Arg(配列番号8)及びVal−Cys(Acm)−His−Ser−Lys−Thr−Arg(配列番号9)が固定されたTSP−1に直接的に結合することが見出され得る。
それらの図は、本発明の受容体上のVal−Cys−His−Ser−Lys−Thr−Arg(配列番号8)領域がTSP−1タンパク質に結合することを示す。
【0093】
例8:固定された TSP −1及び C(Acm) SVTC (Acm) G ( 配列番号6 ) へのアンジオシジン結合の評価
例6に示される方法に従った。但し、TSP−1及びCys (Acm)−Ser−Val−Thr−Cys(Acm)−Gly(配列番号6)をキュベット上に固定し、そして受容体をキュベットに添加した。ペプチドのAcm部分を用いて、実験におけるその安定性を高めた。
図11は、TSP−1及びペプチドの両者が受容体に結合することを示す。これは、TSP−1のCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)領域が受容体に結合することを示す。
【0094】
例9:アンジオシジンの表面標識
損なわれていない、増殖性のA549肺癌細胞を、Tuszynskiなど., Anal. Biochem. 106: 118−122 (1980) により記載のようにして、ラクトペルオキシダーゼを用いて、125I−ヨウ素により表面標識した。手短には、細胞のほぼ集密性単層を含む75mmフラスコを、10mlのDMEMにより3度すすいだ。次に、細胞層を、0.2単位/mlのラクトペルオキシダーゼ500μCiの125I−ヨウ素を含むDMEM5mlにより被覆した。30%H2O2の5個の1μアリコートを、1分間隔で、軽く混合しながら添加した。次に、反応を、5μlの1mMのNaN3の添加により停止し、単層をDMEMにより3度洗浄し、そして、細胞をCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)結合タンパク質の精製のために収穫した。
【0095】
標識された材料のSDS−ゲル電気泳動、続くオートラジオグラフィーによる分析は、インビトロヨウ素化により標識される、非還元条件下での分子量50,000のポリペプチドが標識されたことを示した(図4、レーン5)。
受容体は、60分後、時間−無関係になる時間−依存性態様でTSP−1を結合した。結合は、1mMのCaCl2及び1mMのMgCl2の存在下で最大であり、そして少量ではあるが、しかし有意な量の結合が1mMのEDTAの存在下で生じた。この例は、受容体及びTSP−1が時間−依存性態様で結合すると共に、また、受容体が細胞の表面上で発現されることも示す。
【0096】
例 10:アンジオシジンの免疫組織化学
図12は、乳癌における受容体の局在性を示す。この腫瘍は、図の右側の2種の島と共に、図の中央に大きな垂直のストライプに位置する。右及び左側に位置するより小さな細胞は炎症性細胞であり、そして大きな白色細胞は脂肪組織である。比較のために、一群の正常な乳管が図の低部左側のコーナーに示される。
【0097】
組織を、冷95%エチルアルコールに10分間、固定し、そしてパラフィンにより包埋した。切片(5μm)を切断し、ガラス顕微鏡スライド上に固定した。スライドからパラフィンを除去し、そして等級化されたキシレン−エタノール溶液における連続的なインキュベーションにより再水和化した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、3%H2O2による5分間の処理、続く水洗浄により停止した。次にスライドをリン酸緩衝溶液(PBS)により洗浄し、そして0.1%BSAを含むPBS(PBS−BSA)中、一次IgG(免疫又は非免疫IgGのいずれか)の5〜20μg/ml溶液により30分間、処理した。
【0098】
PBS−BSAでの洗浄の後、スライドを、ビオチニル化された二次抗体の1:250希釈溶液により30分間、処理し、洗浄し、そしてVectastain ABC
【0099】
Immunoyeroxidase Stainlng kit, Vector Laboratories (Burlingame), (A)により提供される方法にしたがって展開した。次に、スライドを、ヘマトキシリンにより対比染色し、カバーガラスにより固定し、そして明るい視野の顕微鏡により試験した。
染色された受容体は、腫瘍細胞の境界近くで可視化され得るが、しかし低部左側のコーナーにおける正常細胞近くでは可視化され得ない。これは、受容体が細胞膜に関係し、そして受容体が腫瘍細胞においてより濃縮されることを示す。
【0100】
例 11:過渡的トランスフェクション及び細胞付着アッセイ
ウシ大動脈内皮細胞(BAEC)及びMDA−MB−231細胞、すなわち乳癌細胞を、Wizard Plus kit (Promega, WI) により、受容体をコードする精製されたDNAによりトランスフェクトした。DNAを、Superfect トランスフェクション試薬(Qiagen, CA)を用いて、細胞中に組み込む。細胞を6のウェルプレートにプレートし、そして80%の集密性に基づいて、トランスフェクションを行う。試薬12μlを、2.5μgのDNAと共に、0.1μg/μlの最小濃度で使用した。Superfect−DNA複合体形成を、血清フリー及び抗生物質フリーの培地いおいて行った。細胞を37℃で3〜4時間インキュベートした。次に、培地を交換し、そしてトランスフェクションの48時間後、それらを付着アッセイのために収穫した。
【0101】
付着アッセイに関しては、96ウェルにプレート中の二重のウェルをTSP−1(40μg/ml)、フィブロネクチン(40μg/ml)又は/及び1%ウシ血清アルブミン(BSA)により被覆した。ウェルを一晩乾燥せしめ、そして次にBSAにより阻止した。2×105個の細胞を含む懸濁液100μlを、タンパク質被覆されたウェルにプレートし、そして37℃で20分〜1時間インキュベートした。非付着性細胞を回収し、そしてウェルをHepes緩衝液により洗浄した。付着細胞を、2.5%のグルタルアルデヒドにより10分間、固定し、そして0.2%Giemsaにより染色した。その染色を洗浄し、そして細胞を1mm2の区画から計数した。BSAに付着する細胞をバックグラウンドとして見なし、そしてフィブロネクチンに付着する細胞は正の対照であった。それらのデータは、図13に示される。
【0102】
例 12:一時的トランスフェクション及び細胞付着アッセイ
例11の方法に従った。但し、受容体ペプチドVal−Cys−His−Ser−Lys−Thr−Arg(配列番号8)及びVal−Cys(Acm)−His−Ser−Lys−Thr−Arg(配列番号11)をプレート上に固定した。TSP−1及びフィブロネクチン、並びに負の対照ペプチド[Ala−Ser−Val−Thr−Ala−Arg(配列番号11)及びPro−His−Ser−Arg−Asn(配列番号10)]及びウシ血清アルブミンを、プレート上に固定した。この実験の結果(図14)は、受容体ペプチドが、正の対照フィブロネクチン及びTSP−1への類似する親和性を伴って、プレートへの前記細胞の付着を引き起こすことを示す。これは、もう1つのタンパク質がTSP−1及びその受容体に関連し、又は受容体が開放され、そしてもう1つのタンパク質により細胞の膜に再結合される理論についての支持を提供する。
【0103】
例 13:一時的トランスフェクション及び細胞付着アッセイ
例12の方法にしたがって。但し、全受容体タンパク質をプレート上に固定し、そしてTSP−1 cDNA又はベクター対照のいずれかによりトランスフェクトされた細胞をプレートに適用した。天然においては、低レベルのTSP−1を発現する細胞をトランスフェクトし、タンパク質を過剰発現した。図15は、TSP−1 cDNAによりトランスフェクトされた細胞が対照細胞系よりも受容体タンパク質を有するプレートに、より結合したことを示す(2.5倍良好に、p<0.001)。フィブロネクチン及びBSAを、細胞付着のために、それぞれ、正及び負の対照として使用した。この証拠は、本発明の受容体がトロンボスポンジンに結合する理論を支持する。
【0104】
この特定の相互作用を、抗−TSP−1抗体、すなわちCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)、及び対照IgGを前記システムに添加することによって確かめた。図16は、抗−TSP−1及び抗−Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)抗体の両者がプレートに結合される受容体へのTSP−1発現細胞の付着を阻害したことを示す。
【0105】
さらに、付着システムへの溶液における結合されなかった受容体の添加は、プレートへの細胞の付着を低めた。図17は、受容体自体が、プレートに結合される受容体への、トランスフェクトされなかった、天然においてTSP−1を発現する細胞の付着を競争的に阻害することを示し、このことは、これが付着を引き起こす相互作用であることを示すことを助ける。
【0106】
例 14:アンジオシジン、すなわち TSP −1受容体に対する抗体の生成
生来又は合成(組換え)Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体タンパク質を用いて、抗体、すなわちポリクローナル及びモノクローナル抗体を生成することができる。ポリクローナル抗体が所望される場合、精製された受容体タンパク質を用いて、選択された哺乳類(例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、等)を免疫化し、そしてその免疫化された動物からの血清を集め、そして既知方法に従って処理した。
【0107】
受容体タンパク質の他に、種々の抗原に対するポリクローナル抗体を含む組成物は、受容体が結合されているカラムに組成物を通すことによって、抗−受容体タンパク質抗体でない抗体を実質的に有さないようにされ得る。洗浄した後、受容体に対するポリクローナル抗体をカラムから溶出する。モノクローナル抗−受容体タンパク質はまた、当業者により容易に生成され得る。
【0108】
ハイブリドーマーによりモノクローナル抗体を製造するための一般的な方法は、良く知られている。不滅の抗体−生成細胞系はまた、融合以外の技法、たとえば腫瘍DNAによるBリンパ球の直接的形質転換、又はEpstein−Barrウィルスによるトランスフェクションにより創造され得る。例えば、M. Schreier など., “Hybridoma Techniques” (1980): Hammerling など.,” Monoclonal Antibodies and T−Cell Hybridamas” (1981); Kennett など., “Monoclonal Antibodies” (1980) を参照のこと。
【0109】
モノクローナル抗体の生成のために不滅化されたB−細胞源の免疫化において抗原としてTSP−1受容体タンパク質(生来又は合成)を用いることによって、受容体タンパク質分子上の異なった部位でのエピトープを認識する一連のモノクローナル抗体を得ることができる。受容体タンパク質の結合領域におけるエピトープを認識する抗体は、抗体とTSP−1との間での競争アッセイにおいて容易に同定され得る。そのような抗体は、それらがTSP−1ペプチド結合に関連する生理学的応答を刺激しないで、インビボでその受容体へのTSP−1の結合を阻止できる場合、治療可能性を有する。
【0110】
特に、ポリクローナルCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体抗血清を、3〜4週ごとに、4回の50μgの注射の後、標準方法によりウサギにおいて生ぜしめた。第1回の注射は、完全フロイントアジュバントと共に与えられ、そして続く注射は不完全フロイントアジュバントと共に投与された。抗体力価及び特異性を、ELISAにより決定した。生来の精製された受容体をこの例に使用した。
【0111】
ELISAアッセイを、標準方法に従って行った。手短には、マイクロタイタープレートを、2μgのCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体、フィブロネクチン又はBSAにより被覆し、そして1%BSAにより1時間、阻止した。ウェルを、150mMのNaCl及び0.05%のTween−20を含む、10mMのリン酸緩衝液(pH7.4)(PBS−T)中、第1抗体の種々の希釈溶液50μlと共に1時間インキュベートした。
【0112】
次に、ウェルを、PBS−Tにより3度、洗浄し、そしてアルカリホスファターゼ結合されたウサギ抗−ヤギIgGのPBS−Tにおける1:800希釈溶液50μlと共に1時間インキュベートした。ウェルをPBS−Tにより3度洗浄し、続いて、Tween−20を含まないPBS−T緩衝液により3度洗浄し、そして50μlのアルカリホスファターゼ基質溶液(0.10Mのグリシン中、1mg/mlのP−ニトロフェニルホスフェート、pH10.4、1mMのZnCl2及び1mMのMgCl2)により処理した。30分後、色彩進行を、1NのNaOH5μlの添加により停止し、そして吸光度を405nmで決定した。
抗体は、表1に示されるように、直接的なELISAにより決定される場合、単一特異的であった。
【0113】
【表1】
【0114】
例 15:抗体による付着阻害
次の実験を行い、TSP−1への癌細胞の付着を阻害する抗−Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体抗体の能力を決定した。A549肺癌は、トロンボスポンジン受容体タンパク質を発現する。分離できるマイクロタイターウェル(Immulon 4 Removawall)を、50μlのTSP−1(40μg/ml)、フィブロネクチン、又は20mMのビス−トリス−プロパン緩衝液(pH6.5)中、ラミニン溶液のいずれかにより、4℃で一晩被覆し、そして200μlの1%BSAにより1時間、阻止した。A549細胞、及び抗−Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体又は非免疫抗血清のための200μg/mlのIgGを、30分間インキュベートし、そして遠心分離し、結合されなかった抗体を除去した。
【0115】
ペレットを、DMEMに再懸濁し、そして細胞を37℃で60分間、タンパク質−被覆されたウェルにおいてインキュベートした。マイクロタイターウェル表面に付着する細胞の数を計数した。表2における結果は、非−免疫IgG−処理された付着細胞の%として表される。表2は、抗−Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体抗体が、TSP−1−被覆された表面へのA549細胞付着を阻害するが、しかしフィブロネクチン又はラミニンへの細胞付着に対する効果を有さなかった。抗体はまた、組織培養プラスチックへのTSP−1の付着も阻害した。
【0116】
【表2】
【0117】
例 16:脈管形成に対するアンジオシジンの効果
脈管形成に対するアンジオシジンの効果を評価するための実験を行った。ウシ大動脈内皮細胞(BAEC)を、コラーゲンマトリックス上にプレートした。次に、細胞をコラーゲンにより積層した。アンジオシジン(37μg/ml)を、処理プレートにおける細胞の上部に添加し、そして対照プレートは緩衝液のみを受けた。24時間後、相対比顕微鏡写真(200倍)を取った。結果は図18に示される。対照プレートにおいては、BAEC細胞が、毛細血管網中に再配置した。しかしながら、アンジオシジンにより処理されたプレートにおいては、毛細血管は形成せず、そして細胞は死滅したように思えた。
【0118】
このコラーゲンアッセイは、脈管形成のための十分に認識されたモデルである。Qian など., Thrombospondin−1 modulates angiogenesis in vitro by up−regulation of matrix metalloproteinase−9 in endothelial cells, Exp. Cell Res. 235: 403−412 (1997)。それらの結果は、アンジオシジンが脈管形成の効果的インヒビターであることを示す。
【0119】
例 17:毛細血管安定性に対するアンジオシジンの効果
この例における実験は、例16における通りに行われた。しかしながら、処理は最初に細胞に対して行われなかった。24時間後、毛細血管が両サンプルにおいて形成し、そして図19における対照プレートに類似するように見えた。次に、緩衝液及びアンジオシジンを、それぞれ対照及び処理プレートに添加した。さらに24時間後、Hoffman干渉顕微鏡写真を取った。ここで、対照は影響を及ぼされなかった。しかしながら、アンジオシジンの添加は、処理プレートにおいてすでに形成した毛細血管を破壊した。結果は、図19に示される。これは、アンジオシジンが脈管形成を妨げるのみならず、また血管の形成を逆転せしめたことを示す。
【0120】
例 18:ウシ大動脈内皮細胞の形態学に対するアンジオシジンの効果
この実験においては、単層培養物におけるBAEC細胞を、上昇する濃度のアンジオシジン(対照=ナシ、0.37μg/ml, 3.7μg/ml, 37μg/ml)の存在下で、1%BSAを含む血清フリーの培地において24時間プレートした。Hoffman干渉顕微鏡写真機(100倍)を用いて、細胞の写真を取った。アンジオシジンの濃度の上昇につれて、BAEC細胞は細長くなり、プレートから分離し、凝集し、そして死滅した。結果は、図20に示される。
【0121】
例 19:細胞生存性に対するアンジオシジンの効果
ウシ大動脈内皮細胞(BAEC)、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)、繊維芽細胞、A549ヒト肺癌細胞(A549)、MDA−MB231ヒト乳癌細胞(MB231)、MCF7ヒト乳癌細胞(MCF7)を、37μg/mlの受容体、又は緩衝液のみにより、24時間、処理した。細胞の生存性を、ALAMAR BLUETM 染料を代謝する細胞の能力を測定するALAMAR BLUETM アッセイを用いて測定した。ALAMAR BLUETM アッセイ(Biosource International, Camarillo, CAから入手できる)は、細胞の増殖を定量的に測定し、そして化学剤の相対的細胞毒性を確立することができる。
【0122】
このアッセイは、代謝活性の検出に基づいての蛍光比色/比色定量増殖インジケーターを組み込んでいる。このシステムは、細胞増殖に起因する増殖培地の化学的還元に応答して、蛍光を発し、そして色彩を変える酸化−還元(レドックス)インジケーターを組み込んでいる。これは、その酸化された、非蛍光の青色形から、その還元された、蛍光の赤色形へのレドックスインジケーターの変化を引き起こす。データは、蛍光に基づく計測(530〜560nmの励起波長及び590nmの発光波長)、又は吸光度に基づく計測(570及び600nm)のいずれかを用いて集められ得る。
【0123】
BAEC及びHUVEC細胞系は、受容体の存在下で低められた生存性を有し、このことは、TSPが、図21に示されるように、それらの細胞系における生存性のための必要条件であることを示唆する。内皮細胞生存性は、アンジオシジンによる処理細胞の後、70〜80%低められる。有意な差異は、線維芽細胞、A549, MB231及びMCF7細胞系においては見出されず、このことは、TSPがそれらの細胞の生存性のための必要条件ではないことを示唆する。
【0124】
例 20:ウシ大動脈内皮細胞( BAEC )及びウシ平滑筋細胞( BSM )の生存性に対するアンジオシジンの効果
BAEC及びBSM細胞を、上昇する濃度のアンジオシジン(0, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 15, 26及び37μg/ml)により24時間、処理した。細胞生存性を、ALAMAR BLUETM アッセイを用いて測定した。アンジオシジンは、BAEC細胞生存性の用量依存性阻害性を有し、図22に示されるように、1次の単一定数の指数破壊曲線を示す。対照的に、BSM細胞は影響を受けていない。
【0125】
同様に、BAEC細胞の生存性に対する受容体の効果を、同じ方法を用いて、マウスLewis肺癌細胞と比較した。アンジオシジンは、BAEC細胞の生存性を低めるが、しかし図23の示されるように、Lewis 肺細胞には影響を及ぼさない。これは、アンジオシジンがLewis肺細胞の生存性を直接的に影響を及ぼさないことを示す。同じ実験を、HUVEC細胞に対して行い、そしてアンジオシジンはそれらの生存性を低めた。結果は図24に示される。
【0126】
例 21:ヒト臍静脈内皮細胞の生存性に対するアンジオシジンの効果
HUVEC細胞生存性に対するアンジオシジンの効果を評価し、そしてFGF及びTSP−1を添加し、それらが細胞生存性に対するアンジオシジン効果を改善するかどうかを決定した。FGF(線維芽細胞増殖因子)は、細胞増殖を促進する内皮細胞ミトゲンである。FGF(2ng/ml)及びTSP−1(20μg/ml)の両者は単独で、対照以上に細胞増殖を刺激した。しかしながら、FGF又はTSP−1のいずれの添加も、アンジオシジン(37μg/ml)の阻害を逆転しなかった。結果は図25に示される。TSP−1は、アンジオシジンの阻害を逆転することが予測されるが;しかしながら、添加される量は正しいモル比を提供するためには不十分である。
【0127】
例 22:ウシ大動脈内皮細胞の受容体介在された生存性
例21の方法に従った。但し、BAEC細胞を使用した。さらに、TSP−1を、20μg/ml 及び5μg/mlの両者で添加した。図26に示されるように、それらの結果は、TSPが、対照に比較して、アンジオシジンのいくらかの阻害を改善できることを示す。
【0128】
例 23:受容体結合アッセイ
受容体結合アッセイについての略図が図27に示されている。次の実験においては、TSP−1を、支持体に共有結合し、ビオチニル化されたアンジオシジンをプレート添加し、そしてアビジン−ペルオキシダーゼを添加し、いかに多くのビオチニル化されたアンジオシジンがTSP−1に結合されたかを測定した。アビジン−ペルオキシダーゼを、450nmの吸光度で分光計を用いて測定した。
固定されたTSP−1へのアンジオシジンの結合が、図28に示される。その結果は、Kb=9nMを有する飽和可能結合を示す。BSAを、負の対照として使用した。
【0129】
遊離アンジオシジンを、システムに添加し、ビオチニル化されたアンジオシジンと比較した。図29は、TSP−1へのビオチン−アンジオシジン複合体の結合に対するアンジオシジンの競争効果を示す。固体されたBSAを負の対照として使用した。アンジオシジン:ビオチン−アンジオシジン複合体の比を高めることにより、その結合は直線的に低下した。
【0130】
TSP−1ペプチドCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)をシステムに添加し、ビオチニル化されたアンジオシジンを含む、結合についてのプレートに基づいて、TSP−1と競争せしめた。Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)は、図30に示されるように、ビオチン−アンジオシジン複合体に対してTSP−1と効果的に競争した。スクランブルされたペプチドVal−Cys−Thr−Gly−Ser−Cys(配列番号15)を、負の対照として使用し、そして効果は有さなかった。
【0131】
例 24:アンジオシジン結合ペプチドの同定
New England Biolabs (Bererly, MA) からのファージ表示ペプチドライブラリーキットを用いて、アンジオシジンに結合するペプチドを同定した。ファージ表示されたペプチドのライブラリーを、標的受容体により被覆されたプレート(又はビーズ)と共にインキュベートし、結合されなかったファージを洗浄し、そして特異的に結合されたファージを溶出した。次に、溶出されたファージを増幅し、そして最も強い結合配列のためにファージのプールを連続的に富化するために、バイオパンニング及び増幅の追加のサイクルを行った。3回のサイクルの後、個々のクローンを、DNA配列決定及びELISAにより特徴づけられた。
【0132】
ファージ表示ライブラリーは、図31に示されるように、多くの受容体結合ペプチドを同定した。それらのペプチドは、図31に示され、そして次の通りである:
Lys−Ser−Trp−Val−Ile−Pro−Gln(配列番号16)
Lys−Leu−Trp−Val−Ile−Pro−Gln(配列番号17)
Lys−Val−Trp−Val−Leu−Pro−Ile(配列番号18)
Lys−Val−Trp−Val−Leu−Ile−Pro(配列番号19)
Lys−Val−Trp−Val−Leu−Pro−Ile(配列番号18)及び
Lys−Val−Trp−Ile−Val−Ser−Thr(配列番号20)。
【0133】
図31における個々の系は、配列決定された8個のクローンの1つを表す。ペプチド間の差異は非常に小さく、電荷及び種類(例えば、疎水性、芳香族又は親水性)に関する保存性アミノ酸置換のみが存在する。
それらの配列はTSP−1からの線状配列ではないので、それらはTSP−1折りたたまれたタンパク質において活性部位を表すことができると思われる。他方では、それらは、アンジオシジンに結合する追加のタンパク質からの配列を表すことができる。
【0134】
例 25:TSP −1及びアンジオシジン結合のペプチド競争
上記アビジン−ビオチンシステムを用いて、TSP−1及びアンジオシジンの結合に対する種々のペプチドの競争効果を評価した。例24に論じられるように、ファージ表示により同定されるペプチドlys−Val−Trp−Val−Leu−Pro−Ile(配列番号18)は、図32に示されるように、結合を阻害した。さらにCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)ペプチドは、結合を効果的に阻害した。
【0135】
より安定性のアセチル化されたペプチドCys(Acm)−Ser−Val−Thr−Cys(Acm)−Gly(配列番号6)もまた、結合を阻害した。鏡像のアセチル化されたペプチドd−Gly−Cys(Acm)−Thr−Val−Ser−Cys(Acm)(配列番号23)は、それが同じ立体配置を有するので、たぶん結合を阻害した。スクランブルされたペプチドVal−Cys−Thr−Gly−Ser−Cys−Gly(配列番号21)及びd−配列ペプチドd−Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号22)を、負の対照として使用した。
【0136】
例 26:HAEC 及び HMVEC − L 細胞の生存性に対するアンジオシジンの効果
例18において論じられたように、アンジオシジンを、ヒト大動脈内皮細胞(HAEC)及びヒト肺毛細血管内皮細胞(HMVEC−L)に添加した。アンジオシジンは、ALAMAR BLUETM アッセイにより測定され、そして図33に示されるように、両細胞系の生存性に対して負の効果を有した。
【0137】
例 27:ウシ大動脈内皮細胞の生存性に対するアンジオシジン及びそのフラグメントの効果
上記例19において論じられたように、アンジオシジンをBAEC細胞に添加した。アンジオシジンのフラグメントを同様に添加した。図34は、アンジオシジン及びアミノ末端フラグメントMet1−Lys132(アミノ末端側に結合されるGSTと共に、GST融合タンパク質として発現される)は、細胞生存性を阻害した。アンジオシジンの中央ドメイン及びカルボキシ末端は、細胞生存性に影響を及ぼさなかった。GSTを、負の対照として使用した。V36−R42、すなわち抗分泌因子の活性部位は、効果を有さず、これは、アンジオシジンが抗分泌因子とは異なった役割を演じることを示す。
【0138】
例 28:Lewis 肺癌側腹部腫瘍の増殖に対するアンジオシジンの効果
10匹の動物の側腹部に、105個のLewis肺癌細胞を皮下注射した。側腹部腫瘍の評価は、側腹部腫瘍が脈管形成に非常に依存するので、脈管形成のための十分に認識されたモデルである。O’Reilly, M.S., Angiostatin: A Novel Angiogenesis Inhibitor that Mediates the Suppression of Metastasis by a Lewis Lung Carcinoma, Cell 79: 315−28 (1994)。9日後、腫瘍が増殖する場合、マウスを2つのグループ(1つのグループは5匹の動物を有する)に分けた。5匹のマウスの1つのグループを、Hepes 緩衝溶液中、50μgのアンジオシジンのIV注射により処理した。対照グループを、Hepes緩衝溶液により処理した。マウスを、グループ分けした後、1, 3及び5日目で処理し、そして7日目に殺した。
【0139】
図35は、対照及び処理グループにおける側腹部腫瘍の進行を示す。皮膚を除去し、ボックスにより印を付けられている腫瘍を露出した。アンジオシジンマウスにおける腫瘍は、対照マウスよりも、より小さかった。さらに、アンジオシジンマウスにおける腫瘍は、柔らかく、壊死性であり、そして圧力が適用されると、つぶれた。対照マウスの腫瘍は、硬く、激症性で、刺激的で、且つ攻撃的に増殖する。
【0140】
腫瘍を、パラフィンに包埋し、そして5ミクロンの切片に切断した。切片を、ヘモトキシリン及びエオシンにより染色した。ヘモトキシリンはDNAを青色に染色し、そしてエオシンはタンパク質をピンク色に染色する。図36は、対照(パネルA及びC)とアンジオシジン(パネルB及びD)処理された細胞との間の差異を示す。パネルA及びBは、光顕微鏡下で400倍の倍率であり、そしてパネルC及びDは、光顕微鏡下で200倍の倍率であった。アンジオシジンにより処理された細胞は、有意な壊死及び細胞の死を示す。
【0141】
図37は、次のようにして測定される、相対的腫瘍体積を示す:
【数1】
測定を、全7日目の処理期間、行った。対照腫瘍は非常に増殖したが、ところが処理腫瘍は、単にわずか、及び直線速度で増殖した。これは、アンジオシジンが腫瘍増殖及び脈管形成に対して有意な効果を有したことを示す。
【0142】
例20と組み合わせると、この例は、アンジオシジンが脈管形成に対して直接的に影響を及ぼすが、しかしLews 肺腫瘍細胞自体には影響を及ぼさなかったことを示す。従って、腫瘍増殖腫瘍生存性に対する効果は、脈管形成に対する効果の結果である。ガス交換及び栄養物を確保する正しい血液供給を伴わない場合、脈管化に依存する2mm3以上の側腹部腫瘍は、生存することができない。
【0143】
例 29:Lewis 肺を有するマウスの生存研究
10匹のマウスに、百万個のLewis肺癌腫瘍細胞を、IV注射により注射した。3日間のインキュベーションの後、マウスを2つのグループに分けた。5匹のマウスから成る1つのグループを、Hepes緩衝溶液中、50μgのアンジオシジンのIV注射により処理した。5匹のマウスの対照グループを、Hepes緩衝溶液により処理した。マウスは、1, 3, 5, 7及び9日目に処理された。
【0144】
2種のグループの生存性を評価した。中位のレベルの処理(1日おきに、及び9日目に終結する)のみによってさえ、アンジオシジングループは、対照グループ(16日)よりも長いメジアン生存期間(19日)を有した。
肺腫瘍は、肺はそのような高い血管化された部分であり、そして腫瘍はさらなる血管化に有意に依存する必要はないので、脈管形成のための非常に良好なモデルではない。それにもかかわらず、これは、アンジオシジンが癌性肺腫瘍を効果的に処理し、その工程における寿命を延長することができることを示す。
【0145】
例 30:ヒト乳癌組織におけるアンジオシジンの局在化
ヒト侵入性乳癌腫瘍サンプル、及び対照としての良性及び正常組織サンプルを、イムノペルオキシダーゼ染色により染色した。サンプルを、TSP−1及びアンジオシジンに対するポリクローナル抗体によりラベルし、次に第1抗体に対する第2抗体を、サンプルに添加した。第2抗体は、基質DABと共に混合される場合、褐色を生成するペルオキシダーゼに接合された。すべての一次乳管癌サンプル(n=11)は、TSP−1及びアンジオシジンに関して、陽性に染色した。対照的に、すべての良性及び正常乳房組織は、TSP及びアンジオシジンに関して負に染色し、但し過形成を有する2種の線維嚢胞性乳房サンプルは除く。
【0146】
癌サンプルにおいては、TSP−1は、腫瘍に隣接する濃間質性コラーゲンにおいて染色し、そしてアンジオシジンは腫瘍細胞において染色した。それらの結果は、TSP−1の上昇する発現を示し、そして管上皮におけるアンジオシジンが腫瘍性転換と相互関係することを示す。
【0147】
例 31:ヒト頭部及び頸部腫瘍組織におけるアンジオシジンの局在化
ヒト頭部及び頸部腫瘍サンプルを、ヘマトキシリン、エオシン及びアンジオシジンにより染色した。その染色された腫瘍を、単一波長(620nm)で光を発し、そして染色された腫瘍部分の光学密度を測定するコンピュータービデオ顕微鏡により分析した。隣接する正常粘膜をまた、あらゆる検体のために分析した。特定の染色についての目的の抗体閾値を、負の対照切片(対照IgG)を分析し、そしてアンジオシジン染色された部分からこの値を引き算することによって、個々の検体のために定義した。
【0148】
この場合、%陽性受容体−染色細胞の正確な定量化を得た。像分析方法を用いて、本発明者は、高い陽性染色評点を有するそれらの患者が、高い毛細血管密度を有し、そして初期処理の12ヶ月以内に、転移性疾病により死亡したことを見出した。低い陽性染色評点を有する患者は、低い毛細血管数を有し、そして少なくとも2年間、疾病フリー状態を維持した。データは、下記表3に示される。
【0149】
【表3】
例 32:内毒素研究
アンジオシジンサンプルを、Sigma (St. Louis. Mo) から入手できる時間調整されたゲル形成内毒素キットを用いて、細胞培養物に影響を及ぼす汚染性内毒素が存在しないことを確かめるために、内毒素の存在について測定した。アンジオシジンサンプルは、0.0076pgの内毒素/μgタンパク質の測定値を与えられた。1ng以下のレベルは、組織培養のために安全であると思われる。従って、アンジオシジン自体が細胞生存性に対して阻害効果を有することは明白である。
【0150】
例 33:生存性研究
his標識されたアンジオシジンを、そのhis標識が細胞生存性に対していずれの効果も有さないことを示すために、his標識された対象GSTタンパク質と比較した。ウシ大動脈内皮細胞(BAEC)を、37μg/mlのhis−標識されたアンジオシジン又はhis−標識されたGSTのいずれかを含む、血清フリーの培地において一晩、培養した。アンジオシジン及びGSTの両者を、pTrcHisA発現ベクターにより形質転換された細胞において発現せしめ、そして非変性条件下でニッケル親和性クロマトグラフィー上で精製した。生存性を、ALAMAR BLUETM アッセイにより測定した。
【0151】
図39は、アンジオシジンが、上昇する濃度のアンジオシジンに伴って低下する生存性を有する、細胞生存性に対する用量依存性効果を有したことを示す。GSTは、細胞生存性に対していずれの効果を有さなかった。この研究は、非変性条件下で、すなわち変性条件よりも生理学的条件に近い条件下で、his標識が細胞生存性に対していずれの効果も有さないことを示す。
【0152】
例 34:BAEC 生存性のアンジオシジン−介在性阻害に対する抗−アンジオシジン抗体の効果
この研究は、BAEC生存性のアンジオシジン−介在性阻害に対する抗−アンジオシジン抗体の効果を試験した。BAECを、5μg/mlのアンジオシジン、5μg/mlのアンジオシジン+100μg/mlの対照IgG、又は5μg/mlのアンジオシジン+100μg/mlの抗−アンジオシジンIgGのいずれかを含む、血清フリー培地において一晩、培養した。生存性を、上記ALAMAR BLUETM アッセイを用いて測定した。
図40は、抗−アンジオシジンIgGがBAEC生存性のアンジオシジン阻害のすべてを実質的に排除したことを示す。対照IgGは、いずれの著しい効果も有さなかった。この例は、アンジオシジンの効果が特異的であり、そして調製におけるいずれかの汚染によらないことを示す。
【0153】
例 35:支持体への BAEC の付着に対するアンジオシジンの効果
この例は、支持体へのBAECの付着に対するアンジオシジンの効果を評価する。処理グループにおける細胞を、アンジオシジン(37μg/ml)により予備処理した。対照グループにおける細胞は、予備処理されなかった。細胞(50,000個)をすぐに、2μgのフィブロネクチン、TSP−1又はBSAのいずれかにより被覆されたマイクロタイターウェル上にプレートした。フィブロネクチンは、BAECを誘引し、そして正の対照として作用する強い細胞外マトリックスタンパク質であり、そしてBSAは付着タンパク質ではなく、そして負の対照として作用する。30分後、非付着性細胞をアスピレートし、ウェルをPBSにより洗浄し、2.5%のグルタルアルデヒドにより固定し、2%Giemsaにより染色し、そして1mm2当たりの付着細胞の数を計数した。
【0154】
図41は、この研究の結果を示す。アンジオシジンにより処理されなかった細胞においては、フィブロネクチングループは非常に強い付着性を示し、そしてTSP−1グループは強い付着性を示した。細胞がアンジオシジンにより処理された場合、フィブロネクチングループにおける細胞の付着性は同じ(非常に強く付着する)に存続したが、しかしTSP−1グループは付着性の鋭い低下を有した。
これは、アンジオシジンの添加が、TSP−1被覆されたプレートに対するBAECの付着性を有意に低めたが、しかし陽性対照のフィブロネクチンプレートに対するその付着性は低めなかったことを示す。アンジオシジンは、その付着機構を破壊する、TSP−1との特異的相互作用を有する。
【0155】
例 36:アンジオシジンのアミノ末端及びカルボキシ末端部分の官能性
この研究は、アンジオシジン(それぞれ配列番号24及び25)のアミノ末端(Met1−Lys132)及びカルボキシ末端(Ile248−Lys380)部分を試験する。変性されていない組換えアンジオシジンフラグメントの結合を、十分な長さのアンジオシジンと比較した。GSTを負の対照として使用した。結合を、TSP−1が共有結合されているキュベットを用いる光学結合方法を用いて評価した。レーザー線を用いて、試験タンパク質(フラグメント、アンジオシジン又はGST)がTSP−1誘導体化されたキュベット表面に結合されるかどうかを検出した。
【0156】
キュベットを、1μgのTSP−1により誘導体化した。キュベット表面を、1%BSA溶液によりブロックし、非特異的結合を妨げた。試験タンパク質を、PBS緩衝液において10nMの濃度で添加した。図42に示される結果は、アンジオシジン及びそのアミノ末端フラグメント(Met1−Lys132)の両者がナノモル範囲で非常に類似する結合性を有することを示す。図42は、アンジオシジンに比較しての%活性を示す。GST及びカルボキシ末端フラグメントの両者は、結合活性を示さない。
【0157】
例 37:アンジオシジンのアミノ末端及びカルボキシ末端部分の官能性
この研究は、アンジオシジン(それぞれ配列番号24及び25)のアミノ末端(Met1−Lys132)及びカルボキシ末端(Ile248−Lys380)部分を試験する。前記フラグメントの抗−内皮活性を、十分な長さのアンジオシジンタンパク質のその活性と比較した。
【0158】
内皮細胞(BAEC)を、37μg/mlのアンジオシジン、フラグメント及びGSTと共に一晩インキュベートした。生存性を、ALAMAR BLUETM アッセイを用いて測定した。
それらの結果はまた、アンジオシジンに比較してフラグメントの抗―内皮活性の%として、図42に示される。これは、アミノ末端が十分な長さのアンジオシジンと同じ抗−内皮活性を有することを示す。さらに、アミノ末端領域の結合及び抗−内皮活性は非常に良く相互関係する。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1(アンジオシジンの配列)は、アンジオシジン、すなわちCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly−特異的受容体タンパク質の配列(配列番号2)である。
【図2】
図2(アンジオシジンの配列)は、アンジオシジン、すなわちCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly−特異的受容体タンパク質の配列(配列番号3)である。
【図3】
図3(配列比較)は、図1及び2(配列番号4及び5)に同定される2種の受容体のDNA配列を比較する。
【図4】
図4(アンジオシジンSDS−PAGEゲル)は、アンジオシジン、すなわちCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly−特異的受容体タンパク質のSDS−PAGEゲルである。レーン1は、還元されていないタンパク質(染色された)である。レーン2は、還元されたタンパク質(染色された)である。レーン3は、還元されていないタンパク質(ラベルされた)である。レーン4は、還元されたタンパク質(ラベルされた)である。レーン5は、還元されていない表面ラベルされたタンパク質である。
【図5】
図5(組換えアンジオシジン)は、SDS−PAGE及びウェスターンブロットによる組換え受容体の分析である。発現された受容体、空のベクター対照及び精製されたhis−受容体を含む細菌抽象抽出物を、SDS−PAGEにより分析し、そして抗−受容体抗体によりブロット染色した。ウェルターンブロットに関しては、膜を、TBS−Tween(0.05%Tween−20を含むトリス−緩衝溶液)中、1:2000の受容体抗体血清により処理し、TBS−Tweenにより洗浄し、1:15,000のホースラディシュペルオキシダーゼ−接合抗−ウサギIgGにより1時間プローブし、そして次に、ECL(Enhanced Chemiluminescence), Amersham, Arlington Heights, ILにより示した。種々のパネル及びレーンは次の通りである:パネルA、染色されたゲル、パネルB、抗−受容体抗体ブロット;及び1予備染色されたMW標準、2挿入体を有さない洗浄剤細胞抽出物、3受容体挿入体を有する洗浄剤細菌抽出物、4還元されたhis−標識精製された受容体、5還元されていないhis−標識精製された受容体及び6予備染色されたMW標準。
【図6】
図6(アンジオシジンへのTSP−1及びペプチドの結合)は、組換え受容体へのTSP−1及びCys(Acm)−Ser−Val−Thr−Cys(Acm)−Gly(配列番号6)の結合を示す。発現された受容体を含む細菌溶解物(レーン2, 4, 7)又は発現された受容体を含まない対照溶解物(レーン1, 3, 6)のSDS−PAGEブロットを、抗−受容体抗体(レーン1, 2)、ビオチニル化されたTSP−1(レーン3, 4)、又はビオチニル化されたCys(Acm)−Ser−Val−Thr−Cys(Acm)−Gly(配列番号6)(レーン6, 7)により染色した。
【図7】
図7(トロンボスポンジン−1に結合する受容体)は、受容体−TSP−1結合定数の決定を示す。TSP−1への受容体の結合性を、Affinity Sensor System, すなわち共鳴ミラーバイオセンサーシステムを用いて、相互作用分析により決定した。TSP−1を、キュベットに結合し、そして受容体を添加した。この図は、図8に示される計測器の応答−対−時間のプロットから得られる擬似1次速度定数のプロットを示す。
【図8】
図8(トロンボスポンジン−1に結合する受容体)は、受容体−1結合定数を決定するために使用される原データを示す。TBS−1への受容体の結合を、共鳴ミラーバイオセンサーシステムを用いて、相互作用分析により決定した。この図は、図7におけるデータ点をプロットするために使用されるサンプル計測器の応答−対−時間を示す。計測器の応答は、受容体−TSP−1複合体の濃度に比例する。
【図9】
図9(TSP−1に結合する受容体に対する受容体ペプチドの効果)は、Affinity Senson system を用いて、TSP−1に結合する受容体に対する受容体ペプチドの効果を示し、ここでTSP−1がキュベットに結合され、そして受容体結合が測定される。受容体のみ、及び受容体+ペプチド(2種の異なったモル比で)を添加した。受容体ペプチド、及びランダムの負の対照を試験し、結合を阻害するそれらの能力を測定した。
【図10】
図10(TSP−1への受容体及びペプチドの結合)は、キュベット上に固定されたTSP−1への受容体のみ、及び種々のペプチドのみの結合を示す。受容体及び受容体ペプチドの両者はTSP−1に結合したが、ところがランダムの負の対照ペプチドは結合しなかった。
【図11】
図11(TSP−1及びCys(Acm)−Ser−Val−Thr−Cys(Acm)−Glyに結合する受容体)は、TSP−1及びペプチドCys(Acm)−Ser−Val−Thr−Cys(Acm)−Gly(配列番号6)の両者は、受容体がキュベット上に固定される場合、受容体に結合することを示す。
【図12】
図12(乳癌における受容体の局在化)は、乳癌における受容体の局在化を示す。染色された受容体は、図の中央に見出される腫瘍細胞の境界近くで可視化され得る。
【図13】
図13(擬似及び受容体トランスフェクトされたウシ大動脈内皮細胞の付着)は、プレート上のTSP−1、又は負の対照BSAに結合する受容体トランスフェクトされた細胞を用いての細胞付着性を示す。受容体トランスフェクトされた細胞は、BSAよりも、TSP−1を含むプレートに、より強く付着した。
【図14】
図14(受容体ペプチドへのB16−F10メラノーマ細胞の付着)は、プレート上に固定された、TSP−1、受容体ペプチド及び対照による細胞付着研究を示す。受容体トランスフェクトされた細胞は、フィブロネクチン(正の対照)、TSP−1及び受容体ペプチドを有するプレートに強く付着した。これは、追加のタンパク質がTSP−1相互作用に関与することを示す。
【図15】
図15(固定された組換え受容体へのTSP−1トランスフェクトされたMDA−MB435乳癌細胞の付着)は、TSP−1トランスフェクトされた細胞(及びベクタートランスフェクトされた対照細胞)による細胞付着研究を示す。TSP−1トランスフェクトされた細胞は、対照細胞よりも受容体プレートにより強く結合した。
【図16】
図16(固定された組換え受容体へのTSP−1トランスフェクトされたMDA−MB−435乳癌細胞の付着に対する抗−TSP−1抗体の効果)は、TSP−1トランスフェクトされた細胞による細胞付着研究を示す。この図は、抗−TSP−1及び抗−Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)抗体が受容体被覆されたプレートへの結合を阻害したことを示す。
【図17】
図17(MDA−MB−435乳癌の付着に対する組換え受容体の効果)は、TSP−1トランスフェクトされた細胞による細胞付着研究を示す。プレート上に固定された受容体に対する付着は、濃度依存性態様で、結合されなかったTSP−1の添加により阻害される。
【図18】
図18(脈管形成に対する受容体の効果)は、脈管形成に対するアンジオシジンの効果を示す。この図は、アンジオシジンが毛細血管の形成を阻害したことを示す。
【図19】
図19(毛細血管安定性に対する受容体の効果)は、毛細血管安定性に対するアンジオシジンの効果を示す。この図は、アンジオシジンがインビトロ形成の後、毛細血管を破壊することを示す。
【図20】
図20(ウシ大動脈内皮細胞の形態学に対する受容体の効果)は、ウシ大動脈内皮細胞の形態学に対するアンジオシジンの効果を示す。高まる濃度のアンジオシジンが、細胞の延長、プレートからの分離、凝集及び死を引き起こした。
【図21】
図21(細胞生存性に対する受容体の効果)は、細胞生存性に対するアンジオシジンの効果を示す。BAEC及びHUVEC細胞系は、受容体の存在下で低められた生存性を有し、これは、TSPがそれらの細胞系の生存性のための必要条件であることを示唆する。線維芽細胞、A549, MB231及びMCF7細胞系においては、有意な差異は見出されず、これは、TSPがそれらの細胞系における生存性のための必要条件ではないことを示唆する。
【図22】
図22(ウシ大動脈内皮細胞(BAEC)及びウシ平滑筋細胞(BSM)の生存性に対する受容体の効果)は、BAEC及びBSM細胞の生存性に対するアンジオシジンの効果を示す。アンジオシジンはBAEC細胞の生存性を低めるが、しかしBSM細胞には影響を及ぼさない。
【図23】
図23(ウシ大動脈内皮細胞(BAEC)及びマウスLewis肺癌の生存性に対する受容体の効果)は、BAEC及びマウスLewis肺癌細胞の生存性に対するアンジオシジンの効果を示す。アンジオシジンはBAEC細胞の生存性を低めるが、しかしLewis肺細胞には影響を及ぼさない。
【図24】
図24(ヒト臍静脈内皮細胞の生存性に対する受容体の効果)は、HUVEC細胞の生存性に対するアンジオシジンの効果を示す。
【図25】
図25(ヒト臍静脈内皮細胞の生存性に対する受容体の効果)は、TSP−1の存在下での、HUVEC細胞の生存製に対するアンジオシジンの効果を示す。
【図26】
図26(ウシ大動脈内皮細胞の受容体−介在性生存性)は、TSP−1の生存下での、BAEC細胞の生存性に対するアンジオシジンの効果を示す。
【図27】
図27(受容体結合アッセイ)は、ビオチン−アビジン結合アッセイの略図を示す。
【図28】
図28(固定されたTSP−1への受容体の結合)は、固定されたTSP−1へのアンジオシジンの結合を示す。これは、9nmのKDを有する、飽和結合を示す。
【図29】
図29(TSP−1へのビオチン−受容体の結合に対する受容体の効果)は、TSP−1へのビオチン−アンジオシジン複合体の結合に対するアンジオシジンの競争効果を示す。
【図30】
図30(TSP−1受容体結合のペプチド競争)は、プレートに結合されるTSP−1に結合するビオチン−アンジオシジン複合体のペプチド競争を示す。
【図31】
図31(ファージ表示ライブラリーからの受容体結合ペプチド)は、ファージ表示ライブラリースクリーニング工程からのアンジオシジン−結合ペプチドを示す。
【図32】
図32(TSP−1受容体結合のペプチド競争(1mg/ml))は、TSP−1及びアンジオシジン結合のペプチド競争を示す。Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)及びLys−Val−Trp−Val−Leu−Pro−Ile(配列番号14)の両ペプチドは、結合を阻害する。
【図33】
図33(ヒト大動脈内皮細胞(HAEC)及びヒト肺毛細血管内皮細胞(HMVEC−L)の生存性に対するアンジオシジンの効果)は、HAEC及びHMVEC−L細胞の生存性に対するアンジオシジンの負の効果を示す。
【図34】
図34(ウシ大動脈内皮細胞の生存性に対するアンジオシジン及びそのフラグメントの効果)は、BAEC細胞に対するアンジオシジンの負の効果、及びアンジオシジンの種々のフラグメントの効果を示す。
【図35】
図35(Lewis肺癌の増殖に対するアンジオシジンの効果)は、マウスの側腹部におけるLewis肺癌腫瘍の増殖に対するアンジオシジンのインビボ効果を定量的に示す。
【図36】
図36(アンジオシジンプロモーター腫瘍壊死)は、細胞レベルでの側腹部腫瘍の壊死に対するアンジオシジンの効果を示す。
【図37】
図37(インビボでのLewis肺癌の増殖に対するアンジオシジンの効果)は、マウスの側腹部におけるLewis肺癌腫瘍の増殖に対するアンジオシジンのインビボ効果を定量的に示す。
【図38】
図38(Lewis肺癌を担持するマウスの生存性に対するアンジオシジン処理の効果)は、Lewis肺癌を担持するマウスの生存性に対するアンジオシジン処理の効果を示す。
【図39】
図39(生存性研究)は、ウシ大動脈内皮細胞生存性に対するアンジオシジンの効果を示す。
【図40】
図40(BAEC生存性のアンジオシジン−介在性阻害に対する抗−アンジオシジン抗体の効果)は、ウシ大動脈内皮細胞生存性のアンジオシジン−介在性阻害に対する抗−アンジオシジン抗体の効果を示す。
【図41】
図41(支持体へのBAECの付着に対するアンジオシジンの効果)は、ウシ大動脈内皮細胞の付着に対するアンジオシジンの効果を示す。
【図42】
図42(アンジオシジンのアミノ末端及びカルボキシ末端部分の官能性)は、アンジオシジンタンパク質のN−末端部分が、TSP−1結合及び抗−内皮活性の両者に関して、十分な長さのアンジオシジンタンパク質のすべての活性を含むことを示す。C−末端部分は、負の対照に類似する活性レベルを有した。
技術分野:
アンジオシジン(angiocidin)、すなわち腫瘍細胞の表面上に発現されるトロンボスポンジン(thrombospondin)のCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)領域に対して特異的な細胞マトリックス受容体が、アンジオシジン、並びにアンジオシジンに対する抗体及びインヒビターを精製するための方法と共に提供される。アンジオシジンは、多くの診断及び治療状態、例えば癌診断、管理及び処理において有用である。
【0002】
発明の背景:
癌細胞は、それらが転移できる前、基礎膜を移動すべきであるので、基礎膜(basement membrane)との細胞相互作用の機構は非常に興味あるものである。偏在する基礎膜は、間隙性コラーゲン支質から器官実質細胞を分離する特定タイプの細胞外マトリックスである。正常及び腫瘍性細胞は、このマトリックスと、異なって反応する。
【0003】
ほとんどの正常細胞(非移動性細胞)は、生存、増殖及び分化のために細胞外マトリックスを必要とするように思われ、そして移動性細胞(正常及び腫瘍性の両者)は、1つの組織からもう1つの組織に移動することにおいて基礎膜を横切るべきである。特に、鱗状又は腺上皮は、基礎膜を横切り、循環及びリンパ系に侵入する(血管内異物侵入)。循環性悪性細胞は典型的には、他の器官の細管層において拘束され、血管壁を侵入し、そして基礎膜を管外組織まで透過し(管外遊出)、ここで二次悪性が確立される。
【0004】
細胞と細胞外マトリックスとの相互作用は、マトリックスにそれら自体結合する細胞の能力に依存する。正常及び悪性細胞の両者における結合は、マトリックスに存在するある型のコラーゲンタンパク質に細胞を結合する特定の糖タンパク質により介在されるように思える。例えば、線維芽細胞、筋芽細胞及び平滑筋細胞は、間隙性タイプI及びIIIコラーゲンとフィブロネクチンとの相互作用を通して細胞外マトリックスに結合し、そしてタイプII軟骨コラーゲンとコンドロネクチンとの相互作用を通して軟骨細胞に結合する。正常及び悪性細胞の両者は、類似する機構により基礎膜に結合する。基礎膜の主要成分は、タイプIVコラーゲン、糖タンパク質及びプロテオグリカンである。糖タンパク質ラミニンは、基礎膜への上皮及び悪性細胞の両者の結合に介在し、タイプIVコラーゲンに細胞を結合する。
【0005】
転移性腫瘍細胞は、転移性工程における複数段階で基礎膜を移動し、基礎膜に結合することによってこの移動を開始する。従って、この膜への腫瘍細胞結合を促進するか又は阻害する特定の結合因子の同定及びこの機構の解明は、癌診断、予防、管理及び処理のために重要な関係を有する。
【0006】
トロンボスポンジン(TSP−1)は、血管基礎膜、すなわち腫瘍支質に存在する細胞付着タンパク質及びマトリックス分子であり、そして血小板により分泌される。それは、腫瘍細胞侵入及び転移を仲介する。理論により結びつけられることは所望されないが、腫瘍細胞コロニー化は、アンジオシジンとして命名されている、新規のCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的腫瘍細胞受容体に結合する、アミノ酸配列Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)を含むTSP−1の付着性ドメインを通して進行すると思われる。この受容体は、トランスメンブラン受容体であり、自由であり、又は細胞結合され得る。
【0007】
TSP−1は、1,152個のアミノ酸(MW 145,00)からそれぞれ成る、3種の同一のジスルフィド−結合された鎖から構成される。個々のポリペプチド鎖は、反復する相同アミノ酸配列から成るドメインから主に構成される。それらのドメインは、NH2−末端球状ドメイン;プロコラーゲン相同ドメイン;プロペルジンに見出される配列に対して相同の3種の反復配列から成る、タイプ1又はプロペルジン反復体ドメイン;上皮増殖因子における配列に対して相同の3種の反復配列から成るタイプ2反復体ドメイン;7種の反復Ca2+−結合配列から成るタイプ3反復体ドメイン;及びCOOH−末端球状ドメインである。
【0008】
TSP−1は、次の活性により特徴づけられる:細胞付着促進活性、細胞ミトゲン活性、細胞走化性活性及び止血活性、並びにそれらの活性、例えば腫瘍細胞、微生物又は寄生体転移活性、血小板凝集活性、フィブリン溶解活性及び免疫変性に由来するいずれかの活性。
【0009】
トロンボスポンジンは、いくつかの研究によれば、同じ細胞上の複数の細胞表面受容体に結合し、又は異なった細胞上の異なった受容体に結合することができる。例えば、血小板は、GPIIb−IIIb, GPIa−IIa(Karczewskiなど., J. Biol. Chem. 264: 211332−21326 (1989) 及びTuszynskiなど., J. Clin. Invest. 87: 1387−1394 (1991))、及びビトロネクチン−受容体(Tuszynskiなど., Exp. Cell Res. 182: 481 (1989))を通してTSP−1を結合することができる。平滑筋細胞、内皮細胞、内皮細胞、U937単球様細胞及びメラノーマ細胞は、ビトロネクチン様受容体を通してTSP−1を結合することができる。鱗状細胞癌は、インテグリン又はCD36ではないMw80,000/105,000を通してTSP−1を結合する(Yabkowitzなど., Cancer Res. 51: 3648−3656 (1991))。
【0010】
トロンボスポンジンの活性及び重要性は、それに対して生成された抗体の機能により示されて来た。抗トロンボスポンジン抗体は、血小板凝集を阻害することが示されており、このことは、トロンボスポンジンがそのシステムにおいてある役割を演じることを確かにする(Tuszynskiなど., Blood 72: 109−115 (1988))。さらに、抗トロンボスポンジン抗体は、細胞付着を示す、抗体を有さないスライドに比較して、トロンボスポンジンにより被覆された培養スライドへの細胞付着を阻止する(G. Tuszynski, Cancer Research 47: 4130−33 (1987))。
【0011】
他の細胞外マトリックスタンパク質のための受容体は単離されている。Liottaなど., アメリカ特許第4,565,789号は、ラミニン受容体の単離を記載している。Mechamなど., J. Biol. Chem. 264: 16652−7 (1989)は、67kDのラミニン受容体に対して構造的及び機能的類似性を示すエラスチン受容体を記載する。CD36は、トロンボスポンジンのCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)配列を結合するものとして包含されて来た(Aschなど., Biochem. Biophys. Res. Comm. 182: 1208−1217 (1992))。しかしながら、CD36は、88kDのタンパク質である。本発明のCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体は、それらの前に単離された細胞外マトリックスタンパク質受容体とは異なる。
本明細書に引用されるすべての資料は、引用により本明細書に組み込まれる。
【0012】
発明の要約:
トロンボスポンジン(TSP−1)のCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的領域のための特異的結合親和性を有する精製された受容体、好ましくは配列番号2及び配列番号3、それらのフラグメント及び突然変異体を含んで成る受容体、及びそれらの受容体に対する抗体及びインヒビターを提供することが本発明の目的である。
配列番号2及び3の受容体、そのフラグメント、変異体、又はそれに対して向けられた抗体及びリガンドを用いて、疾病を処理し又は診断するための方法を提供することが本発明のさらなる目的である。
【0013】
発明の特定の記載:
本発明は、他方では、アンジオシジンとして記載される、精製されたトロンボスポンジン(TSP−1)受容体タンパク質の配列を提供する。受容体の配列は、図1及び2(配列番号2及び3)に見出され得る。それらの配列は3種のアミノ酸Gly−Glu−Argにより異なり、そしてそれらのDNA配列間の差異は図3に見出され得る。
【0014】
受容体は、トロンボスポンジンのCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)領域に対して特異的である。受容体タンパク質は、例えば多くの治療分野、例えば癌診断又は管理において有用である抗体を生成するために使用され得る。Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体結合部位のコンピューターモデリングはまた、Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体部位をインビボで阻止するか又は結合する新規化合物の企画においても助力となる。この受容体タンパク質は、癌と相互関係し、そして癌細胞においてアップレギュレートされる。この受容体はアンジオシジンとして本明細書において言及される。
【0015】
Gly−Glu−Argを有さない受容体の配列(図2)は、次の2種の既知であるが、しかし関連しないタンパク質と配列相同性を共有する:抗分泌因子及びヒト26Sプロテアーゼのユビキチン−結合サブユニット。抗分泌因子は、下垂体により製造されるタンパク質であり、そして結腸上皮を結合し、そして結腸上皮中への水の輸送を阻害する。従って、このタンパク質は、腸における水の流れの身体による調節を可能にする。抗分泌因子は、感染の条件下で、例えば宿主がコレラにより感染される場合に生成される。
【0016】
Johansson, E., Identification of an Active Site in the Antisecretory Factor Protein, Biochimica et Biophysica Acta 1362: 177−82 (1997). 他方では、ヒト26Sプロテアーゼのユビキチン−結合サブユニットは、ユビキチン化されたタンパク質を結合し、そして細胞における古いタンパク質を分解する工程において助力する。Ferrell, K., Molecular Cloning and Expression of a Multiubiquitin Chain Binding Subunit of the human 26S Protease, FEBS Letters 381: 143−48 (1996)。
【0017】
トロンボスポンジン受容体配列がそれらの既知タンパク質の両者と配列相同性を共有することは驚くべきことである。それらの既知タンパク質は、いずれも、癌と相互作用しておらず、又は癌細胞においてアップレギュレートされることも知られていない。そのタンパク質は、いずれの機能も共有せず、そして身体の同じ領域においてさえ作用しない。
【0018】
本発明の受容体は細胞表面上に位置し、そして抗分泌因子は血液において循環し、そしてユビキチン−結合サブユニットは細胞内に含まれる。受容体は2種の従来の既知タンパク質とは異なった後−翻訳修飾を有することは可能である。それらの修飾は次のものを包含することができる:糖化、リン酸化、エクトリン酸化、サブユニット構造(モノマー対ダイマー、又はテトラマー構造)、及びスルフヒドリル基の結合を包含する異なったコンホメーション構造。
【0019】
本発明の受容体に対する抗体及びリガンドは、抗分泌因子及びユビキチン−結合サブユニットの作用を妨げないであろうと思われる。ユビキチン−結合サブユニットは、細胞内に隠された酵素複合体に位置し、そしてたぶんいずれの交差反応性からも保護される。抗分泌因子は、感染、特に胃腸感染の条件下でのみ、身体において生成されると思われる。従って、それは、一般的に、血液において存在せず、そして従って、本発明の受容体に対する抗体と交差反応すべきではない。さらに、抗体特異性は、3種のタンパク質間で異なることができる後−翻訳修飾に依存することができる。競争受容体タンパク質の付加は同様に、タンパク質の後−翻訳差異のために、それらの他のシステムを妨害すべきではない。
【0020】
本発明の受容体はまた、約10−6M〜約10−10M、好ましくは約10−7M〜約10−9M、最も好ましくは約10−8Mの親和性を伴って、トロンボスポンジンペプチドCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)への結合をまだ可能にする、配列番号2及び3の修飾を有する受容体(他方では、突然変異体としても知られている)も包含する。その変異体は、二次構造又はタンパク質機能に影響を及ぼさないいずれかの保存性置換を含んで成り、それらは、同じ種類、例えば疎水性、親水性、塩基性及び酸性のアミノ酸の置換を包含する。
【0021】
特に、それらは、次の置換対を包含するが、但しそれらだけには限定されない:バリン及びトレオニン、グリシン及びイソロイシン、リシン及びアルギニン、グルタミン酸及びアスパラギン酸、フェニルアラニン及びトリプトファン、セリン及びトレオニン、及びメチオニン及びシステイン。好ましくは、修飾は、カルボキシ末端領域、すなわちIle248−Lys380 (配列番号25)に対して行われる。この領域は、アンジオシジンの活性に影響を及ぼすとは思われない。しかしながら、修飾は他の領域に対しても行われ得る。他の保存性置換は、当業者に明らかであろう。
【0022】
さらに、アミノ末端領域を包含するフラグメント(Met1−Lys132)、及びそのアミノ末端フラグメントを包含するフラグメントの突然変異体が、本発明に使用され得る。アミノ末端フラグメントMet1−Lys132は、配列番号24に見出され得る。
【0023】
定義及び略語
“アンジオシジン” Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体のタンパク質“、“トロンボスポンジン受容体タンパク質”、“TSP−1受容体”、及び“受容体”は、ペプチドCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)に対する特異的結合親和性を示すいずれかの哺乳類源、例えばヒト、ブタ、ウマ、ウシ及びマウス(但し、それらだけには限定されない)からの天然のトロンボスポンジン受容体タンパク質を言及する。
【0024】
受容体は、配列番号2及び3に見出される配列を有する。前記用語はまた、合成TSP−1受容体タンパク質、すなわち組換え手段又は直接的化学合成により生成されるタンパク質を包含する。TSP−1受容体タンパク質は、血小板、内皮細胞、上皮(肺)細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、単球マクロファージ、グリア細胞、及び最も特定には、癌組織、例えばメラノーマ細胞及び肺癌細胞(但し、それらだけには限定されない)に見出されるタンパク質である。
【0025】
“脈管形成活性”とは、血管又はリンパ管の形成を阻害するか又は増強する能力として、本明細書において定義される。
“抗−内皮活性”とは、内皮細胞、例えばウシ大動脈内皮細胞生存性を低める能力として、本明細書において定義される。
“抗マラリア活性”とは、内皮細胞へのマラリア−感染された赤血球細胞の細胞付着、マラリアスポロゾイト認識及び肝細胞中への侵入、又はマラリアメロゾイト認識及び赤血球中への侵入のいずれかを阻害する能力として、本明細書において定義される。抗マラリア活性は、細胞付着を阻止するワクチン又は治療の形で示され得る。
【0026】
“抗転移活性”とは、腫瘍細胞転移の程度又はサイズを妨げるか又は非常に低める能力、又は一次固形腫瘍の回帰を阻害するか又は引き起こす能力として、本明細書において定義される。
“アテローム硬化症活性”とは、アテローム硬化性病変形成を促進するか又は阻害するトロンボスポンジンの能力として、本明細書において定義される。アテローム硬化症病変は、特に動脈壁における脂質−含有材料の変性蓄積として定義される。
【0027】
“細胞付着活性”とは、支持体への細胞、好ましくは哺乳類細胞の付着を促進するか又は阻害する能力として、本明細書において定義される。
“糖尿病性網膜症活性”とは、糖尿病により引き起こされる眼における血管の異常形成を阻害する能力として、本明細書において定義される。
“増殖因子活性”とは、細胞増殖を阻害するか又は促進する能力として、本明細書において定義される。
“黄斑変性活性”とは、黄斑変性における網膜及び黄斑下で血管の異常増殖を阻害する能力として、本明細書において定義される。
【0028】
“トロンボスポンジン−様活性”とは、トロンボスポンジンの既知の生物学的活性を模倣するいずれかの活性として、本明細書において定義される。それらの活性は、細胞−付着促進活性、細胞ミトゲン活性、細胞走化性活性及び止血活性、及び腫瘍細胞、微生物又は寄生体転移活性、血小板凝集活性、フィブリン溶解活性及び免疫変性のようなそれらの活性に由来するいずれかの活性を包含する。
【0029】
好ましい態様
本発明の好ましい受容体タンパク質は、図1−2に示される配列(配列番号2及び3)を有する。本発明の追加の受容体タンパク質はまた、上記のように、それらの配列の変異体も包含する。1つの好ましいフラグメントは、アミノ末端(Met1−Lys132)(配列番号24)を包含する。
【0030】
Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体、すなわちアンジオシジンは、癌組織、例えばメラノーマ細胞又は肺癌細胞に由来する。ドデシル硫酸ナトリウム ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)による受容体の分析は、それが非還元条件下で、50kDの見掛け分子量を有することを示す。いくつかの調製においては、100kD以上の分子量を有する少量のダイマーが観察される。還元条件下で、タンパク質は、50及び60kDの見掛け分子量を有する、密接して存在する2つの主要ポリペプチドバンドとして移動し、ここで50kD種は60kD種の変性又は修飾された形で存在する。これは、タンパク質が、ジスルフィド結合される場合、より密集した配置を仮定する2種の鎖間ジスルフィド−結合されたポリペプチド鎖から成る解釈と一致する。
【0031】
タンパク質は、インテグリン、ラミニン又はCD36に対する抗体と交差反応しない。Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体タンパク質、すなわちアンジオシジンは、それがガラクトース、マンノース及びグルコサミン特異的レクチンを結合するので、糖タンパク質である。精製された受容体タンパク質の高い260nm吸光度は、炭水化物の存在と一致する。
精製された生来のアンジオシジンタンパク質を特徴づけるために、インビトロでの受容体としての追加のその活性が研究された。受容体は、イオン依存性態様でトロンボスポンジンと相互作用するが、しかしフィブロネクチン(FN)又はウシ血清アルブミン(BSA)とは相互反応しない。
【0032】
アンジオシジンの使用
本発明のTSP−1受容体は、いくつかの態様で使用され得る。
(1)受容体に対する抗体又はリガンドが生成され得る。それらの抗体又はリガンドはトロンボスポンジンの効果を模倣するか、又はトロンボスポンジン活性を阻止するために受容体と相互作用することができる。
【0033】
(2)受容体配列の知識は、血液、生検又は他の組織において患者の受容体レベルを測定するために使用され得る。非侵入性腫瘍は、この受容体を発現しないか、又はわずかに低レベルで発現し、そして侵入性腫瘍は高レベルで受容体を発現する。受容体のレベルは、患者の診断又は予後を示す。これは、転移し、そして死亡を引き起こす侵入性表現型から、決して広がらない非侵入性腫瘍細胞を区別するであろう信頼できる腫瘍マーカーを提供するであろう。これは、悪性癌の検出及び処理を助けることができる。
【0034】
(3)受容体は、トロンボスポンジン活性を模倣するか又は阻害する薬剤を企画するために使用され得る。
(4)受容体又はそのフラグメントは、トロンボスポンジン活性の競争インヒビターとして患者に投与され得る。受容体の修飾された形が、受容体又はそのフラグメントの代わりに使用され得る。これに関する許容できるフラグメントは好ましくは、約10−5M〜10−10Mの親和性でTSP−1を結合する、TSP−1結合ドメイン又はこのドメインの修飾を含んで成る。
【0035】
(5)細胞毒性薬剤、ホルモン、造影剤、又は放射性成分が、癌処理又は他の治療への使用のために、受容体に向けられた抗体又はリガンド(標的化成分として作用する)に結合され得る。
(6)生物医学装置が、細胞表面、例えば血小板上のトロンボスポンジンのための受容体を担持する細胞を除去するために、受容体に対する抗体又は、受容体に対するリガンドにより被覆され得るか又はそれらに結合され得る。
【0036】
(7)受容体又はそのフラグメントは、腫瘍増殖を阻害し、腫瘍のサイズを低め又は腫瘍増殖を妨げるために使用され得る。
(8)受容体又はそのフラグメントは、脈管形成を妨げ、阻害し、又は逆転するために使用され得る。当業者は、本発明の受容体の他の使用を理解するであろう。
【0037】
それらの組成物のいずれかが、上記の治療有益性を提供するために、単独で作用することができる、その非毒性付加塩、アミド及びエステルと共に患者に投与され得る。そのような組成物はまた、生理学的に耐性の液体、ゲル又は固体希釈剤、アジュバント及び賦形剤と共に供給され得る。標準の製剤は当業者に知られている。好ましい投与態様は、静脈内、筋肉内及び皮下投与を包含する。もう1つの好ましい投与態様は、例えば標的化剤に組成物を連結することによって、身体の影響された部分に組成物を向けるであろう。他の投与態様のために適切である追加の製剤は、坐剤、鼻腔内エアロゾル及び多くの場合、経口製剤を包含する。
【0038】
例えば、本発明の抗体は、患者におけるトロンボスポンジン様活性を仲介することができる。多くの治療及び予防用途、例えば癌治療、アテローム硬化症、マラリア処理又は予防、血栓又は血栓崩壊状態、脈管形成又は細胞結合において、損なわれていないトロンボスポンジンの効果を阻害し、又は模倣することの生理学的効果を有する、本発明の抗体及びそれらを含む組成物を使用することができる。抗体はまた、診断試薬、治療剤又は他の化合物のキャリヤーとしても有用である。抗体はまた、生物医学装置においても使用され得る。
それらの抗体及び組成物は、例えば家畜及び牧畜に関しての獣医学的使用のために、及びヒトへの臨床学的使用のために、他の治療用抗体剤に類似する態様で、動物に投与され得る。
【0039】
いずれかの理論により結びつけられることを所望しないが、本発明の抗体は、生来のトロンボスポンジンに対するアゴニスト又はアンタゴニストとして作用すると思われる。それらの抗体はまた、スポロゾイト周囲(circumsporozoite)タンパク質、トロンボスポンジン関連の無名タンパク質及びプロパージン補体タンパク質に対するアゴニスト又はアンタゴニストとして作用するとも思われる。
【0040】
TSP−Tタイプ1反復体配列、例えばMETH−1及びMETH−2、及びタンパク質のADAMTS種類に属する関連タンパク質を含む他のリガンドは、アンジオシジンと相互作用することができる。Vasquez. F., METH−1, a Human Ortholog of ADAMTS−1, and METH−2 are Members of a New Family of Proteins with Angio−Inhibitory Activity, J. Biol. Chem. 274: 23349−23357 (1999)。受容体に向けられたリガンドは、抗体と同じ手段で使用され得る。受容体又はそのフラグメントはまた、トロンボスポンジンのための競争リガンドとしても投与され得る。受容体の変異体(すなわち、受容体の修飾された形)もまた、トロンボスポンジンのための競争リガンドとして投与され得る。
【0041】
多くのインビトロ及びインビボアッセイが、抗体がトロンボスポンジン様活性をもたらすことを示すために使用され得る。それらのアッセイは次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない:抗体−受容体結合アッセイ、細胞付着アッセイ、血小板凝集アッセイ及び細胞増殖アッセイ。高処理能力の結合アッセイが、トロンボスポンジン様結合により受容体に対する抗体をスクリーンするために使用され得る。受容体をプレートに付着することができ、ラベルされたTSP−1を結合することができ、試験されるべき化合物を添加することができ、そしてそれが受容体に対するTSP−1結合性を阻害するかどうかを決定することができる。下記に論じられるような他のアッセイが、試験されるべき抗体の機能的活性を決定するために使用され得る。
【0042】
転移:
転移は、血流又はリンパによる悪性腫瘍の細胞の移行におけるように、身体の1つの部分から、それに関連しないもう1つの部分への疾病の広がりである。転移は、内皮への腫瘍細胞の付着、内皮の収縮、基礎膜のマトリックス変性及び血流中への腫瘍細胞の侵入を包含するカスケード機構を通してもたらされると思われる。このカスケードにおけるいずれかの相での介入が、転移性癌の処理又は予防に有益であり得る。
【0043】
生来のトロンボスポンジン分子は、腫瘍細胞転移を増強することが示されている。Tuszynskiなど., Cancer Research, 47: 4130−4133 (1987)。トロンボスポンジン増強が生じる機構は、現在十分には理解されていない。
抗転移活性は、インビトロでメラノーマ細胞に結合する化合物の能力(Tuszynskiなど., Anal. Biol., 184: 189−91 (1990))、及びインビボで腫瘍コロニーのサイズ及び数を低める能力(Tuszynskiなど., Cancer Research, 47: 4130−4133 (1987))により特徴づけられる。
【0044】
受容体に向けられた抗体又はリガンドは、抗転移剤として有用であり、特に抗−肺転移剤として有用である。それらの剤は、転移性腫瘍細胞、特にトロンボスポンジンに対して応答性であるそれらの細胞の付着を阻害する。それらはまた、腫瘍コロニー数及び腫瘍コロニーサイズも低める。抗体及びリガンドの特定の利点は、長い循環性半減期である。
そのような抗転移活性が生じる多くの機構が存在する。抗体及びリガンドは、細胞毒性であり、又は細胞増殖を阻害することができる。細胞増殖のインヒビターとして、それらの剤は、1)有糸分裂を阻害し、2)脈管形成を阻害し、又は3)補足経路及び関連するキラー細胞を活性化するよう作用することができる。それらの機構は、受容体への抗体又はリガンドの結合により作用する。
【0045】
本発明の抗体及びリガンドはまた、生物医学的装置にも使用され得る。抗体及びリガンドは、転移性腫瘍細胞の結合を促進する能力を有するので、血液又はリンパからの循環性腫瘍細胞の除去をもたらす剤により生物医学的装置を被覆することが可能である。生物医学的装置は、肝癌又は他の癌を妨げるためにも有用である。
【0046】
抗体及びリガンドのもう1つの使用は、診断又は治療目的のために転移性腫瘍細胞に、毒素、薬剤、ホルモン、造影剤又は放射性成分を標的化するためのキャリヤーとしてである。それらのキャリヤーはまた、肝癌又は他の癌にも結合する。受容体自体又はそのフラグメント/変異体は、トロンボスポンジン活性を競争的に阻害するために使用され得る。特に、本発明は、TSP−1に対して向けられたリガンド又は抗体が放射性成分に結合される、癌を処理するための組成物及び方法を包含する。それはまた、TSP−1に対して向けられたリガンド又は抗体が放射性成分に結合されている、癌の放射性検出及び診断のための組成物及び方法も包含する。
【0047】
癌を処理し、検出し、そして診断するための放射性成分は、当業界において良く知られている。最後に、TSP−1に対して向けられたリガンド又は抗体がMRI増強剤に連結されている、癌の処理に対する治療応答のMRI検出、診断、及び定量化のための組成物及び方法を包含する。癌の治療応答を検出し、診断し、そして定量化するためのMRI増強剤は、当業界において良く知られており、そしてガドリニウム、マンガン、鉄、テクネチウム、GASTROGRAPHINTM, ISOVUETM, HEPATOLYTETM及びNEURULYTETM を包含するが、但しそれらだけには限定されない。他の許容できるMRI増強剤は、当業者に知られている。
【0048】
アテローム硬化症:
アテローム硬化症は、影響される部分の変性によりしばしば付随される、動脈の内壁上への小さな脂肪節の付着により特徴づけられる疾病状態である。
TSP−1受容体に対する抗体、TSP−1受容体に対するリガンド、又は受容体又はそのフラグメント/変異体の投与は、トロンボスポンジン活性を低め、そして動脈損傷の進行を阻害することができる。この結果は、高コレステロールの食事を与えられたウサギにおいて示された。
【0049】
糖尿病性網膜症:
糖尿病性網膜症においては、網膜における血管が損傷を受け、流体が漏れ又は出血し、網膜損傷を引き起こす。増殖性網膜症においては、新規のもろい血管が網膜の表面上で増殖する。それらの新規血管又は新生血管形成は、それらが破壊し、漏れ又はガラス体中に出血するので、重度の視力阻害を導く。ガラス体が血液により曇るので、光は眼を通して網膜に通過することを妨げられ、かすみ、又は視力をゆがめる。新規血管はまた、眼の裏から網膜を分離する瘢痕組織を引き起こし、網膜剥離を引き起こす。網膜剥離は失明を導く。最後に、異常血管が、虹彩上で増殖し、緑内障を導く。TSPは、糖尿病性網膜症における異常血管増殖においてある種の役割を演じると思われる。
【0050】
黄斑変性:
“湿潤”タイプの黄斑変性においては、異常血管(網膜下新生血管形成として知られている)が、網膜及び黄斑下で増殖する。次に、それらの新規血管が出血し、そして流体が漏れ、それにより黄斑の膨張又は隆起を引き起こし、従って中心視力を曲げ又は破壊する。それらの状況下で、視力低下が急速且つ重度になる。TSPは黄斑変性における異常血管増殖において役割を演じると思われる。
【0051】
マラリア:
マラリアは、赤血球において寄生し、そして感染された蚊により刺されることにより哺乳類に伝達される種々の原生動物(プラスモジウム属)のいずれかにより引き起こされる感染性疾病である。本発明の抗体、リガンド、又は受容体又はそのフラグメント/変異体が、細胞付着を阻止する治療剤として使用され得る。
それらの剤は、トロンボスポンジン活性を阻止し、そして従って、マラリアにより感染された赤血球細胞の内皮細胞への細胞付着、マラリアスポロゾイト認識及び肝細胞中への侵入、又はマラリアメロゾイト認識及び赤血球細胞中への侵入を阻害する。
【0052】
脈管形成:
脈管形成は、血管及びリンパ管の形成である。本発明の抗体、リガンド、及び受容体又はそのフラグメント/変異体は、脈管形成の調節、特に創傷治癒の増強、腫瘍増殖、糖尿病性網膜症、黄斑変性及びリウマチ様関節炎の阻害又は予防において有用である。標準の脈管形成アッセイは、当業界において良く知られている。
それらのアッセイは、種々の細胞系を用いての増殖及び移動研究、コラゲナーゼ阻害、及び鶏漿尿膜上でのインビボ新規血管形成(CAMアッセイ)を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【0053】
付着調節:
抗体、リガンド、及び受容体又はそのフラグメント/変異体は、細胞付着を調節し、そしてTSP−1受容体部位を含む細胞、例えば血小板へのTSP−1及び他のタンパク質の結合を阻害することができる。
【0054】
診断:
本発明の抗体及びリガンドは、種々のタイプの癌、例えば胃腸(胃、結腸及び直腸)癌、乳癌、肝癌及びメラノーマ(但し、それらだけには限定されない)についての診断/予後アッセイにおける試薬として有用である。TSP−1受容体のレベルは、患者に予後又は診断を提供するために使用され得る。受容体の配列のさらなる知識は、患者サンプルにおける受容体のレベルを決定するために直接的に使用され得る。
【0055】
キャリヤー:
細胞毒性薬剤、ホルモン、造影剤又は放射性成分が、癌又は他の治療への使用のために抗体又はリガンドに結合され得る。
【0056】
生物医学的装置:
生物医学的装置は、細胞表面上にトロンボスポンジンのための受容体を担持する細胞、例えば血小板を除去するために抗体又はリガンドにより被覆され又はそれらに結合され得る。
トロンボスポンジン受容体に対する適切なリガンドの同定
適切なリガンドは、トロンボスポンジンタンパク質、その変異体及びフラグメント(ペプチドCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)を包含する)、及び本発明の受容体に結合する他のペプチド又はタンパク質を包含する。
【0057】
そのようなリガンドは、ファージ表示ペプチドライブラリーキット、例えばNew England Biolabs (Beverly, MA) から入手できるキットを用いることによって開発され、そして同定され得る。ファージ表示は、選択技法を説明し、ここでペプチド又はタンパク質がバクテリオファージのコートタンパク質との融合体として発現され、ファージビリオンの外表面上に前記融合されたタンパク質の表示をもたらし、そして前記融合体をコードするDNAはビリオン内に存在する。
【0058】
ファージ表示は、個々の配列をコードするDNAへのランダムペプチド配列の莫大なライブラリー間での物理的結合を創造するために使用され得、バイオパンニングと呼ばれるインビトロ選択方法による種々の標的分子(受容体を包含する)ためのペプチドリガンドの急速な同定を可能にする。
【0059】
この技法は、標的受容体により被覆されたプレート(又はビーズ)と共にファージ表示されたペプチドのライブラリーをインキュベートし、結合されなかったファージを洗浄し、そして特異的に結合されたファージを溶出することによって行われる。次に、溶出されたファージが、増幅され、そして最も強い結合配列のためにファージのプールを連続的に富化するために、バイオパンニング及び増幅の追加のサイクルが取られる。3〜4サイクルの後、個々のクローンが、DNA配列決定及びELISAにより特徴づけられる。
【0060】
次に、ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドは、同定されたペプチド配列を含むタンパク質を同定するためにプローブとして使用され得る。次に、それらのタンパク質は、下記例に開示される結合技法のいずれかを用いて、受容体に対するそれらの結合能力について評価され得る。
【0061】
アンジオシジンの発現
アンジオシジン、又はそのフラグメント又は変異体のいずれかが、既知の発現システム、例えば哺乳類細胞系、昆虫細胞、酵母株及び細菌、例えばE.コリにおいて発現され得る。
哺乳類細胞系は、異種タンパク質の発現のためにいくつかの利点を提供する。哺乳類細胞において生成される真核タンパク質は、転写、翻訳、及び後翻訳修飾工程が高等真核生物間に保存されるので、機能的であろう。哺乳類細胞系は、構造体−機能アッセイを包含する種々の組換えタンパク質研究のために、及び細胞機能に対するタンパク質の生理学的効果の分析のために十分に適切にされる。
【0062】
昆虫細胞は、組換えタンパク質の発現のための卓越した宿主である。それらはしばしば、高等真核生物として、それらは哺乳類細胞に類似する後翻訳修飾を行うが、しかし早く増殖し、そしてCO2インキュベーターを必要としないので、タンパク質生成のために選択される。さらに、昆虫細胞は、大規模発現のための懸濁培養に容易に適合され得る。
【0063】
種々の酵母株は、真核タンパク質の発現及び分析のために非常に有用であることがわかっている。酵母は、遺伝子的に十分に特徴づけられており、そして多くの哺乳類−様後翻訳修飾を行うことが知られている。それらの単細胞真核生物は、定義された培地においてすばやく増殖し、哺乳類細胞によりも、研究するのに容易で且つ安価であり、そして発酵に容易に適合される。従って、酵母発現系は、組換え真核タンパク質の大規模生成のために理想的に適合される。
【0064】
E.コリにおける組換えタンパク質の発現は、早く且つしばしば、高い収率をもたらす。しかしながら、細菌はタンパク質を糖化せず、又はタンパク質を最適に折りたたまないので、細菌系は、最適に活性的なタンパク質を生成することができない。それにもかかわらず、細菌発現システムは、しばしば、それらの使用の容易さのために好ましい。
【0065】
〔実施例〕
次の例は、単なる例示目的のためであって、そして本発明の範囲を制限するものではない。組換えアンジオシジンを用いる例においては、配列番号2に提供される配列を使用した。それにもかかわらず、配列番号3で提供される配列、及び両配列の変異体及びフラグメントは、本発明において効果的に十分に作用する。
【0066】
例1:受容体の精製
細胞からのCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体のタンパク質の精製は、次の2つの基本的段階を含んで成る:細胞の調製、及び親和性クロマトグラフィーによる受容体の精製。好ましい細胞源は、マウスメラノーマ細胞、及び容易に入手できるヒト肺癌細胞を包含した。培養された細胞は、ほとんどの組織源に比較して、比較的少ないプロテアーゼを有する追加の利点を有する。これは、活性受容体タンパク質の安定化及び精製を促進する。
【0067】
細胞抽出物を調製し、そして受容体がCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)ペプチドに結合するであろう条件下で、固定されたCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)ペプチドを含むクロマトグラフィーカラムに通した。次に、Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体を、カラムから、精製された形で溶出する。
【0068】
特に、細胞抽出物を、約4.0×107個のB16−F10マウスメラノーマ細胞又はA549ヒト肺癌細胞から、5mlの結合緩衝液(10mMのトリス−HCl, pH7.5, 0.5%の(NON−PRECEDENTIAL)−40洗浄剤、1mMのCaCl2, 1mMのMgCl2, 100μMのロイペプチン、1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)、10μg/mlのアプロチニン)に前記細胞ペレットを溶解することによって調製した。溶解されなかった材料は、40℃で20分間、4,000×gで遠心分離することによって、サンプルから除去された。
【0069】
Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)親和性カラムを、HEPES緩衝溶液(pH7.35)により平衡化された、1mlのCN−活性化されたセファロースに結合された、4mgのCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)を含む5mlカラムを充填することによって構成した。非特異的に吸着されたタンパク質を、50mlの結合緩衝液によりカラムを洗浄することによって、カラムから除去した。特異的に吸着されたタンパク質を、0.10Mのトリス−HCl, pH10.2, 0.05%の(NON−PRECEDENTIAL)−40洗浄剤、1mMのCaCl2, 1mMのMgCl2, 100μMのロイペプチン、1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)、10μg/mlのアプロチニンの緩衝液により溶出した。
【0070】
10mlの画分を、トリスを中和するために700μlの1NのHClを含む管に集めた。管におけるピーク画分を、アニオン交換カラム緩衝液(20mMのトリスHCl、pH8.0、5mMのオクチルグルコシド)により平衡化されたアニオン交換カラム(Mono Q, Pharmacia)に適用した。結合された材料を、NaCl(100%の1MのNaCl)のグラジエント20mlにより溶出し、そしてカラムを280及び260nmでモニターした。結合された材料は通常、0.3MのNaClで溶出し始め、そしてグラジエントを維持し、タンパク質を溶出し、260nmで高い吸光度を有する単一の相同ピークを生成した。
【0071】
溶出された画分及び結合されなかった画分を濃縮し、そしてその濃縮された材料を、8%ポリアクリルアミドゲル上でのSDS−ゲル上で分析し、そして標準技法を用いてクーマシーブルー染色により可視化した。ピーク画分を、図4(レーン1及び2)に示されるように、50kDの見掛け分子量を有する主要バンドとして、非還元条件下で、及び50及び60kDの2つのポリペプチドバンドとして、還元条件(5%のβ−メルカプトエタノール)下で、SDS−ゲル電気泳動に基づいて分析した。
【0072】
約100μgのタンパク質を、1×107個の細胞から回収した。Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体を、Karczewskiなど., J. Biol. Chem. 264: 21322−6 (1989) の標準方法を用いて、125Iによりラベルした。手短には、100μlのオクチルグルコシド緩衝液に溶解された、12μg の精製されたタンパク質を、1つのヨードビーズと共に5分間インキュベートした。反応されなかったヨウ化物を、Tuszynski など., Anal. Biochem. 106: 118−122 (1980) により記載されたように、オクチルグルコシド緩衝液により平衡化されたSephadex G−25の小カラム上で除去した。
【0073】
典型的な実験により得られたタンパク質の比活性は、104cpm/μgであった。SDS−ゲル電気泳動、続くオートラジオグラフィーによる、ラベルされた材料の分析は、還元条件下で、60kDの分子量のポリペプチドバンドが有力であったことを示した。このラベルされた材料のオートラジオグラムは、図4、レーン3及び4に示される。
【0074】
例2:Cys − Ser − Val − Thr − Cys − Gly (配列番号1)−特異的 TSP −1受容体 cDNA の分子クローニング及び配列分析
抗体又はオリゴヌクレオチドプローブ及びDNAライブラリーの調製、及び抗体又は核酸ハイブリダイゼーションによるそれらのスクリーニングのための基本的手段は、当業者に良く知られている。たとえばDNA Cloning: Volume I (D.M. Glover ed. 1985); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames and S.J. Higgins eds. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gate ed. 1984); T. Manietis, E.F. Frisch & J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) を参照のこと。それらの既知方法は、本発明の受容体をクローニングし、そして配列決定するために使用された。
【0075】
A549ヒト肺癌から単離された受容体に対するポリクローナル抗血清を用いて、Drs. Mark Steams and Min Wang, MCP−Hahnemann University により供給されるλUni−ZAP (Stratagene, La Jolla, CA) 前立腺癌細胞(PC3−NI)ライブラリーをスクリーンした。約200,000のプラークを、PicoBlue Immunostaining キット(Stratagene, La Jolla, CA)により提供される方法に従って、ファージ及び細菌により吸着された抗−受容体抗血清の1:1000希釈溶液によりスクリーンした。
【0076】
4個の抗体陽性プラークを単離し、そしてクローン化し、そしてファーゲミドを、ExAssist Interference−Resistant Helper phage プロトコール(Stratagene, La Jolla, CA)を用いて、XL1ブルー細菌に移した。プラスミドDNAを、Wizard plus miniprep (Promega, Madison, WI)を用いて精製し、そしてSequenaseバージョン2.0 (U.S. Biochemical Corp.)を用いて、ジデオキシ鎖終結方法により設定されたT7/T3プライマーを用いて配列決定した。その得られる配列は、図1及び2(配列番号2及び3)に見出され得る。それらの2種の受容体についてのDNA配列の比較は、図3(配列番号4及び5)に見出され得る。
【0077】
例3:組換えアンジオシジンの発現
PBK−CMVプロモーターを含むXL1−ブルー細菌においてサブクローン化された十分な長さの受容体cDNAを、分子生物学における現在のプロトコールに記載のようにして、IPTG(イソプロピル−b−D−チオガラクトピラノシド)によりタンパク質を発現するために誘発した。細菌を、B−Per Bacterial Protein Extraction Reagent (Pierce Chemical Co. Rockfort, Ill) により溶解した。
【0078】
組換え受容体はまた、他の細菌、バキュロウィルス及び哺乳類細菌(例えば、COS細菌)発現システムにおいて発現することができる。当業者は、細菌がタンパク質を糖化せず、又はタンパク質を最適に折りたたまないので、細菌システムは最適な活性タンパク質を生成することができないことを知っている。しかしながら、バキュロウィルス発現システムは、多量の発現されたタンパク質を生成し、そしてこのシステムはまた、多くの後−翻訳修飾、例えば糖化、折りたたみ、リン酸化及び分泌を実施することもできる。
【0079】
受容体cDNAを、バキュロウィルストランスファーベクター中に挿入することができる(MaxBac 2.0キット+pBlueBacHis2 Xpress キット、Invitrogen, Carlsbad, CA)。組換えウィルスを3度、精製し、そして血清フリーの培地においてSf11細胞により生成される受容体の量を、ウェスターンブロットにより推定することができる。さらに、受容体を、pcDNA3.1/Hisベクター(Invitrogen)を用いて、COS細胞発現システムにおいて発現することができる。これは、COS細胞が受容体cDNAによりトランスフェクトされ、そしてCMVプロモーター構造体を用いてタンパク質を発現するために誘発され得る哺乳類発現システムである。COS細胞は、種々の方法、例えばリポフェクチンを用いて、容易にトランスフェクトすることができる。
【0080】
例4:His −標識された組換えアンジオシジンの発現及び精製
アミノ末端に結合された6個のヒスチジン残基を含む組換え受容体を、発現タンパク質発現システム(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて調製した。PBK−CMVベクターにクローン化された十分な長さのcDNAを鋳型として使用し、His標識ベクターpTrcHISA中へのDNAの連結を可能にする正しい制限部位を含むPCR生成物を生成した。
【0081】
これは、それぞれBgl II及びEco RI制限部位を含む、前方向プライマーGGG AGA TCT ATG GTG TTG GAA AGC ACT(配列番号12)及び逆方向プライマーGGG GAA TTC TCA CTT CTT GTC TTC CTC(配列番号13)を用いて、rTth DNAポリメラーゼ、XL(Perkin Elmer, Foster City, CA)によるPCRにより達成された。得られる1.1kbの生成物は、T4 DNAリガーゼを用いて、Bam H1 及びEcoR1により消化されたベクター中に連結される、5’末端でBgl II制限部位及び3’末端でEcoR1部位を含んだ。
【0082】
例5:組換えアンジオシジンへの Cys − Ser − Val − Thr − Cys − Gly (配列番号1)の結合
受容体cDNA挿入体及び空のベクター対照、並びに精製されたHis−標識組換え受容体を含む細菌溶解物を、還元及び非還元条件下でSDS−PAGEにより分析した。ゲルをニトロセルロース紙上に電気ブロットし、そしてブロットを、図5に示されるように、室温で1時間、1%BSAにより阻止した。
【0083】
ウェスターンブロットのために、膜を、TBS−Tween(0.05%のTween−20TM を含むトリス−緩衝溶液)中、1:2000の受容体抗体血清により2時間、処理し、TBS−Tweenにより洗浄し、1:15,000のホースラディシュペルオキシダーゼ−接合された抗−ウサギIgGにより1時間プローブし、洗浄し、そして次に、図5に示されるようにして、ECL(Enhanced Chemiluminescence)、Amersham, Arlington Heights, ILにより示した。
【0084】
リガンドブロットのために、膜を、室温で1時間、ビオチニルされたTSP−1(5μg/ml)又はビオチニル化されたCys (Acm)−Ser−Val−Thr−Cys(Acm)−Gly(配列番号6)(5μg/ml)により処理し、TBS−Tweenにより洗浄し、1:2000のホースラディシュペルオキシダーゼ−アビジンにより1時間プローブし、洗浄し、そして次に、図6に示されるように、ECL(Enhanced Chemiluminescence), Amersham, Arlington Heights, ILにより示した。
【0085】
TSP−1及びCys (Acm)−Ser−Val−Thr−Cys(Acm)−Gly(配列番号6)の両者を、Pierce タンパク質ビオチニル化プロトコール(EZ−Link Sulto−NHS−LC−Biotin, Pierce Chemical Co. Rockfort, Ill)を用いてビオチニル化した。反応しなかったビオチンは、透析により除去された。
【0086】
例6:TSP −1への変性されていないアンジオシジン結合の評価
TSP−1への変性されていない(上記のリガンドブロットプロトコールにおいて、受容体はSDSにより変性される)組換え受容体の結合を、Affinity Sensor System, Cambridge, UKを用いて評価した。それは、リガンド又は受容体のいずれかが共有結合されているキュベットを用いる光学結合方法である。レーザー線を用いて、タンパク質−誘導体化されたキュベット表面に結合されるタンパク質を検出する。この方法は非常に敏感であり、そしてリガンド受容体相互作用のための会合及び解離速度定数の両者を測定する。この計測器は、受容体の1つの分子がTSP−1の1つの分子を結合することを想定し、そして次の関係に従って、解離定数(KD)を計算する:
【0087】
1)平衡でのkass [R] [TSP−1]=kdiss [R−TSP−1], ここでkassは会合のための2次速度定数であり、そしてkdissは解離のための1次速度定数であり;
2)KD=[R] [TSP−1]/[R−TSP−1]=kdiss/kass;
3)[R−TSP−1]l=[R=TSP−1]eq [1−exp (−kont)], ここでアーク秒での計測器応答測定は、受容体−TSP−1複合体R−TSP−1に比例し;
4)kon=kass [L] +kdiss、ここでkonは受容体TSP−1相互作用のための擬似−1次速度定数である。
【0088】
約1μgのTSP−1を、キュベット表面上のCOOH基側のそのアミノ基を通してキュベットに結合した。次に、キュベット表面上の未反応基を、エタノールアミン及びアルブミンにより阻止した。HEPE緩衝溶液(pH7.00)における189nM以上の濃度での受容体は、7分後、飽和できる結合を示し、そして結合が緩衝液により部分的に解離され、又は図7に示されるように、解離のための擬似−1次速度定数−対−受容体の濃度のプロットから計算した。図8に示される、計測器応答−対−時間読み取り(ここで、計測器応答は受容体−TSP−1複合体の濃度に比例する)を用いて、図7上のデータ点をプロットした。
【0089】
緩衝液への洗浄剤Tween20の添加は、特異的結合と一致する結合を変更しなかった。さらに、10倍モル過剰のCys (Acm)−Ser−Val−Thr−Cys(Acm)−Gly(配列番号6)、すなわちTSP−1タイプ1反復体ドメインの存在下での受容体結合の程度は、緩衝液対照の47%であり、ところが10倍モル過剰のスクランブルペプチド、すなわちVal−Cys(Acm)−Thr−Gly−Ser−Cys(Acm)(配列番号7)は、緩衝液対照の88%であり、このことは、結合がCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)配列を含むペプチドと部分的に競争できることを示唆する。それらの結果は、TSP−1を結合するタンパク質のクローニングを示す。
【0090】
例7:固定された TSP −1へのアンジオシジン及びペプチド結合の評価
例6に示される方法に従った。但し、TSP−1をキュベット上に固定し、そして次の溶液の1つを添加した:受容体のみ、ペプチド+受容体(ペプチド:受容体、1000モル比及び100モル比)。使用されるペプチドは、次のものであった:Val−Cys−His−Ser−Lys−Thr−Arg(配列番号8)、Val−Cys(Acm)−His−Ser−Lys−Thr−Arg(配列番号9)及びPro−His−Ser−Arg−Asn(配列番号10)。最初の2種のペプチドは受容体の結合部分に由来し、ここでそれは、TSP−1タンパク質のCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)部分と相互反応する。第3のペプチドは対照である。
【0091】
図9は、ペプチドVal−Cys−His−Ser−Lys−Thr−Arg(配列番号8)が、TSPに結合し、そして受容体の結合を競争的に阻害することによって、固定されたTSP−1による受容体の結合を阻害することを示す。この相互作用は、異なったモル比のペプチド:受容体を比較することによって見出されるように、濃度と相互関係する。
【0092】
さらに、図10は、キュベットに固定されたTSP−1への受容体−由来のペプチドの直接的な結合を示す。正の対照として受容体及び負の対照としてPro−His−Ser−Arg−Asn(配列番号10)を用いれば、ペプチドVal−Cys−His−Ser−Lys−Thr−Arg(配列番号8)及びVal−Cys(Acm)−His−Ser−Lys−Thr−Arg(配列番号9)が固定されたTSP−1に直接的に結合することが見出され得る。
それらの図は、本発明の受容体上のVal−Cys−His−Ser−Lys−Thr−Arg(配列番号8)領域がTSP−1タンパク質に結合することを示す。
【0093】
例8:固定された TSP −1及び C(Acm) SVTC (Acm) G ( 配列番号6 ) へのアンジオシジン結合の評価
例6に示される方法に従った。但し、TSP−1及びCys (Acm)−Ser−Val−Thr−Cys(Acm)−Gly(配列番号6)をキュベット上に固定し、そして受容体をキュベットに添加した。ペプチドのAcm部分を用いて、実験におけるその安定性を高めた。
図11は、TSP−1及びペプチドの両者が受容体に結合することを示す。これは、TSP−1のCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)領域が受容体に結合することを示す。
【0094】
例9:アンジオシジンの表面標識
損なわれていない、増殖性のA549肺癌細胞を、Tuszynskiなど., Anal. Biochem. 106: 118−122 (1980) により記載のようにして、ラクトペルオキシダーゼを用いて、125I−ヨウ素により表面標識した。手短には、細胞のほぼ集密性単層を含む75mmフラスコを、10mlのDMEMにより3度すすいだ。次に、細胞層を、0.2単位/mlのラクトペルオキシダーゼ500μCiの125I−ヨウ素を含むDMEM5mlにより被覆した。30%H2O2の5個の1μアリコートを、1分間隔で、軽く混合しながら添加した。次に、反応を、5μlの1mMのNaN3の添加により停止し、単層をDMEMにより3度洗浄し、そして、細胞をCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)結合タンパク質の精製のために収穫した。
【0095】
標識された材料のSDS−ゲル電気泳動、続くオートラジオグラフィーによる分析は、インビトロヨウ素化により標識される、非還元条件下での分子量50,000のポリペプチドが標識されたことを示した(図4、レーン5)。
受容体は、60分後、時間−無関係になる時間−依存性態様でTSP−1を結合した。結合は、1mMのCaCl2及び1mMのMgCl2の存在下で最大であり、そして少量ではあるが、しかし有意な量の結合が1mMのEDTAの存在下で生じた。この例は、受容体及びTSP−1が時間−依存性態様で結合すると共に、また、受容体が細胞の表面上で発現されることも示す。
【0096】
例 10:アンジオシジンの免疫組織化学
図12は、乳癌における受容体の局在性を示す。この腫瘍は、図の右側の2種の島と共に、図の中央に大きな垂直のストライプに位置する。右及び左側に位置するより小さな細胞は炎症性細胞であり、そして大きな白色細胞は脂肪組織である。比較のために、一群の正常な乳管が図の低部左側のコーナーに示される。
【0097】
組織を、冷95%エチルアルコールに10分間、固定し、そしてパラフィンにより包埋した。切片(5μm)を切断し、ガラス顕微鏡スライド上に固定した。スライドからパラフィンを除去し、そして等級化されたキシレン−エタノール溶液における連続的なインキュベーションにより再水和化した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、3%H2O2による5分間の処理、続く水洗浄により停止した。次にスライドをリン酸緩衝溶液(PBS)により洗浄し、そして0.1%BSAを含むPBS(PBS−BSA)中、一次IgG(免疫又は非免疫IgGのいずれか)の5〜20μg/ml溶液により30分間、処理した。
【0098】
PBS−BSAでの洗浄の後、スライドを、ビオチニル化された二次抗体の1:250希釈溶液により30分間、処理し、洗浄し、そしてVectastain ABC
【0099】
Immunoyeroxidase Stainlng kit, Vector Laboratories (Burlingame), (A)により提供される方法にしたがって展開した。次に、スライドを、ヘマトキシリンにより対比染色し、カバーガラスにより固定し、そして明るい視野の顕微鏡により試験した。
染色された受容体は、腫瘍細胞の境界近くで可視化され得るが、しかし低部左側のコーナーにおける正常細胞近くでは可視化され得ない。これは、受容体が細胞膜に関係し、そして受容体が腫瘍細胞においてより濃縮されることを示す。
【0100】
例 11:過渡的トランスフェクション及び細胞付着アッセイ
ウシ大動脈内皮細胞(BAEC)及びMDA−MB−231細胞、すなわち乳癌細胞を、Wizard Plus kit (Promega, WI) により、受容体をコードする精製されたDNAによりトランスフェクトした。DNAを、Superfect トランスフェクション試薬(Qiagen, CA)を用いて、細胞中に組み込む。細胞を6のウェルプレートにプレートし、そして80%の集密性に基づいて、トランスフェクションを行う。試薬12μlを、2.5μgのDNAと共に、0.1μg/μlの最小濃度で使用した。Superfect−DNA複合体形成を、血清フリー及び抗生物質フリーの培地いおいて行った。細胞を37℃で3〜4時間インキュベートした。次に、培地を交換し、そしてトランスフェクションの48時間後、それらを付着アッセイのために収穫した。
【0101】
付着アッセイに関しては、96ウェルにプレート中の二重のウェルをTSP−1(40μg/ml)、フィブロネクチン(40μg/ml)又は/及び1%ウシ血清アルブミン(BSA)により被覆した。ウェルを一晩乾燥せしめ、そして次にBSAにより阻止した。2×105個の細胞を含む懸濁液100μlを、タンパク質被覆されたウェルにプレートし、そして37℃で20分〜1時間インキュベートした。非付着性細胞を回収し、そしてウェルをHepes緩衝液により洗浄した。付着細胞を、2.5%のグルタルアルデヒドにより10分間、固定し、そして0.2%Giemsaにより染色した。その染色を洗浄し、そして細胞を1mm2の区画から計数した。BSAに付着する細胞をバックグラウンドとして見なし、そしてフィブロネクチンに付着する細胞は正の対照であった。それらのデータは、図13に示される。
【0102】
例 12:一時的トランスフェクション及び細胞付着アッセイ
例11の方法に従った。但し、受容体ペプチドVal−Cys−His−Ser−Lys−Thr−Arg(配列番号8)及びVal−Cys(Acm)−His−Ser−Lys−Thr−Arg(配列番号11)をプレート上に固定した。TSP−1及びフィブロネクチン、並びに負の対照ペプチド[Ala−Ser−Val−Thr−Ala−Arg(配列番号11)及びPro−His−Ser−Arg−Asn(配列番号10)]及びウシ血清アルブミンを、プレート上に固定した。この実験の結果(図14)は、受容体ペプチドが、正の対照フィブロネクチン及びTSP−1への類似する親和性を伴って、プレートへの前記細胞の付着を引き起こすことを示す。これは、もう1つのタンパク質がTSP−1及びその受容体に関連し、又は受容体が開放され、そしてもう1つのタンパク質により細胞の膜に再結合される理論についての支持を提供する。
【0103】
例 13:一時的トランスフェクション及び細胞付着アッセイ
例12の方法にしたがって。但し、全受容体タンパク質をプレート上に固定し、そしてTSP−1 cDNA又はベクター対照のいずれかによりトランスフェクトされた細胞をプレートに適用した。天然においては、低レベルのTSP−1を発現する細胞をトランスフェクトし、タンパク質を過剰発現した。図15は、TSP−1 cDNAによりトランスフェクトされた細胞が対照細胞系よりも受容体タンパク質を有するプレートに、より結合したことを示す(2.5倍良好に、p<0.001)。フィブロネクチン及びBSAを、細胞付着のために、それぞれ、正及び負の対照として使用した。この証拠は、本発明の受容体がトロンボスポンジンに結合する理論を支持する。
【0104】
この特定の相互作用を、抗−TSP−1抗体、すなわちCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)、及び対照IgGを前記システムに添加することによって確かめた。図16は、抗−TSP−1及び抗−Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)抗体の両者がプレートに結合される受容体へのTSP−1発現細胞の付着を阻害したことを示す。
【0105】
さらに、付着システムへの溶液における結合されなかった受容体の添加は、プレートへの細胞の付着を低めた。図17は、受容体自体が、プレートに結合される受容体への、トランスフェクトされなかった、天然においてTSP−1を発現する細胞の付着を競争的に阻害することを示し、このことは、これが付着を引き起こす相互作用であることを示すことを助ける。
【0106】
例 14:アンジオシジン、すなわち TSP −1受容体に対する抗体の生成
生来又は合成(組換え)Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体タンパク質を用いて、抗体、すなわちポリクローナル及びモノクローナル抗体を生成することができる。ポリクローナル抗体が所望される場合、精製された受容体タンパク質を用いて、選択された哺乳類(例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、等)を免疫化し、そしてその免疫化された動物からの血清を集め、そして既知方法に従って処理した。
【0107】
受容体タンパク質の他に、種々の抗原に対するポリクローナル抗体を含む組成物は、受容体が結合されているカラムに組成物を通すことによって、抗−受容体タンパク質抗体でない抗体を実質的に有さないようにされ得る。洗浄した後、受容体に対するポリクローナル抗体をカラムから溶出する。モノクローナル抗−受容体タンパク質はまた、当業者により容易に生成され得る。
【0108】
ハイブリドーマーによりモノクローナル抗体を製造するための一般的な方法は、良く知られている。不滅の抗体−生成細胞系はまた、融合以外の技法、たとえば腫瘍DNAによるBリンパ球の直接的形質転換、又はEpstein−Barrウィルスによるトランスフェクションにより創造され得る。例えば、M. Schreier など., “Hybridoma Techniques” (1980): Hammerling など.,” Monoclonal Antibodies and T−Cell Hybridamas” (1981); Kennett など., “Monoclonal Antibodies” (1980) を参照のこと。
【0109】
モノクローナル抗体の生成のために不滅化されたB−細胞源の免疫化において抗原としてTSP−1受容体タンパク質(生来又は合成)を用いることによって、受容体タンパク質分子上の異なった部位でのエピトープを認識する一連のモノクローナル抗体を得ることができる。受容体タンパク質の結合領域におけるエピトープを認識する抗体は、抗体とTSP−1との間での競争アッセイにおいて容易に同定され得る。そのような抗体は、それらがTSP−1ペプチド結合に関連する生理学的応答を刺激しないで、インビボでその受容体へのTSP−1の結合を阻止できる場合、治療可能性を有する。
【0110】
特に、ポリクローナルCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体抗血清を、3〜4週ごとに、4回の50μgの注射の後、標準方法によりウサギにおいて生ぜしめた。第1回の注射は、完全フロイントアジュバントと共に与えられ、そして続く注射は不完全フロイントアジュバントと共に投与された。抗体力価及び特異性を、ELISAにより決定した。生来の精製された受容体をこの例に使用した。
【0111】
ELISAアッセイを、標準方法に従って行った。手短には、マイクロタイタープレートを、2μgのCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体、フィブロネクチン又はBSAにより被覆し、そして1%BSAにより1時間、阻止した。ウェルを、150mMのNaCl及び0.05%のTween−20を含む、10mMのリン酸緩衝液(pH7.4)(PBS−T)中、第1抗体の種々の希釈溶液50μlと共に1時間インキュベートした。
【0112】
次に、ウェルを、PBS−Tにより3度、洗浄し、そしてアルカリホスファターゼ結合されたウサギ抗−ヤギIgGのPBS−Tにおける1:800希釈溶液50μlと共に1時間インキュベートした。ウェルをPBS−Tにより3度洗浄し、続いて、Tween−20を含まないPBS−T緩衝液により3度洗浄し、そして50μlのアルカリホスファターゼ基質溶液(0.10Mのグリシン中、1mg/mlのP−ニトロフェニルホスフェート、pH10.4、1mMのZnCl2及び1mMのMgCl2)により処理した。30分後、色彩進行を、1NのNaOH5μlの添加により停止し、そして吸光度を405nmで決定した。
抗体は、表1に示されるように、直接的なELISAにより決定される場合、単一特異的であった。
【0113】
【表1】
【0114】
例 15:抗体による付着阻害
次の実験を行い、TSP−1への癌細胞の付着を阻害する抗−Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体抗体の能力を決定した。A549肺癌は、トロンボスポンジン受容体タンパク質を発現する。分離できるマイクロタイターウェル(Immulon 4 Removawall)を、50μlのTSP−1(40μg/ml)、フィブロネクチン、又は20mMのビス−トリス−プロパン緩衝液(pH6.5)中、ラミニン溶液のいずれかにより、4℃で一晩被覆し、そして200μlの1%BSAにより1時間、阻止した。A549細胞、及び抗−Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体又は非免疫抗血清のための200μg/mlのIgGを、30分間インキュベートし、そして遠心分離し、結合されなかった抗体を除去した。
【0115】
ペレットを、DMEMに再懸濁し、そして細胞を37℃で60分間、タンパク質−被覆されたウェルにおいてインキュベートした。マイクロタイターウェル表面に付着する細胞の数を計数した。表2における結果は、非−免疫IgG−処理された付着細胞の%として表される。表2は、抗−Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的受容体抗体が、TSP−1−被覆された表面へのA549細胞付着を阻害するが、しかしフィブロネクチン又はラミニンへの細胞付着に対する効果を有さなかった。抗体はまた、組織培養プラスチックへのTSP−1の付着も阻害した。
【0116】
【表2】
【0117】
例 16:脈管形成に対するアンジオシジンの効果
脈管形成に対するアンジオシジンの効果を評価するための実験を行った。ウシ大動脈内皮細胞(BAEC)を、コラーゲンマトリックス上にプレートした。次に、細胞をコラーゲンにより積層した。アンジオシジン(37μg/ml)を、処理プレートにおける細胞の上部に添加し、そして対照プレートは緩衝液のみを受けた。24時間後、相対比顕微鏡写真(200倍)を取った。結果は図18に示される。対照プレートにおいては、BAEC細胞が、毛細血管網中に再配置した。しかしながら、アンジオシジンにより処理されたプレートにおいては、毛細血管は形成せず、そして細胞は死滅したように思えた。
【0118】
このコラーゲンアッセイは、脈管形成のための十分に認識されたモデルである。Qian など., Thrombospondin−1 modulates angiogenesis in vitro by up−regulation of matrix metalloproteinase−9 in endothelial cells, Exp. Cell Res. 235: 403−412 (1997)。それらの結果は、アンジオシジンが脈管形成の効果的インヒビターであることを示す。
【0119】
例 17:毛細血管安定性に対するアンジオシジンの効果
この例における実験は、例16における通りに行われた。しかしながら、処理は最初に細胞に対して行われなかった。24時間後、毛細血管が両サンプルにおいて形成し、そして図19における対照プレートに類似するように見えた。次に、緩衝液及びアンジオシジンを、それぞれ対照及び処理プレートに添加した。さらに24時間後、Hoffman干渉顕微鏡写真を取った。ここで、対照は影響を及ぼされなかった。しかしながら、アンジオシジンの添加は、処理プレートにおいてすでに形成した毛細血管を破壊した。結果は、図19に示される。これは、アンジオシジンが脈管形成を妨げるのみならず、また血管の形成を逆転せしめたことを示す。
【0120】
例 18:ウシ大動脈内皮細胞の形態学に対するアンジオシジンの効果
この実験においては、単層培養物におけるBAEC細胞を、上昇する濃度のアンジオシジン(対照=ナシ、0.37μg/ml, 3.7μg/ml, 37μg/ml)の存在下で、1%BSAを含む血清フリーの培地において24時間プレートした。Hoffman干渉顕微鏡写真機(100倍)を用いて、細胞の写真を取った。アンジオシジンの濃度の上昇につれて、BAEC細胞は細長くなり、プレートから分離し、凝集し、そして死滅した。結果は、図20に示される。
【0121】
例 19:細胞生存性に対するアンジオシジンの効果
ウシ大動脈内皮細胞(BAEC)、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)、繊維芽細胞、A549ヒト肺癌細胞(A549)、MDA−MB231ヒト乳癌細胞(MB231)、MCF7ヒト乳癌細胞(MCF7)を、37μg/mlの受容体、又は緩衝液のみにより、24時間、処理した。細胞の生存性を、ALAMAR BLUETM 染料を代謝する細胞の能力を測定するALAMAR BLUETM アッセイを用いて測定した。ALAMAR BLUETM アッセイ(Biosource International, Camarillo, CAから入手できる)は、細胞の増殖を定量的に測定し、そして化学剤の相対的細胞毒性を確立することができる。
【0122】
このアッセイは、代謝活性の検出に基づいての蛍光比色/比色定量増殖インジケーターを組み込んでいる。このシステムは、細胞増殖に起因する増殖培地の化学的還元に応答して、蛍光を発し、そして色彩を変える酸化−還元(レドックス)インジケーターを組み込んでいる。これは、その酸化された、非蛍光の青色形から、その還元された、蛍光の赤色形へのレドックスインジケーターの変化を引き起こす。データは、蛍光に基づく計測(530〜560nmの励起波長及び590nmの発光波長)、又は吸光度に基づく計測(570及び600nm)のいずれかを用いて集められ得る。
【0123】
BAEC及びHUVEC細胞系は、受容体の存在下で低められた生存性を有し、このことは、TSPが、図21に示されるように、それらの細胞系における生存性のための必要条件であることを示唆する。内皮細胞生存性は、アンジオシジンによる処理細胞の後、70〜80%低められる。有意な差異は、線維芽細胞、A549, MB231及びMCF7細胞系においては見出されず、このことは、TSPがそれらの細胞の生存性のための必要条件ではないことを示唆する。
【0124】
例 20:ウシ大動脈内皮細胞( BAEC )及びウシ平滑筋細胞( BSM )の生存性に対するアンジオシジンの効果
BAEC及びBSM細胞を、上昇する濃度のアンジオシジン(0, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 15, 26及び37μg/ml)により24時間、処理した。細胞生存性を、ALAMAR BLUETM アッセイを用いて測定した。アンジオシジンは、BAEC細胞生存性の用量依存性阻害性を有し、図22に示されるように、1次の単一定数の指数破壊曲線を示す。対照的に、BSM細胞は影響を受けていない。
【0125】
同様に、BAEC細胞の生存性に対する受容体の効果を、同じ方法を用いて、マウスLewis肺癌細胞と比較した。アンジオシジンは、BAEC細胞の生存性を低めるが、しかし図23の示されるように、Lewis 肺細胞には影響を及ぼさない。これは、アンジオシジンがLewis肺細胞の生存性を直接的に影響を及ぼさないことを示す。同じ実験を、HUVEC細胞に対して行い、そしてアンジオシジンはそれらの生存性を低めた。結果は図24に示される。
【0126】
例 21:ヒト臍静脈内皮細胞の生存性に対するアンジオシジンの効果
HUVEC細胞生存性に対するアンジオシジンの効果を評価し、そしてFGF及びTSP−1を添加し、それらが細胞生存性に対するアンジオシジン効果を改善するかどうかを決定した。FGF(線維芽細胞増殖因子)は、細胞増殖を促進する内皮細胞ミトゲンである。FGF(2ng/ml)及びTSP−1(20μg/ml)の両者は単独で、対照以上に細胞増殖を刺激した。しかしながら、FGF又はTSP−1のいずれの添加も、アンジオシジン(37μg/ml)の阻害を逆転しなかった。結果は図25に示される。TSP−1は、アンジオシジンの阻害を逆転することが予測されるが;しかしながら、添加される量は正しいモル比を提供するためには不十分である。
【0127】
例 22:ウシ大動脈内皮細胞の受容体介在された生存性
例21の方法に従った。但し、BAEC細胞を使用した。さらに、TSP−1を、20μg/ml 及び5μg/mlの両者で添加した。図26に示されるように、それらの結果は、TSPが、対照に比較して、アンジオシジンのいくらかの阻害を改善できることを示す。
【0128】
例 23:受容体結合アッセイ
受容体結合アッセイについての略図が図27に示されている。次の実験においては、TSP−1を、支持体に共有結合し、ビオチニル化されたアンジオシジンをプレート添加し、そしてアビジン−ペルオキシダーゼを添加し、いかに多くのビオチニル化されたアンジオシジンがTSP−1に結合されたかを測定した。アビジン−ペルオキシダーゼを、450nmの吸光度で分光計を用いて測定した。
固定されたTSP−1へのアンジオシジンの結合が、図28に示される。その結果は、Kb=9nMを有する飽和可能結合を示す。BSAを、負の対照として使用した。
【0129】
遊離アンジオシジンを、システムに添加し、ビオチニル化されたアンジオシジンと比較した。図29は、TSP−1へのビオチン−アンジオシジン複合体の結合に対するアンジオシジンの競争効果を示す。固体されたBSAを負の対照として使用した。アンジオシジン:ビオチン−アンジオシジン複合体の比を高めることにより、その結合は直線的に低下した。
【0130】
TSP−1ペプチドCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)をシステムに添加し、ビオチニル化されたアンジオシジンを含む、結合についてのプレートに基づいて、TSP−1と競争せしめた。Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)は、図30に示されるように、ビオチン−アンジオシジン複合体に対してTSP−1と効果的に競争した。スクランブルされたペプチドVal−Cys−Thr−Gly−Ser−Cys(配列番号15)を、負の対照として使用し、そして効果は有さなかった。
【0131】
例 24:アンジオシジン結合ペプチドの同定
New England Biolabs (Bererly, MA) からのファージ表示ペプチドライブラリーキットを用いて、アンジオシジンに結合するペプチドを同定した。ファージ表示されたペプチドのライブラリーを、標的受容体により被覆されたプレート(又はビーズ)と共にインキュベートし、結合されなかったファージを洗浄し、そして特異的に結合されたファージを溶出した。次に、溶出されたファージを増幅し、そして最も強い結合配列のためにファージのプールを連続的に富化するために、バイオパンニング及び増幅の追加のサイクルを行った。3回のサイクルの後、個々のクローンを、DNA配列決定及びELISAにより特徴づけられた。
【0132】
ファージ表示ライブラリーは、図31に示されるように、多くの受容体結合ペプチドを同定した。それらのペプチドは、図31に示され、そして次の通りである:
Lys−Ser−Trp−Val−Ile−Pro−Gln(配列番号16)
Lys−Leu−Trp−Val−Ile−Pro−Gln(配列番号17)
Lys−Val−Trp−Val−Leu−Pro−Ile(配列番号18)
Lys−Val−Trp−Val−Leu−Ile−Pro(配列番号19)
Lys−Val−Trp−Val−Leu−Pro−Ile(配列番号18)及び
Lys−Val−Trp−Ile−Val−Ser−Thr(配列番号20)。
【0133】
図31における個々の系は、配列決定された8個のクローンの1つを表す。ペプチド間の差異は非常に小さく、電荷及び種類(例えば、疎水性、芳香族又は親水性)に関する保存性アミノ酸置換のみが存在する。
それらの配列はTSP−1からの線状配列ではないので、それらはTSP−1折りたたまれたタンパク質において活性部位を表すことができると思われる。他方では、それらは、アンジオシジンに結合する追加のタンパク質からの配列を表すことができる。
【0134】
例 25:TSP −1及びアンジオシジン結合のペプチド競争
上記アビジン−ビオチンシステムを用いて、TSP−1及びアンジオシジンの結合に対する種々のペプチドの競争効果を評価した。例24に論じられるように、ファージ表示により同定されるペプチドlys−Val−Trp−Val−Leu−Pro−Ile(配列番号18)は、図32に示されるように、結合を阻害した。さらにCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)ペプチドは、結合を効果的に阻害した。
【0135】
より安定性のアセチル化されたペプチドCys(Acm)−Ser−Val−Thr−Cys(Acm)−Gly(配列番号6)もまた、結合を阻害した。鏡像のアセチル化されたペプチドd−Gly−Cys(Acm)−Thr−Val−Ser−Cys(Acm)(配列番号23)は、それが同じ立体配置を有するので、たぶん結合を阻害した。スクランブルされたペプチドVal−Cys−Thr−Gly−Ser−Cys−Gly(配列番号21)及びd−配列ペプチドd−Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号22)を、負の対照として使用した。
【0136】
例 26:HAEC 及び HMVEC − L 細胞の生存性に対するアンジオシジンの効果
例18において論じられたように、アンジオシジンを、ヒト大動脈内皮細胞(HAEC)及びヒト肺毛細血管内皮細胞(HMVEC−L)に添加した。アンジオシジンは、ALAMAR BLUETM アッセイにより測定され、そして図33に示されるように、両細胞系の生存性に対して負の効果を有した。
【0137】
例 27:ウシ大動脈内皮細胞の生存性に対するアンジオシジン及びそのフラグメントの効果
上記例19において論じられたように、アンジオシジンをBAEC細胞に添加した。アンジオシジンのフラグメントを同様に添加した。図34は、アンジオシジン及びアミノ末端フラグメントMet1−Lys132(アミノ末端側に結合されるGSTと共に、GST融合タンパク質として発現される)は、細胞生存性を阻害した。アンジオシジンの中央ドメイン及びカルボキシ末端は、細胞生存性に影響を及ぼさなかった。GSTを、負の対照として使用した。V36−R42、すなわち抗分泌因子の活性部位は、効果を有さず、これは、アンジオシジンが抗分泌因子とは異なった役割を演じることを示す。
【0138】
例 28:Lewis 肺癌側腹部腫瘍の増殖に対するアンジオシジンの効果
10匹の動物の側腹部に、105個のLewis肺癌細胞を皮下注射した。側腹部腫瘍の評価は、側腹部腫瘍が脈管形成に非常に依存するので、脈管形成のための十分に認識されたモデルである。O’Reilly, M.S., Angiostatin: A Novel Angiogenesis Inhibitor that Mediates the Suppression of Metastasis by a Lewis Lung Carcinoma, Cell 79: 315−28 (1994)。9日後、腫瘍が増殖する場合、マウスを2つのグループ(1つのグループは5匹の動物を有する)に分けた。5匹のマウスの1つのグループを、Hepes 緩衝溶液中、50μgのアンジオシジンのIV注射により処理した。対照グループを、Hepes緩衝溶液により処理した。マウスを、グループ分けした後、1, 3及び5日目で処理し、そして7日目に殺した。
【0139】
図35は、対照及び処理グループにおける側腹部腫瘍の進行を示す。皮膚を除去し、ボックスにより印を付けられている腫瘍を露出した。アンジオシジンマウスにおける腫瘍は、対照マウスよりも、より小さかった。さらに、アンジオシジンマウスにおける腫瘍は、柔らかく、壊死性であり、そして圧力が適用されると、つぶれた。対照マウスの腫瘍は、硬く、激症性で、刺激的で、且つ攻撃的に増殖する。
【0140】
腫瘍を、パラフィンに包埋し、そして5ミクロンの切片に切断した。切片を、ヘモトキシリン及びエオシンにより染色した。ヘモトキシリンはDNAを青色に染色し、そしてエオシンはタンパク質をピンク色に染色する。図36は、対照(パネルA及びC)とアンジオシジン(パネルB及びD)処理された細胞との間の差異を示す。パネルA及びBは、光顕微鏡下で400倍の倍率であり、そしてパネルC及びDは、光顕微鏡下で200倍の倍率であった。アンジオシジンにより処理された細胞は、有意な壊死及び細胞の死を示す。
【0141】
図37は、次のようにして測定される、相対的腫瘍体積を示す:
【数1】
測定を、全7日目の処理期間、行った。対照腫瘍は非常に増殖したが、ところが処理腫瘍は、単にわずか、及び直線速度で増殖した。これは、アンジオシジンが腫瘍増殖及び脈管形成に対して有意な効果を有したことを示す。
【0142】
例20と組み合わせると、この例は、アンジオシジンが脈管形成に対して直接的に影響を及ぼすが、しかしLews 肺腫瘍細胞自体には影響を及ぼさなかったことを示す。従って、腫瘍増殖腫瘍生存性に対する効果は、脈管形成に対する効果の結果である。ガス交換及び栄養物を確保する正しい血液供給を伴わない場合、脈管化に依存する2mm3以上の側腹部腫瘍は、生存することができない。
【0143】
例 29:Lewis 肺を有するマウスの生存研究
10匹のマウスに、百万個のLewis肺癌腫瘍細胞を、IV注射により注射した。3日間のインキュベーションの後、マウスを2つのグループに分けた。5匹のマウスから成る1つのグループを、Hepes緩衝溶液中、50μgのアンジオシジンのIV注射により処理した。5匹のマウスの対照グループを、Hepes緩衝溶液により処理した。マウスは、1, 3, 5, 7及び9日目に処理された。
【0144】
2種のグループの生存性を評価した。中位のレベルの処理(1日おきに、及び9日目に終結する)のみによってさえ、アンジオシジングループは、対照グループ(16日)よりも長いメジアン生存期間(19日)を有した。
肺腫瘍は、肺はそのような高い血管化された部分であり、そして腫瘍はさらなる血管化に有意に依存する必要はないので、脈管形成のための非常に良好なモデルではない。それにもかかわらず、これは、アンジオシジンが癌性肺腫瘍を効果的に処理し、その工程における寿命を延長することができることを示す。
【0145】
例 30:ヒト乳癌組織におけるアンジオシジンの局在化
ヒト侵入性乳癌腫瘍サンプル、及び対照としての良性及び正常組織サンプルを、イムノペルオキシダーゼ染色により染色した。サンプルを、TSP−1及びアンジオシジンに対するポリクローナル抗体によりラベルし、次に第1抗体に対する第2抗体を、サンプルに添加した。第2抗体は、基質DABと共に混合される場合、褐色を生成するペルオキシダーゼに接合された。すべての一次乳管癌サンプル(n=11)は、TSP−1及びアンジオシジンに関して、陽性に染色した。対照的に、すべての良性及び正常乳房組織は、TSP及びアンジオシジンに関して負に染色し、但し過形成を有する2種の線維嚢胞性乳房サンプルは除く。
【0146】
癌サンプルにおいては、TSP−1は、腫瘍に隣接する濃間質性コラーゲンにおいて染色し、そしてアンジオシジンは腫瘍細胞において染色した。それらの結果は、TSP−1の上昇する発現を示し、そして管上皮におけるアンジオシジンが腫瘍性転換と相互関係することを示す。
【0147】
例 31:ヒト頭部及び頸部腫瘍組織におけるアンジオシジンの局在化
ヒト頭部及び頸部腫瘍サンプルを、ヘマトキシリン、エオシン及びアンジオシジンにより染色した。その染色された腫瘍を、単一波長(620nm)で光を発し、そして染色された腫瘍部分の光学密度を測定するコンピュータービデオ顕微鏡により分析した。隣接する正常粘膜をまた、あらゆる検体のために分析した。特定の染色についての目的の抗体閾値を、負の対照切片(対照IgG)を分析し、そしてアンジオシジン染色された部分からこの値を引き算することによって、個々の検体のために定義した。
【0148】
この場合、%陽性受容体−染色細胞の正確な定量化を得た。像分析方法を用いて、本発明者は、高い陽性染色評点を有するそれらの患者が、高い毛細血管密度を有し、そして初期処理の12ヶ月以内に、転移性疾病により死亡したことを見出した。低い陽性染色評点を有する患者は、低い毛細血管数を有し、そして少なくとも2年間、疾病フリー状態を維持した。データは、下記表3に示される。
【0149】
【表3】
例 32:内毒素研究
アンジオシジンサンプルを、Sigma (St. Louis. Mo) から入手できる時間調整されたゲル形成内毒素キットを用いて、細胞培養物に影響を及ぼす汚染性内毒素が存在しないことを確かめるために、内毒素の存在について測定した。アンジオシジンサンプルは、0.0076pgの内毒素/μgタンパク質の測定値を与えられた。1ng以下のレベルは、組織培養のために安全であると思われる。従って、アンジオシジン自体が細胞生存性に対して阻害効果を有することは明白である。
【0150】
例 33:生存性研究
his標識されたアンジオシジンを、そのhis標識が細胞生存性に対していずれの効果も有さないことを示すために、his標識された対象GSTタンパク質と比較した。ウシ大動脈内皮細胞(BAEC)を、37μg/mlのhis−標識されたアンジオシジン又はhis−標識されたGSTのいずれかを含む、血清フリーの培地において一晩、培養した。アンジオシジン及びGSTの両者を、pTrcHisA発現ベクターにより形質転換された細胞において発現せしめ、そして非変性条件下でニッケル親和性クロマトグラフィー上で精製した。生存性を、ALAMAR BLUETM アッセイにより測定した。
【0151】
図39は、アンジオシジンが、上昇する濃度のアンジオシジンに伴って低下する生存性を有する、細胞生存性に対する用量依存性効果を有したことを示す。GSTは、細胞生存性に対していずれの効果を有さなかった。この研究は、非変性条件下で、すなわち変性条件よりも生理学的条件に近い条件下で、his標識が細胞生存性に対していずれの効果も有さないことを示す。
【0152】
例 34:BAEC 生存性のアンジオシジン−介在性阻害に対する抗−アンジオシジン抗体の効果
この研究は、BAEC生存性のアンジオシジン−介在性阻害に対する抗−アンジオシジン抗体の効果を試験した。BAECを、5μg/mlのアンジオシジン、5μg/mlのアンジオシジン+100μg/mlの対照IgG、又は5μg/mlのアンジオシジン+100μg/mlの抗−アンジオシジンIgGのいずれかを含む、血清フリー培地において一晩、培養した。生存性を、上記ALAMAR BLUETM アッセイを用いて測定した。
図40は、抗−アンジオシジンIgGがBAEC生存性のアンジオシジン阻害のすべてを実質的に排除したことを示す。対照IgGは、いずれの著しい効果も有さなかった。この例は、アンジオシジンの効果が特異的であり、そして調製におけるいずれかの汚染によらないことを示す。
【0153】
例 35:支持体への BAEC の付着に対するアンジオシジンの効果
この例は、支持体へのBAECの付着に対するアンジオシジンの効果を評価する。処理グループにおける細胞を、アンジオシジン(37μg/ml)により予備処理した。対照グループにおける細胞は、予備処理されなかった。細胞(50,000個)をすぐに、2μgのフィブロネクチン、TSP−1又はBSAのいずれかにより被覆されたマイクロタイターウェル上にプレートした。フィブロネクチンは、BAECを誘引し、そして正の対照として作用する強い細胞外マトリックスタンパク質であり、そしてBSAは付着タンパク質ではなく、そして負の対照として作用する。30分後、非付着性細胞をアスピレートし、ウェルをPBSにより洗浄し、2.5%のグルタルアルデヒドにより固定し、2%Giemsaにより染色し、そして1mm2当たりの付着細胞の数を計数した。
【0154】
図41は、この研究の結果を示す。アンジオシジンにより処理されなかった細胞においては、フィブロネクチングループは非常に強い付着性を示し、そしてTSP−1グループは強い付着性を示した。細胞がアンジオシジンにより処理された場合、フィブロネクチングループにおける細胞の付着性は同じ(非常に強く付着する)に存続したが、しかしTSP−1グループは付着性の鋭い低下を有した。
これは、アンジオシジンの添加が、TSP−1被覆されたプレートに対するBAECの付着性を有意に低めたが、しかし陽性対照のフィブロネクチンプレートに対するその付着性は低めなかったことを示す。アンジオシジンは、その付着機構を破壊する、TSP−1との特異的相互作用を有する。
【0155】
例 36:アンジオシジンのアミノ末端及びカルボキシ末端部分の官能性
この研究は、アンジオシジン(それぞれ配列番号24及び25)のアミノ末端(Met1−Lys132)及びカルボキシ末端(Ile248−Lys380)部分を試験する。変性されていない組換えアンジオシジンフラグメントの結合を、十分な長さのアンジオシジンと比較した。GSTを負の対照として使用した。結合を、TSP−1が共有結合されているキュベットを用いる光学結合方法を用いて評価した。レーザー線を用いて、試験タンパク質(フラグメント、アンジオシジン又はGST)がTSP−1誘導体化されたキュベット表面に結合されるかどうかを検出した。
【0156】
キュベットを、1μgのTSP−1により誘導体化した。キュベット表面を、1%BSA溶液によりブロックし、非特異的結合を妨げた。試験タンパク質を、PBS緩衝液において10nMの濃度で添加した。図42に示される結果は、アンジオシジン及びそのアミノ末端フラグメント(Met1−Lys132)の両者がナノモル範囲で非常に類似する結合性を有することを示す。図42は、アンジオシジンに比較しての%活性を示す。GST及びカルボキシ末端フラグメントの両者は、結合活性を示さない。
【0157】
例 37:アンジオシジンのアミノ末端及びカルボキシ末端部分の官能性
この研究は、アンジオシジン(それぞれ配列番号24及び25)のアミノ末端(Met1−Lys132)及びカルボキシ末端(Ile248−Lys380)部分を試験する。前記フラグメントの抗−内皮活性を、十分な長さのアンジオシジンタンパク質のその活性と比較した。
【0158】
内皮細胞(BAEC)を、37μg/mlのアンジオシジン、フラグメント及びGSTと共に一晩インキュベートした。生存性を、ALAMAR BLUETM アッセイを用いて測定した。
それらの結果はまた、アンジオシジンに比較してフラグメントの抗―内皮活性の%として、図42に示される。これは、アミノ末端が十分な長さのアンジオシジンと同じ抗−内皮活性を有することを示す。さらに、アミノ末端領域の結合及び抗−内皮活性は非常に良く相互関係する。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1(アンジオシジンの配列)は、アンジオシジン、すなわちCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly−特異的受容体タンパク質の配列(配列番号2)である。
【図2】
図2(アンジオシジンの配列)は、アンジオシジン、すなわちCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly−特異的受容体タンパク質の配列(配列番号3)である。
【図3】
図3(配列比較)は、図1及び2(配列番号4及び5)に同定される2種の受容体のDNA配列を比較する。
【図4】
図4(アンジオシジンSDS−PAGEゲル)は、アンジオシジン、すなわちCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly−特異的受容体タンパク質のSDS−PAGEゲルである。レーン1は、還元されていないタンパク質(染色された)である。レーン2は、還元されたタンパク質(染色された)である。レーン3は、還元されていないタンパク質(ラベルされた)である。レーン4は、還元されたタンパク質(ラベルされた)である。レーン5は、還元されていない表面ラベルされたタンパク質である。
【図5】
図5(組換えアンジオシジン)は、SDS−PAGE及びウェスターンブロットによる組換え受容体の分析である。発現された受容体、空のベクター対照及び精製されたhis−受容体を含む細菌抽象抽出物を、SDS−PAGEにより分析し、そして抗−受容体抗体によりブロット染色した。ウェルターンブロットに関しては、膜を、TBS−Tween(0.05%Tween−20を含むトリス−緩衝溶液)中、1:2000の受容体抗体血清により処理し、TBS−Tweenにより洗浄し、1:15,000のホースラディシュペルオキシダーゼ−接合抗−ウサギIgGにより1時間プローブし、そして次に、ECL(Enhanced Chemiluminescence), Amersham, Arlington Heights, ILにより示した。種々のパネル及びレーンは次の通りである:パネルA、染色されたゲル、パネルB、抗−受容体抗体ブロット;及び1予備染色されたMW標準、2挿入体を有さない洗浄剤細胞抽出物、3受容体挿入体を有する洗浄剤細菌抽出物、4還元されたhis−標識精製された受容体、5還元されていないhis−標識精製された受容体及び6予備染色されたMW標準。
【図6】
図6(アンジオシジンへのTSP−1及びペプチドの結合)は、組換え受容体へのTSP−1及びCys(Acm)−Ser−Val−Thr−Cys(Acm)−Gly(配列番号6)の結合を示す。発現された受容体を含む細菌溶解物(レーン2, 4, 7)又は発現された受容体を含まない対照溶解物(レーン1, 3, 6)のSDS−PAGEブロットを、抗−受容体抗体(レーン1, 2)、ビオチニル化されたTSP−1(レーン3, 4)、又はビオチニル化されたCys(Acm)−Ser−Val−Thr−Cys(Acm)−Gly(配列番号6)(レーン6, 7)により染色した。
【図7】
図7(トロンボスポンジン−1に結合する受容体)は、受容体−TSP−1結合定数の決定を示す。TSP−1への受容体の結合性を、Affinity Sensor System, すなわち共鳴ミラーバイオセンサーシステムを用いて、相互作用分析により決定した。TSP−1を、キュベットに結合し、そして受容体を添加した。この図は、図8に示される計測器の応答−対−時間のプロットから得られる擬似1次速度定数のプロットを示す。
【図8】
図8(トロンボスポンジン−1に結合する受容体)は、受容体−1結合定数を決定するために使用される原データを示す。TBS−1への受容体の結合を、共鳴ミラーバイオセンサーシステムを用いて、相互作用分析により決定した。この図は、図7におけるデータ点をプロットするために使用されるサンプル計測器の応答−対−時間を示す。計測器の応答は、受容体−TSP−1複合体の濃度に比例する。
【図9】
図9(TSP−1に結合する受容体に対する受容体ペプチドの効果)は、Affinity Senson system を用いて、TSP−1に結合する受容体に対する受容体ペプチドの効果を示し、ここでTSP−1がキュベットに結合され、そして受容体結合が測定される。受容体のみ、及び受容体+ペプチド(2種の異なったモル比で)を添加した。受容体ペプチド、及びランダムの負の対照を試験し、結合を阻害するそれらの能力を測定した。
【図10】
図10(TSP−1への受容体及びペプチドの結合)は、キュベット上に固定されたTSP−1への受容体のみ、及び種々のペプチドのみの結合を示す。受容体及び受容体ペプチドの両者はTSP−1に結合したが、ところがランダムの負の対照ペプチドは結合しなかった。
【図11】
図11(TSP−1及びCys(Acm)−Ser−Val−Thr−Cys(Acm)−Glyに結合する受容体)は、TSP−1及びペプチドCys(Acm)−Ser−Val−Thr−Cys(Acm)−Gly(配列番号6)の両者は、受容体がキュベット上に固定される場合、受容体に結合することを示す。
【図12】
図12(乳癌における受容体の局在化)は、乳癌における受容体の局在化を示す。染色された受容体は、図の中央に見出される腫瘍細胞の境界近くで可視化され得る。
【図13】
図13(擬似及び受容体トランスフェクトされたウシ大動脈内皮細胞の付着)は、プレート上のTSP−1、又は負の対照BSAに結合する受容体トランスフェクトされた細胞を用いての細胞付着性を示す。受容体トランスフェクトされた細胞は、BSAよりも、TSP−1を含むプレートに、より強く付着した。
【図14】
図14(受容体ペプチドへのB16−F10メラノーマ細胞の付着)は、プレート上に固定された、TSP−1、受容体ペプチド及び対照による細胞付着研究を示す。受容体トランスフェクトされた細胞は、フィブロネクチン(正の対照)、TSP−1及び受容体ペプチドを有するプレートに強く付着した。これは、追加のタンパク質がTSP−1相互作用に関与することを示す。
【図15】
図15(固定された組換え受容体へのTSP−1トランスフェクトされたMDA−MB435乳癌細胞の付着)は、TSP−1トランスフェクトされた細胞(及びベクタートランスフェクトされた対照細胞)による細胞付着研究を示す。TSP−1トランスフェクトされた細胞は、対照細胞よりも受容体プレートにより強く結合した。
【図16】
図16(固定された組換え受容体へのTSP−1トランスフェクトされたMDA−MB−435乳癌細胞の付着に対する抗−TSP−1抗体の効果)は、TSP−1トランスフェクトされた細胞による細胞付着研究を示す。この図は、抗−TSP−1及び抗−Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)抗体が受容体被覆されたプレートへの結合を阻害したことを示す。
【図17】
図17(MDA−MB−435乳癌の付着に対する組換え受容体の効果)は、TSP−1トランスフェクトされた細胞による細胞付着研究を示す。プレート上に固定された受容体に対する付着は、濃度依存性態様で、結合されなかったTSP−1の添加により阻害される。
【図18】
図18(脈管形成に対する受容体の効果)は、脈管形成に対するアンジオシジンの効果を示す。この図は、アンジオシジンが毛細血管の形成を阻害したことを示す。
【図19】
図19(毛細血管安定性に対する受容体の効果)は、毛細血管安定性に対するアンジオシジンの効果を示す。この図は、アンジオシジンがインビトロ形成の後、毛細血管を破壊することを示す。
【図20】
図20(ウシ大動脈内皮細胞の形態学に対する受容体の効果)は、ウシ大動脈内皮細胞の形態学に対するアンジオシジンの効果を示す。高まる濃度のアンジオシジンが、細胞の延長、プレートからの分離、凝集及び死を引き起こした。
【図21】
図21(細胞生存性に対する受容体の効果)は、細胞生存性に対するアンジオシジンの効果を示す。BAEC及びHUVEC細胞系は、受容体の存在下で低められた生存性を有し、これは、TSPがそれらの細胞系の生存性のための必要条件であることを示唆する。線維芽細胞、A549, MB231及びMCF7細胞系においては、有意な差異は見出されず、これは、TSPがそれらの細胞系における生存性のための必要条件ではないことを示唆する。
【図22】
図22(ウシ大動脈内皮細胞(BAEC)及びウシ平滑筋細胞(BSM)の生存性に対する受容体の効果)は、BAEC及びBSM細胞の生存性に対するアンジオシジンの効果を示す。アンジオシジンはBAEC細胞の生存性を低めるが、しかしBSM細胞には影響を及ぼさない。
【図23】
図23(ウシ大動脈内皮細胞(BAEC)及びマウスLewis肺癌の生存性に対する受容体の効果)は、BAEC及びマウスLewis肺癌細胞の生存性に対するアンジオシジンの効果を示す。アンジオシジンはBAEC細胞の生存性を低めるが、しかしLewis肺細胞には影響を及ぼさない。
【図24】
図24(ヒト臍静脈内皮細胞の生存性に対する受容体の効果)は、HUVEC細胞の生存性に対するアンジオシジンの効果を示す。
【図25】
図25(ヒト臍静脈内皮細胞の生存性に対する受容体の効果)は、TSP−1の存在下での、HUVEC細胞の生存製に対するアンジオシジンの効果を示す。
【図26】
図26(ウシ大動脈内皮細胞の受容体−介在性生存性)は、TSP−1の生存下での、BAEC細胞の生存性に対するアンジオシジンの効果を示す。
【図27】
図27(受容体結合アッセイ)は、ビオチン−アビジン結合アッセイの略図を示す。
【図28】
図28(固定されたTSP−1への受容体の結合)は、固定されたTSP−1へのアンジオシジンの結合を示す。これは、9nmのKDを有する、飽和結合を示す。
【図29】
図29(TSP−1へのビオチン−受容体の結合に対する受容体の効果)は、TSP−1へのビオチン−アンジオシジン複合体の結合に対するアンジオシジンの競争効果を示す。
【図30】
図30(TSP−1受容体結合のペプチド競争)は、プレートに結合されるTSP−1に結合するビオチン−アンジオシジン複合体のペプチド競争を示す。
【図31】
図31(ファージ表示ライブラリーからの受容体結合ペプチド)は、ファージ表示ライブラリースクリーニング工程からのアンジオシジン−結合ペプチドを示す。
【図32】
図32(TSP−1受容体結合のペプチド競争(1mg/ml))は、TSP−1及びアンジオシジン結合のペプチド競争を示す。Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)及びLys−Val−Trp−Val−Leu−Pro−Ile(配列番号14)の両ペプチドは、結合を阻害する。
【図33】
図33(ヒト大動脈内皮細胞(HAEC)及びヒト肺毛細血管内皮細胞(HMVEC−L)の生存性に対するアンジオシジンの効果)は、HAEC及びHMVEC−L細胞の生存性に対するアンジオシジンの負の効果を示す。
【図34】
図34(ウシ大動脈内皮細胞の生存性に対するアンジオシジン及びそのフラグメントの効果)は、BAEC細胞に対するアンジオシジンの負の効果、及びアンジオシジンの種々のフラグメントの効果を示す。
【図35】
図35(Lewis肺癌の増殖に対するアンジオシジンの効果)は、マウスの側腹部におけるLewis肺癌腫瘍の増殖に対するアンジオシジンのインビボ効果を定量的に示す。
【図36】
図36(アンジオシジンプロモーター腫瘍壊死)は、細胞レベルでの側腹部腫瘍の壊死に対するアンジオシジンの効果を示す。
【図37】
図37(インビボでのLewis肺癌の増殖に対するアンジオシジンの効果)は、マウスの側腹部におけるLewis肺癌腫瘍の増殖に対するアンジオシジンのインビボ効果を定量的に示す。
【図38】
図38(Lewis肺癌を担持するマウスの生存性に対するアンジオシジン処理の効果)は、Lewis肺癌を担持するマウスの生存性に対するアンジオシジン処理の効果を示す。
【図39】
図39(生存性研究)は、ウシ大動脈内皮細胞生存性に対するアンジオシジンの効果を示す。
【図40】
図40(BAEC生存性のアンジオシジン−介在性阻害に対する抗−アンジオシジン抗体の効果)は、ウシ大動脈内皮細胞生存性のアンジオシジン−介在性阻害に対する抗−アンジオシジン抗体の効果を示す。
【図41】
図41(支持体へのBAECの付着に対するアンジオシジンの効果)は、ウシ大動脈内皮細胞の付着に対するアンジオシジンの効果を示す。
【図42】
図42(アンジオシジンのアミノ末端及びカルボキシ末端部分の官能性)は、アンジオシジンタンパク質のN−末端部分が、TSP−1結合及び抗−内皮活性の両者に関して、十分な長さのアンジオシジンタンパク質のすべての活性を含むことを示す。C−末端部分は、負の対照に類似する活性レベルを有した。
Claims (26)
- トロンボスポンジン(TSP−1)のCys−Ser−Val−Thr−Cys−Gly(配列番号1)−特異的領域に対する特異的結合親和性を有する精製された受容体タンパク質。
- 配列番号2及び配列番号3、並びに配列番号2及び3のフラグメント及び突然変異体から成る群から選択された配列を含んで成る請求項1記載の受容体。
- 前記フラグメントが、配列番号24、並びに配列番号24のフラグメント及び突然変異体を含んで成る請求項2記載の受容体。
- トロンボスポンジン活性を阻害する抗体により患者を処理するための方法であって、請求項1又は2記載の受容体を単離し、前記受容体に対する抗体を生成し、そして前記患者を処理するために前記抗体を用いる段階を含んで成る方法。
- トロンボスポンジン活性を模倣する抗体により患者を処理するための方法であって、請求項1記載の受容体を単離し、前記受容体に対する抗体を生成し、そして前記患者を処理するために前記抗体を用いる段階を含んで成る方法。
- トロンボスポンジン活性を阻害するリガンドにより患者を処理するための方法であって、請求項1記載の受容体を単離し、前記受容体に対するリガンドを生成し、そして前記患者を処理するために前記リガンドを用いる段階を含んで成る方法。
- 悪性癌を検出するための方法であって、請求項1記載の受容体の存在を測定し、そして悪性癌が存在するかどうかを決定する段階を含んで成る方法。
- トロンボスポンジン活性を模倣するリガンドにより患者を処理するための方法であって、請求項1記載の受容体を単離し、前記受容体に対するリガンドを生成し、そして前記患者を処理するために前記リガンドを用いる段階を含んで成る方法。
- 請求項1記載の受容体により患者を処理するための方法であって、前記患者に前記受容体を投与し、そして前記受容体によるトロンボスポンジン活性の競争的阻害を可能にすることを含んで成る方法。
- 前記処理方法が、脈管形成を阻害するか又は逆転せしめる請求項8記載の方法。
- 前記処理方法が、腫瘍増殖を阻害するか、妨げるか、又は逆転せしめる請求項8記載の方法。
- 前記方法が患者の生命を延長せしめる請求項8記載の方法。
- 請求項1記載の受容体のフラグメントにより患者を処理するための方法であって、前記受容体のフラグメントを前記患者に投与し、そして前記フラグメントによるトロンボスポンジン活性の競争的阻害を可能にする段階を含んでなる方法。
- 癌を有する患者の予後を診断するか又は決定するための方法であって、請求項1記載の受容体のレベルを決定し、そして転移性及び非転移性腫瘍について既知の値に対するレベルを評価する段階を含んで成る方法。
- 請求項1記載の受容体に向けられた抗体、又は請求項1記載の受容体に向けられたリガンドから成る群から選択された標的化成分に結合された化学療法薬剤を含んで成る、癌を処理するための組成物。
- 請求項1記載の受容体に向けられた抗体、又は請求項1記載の受容体に向けられたリガンドから成る群から選択された標的化成分に結合された放射性成分を含んで成る、癌を処理するための組成物。
- 治療的有効量の請求項16記載の組成物及び任意には、医薬的に許容できるキャリヤーを投与し、標的化成分による癌の標的化を可能にし、そして放射性成分による癌の処理を可能にすることを含んで成る癌の処理方法。
- 請求項1記載の受容体に向けられた抗体、又は請求項1記載の受容体に向けられたリガンドから成る群から選択された標的化成分に結合される放射性成分を含んで成る、癌の放射線学的検出、癌の診断、及び癌の処理に対する治療応答の定量化のための組成物。
- 癌の放射線学的検出、癌の診断、及び癌の処理に対する治療応答の定量化のための方法であって、治療的有効量の請求項18記載の組成物の及び任意には、医薬的に許容できるキャリヤーを投与し、標的化成分による癌の標的化を可能にし、放射性成分による癌の標識を可能にし、そして癌を検出し、癌を処理し、又は癌の処理に対する治療応答を定量化することを含んで成る方法。
- 請求項1記載の受容体に向けられた抗体、又は請求項1記載の受容体に向けられたリガンドから成る群から選択された標的化成分に結合されるMRI増強剤を含んで成る、癌のMRI検出、癌の診断、及び癌の処理に対する治療応答の定量化のための組成物。
- 前記MRI増強剤が、ガドリニウム、マンガン及び鉄から成る群から選択される請求項18記載の組成物。
- 癌のMRI検出、癌の診断、及び癌の処理に対する治療応答を定量化する方法であって、有効量の請求項20記載の組成物及び任意には、医薬的に許容できるキャリヤーを投与し、標的化成分による癌の標的化を可能にし、癌を検出し、癌を診断し、そして癌の治療的応答を定量化するためにMRIを用い、そしてMRI増強剤によるMRIの増強を可能にすることを含んで成る方法。
- 細胞を除去するための手段を含んで成る生物医学的装置であって、前記細胞除去手段が標的化成分に連結され、そして前記標的化成分が請求項1記載の受容体に向けられた抗体、又は請求項1記載の受容体に向けられたリガンドから成る群から選択される方法。
- トロンボスポンジン活性を模倣し、又は阻害する薬剤を設計するための方法であって、候補体薬剤を開発し、そして請求項1記載の受容体へのその結合を評価する段階を含んで成る方法。
- 内皮細胞生存率を低めるための方法であって、医薬的に許容できる量の請求項1記載の精製された受容体タンパク質を投与し、そして内皮細胞生存率を低めるために前記タンパク質と内皮細胞との相互作用を可能にすることを含んで成る方法。
- 細胞付着活性を低めるための方法であって、医薬的に許容できる量の請求項1記載の精製された受容体タンパク質を投与し、そして細胞付着活性を低めるために前記タンパク質と前記細胞との相互作用を可能にすることを含んで成る方法。
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