KR19990087802A - 전립선암의 면역치료 및 면역진단을 위한 화합물 및 방법 - Google Patents
전립선암의 면역치료 및 면역진단을 위한 화합물 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명에서는 전립선암의 치료 및 진단을 위한 화합물 및 방법이 제공된다. 본 발명의 화합물은 전립선 단백질의 적어도 일부분을 함유하는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한, 이러한 폴리펩타이드 또는 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 분자를 포함하는, 전립선암의 면역치료를 위한 약제학적 조성물이 제공된다. 또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 전립선암의 진단 및 모니터링에 유용한 항체를 제조하는데 사용될 수 있다. 또한, 탐침, 프라이머 및 폴리펩타이드를 제조하기 위한 핵산 서열이 제공된다.
Description
전립선암은 남성에서 가장 통상적인 형태의 암이며, 50세 이상의 남성중 30%가 발병하는 것으로 평가된다. 다수의 임상적 증거에 따르면, 사람 전립선암은 뼈로 전이되는 성향을 가지는 것으로 보이며, 안드로겐 의존성 상태로부터 안드로겐 내성 상태로 불가피하게 진행되어 환자의 사망률을 증가시키는 것 같다. 이와 같은 유행성 질환이 현재 미국에서 남자의 암 사망 원인중 제2의 원인이다.
이 질환의 치료에 대한 상당한 연구에도 불구하고, 전립선암은 여전히 치료가 어려운 것으로 남아 있다. 통상적으로, 치료법은 수술 및/또는 방사선 치료에 기초하고 있으나, 이들 방법은 많은 경우에 비효과적이다. 3개의 전립선 특이적 단백질(전립선 특이적 항원(PSA) 및 전립선의 산 포스파타제(PAP))은 진단 및 치료 효능을 제한받고 있다. PSA 농도가 항상 전립선암의 존재와 관련되는 것은 아니며, 양성 전립선 증식(BPH)을 포함하는 일부 경우에는 비-전립선암에 양성이다. 또한, PSA 측정은 전립선 용적과 관련되고, 전이 수준을 나타내지 않는다.
따라서, 전립선암에 대한 개선된 백신 및 진단 방법이 본 기술 분야에 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명은 전립선암의 면역치료 및 진단을 위한 화합물 및 방법에 관한 것이다. 한가지 양태로서, 서열 2 및 4 내지 8에 제공된 부분 서열을 갖는 전립선 단백질의 적어도 면역원성 부분, 또는 단지 보존성 치환체 및/또는 변형체만이 상이한 상기 단백질의 변이체를 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다.
관련된 양태로서, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열, 이들 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터, 이러한 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포가 또한 제공된다. 바람직한 양태로서, 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli), 효모 및 포유동물 세포로 이루어진 그룹중에서 선택된다.
또한, 본 발명은 서열 1 내지 8, 20, 21, 25 내지 31의 폴리펩타이드, 서열 9 내지 19, 22 내지 24 또는 32 내지 43의 핵산중 하나 이상, 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 비-특이적 면역 반응 인핸서와 함께 하나 이상의 상기 폴리펩타이드 또는 핵산을 포함하는 백신을 제공한다.
또 다른 양태로서, 서열 1 내지 8, 20, 21, 25 내지 31의 폴리펩타이드, 서열 9 내지 19, 22 내지 24 또는 32 내지 43의 핵산중 하나 이상의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하여, 환자의 전립선암 성장을 억제시키는 방법이 제공된다.
또 다른 양태로서, (a) 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을 서열 1 내지 8, 20, 21, 25 내지 31 또는 44 내지 57의 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 결합제와 접촉시키는 단계; (b) 결합제와 결합하는 단백질 또는 폴리펩타이드를 상기 샘플에서 검출하는 단계를 포함하는, 환자에서 전립선암을 검출하는 방법이 제공된다.
관련된 양태로서, (a) 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을 서열 1 내지 8, 20, 21, 25 내지 31 또는 44 내지 57의 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 결합제와 접촉시키는 단계; (b) 결합제와 결합하는 단백질 또는 폴리펩타이드의 양을 상기 샘플에서 측정하는 단계; (c) 단계(a) 및 단계(b)를 반복하여 단계(b) 및 단계(c)에서 검출된 폴리펩타이드의 양을 비교하는 단계를 포함하는, 환자에서 전립선암의 진행을 모니터링하는 방법이 제공된다.
관련된 양태로서, 본 발명은 상술된 폴리펩타이드에 결합하는 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체, 및 상기 항체를 포함하는 진단 키트, 및 이러한 항체를 사용하여 전립선암의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 환자로부터 생물학적 샘플을 제공하는 단계; (b) 상기 샘플을 폴리머라제 연쇄 반응에서의 2개 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머(여기서, 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 서열 9 내지 19, 22 내지 24 및 32 내지 43으로 이루어진 그룹중에서 선택된 DNA 서열에 특이적이다)와 접촉시키는 단계; (c) 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 존재하에 증폭시킨 DNA 서열을 상기 샘플에서 검출하는 단계를 포함하는, 전립선암을 검출하는 방법을 제공한다. 한 가지 양태로서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 서열 9 내지 19, 22 내지 24 및 32 내지 43으로 이루어진 그룹중에서 선택된 DNA 서열의 약 10개 이상의 연속한 뉴클레오타이드를 포함한다.
추가의 양태로서, 본 발명은 (a) 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; (b) 서열 9 내지 19, 22 내지 24 및 32 내지 43으로 이루어진 그룹중에서 선택된 DNA 서열에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 탐침과 상기 샘플을 접촉시키는 단계; (c) 올리고뉴클레오타이드 탐침과 하이브리드화하는 DNA 서열을 상기 샘플에서 검출하는 단계를 포함하는, 환자에서 전립선암을 검출하는 방법을 제공한다. 한 가지 양태로서, 올리고뉴클레오타이드 탐침은 서열 9 내지 19, 22 내지 24 및 32 내지 43으로 이루어진 그룹중에서 선택된 DNA 서열의 약 10개 이상의 연속한 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 이러한 양태 및 다른 양태는 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조하면 명백해질 것이다. 본원에 기술된 모든 참조 문헌은 각각이 개별적으로 인용되는 것과 같이 이들 전체를 참조로서 본원에서 인용한다.
본 발명은 일반적으로 전립선암의 치료, 진단 및 모니터링에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 적어도 일부분의 전립선 단백질을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 이러한 폴리펩타이드는 전립선암을 치료하기 위한 백신 및 약제학적 조성물에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 항체와 같은 화합물의 제조에 사용될 수 있으며, 환자의 전립선암, 및 가능하게는 다른 형태의 종양의 진행을 진단 및 모니터링하는데 유용할 수 있다.
도 1은 랫트 전립선 추출물로 면역화시킨 랫트로부터 수득된 혈청의 웨스턴 블롯팅 분석을 나타낸다.
도 2는 도 1의 랫트 면역화 제제의 비-환원된 SDS PAGE를 나타낸다.
도 3은 프로게스테론 및 에스트라무스틴에 대한 랫트 스테로이드 결합 단백질의 추정된 사람 동족체의 결합을 나타낸다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명은 일반적으로 전립선암의 면역치료, 진단 및 모니터링을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 일반적으로 사람 전립선 혈청과의 면역반응성을 입증하는 사람 전립선 단백질의 적어도 일부분을 포함하는 폴리펩타이드이다. 또한, 본 발명에는 본 발명의 폴리펩타이드에 결합하는 분자(예: 항체 또는 이의 단편)가 포함된다. 본원에서는 이러한 분자를 "결합제"로서 언급한다.
특히, 본 발명은 서열 2 및 4 내지 8에 제공된 부분 서열을 갖는 전립선 단백질의 적어도 일부분, 또는 단지 보존성 치환체 및/또는 변형체에서만 상이한 상기 단백질의 변이체를 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드"는 완전한 길이의 단백질을 포함하여 특정한 길이의 아미노산 쇄를 포함하며, 이때 아미노산 잔기는 펩타이드 공유 결합에 의해 결합된다. 따라서, 상기 전립선 단백질의 특정한 부분을 포함하는 폴리펩타이드는 전적으로 그 부분만으로 이루어질 수 있고, 또한 상기 부분은 추가의 서열을 함유하는 보다 큰 폴리펩타이드내에 존재할 수 있다. 추가의 서열은 천연 단백질로부터 유도되거나 이종성일 수 있으며, 이러한 서열은 면역반응성 및/또는 항원성일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 사람 전립선 단백질의 "면역원성 부분"은 자가면역 전립선염을 앓는 개체로부터 유도된 혈청 또는 자가면역 전립선염의 랫트 모델로부터 유도된 혈청과 반응하는 부분이다. 달리 말하면, 면역원성 부분은 면역 반응을 유도할 수 있고, 그 자체로서 전립선염 혈청내에 존재하는 항체에 결합한다. 자가면역 전립선염은 예를 들어 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)의 무독성 균주인 바실루스 칼메테-구에린(Bacillus Calmette-Guerin; BCG)의 투여에 의해 방광암을 치료한 후에 발생할 수 있다. 자가면역 전립선염의 랫트 모델에 있어서, 랫트는 랫트 전립선의 세정 추출물로 면역화시킨다. 이들 공급원의 혈청을 사용하여 본원에 기술된 사람 전립선 유도된 폴리펩타이드와 반응시킬 수 있다. 항체 결합 검정은 예를 들어 문헌[참조: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988]에 기술된 바와 같이 본 기술분야에 공지된 각종 수단을 사용하여 일반적으로 수행할 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드를 하기 기술되는 바와 같이 고체 지지체상에 고정시킬 수 있고, 환자 혈청과 접촉시켜 고정된 폴리펩타이드에 혈청중의 항체를 결합시킨다. 이어서, 결합하지 않은 혈청을 제거하고, 예를 들어125I-표지된 단백질 A를 사용하여 결합된 항체를 검출한다.
본원에 사용된 바와 같이 "변이체"는 단지 보존성 치환체 및/또는 변형체만이 상기 폴리펩타이드와 상이한 폴리펩타이드로서, 폴리펩타이드 또는 당해 폴리펩타이드에 결합하는 분자의 면역치료, 항원성 및/또는 진단 특성이 유지된다. 면역반응성 특성을 갖는 전립선 단백질의 경우, 변이체는 상기 폴리펩타이드 서열중 하나를 변형시켜 변형된 폴리펩타이드의 면역반응성을 평가함으로써 일반적으로 확인할 수 있다. 진단 결합제의 제조에 유용한 전립선 단백질의 경우, 변이체는 전립선암의 존재 또는 부재를 검출하는 항체의 생성능에 대해 변형된 폴리펩타이드를 평가함으로써 확인할 수 있다. 이러한 변형된 서열은 예를 들어 하기 서술된 대표적인 공정을 사용하여 제조 및 시험될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "보존성 치환"은 아미노산이 유사한 특성을 갖는 또다른 아미노산으로 치환되는 것으로, 펩타이드 화학 분야의 통상의 지식을 가진 자는 폴리펩타이드의 2차 구조 및 수치료 성질을 실질적으로 변화시키지 않는 것으로 예상할 수 있다. 일반적으로, 하기 그룹의 아미노산은 보존성 변화를 나타낸다: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his.
또한 다른 한편으로, 변이체는 폴리펩타이드의 항원성 특성, 2차 구조 및 수치료 성질에 최소한의 영향을 미치는 아미노산의 결실 또는 부가를 포함하는 다른 변형체를 함유할 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드는 해독과 동시에 또는 해독후에 단백질의 전이를 유도하는 단백질의 N 말단에 있는 시그날(또는 리더) 서열과 접합될 수 있다. 또한, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드(예: 폴리-His)의 합성, 정제 또는 확인을 용이하게 하고 고체 지지체에 대한 폴리펩타이드의 결합을 증진시키기 위해 링커 또는 다른 서열과 접합될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드는 면역글로블린 Fc 영역과 접합시킬 수 있다.
서열 1 내지 8, 20, 21, 25 내지 31에 제공된 특정한 서열을 갖는 폴리펩타이드는 적합한 사람 전립선 선암 세포주, 예를 들어 LnCap.fgc(ATCC No. 1740-CRL)로부터 분리할 수 있다. LnCap.fgc는 사람 전립선암의 특히 우수한 대표적인 전립선 선암 세포주이다. 사람 암종과 마찬가지로, LnCap.fgc 세포는 SCID 마우스의 이종이식체로서 점차 성장하는 종양을 형성하고, 테스토스테론과 반응하며, PSA를 분비하고, 골수 성분(예: 트란스페린)의 존재에 대해 반응한다. 특히, 상기 폴리펩타이드는 예를 들어 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY]에 기술되어 있고 하기 상세히 기술되는 바와 같은 기술을 사용하여 사람 전립선염 혈청으로 LnCap.fgc cDNA 라이브러리의 발현 스크리닝에 의해 분리할 수 있다. 서열 48 및 49의 폴리펩타이드는 상술된 자가면역 전립선염의 랫트 모델로부터 혈청을 스크리닝함으로써 LnCap/fgc 세포주로부터 분리할 수 있다. 서열 50 내지 56의 폴리펩타이드는 실시예 4에 상세히 기술된 바와 같이 사람 전립선염 혈청으로 스크리닝함으로써 LnCap/fgc 세포주로부터 분리할 수 있다. 서열 44 내지 47의 폴리펩타이드는 실시예 2에 상세히 기술된 바와 같이 사람 정액으로부터 분리할 수 있다. 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열이 수득되면, 올리고뉴클레오타이드-유도된 부위-특이적 돌연변이유발과 같은 표준 돌연변이유발 기술을 사용하여 상기 어떠한 변형체도 용이하게 혼입시킬 수 있다.
또한, 본원에 기술된 폴리펩타이드는 합성 또는 재조합 방법에 의해 제조할 수 있다. 약 100개 미만의 아미노산을 갖는 합성 폴리펩타이드, 및 일반적으로 약 50개 미만의 아미노산을 갖는 합성 폴리펩타이드는 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 이러한 폴리펩타이드는 메리필드 고체-상 합성 방법(여기서, 아미노산은 신장하는 아미노산 쇄에 연속적으로 부가된다)과 같이 상용의 특정 고체-상 기술을 사용하여 합성할 수 있다[참조: Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2146, 1963]. 폴리펩타이드의 자동화된 합성 장비는 공급자[참조: Applied BioSystems, Inc., Foster City, CA]로부터 용이하게 입수할 수 있고, 제조업자의 지시에 따라 작동시킬 수 있다.
한편, 상기 특정한 폴리펩타이드는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 발현 벡터에 삽입시키고, 적합한 숙주에서 상기 단백질을 발현시킴으로써 재조합 방법에 의해 제조할 수 있다. 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 각종 발현 벡터를 사용하여 본 발명의 재조합 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다. 발현은 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 분자를 함유하는 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 어떠한 적합한 숙주 세포에서도 수행될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵 세포, 효모 및 고등 진핵 세포이다. 바람직하게는, 사용된 숙주 세포에는 이. 콜라이, 효모 또는 포유동물 세포주(예: CHO 세포)가 포함된다. 이러한 방식으로 발현된 DNA 서열은 천연 폴리펩타이드, 천연 폴리펩타이드의 부분, 또는 이의 다른 변이체를 암호화할 수 있다.
일반적으로, 제조 방법과 상관 없이, 본원에 기술된 폴리펩타이드는 실질적으로 순수한 형태(즉, 아미노산 조성 및 1차 서열 분석에 의해 폴리펩타이드는 상동성인 것으로 측정된다)로 제조된다. 바람직하게는, 상기 폴리펩타이드는 약 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 99% 이상 순수하다. 하기에 더욱 상세히 기술되는 특히 바람직한 양태에서는 실질적으로 순수한 폴리펩타이드가 본원에 기술된 하나 이상의 방법에 사용되는 약제학적 조성물 또는 백신에 혼입된다.
전립선 단백질의 면역원성 부분을 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드는 일반적으로 전립선암의 면역치료에 사용될 수 있으며, 상기 폴리펩타이드는 전립선 종양 세포에 대한 환자 자신의 면역 반응을 자극한다. 추가의 양태로서, 본 발명은 환자에서 전립선암의 면역치료를 위해 서열 1 내지 8, 20, 21, 25 내지 31 및 44 내지 57의 면역반응성 폴리펩타이드(또는 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA) 하나 이상을 사용하는 방법을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, "환자"는 모든 온혈 동물, 바람직하게는 사람을 의미한다. 환자는 질환을 앓고 있을 수도 있고, 질환을 검출할 수 없을 수도 있다. 따라서, 상기 면역반응성 폴리펩타이드는 전립선암을 치료하거나 전립선암의 성장을 억제하기 위해 사용할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 1차 종양의 수술에 의한 제거 및/또는 방사선치료 및 통상의 화학치료 약물의 투여에 의한 치료 전후에 투여될 수 있다.
이들 양태에 있어서, 본 발명의 폴리펩타이드는 일반적으로 약제학적 조성물 및/또는 백신내에 존재한다. 약제학적 조성물은 하나 이상의 상기 서열(또는 이의 변이체)을 함유할 수 있는 하나 이상의 폴리펩타이드 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 백신은 하나 이상의 상기 폴리펩타이드 및 비-특이적 면역 반응 인핸서, 예를 들어 애쥬번트, 생분해성 중심체(예: 폴리아세틱 갈락티드) 또는 리포솜(본 발명의 폴리펩타이드가 혼입됨)을 포함할 수 있다. 약제학적 조성물 및 백신은 또한 조합 폴리펩타이드(즉, 다수 에피토프를 함유하는 단일 폴리펩타이드)에 혼입되거나, 별도의 폴리펩타이드내에 존재하는 전립선 세포 항원의 다른 에피토프를 함유할 수 있다.
한편, 약제학적 조성물 또는 백신은 미리 생성된 하나 이상의 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 함유할 수 있다. 약제학적 조성물 및 백신에 있어서, DNA는 핵산 발현 시스템, 세균 및 바이러스 발현 시스템을 포함하는 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 각종 전달 시스템내에 존재할 수 있다. 적절한 핵산 발현 시스템은 환자에서 발현시키기 위해 필요한 DNA 서열(예: 적합한 프로모터)을 함유한다. 세균 전달 시스템은 세포 표면상에서 전립선 세포 항원의 에피토프를 발현하는 세균(예: 바실루스-칼메테-구에린(Bacillus-Calmette-Guerrin))을 투여하는 것이다. 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 DNA는 비-병원성(불완전성)의 복제 경쟁 바이러스를 사용할 수 있는 바이러스 발현 시스템(예: 백시니아 또는 기타 수두 바이러스, 레트로바이러스 또는 아데노바이러스)을 사용하여 도입할 수 있다. 적합한 시스템은 예를 들어 문헌[참조: Fisher-Hoch et al., PNAS 86: 317-321, 1989; Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569: 86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8: 17-21, 1990; U.S. Patent Nos. 4,603,112, 4,769,330 및 5,017,487; WO 89/01973; U.S. Patent No. 4,777,127; GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6: 616-627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252: 431-434, 1991; Kolls et al., PNAS 91: 215-219, 1994; Kass-Eisler et al., PNAS 90: 11498-11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88: 2838-2848, 1993; and Guzman et al., Cir. Res. 73: 1202-1207, 1993]에 기술되어 있다. 이러한 발현 시스템내로 DNA를 도입하는 기술은 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있다. 또한, DNA는 예를 들어 문헌[참조: PCT application WO 90/11092, and Ulmer et al., Science 259: 1745-1749, 1993, Cohen, Science 259: 1691-1692, 1993]에 기술된 바와 같이 순수한(naked) 상태일 수 있다. 순수한 상태의 DNA의 흡착은 세포에 효율적으로 전달되는 생분해성 비드상에 DNA를 피복시킴으로써 증가시킬 수 있다.
투여량 뿐만 아니라 투여 경로 및 투여 빈도는 환자마다 달라질 수 있고, 일반적으로 다른 질환의 면역치료에 사용되는 것과 동일할 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물 및 백신은 주사(예: 경피내, 근육내, 정맥내 또는 피하), 비내(예: 흡입) 또는 경구 투여할 수 있다. 1 내지 10회의 투여량을 3 내지 24주의 기간에 걸쳐 투여할 수 있다. 바람직하게는, 4회의 투여량을 3개월의 간격으로 투여하며, 그후 부스터 투여를 주기적으로 수행한다. 또다른 프로토콜도 개개 환자에 적합할 수 있다. 적합한 용량은 치료되는 환자에서 전립선 종양 세포에 대해 면역 반응(세포성 및/또는 체액성)을 유발시키는 폴리펩타이드 또는 DNA의 유효량이다. 적합한 면역 반응은 기저 수준(즉, 무처리)의 10 내지 50% 이상이다. 일반적으로, 투여량에 존재하는 (또는 투여량내의 DNA에 의해 미리 생성된) 폴리펩타이드의 양은 숙주 kg당 약 1pg 내지 약 100mg, 국소용으로는 약 10pg 내지 약 1mg, 및 바람직하게는 약 100pg 내지 약 1㎍의 범위이다. 투여에 적합한 크기는 환자의 크기에 따라 달라질 수 있으나, 전형적으로 약 0.01mL 내지 약 5ml의 범위일 수 있다.
본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 모든 적합한 담체를 본 발명의 약제학적 조성물에 사용할 수 있으나, 담체의 형태는 투여 형태에 따라 달라질 수 있다. 피하 주사와 같이 비경구 투여하는 경우, 담체는 물, 염수, 알콜, 유지, 왁스 및/또는 완충제를 포함하는 것이 바람직하다. 경구 투여하는 경우, 만니톨, 글루코즈, 수크로즈 및/또는 탄산마그네슘과 같은 상기 모든 담체 또는 고체 담체를 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 대한 담체로서는 생분해성 중심체(예: 폴리락틱 글리콜라이드)를 사용할 수 있다. 적합한 생분해성 중심체에는 예를 들어 미국 특허 제4,897,268호 및 제5,075,109호에 기술되어 있다.
각종 비-특이적 면역 반응 인핸서를 본 발명의 백신에 사용할 수 있다. 예를 들면, 애쥬번트가 포함될 수 있다. 대부분의 애쥬번트는 급속한 분해로부터 항원을 보호하도록 고안된 물질(예: 수산화알루미늄 또는 광유), 및 면역 반응의 비특이적 자극제[예: 지질 A, 보르델라 퍼투시스(Bordella pertussis) 또는 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)]를 함유한다. 이러한 애쥬번트는 예를 들어 프로인트 불완전 애쥬번트 및 완전 애쥬번트[참조: Difco Laboratories, Detroit, MI] 및 머크 애쥬번트 65[참조: Merck and Company, Inc., Rahway, NJ]와 같이 상업상 입수할 수 있다.
본원에 기술된 폴리펩타이드는 또한 전립선암의 생체외 치료에 사용될 수 있다. 예를 들면, T 세포와 같은 면역계의 세포를 CellPro Incorporated(Bothell, WA)사의 CEPRATETM시스템을 이용하여 환자의 말초 혈액으로부터 분리할 수 있다[참조: 미국 특허 제5,240,856호; 미국 특허 제5,215,926호; WO 제89/06280호; WO 제91/16116호 및 WO 제92/07243호]. 분리된 세포는 항원-특이적 T 세포를 제공하기 위해 전달 비히클(예: 중심체)내에 함유된 하나 이상의 면역반응성 폴리펩타이드로 자극시킨다. 이어서, 표준 기술을 이용하여 종양 항원-특이적 T 세포의 모집단을 증식시키고, 세포를 환자에게 다시 투여한다.
또한, 다른 한편으로 본 발명의 폴리펩타이드를 사용하여 전이성 사람 전립선 종양을 검출할 수 있는 결합제, 예를 들어 항체 또는 이의 단편을 제조할 수 있다.
본 발명의 결합제는 이하에 기술된 대표적인 공정을 포함하는, 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 방법을 사용하여 일반적으로 제조할 수 있다. 결합제는 본원에 기술된 대표적인 검정법을 사용하여 전립선암이 존재하는 환자와 부재하는 환자를 구별할 수 있다. 바꾸어 말하면, 전립선 단백질에 대해 생성된 항체 또는 다른 결합제 또는 이의 적합한 부분은 질환을 앓고 있는 약 20% 이상의 환자에서 1차 또는 전이성 전립선암의 존재를 나타내는 시그날을 생성시킬 것이고, 1차 또는 전이성 전립선암이 없는 약 90% 이상의 환자에서 상기 질환의 부재를 나타내는 시그날을 생성할 것이다. 이러한 전립선 단백질의 적합한 부분은 전립선암이 완전한 길이의 단백질을 사용하여 나타낼 수 있는 실질적으로 모든 환자(즉, 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상)에서 1차 또는 전이성 전립선암의 존재를 나타내는 결합제, 및 완전한 길이의 단백질을 사용하는 경우 음성일 수 있는 실질적으로 모든 샘플에서 전립선암을 나타내는 결합제를 생성할 수 있는 부분이다. 일반적으로, 2가지 항체의 샌드위치 검정법과 같은 하기에 기술된 대표적인 검정법을 사용하여 전이성 사람 전립선 종양을 검출하는 결합제의 능력을 평가할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이 제조된, 1차 또는 전이성 사람 전립선 종양을 검출할 수 있는 항체를 생성하는 폴리펩타이드의 능력은 일반적으로 폴리펩타이드에 대한 하나 이상의 항체를 제조하여(예를 들어 이하에 기술된 대표적인 방법을 사용함) 환자에서 상기 종양을 검출하는 항체의 능력을 평가함으로써 평가될 수 있다. 이러한 측정은 생성된 항체에 결합하는 폴리펩타이드의 존재에 대해 1차 또는 전이성 전립선암의 존재 또는 부재하에 환자의 생물학적 샘플을 검정함으로써 수행할 수 있다. 이와 같은 검정 시험은 예를 들어 하기 서술되는 대표적인 공정을 이용하여 수행할 수 있다. 이러한 공정에 의해 1차 또는 전이성 전립선 종양의 20% 이상을 검출할 수 있는 항체 생성 폴리펩타이드를 1차 또는 전이성 사람 전립선 종양을 검출할 수 있는 항체를 생성할 수 있는 것으로 간주한다. 폴리펩타이드 특이적 항체를 단독으로 사용하거나 조합하여 사용함으로써 민감성을 개선시킬 수 있다.
1차 또는 전이성 사람 전립선 종양을 검출할 수 있는 폴리펩타이드는 환자에서 전립선암을 진단하거나 질환의 진행을 모니터링하기 위한 마커로서 사용될 수 있다. 한 가지 양태로서, 환자의 전립선암은, 미리 측정된 임계값과 비교하여, 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을 하나 이상의 상기 폴리펩타이드의 농도에 대해 평가함으로써 진단할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 적합한 "생물학적 샘플"에는 혈액, 혈청, 뇨 및/또는 전립선 분비물이 포함된다.
하나 이상의 상기 폴리펩타이드의 농도는 폴리펩타이드(들)에 특이적인 임의의 결합제를 사용하여 평가할 수 있다. 본 발명의 문맥상 "결합제"는 상술된 폴리펩타이드에 결합하는 모든 제제(예: 화합물 또는 세포)이다. 본원에 사용된 바와 같이, "결합"은 2개의 각각의 분자(이들 각각은 세포 또는 고체 지지체상에 존재하거나 부재(즉, 용액)할 수 있다)가 비공유 결합하여 "복합체"가 형성되는 것을 의미한다. 이러한 복합체는 지지체 물질상에 부재하거나 고정(공유 또는 비공유)될 수 있다. 결합 능력은 일반적으로 복합체의 형성에 대한 결합 상수를 측정함으로써 평가될 수 있다. 결합 상수는 복합체의 농도를 생성물 성분 농도로 나누어서 수득한 값이다. 일반적으로, 복합체 형성에 대한 결합 상수가 약 103L/mol을 초과하는 경우에 2개의 화합물은 본 발명의 문맥상 "결합"하는 것으로 언급된다. 결합 상수는 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
상기 조건을 충족시키는 모든 제제는 결합제일 수 있다. 예를 들면, 결합제는 펩타이드 성분이 존재하거나 부재하는 리보솜, RNA 분자 또는 펩타이드일 수 있다. 바람직한 양태로서, 결합 파트너는 항체 또는 이의 단편이다. 이러한 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 또한, 항체는 일본쇄, 키메라, CDR-그래프트된 또는 사람에게 적용된 형태일 수 있다. 항체는 본원에 기술된 방법 및 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 기타 방법에 의해 제조할 수 있다.
샘플에서 폴리펩타이드 마커를 검출하기 위해 결합 파트너를 사용하는 각종 검정 형식이 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있다[참조: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]. 바람직한 양태로서, 상기 검정법은 고체 지지체상에 고정된 결합 파트너를 사용하여 나머지 샘플로부터의 폴리펩타이드에 결합시키고 상기 폴리펩타이드를 제거하는 것이다. 이어서, 결합된 폴리펩타이드는 리포터 그룹을 함유하는 2차 결합 파트너를 사용하여 검출할 수 있다. 적합한 2차 결합 파트너에는 결합 파트너/폴리펩타이드 복합체에 결합하는 항체가 포함된다. 한편, 폴리펩타이드를 리포터 그룹으로 표지하고, 샘플과 함께 결합 파트너를 항온처리한 후 고정된 결합 파트너에 결합시키는 경쟁 검정을 사용할 수도 있다. 결합 파트너에 대한 표지된 폴리펩타이드의 결합을 억제하는 샘플 성분의 범위는 고정된 결합 파트너와 샘플의 반응성을 나타낸다.
고체 지지체는 항원이 부착할 수 있는, 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 모든 물질일 수 있다. 예를 들면, 고체 지지체는 미세역가 플레이트 또는 니트로셀룰로즈 또는 다른 적합한 막내의 시험 웰일 수 있다. 한편, 지지체는 유리, 섬유 유리, 라텍스와 같은 비드 또는 디스크, 또는 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드와 같은 플라스틱 물질일 수 있다. 또한, 지지체는 미국 특허 제5,359,681호에 기술된 것과 같이 자기성 입자 또는 섬유 광학 센서일 수 있다. 결합제는 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 각종 기술을 사용하여 고체 지지체상에 고정시킬 수 있는데, 이는 특허 및 과학 문헌에 충분히 기술되어 있다. 본 발명의 문맥상, 용어 "고정화"는 흡착과 같은 비공유 결합 및 공유 결합(이는 지지체상에서 항원과 작용성 그룹간의 직접적인 결합이거나 가교-결합제에 의한 결합일 수 있다) 모두를 의미한다. 미세역가 플레이트내의 웰 또는 막에 의한 흡착 고정화가 바람직하다. 이러한 경우, 흡착은 적합한 완충제중의 결합제를 고체 지지체와 적합한 시간 동안 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 접촉 시간은 온도에 따라 달라지지만, 전형적으로 약 1시간 내지 약 1일이다. 일반적으로, 플라스틱 미세역가 플레이트의 웰(폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드)을 약 10ng 내지 약 10㎍, 및 바람직하게는 약 100ng 내지 약 1㎍의 결합제와 접촉시키면 적절한 양의 결합제가 충분히 고정된다.
고체 지지체에 대한 결합제의 공유 결합은 일반적으로 결합제에 대한 지지체 및 작용성 그룹(예: 하이드록실 또는 아미노 그룹) 모두와 반응할 수 있는 이작용성 시약을 지지체와 먼저 반응시킴으로써 수행할 수 있다. 예를 들면, 결합제는 벤조퀴논을 사용하여 적절한 중합체 피막을 갖는 지지체에 공유 결합시키거나, 지지체상의 알데하이드를 결합 파트너상의 아민 및 활성 수소와 축합시켜 공유 결합시킬 수 있다[참조: Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, at A12-A13].
특정한 양태로서, 본 발명의 검정법은 2개-항체 샌드위치 검정이다. 이 검정법은 샘플내의 폴리펩타이드가 고정된 항체와 결합하도록 고체 지지체, 통상 미세역가 플레이트의 웰상에 고정된 항체를 샘플과 먼저 접촉시킴으로써 수행할 수 있다. 이어서, 결합하지 않은 샘플을 고정된 폴리펩타이드-항체 복합체로부터 제거하고, 폴리펩타이드상의 다른 부위에 결합할 수 있는 제2 항체(리포터 그룹 함유)를 가한다. 이어서, 고체 지지체에 결합한 제2 항체의 양을 특이적 리포터 그룹에 적합한 방법을 사용하여 측정한다.
보다 구체적으로, 항체가 상술된 바와 같이 지지체상에 고정되는 경우, 지지체상의 나머지 단백질 결합 부위는 전형적으로 차단된다. 소 혈청 알부민 또는 트윈 20TM(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)와 같은 적합한 차단제는 본 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있다. 이어서, 고정된 항체를 샘플과 함께 항온처리하고, 폴리펩타이드를 항체에 결합시킨다. 이 샘플은 항온처리하기 전에 인산염-완충된 염수(PBS)와 같은 적합한 희석제로 희석시킬 수 있다. 일반적으로, 접촉 시간은 전립선암을 앓는 개체로부터 수득한 샘플내에서 폴리펩타이드의 존재가 충분히 검출되는 시간이다. 바람직하게는, 접촉 시간은 결합된 폴리펩타이드와 결합되지 않은 폴리펩타이드간의 평형에 도달한 결합 수준이 약 95% 이상 달성되기에 충분한 시간이다. 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면, 평형에 도달하는데 요구되는 시간을 시간에 따라 발생하는 결합 수준을 분석함으로써 용이하게 측정할 수 있을 것이다. 실온에서, 약 30분의 항온처리 시간이면 일반적으로 충분하다.
이어서, 결합하지 않은 샘플은 고체 지지체를 적합한 완충액, 예를 들어 0.1% 트윈 20TM을 함유하는 PBS로 세척하여 제거할 수 있다. 이어서, 리포터 그룹을 함유하는 제2 항체를 고체 지지체에 가한다. 바람직한 리포터 그룹에는 효소(예: 서양고추냉이 퍼옥시다제), 기질, 보조인자, 억제제, 염료, 방사선 핵종, 발광성 그룹, 형광성 그룹 및 비오틴이 포함된다. 리포터 그룹에 대한 항체의 접합은 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
이어서, 제2 항체는 결합된 폴리펩타이드가 검출되기에 충분한 시간 동안 고정된 항체-폴리펩타이드 복합체와 함께 항온처리한다. 적합한 시간은 일반적으로 시간에 따라 발생하는 결합 수준을 분석함으로써 측정할 수 있다. 이어서, 결합되지 않은 제2 항체를 제거하고, 결합된 제2 항체는 리포터 그룹을 사용하여 검출한다. 리포터 그룹을 검출하는데 사용된 방법은 리포터 그룹의 성질에 따라 달라진다. 방사선활성 그룹의 경우, 신틸레이션 계수 또는 자동방사그래프 방법이 일반적으로 적합하다. 분광학적 방법을 사용하여 염료, 발광성 그룹 및 형광성 그룹을 검출할 수도 있다. 비오틴은 상이한 리포터 그룹(통상적으로 방사선활성 또는 형광 그룹 또는 효소)에 결합된 아비딘을 사용하여 검출할 수 있다. 효소 리포터 그룹은 (일반적으로 특정한 시간 동안) 기질을 첨가한 후 반응 생성물의 분광학적 또는 기타 분석법에 의해 일반적으로 검출할 수 있다.
전립선암의 존재 또는 부재를 측정하기 위해, 고체 지지체에 결합되어 잔류하는 리포터 그룹으로부터 검출된 시그날을 일반적으로 예비측정된 임계값에 상응하는 시그날과 비교한다. 한 가지 바람직한 양태로서, 임계값은 고정된 항체를 전립선암이 없는 환자의 샘플과 함께 항온처리하여 수득한 평균 시그날이다. 일반적으로, 예비측정된 임계값 이상에서 3개의 표준 편차 시그날을 생성하는 샘플을 전립선암에 대해 양성인 것으로 간주한다. 또다른 바람직한 양태로서, 임계값은 문헌[참조: Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, p. 106-7]의 방법에 따라 수용자 작동자 곡선(Receiver Operator Curve)를 사용하여 측정한다. 요약하면, 이러한 양태에서 임계값은 진단 시험 결과에 대해 각각의 가능한 임계값에 상응하는 진정한 양성 비율(즉, 민감성) 및 거짓의 양성 비율(100%-특이성) 한쌍의 플롯으로부터 측정할 수 있다. 상부의 좌측 코너(즉, 가장 큰 부분을 포함하는 값)에 가장 가까운 플롯상의 임계값이 가장 정확한 임계값이며, 이러한 방법으로 측정된 임계값보다 높은 시그날을 생성하는 샘플은 양성인 것으로 간주할 수 있다. 한편, 임계값은 플롯을 따라 좌측(거짓의 양성 비율을 최소화하기 위해)에서 우측(거짓의 음성 비율을 최소화하기 위해)으로 이동시킬 수 있다. 일반적으로, 이러한 방법으로 측정한 임계값보다 높은 시그날을 생성하는 샘플은 전립선암에 대해 양성인 것으로 간주한다.
관련된 양태로서, 본 발명의 검정법은 완전-유동 또는 스트립 시험 포맷에서 수행되는데, 여기서 항체는 니트로셀룰로즈와 같은 막위에 고정된다. 완전-유동 시험에 있어서, 샘플내의 폴리펩타이드는 샘플이 막을 통해 통과함에 따라서 고정된 항체와 결합한다. 이어서, 제2의 표지된 항체는 제2 항체를 함유하는 용액이 막을 통해 유동함에 따라서 항체-폴리펩타이드 복합체와 결합한다. 스트립 시험 포맷에 있어서는 항체가 결합된 막의 한쪽 말단을 샘플 함유 용액에 침지시킨다. 샘플은 제2 항체를 함유하는 영역을 통해 막을 따라 고정된 항체 부분으로 이동한다. 고정된 항체의 부분에서 제2 항체의 농도는 전립선암의 존재를 나타낸다. 전형적으로, 그 부위에서 제2 항체의 농도는 가시적으로 판독할 수 있는 패턴, 예를 들어 선형을 나타낸다. 이러한 패턴의 부재는 음성 결과를 나타낸다. 일반적으로, 막에 고정된 항체의 양은, 생물학적 샘플이 상기 언급된 포맷에서 2가지-항체 샌드위치 검정에서 양성 시그날을 충분히 생성할 수 있는 폴리펩타이드의 양을 함유하는 경우, 가시적으로 감소하는 패턴을 생성하도록 선택된다. 바람직하게는, 막위에 고정된 항체의 양은 약 25ng 내지 약 1㎍, 더욱 바람직하게는 약 50ng 내지 약 500ng의 범위이다. 이러한 시험은 전형적으로 극소량의 생물학적 샘플로 수행할 수 있다.
물론, 본 발명의 항원 또는 항체를 적절히 사용하기 위한 다수의 다른 검정 프로토콜이 존재한다. 상기 설명은 단지 예시적인 것으로 간주한다.
또다른 양태로서, 상기 폴리펩타이드는 전립선암의 진행에 대한 마커로서 사용될 수 있다. 이러한 양태로서, 전립선암의 진단을 위한 상술된 검정법은 시간에 따라 수행할 수 있고, 반응성 폴리펩타이드(들)의 농도 변화가 평가된다. 예를 들면, 본 발명의 검정은 6개월 내지 1년 동안 24시간 내지 72시간 마다 수행할 수 있으며, 그 후 필요에 따라 수행된다. 일반적으로, 전립선암은 결합제에 의해 검출된 폴리펩타이드의 농도가 시간에 따라 증가하는 환자에서 진행성이다. 대조적으로, 전립선암은 반응성 폴리펩타이드의 농도가 시간에 따라 일정하거나 감소하는 경우 진행성이 아니다.
상기 방법에 사용하기 위한 항체는 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 각종 기술에 의해 제조할 수 있다[참조: Harlow and Lane, Antibodies: A Laoratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]. 이러한 기술에 있어서, 항원성 폴리펩타이드를 포함하는 면역원을 다양한 포유동물(예: 마우스, 랫트, 래빗, 양 및 염소)에 초기에 주사한다. 이 단계에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 변형 없이 면역원으로서 사용될 수 있다. 한편, 특히 비교적 짧은 폴리펩타이드는, 당해 폴리펩타이드가 소 혈청 알부민 또는 키홀 림펫 헤모시아닌과 같은 담체 단백질에 결합하는 경우, 보다 우수한 면역 반응이 유도될 수 있다. 면역원은 바람직하게는 하나 이상의 부스터 면역화을 도입하는 미리 결정된 계획에 따라 동물 숙주에 주입되고, 동물은 주기적으로 채혈된다. 이어서, 폴리펩타이드에 특이적인 폴리클로날 항체는 예를 들어 적합한 고체 지지체에 결합된 폴리펩타이드를 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 이러한 항혈청으로부터 정제할 수 있다.
목적하는 항원성 폴리펩타이드에 특이적인 모노클로날 항체는 예를 들어 문헌[참조: Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519]의 기술 및 이의 개선된 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 요약하면, 이들 방법은 목적하는 특이성(즉, 목적하는 폴리펩타이드와의 반응성)을 갖는 항체를 생성할 수 있는 영구증식성 세포주를 제조하는 것이다. 이러한 세포주는 예를 들어 상술된 바와 같이 면역화시킨 동물로부터 수득된 비장 세포로부터 제조할 수 있다. 이어서, 비장 세포를 예를 들어 골수종 세포 융합 파트너, 바람직하게는 면역화된 동물과 동계인 파트너와의 융합에 의해 영구증식시킬 수 있다. 각종 융합 기술이 사용될 수 있다. 예를 들면, 비장 세포 및 골수 세포를 비이온성 세제와 수분 동안 혼합한 다음, 골수 세포가 아닌 하이브리드 세포의 증식을 유지하는 선택 배지상에 저밀도로 플레이팅한다. 바람직한 선별 기술은 HAT(하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘) 선별을 사용한다. 충분한 시간, 통상 약 1 내지 12주가 경과한 후, 하이브리드 콜로니를 관찰한다. 단일 콜로니를 선별하고, 폴리펩타이드에 대한 결합 활성을 시험한다. 활성 및 특이성이 높은 하이브리도마가 바람직하다.
모노클로날 항체는 증식성 하이브리도마 콜로니의 상층액으로부터 분리할 수 있다. 또한, 마우스와 같은 적합한 척추동물 숙주의 복강내로 하이브리도마 세포주의 주입과 같은 각종 기술을 사용하여 수율을 향상시킬 수 있다. 이어서, 모노클로날 항체를 복수액 또는 혈액으로부터 수집할 수 있다. 오염물을 크로마토그래피, 겔 여과, 침전 및 추출과 같은 통상의 기술에 의해 항체로부터 제거할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 예를 들어 친화성 크로마토그래피 단계의 정제 과정에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 모노클로날 항체는 치료제로서 사용되어 전립선 종양을 감소 또는 제거할 수 있다. 본 발명의 항체는 그들 자체(예를 들어, 전이를 억제하기 위해)를 사용하거나 하나 이상의 치료제와 조합하여 사용할 수 있다. 이와 관련하여 적합한 제제에는 방사선 핵종, 분화 유도제, 약물, 독소, 및 이의 유도체가 포함된다. 바람직한 방사선 핵종에는90Y,123I,125I,131I,186Re,188Re,211At, 및212Bi가 포함된다. 바람직한 약물에는 메토트렉세이트, 및 피리미딘 및 푸린 동족체가 포함된다. 바람직한 분화 유도제에는 포볼 에스테르 및 부티르산이 포함된다. 바람직한 독소에는 리신, 아브린, 디프테리아 독소, 콜레라 독소, 겔로닌, 슈도모나스 내독소, 시겔라 독소, 및 미국자리공 항바이러스 단백질이 포함된다.
치료학적 제제는 적합한 모노클로날 항체에 직접 또는 간접(예: 결합 그룹에 의해)적으로 결합(공유 결합)될 수 있다. 제제와 항체의 직접적인 반응은 이들 각각이 서로 반응할 수 있는 치환체를 갖는 경우에 가능하다. 예를 들면, 어느 하나의 구핵성 그룹(예: 아미노 또는 설프하이드릴 그룹)이 카보닐-함유 그룹(예: 무수물 또는 산 할라이드)과 반응하거나, 다른 하나의 우수한 이탈 그룹(예: 할라이드)을 함유하는 알킬 그룹과 반응할 수 있다.
한편, 결합 그룹에 의해 치료학적 제제 및 항체를 결합시키는 것이 바람직하다. 결합 그룹은 항체를 제제로부터 떼어 놓는 스페이서로서 작용하여 결합 능력의 간섭을 피할 수 있게 한다. 또한, 결합 그룹을 사용하여 제제 또는 항체에 대한 치환체의 화학적 반응성을 증가시킬 수 있으며, 이로써 결합 효능을 증가시킬 수 있다. 또한, 화학적 반응성의 증가는 불가능할 수도 있는 제제, 또는 제제에 대한 작용성 그룹의 사용을 용이하게 할 수도 있다.
본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 각종 이작용성 또는 다작용성 시약, 호모- 및 헤테로-작용성 시약(일리노이주 록포드 소재의 Pierce Chemical Co.의 카탈로그에 기술된 바와 같은 시약)을 결합 그룹으로서 사용할 수 있음이 명백할 것이다. 결합은 예를 들어 아미노 그룹, 카복실 그룹, 설프하이드릴 그룹, 또는 산화된 카보하이드레이트 잔기에 의해 수행할 수 있다. 이러한 방법은 다수의 참조 문헌, 예를 들어 로드웰(Rodwell) 등에게 허여된 미국 특허 제4,679,958호에 기술되어 있다.
본 발명의 면역접합체의 항체 부분이 없을 때 치료학적 제제가 더욱 효능적일 경우에는 세포내로 국지화하는 동안에 절단할 수 있는 연결 그룹을 사용하는 것이 바람직할 것이다. 다수의 상이한 절단가능한 결합 그룹이 기술되어 있다. 이들 결합 그룹으로부터 제제의 세포내 방출에 대한 기작은 디설파이드 결합의 감소(예: 미국 특허 제4,489,710호, Senter 등에게 허여), 광불안정성 결합의 조사(예: 미국 특허 제4,625,014호, Senter 등에게 허여), 유도체화된 아미노산 측쇄의 가수분해(예: 미국 특허 제4,638,045호, Kohn 등에게 허여), 혈청 보체-매개된 가수분해(예: 미국 특허 제4,671,958호, Todwell 등에게 허여), 및 산-촉매된 가수분해(예: 미국 특허 제4,569,789호, Blattler 등에게 허여)에 의한 절단이 포함된다.
항체에 하나 이상의 제제를 결합시키는 것이 바람직하다. 한 가지 양태로서, 다수 분자의 제제를 하나의 항체 분자에 결합시킨다. 또다른 양태로서, 한가지 형태 이상의 제제를 하나의 항체에 결합시킬 수 있다. 특정한 양태와 무관하게, 하나 이상의 제제를 갖는 면역접합체를 각종 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 제제를 항체 분자에 직접 결합시키거나, 다수의 결합 부위를 제공하는 결합제를 사용할 수 있다. 또한, 담체를 사용할 수 있다.
담체는 직접적인 공유 결합 또는 결합 그룹에 의한 공유 결합을 포함하는 각종 방법으로 제제를 포함할 수 있다. 적합한 담체에는 알부민과 같은 단백질(예: 미국 특허 제4,507,234호, Kato 등에게 허여), 펩타이드 및 아미노덱스트란과 같은 폴리사카라이드(예: 미국 특허 제4,699,784호, Shih 등에게 허여)가 포함된다. 또한, 담체는 비공유 결합 또는 리포솜 소낭내의 자체의 캡슐화(예: 미국 특허 제4,429,008호 및 제4,873,088호)에 의해 제제를 포함할 수 있다. 방사선 핵종에 특이적인 담체에는 방사선할로겐화된 소형 분자 및 킬레이트 화합물이 포함된다. 예를 들면, 미국 특허 제4,735,792호는 대표적인 방사선할로겐화된 소형 분자 및 이들의 합성법을 기술한다. 방사선 핵종 킬레이트는 금속, 또는 금속 옥사이드, 방사선 핵종을 결합시키는 공여체 원자로서 질소 및 황 원자를 함유하는 킬레이트 화합물로부터 형성할 수 있다. 예를 들어, 다비손(Davison) 등에게 허여된 미국 특허 제4,673,562호는 대표적인 킬레이트 화합물 및 이들의 합성법을 기술한다.
항체 및 면역접합체에 대한 각종 투여 경로가 사용될 수 있다. 전형적으로는 정맥내, 근육내, 피하 또는 절단된 종양의 베드내에 투여할 수 있다. 항체/면역접합체의 정확한 투여량은 사용된 항체, 종양에 대한 항체 밀도 및 항체의 제거 속도에 따라 달라질 수 있음은 명백할 것이다.
또한, 본 발명의 진단 시약은 하나 이상의 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열 또는 하나 이상의 이의 부분을 포함할 수 있다. 예를 들면, 2개 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머(여기서, 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 분자에 특이적이다)를 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기본된 검정에 사용하여 생물학적 샘플로부터 유도된 전립선 종양-특이적 cDNA를 증폭시킬 수 있다. 이어서, 증폭된 cDNA의 존재를 겔 전기영동과 같은 본 기술 분야에 공지된 기술을 사용하여 검출한다. 유사하게는, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 분자에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 탐침을 하이브리드화 검정에 사용하여 생물학적 샘플에서 본 발명의 폴리펩타이드의 존재를 검출할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "DNA 분자에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머/탐침"은 당해 DNA 분자와의 상동성이 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상 및 보다 바람직하게는 약 95% 이상인 올리고뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 본 발명의 진단 방법에서 유용하게 사용될 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및/또는 탐침은 바람직하게는 약 10 내지 40개 이상의 뉴클레오타이드를 가진다. 바람직한 양태로서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 본원에 기술된 특정한 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 분자의 약 10개 이상의 연속한 뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 진단 방법에 사용하기 위한 올리고뉴클레오타이드 탐침은 본원에 기술된 특정한 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 분자의 약 15개 이상의 연속한 뉴클레오타이드를 포함한다. PCR 기본된 검정 및 하이브리드화 검정 방식에 대한 기술은 본 기술 분야에 공지되어 있다[참조: Mullis et al. Ibid; Ehrlich, Ibid]. 따라서, 프라이머 또는 탐침을 사용하여 생물학적 샘플, 바람직하게는 혈액, 정액 또는 전립선 및/또는 전립선 종양 조직에서 전립선 및/또는 전립선 종양 서열을 검출할 수 있다.
하기 실시예는 설명을 위해 제공된 것이며, 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
A. 사람 전립선염 혈청을 사용하여 LnCap.fgc로부터 폴리펩타이드의 분리
본 발명의 대표적인 폴리펩타이드는 다음과 같이 사람 전립선염 혈청으로 사람 전립선암 세포주를 스크리닝하여 분리한다. 사람 전립선 선암 cDNA 발현 라이브러리를 사람 전립선 선암 세포주 LnCap.fgc(ATCC No. 1740-CRL)로부터 정제된 mRNA로부터 역전사효소 합성에 의해 작제한 다음, 람다 ZAP II(Stratagene, La Jolla, CA)내에 생성된 cDNA 클론을 삽입한다.
사람 전립선염 혈청은 BCG의 투여에 의해 방광암을 치료한 후 자가면역 전립선염으로 진단된 환자로부터 수득한다. 이 혈청을 사용하여 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Latobatories, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기술된 바와 같이 LnCap cDNA 라이브러리를 스크리닝한다. 구체적으로, LB 플레이트를 약 104pfu의 LnCap cDNA 라이브러리로 도말하고, 이소프로필티오-베타-갈락토사이드(IPTG) 침지된 니트로셀룰로즈 여과지상에서 1차 플라크 리프트를 수득하기 전에 42℃에서 4시간 동안 항온처리한다. 이어서, 이 플레이트를 추가로 5시간 동안 42℃에서 항온처리하고, 37℃에서 밤새 항온처리하여 2차 플라크 리프트를 제조한다. 여과지를 PBS-T로 3회 세척하고, 1시간 동안 PBS(1% 트윈 20TM함유)로 차단시켜 PBS-T로 다시 3회 세척한 다음 1:200으로 희석시켜 37℃에서 밤새 교반시키면서 사람 전립선염 혈청과 함께 항온처리한다. 이어서, 여과지를 PBS-T로 3회 세척하고, 교반시키면서 1시간 동안125I-표지된 단백질 A(1㎕/15ml PBS-T)와 함께 항온처리한다. 한쌍의 리프트상에 시그날을 형성하는 플라크를 LB 플레이트상에 재플레이팅한다. 생성된 플라크를 중복 여과지로 리프팅하고, 이들 여과지를 상기와 같이 처리한다. 여과지를 밤새 교반하에 4℃에서 사람 전립선염 혈청(1:200 희석)과 함께 항온처리한다. 양성 플라크를 상술된 바와 같이125I-단백질 A로 가시화하는데, 이때 여과지는 16시간 내지 11일 동안의 가변 시간 동안 필름에 노출시킨다. 양성 사람 전립선염 항원 cDNA 클론의 생체내 절단은 제조업자의 프로토콜에 따라 수행한다.
B. 폴리펩타이드의 특성화
양성 클론에 대한 DNA 서열은 Applied Biosystems Inc.사의 Automated Sequence Model 373A(Foster City, CA)상에서 전 및 역 프라이머를 사용하여 수득한다. 이후 HPA8, HPA13, HPA15 내지 HPA17, HPA20, HPA25, HPA28, HPA29, HPA32 내지 HPA38 및 HPA41로서 언급되는, 분리된 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA 서열은 서열 32 및 33, 34와 35, 36, 9와 10, 11, 12, 13과 14, 15, 37과 38, 16, 39, 22와 23, 17과 18, 19, 24, 40과 41, 42와 43에 각각 제시되어 있다. HPA16과 HPA20의 3' 서열은 상동성이다. HPA13, HPA16, HPA20, HPA29 및 HPA33은 새로운 5' 말단을 갖는 중첩 클론인 것으로 믿어진다. 2개의 양성 클론은 HPA15와 상동성인 것으로 결정되었다. 또한, HPA15, HPA34 및 HPA37은 중첩 클론인 것으로 밝혀졌다. 분리된 펩타이드 HPA16, HPA17, HPA20, HPA25, HPA28, HPA32, HPA35, HPA36, HPA34, HPA37, HPA8, HPA13, HPA15, HPA29, HPA33, HPA38 및 HPA41의 예상된 N-말단 아미노산 서열은 β-갈락토시다제(lac Z)의 N-말단 부분을 갖는 프레임내에서 결정된 cDNA 서열을 기준으로 하여 각각 서열 1 내지 8, 20, 21 및 25 내지 31에 제시되어 있다.
분리된 폴리펩타이드에 대해 결정된 cDNA 및 예상된 아미노산 서열을 EMBL 및 GenBank(Release 91) 데이타베이스, 및 또한 DNA STAR 시스템을 이용하여 유전자 뱅크의 공지된 서열과 비교한다. DNA STAR 시스템은 해독된 단백질 서열(Release 91)과 함께 스위스 PIR 데이타베이스의 조합이다. HPA17, HPA25, HPA28, HPA32, HPA35 및 HPA35의 경우 어떠한 현저한 상동성도 발견되지 않았다.
HPA8의 결정된 cDNA 서열은 사람 프로토-온코진 BMI-1과의 상동성이 약 100%인 것으로 밝혀졌다[참조: Alkema, M. J. et al., Hum. Mol. Gen. 2: 1597-1603]. HPA13을 암호화하는 5' 및 3' cDNA 서열은, DNA 데이타베이스 연구에 의하면, 사람 미숙 골수종 세포주(GenBank Acc. No. D63880)의 공지된 cDNA 서열과의 상동성이 100%인 것으로 나타났다. HPA13의 추정된 아미노산 서열은, 단백질 데이타베이스 연구에 의하면, 동일한 cDNA 서열에 의해 암호화된 오픈 리딩 프레임과의 상동성이 100%인 것으로 나타났다. HPA15의 추정된 아미노산 서열은, 단백질 데이타베이스 연구에 의하면, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 추정된 오픈 리딩 프레임(Swiss/PIR Acc. No. S46677)과 고도의 상동성(60% 동일성), 및 장액 분비를 조절하는 뇌하수체선의 사람 단백질과 100% 동일성을 나타냈다[참조: Lonnroth, I., J. Biol. Chem. 35: 20615-20620, 1995]. HPA38의 추정된 아미노산 서열은 사람 열 충격 인자 단백질 2와의 상동성이 100%인 것으로 밝혀졌다[참조: Schuetz, T. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6911-6915, 1991]. HPA41에 대한 5' DNA 서열을 사용한 DNA 데이타베이스 연구 및 추정된 아미노산 서열을 사용한 단백질 데이타베이스 연구에 의하면, 사람 LIM 단백질과의 동일성이 100%인 것으로 나타났다[참조: Rearden, A., Biochem. Biophys. Res. Commun. 201: 1124-1131, 1994]. 본 발명자의 최상의 지식으로는 LIM 단백질을 제외한 본 발명의 어떠한 폴리펩타이드도 사람 전립선내에 존재하는 것으로 이전에 밝혀진 바 없다.
양성 박테리오파지 바이러스 입자를 사용하여 문헌[참조: Sambrook et al., supra]에 기술된 바와 같이 이. 콜라이 XL-1 블루 MRF'를 감염시킨다. 재조합 단백질은 IPTG를 가하여 유도한다. 유도된 및 비유도된 용균액을 SDS-PAGE상에서 중복 작동시키고, 니트로셀룰로즈 여과지로 옮긴다. 여과지를 lacZ의 N-말단 4Kd 부분과 반응성인 사람 전립선염 혈청(1:200 희석) 및 래빗 혈청(1:200 또는 1:250 희석)과 반응시킨다. 혈청의 항온처리는 2시간 동안 실온에서 수행한다. 결합된 항체는125I-표지된 단백질 A를 가한 다음 16시간 내지 11일간의 가변 시간 동안 필름에 노출시켜 검출한다. 면역 블롯팅 결과가 표 I에 요약되어 있으며, 여기서 (+)는 양성 반응을 나타내고, (-)는 반응이 없었음을 나타낸다.
| 항원 | 사람 전립선염 혈청 | 항-lacZ 혈청 | 단백질 양/Kd |
| HPA8HPA13HPA15HPA15HPA17HPA20HPA25HPA28HPA29HPA32HPA33HPA34HPA35HPA36HPA37HPA38HPA41 | (-)(+)(+)(+)(+)(+)(-)(-)(+)(-)(+)시험하지 않음(-)(-)시험하지 않음(-)시험하지 않음 | (-)(+)(+)(+)(-)(+)(+)(-)(+)(-)(+)(+)(-)(-)(+)(-)(+) | 50404038325050 |
사람 전립선염 혈청 및 항-lacZ 혈청과 재조합 사람 전립선염 항원의 양성 반응은 사람 전립선염 혈청이 융합 단백질에 대해 유도된다는 것을 나타낸다. 사람 전립선염 혈청에 반응성을 나타내고 항-lacZ 혈청에 반응성을 나타내지 않는 클론된 항원은 반응성 단백질이 클론내에서 개시되고 있음을 나타낸다. 항-lacZ 혈청에 반응성을 나타내지만 사람 전립선염 혈청에 반응성을 나타내지 않는 항원은 사람 전립선염 혈청을 인식하는 배위 에피토프에 기인하거나, 항원-항체 결합 역학이 면역 블롯팅에서 2시간 동안의 혈청 노출이 충분하지 않은데 기인할 수 있다. 어떠한 혈청과도 반응하지 않는 항원은 이. 콜라이에서 발현되지 않으며, 반응성 에피토프는 융합 단백질 또는 내부 오픈 리딩 프레임내에 존재할 수 있다. HPA13, HPA29 및 HPA33의 재조합 항원은 불안정성에 기인하여, 재조합 항원의 크기를 측정할 수 없다.
대표적인 사람 전립선염 항원의 발현은 4개의 상이한 사람 세포주(2개의 전이성 전립선 종양 세포주 LNCaP 및 DU145 포함), 정상 전립선, 유방, 결장, 신장, 위장, 폐 및 골격근 조직, 9개의 다른 전립선 종양 샘플 및 3개의 다른 유방 종양 샘플에서 RT-PCR에 의해 조사한다. 이들 연구 결과가 표 II에 제시되어 있다.
또한, LNCaP 및 정상 전립선, 신장, 간, 위장, 폐 및 췌장에서 대표적인 항원의 mRNA 발현을 RNase 보호에 의해 조사한다. 이들 연구 결과가 표 III에 제공되어 있다.
| 클론 | LNCap | 전립선 | 신장 | 간 | 위장 | 폐 | 췌장 |
| hpa-15hpa-20hpa-25hpa-32hpa-35hpa-36 | +++++++NT++++ | -++++++++ | +++++NTNT | ++++++NT | ++++NT++ | -NT++++++++ | ++NTNTNT++ |
실시예 2
A. 랫트 스테로이드 결합 단백질의 분리 및 특성화
면역 혈청을 랫트 전립선 추출물로 면역화시킨 랫트로부터 수득하여 자체 전립선 항원에 대한 항체를 제조한다. 구체적으로, 랫트로부터 미리 채혈하여 대조군 혈청을 수득한 다음 프로인트 완전 애쥬번트중의 랫트 전립선 세정 추출물(0.1% 트리톤을 함유하는 PBS중의)로 면역화시킨다. 최초 면역화시킨 후 3주 경과하여 불완전 프로인트 애쥬번트의 부스터를 제공하고, 혈청을 6주 경과하여 수득한다.
이렇게 수득한 혈청을 제조업자의 프로토콜에 따라 ECL 웨스턴 블롯팅 검정(Amersham International, Arlington Heights, III)하고, 도 1에 도시된 바와 같이 랫트 전립선 단백질을 확인한다. 환원시킨 후, SDS-PAGE는 7kD에서 이동하는 굵은 은 염색 밴드를 나타냈다. 환원시키지 않으면, 강한 밴드가 24kD에서 나타났다(도 2). 이 단백질을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하고, 환원 조건하에 겔 전기영동시킨다. 3개의 밴드가 관찰되었는데, 이는 단백질내에 3개 쇄의 존재를 나타낸다; 6 내지 8kD 쇄(C1), 8 내지 10kD 쇄(C2) 및 10 내지 12kD 쇄(C3). 또한, 단백질은 DeltaTMC18 300Å 5㎛ 컬럼, 컬럼 크기 3.9×300mm(Waters-Millipore, Milford, MA)상에서 역상 HPLC에 의해 정제한다. 단백질 100㎍을 함유하는 샘플을 pH 1.9의 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)에 용해시키고, 폴리펩타이드를 pH 1.9의 0.1% TFA중의 아세토니트릴(0 내지 60%) 선형 구배로 유동 속도 0.5mL/분에서 1시간 동안 용출시킨다. 용출물을 214nm에서 모니터링한다. 2개의 피크, 즉 C1 내지 C3 이량체 및 C2 내지 C3 이량체가 수득되었다. C2 쇄의 아미노 말단이 차단된 것으로 밝혀졌다. C1 및 C3 쇄를 Perkin Elmer/Applied Biosystems Inc.사의 Procise Model 494 단백질 서열분석기로 서열분석한 결과, 아미노 말단 서열(각각 서열 44 및 45)이 다음과 같은 것으로 밝혀졌다:
(a) Ser-Gln-Ile-Cys-Glu-Leu-Val-Ala-His-Glu-Thr-Ile-Ser-Phe-Leu 및
(b) Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Ile-Leu-Asp-Glu-Val-Ile-Arg-Gly-Thr(여기서, Xaa는 임의의 아미노산일 수 있다).
이들 서열을 실시예 1에 기술된 데이타베이스를 사용하여 유전자 뱅크의 공지된 서열과 비교한 결과, 에스트라무스틴-결합 단백질(EMBP)로서 공지된 랫트 스테로이드 결합 단백질인 것으로 밝혀졌다[참조: Forsgren, B. et al., Prog. Clin. Biol. Res. 75A: 391-407, 1981; Forsgren, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 3149-53, 1979]. 이 단백질은 랫트 정액내의 주요 분비 단백질이며, 스테로이드, 콜레스테롤 및 프롤린 풍부 단백질을 결합시키는 것으로 밝혀졌다. EMBP는 에스트라무스틴, 및 에스트라무스틴 인산염의 활성 대사산물인 에스트로무스틴을 결합시키는 것으로 밝혀졌다. 에스트라무스틴 인산염은 표준 호르몬 절제 치료에 반응성이 없는 환자의 진행된 전립선암의 치료에 임상적으로 유용한 것으로 밝혀졌다[참조: Van Poppel, H. et al., Prog. Clin. Biol. Res. 370: 323-41, 1991].
B. 랫트 스테로이드 결합 단백질의 추정된 사람 동족체의 분리
정제된 랫트 스테로이드 결합 단백질을 새롭게 절제된 랫트 전립선으로부터 수득하고, 뉴질랜드 백색 암컷 래빗의 피하 면역화에 사용한다[PBS 1ml, 및 무라밀 디펩타이드(애쥬번트 디펩타이드, Calbiochem, La Jolla, CA) 100㎍을 함유하는 불완전 프로인트 애쥬번트중의 정제된 랫트 스테로이드 결합 단백질 150㎍]. 6주 경과하여, 불완전 프로인트 애쥬번트중의 동일한 단백질 용량으로 래빗을 피하 부스팅시킨다. 마지막으로, 2주 경과하여 래빗을 PBS중의 단백질 100㎍로 정맥내 부스팅시키고, 마지막으로 면역화시킨 후 2주 경과하여 혈청을 수득한다.
수득한 래빗 항혈청을 사용하여 LnCap.fgc 세포주를 불연속적으로 스크리닝한다. 래빗 항혈청을 연속 사용하여 하기 실시예 3에 기술된 프로토콜에 따라 사람 정액 음이온 교환 크로마토그래피 푸울을 스크리닝한다. 이 분석 결과는 약 18 내지 22kD 교차-반응성 단백질을 나타냈다. 목적하는 정액 단편(단편 1)을 비-환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 개개 성분으로 분리하고, PVDF 막상에서 블롯팅한 다음 절단하여 70% 포름산중의 CNBr로 분해한다. 생성된 CNBr 단편을 트리신 겔 시스템상에서 분해하고, PVDF로 전기블롯팅시켜 절단한다. 하나의 펩타이드 서열이 다음과 같이 측정되었다:
Val-Val-Lys-Thr-Tyr-Leu-Ile-Ser-Ser-Ile-Pro-Leu-Gln-Gly-Ala-Phe-Asn-Tyr-Lys-Tyr-Thr-Ala(서열 46).
이 서열을 상기 확인된 데이타베이스를 이용하여 유전자 뱅크의 공지된 서열과 비교한 결과, 예기치 않게 육안 낭포성 질환 유체 단백질과 동일한 것으로 밝혀졌으며, 이 단백질의 발현은 전이성 유방암의 존재와 상호 관련되는 것으로 이미 밝혀졌다[참조: Murphy, L. C. et al., J. Biol. Chem. 262: 15236-15241, 1987]. 본 발명자들의 최상의 지식에 따르면, 이 단백질은 수컷 조직에서는 이전에 확인된 바 없다.
스테로이드에 결합하는 상술된 단편 1의 능력은 다음과 같이 조사하였다. 정제된 랫트 스테로이드 결합 단백질(RSBP) 및 단편 1을 SDS-PAGE시키고, 니트로셀룰로즈 여과지상으로 옮긴다. 구체적으로, 겔 레인당 RSBP 1.5㎍ 및 단편 1 4㎍을 4 내지 20% 구배 라엠리 겔(BioRad)상에서 차례로 전기영동시키고, 니트로셀룰로즈로 전기영동에 의해 옮긴다. 단백질 이동 후, 니트로셀룰로즈를 1시간 동안 실온에서 PBS중의 1% 트윈 20에서 차단시키고, (PBS+0.5M NaCl)중의 0.1% 트윈 20 10ml에서 각각 10분 동안 3회 세척한 다음, 1) 세척 완충액으로 희석시킨 서양 고추냉이 퍼옥시다제(HRP, Sigma)와 접합된 0.87μM 프로게스테론; 2) 200μM 에스트라무스틴을 포함하는 0.87μM 프로게스테론 HRP; 또는 3) 0.87μM 프로게스테론 HRP + 400μM 비표지된 프로게스테론 및 200μM 에스트라무스틴으로 프로빙한다. 각각의 반응 혼합물을 1시간 동안 실온에서 항온처리하고, 각각 0.1% 트윈 20, PBS 및 0.5M NaCl로 10분 동안 3회 세척한다. 이어서, 블롯을 발색(ECL 시스템, Amersham)시킨 결과, 에스트라무스틴을 결합시킬 수 있는 프로게스테론 HRP 결합 단백질이 나타났다.
랫트 스테로이드 결합 단백질 및 단편 1에 의해 HRP-프로게스테론에 결합되고 비표지된 프로게스테론 및 에스트라무스틴과 경쟁하는 3개의 밴드가 수득되었다(도 3). 이들 결과는 상술된 사람 정액으로부터 분리된 3개의 밴드가 호르몬을 결합시키고, 1차 서열 또는 2차 해독후 변형에 기인하여 비록 약간 더 클 수는 있지만, 다수의 폴리펩타이드에서 랫트 스테로이드 결합 단백질의 쇄 C1, C2 및 C3에 상응한다는 것을 나타낸다.
또한, 랫트 스테로이드 결합 단백질의 이러한 추정된 동족체는 상술된 래빗 항혈청을 사용한 사람 정액의 연속 스크리닝으로 확인된다. 구체적으로, 소수성 22kD/65kD의 응고 단백질을 수득하고, 22kD 밴드로 CNBr 분해시키면 하기 서열을 갖는 펩타이드가 제공된다:
Val-Val-Lys-Thr-Tyr-Leu-Ile-Ser-Ser-Ser-Ile-Pro-Leu-Gln-Ala-Phe-Asn-Tyr-Lys-Tyr-Thr-Ala(서열 47).
이 펩타이드는 육안 낭포 질환 유체 단백질의 잔기 67 내지 87에 상응하는 것으로 밝혀졌으며, 하기 실시예 4에 기술된 바와 같이 사람 자가면역 전립선염 혈청을 사용하여 다시 확인되었다.
실시예 3
랫트 전립선염 혈청을 사용하여 LnCap.fgc로부터 분리된 폴리펩타이드의 분리 및 특성화
LnCap.fgc 세포 펠릿을 PBS, 1% NP-40 및 60㎍/ml 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)(Sigma, St. Louis, MO)에 재현탁시켜 균질화(10ml중의 10g 세포 펠릿)시킨 다음 Dounce 균질기로 10회 파쇄한다. 이것을 30초 동안 프로브 초음파 처리하고, 다시 Dounce 균질기로 10회 파쇄한다. 생성된 슬러리를 10,000×g으로 원심분리하고, 상층액을 0.45μM 여과기(Amicon, Beverly, MA)로 여과한 다음 BioRad(Hercules, CA) MacroPrep Q-20 음이온 교환 수지에 적용한다. 단백질을 pH 7.5의 20mM 트리스에서 8ml/분의 유동 속도에서 70분 동안의 0 내지 0.8M NaCl 구배로 용출시킨다. 단편을 냉각시키고, 10kD MWCO 원심 농축기(Amicon)으로 농축시킨 다음 60㎍/ml PMSF의 존재하에 -20℃에서 저장한다. 이어서, 이온 교환 푸울을 4 내지 40% 트리스 글리신 레디-겔(BioRad)상에서 전기영동에 의해 검사하고, 이어서 니트로셀룰로즈 여과기에 옮긴다. 목적하는 이온 교환 푸울을 실시예 3A에 상술된 랫트 혈청을 사용하여 ECL(Amersham International) 웨스턴 분석에 의해 확인한다. 이 분석 결과, 0.08 내지 0.13M NaCl에서 약 65kD 단백질이 용출되는 것으로 나타났다. 랫트 혈청 반응성 이온 교환 푸울을 HPLC시키고, 이어서 웨스턴 분석하여 목적하는 단백질 단편을 확인한다. 이어서, 이 단백질을 CNBr로 포화시킨 70% 포름산중에서 24시간 동안 25℃에서 분해시켜 메티오닌 잔기를 절단시킨다.
생성된 CNBr 단편을 Perkin Elmer/Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA)사의 Division Model 172 HPLC로 Vydac C18 컬럼(Hesperia, CA), 컬럼 크기 1×150mM를 사용한 소공 HPLC에 의해 정제한다. 단편을 분당 40㎕의 유동 속도에서 0 내지 60%의 아세토니트릴 구배로 컬럼으로부터 용출시킨다. 용출물은 214nm에서 모니터링한다. 생성된 단편을 Perkin Elmer/Applied Biosystems Inc.사의 Procise 494 단백질 서열분석기에 직접 로딩하고, 아미노 말단으로부터 표준 에드만 화학적 분석법을 이용하여 서열분석한다. 하기 서열을 갖는 2개의 다른 펩타이드가 수득되었다:
(a) Xaa-Ala-Lys-Lys-Phe-Leu-Asp-Ala-Glu-His-Lys-Leu-Asn-Phe-Ala(서열 48) 및 (b) Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Ile-Lys-Lys-Phe-Ile-Gln-Glu-Asn-Ile-Phe- Gly(여기서, Xaa는 임의의 아미노산일 수 있다)(서열 49).
이 서열을 상기 확인된 데이타베이스를 이용하여 유전자 뱅크의 공지된 서열과 비교한 결과, 이하 ER-60으로 언급되는 가능한 단백질 디설파이드 이소머라제 ER-60 전구체의 잔기 286 내지 300 및 228 내지 242로 각각 확인되었다[참조: Bado, R. J. et al., Endocrinology 123: 1264-1273, 1988]. 또한, 이 항원은 포스포리파제 C-알파로서 공지되어 있다(PCT WO 95/08624). ER-60의 잔기 285 내지 227은 메티오닌으로서, 시아노겐 브로마이드 분획중에 존재하는 상기 서열과 일치한다.
ER-60은 다수의 생물학적 활성을 갖는 고유한 원형질 단백질로서, 디설파이드 이소머라제 및 제한된 시스테인 프로테아제 활성을 포함한다. 특히, ER-60은 그룹 I의 주요 조직적합성 복합체(즉, MHC) 경로에 의한 항원의 발현에 관여하는 단백질인 칼넥신을 바람직하게 분해시키는 것으로 밝혀졌다. ER-60 및 관련된 그룹 구성원 ER-72는 결장암에서 과발현되는 것으로 밝혀졌는데, 절단된 형태의 ER-60은 효소 활성을 증가시킨다[참조: Egea, G. et al., J. Cell. Sci.(England) 105: 819-30, 1993]. 그러나, 본 발명자들의 최상의 지식에 의하면, 이 폴리펩타이드는 사람 전립선내에 존재하거나 과발현되는 것으로 이전에 보고된 바 없다. 최근 들어, ER-60 유전자의 발현은 세포 증식의 접촉 억제 유도와 관련되는 것으로 알려졌다[참조: Greene, J. J. et al., Cell. Mol. Biol. 41: 473-80, 1995]. 따라서, ER-60이 절단되어 전립선암에서는 결장암에서 기능하는 것과 같이 기능하지 않는다면, 생성된 접촉 억제의 상실은 신생물 형질전환 및 종양 진행을 유도할 수 있다.
실시예 4
사람 전립선 혈청을 사용한 LnCaP.fgc로부터 분리된 폴리펩타이드의 분리 및 특성화
실시예 1에 기술된 바와 같이 사람 전립선염 혈청을 사용하여 상기 실시예 3에 기술된 이온 교환 기술로 LnCaP.fgc 세포주를 스크리닝한다. 반응성 이온 교환 푸울은 상술된 바와 같이 역상 HPLC에 의해 정제하고, 서열 50 내지 51에 기술된 폴리펩타이드는 선별 기준에 따라 상기 항혈청과의 교차-반응성을 이용하여 분리한다. 상술된 데이타베이스를 사용하여 유전자 뱅크의 공지된 서열과 상기 서열을 비교한 결과, 표 IV에 도시된 상동성을 나타냈다. 그러나, 이들 폴리펩타이드중 어떠한 것도 이전에 사람 전립선과 관련된 바 없다.
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실시예 5
사람 정액 폴리펩타이드의 분리 및 특성화
사람 정액 폴리펩타이드를 균질화되도록 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 구체적으로, 정액 샘플을 pH 7의 0.1mM 비스-트리스 프로판 완충액으로 1 대 10으로 희석한 다음 컬럼에 로딩한다. pH 7.5의 0.01mM 비스-트리스 프로판 완충액에서 평형시킨 Poros(Perseptive Biosystems) 146 II Q/M 음이온 교환 컬럼 4.6mm×100mm상에서 겔 풍부 크로마토그래피에 의해 상기 폴리펩타이드를 푸울내에서 분별한다. 단백질을 상기 완충액에서 0 내지 0.05M NaCl 선형 구배로 용출시킨다. 컬럼 용출물을 파장 220nm에서 모니터링한다. 개개 단편을 Vydac(Hesperia, CA) C18 컬럼상에서 역상 HPLC에 의해 추가로 정제한다.
생성된 단편을 실시예 3에 상술된 바와 같이 서열분석한다. 하기의 N-말단 서열을 갖는 펩타이드가 수득되었다:
(c) Met-Asp-Ile-Pro-Gln-Thr-Lys-Gln-Asp-Leu-Glu-Leu-Pro-Lys-Leu(서열 57).
상술된 바와 같이 유전자 뱅크의 공지된 서열과 상기 서열을 비교한 결과, 사람 태반 단백질 14(PP14)와의 상동성이 100%인 것으로 나타났다.
실시예 6
폴리펩타이드의 합성
HPTU(O-벤조트리아졸-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트) 활성화에 의한 FMOC 화학적 합성법을 이용하여 Applied Biosystems 430A 펩타이드 합성기상에서 폴리펩타이드를 합성한다. Gly-Gys-Gly 서열을 펩타이드의 아미노 말단에 결합시켜 접합, 고정된 표면에의 결합, 펩타이드의 표지화 방법을 제공할 수 있다. 고체 지지체로부터의 펩타이드 절단은 하기 절단 혼합물을 사용하여 수행할 수 있다: 트리플루오로아세트산 : 에탄디티올 : 티오아니솔 : 물 : 페놀(40:1:2:2.3). 2시간 동안 절단시킨 후, 펩타이드를 차가운 메틸-3급-부틸-에테르에 침전시킬 수 있다. 이어서, 펩타이드 펠릿을 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)을 함유하는 물에 용해시키고, 동결 건조시켜 C18 역상 HPLC에 의해 정제한다. 물(0.1% TFA 함유)중의 0% 내지 60% 아세토니트릴(0.1% TFA 함유)의 구배를 이용하여 펩타이드를 용출시킬 수 있다. 순수한 분획을 동결 건조시킨 후, 펩타이드는 전기 분무 또는 다른 형태의 질량 스펙트럼을 이용하거나 아미노산 분석에 의해 특성화할 수 있다.
본 발명의 특정한 양태가 설명을 위해 본원에 기술되었으나, 본 발명의 정신 및 범주를 벗어나지 않고도 상기로부터 여러가지 변형이 생길 수 있음은 명백할 것이다.
(1) 일반적 정보:
(i) 출원인: 코릭사 코포레이션
(ii) 발명의 명칭: 전립선암의 면역치료 및 면역진단을 위한 화합물 및 방법
(iii) 서열 수: 57
(iv) 통신 주소:
(A) 주소: 시드 앤드 베리 엘엘피
(B) 거리: 5번 애비뉴 701 컬럼비아 센터 6300
(C) 도시: 시애틀
(D) 주: 워싱톤주
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호: 98104-7092
(v) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 형태: 플로피 디스켓
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환
(C) 운용 체계: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, Version #1.30
(vi) 현재 출원 정보:
(A) 출원 번호:
(B) 출원일: 1997년 3월 14일
(C) 분류 번호:
(viii) 대리인/관리인 정보:
(A) 성명: 마키 데이비드 제이
(B) 등록 번호: 31,392
(C) 참조/도켓 번호: 210121.424PC
(xi) 원거리통신 정보:
(A) 전화 번호: (206)622-4900
(B) 팩스 번호: (206)682-6031
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 89개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 2에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 89개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 3에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 858개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 4에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 127개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 5에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 43개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 6에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 751개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 7에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 6개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 8에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 16개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 9에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 271개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 10에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 403개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 11에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 2276개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 12에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 3114개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 13에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 1797개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 14에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 720개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 15에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 1996개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 16에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 3642개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 17에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 1397개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 18에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 800개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 19에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 1810개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 20에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 70개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 21에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 100개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 22에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 214개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 23에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 375개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 24에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 304개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 25에 대한정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 22개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 26에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 78개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 27에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 384개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 28에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 68개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 29에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 97개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 30에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 116개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 31에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 124개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 32에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 768개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 33에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 642개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 34에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 236개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 35에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 333개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 36에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 1272개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 37에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 206개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 38에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 341개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 39에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 293개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 40에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 350개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 41에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 377개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 42에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 374개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 43에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 492개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 44에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 15개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 45에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 15개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 46에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 21개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 47에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 21개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 48에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 15개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 49에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 15개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 50에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 18개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 51에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 15개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 52에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 14개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 53에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 15개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 54에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 18개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 55에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 15개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 56에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 15개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 57에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 15개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
Claims (31)
- 서열 2, 4, 5, 6, 7 및 8로 이루어진 그룹중에서 선택된 부분 서열을 갖는 전립선 단백질의 면역원성 부분, 또는 단지 보존성 치환체 및/또는 변형체만이 상이한 상기 단백질의 변이체를 포함하는 폴리펩타이드.
- 서열 11 및 서열 13 내지 19에 제공된 서열, 상기 서열의 보체, 및 서열 11 및 서열 13 내지 19에 제공된 서열과 하이브리드화하는 DNA 서열 또는 이의 보체로 이루어진 그룹중에서 선택된 DNA 서열에 의해 적절히 엄격한 조건하에 암호화된 아미노산 서열의 부분을 포함하는 전립선 단백질, 또는 단지 보존성 치환체 및/또는 변형체만이 상이한 상기 단백질의 변이체를 포함하는 폴리펩타이드.
- 제1항 또는 제2항의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자.
- 제3항의 DNA 분자를 포함하는 발현 벡터.
- 제4항의 발현 벡터로 형질전환시킨 숙주 세포.
- 제5항에 있어서, 숙주 세포가 이. 콜라이(E. coli), 효모 및 포유동물 세포주로 이루어진 그룹중에서 선택된 숙주 세포.
- 제1항 또는 제2항의 폴리펩타이드 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제1항 또는 제2항의 폴리펩타이드 및 비-특이적 면역 반응 인핸서를 포함하는 백신.
- 제8항에 있어서, 비-특이적 면역 반응 인핸서가 애쥬번트인 백신.
- 제1항 또는 제2항의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자 및 비-특이적 면역 반응 인핸서를 포함하는 백신.
- 제10항에 있어서, 비-특이적 면역 반응 인핸서가 애쥬번트인 백신.
- 서열 1, 3, 20, 21, 25 내지 31 및 44 내지 57로 이루어진 그룹중에서 선택된 부분 서열을 갖는 전립선 단백질의 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 전립선암을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
- 서열 1, 3, 20, 21, 25 내지 31 및 44 내지 57로 이루어진 그룹중에서 선택된 부분 서열을 갖는 전립선 단백질의 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드 및 비-특이적 면역 반응 인핸서를 포함하는, 전립선암을 치료하기 위한 백신.
- 제13항에 있어서, 비-특이적 면역 반응 인핸서가 애쥬번트인 백신.
- 제7항에 있어서, 전립선암의 성장을 억제시키는 약제 제조에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
- 제8항에 있어서, 전립선암의 성장을 억제시키는 약제 제조에 사용하기 위한 백신.
- (a) 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을 제1항 또는 제2항의 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 결합제와 접촉시키는 단계; 및(b) 결합제에 결합하는 단백질 또는 폴리펩타이드를 상기 샘플에서 검출하여 환자에서 전립선암을 검출하는 단계를 포함하는, 환자에서 전립선암을 검출하는 방법.
- 제17항에 있어서, 결합제가 모노클로날 항체인 방법.
- 제17항에 있어서, 결합제가 폴리클로날 항체인 방법.
- (a) 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을 제1항 또는 제2항의 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 결합제와 접촉시키는 단계;(b) 결합제와 결합하는 단백질 또는 폴리펩타이드의 양을 상기 샘플에서 측정하는 단계;(c) 단계(a) 및 단계(b)를 반복하는 단계; 및(d) 단계(b) 및 단계(c)에서 검출된 폴리펩타이드의 양을 비교하여 환자에서 전립선암의 진행을 모니터링하는 단계를 포함하는, 환자에서 전립선암의 진행을 모니터링하는 방법.
- (a) 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을, 서열 1, 3, 20, 21, 25 내지 31 및 44 내지 57로 이루어진 그룹중에서 선택된 부분 서열을 갖는 전립선 단백질의 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 결합제와 접촉시키는 단계; 및(b) 결합제와 결합하는 단백질 또는 폴리펩타이드를 상기 샘플에서 검출하여 환자에서 전립선암을 검출하는 단계를 포함하는, 환자에서 전립선암을 검출하는 방법.
- 제21항에 있어서, 결합제가 모노클로날 항체인 방법.
- 제21항에 있어서, 결합제가 폴리클로날 항체인 방법.
- (a) 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을, 서열 1, 3, 20, 21, 25 내지 31 및 44 내지 57로 이루어진 그룹중에서 선택된 부분 서열을 갖는 전립선 단백질의 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 결합제와 접촉시키는 단계;(b) 결합제와 결합하는 단백질 또는 폴리펩타이드의 양을 상기 샘플에서 측정하는 단계;(c) 단계(a) 및 단계(b)를 반복하는 단계; 및(d) 단계(b) 및 단계(c)에서 검출된 폴리펩타이드의 양을 비교하여 환자에서 전립선암의 진행을 모니터링하는 단계를 포함하는, 환자에서 전립선암의 진행을 모니터링하는 방법.
- 제1항 또는 제2항의 폴리펩타이드에 결합하는 모노클로날 항체.
- 제25항에 있어서, 전립선암의 성장을 억제시키는 약제 제조에 사용하기 위한 모노클로날 항체.
- 제26항에 있어서, 치료제와 접합되는 모노클로날 항체.
- (a) 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을 폴리머라제 연쇄 반응에서의 2개 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머(여기서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머중 하나 이상은 서열 9 내지 19, 22 내지 24 및 32 내지 43으로 이루어진 그룹중에서 선택된 DNA 분자에 대해 특이적이다)와 접촉시키는 단계; 및(b) 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 존재하에 증폭시킨 DNA 서열을 상기 샘플에서 검출하여 전립선암을 검출하는 단계를 포함하는, 환자에서 전립선암을 검출하는 방법.
- 제28항에 있어서, 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 서열 9 내지 19, 22 내지 24 및 32 내지 43으로 이루어진 그룹중에서 선택된 DNA 분자의 약 10개 이상의 연속한 뉴클레오타이드를 포함하는 방법.
- (a) 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을 서열 9 내지 19, 22 내지 24 및 32 내지 43으로 이루어진 그룹중에서 선택된 DNA 분자에 대해 특이적인 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 탐침과 접촉시키는 단계; 및(b) 올리고뉴클레오타이드 탐침과 하이브리드화하는 DNA 서열을 상기 샘플에서 검출하여 전립선암을 검출하는 단계를 포함하는, 환자에서 전립선암을 검출하는 방법.
- 제30항에 있어서, 탐침이 서열 9 내지 19, 22 내지 24 및 32 내지 43으로 이루어진 그룹중에서 선택된 DNA 분자의 약 15개 이상의 연속한 뉴클레오타이드를 포함하는 방법.
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