KR20010072825A - 안지오시딘: Ｃｙｓ-Ｓｅｒ-Ｖａｌ-Ｔｈｒ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ서열 특이적인 종양 세포 부착 수용체 - Google Patents

안지오시딘: Ｃｙｓ-Ｓｅｒ-Ｖａｌ-Ｔｈｒ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ서열 특이적인 종양 세포 부착 수용체 Download PDF

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죠지 투스진스키
태피 윌리암스
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하빌 이톤
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윌리엄스 타피
인키네 파마슈티컬 컴퍼니 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 트롬보스폰딘 (TSP-1)의 Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly (서열번호 1)-특이적인 부위에 대한 특이적인 결합 친화력을 가지는 정제된 수용체들에 관한 것으로, 구체적으로서열번호 2및서열번호 3,서열번호 2및서열번호 3의 단편들 및 돌연변이체들 및 상기 수용체들에 대한 항체들과 억제제들로 구성된 군으로부터 선택되는 수용체들에 관한 것이다. 또한, 본 발명은서열번호 2및서열번호 3의 수용체, 그의 단편들, 돌연변이체들 또는 항체들 및 그에 의해 유도된 리간드들 (ligands)을 사용하여 질병을 치료하고 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 정제방법에 의해 제공된 안지오시딘은 암의 진단, 처방 및 치료와 같은 수많은 진단 및 진료 상황에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

안지오시딘: Ｃｙｓ-Ｓｅｒ-Ｖａｌ-Ｔｈｒ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ 서열 특이적인 종양 세포 부착 수용체{Angiocidin: A Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly specific tumor cell adhesion receptor}
기적막 (basement membrane) 간의 세포성 반응 기작 (mechanism of cellular interaction)은 상당한 관심을 모아 왔는데, 이는 암 세포들이 반드시 전이되기 (metastasize) 전에는 이들 기저막을 통과해야만 하기 때문이다. 편재적인 기저막은 기관 실질 세포들 (organ parenchymal cells)을 간질 콜라겐성 기질 (interstitial collagenous stroma)로부터 격리시키는 세포외성 기질(extracellular matrix)의 특이적인 형태이다. 정상 세포 및 종양성 세포들 (neoplastic cells)은 상기 기질을 통하여 상이하게 상호작용한다. 대부분의 정상 세포들 (비이동성 세포들, nonmigratory cells)은 생존, 증식 및 분화를 위하여 세포외성 기질을 요구하는 듯이 보이는 반면, 이동성 세포들 (migratory cells), 일부 정상 및 종양성 세포들은 한 조직에서 다른 조직으로 이동하기 위해서는 기저막을 통과해야만 한다. 특히, 편평상피세포 (squamous epithelium) 또는 선상피세포 (glandular epithelium)에서 발병한 전이성 종양 세포들은 기저막을 통과하여 순환계 (circulatory) 및 림프계 (lymphatic) 시스템으로 진입하게 (intravasation) 된다. 순환하는 종양성 세포들은 전형적으로 다른 기관의 모세혈관 침상 (capilary bed) 내에서 정지된 후 혈관 벽 (blood vessel walls)으로 스며들어 기저막이 혈관외성 기관 (extravascular drgan)으로 침투하게 (extravasation) 되어 그곳에서 이차 종양이 형성되게 된다.
세포들과 세포외성 기질의 상호작용은 세포가 기질에 부착할 수 있는 세포 자체의 능력에 의존한다. 정상 및 종양성 세포 모두에서 부착 (attachment)은 기질에 존재하는 특정한 형태의 콜라겐 단백질 (collagen protein)에 세포가 결합하게 되는 특이적인 당단백질 (glycoprotein)에 의해 매개된다. 예를 들면, 섬유아세포들 (fibroblasrs), 근아세포들 (myoblasts) 및 평활근 세포들 (smooth muscle cells)은 간질성 타입 Ⅰ 및 타입 Ⅱ 콜라겐과 피브로넥틴 (fibronectin)의 상호작용을 통하여 세포외성 기질에 부착하게 되고, 연골아세포들 (chondrocytes)은 타입 Ⅱ 연골 (cartilage) 콜라겐과 콘드로넥틴 (chondronectin)의 상호작용을 통하여부착하게 된다. 정상 및 종양성 세포들 모두 유사한 작용기작을 통하여 기저막에 부착하게 된다. 기저막의 일차적인 구성성분은 타입 Ⅳ 콜라겐, 당단백질 및 프로테오글리칸 (proteoglycan)이다. 당단백질 라민 (lamine)은 상피 세포들 및 종양 세포들이 타입 Ⅳ 콜라겐에 결합하여 기저막에 부착되는 것을 매개한다.
전이성 종양 세포들은 전이과정에 있어서 다중 단계로 기저막을 통과해야만 하는데, 상기 통과 과정은 기저막에 부착하는 것으로부터 시작된다. 따라서, 종양 세포가 상기 기저막에 부착하하는 것을 촉진시키거나 억제하는데 대한 기작의 설명과 이에 관여하는 특이적인 부착 인자들 (attachment factors)의 분리는 암의 진단, 예방, 처방 및 치료에 매우 중요한 의미를 갖는다.
트롬보스폰딘 (TSP-1)은 세포 부착 단백질 (cell adhesive protein)로서 기저막, 종양 기질에 존재하는 기질 분자 (matrix molecules)이고 혈소판 (plateletes)에 의해 분비되어 진다. 트롬보스폰딘은 종양 세포 침투 및 전이를 매개한다. 하기 이론에 의해 한정되는 것은 아니지만, 종양 세포 집락화 (colonization)는서열번호 1로 기재되는 Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly 아미노산 서열을 포함하는 TSP-1의 부착 도메인 (adhesive domain)을 통하여 이루어진다고 알려져 있다. 상기 부착 도메인은 신규한 Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly (서열번호 1)-특이적인 종양 세포 수용체에 결합하게 되는데, 이러한 수용체는 안지오시딘이라고 알려져 있다. 상기 수용체는 막투과성 수용체 (transmembrane receptor)로서 단독으로 또는 세포에 결합되어 존재한다.
TSP-1은 각각 1,152 아미노산 (MW 145,000)으로 구성된 세 개의 동일한 이황화-연결 고리들 (disulfide-linked chains)로 구성되어 있다. 각각의 폴리펩티드 고리는 일차적으로 반복적인 상동성 아미노산 서열 (repeating homologous amino sequences)로 구성된 도메인으로 이루어져 있다. 이러한 도메인들로는 NH2-말단 구상 도메인 (NH2-terminal globular domain); 프로콜라겐 (procollagen) 상동성 도메인; 프로페르딘 (properdin) 내에서 발견되는 서열들에 상동성을 갖는 세 개의 반복적인 서열들로 구성된 타입 1 또는 프로페르딘 반복 도메인; 표피 성장 인자 (epidermal growth factor) 내의 서열들과 상동성을 갖는 세 개의 반복적인 서열들로 구성된 타입 2 반복 도메인; 7개의 반복적인 Ca2+-결합 서열들 (Ca2+-repeating sequences)로 구성된 타입 3 반복 도메인; 및 COOH-말단 구상 도메인이 있다.
TSP-1은 하기의 활성들에 의해 특정되는데, 세포-부착 촉진 활성, 세포 분열원질성 (mitogenic) 활성, 세포 화학주성 (chemotatic) 활성 및 지혈성 (hemostatic) 활성과 종양 세포, 미생물 또는 기생충 전이 활성, 혈소판 응괴 활성, 섬유소융해 (fibrinolytic) 활성 및 면역 중재 (immune modulation)와 같은 활성들로부터 유도되는 어떠한 활성들을 포함한다.
여러 연구에 따르면, 트롬보스폰딘은 동일한 세포에 존재하는 다중 세포 표면 수용체에 결합하거나 서로 다른 세포들에 존재하는 서로 다른 수용체들에 결합할 수 있다. 예를 들면, 혈소판들은 GPⅡ b-Ⅲa, GPⅠa-Ⅱa를 통하여 TSP-1과 결합하거나 (Karczewski et al.,J. Biol. Chem., 264:21332-21326, 1989; Tuszynxkiet al.,J. Clin. Invest., 87:1387-1394 ,1991) 비트로넥틴-수용체와 결합할 수 있다 (Tuszynski et al.,Exp. Cell Res., 182:481, 1989). 평활근 세포들, 상피 세포들. U937 단핵구 (monocyte)-유사 세포들 및 흑색종 (melanoma) 세포들은 비트로넥틴-유사 수용체들을 통하여 TSP-1과 결합할 수 있다. 편평상피세포 암종 (carcinoma)은 인테그린 (integrin) 또는 CD36이 아닌 분자량 80,000/105,000을 통하여 TSP-1과 결합할 수 있다 (Yabkowitz et al.,Cancer Res., 51:3648-3656, 1991).
트롬보스폰딘의 활성 및 중요성은 이에 대하여 개발된 항체의 기능에 의해 입증되어 졌다. 항트롬보스폰딘 항체들은 혈소판 응괴를 억제하는 것으로 알려져 있는데, 이는 트롬보스폰딘이 상기 시스템에 중요한 역할을 담당함을 의미하는 것이다 (Tuszynski et al.,Blood, 72:109-115, 1988). 게다가, 항트롬보스폰딘 항체들은 세포가 트롬보스폰딘으로 코팅된 배양 접시에 부착하는 것을 방지하는데, 이는 트롬보스폰딘이 세포 부착에 관여함을 나타낸다. 현재까지 트롬보스폰딘이 세포 부착에 중요한 역할을 수행하여 아마도 암 전이에 관여할 것이라는 증거들이 계속 발표되고 있다 (G. Tuszynski,Cancer Research, 47:4130-33, 1987).
또한, 다른 세포외성 기질 단백질들에 대한 수용체들이 분리되어 졌다. Liotta 등은 U.S.Pat. No. 4,565,789에서 라민 수용체의 분리에 대하여 기술하였다. Mecham 등은 67 kD 크기의 라민 수용체와 구조적 및 기능적 유사성을 나타내는 엘라스틴 (elastin) 수용체에 대하여 보고하였다 (Mecham et al.,J. Biol. Chem., 264:16652-16657, 1989). CD36은 트롬보스폰딘의서열번호 1로 기재되는Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly 아미노산 서열에 결합하는 것으로 보고되었다 (Asch et al.,Biochem. Biophys. Res. Comm., 182:1208-1217, 1992). 그러나, CD36은 88 kD 크기의 단백질이다. 본 발명의 Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly (서열번호 1)-특이적인 수용체는 이전에 분리되어 보고된 세포외성 기질 단백질 수용체들과 구분되어 진다.
본 발명은 종양 세포의 표면에서 발현되는 트롬보스폰딘 (thrombospondin)의서열번호 1로 기재되는 Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly 부위에 특이적인 세포 기질 수용체 (cell matrix receptor) 안지오시딘 (angiocidic)을 정제하는 방법 및 안지오시딘에 대한 항체와 억제제 (inhibitors)에 관한 것이다. 본 발명의 정제방법에 의해 제공된 안지오시딘은 암의 진단, 처방 및 치료와 같은 수많은 진단 및 진료 상황에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1(안지오시딘의 서열)은서열번호 2로 기재되는 Cys-Ser-Val-Thr-Cys-
Gly-특이적인 수용체 단백질인 안지오시딘의 서열을 나타낸 것이다.
도 2(안지오시딘의 서열)는서열번호 3으로 기재되는 Cys-Ser-Val-Thr-Cys
-Gly-특이적인 수용체 단백질인 안지오시딘의 서열을 나타낸 것이다.
도 3(서열 비교)은서열번호 4및서열번호 5로 기재되는도 1및도 2에서 분리된 상기 두 수용체들의 DNA 서열을 비교한 것이다.
도 4는 Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly-특이적인 수용체 단백질인 안지오시딘을 SDS-PAGE 겔로 분석한 결과이다.
레인 1; 비환원 (non-reduced) 단백질 (염색, stained),
레인 2; 환원 (reduced) 단백질 (염색),
레인 3; 비환원 단백질 (표지, labeled).
레인 4; 환원 단백질 (표지),
레인 5; 비환원 표면-표지 단백질
도 5(재조합 안지오시딘)는 SDS-PAGE와 웨스턴 블럿팅 (western blotting)으로 재조합 수용체 (recombinant receptor)를 분석한 결과이다. 발현된 수용체를 포함하는 세균 추출물 (bacterial extract), 공 벡터 (empty vector) 대조군 및 정제된 his-수용체들을 SDS-PAGE에 의해 분석하고 블럿들은 항-수용체 항체를 이용하여 염색하였다. 웨스턴 블럿팅을 위하여, 막은 TBS-tween (0.05% Tween 20을 포함하는 트리스-완충 식염수)에 용해되어 있는 1:2,000 수용체 항체 혈청으로 2시간 동안 처리한 후 TBS-tween으로 세척하고 1:15,000 고추냉이 퍼옥시다제 (horseradish-peroxidase)-결합 항-토끼 IgG로 1시간 동안 탐침을 수행하였다. 그리고 나서 상기 막을 다시 세척한 후 ECL (Enhanced Chemiluminescence, Amersham, Arlington Heights) 키트를 사용하여 분석하였다. 다양한 패널과 레인들은 하기와 같다:
패널 A; 염색된 겔, 패널 B; 항-수용체 항체 블럿,
레인 1; 전염색된 분자량 크기 마커,
레인 2; 삽입물이 없는 청정제 (detergent) 세포 추출물,
레인 3; 수용체 삽입물을 갖는 청정제 세포 추출물,
레인 4; 환원된 His-표지 정제 수용체,
레인 5; 비-환원된 His-표지 정제 수용체,
레인 6; 전염색된 분자량 크기 마커
도 6(TSP-1 및 펩티드의 안지오시딘에 대한 결합)은 TSP-1 및서열번호 6으로 기재되는 Cys (Acm)-Ser-Val-Thr-Cys (Acm)-Gly이 재조합 수용체에 결합하는 것을 나타낸 것이다. 발현된 수용체를 포함하는 세균 파쇄물 (레인 2, 4, 7) 또는 발현된 수용체를 포함하지 않는 대조군 파쇄물 (레인 1, 3, 6)의 SDS-PAGE 블럿은 항-수용체 항체 (레인 1, 2), 바이오틴화 (biotinylated) TSP-1 (레인 3, 4) 또는 바이오틴화 Cys (Acm)-Ser-Val-Thr-Cys (Acm)-Gly (서열번호 6) (레인 6, 7)으로 염색되었다.
도 7(트롬보스폰딘-1에 대한 수용체 결합)은 수용체 TSP-1의 결합 상수 (binding constant)를 결정한 것이다. TSP-1에 대한 수용체의 결합은 친화 센서 시스템 (Affinity Sensor System)인 공명 거울 바이오센서 시스템 (resonant mirror biosensor system)을 이용한 상호작용 분석 (interaction analysis)에 의해 결정되어 졌다. TSP-1을 큐벳에 결합시킨 후 수용체를 첨가하였다.도 7은도 8에 나타낸 장치 반응 (instrument response) vs 시간의 플롯으로부터 얻은 위성 첫 번째 순서 비 상수 (pseudo first order rate constant)의 플롯을 나타내는 것이다.
도 8(트롬보스폰딘-1에 대한 수용체 결합)은 수용체-TSP-1의 결합 상수를 결정하기 위하여 사용된 초기 결과들을 나타낸다. TSP-1에 대한 수용체의 결합은 공명 거울 바이오센서 시스템을 사용한 상호작용 분석에 의해 결정되어 졌다.도 8은도 7에서 결과점들 (data points)을 플롯하기 위해 사용된 시료 장치 반응 vs 시간을 나타내는 것이다.
도 9(TSP-1에 대한 수용체의 결합에 있어서 수용체 펩티드들의 효과)는 친화 센서 시스템을 이용하여 TSP-1에 대한 수용체의 결합에 미치는 수용체 펩티드들의 효과를 나타낸 것이다. 수용체 단독 또는 수용체와 펩티드 (두개의 서로 다른 몰 비율로)를 함께 첨가하였다. 무작위적인 대조군 뿐 아니라 수용체 펩티드들 모두 결합을 억제하기 위한 그들의 활성을 측정하기 위해 조사되어 졌다.
도 10(TSP-1에 대한 수용체 및 펩티드의 결합)은 다양한 펩티드들 단독 뿐 아니라 수용체 단독의 큐벳 상에서 고정화된 TSP-1에 대한 결합을 나타낸 것이다. 수용체 및 수용체 펩티드들 모두는 TSP-1에 결합한 반면, 무작위적인 대조군 펩티드는 결합하지 않았다.
도 11(TSP-1 및 Cys (Acm)-Ser-Val-Thr-Cys (Acm)-Gly에 대한 수용체 결합)은 수용체가 큐벳 상에 고정화되는 경우 TSP-1 및 Cys (Acm)-Ser-Val-Thr-Cys (Acm)-Gly (서열번호 6) 펩티드 모두 수용체에 결합함을 나타내는 것이다.
도 12(가슴 암종에서 수용체의 국소화)는 가슴 암종 (breast tumor)에서 수용체의 국소화 (localization)를 나타내는 것이다. 염색된 수용체는 도의 중앙에서 발견되는 종양 세포들의 가장자리 주변에서 가시화되어 질 수 있다.
도 13(모조 및 수용체 형질감염된 소 대동맥 내피세포의 부착)은 플레이트 상의 TSP-1 또는 음성 대조군인 BSA에 결합하는 수용체 형질감염 세포들을 사용한 세포 부착 연구 결과이다. 수용체 형질감염 세포들은 BSA 보다 TSP-1을 갖는 플레이트에 보다 강하게 부착하였다.
도 14(B16-F10 흑색종 세포들의 수용체 펩티드들에 대한 부착)는 플레이트 상에 고정된 TSP-1, 수용체 펩티드들 및 대조군을 이용한 세포 부착 연구 결과이다. 수용체 형질감염 세포들은 피브로넥틴 (양성 대조군), TSP-1 및 수용체 펩티드들에 더욱 강하게 부착되었다. 이러한 결과는 TSP-1 상호작용에 있어서 부가적인 단백질이 관여함을 암시하는 것이다.
도 15(TSP-1 형질감염 MDA-MB 435 가슴 암종 세포들의 고정화된 재조합 수용체에 대한 부착)는 TSP-1 형질감염 세포들 (및 벡터 형질감염 대조군 세포들)을 이용한 세포 부착 연구 결과이다. TSP-1 형질감염 세포들은 대조군 세포들에 비하여 수용체에 보다 강하게 결합하였다.
도 16(TSP-1 형질감염 MDA-MB 435 가슴 암종 세포들의 고정화된 재조합 수용체에 대한 부착에 있어서 항-TSP-1 항체들의 효과)은 TSP-1 형질감염 세포들을 이용한 세포 부착 연구 결과이다.도 16은 항-TSP-1 및 항-Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly (서열번호 1) 항체들이 플레이트에 코팅된 수용체에 결합하는 것을 억제함을 증명하는 것이다.
도 17(MDA-MB-435 가슴 암종의 부착에 있어서 재조합 수용체의 효과)은 TSP-1 형질감염 세포들을 이용한 세포 부착 연구 결과이다. 플레이트 상에 고장된 수용체에 대한 부착은 농도 의존적인 양상으로 비결합된 TSP-1의 첨가에 의해 억제되었다.
도 18(신혈관조성에 대한 수용체 효과)은 실혈관조성 (angiogenesis)에 대한 안지오시딘의 효과를 나타낸 것이다.도 18은 안지오시딘이 미소관들 (microtubules)의 형성을 억제함을 증명하는 것이다.
도 19(미세혈관 안정성에 대한 수용체의 효과)는 안지오시딘이 미세혈관(microvessel)의 안정성에 미치는 효과를 나타낸 것이다.도 19는 안지오시딘이 in vitro 형성 후 미소관들을 파괴함을 증명하는 것이다.
도 20(소 대동맥 내피세포의 형태에 대한 수용체의 효과)은 안지오시딘이 소 대동맥 내피세포들 (bovine aortic endothelial cells)의 형태에 미치는 효과를 나타낸 것이다. 안지오시딘의 증가된 농도는 세포들을 연장시키고, 플레이트로부터 탈착시켜 응집시킴으로써 사멸되도록 유도한다.
도 21(세포 생존능에 대한 수용체의 효과)은 안지오시딘이 세포 생존능 (cell viability)에 미치는 효과를 나타낸 것이다. BAEC 및 HUVEC 세포주들은 수용체 존재시에 감소된 생존능을 나타내었는데, 이는 TSP가 상기 세포주들의 생존에 필수적임을 암시하는 것이다. 섬유아세포, A549, MB231 및 MCF7 세포주들 사이에 어떠한 눈에 띄는 차이점도 보이지 않았는데, 이는 TSP가 상기 세포주들의 생존을 위한 필수조건이 아님을 나타낸다.
도 22(소 대동맥 내피세포 [BAEC] 및 소 평활근 [BSM]의 생존에 대한 수용체의 효과)는 안지오시딘이 BAEC 및 BSM 세포들의 생존에 미치는 효과를 나타낸 것이다. 안지오시딘은 BAEC 세포들의 생존능은 감소시킨 반면, BSM 세포들의 생존능에는 아무런 영향도 미치지 않았다.
도 23(소 대동맥 내피세포 [BAEC] 및 생쥐 루이스 폐 암종의 생존에 대한 수용체의 효과)은 안지오시딘이 BAEC 및 생쥐 루이스 폐 암종 세포들의 생존에 미치는 효과를 나타낸 것이다. 안지오시딘은 BAEC 세포들의 생존능은 감소시키는 반면, 루이스 폐 세포들의 생존능에는 아무런 영향도 미치지 않았다.
도 24(인간 배꼽 정맥 내피세포의 생존능에 대한 수용체의 효과)는 안지오시딘이 HUVEC (human umbilical vein endothelial cells) 세포들의 생존능에 미치는 효과를 나타낸 것으로, 안지오시딘은 이들의 생존능을 감소시켰다.
도 25(인간 배꼽 정맥 내피세포의 생존능에 대한 수용체의 효과)는 안지오시딘이 TSP-1이 존재하는 경우에 HUVEC 세포들의 생존능에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 26(소 대동맥 내피세포들의 수용체-매개 생존능)은 안지오시딘이 TSP-1이 존재하는 경우에 BAEC 세포들의 생존능에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 27(수용체 결합능 분석)은 바이오틴-아비딘 수용체 결합능 분석방법 (biotin-avidin receptor binding assay)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 28(고정화된 TSP-1에 대한 수용체의 결합)은 안지오시딘의 고정화된 TSP-1에 대한 결합을 나타낸 것이다.도 27은 KD9 nm에서 포화 결합 (saturable binding)을 나타낸다.
도 29(TSP-1에 대한 바이오틴-수용체의 결합에 있어 수용체의 효과)는 TSP-1에 대한 바이오틴-안지오시딘의 결합에 있어서 안지오시딘의 경쟁 효과 (competition effect)를 나타낸 것이다.
도 30(TSP-1 수용체 결합의 펩티드 경쟁)은 플레이트에 부착되어 있는 바이오틴-안지오시딘 복합체 (biotin-angiocidin complex)의 결합에 대한 안지오시딘의 경쟁 효과를 나타낸 것이다.
도 31(페이지 디스플레이 라이브러리로부터 얻은 펩티드들에 결합하는 수용체)은 페이지 디스플레이 라이브러리 스크리닝 과정 (phage display library screening process)을 통한 안지오시딘-결합 펩티드들을 나타낸 것이다.
도 32(TSP-1 수용체 결합의 펩티드 경쟁 [1 ㎎/㎖])는 TSP-1 및 안지오시딘 결합의 펩티드 경쟁을 나타낸 것이다. Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly (서열번호 1) 및 Lys-Val-Trp-Val-Leu-Pro-Ile (서열번호 14) 펩티드들 모두 결합을 억제하였다.
도 33(인간 대동맥 내피세포들 [HUVEC] 및 인간 폐 미세혈관 내피세포들 [HMVEC-L]의 생존능에 대한 안지오시딘의 효과)은 안지오시딘의 HUVEC 및 HMVEC-L 세포들의 생존능에 미치는 음성적 효과 (negative effect)를 나타낸 것이다.
도 34(소 대동맥 내피세포들의 생존능에 대한 안지오시딘 및 그의 단편들의 효과)는 안지오시딘의 다양한 단편들 뿐 아니라 안지오시딘의 BAEC 세포들에 미치는 음성적 효과를 나타낸 것이다.
도 35(루이스 폐 암종의 성장에 대한 안지오시딘의 효과)는 생쥐의 옆구리에 존재하는 루이스 폐 암 종양의 성장에 미치는 안지오시딘의 in vivo 효과를 정성적으로 (qualitatively) 나타낸 것이다.
도 36(종양 괴사를 촉진하는 안지오시딘)은 안지오시딘이 세포 수준에서 옆구리 종양 (flank tumor)의 괴사 (necrosis)에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 37(in vivo 상에서 루이스 폐 암종의 성장에 대한 안지오시딘의 효과)은 생쥐의 옆구리에 존재하는 루이스 폐 암 종양의 성장에 미치는 안지오시딘의 in vivo 효과를 정량적으로 (quantitatively) 나타낸 것이다.
도 38(생쥐 보유 루이스 폐 암종의 생존에 대한 안지오시딘 처리의 효과)은 생쥐 보유 (mice bearing) 루이스 폐 암종의 생존에 대한 안지오시딘 처리의 효과를 나타낸 것이다.
도 39(생존능 연구)는 안지오시딘이 소 대동맥 내피세포 생존능에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 40(BAEC 생존능의 안지오시딘-매개 억제에 대한 항-안지오시딘 항체의 효과)은 소 대동맥 내피세포 생존능의 안지오시딘-매개 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 41(기질에 대한 BAEC의 부착시 안지오시딘의 효과)은 소 대동맥 내피세포들의 부착에 대한 안지오시딘의 효과를 나타낸 것이다.
도 42(안지오시딘의 아미노 말단 및 카르복시 말단 부위의 기능성)는 안지오시딘 단백질의 N-말단 부위가 TSP-1 결합 및 항-내피세포 활성 모두에 있어서 전체 길이의 안지오시딘 단백질 활성 모두를 포함함을 나타내는 것이다. 안지오시딘 단백질의 C-말단은 음성 대조군과 유사한 수준의 활성을 가지고 있다.
본 발명의 목적은 트롬보스폰딘 (TSP-1)의 Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly (서열번호 1)-특이적인 부위에 대한 특이적인 결합 친화력을 가지는 정제된 수용체들을 제공하는 것이다. 바람직하기로는, 본 발명은서열번호 2및서열번호 3,서열번호 2및서열번호 3의 단편들 및 돌연변이체들 및 상기 수용체들에 대한 항체들과 억제제들로 구성된 군으로부터 선택되는 수용체들을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은서열번호 2및서열번호 3의 수용체, 그의 단편들, 돌연변이체들 또는 항체들 및 그에 의해 유도된 리간드들 (ligands)을 사용하여 질병을 치료하고 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 정제된 트롬보스폰딘 (TSP-1) 수용체 단백질, 다시 말해 이하 안지오시딘이라고 기재되는 단백질의 서열들을 제공한다. 수용체들의 서열들은도 1및도 2에 나타내었다 (서열번호 2및서열번호 3). 상기 서열들은 세 개의 아미노산들 Gly-Glu-Arg에 의해 구분되며 이들 DNA 염기서열들 사이의 차이점들은도 3에서 확인할 수 있다.
수용체들은 트롬보스폰딘의서열번호 1로 기재되는 Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly 부위에 특이적이다. 수용체 단백질들은 예를 들면 암의 진단 또는 처방을 포함하여 수많은 치료학적 분야에서 유용하게 사용될 수 있는 항체들을 생산하는 데 사용될 수 있다. 또한, Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly (서열번호 1)-특이적인 수용체 결합 부위에 대한 컴퓨터 모델링은 in vivo 상에서 Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly (서열번호 1)-특이적인 수용체 결합 부위를 차단하거나 결합하는 새로운 화합물의 고안을 도와줄 수도 있다. 상기 수용체 단백질은 암과 연관되어 있으며 암 세포들 내에서 상향조절되어 (upregulated) 진다. 상기 수용체는 이하 '안지오시딘'이라 명명되어 진다.
Gly-Glu-Arg (도 2) 서열을 제외한 나머지 수용체의 서열은 두 개의 공지된, 그러나 관련이 없는 단백질들과 상동성을 가지는 서열을 공유하는데, 상기 단백질들은 항분비성 인자 (sevretory factor) 및 인간 26S 프로테아제 (protease)의 유비퀴틴-결합 소단위 (ubiquitin-binding subunit)이다.
항분비성 인자는 뇌하수체 (pituitary)에 의해 만들어지는 단백질로서 대장 상피 (colonic epithelium)에 결합하여 대장 상피로의 물의 이동을 억제한다. 따라서, 상기 단백질은 인체가 소화관 (gut) 내에서 물의 유량 (water flow)을 조절하도록 해준다. 항분비성 인자는 숙주가 콜레라에 의해 감염된 경우와 같이 감염된 상태에서 생산되어 진다 (Johanson E., Identification of an Active Site inthe Antisecretory Factor Protein,Biochimica et Biophysica Acta.,1362:177-182, 1997). 한편, 인간 26S 프로테아제의 유비퀴틴-결합 소단위는 편재된 단백질들에 결합하여 세포 내에 존재하는 노화 단백질들의 분해과정을 보조한다 (Ferrell, K., Molecular Cloning and Expression of a Multiubiquitin Chain Binding Subunit of the Human 26S Protease,FEBS Letters, 381:143-148, 1996).
트롬보스폰딘 수용체 서열이 이들 두 개의 공지된 단백질들과 상동성을 갖는 서열을 공유한다는 것은 매우 놀라운 일이다. 이들 공지된 단백질들 모두 암과 전혀 연관되어 있지 않으며 암 세포들 내에서 상향조절되어 진다고 알려져 있지도 않다. 상기 단백질들은 어떠한 기능도 서로 공유하지 않으며, 심지어는 체내의 동일한 부위에서 작용하지도 않는다. 본 발명의 수용체는 세포 표면에 존재하는 반면, 항분비성 인자는 혈액 내에서 순환하고 유비퀴틴-결합 소단위는 세포 내에 포함되어 존재한다. 수용체가 상기 선행의 공지된 단백질들로부터 서로 다른 번역 후 변형과정 (post-translational modifications)을 가지고 있을 가능성도 있다. 이러한 변형들은 당쇄화 (glycosylation), 인산화 (phosphorylation), 외인산화 (ectophosphorylation), 소단위 구조 (subunit structure) (단량체 vs 이량체 또는 사량체 구조, monomer vs dimer or tetramer structure), 및 설프히드릴 그룹들(sufhydryl groups)의 결합을 포함하는 다른 형태적 구조 (conformational structures)를 포함한다.
본 발명의 수용체에 결합하는 항체들 및 리간드들은 항분비성 인자 및 유비퀴틴-결합 소단위의 작용에 의해 방해받지 않을 것으로 믿어진다. 유비퀴틴-결합소단위는 세포 내에 숨겨진 효소 복합체 (enzyme complex) 내에 위치하고 있으며 특정한 교차-활성 (cross-reactivity)에 의해 보호되어 진다. 항분비성 인자는 오직 감염된 상태, 특히 위장 (gastrointestinal) 감염 상태에 있는 체내에서 생산된다. 따라서 항분비성 인자는 일반적으로 혈액 내에는 존재하지 않으며, 그로 인해 본 발명의 수용체에 대한 항체들과 교차-반응할 수 없다. 더우기, 항체 특이성은 세 개 단백질들 사이에 서로 다르게 존재하는 번역 후 변형과정에 의존하게 된다. 이와 유사하게 경쟁적인 수용체 단백질들의 첨가는 다른 단백질들에 의해 방해받지 않는데, 이는 이들 단백질들 사이의 번역 후 차이점들이 유사하기 때문이다.
본 발명의 수용체들은 약 10-6내지 10-10M, 바람직하게는 약 10-7내지 10-9M, 더욱 바람직하게는 약 10-8M의 친화력을 가지는 트롬보스폰딘 펩티드 Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly (서열번호 1)에 대해 여전히 결합할 수 있는서열번호 2및서열번호 3의 변형, 다시 말해 돌연변이를 갖는 수용체들을 포함한다. 상기 돌연변이들은 단백질의 이차 구조 또는 단백질 기능에는 아무런 영향을 미치지 않는 어떠한 보존적인 치환들 (conservative substitutions)로 구성되어 있는데, 이들은 소수성 (hydrophobic), 친수성 (hydrophilic), 염기성 (basic) 및 산성 (acidic)과 같이 동일한 그룹 내 아미노산의 치환을 포함한다. 하기 치환에 한정되는 것은 아니지만 이들은 특히 다음을 포함한다; 발린 (valine) 및 쓰레오닌 (threonine), 글리신 (glycine) 및 이소류우신 (isoleucine), 라이신 (lysine) 및 아르기닌 (arginine), 글루탐산 (glutamic acid) 및 아스파르트산 (aspartic acid), 페닐알라닌(phenylalanine) 및 트립토판 (tryptophan), 세린 (serine) 및 쓰레오닌, 그리고 메싸이오닌 (methionine) 및 시스테인 (cysteine). 변형들은 Ile248-Lys380 (서열번호 25)의 카르복시 말단 부위에서 이루어지는 것이 바람직하다. 그러나, 변형들은 또한 다른 부위에서도 이루어질 수 있다. 다른 보존적 치환들은 당해분야의 업자에게는 자명한 사실이다.
부가적으로, 아미노 말단 단편을 포함하는 단편들의 돌연변이체들 뿐 아니라 아미노 말단 부위 (Met1-Lys132)를 포함하는 단편들도 본 발명에서 사용될 수 있다. 아미노 말단 단편 Met1-Lys132는서열번호 24로 기재되어 진다.
정의 및 약어
"안지오시딘", " Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly (서열번호 1)-특이적인 수용체 단백질", "트롬보스폰딘 수용체 단백질", "TSP-1 단백질", 및 "수용체"는 이에 한정되는 것은 아니지만 펩티드 Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly (서열번호 1)에 대한 특이적인 결합 친화력이 입증된 인간, 돼지, 말, 소 및 생쥐와 같은 포유동물 기원으로부터 얻은 천연의 트롬보스폰딘 수용체 단백질을 의미한다. 상기 수용체는서열번호 2및서열번호 3으로 기재되는 서열을 포함한다. 상기 용어는 또한 합성 TSP-1 수용체 단백질, 예를 들면 재조합 수단들 또는 직접적인 화학 합성에 의해 생산된 단백질을 포함한다. TSP-1 수용체 단백질은 혈소판 내피세포들, 상피 (폐) 세포들, 평활근 세포들, 섬유아세포들, 각질세포들 (keratinocytes), 단핵구 대식세포들 (macrophages), 신경교 세포들 (glial cells) 및, 이에 한정되는 것은 아니지만,흑색종 세포들 및 폐 암종 세포들을 포함하는 대부분의 특정한 암 조직들에서 발견되는 단백질이다.
"신혈관조성 활성 (angiogenesis activity)"은 이하에서 혈관들 또는 림프관들의 형성을 억제하거나 증가시키는 능력으로서 정의되어 진다.
"항-내피성 활성 (anti-endothelial activity)"은 이하에서 소 대동맥 내피 세포들과 같은 내피 세포들의 생존능을 감소시키는 능력으로서 정의되어 진다.
"항말라리아 활성 (antimalaria activity)"은 이하에서 말라리아-감염 백혈구 세포들의 내피 세포들에의 세포부착 (cytoadherence), 말라리아성 포자소체 (sporozoite) 인식 및 감담낭 (hepatocytes)으로의 진입, 또는 말라리아성 분열체 (merozoite) 인식 및 적혈구 세포들로의 진입 등의 어느 하나를 억제할 수 있는 능력으로서 정의되어 진다. 항말라리아 활성은 세포부착을 차단하는 백신 또는 치료제의 형태로 입증되어 진다.
"항전이 활성 (antimetastastic activity)"은 이하에서 종양 세포 전이의 정도 또는 크기를 억제하거나 상당히 감소시키는 능력 혹은 초기 고형 종양들의 퇴행 (regression)을 억제하거나 유도할 수 있는 능력으로서 정의되어 진다.
"동맥경화증 활성 (atherosclerosis activity)"은 이하에서 동맥경화증 병소 형성을 촉진하거나 억제하는 트롬보스폰딘의 능력으로서 정의되어 진다. 동맥경화증 병소는 특히 동맥의 벽 (arterial walls) 내에서 지질-함유 물질들 (lipid-containing materials)의 퇴행성 축적 (degenerative accumulation)으로서 정의되어 진다.
"세포 부착 활성"은 이하에서 세포들, 바람직하게는 포유동물의 세포들이 기질에 부착하는 것을 촉진하거나 억제하는 능력으로서 정의되어 진다.
"당뇨병성 망막병증 활성 (diabetic retinopathy activity)"은 이하에서 안구에서 당뇨병에 의해 야기되는 혈관들의 비정상적인 형성을 억제하는 능력으로서 정의되어 진다.
"성장 인자 활성"은 이하에서 세포 증식을 촉진하거나 억제하는 능력으로서 정의되어 진다.
"반점 퇴행 활성 (macular degeneration activity)은 이하에서 반점 퇴행시 망막 및 반점 아래에 존재하는 혈관들의 비정상적인 성장을 억제하는 능력으로서 정의되어 진다.
"트롬보스폰딘-유사 활성"은 이하에서 트롬보스폰딘의 공지된 생물학적 활성과 유사한 모든 활성으로서 정의되어 진다. 이러한 활성들은 세포-부착 촉진 활성, 세포 분열원질성 (mitogenic) 활성, 세포 화학주성 (chemotatic) 활성 및 지혈성 (hemostatic) 활성과 종양 세포, 미생물 또는 기생충 전이 활성, 혈소판 응괴 활성, 섬유소융해 (fibrinolytic) 활성 및 면역 중재 (immune modulation)와 같은 활성들로부터 유도되는 어떠한 활성들을 포함한다.
바람직한 구체화들
본 발명의 바람직한 수용체 단백질들은도 1및도 2에 나타낸서열번호 2및서열번호 3으로 기재되는 서열들을 갖는다. 본 발명의 부가적인 수용체 단백질들은 또한 전술한 바와 같은 상기 서열들의 돌연변이체들을 포함한다. 하나의 바람직한 단편은 아미노 말단 (Met1-Lys132) (서열번호 24)을 포함한다.
Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly (서열번호 1)-특이적인 수용체, 안지오시딘은 흑색종 세포들 또는 폐 암종 세포들과 같은 암 조직들에서 유래된다. SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis)에 의한 상기 수용체의 분석은 본 발명의 수용체가 비-환원성 (non-reducing) 조건에서 약 50 kD 크기의 분자량을 가짐을 보여준다. 몇몇 조제들에서 소량의 이량체들이 100 kD 보다 훨씬 큰 분자량을 가지고 관찰되어 졌다. 환원성 조건하에서, 상기 단백질은 분자량이 약 50 내지 60 kD 정도로 매우 가깝게 위치한 두 개의 주요 폴리펩티드 밴드들로서 이동되는데, 50 kD 종류는 아마도 60 kD 종류가 분해된 것이거나 이의 변형된 형태일 것이다. 이러한 결과는 상기 단백질이 이황화 결합시 보다 조밀한 구성 (compact configuration)을 가지게 되는 두 개의 상호고리 (interchain) 이황화-연결 폴리펩티드 고리들로 구성된다는 설명에 부합되는 것이다.
상기 단백질은 인테그린들, 라민 또는 CD36에 대한 항체들과 교차 반응하지 않는다. Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly (서열번호 1)-특이적인 수용체, 안지오시딘은 갈락토오스 (galactose), 만노스 (mannose) 및 글루코사민 (glucosamine) 특이적인 렉틴들 (lectins)에 결합하는 것으로 미루어 당단백질이다. 탄수화물 (carbohydrates)의 존재는 정제된 수용체 단백질의 높은 260 nm 흡광도 (absorbance)와 일치하는 것이다.
정제된 천연의 안지오시딘 단백질을 보다 더 특정하기 위하여, 수용체로서그의 활성을 in vitro 상에서 연구하였다. 상기 수용체는 이온 의존적 양상으로 트롬보스폰딘과 상호작용을 하지만 피브로넥틴 (FN) 또는 소 혈청 알부민 (BSA)과는 상호작용을 하지 않는다.
안지오시딘의 용도
본 발명의 TSP-1 수용체는 하기와 같이 여러 분야에서 사용될 수 있다.
(1) 수용체에 대한 항체들 또는 리간드들이 형성되어 질 수 있다. 이러한 항체들 또는 리간드들은 트롬보스폰딘의 효과를 흉내내거나 트롬보스폰딘 활성을 차단하기 위한 수용체와 상호작용을 할 수 있다.
(2) 수용체 서열에 대한 정보는 혈액, 조직생검 (biopsy) 또는 다른 조직 내 환자의 수용체 수준을 측정하기 위하여 사용될 수 있다. 비침투성 (noninvasive) 종양들은 이러한 수용체를 발현하지 못하거나 이들을 단지 매우 낮은 수준으로 발현하는 반면, 침투성 (invasive) 종양들은 상기 수용체를 매우 높은 수준으로 발현한다. 수용체의 수준은 환자의 진단 또는 예후 (prognosis)를 암시할 수 있다. 이는 전이되어 사망을 유도하는 침투성 종양의 표현형질로부터 전혀 전이되지 않는 비침투성 종양 세포를 구분할 수 있는 매우 신뢰할 만한 종양 표시자를 제공할 것이다. 이는 악성종양 (malignant) 암을 검출하고 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
(3) 상기 수용체는 트롬보스폰딘 활성과 유사한 활성을 갖거나 이들의 활성을 억제하도록 약제를 고안하는데 사용될 수 있다.
(4) 수용체 또는 그의 단편들은 트롬보스폰딘 활성의 경쟁적 억제제로서 환자에게 투여될 수 있다. 상기 수용체의 변형된 형태가 수용체 또는 그의 단편들을 대신하여 사용될 수 있다. 이러한 목적으로 허용가능한 단편은 약 10-6M 내지 10-10M의 친화력을 가지면서 TSP-1에 결합할 수 있는 TSP-1 결합 도메인 또는 상기 도메인의 변형체로 구성되는 것이 바람직하다.
(5) 세포독성 약제들, 호르몬들, 영상 제제 (image agents) 또는 방사성 성분들 (radioactive moeities)이 암 치료 또는 다른 요법에서의 용도로 (목적하는 성분으로서 작용하는) 수용체에 의해 유도된 항체 또는 리간드에 결합할 수 있다.
(6) 생체의학 (biomedical) 기구는 혈소판과 같이 세포 표면 상에 트롬보스폰딘을 위한 수용체들을 가지고 있는 세포들을 제거하기 위하여 수용체에 대한 항체 또는 수용체에 대한 리간드로 코팅되거나 이들에 결합될 수 있다.
(7) 수용체 또는 그의 단편들은 종양의 성장을 억제하거나 종양의 크기를 감소시키거나 혹은 종양의 성장을 방지하기 위하여 사용될 수 있다.
(8) 수용체 또는 그의 단편들은 신혈관조성을 방지하거나, 억제하거나 또는 역으로 진행시키기 위하여 사용될 수 있다.
이외에도 당해분야의 기술자에게 본 발명의 수용체의 다른 용도들은 자명한 사실이다.
이러한 조성물들의 어느 하나는 앞서 언급한 치료학적 목적을 제공하기 위하여 단독으로 제공되어지는 비독성 부가염들 (nontoxic addition salts), 아마이드들 (amides) 및 그의 에스테르들 (esters)과 함께 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 조성물들은 또한 생리학적으로 허용가능한 액체 (physiologically tolerable liquid), 겔 또는 고형 희석제들 (diluents), 면역 보강제들 (adjuvents) 및 부형제들 (excipients)와 함께 제공될 수 있다. 표준 제형들은 당해분야의 업자에게는 자명한 사실이다. 투여의 바람직한 형태들로는 정맥내 (intrevaneous), 근육내 (intramuscle) 및 피하 (subcutaneous) 투여가 있다. 투여의 또 다른 형태로는 상기 조성물을 신체의 질병 부위(들)에 예를 들면 목적하는 제제 (targeting agent)에 상기 조성물을 연결하여 직접 투여하는 것도 바람직하다. 투여의 다른 형태로 적당한 부가적인 제형들은 좌약들 (suppositories), 비강내 에어로졸들 (intranasal aerosols) 및 몇몇 경우에는 경구 (oral) 제형들도 포함한다.
예를 들면, 본 발명의 항체들은 환자에게 투여되어 트롬보스폰딘-유사 활성을 매개할 수 있다. 트롬보스폰딘의 효과를 억제하거나 흉내낼 수 있는 생리학적 효과를 가지는 본 발명의 항체들 및 이들을 포함하는 조성물들은 암 요법, 동맥경화증, 말라리아 치료 또는 예방, 혈전성 (thrombotic) 또는 혈전용해성 (thrombolytic) 상태들, 신혈관조성 또는 세포 부착 등과 같은 수많은 치료학적 및 예방학적 응용분야에서 사용될 수 있다. 항체들은 또한 진단용 시약들, 치료제들 또는 다른 화합물들의 담체들로서 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 항체들은 생체의학 기구에도 사용될 수 있다.
이러한 항체들 및 조성물들은 가정용 및 농장용 동물들 또는 가축을 위한 수의 용도로 동물에게 투여되거나 다른 치료학적 항체 제제들과 유사한 양상으로 인간에게 임상적 용도로 사용될 수 있다.
어떤 이론에 의해서도 그 범위가 한정되기를 바라지는 않지만, 본 발명의 항체들은 천연형의 트롬보스폰딘에 대한 작용물질들 (agonists) 또는 길항물질들 (antagonists)로서 작용하는 것으로 여겨진다. 이러한 항체들은 또한 주위포자소체 (circumsporozoite) 단백질, 트롬보스폰딘 관련의 익명 (anonymous) 단백질 및 프로페르딘 보조 (cpmplement) 단백질에 대한 작용물질들 또는 길항물질들로서 작용하는 것으로 여겨진다. METH-A 및 METH-2와 ADAMTS 클래스의 단백질에 속하는 관련된 단백질들과 같이 TSP-1 타입 1 반복 서열들을 포함하는 다른 리간드들은 안지오시딘과 상호작용을 한다 (Vasquez, F., METH-1, a Human Ortholog of ADAMTS-1, and METH-2 are Members of a New Family of Proteins with Angio-Inhibitory Ativity,J. Biol. Chem., 274:22349-23357, 1999). 수용체에 의해 유도된 리간드들은 항체들과 같이 동일한 방법으로 사용될 수 있다. 수용체 또는 그의 단편들은 또한 트롬보스폰딘을 위한 경쟁적 리간드들로서 투여될 수 있다.
수많은 in vivo 및 in vitro 분석방법들이 항체들이 트롬보스폰딘-유사 활성 효과를 나타냄을 증명하기 위하여 사용될 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니지만, 이러한 분석방법들은 하기의 방법들은 포함한다: 항체-수용체 결합 분석방법들, 세포 부착 분석방법들, 혈소판 응괴 분석방법들 및 세포 증식 분석방법들. 예를 들면, 고효율 결합 분석방법 (high throughput binding assay)이 트롬보스폰딘-유사 결합능을 가지는 수용체에 대한 항체들을 선별하기 위하여 사용될 수 있다. 누구나 수용체를 플레이트에 부착시키고, 여기에 표지된 TSP-1을 결합시키고, 검사되어질 화합물을 첨가한 후 상기 화합물이 수용체에 대한 TSP-1 결합을 억제하는지 여부를 결정할 수 있다. 하기에 서술된 바와 같은, 다른 분석방법들이 검사되어질 항체의 기능적 활성을 결정하기 위하여 사용될 수 있다.
전이
전이는 질병이 신체의 한 부분에서 이와 관련이 없는 다른 부분으로 퍼지는 현상으로서, 혈류나 림프관 (lymphatics)을 통하여 악성 종양의 세포가 이동하는 것을 말한다. 전이는 종양 세포의 내피에의 부착, 내피의 수축 (retraction), 기저막의 기질 분해 및 종양 세포들의 혈류 내로의 침투를 포함하는 일련의 캐스케이드 기작 (cascade mechanism)을 통하여 이루어지는 것으로 알려져 있다. 이러한 캐스케이드 내 한 단계에서의 방해 (intervention)는 전이성 암들의 치료 및 예방에 매우 유용할 것이다.
천연형의 트롬보스폰딘 분자는 종양 세포 전이에 약효를 나타내는 것으로 보고되어 있다 (Turszynski et al.,Cancer Research, 47:4130-4133, 1987). 트롬보스폰딘의 약효가 유발하는 기작들에 대해서는 현재까지 잘 알려져 있지 않다.
항전이성 활성은 in vitro 상에서 흑색종 세포들에 결합하는 화합물의 능력 (Turszynski et al.,Anal. Bio., 184:189-191, 1990)과 in vivo 상에서 종양 집락들의 크기 및 수를 감소시키는 능력 (Turszynski et al.,Cancer Research, 47:4130-4133, 1987)에 의해 특정지어져 왔다.
본 발명의 수용체에 의해 유도된 항체들 또는 리간드들은 항전이성 제제들로서 사용되며, 특히 항-폐 전이성 제제들 (anti-pulmonary mstastatic agents)로 유용하게 사용될 수 있다. 이러한 제제들은 전이성 종양 세포들, 특히 트롬보스폰딘에 대해 반응하는 세포들의 부착을 억제한다. 이들은 또한 종양 집락의 크기 뿐 아니라 종양 집락의 수도 감소시킨다. 본 발명의 항체들 및 리간드들의 특별한 장점은 긴 순환성 반감기 (long circulating half-life)를 갖는다는 것이다.
이러한 항전이성 활성이 유도될 수 있는 수많은 기작들이 있다. 항체들 및 리간드들은 세포에 독성을 나타내거나 세포 증식을 억제할 수 있다. 세포 증식 억제제로서, 이러한 제제들은 1) 분열원질조성 (mitogenesis)을 억제하거나 2) 신혈관조성을 억제하거나 3) 보조 기작 (complement pathway) 및 관련된 살상 세포들 (killer cells)을 활성화시키는 작용을 할 수 있다.
본 발명의 항체들 및 리간드들은 또한 생체의학 기구 분야에서도 그 용도를 찾을 수 있다. 항체들 및 리간드들은 전이성 종양 세포들의 부착을 촉진하는 능력을 가지고 있기 때문에, 혈액 또는 림프로부터 순환하는 종양 세포들을 효과적으로 제거하기 위한 제제로서 생체의학 기구에 코팅될 수 있다. 또한 생체의학 기구는 간암 또는 다른 암종들을 걸러내는데 (trap) 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 항체들 및 리간드들의 또 다른 용도는 진단학적 또는 치료학적 목적으로서 목적으로 하는 독소들, 약제들, 호르몬들, 영상 제제들 또는 전이성 종양 세포들에 대한 방사성 성분들에 대한 담체로 사용하는 것이다. 이러한 담체들 역시 간암 또는 다른 암종들에 결합할 수 있다. 수용체 자체 또는 그의 단편들/돌연변이체들은 트롬보스폰딘 활성을 경쟁적으로 저해하기 위하여 사용될 수 있다. 특별히, 본 발명은 TSP-1에 의해 유도된 항체 또는 리간드를 방사성 성분에 연결시켜 암을 치료하는 조성물들 및 그의 방법들을 포함한다. 본 발명은 또한 TSP-1에 의해 유도된 항체 또는 리간드를 방사성 성분에 연결시켜 방사성 물질을 검출하고 암을 진단하기 위한 조성물들 및 그의 방법들을 포함한다. 암의 치료, 검출 및 진단을 위한 방사성 성분들은 당해분야에 잘 알려져 있다. 마지막으로, 본 발명은 TSP-1에 의해 유도된 항체 또는 리간드를 MRI 증강 제제 (MRI enhancing agents)에 연결시켜 MRI 검출, 암의 진단 및 암의 치료에 대한 치료학적 반응의 정량을 위한 조성물들 및 그의 방법들을 포함한다. 암의 검출, 진단 및 암의 치료에 대한 치료학적 반응의 정량을 위한 MRI 증강 제제들은 당해분야에 잘 알려져 있으며, 이에 한정되는 것은 아니지만 가돌리니움 (gadolinium), 망간 (manganese), 철, 테크네시움 (technecium), 가스트로그라핀 (GASTROGRAPHINTM), 이소뷰 (ISOVUETM), 헤파토라이트 (HEPATOLYTETM) 및 뉴로라이트 (NEUROLYTETM) 등을 포함한다. 다른 허용가능한 MR1 증강 제제들은 당해분야의 업자에게는 이미 공지되어 있다.
동맥경화증
동맥경화증은 동맥의 내부 벽에 작은 지방 결절 (fatty nodules)의 침착 (deposition)에 의해 특정되는 질병 상태로서 주로 질병 부위의 퇴행에 의해 수반되어 진다.
TSP-1 수용체에 대한 항체들, TSP-1 수용체에 대한 리간드들, 수용체 또는그의 단편들/돌연변이체들의 투여는 트롬보스폰딘 활성을 감소시키고 대동맥 병소 (aortic lesions)의 발달을 억제할 수 있다. 이러한 결과는 콜레스테롤 함량이 높은 음식물을 섭취한 토끼 내에서 입증되었다.
당뇨병성 망막병증
당뇨병성 망막병증이 유발되면 망막에 존재하는 혈관들은 손상을 입고, 유액이 새거나 출혈이 생기게 되고, 망막 손상이 야기된다. 증식성 망막병증에서는 새로운, 깨지기 쉬운 혈관들이 망막의 표면에서 성장한다. 이러한 새로운 혈관들 또는 신혈관신생 (neovascularization)은 깨지고 새거나 유리체 (vitreous) 내로 출혈이 생기기 때문에 심각한 시각 장애를 유발할 수 있다. 유리체는 출혈된 혈액으로 인해 흐려지게 되므로, 빛이 안구를 통해 망막으로 통과하는 것이 방해를 받아 시각이 뿌해지고 뒤틀려진다. 새로운 혈관들은 또한 반흔 (scar) 조직들을 야기할 수 있는데, 이는 망막을 안구의 뒤쪽으로부터 끌어당기는 작용을 하여 망막 박리 (retinal datechment)를 야기하게 되고 결과적으로 망막 박리가 실명 (blindnss)을 이끌게 된다. 마지막으로, 비정상적 혈관들은 홍채 (iris) 상에 성장하게 되어 녹내장 (glaucoma)을 이끌게 된다. TSP는 당뇨병성 망막병증에서 비정상적 혈관의 성장에 중요한 역할을 수행하는 것으로 여겨진다.
반점 퇴행
반점 퇴행 (macula degeneration)의 "건조" 형태 ("wet" type)에 있어서, (소망막성 신혈관신생으로 알려진) 비정상적 혈관들은 망막과 반점 (macula) 아래에서 성장한다. 그리고 나서 이러한 새로운 혈관들은 출혈이 일어나고 유액이 새게되며, 그로인해 반점이 부풀어오르거나 들어 올려지게 되어 중심와 시력 (central vision)이 뒤틀리거나 파괴된다. 이러한 상황하에서, 시각 상실은 재빠르고 심각하게 진행된다. TSP는 반점 퇴행에 있어서 비정상적인 혈관의 성장에 중요한 역할을 수행하는 것으로 여겨지고 있다.
말라리아
말라리아는 적혈구 소체 (corpuscles) 내에 기생하는 다양한 원생동물들 (플라스모디움 속) (geneus Plasmodium) 중의 어느 하나에 의해 야기되는 감염성 질병 (infectious disease)으로서 감염된 모기의 물림에 의해 동물에게 전염된다. 본 발명의 항체들, 리간드들, 수용체 또는 그의 단편들/돌연변이체들은 세포부착을 차단하기 위한 치료학적 제제로 사용될 수 있다.
이러한 제제들은 트롬보스폰딘 활성을 차단하여 그로 인해 말라리아-감염 적혈구 세포들이 내피 세포들에 부착하는 것을 억제하거나 간 세포 (hepatocytes)로의 진입을 억제하게 된다.
신혈관조성
신혈관조성은 혈관 및 림프관들이 형성되는 것이다. 본 발명의 항체들, 리간드들, 수용체 또는 그의 단편들/돌연변이체들은 신혈관조성의 조절에 사용될 수있는데, 특히 창상 치유를 촉진하거나, 종양의 성장, 당뇨병성 망막병증, 반점 퇴행 및 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthritis)을 억제 또는 방지하는데 유용하게 사용될 수 있다. 표준적인 신혈관조성 분석방법들은 당해분야에 잘 알려져 있다. 이에 한정되는 것은 아니지만, 이러한 분석방법들은 다양한 세포주들을 이용한 증식 및 이동 연구, 콜라겐 분해효소 (collagenase) 억제 및 닭 융모요막 (chicken chorioallantoic membranes) 상의 in vivo 신혈관신생 분석방법 (CAM assay) 등을 포함한다.
부착 중재
본 발명의 항체들, 리간드들, 수용체 또는 그의 단편들/돌연변이체들은 세포 부착을 중재하고 TSP-1과 TSP-1 수용체 부위를 포함하는 혈소판들과 같은 세포들에 대한 단백질들의 결합을 억제한다.
진단
본 발명의 항체들 및 리간드들은 다양한 종류의 암들, 이에 한정되는 것은 아니지만, 위장관 (gastrointestinal tract) (위장 [gastric], 대장 [colonic], 직장 [rectal]) 암종들, 가슴 암종들, 간 암종들 및 흑색종들을 포함하는 암의 진단학적/예방학적 분석방법들의 시약으로서 유용하게 사용될 수 있다. TSP-1 수용체의 수준은 환자의 예후 또는 진단을 제공하기 위해 사용되어 질 수 있다. 더나아가 수용체 서열에 대한 지식은 환자 시료 내 수용체의 수준을 직접적으로 결정하기위하여 사용될 수 있다.
담체
세포독성 약제들, 호르몬들, 영상 약제들 또는 방사성 성분들은 암 또는 다른 요법에 사용하기 위한 항체들 또는 리간드들과 결합되어질 수 있다.
생체의학 기구
생체의학 기구는 혈소판들과 같이 세포 표면 상에 트롬보스폰딘의 수용체를 가지고 있는 세포들을 제거하기 위한 항체들 또는 리간드들로 코팅되거나 이들에 연결되어 사용될 수 있다.
트롬보스폰딘 수용체에 대한 적당한 리간드들의 분리
적당한 (appropriate) 리간드들은 트롬보스폰딘 단백질, 그의 돌연변이체들 및 (Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly [서열번호 1]로 기재되는 펩티드를 포함하는) 단편들, 그리고 본 발명의 수용체에 결합하는 다른 펩티드들 또는 단백질들을 포함한다.
이러한 리간드들은 New England Biolabs (Beverly, MA)에서 시판하고 있는 페이지 디스플레이 펩티드 라이브러리 키트 (phage display peptide library kit)를 사용하여 개발되고 분리될 수 있다. 페이지 디스플레이는 선별 기술 (selection technique)로서 펩티드 또는 단백질을 박테리오페이지 (bacteriophage)의 외피-단백질 (coat-protein)과 융합시켜 발현시킴으로써 융합 단백질은 페이지 비리온 (virion)의 외부 표면에 나타나고 비리온 내에는 융합을 암호화하는 DNA가 잔존하게 되는 결과를 얻는다. 페이지 디스플레이는 각각의 서열을 암호화하는 DNA에 대한 무작위적 펩티드 서열들의 거대한 라이브러리 사이에 물리적인 연관 (linkage)을 만들어 바이오패닝 (biopanning)이라 불리는 in vitro 선별 과정 (selection process)에 의해 (수용체를 포함하는) 목적하는 분자들의 다양성을 위한 펩티드 리간드들의 신속한 분리를 가능하게 하는데 사용될 수 있다. 상기 기술은 페이지-디스플레이된 펩티드들의 라이브러리를 목적하는 수용체로 코팅된 플레이트 (또는 비드)와 함께 배양한 후 결합되지 않은 페이지를 세척하고 특이적으로 결합된 페이지를 용출하는 과정에 의해 수행된다. 그리고 나서 용출된 페이지는 증폭되고 가장 단단하게 결합한 서열들 순으로 페이지 풀 (phage pool)을 연속적으로 채우기 위한 부가적인 횟수의 바이오패닝과 증폭 과정을 거치게 된다. 3 내지 4회 후, 개별적인 클론들을 DNA 서열분석 및 ELISA를 통하여 특정화하였다.
펩티드들을 암호화하는 올리고뉴클레오티드는 분리된 펩티드 서열을 포함하는 단백질들을 동정하기 위한 탐침 (probe)으로 사용되어 진다. 이러한 단백질들은 이하의 실시예에 기술된 결합 기술들 중의 어느 하나를 사용하여 수용체를 위한 그들의 결합 능력이 평가될 수 있다.
안지오시딘의 발현
안지오시딘 또는 그의 단편들 또는 돌연변이체들은 포유동물 세포주들, 곤충세포주들, 효모 균주들 및 대장균 (E.coli)과 같은 세균을 포함하는 공지된 발현 시스템들 (expression systems)에 의하여 발현될 수 있다.
포유돌물 세포주들은 이형 (heterologous) 단백질들의 발현을 위한 몇가지 장점들을 가지고 있다. 포유동물 세포주에서 생산된 진핵세포 단백질들은 전사, 번역 및 번역 후 변형과정들이 진핵세포들 사이에서 보존적이기 때문에 기능적일 수 있다. 포유동물 세포주들은 구조-기능 분석방법들을 포함하고 세포 기능에 대한 단백질의 생리학적 효과를 분석하는 다양한 재조합 단백질에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.
곤충 세포주들은 재조합 단백질의 발현을 위한 훌륭한 숙주이다. 이들은 고 진핵세포들로서 포유동물 세포들과 매우 유사한 번역 후 변형과정을 수행하지만 포유동물 세포들 보다 성장이 빠르고 CO2배양기를 요구하지 않기 때문에 주로 단백질 생산을 위해 선택되어져 왔다. 게다가, 곤충 세포들은 대량 발현을 위한 상등액 배양에 손쉽게 적용될 수 있다.
다양한 효모 균주들은 진핵세포 단백질들의 발현 및 분석을 위해 매우 유용하게 사용될 수 있음이 입증되었다. 효모는 유전학적으로 그 특성이 잘 밝혀져 있으며, 많은 포유동물-유사 번역 후 변형과정을 수행하는 것으로 알려져 있다. 이러한 단일-세포성 진핵 생물들은 정제된 배지에서 빠르게 성장하고 포유동물 보다 작업하기가 용이하며 덜 소모적이기 때문에 발효에 적용하기가 용이하다. 그러므로, 효모 발현 시스템은 재조합 진핵세포 단백질들의 대량 생산을 위한 연구에 이상적으로 사용되어 왔다.
대장균에서 재조합 단백질의 발현은 신속하고 고효율을 제공한다. 그러나, 세균성 시스템 (bacterial system)은 세균이 당쇄화 (glysocylated) 단백질을 생산하지 않고 단백질을 적절하게 폴딩 (folding)시키지 못하기 때문에 활성 단백질을 최적으로 생산하지 못한다. 그럼에도 불구하고, 세균성 발현 시스템은 그들의 사용의 편이성으로 인해 주로 선호되고 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
안지오시딘의 서열 외에 재조합 안지오시딘을 사용한 실시예에서는 안지오시딘 펩타이드에서 일부 아미노산을 유사 아미노산으로 치환한서열번호 2의 펩타이드와서열번호 3의 펩타이드를 사용할 수 있다.
<실시예 1> 수용체의 정제
세포로부터,서열번호 1의 펩타이드를 정제하기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다. 세포로는 널리 알려져 시판되는 생쥐의 흑색종 세포나 사람의 폐암세포 등이 바람직하다.
세포의 세포벽을 파괴한 후 얻은 세포추출물을서열번호 1의 펩타이드가 부착된 크로마토그래피 컬럼에 통과시켰다. 컬럼을 통과한 추출물은 버리고, 컬럼에 붙은 수용체 단백질을 분리하였다. 보다 상세한 과정은 하기와 같다.
생쥐 흑색종 세포인 B16-F10이나 사람 폐암세포인 A549가 세포배양 플레이트에서 4.0 ×107만큼 자라나면, 세포를 원심분리용 튜브에 넣고 긁어모아 결합 완충용액 (Binding buffer, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5% (Non-Precedential)*-40 detergent, 1mM CaCl2, 1mM MgCl2, 100 uM leupetin, 1 mM phenylmethyl sulfonyl fluoride [PMSF], 10 ㎍/㎖ aprotinin) 5 ㎖를 넣어 잘 섞어준 뒤 4℃에서 4,000 ×g로 20분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하였다.
컬럼을 제조하기 위하여, 세파로오스 (Sepharose)를 CN으로 활성화하고, HEPES (pH 7.35) 완충용액으로 평형을 맞춘 다음서열번호 1의 펩타이드 4 ㎎을 활성화한 세파로오스 입자와 혼합하였다. 이로부터 얻은 총 부피 2배 분량의 결합완충용액을 첨가하여 잘 섞은 후 5 ㎖의 컬럼에 상기 내용물을 채웠다. 50 ㎖의 결합 완충용액을 컬럼에 통과시켜 컬럼을 세척한 후 세포 추출물을 통과시켜서열번호 1의 펩티드와 반응하는 수용체 단백질을 컬럼에 결합시켰다. 이를 통하여 반응하지 않은 수용체는 컬럼을 통과하여 제거하였다. 용출 완충용액 (elution buffer, 0.10 M Tris-HCl, pH 10.2, 0.05% (Non-Precedential)*-40 detergent, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 100 uM leupetin, 1 mM PMSF, 10 ㎍/㎖ aprotinin)을 컬럼에 통과시켜서열번호 1의 펩티드와 반응한 수용체 단백질을 컬럼으로부터 분리하는데, Tris를 중화할 1 N HCl 200 ㎕가 든 튜브에 각각 10 ㎖의 컬럼 추출물을 받은 다음, 음이온 교환수지 컬럼 완충용액 (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5 mM octylglucoside)으로 평형화한 음이온 교환수지 칼럼 (Mono Q, Pharmacia)에 통과시켰다. 음이온 교환수지 컬럼에 부착된 단백질은 NaCl 용액을 1 M 단위로 변화시키며 20 ㎖씩 첨가한 후, 260 ~ 280 nm 범위에서 흡광도를 측정하여 분리하였다. 그 결과, 0.3 M 농도의 NaCl을 사용하였을 때 단백질이 분리되기 시작하였으며 균일하게 260 nm에서 단독적인 높은 흡광도를 나타내는 물질을 분리하였다. 260 ~ 280 nm에서 흡광하는 칼럼 추출물을 선별하여 분리한 용액과 컬럼에 부착되지 않아 통과한 용액을 분획별로 각각 농축하여, 8% SDS PAGE에 전기영동하고 코마씨 블루로 염색한 결과 (도 4, 레인 1,2), 분리된 단백질은 비환원 조건의 겔에서는 50 kD의 밴드를 나타내었고, 5 % 베타-머캅토에탄올 (beta-mercaptoethanol)을 사용한 환원 조건의 겔에서는도 4에서와 같이 두 개로 분리된 50 kD과 60 kD의 밴드로 나뉘어 전개되었다.
1 ×107의 세포에서 100 ㎍의 단백질이 추출되는 것으로 나타났다.서열번호 1의 펩타이드와 반응하는 수용체 단백질은125I-요오드로 방사능 표지를 하여 (Karczewski,et al.,J. Biol. Chem.,264:21322~21326, 1989) 오토래디오그래프 (autoradiograph)를 통해 하기와 같이 반응의 특이성 (specificity)을 검증하였다. 요오드 비드 한개 당 옥틸글루코사이드 (octylglucoside) 100 ㎕에 녹인 정제된 단백질 12 ㎍을 5분 동안 반응시켰다. 상기 반응용액을 옥틸글루코사이드 완충용액 (Tuszynski,et al.,Anal. Biochem.,106:118~122, 1980)으로 평형화한 세파덱스 (Sephadex) G-25 컬럼에 통과하여 반응하지 않은 요오드는 제거하였다. 분리한 단백질의 방사능은 104 cpm/㎍이었으며, 방사능 표지를 한 단백질을 환원된 SDS PAGE 실시 후 오토래디오그래피를 실시하여 60 kD 위치의 밴드를 확인하였다 (도 4, 레인 3, 4).
<실시예 2> 서열번호 1의 펩타이드와 반응하는 수용체 단백질의 cDNA 클로닝과 그 서열분석
항체를 제조하는 방법, DNA 탐침의 제조 및 DNA 라이브러리의 제조, 항체나 핵산의 혼성 등을 이용한 스크린 방법, 클로닝의 방법 등은 하기의 문헌을 참고하였다: DNA CLONING; Volume I, D. M. Glover ed. 1985, NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION; B.D. Hames and S.J. Higgins eds. 1985, OLIGONUCLEOTIDESYNTHESIS; M. J. Gate ed. 1984, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 1982, T. Maniatis, E. F. Frisch, and J. Sambrook. 본 발명의 수용체에 대한 유전자의 클로닝과 DNA 염기서열 분석을 위해 상기의 문헌에 제시된 방법을 사용하였다.
사람 폐암세포인 A549로부터 분리한 다클론성 항혈청 (polyclonal antisera)을 단백질 분해효소 암 세포 (protease cancer cell, PC3-NI) 라이브러리 (MCP-Hahnemann University의 Drs. Mark Stearn과 Min Wang 등으로부터 제공받음)로부터 유래한 λ Uni-ZAP (Stratagene, La Jolla CA)를 선별하는 데 사용하였다. 1 : 1000으로 희석한 항-수용체 항혈청 (anti-receptor antiserum)을 포함한 페이지와 박테리아를 이용해 PicoBlue Immunostaining kit (Strategene, La Jolla, CA)로 선별한 200,000개의 플라크 중 항체에 대한 양성반응을 보인 네 개의 클론을 분리하여 이들을 클로닝하였다. 상기 클론들을 ExAssist Interference-Resistant Heplper Phage protocol (Stratagene, La Jolla, CA)의 지시에 따라 E.coliXL-I Blue에 형질전환하여 표적물질을 포함한 플라스미드를 얻을 수 있었다. Wizard plus miniprep (Promega, Madison, WI)를 이용하여 플라스미드를 보편적인 시발체 (Universal primer)인 T7/T3를 이용하여 디데옥시사슬 종결 방법 (dideoxychain termination method with Sequence version 2.0, U. S. Biochemical Corp.)으로 서열을 분석하였다. 서열분석 결과,도 1과도 2의 서열을 확인하였으며 두 수용체에 대한 DNA 염기서열을 비교, 분석하여도 3에 나타내었다.
<실시예 3> 재조합 안지오시딘의 형질발현
PBK-CMB 프로모터를 가진 XL 1-blue 박테리아에 서브클로닝된 수용체 cDNA의 전체구조는 IPTG (isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside)를 이용하여 형질발현을 유도하였다. 세포벽을 파괴하여 얻은 세포 추출물에 세균 단백질 추출 시약 (B-Per bacterial protein extraction reagent, Pierce Chemical Co Rockfort, III)을 처리하여 단백질을 분리하였다.
다른 박테리아나 베큘로바이러스 (baculovirus), 포유동물 세포 (mammalian cell, e.g. COS cell) 등과 같은 형질발현 시스템을 이용해서도 재조합 수용제를 형질발현할 수 있다. 박테리아류는 당쇄화 단백질 (glycosylate protein)이나 적당한 접힙 단백질 (folding protein)이 존재하지 않으므로 목적하는 단백질을 충분히 활성화할 능력이 부족하지만, 베큘로바이러스 형질발현 시스템은 더 많은 단백질을 생산할 뿐 아니라 번역 (translation) 후 당쇄화 (glycosylation), 접힘 (folding), 인산화 (phosphorylation), 분비 (secretion) 등과 같은 다양한 변형 (modification) 과정을 수행할 수 있기 때문에 본 발명의 목적에 더욱 유리하다. 수용체의 cDNA를 베큘로바이러스 전이 벡터 (Baculovirus transfer vector, MaxBac 2.0 kit + pBlueBacHis2Xpress kit, Invitrogen, Carlsland, CA)에 삽입하여 세번 정도 정제한 후 무혈청 배지에 배양된 Sf11 세포에 형질감염 (transfection)하여 얻은 수용체 단백질을 웨스턴 블럿 (Western blot) 등의 방법으로 정량할 수 있다.
pcDNA3.1/His vector (Invitrogen, Carlsland, CA)를 사용한 COS 세포 형질발현 시스템을 이용하여 수용체를 발현할 수 있다. 이는 수용체의 cDNA를 COS 세포에 형질감염하여 형질발현을 유도하도록 한 형질발현 시스템으로 CMV 프로모터구조를 사용해 단백질을 얻을 수 있으며, 리포펙틴 (lipofectin) 등의 물질을 사용하면 COS 세포에 형질감염하기 쉬우므로 사용하기 쉬운 장점이 있다.
<실시예 4> His로 표지된 재조합 안지오시딘의 형질발현과 그 산물의 정제
발현 시스템 (Express protein expression system, Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 아미노기 부분에 6개의 히스티딘 아미노산을 연결한 재조합 수용체의 DNA 컨스트럭트를 제조하였다. His-표지 벡터 (His-tag vector)인 pTrcHISA에 클로닝할 수 있도록 제한효소 인식부위를 맞추기 위해,실시에 3에서와 같이 PBK-CMV vector에 클로닝 된 cDNA를서열번호 12와서열번호 13의 시발체와 rTth DNA 중합효소 (polymerase), XL (Perkin Elmer, Foster City, CA)을 사용해 PCR을 수행하였다. 이로부터 얻은 1.1 kb 길이의 생성물은 5' 말단에는 제한효소 BglII의 인식부위를, 3' 말단에는 제한효소 EcoR1의 인식부위를 포함하고 있다. 상기 생성물을 EcoRI으로 처리된 pTrcHISA 벡터에 T4 DNA 라이게이즈 (ligase)를 이용하여 클로닝하였다. 클로닝한 유전자 컨스트럭트는 상기 발현 시스템 (Express protein expression system, Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 형질발현하였다.
<실시예 5> 재조합 안지오시딘과 TSR-1의 결합
수용체의 cDNA를 포함한 벡터와 아무것도 포함하지 않은 벡터, 그리고 His-표지 포함한 수용체의 cDNA를 포함한 벡터와 그의 아무것도 포함하지 않은 벡터 등이 형질전환된 박테리아에서 얻은 세포 추출물 DNA를 환원 조건과 비환원 조건에서각각 SDS PAGE로 분석하였다. 전개된 겔을 니트로셀룰로오스 막에 전기블럿팅 (electroblot)을 한 뒤 1% BSA를 이용하여 1시간 동안 상온에서 블록킹 (blocking)하여도 5와 같은 결과를 얻었다.
<실험예 1> 웨스턴 블럿 분석
블럿팅용 막을 TBS-tween (Tris-buffered saline, 0.05% TWEEN 20TM)에 1 : 20,000으로 용해된 수용체 항체 혈청 (receptor antibody serum) 용액에 두 시간 동안 반응시킨 뒤 TBS-tween으로 세촉하였다. 상기 반응한 막을 1 : 15,000으로 희석한 양고추냉이 퍼옥시다제-결합 항 토끼-IgG (horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG)에 1시간 동안 반응시킨 후 이를 다시 세척하고 ECL (Enhanced Chemiluminescence, Amersham, Arlinton Heights, IL)로 검출하였다 (도 5).
<실험예 2> 리간드 블럿 분석 (Ligand blot)
TSP-1과 TSR-1 (서열번호 6)의 펩타이드는 Pierce protein biotinylation protocol (EZ-link Sulfo-NHS-LC-Biotin, Pierce Chemical Co Rockfort, III)에 따라 바이오틴화 했으며, 투석하여 반응하지 않은 바이오틴을 제거하였다.
각각 상온에서 한 시간동안 바이오틴화한 TSP-1 (5 ㎍/㎖)과 TSR-1 (서열번호 6)의 펩타이드 (5 ㎍/㎖)를 TBS-tween 용액으로 세척하고, 1 : 2,000으로 희석한 양고추냉이 퍼옥시다제 아비딘 (horseradish peroxidase avidin)으로 1시간 동안 반응시킨 뒤 ECL로 검출하였다 (도 6).
<실시예 6> 변성되지 않고, TSP-1에 반응이 된 안지오시딘의 정성분석
변성되지 않은 (실시예 5의 리간든 블럿 방법에서, 수용체는 SDS에 의해 변성되었다.) TSP-1과 반응한 재조합 수용체는 친화 센서 시스템 (Affinity Sensor System, Cambridge, UK)를 이용하여 정성분석하였다. 상기 정성분석은 리간드나 수용체가 공유결합으로 결합된 큐벳 (cuvette)을 사용하는 광학 결합 방법 (optical binding method)을 이용하였다. 상기 방법은 아주 민감할 뿐만 아니라 리간드와 수용체가 반응하는 데 있어 결합상수와 분리상수를 모두 측정할 수 있는 장점이 있다. 수용체 한 분자가 TSP-1 한 분자에 결합하는 것을 하기 수학식 1 내지 4에 따라 분리상수 (KD)를 계산한다.
평형상태에서 kass[R][TSP-1] = kdiss[R-TSP-1]
이때, kass는 결합반응에서, 2차 속도결정상수 (second order rate constant)이고, kdiss는 분리반응에서 1차 속도결정상수이다.
KD= [R][TSP-1]/[R-TSP-1] = kdiss/kass
[R-TSP-1]t= [R-TSP-1]eq[1-esp(-kont)]
이때, arc 초로 계산하는 기기 반응식은 수용체-TSP-1 복합체 R-TSP-1에 비례한다.
kon= kass[L] + kdiss
이때, kon은 수용체 TSP-1 반응을 위한 위성-1차 반응 상수이다.
TSP-1 1 ㎍을 큐벳에 담아 큐벳 표면의 카르복시기에 TSP-1의 아미노기가 반응할 수 있도록 하였다. 반응하지 않은 물질은 에탄올 아민 (ethanol amine)과 알부민 (albumin)을 이용하여 차단하였다. HEPES 완충용액 (pH 7.00)에서 189 nM의 농도를 가진 수용체 단백질을 안정하게 반응시키는 데는 7분 이상의 시간이 소요되었는데, 완충용액에서는 부분적으로 분리반응이 일어나는가 하면 낮은 pH에서는 분리반응이 우세하게 일어나기도 하였다. 44 nm에서의 분리상수를도 7에 도시하였는데, 결합상수와 수용체 단백질의 농도 사이에는 1차 반응과 비슷한 관계가 성립하였다. 기기의 반응과 감지할 때까지 걸리는 시간과의 관계는도 8에 도시하였는데, 기기의 반응은 수용체와 TSP-1이 복합체를 이룬 농도와 일정한 비례관계를 성립하며, 이러한 비례관계는도 7을 작성할 때 참고하였다. 기기의 반응과 수용체 TSP-1 복합체 농도와의 비를 도시하였다. 완충용액에 Tween 20을 첨가하는 것은 특이적 결합 (specific binding)의 결합상수에 영향을 미치지 않았으며, 분리한 수용체 단백질인 안지오시딘이 용해되어 있는 용액에 TSP-1의 첫 번째 반복 도메인인 TSR-1 (서열번호 6)의 펩타이드가 10배의 몰비로 과량 존재하면 완충능력은 47% 감소하였고, 불특정형의 TSR-1 (서열번호 6)의 펩타이드가 10배의 몰비로 과량 존재하면 완충능력은 88% 감소하여 TSP-1과 안지오시딘이 특이적으로 결합하는 데 있어서열번호 1의 펩타이드를 가진 부류와 어느 정도 경쟁반응을 하는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과를 미루어 볼 때, TSP-1과 반응하는 단백질이 올바르게 클로닝되었음을 알 수 있다.
<실시예 7> 고정화 (immobilized)된 TSP-1과 반응하는 안지오시딘의 정성분석
TSP-1을 큐벳에 고정화한 것과 HEPES에 수용체만 용해시킨 용액 또는 펩타이드와 수용체를 (펩타이드 : 수용체 몰 비는 1,000 : 1 또는 100 : 1)함께 용해시킨 용액 중 한가지 용액을 첨가한 것을 제외하면,실시예 6과 동일한 방법을 사용하였다.
수용체의 반응부분으로부터 분리한 두가지 펩타이드인서열번호 8및서열번호 9의 펩타이드는 TSP-1 단백질의 일부구조인서열번호 1의 펩타이드와 반응을 하는 펩타이드이다. 이를 음성 대조군인서열번호 10의 펩타이드와 함께 수용체와반응시켜 수용체만을 갖고 있는 대조군과 함께 큐벳에 각각 반응시켰다.
도 9에 나타난 바와 같이,서열번호 8의 펩타이드는 TSP와 반응함으로써 수용체가 고정화된 TSP-1과 반응하는 것을 경쟁적으로 방해하였다. 상기 반응은 펩타이드와 수용체의 몰 비를 변화하여 실험한 결과 농도에 의존하여 반응하는 것으로 나타났다.
도 10에 나타난 바와 같이, 수용체로부터 유래한 펩타이드는 큐벳에 고정화된 TSP-1과 직접 반응하였다. 양성 대조군과 음성 대조군이서열번호 10의 펩타이드 등을 수용체와 반응시킨 것과는 대조적으로 수용체의 반응부분으로부터 분리한서열번호 8및서열번호 9의 펩타이드는 고정화된 TSP-1과 직접 반응하였다.
도 9및도 10을 통해, 본 발명의 수용체 단백질 구조의 일부인서열번호 8의 펩타이드가 TSP-1 단백질과 반응하는 것을 알 수 있다.
<실시예 8> 고정화된 TSP-1, TSR-1 등과 반응하는 안지오시딘의 정성분석
TSP-1과, TSR-1 (서열번호 6)의 펩타이드를 사용한 것을 제외하면, 모든 방법은실시예 6과 동일하다. TSR-1 (서열번호 6)의 시스테인을 아세틸화한 형태의 펩타이드는 실험 과정동안 더욱 안정하였다.
도 11에 나타난 바와 같이 TSP-1 과 TSR-1 (서열번호 6)의 펩타이드는 모두 수용체와 반응하는 것으로 나타났으며, 이것을 통해 TSP-1의 펩타이드 등서열번호 1의 펩타이드와 같은 부분이 수용체와 반응한다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 9> 세포 표면에 있는 안지오시딘의 표지
락토퍼옥시다아제 (Lactoperoxidase)를 이용하여 A549 세포의 표면을125I-요오드로 표지하였다 (Tuszynski,et al.,Anal. Biochem., 106:118~122, 1980). 세포가 한 층으로 배양된 75 mm 세포배양용 플라스크를 DMEM 배지 10 ㎖로 씻어준 다음, 여기에 락토퍼옥시다아제 0.2 unit/㎖을 포함한 DMEM 배지 5 ㎖과125I-요오드 500 uCi를 첨가해 주었다. 30% H2O2용액 5 ㎕를 다섯 번에 나누어 1분 간격으로 가볍게 흔들어 혼합한 후 1 mM NaN35 ㎕를 첨가하여 반응을 멈추었다. DMEM으로 다시 세번 세척한 후서열번호 1의 펩타이드와 결합할 단백질의 정제를 위해 세포를 모아 준다. SDS-PAGE와 오토래디오그래프로 확인한 결과, 요오드로 표지된 분자량 50,000의 폴리펩타이드를 확인할 수 있었다 (도 4, 레인 5).
수용체와 TSP-1은 빈응시간 60분 동안은 시간에 의존하여 증가하였으나, 60분 후에는 시간과의 상관성이 없었다. 1 mM CaCl2와 1 mM MgCl2의 조건에서 최적의 반응을 보였으며, 1 mM의 EDTA를 첨가하자 작지만 상당한 반응을 나타내었다. 따라서, 수용체와 TSP-1의 반응은 시간 의존적이며 수용체가 세포의 표면에서 발현된다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 10> 안지오시딘의 면역화학분석 (immunochemistry)
도 12는 유방암 세포에 있는 수용체의 위치를 추적한 사진이다. 암세포는그림 중앙에 큰 세로줄로 자라 있으며, 그림 오른쪽에 두 개의 암세포 덩어리가 존재하고 있다. 오른쪽과 왼쪽에 있는 더 작은 크기의 세포 덩어리는 염증성 (inflammatory) 세포이며, 크고 하얀 세포는 지방세포이다. 정상적인 유방세포는 그림의 왼쪽 아래에 두어 비교하였다.
유방암 세포의 조직과 정상 유방조직을 각각 95% 에탄올 (ethanol)에 10분 동안 고정한 후 다시 파라핀으로 고정하였다. 고정된 것을 5 ㎛ 두께로 차례로 잘라 유리 슬라이드에 끼워 넣었다. 슬라이드에서 파라핀을 제거하고 자일렌-에탄올 (graded xylene-ethanol) 용액에서 차례로 반응시켜 재탈수 (rehydration)하였다. 3% H2O2에 5분 동안 반응시켜 내생성 퍼옥시다아제 (endogenous peroxidase)의 활성을 억제하였으며, 증류수로 다시 헹구어 주었다. 슬라이드를 PBS로 세척한 후 PBS-BSA (0.1% BSA를 포함한 PBS)에 용해시킨 1차 IgG 용액 (5 ~ 20 ㎍/㎖)과 30분 동안 반응시켰다. PBS-BSA로 세척한 후 슬라이드에 1 : 250으로 희석한 2차 바이오틴화 항체를 첨가하여 30분 동안 반응시킨 뒤, 헹구어 내고 Vectorstatin ABC Immunoperoxidase staining kit (Vector Labobatories, Burlingame, CA)를 이용하여 현상하였다. 슬라이드는 다시 헤마톡실린 (hematoxylin)으로 바꾸어 염색한 뒤 커버글래스를 덮고 현미경으로 관찰하였다.
염색된 수용체는 암세포의 가장자리에 위치한 것으로 나타났는데, 왼쪽 아래의 정상세포 그림에서와 같이 정상세포에서는 수용체가 나타나지 않았다. 이것으로 수용체는 세포막에 결합하고 있음을 확인하였고 암세포에 더욱 많이 농축되어있음을 확인할 수 있었다.
<실시예 11> 일시적 형질감염 (Transient transfection)과 세포 부착 분석 (adhesion assay)
소 대동맥 내피 세포 (Bovine Aorta Endothelial Cell, BAEC)와 사람 유방암세포인 MDA-MB-231 세포에 수용체 DNA를 형질감염하였다 (Wizard Plus kit, Promega, WI). 이때, 형질감염 시약 (Super fect transfection reagent, Qiagen, CA)을 사용하여 DNA를 세포 내에 주입할 수 있었다.
6개의 웰로 구성된 세포배양 플레이트에 세포가 한 층으로 자라도록 배양한 뒤 수용체 DNA를 세포의 80% 이상에 형질감염시켰다. DNA 2.5 ㎍ 당 12 ㎕의 시약을 사용하여 농도가 최소 0.1 ㎍/㎕ 이상이 되게 하였다. 시약과 DNA의 결합은 각각 혈청이 없고 항생제 (antibiotics)가 없는 조건에서 실시하였다. 세포는 그 이후 37℃에서 3 ~ 4 시간 안 배양하였다. 형질감염 48시간 후에 배지를 바꾸어 배양한 뒤 세포를 회수하였다. 부착 분석 (Adhesion assay)를 위해, 96개의 웰로 구성된 세포배양용 플레이트에 두 줄씩 각각 TSP-1 (50 ㎍/㎖), 피브로넥틴 (fibronectin, 40 ㎍/㎖), 1% BSA를 채운 뒤 밤새 건조시켜서 다른 기타 반응이 일어나지 않도록 BSA로 차단하였다. 2 ×105의 세포를 가진 100 ㎕ 세포 배양액을 각 웰에 채우고 37℃에서 20 ~ 60분 동안 반응시켰다. 반응하지 않은 세포를 제거한 후 HEPES 완충용액 (pH 7.0)으로 한 번 헹구어 주었다. 반응한 세포는 2.5% 글루타르알데히드 (glutaraldehyde)로 10분 동안 고정하고, 0.2% 지엠사 (Giemsa)로 염색하였다. 그리고, 1 mm2에 있는 세포의 수를 세어주었다. BSA에 부착된 세포를 음성 대조군으로, 피브로넥틴에 부착된 세포를 양성 대조군으로 하여 그 결과를도 13에 도시하였다.
<실시예 12> 일시적 형질감염과 세포의 부착 분석
서열번호 8및서열번호 11의 펩타이드를 사용한 것을 제외하고실시예 11과 동일한 방법을 사용하였다. 이때, TSP-1과 피브로넥틴을 대조군으로 함께 사용하였다. 음성 대조군으로 사용된서열번호 11의 펩타이드와서열번호 10의 펩타이드도 각각 고정화하였다.
도 14에서와 같이, 수용체의 펩타이드는 세포가 플레이트에 부착하도록 만드는데 양성 대조군인 피브로넥틴과 TSP-1에 대해서도 동일한 정도의 효과를 나타내었다. 이러한 사실은, TSP-1과 그의 수용체가 또 다른 제 3의 단백질과 상호작용한다는 이론을 뒷받침하는 것이며 수용체가 분비된 후 제 3의 다른 단백질에 의해 세포막에 다시 부착한다는 이론과 부합하는 것이다.
<실시예 13> 일시적 형질감염과 세포의 부착 분석
수용체 단백질 전체가 플레이트에 고정화된 것과 TSP-1 cDNA나 벡터 대조군 중 하나가 세포에 형질감염되어 각 플레이트에 사용된 것을 제외하고,실시예 11과동일한 방법을 사용하였다. TSP-1을 소량 생산하는 세포에 TSP-1 cDNA를 형질감염하여 그 단백질을 다량 생산하게 하였다.도 15에서와 같이, TSP-1 cDNA를 형질감염한 세포가 수용체 단백질과 결합하는 비율이 음성 대조군에 비해 플레이트에 좀 더 잘 반응하였다 (약 2.5배, p<0.001). 앞의 예와 같이 피브로넥틴과 BSA는 각각 양성 대조군과 음성 대조군으로 사용하였고 이로부터 수용체가 트롬보스폰딘 (thrombopondin)과 반응하는 것을 추정할 수 있다. 이러한 특별한 상호작용은 항-TSP-1 (anti-TSP-1)이나서열번호 1의 펩타이드 또는 대조군 IgG를 실험군에 처리해 확인할 수 있다.도 16은 TSP-1에 대한 항체와서열번호 1의 펩타이드에 대한 항체가 TSP-1을 발현하는 세포가 플레이트에 부착하는 것을 방해함을 나타낸다.
더우기, 용액상의 반응하지 않은 수용체를 부착 시스템에 첨가하면 세포가 플레이트에 부착하는 것을 방해하는 것을 관찰할 수 있다.도 17은 수용체 자체가 형질감염되지 않은 원래부터 TSP-1을 발현하는 세포가 플레이트에 부착된 수용체에 붙는 것을 경쟁적으로 방해한다는 것을 나타나낸 것으로서 부착을 유발하는 상호작용의 일례로서 추측할 수 있게 한다.
<실시예 14> TSP-1의 수용체인 안지오시딘에 대한 항체의 제조
자연적이든 인공적으로 합성한 것이든서열번호 1의 펩타이드에 대한 수용체 단백질에 대한 항체는 다클론성 (polyclonal) 또는 단클론성 (monoclonal)으로 제조될 수 있다.
다클론성 항체를 얻기 위해서는, 정제된 수용체 단백질을 선택한 포유동물 (예를 들어 생쥐, 토끼, 염소, 말 등)에서 면역반응이 일어나도록 한 다음 그 동물에서 혈액을 추출하여 혈청만을 추출한 후 항체를 수거, 정제하면 된다. 수용체 단백질에 대한 항체 이외에도 다른 복잡한 조성물이 함께 포함된 상기 항체는 수용체가 부착된 컬럼에 통과시켜 정제할 수 있으며, 상기 컬럼을 결합 완충용액으로 세척한 뒤 컬럼에서 항체를 분리하였다.
단클론성 항체를 얻기 위해서는 여러 가지 방법을 사용할 수 있지만, 하이브리도마 (Hybridoma)를 이용하여 하기와 같이 만들 수 있다 (M. Schreiner,et al., Hybridoma Techniques, 1980, Hammerling,et al., Monoclonal antibodies and T-cell hybridomas, 1981, Kennett,et al., Monoclonal Antibodies, 1980). B 림프구 (B lymphoicyte)에 발암성 (oncogenic) DNA를 직접 형질감염시키거나 엡스테인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus) 등을 이용해 형질감염시킴으로써 항체를 생성하는 세포주를 제조할 수 있다. 상기 세포주에 항원인 TSP-1 수용체 단백질을 사용하여 수용체 단백질의 서로 다른 부분을 각각 인식할 수 있는 단클론성 항체의 패널 (pannel)을 얻을 수 있다. 수용체 단백질의 반응부위를 인식하는 항체는 항체와 TSP-1 사이의 경쟁반응을 유도하는 분석을 이용해 가려낼 수 있다. 그러한 항체들은 TSP-1 펩타이드 결합과 관계된 다른 생리적인 작용에 별다른 영향을 미치지 않는 한 TSP-1이 그의 수용체와 반응하는 것 막을 수 있는 일종의 치료제로서의 가능성을 갖고 있다.
서열번호 1의 펩타이드를 3 ~ 4주 동안 한번에 50 ㎍씩 토끼에 접종하여 다클론성 항체를 얻었다. 최초 접종은 완전 프르운드 면역 보강제 (completeFneund's adjuvant)로 실시하였으며, 그 이후의 접종은 불완전 프르운드 면역 보강제 (incomplete Fneund's adjuvant)로 실시하였다. 항체를 적정한 후 ELISA로 특이성을 조사하였다. ELISA는 하기와 같이 실시하였다. 미세역가 플레이트 (Microtitor plate)를서열번호 1의 펩타이드 2 ㎍, 동일한 양의 피브로넥틴, BSA 등으로 코팅한 후, 1% BSA로 1시간 동안 차단하였다. 10 mM 인산염 완충용액 (phosphate buffer, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20 [PBS-T])에 첫 번째 나온 항체를 다양한 농도로 희석한 용액 50 ㎕씩을 각 웰에 넣어 1시간 동안 반응시켰다. PBS-T로 세번 세척한 웰에 토끼 항-염소 IgG (rabbit anti-goat IgG)와 알칼린 인산화효소 (alkaline phosphatase)를 결합시킨 후 PBS-T 용액에 1 : 800으로 희석한 용액 50 ㎕를 각 웰에 넣어 1시간 동안 반응시켰다. PBS-T로 세번, TWEEN-20TM이 없는 PBS-T로 세번, 이렇게 여섯번 헹구어 낸 웰에 알칼린 인산화효소 기질 용액 (1 ㎎/㎖ p-nitrophenylphosphate in 0.01 M glycine, pH 10.4, 1 mM ZnCl2, 1mM MgCl2) 50 ㎖을 첨가하였다. 30분 후 1 N NaOH 5 ㎕씩을 넣어 반응을 멈춘 뒤 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 하기의표 1과 같이 ELISA로 분석한 결과, 얻은 항체는 단클론성임이 밝혀졌다.
안지오시딘 항체의 단특이성 (monospecificity, 405 nm)
BSA 피브로넥틴 서열번호 1의 펩타이드에 대한 수용체
면역반응 전 혈청 0.123+/- 0.005 0.135+/- 0.006 0.130+/-0.007
서열번호 1의 펩타이드와 반응한 수용체 0.134+/- 0.007 0.176+/- 0.004 0.665+/- 0.003
<실시예 15> 항체에 의한 세포 부착 억제
하기의 실험은서열번호 1의 펩타이드에 대한 항체가 암세포와 TSP-1이 반응하는 것을 억제하는지의 여부를 확인하기 위해 실시하였다.
인간 폐암세포인 A549는 트롬보스폰딘 수용체 단백질을 만들어내는 세포주이다. 검출성 미세역가 (Detachable microtiter, Immulon 4 Removawell)의 각 웰에 40 ㎍/㎖ TSP-1, 피브로넥틴, 라민 용액 (20 mM bis-tris-propane 완충용액, pH 6.5에 용해)을 각각 50 ㎕씩 넣어 코팅되도록 4℃에서 밤새 반응시킨 후 1% BSA 200 ㎕로 각 웰을 차단하였다. A549세포와 각각 앞서 제조한서열번호 1의 펩타이드 수용체에 대한 항체 및 면역반응이 일어나지 않은 항혈청에 대한 IgG 200 ㎍/㎖를 30분 동안 반응시키고 원심분리하였다. 반응하지 않은 항체를 제거하기 위하여 상층액은 버리고 DMEM 배지를 첨가하여 37℃에서 60분 동안 반응시켰다. 미세역가 웰 표면에 부착한 세포의 수를 세어표 2와 같이 비-면역 IgG (non-immune IgG)가 처리된 세포가 부착되어 있는 비율로 나타내었다.표 2에 나타낸 바와 같이,서열번호 1의 펩타이드에 대한 수용체의 항체는 A549 세포가 TSP-1로 코팅된 표면에 붙는 것을 방해하는 반면, 피브로넥틴 또는 라민에 대해서는 별 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 상기 항체는 TSP-1이 세포 배양용 플레이트를 구성하는 조직 배양용 플라스틱 (tissue culture plastic)에 부착하는 것도 방해하였다.
항체에 의한 세포 부착력의 감소
단백질 기질 %, 부착된 세포
트롬보스폰딘 10.5 %
피브로넥틴 101 %
라민 103 %
<실시예 16> 안지오시딘이 신혈관조성에 미치는 영향
콜라겐을 이용한 분석은 실형관조성 (angiogenesis)을 연구하는 좋은 모델로 알려져 있으며, 하기의 문헌을 참고하였다: Qian et al., Thrombospondin-1 modulates angiogenesis in vitro by up-regulation of matrix metalloproteinase-9 in endothelial cells.Exp. Cell Res., 235:403~412, 1997.
소 대동맥 내피 세포 BAEC를 콜라겐 기질에 도말한 후 콜라겐을 그 위에 도말하였다. 실험군의 경우 맨 위에는 안지오시딘 (37 ㎍/㎖)을 첨가하고, 대조군 플레이트에는 HEPES, pH 7.0 완충용액을 첨가하였다. 24시간 후 상 대조 광학현미경 (phase contrast photomocrograph, 200 ×)을 이용하여 관찰하였다.도 18에서와 같이, 대조군 플레이트에는 BAEC가 재정렬하여 모세혈관과 같은 형태로 모양을 형성한 반면, 안지오시딘을 처리한 플레이트에는 모세혈관을 형성하지 않을 뿐 아니라 세포의 활성이 낮았다.
<실시예 17> 안지오시딘이 모세혈관의 안정화에 미치는 영향
처음에 세포에 안지오시딘을 처리하지 않은 것을 제외하고 앞의실시예 16과 동일한 실험방법을 사용하였다. 배양 24시간 후 모세혈관은 모든 세포에서 잘 나타났고, 여기에 완충용액과 안지오시딘을 각각 대조군과 실험군에 처리하고 24시간 후 호프만 간섭 광학현미경 (Hoffman interference photomicrograph)을 이용해 관찰한 결과 대조군에서는 아무런 변화가 관찰되지 않았지만, 안지오시딘을 처리한 군에서는 이미 형성된 모세혈관이 파손된 것을 볼 수 있었다 (도 19). 이는, 안지오시딘이 신혈관조성을 방해할 뿐 아니라 이미 진행된 상태를 되돌릴 수 있는 가능성이 있음을 나타내는 것이다.
<실시예 18> 안지오시딘이 BAEC의 모양 형성에 미치는 영향
혈청 없이 1% BSA를 첨가한 배지에 한 층으로 배양한 BAEC에 안지오시딘의 농도를 달리하여 24시간 동안 배양하였다 (대조군 = 0, 0.37 ㎍/㎖, 3.7 ㎍/㎖, 37 ㎍/㎖). 호프만 간섭 현미경 (100 ×)으로 관찰한 결과, 안지오시딘의 농도가 증가할수록 BAEC의 모양은 일그러졌으며, 플레이트로부터 분리되어 뭉치다가 사멸하는 현상을 보였다 (도 20).
<실시예 19> 안지오시딘이 세포 생존율에 미치는 영향
BAEC, 인간 대동맥 내피 세포 (Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC), 섬유아 세포 (fibroblast cell), A549 인간 폐암세포 (A549), MDA-MB231인간 유방암 세포 (MCF7)에 수용체 37 ㎍/㎖이나 완충용액을 넣고 24시간 동안 배양하였다. 대사하는 세포의 양을 측정하기 위하여 ALAMAR BLUETMassay (Biosource International, Camarillo, CA)를 이용하였는데, 상기 분석은 세포주의 성장활성을 측정할 수 있으며 이를 통해 세포생장에 영향을 미치는 화학물질의 독성정도를 알 수 있다. 추적하는 방법으로, 형광/발색 추적장치를 도입하였다. 이는 세포성장에 의해 변화된 세포성장용 배지의 화학물질이 변화함에 따라 형광이나 색깔변화를 일으키는 산화-환원 지시약을 포함하여 세포가 성장하면서 산화상태에서는 무형광으로 유도되고, 푸른 지시약 상태에서 배지의 산화로 인한 환원상태에서는 형광을 띄며 붉은 상태로 유도되는 것을 추적하는 것이다. 그러한 변화된 상태는 형광추적장치 (530 ~ 560 nm excitation, 590 nm emission)나, 흡광측정장치 (570 nm, 600 nm) 등으로 알 수 있다.
BAEC나 HUVEC은 수용체가 존재하는 경우 생존율이 점점 감소해서 TSP이 상기 세포주들이 살아가는 데 있어 꼭 필요한 물질임을 알 수 있었고 (도 21), 내피 세포는 안지오시딘을 처리한 후 70 ~ 80% 정도 생존율이 감소하였다. 섬유아 세포에서는 별다른 변화가 없었으며 A549, MB231, MCF7 등에서도 별다른 반응이 없어, 이들 세포의 생존에는 TSP-1이 필요하지 않음을 추측할 수 있었다.
<실시예 20> 안지오시딘이 BAEC와 BSM의 생존에 미치는 영향
BAEC와 BSM 세포에 안지오시딘의 농도를 달리하여 (0, 0.625, 1.25, 2.5, 5,15, 26, 37 ㎍/㎖) 24시간 동안 배양하였다. 세포 생존율은실시예 19에서와 같이 ALAMAR BLUETMassay를 이용해 측정하였다. 안지오시딘은 그의 양과 BAEC의 생존율에 대해 1차 반응이면서, 단일 상수의 지수적 감소를 보이는 반응을 나타내는 반면 (도 22), 이와는 대조적으로 BSM 세포는 별다른 영향을 받지 않았다.
수용체가 BAEC의 생존에 미치는 영향을 생쥐 루이스 폐암세포의 경우와 비교하여 확인하였다. 그 결과, 안지오시딘은 BAEC의 생존율을 감소시키지만 루이스 폐암세포에 대해서는 별다른 영향을 미치지 않았다. 이와 같은 실험을 HUVEC에 대해 실시한 결과 HUVEC의 생존율 역시 감소하였다 (도 24).
<실시예 21> 안지오시딘이 HUVEC의 생존율에 미치는 영향
세포성장을 촉진하는 FGF (Fibroblast Growth Factor)와 TSP-1을 각각 2 ng/㎖, 20 ㎍/㎖ 농도로 HUVEC에 처리한 결과, 안지오시딘 (37 ㎍/㎖)의 효과를 방해하진 않았다 (도 25). TSP-1이 안지오시딘의 억제 반응을 되돌려 놓을 것이라 예상되었지만 첨가한 양만으로는 그런 반응이 일어나진 않았다.
<실시예 22> 수용체가 매개하는 BAEC의 생존율 변화
HUVEC 대신에 BAEC를 사용한 것을 제외하고,실시예 21과 동일한 방법을 사용하였으며, TSP-1을 각각 20 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖ 농도로 세포에 첨가하였다.도 26에서와 같이, TSP-1은 대조군과 대비하여 안지오시딘의 억제작용을 더욱 촉진하였다.
<실시예 23> 수용체 결합 분석 (Receptor Binding Assay)
도 27은 결합 분석의 개요를 나타낸다. 하기의 실험에서 TSP-1은 기질에 공유결합하며, 바이오틴화된 안지오시딘을 플레이트에 첨가하여 TSP-1에 붙은 바이오틴화된 안지오시딘의 양을 결정하기 위해서 아비딘-퍼옥시다아제 (avidin-peroxidase)를 첨가하였다. 아비딘-퍼옥시다아제는 450 nm의 파장에서 흡광계로 측정할 수 있다.
도 28에서와 같이, 고정화된 TSP-1에 안지오시딘을 결합할 때의 KD값은 9 nM이고, BSA를 음성 대조군으로 사용하였다.
바이오틴화한 안지오시딘과 경쟁반응을 하기 위하여 아무런 처리도 하지 않은 안지오시딘을 첨가하였다.도 29에서와 같이, 바이오틴화한 안지오시딘이 TSP-1과 반응할 때 반응하지 않은 안지오시딘이 경쟁적으로 반응함을 알 수 있다. 이때, 고정화된 BSA를 음성 대조군으로 사용하였다. 바이오틴화한 안지오시딘에 반응하지 않은 안지오시딘의 양을 증가시키면서 첨가하자 결합은 점차 감소하였다.
바이오틴화한 안지오시딘과 반응하는 플레이트 상에 TSP-1과의 경쟁반응을 유도하기 위해 TSP-1 펩타이드인서열번호 1의 펩타이드를 첨가한 결과,서열번호 1의 펩타이드는 TSP-1과 효과적으로 경쟁반응하는 것으로 나타났다 (도 30).서열번호 15의 무정형 펩타이드를 음성 대조군으로 사용하였는데, 아무런 반응이 일어나지 않았다.
<실시예 24> 안지오시딘과 반응하는 펩타이드의 분리
페이지-디스플레이 펩티드 라이브러리 키트 (Phage-displayed peptide library kit, New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 안지오시딘과 반응하는 펩티드들을 선별하였다. 대상 수용체로 코팅된 플레이트 상에서 페이지를 배양한 후 플레이트에 붙어 자라지 않은 페이지는 세척하여 제거하고, 붙어 자란 페이지만을 선별배양하여 각각의 클론에 대한 DNA 염기서열을 분석하였으며, ELISA로 특이성 분석을 수행하였다.
도 31에서와 같이, 다수의 수용체 반응 단백질을 분리해 낼 수 있었다 (서열번호 16, 17, 18, 19및20).
도 31의 각 레인은 염기 서열을 분석한 8개의 클론 중 한 가지를 나타내는데, 각 펩티드 사이의 차이는 무시할 수 있을 정도로 작아 전하 (charge)나 분류 (class)가 동일한 아미노산으로 서로 바꾼 정도의 차이를 나타내었다.
이들 아미노산 서열은 TSP-1으로부터 연속적으로 분리한 서열이 아니기 때문에 TSP-1 접힘 단백질 (folded protein)의 반응 활성부분을 구성하는 구조들로 추측되며, 이외에도 안지오시딘에 부착한 또 다른 단백질의 아미노산 서열일 가능성도 배재할 수 없다.
<실시예 25> 안지오시딘과 TSP-1 펩티드의 경쟁반응
실시예 24의,서열번호 18의 펩티드는도 32와 같이 안지오시딘과 TSP-1의반응을 방해한다.서열번호 1의 펩티드와 아세틸화 반응으로 더욱 안정화된서열번호 6의 펩티드도 같은 작용을 한다.서열번호 6의 거울상 펩티드인서열번호 23의 펩티드도 같은 작용을 하지만, 무정형 펩티드인서열번호 21의 펩티드와서열번호 6의 펩티드에 대하여 d-oriented 펩티드인서열번호 22의 펩티드는 작용을 나타내지 않았다.
<실시예 26> 안지오시딘이 HAEC와 HMVEC-L 세포의 생존에 미치는 영향
실시예 19에 나타난 바와 같이 안지오시딘을 HAEC와 HMVEC-L세포에 처리한 결과, 안지오시딘은 두 세포 모두에 있어 생존율을 떨어뜨렸으며, ALAMAR BLUETMassay 결과를도 33에 나타내었다.
<실시예 27> 안지오시딘과 안지오시딘의 구조 일부가 BAEC에 나타내는 효과
실시예 19에서와 같이, 안지오시딘을 안지오시딘을 임의로 조각내어 만든 구조의 펩티드와 함께 BAEC에 첨가하였다.도 34에 나타난 바와 같이, 안지오시딘과 그의 아미노 말단인 Met1-Lys132 (GST를 아미노기 끝에 연결하여 GST 융합 단백질 형태로 발현시킴)는 생존율을 낮추었다. 안지오시딘의 가운데 구조의 펩티드와 카르복시 말단 펩티드는 생존율에 별 영향을 미치지 않았다. 이때, GST를 음성 대조군으로 사용하였다.
한편, 항분비성 인자 (antisecretory factor)의 활성화부분인 V36-R42 부위는 아무런 영향을 미치지 않았으며, 이를 통해 안지오시딘이 항분비성 인자와는 다른 역할을 하는 것을 알 수 있었다.
<실시예 28> 안지오시딘이 루이스 폐암종의 성장에 미치는 영향
옆구리 종양 (Flank tumor)의 성장은 신혈관조성에 의존하기 때문에 (O`Reilly, M. S. , Angiostatin: A novel angiogenesis Inhibitor that mediates the suppression of metastasis by a Lewis lung carcinoma,Cell,79:315-328, 1994) 이를 실험모델로 사용하였다. 10마리의 생쥐에 1 ×106루이스 폐암 세포 (Lewis lung carcinoma cell)를 투여하고 9일이 지난 후에 암세포가 자라나면 생쥐를 5마리씩 두 그룹으로 나누어 한 그룹에는 HEPES 완충용액 (pH 7.0)을, 다른 한 그룹에는 HEPES 완충용액 (pH 7.0)에 용해된 안지오시딘 50 ㎍을 각각 첫날, 1, 3, 5일째 되는 날 네번 주사하였다 (도 35).
7일째 되는 날, 생쥐를 모두 희생시킨 후 피부를 벗겨내어 암세포 덩어리를 관찰한 결과, 안지오시딘을 처리한 실험군의 종양이 훨씬 작았다. 안지오시딘을 처리한 그룹의 생쥐에서 생겨난 종양은 더 부드럽고 말랑말랑하며 부서지기 쉬운 암세포 덩어리를 보인 반면, 대조군의 생쥐는 단단하고 딱딱하며 건강한 세포로 가득 찬 점차 자라나는 형상의 종양을 보였다. 각 종양을 파라핀으로 고정하여 5 ㎛ 두께의 얇은 층으로 잘라내었다. 각 조각을 DNA를 푸르게 염색하는 헤마톡실린과 단백질을 분홍색으로 염색하는 에오신으로 염색하여도 36과 같이 비교하였다.400 ×일반현미경으로 관찰한 A, B와, 200 ×일반현미경으로 관찰한 C, D를 보면, 안지오시딘을 처리한 실험군에서 확연한 세포괴사 (necrosis)와 세포사멸을 확인할 수 있다.
도 37은 하기 수학식 5로 계산한 종양의 부피를 나타낸 것이다.
길이 ×(너비)2/2
측정은 7일에 걸쳐 시행하였다. 대조군의 종양 크기는 지수적 증가를 보인 반면, 실험군의 종양은 훨씬 둔화된 증가율을 보였다. 그러므로, 안지오시딘이 암세포 성장 및 신혈관조성을 둔화하는 것으로 보인다.실시예 20의 결과와 함께 본 실시예의 결과를 통하여, 안지오시딘이 신혈관조성에 직접적 영향을 미치나 루이스 폐암 세포에는 영향을 미치지 않음을 알 수 있다. 그러므로, 종양의 성장과 종양세포의 생존은 신혈관조성에 의해 크게 영향받음을 알 수 있다. 충분한 혈액공급이 없으면 가스교환이나 영향공급에 있어 지장을 받을 뿐 아니라, 혈관생성에 절대적으로 의존하는 2 mm3보다 부피가 큰 종양의 세포는 생존에 직접적인 영향을 받을 수 밖에 없다.
<실시예 29> 루이스 폐를 가진 생쥐에 대한 안지오시딘의 영향
10마리의 생쥐에게 4번에 걸쳐 루이스 폐암 세포를 1 million 접종하였다. 사흘 후 두 그룹으로 나누어 한 그룹은 HEPES 완충용액만을, 다른 한 그룹은 HEPES 완충용액에 용해된 50 ㎍의 안지오시딘을 첫날, 1, 3, 5, 7, 9일째에 투여하였다.도 38에 나타난 바와 같이, 대조군은 16일, 안지오시딘을 투여한 실험군은 19일 동안 생존하였다.
폐암세포의 모델은 폐 자체에 원래 많은 혈관이 분포하여 더 이상의 혈관을 형성할 가능성이 적기 때문에 신혈관조성의 모델로는 적합하지 않다. 그러나, 이번 실시예에서는 안지오시딘이 암세포에 효과적으로 작용하여 수명연장에 도움이 됨을 확인할 수 있었다.
<실시예 30> 사람 유방암 조직에서 안지오시딘의 위치
면역퍼옥시다아제 염색 (Immunoperoxidase stain)을 하기 위해, 대조군인 정상 유방세포와 실험군인 유방암 세포를 각각 TSP-1과 안지오시딘에 대한 다클론성 항체로 표지하였다. 여기에 이에 대한 항체를 첨가하여 2차 항체가 결합하게 한 후 이에 대한 기질 DAB과 혼합하여 발색반응을 유도하였다.
모든 실험군의 세포는 TSP-1과 안지오시딘에 대해 양성반응을 보였지만, 음성 대조군인 양성 병소 (benign lesion)와 정상 유방세포에서는 음성반응을 보였다. 그러나, 증식 (Hyperplasia)이 있는 섬유낭종성 가슴 (fibrocystic breast)에서는 양성반응을 보인다. 암세포의 시료에서 종양과 연관된 기질성 콜라겐 (stromal collagen)에 TSP-1이 진하게 염색되었는데, 안지오시딘이 혈관상피세포에서 발현하는 정도가 증가하는 것으로 보아 종양의 형질전환 (transformation)과 상관성이 있다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 31> 인간 머리와 목에 난 종양에서 안지오시딘의 역할
인간 머리와 목에 난 종양의 시료를 헤마톡실린, 에오신, 안지오시딘 항체 등으로 염색하여 컴퓨터 비디오 현미경 (computer video microscope)으로 분석하였는데, 620 nm의 단일 파장에서 검출되는 형광을 측정하여 염색된 부분을 분석하였다. 정상 점막 (mucosa) 세포는 각 해당 시료마다 분석하였다. 각 염색에 대한 항체의 한계치는 음성 대조군이 IgG의 분석결과를 바탕으로 정하였다. 안지오시딘의 영향으로 염색된 지역의 값에서 상기 음성 대조군의 측정치를 빼서 양성반응을 나타낸 세포의 비율을 결정하였다. 상 분석 시스템을 이용하여 양성반응을 강하게 내는 환자일수록 모세혈관의 비율이 높은 것을 알 수 있었고, 이런 경우 환자들은 다른 신체부위로 암이 전이되어 전이성 질병 (metastatic disease)으로 12개월 이내에 사망하였다. 약한 양성반응을 나타낸 환자들은 낮은 모세혈관 분포를 나타냈으며 2년 이내에 증상이 호전되었다.
머리와 목의 종양
부위 병리학적 분화 안지오시딘 분포 신혈관조성(vessels/mm2) 2년 내 생존여부
편도선 중간 5 52 생존
입 천장 빈약 5 24 생존
인두 빈약 9 15 생존
혀 중간 14 10 생존
구강 강함 73 140 사망
혀 빈약 82 213 사망
<실시예 32> 내독소 연구 (Endotoxin study)
세포배양에 영향을 주는 내독소가 오염되지 않은 상태에서 안지오시딘이 작용함을 보이기 위해 자라나는 세포에 안지오시딘을 처리한 결과, 안지오시딘은 단백질 1 ㎍당 0.0076 pg의 내독소 효과를 나타내었다. 1 ng 미만의 내독소는 세포배양에 안전한 것으로 알려져 있으므로, 안지오시딘 자체로는 내독소로서 세포의 성장에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.
<실시예 33> 생존능 연구 (Viability study)
His-표지 안지오시딘의 효과가 첨가한 히스티딘의 아미노산에 의한 것이 아니라는 것을 밝히기 위하여, BAEC에 각각 His-표지 안지오시딘과 His-표지 GST를 37 ㎍/㎖ 포함하여 무혈청 배지에서 밤새 배양하였다. 안지오시딘과 pTrcHisA 발현 벡터 (expression vector)에 형질전환하여 얻은 GST를 환원되지 않은 조건에서 니켈 친화 크로마토그래피 (Nickel affinity chromatography)를 이용하여 정제하였다. 정제된 펩티드를 ALAMAR BLUETMassay를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다.도 39에 나타난 바와 같이, 안지오시딘은 세포생존에 있어 처리한 양에 비례하여영향을 미치는데 안지오시딘의 양이 증가하면 생존율은 떨어진다. 반면, GST는 세포생존에 아무런 영향을 미치지 않았다. 생체와 비슷한 조건에서라면 His-표지는 세포생장에 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 볼 수 있다.
<실시예 34> 안지오시딘에 대한 항체가 안지오시딘을 처리한 BAEC에 미치는 영향
BAEC에 안지오시딘만 5 ㎍/㎖, 안지오시딘 5 ㎍/㎖과 IgG 100 ㎍/㎖, 그리고 안지오시딘 5 ㎍/㎖과 항-안지오시딘 IgG 100 ㎍/㎖ 등 각각을 무혈청 배지에 넣고 배양하여 밤새 키운 다음, ALAMAR BLUETMassay로 세포의 생존율을 측정하였다.도 40에 나타난 바와 같이, 항-안지오시딘 IgG는 안지오시딘이 BAEC에 작용하는 것을 방해하는 것으로 나타났다. 그러므로, 안지오시딘의 효과는 특이적으로 일어나는 것임을 확인할 수 있다.
<실시예 35> BAEC가 기질과 결합할 때 안지오시딘의 영향
실험군인 BAEC에는 안지오시딘 37 ㎍/㎖을 처리하였고, 대조군의 세포에는 안지오시딘을 처리하지 않았다. 세포가 50,000 정도 자랐을 때 각각 2 ㎍의 피브로넥틴, TSP-1, BSA 등으로 코팅된 웰에 세포를 옮겼다. 피브로넥틴은 영향력이 큰 세포 조직 단백질로서 BAEC와 강하게 결합하므로 양성 대조군으로 취급할 수 있고, BSA는 그 반대이므로 음성 대조군으로 사용하였다. 30분 후에 웰 바닥에 부착되지 않은 세포를 흡입하여 제거하였고, 각각 PBS로 헹구어 2.5% 글루코타르알데히드 (glucotaraldehyde)로 고정한 후 2% 지엠사 (Giemsa)로 염색하여 세포의 수를 1 mm2안에서 세었다.도 41에 나타낸 바와 같이, 안지오시딘을 처리하지 않은 군에서는 피브로넥틴의 그룹과 TSP-1의 그룹에서 아주 강한 세포 점착을 보였고, 안지오시딘을 처리한 군에서는 세포 점착이 현저히 낮아졌다. 즉, 안지오시딘은 TSP-1과 특정의 결합을 한다는 것을 재확인할 수 있었다.
<실시예 36> 안지오시딘의 아미노 말단과 카르복시 말단의 작용
재조합한 안지오시딘 펩티드의 일부와 안지오시딘 펩티드의 전체구조를 비교하였다. GST는 음성 대조군으로 사용하였고, 반응결합성은 TSP-1 1 ㎍이 공유결합으로 고정된 큐벳을 사용하는 광학측정법을 이용하였다. 레이저광을 이용하여 실험군과 대조군의 펩티드가 각각 TSP-1이 부착된 큐벳의 표면에 결합했는지의 여부를 알아보았다. TSP-1이 결합한 큐벳은 1% BSA로 다시 비특정결합에 대한 차단을 하였고, PBS 완충용액에 10 nm의 농도가 되도록 시료에 첨가하였다.도 42에 나타낸 바와 같이, 안지오시딘과 그의 아미노기 말단 (Met1-Lys132)은 나노몰 범위에서 아주 유사한 활성을 보였다. BAEC는 각각 37 ㎍/㎖ 안지오시딘,서열번호 24및25의 재조합 펩티드, GST 등과 함께 배양하여 ALAMAR BLUETMassay로 세포의 활성을 측정하였다. 그 결과,도 42에 나타낸 바와 같이 안지오시딘의 펩티드 아미노 말단인서열번호 24의 펩티드가 안지오시딘과 거의 비슷한 활성을 나타내었으며,실시예 36의 결과와 더불어 안지오시딘의 아미노 말단이 안지오시딘의 효과와 연계되어 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명은 트롬보스폰딘 (TSP-1)의 Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly (서열번호 1)-특이적인 부위에 대한 특이적인 결합 친화력을 가지는 정제된 수용체들에 관한 것으로, 구체적으로서열번호 2및서열번호 3,서열번호 2및서열번호 3의 단편들 및 돌연변이체들 및 상기 수용체들에 대한 항체들과 억제제들로 구성된 군으로부터 선택되는 수용체들에 관한 것이다. 또한, 본 발명은서열번호 2및서열번호 3의 수용체, 그의 단편들, 돌연변이체들 또는 항체들 및 그에 의해 유도된 리간드들 (ligands)을 사용하여 질병을 치료하고 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 정제방법에 의해 제공된 안지오시딘은 암의 진단, 처방 및 치료와 같은 수많은 진단 및 진료 상황에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (26)

  1. 트롬보스폰딘 (TSP-1)의 Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly (서열번호 1) 서열-특이적인 부위에 대한 특이적 결합 친화력 (specific binding affinity)을 가지는 정제된 수용체 단백질 (purified receptor protein).
  2. 제 1항에 있어서, 서열은서열번호 2및서열번호 3, 그리고서열번호 2및서열번호 3의 단편들 및 돌연변이체들로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 수용체 단백질.
  3. 제 2항에 있어서, 단편은서열번호 24, 그리고서열번호 24의 단편들 및 돌연변이체들로 구성되는 것을 특징으로 하는 수용체 단백질.
  4. 1) 제 1항 또는 제 2항의 수용체를 분리하는 단계;
    2) 상기 수용체에 대한 항체들을 제조하는 단계; 및
    3) 상기 항체들을 환자의 치료에 사용하는 단계로 구성되는 트롬보스폰딘 활성을 억제하는 (inhibits) 항체를 이용하여 환자를 치료하는 방법.
  5. 1) 제 1항의 수용체를 분리하는 단계;
    2) 상기 수용체에 대한 항체들을 제조하는 단계; 및
    3) 상기 항체들을 환자의 치료에 사용하는 단계로 구성되는 트롬보스폰딘 활성을 흉내내는 (mimics) 항체를 이용하여 환자를 치료하는 방법.
  6. 1) 제 1항의 수용체를 분리하는 단계;
    2) 상기 수용체에 대한 리간드 (ligand)를 제조하는 단계; 및
    3) 상기 리간드를 환자의 치료에 사용하는 단계로 구성되는 트롬보스폰딘 활성을 억제하는 리간드를 이용하여 환자를 치료하는 방법.
  7. 1) 제 1항의 수용체의 존재를 측정하는 단계; 및
    2) 악성종양 암이 존재하는지 여부를 결정하는 단계로 구성되는 악성종양 암을 검출하는 방법.
  8. 1) 제 1항의 수용체를 분리하는 단계;
    2) 상기 수용체에 대한 리간드를 제조하는 단계; 및
    3) 상기 리간드를 환자의 치료에 사용하는 단계로 구성되는 트롬보스폰딘 활성을 흉내내는 리간드를 이용하여 환자를 치료하는 방법.
  9. 1) 환자에게 제 1항의 수용체를 투여하는 단계; 및
    2) 수용체가 트롬보스폰딘 활성을 경잭적으로 (competitively) 억제하도록 반응하는 단계로 구성되는 제 1항의 수용체를 이용하여 환자를 치료하는 방법.
  10. 제 8항에 있어서, 치료하는 방법은 신혈관조성 (angiogenesis)을 억제하거나 역행시키는 (reverse) 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 8항에 있어서, 치료하는 방법은 종양의 성장을 억제하고, 방지하고 또는 역행시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 8항에 있어서, 방법은 환자의 수명을 연장시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 1) 제 1항의 수용체 단편을 환자에게 투여하는 단계; 및
    2) 상기 단편들이 트롬보스폰딘 활성을 경쟁적으로 저해하도록 반응시키는 단계로 구성되는 제 1항의 수용체의 단편을 이용하여 환자를 치료하는 방법.
  14. 1) 제 1항의 수용체의 수준을 결정하는 단계; 및
    2) 전이성 (metastatic) 및 비전이성 (nonmetastatic) 종양들을 위한 공지된 값들에 대하여 상기 수준을 평가하는 단계로 구성되는 암을 가진 환자를 진단 (diagnosis)하거나 예후 (prognosis)를 결정하는 방법.
  15. 제 1항의 수용체에 의해 유도된 항체 및 제 1항의 수용체에 의해 유도된 리간드로 구성된 군으로부터 선택된 목적하는 성분 (targeting moieties)에 연결된 화학요법 약제 (chemotherapy drug)로 구성된 암을 치료하기 위한 조성물.
  16. 제 1항의 수용체에 의해 유도된 항체 및 제 1항의 수용체에 의해 유도된 리간드로 구성된 군으로부터 선택된 목적하는 성분에 연결된 방사성 성분(radioactive moieties)으로 구성된 암을 치료하기 위한 조성물.
  17. 1) 제 16항의 조성물의 치료학적으로 효과적인 유효량과 이에 선택적으로 약악적으로 허용가능한 담체 (carrier)를 투여하는 단계;
    2) 목적하는 성분이 암을 타겟 (target)하도록 반응시키는 단계; 및
    3) 방사성 성분이 암을 치료하도록 반응시키는 단계로 구성되는 암을 치료하는 방법.
  18. 제 1항의 수용체에 의해 유도된 항체 및 제 1항의 수용체에 의해 유도된 리간드로 구성된 군으로부터 선택된 목적하는 성분에 연결된 방사성 성분으로 구성되어 있는 암의 방사선학적 검출, 암의 진단 및 암 치료에 대한 치료학적 반응의 정량을 위한 조성물.
  19. 1) 제 16항의 조성물의 유효량과 이에 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 투여하는 단계;
    2) 목적하는 성분이 암을 타겟하도록 반응시키는 단계;
    3) 방사성 성분이 암을 표지하도록 (labelled) 반응시키는 단계; 및
    4) 암을 검출하거나, 암을 진단하거나, 또는 암 치료에 대한 치료학적 반응을 정량하는 단계로 구성되는 암을 방사선학적으로 검출하는 방법.
  20. 제 1항의 수용체에 의해 유도된 항체 및 제 1항의 수용체에 의해 유도된 리간드로 구성된 군으로부터 선택된 목적하는 성분에 연결된 MRI 증강 제제 (MRI enhancing agents)으로 구성되어 있는 암의 MRI 검출, 암의 진단 및 암 치료에 대한 치료학적 반응의 정량을 위한 조성물.
  21. 제 18항에 있어서, MRI 촉진 제제는 가돌리니움 (gadolinium), 망간 (manganese) 및 철 (iron)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 1) 제 20항의 조성물의 유효량과 이에 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 투여하는 단계;
    2) 목적하는 성분이 암을 타겟하도록 반응시키는 단계;
    3) 방사성 성분이 암을 표지하도록 반응시키는 단계;
    4) 암을 검출하거나, 암을 진단하거나, 암 치료에 대한 치료학적 반응을 정량하기 위하여 MRI를 사용하는 단계; 및
    5) MRI 증강 제제가 MRI를 촉진하도록 반응시키는 단계로 구성되는 암을 방사선학적으로 검출하는 방법.
  23. 세포 제거 수단들 (means)은 목적하는 성분에 연결하고, 목적하는 성분은 제 1항의 수용체에 의해 유도된 항체 및 제 1항의 수용체에 의해 유도된 리간드로 구성된 군으로부터 선택되는, 세포들을 제거하기 위한 수단들로 구성되는 생체의학 기구.
  24. 1) 후보 약제 (candidiate drugs)를 개발하는 단계; 및
    2) 제 1항의 수용체에 대한 상기 후보 약제의 결합을 평가하는 단계로 구성되는 트롬보스폰딘 활성을 흉내내거나 억제하는 약제를 고안하는 방법.
  25. 1) 제 1항의 정제된 수용체 단백질의 약학적으로 허용가능한 양을 투여하는 단계; 및
    2) 내피세포 생존능을 감소시키기 위하여 상기 수용체 단백질이 내피세포와 상호작용을 하도록 반응시키는 단계로 구성되는 내피세포 생존능을 감소시키는 방법.
  26. 1) 제 1항의 정제된 수용체 단백질의 약학적으로 허용가능한 양을 투여하는 단계; 및
    2) 세포 부착 활성을 감소시키기 위하여 상기 수용체 단백질이 세포와 상호작용을 하도록 반응시키는 단계로 구성되는 세포 부착 활성을 감소시키는 방법.
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