HU217175B

HU217175B - Új belhámvaszkuláris protein-1 (VAP-1), amely emberben a limfociták kötődését mediálja

Info

Publication number: HU217175B
Application number: HU9403516A
Authority: HU
Inventors: Sirpa Jalkanen; Marko Salmi
Original assignee: Oy Biotie Therapies Ltd.
Priority date: 1992-06-09
Filing date: 1993-06-09
Publication date: 1999-12-28
Also published as: JP3431922B2; EP0656906B1; AU4328193A; CA2137551C; WO1993025582A1; NZ299958A; JP2003180346A; DK0656906T3; ATE184315T1; DE69326347D1; GR3031255T3; FI121176B; CA2137551A1; HUT75824A; AU671837B2; NZ253151A; KR950701938A; JPH07507557A; ES2135480T3; EP0656906A1

Abstract

A találmány egy új belhámvaszkűláris adhéziós prőtein-1-re (VAP-1)vőnatkőzik, amely emberben a limfőciták kötődését mediálja. Atalálmány tárgyát képezik tővábbá az anti-VAP-1 mőnőklőnálisantitestek, és az 1B2 mőnőklőnális antitest, valamint egy hibridómasejtvőnal (DSM ACC 2041), amely ezt termeli. A találmány tárgyatővábbá eljárás gyűlladásős és aűtőimműn betegségek kezelésérealkalmas gyógyászati készítmény, illetve eljárás a fenti betegségek exvivő diagnősztizálására VAP-1-kötő vegyületek, példáűl anti-VAP- 1antitestek alkalmazásával. ŕ

Description

A találmány tárgyai alapvetően megtisztított és izolált belhámvaszkuláris adhéziós protein-1 (VAP-1), amely a DSM ACC 2041 számon letétbe helyezett hibridóma sejtvonal által termelt monoklonális antitesttel ismerhető fel; anti-VAP-1 antitest; az ezt termelő hibridóma sejtvonal; az anti-VAP-1 antigént felismerő monoklonális antitest (1B2); sejtmentes kompozíció és gyógyászati készítmény, amely anti-VAP-1 antitestet tartalmaz; valamint eljárás belhámsejtek limfocitákhoz való kötődésének antagonizálására in vitro; és eljárás egészségi állapot diagnosztizálására ex vivő.

A legtöbb érett limfocita folyamatosan recirkulál a vér és a nyirokszervek között [Butcher E. C., Curr. Top. Microbiol. Immunoi. 128, 85 (1986)]. A limfociták az ér belhámsejtek felismerése és azokhoz való kötődésük révén hagyják el a vért. Ezután a belhámsejtek között a környező szövetekbe vándorolnak. A limfociták mozgása teszi lehetővé, hogy a limfocitaspecificitás teljes repertoárja az egész testben hozzáférhető legyen az immunreakciók számára, és elősegíti az immunválasz kialakulásához és szabályozásához szükséges sejt-sejt kölcsönhatásokat is. A limfocitatapadás a belhámsejtekhez a mindkét sejttípusban expreszálódott komplementer adhéziós molekulák közötti kölcsönhatásoktól függ [Springer T. A., Natúré 346, 425 (1990); Stoolman L. M., Cell 56, 907 (1989); Osbom L„ Cell 62, 3 (1990); Pober és Cotran, Transplantation 50, 537 (1990); Butcher E. C., Cell 67, 1033 (1991)]. Normális körülmények között a limfociták főleg a magas belhámvenuláknak (HÉV) nevezett specializált, posztkapilláris venulákhoz (apró vénákhoz) kötődnek. Ismertettek funkcionálisan elkülönülő limfocita-HEV felismerő rendszereket, amelyek a limfocitavándorlást a perifériás nyirokcsomókhoz, a nyálkahártya-nyirok szervekhez, az ízületi hártyához és a bőrhöz szervspecifíkusan mediálják [Butcher E. C. és munkatársai, Eur. J. Immunoi. 10, 210 (1980); Jalkanen

S. és munkatársai, Science 233, 556 (1986); Picker L. J. és munkatársai, Natúré 349, 796 (1991)]. Gyulladás esetén a belhámsejtek aktiválása adhéziós molekulái állapotának megváltozását eredményezi, ami nagymértékben meghatározza a leukocitabeáramlás nagyságát és típusát az érintett szövetbe. Ezért a belhámsejt-molekulák kulcsszerepet játszanak a helyi immunválasz jellemzőinek szabályozásában, és nyilvánvalóan a limfociták mozgását és a leukociták kiszivárgását szabályozó mechanizmusok pontos megismerése új eszközöket nyújthat a gyulladásos válasz klinikai befolyásolására.

Mivel emberben a szövetszelektív, irányított limfocitamozgást mediáló belhámsejtligandumok nagyrészt ismeretlenek, szükség van az ilyen molekulák azonosítására.

1991 júniusában a European Federation of Immunological Societies ülésén egy kivonatban már közöltünk olyan előzetes eredményeket, amelyek a limfociták magas belhámvenulákhoz való kötődésében szerepet játszó, eddig ismeretlen belhámsejtantigén létezésére utalnak [Salmi és munkatársai, EFIS llth Meeting Abstracts, 21 -12 (1991)].

A gyulladás szabályozásának jelentőségét felismerve, és tudatában annak, hogy szükség van a szövetszelektív, irányított limfocitamozgást mediáló belhámsejtligandumok felderítésére, megkíséreltük a humán ízületnedv erek által expresszált ilyen molekulák azonosítását. Ezek a vizsgálatok vezettek egy új belhámvaszkuláris adhéziós protein-1 (VAP-1) azonosításához, amely emberben a limfociták kötődését mediálja, és a fenti molekula elleni monoklonálisantitest-termelés felismeréséhez. Ezek az antitestek a VAP-1 szintjének kvantitatív és kvalitatív meghatározására szolgáló vizsgálatokban, és klinikai kezelésekben alkalmazhatók, amelyek célja a VAP-1 hatásának antagonizálása az ilyen kezelésre szoruló betegben.

A fentieknek megfelelően a találmány egyrészt megtisztított és izolált VAP-1 proteinre vonatkozik, amely a DSM ACC2041 számon 1992. 06. 09-én letétbe helyezett hibridóma sejtvonal által termelt monoklonális antitesttel ismerhető fel.

A találmány továbbá a VAP-1 protein elleni antitestekre, különösen monoklonális antitestekre, és a fenti antitesteket tartalmazó készítményekre vonatkozik. A találmány tárgyát képezi az 1B2 monoklonális antitest, valamint az ezt termelő hibridóma sejtvonal (DSM ACC2041, letétbe helyezve a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturennél 1992. 06. 09-én).

A találmány tárgya továbbá eljárás a belhámsejtek limfocitákhoz való VAP-1 mediálta kötődésének antagonizálására in vitro, oly módon, hogy a VAP-1 mediálta limfocita-belhámsejt adhéziós reakciót gátoljuk egy VAP-1-kötő vegyület olyan mennyiségével, amely elegendő a fenti reakcióban résztvevő belhámsejten lévő VAP-1-helyek blokkolására, különösen akkor, ha a fenti limfocita-belhámsejt adhéziós reakció egy betegséggel, például (krónikus vagy heveny) gyulladással, arthritisszel, reumás arthritisszel, fertőzéssel, dermatózissel, gyulladásos bélbetegséggel vagy autoimmun betegséggel kapcsolatos.

A találmány tárgya továbbá eljárás az egészségi állapot diagnosztizálására in vitro, amelyet a belhámsejtek limfocitákhoz való VAP-1 mediálta kötődése közvetít egy alanyban, oly módon, hogy kimutatjuk az antiVAP-1 antitestek kötődését az alanytól vett VAP-1-pozitív sejtekhez, és az egészségi állapotot az ilyen kötődés alapján diagnosztizáljuk, a fenti egészségi állapot például (krónikus vagy heveny) gyulladás, arthritis, reumás arthritis, fertőzés, dermatózis, gyulladásos bélbetegség vagy autoimmun betegség lehet.

Az ábrákat röviden alább ismertetjük.

1. ábra: VAP-1 eloszlása humán szövetekben. (A) Gyulladásos ízületi hártyában az mAb 1B2 erősen festi a HEV-szerű ereket. (B) Mandulában a VAP-1 expreszsziója a HEV-ben változó, intenzívtől (nyílhegyek) a nagyon gyenge (nyilak) értékekig, vagy negatív. (C) A mandula immunfluoreszcens festése mutatja a VAP-1 erős expresszióját az erek luminális felületén (nyilak). (D) A vakbélben csak néhány, gyengén festődő HÉV látható (nyílhegyek). Nagyítások: 1 A. ábrán 100-szoros, 1B. ábrán 250-szeres, IC. és 1D. ábrán 400-szoros.

2. ábra: A VAP 90 kD molekulatömegű protein. 1. sáv: immuntisztított VAP-1 ezüstfestése. 2. és 3. sáv: a mandula ¹²⁵I-jelzett vázsejtjeit vagy mAb lB2-vel (2. sáv)

HU 217 175 Β vagy kontroll mAb 3G6-tal (3. sáv) immunprecipitáltuk. A 180-200 kD-nak megfelelő területen lévő sávok nem mindig vannak jelen. A molekulatömeg-standardokat a bal oldalon tüntettük fel. A limfocitáktól megszabadított mandulaextraktumokat lízis pufferben (150 mmol/1 NaCl, 10 mmol/1 Tris-bázis, 0,15 mmol/1 MgCl₂, 1% NP-40, 1 mmol/1 PMSF és 1% aprotinin) egy éjszakán keresztül 4 °C-on szolubilizáltuk. A lizátumot 10000 g-vel, °C-on 30 percen keresztül centrifugáltuk. A felülúszót Sepharose CL-4B (Pharmacia, Svédország) oszlopon átvezetve előderítettük. Ezután egymás után három, CNBr-nal aktivált, Sepharose 4B (Pharmacia) oszlopon vezettük át, amelyeket normális egérszérummal, nem találmány szerinti IgG| mAb-tel és 1B2 mAb-tel (5 mg/ml, ml oszloptérfogat) derivatizáltunk. Az oszlopot alaposan átmostuk a lízis pufferrel. Ezután az 1B2 oszlophoz kötött anyagot 50 mmol/1 koncentrációjú trietanolaminnal eluáltuk, liofilizáltuk, SDS-PAGE (7,5%, redukáló) alkalmazásával rezolváltuk és ezüst-festéssel tettük láthatóvá.

3. ábra: A VAP-1 részt vesz a limfociták HEV-hez való kötődésében. A limfociták kötődését a mandula-, a perifériás nyirokcsomó- (PLN), az ízületi hártya- és a vakbél-HEV-hez, és a granulociták kötődését a mandula-HEV-hez mAb 1B2 jelenlétében, és annak távollétében vizsgáltuk, fagyasztottmetszet-vizsgálattal, in vitro. Három, egymástól független kísérlet eredményét közöljük a kontrolikötődés %-ában, a standard hibákkal (100%=megkötött sejtek száma a 3G6-tal kezelt metszetben).

4. ábra: Az izolált VAP-1 elősegíti a limfocitakötődést. Az immuntisztított VAP-1-et és a kontrollproteineket [1E12 (nem rokon belhámsejt-molekula, amely elősegíti a limfocitakötődést) és BSA] üvegen adszorbeáltuk, és meghatároztuk a limfocitakötődést. (A) Két, egymástól független kísérlet eredményét közöljük a kontrollkötődés %-ában (100%=a lemezhez kötött VAP-1-hez vagy 1E 12-höz kötődött sejtek száma mAb 3G6-tal végzett kezelés után). A nem specifikus háttérértéket (kötődés a BSA-hoz) minden analíziseredményből levontuk. (B) Limfociták kötődése VAP-1-gyei bevont rezervoárhoz mAb 3G6 jelenlétében. (C) Limfociták kötődése VAP1-gyei bevont rezervoárhoz mAb 1B2 jelenlétében. A VAP-l-et és az 1E12-t mandulaextraktumokból tisztítottuk affinitásuk alapján a 2. ábrával kapcsolatban ismertetett módon. A tisztított VAP-l-et, 1 El2-t és hővel inaktivált BSA-t 20 mmol/1 koncentrációjú Tris-HCl pufferrel (pH 7,4) hígítottuk, amely 150 mmol/1 NaClot, 2 mmol/1 MgCl₂-ot, 2 mmol/1 CaCl₂-ot és 0,01 % βoktil-glükopiranozid detergenst tartalmazott. A proteineket üvegrezervoárokon (Lab-Tek kamra lemezek, Nunc) adszorbeáltuk +4 °C-on 16 órán keresztül. 1 mg/ml BSA-t tartalmazó PBS pufferrel szobahőmérsékleten 30 percen keresztül végzett blokkolás után a rezervoárokba 1B2 vagy 3G6 felülúszókat mértünk, és az inkubálást szobahőmérsékleten 30 percen keresztül folytattuk. Eközben frissen izolált perifériás vér mononukleáris sejteket szövettenyésztő lombikokban 10% FCS-t és 10 mmol/1 Hepest tartalmazó RPMI 1640-ben inkubáltunk 37 °C-on 1 órán keresztül, ezzel eltávolítottuk a műanyaghoz tapadó monocitákat. A nem tapadó limfocitákat 100 ml RPMI 1640-ben bemértük az egyes rezervoárokba, 1,8-10⁶ sejt/rezervoár koncentrációban. 37 °C-on 30 percen keresztüli inkubálás után a meg nem tapadt sejteket lerázással eltávolítottuk. A rezervoárok tetejét eltávolítottuk, a lemezeket gyenge PBS-sugárral mostuk, és 1% glutáraldehidet tartalmazó hideg PBS-sel fixáltuk. Ezután a sejteket Diff-Quick festék alkalmazásával megfestettük. A kötött sejteket az egyes rezervoárokban lévő sejtek vizuális számlálásával határoztuk meg (mintánként 50 mm² összterületen).

5. ábra: VAP-1 felfelé szabályozott a gyulladásos bélben. Normális bélben csak néhány gyengén pozitív ér figyelhető meg a lamina propriában (A; ezen a területen a venulák VAP-1-re nézve gyakorlatilag negatívak). Gyulladásos bélben (fekélyes colitis) számos VAP-1pozitív apró véna (nyilak) látható mind a lamina propriában (B), mind a szerveződött nyiroktüszőkben (C). Az endogén peroxidáztartalmú sejtek (hízósejtek) nem specifikus reaktivitást mutatnak, e: a bél hámsejtjei; lp: laminapropria. Nagyítás: 250-szeres.

6. ábra: VAP-1-indukció krónikus dermatózisokban. Ugyanazon beteg normális bőrterületéről (A) és psoriasisos sérüléséből (B) származó bőrmetszetekben a VAP-1 indukciója látható a bőr ereiben (nyílhegyek) a gyulladásos helyeken. Perivaszkuláris leukocitabeszűrődések láthatók a VAP-1-pozitív venulák körül, e: epidermis. Nagyítás: 200-szoros. C) VAP-1 expresszióját (értékelés +-től + + + +-ig) normális és beteg bőiben határoztuk meg ugyanazon betegből származó páros metszetekben (nem érintett és érintett). Zárójelben tüntettük fel az egyes csoportokba tartozó betegek számát.

7. ábra: A gyulladás által indukált VAP-1 mediálja a limfocitakötődést. Fagyasztott metszetkötődési vizsgálatot végeztünk, amelyben a PBL kötődését vizsgáltuk a VII. faktorra pozitív venulákhoz gyulladásos lamina propriában. Az inhibíciós vizsgálatokat úgy végeztük, hogy a szövetmetszeteket 1B2 és 3G6 monoklonális antitestekkel (mAb) előinkubáltuk. Az eredményeket a kontrolikötődés %-ában adtuk meg, a standard hibákkal (azaz a PBL kötődése mAb 3G6 jelenlétében jelenti a 100% kötődést).

A találmányt részletesen az alábbiakban ismertetjük.

A leukocita felületi receptorok és ér belhámsejteken lévő ligandumaik közötti kölcsönhatások kritikusan szabályozzák a limfocitaforgalmat a vér és a különféle nyirokszervek között, valamint a leukociták kiszivárgását a gyulladásos helyekre. Ismertetünk egy, az 1B2 monoklonális antitest által definiált új, 90 kD molekulatömegű humán belhámsejt adhéziós molekulát (VAP-1). A VAP-1 elsődlegesen az ízületi hártya, a perifériás nyirokcsomó és a mandula magas belhám-venuláiban (HÉV) expresszálódik, és az 1B2 erőteljesen gátolja a limfocitakötődést a HEV-ekhez ezekben a szövetekben, ellentétben a nyálkahártyán lévőkkel. Ezenkívül a limfociták az immunaffínitással izolált VAP-1-hez 1B2 által gátolható módon kötődnek. Az expressziós minta, a móltömeg, és a funkcionális tulajdonságok alapján a VAP-1 a limfociták új belhámligandumát jelenti. Arra a következtetésre jutottunk, hogy a VAP-1 egy új, vaszku3

HU 217 175 B láris molekula, amely az emberben közvetlenül részt vesz a limfocitaforgalomban.

Antitestek termelése

A VAP-1 protein elsődleges aznosítására megfelelő állatot, például egeret a humán ízületi hártya vázelemeivel immunizálva izületnedv erek elleni monoklonális antitesteket termeltünk. A humán ízületi hártya ilyen vázelemeit ismert eljárások alkalmazásával állíthatjuk elő. Az ízületi hártya vázanyagait úgy izolálhatjuk, hogy az ízületi szövetből eltávolítjuk a limfocitákat. Az ízületi szövetet aprítjuk, és az aprított szövetet rozsdamentes acél szitán átnyomjuk. A vázelemeket a szita tetejéről összegyűjtjük.

Az immunogént előnyösen egy adjuvánssal, például nem teljes Freund-adjuvánssal együtt adagoljuk; azonban bármely más, megfelelő adjuváns is alkalmazható. Az immunogént és az adjuvánst bármely adagolási mód vagy előírás szerint adagolhatjuk, amely az antitestek szintézisének megindítását eredményezi. így például az immunogén (egy injekcióban mintegy lpg VAP-l-et tartalmazó ízületi hártya vázanyag) egyhetes időközökben háromszori adagolása a specifikus patogénmentes Balb/c egerek talpába immunválaszt indukál.

A térdhaj lati nyirokcsomókból származó limfocitákat a fentiek szerint ismert eljárások alkalmazásával állítjuk elő, oly módon, hogy az aprított nyirokcsomókat rozsdamentes acélszitán nyomjuk keresztül, és a szabaddá vált limfocitákat a szűrletből összegyűjtjük, és nem szekretáló NS-1 egér myeloma sejtekkel (beszerezhető az ATCC-ből, száma TIB 18) fuzionáljuk, a standardelőírások alkalmazásával. A hibridómákat bármely megfelelő eljárással kiszűrhetjük, például a fagyasztott metszetek immunperoxidázos festésével. Egy, az az ízületi hártya ér belhámjával reagáló antitestet termelő hibridómát (1B2, IgG, alosztály) kétszer klónoztunk határhígitásos módszerrel, és tovább analizáltuk. A mAb 1B2 által felismert antigént VAP-1-nek neveztük (vaszkuláris adhéziós protein1 rövidítése).

A találmány szerinti eljárásban VAP-1-kötő proteinként alkalmazott antitestek előnyösen monospecifikus antitestek, azaz az antitestek csak a VAP-1-re, vagy annak egy antigénszakaszára specifikusak. A monospecifikus antitestek mind poliklonálisak, mind monoklonálisak lehetnek.

A poliklonális antitesteket úgy állíthatjuk elő, hogy egy arra alkalmas állatba injektáljuk a lényegében tiszta VAP-1 készítményt, majd megfelelő időközökben egy vagy több megerősítő injekciót adunk.

Előnyösen azonban VAP-1 antigén elleni monoklonális antitesteket (vagy azok biológiailag aktív származékait, például Fab’-t, F(ab’)₂-t vagy Fv fragmenseket) alkalmazunk a találmány szerinti eljárásban. Megjegyzendő, hogy a monoklonális antitestek bármely megfelelő forrásból származhatnak, így például rágcsáló- vagy emberi monoklonális antitestek közül választhatók.

Az antitestet úgy is előállíthatjuk, hogy az antitestet vagy annak biológiailag aktív származékát kódoló DNSszekvenciát egy megfelelő sejtbe, például egy mikroba-, növényi, állati vagy emberi sejtbe klónozzuk, és a sejtet az antitest vagy annak biológiailag aktív származéka kifejezésére alkalmas körülmények között tenyésztjük, majd az antitestet vagy annak biológiailag aktív származékát a tenyészetből kinyerjük.

A találmány szerinti reagensben alkalmazott antitesteknek előnyösen lényegében tiszta formában kell lenniük ahhoz, hogy a találmány szerinti eljárás pontossága javuljon.

A VAP-1 jellemző tulajdonságai

Az izolált VAP-1 móltömege redukálókörülmények között 90 kD, és nem redukáló körülmények között 100 kD.

A VAP-1 antigén izolálására előnyös VAP-1 proteinforrás a limfocitáktól mentesített, mandulából származó extraktum. Ezt az extraktumot úgy állítjuk elő, hogy a mandulaszövetből az aprított szövet rozsdamentes acél szitán való átnyomásával eltávolítjuk a limfocitákat. A szita tetejéről összegyűjtjük a vázelemeket. Azonban bármely VAP-l-et expresszáló sejttípus alkalmazható az alább ismertetett eljárásban, mivel a végső izolálásra a példaszerűen ismertetett eljárás a VAP-1 1B2 mAb-vel szembeni affinitásán alapul.

Az összes lépést alacsony hőmérsékleten (körülbelül 4 °C-on) hajtjuk végre. A sejteket óvatosan (például egy éjszakán keresztül 4 °C-on) lizáljuk pufferben, amely 150 mmol/1 NaCl-ot, 10 mmol/1 Tris-bázist, 0,15 mmol/1 MgCl₂-ot, 1% ΝΡ-40-et, 1 mmol/1 PMSFet és 1% aprotinint tartalmaz. A fenti extraktumot ezután előnyösen megtisztítjuk a lizált sejttörmeléktől óvatos centrifugálással, például 10000 g-vel 30 percen keresztül. A felülúszót ezután affinitási oszlopok sorozatára visszük fel, amelyek affinitási szerként egymás után (1) normál egérszérumot, (2) nem specifikus IgG] mAb-t (például lE12-t vagy más, kereskedelmi forgalomban kapható nem specifikus IgG, mAb-t) és (3) 1B2 mAb-t tartalmaznak. Az 1B2 mAb oszlophoz kötődött anyagot 50 mmol/1 koncentrációjú trietanolaminnal eluáljuk, és liofilizáljuk. A fenti módszerrel izoláltuk a VAP-l-et a mandula vázanyagból. A szakirodalomból ismert egyéb ekvivalens módszer is alkalmazható.

Amint azt az 1B2 monoklonális antitestek alkalmazásával kimutattuk, a sejtekben a VAP-1 a gyulladásos ízületi hártyák HEV-szerű venuláiban fordul elő bőségesen. A VAP-1 nem található meg a beszűrődő leukocitákban vagy az ízületi hártya vázanyagainak kötőszöveti komponenseiben. A perifériás nyirokcsomóban és mandulában a VAP-1 főleg a HEV-ben található meg. A VAP-1 főleg a belhámsejtek luminális oldalán lokalizálódik. A VAP-1 szemcsés festődése látható a belhámsejtek citoplazmájában és az abluminális felületen is.

A VAP-1 szintje - különösen a mandulában - nagymértékben változik a különböző HEV-ekben, és egyes (jellegzetesen durva morfológiájú) HEV-ekben egyáltalán nincs VAP-1. A vakbélben és a bél lamina propriában csak néhány gyengén festődő venula jelenléte látha4

HU 217 175 Β tó. A VAP-1 gyenge expresszióját találtuk a csíraközpontokban lévő fa alakú sejtekben, és az artériák, a vénák és a bélfal simaizom-sejtjeiben.

Ezzel szemben a VAP-1 gyakorlatilag hiányzik a nagyobb erek luminális felületéből. A szöveti metszetekben lévő leukocitákon kívül az alábbi sejtek sem expresszálnak VAP-1-et: perifériás vér limfociták, monociták, NK sejtek, granulociták és izolált mandula leukociták, a T-limfoblasztoid CCRF-CEM sejtvonal (ATCC CCL 119), a B-limfoblasztoid KCA és IBW4 sejvonalak [EBV transzformált B-sejtvonalak, amelyeket eredetileg E. Eglemantól kaptunk (Stanford University)], egy U937 monocita sejtvonal (ATCC CRL 1593); a KG-1 (ATCC CCL 246), a KG-la (ATCC CCL 246.1) és a K562 (ATCC CCL 243) leukémia sejtvonalak; az EaHy-926 belhám sejtvonal [karcinóma és a belhámsejtek közötti hibridóma sejtvonal, Edgell és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3724 (1983)] és a simaizomsejtek, fibroblasztok és keratinociták primer tenyészetei, és a belhám HeLa sejtvonal (ATCC CCL 2). A humán köldökvéna belhámsejtek (HUVEC) - amelyeket Jaffe [J. Clin. Invest. 52, 2745 (1973)] módszere szerint izoláltunk - nem expresszálnak VAP-1-et sem bazálisan, sem 20 és 100 egység/ml IL-l-gyel, 200 egység/ml TNF-fel vagy 0,1 és

I, 0 pg/ml LPS-sel végzett, 4, illetve 20 órán keresztüli kezelés után.

A VAP-1-et a leukocitakötődést mediáló ismert belhámsejt-molekulákkal összehasonlítva számos különbséget találtunk. Az intercelluláris adhéziós molekula- 1 és -2 (ICÁM-1 és ICAM-2), a vaszkuláris sejtadhéziós molekula-1 (VCAM-1), az E-szelektin (ELAM-1) és a P-szelektin (CD62, PADGEM, GMP 140) mindegyike expresszálódik a HUVEC-ben vagy bazálisan, vagy a gyulladás mediátorai által indukálva [Springer T. A., Natúré 346, 425 (1990); Stoolman L. M„ Cell 56, 907 (1989); Osbom L„ Cell 62, 3 (1990); Pober és Cotran, Transplantation 50, 537 (1990); Butcher E. C., Cell 67, 1033 (1991); de Fougerolles A. R. és munkatársai, J. Exp. Med. 174, 253 (1991); Osbom L. és munkatársai, Cell 59, 1203 (1989); Bevilacqua Μ. P. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 9238 (1987); McEver R. P. és munkatársai, J. Clin. Invest 84, 92 (1989); Hattori R. és munkatársai,

J. Bioi. Chem. 264, 7768 (1989); Wellicome S. M. és munkatársai, J. Immunoi. 144, 2558 (1990); Pober J. S. és munkatársai, J. Immunoi. 137, 1893 (1986); Dustin M. L. és munkatársai, J. Immunoi. 137, 245 (1986)]. Ezzel szemben a VAP-1 nem expresszálódik konstitutív módon, és nem is indukálható IL-l-gyel, TNFa-val vagy LPS-sel végzett kezeléssel a HUVEC felületén vagy citoplazmájában. A fenti molekulák szövetekben való megoszlása világosan eltérő - az eloszlás akkor is eltérő, ha mandulából származó parallel metszetekben vizsgáljuk (nem közölt adatok). Az ICAM-ok megfestik a legtöbb nagy és kis ér és bizonyos leukociták luminális felületét [de Fougerolles A. R. és munkatársai, J. Exp. Med. 174, 253 (1991); Dustin M. L. és munkatársai, J. Immunoi. 137, 245 (1986)]. Másrészről a VCAM-1 és az ELAM-1 csak néhány venulát fest meg a gyulladásos szövetben [Rice G. E. és munkatársai, J. Exp. Med. 171, 1369 (1990); Rice G. E. és munkatársai, Am. J. Pathol. 128, 385 (1991); Cotran R. S. és munkatársai, J. Exp. Med. 164, 661 (1986)]. A VAP-1 erősen expresszálódik a HEV-ek nagy többségében a nem nyálkahártyás helyeken, és hiányzik a fehérvérsejtekből és a vizsgált sejtvonalakból. Az ismert adhéziós molekulák molekulatömegei szintén világosan eltérnek a VAP-1-étől, az ICAM-1 kivételével [az ICAM-2 móltömege 60 kD, a VCAM-l-é 110 kD, az E-szelektiné 115 kD, és a P-szelektiné 140 kD, Stoolman Μ. M., Cell 56, 907 (1989); Osbom L., Cell 62, 3 (1990); de Fougerolles A. R. és munkatársai, J. Exp. Med. 174, 253 (1991)]. Ezenkívül A VAP-1 főleg a limfocitakötődésben játszik szerepet, míg az ICAM-ok, az E- és a P-szelektin erőteljesen mediálja a polimorfonukleáris leukociták adhézióját is [Springer T. A:, Natúré 346, 425 (1990); Stoolman L. M., Cell 56, 907 (1989); Osbom L„ Cell 62, 3 (1990); Pober és Cotran, Transplantation 50, 537 (1990); Butcher E. C., Cell 67, 1033 (1991)]. Az ez idáig ismertetett egyetlen, a limfocitakötődésben szerepet játszó, és a HUVEC-en nem expresszálódó belhámsejt adhéziós molekula a MECA-79 által definiált antigén [Berg E. L. és munkatársai, J. Cell Bioi. 114, 343 (1991)]. Ez azonban szövetspecifikusan a perifériás nyirokcsomókban fordul elő. Ezenkívül, a VAP-1 nem expresszálódik vele együtt egyik MECA-79-pozitív venulában sem, és az mAb 1B2 nem ismeri fel a tisztított MECA-79 antigént.

Ezért a VAP-1 expressziós mintája, funkciója és móltömege arra utal, hogy ez nem azonos egyetlen eddig ismert, a limfocitakötődésben szerepet játszó belhámsejt-molekulával sem, és hogy a gyulladás összefüggésben van a VAP-1 expressziójának szintjével in vivő. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy emberben a VAP-1 hozzátartozik a fiziológiás limfocitarecirkuláció megértéséhez, és különösen értékes a szövetszelektív, célzott limfocitavándorlás molekuláris mechanizmusának vizsgálatában.

VAP-1 és VAP-1-kötő vegyületek alkalmazása

A találmány diagnosztikai reagensre vonatkozik, amely alkalmas a VAP-1 protein és a VAP-1-pozitív sejtek kimutatására emberi vagy állati testből vett mintákban. A fenti reagens lehet egy, a VAP-1 proteinnel reagáló antitest, vagy a fenti antitest egy, a VAP-1-gyei reagáló fragmense, amely kívánt esetben egy olyan anyaggal van jelezve, amely lehetővé teszi az antitest kötődésének kimutatását az izolált VAP-1-hez, vagy a VAP-l-et a felületükön expresszáló sejtekhez. A fenti diagnosztikai készítményt készlet formájában prezentálhatjuk, a fenti készlet különálló tartályokban tartalmaz

a) egy, a VAP-1-gyei reagáló antitestet, vagy az antitest egy, a VAP-1-gyei reagáló fragmensét, előnyösen olyan anyaggal jelezve, amely lehetővé teszi az antitest VAP-1 antigénhez való kötődésének kimutatását; és

b) tisztított VAP-1 proteint, a vizsgálati eredmények standard értékelésének biztosítására.

HU 217 175 Β

A találmány másrészről egy eljárásra vonatkozik, gyulladások csökkentésére vagy kezelésére emberi vagy állati testben in vivő, oly módon, hogy az ilyen kezelésre szoruló beteg embernek vagy állatnak egy VAP-l-kötő vegyület (például egy, a VAP-l-gyel reagáló antitest vagy a fenti antitest egy biológiailag aktív származéka vagy a VAP-1 oldható liganduma) hatásos mennyiségét adagoljuk.

Kezelés alatt értjük a VAP-l-kötő vegyületek adagolását egy alanynak, a VAP-1 adhéziós események által médiáit betegségek megelőzése, enyhítése, megakadályozása vagy gyógyítása céljából. A találmány tárgyát képező, speciális VAP-l-kötő molekulák tisztított natív vagy rekombináns VAP-l-kötő proteinek, például antitestek vagy egyéb molekulák lehetnek.

A betegnek való adagolás céljára a találmány szerinti reagenst parenterálisan, nazálisán, enterálisan vagy rektálisan adagolhatóvá formálhatjuk. A reagens például injektálható készítmény, aeroszol készítmény, szuszpenzió, oldat, beöntés stb. formában lehet. A reagenst gyógyászatilag elfogadható segédanyagokkal vagy hordozóanyagokkal, például izotóniás sóoldattal formálhatjuk a gyógyszerkészítésben szokásosan alkalmazott módszerekkel. A reagenst olyan dózisban adagoljuk, amely elegendő a betegben a VAP-1 adhéziós események blokkolása révén a gyulladáscsökkentő hatás kiváltására.

A találmány szerinti reagens alkalmas minden olyan állapot kezelésére vagy diagnosztizálására, amely VAP-1 adhézió által médiáit, fokozott gyulladásos reakcióval jár. Ezért a reagens alkalmas például arthritis, helyi fertőzések, dermatózisok, gyulladásos bélbetegség, autoimmun betegségek stb. diagnosztizálására.

Egyik kiviteli alak szerinti, a VAP-l-kötő vegyület hatásos mennyiségét adagoljuk a gyulladás másodlagos, ártalmas gyulladásos hatásai elleni gyógyászati előnyök biztosítására. Hatékony mennyiség alatt a VAP-l-kötő vegyület azon mennyiségét értjük, amellyel a VAP-1 mediálta események toxikus hatásai legalábbis enyhíthetők. Egy gazdaszervezetben VAP-1 által médiáit túlzott mértékű események alatt a VAP-1 által médiáit adhéziós események olyan szintje értendő egy alanyban, amely meghaladja az alany normális egészségi állapotát jellemző szintet. Másodlagos szövetkárosodás vagy toxikus hatás alatt olyan szövetkárosodást vagy toxikus hatást értünk, amely az egyébként egészséges szövetekben, szervekben, és ezek sejtjeiben lép fel a VAP-1 által médiáit, túlzott mértékű adhéziós események jelenléte miatt, többek között a test más helyére ható primer stimulus eredményeként.

A találmány szerinti eljárásban a VAP-l-kötő vegyületek, például anti-VAP-1 antitestek infúziója a betegbe a fenti antitestek kötődését eredményezi a beteg azon sejtjeihez, amelyek felületükön VAP-1-et expreszszálnak, ilyenek például az ízületi hártya-HEV, a perifériás nyirokcsomó-HEV és a mandula-HEV, így megelőzik vagy gátolják a limfociták tapadását az ilyen szövetekhez vagy sejtekhez, és ezáltal megakadályozzák a nemkívánatos limfocitaforgalmat vagy beszivárgást az érintett szövetekbe vagy sejtekbe, és ezáltal megakadályozzák a VAP-1 által irányított limfocitaforgalomból és limfocitabeszivárgásból származó nemkívánatos gyulladásos válaszokat.

Ennek megfelelően a találmány szerinti gyógyászati készítmények VAP-l-kötő vegyületeket tartalmaznak olyan mennyiségben, amely elegendő a betegben a természetes VAP-1 kötődését a VAP-1 biológiai célpontjaihoz, különösen a belhámsejtekhez (teljesen vagy részlegesen) antagonizálni.

A VAP-l-kötő vegyületeket kémiailag vagy géntechnológiai úton összekapcsolhatjuk egyéb szerek fragmenseivel, amelyek a fenti VAP-l-kötő vegyületeket célzottan juttatják el a kívánt hatás helyére. A VAP-l-kötő vegyületeket kémiailag vagy géntechnológiai úton más vegyületekkel azért is összekapcsolhatjuk, hogy a VAP-l-kötő vegyületek tulajdonságait javítsuk, vagy azoknak olyan további tulajdonságokat biztosítsunk, amelyek fokozzák e vegyületeknek a VAP-1 adhéziómediálta toxikus hatásokat enyhítő képességét.

A VAP-l-kötő vegyületek mennyiségét és adagolási rendjét a gyulladásos betegségek, például az arthritis és a szövetkárosodások kezelésében járatos szakemberek egyszerűen meghatározhatják. Általában a VAP-l-kötő vegyülettel végzett kezelés során a dózist különböző körülmények határozzák meg, például az alkalmazott VAP-l-kötő vegyület típusa, a kezelendő alany kora, neme, egészségi állapota és gyógykezelésének körülményei, az adott esetben egyidejűleg alkalmazott egyéb kezelés fajtája, a kezelés gyakorisága és a kívánt hatás természete, a szövetkárosodás mértéke, a tünetek időtartama, és az esetleges ellenjavallatok, valamint a kezelést végző orvos által beállítandó egyéb változók. A kívánt dózist egy vagy több alkalommal adhatjuk a kívánt eredmény elérésére. A találmány szerinti VAPl-kötő vegyületet, például anti-VAP-1 antitestet tartalmazó gyógyászati készítményeket egységdózis formában prezentálhatjuk.

A találmány szerinti VAP-l-kötő vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítményeket bármely gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagban adagolhatjuk. A gyógyászati készítmények bármely formában adagolhatok, amely emberben vagy állatban megelőzi, enyhíti, megakadályozza vagy gyógyítja a VAP-1 által médiáit eseményekből származó állapotokat. Itt említjük meg, hogy a leírásban és igénypontokban egy betegség kezelésére szolgáló eljárás alatt a fenti betegség megelőzésére szolgáló eljárást is értjük.

A parenterális adagolásra alkalmas, találmány szerinti VAP-l-kötő proteint tartalmazó készítmények steril, vizes vagy nemvizes oldatok, szuszpenziók vagy emulziók lehetnek. A nemvizes oldószerek közé tartoznak például a propilénglikol, a polietilénglikol, a növényi olajok, a halolaj, és az injektálható szerves észterek. A vizes hordozóanyagok közé tartozik a víz, a víz/alkohol oldatok, emulziók vagy szuszpenziók, például a sóoldat és a pufferolt parenterális hordozóanyagok, mint például a nátrium-klorid-oldat, a Ringer-féle dextrózoldat, a dextróz+nátrium-klorid-oldat, a laktózt tartalmazó Ringer-oldat vagy a fixált olajok. Az intravénás hor6

HU 217 175 Β dozóanyagok közé tartoznak például a cseppfolyós és tápláló utántöltők, az elektrolit utántöltők, például a Ringer-féle dextrózoldat-alapúak, és a hasonlók.

A találmány szerinti VAP-l-kötő vegyületeket spray vagy nyújtott hatású készítmény formájában is adagolhatjuk, különösen akkor, ha az elsődleges sérülés inkább hosszadalmas vagy késleltetett, mint heveny. Egy példa arra az esetre, amikor az elsődleges sérülés inkább hoszszadalmas vagy késleltetett, mint heveny, egy olyan fertőzés vagy rándulás, amikor a szövet vagy izom sérülése az elsődleges fertőzés vagy sérülés után napokig nem látható (vagy nem hagy alább). A találmány szerinti VAP-l-kötő molekulákat nagy koncentrációkban juttathatjuk a specifikus szervekhez megfelelően beillesztett katéterek segítségével, vagy a fenti molekulákat kiméra molekulák (vagy komplexek) részeként adva, amelyeket úgy terveztünk, hogy célzottan a specifikus szervekhez jussanak.

A nyújtott hatású formák adagolása még célszerűbb akkor, ha hosszabb időn keresztül ismételt injekciók adása javallott a beteg számára. így például a találmány szerinti VAP-l-kötő proteineket nyújtott hatású készítmények formájában célszerű adni akkor, ha a találmány szerinti eljárást VAP-l-gyel kapcsolatos rendellenességen alapuló genetikus vagy krónikus gyulladásos betegségek kezelésére alkalmazzuk, ezáltal a betegnek maximálisan biztosítjuk a kényelmet.

A találmány szerinti VAP-l-kötő vegyületeket dózisformákban alkalmazhatjuk, például orális adagolásra tabletták, kapszulák, porcsomagok vagy cseppfolyós oldatok formájában, ha a VAP-l-kötő vegyület biológiai aktivitását nem semmisíti meg az emésztési folyamat, vagy ha a vegyület tulajdonságai megengedik a bélszöveten keresztüli felszívódást.

A találmány szerinti gyógyászati készítményeket ismert eljárásokkal állíthatjuk elő, például szokásos keverési, granulálási, drazsékészítési, oldási, liofilizálási vagy hasonló eljárásokat alkalmazva. A találmány szerinti készítmények VAP-1 által indukált, krónikus vagy akut fiziológiás károsodás szabályozására alkalmazhatók. A találmány szerinti készítmények elébe vágnak a test saját mechanizmusainak, mivel a VAP-1 adhéziót maximális hatékonysággal felismerik.

Intravénás dózisformában a találmány szerinti készítmények hatása kielégítően gyorsan fellép, így a potenciális szöveti károsodások akut kezelésére alkalmazhatók.

Emellett a kis hatású változat alkalmas a VAP-lgyel kapcsolatos enyhe vagy krónikus betegségek kezelésére.

Ezenkívül a találmány szerinti készítmények laboratóriumi vizsgálatokban az emberi vagy állati véráramban vagy extracelluláris szövetekben a VAP-1 szintjének meghatározásához szükséges reagensként is alkalmazhatók.

A VAP-l-kötő proteinek, amelyek a természetes szennyeződésektől lényegében mentesek, természetes vagy rekombináns forrásokból izolálhatok és tisztíthatok a proteinek izolálására szokásosan használt eljárásokkal és körülmények között, például extrahálással, kicsapással, kromatográfíával, affínitási kromatográfiával, elektroforézissel, és hasonló eljárásokkal.

A találmányt közelebbről - a korlátozás szándéka nélkül - az alábbi példákkal kívánjuk ismertetni.

1. példa

A VAP-1 megoszlása a szövetekben

A VAP-1 szöveti megoszlását a kriosztátos metszetek immunperoxidázos festésével határoztuk meg. A metszeteket elsődleges antitestekkel [lB2-vel és kontrollként 3G6-tal (csirke T-sejtek elleni egér IgG, mAb)] 30 percen keresztül inkubáltuk. Foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS, 8 g NaCl, 1,21 g K₂ HPO₄ és 0,34 g KH₂PO₄literenként, pH 7,2) kétszer mostuk, majd peroxidázzal konjugált birka antiegér IgG-t (Dakopatt, Dánia) adtunk hozzá 5% AB-szérumot tartalmazó PBS-ben, 30 percen keresztül. Ezután kromogénként 3’,3’-diamino-benzidin-hidrokloridot alkalmaztunk 0,03% hidrogén-peroxidot tartalmazó PBS-ben. A festés után a metszeteket hematoxilinnal ellenfestettük. Immunfluoreszcens festés céljára a 3 pm-es kriosztát metszeteket elsődleges antitestekkel felülrétegeztük, és FITC-konjugált birka antiegér IgG-t (Sigma, St. Louis) alkalmaztunk a második fázisban reagensként.

Immunohisztológiai festéssel láthatóvá vált, hogy az az 1B2 monoklonális antitest erősen festette a HEVszerű venulákat (apró vénákat) a gyulladásos ízületi hártyákban (1A. ábra). Nem észleltünk festődést sem a beszűrődő leukocitákban, sem az ízületi hártya vázanyagának egyéb kötőszöveti komponenseiben. Az mAb 1B2 által felismert antigént VAP-1-nek neveztük (a vaszkuláris adhéziós protein-1 rövidítése). Perifériás nyirokcsomóban és mandulában az mAb 1B2 a HEVek többségével reagált (1B. ábra). A VAP-1 erősen expresszálódott a belhámsejtek luminális oldalán (IC. ábra). Szemcsés festést láttunk a belhámsejtek citoplazmájában, és az abluminális felszín is mAb lB2-pozitív volt. Különösen a mandulában a festés intenzitása a különböző HEV-ekben jelentősen változott, és néhány, jellegzetesen durva morfológiájú HÉV lB2-negatív volt (1D. ábra). A vakbélben és a bél lamina propriájában csak néhány gyengén festődő venulát találtunk. A VAP-1 gyenge expresszióját figyeltük meg a csíraközpontok fa alakú sejtjein, és az artériák, vénák és bélfal simaizomsejtjein. Ezzel szemben a VAP-1 gyakorlatilag hiányzott a nagyobb erek luminális felületéből. A szövetmetszetekben lévő leukocitákhoz hasonlóan a perifériás vér limfociták, monociták, NK sejtek, granulociták és izolált mandulaleukociták teljesen 1 B2-negatívak voltak FACS analízis szerint. A T-limfoblasztomás (CCRF-CEM), B-limfoblasztomás (KCA, IBW-4), monocitás (U937), és leukémiás (KG-1, KGla, K 562) sejtvonalak mindegyikéből hiányzott a VAP-1. Ezenkívül hiányzott a VAP-1 a humán köldökvéna belhámsejtekből (HUVEC) bazálisan, és szintézisét IL-l-gyel (20, 100 egység/ml), TNF-p-vel (200 egység/ml), vagy LPS-sel (0,1, 1,0 pg/ml) végzett 4, illetve 20 órán keresztüli kezeléssel sem lehetett indukálni. Egy belhámsejtvonal (EaHy-926) szintén lB2-negatív

HU217 175 Β volt. A simaizomsejtek, fibroblasztok és keratinociták elsődleges tenyészetei és egy epiteloid (HeLa) sejtvonal nem expresszáltak VAP-l-et.

2. példa

A VAP-1 sejten belüli elhelyezkedése

Az 1. példában ismertetett, a szöveti lokalizációra vonatkozó kísérletek mellett tanulmányoztuk a VAP-1 sejteken belüli elhelyezkedését is a mandulából kivágott vastag (15 pm) metszetek közös fókuszú mikroszkopizálásával. A metszeteket 15 percen keresztül inkubáltuk mAb lB2-vel vagy 3G6-tal, PBS-tal kétszer mostuk, majd FITC-konjugált birka antiegér Ig-vel további 15 percen keresztül felülrétegeztük. Ezután a mintákat 10% PBS-t és elhalványulást gátló szerként fenilén-diamint tartalmazó glicerinbe merítettük, majd közös fókuszú mikroszkópiával analizáltuk. Mikroszkópos megfigyeléssel könnyen megfigyelhettük, hogy a VAP-1 a HÉV luminális felületén, és a citoplazmán belül elkülönülő granulákban van jelen. Ezen granulákat jelenleg még nem azonosítottuk, de kétszínű immunfluoreszcens festéssel, mAb lB2-t és a VIII. faktor elleni antitestet alkalmazva a granulák nem kolokalizálódtak. Ezért a VAP-1-pozitív granulák nem azonosak a belhámsejtek Weibel-Palade-testjeivel, amelyekben ismerten a P-szelektin nevű belhámsejt adhéziós molekula található.

3. példa

A VAP-1 móltömegének meghatározása

A limfocitáktól mentesített mandulaextraktumot lízis pufferben (150 mmol/1 NaCl, 10 mmol/1 Tris-bázis, 0,15 mmol/1 MgCl₂, 1% NP-40, 1 mmol/1 PMSF és 1% aprotinin) szolubilizáltuk 4 °C-on, egy éjszakán keresztül. A lizátumot 4 °C-on, 10000 g-vel 30 percen keresztül centrifugáltuk. A felülúszót Sepharose CL4B (Pharmacia, Svédország) oszlopon átvezetve előtisztítottuk. Ezután egymást követően három, CNBrnal aktivált Sepharose-4B (Pharmacia) oszlopon vezettük át, amelyeket normál egérszérummal, nem releváns IgG| mAb-tel és 1B2 mAb-tel (5 mg/ml, 5 ml oszloptérfogat) derivatizáltunk. Az oszlopot a lízis pufferrel alaposan átmostuk. Ezután az 1B2 oszlophoz kötődött anyagot 50 mmol/1 koncentrációjú trietanol-aminnal eluáltuk, és liofilizáltuk, SDS-PAGE (7,5%, redukáló) alkalmazásával rezolváltuk, és ezüstfestéssel láthatóvá tettük.

A jódos jelzés céljára a limfocitamentesített mandulaextraktumokat 100 egység/ml kollagenázt (Clostridium histolyticumból származó, II. típusú, Sigma), 10% magzati borjúszérumot (FCS), antibiotikumokat és 10 mmol/1 Hepest tartalmazó RPMI 1640-ben 37 °C-on, óvatos keverés közben, 1 órán keresztül emésztettük. A kollagenázos emésztés után a sejteket HBSS-sel mostuk, és felületüket ¹²⁵I-dal jeleztük, laktoperoxidázos módszert alkalmazva. A jódozott sejteket a lízis pufferrel lizáltuk, és a lizátumot 15 percen keresztül 10 000 gvel centrifugálva derítettük. A lizátumot CNBr-dal aktivált, normál egérszérummal kapcsolt Sepharose oszlopon előtisztítottuk. Az immunkicsapásokat CNBr-dal aktivált, 1B2 vagy 3G6 monoklonális antitestekkel kapcsolt Sepharose 4B gyöngyökkel hajtottuk végre. A mintákat 7%-os SDS-PAGE alkalmazásával analizáltuk redukáló (2-merkapto-etanol) körülmények között.

A VAP-1 móltömegének meghatározására a mandula vázanyagából affinitással izolált molekulát SDSPAGE-nek vetettük alá. A gél ezüstfestésével egy fő sáv vált láthatóvá, amelynek látszólagos móltömege 90 kD, redukáló körülmények között (2. ábra). A VAP-1 kissé lassabban vándorolt nem redukáló körülmények között (M_r 100 kD). A mandulából származó jódozott vázsejtekből kapott immunprecipitátumok analízise megerősítette az mAb 1B2 reaktivitását egy 90 kD móltömegű molekulával (és egy valamivel kisebb bomlási termékkel) (2. ábra). Néhány esetben egy 180-200 kD móltömegnek megfelelő sávot is találtunk.

4. példa

Limfociták kötődése a mandula-, a nyirokcsomó(PLN), az ízületi hártya- és a vakbél-HEV-hez, és a granulociták kötődése a mandula-HEV-hez E módszert részletesen Jalkanen és Butcher ismertették [Blood 66, 577 (1985)]. Röviden, az emberi mandulából, ízületi hártyából, vakbélből és perifériás nyirokcsomóból származó, frissen vágott, fagyasztott metszeteket 1B2 vagy 3G6 felülúszókkal inkubáltuk 7 °Con, lassú forgás közben, 30 percen keresztül. Ezután hozzáadtuk a fikollal izolált limfocitákat (3 10⁶/metszet) 5% FCS-t és 10 mmol/1 Hepest tartalmazó HBSSben, és 30 percen keresztül tovább inkubáltuk. Az inkubálás befejezése után a nem tapadó sejteket egy éjszakán keresztül fixáltuk 1% glutáraldehidet tartalmazó hideg PBS pufferben. Megszámoltuk a HEV-hez kötött sejteket 4-6 metszeten szövetenként, mintánként (legalább 100 HÉV, egyetlen vak). A granulocitakötődés meghatározására a vizsgálatot hasonló módon végeztük, azzal az eltéréssel, hogy a granulocitákat - amelyeket Histopaque 1119 (Sigma) alkalmazásával izoláltunk - Ca²⁺ - Mg²⁺-mentes HBSS-ben tartottuk egészen a metszetekre való felvitelig.

A VAP-1 szövetekben való megoszlása a belhámsejteken in vivő arra utalt, hogy valószínűleg speciális felismerő elemként funkcionál a leukociták számára. Ezért megvizsgáltuk a VAP-1 HEV-kötődésben játszott szerepét módosított Stamper-Woodruff-módszerrel in vitro [Jalkanen és Butcher, Blood 66, 577 (1985)]. A fagyasztott metszetek előkezelése mAb lB2-vel gátolta a limfociták kötődését a HEV-hez (3. ábra). Az inhibitor hatás a mandulában és a perifériás nyirokcsomóban volt a legkifejezettebb, de jelentősen csökkent a ízületi hártya-HEV-hez való kötődés is. A limfocitakötődés a vakbél-HEV-hez és a granulocitakötődés a mandulaHEV-hez kevésbé változott (3. ábra). Ezek az eredmények jelzik, hogy a VAP-1 vagy médiaija, vagy szoros kapcsolatban van a perifériás nyirokcsomó-, a mandula- és az ízületi hártya-HEV limfocitafelismerést médiáié belhámsejtelemeivel. A VAP-1 limfocita-belhámsejt kölcsönhatásban való szerepének közvetlen kiértékelésére analizáltuk a limfociták kötődését az af8

HU 217 175 B finitás alapján izolált VAP-l-hez (4. ábra). A limfociták hatékonyan tapadtak a lemezhez kötött VAP-l-hez. A limfociták kötődését a VAP-l-hez specifikusan gátolta az mAb 1B2, míg a kontoll mAb 3G6 nem. Az mAb 1B2 nem akadályozta meg a limfociták kötődését az egyéb, nem rokon belhámsejt-molekulákhoz (4. ábra).

A szöveti megoszlásra és a HEV-kötődésre vonatkozó vizsgálatok eredményei arra utalnak, hogy a VAP-1 főleg a limfociták perifériás nyirokcsomóhoz, mandulához és ízületi hártyához való eljutásában játszik szerepet. Érdekes módon a mandulában a VAP-1 expresszió hiánya a posztkapilláris venulák kisebb részhalmazára jellemző, amelyeket morfológiailag nem lehet megkülönböztetni az 1 B2-pozitívaktól. Mivel a mandulák szoros kapcsolatban vannak a gyomor-bél rendszerrel, valószínűleg mind a nyálkahártya (HEV-negatív), mind a perifériás nyirokcsomó (VAP-pozitív) típusú HEV-ek specificitásait tartalmazzák. További vizsgálatra szorul annak meghatározása, hogy a fenotípusos eltérés a VAP-1 expresszióban hogyan függ össze az egyes HEV-ek limfocitakötő kapacitásával. A VAP-1 ritka előfordulása a nyálkahártya limfoid szerveiben arra utal, hogy ez a belhámantigén eltérően van szabályozva a különböző limfocitafelismerő rendszerekben. Ezenkívül a gyulladás mértéke összefüggésben van a VAP-1 expresszió szintjével in vivő.

5. példa

1B2 hatásának vizsgálata a sejtek VAP-l-hez való kötődésére

A VAP-1-et és az 1 El2-t mandulaextraktumokból tisztítottuk affinitási kromatográfiával a 2. példában leírt módon. A tisztított VAP-1-et, lE12-t és a hővel inaktivált BSA-t 20 mmol/1 Tris-HCl-t (pH 7,4), 150mmol/l NaCl-ot, 2 mmol/1 MgCl₂-ot, 2 mmol/1 CaCl₂-ot tartalmazó oldattal hígítottuk, amely detergensként 0,01% β-oktil-glükopiranozidot tartalmazott. A proteineket üvegrezervoárokon (Lab-Tek kamra lemezek, Nunc) adszorbeáltuk +4 °C-on 16 órán keresztül. 1 mg/ml BSA-t tartalmazó PBS-pufferrel szobahőmérsékleten 30 percen keresztül végzett blokkolás után a rezervoárokba 1B2 vagy 3G6 felülúszókat mértünk, és az inkubálást szobahőmérsékleten 30 percen keresztül folytattuk. Eközben frissen izolált perifériás vér mononukleáris sejteket szövettenyésztő lombikokban 10% FCS-t és 10 mmol/1 Hepest tartalmazó RPMI 1640-ben inkubáltunk 37 °C-on 1 órán keresztül, ezzel eltávolítottuk a műanyaghoz tapadó monocitákat. A nem tapadó limfocitákat 100 μΐ RPMI 1640-ben bemértük az egyes rezervoárokba, 1,8-10⁶ sejt/rezervoár koncentrációban. 37 °C-on 30 percen keresztüli inkubálás után a meg nem tapadt sejteket lerázással eltávolítottuk. A rezervoárok tetejét eltávolítottuk, a lemezeket gyenge PBS-sugárral mostuk, és 1% glutáraldehidet tartalmazó hideg PBS-sel fixáltuk. Ezután a sejteket Diff-Quick festék alkalmazásával megfestettük. A kötött sejteket az egyes rezervoárokban lévő sejtek vizuális számlálásával határoztuk meg (mintánként 50 mm² összterületen).

6. példa

A VAP-1 részleges aminosavszekvenciája

Meghatároztuk a 90 kD móltömegű VAP-1 antigén részleges aminosavszekvenciáját. A részleges aminosavszekvencia 20 aminosav hosszúságú, mégpedig:

TEDGDMXLVNGASANEGXVE (1 számú szekvencia)

A protein- és DNS-szekvencia adatbázisokban végzett kutatása során nem találtuk meg ezt a szekvenciát egyetlen ismert szekvenciában sem.

7. példa

A VAP-1 meghatározása gyulladásos választ mutató klinikai mintákban

A normális mandula-, perifériás nyirokcsomó-, bélés szívmintákat sebészeti műtétekből frissen kaptuk, míg a veseminták szervdonoroktól származtak. Az egyéb szövetek boncolási minták voltak. A fenti összes minta hisztopatológiás vizsgálat szerint nem volt gyulladásos. A gyulladásos mintákat krónikus dermatózisban (psoriasis, atópiás ekcéma, lichen ruber planus) szenvedő betegektől vettük bőrlyukasztásos próbakimetszéssel. Kontroll próbakimetszéseket is vettünk ugyanazon beteg makroszkóposán nem érintett bőrterületeiből. A gyulladásos bélmintákat gyulladásos bélbetegségben (Crohnféle betegség, fekélyes colitis) szenvedő, gyógyászati célból megoperált betegektől vettük. Az ízületi hártya minták ízületi hártya eltávolításokból származtak.

A mintákat immunperoxidázos módszerrel festettük az 1. példában ismertetett módon. Röviden, az acetonnal fixált, fagyasztott metszeteket egymás után inkubáltuk primer antitestekkel (tenyészetek felülúszóival vagy 50 pg/ml tisztított immunglobulinnal), és a megfelelő, peroxidázzal konjugált második fázisú reagensekkel, és a színreakciót H₂O₂ és szubsztrátként diamino-benzidin alkalmazásával hoztuk létre. A VAP-1 expresszióját a bél- és bőrmintákban (normális és gyulladásos) két független leolvasóval analizáltuk, kódolt mintákból, a diagnózis ismerete nélkül.

Amint az 1. példában megjegyeztük, a VAP-1 csak alacsony szinten expresszálódott a normális, nem gyulladásos bél néhány venulájában (5A. ábra). Ezzel szemben a gyulladásos bélbetegségben szenvedő betegektől vett bélmintákban a VAP-1 jelentősen nagyobb mértékű expressziója figyelhető meg (5B. és 5C. ábra, valamint I. táblázat). A VAP-1 mind a lamina propria sima falú venuláiban, mind a szervezett nyiroktüszőkben (Peyer-plakkokban) lévő HEV-szerű venulákban indukálódott. A krónikus gyulladás a bőrben is a VAP-1 szintézisének fokozódásával járt (6A. és 6B. ábra). Annak érdekében, hogy az egyedek közötti eltérések hatásait az eredményekből kiküszöböljük, ugyanazon betegből egyidejűleg metszettünk ki és festettünk meg egy mintát a dermatózisos sérülésből, és egy kontrollmintát a nem gyulladásos területből. Ezekben a mintákban a VAP-1-pozitív venulák száma a felhámban nagyobb volt a gyulladásos mintában, mint a kontrollterületről vett mintában. Ezenkívül, a jelentős perivaszkuláris leukocitabeszűrődések mindig a VAP-1-pozitív erekhez kapcsolódtak.

HU217 175 Β

I. táblázat

VAP-1 indukciója gyulladásos bélbetegségben

Minta	n	VAP-1
-	+	+ +	+ + +	+ + + +
Normál	9	0	5	3	1	0
Crohn	7	0	0	2	3	2
Fekélyes colitis	7	0	0	0	5	2

A bélminták Crohn-féle betegség, fekélyes colitis és tumorok miatt operált betegekből származtak (a tumoros minták nem beteg részei jelentik a normál mintákat). A VAP-l-pozitív venulák számát minden egyes mintában —tói + + + + -ig értékeltük, az anyagok és módszerek részben leírtak szerint.

8. példa

VAP-1 által médiáit kötődés a gyulladásos nyálkahártyához

Fagyasztottmetszet-vizsgálatot végeztünk in vitro a 3. példában leírtak szerint. Az 1B2 monoklonális antitest mintegy 60%-ban gátolta a limfocitakötődést a lamina propria apró ereihez (7. ábra) két bélmintában, amelyekben a VAP-1 erősen expresszálódott.

Noha a találmányt annak specifikus kiviteli alakjaival kapcsolatban ismertettük, magától értetődik, hogy az tovább módosítható, és a találmány magában foglalja azokat a változtatásokat, alkalmazásokat vagy adaptációkat is, amelyek a találmány lényegéből általában következnek, és felöleli azokat az eltéréseket is a jelen leírástól, amelyek azon a szakterületen, amelyhez a találmány tartozik, ismertek, vagy a szokásos gyakorlat részét képezik, és a leírásban és az alábbi igénypontokban ismertetett alapvető jellemzőkre alkalmazhatók.

Szekvenciajegyzék

1. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:

(A) Szekvencia hossza: 20 aminosav (B) Szekvencia típusa: aminosav (C) Szál típusa: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: peptid (xi) Szekvencia leírása:

Thr Glu Asp Gly Asp Met Xaa Leu Val Asn Gly Alá Ser 5 10

Alá Asn Glu Gly Xaa Val Glu

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Megtisztított és izolált belhámvaszkuláris adhéziós protein-1 (VAP-1), azzal jellemezve, hogy a DSM ACC2041 számon letétbe helyezett hibridóma sejtvonal által termelt monoklonális antitesttel ismerhető fel. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
2. Az 1. igénypont szerinti VAP-1, azzal jellemezve, hogy limfocitákhoz kötődik.

15 (Módosítási elsőbbsége: 1994.07.01.)
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti VAP-1, azzal jellemezve, hogy a VAP-1 anti-VAP-1 antitesthez való kötésével van előállítva.

(Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)

20
4. Hibridóma sejtvonal, azzal jellemezve, hogy antiVAP-1 antitestet termel.

(Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
5. A 4. igénypont szerinti hibridóma sejtvonal, azzal jellemezve, hogy letéti száma DSM ACC2041.

25 (Módosítási elsőbbsége: 1994.07.01.)
6. Anti-VAP-1 antitest, vagy annak anti-VAP-1 kötődő fragmense, azzal jellemezve, hogy az antitest vagy kötődő ffagmens humán belhám-VAP-l-re specifikus, és az antitest nem kötődik a humán köldökvéna-bel30 hámsejtek (HUVEC) felületi proteinjeihez.

(Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
7. 1B2 monoklonális antitest, azzal jellemezve, hogy specifikusan kötődik az 5. igénypont szerinti sejtvonal által termelt VAP-1-hez.

35 (Módosítási elsőbbsége: 1994.07.01.)
8. Sejtmentes kompozíció, azzal jellemezve, hogy egy anti-VAP-1 antitestet vagy annak egy anti-VAP-1 kötődő fragmensét tartalmazza.

(Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)

40
9. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy a

6. vagy 7. igénypont szerinti anti-VAP-1 antitest hatásos mennyiségét tartalmazza, és injekciós adagolásra alkalmas formában van.

(Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)

45
10. A 9. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy egységdózis formában van. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
11. Eljárás belhámsejtek limfocitákhoz való, VAP-1 mediálta kötődésének antagonizálására in vitro, azzal

50 jellemezve, hogy a VAP-1 mediálta limfocita-belhámsejt adhéziós reakciót egy VAP-1-kötő vegyület a fenti reakcióban részt vevő belhámsejten lévő VAP-1-helyek blokkolásához elegendő mennyiségének biztosításával gátoljuk.

55
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy VAP-1-kötő vegyületként anti-VAP-1 antitestet alkalmazunk.
13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy anti-VAP-1 antitestként poliklonális antitestet

60 alkalmazunk.

HU 217 175 Β
14. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy anti-VAP-1 antitestként monoklonális antitestet alkalmazunk.
15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy monoklonális antitestként 1B2 monoklonális antitestet alkalmazunk.
16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a limfocita-belhámsejt adhéziós reakcióként krónikus vagy heveny gyulladással, arthritisszel, reumás arthritisszel, fertőzéssel, dermatózissal, gyulladásos bélbetegséggel vagy autoimmun betegséggel kapcsolatos reakciót gátolunk.
17. Eljárás egy beteg egészségi állapotának diagnosztizálására, amelyet a belhámsejtek limfocitákhoz való, VAP-1 mediálta kötődése médiái, azzaljellemezve, hogy 1. a betegből eltávolított, vélhetően VAP- 1-pozitív sejteket egy anti-VAP-1 antitesttel érintkeztetjük,

2. kimutatjuk az anti-VAP-1 antitest kötődését a VAP-1 pozitív sejtekhez, és

3. a kötődés mértéke alapján diagnosztizáljuk az egészségi állapotot.

5
18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy anti-VAP-1 antitestként poliklonális antitestet alkalmazunk.
19. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy anti-VAP-1 antitestként monoklonális antites10 tét alkalmazunk.
20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy monoklonális antitestként 1B2 monoklonális antitestet alkalmazunk.
21. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 15 hogy krónikus vagy heveny gyulladást, arthritist, reumás arthritist, fertőzést, dermatózist, gyulladásos bélbetegséget vagy autoimmun betegséget diagnosztizálunk.