FI120496B - Lymfosyyttien sitoutumiseen vaikuttava ihmisen endoteelisolun molekyyli - Google Patents

Description

Lymfosyyttien sitoutumiseen vaikuttava ihmisen sndoteeil· solun molekyyli

KEKSINNÖN ALA

Tämä keksintö koskee uutta ihmisen endoteeiisolun adheesioanti-5 geeniä nimeltä VAP-1, sekä menetelmää valmistaa monokionaalista vasta-ainetta, 1B2, joka tunnistaa VAP-1-antigeenin,

KEKSINNÖN TAUSTA

Useimmat kypsät lymfosyytit kiertävät jatkuvasti veren ja iymfaattis-ten elinten välillä (Butcher, E, C., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 128, 85 10 (1986)). Lymfosyytit poistuvat verestä tunnistamalla ja tarttumalla verisuonien endoteelisoiuihin, Tämän jälkeen ne siirtyvät endoteelisölujen välistä ympäröiviin kudoksiin. Lymfosyyttien kulkeutuminen mahdollistaa kaikki lymfosyyttis-peslfiset immuunireaktiot kehon jokaisessa osassa, ja helpottaa immuunivasteen syntymisen ja kontrollin vaatimia solunvälisiä interaktioita. Lymfosyyttien 15 tarttumiseen endoteelisoiuihin vaikuttaa molemmissa solutyypeissä ilmentyvien komplementaaristen adheesiomolekyylien vuorovaikutus (Springer, T. A., Nature 346, 425 (1990); Stoolman, LM.. Cell 56, 907 (1989); Osborn, L, Cell 62, 3 (1990); Pober and Cotran, Transplantation 50, 537 (1990); Butcher, E.C., Cell 67, 1033 (1991)). Normaalitilassa lymfosyytit sitoutuvat pääasiallisesti eri-20 koistuneisiin postkapillasrisiin laskimoihin, joita kutsutaan körkeaendoteelisiksi laskimoiksi (engl. High Endothelial Venule, HEV). Toiminnallisesti erilliset lym-fosyytti-HEV-tunnistusjärjesteimät, jotka myötävaikuttavat lymfosyyttien kulkeutumiseen perifeerisiin imusolmukkeisiin, suoliston lymfaattiseen kudokseen, niveikalvoon ja ihoon elinspesifiseliä tavalla on kuvattu kirjallisuudessa 25 (Butcher, E.C., et ai, Eur. J. immanol. 10, 210 (1980); Jalkanen, S., et ai, Science 233, 556 (1986); Picker, L. J., et ai., Nature 349, 796 (1991)). Tulehdustilanteessa endoteeiisolun aktivaatio aikaansaa muutoksia adheesiomolekyylien tilassa, mikä suuressa määrin vaikuttaa tulehtuneeseen kudokseen siirtyvien leukosyyttien määrään ja tyyppiin. Täten endoteelisolut ovat 30 avainasemassa paikallisen immuunivasteen kontrollissa, ja lymfosyyttien kulkeutumista ja poistumista verenkierrosta säätelevän mekanismin yksityiskohtainen ymmärtäminen voi luonnollisesti antaa uusia mahdollisuuksia tulehdus-vasteen kliinistä muokkaamista ajatellen.

2

Koska ihmisen lymfosyyttien kudossetektiiviseen kulkeutumiseen vaikuttavat endoteeiisoiuligandit ovat pääasiallisesti tuntemattomia, on suuri tarve tunnistaa tämänkaltaisia molekyylejä.

Tämän keksinnön keksijät esittelivät European Federation of immu-5 nologicai Socieies -järjestön kokousabstraktissa kesäkuussa 1991 alustavia tuloksia jotka viittasivat aikaisemmin tuntemattoman lymfosyyttien HEV-sitoutumiseen vaikuttavan endoteelisolun antigeenin olemassaoloon. (Salmi et af., EFIS 11 th Meeting Abstracts, 21-12; 1991).

KEKSINNÖN YHTEENVETO

10 Tunnistaen tulehduksen kontrollin tärkeyden ja kudosselektiivisen lymfosyyttien kulkeutumiseen vaikuttavien endoteelisoiujen figandien ymmärtämisen tarpeen, kyseiset keksijät pyrkivät tunnistamaan ihmisen niveikalvon suonissa ilmentyviä molekyylejä. Nämä tutkimukset ovat huipentuneet uuden lymfosyyttien sitoutumiseen vaikuttavan ihmisen endoteelisolun molekyylin, is VAP-1, tunnistamiseen ja tätä molekyyliä tunnistavien monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseen. Nämä vasta-aineet ovat käyttökelpoisia VAP-1-tason kvantitatiiviseen ja kvalitatiiviseen määrittämiseen tarkoitetuissa testeissä sekä f kliinisessä hoitotilanteessa, jossa kumotaan VAP-1-molekyylin toiminta hoidon j tarpeessa olevassa potilaassa.

20 Täten, esillä oleva keksintö koskee ensisijaisesti VAP-1-proteiinia, joka on olennaisesti vapaa luonnoiiisista kontaminaatioista, jotka liittyvät tällaiseen VAP-1-proteiiniin ihmisessä tai eläimessä.

Lisäksi keksintö koskee eristettyä VAP-1-proteiinia.

Keksintö koskee tämän lisäksi menetelmiä valmistaa VAP-1 -25 proteiinin vasta-aineita, erityisesti monokbnaaiisia vasta-aineita, sekä tämän-kaitaisia vasta-aineita sisältäviä kompositioita. Tässä keksinnössä kuvataan monoklonaalinen vasta-aine, 1B2, sekä tätä tuottava hybridömasoiuiinja (DSM ACC2041).

Keksintö koskee lisäksi menetelmää lymfosyyttien VAP-1 -välitteisen 30 endoteefisoluihin sitoutumisen vastustamiseksi, jossa menetelmässä inhiboidaan lymfosyyttien ja endoteeiisolujen VAP-1 -välitteinen adileesioreaktio in vitro antamalla VAP-1 sitovaa yhdistettä sellaisena määräni, joka riittää blok-kaamaan reaktioon osallistuvien endoteeiisolujen VAP-1 sitoutumiskohdat, erityisesti sellaisissa tapauksissa, joissa lymfosyyttien ja endoteeiisolujen ad-35 heesioreaktio liittyy tautiin, kuten tulehdukseen (krooninen tai akuutti) artriittiin, reumaan, derrnatoosnn, tulehdukselliseen suolistotautiin ja autoimmuunitautiin.

i j 3

KUVIEN LYHYT KUVAUS

Kuva 1.VAP-1 esiintyminen ihmisen kudoksissa. (A) Tulehtuneessa nivelkalvossa monokldnaalinen vasta-aine 1B2 värjää HEV-kaltaiset suonet voimakkaasti. (B) Nielurisassa VAP-1-ilmentyminen HEV:ssä vaihtelee voi-5 mäkkaasta (nuoli) heikkoon (nuoli) tai negatiiviseen. (C) Nielurisan imrnuno-fluoresenssivärjäys osoittaa VAP-1 :n huomattavaa ilmentymistä suonen lumi-naalipinnalla (nuolet). (D) Umpisuoiilisäkkeessä nähdään vain muutama heikosti värjäytyvä HEV (nuolet). Suurennukset: A 100x, B 250x, C ja D 400x.

Kuva 2. VAP-1 on 90 kD:n kokoinen proteiini. Kaista 1: Immuno-10 puhdistetun VAP-1 :n hopeavärjäys, Kaistat 2-3:125i-leimatut nielurisan sideku-dossölut immunopresipitoitiin joko vasta-aineella 1B2 (kaista 2) tai kontroliivas-ta-aineeila 3G6 (kaista 3). 180-200 kD bändit eivät aina esiinny. Molekyyiipai-nöstandardit vasemmäila, Lymfosyyttivapaat nieiurisauutteet soiubiiisoitiin ha-joituspuskurissa (150 mM NaCI, 10 mM Tris-base, 0.15 mM MgCU, 1% NP-40, 15 i mM PMSF ja 1% aprotiniini) yli yön 4°C:ssa. Lysaatti sentrifugoitiin 10 000 g 30 min 4° C:ssa. Lysaatti esipuhdistettiin Sepharose CL-4B (Pharmacia, Ruotsi) pylväässä. Tämän jälkeen lysaatti ajettiin kolmen CNBr-aktivoidun sefa-roosipylvään läpi (Sepharose-4B( Pharmacia), jotka olivat derivoitu joko hiiren normaaSiseerumiUa, irrelevantilta IgGi -vasta-aineelia tai 1 B2-vasta-aineella (5 20 mg/mi, 5 ml pylväs) Pylväät pestiin tarkoin hajoituspuskuriila. Tämän jälkeen 1 B2-pylvääseen sitoutunut materiaali eluoitiin käyttäen 50 mM trietanotiamiinia, kyimäkuivattiin, liuotettiin SDS-PAGE:en (7,5%, redusoitu) ja visualisoitiin ho-peavärjäyksen avuila.

Kuva 3. VAP-1 liittyy lymfosyyttien sitoutumiseen HEV:iin. Määritet-25 tiin lymfosyyttien sitoutumista nieiurisaan, perifeerisiin fmusoimukkeisiin (PLN), nivelkalvoon ja umpisuolilisäkkeen HEV:iin sekä granuiosyyttien sitoutumista nielurisan HEV:iin 1 B2-vasta-aineen iäsnä ollessa tai ilman käyttäen in vitro si-toutumiskoettä jääieikkeiilä. Kolmen riippumattoman kokeen tulokset esitetään standardivirheineen prosenttilukuina kontrollisitoutumiseen verrattuna (100% = 30 3G6-käsiteltyihin leikkeisiin sitoutunut solumäärä).

Kuva 4. Eristetty VAP-1 tukee lymfosyyttien sitoutumista, immuno-puhdistettu VAP-1 sekä kontroUiproteiinit (1E12; toinen endoteeiisoiu-moiekyyii, joka tukee lymfosyyttien sitoutumista, ja BSÄ) absorboitiin lasille, ja määritettiin lymfosyyttien sitoutuminen. (A) Kahden riippumattoman kokeen tu~ 35 iokset annettuna prosentteina kontroiiisitoutumiseen verrattuna (100% = 3G6-vasta-aineen käsittelyn jälkeen levylle sidottuun VAP-1 tai 1E12 proteiiniin si- 4 dottujen solujen määrä). Ei-spesifinen sitoutuminen (BSA proteiiniin sitoutuminen) on vähennetty kaikista analyyseista. (B) Lymfosyyttien sitoutuminen VÄP-1 pinnoitettuihin kuoppiin 3G6-vasta-aineen läsnä ollessa. (C) Lymfosyyttien sitoutuminen VAP-1 pinnoitettuihin kuoppiin 1 B2-vasta-aineen läsnä oilessa.

5 VAP-1 ja 1E12 proteiinit oli affiniteettipuhdistettu nielurisauutteista kuten Kuvassa 2 esitettiin. Puhdistettu VAP-1 , 1 El2 ja kuumuudella inaktivoitu BSA laimennettiin 20 mM Tris-HCI, pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM MgCi3, 2 mM Ca-Ci2 käyttäen 0.01 % β-oktyyligiukopyranosiidia detergenttina. Proteiinit kiinnitettiin iasikuoppiin (Lab-Tek kammiolevy, NUNC) 16 h +4°C;ssa. Blokkaus suori-10 tettiin 30 min huoneenlämmössä PBS:llä johon oli lisätty 1 rng/ml BSA, jonka jälkeen kuoppiin lisättiin 1B2 ja 3G6 supematantit ja inkuboitiin 30 min huoneenlämmössä. Samanaikaisesti inkuboitiin juuri eristettyjä perifeerisen veren mononukleaarisia soluja RPMI 1640:ssä, sisältäen 10% FCS ja 10 mM Hepes 1 tunti 37°C:ssa kudosviijelypuiioissa pohjaan kiinnittyvien monosyyttien pois-15 tamiseksi. Kiinnittymättömät lymfosyytit (1.8x10® solua/kuoppa) lisättiin jokaiseen kuoppaan 100 pi:ssa RPMI 1640. Inkuboitiin 30 min 37°C:ssa, jonka jäi-keen kiinnittymättömät solut poistettiin. Kuoppien väliseinät poistettiin, levyt pestiin heikossa PBS virrassa ja fiksattiin kylmässä PBS:ssä, joka sisälsi 1% glutaarialdehydiä. Tämän jälkeen solut värjättiin Diff-Quick värjäysäineella.

20 Kiinnittyneet soiut kvantjfoitiin määrittämällä visuaalisesti jokaisen kuopan so-lumäärä (totaalinen pinta-ala 50 mm2/näyte).

Kuva 5. VAP-1 on lisääntynyt tulehtuneessa suolessa. Normaa-iisuoiessa esiintyy vain muutama heikosti positiivinen suoni lamina prapriassa (A, tässä kohdassa suonet ovat käytännössä VAP-1-negatiivisia). Tuiehtu-25 neessa suonessa (ulseratiivinen koiiitti) nähdään useita VAP-1-positiivisia suonia (nuolet) sekä B) lamina propriassa että C) järjestäytyneissä imusoiukeräy-tymissä, Endogeeniset peroksidaasia sisältävät solut (mast solut) osoittavat ei-spesifistä reaktiivisuutta, e, suolen epiteelisoluja; ip, lamina propria. Suurennus 25Öx.

30 Kuva 6, VÄP-1 induktio kroonisessa dermatoosissa. Ihon koepalat saman potilaan ihon normaalialueelta (A) ja psoriasis-leesiösta (B) osoittavat | että VAP-1 on indusoitunut tulehduskohtien dermaalisuonissa (nuolet). Peri-vaskulaarinen ieukosyytti-infiitraatio näkyy VAP-1-positiivisten suonien ympärillä. e, epidermis. Suurennus 200x. C) VAP-1 :n ilmentyminen (arvio + -> ++++) 35 normaalissa ja sairaassa ihossa määritettiin rinnakkaisista koepaloista (nor- 5 maali ja leesio) samasta potilaasta. Suluissa olevat luvut osoittavat jokaiseen ryhmään kuuluvien potilaiden määrän.

Kuva 7. Tulehduksen indusoima VAP-1 vaikuttaa lymfosyyttien sitoutumiseen. Jääleikkeeliä tehtiin sitoutumistesti, jossa tutkittiin perifeerisen 5 veren lymfosyyttien sitoutumista Tekijä Vlll-positiivisiin suoniin tulehtuneessa lamina propriassa. Inhibitiotesti suoritettiin pre-inkuboimalla kudosleikkeet vasta-aineilla 1B2 ja 3G6. Tulokset esitetään prosentteina kontrollisitoutumisesta standardivirheineen (so. PBL-sitoutuminen 3G6-vasta-aineen läsnä ollessa määritellään 100%:ksi).

10 KEKSINNÖN TARKEMPI KUVAUS

Leukosyyttien pintareseptoreiden ja näiden vaskulaarisissa endo-teelisoluissa olevien ligandien välisellä vuorovaikutuksella on kriittinen merkitys lymfosyyttien liikkumiselle veren ja erilaisten lymfaattisten kudosten välillä sekä leukosyyttien siirtymiselle suonista tulehduskohtiin. Me kuvaamme tässä uutta 15 90 kD:n ihmisen endoteeiisolun adheesiomolekyyliä (VAP-1) määriteltynä mo~ noklonaalisen vasta-aineen 1B2 avulla. VAP-1 ilmenee ensisijaisesti nivelkal-von, perifeeristen imusolmukkeiden ja nielurisan HEV:eissä ja 1B2 inhiboi huomattavasti lymfosyyttien sitoutumista HEV;iin näissä kudoksissa, toisin kuin j suoliston imukudoksessa. Lisäksi lymfosyytit sitoutuvat immunoafRniteettieris-20 tettyyn VAP-1 ;een tavalla, joka on inhiboitavissa 1B2-vasta-aineeila. Esiintyminen, moiekyyiipaino ja toiminnalliset ominaisuudet osoittavat että VAP-1 on uusi lymfosyyttien endoteeiiiigandi. Me päättelemme, että VAP-1 on uusi vas-kulaarinen molekyyli, joka suoranaisesti liittyy lymfosyyttien kulkeutumiseen ihmisessä, 25 Vasta-aineiden tuotanto VAP-1-proteiinin alustavaksi tunnistamiseksi tuotettiin monokionaa-lisia vasta-aineita nivelkaivon suonia vastaan immunisoimalla sopiva eläin, kuten hiiri, käyttäen ihmisen nivelkaivon sidekudosta. Tämänkaltainen ihmisen nivelestä peräisin oleva sidekudosmateriaali saadaan käyttäen sinänsä tunnetko tuja menetelmiä. Nivelkaivon sidekudos voidaan eristää poistamalla lymfosyytit nivelkudoksesta. Niveikudos hienonnetaan ja hienonnettu kudos puristetaan ruostumattoman terässiivilän läpi. Sidekudosmateriaaii kerätään siivilän päältä.

Immunogeeni annetaan yhdessä adjuvantin kanssa, kuten esimerkiksi vajaan Freundin adjuvantin kanssa, joskin mitä tahansa sopivaa adjuvant-35 tia voidaan käyttää. Immunogeeni ja adjuvantti injisoidaan käyttäen mitä ta- 6 hansa tunnettua anto-ohjetta tai protokollaa, jolla aikaansaadaan vasta-aineiden muodostumisen indusointi. Immunogeeni (nivelkaivon sidekudpsma-teriaaii, jossa on arvioita noin 1 pg VAP-1 -antigeeniä injektiota kohden), voidaan esimerkiksi injisoida kolme kertaa viikon väliajoin spesifisesti pato-5 geenivapaan Baie/c hiiren jalkapöytään, jolloin immuunivaste Indusoituu.

Polven takana olevien imusolmukkeiden lymfosyytit eristetään käyttäen sinänsä tunnettuja menetelmiä kuten yllä kuvattiin, puristamalla jauhetut imusolmukkeet ruostumattoman terässiivilän läpi ja keräämällä vapautuneet lymfosyytit siivilän läpi kulkevasta aineesta, jonka jälkeen ne fuusioidaan ei-10 sekretoiviin NS-1 hiiren myeloornasoluihin {saatavana ATCC:stä, numerolta T1B 18) käyttäen standardimenetelmiä. Hybridomat voidaan seuloa käyttäen mitä tahansa sopivaa menetelmää, kuten jääieikkeiden immunoperoksi-daasivärjäystä. Yksi hybridoma (1B2, alaluokka IgGi,) joka tuotti nivelkaivon vaskufaarisen endoteeiin kanssa reaktiivista vasta-ainetta kloonattiin kaksi ker-15 taa rajaavalla laimennoksella ja vaiitiiin jatkotutkimuksia varten. Monoklonaaii-sen vasta-aineen 1B2 tunnistama antigeeni nimettiin VAP-1 :ksi (engl. Muscular Adhesion Proteän-1).

Keksinnön mukaisissa menetelmissä VAP-1 :een sitoutuvina proteiineina käytetyt vasta-aineet ovat monospesifisiä vasta-aineita, so. vasta-aineita 20 jotka tunnistavat spesifisesti vain VAP-1-proteiinin tai tämän antigeenistä osaa.

Monospesifiset vasta-aineet voivat olla sekä polyklonaalisia että monokionaali-sia.

Polyklonaajisia vasta-aineita voidaan valmistaa inpsoimalla sopivaan eläimeen olennaisesti puhdas VAP-1 valmiste ja antamalta tämän jälkeen 25 yksi tai useampi täydennysinjektio sopivin väliajoin.

Keksinnön mukaisissa menetelmissä on kuitenkin edullista käyttää j VAP-1-antigeeniä tunnistavia monoklonaalisia vasta-aineita (tai näiden biologisesti aktiivisia johdannaisia kuten Fab’, F(ab')2 tai Fv-fragmentteja). On huomattava, että monoklonaaliset vasta-aineet voidaan tuottaa missä tahansa so-30 pivassa kohteessa, ja ne voivat siten olla esimerkiksi jyrsijän tai ihmisen mo-noklonaalisia vasta-aineita,

Vasta-aine voidaan myös tuottaa kloonaamalla vasta-ainetta tai sen biologisesti aktiivista johdannaista koodittava DNA-sekvenssi sopivaan soluun, esim, mikrobi-, kasvi-, eläin- tai ihmissoluun, ja viljelemällä soluja vasta-aineen 35 tai sen biologisesti aktiivisen johdannaisen tuotantoa suosivissa olosuhteissa ottaen viljelystä taiteen vasta-aine tai sen biologisesti aktiivinen johdannainen.

Esillä olevassa keksinnössä käytetyn reagenssin vasta-aineet tulisi edullisessa tapauksessa olla olennaisesti puhtaassa muodossa menetelmän täsmällisyyden parantamiseksi.

7 VAP-1 :n ominaisuudet 5 Eristetty VAP-1 on mofekyyiipainoltaan 90 kD redusoiduissa olosuh teissa ja 100 kD ei-redusoiduissa olosuhteissa.

Lymfosyyttivapaa nielurisauute on edullinen lähde VAP-1-antigeenin eristämiseksi. Nämä uutteet voidaan valmistaa poistamalla lymfosyytit nielu-risakudoksesia puristamalla hienonnettu kudos ruostumattoman ferässiiviiän to läpi, Sidekudosmateriaaii otetaan talteen siivilän päältä. Toisaalta alla kuvatussa menetelmässä voidaan käyttää mitä tahansa VAP-1 ilmentävää solutyyppiä, koska esimerkinomaisesti esitetyissä menetelmissä lopullinen eristys on riippuvainen VAP-1-ja 1 B2-vasta-aineen väiisestä affiniteetisiä.

Kaikki vaiheet tulisi suorittaa viileässä (noin 4°G:ssa), Solut rikotaan 15 varovaisesti {esimerkiksi yli yön +4°C:ssa) proteolyysiä inhiboivaa ainetta sisältävässä puskurissa, esim. puskurissa joka sisältää 150 mM NaCl, 10 mM Tris-base, 0,15 mM MgCI2 1 % NP4Q, 1 mM PMSF ja 1 % aprotiniiniä. Nämä uutteet voidaan esipuhdistaa solujen rikkoutumisesta aiheutuvasta roskasta käyttäen varovaista sentrifugointia, esim. 10.000 g 30 min. Supernatantti siirretään 20 tämän jälkeen affiniteettipylvässysieemiin, seuraavassa järjestyksessä, (1) hiiren normaailseerumipylväs, (2) ei-spesifinen fgGi -vasta-ainepylväs (kuten 1E12 tai mikä tahansa kaupallisesti saatava ei-spesifinen IgG-i-vasta-aine) ja (3) monoklonaaiinen vasta-aine 1B2-pytväs. 1 B2~vasta-ainepylvääseen sitoutunut materiaali eluoidaan 50 mM trietanoiiamiinin avulla ja kyimäkuivataan. 25 Käyttäen tätä lähestymistapaa voidaan eristää VAP-1 nielurisan sidekudoksesta. Voidaan myös käyttää muita vastaavia, sinänsä tunnettuja menetelmiä.

Monoklonaalisen vasta-aineen 1B2 avulla huomataan, että tulehtuneissa nivelkaivoissa VAP-1 esiintyy runsaasti HEV-kaltaisissa suonissa. VAP-1 ei esiinny inftlfroivissa leukosyyteissä eikä missään nivelen sidekudoksen si-30 dekudoskomponentissa. Perifeerisissä imusolmukkeissa ja nielurisassa VAP-1 näyttää esiintyvän suurimmassa osassa HEV:stä. VAP-1 on vahvasti lokalisoitunut endoteelisoiujen iuminaalipuolelle. VAP-1 :n granulaarivärjäystä nähdään endoteelisolujen sytoplasmassa sekä myös kudoksenpuoleisella pinnalla.

Erityisesti nielurisassa VAP-1-tasot vaihtelevat suuresti eri 35 HEV:eissä ja muutama yksittäinen HEV (jolla tyypillinen pyöristynyt morfologia) on kokonaan VAP-1-negatiivinen. Umpilisäkkeessä ja suolen lamina proprias- 8 sa näyttää olevan vain muutama heikosti värjäytyvä suoni. Heikosti ilmentyvänä VAP-1 esiintyy myös dendrilttisoiujen kaltaisissa soluissa itäkeskuksissa ja arterioiden, laskimoiden ja suolenseinämän siteissä lihassoluissa.

Sitä vastoin VAP-1 puuttuu lähes kokonaan suurempien suonten 5 tuminaalipinoalta. Kudosieikkeiden lymfosyyttien lisäksi, VAP-1 ei näytä ilmentyvän seuraavissa soluissa: perifeerisen veren lymfosyytit, monosyytit, NK solut, granulosyytit ja eristetyt nielurisan leukosyytit, T-lymfobiastoidisolulinja CCRF-CEM (CCL 119, ATCC), B-lymfoblastpidlsolulinjat KCA ja IBW-4 (EBV transformoitu B solulinja, joka on saatu E. Engiemanilta, Stanford University), 10 monosyyttinen solulinja U937 (CRL 1593, ATCC); ja leukemiasolulinjat KG-1 (CCL 246, ATCC); KG-1 a (CCL 246.1, ATCC) ja K562 (CCL 243, ATCC); en-doteeiisolulinja EaHy-926 (karsinoina- ja endoteeHsoluhybridomasoluHnja, Ed-geli et a!., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:3724 (1983)); sekä prirnaariviljelyssä olleet sileälihassolut, fibroblastit ja keratinosyytit, sekä eptieloidisolulinja He-15 La(CCL 2, ATCC). Jaffen menetelmän mukaisesti eristetyt (J. Clin. Invest 522745 (1973)) ihmisen napanuoralaskimon endoteeiisolut (HUVEC) eivät ilmennä VAP-1 sellaisinaan eikä myöskään 4 tai 20 tunnin iL-1-käsittelyn (20-100 U/mi), TNF-käsittelyn (200 U/mi) tai LPS-käsitteiyn (1.1, 1.0 pg/ml) jälkeen.

20 Vertailemalla VAP-1 tunnettuihin leukosyyttien sitoutumiseen osal listuviin endoteelisolujen molekyyleihin huomataan useita eroja. Solujen välinen adheesiomolekyyli I ja 2 (10AM-1 ja ICAM-2), vaskulaarisen solun adheesiomolekyyli 1 (VCAM-1), E-selektiini (ELAIVi-1) ja P-seiektiini (CD62, PADGEM, GMP 140) ilmentyvät kaikki HUVEC-soluissa joko basaalisesti tai 25 tulehdusmediaattori-induktion jälkeen (Springer, TA, Nature 346:425 (1990); Stooiman, L. M,, Cell 56.907 (1989); Osborn, L.t Cell 62:3 (1990); Pober and Cotran, Transplantation 50:537(1990); Butcher, £0,,. Cell 67:1033 (1991); de Fougerolles, A.R., et at, J. Exp, Med. 174, 253 (1991); Osborn L., ef a/., Ceil 59, 1203 (1989); Bevilacqua, M.P., et at., Proc. Natl. Acad. Set. 84, 9238 30 (1987); McEver, R. P„ ef a/., J. Clin. Invest 84, 92 (1989); Hattori, R., et ai., J.

Biol. Chem. 264, 7768 (1989); Wellicome, S.M., et at, J. Immunol. 144, 2558 (1990); Pober, J. S., et ai, J. Immunol 137, 1893 (1986); Dustin, M. L., et al.,J. Immunol 137, 245 ¢1986)). Sitä vastoin VAP-1 ei ilmenny konstitutiivisesti eikä IL-1, TNF-alfa tai LPS-käsittelyn indusoimana HUVEC-solujen pinnalla. Näi-35 den molekyylien kudosdistribuutio on selkeästi erilainen, myös kun analysoidaan nielurisan rinnakkaisleikkeitä (tuloksia ei esitetty tässä), 1CAM värjäytyy 9 useimpien suurten ja pienempien suonten lummaaiipinnalia ja joissakin leukosyyteissä (de Fougerolles, A. R.t et ai, J. Exp. Med. 174, 253 (1991); Dustin, M. L, et ai., J. Immunol 137, 245 (1986)). Toisaalta VCAM-1 ja ELAM-1 värjäytyy vain muutamissa tulehtuneen kudoksen laskimoissa (Rice, G. E,, et ai., J.

5 Exp. Med; 171,1369 (1990); Rice, G. E„ et ai., Am. J. Pathol. 138, 385 (1991);

Cotran, R. S,, ei ai, J. Exp, Med. 164, 661 (1986)). Sitä vastoin VAP-1 ilmentyy voimakkaasti suurimmassa osassa HEV;ssä non-mukosaalisissa kohdissa ja puuttuu kaikista veren valkosoluista ja testatuista sqlulinjoista. Tunnetut adheesiomolekyylit eroavat myös selvästi VAP-1 :stä molekyylipainonsa suhteen, 10 lukuun ottamatta ICAM-1 {IGAM-2 on 60 kD, VGAM-1 110 kD, E-selektlini 115 kD ja P~seiektiini 140 kD molekyyli (Stooiman, LM., Cell, 56: 907 (1989); Osborn, L, Dell 62: 3 (1990); and de Fougerolles, A. R.t et ai, J. Exp. Med. 174, 253 (1991)). Lisäksi, VAP-1 osallistuu pääasiallisesti lymfosyyttien sitoutumiseen, kun taas !CAM:t, E- ja P-seiektiini vaikuttavat myös tehokkaasti polymor-15 fonukleaaristen leukosyyttien adheesioon (Springer, T.A., Nature 346, 425 (1990); Stooiman, L.iVL, Cell 56, 907 (1989); Osborn, L, Cell. 62, 3 (1990);

Pober and Cotran, Transplantation 50, 537 (1990); Butcher, E.G., Cell 67, 1033 (1991)), Ainoa toistaiseksi kuvattu ihmisen lymfosyyttien sitoutumiseen vaikuttava endoteeiin adheesiomolekyyli, joka ei ilmenny HUVEC:ssä on ME-20 CA-79-vasta-aineen tunnistama antigeeni (Berg, E.L., et ai, J. Cell Etoi 114, 343 (1991)). Tosin, tämä on perifeeristen imusolmukkeiden kudosspesifinen addressiini. Lisäksi VAP-1 ei esiinny kaikissa MECA-79 positiivisissa laskimoissa, ja 1 B2-vasta-aine ei tunnista puhdistettua MECA-79-antigeeniö.

Täten, VAP-1 ;n ilmentymiskuvio, toiminta ja mölekyylipäino osoitta-25 vai, ettei se ole identtinen minkään aikaisemmin kuvatun lymfosyyttien sitoutumiseen vaikuttavan endoteeiimoiekyylin kanssa ja että tulehdusaste korreloi I

VAP-1 :n ilmentyrnistasoon in vivo. Nämä tulokset osoittavat, että VAP-1 on relevantti, kun tahdomme ymmärtää lymfosyyttien fysiologista kulkeutumista ihmisessä, ja että se on erityisen arvokas työkalu tutkittaessa kudosselektiivisen 30 lymfosyyttien kotiutumisen molekuiaarisia mekanismeja.

VAP-1:n ja VAP-1-sitovien yhdisteiden käyttö

Keksinnön mukaisesti valmistettujen VAP-1-sitovien yhdisteiden eräs käyttömuoto koskee tulehduksen vähentämistä tai hoitoa in vivo ihmisen tai eläimen kehossa antamalla hoidon tarpeessa olevalle ihmis- tai eläinpotj-35 laaile tehokas määrä VAP-1 sitovaa yhdistettä (kuten VAP-1-reaktiivista vasta- 10 ainetta tai tällaisen vasta-aineen biologisesti aktiivista johdannaista, tai liukoista VAP-1-ligandia).

Ilmaisut ''hoito” tai "hoitaminen” on tarkoitettu kattamaan VAP-1 sitovien yhdisteiden antamista kohteelle tarkoituksena ennaltaehkäistä, kohen-5 taa, ehkäistä tai hoitaa VAP-1-proteiinin adheesioon liittyviä tiloja. Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettuja erityisiä VAP-1 :tä sitovia molekyylejä ovat puhdistetut VAP-1 ;tä sitovat naiiivit ja rekombinanttiproteiinit, kuten vasta-aineet tai muut molekyylit.

Potilaalle annettaessa keksinnön mukaisesti valmistetut reagenssit 10 voidaan formuloida parenteeraliselie, nasaaiiseile, enteriselle tai rektaaliselle antotavalle sopivalla tavalla. Täten reagenssit voivat olla esimerkiksi injisoita-vassa muodossa, aerosoliformulaationa, suspensiona, iiuksena, enemana yms. Reagenssi voidaan formuloida käyttäen farmaseuttisesti hyväksyttäviä lisäaineita tai kantajia, kuten isotonista suolaliuosta tavanomaisen farmaseutti-15 sen käytännön mukaisesti, Reagenssin annostaso tulee olla riittävä, jotta potilaassa aikaansaadaan VAP-1 ;.n blokkauksen antama anti-inflammatoorinen teho.

Keksinnön mukaisesti valmistettu reagenssi sopii minkä tahansa VAP-1 :n adheesioväiitteisen kohonneen tulehdusreaktion tunnistamiseen ja 20 hoitoon. Täten reagenssi on käyttökelpoinen esim. artriitin, paikallisen infektion, dermatoosin, tulehduksellisen suolistotaudin (IBP) ja autoimmuunitaudin kaltaisten tilojen tunnistamisessa.

Eräässä käyttömuodossa annetaan tehokas määrä VAP-1-sitovaa yhdistettä, jotta aikaansaadaan tulehduksen aiheuttamaan haitalliseen sekun-25 daaritulehdukseen nähden terapeuttisia hyötyä. “Tehokas määrä" VAP-1-sitovaa yhdistettä tarkoittaa määrää, jolla VÄP-1-välitteisten tapahtumien toksinen teho vähintään lievennetään. “Kohonneelta" isännän VAP-1-välitteisellä tapahtumalla tarkoitetaan sellaista VAP-1-välitteistä adheesiotapahiurnäa kohteessa, joka ylittää kohteen lääketieteellisesti terveen tilan normin. “Sekundaa-30 risella” kudostuholla tai toksisella teholla tarkoitetaan sitä sekundaarista kudos-tuhoa tai toksista tehoa, joka esiintyy muuten terveessä kudoksessa tai elimessä ja tämän soluissa johtuen kohonneesta VAP-1-välitteisistä adheesiota-pahtumista. Tämä määritelmä sisältää myös sellaiset tapahtumat, jotka johtuvat muualla kehossa esiintyvästä “primaari” kiihokkeesta.

35 Keksinnön mukaisesti valmistettujen VAP-1 :tä sitovien yhdisteiden, kuten VAP-1 -vasta-aineiden, antaminen infuusiona potilaalle aikaansaa tälfais- 11 ten vasta-aineiden sitoutumisen potilaan VAP-1 :tä ilmentävien solujen pinnalle, kuten niveikalvon HEV, perifeeriset imusolmuke-HEV ja nielurisan HEV, jolloin näiden solujen adheesio muihin soluihin VAP-1 :n välityksellä estyy ja jolloin estetään ei-toivottu lymfosyyttien kulkeutuminen tai siirtyminen kyseisiin kudok-5 siin tai soluihin. Näin estetään ei-toivotut inflammatooriset vasteet, jotka johtuvat VAP-1-välitteisestä leukosyyttien kulkeutumisesta ja leukosyyttien siirtymisestä pois verenkierrosta.

Täten keksinnön mukaisesti valmistetut farmaseuttiset kompositiot ovat kompositioita, jotka sisältävät VAP-1 -sitovia yhdisteitä sellaisessa määrin, 10 että potilaan natiivin VAP-1 :n sitoutuminen biologiseen VAP-1-kohteeseen, ja erityisesti endoteeiisolulhin, estyy (kokonaan tai osittain).

VAP-1-sitovat yhdisteet voidaan joko kemiallisesti tai käyttäen geeniteknologiaa konjugoida muiden aineiden fragmentteihin, jotka mahdollistavat tämänkaltaisen VAP-1-sitovan yhdisteen kohdistamisen haluttuun kohteeseen.

15 Vaihtoehtoisesti muita yhdisteitä voidaan joko kemiallisesti tai käyttäen geeniteknologiaa konjugoida VAP-1-sitovaan yhdisteeseen tätä tehostaen tai lisäten muita ominaisuuksia tämänkaltaiseen VAP-1-sitovaan yhdisteeseen. Tässä tarkoitetaan erityisesti sellaisia ominaisuuksia, jotka tehostavat yhdisteen kykyä edistää VAP-1-proteiinin adheesio-välitteistä toksisen tehon vähentämistä.

20 Alan ammatti-ihminen, jolla on kokemusta fuiehdusperäisten tau tien, kuten artriitin ja kudosvaurion hoidossa, voi helposti määrittää tarvittavat VAP-1-sitovien yhdisteiden annokset ja antomuodot. Yleensä VAP-1-sitovien yhdisteiden hoitoannokset vaihtelevat riippuen seuraavanlaisista huomioitavista seikoista; käytettävän VAP-1-sitovan yhdisteen tyyppi; potilaan ikä; tervey-25 dentiia; hoidettava tauti; muu samanaikainen terapia, ja mahdollisesti hoidon toistuminen ja halutuntyyppinen vaste; kudosvaurion taajuus; potilaan sukupuoli; oireiden kesto sekä mahdolliset kontraindikaatiot tel muut hoitavan lää- : kärin määrittelemät muuttujat. Haluttu annos voidaan antaa kerta-annoksena tai useampina annoksina haluttua tulosta ajatellen. Keksinnön mukaisesti vai-30 alistettuja VAP-1-sitovia yhdisteitä sisältävät farmaseuttiset kompositiot voivat olla kerta-annosmuotoisia.

Keksinnön mukaisesti valmistettuja VAP-1-sitovia yhdisteitä sisältävät farmaseuttiset kompositiot voidaan antaa missä tahansa sopivassa farmakologisessa kantajassa. Ne voidaan antaa missä tahansa muodossa, joka 35 edistää VAP-1-välitteisen tapahtuman ennaltaehkäisyä, lieventämistä, ehkäisyä tai hoitoa ihmisessä tai eläimessä. Määrittelymielessä selitysosassa käyte- 12 tyllä ilmaisulla taudin “hoitomenetelmä" ja vastaavilla ilmaisuilla tarkoitetaan myös kyseisin taudin ennaltaehkäisyä.

Keksinnön mukaisesti valmistetut VAP-1-sitovat proteiinivalmisteet parenteraalista antomuotoa varten kattavat steriilejä vesipohjaisia ja ei-5 vesipohjaisia liuottimia, suspensioita ja emulsioita. Esimerkkeinä ei-vesipohjaisista liuottimista mainittakoon propyieenigiykoli, poiyetyieenigiykoli, kasvisöljyt, kalaöljyt ja injektoitavat orgaaniset esterit. Vesipohjaisia kantajia ovat mm. vesi, vesialkohoiiliuokset, emulsiot tai suspensiot kattaen fysiologisen suolaliuoksen ja puskuroidut parenteraalfsei kantajat, kuten natriumkiondi-10 liuos, Ringer dekstroosiiiuos, dekstroosi-natriumkforidiliuos, laktoosia sisältävä Ringer liuos tai öljyt, Suonensisäisesti käytettäväksi tarkoitettuja kantajia ovat mm. neste- ja ravintonesteet, eiektrolyytitasapainottajat, esim. Ringer dekst-roosiin ja vastaaviin perustuvat liuokset.

Keksinnön mukaisesti valmistetut VAP-1-sitovat yhdisteet voidaan 15 myös antaa pumpun -avulla tai pitkävaikutteisessa muodossa varsinkin silloin, kun primaartvaurio on viivästynyt tai pitkäaikainen eikä akuutti. Esimerkkinä tällaisesta ti lanteesta mainittakoon infektio tai murtuma, jossa kudos- tai lihasvaurio huomataan vasta usean vuorokauden jälkeen primaari-infektio- tai vauriota aiheuttaman tapahtuman jälkeen, tai jos infektio tai vaurio on pysyvä. Keksin-20 nön mukaisesti valmistetut VAP-1-sitovat molekyylit voidaan myös antaa määrättyihin elimiin korkeissa konsentraatioissa osana kimeeristä molekyyliä (tai kompleksia), joka on suunniteltu määrättyyn elimeen kohdennettavaksi.

Anto pitkävaikutteisena muotona on erityisen edullista potilaan kannalta, jos tarvitaan toistuvia injektiota pidemmän ajan. On esimerkiksi edullista 25 antaa keksinnön mukaisesti valmistettuja VAP-1-sitovia proteiineja pitkävaikutteisessa muodossa siiloin, kun keksinnön mukaisia menetelmiä käytetään VAP-1-välitteisen perinnöllisen tai kroonisen inflammatoorisen taudin hoitoon, jolloin potilaan kannalta maksimoidaan hoidon mielekkyyttä.

Keksinnön mukaisesti valmistettua VAP-1-sitovaa yhdistettä voi-30 daan käyttää sellaisinakin annosmuotoina kuten oraalisesti annettavina tabletteina, kapseleina, jauheina tai nestemäisinä liuoksina, mikäli VAP-1-sitovan yhdisteen biologinen aktiivisuus ei tuhoudu ruoansulatuskanavassa ja jos yhdisteen ominaisuudet sallivat sen imeytymistä suoliston kudoksen iäpi.

Keksinnön mukainen farmaseuttisten kompositioiden valmistusme-35 netelmä voi sisältää sinänsä tunnettuja menetelmiä, esim. konventionaalista sekoittamista, granulointia, rakeistusta, liuottamista, kylmäkuivausta tai vas- 13 taavia menetelmää. Keksinnön mukaisesti valmistetut kompositiot ovat sinällään käyttökelpoisia kroonisen tai akuutin VAP-1 -indusoidun fysiologisen vaurion kontrollissa. Keksinnön mukaisesti valmistetut kompositiot vastustavat kehon omaa VAP-1 -ahdeesiota tunnistavan mekanismin maksimaalista tehoa.

5 Suonensisäisenä annosmuotona keksinnön mukaisesti valmistetut kompositiot omaavat riittävän nopean vaikutuksen ollakseen käyttökelpoisia potentiaalisen kudosvaurion akuuttihoidossa.

Matala-vaikutteinen muoto on lisäksi käyttökelpoinen lievien tai kroonisten VAP-1 -välitteisten tilojen hoitoon.

10 VAP-1 -sitovat proteiinit, jotka ovat olennaisesti vapaita luonnollisista kontaminanteista, voidaan eristää ja puhdistaa luonnollisista lähteistä tai re-kombinanttiiähteistä käyttäen tavanomaisia tunnettuja tämänkaltaisten proteiinien eristämiseen käytettyjä olosuhteita ja menetelmiä, kuten uutio, presipitaa-tio, kromatografia, affiniteettikromatografia, elektroforeesi tai vastaava.

15 Seuraavassa annetut esimerkit on tarkoitettu kuvaamaan esillä ole vaa keksintöä eivätkä ne miMän tavalla rajoita keksinnön suojapiiriä.

Esimerkki 1 VAP-1 kudosdistrihuufio VAP-1 :n kudosdistribuutio määritettiin käyttäen jääleikkeiden immu-20 noperoksidaasivärjäystä. Leikkeet inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla (1B2 ja kontrollina 3G6, hiiren IgGI-vasia-aine kanan T-soiuja vastaan) 30 min. Pestiin kaksi kertaa fosfaatti pusku roidu !!a fysiologisella suolaliuoksella (PBS, 8 g NaCI, 1.21 g K2HP04 ja 0.34 g KH2PO4 litralla, pH 7.2), jonka jälkeen lisättiin peroksidaasikonjugoitua lampaan anti-hiin-lgG (Dakopatt, Tanska) 5% AB-25 seerumia sisältävässä PBS:ssä 30 min. Seuraavaksi käytettiin kromogeenina 33!-diaminobentsidiinihydrokloridia 0.03% vetyperoksidia sisältävässä RBS:ssä. Värjäyksen jälkeen leikkeet vastavärjättiin hematoksyliiniilä. Immunofiuoresenssivärjäystä varten 3 pm jääleikkeet peitettiin primaarisilla vasta-aineiila ja käytettiin FITG-konjugoitua fampaan antf-hiiri-igGttä (Sigma, 30 St. Louis) kakkosvaiheen reagenSsina.

Immunohistoiogiset värjäykset osoittivat, että monokionaaiinen vasta-aine 1B2 värjäsi HEV^kaftaiset laskimot voimakkaasti tulehtuneissa nivel-kaivoissa (Kuva TA), infiitroiiuvissa leukosyyteissä ei ilmennyt mitään värjäystä, kuten ei myöskään tulehtuneessa nivefstroomassa. Monoklonaaiisen vasta-35 aineen 1B2 tunnistama antigeeni nimettiin VAP-1 :ksi (engi. Vascular Adhesion 14

Protein-1). Perifeerisissä imusolmukkeissa ja nielurisassa mAb 182 reagoi lähes kaikkien HEVrien kanssa (Kuva IB). VAP-1 ilmentyi voimakkaasta endö-teelisolujen luminaalipuoleiia (Kuva 1C). Endoteeiisolujen sytoplasmassa näkyi granulaarista värjäytymistä ja myös kudoksenpuoleinen pinta oli mAh 1B2 po-5 sitiivinen, Erityisesti nielurisassa värjäysyoimakkuudessa esiintyi huomattavaa vaihtelua eri HEV:ien välillä, ja muutama pullistunut HEV oli 1 B2-negatiävinen (Kuva 1B). Umpilisäkkeessä ja suolen lamina propriassa esiintyi vain muutama heikosti värjäytyvä laskimo (Kuva 10). VAP-1 :n heikkoa ilmentymisiä oli myös nähtävissä itukeskusten dendriittisolujen kaltaisissa soluissa ja arterioiden, 10 laskimoiden ja suolenseinämän sileäiihassoiujen pinnalla. Toisaalta VAP-1 puuttui lähes kokonaan suurten suonten luminaalipuoleiia. Samoin kuin kudos-leikkeiden lymfosyytit, perifeeriset veren lymfosyytit, monosyytit, NK-solut, gra-nulosyytit ja nielurisasta eristetyt lymfosyytit olivat kaikki täysin 1 B2-negatiivisia FACS-analyyseissä. VAP-1 puuttui T-lymfoblastoidi- (CCRF-CEM), B-15 iymfobhastoidi(KCA, IBW-4), monosyytti- (U937) ja leukemia- (KG-1, KG-1a, K 562) soiulihjoista. Lisäksi VAP-1 puuttui ihmisen napanuorataskimon endotee-lisoluista (HUVEC) basaaiisesii; ja 4 h tai 20 h IL-1 (20,100 U/mi), TNF-p(200 U/mi) tai LPS (0.1 ,1.0 pg/mf) käsittely ei indusoinut sen synteesiä. Yksi endo-teetisoiulinja (EaHy-926) oli myös 1B2-negatiivinen. SileäSihassöiut, fibröblastit 20 ja keratinosyytit, jotka olivat oiieet primaariyiljelyssä ja yksi epitelöiidinen (He-La) solulinja eivät ilmentäneet VAP-1 :tä .

Esimerkki 2 VAP-1 :n solunsisäinen lokaiisaatio

Esimerkissä 1 kuvatun kudoslokaiisaatiokokeen lisäksi tutkittiin 25 myös VAP-1 :n soJujensisäistä lokaiisaatiota konfokaatisen mikroskopian avulla nielurisan paksuista leikkeistä (15 pm). Leikkeet inkuboitiin 15 min mAb:lia 1B2 tai 3G6, pestiin kaksi kertaa PBSillä ja peitettiin FiTC-konjugoidulla lampaan anti-hiiri-lg:l!ä 15 min. Tämän jälkeen näytteet peitettiin giyseroli-PBS-liuoksella käyttäen fenyleenidiamimia anti-fadeing tekijänä ennen konfokaaiimikrosko-30 pointia. Mikroskooppinen tutkimus osoitti selvästi, että VAP-1 esiintyy HEV:n luminaalipinnalla sekä erillisissä sytoplasman granuioissa. Näiden granuloiden identiteetti on toistaiseksi epäselvä, mutta kaksi-väri-immunofluoresenssivfrjäyksessä 1 B2-va$ta-aineella granulat eivät ko-lokalisoituneet. Täten VAP-1-positiiviset granulat eivät ote endoteeiisoiujen

Weibel-Palade bodeja, joiden tiedetään sisältävän endoteelisolun P-setekt|ini molekyyliä.

15

Esimerkki 3 VAP-1 molekyylipainon määritys

5 Lymfosyyttivapaat nielunsauutteet hajotettiin puskurissa (150 mM

NaCI, 10 mM Tris-base, 0.15 mM MgCh, 1% NP4Ö, 1 mM PMSF ja 1% apro-tiniinia) yli yön 4°C:ssa. Lysaatti sentrifugoitiin 10.000 g 4°C:ssa. Supernatantti esipuhdistetöin Sepharose CL-4B pylväässä (Pharmada, Ruotsi). Tämän jälkeen lysaatti ajettiin kolmen CNBr-aktivoidun sefaroosipylvään läpi (Sepharo-10 se~4B, Pharmacia), jotka olivat derivoitu joko hiiren normaaliseerumilla, irrelevantilla IgGi -vasta-aineella tai 182-vasta-aineella (5 mg/ml, 5 mi pylväs) Pylväät pestiin tarkoin hajoituspuskurilla. Tämän jälkeen 182-pylvääseen sitoutunut materiaali eluoitiin käyttäen 50 mM trietanoliamiinia, kylmäkulvattiin, liuotettiin ja ajettiin SDS-PAGE:en (7,5%, redusoitu) ja visualisoitiin hopeavärjäyksen 15 avulla.

Jodi värjäystä varten lymfosyyttivapaat nielunsauutteet digestoitiin RPMI 1640:ssa, sisältäen 100 U/ml kollagenaasia (Clostridium histolytjcum, tyyppi li, Sigma), 10% FCS, antibiootteja ja 10 mM Hepes 1 tunti 37°C:ssa varovasti hämmentäen. Kollagenaasikäsitteiyn jälkeen solut pestiin HBSSrilä ja 20 pintaleimattiin käyttäen 12SI ja laktoperoksidaasimenetelmää. Jodiieimatut solut lysoitiin puskurissa ja lysaatti esipuhdistettiin sentrifugoimalla lOOOOg 15 min. Lysaattia esipuhdistettiin lisäksi 16 tuntia 4°G:$sa CnBR-aktivoidulia hiiren normaaiiseerumiin kytketyllä Sepharose:!!a. Immunopresipitaatio suoritettiin käyttäen CnBR-aktivoituja 1B2 tai 306 päällystettyjä Sepharose 4B pallukoita. 25 Näytteet analysoitiin käyttäen 7.5% SDS-PAGE redusoivissa olosuhteissa (2- merkaptöetanoii).

VAP-1:n molekyyiipaino määritettiin nielurisasta käyttäen afRniteet-tieristettyä molekyyliä SDS-PAGEssa. Geelin hopeavärjäys osoitti pääasiallisen bändin, jonka molekyyiipaino oli 90 kD redusoiduissa olosuhteissa (Kuva 30 2). VAP-1 liikkui hieman hitaammin ei-redusoiduissa olosuhteissa (Mr 100 kD).

Jodivärjätyn nielurisakudoksen immunopresipitaattien analysointi varmisti 1B2-vasta-aineen reaktiivisuutta 90 kD:n molekyylin kanssa (sekä hieman pienemmän degrädaatiotuötteen kanssa (Kuva 2). Joissakin tapauksissa oli myös 180-200 kD:n bändi nähtävissä.

16

Esimerkki 4

Lymfosyyttien sitoutuminen nielurisaan, perifeeriseen imusolmukkeeseen (PLM), nivelkaivoon ja umpisuolilisäkkeen HEVriin sekä granuio-syyttien sitoutumien riieiurisa-HEV:iin 5 Tämän menetelmän yksityiskohdat on aikaisemmin julkaistu julkai sussa Jalkanen ja Butcher, Blood 66, 577 (1985). Lyhyesti kuvattuna juuri leikatut ihmisen nielurisan, niveikaivon, umpilisäkkeen ja perifeeristen imusolmukkeiden jääleikkeet inkuboitiin 1B2 tai 3G6 supernatanteiila 80 min 7°C:ssa varovasti pyörittäen. Lisättiin Ficoil-eristetyt lymfosyytit (3x106/ieike) tö HBSS:ssä, jossa oii 5% FCS ja 10 mM Hepes, ja jatkettiin inkubointia 30 min. inkuboinnin jälkeen kiinnittymättörnät solut kaadettiin varovasti pois ja kiinnittyneet solut fiksoitiin yli yön kylmässä PBS:ssä, jossa oli 1% glutaraldehydiä.

HEV:iin sitoutuneet solut laskettiin 4-6 leikkeestä kudosta ja näytettä kohden (vähintään 100 HEV) single blind-periaatteella. Granulosyyttejä määritettäessä 15 käytettiin vastaavaa menetelmää siiiä erolla, että granulpsyytit (eristetty käyttäen Histopaque 1119, Sigma) pidettiin Ca2*ja Mg2+ vapaassa HBSS:ssä kunnes siirrettiin leikkeille.

VAP-1 :n kudosdistribuutio endoteeiisoluissa in vivo osoitti, että proteiini saattaa toimia leukosyyttien spesifisenä tunnistuselementtinä. Siksi tutkit-20 tiin VAP-1:n toiminnallista rooiia HEV-sitoutumisessa käyttäen modifioitua Stamper-Woodruff in vitro -menetelmää (Jalkanen and Butcher, Blood 66, 577 (1985)). Jääleikkeiden esikäsitteiy 1 B2-vasta-aineella inhiboi lymfosyyttien sitoutumisen HEV:iin (Kuva 3), inhibitoorinen teho oli selvin nielurisassa ja perifeerisissä imusolmukkeissa, mutta myös sitoutuminen niveikaivon HEV:iin oli 25 huomattavasti pienempi. Vaikutus lymfosyyttien sitoutumiseen umpilisäkkeen HEV:iin ja granuiosyyttien sitoutuminen nielurisan HEV:iin oli vähäisempi (Kuva 3). Nämä tulokset osoittavat, että VAP-1 joko myötävaikuttaa tai liittyy läheisesti perifeeristen imusolmukkeiden, nielurisan ja niveikaivon HEV:ien lymfosyyttien tunnistamiseen vaikuttaviin endöteelisolujen tekijöihin. VAP-1 :n Jymfo-30 syyttiendoteetioluinteraktioon liittymisen suoraa evaluointia varten tutkittiin lymfosyyttien sitoutumista affiniteettipuhdistettuun VAP-1-proteiiniin (Kuva 4).

Lymfosyytit kiinnittyivät tehokkaasti kuoppiin sidottuun VAP-1 :een. Lymfosyyt- tien sitoutuminen VAP-1 :een inhiboitui spesifisesti 1B2~vasta-aineella, mutta ei 3G6 kontrollivasta-aineella. Monokionaaiinen vasta-aine 182 ei ehkäissyt fym-35 fosyyttien sitoutumista toiseen ei-relevanttiin endoteelisoiumolekyyfiin (Kuva 4).

i 17

Kudosdistribuutio ja HEV-sitoutuminen osoittaa, että VAP-1 pääasiallisesti liittyy lymfosyyttien kulkeutumiseen perifeerisiin imusolmukkeisiin, nielurisaan ja nivelkalvoon. Mielenkiintoista on, että nielurisassa VAP-1-ilmeniymisen puute määrittelee pienen postkapiilaarilaskimopopulaation, joka 5 morfologisti ei eroa 1 B2-pos|tiivisista. Koska nielurisa on tiiviisti yhteydessä suolistoon siinä voi esiintyä sekä iirnakafvotyyppisiä (VAP-1-negatiivinen), että perifeeristen imusolmukkeiden (VAP-1-positiivinen) HEVrejä. On vielä määritettävä miten VAP-1 -ilmentymisen fenotyyppiset erot korreloivat yksittäisten HEVien lymfosyyttien sitoutumiskapasiteettlin. Pienet VAP-1 määrät limakal-10 vojen lymfaatiisissa elimissä viittaavat siihen, että tämä endoteeiiantigeeni voi olla differentioidun regufoinnin alaisuudessa erilaisissa iymfosyyttien tunnistus-systeemeissä. Lisäksi tulehduksen taso korreloi VAP-1 :n ilmentymiseen in vivo.

Esimerkki 5 15 1 B2*n vaikutus solujen sitoutumiseen VAP-1 -proteiiniin VAP-1 ja 1E12 affiniteettf puhdistettiin nielurisauutteista kuten Esimerkissä 2 kuvattiin. Puhdistettu VAP-1, 1E12 ja kuumuudella inaktivoitu BSA laimennettiin 20 mM Tris-HCi, pH 7.4, 150 mM NaCI, 2 mM MgCI2) 2mM CaCi2 sisältäen 0.01% β-oktyyiiglykopryanosiidiä detergenttinä. Proteiini absorboitiin 20 lasikuoppiin (Lab-Tek kuoppalevyt, Nunc) 16 h +4°C:ssa. Blokattiin PBS:liä, jossa oli 1 mg/mi BSA 30 min huoneenlämmössä, jonka jälkeen kuoppiin lisättiin 1B2 tai 3G6 supernatantit ja inkuboitiin vielä 30 min huoneenlämmössä. Lisäksi inkuboitiin juuri eristettyjä perifeerisien veren mononukieaaräsoluja RPMl 164ö:ssä, jossa oii 10% FCS ja 10 mM Hepes, 1 tunti 37°G;ssa kudosviljeiy-25 pulloissa monosyyttien poistamiseksi. Kiinnittymättömät lymfosyytit (1.8x106 soiua/kuoppa) 100 pf RPMl 1640:858, lisättiin jokaiseen kuoppaan. Inkuboitiin 30 min 37eC;ssa, jonka jälkeen kiinnittymättömät solut kaadettiin pois. Kuoppien kannet poistettiin ja levyt pestiin hienossa RBS-virrassa, fiksattiin kylmässä PBS:ssa, jossa oli 1% glutaraidehydiä. Tämän jälkeen solut värjättiin käyttäen 30 Diff-Quick väriä. Kiinnittyneet solut kvantitoitiin visuaalisesti laskemalla solu-määrä jokaisessa kuopassa (koko pinta-ala 50 mm2/näyte).

i 18

Esimerkki 6 VAP-1 -proteiinin osittainen aminohapposekvenssi Määritettiin 90 kD:n VAP-1-antigeenin osittainen aminohapposekvenssi. Tämä osittainen aminohapposekvenssi on 20 aminohapon pituinen: 5 TEDGDMXLVNGASANEGXVE [SEG iD NO. :1:]. Proteiini- ja DNA* sekvenssien tietopankeista suoritettu haku osoitti, ettei tämä sekvenssi kuulu mihinkään aikaisemmin tunnettuun sekvenssiin.

Esimerkki 7 VAP-1 määritys tulehdusvastetta osoittavista kliinisistä näytteistä 10 Tuoreet näytteet normaalista nielurisasta, perifeerisistä imusolmuk keista, suolistosta ja sydämistä saatiin leikkauksista ja munuaisnäytteet saatiin eiiniuovuttajilta. Muut kudokset ovat peräisin koepalanäytteisfcä. Kaikki näytteet määritettiin histopatologisesti ei-tulehtuneiksi. Tulehdusnäytteet saatiin kroonisesta dermatoosisfa kärsivien potilaiden ihobiopsioista (psoriasis, atooppinen 15 ihottuma, lichen ruber pianus). Samoista potilaista otettiin kontroilibiopsiat makroskooppisesti terveiksi määritellyiltä alueilta. Suoliston tulehdusnäytteet saatiin tulehduksellista suolistotautia potevista potilaista (Crohnin tauti, ulsera-tiivinen koliitti), joille tehtiin terapeuttinen leikkaus. Nivelkaivonäytteet olivat peräisin synovektomioista.

20 Näytteet väsättiin immunoperoksidaasiila kuten Esimerkissä 1 ku vattiin. Lyhyesti kuvattuna asetonifiksoidut jääleikkeet inkuboitäin primaarivasta-aineella (viljelysupematantilia tai 50 pg/ml puhdistettua immunogiobuiiinia) ja sopivalla peroksidaasikonjugoidulia toisen vaiheen reagenssilla ja värireaktio aikaansaatiin käyttäen H2O2 ja diamiinobentsidiiniä substraattina. VAP-1-25 ilmentyminen suoli- ja ihonäytteissä (normaali ja tulehtunut) analysoitiin koodatuista näytteistä kahden itsenäisen tutkijan voimin tuntematta diagnoosia.

Kuten Esimerkissä 1 todettiin, VAP-1 ilmentyy vain matalalla tasolla joissakin normaalin ei-tulehtuneen suolen laskimoissa (Kuva 5A). Toisaalta tulehduksellista suolistotautia potevan potilaan suolistonäytteessä esiintyi huo-30 mättävää VAP-1-ilmentymisen nousua (Kuvat 5B ja 5C sekä Taulukko 1). VAP-1 indusoitui sekä lamina proprian ohutseinäisissä laskimoissa ja organisoidun lymfaattisen follikkelin (Peyer's patches) HEV-kaltaisissa laskimoissa. VAP-1: n lisääntynyt synteesi korreloitui myös ihon krooniseen tulehdukseen (Kuvat 6Ä ja B). Tuloksiin vaikuttavien yksilöllisten erojen poissulkemiseksi 35 otettiin samanaikaisesti näytteet saman potilaan dermatoosileesiosta sekä 19 kontrollinäyte terveestä ihosta. Myös näissä näytteissä VAP-1-positiivisien laskimoiden määrä ylemmässä dermiksessä oli korkeampi tulehdusnäytteessä kuin vastaavassa kontrollialueelta otetussa näytteessä. Lisäksi VAP-1 -positiivisiin laskimoihin liittyi aina huomattava penvaskulaarinen leukosyytti-5 infiitraatio.

2d

Taulukko 1 VAP-1 induktio tuiehdukseliisissa suolistotaudeissa Näyte n VAP-1 - + 4-+ +++ ++++

Normaali 9 0 5 3 1 0 C röhit 7 0 0 2 3 2

Ulserat, koi. 7 - 0 0 0 5 2

Suoli-näytteet otettiin orohnin tautia, ulseratiivista koliittia ja tuumoreita sairas-5 tavista leikkauspotilaista (tuumorinäytteiden normaalialueet edustavat "normaali" näytteitä).

VAP-1-positiivisten laskimoiden määrä per näyte määritettiin , ++++ kuten yllä kuvattiin.

Esimerkki 8 10 VAP-1 vaikuttaa tulehtuneen limakalvon siioutumisreaktioon

In vitro sitoutumistesti jääleikkeillä suoritettiin kuten Esimerkissä 3 kuvattiin, Monoklonaaitnen vasta-aine 1B2 inhiboi lymfosyyttien sitoutumista lamina proprian pieniin suoniin noin 60% (Kuva 7) kahdessa suolistonäyttees-sä Joissa VAP-1 ilmentyminen ohi huomattavaa.

15 Koska keksintöä on tässä kuvattu spesifisten käyttöesimerkkien avulta on ymmärrettävä, että sitä voidaan edelleen modifioida ja tämä hakemus on tarkoitettu kattamaan mitä tahansa keksintöön kohdistuvaa variaatiota, käyttöä tai adaptaatiota, jotka noudattavat keksinnön mukaista periaatetta kattaen myös seilaisia esillä olevasta kuvauksesta poikkeavia käyttöjä, jotka kuu-20 luvan keksinnön kohteena olevan alan tunnettuun tai tavanomaiseen käyttöön ja joita voidaan soveltaa yllä kuvattuihin olennaisiin ominaisuuksiin liitteessä olevien vaatimusten mukaisessa laajuudessa.

21

SekvenssiHstaus (1) YLEISET TIEDOT: (i) HAKUA: (A): NIMI: Jalkanen, Sirpa (8): KATU: Rauvolantie 79 (C): KAUPUNKI: Piispanristi

(E) : MAA: SUOMI

(F) : POSTINUMERO: FI-2Ö76Q

(i) HAKIJA: (A): NIMI: Salmi, Marko (8): KATU: Keilonsoittajankatu 8a A13 (C): KAUPUNKI: Turku

(E) : MAA: SUOMI

(F) : POSTINUMERO: FI-2050G

(ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Lymfosyyttien sitoutumiseen vaikuttava ihmisen endotee-lisolun molekyyli (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 1 (iv) KIRJEENVAIHTO-OSOITE: (A) VASTAANOTTAJA: Biotie Therapies Oy] (B) KATU: Tykistökatu 6 (C) KAUPUNKI: Turku

(E) MAA: SUOMI

(F) POSTINUMERO: FI-20520 (v) KÖNEKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke (B) TIETOKONE: Fujitsu Siemens (C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: M/S Office 22 (D) OHJELMISTO: Microsoft Word (vi) NYKYISEN HAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: 945784 (B) JÄTTÖPÄiVÄMÄÄRÄ: 9.6.1993 (2) SEKVENSSIN NRO 1 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 20 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUQSTEISUUS: molempia (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI

NRO 1:

Thr Glu Asp Gly Asp Met Xaa Leu Vai Asn Gly Ala Ser 1 5 10

Ala Asn Ghu Gly Xaa Vai Glu 15 20 :

Claims (11)

23

1. Olennaisesti puhdistettu ja eristetty ihmisen endoteelinen suonen adheesioproteiini, VAP-1, t u n n e 11 u siitä, että kyseinen VAP-1 on tunnistet- 5 tavissa monoklonaalisen vasta-aineen avuiia, joka vasta-aine on tuotettu tai-lennusnumeroila DSM AGO 2041 varustetun hybridornasoluiinjan avulla.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen VÄP-1, tunnettu siitä, että kyseinen VAP-1 on molekyylipainoitaan 90 kDa.

3. Patenttivaatimusten 1 - 2 mukainen VAP-1, t u n n e tiu siitä, et-10 tä kyseinen VAP-1 sitoutuu iymfosyytteihin.

4. Patenttivaatimusten 1 ~ 3 mukainen VAP-1, t u n n ett u siitä, että kyseinen VAP-1 on tuotettu sitomalla kyseinen VAP-1 anti-VAP-1 vasta-aineeseen.

5. Hybridomasolulinja, t u n net t u siitä, että se tuottaa anti-VAP-1 15 vasta-ainetta ja että sille on annettu tallennusnumero DSM ACC2041.

6. Menetelmä valmistaa anti-VAP-1 -vasta-ainetta tai sen anti-VAP-1 -sitovaa fragmenttia, joka vasta-aine tai sitova fragmentti tunnistaa spesifisesti minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukaista ihmisen endoteeli-VAP-1 -proteiinia ja joka vasta-aine tai sitova fragmentti ei sitoudu ihmisen na- 20 panuoraiaskimosofun (HUVEG) pintaproteiineihin, tu n n ettu siitä, että menetelmä käsittää vasta-aineen tai sitovan fragmentin tuottamisen joko hybrido-masoiulinjassa tai vasta-aineen tai sitovan fragmentin DNA:lla kloonatussa solussa.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä tunnettu siitä, 25 että menetelmässä tuotetaan suonen adheesioproteiinia VAP-1 spesifisesti tunnistava monoklonaaiinen vasta-aine 1B2.

8. Menetelmä anti-VAP-1 -vasta-ainetta tai sen anti-VAP-1 -sitovaa fragmenttia sisältävän soluvapaan komposition valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukaisen menetelmän sekä 30 solujen poistamisen.

9. Menetelmä anti-VAP-1 -vasta-ainetta tai sen anti-VAP-1 -sitovaa fragmenttia sisältävän farmaseuttisen komposition valmistamiseksi, tunne t -t u siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukaisen menetelmän sekä komposition formuloimisen injisoitavaan muotoon.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, t u n n e itu siitä, että kompositio formuloidaan yksikköannosmuotoon. 24

11. Menetelmä estää VAP-1 välitteistä endoteeiisölujen sitoutumista lymfosyyiteihin, t u n n e 11 u siitä, että VAP-1 välitteinen lymfosyytti-endoteeJi-solu-adheesioreakiio estetään in vitro antamalla patenttivaatimuksen 6, 8 tai 9 mukaisesti valmistettua VAP-1 :tä sitovaa yhdistettä riittävänä määränä endo-5 teelisoiujen kyseiseen reaktioon osallistuvien VAP-1-sitoutumiskohtien biok-kaamiseksi. 25