JPH06508991A - リンパ細胞に結合した表面タンパク質に対するモノクローナル抗体 - Google Patents
リンパ細胞に結合した表面タンパク質に対するモノクローナル抗体Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
リンパ細胞に結合した表面タンパク質に対するモノクローナル抗体
本発明は、ヒトリンパ球に結合した表面タンパク質に関する。更に、この発明は
特に、ハイブリドーマセルライン及び、例えばLAM−1の発現を減少させてい
るT及びB細胞を識別することによって、免疫学的な疾患症候群による病気を検
出するために有効なハイブリドーマセルラインによって産生されるモノクローナ
ル抗体に関する。
従来技術
遺伝子は、一般に1個のセルラインによって発現するが、これとは別にしばしば
その細胞集団の機能を制限する。機能的に独立した領域の組合せによる遺伝子の
発生は、新しい遺伝子が新しい機能を有するタンパク質を暗号化して進化したと
きにしばしば起こる。誘発的な内皮白血球接合分子(ELAM−1)は、サイト
カインか存在する内皮白血球接合細胞の表面に発現する。この分子は、血管に対
し細胞の付着を媒介することによって炎症部位における血液中の白血球を増大さ
せる可能性があることを示唆している( Bevilaqua et al、
、 proc、 Natl、 Acad、 Sci、USA 84:9238(
1987) )。
血小板及びGMP−140と呼ばれる内皮細胞中で明らかにされている顆粒膜タ
ンパク質は、クローン化されており、またELAM−1と相同である(John
son e t al、、Blood 5upp1.71:327a (198
8))。
課題を解決するための手段
本発明は、一般に動物レクチン、成長因子及びC,/C,結合タパク質の結合領
域を有する相同の領域を含有する白血球付着細胞表面タンパク質LAM−1を暗
号化するヒトcDNA塩基配列を特徴としている。LAM−1タンパク質は、c
DNA塩基配列又はLAM−1である免疫遺伝性フラグメントによって暗号化
されている。
好ましい具体例としては、cDNA塩基配列かヒト扁桃腺CDNAライブラリー
からB細胞の特定のcDNAの集団として分離され、またそのタンパク質のアミ
ノ酸配列は、実質的に図2に示され、より好ましくは図2に示されるように相同
の塩基配列を80%存し、最も好ましくは相同の塩基配列を90%存する。(こ
こで、“実質的に示される”とは、同等の機能を有する表示された塩基配列に足
る塩基配列を意味する。
別の観点において、この発明は、機能的な分子を生ずるリンパ球結合細胞表面タ
ンパク質LAM−1やそのフラグメントに対し発現する抗体、或いは特にLAM
−1が結合している分子やそのフラグメントに対して発現する抗体を特徴として
いる。
別の局面において、本発明は上述した抗体と細胞集団との反応や抗体を結合して
いる細胞集団を分離するLAM−1で発現されている細胞を識別する方法を特徴
としている。また、抗体の結合は、LAM−1の受容体反応性を遮断するために
使用することかできる。
別の局面において、本発明は、毒性のない薬学上の媒介体物質であるLAM−1
に対する治療を含む白血球移動状態から受けるヒト患者を治療する方法を特徴と
する。この方法の好ましい具体例において、この患者は組織損傷、自己免疫疾患
、又は癌から苦痛を被り、或いはこの患者は、内蔵又は組織移植が可能となる。
別の局面において、本発明は、LAM−1に結合したり、又は機能的な分子を生
ずるために、特にLAM−1に結合した分子に結合するであろうリガンドを識別
するためにLAM−1を使用することを特徴とする。
この明細書中で使用されているように、相手(antagoist)の用語は、
LAM−1と相互に作用したり、LAM−1の機能を妨げたりする幾つかの因子
を含むものとする。例えば、LAM−1に対し反応性を有する抗体又はLAM−
1に結合する幾つかのりガントなとである。
リンパ球結合細胞表面タンパク質LAM−1は、従来、識別されていない単一な
受容体タンパク質である。LAM−1は、いくつかの異なる受容体中で明らかに
されている相同の領域を含み、また細胞粘着において密接な関係があるタンパク
質であるELAM−1及びGMP−40を含む遺伝子集合体である新規な組織体
部分である。最も望ましいLAM−1は同様な機能を与えるが、リンパ球によっ
て唯一発現される。LAM−1を暗号化しているcDNAを分離することで、こ
の分子の構造が決定される。このcDNAは、この遺伝子を発現しない細胞に対
しLAM−1を発現させるために使用されている。
LAM−1に対して反応性のある抗体はこの受容体を発現する細胞を識別したり
、その機能を遮断したりするために使用することができる。加えて、cDNAタ
ンパク質物質は、リンパ球の粘着や機能を妨げる相手リガンドを発現させるため
に使用することかでき、これによって組織の損傷や癌細胞の転移のような状態を
治療するために使用することかできる。
本発明の他の特徴や利点は、次に詳述する好ましい実施例や特許請求の範囲から
明らかになるであろう。
図面において、図IA及びIBは、LAM−1cDNAクローンの構造を示す。
図2は、LAM−1の決定されたc DNA核酸塩酸塩塩基配列推定されるアミ
ノ酸配列を示す。図3A、3B及び3Cは、LAM−1の相同性や池のタンパク
質を示す。
B細胞の特定のcDNAは、B細胞(RAJ I)RNA又はT細胞(H3B−
2)RNAのいずれかに由来するラベルされたcDNAを用いて特異的なハイブ
リダイゼーション法によってヒト扁桃腺CDNAライブラリー(ATCCno、
37546)から分離した(Tedder et al、 、 Proc、 N
cad、 Sci、 USA、 85:208−212(1988))。陽性の
血小板か分離され、そしてクローン化され、次いでcDNAかプラスミドp s
p 65 (Promega、Madis。
n、WI)に挿入されて継代クローンされた。核酸塩塩基配列は、マクサム−ギ
ルバート法(Meth、 Enzymol、 、 65:499(1980))
を用いて決定された。1のギャブペナルティは、ギャブ若しくは削除か生じてい
る核酸塩又は塩基配列中のアミノ酸を対応する分析によって測定した。
261RAJI+H5’B2−cDNAクローンの1個か分離され、1.90K
bcDNAを含有するB125を挿入していくつかのBセルライン(Tedde
r et al、、 s upra)で明らかにされている2、4KbRNAを
用いてハイブリダイズした。
しかしながら、B125は、池のRAJI+H3B2−クローンの幾つかと、或
いは幾つかのTセルラインに由来するm−RNAとハイブリダイズしなかった。
B125cDNAクローンは、制限地図及び核酸塩塩基配列の決定によって構造
ずけられた。B125でハイブリダイズされた2、3KbcDNA(near−
full−1ength)が分離され、塩基配列化され、そしてI)LAM−1
と命名された。
図IAに示されるように、制限地図は、pLAM−1の標準的な一重、二重、三
重切断によって構成されていた。推定されている暗号化する部分を黒色で示す。
矢印は指令及び決定された該酸塩塩基配列の範囲を示し、オーブン環状は5′末
端ラベルを示す。図IBに、LAM−1mRNAの構造の概略図を示す。細い線
は、5′及び3′翻訳されない塩基配列(UT)を示す。厚い棒状は翻訳されて
いる部分を示す。ボックス部分は、レクチン、表皮性の成長因子(EGF)I域
及び2個の短い一致した繰り返しく5CR)単位を表す。オープンボックスは推
定されている膜内外(TM)領域を示す。リンパ球様及び非リンパ球様領域のセ
ルラインによってLAM−1mRNAの発現が検査される。ノーザンプロット分
析によって、BセルラインRAJ I、SB、Laz−509及びGK−5から
分離されたポリ(A)十における2、6KbRNA種に強くハイブリダイスI、
f:LAM −1、!−1,7K b RNAfll:W< バー(ブリダイス
したLAM−1とが検出された。
しかしながら、2個の前Bセルライン(Na1m−6及びPB−697)、3個
のBセルライン(Namalwa 、 Daudi 、 andBJAB) 、
骨髄性単球セルライン(LPSで培養されたU937及びU937)及び赤血白
血球(K−562)セルラインから分離されたRNAは、LAM−1とハイブリ
ダイズしなかった。このことは、この遺伝子の発現が選択的にBリンパ球に結合
していることを示唆している。
B]25cDNAクローンは、図2に示されるように、372アミノ酸のタンパ
ク質を暗号化することのできる1、181bpオーブンリーデイングフレイムを
含んでいた。上述したアミノ酸配列に示される総数はアミノ酸残基位置を示す。
右側の総数は核酸塩残基位置を示す。アミノ酸は、単一の文字コードによって示
され、*はターミネーションコドンを示す。ボックス化された塩基配列は、N−
結合グリコシレーション部位を識別することを可能にする。単−及び膜内外のペ
プチドと識別することができる疎水性領域に下線を引いてお(。縦の矢状は、成
熟したタンパク質のアミノ酸末端の最も考えられる部位を示す (See va
n )Ieijne、Nucleic Ac1d Res、、14:4683
(1986))。
LAM−1のアミノ酸配列は、膜糖タンパク質の定型の構造を予測させた。可能
な翻訳開始部位は核酸塩部位53及び92において明らかにされている。
第2番目の開始部位は、最適な開始のための一致した塩基配列(A/G) CC
AUG (Kozak 5Cell:44283−293(1986) )に最
も良く適合し、単一ペプチドを示すことができる27アミノ酸の疎水性領域に続
いている。ヘイジュネのアルゴリズム(The algorithm of v
on He1jne )によれば、成熟したタンパク質の最も可能性のあるアミ
ノ末端は、アミノ酸部位52におけるTrpであろう。
LAM−1塩基配列は、膜内外領域であることのできるアミノ酸346−368
間に第2番目の疎水性領域を含む。推定される天然のLAM−1タンパク質は、
7位にNリンクされた炭水化物付着部位を有する約294アミノ酸の細胞外の領
域を有するであろう。LAM−1は、8塩基及び1酸残基を存するI7アミノ酸
の細胞質屋を有するであろう。2個の細胞質残基は、タンパク質キナーゼC燐酸
化残基がいくつかの塩基残基のカルボキシル末端部位であるまで、燐酸反応の基
質として作用することができる。これらの結果は、処理されたLAM−1タンパ
ク質がこのレセプターを正常に発現するセルラインから、或いは転写されたセル
ラインから、抗体又はリガンドを有するアヒイニティー力うムクロマトグラヒイ
ーなどの慣用手段によって分離することかできることを示唆している。
また、このタンパク質はLAM−1cDNAのin vitroにおける翻訳に
よって合成することができる。
LAM−1は、動物レクチン、成長因子及びC,/C,結合タンパク質である3
個の性質の異なる集団において明らかにされている予め関連していない領域と結
合する。LAM−1の提案された細胞外領域は図IBに示されるように、一般的
な構造を有するCys残基(7%)と高い数値を含有していた。図3に示される
ように、相同のタンパク質部分は、それぞれ末端にアミノ酸残基数を有すること
が示されている。相同の酸はボックスに示される。ギャップ(−)は相同性を増
加させる塩基配列中に挿入されている。タンパク質の最初157アミノ酸(図3
A)はIgEに対する低いアフィニティーレセプター(Ki kutani e
t a 1.ce1147:657(1986)) 、アシアログリコプロティ
ンレセプター(Spiess et al、、Proc、Natl、Acad、
Sci、USA 82:6465(1985))及び幾つかの他の炭水化物結合
タンパク質(prickamer et al、、J、Exp、Med、167
:1034(1988) ;にrusius et al、 、 J、 B i
。
1、chem、262:13120−12125(1987): and Ta
kahasi et al、、J、Bi。
1、chem、 260 :12228 (1985))を有する同類族である
。
すへての動物レクチン炭水化物認識領域間で保持されているアミノ酸を(*)で
示す。塩基配列の相同性が少なくとも30%であるけれども、動物レクチン炭水
化物認識領域において明らかにされているすへての不変残基か保持されている(
Drickamer、J、Biol、chem、263 :9557 (198
8) )。
36アミノ酸(図3B)の次の領域は、表面成長因子(EGF) (Grego
ry 5Nature 257:325(1975)) 、ファクターIXに基
づ<EGF様繰り返し単位(Yoshitake er al、Biochem
、25:3736 (1985))及びヒブロプラスト プロテオグリカン コ
アツこれらのドメインの直後に、各々か、IL−2レセプター(Leonard
等、nature311:626 (1984))、X1ll因子(Ichin
ose等、Biochem、 25 : 4633 (1986) )および多
くのC3/C4結合タンパク質(Kl 1ckstein等、J、 Exp、
Med、I65:1095 (1987)およびMorley等、EMBOJ、
3:153 (1984))を含む短い一致くり返し単位(SCR)と相同であ
る2つの62のアミノ酸(図3C)のタンデムドメインか続いた。4つの保存さ
れたCys残基を含むより前に記載されだすへてのSCRと対照的に、これら2
つのSCRは6個のCys残基を有した。すべてのSCRにおいて見出される4
つの保存されたCys残基を[3Cにおいてじ)により示し、LAM−1におい
て見出される付加的な保存されたCysを(+)により示す。これらのタンパク
質の各々に存在する多数のSCRの中て、LAM−1に最も相同であるSCRを
図示する。I5のアミノ酸スペーサーが、推定のトランスメンブランドメインに
先行した。
推論されたLAM−1のアミノ酸配列は、ELAM−1およびGMP−140の
ものと相同である。従って、これら2つのタンパク質およびLAM−1は、種々
の細胞リネージにより発現され、細胞の相互作用におけるレセプターとして作用
しつる新規な族の相同構造を構成する。
使用
リンパ球の組織損傷または損害または組織移植の領域への移動および浸入が病状
を発生または増加させることができるため、これらの過程を妨害する薬剤を抗原
として用いて、このタンパク質に対する抗体を生成し、リンパ球の付着および機
能を妨害するアンタゴニストリガンドを発生させることができる。これらの薬剤
の研究における使用により、LAM−fの3次元構造か決定され、このリンパ球
機能における役割が明らかにされる。これらの薬剤の患者への投与を用いて、病
状をX断するがまたは減少させることができる。例として、この抗原を発現する
悪性細胞の副次集団により、レセプターが腫瘍細胞の転移において機能すること
ができる。レセプター機能を遮断するために開発された薬剤は、悪性細胞の転移
および回帰を阻害するこ本発明は、ヒト白血球付着分子−1(LAM−1)に対
するモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞系〔以前は、リンパ球関
連細胞表面タンパク質と呼称されていた〕およびこの細胞系により生成した抗体
に関する。本発明は特に、減少したLAM−1発現を有する細胞、例えばTおよ
びB細胞を識別することによりエイズを識別し、治療するのに有用である細胞系
により形成した細胞系およびモノクローナル抗体に関する。好中球または、活性
化に続<LAM−1発現を下方に調節することかできる。従って、LAM−1は
、好中球を識別する有用なマーカーであることができる〔6〕。例えば、抗体は
、白血球の炎症または組織損傷の部位への進入を遮断し、白血球により媒介され
た腎臓または他の器官移植拒絶反応を防止するのに有用である。
従来技術
本出願人の係属中の出願通番第07/313,109号明細書には、以下で白血
球付着分子−1(LAM−1)を再指定され、(redes i gned)動
物レクチン、成長因子およびC3/C4結合タンパク質並びにcDNA配列によ
りコードされたLAM=1タンパク質の結合ドメインと相同であるドメインを存
するリンパ球関連細胞表面タンパク質LAM−1をコードするヒトcDNA配列
が記載されている。LAM−1に対するアンタゴニストは、治療量のアンタゴニ
ストを無毒性の薬の担体と共に投与することを含む、リンパ球可動状態で苦しむ
ヒト患者の治療方法において用いられた。
通常の白血球は、循環から離れ、内皮細胞の上の細胞表面レセプターとリガンド
との間の相互作用により特定のリンパ器官または炎症部位中に局在する能力を有
する〔参照1〜3、グロソサリー参照〕。白血球−付着分子−1(LAM−1)
は、周辺LN(リンパ節)の高内皮細静脈(HEV)および活性化された内皮に
おいて発現された特定の複合糖質と相互作用する〔3〜5〕。LAM−1は、ヒ
ト周辺リンパ球、好中球、好酸球、単球および造血前駆細胞により発現される〔
5〜8〕。LAN(−1は、循環するリンパ球および記憶T細胞の大部分により
発現されるが、分裂促進剤刺激の数日後に失われる(5. 9゜10)。対照的
に、LAM−1は、リンパ球および好中球のPMAへの露出から数分以内に細胞
表面から発生する(5. 6゜11〕。リンパ球および好中球は共に単一のLA
M−1タンパク質生成物を発現するか、リンパ球における細胞表面の分子量(M
r)は74.000であり、好中球のものは90.000〜100.000であ
る[6.9,123゜
いくつかの腫瘍細胞の毛細血管内皮への特異的付着および器官特異性転移の存在
により、腫瘍細胞と通常の組織との間の相互作用か腫瘍の局在に影響することが
示唆される〔13〜15〕。悪性細胞においてこれらの事項を媒介する分子は完
全には記載されていないか、通常の白血球の付着および移動に含まれる多くの細
胞表面分子は、造血悪性細胞の散布中に含まれる〔1〜3〕。mLHRはリンパ
腫の散布中に含まれ(14〜16〕、ヒト悪性リンポプラストイド(lymph
oblastoid)細胞系におけるカルシウム依存性ホスホマンノシル結合部
位は、周辺LNREV結合を媒介する〔17〕。ここに記載した発明において、
LAM−1発現の構造、機能および調節を、通常のリンパ球において試験し、悪
性白血球のLAM−1と比較した。
LAM−1分子は、C3/C4結合タンパク質において見出されるものと同様に
、表皮の成長因子状ドメインおよび短い一致くり返し単位が続くアミノ末端にお
いてレクチン状ドメインを富む新規な細胞付着/回帰分子の族の要素である。J
、 Lixp。
Med、、170 :123〜133 (1989)(4)および係属中の出願
通番第07/313,109号明細書において、T、 F、 Tedder等は
、新規な細胞表面分子LAM−1をコードするCDNAの単離および染色体局在
を報告している。Eur、 J、 [mmunol、、20 :1351−13
55 (1990)において、T、 F、 Tedder等は、ヒト抗原特異性
記憶子細胞は、リンパ球再循環に必要であるLAM−1を発現することを報告し
た。J、 Biol。
gical Chemistry、265 : 7760−7677 (199
0)において、Ord等(T、F、 Tedderの援助の下で)は、リンパ球
および好中球をコードする遺伝子の構造を報告した。J、 [mmunolog
y、144 : 532−542 (1990)(5)において、T。
1”、 Tedder等は、LAM−1と反応する2つのモノクローナル抗体、
LAMI−1およびLAMI−2を記載した。〔注:ここで用いるLAM−1は
、白血球付着分子−1自体を示し、「LAMI−XJは、LAM−1のエピトー
プに結合する抗体Xを示す。〕
モノクローナル抗体LAMI−1およびLAMI−2は、血液リンパ球、NK(
ナチュラルキラー)細胞、好中球、単球および造血前駆細胞と反応性を存するこ
とが見出された。LAM−1の結合は、後にLAM−1が細胞表面から損失する
、白血球のリンパ器官または急性炎症の部位への濡出の過程に関与する。LAM
−1または、以前に識別されたTQIおよびLeu−8モノクローナル抗体によ
り認識される。
CD2、CD18、CD11aまたはCD1lbの発現の付随的す増加を伴う、
インビボでの白血球活性化後のLAM−1発現の損失により、移動および内皮細
胞表面を認識する能力が顕著かつ驚異的に増大する。エイズの患者は、彼等のT
およびB細胞の発現か消失したという事実は、顕著である。これはまた、池の免
疫学的症候群において発生する。従って、好中球によるLAM−1発現の変化は
、mLHRが急性炎症の部位への好中球の移動に関するため、顕著である。他の
セレクチンおよびレセプターと結合したLAM−1は、はとんどの白血球の漏出
に関連する。従って、種々の白血球副次集団によるLAM−1の発現は、局所的
な免疫応答の特性および重要性における重要な役割を有する〔5〕。
本発明は、LAM−1に対する新規な抗体の製造に関する。
新規なモノクローナル抗体、抗LAMI−3は、LAM−1の検出に対する放射
性同位体または免疫蛍光アッセイに有用である。例えば、LAM−1を存するか
有しない種の識別である。
さらに、抗体は、LAM−1を発現しない細胞からLAM−1を発現する細胞を
分離するかまたはその逆に有用である。さらに、このモノクローナル抗体はまた
HEVまたは内皮への白血球結合を完全に遮断する。
好中球媒介炎症は、大人の呼吸障害症候群、多器官障害およびリバーフュージョ
ン損傷(reperfusion 1njury)を含む多くのヒト臨床明示に
含まれる。この型の炎症反応を阻害する1つの方法は、炎症領域に隣接した好中
球と内皮との間の付着作用を完全に遮断することである。抗LAMI−3は多く
の種においてLAM−1と反応するが、mLHRとは結合しない。抗LAMI−
3はリンパ節へのリンパ球トラフィックおよび好中球の血液から炎症部位への濡
出を完全に停止させる。可溶性形態の抗LAMI−3の投与は、好中球媒介炎症
の阻害に臨床的に作動である。抗LAMI−3はまた、ヒトREVおよび活性内
皮への付着を遮断する。従って、抗LAM1−3を用いることにより、炎症また
は組織損傷の部位へのリンパ球の進入が遮断される。このような活性は、リンパ
球により媒介された腎臓または他の器官の移植拒絶反応を防止するのに有用であ
る。
キメラ化されたモノクローナル抗体をマウス抗体から製造することもまた本発明
の範囲内である。抗体は、Yの幹および腕を画成する2つの長い[ヘビーJ鎖並
びに腕の外側に結合した2つの短い「ライト」鎖から成るY型の分子である。抗
体分子の腕のアミノ末端は、抗体の可変部を含む。可変部は、特定の抗原に特異
的である。分子の幹は、カルボキシル基(COO−)で終了する「定常」部であ
り、同一の種における同一の同基準標本の抗体において分子から分子へ維持され
る。
マウス抗体の定常部は、マウスモノクローナル抗体に対する一次源ヒト免疫反応
であると見出された。標準の遺伝子工学法を用いて、マウス可変部は、ヒト定常
部と融合して、「キメラの」 (ライオンの頭、ヤギの体およびヘビの尾を有す
るギリシャ神話の怪物であるキメラまたはギンザメに由来する)抗体を生じる。
従って、これらのキメラの抗体は種々の遺伝子起源の領域を有し、アレルギー反
応を起こす傾向か比較的低いことか見出された。
発明の開示
N5−1骨髄腫細胞と、マウスから得られた牌繊細胞とを融合させることにより
形成したハイプリドーマ細胞系をLAM−1cDNA)−ランスフエフl−30
0,19細胞(マウス前B細胞系)により免疫処置した。ハイブリドーマ細胞系
は、ヒト、サル、ウシ、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ブタおよびヤギ白血球付
着分子−1,LAM−1と反応性を有するモノクローナル抗体を形成する。抗L
AMI−3として識別された、本発明の細胞系により形成したモノクローナル抗
体は、白血球の炎症または組織損傷の部位への進入を遮断するのに臨床的に有用
図4は、後のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による
、抗LAMI抗体を有する細胞表面から発生したLAM−1の免疫沈降または非
反応性同基準標本調和抗体を有する対照の免疫沈降を示す:
図5は、種々の形態の造血悪性を有する患者からのLAM−1陽性である悪性細
胞の百分率および反応性を示す;図6は、抗LAMI−1抗体または非反応性同
基準標本調和対照を用いて、還元または非還元条件下での後のドデシル硫酸ナト
リウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による、ヨウ素化CLL細胞表面から
のLAM−1の免疫沈降を示す;図7は、抗LAMI−3抗体およびPPME−
F ITCから得られた間接免疫沈降結果を示す;
図8は、PAM曝露後の悪性細胞およびcDNA)ランスフエクト細胞による細
胞表面LAM−1の調節を示す。
寄託の記述
本発明を実施する抗LAM−1モノクローナル抗体抗LAM1−3を形成する混
成細胞系は、アメリカ合衆国メリーランド州20852 ロックビル12301
バークローンドライブ所在のアメリカン タイプ カルチャー コレクション
(American Type Cu1ture Co11ection)によ
り、1991年6月12日に寄託され、A、 T、 C,C,寄託No、HB1
0771として認可された。
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セレクチン(selectins) == c DNAクローニングにより同定
された細胞付着/回帰レセプター分子の最近記載された族。この族の構成要素は
、マウスリンパ球回帰レセプター(mLHR)のヒト相同器官である白血球付着
分子−1(LAM−1)、活性化された血小板および内皮細胞上に発現されたヒ
ト顆粒−膜タンパク質(GMP−140、PADGEM、CD62)および活性
化された内皮細胞上に発現されたヒト内皮白血球付着分子−1(ELAM−1)
を含む。「セレクチン」の名称は、レクチンドメインの存在およびこれらの選択
的細胞トラフィッキングにおける役割のため、この族に提案された。
LN=Nニリン
PMA=ホルボール 12−ミリステート 13−アセテートPKC=プロティ
ンキナーゼC
LAM−1=白血球付着分子−1
CLL=クローン性リンパす白血病
NHL=非ホジキン(non−Hodgkins)リンパ腫PPME=酵母から
のポリホスホモノエステルAML=大人の骨髄性白血病
CML=クローン性骨髄性白血病
PB〜IC−周辺血液単球細胞
BM=骨髄
RPMJ−アメリカ合衆国メリーラント州 ウォルカースヒル所在のギブコ(G
ibco)から入手しうる市販の製品FSC=小胞状小胞状綿付着細胞リ
ンパ腫C3F=コロニー刺
激因子−拡散小付着細胞リンパ腫
FITC=フルオレセイン イソチオシアネートLPS=リボ多糖
LAM−1発現を、通常のおよび新生物白血球において試験して、白血球移動を
調節する機構をさらに理解した。通常のリンパ球の上澄み液からの分子量69.
000のLAM−1の大きいフラグメントの免疫沈降を、LAM−1が細胞表面
から迅速に付着することがてきる(図4)ことを例証するPMAと共に培養した
。LAM−1発現が、内面化よりむしろ流出により下方に調節されたということ
は、はとんどの他の表面分子の下方調節を調節するものとは別個のPMA感応性
調節経路がLAM−1の発現を調節することを示唆する。この調節経路はPKC
の活性化を特異的に含む(表3)。刺激せずに培養したリンパ球の上澄み流体(
図4)中に可溶性アイソフオーム(isoform)が存在することにより、L
AM−1が、緩徐な速度で、発現を新規なレセプターの連続的な合成により一定
に維持されながら、連続的に発生することが示唆される。発生の機構が未知であ
るが、細胞表面レセプターの酵素の付着は膜結合プロテアーゼの特異的活性化に
起因する。これは、活性化された白血球により分泌された可溶性プロテアーゼか
この作業により検出されないため、適切な方法である。あるいはまた、LAM−
1タンパク質のコンホーメーションにおける活性誘発変化は、次に可溶性タンパ
ク質により付着するLAM−1上の発生期の部位を露出する。しかし、LAM−
1cDNAによりトランスフェクトされた細胞系がPMA露出の後に迅速にLA
M−1発現を調節するという発見(図8)は、LAM−1に付着するプロテア−
七か分布中に遍在することを示唆する。発生によるLAM−1の下方調節は、m
LHRのものに類似する〔33〜34〕。
これは、LAM−1の細胞表面発現が活性化により急速に下方調節された(5.
6. 11)という観察と一致する。従って、細胞表面からのLAM−1除去
は、内皮から白血球を分離してこれらが後に組織中へ移動するのに必要である。
LAM−1は、種々の研究された血液学的悪性(表11図5)中で最も頻繁にC
LL細胞により発現された。これらの結果は、CLLおよびNHL細胞を用いて
TQIおよびLeu−8に対するLAM−1発現の以前の研究を拡張する〔35
〜37〕。LAM−1の発現が血液学的悪性中で若干制限されるため、発現また
は発現の欠乏は、白血球細胞のトラフィッキングおよびNHLの散布における主
要な衝撃である。CLL細胞からのLAM−1の免疫沈降は、これか、通常のリ
ンパ球(図6)により発現された糖タンパク質のMr74,000アイソフオー
ムに類似することを示した。さらに、悪性細胞により発現されたLAM−1は、
通常のリンパ球およびCLL細胞におけるLAM−1か、共にHEVおよびP
P M Eに結合することができた(表2、図7)ため、機能的であった。HE
VおよびPPME結合の両方は、新規なモノクローナル抗体、抗LAMI−3か
完全にすへてのHEVおよびPPME結合を遮断することかできたため、LAM
−1により媒介された。
表I LAM−1発生はプロティンキナーゼ阻害剤により遮断される
PMA処理なし” PMA処理あり
媒体 60 115 13 47
スタウロ
ポーリン 1mM 57 91 54 95500μM 72 95 49 9
1
100μM 51 88 51 92
50μM 47 92 58 100
H−71mM 52 94 53 92500μM 67 102 32 80
100μM 58 109 23 9150μM 61 106 11 61
a=抗LAM−1モノクローナル抗体と反応性を有する細胞の百分率を、間接免
疫蛍光分析により測定した。陽性細胞の染色の相対的強度を、FAC3分析(2
56チヤネル、3つの10個の組の対数目盛上)により得られた平均の蛍光チャ
ネル番号(MFCNo、)に基いて示す。非反応性モノクローナル抗体で処理し
た細胞はMFC番号40の3%陽性細胞を有した。
表2 通常のおよび悪性の細胞のREVへの結合LAM−I CD44 HEV
あたり
1 70 +++ 93 ++++ 2.12±0.052 59 ’++ 9
9 ++++ 1.02±0.224 52 ++ 96 ++++ 1.02
±0.323 2 − 65 ++++ 0.18±0.11通常
PBL 85 +++ 100 、++++ 4.64±0.67a=抗LAM
I−1および515モノクローナル抗体を有する細胞の百分率を、間接免疫蛍光
分析を用いて測定した。陽性細胞の染色の相対的強度を、活性なしである(−)
および最高の活性を示す(++++)に基いて示す。b−値は、各HEVに結合
した細胞(±SD)の平均数を示す。+50REVの合計を、各試料において試
験した。LAM−1+における場合(“ 1. 2および4)と、LAM−1−
の場合(3)との間のREVあたり結合した細胞の数の差異は、スチューデント
のT−試験統計を用いて統計的に有意(P<0.005)であった。
表4 PPMEおよびHEV結合はリンパ球活性化により増強される。1
抗LAMB−106868±571 2103±905 2030 1.5±0
.8 0.2±0.2抗CD2 17886±419 2863±689 96
5 2.4±0.9’0.2±0.2抗CD3 19718±1294 121
1±618 303 2.7±1.030.2±0.21、 血液リンパ球を単
離し、示した抗体と共に4°Cにおし)て20分間インキュベートし、抗CD3
を、5pertini等、Nature349: 691−694 (1991
)に示されるように架橋させた(Spertini等、図1参照〕。1回洗浄し
た後、細胞を125I標識P PME90、36μg/ml、試料あたり2.2
x I O’ c、p、m、)と共に4°Cて30分間インキュへ−1−1,
た。抗LAM1−3を、試験抗体を加える1分前およびすべてのインキュベーシ
ョンの間加えた。(]25r)PPMEのカルシウム依存結合を、5mMのED
TAの存在下で評価した。細胞を洗浄し、PBS−BSAに再懸濁させ、75%
(V / V )仔ウシ血清の750μlり・ソション上に載置した。細胞ペレ
ットを単離し、結合した(126()PPMEをγ(ガンマ)計数により評価し
た。これらのデータは、3つの実験において得られたものを代表する。
蛍光標識P P Li Eを標準の方法によりヨウ素化し、比活性(2X I
O’ c、p、m、/ng)を自己転位曲線分析(こより測定し、最大の結合能
力は2006であった。
2、REV結合を、12μmの新鮮に切断し、凍結したラットリンパ節切片を用
いて評価した。REVに結合したリンパ球の数を、コードしたスライド上で計数
した。値は4つの実験の平均上標準偏差(s、 d、 )であり、対照の抗体処
理細胞と、抗CD−2および抗CD−3処理細胞との間の差異は有意であった。
3、 対のスチューデントのt試験を用いてP<0.05゜4、 対のスチュー
デントのt試験を用いてP<0.010HEV結合のレベルはまた、発現された
LAM−1の量に比例し、LAM−1陰性細胞はHEVおよびPPMEに結合す
ることかできなかった。LAM−1はまた、PMA露出の後にCLI[胞の表面
から発生した(図8)。しかし、発生の前兆の経路は、LAM−1発生の時間経
過か通常のリンパ球におけるより緩徐であるため、若干のCLL細胞において活
性が比較的低かった。従って、悪性の細胞は、通常の細胞における通常の相対物
と区別不能である機能的LAM−ルセブターを発現し、CLL細胞によるLAM
−1の発現は、これらの細胞が周辺LN中に局在する高い傾向と相関する。
LAM−1と対照的に、CD44発現は、試験した白血病およびNHLの中で一
貫して高いレベルで発現され、一方他の付着分子CDI+/CD18、CD54
およびCD58の発現は可変であった(表■)。CD44の発現は、高いレベル
のCD44を発現するLAM−1陰性CLL細胞か、リンポプラストイト細胞(
lymphoblas+oid cell)を用いた1つの研究群により示され
たものと類似する凍結切片アッセイ(表2)におけるHEVと結合しなかったた
め、REVに結合する細胞の能力と相関しなかった〔17〕。CD44は、はと
んどすべての造血細胞、繊維芽細胞、表皮性、膠およびメラニン細胞起源細胞に
おいて発現される広範囲に分布した糖タンパク質の族を構成する(21,38)
、CD44は初期には、mLHRと同一のヒト回帰レセプターと考えられていた
が(28,29)、これは、ヒアルロン酸塩に対するレセプターとして細胞−細
胞または細胞−マトリックス結合に比較的一般に含まれる〔39〕。以前の研究
により、CD44かNHLの散布中に含まれることか示唆された〔40〕。しか
し、本発明の結果である研究の間、CD44発現のみの結果からの明らかな関連
は推論されなかった。
LAM−1は、はとんとの好中球、単球、通常の骨髄前駆細胞およびBM(骨髄
)における初期の赤血球前駆体において発現される〔6〕。この回帰レセプター
および他の付着分子の共発現(co−expression)は、これらの細胞
のBMにおける生理学的維持(回帰)を調節する。静脈内に移植された造血幹細
胞の回帰は、LAM−1リガンドに擬態する〔42〕ガラクトシルおよびマンノ
ツル特異体〔41〕を有する認識系により媒介される。これに関して、AMLお
よびCML細胞は、LAM−1の発現を欠くことが見出された。リンパ腫の状態
と異なり、これは、通常の骨MItB胞におけるLAM−1の高レベル発現と明
らかに異なる。はとんとのAMLおよびCML細胞におけるLAM−1発現の欠
乏は、これらの細胞の血流への経路を好む。
CML細胞のオーバーナイト培養の結果細胞表面にLAM−1が発現されなかっ
たか、これらの細胞によるLAM−1発現の全体的な欠乏は、白血病骨髄細胞に
よるLAM−1の調節の池の研究が保証されることを示す。
マウスおよびヒトにおいて、リンパ球の周辺LNのREVへの結合および通常の
白血球の血液から炎症障害への移動か、発現か対応して調節される若干の付着分
子により調節されるという増大する証拠が存在する(5. 6. 33. 43
)。類似の機構か白血病およびリンパ腫の散布に寄与すると考えられる。1つの
マウスにおける研究において、REVに対する機能的レセプターの発現は、悪性
リンパ球集団のREV含有器官への造血散布を調節することが示された〔16〕
。HEVに十分結合するリンパ腫は血液を介してわずかに散布し、最終的にすべ
てのLN群を対称的に含む。対照的に、非結合性リンパ腫によるLNの全体的な
包含は、注入の部位において形成する局在した腫瘍を排出する節に限定される。
これらの結果は、REVに対する機能的レセプターの発現は、悪性リンパ球集団
のHEV含存器官への造血散布を調節するかまたは転位の挙動を決定する因子と
共調節される(co−regulated)ことも示唆する〔16〕。ヒトにお
いて、機能的REV結合分子、例えばLAM−1の、CLLおよび低球リンパ腫
細胞における発現は、通常のリンパ球において発生するのと同様に、これらの悪
性細胞の広範囲にわたる散布に寄与する。
周辺血液単球細胞(PBMC)を、血液、骨髄(BM)試料およびLNの単一細
胞懸濁液のフィコール−ハイバック(Fic。
II−Hypaque)密度勾配遠心分離により単離した。細胞をヒユーマン
プロテクション コミティー 才プ ザ ダナーファーバー キャンサー イン
スティテユート(Human Protection Comm1ttee o
f the Dana−Farber Cancer In5titute)に
より認可されたプロトコルにより得た。腫瘍の型を、従来の形態学的、細胞学的
および免疫表現(immunophenotype)判断基準に従って分類した
。腫瘍細胞リネージを、表面および細胞質免疫グロブリン(Ig) 、HLA−
DRAg、CD1.CD2.CD3、CD4.CD5.CD6.CD8.CD9
.CDl0.CD1 lb、CDl3.CD14.CDl9.CD20およびC
D33を含む抗原(Ag)の分析により決定した。細胞を単離の直後に試験した
かまたは直ちに凍結保存し、用いるまで液体窒素中に凍結したまま保持した。悪
性の細胞の頻度は、試験しだすへての試料において常に90%より大きかった。
抗LAM−1モノクローナル抗体抗LAMI−1および抗しAMI−2およびモ
ノクローナル抗体抗TQIは、以前に記載された(5. 8)。本発明の抗LA
MI−3抗体(IgG1)は、N5−1骨髄腫細胞と、〔5〕により記載された
LAM−1cDNAによりトランスフェクトされたマウス前B細胞系300.1
9の細胞によりくり返し免疫処置されたBa1b/Cマウスからの牌繊細胞との
融合により生じた。これらの研究において用いた抗体は以下のものを含んだ:
J、 Ritz (Dana−Farber Cancer In5t、ボスト
ン、MA)からの贈呈である2F12(CDIIa)およびl0F12 (CD
18)(18);T、A、Springer (Center far Blo
od Re5earch、ボストン、MA)からの贈呈であるTS2/9 (C
D58.抗LFA−3)(19〕およびRRI/I (CD54、抗ICAM−
1)(20); G、 S、 Kansas (Dana−Farber Ca
ncer In5t、)からの贈呈である515 (CD44)(21);およ
び904 (CD11b)間接免疫蛍光分析を、フィコール−ハイパツク密度勾
配遠心分離により単離された可視細胞において実施した。LAM−1、CDI
Ia、CD1lb、CDII複合体のサブユニット(CDI8)、CD44.C
D54およびCD58の表現を、フローサイトメトリー分析(クールターエピマ
ウス(Coulter Epecs) C、クールター エレクトロニクス(C
oulter ElectronicS)バイアレアFL)を用いた間接免疫蛍
光により試験した。ヒト白血球と反応性てないアイソタイプ整合マウス抗体を、
負の対照として用いた。細胞を各モノクローナル抗体に関して氷上で20分間イ
ンキュベートし、洗浄し、F■Tc結合ヤギ抗マウスIg試薬(サザンバイオテ
クノロジーアソシエート(Southern Biotechnology A
s5ociates)、バーミンガム、AL)で処理した。
通常のリンパ球およびB−CLL細胞の、PPME (f l−PPME)の蛍
光誘導体(S、 D、 Rosen、カリフォルニア大学、サンフランシスコ、
CΔの贈呈)への結合能力を、細胞を、リン酸緩衝液(PBS)中で30μg/
mlにおいて、lOOμIのfl−PPMEと共に氷上で30分間インキュベー
トすることにより評価した。2回洗浄した後、fl−PPME結合を、記載され
たように(23,24)フローサイトメトリー分析により試験した。
HEV結合アッセイ
インビトロでのHEV結合アッセイを、ヒトまたはラット周辺LNの凍結組織切
片を用いて、〔5〕に記載された、S tampe「およびWoodruff
C25)並びにButcher等(26〕の方法を用いて実施した。抗LAM−
1モノクローナル抗体を用いた細胞結合の遮断を、新鮮に切断し、凍結したラッ
トリンパ節切片を用いて実施し、抗体を1 : 100の希釈において腹水流体
と細胞を2回洗浄し、30X10@細胞/−の濃度でRPMI1640媒体(シ
グマ(Sigma)、セントルイス、MO)に再懸濁させ、室温でノイラミニダ
ーゼ(0,I U/yd、カルバイオケム(Calbiochem、ラジョラ、
CA)を用いて40分処理し、次いてラクトペルオキシダーゼ触媒ヨウ素化によ
り標識した。洗浄後、細胞を〔27〕に記載されたように1%(v/v)NP−
40を含む緩衝液中で溶解した。細胞の溶解物を、3μmのマウス腹水流体(ア
イソタイプ整合抗体)および25μmのガンマ結合Gアガロース(ジエネックス
(Genex)、ガイサースバーグ、MD)の50%(V / V )懸濁液を
用いて2時間安全性を事前に保証した。細胞溶解物を再び夜を通じて安全性を事
前に保証した。次に安全性を事前に保証した溶解物の半分を3μmの抗TQI腹
水流体、3μlの抗LM−1−腹水流体および50μmのガンマ結合Gと共に、
4℃で18時間定常的に回転させながらインキュベートした。他の半分の溶解物
を、3μmのアイソタイプ整合マウス腹水流体を用いて同様に処理した。
免疫沈降物を洗浄し、5DS−PAGEにより分析した。分子量(Mr)を、標
準の分子量マーカー(BRL、ベラスダ、MD)を用いて測定した。
LAM−1発生を研究するように設計された実験において、LAM−1を、上澄
み流体および、RPMT1640媒体単独またはPMA (+ 00 n g/
me、シグマ、セントルイス、MO)を含むRPMI媒体中て37°Cて60分
間培養したP BMCのペレットから免疫沈降させた。さらに、LAM−1の表
現を、細胞を、アジ化ナトリウム(シグマ)またはプロティンキナーゼ阻害剤、
1−(5−イソキノリニル−スルホニル)−2−メチルピペラジン(H−1)、
カルバイオケム)およびスタウロスポリン(シグマ)を用いて37°Cで30分
間培養した後、細胞をPMA(10nM、30分)と共にインキュベートした後
に評価した。
LAM−1を細胞表面から培地中に落とす。PBMCはヨウ素で処理し培地また
は1100n/mlのPMAを含む培地中で培養した表面であった。上清液およ
び細胞を収集し抗LAM−1抗体または対照抗体に適合させた非反応性アイソタ
イプ(対照)を用いて免疫沈降させた。免疫沈降させた材料を7.5%SOSア
クリルアミドゲル上で還元条件下に電気泳動させオートラジオグラフィーにかけ
た。既知の分子量標準の移動度をキロダルトン(kDa)で示す。
A一旦
悪性細胞によるLAM−1発現の頻度。種々の形態の造血悪性腫瘍を患う 11
8名の患者からの細胞を表面LAM−1発現について抗LAMI−1モノクロー
ナル抗体を用いたフローサイトメトリー分析による間接免疫蛍光アッセイで試験
した。各場合に、各試料についての背景染色をモノクローナル抗体に適合させた
非反応性アイソタイプを用いて測定し背景染色のレベル(通常5%未満)を示さ
れた値から控除した。水平の棒線は反応性細胞の平均頻度を示す。〔略号: P
re−B 、前B急性リンパ芽球性白血病:T−ALL 、 T細胞急性リンパ
芽球性白血病; B−CLL、B型慢性すンパ球性白血病;FSC1SC1胞状
納付リンパ腫(foil icularsmall cleaved cell
lymphoma) ; DSC、散在性小付着細胞すンパ腫;DLC1散在
性大細胞リンパ腫;Burk、、パーキット型リンパ腫;M、M、、多発性黒色
腫;AML、急性骨髄性白血病、 CML、慢性骨髄性白血病〕。悪性細胞の相
対的蛍光染色強度は陽性集団か背景蛍光染色から識別されるピークとして確認す
ることがてきること:±、陽性に染色された細胞の肩が明白であった;+、陽性
細胞の分離したピークが弱い蛍光により確認された;++、適当な蛍光の蛍光陽
性細胞の明確な分離ピーク;++十、正常血液リンパ球と同一の強度の蛍光陽性
細胞のピーク。
すべての悪性細胞の組織供給源も示す。
図 6
B−CLL細胞から免疫沈降させたLAM−1の分析。表面ヨウ素処理細胞(4
5XIO’ )の洗剤溶解物を抗TQIおよび抗LAMI−1抗体(LAM−1
)または抗体対照を適合した非反応性アイソタイプ(対照)により免疫沈降させ
た。免疫沈降させた材料を分割し非還元および還元条件下に12%SDSポリア
クリルアミドゲル上次いでオートラジオグラフにかけて分析した。分子量(kD
a)は既知のタンパク質標準の移動度により決定した。
図 7
正常ヒトリンパ球およびCLL細胞はLAM−1によりPPMEを結合すること
ができる。細胞を抗1、AMI−3モノクローナル抗体(濃い線)または抗体を
適合させた非反応性アイソタイプ(薄い線)により処理した後間接免疫蛍光分析
によってLAM−1発現について試験した。また細胞を抗LAMI−3抗体(薄
い線)または非反応性対照抗体(濃い線)により処理した後F[TC−コンジュ
ゲートPPMEと反応させた。細胞染色の蛍光強度はフローサイトメトリーによ
り分析した。
図 8
悪性細胞およびPMAに曝した後にcDNAをトランスフェクションした細胞に
よる細胞表面CAM−1の調節。LAM−1cDNA、 K562−LAMIお
よび300.19−LAMIでトランスフェクションした細胞、およびCAM−
1を発現する悪性細胞を培地またはlOng/ml (7)PMAを含む培地中
で90分間培養した。培養後、フローサイトメトリー分析による間接免疫蛍光ア
ッセイで抗LAMI−1抗体を用いて細胞のLAM−1発現について試験した。
また細胞は非反応性対照抗体を用いて染色され背景染色のレベルは常に5%未満
であった。
LAM−1を発現する細胞の頻度を控除した背景染色細胞の数と共LAM−1は
PMAに曝された後細胞表面から遊離する。
免疫沈降実験を行ってPMAに曝したPBMCの表面からの調節後にLAM−1
の運命を測定した[5]。表面ヨウ素処理細胞をRPMI培地単独またはPMA
含有培地中で60分間培養した。培養後、上溝液と細胞を分離し、細胞を洗剤で
溶解した。CAM−1の異なるエピトープに結合し[51、さらに免疫沈降に対
して相互に一層有効な抗LAMl−1および抗TQI抗体を組み合わせて細胞溶
解物および上清液を免疫沈降させた。さらにLAN−1がシアル酸基の除去後一
層容易に免疫沈降することがあるため細胞を表面のヨウ素処理の前にノイラミニ
ダーゼで処理した。細胞をPMAで処理すると免疫沈降可能なLAM−1の細胞
表面からの著しい損失を招き上溝液から免疫沈降したLAM−1のレベルが付随
して増加した。
またPMAを含まない培地中での細胞のインキュベーションは上清液に見出され
る少量のLAM−1を生じる(図4)。上清液から沈殿したLAM−1の分子量
は細胞表面で見出される種類のCAM−1よりはわずかに(約5 kDaだけ)
小さかった。興味深いことに、PMA処理細胞の細胞表面に見出される残留LA
M−1は上清液中に見出されるCAM−1の分子量に極めて類似していた。上清
液からの標識LAM−1の量的な回収は、可溶化した細胞から免疫沈降させた量
に比べ、主要な部分のLAN−1が細胞表面から落ちPMAに曝された後インタ
ーナリゼーションされないことを示す。
悪性リンパ球による接着分子の発現
LAM−1およびリンパ球の接着および移動に関連することが知られている他の
細胞表面分子の発現を間接免疫蛍光分析により118名の患者からの悪性リンパ
球において試験した。LAM−1発現はCLL細胞上でならびに胞状(FSC)
および散在性小付着細胞リンパ腫(DSC) (表3)として分類されるリンパ
腫間で最もしばしば明らかにされた。他方、最も急性な骨髄芽球性白血病(AM
C) 、急性リンパ芽球性白血病(ALE、) 、慢性骨髄性白血病(CMI。
)、散在性大細胞リンパ腫(DLC) 、バーキットリンパ腫および多発性黒色
腫はLAN−1陰性であった。細胞表面LAM−1発現のレベルはCLL細胞に
おいて最も高く;さらに16の症例の11にLAM−1を発現した、50%より
多い細胞はLAM−1+であった(図5)。
一般に、LAM−1染色の蛍光強度レベルは25%未満の陽性細胞を有する最も
悪性な細胞集団が容易に検出可能なレベルてLAM−1を発現しないようなLA
M−1+細胞の頻度に相関した。
CLL細胞はめったにLAM−1以外の、CD44 (表3)を除く、接着分子
を発現せず、これはさらにリンパ球ホーミングに関連している[28.29]。
90%より多い細胞試料はCD44+であり、正常造血細胞上のその偏在する分
布に一致した。93%の白血病および84%のB−NHLかこの抗原について陽
性でありさらに一般に60%より多い細胞がCD44+であった。一般に、CD
11a 、 CD11b、CD18、CD54、およびCD58の発現は一層不
均一であった(表3)。
約8〜16時間4°Cで正常血リンパ球をインキュベーションすると細胞表面か
ら完全にCAM−1を失わせることかできる[30]。
しかし、PBMC,LAM−1+リンパ芽球性細胞系および新鮮単離LAM−ト
悪性細胞の低温保存ではCAM−1の量的発現があまり変わらなかった。LAM
−1発現の少量の減少は約8〜16時間10%FC3(ウシ胎児血清)を加えた
RPM[1640中で細胞を培養することにより逆転させることがてきることが
観察された。結果として、37の悪性細胞の試料を上記培養後に再試験した。し
かし、この処理により細胞表面上のLAM−1の出現またはいずれの場合にもL
AM−1発現の頻度の有意な増加か生じなかった。
悪性細胞により発現されたLAM−1の構造抗LAM−1抗体を用いCLL細胞
からLAN−1を免疫沈降させt7゜LAM−1は非還元条件下68.000の
Mrに移動し還元後は73.000であり(図6)、正常リンパ球から免疫沈降
させたLAM−1に類似していた(図4)。従って、正常および悪性リンパ球か
同一の細胞表面LAM−1タンパク質を発現することがわかる。
LAM−1受容体の機能
LAM−1発現と細胞かヒト末梢LN HEVに結合する能力との間の関係を正
常循環血液からの細胞、3つのLAM−1陽性CLLおよび1つのLAM−1陰
性CLLを用いて試験した。細胞をスタムパ−(Stamper)およびウッド
ラフ(Woodruff)の凍結切片アッセイ(fr。
zen 5ection assay)[25]を用いてヒト末梢LNのREV
に結合するそれらの能力について試験した。LAN−1+細胞はそれらの細胞表
面に発現されたLAM−1の量に相当するレベルでREVに結合するが、LAM
−I CLL細胞は結合しなかった(表2)。対照的に、CD44発現は試験し
た細胞試料のすべてにおいて極めて高< f(EV接着と関係しなかった。付加
的研究でREV結合を阻止する抗LAM−1モノクローナル抗体の能力を試験し
た。新規な抗体、抗LAMI−3は、92〜95%の正常リンパ球およびLAM
−1+ CLL細胞のラット末梢LN REVへの結合(表2からの細胞)を特
異的に阻止することができた。対照的に、異なる抗体、LAM−1の異なるエピ
トープと反応する抗LAMI−10の結合はREV結合における検出可能な効果
を有しなかった(表4参照)。従って、LAM−1発現のレベルは細胞のREV
に結合する能力および特異的に結合を阻止されたCAM−1と反応する抗体に関
連した。
mLHRのためのりガントはマンノース6リン酸リツチな多糖PPMEにより模
造される[241゜従って、正常ヒトリンパ球およびCLL細胞のフルオレセイ
ン処理した(fluoresceinated) PPMEへの結合能力を試験
しさらにヒトLAM−1の機能的容量を特徴付けた。正常血リンパ球およびLA
M−1+ CLL細胞はPPMEに結合することができたが、LAM−1−CL
L細胞はPPMEに結合しなかった(図7)。LAM−1に対するPPME結合
の特異性は細胞へのPPME結合を完全に阻止する抗LAMi3抗体の能力によ
り確かめられた(図7)。
しAM−1発現の調節
ホルボールエステルに正常リンパ球および好中球を曝すことは細胞表面からのL
AM−1の迅速な消失を誘導する[5.6]。従って、PMA刺激後のLAM−
1発現の調節はCLLを患った16名の患者からの細胞において研究された。P
MAに90分曝した後、LAM−1発現は4症例で完全に消失したか、残りの1
2症例では部分的にダウンモジュレーションされたにすぎなかった。これらの1
2症例のIO症例で、LAM−1発現のダウンモジュレーションは同一条件下に
同時に培養されたRAJ[細胞のものに類似していた(図8)か、これは2つの
症例(B−CLL # 1および#2、図8)で最小であったにすぎない。FS
C型NHLを患った1名の患者からの細胞で、PMAは90分の刺激後にLAM
−1発現のほとんど完全な調節を誘導した(図8)。さらに試験した6つのLA
M−1+ CLL細胞試料では、PMAに曝すことは同時に処理したRAJI細
胞の動力学と同様のPMAを用いた180〜360分の培養後LAM−1発現を
完全に失わせる。またこれらの実験は低温保存血リンパ球および対照としてのR
AJI細胞を用い、PMAに曝した後の細胞のRAM−1発現を調節する能力に
あまり影響を与えずに、行った。
さらに、LAM−1発現のダウンモジュレーションをLAM−1cDNAをトラ
ンスフェクションした細胞で研究した。赤白同病細胞系、K562、およびマウ
ス前B細胞系、300.19を記載されているようにr51LAM−1cDNA
でトランスフェクションし、細胞表面[、AM−1の比較的高いレベルを発現す
る細胞を生じさせた(図8)。
RAJ I細胞および主要なCLL細胞で観察されたことに比べ、これらの細胞
をPMAに90分曝すことは細胞表面からLAN−1をほぼ完全に失わせた。
LAM−1発散におけるPKCの役割はさらにそれらをPMAに曝す前にプロテ
ィンキナーゼと共に正常血リンパ球を培養することにより評価した。細胞をH−
7[31]およびスタウロスポリン[32]て処理することは、種々の最適モル
濃度(表1)であっても、発散を阻害した。対照的に、リンパ球のアジ化ナトリ
ウムでの前処理は細胞表面受容体のダウンモジュレーションを阻害しなかった。
しかし、発散過程は4°CてのPMA処理が検出可能なLAM−1の発散を誘導
しないので進行中の代謝を必要とする(データは示していない)。このように、
PKCは切断の信号を送るLAM−1の直接的リン酸化によりまたはプロテアー
ゼ活性のキナーゼ調節により細胞表面受容体発現を調節することがある。
LAM−1の発散は可溶性プロテアーゼの活性化誘導分泌に起因しない。好中球
(107個/ml)を顆粒球/マクロファージC3Fのような系統特異的サイト
カインで活性化し、完全なLAM−1発散を賦与した[61゜これらの培養物の
上溝液を収集しリンパ球またはLAM−1cDNAでトランスフェクションした
細胞の培養基として37°Cて120分間使用した。この処理はフローサイトメ
トリー分析により評価したようなリンパ球の表面からの検出可能なLAM−1発
散を誘導しなかった。さらに、リンパ球の存在下の系統特異的な刺激による好中
球の活性化はリンパ球LAM−1の検出可能な損失を誘導せず好中球のLAM−
1発散が完了した。このようにして、膜結合プロテアーゼか細胞表面からLAM
−1を切断しあるいは細胞の活性化か切断を起こすのに必要であることがわかる
。
組織からの悪性白血球上のLAM−1発現LAM−1発現はリンパ球の組織への
進入中にダウンレギュレーションされることかありこのダウンレギュレーション
は培養中可逆である[51゜CLL患者の高度に浸潤した肺臓から単離した悪性
細胞はその患者の末梢血で見出せるCLL細胞より低いレベルてLAM−1を発
現することが見出された〔すなわち血液細胞の65%および牌細胞(splen
ocyte)の25%) 、 LAM−1陽性牌繊細胞の割合はPMAで180
分間刺激した患者末梢B−CLL細胞のものに匹敵した。このことはLAM−1
発現が正常リンパ球で発生するような肺臓へのCLL細胞の侵入に伴い減少した
ことを示唆する。
NHLを患った患者からのLN細胞(PSCを患った2名の患者、DLCを患っ
た1名およびDSCを患った2名)および白血病8M細胞(AMCを患った2名
の患者、ALLを患った1名およびCMLを患った1名からの)を1096のF
e2を含むRPMI 1640培地中37°Cて一昼夜インキユベーションした
。正常肺臓細胞を用いて同一条件下に得た結果に反して[5] 、LAM−1発
現における増加は培養後の悪性細胞上に検出されず、LAM−1がこれらの細胞
上で本質的に発現しないことを示した。
次の、表5には多数のモノクローナル抗体抗LAMI−1、−2および−3の特
性を示す。ラインl、2、および3は抗体、アイソタイプの名称および染色強度
の相違を示す。これらの特性はエピトープ認識の相違を暗示するものではない。
抗体の機能的研究をライン4〜6に示す。これらの結果は種々の部分のLAM−
1分子が種々のモノクローナル抗体により認識されることを示す。リンパ節はリ
ンパ球か血流からリンパ節に侵入するのに用いる高度な内皮小静脈(high
endothelial venuIe HEV)と称する構造を含む。リンパ
球の節への漏出は細胞が小静脈を貫き横切ることがてきる接着分子により媒介さ
れることが示された。この過程はリンパ節組織断片を用い単離したリンパ球をイ
ンキュベーションすることにより研究した。断片をリンパ球単独でインキュベー
ションする場合、細胞は)IEVに接着し、接着細胞の数を数えることができる
。種々のモノクローナル抗体は、LAM−1抗体を含めて、この結合を阻止する
のに用いられ、ライン4はLAMI−1,−2および−3についてのかかる研究
の結果を示す。
多糖PPMεはLAM−1分子の自然なりガントを模造する。PPMEが直接に
フルオレセインで処理することができるので、LAM−1とPPMEとの相互作
用における種々のモノクローナル抗体の効果を研究することか可能である。ライ
ン5はまずLAM−1モノクローナル抗体とインキュベーションし、次いでPP
MB−F[TCで処理した細胞を用いた結果を詳述する。抗TQI 、抗LAM
l−2および抗LAMl−3はPPME結合を阻止し抗LAMI−1はPPME
結合を高めた。これらの結果は抗体間の機能的な(さらに外挿法、特異性による
)相違を示す。
ライン6に示した結果はライン5の実験の逆転により得られた;すなわち、細胞
をまず未標識PPMEとインキュベーションし、次いでLAM−1抗体を用いた
間接的免疫蛍光を行った。ライン5に示すように、次のモノクローナル抗体結合
におけるPPMEとのインキュベーションの効果の相違は種々のモノクローナル
抗体がLAM−1分子の種々のエピトープを認識することを示す。
ライン7〜10は所定のモノクローナル抗体が他のモノクローナル抗体の次の結
合を阻止する能力を分析した研究の結果を詳述する。他の抗体による1つの抗体
の阻止は問題の2つの抗体が分子上で同一または相互に類似したエピトープを認
識する証拠を提供する。表4の結果は抗LAM−1が抗LAMI−3を阻止しな
いことを示し、それらのエピトープが異なることを示す。しかし、抗LAMi2
は抗LAM13を阻止し、これらのエピトープが少なくとも相互に類似すること
を示す。しかし、抗LAMI−2および抗[、AM13の間には、Leu 8に
関して発生する異なる応答による違いか存在する。抗LAMI−2はLeu 8
を少しも阻止しないか、抗LAMI−3はこれを著しく阻止する。種の交差反応
性は抗体および確認されるエピトープ間に存在する相違のさらなる指摘を与える
。
ライン11はモノクローナル抗体に関するドメインマツピングの結果を示す。C
AM−1分子は次の3つのドメインを含む:(a)レクチン様ドメイン(し);
(b)上皮成長因子様ドメイン(EGF) ;および(C)短いコンセンサスリ
ピートのドメイン(SCR)。
ドメインが各抗体により認識されたことを測定するために、cDNAを次のもの
をコードする情報を含むように構成した:(1)すへてのLAM−1分子:
(2) LAN−1分子からのり、EGFおよびSCRドメイン;(3) LA
M−1分子からのしドメインに加え同一ファミリーのタンパク質のCD62分子
からのEGFおよびSCRドメイン;(4)Lに加えLAM−1からのEGF
ドメイン(CD62からのSCR’);および
(5)Lに加えLAM−1からのSCRドメイン(CD62からのEGF )。
対応するタンパク質を次に産生ずる細胞にこれらのcDNAをトランスフェクシ
ョンした。次に種々のモノクローナル抗体の反応性のパターンを表6に示すよう
に決定し、さらにモノクローナル抗体の反応性に必要なドメインを挙げた。例え
ば、抗LAMl−3は記載されだすへてのドメインを培地により発現する細胞に
極めて強力に結合した。しかし、抗LAMI−1はLAM−1(L+5CR)ま
たはCAM−1(L)だけを含む細胞に結合しなかった。従って、抗LAMI−
1により認識されるエピトープはEGF ドメイン内、あるいはこれはLおよび
EGF ドメインの部分を含み、SCRドメインを含まない部位を構成する必要
がある。他方、LAMI3はLAM−1(L)ドメインを含むことだけが必要で
ある。従って、2つの抗体は識別可能である。
表5.抗LAM−1モノクローナル抗体の特徴付け2 アイソタイプ GI G
I M G13 蛍光’ ++7 +++7 ++ ++++74 HEV結合
’ N B wB B
5 PPME結合’ BE B B
6 PPME阻止4 −7+/−十/−−標識モノクローナル抗体の結合阻止能
カフ TQ−1’ 十++ −+++ +++8 Leu8’ ++ −十++
9 LAMI−1s−+++ −
10LAMI−3’ +++ −+++ +++It ドメインマツプ’L L
+EGF L L種の交差反応性
12 アカゲザル − +++ −+’13 シシザル +++ ++ −
14ウシ ND ND NC+++
15 ウサギ +++ −++ ++++19 ブタ ND ND ND +
20 ヤギ ND ND ND +++21 エピトープ CA RD
1=蛍光強度、ヒトリンパ球および末梢単核細胞。間接免疫蛍光アッセイにおけ
る染色の蛍光強度は4−(+)等級で与え(−)は特異的な反応性を示さず(+
+++)は活性の最も高いレベルを示す。
2=モノクローナル抗体阻止、高度な内皮小静脈結合。
3:モノクローナル抗体阻止、ホスホマンナンモノエステルフラグメント(PP
ME)。
4=モノクローナル抗体のPPME阻止。
5=抗体の結合を阻止する能力。
6=マツピングしたドメイン。
略号
Bind=結合
B=阻止
wB=わずかに阻止
E=増強
ND=未処理
L:レクチン
EGF=上皮成長因子様
5CR=短いコンセンサスリピート
N−効果なし
表6.LAM−1ドメインを含む融合タンノ(り質と反応する抗LAM−1モノ
クローナル抗体により認識された構造的ドメイン1゜試験mAbすべて レクチ
ン レクチン レクチン レクチンLAM−I EGF EGF 5CRs 5
CRsa=値はLAM−1cDNAまたはレクチン、EGF様を暗号化する組換
えcDNA、あるいはCD62を暗号化するcDNAの残部を有するLAM−1
の2つのSCRドメインてトランスフェクションしたCO5−7細胞の免疫蛍光
染色の相対的強度を示す。
5CR=短いコンセンサスリピートのドメインEGF−上皮成長因子様ドメイン
= = ご 2 0 # 旬 〜 −6o u+ N ヵ ;;= 唖 ψ い
h
ψ xg+ か
: ≧ 苔 ミ楓ミ長ミミミ目省?題ろ一−−−−−−−+−−〜 〜 〜 〜
11111− ロロ!−臂の
盲1111− N M m r−++
20〇−
1・4コ
フロントページの続き
(51) Int、 C1,5識別記号 庁内整理番号GOIN 33153
K 8310−2J331577 B 8310−2J
// C12N 15106
(C12P 21108
C12R1:91)
I
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.LAM−1として識別される白血球付着分子−1を暗号化するヒトcDNA 塩基配列によって転写された前Bセルラインによって免疫したマウス細胞から作 成されたハイプリドーマセルラインであって、前記LAM−1として識別される タンパク質が動物レクチン、成長因子及びC3/C4結合タパク質の結合領域と 相同の領域を含有することを特徴とするハイブリドーマセルライン。 2.LAM−1に対して指令するモノクローナル抗体を産生する請求項1記載の ハイブリドーマセルラインであって、前記モノクローナル抗体が(a)リンパ腺 へのリンパ球の移動及び(b)炎症部位における内皮に対する血液からの白血球 の付着を遮断することを特徴とするハイブリドーマセルライン。 3.前記免疫するタンパク質がLAM−1cDNA塩基配列によって暗号化され ていることを特徴とする請求項1記載のハイブリドーマセルライン。 4.前記免疫するタンパク質が図2に示すように実質的に同じ核酸塩塩基配列を 有するcDNA塩基配列に由来していることを特徴とする請求項1記載のハイブ リドーマセルライン。 5.LAM−1として識別される白血球付着分子−1を暗号化するヒトcDNA 塩基配列に由来するタンパク質に対して反応性を有するモノクローナル抗体を産 生することを特徴とするハイブリドーマセルライン。 6.LAM−1として識別される白血球付着分子−1を暗号化するヒトcDNA 塩基配列に由来するタンパク質と反応することを特徴とするハイブリドーマセル ライン。 7.LAM−1として識別される白血球付着分子−1又はその免疫抗原性フラグ メントに結合するモノクローナル抗体であって、前記LAM−1で識別されるタ ンパク質又は免疫抗原性フラグメントが動物レクチン、成長因子及びC3/C4 結合タパク質の結合領域と相同の領域を含有することを特徴とするモノクローナ ル抗体。 8.前記モノクローナル抗体が図2に示すと、実質的に同じアミノ酸配列を有す るタンパク質の特異的エピトープに結合することを特徴とする請求項7記載のモ ノクローナル抗体。 9.前記モノクローナル抗体がマウスモノクローナル抗体由来の可変部とヒト抗 体由来の定常部とを有するキメラ化モノクローナル抗体であることを特徴とする 請求項7記載のモノクローナル抗体。 10.LAM−1として識別される白血球付着分子−1に対して指令するモノク ローナル抗体を産生するハイブリドーマセルラインであって、前記モノクローナ ル抗体がリンパ腺へのリンパ球の移動及び炎症部位に対する血液からの白血球の 付着を遮断することを特徴とするハイブリドーマセルライン。 11.前記ハイブリドーマセルラインがヒト、さる、牛、うさぎ、羊、犬、猫、 豚及び山羊のLAM−1分子に対して反応性を有するモノクローナル抗体を産生 することを特徴とする請求項10記載のハイブリドーマセルライン。 12.前記ハイブリドーマセルラインがcDNAトタンスフェクションされた細 胞によって免疫したマウスから得られた脾細胞とNS−1ミエローマ細胞を融合 することによって作成されることを特徴とする請求項10記載のハイブリドーマ セルライン。 13.A.T.C.C受託番号がHB10771を有することを特徴とするハイ ブリドーマセルライン。 14.LAM−1として識別される白血球付着分子−1に結合するモノクローナ ル抗体であって、前記モノクローナル抗体がリンパ腺へのリンパ球の移動及び炎 症部位に対する血液からの白血球の付着を遮断することを特徴とすモノクローナ ル抗体。 15.前記モノクローナル抗体がヒト、さる、牛、うさぎ、羊、犬、猫、豚及び 山羊のLAM−1分子に対して反応性を有することを特徴とする請求項14記載 のモノクローナル抗体。 16.前記モノクローナル抗体が細胞タンパク質とLAM−1領域との融合タン パク質と反応することを特徴とする請求項14記載のモノクローナル抗体。 17.前記モノクローナル抗体が(1)LAM−1領域及び(2)レクチン、表 皮成長因子及び短い共通反復から成る群から選ばれた領域とLAM−1領域との 融合タンパク質から成る群から選ばれた1種と反応することを特徴とする請求項 14に記載のモノクローナル抗体。 18.前記モノクローナル抗体が融合されたLAM−1領域を有するタンパク質 と反応することを特徴とする請求項14記載のモノクローナル抗体。 19.前記モノクローナル抗体がマウスモノクローナル抗体由来の可変部とヒト モノクローナル抗体由来の定常部とを有するキメラ化モノクローナル抗体であっ て、前記キメラ化モノクローナル抗体がLAM−1として議別される白血球付着 分子−1に結合し、前記キメラ化モノクローナル抗体がリンパ腺へのリンパ球の 移動及び炎症部位に対する血液からの白血球の付着を遮断することを特徴とする 請求項14記載のモノクローナル抗体。 20.A.T.C.C受託番号HB10771を有するハイブリドーマセルライ ンによって産生されることを特徴とするモノクローナル抗体。 21.A.T.C.C.ハイブリドーマ寄託番号HB10771によって産生さ れるモノクローナル抗体によって識別される抗原に対し特異性を有するモノクロ ーナル抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマセルライン。 22.A.T.C.C.ハイブリドーマ寄託番号HB10771によって産生さ れるモノクローナル抗体によって識別される抗原に対し特異性を有することを特 徴とするモノクローナル抗体。 23.A.T.C.C.寄託番号HB10771によって産生されるモノクロー ナル抗体によって識別される抗原に対し特異性を有するキメラ化モノクローナル 抗体であって、該キメラ化モノクローナル抗体がA.T.C.C.受託番号HB 10771によって産生されるモノクローナル抗体によって識別される前記抗原 を認識するマウスモノクローナル抗体由来の可変部とヒトモノクローナル抗体由 来の定常部とを有することを特徴とするキメラ化モノクローナル抗体。 24.LAM−1として識別される白血球付着分子−1を発現させる細胞を分離 及び識別するに当たり、(a)LAM−1を発現させるか、或いは発現させると 考えられる細胞のサンプルと、A.T.C.C.寄託番号HB10771を有す るハイブリドーマセルラインによって産生されるモノクローナル抗体の特性を有 するモノクローナル抗体とを反応させ、 (b)分離及び/又は識別手段によって細胞を含む非抗体から細胞を含む抗体を 分離及び/又は識別する、ことを特徴とする細胞を分離及び識別する方法。 25.LAM−1として識別される白血球付着分子−1が発現させる細胞を分離 及び識別するに当たり、(a)LAM−1を発現させるか、或いは発現させると 考えられる細胞のサンプルと、A.T.C.C.寄託番号HB10771を有す るハイブリドーマセルラインによって産生されるモノクローナルとを反応させ、 (b)分離及び/又は識別手段によって細胞を含む非抗体から細胞を含む抗体を 分離及び/又は識別する、ことを特徴とする細胞を分離及び識別する方法。 26.LAM−1として識別される白血球付着分子−1をイムノアッセイにおい て検出するに当たり、(a)LAM−1分子を含むか、或いは含むと考えられる サンプルと、抗しAM−1モノクローナル抗体とを、抗体/LAM−1複合体が 生成するのに十分な時間と条件下で接触させ(b)標準イムノアッセイ法によっ て抗体/LAM−1復合体を検出する ことを特徴とする方法。 27.前記モノクローナル抗体が抗体LAM1−3モノクローナル抗体であるこ とを特徴とする請求項26記載の方法。 28.前記モノクローナル抗体が抗しAM1−3モノクローナル抗体由来の可変 部とヒト抗体由来の定常部とを有するキメラ化モノクローナル抗体であることを 特徴とする請求項26記載の方法。 29.リンパ球移動症にかかっている患者における白血球移動及び受容体活性を 遮断するか、炎症部位への白血球の侵入を減少させるか、自己免疫応答を軽減又 は消滅させるか、或いは組織移植における拒絶反応を克服するに当たり、前記患 者に対し治療上又は生理学的に有効な量の抗しAM1−3モノクローナル抗体を 投与することを特徴とする方法。 30.患者に投与するモノクローナル抗体が、抗しAM1−3由来の可変部とヒ ト抗体由来の定常部とを有するキメラ化抗LAM1−3モノクローナル抗体であ ることを特徴とする請求項29記載の方法。 31.白血球の活性化を診断及び/又は検出するために、LAM−1の発現が異 常であるか、或いは減少している白血球を識別するに当たり、 (1)LAM−1の発現が異常であるか、或いは減少している白血球を含むか、 或いは含むと考えられるサンプルと共に、LAM−1に対する抗体を培養し、次 いで、(2)フローサイトメトリー、ラジオイムノアッセイなどからなる群から 選ばれた標準免疫アッセイ法によって、前記LAM−1の発現の異常或いは減少 について白血球を識別する、ことを特徴とする白血球の識別方法。
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