FI121176B - Lymfosyyttien sitoutumiseen vaikuttava ihmisen endoteelisolun molekyyli - Google Patents

Description

Lymfosyyttien sitoutumiseen vaikuttava ihmisen endoteeli-solun molekyyli

KEKSINNÖN ALA

Tämä keksintö koskee uutta ihmisen endoteelisolun adheesioanti-5 geeniä nimeltä VAP-1 tunnistavaa monoklonaalista vasta-ainetta, erityisesti 1B2-vasta-ainetta, sekä tämänkaltaisten molekyylien käyttöä kroonisen in-flammatoorisen ja infektiivisen tilan tunnistamiseksi, jonka tilan tunnusomaisena piirteenä on lymfosyyttien kertyminen.

KEKSINNÖN TAUSTA

10 Useimmat kypsät lymfosyytit kiertävät jatkuvasti veren ja lymfaattis- ten elinten välillä (Butcher, E. C., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 128, 85 (1986)). Lymfosyytit poistuvat verestä tunnistamalla ja tarttumalla verisuonten endoteelisoluihin. Tämän jälkeen ne siirtyvät endoteelisolujen välistä ympäröiviin kudoksiin. Lymfosyyttien kulkeutuminen mahdollistaa kaikki lymfosyyttis-15 pesifiset immuunireaktiot kehon jokaisessa osassa, ja helpottaa immuunivasteen syntymisen ja kontrollin vaatimia solunvälisiä interaktioita. Lymfosyyttien tarttumiseen endoteelisoluihin vaikuttaa molemmissa solutyypeissä ilmentyvien komplementaaristen adheesiomolekyylien vuorovaikutus (Springer, T. A., Nature 346, 425 (1990); Stoolman, L.M., Cell 56, 907 (1989); Osborn, L., Cell 62, 20 3 (1990); Pober and Cotran, Transplantation 50, 537 (1990); Butcher, E.C.,

Cell 67, 1033 (1991)). Normaalitilassa lymfosyytit sitoutuvat pääasiallisesti erikoistuneisiin postkapillaarisiin laskimoihin, joita kutsutaan korkeaendoteelisiksi laskimoiksi (engl. High Endothelial Venule, HEV). Toiminnallisesti erilliset lym-fosyytti-HEV-tunnistusjärjestelmät, jotka myötävaikuttavat lymfosyyttien kul-25 keutumiseen perifeerisiin imusolmukkeisiin, suoliston lymfaattiseen kudokseen, nivelkalvoon ja ihoon elinspesifisellä tavalla on kuvattu kirjallisuudessa (Butcher, E.C., et ai., Eur. J. Immunol. 10, 210 (1980); Jalkanen, S., et ai., Science 233, 556 (1986); Picker, L. J., et ai., Nature 349, 796 (1991)). Tulehdustilanteessa endoteelisolun aktivaatio aikaansaa muutoksia adheesio-30 molekyylien tilassa, mikä suuressa määrin vaikuttaa tulehtuneeseen kudokseen siirtyvien leukosyyttien määrään ja tyyppiin. Täten endoteelisolut ovat avainasemassa paikallisen immuunivasteen kontrollissa, ja lymfosyyttien kulkeutumista ja poistumista verenkierrosta säätelevän mekanismin yksityiskohtainen ymmärtäminen voi luonnollisesti antaa uusia mahdollisuuksia tulehdus-35 vasteen kliinistä muokkaamista ajatellen.

2

Koska ihmisen lymfosyyttien kudosselektiiviseen kulkeutumiseen vaikuttavat endoteelisoluligandit ovat pääasiallisesti tuntemattomia, on suuri tarve tunnistaa tämänkaltaisia molekyylejä.

Tämän keksinnön keksijät esittelivät European Federation of Immu-5 nological Socieies -järjestön kokousabstraktissa kesäkuussa 1991 alustavia tuloksia jotka viittasivat aikaisemmin tuntemattoman lymfosyyttien HEV-sitoutumiseen vaikuttavan endoteelisolun antigeenin olemassaoloon. (Salmi et ai., EFIS 11 th Meeting Abstracts, 21-12; 1991).

KEKSINNÖN YHTEENVETO

10 Tunnistaen tulehduksen kontrollin tärkeyden ja kudosselektiivisen lymfosyyttien kulkeutumiseen vaikuttavien endoteelisolujen ligandien ymmärtämisen tarpeen, kyseiset keksijät pyrkivät tunnistamaan ihmisen nivelkalvon suonissa ilmentyviä molekyylejä. Nämä tutkimukset ovat huipentuneet uuden lymfosyyttien sitoutumiseen vaikuttavan ihmisen endoteelisolun molekyylin, 15 VAP-1, tunnistamiseen ja tätä molekyyliä tunnistavien monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseen. Nämä vasta-aineet ovat käyttökelpoisia VAP-1-tason kvantitatiiviseen ja kvalitatiiviseen määrittämiseen tarkoitetuissa testeissä sekä kliinisessä hoitotilanteessa, jossa kumotaan VAP-1-molekyylin toiminta hoidon tarpeessa olevassa potilaassa.

20 Keksintö koskee VAP-1-proteiinin vasta-aineita, erityisesti monoklo- naalisia vasta-aineita, sekä tämänkaltaisia vasta-aineita sisältäviä kompositioita. Tässä keksinnössä kuvataan monoklonaalinen vasta-aine, 1B2, sekä tätä tuottava hybridomasolulinja (DSM ACC2041).

Keksintö koskee lisäksi menetelmää lymfosyyttien VAP-1-välitteisen 25 endoteelisoluihin sitoutumisen tunnistamiseksi, jossa menetelmässä inhiboidaan lymfosyyttien ja endoteelisolujen VAP-1-välitteinen adheesioreaktio in vitro antamalla VAP-1 sitovaa yhdistettä sellaisena määränä, joka riittää blok-kaamaan reaktioon osallistuvien endoteelisolujen VAP-1 sitoutumiskohdat, erityisesti sellaisissa tapauksissa, joissa lymfosyyttien ja endoteelisolujen ad-30 heesioreaktio liittyy tautiin, kuten tulehdukseen (krooninen tai akuutti) artriittiin, reumaan, dermatoosiin, tulehdukselliseen suolistotautiin ja autoimmuunitautiin.

Keksintö koskee vielä lisäksi menetelmää sellaisen lääketieteellisen tilan diagnosoimiseksi in vitro, jossa esiintyy VAP-1-välitteistä endoteelisolujen sitoutumista lymfosyytteihin. Menetelmä kattaa VAP-1-positiivisiin kohdesolui-35 hin sitoutuvan anti-VAP-1-vasta-aineen tunnistamisen näytteestä, jolloin kyseinen lääketieteellinen tila määritetään tämänkaltaisen sitoutumisen perusteella, 3 kyseisen lääketieteellisen tilan ollessa mm. tulehdus (krooninen tai akuutti) art-riitti, reuma, dermatoosi, tulehduksellinen suolistotauti ja autoimmuunitauti.

KUVIEN LYHYT KUVAUS

Kuva 1. VAP-1 esiintyminen ihmisen kudoksissa. (A) Tulehtuneessa 5 nivelkalvossa monoklonaalinen vasta-aine 1B2 värjää HEV-kaltaiset suonet voimakkaasti. (B) Nielurisassa VAP-1-ilmentyminen HEV:ssä vaihtelee voimakkaasta (nuoli) heikkoon (nuoli) tai negatiiviseen. (C) Nielurisan immuno-fluoresenssivärjäys osoittaa VAP-1 :n huomattavaa ilmentymistä suonen lumi-naalipinnalla (nuolet). (D) Umpisuolilisäkkeessä nähdään vain muutama hei-10 kosti värjäytyvä HEV (nuolet). Suurennukset: A 10Ox, B 250x, C ja D 400x.

Kuva 2. VAP-1 on 90 kD:n kokoinen proteiini. Kaista 1: Immuno-puhdistetun VAP-1 :n hopeavärjäys. Kaistat 2-3: 125l-leimatut nielurisan sideku-dossolut immunopresipitoitiin joko vasta-aineella 1B2 (kaista 2) tai kontrollivas-ta-aineella 3G6 (kaista 3). 180-200 kD bändit eivät aina esiinny. Molekyylipai-15 nostandardit vasemmalla. Lymfosyyttivapaat nielurisauutteet solubilisoitiin ha-joituspuskurissa (150 mM NaCI, 10 mM Tris-base, 0.15 mM MgCh, 1% NP-40, i mM PMSF ja 1% aprotiniini) yli yön 4°C:ssa. Lysaatti sentrifugoitiin 10 000 g 30 min 4° C:ssa. Lysaatti esipuhdistettiin Sepharose CL-4B (Pharmacia, Ruotsi) pylväässä. Tämän jälkeen lysaatti ajettiin kolmen CNBr-aktivoidun sefa-20 roosipylvään läpi (Sepharose-4B, Pharmacia), jotka olivat derivoitu joko hiiren normaaliseerumilla, irrelevantilla IgGi -vasta-aineella tai 1 B2-vasta-aineella (5 mg/ml, 5 ml pylväs) Pylväät pestiin tarkoin hajoituspuskurilla. Tämän jälkeen 1 B2-pylvääseen sitoutunut materiaali eluoitiin käyttäen 50 mM trietanoliamiinia, kylmäkuivattiin, liuotettiin SDS-PAGE:en (7,5%, redusoitu) ja visualisoitiin ho-25 peavärjäyksen avulla.

Kuva 3. VAP-1 liittyy lymfosyyttien sitoutumiseen HEV:iin. Määritettiin lymfosyyttien sitoutumista nielurisaan, perifeerisiin imusolmukkeisiin (PLN), nivelkalvoon ja umpisuolilisäkkeen HEV:iin sekä granulosyyttien sitoutumista nielurisan HEV:iin 1 B2-vasta-aineen läsnä ollessa tai ilman käyttäen in vitro si-30 toutumiskoetta jääleikkeillä. Kolmen riippumattoman kokeen tulokset esitetään standardivirheineen prosenttilukuina kontrollisitoutumiseen verrattuna (100% = 3G6-käsiteltyihin leikkeisiin sitoutunut solumäärä).

Kuva 4. Eristetty VAP-1 tukee lymfosyyttien sitoutumista. Immuno-puhdistettu VAP-1 sekä kontrolliproteiinit (1E12; toinen endoteelisolu-35 molekyyli, joka tukee lymfosyyttien sitoutumista, ja BSA) absorboitiin lasille, ja määritettiin lymfosyyttien sitoutuminen. (A) Kahden riippumattoman kokeen tu- 4 lokset annettuna prosentteina kontrollisitoutumiseen verrattuna (100% = 3G6-vasta-aineen käsittelyn jälkeen levylle sidottuun VAP-1 tai 1E12 proteiiniin sidottujen solujen määrä). Ei-spesifinen sitoutuminen (BSA proteiiniin sitoutuminen) on vähennetty kaikista analyyseista. (B) Lymfosyyttien sitoutuminen VAP-5 1 pinnoitettuihin kuoppiin 3G6-vasta-aineen läsnä ollessa. (C) Lymfosyyttien sitoutuminen VAP-1 pinnoitettuihin kuoppiin 1 B2-vasta-aineen läsnä ollessa. VAP-1 ja 1E12 proteiinit oli affiniteettipuhdistettu nielurisauutteista kuten Kuvassa 2 esitettiin. Puhdistettu VAP-1 , 1E12 ja kuumuudella inaktivoitu BSA laimennettiin 20 mM Tris-HCI, pH 7.4, 150 mM NaCI, 2 mM MgCi2, 2 mM Ca-10 Ci2 käyttäen 0.01% β-oktyyliglukopyranosiidia detergenttina. Proteiinit kiinnitettiin lasikuoppiin (Lab-Tek kammiolevy, NUNC) 16 h +4°C:ssa. Blokkaus suoritettiin 30 min huoneenlämmössä PBS:llä johon oli lisätty 1 mg/ml BSA, jonka jälkeen kuoppiin lisättiin 1B2 ja 3G6 supernatantit ja inkuboitiin 30 min huoneenlämmössä. Samanaikaisesti inkuboitiin juuri eristettyjä perifeerisen veren 15 mononukleaarisia soluja RPMI 1640:ssä, sisältäen 10% FCS ja 10 mM Hepes 1 tunti 37°C:ssa kudosviljelypulloissa pohjaan kiinnittyvien monosyyttien poistamiseksi. Kiinnittymättömät lymfosyytit (1.8x106 solua/kuoppa) lisättiin jokaiseen kuoppaan 100 pl:ssa RPMI 1640. Inkuboitiin 30 min 37°C:ssa, jonka jälkeen kiinnittymättömät solut poistettiin. Kuoppien väliseinät poistettiin, levyt 20 pestiin heikossa PBS virrassa ja fiksattiin kylmässä PBS:ssä, joka sisälsi 1% glutaarialdehydiä. Tämän jälkeen solut värjättiin Diff-Quick värjäysaineella. Kiinnittyneet solut kvantitoitiin määrittämällä visuaalisesti jokaisen kuopan so-lumäärä (totaalinen pinta-ala 50 mm2/näyte).

Kuva 5. VAP-1 on lisääntynyt tulehtuneessa suolessa. Normaa-25 lisuolessa esiintyy vain muutama heikosti positiivinen suoni lamina propriassa (A, tässä kohdassa suonet ovat käytännössä VAP-1-negatiivisia). Tulehtuneessa suonessa (ulseratiivinen koliitti) nähdään useita VAP-1-positiivisia suonia (nuolet) sekä B) lamina propriassa että C) järjestäytyneissä imusolukeräy-tymissä. Endogeeniset peroksidaasia sisältävät solut (mast solut) osoittavat ei-30 spesifistä reaktiivisuutta, e, suolen epiteelisoluja; Ip, lamina propria. Suurennus 250x.

Kuva 6. VAP-1 induktio kroonisessa dermatoosissa. Ihon koepalat saman potilaan ihon normaalialueelta (A) ja psoriasis-leesiosta (B) osoittavat että VAP-1 on indusoitunut tulehduskohtien dermaalisuonissa (nuolet). Peri-35 vaskulaarinen leukosyytti-infiltraatio näkyy VAP-1-positiivisten suonien ympärillä. e, epidermis. Suurennus 200x. C) VAP-1 :n ilmentyminen (arvio + -> ++++) 5 normaalissa ja sairaassa ihossa määritettiin rinnakkaisista koepaloista (normaali ja leesio) samasta potilaasta. Suluissa olevat luvut osoittavat jokaiseen ryhmään kuuluvien potilaiden määrän.

Kuva 7. Tulehduksen indusoima VAP-1 vaikuttaa lymfosyyttien si-5 toutumiseen. Jääleikkeellä tehtiin sitoutumistesti, jossa tutkittiin perifeerisen veren lymfosyyttien sitoutumista Tekijä Vlll-positiivisiin suoniin tulehtuneessa lamina propriassa. Inhibitiotesti suoritettiin pre-inkuboimalla kudosleikkeet vasta-aineilla 1B2 ja 3G6. Tulokset esitetään prosentteina kontrollisitoutumisesta standardivirheineen (so. PBL-sitoutuminen 3G6-vasta-aineen läsnä ollessa 10 määritellään 100%:ksi).

KEKSINNÖN TARKEMPI KUVAUS

Leukosyyttien pintareseptoreiden ja näiden vaskulaarisissa endo-teelisoluissa olevien ligandien välisellä vuorovaikutuksella on kriittinen merkitys lymfosyyttien liikkumiselle veren ja erilaisten lymfaattisten kudosten välillä sekä 15 leukosyyttien siirtymiselle suonista tulehduskohtiin. Me kuvaamme tässä uutta 90 kD:n ihmisen endoteelisolun adheesiomolekyyliä (VAP-1) määriteltynä mo-noklonaalisen vasta-aineen 1B2 avulla. VAP-1 ilmenee ensisijaisesti nivelkal-von, perifeeristen imusolmukkeiden ja nielurisan HEV:eissä ja 1B2 inhiboi huomattavasti lymfosyyttien sitoutumista HEV:iin näissä kudoksissa, toisin kuin 20 suoliston imukudoksessa. Lisäksi lymfosyytit sitoutuvat immunoaffiniteettieris- tettyyn VAP-1 :een tavalla, joka on inhiboitavissa 1B2-vasta-aineella. Esiintyminen, molekyylipaino ja toiminnalliset ominaisuudet osoittavat että VAP-1 on uusi lymfosyyttien endoteeliligandi. Me päättelemme, että VAP-1 on uusi vas-kulaarinen molekyyli, joka suoranaisesti liittyy lymfosyyttien kulkeutumiseen 25 ihmisessä.

Vasta-aineiden tuotanto VAP-1-proteiinin alustavaksi tunnistamiseksi tuotettiin monoklonaa-lisia vasta-aineita nivelkalvon suonia vastaan immunisoimalla sopiva eläin, kuten hiiri, käyttäen ihmisen nivelkalvon sidekudosta. Tämänkaltainen ihmisen 30 nivelestä peräisin oleva sidekudosmateriaali saadaan käyttäen sinänsä tunnet tuja menetelmiä. Nivelkalvon sidekudos voidaan eristää poistamalla lymfosyytit nivelkudoksesta. Nivelkudos hienonnetaan ja hienonnettu kudos puristetaan ruostumattoman terässiivilän läpi. Sidekudosmateriaali kerätään siivilän päältä.

Immunogeeni annetaan yhdessä adjuvantin kanssa, kuten esimer-35 kiksi vajaan Freundin adjuvantin kanssa, joskin mitä tahansa sopivaa adjuvant- 6 tia voidaan käyttää. Immunogeeni ja adjuvantti injisoidaan käyttäen mitä tahansa tunnettua anto-ohjetta tai protokollaa, jolla aikaansaadaan vasta-aineiden muodostumisen indusointi. Immunogeeni (nivelkalvon sidekudosma-teriaali, jossa on arviolta noin 1 pg VAP-1 -antigeeniä injektiota kohden), voi-5 daan esimerkiksi injisoida kolme kertaa viikon väliajoin spesifisesti pato-geenivapaan Balc/c hiiren jalkapöytään, jolloin immuunivaste indusoituu.

Polven takana olevien imusolmukkeiden lymfosyytit eristetään käyttäen sinänsä tunnettuja menetelmiä kuten yllä kuvattiin, puristamalla jauhetut imusolmukkeet ruostumattoman terässiivilän läpi ja keräämällä vapautuneet 10 lymfosyytit siivilän läpi kulkevasta aineesta, jonka jälkeen ne fuusioidaan ei-sekretoiviin NS-1 hiiren myeloomasoluihin (saatavana ATCC:stä, numerolla TIB 18) käyttäen standardimenetelmiä. Hybridomat voidaan seuloa käyttäen mitä tahansa sopivaa menetelmää, kuten jääleikkeiden immunoperoksi-daasivärjäystä. Yksi hybridoma (1B2, alaluokka IgGi,) joka tuotti nivelkalvon 15 vaskulaarisen endoteelin kanssa reaktiivista vasta-ainetta kloonattiin kaksi kertaa rajaavalla laimennoksella ja valittiin jatkotutkimuksia varten. Monoklonaali-sen vasta-aineen 1B2 tunnistama antigeeni nimettiin VAP-1 :ksi (engl. Mascu-lar Adhesion Protein-1).

Keksinnön mukaisissa menetelmissä VAP-1 :een sitoutuvina proteii-20 neina käytetyt vasta-aineet ovat monospesifisiä vasta-aineita, so. vasta-aineita jotka tunnistavat spesifisesti vain VAP-1-proteiinin tai tämän antigeenistä osaa. Monospesifiset vasta-aineet voivat olla sekä polyklonaalisia että monoklonaali-sia.

Polyklonaalisia vasta-aineita voidaan valmistaa injisoimalla sopi-25 vaan eläimeen olennaisesti puhdas VAP-1 valmiste ja antamalla tämän jälkeen yksi tai useampi täydennysinjektio sopivin väliajoin.

Keksinnön mukaisissa menetelmissä on kuitenkin edullista käyttää VAP-1-antigeeniä tunnistavia monoklonaalisia vasta-aineita (tai näiden biologisesti aktiivisia johdannaisia kuten Fab’, F(ab’)2 tai Fv-fragmentteja). On huo-30 mättävä, että monoklonaaliset vasta-aineet voidaan tuottaa missä tahansa sopivassa kohteessa, ja ne voivat siten olla esimerkiksi jyrsijän tai ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita.

Vasta-aine voidaan myös tuottaa kloonaamalla vasta-ainetta tai sen biologisesti aktiivista johdannaista koodittava DNA-sekvenssi sopivaan soluun, 35 esim. mikrobi-, kasvi-, eläin- tai ihmissoluun, ja viljelemällä soluja vasta-aineen 7 tai sen biologisesti aktiivisen johdannaisen tuotantoa suosivissa olosuhteissa ottaen viljelystä taiteen vasta-aine tai sen biologisesti aktiivinen johdannainen.

Esillä olevassa keksinnössä käytetyn reagenssin vasta-aineet tulisi edullisessa tapauksessa olla olennaisesti puhtaassa muodossa menetelmän 5 täsmällisyyden parantamiseksi.

VAP-1:n ominaisuudet

Eristetty VAP-1 on molekyylipainoltaan 90 kD redusoiduissa olosuhteissa ja 100 kD ei-redusoiduissa olosuhteissa.

Lymfosyyttivapaa nielurisauute on edullinen lähde VAP-1-antigeenin 10 eristämiseksi. Nämä uutteet voidaan valmistaa poistamalla lymfosyytit nielu-risakudoksesta puristamalla hienonnettu kudos ruostumattoman terässiivilän läpi. Sidekudosmateriaali otetaan talteen siivilän päältä. Toisaalta alla kuvatussa menetelmässä voidaan käyttää mitä tahansa VAP-1 ilmentävää solu-tyyppiä, koska esimerkinomaisesti esitetyissä menetelmissä lopullinen eristys 15 on riippuvainen VAP-1 - ja 1 B2-vasta-aineen välisestä affiniteetistä.

Kaikki vaiheet tulisi suorittaa viileässä (noin 4°C:ssa). Solut rikotaan varovaisesti (esimerkiksi yli yön +4°C:ssa) proteolyysiä inhiboivaa ainetta sisältävässä puskurissa, esim. puskurissa joka sisältää 150 mM NaCI, 10 mM Tris-base, 0.15 mM MgCI2 1 % NP40, 1 mM PMSF ja 1 % aprotiniiniä. Nämä uut-20 teet voidaan esipuhdistaa solujen rikkoutumisesta aiheutuvasta roskasta käyttäen varovaista sentrifugointia, esim. 10.000 g 30 min. Supernatantti siirretään tämän jälkeen affiniteettipylvässysteemiin, seuraavassa järjestyksessä, (1) hiiren normaaliseerumipylväs, (2) ei-spesifinen IgGi -vasta-ainepylväs (kuten 1E12 tai mikä tahansa kaupallisesti saatava ei-spesifinen IgGi-vasta-aine) ja 25 (3) monoklonaalinen vasta-aine 1B2-pylväs. 1B2-vasta-ainepylvääseen sitou tunut materiaali eluoidaan 50 mM trietanoliamiinin avulla ja kylmäkuivataan. Käyttäen tätä lähestymistapaa voidaan eristää VAP-1 nielurisan sidekudoksesta. Voidaan myös käyttää muita vastaavia, sinänsä tunnettuja menetelmiä.

Monoklonaalisen vasta-aineen 1B2 avulla huomataan, että tulehtu-30 neissa nivelkaivoissa VAP-1 esiintyy runsaasti HEV-kaltaisissa suonissa. VAP-1 ei esiinny infiltroivissa leukosyyteissä eikä missään nivelen sidekudoksen si-dekudoskomponentissa. Perifeerisissä imusolmukkeissa ja nielurisassa VAP-1 näyttää esiintyvän suurimmassa osassa HEV:stä. VAP-1 on vahvasti lokalisoitunut endoteelisolujen luminaalipuolelle. VAP-1 :n granulaarivärjäystä nähdään 35 endoteelisolujen sytoplasmassa sekä myös kudoksenpuoleisella pinnalla.

8

Erityisesti nielurisassa VAP-1-tasot vaihtelevat suuresti eri HEV:eissä ja muutama yksittäinen HEV (jolla tyypillinen pyöristynyt morfologia) on kokonaan VAP-1-negatiivinen. Umpilisäkkeessä ja suolen lamina proprias-sa näyttää olevan vain muutama heikosti värjäytyvä suoni. Heikosti ilmentyvä-5 nä VAP-1 esiintyy myös dendriittisolujen kaltaisissa soluissa itu keskuksissa ja arterioiden, laskimoiden ja suolenseinämän sileissä lihassoluissa.

Sitä vastoin VAP-1 puuttuu lähes kokonaan suurempien suonten luminaalipinnalta. Kudosleikkeiden lymfosyyttien lisäksi, VAP-1 ei näytä ilmentyvän seuraavissa soluissa: perifeerisen veren lymfosyytit, monosyytit, NK so-10 lut, granulosyytit ja eristetyt nielurisan leukosyytit, T-lymfoblastoidisolulinja CCRF-CEM (CCL 119, ATCC), B-lymfoblastoidisolulinjat KCA ja IBW-4 (EBV transformoitu B solulinja, joka on saatu E. Englemanilta, Stanford University), monosyyttinen solulinja U937 (CRL 1593, ATCC); ja leukemiasolulinjat KG-1 (CCL 246, ATCC); KG-1 a (CCL 246.1, ATCC) ja K562 (CCL 243, ATCC); en-15 doteelisolulinja EaHy-926 (karsinoma-ja endoteelisoluhybridomasolulinja, Ed-gell et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:3724 (1983)); sekä primaariviljelyssä olleet sileälihassolut, fibroblastit ja keratinosyytit, sekä eptieloidisolulinja He-La(CCL 2, ATCC). Jaffen menetelmän mukaisesti eristetyt (J. Clin. Invest. 522745 (1973)) ihmisen napanuoralaskimon endoteelisolut (HUVEC) eivät il-20 mennä VAP-1 sellaisinaan eikä myöskään 4 tai 20 tunnin IL-1-käsittelyn (20-100 U/ml), TNF-käsittelyn (200 U/mi) tai LPS-käsittelyn (1.1, 1.0 pg/ml) jälkeen.

Vertailemalla VAP-1 tunnettuihin leukosyyttien sitoutumiseen osallistuviin endoteelisolujen molekyyleihin huomataan useita eroja. Solujen väli-25 nen adheesiomolekyyli I ja 2 (ICAM-1 ja ICAM-2), vaskulaarisen solun adheesiomolekyyli 1 (VCAM-1), E-selektiini (ELAM-1) ja P-selektiini (CD62, PADGEM, GMP 140) ilmentyvät kaikki HUVEC-soluissa joko basaalisesti tai tulehdusmediaattori-induktion jälkeen (Springer, T.A., Nature 346:425 (1990); Stoolman, L. M., Cell 56.907 (1989); Osborn, L., Cell 62:3 (1990); Pober and 30 Cotran, Transplantation 50:537 (1990); Butcher, E.C., Cell 67:1033 (1991); de Fougerolles, A.R., et ai., J. Exp. Med. 174, 253 (1991); Osborn L., et al., Cell 59, 1203 (1989); Bevilacqua, M.P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 9238 (1987); McEver, R. P., et al., J. Clin. Invest 84, 92 (1989); Hattori, R., et al., J. Biol. Chem. 264, 7768 (1989); Wellicome, S.M., et al., J. Immunol. 144, 2558 35 (1990); Pober, J. S., etal., J. Immunol 137, 1893 (1986); Dustin, M. L., etal., J.

Immunol 137, 245 (1986)). Sitä vastoin VAP-1 ei ilmenny konstitutiivisesti eikä 9 IL-1, TNF-alfa tai LPS-käsittelyn indusoimana HUVEC-solujen pinnalla. Näiden molekyylien kudosdistribuutio on selkeästi erilainen, myös kun analysoidaan nielurisan rinnakkaisleikkeitä (tuloksia ei esitetty tässä). 1CAM värjäytyy useimpien suurten ja pienempien suonten luminaalipinnalla ja joissakin leuko-5 syyteissä (de Fougerolles, A. R., et ai., J. Exp. Med. 174, 253 (1991); Dustin, M. L, ei ai., J. Immunol 137, 245 (1986)). Toisaalta VCAM-1 ja ELAM-1 värjäytyy vain muutamissa tulehtuneen kudoksen laskimoissa (Rice, G. E., et ai., J. Exp. Med. 171, 1369 (1990); Rice, G. E., et ai., Am. J. Pathol. 138, 385 (1991); Cotran, R. S., et ai., J. Exp. Med. 164, 661 (1986)). Sitä vastoin VAP-1 ilmen-10 tyy voimakkaasti suurimmassa osassa HEV:ssä non-mukosaalisissa kohdissa ja puuttuu kaikista veren valkosoluista ja testatuista solulinjoista. Tunnetut adheesiomolekyylit eroavat myös selvästi VAP-1 :stä molekyylipainonsa suhteen, lukuun ottamatta ICAM-1 (ICAM-2 on 60 kD, VCAM-1 110 kD, E-selektiini 115 kD ja P-selektiini 140 kD molekyyli (Stoolman, L.M., Cell, 56: 907 (1989); Os-15 born, L, Dell 62: 3 (1990); and de Fougerolles, A. R., et ai., J. Exp. Med. 174, 253 (1991)). Lisäksi, VAP-1 osallistuu pääasiallisesti lymfosyyttien sitoutumiseen, kun taas ICAM:t, E-ja P-selektiini vaikuttavat myös tehokkaasti polymor-fonukleaaristen leukosyyttien adheesioon (Springer, T.A., Nature 346, 425 (1990); Stoolman, L.M., Cell 56, 907 (1989); Osborn, L, Cell. 62, 3 (1990); 20 Pober and Cotran, Transplantation 50, 537 (1990); Butcher, E.C., Cell 67, 1033 (1991)). Ainoa toistaiseksi kuvattu ihmisen lymfosyyttien sitoutumiseen vaikuttava endoteelin adheesiomolekyyli, joka ei ilmenny HUVEC:ssä on ME-CA-79-vasta-aineen tunnistama antigeeni (Berg, E.L., et ai., J. Cell Biol. 114, 343 (1991)). Tosin, tämä on perifeeristen imusolmukkeiden kudosspesifinen 25 addressiini. Lisäksi VAP-1 ei esiinny kaikissa MECA-79 positiivisissa laskimoissa, ja 1B2-vasta-aine ei tunnista puhdistettua MECA-79-antigeeniä.

Täten, VAP-1 :n ilmentymiskuvio, toiminta ja molekyylipaino osoittavat, ettei se ole identtinen minkään aikaisemmin kuvatun lymfosyyttien sitoutumiseen vaikuttavan endoteelimolekyylin kanssa ja että tulehdusaste korreloi 30 VAP-1 :n ilmentymistasoon in vivo. Nämä tulokset osoittavat, että VAP-1 on relevantti, kun tahdomme ymmärtää lymfosyyttien fysiologista kulkeutumista ihmisessä, ja että se on erityisen arvokas työkalu tutkittaessa kudosselektiivisen lymfosyyttien kotiutumisen molekulaarisia mekanismeja.

VAP-1-sitovien yhdisteiden käyttö 35 Esillä oleva keksintö koskee diagnostista reagenssia VAP-1- proteiinin ja VAP-1-positiivisten solujen detektoimiseksi ihmisen tai eläimen 10 kehosta otetusta näytteestä. Tällainen reagenssi on VAP-1-proteiinin kanssa reaktiivinen vasta-aine, tai tällaisen vasta-aineen VAP-1-reaktiivinen fragmentti, joka haluttaessa voi olla leimattu sellaisella aineella, joka mahdollistaa eristettyyn VAP-1 :een tai pinnallaan VAP-1 ilmentävien soluihin kiinnittyneen vas-5 ta-aineen tunnistamisen. Tämänkaltainen diagnostinen kompositio voidaan toimittaa kittimuotoisena, jollaisessa kitissä esiintyy erihiisissä säiliöissä: (a) VAP-1-reaktiivinen vasta-aine, tai tällaisen vasta-aineen biologisesti aktiivinen johdannainen, leimattuna sellaisella aineella, joka mahdollistaa 10 vasta-aineen VAP-1 -antigeeniin sitoutumisen detektion; ja (b) puhdistettu VAP-1-proteiini standardina testitulosten evaluoimiseksi.

Keksinnön mukainen reagenssi sopii minkä tahansa VAP-1 :n ad-heesiovälitteisen kohonneen tulehdusreaktion tunnistamiseen. Täten reagens-15 si on käyttökelpoinen esim. artriitin, paikallisen infektion, dermatoosin, tulehduksellisen suolistotaudin (IBD) ja autoimmuunitaudin kaltaisten tilojen tunnistamisessa.

Täten keksinnön mukaiset kompositiot ovat kompositioita, jotka sisältävät VAP-1-sitovia yhdisteitä sellaisessa määrin, että potilaan natiivin VAP-20 1:n sitoutuminen biologiseen VAP-1-kohteeseen, ja erityisesti endoteelisolui- hin, estyy (kokonaan tai osittain) in vitro.

Esillä olevan keksinnön mukaiset kompositiot antavat lisäksi tarvittavat reagenssit ihmisen tai eläimen veren tai ekstrasellulaaristen kudosten VAP-1-tasojen määrittämiseen tarkoitettua laboratoriotestiä varten.

25 VAP-1-sitovat proteiinit, jotka ovat olennaisesti vapaita luonnollisista kontaminanteista, voidaan eristää ja puhdistaa luonnollisista lähteistä tai re-kombinanttilähteistä käyttäen tavanomaisia tunnettuja tämänkaltaisten proteiinien eristämiseen käytettyjä olosuhteita ja menetelmiä, kuten uutto, presipitaa-tio, kromatografia, affiniteettikromatografia, elektroforeesi tai vastaava.

30 Seuraavassa annetut esimerkit on tarkoitettu kuvaamaan esillä ole vaa keksintöä eivätkä ne millään tavalla rajoita keksinnön suojapiiriä.

Esimerkki 1 VAP-1 kudosdistribuutio VAP-1 :n kudosdistribuutio määritettiin käyttäen jääleikkeiden immu-35 noperoksidaasivärjäystä. Leikkeet inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla (1B2 ja 11 kontrollina 3G6, hiiren lgG1-vasta-aine kanan T-soluja vastaan) 30 min. Pestiin kaksi kertaa fosfaattipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella (PBS, 8 g NaCI, 1.21 g K2HP04 ja 0.34 g KH2P04 litralla, pH 7.2), jonka jälkeen lisättiin peroksidaasikonjugoitua lampaan anti-hiiri-lgG (Dakopatt, Tanska) 5% AB-5 seerumia sisältävässä PBS:ssä 30 min. Seuraavaksi käytettiin kromogeenina 3’3’-diaminobentsidiinihydrokloridia 0.03% vetyperoksidia sisältävässä PBS:ssä. Värjäyksen jälkeen leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä. Immunofluoresenssivärjäystä varten 3 pm jääleikkeet peitettiin primaarisilla vasta-aineilla ja käytettiin FITC-konjugoitua lampaan anti-hiiri-lgG:tä (Sigma, 10 St. Louis) kakkosvaiheen reagenssina.

Immunohistologiset värjäykset osoittivat, että monoklonaalinen vasta-aine 1B2 värjäsi HEV-kaltaiset laskimot voimakkaasti tulehtuneissa nivel-kaivoissa (Kuva 1 A). Infiltroituvissa leukosyyteissä ei ilmennyt mitään värjäystä, kuten ei myöskään tulehtuneessa nivelstroomassa. Monoklonaalisen vasta-15 aineen 1B2 tunnistama antigeeni nimettiin VAP-1:ksi (engl. Vascular Adhesion Protein-1). Perifeerisissä imusolmukkeissa ja nielurisassa mAb 1B2 reagoi lähes kaikkien HEV:ien kanssa (Kuva 1B). VAP-1 ilmentyi voimakkaasta endo-teelisolujen luminaalipuolella (Kuva 1C). Endoteelisolujen sytoplasmassa näkyi granulaarista värjäytymistä ja myös kudoksenpuoleinen pinta oli mAb 1B2 po-20 sitiivinen. Erityisesti nielurisassa värjäysvoimakkuudessa esiintyi huomattavaa vaihtelua eri HEV:ien välillä, ja muutama pullistunut HEV oli 1 B2-negatiivinen (Kuva 1B). Umpilisäkkeessä ja suolen lamina propriassa esiintyi vain muutama heikosti värjäytyvä laskimo (Kuva 1D). VAP-1 :n heikkoa ilmentymistä oli myös nähtävissä itukeskusten dendriittisolujen kaltaisissa soluissa ja arterioiden, 25 laskimoiden ja suolenseinämän sileälihassolujen pinnalla. Toisaalta VAP-1 puuttui lähes kokonaan suurten suonten luminaalipuolelta. Samoin kuin kudos-leikkeiden lymfosyytit, perifeeriset veren lymfosyytit, monosyytit, NK-solut, gra-nulosyytit ja nielurisasta eristetyt lymfosyytit olivat kaikki täysin 1B2-negatiivisia FACS-analyyseissä. VAP-1 puuttui T-lymfoblastoidi- (CCRF-CEM), B-30 lymfobhastoidi(KCA, IBW-4), monosyytti- (U937) ja leukemia- (KG-1, KG-1a, K 562) solulinjoista. Lisäksi VAP-1 puuttui ihmisen napanuoralaskimon endotee-lisoluista (HUVEC) basaalisesti; ja 4 h tai 20 h IL-1 (20,100 U/ml), TNF-p(200 U/mi) tai LPS (0.1 , 1.0 pg/ml) käsittely ei indusoinut sen synteesiä. Yksi endo-teelisolulinja (EaHy-926) oli myös 1B2-negatiivinen. Sileälihassolut, fibroblastit 35 ja keratinosyytit, jotka olivat olleet primaariviljelyssä ja yksi epiteloiidinen (He-La) solulinja eivät ilmentäneet VAP-1 :tä.

12

Esimerkki 2 VAP-1 :n solunsisäinen lokalisaatio

Esimerkissä 1 kuvatun kudoslokalisaatiokokeen lisäksi tutkittiin myös VAP-1 :n solujensisäistä lokalisaatiota konfokaalisen mikroskopian avulla 5 nielurisan paksuista leikkeistä (15 pm). Leikkeet inkuboitiin 15 min mAb:lla 1B2 tai 3G6, pestiin kaksi kertaa PBS:llä ja peitettiin FITC-konjugoidulla lampaan anti-hiiri-lg:llä 15 min. Tämän jälkeen näytteet peitettiin glyseroli-PBS-liuoksella käyttäen fenyleenidiamiinia anti-fadeing tekijänä ennen konfokaalimikrosko-pointia. Mikroskooppinen tutkimus osoitti selvästi, että VAP-1 esiintyy HEV:n 10 luminaalipinnalla sekä erillisissä sytoplasman granuloissa. Näiden granuloiden identiteetti on toistaiseksi epäselvä, mutta kaksi-väri-immunofluoresenssivärjäyksessä 1 B2-vasta-aineella granulat eivät ko-lokalisoituneet. Täten VAP-1-positiiviset granulat eivät ole endoteelisolujen Weibel-Palade bodeja, joiden tiedetään sisältävän endoteelisolun P-selektiini 15 molekyyliä.

Esimerkki 3 VAP-1 molekyylipainon määritys

Lymfosyyttivapaat nielurisauutteet hajotettiin puskurissa (150 mM NaCI, 10 mM Tris-base, 0.15 mM MgCb, 1% NP40, 1 mM PMSF ja 1% apro-20 tiniinia) yli yön 4°C:ssa. Lysaatti sentrifugoitiin 10.000 g 4°C:ssa. Supernatantti esipuhdistettiin Sepharose CL-4B pylväässä (Pharmacia, Ruotsi). Tämän jälkeen lysaatti ajettiin kolmen CNBr-aktivoidun sefaroosipylvään läpi (Sepharo-se-4B, Pharmacia), jotka olivat derivoitu joko hiiren normaaliseerumilla, irrelevantilla IgGi -vasta-aineella tai 1B2-vasta-aineella (5 mg/ml, 5 ml pylväs) Pyl-25 väät pestiin tarkoin hajoituspuskurilla. Tämän jälkeen 1 B2-pylvääseen sitoutunut materiaali eluoitiin käyttäen 50 mM trietanoliamiinia, kylmäkuivattiin, liuotettiin ja ajettiin SDS-PAGE:en (7,5%, redusoitu) ja visualisoitiin hopeavärjäyksen avulla.

Jodivärjäystä varten lymfosyyttivapaat nielurisauutteet digestoitiin 30 RPMI 1640:ssa, sisältäen 100 U/ml kollagenaasia (Clostridium histolyticum, tyyppi II, Sigma), 10% FCS, antibiootteja ja 10 mM Hepes 1 tunti 37°C:ssa varovasti hämmentäen. Kollagenaasikäsittelyn jälkeen solut pestiin HBSS:llä ja pintaleimattiin käyttäen 125l ja laktoperoksidaasimenetelmää. Jodileimatut solut lysoitiin puskurissa ja lysaatti esipuhdistettiin sentrifugoimalla I0000g 15 min. 35 Lysaattia esipuhdistettiin lisäksi 16 tuntia 4°C:ssa CnBR-aktivoidulla hiiren 13 normaaliseerumiin kytketyllä Sepharose:lla. Immunopresipitaatio suoritettiin käyttäen CnBR-aktivoituja 1B2 tai 306 päällystettyjä Sepharose 4B pallukoita. Näytteet analysoitiin käyttäen 7.5% SDS-PAGE redusoivissa olosuhteissa (2-merkaptoetanoli).

5 VAP-1:n molekyylipaino määritettiin nielurisasta käyttäen affiniteet- tieristettyä molekyyliä SDS-PAGEssa. Geelin hopeavärjäys osoitti pääasiallisen bändin, jonka molekyylipaino oli 90 kD redusoiduissa olosuhteissa (Kuva 2). VAP-1 liikkui hieman hitaammin ei-redusoiduissa olosuhteissa (Mr 100 kD). Jodivärjätyn nielurisakudoksen immunopresipitaattien analysointi varmisti 1B2-10 vasta-aineen reaktiivisuutta 90 kD:n molekyylin kanssa (sekä hieman pienemmän degradaatiotuotteen kanssa (Kuva 2). Joissakin tapauksissa oli myös 180-200 kD:n bändi nähtävissä.

Esimerkki 4

Lymfosyyttien sitoutuminen nielurisaan, perifeeriseen imusolmukkee-15 seen (PLN), nivelkalvoon ja umpisuolilisäkkeen HEV:iin sekä granulo-syyttien sitoutumien nielurisa-HEV:iin Tämän menetelmän yksityiskohdat on aikaisemmin julkaistu julkaisussa Jalkanen ja Butcher, Blood 66, 577 (1985). Lyhyesti kuvattuna juuri leikatut ihmisen nielurisan, nivelkalvon, umpilisäkkeen ja perifeeristen imusol-20 mukkeiden jääleikkeet inkuboitiin 1B2 tai 3G6 supernatanteilla 30 min 7°C:ssa varovasti pyörittäen. Lisättiin F icoll -eri stetyt lymfosyytit (3x106/leike) HBSS:ssä, jossa oli 5% FCS ja 10 mM Hepes, ja jatkettiin inkubointia 30 min. Inkuboinnin jälkeen kiinnittymättömät solut kaadettiin varovasti pois ja kiinnittyneet solut fiksoitiin yli yön kylmässä PBS:ssä, jossa oli 1% glutaraldehydiä. 25 HEV:iin sitoutuneet solut laskettiin 4-6 leikkeestä kudosta ja näytettä kohden (vähintään 100 HEV) single blind-periaatteella. Granulosyyttejä määritettäessä käytettiin vastaavaa menetelmää sillä erolla, että granulosyytit (eristetty käyttäen Histopaque 1119, Sigma) pidettiin Ca2+ja Mg2+vapaassa HBSS:ssä kunnes siirrettiin leikkeille.

30 VAP-1 :n kudosdistribuutio endoteelisoluissa in vivo osoitti, että pro teiini saattaa toimia leukosyyttien spesifisenä tunnistuselementtinä. Siksi tutkittiin VAP-1 :n toiminnallista roolia HEV-sitoutumisessa käyttäen modifioitua Stamper-Woodruff in vitro -menetelmää (Jalkanen and Butcher, Blood 66, 577 (1985)). Jääleikkeiden esikäsittely 1 B2-vasta-aineella inhiboi lymfosyyttien si-35 toutumisen HEV:iin (Kuva 3). Inhibitoorinen teho oli selvin nielurisassa ja peri- 14 feerisissä imusolmukkeissa, mutta myös sitoutuminen nivelkalvon HEV:iin oli huomattavasti pienempi. Vaikutus lymfosyyttien sitoutumiseen umpilisäkkeen HEV:iin ja granulosyyttien sitoutuminen nielurisan HEV:iin oli vähäisempi (Kuva 3). Nämä tulokset osoittavat, että VAP-1 joko myötävaikuttaa tai liittyy lähei-5 sesti perifeeristen imusolmukkeiden, nielurisan ja nivelkalvon HEV:ien lymfosyyttien tunnistamiseen vaikuttaviin endoteelisolujen tekijöihin. VAP-1 :n lymfo-syyttiendoteelioluinteraktioon liittymisen suoraa evaluointia varten tutkittiin lymfosyyttien sitoutumista affiniteettipuhdistettuun VAP-1-proteiiniin (Kuva 4). Lymfosyytit kiinnittyivät tehokkaasti kuoppiin sidottuun VAP-1 :een. Lymfosyyt it) tien sitoutuminen VAP-1 :een inhiboitui spesifisesti 1 B2-vasta-aineella, mutta ei 3G6 kontrollivasta-aineella. Monoklonaalinen vasta-aine 1B2 ei ehkäissyt lymfosyyttien sitoutumista toiseen ei-relevanttiin endoteelisolumolekyyliin (Kuva 4).

Kudosdistribuutio ja HEV-sitoutuminen osoittaa, että VAP-1 pääasiallisesti liittyy lymfosyyttien kulkeutumiseen perifeerisiin imusolmukkeisiin, nie-15 lurisaan ja nivelkalvoon. Mielenkiintoista on, että nielurisassa VAP-1-ilmentymisen puute määrittelee pienen postkapillaarilaskimopopulaation, joka morfologisti ei eroa 1B2-positiivisista. Koska nielurisa on tiiviisti yhteydessä suolistoon siinä voi esiintyä sekä limakalvotyyppisiä (VAP-1-negatiivinen), että perifeeristen imusolmukkeiden (VAP-1-positiivinen) HEV:ejä. On vielä määri-20 tettävä miten VAP-1-ilmentymisen fenotyyppiset erot korreloivat yksittäisten HEV:ien lymfosyyttien sitoutumiskapasiteettiin. Pienet VAP-1 määrät limakalvojen lymfaattisissa elimissä viittaavat siihen, että tämä endoteeliantigeeni voi olla differentioidun reguloinnin alaisuudessa erilaisissa lymfosyyttien tunnistus-systeemeissä. Lisäksi tulehduksen taso korreloi VAP-1 :n ilmentymiseen in vi-25 vo.

Esimerkki 5 1B2:n vaikutus solujen sitoutumiseen VAP-1-proteiiniin

VAP-1 ja 1E12 affiniteettipuhdistettiin nielurisauutteista kuten Esimerkissä 2 kuvattiin. Puhdistettu VAP-1, 1E12 ja kuumuudella inaktivoitu BSA 30 laimennettiin 20 mM Tris-HCI, pH 7.4, 150 mM NaCI, 2 mM MgCI2, 2mM CaCI2 sisältäen 0.01% β-oktyyliglykopryanosiidiä detergenttinä. Proteiini absorboitiin lasikuoppiin (Lab-Tek kuoppalevyt, Nunc) 16 h +4°C:ssa. Blokattiin PBS:llä, jossa oli 1 mg/ml BSA 30 min huoneenlämmössä, jonka jälkeen kuoppiin lisättiin 1B2 tai 3G6 supernatantit ja inkuboitiin vielä 30 min huoneenlämmössä. Li-35 säksi inkuboitiin juuri eristettyjä perifeerisien veren mononukleaarisoluja RPMI

15 1640:ssä, jossa oli 10% FCS ja 10 mM Hepes, 1 tunti 37°C:ssa kudosviljely-pulloissa monosyyttien poistamiseksi. Kiinnittymättömät lymfosyytit (1.8x106 solua/kuoppa) 100 pl RPMI 1640:ssa, lisättiin jokaiseen kuoppaan. Inkuboitiin 30 min 37°C:ssa, jonka jälkeen kiinnittymättömät solut kaadettiin pois. Kuoppi-5 en kannet poistettiin ja levyt pestiin hienossa PBS-virrassa, fiksattiin kylmässä PBS:ssa, jossa oli 1% glutaraldehydiä. Tämän jälkeen solut värjättiin käyttäen Diff-Quick väriä. Kiinnittyneet solut kvantitoitiin visuaalisesti laskemalla solu-määrä jokaisessa kuopassa (koko pinta-ala 50 mm2/näyte).

Esimerkki 6 10 VAP-1-proteiinin osittainen aminohapposekvenssi Määritettiin 90 kD:n VAP-1-antigeenin osittainen aminohapposekvenssi. Tämä osittainen aminohapposekvenssi on 20 aminohapon pituinen: TEDGDMXLVNGASANEGXVE [SEQ ID NO. :1:j. Proteiini-ja DNA-sekvenssien tietopankeista suoritettu haku osoitti, ettei tämä sekvenssi kuulu 15 mihinkään aikaisemmin tunnettuun sekvenssiin.

Esimerkki 7 VAP-1 määritys tulehdusvastetta osoittavista kliinisistä näytteistä

Tuoreet näytteet normaalista nielurisasta, perifeerisistä imusolmukkeista, suolistosta ja sydämistä saatiin leikkauksista ja munuaisnäytteet saatiin 20 elinluovuttajilta. Muut kudokset ovat peräisin koepalanäytteistä. Kaikki näytteet määritettiin histopatologisesti ei-tu!ehtuneiksi. Tulehdusnäytteet saatiin kroonisesta dermatoosista kärsivien potilaiden ihobiopsioista (psoriasis, atooppinen ihottuma, lichen ruber pianus). Samoista potilaista otettiin kontrollibiopsiat makroskooppisesti terveiksi määritellyiltä alueilta. Suoliston tulehdusnäytteet 25 saatiin tulehduksellista suolistotautia potevista potilaista (Crohnin tauti, ulsera-tiivinen koliitti), joille tehtiin terapeuttinen leikkaus. Nivelkalvonäytteet olivat peräisin synovektom ioista.

Näytteet värjättiin immunoperoksidaasilla kuten Esimerkissä 1 kuvattiin. Lyhyesti kuvattuna asetonifiksoidut jääleikkeet inkuboitiin primaarivasta-30 aineella (viljelysupernatantilla tai 50 pg/ml puhdistettua immunoglobuliinia) ja sopivalla peroksidaasikonjugoidulla toisen vaiheen reagenssilla ja värireaktio aikaansaatiin käyttäen H202 ja diamiinobentsidiiniä substraattina. VAP-1-ilmentyminen suoli-ja ihonäytteissä (normaali ja tulehtunut) analysoitiin koodatuista näytteistä kahden itsenäisen tutkijan voimin tuntematta diagnoosia.

16

Kuten Esimerkissä 1 todettiin, VAP-1 ilmentyy vain matalalla tasolla joissakin normaalin ei-tulehtuneen suolen laskimoissa (Kuva 5A). Toisaalta tulehduksellista suolistotautia potevan potilaan suolistonäytteessä esiintyi huomattavaa VAP-1-ilmentymisen nousua (Kuvat 5B ja 5C sekä Taulukko 1). 5 VAP-1 indusoitui sekä lamina proprian ohutseinäisissä laskimoissa ja organisoidun lymfaattisen follikkelin (Peyer’s patches) HEV-kaltaisissa laskimoissa. VAP-1 :n lisääntynyt synteesi korreloitu! myös ihon krooniseen tulehdukseen (Kuvat 6A ja B). Tuloksiin vaikuttavien yksilöllisten erojen poissulkemiseksi otettiin samanaikaisesti näytteet saman potilaan dermatoosileesiosta sekä 10 kontrollinäyte terveestä ihosta. Myös näissä näytteissä VAP-1-positiivisten las kimoiden määrä ylemmässä dermiksessä oli korkeampi tulehdusnäytteessä kuin vastaavassa kontrollialueelta otetussa näytteessä. Lisäksi VAP-1-positiivisiin laskimoihin liittyi aina huomattava perivaskulaarinen leukosyytti-infiltraatio.

15 Taulukko 1 VAP-1 induktio tulehduksellisissa suolistotaudeissa Näyte n VAP-1 - + ++ +++ ++++

Normaali 9 0 5 3 1 0

Crohn 7 0 0 2 3 2

Ulserat. koi. 7 0 0 0 5 2

Suoli-näytteet otettiin crohnin tautia, ulseratiivista koliittia ja tuumoreita sairastavista leikkauspotilaista (tuumorinäytteiden normaalialueet edustavat ”nor-20 maali” näytteitä).

VAP-1-positiivisten laskimoiden määrä per näyte määritettiin , ++++ kuten yllä kuvattiin.

Esimerkki 8 VAP-1 vaikuttaa tulehtuneen limakalvon sitoutumisreaktioon 25 In vitro sitoutumistesti jääleikkeillä suoritettiin kuten Esimerkissä 3 kuvattiin. Monoklonaalinen vasta-aine 1B2 inhiboi lymfosyyttien sitoutumista 17 lamina proprian pieniin suoniin noin 60% (Kuva 7) kahdessa suolistonäyttees-sä, joissa VAP-1 ilmentyminen ohi huomattavaa.

Koska keksintöä on tässä kuvattu spesifisten käyttöesimerkkien avulla on ymmärrettävä, että sitä voidaan edelleen modifioida ja tämä hake-5 mus on tarkoitettu kattamaan mitä tahansa keksintöön kohdistuvaa variaatiota, käyttöä tai adaptaatiota, jotka noudattavat keksinnön mukaista periaatetta kattaen myös sellaisia esillä olevasta kuvauksesta poikkeavia käyttöjä, jotka kuuluvan keksinnön kohteena olevan alan tunnettuun tai tavanomaiseen käyttöön ja joita voidaan soveltaa yllä kuvattuihin olennaisiin ominaisuuksiin liitteessä 10 olevien vaatimusten mukaisessa laajuudessa.

18

Sekvenssilistaus (1) YLEISET TIEDOT: (i) HAKIJA: (A) : NIMI: Jalkanen, Sirpa (B) : KATU: Rauvolantie 79 (C) : KAUPUNKI: Piispanristi

(E) : MAA: SUOMI

(F) : POSTINUMERO: FI-20760 (i) HAKIJA: (A) : NIMI: Salmi, Marko (B) : KATU: Kellonsoittajankatu 8a A13 (C) : KAUPUNKI: Turku

(E) : MAA: SUOMI

(F) : POSTINUMERO: FI-20500 (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Lymfosyyttien sitoutumiseen vaikuttava ihmisen endotee-lisolun molekyyli (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 1 (iv) KIRJEENVAIHTO-OSOITE: (A) VASTAANOTTAJA: Biotie Therapies Oyj (B) KATU: Tykistökatu 6 (C) KAUPUNKI: Turku

(E) MAA: SUOMI

(F) POSTINUMERO: FI-20520 (v) KONEKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke (B) TIETOKONE: Fujitsu Siemens (C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: M/S Office 19 (D) OHJELMISTO: Microsoft Word (vi) NYKYISEN HAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: 945784 (B) JÄTTÖPÄIVÄMÄÄRÄ: 9.6.1993 (2) SEKVENSSIN NRO 1 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 20 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: molempia (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI

NRO 1:

Thr Glu Asp Gly Asp Met Xaa Leu Vai Asn Gly Ala Ser 1 5 10

Ala Asn Ghu Gly Xaa Vai Glu 15 20

Claims (14)

1. Anti-VAP-1 vasta-aine tai tämän anti-VAP-1 sitova fragmentti, tunnettu siitä, että kyseinen vasta-aine tai sitova fragmentti tunnistaa spesifisesti sellaista ihmisen endoteeli-VAP-1-proteiinia, joka on tunnistettavissa tallennusnumerolla DSM AGO 2041 varustetun hybridomasolulinjan avulla tuotetun monoklonaalisen vasta-aineen avulla, ja joka vasta-aine ei sitoudu ihmisen napanuoralaskimosolun (HUVEC) pintaproteiineihin.

2. Suonen adheesioproteiinia VAP-1 spesifisesti tunnistava mono-klonaalinen vasta-aine 1B2, tunnettu siitä, että se on tuotettu hybrido-masolulinjassa, jolle on annettu tallennusnumero DSM ACC2041.

3. Soluvapaa kompositio, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaista anti-VAP-1 vasta-ainetta tai tämän anti-VAP-1 sitovaa fragmenttia tai patenttivaatimuksen 2 mukaista monoklonaalista vasta-ainetta.

4. Menetelmä tunnistaa VAP-1 välitteistä endoteelisolujen sitoutumista lymfosyytteihin, tunnettu siitä, että VAP-1 välitteinen lymfosyytti-endoteelisolu-adheesioreaktio estetään in vitro antamalla minkä tahansa patenttivaatimuksen 1 - 3 mukaista VAP-1 :tä sitovaa yhdistettä riittävänä määränä endoteelisolujen kyseiseen reaktioon osallistuvien VAP-1 -sitoutumiskohtien blokkaamiseksi.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kyseinen VAP-1 sitova yhdiste on anti-VAP-1 vasta-aine.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kyseinen VAP-1 vasta-aine on polyklonaalinen.

7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kyseinen VAP-1 vasta-aine on monoklonaalinen.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kyseinen monoklonaalinen vasta-aine on monoklonaalinen vasta-aine 1B2.

9. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kyseinen lymfosyytti-endoteelisolu-adheesioreaktio liittyy seuraavaan ryhmään kuuluvaan tautiin: (krooninen tai akuutti) tulehdus, artriitti, reuma, infektio, dermatoosi, tulehduksellinen suolistotauti (IBD) ja autoimmuunitauti.

10. Menetelmä diagnosoida potilaassa lääketieteellistä tilaa, johon liittyy VAP-1 välitteinen endoteelisolujen sitoutuminen lymfosyytteihin, tunnettu siitä, että (1) poistetaan VAP-1 positiivisiksi epäiltyjä soluja kyseisestä potilaasta (2) saatetaan kohdan (1) mukaisen solut yhteyteen patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen anti-VAP-1 vasta-aineen kanssa (3) detektoidaan anti-VAP-1 vasta-aineen sitoutumista kyseisiin VAP-1 positiivisiin soluihin, ja (4) määritetään kyseinen lääketieteellinen tila kyseisen sitoutumisen määrän perusteella.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kyseinen VAP-1 vasta-aine on polyklonaalinen.

12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kyseinen VAP-1 vasta-aine on monoklonaalinen.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kyseinen monoklonaalinen vasta-aine on monoklonaalinen vasta-aine 1B2.

14. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kyseinen lääketieteellinen tila on tauti joka kuuluu seuraavaan ryhmään: (krooninen tai akuutti) tulehdus, artriitti, reuma, infektio, dermatoosi, tulehduksellinen suolistotauti (IBD) ja autoimmuunitauti.