JPH07507557A - ヒトにおけるリンパ球結合を仲介する新規な内皮細胞分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトにおけるリンパ球結合を仲介 する新規な内皮細胞分子 ｌ豆立豆１ 本発明は、ＶＡＰ−１と名づけられた新規なヒト内皮細胞接着抗原、およびＶＡ Ｐ−１抗原を認識するモノクローナル抗体、ｌＢ２に向けられ、ならびにリンノ （球移動で特徴づけられる慢性的な炎症性のおよび感染の状態の診断および治療 におけるかかる分子の用途に向けられる。

及ｍ旦 はとんどの成熟したリンパ球はたえず血液とリンノ（系器官とのあいだを再循環 している（ブ・ソチャー、イー・シー（Ｂｕｔｃｈｅｒ、　Ｅ、　Ｃ，）、カレ ント・トビ・ソクス・イン−フィクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（Ｃ ｕｒｒ、　Ｔｏｐ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｕ＋ｕｎｏ１．）１２８巻、８５頁（１９８６年） ）。リンＡ球は血管内皮細胞を認識しそこに結合することによって血液から出て いく。そののち、リンノ（球は内皮細胞間を通って周辺の組織の中へ移動する。

リンノく球の往来（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）により、リンパ球の特性のすべて のもの（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）が身体のいたるところでの免疫反応に用も１ら れるよう書こなり、また免疫応答の発生および制御に必要とされる細胞−細胞の 相互作用が促進される。内皮細胞との１ノンノく球の接着は、両方の細胞の型上 で発現される相補的な接着分子間の相互作用に依存する（スブリンガー、ティー ・ニー　（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、　Ｔ、　Ａ、　）、ネイチａｒ　−（Ｎａｔｕｒ ｅ）３４６巻、４２５頁（１９９０年）；ストールマン、エル・エム（Ｓｔｏｏ ｌｍａｎ、　Ｌ、　Ｍ、　）、セル（Ｃｅｌｌ）５６巻、９０７頁（１９８９年 ）；オズボーン、エル（Ｏｓｂｏｒｎ。

Ｌ、）、セル６２巻、３頁（１９９０年）；ホバー（Ｐｏｂｅｒ）およびコトラ ン（Ｃｏｔｒａｎ）、トランスプランテーション（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉ ｏｎ）５０巻、５３７頁（１９９０年）；ブッチャー、イー・シー（Ｂｕｔｃｈ ｅｒ。

Ｅ、　Ｃ，’）、セル６７巻、１０３３頁（１９９１年））。正常な状態では、 リンパ球は主に高内皮細静脈（ｈｉｇｈ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｖｅｎｕｌ ｅｓ）（ＨＥＶ）と呼ばれる、専門化された後毛細管の細静脈（ｓｐｅｃｉａｌ ｉｚｅｄ　ｐｏｓｔｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｖｅｎｕｌｅｓ）に結合する。器官に 特異的な方法での末梢リンパ節、粘膜のリンパ様器官、滑膜および皮膚へのリン パ球の移動を仲介する、機能的に別個なリンパ球−ＨＥＶ認識システムが記載さ れている（ブッチャー、イー・シーら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イム ノロジー（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）１０巻、２１０頁（１９８０ 年）：ヤルカネン、ニス（Ｊａｌｋａｎｅｎ、　Ｓ、　）ら、サイエンス（Ｓｃ ｉｅｎｃｅ）２３３巻、５５６頁（１９８６年）；ピッカー、エル・ジェイ（Ｐ ｉｃｋｅｒ、　Ｌ、　Ｊ、　）ら、ネイチ＋−３４９巻、７９６頁（１９９１年 ））。炎症では内皮細胞が活性化するとその接着分子の状況が変化し、その活性 化は影響される組織への白血球の流入（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　１ｎｆｌｕｘ）の 規模と型をほぼ決定する。

このように、内皮細胞分子は局所免疫応答の特徴を制御するのに重要な要素であ り、明らかにリンパ球の往来および白血球の血管外移動を調節する機構の詳しい 理解は炎症反応を臨床的に操るための新しい手段を提供することができる。

ヒトにおいて組織選択的リンパ球ホーミング（ｈｏｓｉｎｇ）を仲介する内皮細 胞リガンドはほとんど知られていないので、かかる分子を同定する必要がある。

本発明者らは１９９１年６月のヨーロピアン・フェデレーション・オブ・イムノ ロジカル・ソサイエティズ（ＥｕｒｏｐｅａｎＦｅｄｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉ ｏ＋ｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｉｅｓ）のミーティングでの要約に 、高内皮細静脈とのリンパ球結合に関係する、以前に知られていない内皮細胞抗 原の存在を示すいくつかの予備の知見を紹介した（サルミ（Ｓａｌｍｉ）ら、Ｅ ＦＩＳ　第１１回　ミーティング・アブストラクツ（ＥＦＩＳｌｌｔｈ　Ｍｅｅ ｔｉｎｇ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ）　、２１〜１２頁、　１９９１年）。

ｌ豆皮１ヱ 炎症を抑制することの重要性を認識し、組織選択性リンパ球ホーミングを仲介す る内皮細胞リガンドを理解することの必要性を認識して、本発明者らはヒト滑膜 管（ｓｙｎｏｖｉａｌ　ｖｅｓｓｅｌ）により発現されるような分子を同定しよ うと試みた。これらの研究により、ヒトにおけるリンパ球結合を仲介する新規な 内皮細胞分子、ＶＡＰ−１を同定し、それに対するモノクローナル抗体を産生じ た。

これらの抗体は、ＶＡＰ−ルベルの量的および質的な評価の分析において、およ びその治療が必要な患者でのＶＡＰ−１の作用と拮抗するように計画された臨床 的な治療において有用である。

したがって、本発明は第一に、ヒトまたは動物の宿主におけるＶＡＰ−１タンパ ク質と結びつ（天然夾雑物を本質的に含まない、ＶＡＰ−１タンパク質に向けら れる。

さらに本発明は単離されたＶＡＰ−１タンパク質に向けられる。

さらに本発明は、ＶＡＰ−１タンパク質に対する抗体、とくにモノクローナル抗 体、およびかかる抗体を含む組成物に向けられる。モノクローナル抗体ＩＢ２は 、この抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞系（ＤＳＭ　ＡＣＣ２０４１）と同様 に、本発明によってえられる。

さらに本発明は、ＶＡＰ−１が仲介する内皮細胞のリンパ球との結合に拮抗させ る方法に向けられる。この方法は、ＶＡＰ−１が仲介するリンパ球−内皮細胞接 着反応を、かかる反応に関与するＶＡＰ−１内皮細胞部位をブロックするのに充 分な量のＶＡＰ−１結合合成物（ＹＡＰ−１ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ ）を提供することによって阻害することからなり、と（にその部位ではリンパ球 −内皮細胞接着反応が、炎症（慢性または急性）、関節炎、リウマチ様関節炎、 感染症、皮膚疾患、炎症性腸疾患および自己免疫疾患などの疾患と結びつく。

さらに本発明は、患者におけるＶＡＰ−１が仲介する内皮細胞のリンパ球との結 合によって仲介される医療状態を診断する方法に向けられる。この方法は、かか る患者から採取したＹＡＰ−１陽性細胞に結合する抗ＶＡＰ−１抗体を検出する こと、およびかかる結合にもとづいて医療状態を診断することからなり、かかる 医療状態には炎症（慢性または急性）、関節炎、リウマチ様関節炎、感染症、皮 膚疾患、炎症性腸疾患および自己免疫疾患が含まれる。

の　な２日 Ｆｉｇ、１０ヒト組織におけるＶＡＰ−１（７）分布。（Ａ）炎症をおこしてい る（　ｉｎｆ　ｌａｍｅｄ）滑膜では、ｍＡｂ　ｌＢ２はＨＥＶ様血管を強（染 色する。（Ｂ）扁桃（ｔｏｎｓｉｌ）では、ＨＥＶにおけるＶＡＰ−１の発現は 、強いもの（矢じり）からきわめて弱いもの（矢印）または陰性のものまで様々 である。（Ｃ）扁桃の免疫蛍光染色は、血管の内腔表面上のＹＡＰ−１の顕著な 発現（矢印）を示す。

、　（Ｄ）虫垂では、わずかに弱（染まっているＨＥＶが見えるだけである（矢 じり）。倍率−Ａは１００倍、Ｂは２５０倍、ＣおよびＤは４００倍である。

Ｆｉｇ、　２゜ＶＡＰ−１は９０ｋＤのタンパク質である。レーンｌ：免疫精製 されたＹＡＰ−１の銀染色。レーン２および３：扁桃の１２５工でラベルされた 間質細胞はｍ　Ａ　ｂＩＢ２で（レーン２）またはコントロールのｍ　Ａ　ｂ３ Ｇ６で（レーン３）免疫沈降した。１８０〜２００ｋＤの範囲のバンドは必ずし も存在するわけではない。分子量標準は左に示されている。白血球を除去した（ ｄｅｐｌｅｔｅｄ）扁桃抽出物を、細胞溶解緩衝液（１５ｈＭ　Ｎ　ａ　Ｃｌ　 、　１０ａ＋Ｍ　トリス塩基、０．１５ａ＋Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　ｚ、１％ＮＰ− ４０，１ａ＋ＭＰＭＳＦおよび１％アプロチニン）に４°Ｃにて一晩溶解させた 。細胞溶解物を４℃にて１００００　ｇで３０分間遠心分離した。細胞溶解物を セファロース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−４Ｂ　（ファルマシア（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ）、スウェーデン）カラムを通すことによって上清をあらかじめ浄化し た。

つぎに正常なマウス血清を、関係のないＩ　ｇ　Ｇ　ｌ　ｒｎ　Ａ　ｂを、およ びＩＢ２ｍＡｂを用いてえられた、３つのＣＮＢ　ｒ活性化セファロース−４Ｂ （ファルマシア）カラム（５ｍｇ／ｌ、５ｍｌのカラム容積）にその上清を連続 して適用した。カラムを細胞溶解緩衝液で充分に洗浄した。そののち、１Ｂ２カ ラムに結合した材料を５０ｍＭ　トリエタノールアミンで溶出し、凍結乾燥し、 ５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離しく７．５％、還元）、銀染色を用いて視覚化した。

Ｆｉｇ、　３゜ＶＡＰ−１はＲＥＶとのリンパ球結合に関係する。扁桃、末梢リ ンパ節（ＰＬＮ）、滑層および虫垂のＨＥＶとのリンパ球の結合、および扁桃の ＲＥＶとの顆粒球の結合を、インビトロの凍結切片分析を用いてｍ　Ａ　ｂＩＢ ２の存在下および非存在下で評価した。３つの独立した実験の結果を標準誤差と ともにコントロールの結合の百分率として示す（１００％＝３０６処理切片上の 結合細胞の数）。

Ｆｉｇ、　４゜単離したＶＡＰ−１はリンパ球結合をサポートする。免疫精製さ れたＶＡＰ−１およびコントロールのタンパク１（ＩＥ１２；リンパ球結合をサ ポートする関連のない内皮細胞分子、およびＢＳＡ）をガラス上に吸収させ、リ ンパ球結合を調べた。（Ａ）２つの独立した実験の結果をコントロールの結合か ら百分率で示す（１００％＝ｍＡｂ　３Ｇ６処理後の、プレート結合ＶＡＰ−１ またはＩＥ１２に結合した細胞の数）。（ＢＳＡに結合している）非特異的なバ ックグラウンドをすべての分析結果から引算する。（Ｂ）ｍＡｂ　３Ｇ６の存在 下でＶＡＰ−１で被覆されたウェルとのリンパ球結合。（Ｃ）ｍＡｂＩＢ２の存 在下でＶＡＰ−１で被覆されたウェルとのリンパ球結合。ＶＡＰ−１およびＩＥ １２をＦｉｇ、　２　ニ示すように扁桃抽出物からアフィニティー精製した。精 製されたＶＡＰ−１、ＩＥ１２および熱不活性化したＢＳＡを、０．０１％β− オクチルグルコピラノシドを界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）として用いた２ ０ｍ１ｉ　トリス塩酸、ｐ）Ｉ７．４．１５０ｍＭ　ＮａＣ１，２ｍＭ　ＭｇＣ ｌ２．２ＩＩＩＭ　ＣａＣｌ２中に希釈した。タンパク質をガラスウェル（ラブ −チック（ｔａｂ−Ｔｅｋ）チャンバースライド、ヌンク（Ｎｕｎｃ））上に１ ６時間＋４℃で吸収した。１　ｍｇ／＋ｏｌ　Ｂ　Ｓ　Ａを含有するＰＢＳ中で ３０分間室温でブロックしたのち、ＩＢ２または３Ｇ６上清をウェルに添加し、 ３０分間室温でインキュベーションを続けた。一方、新たに単離された末梢血単 球を組織培養ボトルにおいて１０％ＦＣ５および１０ｍＭ　へペスを含有するＲ ＰＭＩ　１６４０中で１時間３７°Ｃでインキュベートしてプラスチック接着単 球を除去した。１００μｌのＲＰＭＩ１６４０中の非接着リンパ球（１，８ｘｌ ｏ細胞／ウエル）を各ウェルに適用した。３７°Ｃでの３０分間のインキュベー ションののち、非接着細胞を軽くたたくことによってはずした。ウェルの上表部 （ｔｏｐｓ）を除去し、スライドをＰＢＳのおだやかな流れによって洗浄し、１ ％グルタルアルデヒドを含有する冷ＰＢＳ中で固定した。そののち、ディツーク イック染色（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ　５ｔａｉｎｓ）を用いて細胞を染色した。

結合した細胞を、各ウェルにおける細胞の数を視覚的に評価して点数をつけるこ とによって定量化した（総面積５０ｎ＋ｍ　／試料）。

Ｆｉｇ、　５゜ＶＡＰ−１は炎症をおこした消化管（ｇｕｔ）で正の調節をうけ る。正常な消化管では、固有層（ｌａｍｉｎａｐｒｏｐｒｉａ）におけるごくわ ずかのかすかに陽性の血管力く観察される（Ａ、この範囲では細静脈はＶＡＰ− Ｉｆこ対してはほとんど陰性である）。炎症をおこした消化管（潰瘍性大腸炎） では、多数のＶＡＰ−１陽性細静脈（矢印）が、Ｂ）固有層でもＣ）組織化され たリンノ（小胞でも見られる。内因性パーオキシダーゼを含有する細胞（肥満細 胞）は非特異的な反応性を示す。ｅ１消化管の上皮細胞；１ｐ１固有層。倍率２ ５０倍。

Ｆｉｇ、　６゜慢性皮膚疾患でのＶＡＰ−１誘導。同じ患者の正常な範囲（Ａ） および乾癖の病変（Ｂ）からの皮膚生検材料は炎症の部位の皮膚の血管（矢じり ）でＶＡＰ−１の誘導を示す。血管周囲の白血球浸潤物はＶＡＰ−１陽性細静脈 の周辺にみられつる。ｅ１表皮。倍率２００倍。

Ｃ）正常なおよび疾患のある皮膚におけるＶＡＰ−１の発現（十〜＋＋＋＋で評 価した）は同一患者からの対の生検材料（関係のないものおよび関係するもの） について調べた。丸かっこ内に各群に属する患者数を示す。

Ｆｉｇ、　７゜炎症で誘導されたＶＡＰ−１はリンパ球結合を仲介する。凍結切 片結合分析を行ない、前記分析では炎症をおこした固有層の第■因子陽性細静脈 へのＰＢＬの結合を分析した。阻害分析は組織切片をｍＡｂ　ＩＢ２および３Ｇ ６でブレインキュベートすることによって行なった。結果を標準誤差とともにコ ントロールの結合の百分率として示す（すなわち、ｍＡｂ　３Ｇ６の存在下での ＰＢＬの結合を１００％の結合と定義する）。

■　の−　な　日 白血球表面の受容体と血管内皮細胞上のそれらのリガンドとの相互作用は、炎症 部位への白血球の血管外遊出と同様、白血球の血液と種々のリンパ器官とのあい だの往来を臨界的に制御する。我々はここに、モノクローナル抗体ＩＢ２で定義 される新規な９０ｋＤヒト内皮細胞接着分子（ＶＡＰ−１）について記載する。

ＶＡＰ−１は滑層、末梢リンパ節および扁桃の高内皮細静脈（ＨＥ　Ｖ）上に優 先的に発現され、ＩＢ２は粘膜部位でのＲＥＶとは対照的に、これらの組織のＨ ＥＶへのリンパ球結合を著しく阻害する。さらに、リンパ球はＩＢ２を阻害しう る方法でイムノアフィニティーで単離されたＹＡＰ−１と結合する。発現パター ン、分子量および機能的性質によってリンパ球に対する新規な内皮リガンドとし てＶＡＰ−１が定義される。我々はＶＡＰ−１はヒトにおけるリンパ球往来に直 接関係する新規な血管分子であると断定する。

Ｋ生立亙ユ ＶＡＰ−１タンパク質の初期の同定のために、滑層管に対するモノクローナル抗 体を、ネズミなどの適当な動物をヒト滑脱の間質要素で免疫することによって産 生じた。かかるヒト滑脱の間質要素は当該技術分野において知られている方法を 用いてえることができる。滑層の間質は滑脱組織からリンパ球を除去することに よって単離することができる。滑脱組織を細かく刻み、刻んだ組織をステンレス スチールのスクリーンによって押しつけた。

間質要素はスクリーンの上表部から集めた。

好ましくは免疫原は、たとえば不完全フロインドアジュバントなどのアジュバン トと一緒に投与するが、いかなる適当なアジュバントを用いてもよい。免疫原お よびアジュバントは抗体合成を誘導するであろういかなる方式またはプロトコル によっても注射しうる。たとえば、免疫原（注射あたり約ｌμｇのＶＡＰ−１抗 原を含有する滑脱間質要素）を１週問おきに３回、特異性病原体（５ｐｅｃｉｆ 　ｉｃ−ｐａｔｈｏｇｅｎ）のないＢ　ａ　ｌ　ｂ　／　ｃ　７ウスの足跡に注 射することによって免疫応答を誘導するであろう。

膝裏リンパ節からのリンパ球を、細かく刻んだリンパ節をステンレススチールの スクリーンにより押しつけ、放出されたリンパ球をフローから集めることにより 、前述のように当該技術分野で知られている方法を用いることによって単離する が、ついで標準のプロトコルを用いて非分泌のＮ５−１マウスメラノーマ細胞（ ＡＴＣＣより入手可能、Ｎｏ、ＴＩ８１８）と融合する。ハイブリドーマは凍結 切片のイムノパーオキシダーゼ染色などのいかなる適当な方法を用いてスクリー ニングしてもよい。滑層の血管内皮と反応する抗体を産生ずる１つのハイブリド ーマ（Ｉ　Ｂ２、サブクラスＩｇＧ１）を、限界希釈で２回クローン化し、さら なる分析のために選択した。ｍ　Ａ　ｂＩＢ２によって認識された抗原はＶＡＰ −１（血管接着タンパク質（ＶａｓｃｕｌａｒΔｄｈｅｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅｉ ｎ）−１として）と名づけた。

ＶＡＰ−１結合タンパク質として本発明の方法に用いられる抗体は、好ましくは 単一特異性抗体、すなわちＶＡＰ−１のみ、またはその抗原性断片に対して特異 性を有する抗体ある。単一特異性抗体はポリクローナルであってもモノクローナ ルであってもよい。

ポリクローナル抗体は適当な動物にＶＡＰ−１の実質的に純粋な調製物を注射し 、適当な間隔で１回またはそれ以上のブースター注射によって調製することがで きる。

しかしながら、本発明の方法においてはＶＡＰ−１抗原に対して作成されたモノ クローナル抗体（またはＦａｂ’　、Ｆ　（ａｂ’　）２もしくはＦｖ断片など の生物学的に活性なそれらの誘導体）を用いることが好ましい。

モノクローナル抗体はいかなる適当なソースのものでもよく、したがってたとえ ばネズミまたはヒトモノクローナル抗体から選択することができる。

抗体は、その抗体または生物学的に活性なその誘導体をコードするＤＮＡ配列を 適当な細胞、たとえば微生物の、植物の、動物のまたはヒトの細胞でクローン化 し、問題の抗体または生物学的に活性なその誘導体の産生を導く状況下で細胞を 培養し、培養物から抗体または生物学的に活性なその誘導体を回収することによ っても産生ずることができる。

本発明の試薬に用いられる抗体は、方法の精度を向上させるために好ましくは実 質的に純粋な形であるべきでＪＩｉ　ＩｌｌされたＶＡＰ−１は還元条件下で９ ０ｋＤ、非還元条件下では＋００ｋＤの分子量を有する。

ＶＡＰ−１抗原を甲離するために、リンパ球を除去した精桃抽出物がＶ　Ａ、　 Ｐ　−１タンパク質の好ましいソースである。これらの抽出物は細か（刻んだ組 織をステンレススチールのスクリーンにより押しつけることによって扁桃組織か らリンパ球を除去することによって調製される。間質要素はスクリーンの上表部 から集められる。しかしながら、例示した手順が最終的な単離のためＶＡＰ−１ のｌＢ２ｍＡｂへのアフィニティーに依存するので、Ｖ　Ａ　Ｐ　−１を発現す るいかなる細胞の型でも以下の手順に用いることができる。

すべての工程は冷却温度（約４°Ｃ）で行なわれるべきである。細胞は１５０ｍ Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃ１、１０ｍＭ　トリス塩基、０、１５ｍＭ　〜ＩｇＣＩ２．１％ ＮＰ４０．１ｍＭＰＭＳＦおよび１％アプロチニンを含む緩衝液などのタンパク 質分解を阻害するための薬剤を含む緩衝液中でゆるやかに（たとえば４°Ｃで１ 晩かけて）溶解させる。ついでこのような抽出物は好ましくは、たとえば、１０ ０００　ｇで３０分間、穏やかに遠心することにより細胞溶解デブリ（ｃｅｌｌ 　１ｙｓｉｓｄｅｂｒｉｓ）が取り除かれる。つぎに上清はアフィニティー薬剤 として、連続して、（１）正常マウス血清、（２）非特異的１ｇＧ１　ｍＡｂ　 （ｌＥ１２または市販されている非特異的Ｉ　ｇ　Ｇ　１ｒｎ　Ａ　ｂのいずれ かなど）および（３）１８２ｍＡｂを備える一連のアフィニティーカラムに付さ れる。ｌＢＺｍＡｂカラムに結合した材料は５０ｍＭトリエタノールアミンを用 いて溶出され、さらに凍結乾燥される。このアプローチを用いてＶＡＰ−１は扁 桃間質から単離される。当該技術分野において知られている　他の同等の方法を 用いてもよい。

モノクローナル抗体ＩＢ２を用いて検出すると、細胞内において、ＶＡＰ−１は 炎症をおこした滑層のＨＥＶ様細静脈に豊富に存在する。、ＶＡＰ−１は浸潤白 血球やいずれの滑脱間質の結合組織成分にも存在しない。末梢リンパ節および扁 桃においてはＶＡＰ−１はＨＥ　Ｖの大部分に存在しているようである。ＶＡＰ −１は内皮細胞・　の内腔側に多く局在する。内皮細胞の細胞質中ならびに非内 腔表面においてもＹＡＰ−１の顆粒染色が見られる。

とくに扁桃においては、異なるＨＥＶ間でＹＡＰ−ルベルは太き（変動し、個々 のＲＥＶ（典型的な丸みを帯びた形態を伴う）で完全にＶＡＰ−１を欠くものは ほとんどない。消化管の虫垂および固有層においてはかすかに染色される細静脈 さえもほとんど存在しないようであった。上肢中心における樹状様細胞上ならび に動脈、静脈および腸壁の平滑筋細胞上に、ＶＡＰ−１の微弱な発現が見出され る。

対照的に、ＶＡＰ−１はより大きい血管の内腔表面には実際上存在しない。組織 切片中の白血球に加えて、以下の細胞はＶＡＰ−１を発現していないようである ：末梢血リンパ球、単球、ＮＫ細胞、顆粒球および単離された扁桃白血球、Ｔ− リンパ芽球様細胞系ＣＣＲＦ−ＣＥＭ　（ＣＣＬＩ　１９、ＡＴＣＣ）、Ｂ−リ ンパ芽球様細胞系ＫＣＡおよびＩＢＷ−４（スタッフォード大学、イー・エンブ レマン（Ｅ、Ｅｎｇｌｅｍａｎ）からもとは入手した、ＥＢＶで形質転換された Ｂ細胞系）、単球性細胞系Ｕ９３７（ＣＲＬ１５９３、ＡＴＣＣ）；ならびに白 血病細胞系ＫＧ−１（ＣＣＬ２４６、ＡＴＣＣ）；　ＫＧ−１ａ（ＣＣＬ２４６ ．１．ＡＴＣＣ）およびに５６２（ＣＣＬ２４３、ＡＴＣＣ）；内皮細胞系Ｅａ Ｈｙ−９２６（カルシノーマと内皮細胞との間のハイブリドーマ細胞系、ニジエ ル（Ｅｄｇｅｌｌ）ら、プロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・ オブ・サイエンス・ニー・ニス・ニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃ　ｉ、　ＬＩＳＡ）　８０巻：　３７２４頁（１９８３年）；ならびに平滑 筋細胞、線維芽細胞および角化細胞の初代培養、および上皮様Ｈｅ　Ｌ　ａ細胞 系（ＣＣＬ　２、ＡＴＣＣ）。ジャフェ（Ｊａｆｆｅ）　（ジャーナル・オブ・ クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、）５２ 巻、２７４５頁（１９７３年））の方法によって単離されたヒト謄静脈内皮細胞 （ＨＵＶＥＣ）は基礎的にもＩＬ−１（２０，１００Ｕ　／　ｍｌ）　、Ｔ　Ｎ 　Ｆ　（２００Ｕ　／　ｍｌ）またはＬＰＳ（０，ｌ、　１．０ｎｇ　／　ｍｌ ）を用いる４時間または２０時間処理後でもＶＡＰ−１を発現しなかった。

ＶＡＩ’−１と、白血球結合を仲介する既知の内皮細胞分子とを比較することに より、数種の相違が明らかになっている。細胞間接着分子−■および−２（ＩＣ ＡＭ−１およびＩＣＡＭ−２）、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）、Ｅ− セレクチン（ＥＬＡＭ−１）およびＰ−セルクチ：／（ＣＤ６２、ＰＡＤＧＥＭ 、ＧＭＰ　１４０）は、基礎的にもまたは炎症性メディエータによって誘導した あとでもすべてＨＵＶＥＣ上で発現する（スブリンガー、ティー・ニー、ネイチ ャー３４６巻、４２５頁（１９９０年）；ストールマン、エル・エム、セル５６ 巻、９０７頁（１９８９年）；オズポーン、エル、セル６２巻、３頁（１９９０ 年）：ホバーおよびコトラン、トランスプランテーション５０巻、５３７頁（１ ９９０年）：ブッチャー、イー・シー、セル６７巻、１０３３頁（１９９１年） ；デ・フォーゲロールス、ニー・アール（ｄｅ　Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ。

人、Ｒ１）ら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ、　Ｅ ｘｐ、　Ｍｅｄ、　）、１７４巻、２５３頁（１９９１年）；オズボーン、エル ら、セル５９巻、１２０３頁（１９８９年）；ベビラクア、エム・ピー（Ｂｅｖ 　ｉ　ｌ　ａｃｑｕａ、　Ｍ、　Ｐ、　）ら、ブロシーデインダス・オブ・ナシ ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンス８４巻、９２３８頁（１９８７年）；マ ックエバー、アール・ビー（ＭｃＥｖｅｒ。

Ｒ，Ｐ、　）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ 、Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｔ、）８４巻、９２頁（１９８９年）；ハラトリ、アー ル（Ｉｌａｔｔｏｒｉ、　Ｒ，）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ スリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｆｆｌ、　）２６４巻、７７６８頁（１９８ ９年）：ウエリコム、ニス−エム（Ｗｅｌｌｉｃｏｍｅ、Ｓ、Ｍ、）ら、ジャー ナル・オブ・イムノロジー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）１４４巻、２５５８頁 （１９９０年）；ホバー、ジエイ・ニス（Ｐｏｂｅｒ、　Ｊ、　Ｓ、　）ら、ジ ャーナル・オブ・イムノロジ−１３７巻、１８９３頁（１９８６年）；ダスティ ン、エム・エル（Ｄｕｓｔｉｎ、　Ｍ、　Ｌ、　）ら、ジャーナル・オブ・イム ノロジ−１３７巻、２４５頁（１９８６年））。対照的にＶＡＰ−１はＨＵ　Ｖ 　Ｅ　Ｃの表面上または細胞質中に、内在的に発現しておらずまたＩＬ−１、Ｔ ＮＦａまたはＬＰＳ処理により誘導されることもない。これらの分子の組織分布 は明瞭に異なり、さらに扁桃の平行切片（ｐａｒａｌｌｅｌ　５ｅｃｔｉｏｎｓ ）について分析したばあいも分布は異なる（データは示さない）。ＩＣＡＭはほ とんどの大血管および小血管ならびにある白血球の内腔表面を染色する（デ・フ ォーゲロールス、ニー・アールら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メ ディシン、１７４巻、２５３頁（１９９１年）；ダスティン、エム・エルら、ジ ャーナル・オブ・イムノロジ−１３７巻、２４５頁（１９８６年））。他方、Ｖ ＣＡＭ−１およびＥＬＡＭ−１は炎症をおこした組織内のいくらかの細静脈を染 色するのみである（ライス、ジー・イー（Ｒｉｃｅ、　Ｇ、　Ｅ、　）ら、ジャ ーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン１７１巻、１３６９頁（１９９ ０年）；ライス、ジー・イーら、アメリカン・ジャーナル・オブ・バソロジ−（ Ａｍ、　Ｊ、　Ｐａｔｈｏｌ、　）１３８巻、３８５頁（１９９１年）、コトラ ン、アール−ｘス（Ｃｏｔｒａｍ、　Ｒ，Ｓ、　）ら、ジャーナル・オブ・エク スペリメンタル・メディシン１６４巻、６６１頁（１９８６年））。これらとは 異なり、ＶＡＰ−１は大半のＩＩ　Ｅ　Ｖの非粘膜部位で強く発現しており、す べての調べられた白血球および細胞系には存在しない。既知の接着分子の分子量 もまた、Ｉ　ＣＡＭ−１を例外としてＶ　Ａ、　Ｐ　−１のものと明瞭に異なる （ＩＣＡＭ−２は６０ｋＤ。

Ｖ　ＣＡ　Ｍ　−１は１１０ｋＤ、Ｅ−セレクチンは１］５ｋＤならびにＰ−セ レクチンは１４０ｋＤの分子である、ストールマン、エル・エム、セル５６巻＝ ９０７頁（１９８９年）；オズボーン、エル、セル６２巻：３頁（１９９０年） ：ならびにデ・フォーゲロールス、ニー・アールら、ジャーナル・オブ・エクス ペリメンタル・メディシン１７４巻、２５３頁（１９９１年））。

さらに、ＶＡＰ−１は主としてリンパ球結合に関係し、一方ＩＣＡＭ、Ｅ−およ びＰ−セレクチンは多形核白血球の接着をも効率よく仲介する（スブリンガー、 ティー・ニー、ネイチャー３４６巻、４２５頁（１９９０年）ニストールマン、 エル・エム、セル５６巻、９０７頁（１９８９年）；オズボーン、エル、セル６ ２巻、３頁（１９９０年）：ホバーおよびコトラン、トランスプランテーション ５０巻、５３７頁（１９９０年）；ブッチャー、イー・シー、セル６７巻、１０ ３３頁（１９９１年））。

ヒトにおいてリンパ球結合に関係しかつＨＵＶＥＣ上で発現されない、これまで に記載された唯一の内皮接着分子は、ＭＥＣＡ−７９として定義された抗原であ る（バーブ、イー・エル（Ｂｅｒｇ、　Ｅ、　Ｌ、　）ら、ジャーナル・オブ・ セル・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）１１４巻、３４３頁（１９９ １年））。

しかしながらそれは、末梢リンパ節の組織特異的なアドレッシン（ａｄｄｒｅｓ ｓｉｎ）である。さらにＶＡＰ−１は、すべてのＭＥＣＡ−７９陽性細静脈で共 発現（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓ）されておらず、またｍＡｂ　ＩＢ２は精製された ＭＥＣＡ−７９抗原を認識しない。

したがって、ＶＡＰ−１の発現パターン、機能および分子量から、ＶＡＰ−１が これまでに定義されたリンパ球結合に関係する内皮性分子のいずれとも同一では ないことならびにインビボでのＶＡＰ−１発現のレベルが炎症の程度に相関する ことが示される。これらの結果は、ＶＡＰ−１がヒトにおける生理的なリンパ球 の再循環を理解する上で意味があり、また組織選択的なリンパ球のホーミングの 分子機構を詳細に分析するためにとりわけ価値がある。

ＶＡＰ−１”よびＹＡＰ−１ムム　の　゛本発明は、人体または動物体からとっ た試料中のＶＡＰ−１タンパク質およびＶＡＰ−１陽性細胞を検出するための診 断用試薬に関する。このような試薬は、ＶＡＰ−１タンパク質と反応する抗体ま たは該抗体のＶＡＰ−１と反応する断片であってよく、ラベルされたもの、所望 により単離されたＶＡＰ−１または表面上にＶＡＰ−１を発現する細胞との抗体 の結合を検出することを可能とする物質を用いてラベルされたものであってよい 。このような診断用組成物はキットに備えられていてもよく、このようなキット は独立した容器に、 （ａ）ＶＡＰ−１と反応する抗体、または該抗体の生物学的に活性な誘導体、好 ましくはＶＡＰ−１抗原との抗体の結合を検出することを可能とする物質を用い てラベルされたちの：および （ｂ）分析結果を評価するための標準を提供するための、精製されたＶＡＰ−１ タンパク質 を備えていてもよい。

別の局面において、本発明はインビボで、人体内または動物体内において炎症を 低減させるかまたは処置する方法であって、このような処置を必要とするヒトま たは動物の患者に対して効果を生じうるレベルのＶＡＰ−１結合合成物（ＶＡＰ −１と反応する抗体、またはこのような抗体の生物学的に活性な誘導体、もしく はＶＡＰ−１の可溶性リガンドなど）を投与することによる処置方法に向けられ る。

「処置」または「処置する」の語は、ＶＡＰ−１の接着が生じることによって仲 介される障害の予防、回復、防止または治療を含みうる目的のため被験者にＶＡ Ｐ−１結合合成物を投与することを含むことを意図する。本発明の方法の主体で ある特定のＶＡＰ−１結合分子は、精製された天然のおよび組換えＶＡＰ−１結 合タンパク質（抗体または他の分子など）である。

患者に投与するばあい、本発明の試薬は腸管外、鼻、腸または直腸への投与に好 適となるよういかなる方法で製剤化されてもよい。したがって、試薬はたとえば 注射可能な剤形、エアゾル剤形、懸濁剤、溶液、浣腸剤などの形態であってよい 。試薬は通例の医薬のプラクティスにしたがって、たとえば等張の生理食塩水な どの医薬的に許容しうる賦形剤またはビヒクルとともに製剤化されうる。試薬の 投与量レベルは、患者におけるＶＡＰ−１の接着の発生をブロックすることによ り抗炎症効果を提供するに充分な量であろう。

本発明の試薬は、ＶＡＰ−１の接着によって仲介される増大した炎症反応に関係 するいかなる状態をも診断または処置するために好適である。したがって、試薬 は関節炎、局所感染症、皮膚硬化症、炎症性腸疾患、自己免疫疾患などのような 状態を診断するのに有用である。

ｌの実施態様において、炎症の第２次傷害性の炎症作用に対する治療上の利益を 提供するために効果を生ずるレベルのＶＡＰ−１結合合成物が投与される。ＶＡ Ｐ−１結合合成物の「効果を生ずるレベル」とはＶＡＰ−１が仲介して発生する 毒性作用が最小で改善されるレベルを意味する。「過度の」宿主でのＶＡＰ−１ が仲介する発生とは被験者の健康な医療状態の標準を超える、被験者におけるＶ ＡＰ−１が仲介する接着の発生のレベルを意味する。「第２次」組織損傷または 毒性作用とは、体内のどこか他の場所の「第１次」刺激の結果を含めてＭＡＰ− １が仲介する接着の過度の発生があるために、その他の健康な組織、器官および その中の細胞に惹起こされる組織損傷または毒性作用を意味する。

本発明の方法において、たとえばＶＡＰ−１抗体などのＶＡＰ−１結合合成物の 患者への注入の結果、滑脱ＨＥＶ。

末梢リンパ節ＨＥＶおよび扁桃ＨＥＶなどのその表面上にＶＡＰ−１を発現する 患者の細胞にががる抗体が結合し、ＶＡＰ−１結合によってこれらの細胞が他の 細胞に付着することが妨げられ、がくしてががる組織および細胞にリンパ球が接 着することが妨げられるがまたは阻害され、よって接着をうけた組織または細胞 への望ましくないリンパ球の往来または流入が妨げられ、したがってＶＡＰ−１ が司る白血球の往来および白血球の遊出から起こる望ましくない炎症反応が妨げ られる。

したがって、本発明の医薬組成物は患者におけるＶＡＰ−１の生物学的ターゲッ トへのがかる患者に生来あるＶＡＰ−１結合およびとくに内皮細胞との結合に（ 完全にまたは部分的に）拮抗するのに充分な量でＶＡＰ−１結合合成物を含有す る組成物を提供する。

ＶＡＰ−１結合合成物は、かがるＶＡＰ−１結合合成物の所望の作用部位へのタ ーゲツティングを提供する他の薬剤の断片に、化学的にまたは遺伝子工学によっ て接合されてもよい。代わりになるべきものとして、ががるＶＡＰ−１結合合成 物に付加的な特性、とくにＶＡＰ−■接着が仲介する毒性作用の軽減を促進する 合成物の能力を増強する特性を増強または提供するために、ＶＡＰ−１結合合成 物に、化学的にまたは遺伝子工学によって他の合成物が接合されてもよい。

ＶＡＰ−１結合合成物の投与量および投与方式は、関節炎および組織傷害などの 炎症に関連した障害を処置する臨床分野における当業者によって容易に決定され うる。

一般的にＹＡＰ−１結合合成物による処置の投与量は以下の点を考慮することに 依存して変動するであろう：用いられるＶＡＰ−１結合合成物の型：年齢；健康 状態；処置をうけている医療状態；あれば、同時に行なわれる処置の種類、処置 の頻度および所望の効果の本質；組織損傷の度合い；性；症状のあった期間；な らびにあれば禁忌および、個々の医師によって調整されるべき他の変動要素（ｖ ａｒｉａｂｌｅｓ）。所望の結果をうるために１または複数の適用で所望の投与 量を投与することができる。抗ＶＡＰ−１抗体などの本発明のＶＡＰ−１結合合 成物を含有する医薬組成物は単位投与量の形で提供されてもよい。

本発明のＶＡＰ−１結合合成物を含有する医薬組成物は、投与のためのいかなる 適切な薬学的担体中でも投与することができる。ヒトおよび動物におけるＶＡＰ −１が仲介して発生する状態の予防、緩和、防止または治療に効を奏するいかな る剤形で投与されてもよい。限定の目的のため、明細書およびクレーム全体にわ たる、疾患の「処置の方法」という表現や同様の表現はかかる疾患の防止のため の方法を含むと解釈されることを意図している。

非経口投与のための本発明のＶＡＰ−１結合タンパク質の調製物は滅菌した水性 または非水性溶媒、懸濁液および乳濁液を含む。非水性溶媒の例はプロピレング リコール、ポリエチレングリコール、植物油、魚油、および注射可能な有機エス テル類である。水性担体には塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース溶液 、デキストロース・プラス・塩化ナトリウム溶液、ラクトース、または固定油（ ｆｉｘｅｄ　ｏｉｌｓ）を含有するリンゲル溶液を含む、生理食塩水および緩衝 性医療用非経口用のビヒクルを含んだ、水、水−アルコール溶液、乳濁液または 懸濁液を含む。静脈内ビヒクルにはリンゲルデキストロースなどにもとづいたも ののような、流体（ｆｌｕｉｄ）および栄養補液、電解質補液が含まれる。

また、本発明のＶＡＰ−１結合合成物はと（に第１次傷害が急性よりも持続また は遅延するばあい、ポンプによってまたは、徐放性形態でも投与されてもよい。

第１次傷害が急性よりもしばしば持続または遅延するような例は、感染または捻 挫で組織または筋肉への損傷が第１次感染または損傷から数日後まであられれな い（または存続する）ばあいである。本発明のＶＡＰ−１結合分子はまた、好適 に挿入されたカテーテルによって、または特定の器官にターゲツティングするよ う設計されたキメラ分子（または複合体）の一部などのような分子を提供するこ とによって特定の器官に高濃度に送達されてもよい。

長期間にわたる反復注射が指示されるばあい、徐放性形態での投与が患者にとっ てより好都合である。たとえば本発明の方法がＶＡＰ−１に関連した障害にもと づく遺伝的または慢性的な炎症性疾患を処置するのに用いられるものであるばあ い、患者の快適さを最大限とするために本発明のＶＡＰ−１結合タンパク質を徐 放性形態で投与することが望ましい。

本発明のＶＡＰ−１結合合成物は、ＶＡＰ−１結合合成物の生物学的活性が消化 プロセスによって破壊されなければ、さらに前記合成物が可能とする特質が小腸 組織を経て吸収されるものであれば、錠剤、カプセル、粉末パケット（ｐｏｗｄ ｅｒ　ｐａｃｋｅｔｓ）　、または経口投与用の液体溶液などの投与形態で用い ることができる。

本発明の医薬組成物は本来知られている方法、たとえば通例の混合、顆粒化、糖 衣剤作製、溶解、凍結乾燥または同様のプロセスによって製造される。本発明の 組成物は、慢性のものでも急性のものでも、ＶＡＰ−１で誘導される生理的損傷 を制御する上で、それら自身においておよびそれら自身の有用性が見出される。

本発明の組成物はＶＡＰ−１接着を認識するための生体自身の機構の作動を最大 限の可能性にまで抑える。

静脈注射の投与形態においては、本発明の組成物は充分に迅速に作用が開始され 、ありうる組織損傷の速やかな処理（ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ）に有用である。

加えて、穏やかなまたは慢性のＶＡＰ−１が関連した障害の処理においては低い 能力のバージョンが有用である。

加うるに、本発明の組成物はヒトのまたは動物の血流または細胞外組織における ＶＡＰ−ルベルの実験室での分析のために不可欠な試薬を提供する。

天然のまたは組換えのソースから、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニ ティークロマトグラフィー、電気泳動などの、かかるタンパク質を単離するのに 当該技術分野において従来から用いられる通例の条件および技術にしたがって、 天然の夾雑物を実質的に含まないＶＡＰ−１結合タンパク質を単離および精製す ることができる。

以下の実施例は単に本発明を説明することを意図したものであり、いかようにも その範囲を限定するものではない。

ｌ１ｌ 実」Ｌ男」２ ＶＡＰ−１の ＶＡＰ−１の組織分布はクリオスタット切片のイムノパーオキシダーゼ染色によ って調べた。前記切片は第一抗体（ｌＢ２および３０６、ニワトリＴ細胞に対す るコントロールマウスＩ　ｇ　Ｇ　ｌｒｎ　Ａ　ｂ　）とともに３０分間インキ ュベートした。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、８ｇＮ　ａ　Ｃｌ　−１，２１ ｇ　ＫｚＨＰ　Ｏ４および０．３４　ｇ　Ｋ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４／リツトル、ｐＨ７ ，２）における２回の洗浄ののち、５％ＡＢ−血清を含有するＰＢＳ中のパーオ キシダーゼ接合ヒツジ抗マウスＩｇＧ（ダコパット（Ｄａｋｏｐａｔｔ）　、デ ンマーク）を３０分加えた。ついで、０．０３％過酸化水素を含有するＰＢＳ中 の３′　３′−ジアミノベンジジン塩酸塩を色素原として用いた。染色後、切片 をヘマトキシリンで後染色した。免疫蛍光染色のために、３μｍのクリオスタッ ト切片を第一抗体でおおい、ＦＩＴＣ接合ヒツジ抗マウスＩｇＧ（シグマ、セン トルイス）を第二段階の試薬として用いた。

免疫組織染色によってモノクローナル抗体ＩＢ２が炎症をおこした滑脱における ＨＥＶ様細静脈を強（染色したことが示された（Ｆｉｇ、ＩＡ）。浸潤白血球に も滑脱の間質のいかなる結合組織成分にも染色はみられなかった。

ｍＡｂ　ｌＢ２によって認識される抗原はＶＡＰ−１（血管接着タンパク−１と して）と名づけられた。末梢リンパ節および扁桃において、ｍＡｂ　ｌＢ２はＨ ＥＶの大部分と反応した（Ｆｉｇ、　Ｉ　Ｂ　）。ＶＡＰ−１は内皮細胞の内腔 側で強（発現された（Ｆｉｇ、　Ｉ　Ｃ）。顆粒染色は内皮細胞の細胞質におい てみられ、また非内腔表面はｍ　Ａ　ｂＩＢ２陽性であった。とくに扁桃におい て、異なるＨＥＶ間で染色強度は顕著に変化し、典型的な丸みを帯びた形態の個 々のＨＥＶはほとんどｌＢ２陰性ではなかった（Ｆｉｇ。

ＩＤ）。消化管の虫垂においておよび固有層において、わずかに弱く染まってい る細静脈のみが検出できた。ＶＡＰ−１の弱い発現はまた上肢中枢における樹状 様細胞においてならびに動脈、静脈および腸壁の平滑筋細胞においてみられた。

対照的に、ＶＡＰ−１はより大きな血管の内腔表面には実際に存在しなかった。

組織切片における白血球のように、末梢血リンパ球、単球、ＮＫ細胞、顆粒球お よび単離された扁桃白血球はＦＡＣＳ分析においてすべて完全にｌＢ２陰性であ った。Ｔ−リンパ芽球様細胞系（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ）　、Ｂ−リンパ芽球様細胞 系（ＫＣＡ、ＩＢＷ−４）　、単球細胞系（ｌ９３７）および白血球細胞系（Ｋ Ｇ−ＩＳＫＧ−１ａ、に５６２）はすべてＶＡＰ−１を欠いていた。さらに、Ｖ ＡＰ−１は基本的にはヒト謄静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）には存在せず；さらに ＩＬ−１（２０，１００Ｕ／ｍｌ）　、ＴＮＦ−μ（２００Ｕ／ｍｌ）またはＬ ＰＳ（０，１，１，０μｇ　／　ｌ１１）を用いた４時間または２０時間の処理 によってもＶＡＰ−１の合成を誘導できなかった。内皮細胞系（ＥａＨｙ−９２ ６）もまたｌＢ２陰性であった。平滑筋細胞、線維芽細胞および角化細胞の初代 培養ならびに上皮様（Ｈｅ　Ｌ　ａ）細胞系はＶＡＰ−１を発現しなかった。

支１■ユ ＶＡＰ−１の　の。

実施例１に記載された組織局在性実験に加えて、ＶＡＰ−１の細胞内の局在性を さらに扁桃から切断された厚い切片（１５μｍ）を共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃ ａｌ　ｍ１ｃｒｏｓｃｏｐｙ）によって調べた。切片をｍＡｂ　ｌＢ２または３ Ｇ６とともに１５分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、ＦＩＴＣ接合ヒ ツジ抗マウスＩｇでさらに１５分間おおった。そののち、共焦点顕微鏡による分 析の前に試料を１０％ＰＢＳおよび抗進色剤（ａｎｔｉ−ｆａｄｅｉｎｇ　ａｇ ｅｎｔ）としてフェニレンジアミンを含有するグリセロール中にマウントした。

顕微鏡検査によって細胞質内の独立性の顆粒におけると同様にＨＥＶの内腔表面 上にＹＡＰ−１が存在することは容易に理解できた。これらの顆粒の同一性は現 在は不明であるが、ｍＡｂ　ｌＢ２および第■因子に対する抗体を用いる２色免 疫蛍光染色において、顆粒は共に局在（ｃｏ−１ｏｃａｌｉｚｅ）　Ｌ／なかっ た。したがって、ＹＡＰ−１陽性類粒は内皮細胞接着分子、Ｐ−セルクチンが存 在することが知られている、内皮細胞のワイベルーパラド体（Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐ ａｌａｄｅ　ｂｏｄｉｅｓ）ではなかった。

支立且ユ ＶＡＰ−１の　の リンパ球を除去した扁桃抽出物を細胞溶解緩衝液（１５０ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｃｌ　 、　１０＋ａＭ　）リス塩基、０．１５ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｃ１２，１％　ＮＰ４０ ．１１Ｍ　ＰＭＳＦおよび１％アプロチニン）中で一晩４°Ｃで溶解した。溶解 物を１００００　ｇで３０分間４°Ｃで遠心分離した。溶解物をセファロース　 ＣＬ−４Ｂ（ファルマシア、スウェーデン）カラムに通過させることによって上 清を事前に浄化した。ついで正常マウス血清、関連がないＩ　ｇ　Ｇ　ｌｒｎ　 Ａ　ｂおよびＩＢ２ｍＡｂ（５ｍｇ／　ｍｌ、５＋＋＋１カラム容積）を用いて えられた３つのＣｎＢｒで活性化されたセファロース−４Ｂ（ファルマシア）カ ラムに連続して付した。カラムを前記細胞溶解緩衝液を用いて充分に洗浄した。

そののち、ｌＢ２カラムに結合した材料を５０＋＋＋Ｍ　トリエタノールアミン で溶出し、凍結乾燥し、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（７，５％、還元）において分離し 銀染色を用いて視覚化した。

ヨウ素ラベリングのためにリンパ球を除去した扁桃抽出物を１００Ｕ／ａ＋１　 コラゲナーゼ（ヒストリチフス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｈｉｓｔｏｌｙｔ ｉｃｕｍ）由来の■型、ジグ７）　、１０％胎児ウシ血清（Ｆｅ２）　、抗生物 質、および１０！１Ｍ　へペスを含有するＲＰＭＩ　１６４０中で１時間３７° Ｃで穏やかに撹拌しながら消化した。コラゲナーゼ消化ののち、細胞をＨＢＳＳ 中で洗浄し、ラクトペルオキシダーゼ法をもちいて１２５Ｉで表面をラベルした 。ヨウ素化された細胞を前記細胞溶解緩衝液で溶解し、溶解物を１００００　ｇ で１５分間遠心分離により浄化した。溶解物を正常マウス血清とカップルしたＣ ｎＢｒで活性化されたセファロースをもちいて１６時間４℃で事前に浄化した。

免疫沈殿をｍ　Ａ　ｂ１Ｂ２または３Ｇ６と接合したＣｎＢｒで活性化されたセ ファロース４Ｂビーズを用いて行った。試料を還元（２−メルカプトエタノール ）条件下で７．５％５ＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。

ＶＡＰ−１の分子量を決定するために、扁桃の間質からのアフィニティーで単離 された分子を５ＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ゲルの銀染色によって還元条件下で見 かけの分子量が９０ｋＤの主要バンドが示された（Ｆｉｇ、２）。ＶＡＰ−１は 非還元条件下ではわずかにゆっくりと移動した（Ｍ　ｒ　１００ｋ　Ｄ　）。扁 桃のヨウ素化された間質細胞からの免疫沈殿の分析によって９０ｋＤの分子（お よびわずかにより小さい分解産物）とのｍＡｂ　ｌＢ２の反応性を確認した（Ｆ ｉｇ、２）。また、１８０〜２００ｋＤのバンドは目視できることもあった。

支ｉ五１ Ｌンパ　ＰＬＮ　’　および　ＨＥＶ のリンパ　の；ムな゛びに−　ＨＥＶとの　翫　の合 この技術の詳細はすでに記載されている（ヤルカネンおよびブッチャー、ブラッ ド（Ｂｌｏｏｄ）６６巻、５７７頁（１９８５年））。

簡潔には、ヒト扁桃、滑脱、虫垂および末梢リンパ節からの新たに切断され凍結 された切片をｌＢ２または３Ｇ６の上清とともに３０分間７℃で穏やかに回転さ せなからインキュベートした。ついで５％ＦＣ５および１０ｍＭ　へペスを含有 するＨ　Ｂ　Ｓ　Ｓ中のフィコールで単離されたリンパ球（３×１０６／切片） を添加し、インキュベーションを３０分間継続した。インキュベーションののち 、非接着細胞を穏やかに傾けて除き（ｔｉｐｐｅｄ　ｏｆｆ）　、接着細胞を１ ％グルタルアルデヒドを含有する冷ＰＢＳ中で一晩固定した。１試料当たり１組 織当たり４％６切片上においてＨＥＶに結合した細胞をシングルブラインドで計 測した（最小１００ＨＥ　Ｖ　）。顆粒球結合を調べるばあいは、顆粒球（ヒス トバク（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ）　１１１９、シグマを用いて単離された）を、 切片に適用する直前まで、Ｃａ２＋およびＭｇ２“を含まないＨＢＳＳに保持し たこと以外は同様に分析を行った。

インビボの内皮細胞上におけるＶＡＰ−１の組織分布によって、ＶＡＰ−１が白 血球のための特異的な認識要素として機能しつるであろうことが示唆された。し たがって、ＲＥＶ結合におけるＶＡＰ−１の機能的役割を、修飾したスタンパー −ウッドラフ・イン・ビトロ・アッセイ（Ｓｔａｍｐｅｒ−Ｗｏｏｄｒｕｆｆ　 ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｓｓａｙ）　（ヤルカネンおよびブッチャー、ブラッド６ ６巻、５７７頁（１９８５年））を用いて検討した。ｍＡｂ　ｌＢ２との凍結さ れた切片の前処理はＨＥＶとのリンパ球結合を阻害した（Ｆｉｇ、３）。

阻害効果は扁桃および末梢リンパ節において最も示されたが、滑脱ＨＥＶとの結 合もまた著しく減少した。虫垂ＨＥＶとのリンパ球結合および扁桃ＨＥＶとの顆 粒球結合はほとんど影響を受けなかった（Ｆｉｇ、３）。これらの知見からＶＡ Ｐ−１は末梢リンパ節、扁桃および滑脱ＨＥＶのリンパ球認識を仲介する内皮細 胞要素を、仲介するか前記要素と親密に結びつくかであることが示される。リン パ球−内皮細胞相互作用におけるＶＡＰ−１のかかわりあいを直接的に評価する ために、アフィニティーで単離されたＶＡＰ−１とのリンパ球の結合を分析した （Ｆｉｇ。

４）。リンパ球はプレート結合ＶＡＰ−１に効果的に接着した。ＶＡＰ−１との リンパ球結合は特異的にｍＡｂＩＢ２で阻害されたが、コントロールのｍＡｂ　 ３Ｇ６では阻害されなかった。ｍＡｂ　ＩＢ２は別の関連のない内皮細胞分子と のリンパ球結合を妨害しなかった（Ｆｉｇ。

４）。

組織分布およびＲＥＶ結合の結果はＶＡＰ−１は主に末梢リンパ節、扁桃および 溝膜とのリンパ球の往来に関係することが示唆される。興味深いことに、扁桃に おけるＶＡＰ−１発現の欠如したものは、ｌＢ２陽性のものとは形態的には区別 できない、後毛細血管細静脈のマイナーサブセットと定義される。扁桃は胃腸管 と親密に結びつけられているので、それらは粘膜（ＶＡＰ−１陰性）型および末 梢リンパ節（ＶＡＰ−１陽性）型の両方のＨＥＶ特異性を含みつる。ＶＡＰ−１ 発現における表現型の違いが各々の個々のＨＥＶのリンパ球結合能とどのように 相互に関係するかは依然決定すべきである。粘膜のリンパ系器官におけるＶＡＰ −１の欠乏はこの内皮抗原が異なったリンパ球認識システムにおいて相違して調 節されるかもしれないことを暗示する。さらに、炎症の程度はインビボのＶＡＰ −１発現のレベルと相互に関係する。

１１且１ ＶＡＰ−１の　の　ムについてのＩＢ２の　のたム１ヨ虹折 ＶＡＰ−１およびＩＥ１２を実施例２に記載されたように扁桃抽出物からアフィ ニティー精製した。精製されたＶＡＰ−１、ＩＥ１２および熱不活性化されたＢ ＳＡを、０．Ｏ１％β−オクチルグルコピラノシドを界面活性剤として用いた２ ０ｍＭ　）リス塩酸、ｐＨ７，４，１５０ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｃ１。

２ｍＭ　ＭｇＣｌ２．２　ｍＭ　Ｃａ　Ｃ１２中に希釈した。タンパク質をガラ スウェル（ラブ−チックチャンバースライド、ヌンク）上に１６時間＋４℃で吸 収した。ｌｌ１ｇ／ｌ１ｌＢＳＡを含有するＰＢＳ中で３０分間室温でブロック したのち、ＩＢ２または３Ｇ６上清をウェルに添加し、３０分間室温でインキュ ベーションを続けた。一方、新たに単離された末梢血単球を組織培養ボトルにお いてｌＯ％ＦＣ５および１０ｍＭ　ヘペスを含有するＲＰＭＩ　１６４０中で１ 時間３７℃でインキュベートしてプラスチック接着単球を除去した。１００μｌ のＲＰＭＩ　１６４０中の非接着リンパ球（１，８ｘ　１０６細胞／ウエル）を 各ウェルに適用した。

３７°Ｃでの３０分間のインキュベーションののち、非接着細胞を軽くたたくこ とによってはずした。ウェルの上表部を除去し、スライドをＰＢＳのゆるやかな 流れによって洗浄し、１％グルタルアルデヒドを含有する冷ＰＢＳ中で固定した 。そののち、ディツークイック染色を用いて細胞を染色した。結合した細胞を各 ウェルにおける細胞の数を視覚的に評価して分類することによって定量化した（ 総面積５０＋＋＋ｍ２／試料）。

９０ｋＤのＶＡＰ−１抗原の部分アミノ酸配列を決定した。部分アミノ酸配列は ＴＥＤＧＤＭＸＬＶＮＧＡＳＡＮＥＧＸＶＥ［配列番号＝１］である２０アミノ 酸長である。タンノくり質およびＤＮＡ配列のデータベースのサーチではこの配 列がいかなる他の既知の配列であることも明らかにしなかった。

支１五ユ ＝　、六　−・に一番るＶＡＰ−１の １　正常の扁桃、末梢リンパ節、消化管、および心臓試料を外科手術から新たに え、器官提供者から腎臓試料をえた。他の組織は剖検試料に由来した。これらす べての標本は組織病理学的に非炎症性であると決定された。炎症性標本は慢性皮 膚疾患（乾癖、アトピー性湿疹、偏平紅色苔癖）にかかっている患者の皮膚のパ ンチ生検材料からえた。また、同一の患者の肉眼的に関係のない範囲からコント ロールの生検材料をえた。炎症をおこした消化管標本は治療目的で手術を行った 炎症性腸疾患（クローン病（Ｃｒｏｈｎ’　ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ）、潰瘍性大腸 炎）にかかった患名由来であった。滑脱標本は滑層切除物由来であった。

試料は実施例１に記載されたようにイムノパーオキシダーゼを用いて染色した。

簡潔には、アセトンで固定した凍結切片を順次第一抗体（培養上清または５０μ ｇ／ｍｌ精製免疫グロブリン）とおよび適したパーオキシダーゼ接合第二段階試 薬とインキュベートし、呈色反応はＨ２Ｏ２および基質としてジアミノベンジジ ンを用いて行なった。

腸および皮膚試料（正常および炎症性）におけるＶＡＰ−１発現を診断の知識な しにコードされた試料から２つの独立した読取装置によって分析した。

実施例Ｉに述べたように、ＶＡＰ−１は正常の炎症をおこしていない消化管のい （つかの細静脈において低いレベルでのみ発現される（Ｆｉｇ、５Ａ）。対照的 に、炎症性腸疾患の患者からの消化管標本は著しく増加したＶＡＰ−１の発現を 示した（Ｆｉｇ、５Ｂおよび５Ｃならびに表１）。ＶＡＰ−１は固有層の平滑な 壁で囲まれた細静脈（ｆｌａｔ−ｗａｌｌｅｄ　ｖｅｎｕｌｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ 　ｌａｍｉｎａ　ｐｒｏｐｒｉａ）においておよび組織化されたリンパ小節（バ イエル板）におけるＨＥＶ様細静脈においての両方で誘導された。皮膚において も、慢性炎症はＶＡＰ−１の増加した合成に伴って起こった（Ｆｉｇ、６Ａおよ びＢ）。結果における個人間の変動のいかなる効果をも排除するために、皮膚疾 患領域からの１試料および同一患者の関係のない皮膚範囲からのコントロール試 料を同時にバイオプシーし染色した。これらの標本においても、上方真皮におけ るＶＡＰ−１陽性細静脈の数はコントロール範囲からの試料におけるよりは炎症 性試料においてより高かった。さらに、目だった脈管周囲のリンパ球浸潤物はつ ねにＹＡＰ−１陽性血管と結びついていた。

Ｌユ 炎症性潰瘍疾患におけるＶＡＰ−１の誘導正常　９０５３１０ クローン病　７００２３２ 潰瘍性大腸炎　７００５２２ 腸標本はクローン病、潰瘍性大腸炎および腫瘍について手術した患者由来であっ た（腫瘍試料の関係のない範囲は「正常」試料を示す）。材料および方法に記載 されたように各試料におけるＶＡＰ−１陽性細静脈の数は−から＋＋＋＋で評価 した。

支１且Ｉ ＶＡＰ−１は：　おこした　の　入　るインビトロの凍結切片分析は実施例３に 記載されたように行なった。モノクローナル抗体ＩＢ２は豊富にＶＡＰ−１を発 現した２つの消化管試料においておおよそ６０％まで固有層の小さい血管とのリ ンパ球結合を阻害した（Ｆｉｇ。

７）。

本発明はその特定の実施態様に関連して記載されているが、さらなる修飾が可能 であり、一般に本発明の原理にしたがい、本発明が関係する技術分野における既 知または通例の実施において含まれるような、および先に述べた本質的な特徴に 適用されうるような、および添付した請求の範囲にしたがうような本明細書開示 からのこのような離脱を含む、本発明のいかなる変異、用途、または適用を本願 がカバーすることが意図されることが理解されるであろう。

配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人： （Ａ）：氏名：ヤルカネン、シルバ （Ｂ）；通り：ラウボランチェ （Ｃ）：市：ビースパンリスチ （Ｅ）：国：フィンランド共和国 （Ｆ）：郵便番号（ＺＩＰ）：ニスエフ−２０フ６０（ｉ）出願人： （Ａ）：氏名：サルミ、マルコ （Ｂ）：通り：ベヘーヘメーンカツ　１２アー（Ｃ）二重：ツルク （Ｅ）：国：フィンランド共和国 （Ｆ）：郵便番号（ＺＩＰ）：ニスエフ−２０５００（ｉ　ｉ）発明の名称：ヒ トにおけるリンノく球結合を仲介する新規な内皮細胞分子 （ｉｉｉ’）配列の数＝１ （ｉｖ）連絡先住所： （Ａ）受信人：オリオンコーポレーション、オリオンーファルモス　ファーマシ ューテイカルズ、特許部 （Ｂ）通り：オリオニンチェ　１ （Ｃ）市：ニスポー （Ｅ）国：フィンランド共和国 （Ｆ）ＺＩＰ：エスエフ−０２２００ （Ｖ）コンピュータリーグプルフオーム：（Ａ）メディアタイプ：フロ・ソピー ディスク（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ　ｐｃ　コンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：　ＰＣ−ＤＯ５／ＭＳ−ＤＯ５ （Ｄ）ソフトウェア：ＡＳＣＩＩ−フォーマット（ｖｉ）先行出願データ： （Ａ）出願番号：ＵＳ８９５３５４ （Ｂ）出願臼：１９９２年６月６日 （２）配列番号：ｌに対する情報： （ｉ）配列の性質： （Ａ）長さ：２０アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：両形態 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号：１： Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｘａａ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　 ＡｓｎＦｉｇ、　ＩＡ　Ｆｉｇ、　ＩＢ Ｆｉｇ、　ＩＣＦｉｇ、　ＩＤ Ｆｉｇ、　２ １Ｂ２　■■■■■■■− コントロール結合に対する％ Ｆｉｇ、　３ に対する結合　抗体 実験■ 実験■ ０　５０　１（Ｋ） コントロール結合に対する％ Ｆｉｇ、　４Ａ Ｆｉｇ、　４Ｂ　Ｆｉｇ、　４Ｃ Ｆｉｇ、　６Ｃ に対する結合　ｍＡｂ Ｆｉｇ、　７ 閑悴膿査１１１失 ＋ｍｅ１１Ａ＋１．Ｎａ　Ｐｃ工／ＦＩ　９３１００２５０フロントページの続 き

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．実質的に精製され単離された内皮血管接着タンパク質−１（ＶＡＰ−１）。 ２．該ＶＡＰ−１がヒトＶＡＰ−１である請求の範囲第１項記載のＶＡＰ−１。 ３．該ＶＡＰ−１がアミノ酸配列ＴＥＤＧＤＭＸＬＶＮＧＡＳＡＮＥＧＸＶＥ［ 配列番号：１］からなる請求の範囲第１または２項記載のＶＡＰ−１。 ４．該ＶＡＰ−１が９０ｋＤａの分子量をもつ請求の範囲第１、２または３項記 載のＶＡＰ−１。 ５．該ＶＡＰ−１がリンパ球と結合する請求の範囲第１、２、３または４項記載 のＶＡＰ−１。 ６．該ＶＡＰ−１が、抗ＶＡＰ−１抗体と該ＶＡＰ−１を結合することからなる 方法によってえられる請求の範囲第１、２、３、４または５項記載のＶＡＰ−１ 。 ７．抗ＶＡＰ−１抗体を産生するハイブリドーマ細胞系。 ８．受託番号がＤＳＭ　ＡＣＣ２０４１である請求の範囲第７項記載のハイブリ ドーマ細胞系。 ９．抗ＶＡＰ−１抗体または該抗ＶＡＰ−１抗体の結合断片がヒト内皮ＶＡＰ− １に特異的であり、該抗体がヒト■静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）表面タンパクと 結合しない、該抗体、または該結合断片。 １０．請求の範囲第８項記載の細胞系によって産生される、血管接着タンパク質 ＶＡＰ−１と特異的に結合するモノクローナル抗体１Ｂ２。 １１．抗ＶＡＰ−１抗体または該抗ＶＡＰ−１抗体の結合断片からなる、細胞を 含まない組成物。 １２．有効量の請求の範囲第９または１０項記載の抗ＶＡＰ−１抗体からなり、 注射に適した剤形である医薬組成物。 １３．単位投与量の形である請求の範囲第１２項記載の医薬組成物。 １４．ＶＡＰ−１が仲介するリンパ球との内皮細胞の結合を拮抗する方法であっ て、該方法がＶＡＰ−１が仲介するリンパ球−内皮細胞接着反応に関与するＶＡ Ｐ−１内皮細胞部位をブロックするのに充分な量のＶＡＰ−１結合合成物を与え ることによって、前記反応を阻害することからなる方法。 １５．該ＶＡＰ−１結合合成物が抗ＶＡＰ−１抗体である請求の範囲第１４項記 載の方法。 １６．該抗ＶＡＰ−１抗体がポリクローナル抗体である請求の範囲第１５項記載 の方法。 １７．該抗ＶＡＰ−１抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第１５項記載 の方法。 １８．該モノクローナル抗体がモノクローナル抗体１Ｂ２である請求の範囲第１ ７項記載の方法。 １９．該ＶＡＰ−１が仲介するリンパ球−内皮細胞接着反応の該阻害が患者にお いてインビボで生じる請求の範囲第１４項記載の方法。 ２０．該リンパ球−内皮細胞接着反応が炎症（慢性または急性）、関節炎、リウ マチ様関節炎、感染症、皮膚疾患、炎症性腸疾患および自己免疫疾患からなる群 から選択される疾患と結びつく請求の範囲第１９項記載の方法。 ２１．該ＶＡＰ−１が仲介するリンパ球−内皮細胞接着反応の該阻害がインビト ロで生じる請求の範囲第１４項記載の方法。 ２２．ＶＡＰ−１が仲介するリンパ球との内皮細胞の結合を患者において診断す る方法であって、該方法がＶＡＰ−１が仲介するリンパ球内皮細胞接着反応に関 与するＶＡＰ−１内皮細胞部位をブロックするのに充分な量のＶＡＰ−１結合合 成物を投与することによって、該患者における前記反応を阻害することからなる 方法。 ２３．該ＶＡＰ−１結合合成物が抗ＶＡＰ−１抗体である請求の範囲第２２項記 載の方法。 ２４．該抗ＶＡＰ−１抗体がポリクローナル抗体である請求の範囲第２３項記載 の方法。 ２５．該抗ＶＡＰ−１抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第２３項記載 の方法。 ２６．該モノクローナル抗体がモノクローナル抗体１Ｂ２である請求の範囲第２ ５項記載の方法。 ２７．該リンパ球−内皮細胞接着反応が炎症（慢性または急性）、関節炎、リウ マチ様関節炎、感染症、皮膚疾患、炎症性腸疾患および自己免疫疾患からなる群 から選択される疾患と結びつく請求の範囲第２２項記載の方法。 ２８．ＶＡＰ−１が仲介するリンパ球との内皮細胞の結合によって仲介される患 者における医療状態を診断する方法であって、 （１）ＶＡＰ−１陽性細胞であろうと思われる該患者からの細胞を採取すること 、 （２）工程（１）の該細胞を抗ＶＡＰ−１抗体にさらすこと、 （３）該ＶＡＰ−１陽性細胞との抗ＶＡＰ−１抗体結合を検出すること、 （４）該結合の量にもとづいて該医療状態を診断することからなる該方法。 ２９．該抗ＶＡＰ−１抗体がポリクローナル抗体である請求の範囲第２８項記載 の方法。 ３０．該抗ＶＡＰ−１抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第２８項記載 の方法。 ３１．該モノクローナル抗体がモノクローナル抗体１Ｂ２である請求の範囲第３ ０項記載の方法。 ３２．該医療状態が炎症（慢性または急性）、関節炎、リウマチ様関節炎、感染 症、皮膚疾患、炎症性腸疾患および自己免疫疾患からなる群から選択される疾患 である請求の範囲第２８項記載の方法。