KR100268772B1

KR100268772B1 - 인간에 있어서 임파구 결합을 매개하는 신규 내피 세포 분자

Info

Publication number: KR100268772B1
Application number: KR1019940704502A
Authority: KR
Inventors: 시르파잘카넨; 마르코살미
Original assignee: 마르쿠 잘카넨; 오이 바이오티 쎄라피즈 엘티디.; 마르코살미; 시르파잘카넨
Priority date: 1992-06-09
Filing date: 1993-06-09
Publication date: 2000-10-16
Also published as: JP3431922B2; EP0656906B1; AU4328193A; CA2137551C; WO1993025582A1; NZ299958A; JP2003180346A; DK0656906T3; ATE184315T1; DE69326347D1; GR3031255T3; FI121176B; CA2137551A1; HUT75824A; HU217175B; AU671837B2; NZ253151A; KR950701938A; JPH07507557A; ES2135480T3

Abstract

인간에 있어서 임파구 결합을 매개하는 신규 내피세포 분자, VAP-이 기술된다. 본 발명에 의해 항-VAP-1 모노클로날 항체가 기술되고 모노클로날 항체 IB2와 더불어 그것을 생산하는 하이브리도마 세포계(DSM, ATCC2041)가 제공된다. 본 발명은 또한 항-VAP-1항체와 같은 VAP-1 결합성 화합물을 투여함으로써 염증 및 자기면역질환을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

[발명의 명칭]

인간에 있어서 임파구 결합을 매개하는 신규 내피세포 분자

[발명의 분야]

본 발명은 신규 인간 내피 세포 유착 항원(human endothelial cell adhesion antigen; 이하, VAP-1으로 칭함), 이 VAP-1 항원을 인지하는 모노클로날 항체(monoclonal antibody), 1B2 및 임파구 유주(lymphocyte migration)를 특징으로 하는 만성 염증 및 감염성 상태(imfectious conditions)를 진단하고 치료하는 데 있어서 이 분자들의 용도에 대한 것이다.

[발명의 배경]

대부분의 성숙한 임파구는 계속적으로 혈액과 임파기관(lymphatic organs) 사이를 순환한다[(Butcher, E. C., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 128, 85(1986)]. 임파구는 혈관 내피세포를 인지하고 결합하여 혈액을 떠난다. 그런 다음, 그것들은 내피 세포 사이에서 주변 조직 안으로 이동한다. 임파구의 교통(trafficking)은 임파구 특이성의 다양한 면면이 신체 전체에 걸쳐서 면역 반응(immume reactions)에서 작용하게 하며, 그것은 또한 면역 반응(immune responses)의 발생(generation) 및 조절에 요구되는 세포-세포 상호작용을 촉진한다. 내피세포에 대한 임파구의 유착성(adherence)은 양쪽 세포 유형에서 발현되는 상보 유착(complementary adhesion) 분자들 사이의 상호 작용에 의존한다[Springer, T. A., Nature 346, 425(1990); Stoolman, L. M., Cell 56, 907(1989); Osborn, L., Cell 62, 3(1990(; Pober and Cotran, Transplantation 50, 537(1990); Butcher, E. C., Cell 67, 1033(1991)]. 장상조건 하에서, 임파구는 주로 고내피세정맥(high endothelial venules; HEV)이라 불리는 분화된 후모세관 세정맥(specialized postcapillary venules)에 결합한다. 기관-특이적(organ-specific) 방식으로 말초 임파절(peripheral lymph nodes), 점막 임파양 기관(mucoal lymphoid organs), 활액막(synovium) 및 피부로 유주하는 임파구를 조절하는, 기능적으로 분리된 임파구-HEV 인지 체계가 기술되어 있다[Butcher, E. C., et al., Eur. J. Immunol. 10, 210(1980); Jalkanen, S., et al., Science 233, 556(1986); Picker, L. J., et al., Nature 349, 796(1991)]. 염증에 있어서, 내피세포의 활성화는 감염된 조직으로의 백혈구의 유입의 양과 유형을 대체적으로 결정하는 유착 분자 상태의 변화를 낳는다. 그리하여, 내피세포 분자는 국소 면역 반응의 특성을 조절하는 데 있어서 핵심요소이며, 분명히 임파구 교통(traffic) 및 백혈구 일출(exravasation)을 조절하는 기구(mechanisms)의 세부적인 이해는 임상적으로 염증 반응을 촉진(觸疹; manipulation)하는 새로운 수단을 제공할 수 있다.

인간에 있어서 조직-선택성 임파구의 귀소(tissue-selective lymphocyte homing)를 매개(mediating)하는 내피세포 배위자(ligands)는 많이 알려지지 않아서, 그러한 분자들의 동정(identification)이 필요한 상태이다.

본 발명자들은 1991년 6월의 면역학회 유럽연맹(European Federation of Immunological Societies) 회의의 초록에서 고내피세정맥에 대한 임파구의 결합에 수반되는 종래에 알려지지 않은 내피세포 항원의 존재를 가리키는 일차적 발견을 발표하였다(Salmi et al., EFIS 11th Meeting Abstracts, 21-12; 1991).

[발명의 요약]

염증 조절의 중요성을 인지하고, 조직-선택성 임파구 귀소를 매개하는 내피세포 배위자를 이해해야 할 필요를 인식하여, 본 발명자들은 인간 활액 맥관(human synovial vessel)에 의해 발현되는 그러한 분자들은 밝혀내기 위한 시도를 하였다. 이 연구로써 인간에서의 임파구 결합을 매개하는 새로운 내피세포 분자, VAP-1 및 그에 대항하는 모노클로날 항체의 생산을 규명하게 되었다. 이 항체들은 VAP-1 준위의 양적 및 질적 평가를 위한 분석에 있어서 및 VAP-1 작용에 길항하도록 할 목적의, 그러한 치료가 필요한 환자의 임상 치료에 있어서 유용하다.

따라서, 본 발명은 첫째 VAP-1 단백질로서, 필수적으로 인간이나 동물 숙주에서 그러한 VAP-1 단백질에 결합하고 있는 천연 오염물(natural contaminants)이 제거된 VAP-1 단백질을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 VAP-1 단백질을 분리하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 VAP-1 단백질에 대한 항체, 특히 모노클로날 항체, 및 그러한 항체를 포함하는 조성물을 목적으로 한다. 본 발명에 의해 모노클로날 항체 1B2가 제공됨은 물론, 그것을 생산하는 하이브리도마 세포계(hybridoma cell line)가 제공된다(DSM ACC2041).

또한 본 발명은 VAP-1 매개 임파구-내피세포 유착 반응을, VAP-1을 차단(block)하기에 충분한 양의 VAP-1 결합 화합물을 그 반응에 참여하는 내피세포 부위(site), 특히 그러한 임파구-내피세포 유착 반응이 염증(만성 또는 급성), 관절염(arthritis), 류머티스성관절염(rheumatoid arthritis), 감염(infection), 피부병(dermatosis), 염증성 장염(inflammatory bowel disease) 및 자기면역질환(autoimmune disease)에 관여하는 부위에 공급함으로써 억제하는 것을 포함하는, VAP-1-매개 임파구에 대한 내피세포의 결합에 대한 길항 방법을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 피검자(subject)에 있어서 임파구에 대한 내피 세포의 VAP-1-매개 결합에 의해 매개되는 의학적 상태를 진단하기 위한; 그 피검자로부터 채취한 VAP-1 양성 세포에 결합하는 항-VAP-1 항체를 검출(detecting)하는 것, 및 그러한 결합에 기초하여 염증(만성 또는 급성), 관절염, 류머티스성관절염, 감염, 피부증, 염증성 장염 및 자기면역질환을 포함하는 의학적 상태를 진단하는 것을 포함하는, 진단방법을 목적으로 하다.

[도면의 간단한 설명]

제1도. 인간 조직(tissue)에서 VAP-1의 분포. (A) 염증을 유발시킨 활액막에서, mAb 1B2는 강하게 HEV-양 맥관(HEV-like vessels)을 염색한다. (B) 편도선(tonsil)에 있어서, HEV에서 VAP-1 발현(expression)은 강한 것(화살촉표)으로부터 매우 약한 것(화살표)까지 일어나며, 전혀 발생하지 않기도 한다. (C) 편도선의 면역형광염색(immunofluorescence staining)은 맥관의 내구경표면(luminal surface)에서 VAP-1의 현저한 발현을 보여준다. (D) 충수(appendix)에서, 매우 약하게 염색된 HEV가 보인다(화살촉표). 배율: A는 x100, B는 x250, C 및 D는 x400이다.

제2도. VAP-1은 90kD이다. Lane 1: 면역정제된(immunopurified) VAP-1의 은염색법(silver staining). Lane 2-3:¹²⁵I-표식된 편도선의 지질세포(stromal cells)를 mAb 1B2(lane 2) 또는 대조 mAb 3G6(lane 3)으로 면역침전시켰다(immunoprecipitate). 180-200kD 대역의 띠(band)는 항상 나타나지는 않는다. 분자량 척도(standard)가 왼쪽에 표시된다. 임파구 제거된(depleted) 편도선 추출물을 용해완충액(lysis buffer)(150 mM NaCl, 10 mM Tris-base, 0.15 mM MgCl₂, 1% NP-40, 1 mM PMSF 및 1% aprotinin)에서 4℃에서 하룻밤 용해시켰다. 용해질(lysate)을 4℃에서 30분간 10000g에서 원심분리하였다. 용해질을 세파로오스 CL-4B 컬럼(Pharmacia, Sweden)에 통과시켜 상청액을 전세정하였다(preclear). 다음 그것을 연속하여 정상 새앙쥐(mouse) 혈청, 무관련(irrelevant) IgG₁mAb 및 1B2 mAb으로 유도된(derivatized) 세 개의 CNBr-활성화 세파로오스-4B 컬럼(Pharmacia)(5 ㎎/ml, 5 ml column volume)에 적용하였다. 용해완충액으로 컬럼을 충분히 세척하였다. 그런 다음, 1B2 컬럼에 결합된 물질을 50 mM 트리에타놀아민으로 용출시키고, 동결건조하고, SDS-PAGE(7.5%, reduced)에 용해시키고 은염색법을 이용하여 가시화하였다(visualized).

제3도. VAP-1은 HEV에 대한 임파구의 결합에 관련되어 있다. 임파구의 편도선, 말초 임파절(peripheral lymph node; PLN), 활액막 및 충수 HEV에 대한 결합, 및 과립구(granulocyte)의 편도선 HEV에 대한 결합을 시험관내 동결절편 시험분석(frozen section assay)을 이용하여 mAb 1B2의 존재 및 부재상태에서 평가하였다. 독립적인 3회의 실험 결과를 대조군 결합(100%=3G6 처치 절편에 결합된 세포의 수)에 대한 백분율로 표준오차와 함께 나타냈다.

제4도. VAP-1 분리물(isolated VAP-1)은 임파구 결합을 지지한다(support). 면역 정제된 VAP-1 및 대조 단백질(1E12; 임파구 결합을 지지하는 비상관(unrelated) 내피 세포 분자, 및 BSA)을 유리(glass)에 흡수시키고, 임파구 결합을 정량하였다. (A) 두개 독립된 실험의 결과를 대조 결합에 대한 백분율로 나타냈다(100%=mAb 3G6 처치후 판-결합된(plate-bound) VAP-1 또는 1E12에 결합된 세포의 수). 비특이적 배경(background)(BSA에의 결합)은 모든 분석에서 공제하였다. (B) mAb 3G6 존재하 VAP-1-피복된 웰(coated well)에 대한 임파구 결합. (C) mAb 1B2 존재하 VAP-1-피복된 웰(well)에 대한 임파구 결합. VAP-1 및 1E12를 제 2도에 나타낸 바의 편도선 추출물로부터 친화도 정제(affinity purify)하였다. 정제된 VAP-1, 1E12 및 열-불활성화된(heat-inactivated) BSA를 청정제(detergent)로서 0.01% β-옥틸글루코피라노사이드와 함께, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂에 희석하였다. 단백질을 유리 웰(Lab-Tek chamber slides, Nunc)에 4℃에서 16시간동안 흡수시켰다. 상온에서 30분동안 1 ㎎/ml BSA를 함유하는 PBS에서 차단한 후, 1B2 또는 3G6 상청액을 웰에 가하고 상온에서 30분간 숙성(incubation)시켰다. 한편, 새로인 분리한 말초 혈액 단핵세포(mononuclear cells)를 조직 배양 병(bottle)에서 10% FCS 및 10 mM 헤페스(Hepes)를 함유한 RPMI 1640에서 1시간동안 37℃에서 숙성시켜서, 증식성 유착성 단핵세포(plastic adherent monocyte)를 제거하였다. 각 웰에 100 μl RPMI 1640에 담긴 비-유착 임파구를 적용하였다(1.8x10⁶cells/well). 37℃에서 30분동안 숙성시킨 뒤, 비-유착 세포를 털어내서(flicking) 제거하였다. 웰의 윗부분을 제거하고, 슬라이드를 천천히 흐르는 PBS에 세척하고, 1% 글루타르알데하이드를 함유하는 차가운 PBS에서 고정시켰다. 그런 뒤, 디프-퀵 염료(Diff-Quick stains)를 이용하여 세포를 염색하였다. 각 정(총면적 50 ㎟/sample)에서 세포의 수를 시각으로 세어서 결합된 세포를 정량하였다.

제5도. VAP-1은 염증유발된 장(gut)에서 상향-조절된다(up-regulated). 정상의 장에서는, 고유층(lamina propria)에서 자주 적은 수의 희미한 양성 맥관이 관찰된다(A, 이 지역에서 세정맥은 실제로 VAP-1에 음성이다.). 염증유발된 장(궤양성대장염, ulcerative colitis)에서, 수많은 VAP-1 양성 세정맥(화살표)이 B) 고유층 및 C) 기질화 임파양 소절(organized lymphoid follicles) 모두에서 보인다. 세포(비만세포(mast cell))를 함유하는 내인성(endogenous) 퍼옥시다제는 비-특이적 반응성을 보인다. e, 장(gut)의 내피세포; lp, 고유층(lamina propria). 배율 x250.

제6도. 만성 피부병(chronic dermatoses)에서 VAP-1의 유도(induction), 같은 환자의 정상지역(A) 및 건선 병소(psoriatic lesion)(B)로부터의 피부 생검(skin biopsy)은 염증부위의 피부혈관(화살촉표)에서 VAP-1의 유도를 보인다. VAP-1 양성 세정맥 주위에 혈관 주변의 백혈구 침윤(perivascular leukocyte infiltrates)을 볼 수 있다. e, 표피(epidermis). 배율 x200. C) 정상 및 발병된 피부에서 VAP-1의 발현(+에서 ++++까지 점수를 매김)은 같은 환자로부터의 한 쌍의 생검(paired biopsies)(비-병발 및 병발(involved))에서 정량하였다. 괄호 안은 각 군에 속하는 환자의 수이다.

제7도. 염증-유도 VAP-1 은 임파구 결합을 매개한다. 동결절편결합시험분석(frozen section binding assay)을 수행하여, 염증유발된(inflamed) 고유층에서 제 Ⅶ인자(Factor Ⅶ) 양성 세정맥에 대한 PBL의 결합을 분석하였다. 조직 절편을 mAbs 1B2 및 3G6으로 전숙성(preincubating)시켜서 억제시험분석(inhibition assay)을 수행하였다. 그 결과를 표준오차와 같이 대조군 결합에 대한 백분율로 나타낸다(즉, mAb 3G6 존재하 PBL의 결합이 100% 결합이다.).

[발명의 상세한 설명]

백혈구 표면 수용기(receptors)와 혈관 내피세포의 그것들의 배위자 사이의 상호작용은 혈액과 다양한 임파성 기관 사이의 임파구 교통뿐만 아니라 염증부위로의 백혈구의 일출을 엄밀하게 조절한다. 발명자들은 여기에서 모노클노날 항체 1B2에 의해 정의되는 90 kD 인체 내피세포 유착 분자(VAP-1)를 기술한다. VAP-1은 우선적으로 활액막, 말초 임파절 및 편도선 고내피세정맥(HEV)에서 발현되며 1B2는 이들 조직에서 HEV에 대한 임파구 결합을, 점막부위(mucosal site)에서 그에 대항함으로써 현저하게 억제한다. 더욱이, 임파구는 1B2-억제성 방식(1B2-inhibitable manner)으로 면역친화성-분리(immunoaffinity-isolated) VAP-1에 결합한다. 발현양식(expression pattern), 분자량 및 기능적 특성들에 의해 VAP-1을 임파구에 대한 새로운 내피 배위자(endothelial ligand)로 정의한다. 본 발명자들은 VAP-1은 인간에 있어서 임파구 교통에 직접적으로 수반되는 새로운 혈관 분자라고 결론을 내린다.

[항체의 생산]

VAP-1 단백질의 첫 동정에 이용하기 위하여, 인간 활액의 지질성분소(stromal elements)를 가지고, 새앙쥐 같은 적당한 동물을 면역화시켜서 활액막 맥관에 대한 모노클로날 항체를 생산하였다. 그러한 인간 활액막의 지질성분소는 공지의 방법으로 얻을 수 있다. 활액막 지질은 활액막 조직으로부터 임파구를 제거(depleting)하여 분리할 수 있다. 활액막 조직을 다지고(mince) 그 다진 조직을 스페인레스강 스크린을 통하여 압착한다. 스크린의 끝(top)으로부터 지질성분소를 모은다. 바람직하게는 이뮤노겐(immunogen)은 예를 들어, 불완전 프로인트 보조약(incomplete Freund's adjuvant)과 함께 투여한다. 그러나 여하한 적당한 보조약을 사용할 수 있다. 이뮤노겐과 보조약을 항체합성을 유도할 수 있는 실험법(protocol)나 양생법(regime)에 따라 주사한다. 예를 들어, 특이적-병원이 없는(specific-pathogen free) Balb/c 새앙쥐의 발바닥(footpad)에 일주일 간격으로 세 번 이뮤노겐(일 주사당 약 1㎍ VAP-1 항원을 함유하는 활액막 지질성분소)을 주사하면 면역반응을 유도할 것이다.

슬와근(popliteal) 임파절로부터의 임파구는, 다진 임파절을 스테인레스강 스크린을 통하여 압착하고 그 유출(flow)로부터 방출되는 임파구를 모으는 방식의, 위에서 기술한 바의 잘 알려진 방법을 이용하여 분리하고, 표준실험법을 이용하여 비분비성(nonsecreting) NS-1 새앙쥐 골수종(myeloma) 세포(ATCC로부터 구입가능, No. TIB 18)와 융합시킨다. 동결절편의 면역퍼옥시다제(immunoperoxidase) 염색법과 같은 여하한 적당한 방법을 이용하여 하이브리도마를 선별(screen)할 수 있다. 활액막의 맥관 내피와 반응성인 항체를 생산하는 하이브리도마(1B2, IgG₁subclass)를 제한희석(limiting dilution)으로 두 번 클로닝하고(clone) 추억의 시험분석용으로 선택하였다. mAb 1B2 에 의해 인지된 항원은 VAP-1(Vascular Adhesion Protein)으로 명명하였다.

VAP-1 결합 단백질로서 본 발명의 방법에서 이용된 항체는 바람직하게는 단일특이성 항체(monospecific antibodies), 즉, 오직 VAP-1 또는 그것의 항원성 분절(fragment)에 대해서만 특이성을 갖는 항체이다. 단일특이성 항체는 폴리클로날(polyclonal) 및 모노클로날 모두일 수 있다.

폴리클로날 항체는 적당한 동물에 실질적으로 순수한 VAP-1 제제를 주사하고 적당한 간격으로 한 번 또는 그 이상 촉진주사(booster injections)를 하여 제조할 수 있다.

그러나, 본 발명의 방법에 있어서 VAP-1 항원에 대한 모노클로날 항체(또는 Fab', F(ab')₂또는 Fv 분절과 같은 생물학적으로 활성인 그것들의 유도체)를 사용하는 것이 바람직하다. 모노클로날 항체는 여하한 적당한 원천(source)으로부터 얻을 수 있으며, 그러므로 예를 들어, 쥐(murine) 또는 인간 모노클로날 항체로부터 선택할 수도 있음을 주목해야만 한다.

항체는 또한 적당한 세포, 예를 들어, 미생물, 식물, 동물 또는 인간 세포에서 항체 또는 생물학적으로 활성인 그 유도체를 부호화(coding)하는 DNA 서열을 클로닝하고, 당해 항체 또는 싱물학적으로 활성인 유도체의 생산을 유도하는 조건에서 그 세포를 배양하고, 그 배양물로부터 항체 또는 생물학적으로 활성인 그의 유도체를 회수함(recovering)으로써 제조할 수 있다.

본 발명의 시약(reagent)에서 사용되는 항체는 본 방법의 정확도를 증진시키기 위하여 바람직하게는 실질적으로 순수한 형태이어야 한다.

[VAP-1의 특성]

분리된 VAP-1은 환원조건(reducing conditions)에서 90 kD 그리고 비-환원조건에서는 100 kD의 분자량의 갖는다.

VAP-1을 분리하기 위하여, 임파구-제거 편도선 추출물이 VAP-1 단백질의 좋은 원천이다. 이 추출물은 잘 다진 편도선 조직을 스테인레스강 스크린을 통하여 압착하여 그 조직으로부터 임파구를 제거하여 제조한다. 지질성분소를 스크린의 정상부분으로부터 모은다. 그러나, 예시공정(exemplified procedure)로서의 아래의 공정에서 발현된 VAP-1이 사용될 수 있는 어떠한 세포 유형도, 최조 분리물(final isolation)로서 1B2 mAb에 대한 VAP-1의 친화력을 신뢰할 수 있다.

모든 단계는 냉장온도(약 4℃)에서 수행되어야 한다. 세포를, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-base, 0.15 mM MgCl₂, 1% NP-40, 1 mM PMSF 및 1% 아프로티닌을 함유하는 완충액과 같은, 단백질분해를 억제하는 시약을 함유하는 완충액에서 온화하게 용해한다(예를 들어 4℃에서 하룻밤). 다음 그러한 추출물을 예를 들어, 10,000g에서 30분동안 온화하게 원심분리하여 세포용해 찌꺼기(debris)를 제거한다. 다음으로 상청액을, 친화성 인자(affinity agent)로서, 연속적으로, (1) 정상 새앙쥐 혈청, (2) 비-특이성 IgG₁mAb(1E12 또는 상업적으로 사용가능한 비-특이성 IgG₁mAb와 같은 것) 및 (3) 1B2 mAb가 제공되는 일련의 친화도 컬럼에 적용한다. 1B2 mAb 컬럼에 결합한 물질을 50 mM 트리에타놀아민으로 용출시키고, 동결건조한다. 이러한 장치를 이용하여, 편도선 지질로부터 VAP-1을 분리하였다. 다른 이와 비슷한 잘 알려진 방법을 이용할 수도 있다.

세포들에서, 모노클로날 항체 1B2를 사용하여 검사해 본 바로는, VAP-1은 염증유발된 활액막에 있어서 HEV-같은 세정맥에 풍부하다. VAP-1은 침윤 백혈구 또는 활액막 지질의 어떠한 연결 조직 성분에는 있지 않다. 말초 임파절 및 편도선에서, VAP-1은 HEV의 대부분에서 나타나는 것으로 보인다. VAP-1은 내피 세포의 내구경면(luminal side)에 고도로 자리한다. VAP-1의 과립상 염색(granular staining)은 내피세포 세포질에서, 그리고 또한 외구경표면(abluminal surface)에서 보인다.

특히 편도선에서, VAP-1 준위는 여러 HEV들에서 매우 다양하며, 아주 적은 몇몇 HEV(전형적인 무리(plump) 형태를 갖는)만이 전혀 VAP-1을 갖지 않는다. 충수 및 장(gut)의 고유층에는 아주 적은 수의 희미하게 염색된 세정맥이 나타나는 것으로 보인다. 배중추(germinal centers)의 수지상 세포(dendritic-like cells)에서, 및 동맥, 정맥 및 장벽(bowel wall)의 평활근세포(smooth muscle cells)에서 미약한 VAP-1의 발현이 발견된다.

대조적으로, VAP-1은 보다 큰 맥관(vessels)의 내구경면에는 실질적으로 없다. 조직절편의 백혈구는 물론, 다음의 세포들도 VAP-1의 발현이 보이지 않는다; 말초혈액임파구, 단핵세포, NK세포, 과립구 및 분리된 편도선 백혈구, T-임파아구성세포계(T-lymphoblastoid cell line) CCRF-CEM(CCL 119, ATCC); B-임파아구성세포계 KCA 및 IBW-4(스탠포드대학교, E. Engleman으로부터 최초로 얻은 EBV 전형된 B세포계), 단핵 세포계 U937(CRL 1593, ATCC); 및 백혈병 세포계 KG-1(CCL 246, ATCC); KG-la(CCL 246.1, ATCC) 및 K562(CCL 243, ATCC); 내피세포계 EaHy-926(암(carcinoma) 및 내피세포 사이의 하이브리도마세포계, Edgell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3724(1983)); 및 평활근세포, 섬유아세포(fibroblast) 및 케라티노사이트(keratinocyte)의 일차배양물, 및 내피양(epithelioid) HeLa 세포계(CCL 2, ATCC). 자페(Jaffe)의 방법(J. Clin. Invest. 52.2745(1973))으로 분리한, 인간배꼽(umbilical) 정맥 내피세포(HUVEC)는 기본적으로나(basally), 또는 IL-1(20,100 U/ml), TNF(200 U/ml) 또는 LPS(0.1, 1.0 ㎍/ml)로 처치한 4시간 또는 20시간후에나 VAP-1을 발현하지 않았다.

백혈구 결합을 매개하는 공지의 내피세포 분자와 VAP-1을 비교할 때, 몇가지 다른 점을 드러낸다. 세포간(intercellular) 유착분자 -1 및 -2(ICAM-1 및 ICAM-2), 맥관세포 유착분자-1(VCAM-1), E-셀렉틴(selectin)(ELAM-1) 및 P-셀렉틴(CD62, PADGEM, GMP 140)은 모두 기본적으로나, 또는 염증성 매개자에 의해 유도된 후에나 발현된다(Springer, T. A., Nature 346:425(1990); Stoolman, L. M., Cell 56:907(1989); Osborn, L., Cell 62:3(1990); Pober and Cotran, Transplantation 50:537(1990); Butcher, E. C., Cell 67:1033(1991); de Fougerolles, A. R., et al., J. Exp. Med. 174, 253(1991); Osborn L., et al., Cell 59, 1203(1989); Bavilacqua, M. P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 9238(1987); McEver. R. P., et al., J. Clin. Invest. 84, 92(1989); Hattori. R., et al., J. Biol. Chem. 264, 7768(1989); Wellicome, S. M., et al., J. Immunol. 144, 2558(1990); Pober, J. S., et al., J. Immunol. 137, 1893(1986); Dustin, M. L., et al., J. Immunol 137, 245(1986)). 대조적으로, VAP-1은 기본적으로 발현되지 않으며, 또한 HUVEC의 표면이나 세포형질에 IL-1-, TNFa 또는 LPS 처치에 의해서도 유도되지 않는다. 이 분자의 조직분포는 확실히 특유하며, 또한 그 분포는 편도선의 평행절편(parallel section)에서 분석할 때 특유하다(자료는 나타내지 않음). ICAM들은 대부분의 크고 작은 맥관 및 일부 백혈구의 내구경표면을 염색한다(de Fougerolles, A. R., et al., J. Exp. Med. 174, 253(1991); Dustin, M. L., et al., J. Immunol. 137, 245(1986)). 다른 한편, VCAM-1 및 ELAM-1은 단지 염증유발된 조직에서 적은 수의 세정맥을 염색한다(Rice, G. E., et al., J. Exp. Med. 171, 1369(1990); Rice, G. E., Et al., Am. J. Pathol. 138, 385(1991); Cotran, R. S., et al., J. Exp. Med. 164, 661(1986)). 대신 VAP-1은 비-점막부위에서 HEV의 많은 대다수에서 강하게 발현되었고, 시험한 백색(white) 세포 및 세포계에서 없었다. ICAM-1을 제외하고는 공지의 유착 분자들의 분자량 또는 VAP-1과는 확연히 달랐다(ICAM-2는 60 kD, VCAM-1dms 110 kD, E-셀렉틴 115 kD, 그리고 P-셀렉틴은 140 kD분자이다. Stoolman, L. M., Cell 56, 907(1989); Osborn, L., Cell 62, 3(1990); de Fougerolles, A. R., et al., J. Exp. Med. 174, 253(1991)). 더욱이, VAP-1은 주로 임파구 결합에 관련하는 한편, ICAM들, E- 및 P-셀렉틴은 또한 다형핵백혈구(polymorphonuclear leukocytes)의 유착을 효율적으로 매개하다(Springer, T. A., Nature 346, 425(1990); Stoolman, L. M., Cell 56, 907(1989); Osborn, L., Cell 62, 3(1990); Pober and Cotran, Transplantation 50, 537(1990); Butcher, E. C., Cell 67, 1033(1991)). 인간에서 임파구 결합에 관련되며 HUVEC에서 발현되지 않는 지금까지 기술된 유일한 내피 유착 분자는 MECA-79로 정의되는 항원이다(Berg. E. L., et al., J. Cell Biol. 114, 343(1991)). 그렇지만, 그것은 말초 임파절의 조직-특이성 어드레신(addressin)이다. 더욱이, VAP-1은 모든 MECA-79-양성 세정맥에서 공조발현(co-express)하지 않으며, mAb 1B2는 정제된 MECA-79 항원을 인지하지 않는다.

그러므로, VAP-1의 발현양식, 기능 및 분자량은 그것이 임파구 결합에 관련하는 다른 어떤 기존의 내피 분자와 동일하지 않으며, 생체내에서 염증의 정도는 VAP-1 발현의 준위(level)에 상관관계가 있다는 것을 나타내는 것이다. 이러한 결과는 VAP-1이 인간에 있어서 생리학상의 임파구 재순환을 이해하는 데 적절하며, 특히 조직 선택성 임파구 귀소의 분자적 기구를 분석하는 데 가치가 있다는 것을 보여준다.

[VAP-1 및 VAP-1 결합 화합물의 용도]

본 발명은 인간 또는 동물체로부터 채취한 시료에서, VAP-1 단백질 및 VAP-1 양성 세포의 검출에 대한 진단시약에 관한 것이다. 그러한 시약은 VAP-1 단백질과 반응하는 항체; 또는, 바람직하게는 VAP-1 분리물 또는 그 표면에서 VAP-1을 발현하는 세포에 대한 항체의 결합을 검출(detection)하는 것을 허용하는 물질로 표식된(labelled) 상기 항체의 VAP-1 반응성 분절일 수 있다. 그러한 진단 조성물은 개별 용기에,

a) VAP-1과 반응성인 항체, 또는 상기 항체의 생물학적으로 활성인 유도체로서, 바람직하게는 VAP-1 항원에 대한 항체의 결합을 검출하는 것을 허용하는 물질로 표식된 유도체; 및

b) 시험분석결과에 대한 기준값을 제공하기 위한 정제된 VAP-1 단백질, 이 구비된 키트(kit)로서 만들 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 염증의 치료가 요구되는 인간 또는 동물 환자에게 VAP-1-결합성 화합물(VAP-1과 반응하는 항체, 또는 그 항체의 생물학적으로 활성인 유도체, 또는 VAP-1의 용해성 배위자 등)의 유효량을 투여함으로써, 인간 또는 동물 생체내에서 염증을 완화 또는 치료하는 방법을 목적으로 하다. 용어 "치료(treatment)" 또는 "치료하기(treating)"는 예방(prophylaxis), 개선(amelioration), 방제(prevention) 또는 VAP-1 유착 현상(events)에 의해 매개되는 질병의 치료를 포함하는 목적을 갖는, 대상자에 대한 VAP-1-결합성 화합물의 투여를 포함함을 의미한다. 본 발명의 방법의 대상인 특수 VAP-1-결합성 분자는 정제된 천연 단백질 및, 항체 또는 다른 분자 등과 같은, 재조합(recombinant) VAP-1-결합성 단백질이다.

환자에 투여시, 본 발명의 시약은 비경구적으로(parenteral), 경비적으로(nasal), 장용으로(enteric) 또는 직장으로(rectal) 투여하기에 적당한 여하한 방법으로 제형화 할 수 있다. 그리하여, 본 시약은 예를 들어, 주사제, 에어로졸제, 현탁제, 액제, 관장제(enema) 등의 제형일 수 있다. 본 시약은 통상의 제약학적 방법에 따라서 등장액과 같은 제약학적으로 허용되는 부형제(excipients or vehicles)와 함께 제형화할 수 있다. 본 약물의 투여량은 환자의 VAP-1 유착 현상의 차단에 의해 항-염증 효과를 제공하는 데 충분해야 할 것이다.

본 발명의 시약은 VAP-1 유착-매개로 증진된 염증반응에 관련된 어떠한 증상의 진단 또는 치료에 적절하다. 그러므로, 이 시약은 관절염, 국소 감염, 피부병, 염증성 장염 등의 증상의 진단에 유용하다.

일 실시양태에 있어서, 염증의 2차 유해 염증 작용에 대한 치료적 이익을 제공하기 위하여 VAP-1-결합성 화합물의 유효량(efficacious level)을 투여한다. VAP-1-결합성 화합물의 "유효량"은 VAP-1-매개 현상에 의한 독성 효과가 그 최소의 수준으로 개선되는 양을 의미한다. "과잉의(excessive)" 숙주(host) VAP-1-매개 현상은 대상물에 있어서 대상물의 건강한 의학적 상태의 정상치(norm)를 초과하는 VAP-1-매개 유착 현상의 정도를 의미한다. "2차(secondary)" 조직 손상 또는 독성작용은 신체의 그밖의 부분에서의 "1차" 자극(stimulus)의 결과로 생기는 것을 포함하는, 과잉의 VAP-1-매기 유착 현상에 기인하는 다른 건강한 조직, 기관, 및 그 안의 세포들에 발생하는 조직손상 또는 독성작용을 의미한다.

본 발명의 방법에 있어서, VAP-1-결합성 화합물, 예를 들어, VAP-1 항체 같은 것의 환자에 대한 주입(infusion)은 활액막 HEV, 말초 임파절 HEV 및 편도선 HEV와 같은, 그 표면에서 VAP-1을 발현하는 환자의 세포들에 그 항체가 결합하는 결과를 낳음으로써, 그것이 VAP-1 결합에 의해 다른 세포에 유착하는 것을 방지하며, 그리하여 그러한 조직이나 세포들에 대한 임파구의 유착을 예방 또는 억제하고, 그리하여 병에 걸린 세포나 조직으로의 임파구의 바람직하지 못한 교통이나 유입을 예방하고, 그리하여 VAP-1에 의한 백혈구의 교통 및 백혈구 일출로부터 발생하는 바람직하지 못한 염증반응을 예방한다.

따라서, 본 발명의 제약학적 조성물은 환자에 있어서, 생물학적 표적 및 특히 내피세포에 대한 환자의 본래의 VAP-1 결합에 (부분적으로 또는 충분히) 길항하기에 충분한 양의 VAP-1 결합 화합물을 함유하는 조성물을 제공한다.

VAP-1 결합성 화합물은 화학적으로나 유전공학에 의해 VAP-1-결합성 화합물을 원하는 작용부위로 표적화(targeting)해주는 다른 인자(agent)의 분절에 접합될(conjugated) 수 있다. 마찬가지로, 다른 화합물인 화학적으로나 유전공학에 의해 VAP-1-결합성 화합물에 접합되어, 그 VAP-1-결합성 화합물에 부가의 특성, 특히 VAP-1 유착-매개 독성작용의 제거(relief)를 촉진하는 능력을 증강시키는 특성을 제공 또는 증강시킬 수 있다.

VAP-1-결합성 화합물의 투여의 양 및 식이법(regimen)은 관절염 및 조직 상해(injury)와 같은 염증-관련 질환을 치료하는 임상기술에 있어서 보통의 숙련된 기술을 가진 이들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 일반적으로, VAP-1-결합성 화합물 치료의 복용량은 사용하는 VAP-1-결합성 화합물의 유형; 나이; 건강; 치료를 요하는 의학 상태; 만약 있다면, 병행하는 치료의 종류, 치료의 횟수 및 기대하는 효과의 특성; 조직 손상의 범위; 성(gender); 증상의 지속기간; 및 만약 있다면, 대항적응(counterindication), 및 서로 다른 의사들에 의해 조정된 변수들(variables)과 같은 것을 고려하여 변화될 것이다. 한 번 또는 그 이상의 적용으로 원하는 결과를 얻을 수 있도록 적당한 복용량을 투여할 수 있다. 항-VAP-1 항체와 같은 본 발명의 VAP-1 결합성 화합물을 함유하는 제약학적 조성물은 단위 복용 제형으로 제공될 수 있다.

본 발명의 VAP-1 결합성 화합물을 함유하는 제약학적 조성물은 투여에 적당한 약리학적 담체와 함께 투여될 수 있다. 그것은 인간 또는 동물에서 VAP-1 매개 현상의 상태를 예방, 완화, 방제 또는 치료하는 데 효과가 있는 어떠한 제형으로도 투여될 수 있다. 명확한 정의를 위하여, 질병의 "치료 방법(a method of treatment)"의 표현, 및 그 유사 표현은 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐서, 그러한 질병을 예방하는 방법을 포함하는 것으로 한다.

비경구적 투여를 위한 본 발명의 VAP-1-결합성 단백질의 제제는 멸균된 수용성 용매 또는 비-수용성 용매, 현탁액 또는 유탁액을 포함한다. 비-수용성 용매의 예로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 식물성기름(vegetable oil), 물고기기름(fish oil), 및 주사 가능한 유기 에스테르가 있다. 수용성 담체로는 물, 물-알코올 용액, 생리식염수 및 소디움클로라이드, 링거(Ringer)의 덱스트로스 용액, 덱스트로스와 소디움클로라이드의 용액, 락토스를 함유하는 링거 용액을 포함하는 의약적 비경구투여 완충 부형제(vehicle)를 포함하는 유탁액 또는 현탁액, 또는 정유(fixed oil)를 들 수 있다. 정맥내 투여용 기초제는 링거의 덱스트로스 및 그 유사한 것들에 기초한 것과 같은, 유체(fluid) 및 영양보충물(nutrient replenisher), 전해질보충물을 포함한다.

본 발명의 VAP-1-결합성 화합물은 또한 펌프(pump)에 의해서, 또는 특히, 1차 상처가 급성이 아니라 오랫동안 지속 또는 지연되었을 때 지속성-방출제형(sustained-release form)으로 투여할 수 있다. 1차 상처가 급성이 아니고 종종 지속 또는 지연되는 예는 1차 감염이나 손상이 며칠뒤까지 조직이나 근육에 대한 손상으로 드러나지(또는 지속되지) 않는 감염이나 염좌(sprain)가 있다. 본 발명의 VAP-1-결합성 분자는 또한 적당한 삽입용 카테테르를 이용하거나, 특정기관을 표적화하도록 고안된 복합분자(chimeric molecule, 또는 complex)의 일부로서 그 분자를 제공함으로써 고농도로 특정한 기관으로 공급할 수 있다.

장기간 반복주사(repeated injection)를 처방 받았을 때는 지속성-방출 제형의 투여가 더 편리하다. 예를 들어, 본 발명의 방법이 VAP-1-매개 질환에 기초한 유전적 또는 만성적 염증을 치료하는데 사용될 때는 환자를 최대한 편하게 하기 위하여 지속성-방출 제형으로 본 발명의 VAP-1-결합성 단백질을 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 VAP-1-결합성 화합물은, VAP-1-결합성 화합물의 생물학적 활성이 소화과정(digestive process)에서 파괴되지 않으며, 그리고 그 화합물의 특성이 장 조직을 통과하며 흡수된다면 경구투여를 위한 정제, 캅셀제, 산제 또는 액제와 같은 복용 제형으로 사용될 수 있다.

본 발명의 제약학적 조성물은 예를 들어, 통상의 혼합, 과립화, 당의정화(gragee-making), 용해, 동결건조 또는 유사한 공정에 의해, 이미 잘 알려진 방식으로 제조된다. 본 발명의 조성물은 그 자체로서, 만성 또는 급성의 VAP-1-유도 생리학적 손상의 조절에 있어서 유용성을 갖는다. 본 발명의 조성물은 그 최대도(maximum potential)로 VAP-1 유착을 인지하는 신체 자체의 기구(mechanism)를 방지한다.

정맥내 투여 제형에서, 본 발명의 조성물은 잠재적 조직 손상의 급성 처치(acute management)에 유용한 신속한 작용개시를 갖는다.

덧붙이면, 낮은 효능화(low potency version)가 경증 또는 만성 VAP-1-관련 질환의 처치에 유용한다.

부가적으로, 본 발명의 조성물은 인간 또는 동물의 혈류 또는 세포외 조직에서 VAP-1 준위의 실험실내 시험분석하는 데 대한 필수적인 시약을 제공한다.

추출, 침전, 크로마토그라피, 친화도 크로마토그라피, 전기영동 또는 그 유사한 방법과 같은 종래 단백질 분리에 사용하여온 통상의 조건 및 기술에 따라서, 실질적으로 천연 오염물이 제거된 VAP-1-결합성 단백질을 그의 천연 또는 재조합 원천으로부터 분리 및 정제할 수 있다.

아래의 실시예들은 단지 본 발명을 설명하고자 함이지 그 범위를 제한하고자 함이 아니다.

[실시예]

[실시예 1]

[VAP-1의 조직 분포]

저온 절편(cryostat section)을 면역퍼옥시다제 염색하여 VAP-1의 조직 분포를 결정하였다. 절편은 1차 항체(1B2 및 3G6, 닭 T-세포에 대한 대조 새앙쥐 IgG₁mAb)와 같이 30분간 숙성시켰다. 인산염 완충생리식염수(리터당 PBS, 8 g NaCl, 1.21 g K₂HPO₄및 0.34 g KH₂PO₄, pH 7.2)에서 두 번 씻은 후, 5% AB-혈청을 함유하는 PBS에 든 퍼옥시다제-접합 양(sheep) 항-새앙쥐 IgG(Dakopatt, Denmark)를 30분동안 가하였다. 다음, 0.03% 하이드로젠 퍼옥사이드를 함유하는 PBS에 든 3',3'-디아미노벤지딘 하이드로클로라이드를 색원체(chromogen)로 사용하였다. 염색후, 절편을 헤마톡실린(hematoxylin)으로 대비염색하였다. 면역형광염색을 위해서, 3 ㎛ 저온 절편을 1차 항체로 덮어씌우고, FITC-접합 양 항-새앙쥐 IgG(Sigma, St. Louis)를 2단계 시약으로 사용하였다.

면역조직학적(immunohistological) 염색의 결과 모노클로날 항체 1B2는 염증유발 활액막에서 HEV-양 세정맥을 강하게 염색하는 것을 보여준다(제 1a도). 침윤 백혈구나 활액막 지질의 연관조직(connective tissue) 성분에서는 염색현상이 관찰되지 않았다. mAb 1B2에 의해 인지된 항원을 VAP-1(Vascular Adhesion Protein-1)이라 명명하였다. 말초 임파절 및 편도선에서, mAb 1B2는 HEV의 대부분과 반응하였다(제 1b도). VAP-1은 내피세포의 내구경면에서 강하게 발현되었다(제 1c도). 내피세포 세포형질에서 과립상 염색이 보이고 외구경표면(abluminal surface)은 mAb 1B2 양성이었다. 특히 편도선에서 서로 다른 HEV 간에 염색의 강도가 주목할 만큼 다양하였으며, 전형적인 무리 형태를 갖는 소수의 HEV는 1B2-음성이었다(제 1d도). 충수 및 장(gut)의 고유층에서는, 단지 아주 적은 수의 염색된 세정맥이 탐지되었다. 또한 배중추의 수지상 세포, 및 동맥, 정맥 및 장(bowel)벽의 평활근세포에서 약한 VAP-1의 발현이 보였다. 대조적으로, 보다 큰 맥관의 구경표면에는 실제로 VAP-1이 없었다. 조직 절편의 백혈구와 마찬가지로, 말초 혈액 백혈구, 단핵세포, NK세포, 과립구 및 편도선 백혈구 분리물은 모두 FACS 시험분석에서 완전히 1B2-음성이었다. T-임파아구양(CCRF-CEM), B-임파아구양(KCA, IBW-4), 단핵성(U937) 및 백혈병(KG-1, KG-1a, K562) 세포계는 모두 VAP-1을 결여하였다. 더욱이, VAP-1은 인간배꼽정맥내피세포(HUVEC)에 본디 없으며; IL-1(20,100 U/ml), TNF-μ(200 U/ml) 또는 LPS(0.1, 1.0 ㎍/ml)로 처치한 4시간 또는 20시간에도 그 합성이 유도되지 않았다. 내피세포계(EaHy-926) 또한, 1B2-음성이었다. 평활근세포, 섬유아세포 및 케라티노사이트의 일차배양물 및 내피양(HeLa) 세포계도 VAP-1을 발현하지 않았다.

[실시예 2]

[VAP-1의 세포내 정위]

실시예 1에 기술한 조직 정위(localization) 실험에 이어, 편도선으로부터 자른 두꺼운 절편(15 ㎛)의 공초점 현미경검사(confocal microscopy)로 VAP-1의 세포내 정위를 연구하였다. 절편을 mAb 1B2 또는 3G6으로 15분간 숙성시키고, PBS로 두번 씻고 FITC-접합 양 항-새앙쥐 Ig로 15분간 덮어씌웠다. 그런 다음, 시료를 공초점 현미경으로 분석하기에 앞서 항-퇴색제(anti-fading agent)로서 10% PBS 및 페닐렌디아민을 함유하는 글리세롤에 봉입하였다(mounting). 현미경 관찰에 의해, VAP-1이 HEV의 내구경 표면 및 세포형질 내의 각각의 과립에도 존재한다는 것을 쉽게 분별할 수 있었다. 이 과립들의 정체(indentity)는 현재 불분명하나, mAb 1B2 및 제 Ⅷ인자에 대한 항체를 이용하여 2-색 면역형광 염색을 했을 때, 이 과립들은 정위되지 않았다. 그리하여, VAP-1 양성 과립은 내피세포 유착 분자, P-셀렉틴에 존재하는 것으로 알려진, 내피세포의 바이델-팔라데체(Weidel-Palade bodies)가 아니다.

[실시예 3]

[VAP-1의 분자량 정량]

임파구-제거 편도선 추출물을 용해완충액(150 mM NaCl, 10 mM Tris-base, 0.15 mM MgCl₂, 1% NP-40, 1 mM PMSF 및 1% aprotinin)에서 4℃에서 하룻밤 용해시켰다. 용해질을 4℃에서 30분동안 10000 g로 원심분리하였다. 용해질을 세파로스 CL-4B(Pharmacia, Sweden) 컬럼에 통과시켜 상청액을 전세정하였다. 다음 그것을 연속하여 정상마우스 혈청, 무관련(irrelevant) IgG₁mAb 및 1B2 mAb으로 유도된(derivatized) 세 개의 CNBr-활성화 세파로오스-4B 컬럼(Pharmacia)(5 ㎎/ml, 5ml column volume)에 적용하였다. 용해완충액으로 컬럼을 충분히 세척하였다. 그런 다음, 1B2 컬럼에 결합된 물질을 50 mM 트리에타놀아민으로 용출시키고, 동결건조하고, SDS-PAGE(7.5%, reduced)에 용해시키고 은염색법을 이용하여 가시화하였다.

요오드 표식을 위해, 임파구-제거 편도선 추출물을 100 U/ml 콜라게나제(클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)으로부터의 유형 Ⅱ), 10% 송아지태혈청(FCS, fetal calf serum), 항체 및 10 mM 헤페스(Hepes)를 함유한 RPMI 1640에서 천천히 교반하며 37℃에서 1시간동안 온침시켰다(digestion), 콜라게나제 온침후, 세포를 HBSS에서 씻고, 락토퍼옥시다제 방법을 이용하여¹²⁵Ⅰ로 표면-표식을 하였다. 요오드화된 세포를 용해완충액으로 용해시키고, 용해물을 10000 g에서 15분동안 원심분리하여 맑게 하였다(clarify). 용해물을 정상 새앙쥐 혈청에 결합된(coupled) CnBr-활성화 세파로스로 4℃에서 16시간 동안 전세정하였다. mAb 1B2 또는 3G6과 결합된 CnBr-활성화 세파로스-4B 비드(beads)로 면역침전법을 수행하였다. 환원(2-머캅토에탄올) 조건에서 7.5% SDS-PAGE를 이용하여 시료를 분석하였다.

VAP-1의 분자량을 정량하기 위하여, 편도선 지질로부터 친화도-분리한 분자를 SDS-PAGE에 적용하였다. 겔(gel)을 은염색하여 환원조건에서 90 kD의 분명한 분자량주대역(major band)이 드러났다(제 2도). VAP-1은 비-환원조건에서 조금 느리게 이동하였다(mγ 100 kD). 요오드화 편도선 지질세포로부터의 면역침전법 분석으로 mAb 1B2의 90 kD 분자 (및 조금 더 작은 분해산물)와의 반응성을 확인하였다. 또한 180-200 kD 대역도 때때로 볼 수 있었다.

[실시예 4]

[편도선, 말초 임파절(PLN), 활액막, 및 충수 HEV에 대한 임파구의 결합 및 편도선 HEV에 대한 과립구의 결합]

이 기술의 세세한 내용은 일찍이 기술되었다(Jalkanen and Butcher, Blood 66, 577 (1985)). 간단히 하면, 인간 편도선, 활액막, 충수 및 말초 임파절에서 자른 신선한 냉동 절편을 1B2 또는 3G6 상청액과 같이 7℃에서 30분간 서서히 회전시키며 숙성시켰다. 5% FCS 및 10 mM 헤페스를 함유하는 HBSS에 든 피콜(Ficoll)-분리 임파구(3x10⁶/section)를 가하고 숙성을 30분간 더 계속하였다. 숙성후, 비-유착 세포를 버리고(tip off) 유착세포를 1% 글루타르알데하이드를 함유하는 찬 PBS에서 하룻밤 고정시켰다. 시료당 조직당 4에서 6절편에서 HEV에 결합된 세포를 하나의 단위점(single blind)으로 간주하였다(최소 100 HEV). 과립구 결합을 정량할 때도, 과립구(Histopaque 1119를 이용하여 분리한 것, Sigma)를 절편에 적용하는 바로 전까지 Ca²⁺-Mg²⁺-없는 HBSS에서 보관한 것을 제외하고는, 유사하게 수행하였다.

생체내 내피세포에서 VAP-1의 조직 분포는 그것이 백혈구에 대한 특이적 인지 요소로서 기능한다는 것을 시사하였다. 그러므로, 변형된 스탬퍼-우드러프 시험관내 분석법(modified Stamper-Woodruff in vitro assay)(Jalkanen and Butcher, Blood 66, 577 (1985))을 이용하여 HEV-결합에서 VAP-1의 기능적 역할을 연구하였다. 냉동 절편을 mAb 1B2로 전처리하여 HEV에 대한 임파구의 결합을 억제하였다(제 3도). 억제효과는 편도선 및 말초 임파절에서 가장 뚜렷하였으나, 활액막 HEV에 대한 결합도 또한 유의성 있게 감소하였다. 충수 HEV에 대한 임파구 결합 및 편도선 HEV에 대한 과립구 결합은 보다 덜 영향을 받았다(제 3도). 이러한 발견은 VAP-1이 말초 임파절, 편도선 및 활액막 HEV에 대한 임파구의 인지를 매개하거나, 그것을 매개하는 내피세포 요소(element)와 밀접하게 관련이 있다는 것을 나타낸다. 임파구-내피세포 상호작용에서 VAP-1의 관련을 직접적으로 평가해보기 위해서, 친화도-분리 VAP-1에 대한 임파구의 결합을 분석하였다(제 4도). 임파구는 판-결합된(plate-bound) VAP-1에 효율적으로 유착하였다. VAP-1에 대한 임파구 결합은 특히 mAb 1B2에 의해 억제되었으나, 대조 mAb 3G6은 그렇지 않았다. mAb 1B2는 다른 관련이 없는 내피세포 분자에 대한 임파구의 결합을 막지 않았다(제 4도).

조직 분포 및 HEV-결합의 결과는 VVAP-1이 주로 말초 임파절, 편도선 및 활액막으로의 임파구의 교통(trafficking)에 관련이 있다는 것을 시사한다. 흥미롭게도, 편도선에서 VAP-1 발현의 부족(lack)은 1B2-양성의 것과 형태적으로 분간할 수 없는 후모세관 세정맥의 미미한 부분집합(subset)을 규정한다. 편도선은 궁극적으로 위장관(gastrointestinal tract)에 관련되어 있으므로, 그것은 정막성(VAP-1 음성) 및 말초임파절(VAP-1 양성) 유형의 둘 다의 HEV-특이성을 갖을 수 있다. VAP-1 발현에서 표현형의 상이함(phenotypic difference)이 어떻게 각 개별 HEV의 임파구 결합능력과 상관관계를 갖는지는 앞으로 결정해야 할 문제로 남는다. 점막 임파성 기관에서 VAP-1의 희소(scarcity)는 이 내피 항원이 특유한 임파구 인지 체계에서 구별되어 조절된다는 것을 암시한다. 더욱이, 염증의 정도는 생체내에서 VAP-1의 발현 준위에 상관관계를 갖는다.

[실시예 5]

[VAP-1에 대한 세포의 결합에 미치는 1B2의 효과에 대한 시험분석]

실시예 2에서 기술한 바에 따라, 편도선 추출물로부터 VAP-1 및 1E12를 친화도-정제하였다(affinity purify). 정제된 VAP-1, 1E12 및 열-불활성화시킨 BSA를 청정제(detergent)로서 0.01% β-옥틸글루코피라노사이드와 함께, 20mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂에 희석하였다. 단백질을 유리 웰(Lab-Tek chamber slides, Nunc)에 4℃에서 16시간동안 흡수시켰다. 상온에서 30분동안 1mg/ml BSA를 함유하는 PBS에서 차단(blocking)한 후, 1B2 또는 3G6 상청액을 웰에 가하고 상온에서 30분동안 숙성시켰다. 한편, 새로이 분리한 말초 혈액 단핵세포(mononuclear cells)를 조직 배향 병에서 10% FCS 및 10 mM 헤페스(Hepes)를 함유한 RPMI 1640에서 1시간동안 37℃에서 숙성시켜서, 증식성 유착성 단핵세포(plastic adherent monocyte)를 제거(depleting)하였다. 각 웰에 100㎕ RPMI 1640에 담긴 비-유착 임파구를 적용하였다(1.8×10⁶cells/well). 37℃에서 30분동안 숙성시킨 뒤, 비-유착 세포를 털어내서(by flicking) 제거하였다. 웰의 윗부분을 제거하고, 슬라이드를 천천히 흐르는 PBS에 세척하고, 1% 글루타르알데하이드를 함유하는 차가운 PBS에서 고정시켰다. 그런 뒤, 디프-퀵 염료(Diff-Quick stains)를 이용하여 세포를 염색하였다. 각 정(총면적 50㎟/sample)에서 세포의 수를 시각으로 세어서 결합된 세포를 정량하였다.

[실시예 6]

[VAP-1의 부분 아미노산 서열]

90 kD VAP-1 항원의 부분(partial) 아미노산 서열을 결정하였다. 부분 아미노산 서열은 TEDGDMXLVNGASANEGXVE[SEQ ID NO. :1:]로서 20 아미노산 길이이다. 단백질 및 DNA 서열 데이타베이스를 조사해도 다른 어떤 공지의 서열에서 이러한 서열을 보이지 않았다.

[실시예 7]

[염증반응을 보이는 임상 시료에서 VAP-1의 정량]

외과 수술로부터 정상 편도선, 말초 임파절, 장(gut), 및 심장의 신선한 시료를 얻었으며, 기관제공자(organ donor)로부터 신장 시료를 얻었다. 다른 조직은 부검(autopsy) 시료였다. 모든 표본은 조직병리학적으로 비-염증발생인 것을 확인하였다. 염증발생 표본은 만성 피부병(건선, 과민성습진(atopic eczema), 편평태선(lichen ruber planus))을 앓고 있는 환자로부터 피부천자생검법(skin punch biopsy)으로 얻었다. 또한 같은 환자로부터 육안으로 볼 때 감염되지 않는 대조 생검(contral biopsy)을 취했다. 염증발생 장 표본은 치료적 목적으로 외과수술을 받는 염증성 장염(크론병(Crohn's disease), 궤양성대장염)을 앓는 환자로부터 구했다. 활액막 표본은 활막절제(synovectomy)에서 얻었다.

시료를 실시예 1에서 기술한 바대로 면역퍼옥시다제로 염색하였다. 간단하게 언급하면, 아세톤-고정 냉동 절편을 연속하여 1차 항체(배양물 상청액 또는 50㎍/ml 정체면역글로불린) 및 적당한 퍼옥시다제 결합 2단계 시약과 함께 배양하고, H₂O₂및 기질(substrate)로서 디아미노벤지딘을 이용하여 발색반응(color reaction)을 전개하였다. 장(bowel) 및 피부 시료(정상 및 염증발생)에서 VAP-1 발현을 진단구별 없이(without knowledge of the diagnosis) 암호화된(coded) 시료로부터의 두 독립된 리더(reader)에 의해 분석하였다.

실시예 1에서 주목한대로, VAP-1은 정상 비-염증발생 장(gut)의 일부 세정맥에서 저조한 준위로 발현되었다(제5a도). 대조적으로 염증성 장염에 걸린 환자의 장 표본은 현저하게 증가된 VAP-1 발현을 보였다(제5b 및 5c도 및 표 1). VAP-1은 고유층의 벽이 편평하게 된(flat-walled) 세정맥 및 기질화된 임파양 소절(organized lymphoid follicles)(파이어판, Peyer's patches)의 HEV-유사 세정맥에서 모두 유도되었다. 또한 피부에서 만성 염증은 VAP-1의 합성의 증강을 수반하였다(제6a 및 b도). 결과에 있어서 개체간의 변이성(variation)의 효과를 배제하기 위하여, 피부병 병소로부터 한 시료와 같은 환자의 비감염 피부지역으로부터의 대조시료를 동시에 생검하여 염색하였다. 또한 이 표본들에서 상부 진피(upper dermis)의 VAP-1 양성 세정맥의 수는 대조지역으로부터의 시료에서 보다 염증발생된 시료에서 더 높았다. 더욱이, 두드러진 혈관주위의 백혈구 침윤은 항상 VAP-1 양성 맥관과 관련되었다.

* 장(bowel) 표본들은 크론병, 궤양성대장염 및 종양으로 수술하는 환자로부터 얻었다(종양 시료의 비감염 지역은 정상시료를 나타낸다). 각 시료에서 VAP-1 양성 세정맥의 수는 재료 및 방법에서 기술한 바대로 -로부터 ++++까지로 점수를 표시하였다.

[실시예 8]

[염증유발된 점막에 대한 결합을 매개하는 VAP-1]

시험관내에서 실시예 3에서 기술한 바대로 냉동 절편 시험분석을 수행하였다. VAP-1을 다량 발현하는 두 개의 장(gut) 시료에서 모노클로날 항체 1B2는 고유층의 작은 맥관(small vessel)에 대한 임파구 결합을 약 60% 억제하였다(제7도).

본 발명이 특정 실시양태와 관련되어 설명되었지만, 더 변형조절(modification)할 수 있음을 물론이며, 이 출원은 일반적으로 본 발명의 원리에 따르며, 본 발명이 갖는 기술범위 안의 공지의 또는 일반적인 실시에 해당하거나, 이상에서 개진된 필수적인 특징을 적용할 수 있거나 첨부한 청구범위 안에 들어오는 바의, 본 발명의 개시(명세, disclosure)로부터의 그러한 출발(이탈, departure)을 포함하는 본 발명의 여하한 변이(variation), 사용 또는 적용을 보호하고자 하는 것이다.

서열 목록(Sequence Listing)

(1) 일반 정보

(i) 출원인

(A) 성명 : 잘카넨, 시르파(Jalkanen, Sirpa)

(B) 거리 : 라우볼란티에(Rauvolantie)

(C) 도시 : 피이스판리스티(PIISPANRISTI)

(E) 국가 : 핀란드(FINLAND)

(F) 우편번호(ZIP) : SF-20760

(i) 출원인

(A) 성명 : 살미, 마르코(Salmi, Marko)

(B) 거리 : 베헤-헤민카투

(C) 도시 : 투르쿠(TURKU)

(E) 국가 : 핀란드(FINLAND)

(F) 우편번호(ZIP) : SF-20500

(ii) 발명의 명칭 : 인간에 있어서 임파구 결합을 매개하는 신규 내피세포 분자

(iii) 서열의 수: 1

(iv) 통신 주소 :

(A) 수신자

오리온 코포레이션, 오리온-파모스 파마슈티칼, 페이턴트 디파트먼트

(B) 거리 : 오리오닌티에 1(orionintie 1)

(C) 도시 : 에스푸(ESPOO)

(E) 국가 : 핀란트(FINLAND)

(F) 우편번호(ZIP) : SF-02200

(v) 컴퓨터 헤독 형식(computer readable form)

(A) 매체 유형(medium type) : 플로피 디스크

(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환형

(C) 운용 시스템 : PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어 : ASCII-format

(vi) 선출원 자료 :

(A) 출원번호 : US895354

(B) 출원일 : 1992년 6월 6일

(2) SEQ ID NO: 1:에 대한 정보

(i) 서열 특성:

(A) 길이 : 20 아미노산

(B) 유형(type) : 아미노산

(C) 가닥꼬임성(strandedness) : 양성(both)

(D) 위상(topology) : 선형(linear)

(ii) 분자 유형 : 펩타이드

(xi) 서열 명세 : SEQ ID NO: 1:

Thr Glu Asp Gly Asp Met Xaa Leu Val Asn Gly Ala Ser

1 5 10

Ala Asn Glu Gly Xaa Val Glu

15 20

Claims

환원조건에서 SDS-PAGE에 의해 결정되는 90kD의 분자량을 가지며, 기탁번호 DSM ACC 2041의 하이브리도마 세포계에 의해 생성되는 모노클로날 항체에 의해 인식되는, 실질적으로 분리정제된 인간 내피 맥관 유착 단백질(VAP-1).
제1항에 있어서, 상기 VAP-1이 임파구에 결합하는 것인 VAP-1.
제1항 또는 2항에 있어서, 상기 VAP-1이 기탁번호 DSM ACC 2041의 하이브리도마 세포계에 의해 생성되는 항-VAP-1 항체에 상기 VAP-1을 결합시키는 것을 포함하는 공정에 의해 생산되는 것인 VAP-1.
항-VAP-1 항체를 생산하는 하이브리도마 세포계.
제4항에 있어서, 기탁번호가 DSM ACC 2041인 하이브리도마 세포계.
제1항에서 정의되는 인간 내피 VAP-1에 특이적이며, 인간 배꼽정맥(umbilical vein) 내피 세포(HUVEC) 표면 단백질에 결합하지 않는 항-VAP-1 항체 또는 그 항-VAP-1 항체 결합 분절.
제6항에 있어서, 상기 항체가 기탁번호 DSM ACC 2041의 하이브리도마 세포계에 의해 생성되는, 맥관 유착 단백질 VAP-1에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 1B2인 항-VAP-1 항체.
제6항 또는 7항의 항-VAP-1 항체 또는 그 항-VAP-1 항체 결합 분절을 함유하는 세포-유리 조성물.
제6항 또는 7항의 항-VAP-1 항체 또는 그 항-VAP-1 항체 결합 분절 및 제약학적으로 허용되는 담체를 함유하며, VAP-1 매개 임파구-내피세포 유착 반응을 억제하는 데 사용되는 제약학적 조성물.
제6항 또는 7항의 항-VAP-1 항체 또는 그 항-VAP-1 항체 결합 분절 및 제약학적으로 허용되는 담체를 함유하는, VAP-1 매개 임파구에 대한 내피세포결합을 진단하는 데 사용되는 진단 조성물.