JP3431922B2

JP3431922B2 - 炎症性疾患および自己免疫疾患の診断用組成物および診断方法

Info

Publication number: JP3431922B2
Application number: JP50115594A
Authority: JP
Inventors: ヤルカネン、シルパ; サルミ、マルコ
Original assignee: オイバイオティエセラピーズリミテッド
Priority date: 1992-06-09
Filing date: 1993-06-09
Publication date: 2003-07-28
Anticipated expiration: 2018-07-28
Also published as: EP0656906B1; AU4328193A; CA2137551C; WO1993025582A1; NZ299958A; JP2003180346A; DK0656906T3; ATE184315T1; DE69326347D1; GR3031255T3; FI121176B; CA2137551A1; HUT75824A; HU217175B; AU671837B2; NZ253151A; KR950701938A; JPH07507557A; ES2135480T3; EP0656906A1

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、VAP−１と名つけられた新規なヒト内皮細
胞接着抗原、およびVAP−１抗原を認識するモノクロー
ナル抗体、1B2に向けられ、ならびにリンパ球移動で特
徴づけられる慢性的な炎症性のおよび感染の状態の診断
および診療におけるかかる分子の用途に向けられる。

発明の背景ほとんどの成熟したリンパ球はたえず血液とリンパ系
器官とのあいだを再循環している（ブッチャー、イー・
シー（Butcher,E.C.）、カレント・トピックス・イン・
マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（Curr.T
op.Microbiol.Immunol.）128巻、85頁（1986年））。リ
ンパ球は血管内皮細胞を認識しそこに結合することによ
って血液から出ていく。そののち、リンパ球は内皮細胞
間を通って周辺の組織の中へ移動する。リンパ球の往来
（trafficking）により、リンパ球の特性のすべてのも
の（repertoire）が身体のいたるところでの免疫反応に
用いられるようになり、また免疫応答の発生および制御
に必要とされる細胞−細胞の相互作用が促進される。内
皮細胞とのリンパ球の接着は、両方の細胞の型上で発現
される相補的な接着分子間の相互作用に依存する（スプ
リンガー、ティー・エー（Springer,T.A.）、ネイチャ
ー（Nature）346巻、425頁（1990年）；ストールマン、
エル・エム（Stoolman,L.M.）、セル（Cell）56巻、907
頁（1989年）；オズボーン、エル（Osborn,L.）、セル6
2巻、３頁（1990年）；ポバー（Pober）およびコトラン
（Cotran）、トランスプランテーション（Transplantat
ion）50巻、537頁（1990年）；ブッチャー、イー・シー
（Butcher,E.C.）、セル67巻、1033頁（1991年））。正
常な状態では、リンパ球は主に高内皮細静脈（high end
othelial venules）（HEV）と呼ばれる、専門化された
後毛細管の細静脈（specialized postcapillary venule
s）に結合する。器官に特異的な方法での末梢リンパ
節、粘膜のリンパ様器官、滑膜および皮膚へのリンパ球
の移動を仲介する、機能的に別個なリンパ球−HEV認識
システムが記載されている（ブッチャー、イー・シー
ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー
（Eur.J.Immunol.）10巻、210頁（1980年）；ヤルカネ
ン、エス（Jalkanen,S.）ら、サイエンス（Science）23
3巻、556頁（1986年）；ピッカー、エル・ジェイ（Pick
er,L.J.）ら、ネイチャー349巻、796頁（1991年））。
炎症では内皮細胞が活性化するとその接着分子の状況が
変化し、その活性化は影響される組織への白血球の流入
（leukocyte influx）の規模と型をほぼ決定する。この
ように、内皮細胞分子は局所免疫応答の特徴を制御する
のに重要な要素であり、明らかにリンパ球の往来および
白血球の血管外移動を調節する機構の詳しい理解は炎症
反応を臨床的に操るための新しい手段を提供することが
できる。

ヒトにおいて組織選択的リンパ球ホーミング（homin
g）を仲介する内皮細胞リガンドはほとんど知られてい
ないので、かかる分子を同定する必要がある。

本発明者らは1991年６月のヨーロピアン・フェデレー
ション・オブ・イムノロジカル・ソサイエティズ（Euro
pean Federation of Immunological Societies）のミー
ティングでの要約に、高内皮細静脈とのリンパ球結合に
関係する、以前に知られていない内皮細胞抗原の存在を
示すいくつかの予備の知見を紹介した（サルミ（Salm
i）ら、EFIS 第11回ミーティング・アブストラクツ
（EFIS 11th Meeting Abstracts）、21〜12頁;1991
年）。

発明の要約炎症を抑制することの重要性を認識し、組織選択性リ
ンパ球ホーミングを仲介する内皮細胞リガンドを理解す
ることの必要性を認識して、本発明者らはヒト滑膜管
（synovial vessel）により発現されるような分子を同
定しようと試みた。これらの研究により、ヒトにおける
リンパ球結合を仲介する新規な内皮細胞分子、VAP−１
を同定し、それに対するモノクローナル抗体を産生し
た。これらの抗体は、VAP−１レベルの量的および質的
な評価の分析において、およびその治療が必要な患者で
のVAP−１の作用と拮抗するように計画された臨床的な
治療において有用である。

さらに本発明は、VAP−１タンパク質に対する抗体、
とくにモノクローナル抗体、およびかかる抗体を含む組
成物に向けられる。モノクローナル抗体1B2は、この抗
体を産生するハイブリドーマ細胞系（DSM ACC2041）と
同様に本明細書の記載によってえることができる。

さらに本発明は、患者におけるVAP−１が仲介する内
皮細胞のリンパ球との結合によって仲介される医療状態
を診断する方法に向けられる。この方法は、かかる患者
から採取したVAP−１陽性細胞に結合する抗VAP−１抗体
を検出すること、およびかかる結合にもとづいて医療状
態を診断することからなり、かかる医療状態には炎症
（慢性または急性）、関節炎、リウマチ様関節炎、感染
症、皮膚疾患、炎症性腸疾患および自己免疫疾患が含ま
れる。

図面の簡単な説明 Fig.1。ヒト組織におけるVAP−１の分布。（Ａ）炎症
をおこしている（inflamed）滑膜では、mAb 1B2はHEV
様血管を強く染色する。（Ｂ）扁桃（tonsil）では、HE
VにおけるVAP−１の発現は、強いもの（矢じり）からき
わめて弱いもの（矢印）または陰性のものまで様々であ
る。（Ｃ）扁桃の免疫蛍光染色は、血管の内腔表面上の
VAP−１の顕著な発現（矢印）を示す。（Ｄ）虫垂で
は、わずかに弱く染まっているHEVが見えるだけである
（矢じり）。倍率:Aは100倍、Ｂは250倍、ＣおよびＤが
400倍である。

Fig.2。VAP−１は90kDのタンパク質である。レーン1:
免疫精製されたVAP−１の銀染色。レーン２および3:扁
桃の¹²⁵Iでラベルされた間質細胞はmAb 1B2で（レーン
２）またはコントロールのmAb 3G6で（レーン３）免疫
沈降した。180〜200kDの範囲のバンドは必ずしも存在す
るわけではない。分子量標準は左に示されている。白血
球を除去した（depleted）扁桃抽出物を、細胞溶解緩衝
液（150mM NaCl、10mM トリス塩基、0.15mM MgCl₂、
１％NP−40、1mM PMSFおよび１％アプロチニン）に４
℃にて一晩溶解させた。細胞溶解物を４℃にて10000gで
30分間遠心分離した。細胞溶解物をセファロース（Seph
arose）CL−4B（ファルマシア（Pharmacia）、スウェー
デン）カラムを通すことによって上清をあらかじめ浄化
した。つぎに正常なマウス血清を、関係のないIgG₁ mA
bを、および1B2 mAbを用いてえられた、３つのCNBr活
性化セファロース−4B（ファルマシア）カラム（5mg/m
l、5mlのカラム容積）にその上清を連続して適用した。
カラムを細胞溶解緩衝液で充分に洗浄した。そののち、
1B2カラムに結合した材料を500mMトリエタノールアミン
で溶出し、凍結乾燥し、SDS−PAGEで分離し（7.5％、還
元）、銀染色を用いて視覚化した。

Fig.3。VAP−１はHEVとのリンパ球結合に関係する。
扁桃、末梢リンパ節（PLN）、滑膜および虫垂のHEVとの
リンパ球の結合、および扁桃のHEVとの顆粒球の結合
を、インビトロの凍結切片分析を用いてmAb 1B2の存在
下および非存在下で評価した。３つの独立した実験の結
果を標準誤差とともにコントロールの結合の百分率とし
て示す（100％＝3G6処理切片上の結合細胞の数）。

Fig.4。単離したVAP−１はリンパ球結合をサポートす
る。免疫精製されたVAP−１およびコントロールのタン
パク質（1E12;リンパ球結合をサポートする関連のない
内皮細胞分子、およびBSA）をガラス上に吸収させ、リ
ンパ球結合を調べた。（Ａ）２つの独立した実験の結果
をコントロールの結合から百分率で示す（100％＝mAb
3G6処理後の、プレート結合VAP−１または1E12に結合し
た細胞の数）。（BSAに結合している）非特異的なバッ
クグラウンドをすべての分析結果から引算する。（Ｂ）
mAb 3G6の存在下でVAP−１で被覆されたウェルとのリ
ンパ球結合。（Ｃ）mAb 1B2の存在下でVAP−１で被覆
されたウェルとのリンパ球結合。VAP−１および1E12をF
ig.2に示すように扁桃抽出物からアフィニティー精製し
た。精製されたVAP−１、1E12および熱不活性化したBSA
を、0.01％β−オクチルグルコピラノシドを界面活性剤
（detergent）として用いた20mM トリス塩酸、pH7.4、
150mM NaCl、2mM MgCl₂、2mM CaCl₂中に希釈した。
タンパク質をガラスウェル（ラブ−テック（Lab−tek）
チャンバースライド、ヌンク（Nunc））上に16時間＋４
℃で吸収した。1mg/ml BSAを含有するPBS中で30分間室
温でブロックしたのち、1B2または3G6上清をウェルに添
加し、30分間室温でインキュベーションを続けた。一
方、新たに単離された末梢血単球を組織培養ボトルにお
いて10％FCSおよび10mM ヘペスを含有するRPMI 1640
中で１時間37℃でインキュベートしてプラスチック接着
単球を除去した。100μｌのRPMI 1640中の非接着リン
パ球（1.8×10⁶細胞／ウェル）を各ウェルに適用した。
37℃での30分間のインキュベーションののち、非接着細
胞を軽くたたくことによってはずした。ウェルの上表部
（tops）を除去し、スライドをPBSのおだやかな流れに
よって洗浄し、１％グルタルアルデヒドを含有する冷PB
S中で固定した。そののち、ディフ−クイック染色（dif
f−Quick stains）を用いて細胞を染色した。結合した
細胞を、各ウェルにおける細胞の数を視覚的に評価して
点数をつけることによって定量化した（総面積50mm²/試
料）。

Fig.5。VAP−１は炎症をおこした消化管（gut）で正
の調節をうける。正常な消化管では、固有層（lamina p
ropria）におけるごくわずかのかすかに陽性の血管が観
察される（Ａ、この範囲では細静脈はVAP−１に対して
はほとんど陰性である）。炎症をおこした消化管（潰瘍
性大腸炎）では、多数のVAP−１陽性細静脈（矢印）
が、Ｂ）固有層でもＣ）組織化されたリンパ小胞でも見
られる。内因性パーオキシダーゼを含有する細胞（肥満
細胞）は非特異的な反応性を示す。ｅ、消化管の上皮細
胞;Ip、固有層。倍率250倍。

Fig.6。慢性皮膚疾患でのVAP−１誘導。同じ患者の正
常な範囲（Ａ）および乾癬の病変（Ｂ）からの皮膚生検
材料は炎症の部位の皮膚の血管（矢じり）でVAP−１の
誘導を示す。血管周囲の白血球浸潤物はVAP−１陽性細
静脈の周辺にみられうる。ｅ、表皮。倍率200倍。Ｃ）
正常なおよび疾患のある皮膚におけるVAP−１の発現
（＋〜＋＋＋＋で評価した）は同一患者からの対の生検
材料（関係のないものおよび関係するもの）について調
べた。丸かっこ内に各群に属する患者数を示す。

Fig.7。炎症で誘導されたVAP−１はリンパ球結合を仲
介する。凍結切片結合分析を行ない、前記分析では炎症
をおこした固有層の第VII因子陽性細静脈へのPBLの結合
を分析した。阻害分析は組織切片をmAb 1B2および3G6
でプレインキュベートすることによって行なった。結果
を標準誤差とともにコントロールの結合の百分率として
示す（すなわち、mAb 3G6の存在下でのPBLの結合を100
％の結合と定義する）。

発明の詳細な説明白血球表面の受容体と血管内皮細胞上のそれらのリガ
ンドとの相互作用は、炎症部位への白血球の血管外遊出
と同様、白血球の血液と種々のリンパ器官とのあいだの
往来を臨界的に制御する。我々はここに、モノクローナ
ル抗体1B2で定義される新規な90kDヒト内皮細胞接着分
子（VAP−１）について記載する。VAP−１は滑膜、末梢
リンパ節および扁桃の高内皮細静脈（HEV）上に優先的
に発現され、1B2は粘膜部位でのHEVとは対照的に、これ
らの組織のHEVへのリンパ球結合を著しく阻害する。さ
らに、リンパ球は1B2を阻害しうる方法でイムノアフィ
ニティーで単離されたVAP−１と結合する。発現パター
ン、分子量および機能的性質によってリンパ球に対する
新規な内皮リガンドとしてVAP−１が定義される。我々
はVAP−１はヒトにおけるリンパ球往来に直接関係する
新規な血管分子であると断定する。

抗体の産生 VAP−１タンパク質の初期の同定のために、滑膜管に
対するモノクローナル抗体を、ネズミなどの適当な動物
をヒト滑膜の間質要素で免疫することによって産生し
た。かかるヒト滑膜の間質要素は当該技術分野において
知られている方法を用いてえることができる。滑膜の間
質は滑膜組織からリンパ球を除去することによって単離
することができる。滑膜組織を細かく刻み、刻んだ組織
をステンレススチールのスクリーンによって押しつけ
た。間質要素はスクリーンの上表部から集めた。

好ましくは免疫原は、たとえば不完全フロイントアジ
ュバントなどのアジュバントと一緒に投与するが、いか
なる適当なアジュバントを用いてもよい。免疫原および
アジュバントは抗体合成を誘導するであろういかなる方
式またはプロトコルによっても注射しうる。たとえば、
免疫原（注射あたり約１μｇのVAP−１抗原を含有する
滑膜間質要素）を１週間おきに３回、特異性病原体（sp
ecific−pathogen）のないBalb/cマウスの足蹠に注射す
ることによって免疫応答を誘導するであろう。

膝窩リンパ節からのリンパ球を、細かく刻んだリンパ
節をステンレススチールのスクリーンにより押しつけ、
放出されたリンパ球をフローから集めることにより、前
述のように当該技術分野で知られている方法を用いるこ
とによって単離するが、ついで標準のプロトコルを用い
て非分泌のNS−１マウスメラノーマ細胞（ATCCより入手
可能、No.TIB 18）と融合する。ハイブリドーマは凍結
切片のイムノパーオキシダーゼ染色などのいかなる適当
な方法を用いてスクリーニングしてもよい。滑膜の血管
内皮と反応する抗体を産生する１つのハイブリドーマ
（1B2、サブクラスIgG₁）を、限界希釈で２回クローン
化し、さらなる分析のために選択した。mAb1B2によって
認識された抗原はVAP−１（血管接着タンパク質（Vascu
lar Adhesion Protein）−１として）と名づけた。

VAP−１結合タンパク質として本発明の診断方法に用
いられる抗体は、好ましくは単一特異性抗体、すなわち
VAP−１のみ、またはその抗原性断片に対して特異性を
有する抗体ある。単一特異性抗体はポリクローナルであ
ってもモノクローナルであってもよい。

ポリクローナル抗体は適当な動物にVAP−１の実質的
に純粋な調製物を注射し、適当な間隔で１回またはそれ
以上のブースター注射によって調製することができる。

しかしながら、本発明の診断方法においてはVAP−１
抗原に対して作成されたモノクローナル抗体（またはFa
b′、Ｆ（ab′）２もしくはFv断片などの生物学的に活
性なそれらの誘導体）を用いることが好ましい。モノク
ローナル抗体はいかなる適当なソースのものでもよく、
したがってたとえばネズミまたはヒトモノクローナル抗
体から選択することができる。

抗体は、その抗体または生物学的に活性なその誘導体
をコードするDNA配列を適当な細胞、たとえば微生物
の、植物の、動物のまたはヒトの細胞でクローン化し、
問題の抗体または生物学的に活性なその誘導体の産生を
導く状況下で細胞を培養し、培養物から抗体または生物
学的に活性なその誘導体を回収することによっても産生
することができる。

本発明の試薬に用いられる抗体は、方法の精度を向上
させるために好ましくは実質的に純粋な形であるべきで
ある。

VAP−１の特性単離されたVAP−１は還元条件下１で90kD、非還元条
件下では100kDの分子量を有する。

VAP−１抗原を単離するために、リンパ級を除去した
扁桃抽出物がVAP−１タンパク質の好ましいソースであ
る。これらの抽出物は細かく刻んだ組織をステンレスス
チールのスクリーンにより押しつけることによって扁桃
組織からリンパ球を除去することによって調製される。
間質要素はスクリーンの上表部から集められる。しかし
ながら、例示した手順が最終的な単離のためVAP−１の1
B2 mAbへのアフィニティーに依存するので、VAP−１を
発現するいかなる細胞の型でも以下の手順に用いること
ができる。

すべての工程は冷却温度（約４℃）で行なわれるべき
である。細胞は150mM NaCl、10mM トリス塩基、0.15m
M MgCl₂、１％NP40、1mM PMSFおよび１％アプロチニ
ンを含む緩衝液などのタンパク質分解を阻害するための
薬剤を含む緩衝液中でゆるやかに（たとえば４℃で１晩
かけて）溶解させる。ついでこのような抽出物は好まし
くは、たとえば、10000gで30分間、穏やかに遠心するこ
とにより細胞溶解デブリ（cell lysis debris）が取り
除かれる。つぎに上清はアフィニティー薬剤として、連
続して、（１）正常マウス血清、（２）非特異的IgG₁
mAb（1E12または市販されている非特異的IgG₁ mAbのい
ずれかなど）および（３）1B2 mAbを備える一連のアフ
ィニティーカラムに付される。1B2 mAbカラムに結合し
た材料は50mMトリエタノールアミンを用いて溶出され、
さらに凍結乾燥される。このアプローチを用いてVAP−
１は扁桃間質から単離される。当該技術分野において知
られている他の同等の方法を用いてもよい。

モノクローナル抗体1B2を用いて検出すると、細胞内
において、VAP−１は炎症をおこした滑膜のHEV様細静脈
に豊富に存在する。VAP−１は浸潤白血球やいずれの滑
膜間質の結合組織成分にも存在しない。末梢リンパ節お
よび扁桃においてはVAP−１はHEVの大部分に存在してい
るようである。VAP−１は内皮細胞の内腔側に多く局在
する。内皮細胞の細胞質中ならびに非内腔表面において
もVAP−１の顆粒染色が見られる。

とくに扁桃においては、異なるHEV間でVAP−１レベル
は大きく変動し、個々のHEV（典型的な丸みを帯びた形
態を伴う）で完全にVAP−１を欠くものはほとんどな
い。消化管の虫垂および固有層においてはかすかに染色
される細静脈さえもほとんど存在しないようであった。
上胚中心における樹状様細胞上ならびに動脈、静脈およ
び腸壁の平滑筋細胞上に、VAP−１の微弱な発現が見出
される。

対照的に、VAP−１はより大きい血管の内腔表面には
実際上存在しない。組織切片中の白血球に加えて、以下
の細胞はVAP−１を発現していないようである：末梢血
リンパ球、単球、NK細胞、顆粒球および単離された扁桃
白血球、Ｔ−リンパ芽球様細胞系CCRF−CEM（CCL119、A
TCC）;B−リンパ芽球様細胞系KCAおよびIBW−４（スタ
ンフォード大学、イー・エングレマン（E.Engleman）か
らもとは入手した、EBVで形質転換されたＢ細胞系）、
単球性細胞系U937（CRL1593、ATCC）；ならびに白血病
細胞系KG−１（CCL246、ATCC）;KG−1a（CCL246.1、ATC
C）およびK562（CCL243、ATCC）；内皮細胞系EaHy−926
（カルシノーマと内皮細胞との間のハイブリドーマ細胞
系、エジェル（Edgell）ら、プロシーディングズ・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・
エス・エー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）80巻:3724頁（1
983年）；ならびに平滑筋細胞、線維芽細胞および角化
細胞の初代培養、および上皮様HeLa細胞系（CCL2、ATC
C）。ジャフェ（Jaffe）（ジャーナル・オブ・クリニカ
ル・インベスティゲーション（J.Clin.Invest.）52巻、
2745頁（1973年））の方法によって単離されたヒト臍静
脈内皮細胞（HUVEC）は基礎的にもIL−１（20、100U/m
l）、TNF（200U/ml）またはLPS（0.1、1.0μg/ml）を用
いる４時間または20時間処理後でもVAP−１を発現しな
かった。

VAP−１と、白血球結合を仲介する既知の内皮細胞分
子とを比較することにより、数値の相違が明らかになっ
ている。細胞間接着分子−１および−２（ICAM−１およ
びICAM−２）、血管細胞接着分子−１（VCAM−１）、Ｅ
−セレクチン（ELAM−１）およびＰ−セレクチン（CD6
2、PADGEM、GMP140）は、基礎的にもまたは炎症性メデ
ィエータによって誘導したあとでもすべてHUVEC上で発
現する（スプリンガー、ティー・エー、ネイチャー346
巻、425頁（1990年）；ストールマン、エル・エム、セ
ル56巻、907頁（1989年）；オズボーン、エル、セル62
巻、３頁（1990年）ポバーおよびコトラン、トランスプ
ランテーション50巻、537頁（1990年）；ブッチャー、
イー・シー、セル67巻、1033頁（1991年）；デ・フォー
ゲロールス、エー・アール（de Fougerolles,A.R.）
ら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシ
ン（J.Exp.Med.）、174巻、253頁（1991年）；オズボー
ン、エルら、セル59巻、1203頁（1989年）；ベビラク
ア、エム、ピー（Bevilacqua,M.P.）ら、プロシーディ
ングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス84巻、9238頁（1987年）；マックエバー、アール・
ピー（McEver,R.P.）ら、ジャーナル・オブ・クリニカ
ル・インベスティゲーション（J.Clin.Invet.）84巻、9
2頁（1989年）；ハットリ、アール（Hattori,R.）ら、
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスリー（J.Bi
ol.Chem.）264巻、7768頁（1989年）；ウェリコム、エ
ス・エム（Wellicome,S.M.）ら、ジャーナル・オブ・イ
ムノロジー（J.Immunol.）144巻、2558頁（1990年）；
ポバー、ジェイ・エス（Pober,J.S.）ら、ジャーナル・
オブ・イムノロジー137巻、1893頁（1986年）；ダステ
ィン、エム・エル（Dustin,M.L.）ら、ジャーナル・オ
ブ・イムノロジー137巻、245頁（1986年））。対照的に
VAP−１はHUVECの表面上または細胞質中に、内在的に発
現しておらずまたIL−１、TNFaまたはLPS処理により誘
導されることもない。これらの分子の組織分布は明瞭に
異なり、さらに扁桃の平行切片（parallel sections）
について分析したばあいも分布は異なる（データは示さ
ない）。ICAMはほとんどの大血管および小血管ならびに
ある白血球の内腔表面を染色する（デ・フォーゲロール
ス、エー・アールら、ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンタル・メディシン、174巻、253頁（1991年）；ダステ
ィン、エム・エルら、ジャーナル・オブ・イムノロジー
137巻、245頁（1986年））。他方、VCAM−１およびELAM
−１は炎症をおこした組織内のいくらかの細静脈を染色
するのみである（ライス、ジー・イー（Rice,G.E.）
ら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシ
ン171巻、1369頁（1990年）；ライス、ジー・イーら、
アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー（Am.J.Pat
hol.）138巻、385頁（1991年）；コトラン、アール・エ
ス（Cotram,R.S.）ら、ジャーナル・オブ・エクスペリ
メンタル・メディシン164巻、661頁（1986年））。これ
らとは異なり、VAP−１は大半のHEVの非粘膜部位で強く
発現しており、すべての調べられた白血球および細胞系
には存在しない。既知の接着分子の分子量もまた、ICAM
−１を例外としてVAP−１のものと明瞭に異なる（ICAM
−２は60kD、VCAM−１は110kD、Ｅ−セレクチンは115kD
ならびにＰ−セレクチンは140kDの分子である、ストー
ルマン、エル・エム、セル56巻:907頁（1989年）；オズ
ボーン、エル、セル62巻:3頁（1990年）；ならびにデ・
フォーゲロールス、エー・アールら、ジャーナル・オブ
・エクスペリメンタル・メディシン174巻、253頁（1991
年））。さらに、VAP−１は主としてリンパ球結合に関
係し、一方ICAM、Ｅ−およびＰ−セレクチンは多形核白
血球の接着をも効率よく仲介する（スプリンガー、ティ
ー・エー、ネイチャー346巻、425頁（1990年）；ストー
ルマン、エル・エム、セル56巻、907頁（1989年）；オ
ズボーン、エル、セル62巻、３頁（1990年）；ポバーお
よびコトラン、トランスプランテーション50巻、537頁
（1990年）；ブッチャー、イー・シー、セル67巻、1033
頁（1991年））。

ヒトにおいてリンパ球結合に関係しかつHUVEC上で発
現されない、これまでに記載された唯一の内皮接着分子
は、MECA−79として定義された抗原である（バーグ、イ
ー・エル（Berg,E.L.）ら、ジャーナル・オブ・セル・
バイオロジー（J.Cell Biol.）114巻、343頁（1991
年））。しかしながらそれは、末梢リンパ節の組織特異
的なアドレッシン（addressin）である。さらにVAP−１
は、すべてのMECA−79陽性細静脈で共発現（co−expres
s）されておらず、またmAb 1B2は精製されたMECA−79
抗原を認識しない。

したがって、VAP−１の発現パターン、機能および分
子量から、VAP−１がこれまでに定義されたリンパ球結
合に関係する内皮性分子のいずれとも同一ではないこと
ならびにインビボでのVAP−１発現のレベルが炎症の程
度に相関することが示される。これらの結果は、VAP−
１がヒトにおける生理的なリンパ球の再循環を理解する
上で意味があり、また組織選択的なリンパ球のホーミン
グの分子機構を詳細に分析するためにとりわけ価値があ
る。

VAP−１およびVAP−１結合合成物の用途本発明は、人体または動物体からとった試料中のVAP
−１タンパク質およびVAP−１陽性細胞を検出するため
の診断用試薬に関する。このような試薬は、VAP−１タ
ンパク質と反応する抗体または該抗体のVAP−１と反応
する断片であってよく、ラベルされたもの、所望により
単離されたVAP−１または表面上にVAP−１を発現する細
胞との抗体の結合を検出することを可能とする物体を用
いてラベルされたものであってよい。このような診断用
組成物はキットに備えられていてもよく、このようなキ
ットは独立した容器に、（ａ）VAP−１と反応する抗体、または該抗体の生物学
的に活性な誘導体、好ましくはVAP−１抗原との抗体の
結合を検出することを可能とする物質を用いてラベルさ
れたもの：および（ｂ）分析結果を評価するための標準を提供するため
の、精製されたVAP−１タンパク質を備えていてもよい。

別の局面において、本発明はインビボで、人体内また
は動物体内において炎症を低減させるかまたは処置する
方法であって、このような処置を必要とするヒトまたは
動物の患者に対して効果を生じうるレベルのVAP−１結
合合成物（VAP−１と反応する抗体、またはこのような
抗体の生物学的に活性な誘導体、もしくはVAP−１の可
溶性リガンドなど）を投与することによる処置方法に適
用してもよい。

「処置」または「処置する」の語は、VAP−１の接着
が生じることによって仲介される障害の予防、回復、防
止または治療を含みうる目的のため被験者にVAP−１結
合合成物を投与することを含むことを意図する。本発明
の診断方法の主体である特定のVAP−１結合分子は、精
製された天然のおよび組換えVAP−１結合タンパク質
（抗体または他の分子など）である。

患者に投与するばあい、本発明の試薬は腸管外、鼻、
腸または直腸への投与に好適となるよういかなる方法で
製剤化されてもよい。したがって、試薬はたとえば注射
可能な剤形、エアゾル剤形、懸濁剤、溶液、浣腸剤など
の形態であってよい。試薬は通例の医薬のプラクティス
にしたがって、たとえば等張の生理食塩水などの医薬的
に許容しうる賦形剤またはビヒクルとともに製剤化され
うる。試薬の投与量レベルは、患者におけるVAP−１の
接着の発生をブロックすることにより抗炎症効果を提供
するに充分な量であろう。

本発明の試薬は、VAP−１の接着によって仲介される
増大した炎症反応に関係するいかなる状態をも診断また
は処置するために好適である。したがって、試薬は関節
炎、局所感染症、皮膚硬化症、炎症性腸疾患、自己免疫
疾患などのような状態を診断するのに有用である。

１の実施態様において、炎症の第２次傷害性の炎症作
用に対する治療上の利益を提供するために効果を生ずる
レベルのVAP−１結合合成物が投与される。VAP−１結合
合成物の「効果を生ずるレベル」とはVAP−１が仲介し
て発生する毒性作用が最小で改善されるレベルを意味す
る。「過度の」宿主でのVAP−１が仲介する発生とは被
験者の健康な医療状態の標準を超える、被験者における
VAP−１が仲介する接着の発生のレベルを意味する。
「第２次」組織損傷または毒性作用とは、体内のどこか
他の場所の「第１次」刺激の結果を含めてVAP−１が仲
介する接着の過度の発生があるために、その他の健康な
組織、器官およびその中の細胞に惹起こされる組織損傷
または毒性作用を意味する。

たとえばVAP−１抗体などのVAP−１結合合成物の患者
への注入の結果、滑膜HEV、末梢リンパ節HEVおよび扁桃
HEVなどのその表面上にVAP−１を発現する患者の細胞に
かかる抗体が結合し、VAP−１結合によってこれらの細
胞が他の細胞に付着することが妨げられ、かくしてかか
る組織および細胞にリンパ球が接着することが妨げられ
るかまたは阻害され、よって接着をうけた組織または細
胞への望ましくないリンパ球の往来または流入が妨げら
れ、したがってVAP−１が司る白血球の往来および白血
球の遊出から起こる望ましくない炎症反応が妨げられ
る。

したがって、医薬組成物は患者におけるVAP−１の生
物学的ターゲットへのかかる患者に生来あるVAP−１結
合およびとくに内皮細胞との結合に（完全にまたは部分
的に）拮抗するのに充分な量でVAP−１結合合成物を含
有する組成物により提供される。

VAP−１結合合成物は、かかるVAP−結合合成物の所望
の作用部位へのターゲッティングを提供する他の薬剤の
断片に、化学的にまたは遺伝子工学によって接合されて
もよい。代わりになるべきものとして、かかるVAP−１
結合合成物に付加的な特性、とくにVAP−１接着が仲介
する毒性作用の軽減を促進する合成物の能力を増強する
特性を増強または提供するために、VAP−１結合合成物
に、化学的にまたは遺伝子工学によって他の合成物が接
合されてもよい。

VAP−１結合合成物の投与量および投与方式は、関節
炎および組織傷害などの炎症に関連した障害を処置する
臨床分野における当業者によって容易に決定されうる。
一般的にVAP−１結合合成物による処置の投与量は以下
の点を考慮することに依存して変動するであろう：用い
られるVAP−１結合合成物の型；年齢；健康状態；処置
をうけている医療状態；あれば、同時に行なわれる処置
の種類、処置の頻度および所望の効果の本質；組織損傷
の度合い；性；症状のあった期間；ならびにあれば禁忌
および、個々の医師によって調整されるべき他の変動要
素（variables）。所望の結果をうるために１または複
数の適用で所望の投与量を投与することができる。抗VA
P−１抗体などのVAP−１結合合成物を含有する医薬組成
物は単位投与量の形で提供されてもよい。

VAP−１結合合成物を含有する医薬組成物は、投与の
ためのいかなる適切な薬学的担体中でも投与することが
できる。ヒトおよび動物におけるVAP−１が仲介して発
生する状態の予防、緩和、防止または治療に効を奏する
いかなる剤形で投与されてもよい。限定の目的のため、
明細書およびクレーム全体にわたる、疾患の「処置の方
法」という表現や同様の表現はかかる疾患の防止のため
の方法を含むと解釈されることを意図している。

非経口投与のための本発明のVAP−１結合タンパク質
の調製物は滅菌した水性または非水性溶媒、懸濁液およ
び乳濁液を含む。非水性溶媒の例はプロピレングリコー
ル、ポリエチレングリコール、植物油、魚油、および注
射可能な有機エステル類である。水性担体には塩化ナト
リウム溶液、リンゲルデキストロース溶液、デキストロ
ース・プラス・塩化ナトリウム溶液、ラクトース、また
は固定油（fixed oils）を含有するリンゲル溶液を含
む、生理食塩水および緩衝性医療用非経口用のビヒクル
を含んだ、水、水−アルコール溶液、乳濁液または懸濁
液を含む。静脈内ビヒクルにはリンゲルデキストロース
などにもとづいたもののような、流体（fluid）および
栄養補液、電解質補液が含まれる。

また、VAP−１結合合成物はとくに第１次傷害が急性
よりも持続または遅延するばあい、ポンプによってまた
は、徐放性形態でも投与されてもよい。第１次傷害が急
性よりもしばしば持続または遅延するような例は、感染
または捻挫で組織または筋肉への損傷が第１次感染また
は損傷から数日後まであらわれない（または存続する）
ばあいである。VAP−１結合分子はまた、好適に挿入さ
れたカテーテルによって、または特定の器官にターゲッ
ティングするよう設計されたキメラ分子（または複合
体）の一部などのような分子を提供することによって特
定の器官に高濃度に送達されてもよい。

長期間にわたる反復注射が指示されるばあい、徐放性
形態での投与が患者にとってより好都合である。たとえ
ばVAP−１に関連した障害にもとづく遺伝的または慢性
的な炎症性疾患を処置するのに用いられるものであるば
あい、患者の快適さを最大限とするためにVAP−１結合
タンパク質を徐放性形態で投与することが望ましい。

VAP−１結合合成物は、VAP−１結合合成物の生物学的
活性が消化プロセスによって破壊されなければ、さらに
前記合成物が可能とする特質が小腸組織を経て吸収され
るものであれば、錠剤、カプセル、粉末パケット（powd
er packets）、または経口投与用の液体溶液などの投与
形態で用いることができる。

医薬組成物は本来知られている方法、たとえば通例の
混合、顆粒化、糖衣剤作製、溶解、凍結乾燥または同様
のプロセスによって製造される。該医薬組成物は、慢性
のものでも急性のものでも、VAP−１で誘導される生理
的損傷を制御する上で、それら自身においておよびそれ
ら自身の有用性が見出される。該医薬組成物はVAP−１
接着を認識するための生体自身の機構の作動を最大限の
可能性にまで抑える。

静脈注射の投与形態においては、本発明の組成物は充
分に迅速に作用が開始され、ありうる組織損傷の速やか
な処理（management）に有用である。

加えて、穏やかなまたは慢性のVAP−１が関連した障
害の処理においては低い能力のバージョンが有用であ
る。

加うるに、本発明の組成物はヒトのまたは動物の血流
または細胞外組織におけるVAP−１レベルの実験室での
分析のために不可欠な試薬を提供することもできる。

天然のまたは組換えのソースから、抽出、沈殿、クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、
電気泳動などの、かかるタンパク質を単離するのに当該
技術分野において従来から用いられる通例の条件および
技術にしたがって、天然の夾雑物を実質的に含まないVA
P−１結合タンパク質を単離および精製することができ
る。

以下の実施例は単に本発明を説明することを意図した
ものであり、いかようにもその範囲を限定するものでは
ない。

実施例参考例１ VAP−１の組織分布 VAP−１の組織分布はクリオスタット切片のイムノパ
ーオキシダーゼ染色によって調べた。前記切片は第一抗
体（1B2および3G6、ニワトリＴ細胞に対するコントロー
ルマウスIgG₁ mAb）とともに30分間インキュベートし
た。リン酸緩衝生理食塩水（PBS、8g NaCl、1.21g K₂
HPO₄および0.34g KH₂PO₄/リットル、pH7.2）における
２回の洗浄ののち、５％AB−血清を含有するPBS中のパ
ーキオキシダーゼ接合ヒツジ抗マウスIgG（ダコパット
（Dakopatt）、デンマーク）を30分加えた。ついで、0.
03％過酸化水素を含有するPBS中の３′３′−ジアミノ
ベンジジン塩酸塩を色素原として用いた。染色後、切片
をヘマトキシリンで後染色した。免疫蛍光染色のため
に、３μｍのクリオスタット切片を第一抗体でおおい、
FITC接合ヒツジ抗マウシIgG（シグマ、セントルイス）
を第二段階の試薬として用いた。

免疫組織染色によってモノクローナル抗体1B2が炎症
をおこした滑膜におけるHEV様細静脈を強く染色したこ
とが示された（Fig.1A）。湿潤白血球にも滑膜の間質の
いかなる結合組織成分にも染色はみられなかった。mAb
1B2によって認識される抗原はVAP−１（血管接着タン
パク−１として）と名づけられた。末梢リンパ節および
扁桃において、mAb 1B2はHEVの大部分と反応した（Fi
g.1B）。VAP−１は内皮細胞の内腔側で強く発現された
（Fig.1C）。顆粒染色は内皮細胞の細胞質においてみら
れ、また非内腔表面はmAb 1B2陽性であった。とくに扁
桃において、異なるHEV間で染色強度は顕著に変化し、
典型的な丸みを帯びた形態の個々のHEVはほとんど1B2陰
性ではなかった（Fig.1D）。消化管の虫垂においておよ
び固有層において、わずかに弱く染まっている細静脈の
みが検出できた。VAP−１の弱い発現はまた上胚中枢に
おける樹状様細胞においてならびに動脈、静脈および腸
壁の平滑筋細胞においてみられた。対照的に、VAP−１
はより大きな血管の内腔表面には実際に存在しなかっ
た。組織切片における白血球のように、末梢血リンパ
球、単球、NK細胞、顆粒球および単離された扁桃白血球
はFACS分析においてすべて完全に1B2陰性であった。Ｔ
−リンパ芽球様細胞系（CCRF−CEM）、Ｂ−リンパ芽球
様細胞系（KCA、IBW−４）、単球細胞系（U937）および
白血球細胞系（KG−１、KG−1a、K562）はすべてVAP−
１を欠いていた。さらに、VAP−１は基本的にはヒト臍
静脈内皮細胞（HUVEC）には存在せず；さらにIL−１（2
0、100U/ml）、TNF−μ（200U/ml）またはLPS（0.1、1.
0μg/ml）を用いた４時間または20時間の処理によって
もVAP−１の合成を誘導できなかった。内皮細胞系（EaH
y−926）もまた1B2陰性であった。平滑筋細胞、線維芽
細胞および角化細胞の初代培養ならびに上皮様（HeLa）
細胞系はVAP−１を発現しなかった。

参考例２ VAP−１の細胞内の局在性参考例１に記載された組織局在性実験に加えて、VAP
−１の細胞内の局在性をさらに扁桃から切断された厚い
切片（15μｍ）を共焦点顕微鏡（confocal microscop
y）によって調べた。切片をmAb 1B2または3G6とともに
15分間インキュベートし、PBSで２回洗浄し、FITC接合
ヒツジ抗マウスIgでさらに15分間おおった。そののち、
共焦点顕微鏡による分析の前に試料を10％PBSおよび抗
退色剤（anti−fadeing agent）としてフェニレンジア
ミンを含有するグリセロール中にマウントした。顕微鏡
検査によって細胞質内の独立性の顆粒におけると同様に
HEVの内腔表面上にVAP−１が存在することは容易に理解
できた。これらの顆粒の同一性は現在は不明であるが、
mAb 1B2および第VIII因子に対する抗体を用いる２色免
疫蛍光染色において、顆粒は共に局在（co−localize）
しなかった。したがって、VAP−１陽性顆粒は内皮細胞
接着分子、Ｐ−セレクチンが存在することが知られてい
る、内皮細胞のワィベル−パラド体（Weibel−Palade b
odies）ではなかった。

参考例３ VAP−１の分子量の決定リンパ球を除去した扁桃抽出物を細胞溶解緩衝液（15
0mM NaCl、10mM トリス塩基、0.15mM MgCl₂、１％
NP4O、1mM PMSFおよび１％アプロチニン）中で一晩４
℃で溶解した。溶解物を10000gで30分間４℃で遠心分離
した。溶解物をセファロース CL−4B（ファルマシア、
スウェーデン）カラムに通過させることによって上清を
事前に浄化した。ついで正常マウス血清、関連がないIg
G₁ mAbおよび1B2 mAb（5mg/ml、5mlカラム容積）を用
いてえられた３つのCnBrで活性化されたセファロース−
4B（ファルマシア）カラムに連続して付した。カラムを
前記細胞溶解緩衝液を用いて充分に洗浄した。そのの
ち、1B2カラムに結合した材料を50mMトリエタノールア
ミンで溶出し、凍結乾燥し、SDS−PAGE（7.5％、還元）
において分離し銀染色を用いて視覚化した。

ヨウ素ラベリングのためにリンパ球を除去した扁桃抽
出物を100U/ml コラゲナーゼ（ヒストリチクス菌（Clo
stridium histolyticum）由来のII型、シグマ）、10％
胎児ウシ血清（FCS）、抗生物質、および10mM ヘペス
を含有するRPMI 1640中で１時間37℃で穏やかに撹拌し
ながら消化した。コラゲナーゼ消化ののち、細胞をHBSS
中で洗浄し、ラクトペルオキシダーゼ法をもちいて¹²⁵I
で表面をラベルした。ヨウ素化された細胞を前記細胞溶
解緩衝液で溶解し、溶解物を10000gで15分間遠心分離に
より浄化した。溶解物を正常マウス血清とカップルした
CnBrで活性化されたセファロースをもちいて16時間４℃
で事前に浄化した。免疫沈殿をmAb 1B2または3G6と接
合したCnBrで活性化されたセファロース4Bビーズを用い
て行った。試料を還元（２−メルカプトエタノール）条
件下で7.5％SDS−PAGEを用いて分析した。

VAP−１の分子量を決定するために、扁桃の間質から
のアフィニティーで単離された分子をSDS−PAGEに供し
た。ゲルの銀染色によって還元条件下で見かけの分子量
が90kDの主要バンドが示された（Fig.2）。VAP−１は非
還元条件下ではわずかにゆっくりと移動した（Mr100k
D）。扁桃のヨウ素化された間質細胞からの免疫沈殿の
分析によって90kDの分子（およびわずかにより小さい分
解産物）とのmAb 1B2の反応性を確認した（Fig.2）。
また、180〜200kDのバンドは目視できることもあった。

参考例４扁桃、末梢リンパ節（PLN）、滑膜、および虫垂HEVとの
リンパ球の結合ならびに扁桃HEVとの顆粒球の結合この技術の詳細はすでに記載されている（ヤルカネン
およびブッチャー、ブラッド（Blood）66巻、577頁（19
85年））。簡潔には、ヒト扁桃、滑膜、虫垂および末梢
リンパ節からの新たに切断され凍結された切片を1B2ま
たは3G6の上清とともに30分間７℃で穏やかに回転させ
ながらインキュベートした。ついで５％FCSおよび10mM
ヘペスを含有するHBSS中のフィコールで単離されたリ
ンパ球（３×10⁶/切片）を添加し、インキュベーション
を30分間継続した。インキュベーションののち、非接着
細胞を穏やかに傾けて除き（tipped off）、接着細胞を
１％ゲルタルアルデヒドを含有する冷PBS中で一晩固定
した。１試料当たり１組織当たり４〜６切片上において
HEVに結合した細胞をシングルブラインドで計測した
（最小100HEV）。顆粒球結合を調べるばあいは、顆粒球
（ヒストパク（Histopaque）1119、シグマを用いて単離
された）を、切片に適用する直前まで、Ca²⁺およびMg²⁺
を含まないHBSSに保持したこと以外は同様に分析を行っ
た。

インビボの内皮細胞上におけるVAP−１の組織分布に
よって、VAP−１が白血球のための特異的な認識要素と
して機能しうるであろうことが示唆された。したがっ
て、HEV結合におけるVAP−１の機能的役割を、修飾した
スタンパー−ウッドラフ・イン・ビトロ・アッセイ（St
amper−Woodruff in vitro assay）（ヤルカネンおよび
ブッチャー、ブラッド66巻、577頁（1985年））を用い
て検討した。mAb 1B2との凍結された切片の前処理はHE
Vとのリンパ球結合を阻害した（Fig.3）。阻害効果は扁
桃および末梢リンパ節において最も示されたが、滑膜HE
Vとの結合もまた著しく減少した。虫垂HEVとのリンパ球
結合および扁桃HEVとの顆粒球結合はほとんど影響を受
けなかった（Feg.3）。これらの知見からVAP−１は末梢
リンパ節、扁桃および滑膜HEVのリンパ球認識を仲介す
る内皮細胞要素を、仲介するか前記要素と親密に結びつ
くかであることが示される。リンパ球−内皮細胞相互作
用におけるVAP−１のかかわりあいを直接的に評価する
ために、アフィニティーで単離されたVAP−１とのリン
パ球の結合を分析した（Fig.4）。リンパ球はプレート
結合VAP−１に効果的に接着した。VAP−１とのリンパ球
結合は特異的にmAb 1B2で阻害されたが、コントロール
のmAb 3G6では阻害されなかった。mAb 1B2は別の関連
のない内皮細胞分子とのリンパ球結合を妨害しなかった
（Fig.4）。

組織分布およびHEV結合の結果はVAP−１は主に末梢リ
ンパ節、扁桃および滑膜とのリンパ球の往来に関係する
ことが示唆される。興味深いことに、扁桃におけるVAP
−１発現の欠如したものは、1B2陽性のものとは形態的
には区別できない、後毛細血管細静脈のマイナーサブセ
ットと定義される。扁桃は胃腸管と親密に結びつけられ
ているので、それらは粘膜（VAP−１陰性）型および末
梢リンパ節（VAP−１陽性）型の両方のHEV特異性を含み
うる。VAP−１発現における表現型の違いが各々の個々
のHEVのリンパ球結合能とどのように相互に関係するか
依然決定すべきである。粘膜のリンパ系器官におけるVA
P−１の欠乏はこの内皮抗原が異なったリンパ球認識シ
ステムにおいて相違して調節されるかもしれないことを
暗示する。さらに、炎症の程度はインビボのVAP−１発
現のレベルと相互に関係する。

参考例５ VAP−１との細胞の結合についての1B2の効果のための分
析 VAP−１および1E12を参考例２に記載されたように扁
桃抽出物からアフィニティー精製した。精製されたVAP
−１、1E12および熱不活性化されたBSAを、0.01％β−
オクチルグルコピラノシドを界面活性剤として用いた20
mM トリス塩酸、pH7.4、150mM NaCl、2mM MgCl₂、2m
M CaCl₂中に希釈した。タンパク質をガラスウェル（ラ
ブ−テックチャンバースライド、ヌンク）上に16時間＋
４℃で吸収した。1mg/ml BSAを含有するPBS中で30分間
室温でブロックしたのち、1B2または3G6上清をウェルに
添加し、30分間室温でインキュベーションを続けた。一
方、新たに単離された末梢血単球を組織培養ボトルにお
いて10％FCSおよび10mM ヘペスを含有するRPMI 1640
中で１時間37℃でインキュベートしてプラスチック接着
単球を除去した。100μＬのRPMI 1640中の非接着リン
パ球（1.8×10⁶細胞／ウェル）を各ウェルに適用した。
37℃での30分間のインキュベーションののち、非接着細
胞を軽くたたくことによってはずした。ウェルの上表部
を除去し、スライドをPBSのゆるやかな流れによって洗
浄し、１％グルタルアルデヒドを含有する冷PBS中で固
定した。そののち、ディフ−クイック染色を用いて細胞
を染色した。結合した細胞を各ウェルにおける細胞の数
を視覚的に評価して分類することによって定量化した
（総面積50mm²/試料）。

参考例６ VAP−１の部分アミノ酸配列 90kDのVAP−１抗原の部分アミノ酸配列を決定した。
部分アミノ酸配列はTEDGDMXLVNGASANEGXVE［配列番号:
1］である20アミノ酸長である。タンパク質およびDNA配
列のデータベースのサーチではこの配列がいかなる他の
既知の配列であることも明らかにしなかった。

実施例１炎症反応を示す臨床試料におけるVAP−１の測定正常の扁桃、末梢リンパ節、消化管、および心臓試料
を外科手術から新たにえ、器官提供者から腎臓試料をえ
た。他の組織は剖検試料に由来した。これらすべての標
本は組織病理学的に非炎症性であると決定された。炎症
性標本は慢性皮膚疾患（乾癬、アトピー性湿疹、偏平紅
色苔癬）にかかっている患者の皮膚のパンチ生検材料か
らえた。また、同一の患者の肉眼的に関係のない範囲か
らコントロールの生検材料をえた。炎症をおこした消化
管標本は治療目的で手術を行った炎症性腸疾患（クロー
ン病（Crohn′s disease）、潰瘍性大腸炎）にかかった
患者由来であった。滑膜標本は滑膜切除物由来であっ
た。

試料は参考例１に記載されたようにイムノパーオキシ
ダーゼを用いて染色した。簡潔には、アセトンで固定し
た凍結切片を順次第一抗体（培養上清または50μg/ml
精製免疫グロブリン）とおよび適したパーオキシダーゼ
接合第二段階試薬とインキュベートし、呈色反応はH₂O₂
および基質としてジアミノベンジジンを用いて行なっ
た。腸および皮膚試料（正常および炎症性）におけるVA
P−１発現を診断の知識なしにコードされた試料から２
つの独立した読取装置によって分析した。

参考例１に述べたように、VAP−１は正常の炎症をお
こしていない消化管のいくつかの細静脈において低いレ
ベルでのみ発現される（Fig.5A）。対照的に、炎症性腸
疾患の患者からの消化管標本は著しく増加したVAP−１
の発現を示した（Fig.5Bおよび5Cならびに表１）。VAP
−１は固有層の平滑な壁で囲まれた細静脈（flat−wall
ed venules of the lamina propria）においておよび組
織化されたリンパ小節（パイエル板）におけるHEV様細
静脈においての両方で誘導された。皮膚においても、慢
性炎症はVAP−１の増加した合成に伴って起こった（Fi
g.6AおよびＢ）。結果における個人間の変動のいかなる
効果をも排除するために、皮膚疾患領域からの１試料お
よび同一患者の関係のない皮膚範囲からのコントロール
試料を同時にバイオプシーし染色した。これらの標本に
おいても、上方真皮におけるVAP−１陽性細静脈の数は
コントロール範囲からの試料におけるよりは炎症性試料
においてより高かった。さらに、目だった脈管周囲のリ
ンパ球湿潤物はつねにVAP−１陽性血管と結びついてい
た。

腸標本はクローン病、潰瘍性大腸炎および腫瘍につい
て手術した患者由来であった（腫瘍試料の関係のない範
囲は「正常」試料を示す）。材料および方法に記載され
たように各試料におけるVAP−１陽性細静脈の数は−か
ら＋＋＋＋で評価した。

参考例７ VAP−１は炎症をおこした粘膜との結合を仲介するインビトロの凍結切片分析は参考例３に記載されたよ
うに行なった。モノクローナル抗体1B2は豊富にVAP−１
を発現した２つの消化管試料においておおよそ60％まで
固有層の小さい血管とのリンパ球結合を阻害した（Fig.
7）。

本発明はその特定の実施態様に関連して記載されてい
るが、さらなる修飾が可能であり、一般に本発明の原理
にしたがい、本発明が関係する技術分野における既知ま
たは通例の実施において含まれるような、および先に述
べた本質的な特徴に適用されうるような、および添付し
た請求の範囲にしたがうような本明細書開示からのこの
ような離脱を含む、本発明のいかなる変異、用途、また
は適用を本願がカバーすることが意図されることが理解
されるであろう。

配列表（１）一般情報：（ｉ）出願人：（Ａ）：氏名：ヤルカネン、シルパ（Ｂ）：通り：ラウボランチエ（Ｃ）：市：ピースパンリスチ（Ｅ）：国：フィンランド共和国（Ｆ）：郵便番号（ZIP）：エスエフ−20760 （ｉ）出願人：（Ａ）：氏名：サルミ、マルコ（Ｂ）：通り：ベヘ−ヘメーンカツ 12ア− （Ｃ）：市：ツルク（Ｅ）：国：フィンランド共和国（Ｆ）：郵便番号（ZIP）：エスエフ−20500 （ii）発明の名称：ヒトにおけるリンパ球結合を仲介
する新規な内皮細胞分子（iii）配列の数:1 （iv）連絡先住所：（Ａ）：受信人：オリオンコーポレーション、オリ
オン−ファルモスファーマシューティカルズ、特許部（Ｂ）：通り：オリオンニンチエ１（Ｃ）：市：エスポー（Ｅ）：国：フィンランド共和国（Ｆ）:ZIP:エスエフ−02200 （ｖ）コンピュータリーダブルフォーム：（Ａ）メディアタイプ：フロッピーディスク（Ｂ）コンピュータ:IBM PC コンパチブル（Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア:ASC II−フォーマット（vi）先行出願データ：（Ａ）出願番号:US895354 （Ｂ）出願日:1992年６月６日（２）配列番号:1に対する情報：（ｉ）配列の性質：（Ａ）長さ:20アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：両形態（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号:1:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｒ 1:91 // Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 ＣＣ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｕｐｐｌ．Ｖｏｌ．０，Ｎｏ．16Ｆ（1992），ｐ．107 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/78 G01N 33/53 - 33/577 A61K 39/395 C07K 16/18 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】リンパ球を除去した滑膜から得ることがで
き、受託番号がDSM ACC2041であるハイブリドーマ細胞
系によって産生されるモノクローナル抗体により検出さ
れることができ、かつ還元条件下でのSDS−PAGEにより9
0kDaの分子量を有するものとして特徴づけられるヒト内
皮血管接着タンパク質−１（VAP−１）に対する抗体ま
たはそのVAP−１結合断片からなる細胞を含まない組成
物であって、炎症（慢性または急性）、関節炎、リウマ
チ様関節炎、乾癬、アトピー性湿疹、偏平紅色苔癬、炎
症性腸疾患および自己免疫疾患からなる群から選択され
る疾患における炎症の程度を診断するための組成物。
【請求項２】（１）VAP−１陽性細胞であろうと思われ
る患者由来の細胞をインビトロにおいて抗VAP−１抗体
またはそのVAP−１結合断片にさらすこと、および（２）該VAP−１陽性細胞との抗VAP−１抗体またはその
VAP−１結合断片の結合を検出すること、を特徴とするVAP−１発現量の測定方法であって、該VAP−１が、リンパ球を除去した滑膜から得ることが
でき、受託番号がDSM ACC2041であるハイブリドーマ細
胞系によって産生されるモノクローナル抗体により検出
されることができ、かつ還元条件下でのSDS−PAGEによ
り90kDaの分子量を有するものとして特徴づけられる、
ヒト内皮血管接着タンパク質−１である該方法。
【請求項３】該抗VAP−１抗体がポリクローナル抗体で
ある請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項４】該抗VAP−１抗体がモノクローナル抗体で
ある請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項５】該モノクローナル抗体が受託番号がDSM A
CC2041であるハイブリドーマ細胞系により産生されるモ
ノクローナル抗体である請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項６】前記細胞が炎症（慢性または急性）、関節
炎、リウマチ様関節炎、乾癬、アトピー性疾患、偏平紅
色苔癬、炎症性腸疾患および自己免疫疾患からなる群か
ら選択される疾患の患者由来の細胞である請求の範囲第
２項記載の方法。