SU1779263A3 - Способ получения внеклеточной перекисной дисмутазы человека 2 - Google Patents

Description

Изобретение относится к способам получения перекисной дисмутазы и ее использованию для терапевтического лечения.

Некоторые соединения имеют тенденцию к самоокислению. Все процессы самоокисления приводят к образованию токсичных промежуточных соединений восстановления кислорода. Самоокисление адреналина, пирогаллола и других соединений приводит к образованию перекисного радикала. Небольшая часть восстановления кислорода в митохондриях приводит к образованию перекиси, а в дальнейшем-перекиси водорода. Микросомная цитохромная Р450 - система также высвобождает высший окисел.

Перекись водорода образуется всегда, когда образуется высший окисел в результате реакции дисмутации. Большинство оксидаз в организме непосредственно восстанавливает кислород в перекись водорода.

Ионизирующее излучение расщепляет воду с образованием атомов водорода и гидроксильных радикалов. Образующиеся та ким образом .гидроксильные радикалы характерны для большей части биологических опасностей, к которым приводит ионизирующее излучение.

В системе оксидазы ксантина, например. образуется не только высший окисел, но также перекись водорода, как непосредственно, так и в результате дисмутации высшего оксида. Эти соединения могут затем взаимодействовать с образованием гидроксильного радикала. Система оксидазы ксантина повреждает протеины, углеводы и нуклеиновые кислоты, а также убивает клетки, Из биохимических соединений полиненасыщенные липиды оказываются наиболее чувствительными к токсичному воздействию кислорода. Промежуточные соединения кислорода могут инициировать цепные реакции, включающие молекулярный кислород, так называемое окисление липида в перекисное соединение. Гидроперекиси липидов, образующиеся таким образом, и продукты их разложения не только наносят ущерб функциям клеточных мемб

1779263 АЗ ран, но могут также повреждать другие компоненты клеток.

Организмы, живущие в присутствии кислорода, были вынуждены в процессе эволюции создать несколько защитных механизмов против токсичных метаболитов восстановления кислорода. К защитным факторам относятся дисмутазы высших окислов (ДВО), которые подвергают дисмутации радикал высшего окисла, и содержатся в относительно постоянных количествах в клетках ткани млекопитающих. Самым известным из этих ферментов является ДВОCuZn, который является димером с молекулярным весом 33000, содержащим два атома меди и два атома цинка. ДВОCuZn обнаружен в цитозоле и в межмембранном промежутке митохондрии. ДВ.О-Мп является тетрамером с молекулярным весом 85000. содержащим 4 атома Мп, и он сосредоточен главным образом в митохондриальной матрице. До последнего времени предполагали, что внеклеточные жидкости не обладают ДВО-активностью.

Недавно.установлено присутствие дисмутазы высшего окисла во внеклеточной жидкости (например, плазме крови, лимфе, синовиальной жидкости и цереброспинальной жидкости), которая была названа ЕСSOD (ВК-ДВО), внеклеточная дисмутаза высшего окисла). У человека активность на мл плазмы составляет менее 1 % от общей ДВО-активности на г ткани, но она видимо активно регулируется организмом. Сходство с лектинами указывает на то., что в отличие от ДВО CuZn этот фермент является гликопротеином. Он видимо состоит из четырех равных нековалентно связанных субъединиц с общим (тетрамерным) молекулярным весом 135000 с содержанием металлов: один атом Си и один атом Zn на одну субъединицу. Фермент катализирует дисмутацию первого порядка радикала высшего окисла, как это делают другие ДВО, содержащие Си.

_ - ₊Дво . + Ог . + 2Н -> О₂ + Н₂О

Удельная активность является очень высокой и, видимо, объясняется наличием четырех атомов Си в молекуле. При хроматографии на гепарин-Сефарозе этот фермент разделяется на три фракции, А без какого-либо средства, В - со слабым сродством и С —с сильным сродством относительно гепарина. В отличие от поведения ВК-ДВО, ДВО-CuZn и ДВО-Μη не связываются с гепарин-Сефарозой. Этот фермент обладает определенным гидрофобным характером, который может указывать на сродство с клеточными мембранами. Срод ство с гепарином часто указывает на сродство с сульфатом гепарина, который содержится на поверхности клетки, в частности, на эндотелии кровеносных сосудов. Следовательно, можно предположить, что ВКДВО частично локализована на поверхности клеток, а частично во внеклеточных Жидкостях. Аминокислотный состав и антигенная активность совершенно не похожи на те же показатели исследованных ранее ДВО-изоферментов. Информационная РНК, кодирующая ВК-ДВО, содержит последовательность, кодирующую сигнальный пептид, что указывает на то, что ВК-ДВО является секретируемым протеином, и РНК, кодирующая ДВО-CuZn, с другой стороны, не содержит такую последовательность, кодирующую сигнальный пептид. Кроме того, аминокислотная последовательность ВК-ДВО отличается от аминокислотной последовательности других ДВО-изоферментов; как было установлено, ВК-ДВО содержитя в плазме всех исследованных видов млекопитающих, а также у птиц и рыб. Содержание варьирует в широких пределах от вида к виду, но внутривидовые вариации очень незначительны. В плазме грызуна содержится в 10-20 раз больше ВК-ДВО, чем в плазме человека, в которой содержится сравнительно мало ВКДВО. ВК-ДВО был также обнаружен во всех типах исследованной ткани животного. В тканях внутривидовые различия значительно слабее. Концентрация ВК-ДВО в тканях (единиц на грамм влажного веса) выше, чем концентрация ВК-ДВО в плазме (единиц/мл) у человека. У грызунов ткань и плазма содержат приблизительно равные количества ВК-ДВО.

Активность ДВО делает их интересными кандидатами на использование в качестве терапевтических агентов с целью подавления токсичных эффектов высших окислов и других кислородных радикалов.

Ввиду вышеупомянутой низкой концентрации ДВО-активности во внеклеточных жидкостях, компоненты во внеклеточной жидкости и поверхности.клеток являются наименее защищенными против радикалов высших окислов и других токсичных продуктов восстановления кислорода по сравнению с внутренностью клетки. Таким образом, ВК-ДВО образует особенно интересный продукт для терапевтических применений в связи с внеклеточным образованием радикалов высших окислов.

Важным аспектом изобретения является то, что оно относится к ВК-ДВО рекомбинантного происхождения.

ДНК-последовательность, кодирующая ВК-ДВО, или ее модификации или производные, как они были определены выше, может иметь природу комплементарной ДНК(кДНК), т. е. она может быть сконстру- 5 ирована” при помощи образования кДНКбиблиотеки на основе иРНК из клеток, продуцирующих ВК-ДВО, посредством известных стандартных приемов и векторов. Эксперименты с гибридизацией могут быть 10 затем осуществлены с использованием синтетических олигонуклеотидов в качестве зондов с тем, чтобы идентифицировать кДНК-последовательность, кодирующую ВК-ДВО. В качестве альтернативы ДНК-по- 15 следовательность может носить геномную природу, то есть, она может быть получена непосредственно из клеточного генома, например, при помощи отбора геномных последовательностей, гибридизирующихся с 20 ДНК-зондом, полученным на основе полной или частичной амнокислотной последовательности ВК-ДВО. Для терапевтических целей предпочтительным вариантом является ДНК-последовательность ВК-ДВО че- 25 ловеческого происхождения с тем, чтобы избежать неблагоприятных иммунных реакций.

ДНК-последовательность может также иметь синтетическую природу. ДНК-после- 30 довательность может быть смешанной, синтетической и геномной природы, смешанной геномной и кДНК природы, или смешанной кДН К и синтетической природы, полученной лигированием ДНК-фрагментов 35 кДНК. геномной или синтетической природы (в зависимости от необходимости), причем ДНК-фрагменты содержат часть гена, кодирующего ВК-ДВО, эти процедуры выполняются при помощи стандартных при- 40 емов.

MetteuAlBLeuLeuCyaSerCysLeuLeuLeuAlaAlaGlyAlaSeгАвр

ATGCTGGCGCTACTGTGTTCCTGCCTGCTCCTGGCAGCCGGTGCCTCGGAC TACGACCGCOATGACACAAGGACGGACGAGGACCGTCGGCCACGGAGCCTG -1 *1 -10 ¹²⁰ AlaTrpThrGlyGluAapSerAlaGluProAenSerAspSerAlaGluTrpIleArgAsр ₍GCCTGGACGGGCGAGGACTCGGCGGAGCCCAACTCTGACTCGGCGGAGTGGATCCGAGAC •CGGACCTGCCCGCTCCTGAGCCGCCTCGGGTTGAGACTGAGCCGCCTCACCTAGGCTCTG 20 30 ’ ¹⁸⁰ :HetryrAlaLvsValThrGlutlgTrpGlnGluValMetGlnArqArqAspAsoAsDGlY ATGTACGCCAAGGTCACGGAGATCTGGCAGGAGGTCATGCAGCGGCGGGACGACGACGGC TACATGCGGTTCCAGTGCCTCTAGACCGTCCTCCAGTACGTCGCCGCCCTGCTGCTGCCG

240

Изобретение относится к способному к репликации вектору экспрессии, который содержит ДНК-последовательность, кодирующую ВК-ДВО. Непосредсгвенно вниз ог этой последовательности (последовательности, кодирующей ВК-ДВО) может содержаться последовательность кодирующая сигнальный пептид, присутствие которого гарантирует секретирование ВК-ДВО, экспрессированной клеткой-хозяина. в которую был введен вектор. Сигнальной последовательностью может быть, например, следующая последовательность:

-18 -10 -1

MetLeuAlaLeuCyserCysLeuLeuLeyAtjaAl aGlyAlaSerAspAla

ATGCTGGCGCTACTGTGTTCCTG'CCTG CTCCTGTGCAGCCGGTGCCTCSGACGCC

TAGGACCGCGATGACACAAGGACGGA CTGACCACCGTCGGCCACGAAGCCYTGGG

120

Эта сигнальная последовательность составляет предмет настоящего изобретения и предполагается, что она может быть вставлена в направлении вниз от ДНК-последовательностей, кодирующих другие протеины или пептиды с тем, чтобы обеспе чить секретирование полученных в резуль тате продуктов из клеток.

Такой линией клеток является СНОK1/pPS Зпео-18, которая сдана 27 августа 1986 г. в Европейское Собрание Культур Клеток Животных под шифром хранения ЕСАСС 86082701.

Изобретение относится также к ДНКфрагменту, который кодирует ВК-ДВО и который содержит следующую ДНК-последояательность;

50

ThrLeuHisAlaAlaCysGlnValGlnProSerAlaThrLauAspAlaAlaGlnProArq ACGCTCCACGCCGCCTGCCAGGTGCAGCCGTCGGCCACGCTGGACGCCGCGCAGCCCCGG TGCGAGGTGCGGCGGACGGTCCACGTCGGCAGCCGGTGCGACCTGCGGCGCGTCGGGGCC

70' ³°⁰

Уа1ТНгС1У/а1Уа11.еиРЬеАгаС1пЬаиА1аРгоЛгдА1аРуаЬеиАзрА1аРбг?14 GTGACCGGCGTCGTCCTCTTCCGGCAGCTTGCGCCCCGCGCCAAGCTCGACGCCTT^t.v CA.CtGGCCGCAGCACGAGAAGGCCGTCGAACGCGGGGCGCGGTTCGAGCTGCGGAAGAA4

Ί 1779263 8

90

AlaLeuGluG1уVh»ProThrG1uPгоAanSerSerS«rArqAlalleHisValHisGln gccctggagggcttcccgaccgagccgaacagctccagccgcgccatccacgtgcaccag cgggacctcccgaagggctggctcggcttgtcgaggtcggcgcggtaogtgcacgtggtc pheGlyAtpLcuSerGInGlyCyaGluSerThtGlyPr oH1«Ту tAs nP г о L·uAlaVa1

TTCGGGGACCTGAGCCAGGGCTGCGAGTCCACCGGOCCCCACTACAACCCGCTGGCCGTG aagcccctggactcggtcccgacgctcaggtggcccggggtgatgttgggcgaccggcac

480

120 130

ProBl«ProGlnHUPtpGlyAtpPh6GlvAsaPheAl>ValArqAspGlySerL8uTrp

CCGCACCCGCAGCACCCGGGCGACTTCGGCAACTTCGCGGTCCGCGACGGCAGCCTCTGG

GGCGTGGGCGTCGTGGGCCCGCTGAAGCCGTTGAAGCGCCAGGCGCTGCCG'rCGGAGACC

540

140 ISO

ArqTyrA r qAlaGlvLeuAlaAlaSerLtuAlaGlyProHi tSctlltvalGlyAr gAla

AGGTACCGCGCCGGCCTGGCCGCCTCGCTCGCmGGCCCGCACTCCATCGTGGGCCGGGCC

TCCATGGCGCGGCCGGACCGGCGGAGCGAGCGCCCGGGCGTGAGGTAGCACCCGGCCCGG ⁶⁰⁰

160 170

ValValValHlcAlaGlyGluAspAspLeuGlyArgGlyGlyAsnGlnAlaSarValGlu GTGGTCGTCCACGCTGGCGAGGACGACCTGGGCCGCGGCGGCAACCAGGCCAGCGTGGAG caccagcaggxgcgaccgctcctgctcgacccggcgccgccgttggtccggtcgcacctc.

660 lao - 190

AanGlyAtnAlaGlyAtqAr qLeuAlaCvaCyaValValGlyva3CyaGlvPtoGlyt.au AACGGGAACGCGGGCCGGCGGCTGGCCTGCTGCCTGGTGGGCGTGTGCGdGCCCGGGCTC TTGCCCTTGCGCCCGOCCGCCGACCGGACGACGCACCACCCGCACACGCCCGGGCCCGAG

720

200 210 :·7?rpGluAtgGlnAlaArgGluHl»BerGluArgLy8Ly»ArgArgArgQluStrGluCyB TGGGAGCGCCAGGCGCGGGAGCACTCAGAGCGCAAGAAGCGGCGGCGCOAGAGCGAGTGC ACCCTCGCGGTCCGCGCCCTCGTGAG’TCTCGCGTTCTTCGCCGCCOCGCTCTCGCTCACG

780

220 -Ш.·

LyaAlaAIa·**

AAGGCCGCCTGA

TTCCGGCGGACT

Необходимо отметить, что эта последовательность включает кодирующую последовательность сигнального пептида, приведенную выше. Сигнальная последовательность простирается от акинокислоты - 5 18 до -1. Последовательность, кодирующая зрелый ВК-ДВО, начинается в аминокисло-. те+1.

Клетки, продуцирующие ВК-ДВО, могут быть идентифицированы иммуногистохими- 10 ческим способом с использованием антител, направленных против ВК-ДВО или при помощи анализа на секретирование ВКДВО в.среду, в которой культивируют специфичные клетки. 15

Как уже было упомянуто выше, ВК-ДВО проявляет сродство с гепарином, что указывает на сродство с сульфатом гепарина, или другими гепариноподобными глюкозоиминоглюканами, содержащимися на поверх- 20 ности клетки, в частности, на поверхности клеток эндотелия. Таким образом, имеет смысл индуцировать высвобождение ВКДВО с поверхностей клеток и тем самым обеспечить улучшенный выход ВК-ДВО вы- 25 ращиванием клеток в среде, содержащей гепарин или гепариновый аналог.

ДНК-фрагмент, содержащий ДНК-последовательность, кодирующую ВК-ДВО, вставляют в вектор, который вводят в клетку-хозяина, которую затем выращивают на соответствующей среде при подходящих условиях с целью осуществления экспрессии ВК-ДВО, далее ВК-ДВО изолируют. Средой, которую используют для выращивания клеток, может быть любая известная среда, пригодная для этой цели, но в нее обходимо добавить Си и/или Zn, ВК-ДВО. экспрессированная клетками, может секретироваться, то есть проходить через клеточные мембраны, в зависимости от типа клетки и состава вектора. Если ВК-ДВО продуцируется внутри клетки, то есть не секретируется клеткой, то она может быть выделена с использованием стандартных приемов, включающих разрушение клеток механическими средствами, например, с использованием ультразвука или гомогенизации, или при помощи ферментных или химических средств с^оследующей очисткой.

Для того, чтобы обеспечить секретирование, ДНК-последовательность, кодирующая ВК-ДВО, должна предваряться последовательностью, кодирующей сигнальный пептид, присутствие которого обеспечивает секретирование ВК-ДВО из клеток так, что по крайней мере значительная часть ВК-ДВО, экспрессированной в клетке, секретируется в культуральную среду и в дальнейшем может быть извлечена оттуда. Экспериментально было установлено, что часть секретированной ВК-ДВО содержится в среде, а часть ВК-ДВО присутствует на поверхности клеток. Таким образом, выражение “секретированный в культуральную среду включает любой перенос ВК-ДВО через клеточную мембрану, заканчивается ли он в культуральной среде или на поверхности клетки. ВК-ДВО может быть извлечен из среды при помощи стандартных приемов, содержащих фильтрацию клеток и изоляцию секретированного протеина.

Очистка ВК-ДВО возможна с помощью антител, которые используют для хроматографии по принципу сродства. Антитела могут быть либо поликлональными, либо моноклональными антителами. Предпочтительными в настоящее время являются моноклональные антитела, так как большая часть моноклональных антител. как было установлено, связывается с антигеном более слабо, чем смесь поликлональных тел, из. чего следует, что десорбция может быть осуществлена при умеренных условиях с использованием слабых элементов.

Кроме того, так как все IgG должны быть направлены против ВК-ДВР, гораздо меньшие количества матрицы антител надо будет использовать для адсорбции ВК-ВДО из биологического материала. Десорбция ВКДВО потребует меньшие объемы элюента, что упрощает процедуры элюирования, которые в настоящее время весьма трудоемки из-за больших объемов элюента, необходимых для проведения десорбции.

Специфичность моноклональных антител относительно ВК-ДВО видимо выше, чем специфичность поликлональных антител. Элюат, таким образом, будет более чистым, что означает исключение одной или нескольких последующих стадий очистки. Это означает, что процедура получения будет упрощена, а выход будет выше для ВКДВО, что представляет собой важное экономическое преимущество.

В большинстве случаев, особенно, когда используют поликлональные антитела для очистки ВК-ДВО. собранный элюат может быть абсорбирован на ионообменной матрице с последующим элюированием ВКДВО-активности и сбором фракций, содержащих ВК-ДВО-активность. Последующая очистка собранного элюата может быть осуществлена при помощи нанесения его на хроматографическую, колонку с матрицей, содержащей гепарин или гепариновый аналог, например, сульфат гепаринаили любой другой сульфатированный глюкозоаминогликан, сульфат декстрана или другое, сильно отрицательно заряженное соединение, и последующего элюирования: далее собирают фракции, обладающие сродством с анализируемым материалом.

Изобретение относится к использованию ВК-ДВО с целью диагностики, профилактики или лечения заболеваний или нарушений, связанных с присутствием или образованием радикалов высших окислов, или других токсичных промежуточных соединений кислорода, образующихся из радикалов высших окислов.

Примерами таких заболеваний или нарушений могут служить ишемия, инфаркт миокарда, почки, мозга или инфаркт кишечника. воспалительные заболевания, такие как ревматический’артрит, панкреатит, в частности, острый панкреатит, пиелонефриты и другие типы нефритов., и гепатиты, аутоиммунные заболевания, сахарный диабет (инсулиновой природы), рассеянный склероз, жировая эмболия, расстройство дыхательной системы у взрослых, нарушение дыхательной системы у детей, кровоизлияния в мозг у новорожденных, ожоги, разрушающее воздействие ионизирующего излучения и канцерогенез.

Таким образом. ВК-ДВО может найти по существу такое же применение, что и CuZn-ДВО, терапевтическая активность которой изучена более подробно и обсуждается ниже,

Однако, было установлено, что ВК-ДВО обладает несколькими свойствами, которые, как предполагается, делают ее особенно эффективной в терапевтических приложениях. CuZn-ДВО имеет низкий молекулярный вес (33000), что приводит к тому, что она быстро выводится из организма в результате фильтрации в клубочке в почках так. что в человеческом организме этот фермент имеет период полураспада примерно 20-30 минут. Предварительные эксперименты с ВК-ДВО неожиданным образом показали значительно более продолжительное время полураспада для ВК-ДВО. В.настоящее время этот факт частично объясняется высоким молекулярным весом ВК-ДВО. равным 135000, который препятствует ее выделению из организма в результате фильтрации в клубочке, а частично, тем, что ВКДВО, видимо, связывается с поверхностями эндотелия клеток, о чем речь пойдет ниже. При терапевтическом применении ВК-ДВО этот фермент имеет время полураспада в человеческом организме не менее 4 часов, а возможно и больше.

ВК-ДВО является в случае своего нативного окружения секретированным протеином и, таким образом, весьма правдоподобно, что он синтезируется для выполнения функций во внеклеточном пространстве (во внеклеточной жидкости или на поверхностях клеток), которые и позволяют ему проявлять свойства, которые особенно хорошо приспособлены для защиты компонент плазмы или внешней поверхности клеток от токсичных воздействий радикалов высших окислов или других радикалов кислорода. Эта точка зрения подтверждается, например, тем, что ВК-ДВО имеет слабо гидрофобный характер, который способствует ее связыванию с внешней поверхностью клеток, а тот факт, что этот фермент проявляет сродство с гепарином, указывает на сродство с сульфатом гепарина, который обнаружен на внешней поверхности клеток. Таким образом, оба эти свойства указывают на способность защищать ткань, см. примеры, в которых результаты подтверждают связывание ВК-ДВО с эндотелием кровеносных сосудов.

ДВО-активность в терапевтических приложениях была подтверждена для следующих заболеваний или нарушений.

При парентеральном применении CUZn-ДВО проявлял активность в качестве противовоспалительного агента в ряде животных моделей воспалительных процессов, а также при воспалительных заболеваниях животных. У человека положительные эффекты ДВО были отмечены при ревматическом артрите и артрозах, при воспалении мочевого пузыря и других урологических заболеваниях, а также при осложнениях, вызванных в результате лечения ионизирующим излучением. В некоторых странах бычья CuZn-ДВО зарегистрирована в качестве лекарственного препарата (Орготеин, Пероксинорм), который используют главным образом для лечения артритов и артрозов, при этом композицию применяют внутрь суставов.

При парентеральном применении CuZn-ДВО не воспринимается клеткой. CuZn-ДВО, заключенная в липосомы, воспринимается клетками. Была подтверждена ее эффективность против заболевания Крона, заболевания Бечета, язвенных колитов.

заболевания Ковальского и нежелательных эффектов радиационной терапии. Механизм противовоспалительной активности CuZn-ДВО не совсем ясен. Прямая защита от кислородных радикалов, продуцируемых активированными лейкоцитами, была выдвинута в качестве гипотезы. Другая возможность заключается в предотвращении образования сильно хемотактических материалов, вызванного перекисями,

Другой областью применения ДВО является его использование в качестве защитного фактора против разрушения ткани, вызванного ишемией с последующим восстановлением кровотока. Если прерывается подача крови к ткани, то ткань медленно будет превращаться в некротическую. Макро- и микроскопический процесс разрушения в общем случае будет развиваться медленно, в течение нескольких часов. Если кровоток восстанавливается в ткани, например. через 1 ч, то вместо улучшения будет наблюдаться очень сильное ускорение разрушения ткани. Наиболее вероятно, имеется несколько причин для называемого пародокса восстановления кровотока, но кислородные радикалы, которые образуются в результате повторного появления кислорода в ранее ишемической ткани, вносят свой вклад в это разрушение. Так как такие радикалы являются в высшей степени короткоживущими и, следовательно, их трудно изучать непосредственно, их образование и воздействие могут быть проанализированы на основании защитного воздействия различных пожирателей. Защита тканей была подтверждена в моделях восстановления кровотока при ишемии или аноксии в почке.

Результаты относительно ишемии и последующего восстановления кровотока имеют потенциально важные клинические приложения. Может быть получен исключительно хороший эффект восстановления кровотока в ткани в связи с инфарктами сердца в результате сопутствующего применения ДВО и/или других защитных факторов против кислородных радикалов и тромболитических факторов, например, плазминогенного активатора ткани. Результаты экспериментов с ДВО указывают на то. что ее можно использовать в связи с хирургией сердца и трансплантацией сердца. Аналогичным образом результаты применения ДВО в связи с ишемией почек с последующим восстановлением кровотока могут быть использованы в связи с трансплантацией почек и трансплантацией других органов таких, как кожа, легкие, печень или поджелудочная железа. Заболевание ише мня головного мозга является еще одним возможным применением.

ДВО обладают также другими интересными защитными эффектами в связи с другими патологическими заболеваниями.

Например, панкреатит был вызван в поджелудочной железе собаки тремя различными путями: вливание олеиновой кислоты, частичная закупорка выводного протока и ишемия с последующим восстановлением кровотока. Было установлено, что ДВО, каталаза и ДВО + каталаза оказывают защитное воздействие, но в общем случае наиболее эффективным оказывается комбинированное лечение. Эти результаты указывают на возможность активной терапии против этого заболевания, для которого в настоящее время не существует специальной терапии:

Было установлено, что лечение с использованием ДВО является эффективным также при ожогах.

Парентеральное применение CuZnДВО предотвращает бронхолегочную дисплазию у преждевременно рожденных детей, страдающих от младенческих нарушений дыхательной системы.

В моделях с щенками гончей собаки было отмечено, что инъекция ДВО уменьшает частоту внутрижелудочных кровоизлияний головного мозга с последующим снижением кровяного давления.

ДВО улучшает состояние крыс, страдающих гепатитом.

Острое сильное увеличение кровяного давления приводит к функциональным и морфологическим нарушениям в артериолах головного мозга. Ингибиторы синтеза простагландинов и дисмутаза высших окислов предназначены для защиты против таких нарушений.· Детальный анализ этой модели приводит к заключению, что радикалы высших окислов образуются в качестве побочных продуктов в процессе синтеза простагландинов. Эти результаты наводят на мысль, что повреждение тканей, вызванное радикалами высших окислов, которые высвобождаются в процессе синтеза простагландинов, может иметь место в других патологических ситуациях, и что ДВО может осуществлять защитное действие.

При различных типах аутоиммунных заболеваний таких, как системный склероз и ревматический артрит, была отмечена более высокая частота хромосомных повреждений в лимфоцитах. Фибробластные культуры и прямые препараты костного мозга также иногда обладают более высокой частотой повреждений.

Неопластическая трансформация клеток в общем случае разбивается на две фазы, а именно, на инициирование и последующее развитие. В лабораторных моделях, когда инициирование осуществляли при помощи ионизирующего излучения, блеомицина, мизонидазола и других нитроимидазолов, онкогенную трансформацию эффективно ингибируют при помощи введения 8 среду ДВО. Причем нет необходимости в присутствии ДВО в процессе воздействия инициирующих материалов, что видимо указывает на то. что фермент ингибирует последующую стадию развития. Нетоксичные дозы ксантина + оксидазы ксантина вызывают рост клеток. Добавление ДВО или ДВО + каталазы ингибирует этот эффект. В модели, в которой кожные опухоли вызывали бензантраценом с последующим применением форболового сложного эфира (ТРА), при помощи локальной обработки липофильным комплексом меди с ДВО-активностью значительно снижали образование опухоли. Этот результат указывает на то, что по крайней мере в некоторых случаях радикалы высших окислов участвуют в образовании опухоли и что ДВО может осуществлять защиту против такого действия.

Есть основания предполагать, что кислородные радикалы участвуют в неблагоприятных воздействиях токсичных материалов таких, как блеомицин, адриамицин, аллоксан, 6-гидродопамин, паракват, дигидрофумаровая кислота, нитрофурантоин и стрепотозотоцин. В тех случаях, когда образование радикалов имеет место во внеклеточном пространстве, это пространство может быть защищено при помощи инъекции защитного фермента. Так ДВО может защищать против диабетогенной активности аллоксана в лабораторных условиях и в живом организме. Таким образом, разрушающее воздействие аллоксана, видимо, осуществляется через воздействие радикалов высших окислов или других кислородных радикалов, полученных из него. Причина высокой чувствительности /3-клеток к аллоксану не совсем ясна и можно только предполагать, что имеется какая-либо связь между чувствительностью к аллоксану и тяжестью заболевания сахарным диабетом (инсулинового типа). При сахарном диабете существуют инфильтрация в островках Лагерганса под воздействием воспаленных клеток, которые потенциально могут образовывать кислородные радикалы. Поэтому можно подположить. что защита /3-клеток при по мощи инъекций ДВО является первым шагом в борьбе с сахарным диабетом.

В общем случае CuZn-ДВО использовали в качестве испытываемого материала в экспериментах, которые были описаны выше. Однако можно предположить, что ВКДВО можно использовать для тех же целей. Ранее было установлено, что ее можно использовать с более высокой.эффективностью благодаря ее специфичным свойствам, которые делают ВК-ДВО особенно притягательной для внеклеточного применения.

Пример 1. Получение гомогенатов пупочного канатика.

Человеческие пупочные канатики собирали в палате для рожениц в госпитале Университета в Умеа. Их хранили в холодильнике в палате, а затем быстро замораживали в лаборатории при температуре -80°С и хранили при температуре -30°С.

После оттаивания пупочные канатики измельчали, суспендировали в 50 мл буфера фосфата калия, pH 7,4, содержащего 0,3 М КВч, 3 мМ диэтилентриаминпентауксусной кислоты (ДТП К). 100000 м ед/д тразилола (апротинииа) и 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ). Использовали 4 л буфера на кг пупочных канатиков.. Для увеличения экстрагирования ВК-ДВО из ткани (примерно в 3 раза) использовали хаотропную увеличивающую диффузию соль КВч. ДТПК, тразилол и ФМСФ добавляли с тем, чтобы ингибировать протеазы. Эту суспензию в дальнейшем подвергали гомогенизации, обрабатывали ультразвуком, встряхивали при температуре 4°С в течение 1 часа. Полученные в результате гомогенаты подвергали центрифугированию (бОООхд, 20 мин), а верхние слои быстро замораживали при температуре -80°С, хранили при температуре -ЗО°С.

П р и м е р 2, Получение и очистка ВК-ДВО легких человека.

Извлекали тегкие человека в течение 24 ч после смерти при помощи вскрытия девяти трупов без каких-либо очевидных признаков заболевания легких. Легкие измельчали на куски, промывали в 0,15 М растворе NaCI. гомогенизировали в 5 объемах смеси ледвода, 50 мМ ацетата натрия, pH 5,5, Гомогенат обрабатывали ультразвуком, экстрагировали в течение 30 минут при температуре 4°С и центрифугировали (6000 х д) в течение 20 минут.

Верхний слой адсорбировали на ДЭАЭСефселе, уравновешенной 50 мМ ацетатом натрия, pH 5,50, и элюировали градиентом 0-200 мМ NaCI в ацетатном буфере. Градиентный объём в 10 раз превышал объем колонки.

Активные фракции собирали, разбавляли 1,5 объемами дистиллированной воды и титровали до pH 8,4 с использованием 1М раствора NaOH. Снова адсорбировали на ДЭАЭ-Сефаселе, уравновешенном 175 мМ трис HCI, pH 8,4 (I объем ионообменного материала на 10 объемов фракции). Далее ДЭАЭ-Сефасел промывали буфером, заполняли им колонну и элюировали 0-200 мМ градиентным раствором NaCI в Трис-буфере.

Собранные фракции концентрировали и подвергали диализу относительно 150 мМ фосфата натрия при pH 6.5. Пробу наносили на колонну (примерно 1 мл геля на 15 мг протеина в пробе) с°Фенил-Сефарозой, уравновешенной относительно того же буфера. Эту активность элюировали градиентом 0-0,5 М КВч в 50 мМ фосфата натрия (pH 6.5).

Активные фракции собирали, концентрировали и подвергали диализу против 0,15 М фосфата натрия, pH 6,5. Пробу наносили на колонну из Кон A-Сефарозы, уравновешенной относительно фосфатного буфера, а затем элюировали при помощи 50 мМ сг-метил D-маннозида в фосфатном буфере.

Активные фракции концентрировали, наносили на колонну и элюировали в 50 мМ фосфата натрия, pH 6,5.

Активные фракции со стадии элюирования собирали, концентрировали и наносили на колонну из лектина пшеничных зерен Сефароза (10 мл), уравновешенную при помощи 0,15 М фосфата натрия, pH 6,5. Фермент элюировали 0,45 М N-ацетил-Оглюкозамином в фосфатном буфере.

Активные фракции с описанной выше стадии собирали, концентрировали, подвергали диализу против 0,15 М фосфата натрия, pH 6,5, и наносили на колонну, содержащую голубую Сефарозу КЛ-6Б, уравновешенную при помощи фосфатного буфера. После промывки колонны буфером подавали 10 мМ НАД и Ю мМ НАДФ. После промывки буфером пиридиновых нуклеотидов фермент элюировали 0,9 М КВч в 50 мМ фосфата натрия, pH 6,5.

Активные фракции из голубой Сефарозы колонны подвергали диализу против 25 мМ фосфата натрия, pH 6,5, и наносили на колонну, с гепарин-Сефарозой, уравновешенную тем же буфером, элюировали 140 мл градиента 0-1,0 М NaCI в фосфатном буфере. Получали три фракции.

Фракция А содержала УФ-абсорбирующий материал, который не связывался с гепарин-Сефарозой. Ее подвергали очистке на колонне с Сефакрил G-300. Пробу элюировали в 25 мМ трис HCI. pH' 7,5.

Фракция А, В и С подвергали диализу относительно 25 мМ Трис HCI, pH 7,5, а затем концентрировали до объемв 1 мл на мембранных ультрафильтрах. Фракцию С использовали для получения антител ВКДВО в соответствии с описанием, приведенным в помещенном ниже примере.

Пример 3. Кролику подкожным способом вводили 30 μ г ВК-ДВО (фракцию С), вместе с полной добавкой Фрейнда. Далее-иммунизацию ускоряли при помощи 5 инъекций 30 μ г ВК-ДВО в неполной добавке Фрейнда с интервалами в один месяц. Через 2 недели после введения последней дозы кролику собирали кровь. lgG-фракцию антисыворотки изолировали при помощи адсорбции и десорбции из материала Протеин-А-Сефароза в соответствии с рекомендациями фирмы-п роизводителя. Элюирование осуществляли 0,1 М гликоколHCI, pH 3.0. Собранный IgG титровали при pH 7,0. После этого IgG подвергали диализу против 0,1 М карбоната натрия (pH 8,3), 0,15 М NaCI (соединяющий буфер).

IgG разбавляли до концентрации 5-8 мг/мл при помощи соединяющего буфера. Добавляли Сефарозу, активированную CNB, инкубировали при встряхивании в течение ночи при температуре 4°С. Буфер отсасывали из геля и анализировали на оставшийся протеин. В общем случае получали более чем 98% связывание. Гель, со связанным IgG блокировали суспензией в 1 М этаноламина в течение ночи при температуре 4°С, промывали “соединяющим буфером”, далее 0,1 М ацетата натрия (pH 4,0), 0,5 М NaCI. Гель хранили в “соединяющем буфере с азидом в качестве антибактериального агента

100 μ л 50% суспензии анти-ВК-ДВОСефарозы добавляли к 0.5 мл ВК-ДВО в “соединяющем буфере”. Осуществляли параллельное контрольное инкубирование с использованием 100 μ л 50% суспензии Сефарозы 4В. Растворы встряхивали в течение ночи при температуре 4°С, а затем центрифугировали. Остаточная активность в растворе, обработанном Сефарозой 4В, была равна 2080 ед/мл, а в растворе, обработанном анти-ВК-ДВО-Сефарозой - 720 ед/мл. Используя эти цифры, можно рассчитать, что 1 мл анти-ВК-ДВО-Сефарозного геля связывает 13500 единиц ВК-ДВО (примерно 120 μ г). Эти расчеты использовали для составления плана адсорбции ВК-ДВО из гомогенатов ткани человека.

Пример 4. Иммуноадсорбция ВКДВО в анти-ВК-ДВО-Сефарозе.

Приготавливали примерно 10 л экстракта пупочных канатиков в соответствии с примером 1. Содержание ВК-ДВО в экстракте составляло примерно 150 ед/мл. Если гель связывает 13500 ед/мл (см. пример 3), адсорбция всей ВК-ДВО в 10 мл экстракта требовала примерно- 110 мл анти-ВКДВО-Сефарозы.

Экстракт подвергали центрифугированию (6000х. 30 мин), с тем. чтобы удалить осажденный протеин. Затем в верхний слой добавляли 110 мл анти-ВК-ДВО-Сефарозы, смесь инкубировали в течение ночи при температуре 4°С при перемешивании. Гель отделяли от экстракта на стеклянной воронке, промывали 50 мМ фосфата калия (р'Н 7.0), 0,5 М NaCI.

Гель упаковывали в хроматографическую колонку, элюирование начинали с 50 мМ фосфата К (pH 7,0), 0,5 М NaCI со скоростью 50 мл/час и фиксировали поглощение в области 280 нм. Элюирование продолжали до достижения очень гГизких значений при А280. Далее ВК-ДВО элюировали линейным градиентом KSCN 0,5-2,5 М в 50 мМ фосфата калия, pH 7,0. Общий объем градиента составлял 500 мл, а элюирование осуществляли со скоростью 30 мл/час. Десорбция ВК-ДВО протекала медленно и элюирование не могло быть ускорено.

Элюирование ВК-ДВО не является полным в конце градиента 2,5 М KSCN, но элюирование не продолжают с тем, чтобы не собирать ВК-ДВО. которая становится слишком денатурированной под действием высокой концентрации KSCN.

Первую активность в градиенте не собирали, так как она содержала слишком большое количество примесей неспецифично связанного протеина (Агар).

Пример 5. Адсорбция и элюирование из ДЭАЭ-Сефасела.

В собранный элюат из колонны с антиВК-ДВО-Сефарозой добавляли 1-аминометилпропанол до конечной концентрации 10 мМ. Раствор титровали до pH 9,0 с использованием 1М NaOH, разбавляли 5 объемами дистиллированной воды. В полученный раствор добавляли 40 мл ДЭАЭ-Сефасела, уравновешенного 50 мМ фосфатом натрия, 0,5 М NaCI, 175 мМ Трис-НС1, pH 9.6.

ВК-ДВО адсорбировали на ДЭАЭ-Сефаселе при перемешивании в течение ночи при температуре 4°С. ДЭАЭ-Сефасел затем собирали на стеклянной воронке, промывали раствором 50 мМ фосфата натрия, pH 6,5, и заполняли им хроматографическую колонну диаметром 2,5 см. Эту колонну сначала элюировали примерно 4 объемами вышеупомянутого буфера. Затем ВК-ДВО элюи ровали раствором 50 мМ фосфата натрия (pH 6,5), 0,25 М NaCI. Фракции подвергали диализу против 25 мМ фосфата натрия pH 6,5, и концентрировали до объема 2 мл.

Пример 6. Окончательная очистка ВК-ДВО на гепарин-Сефарозе.

Четыре отдельные порции элюата из ДЭАЭ-Сефасела, полученные в соответствии с описанием, приведенным выше, разделяли одновременно на гепарин-Сефарозе. Растворы фермента, которые должны наносить на колонну, подвергали диализу против 25 мМ фосфата калия, pH 6,5.

мл геля гепарин-Сефароза промывали 25 мМ фосфата калия, pH 6,5, содержащем IM NaCI, а затем буфером без NaCI. Гепарин-Сефарозу использовали для наполнения хроматографической колонны диаметром 2,5 см, а элюирование начинали с 25 мМ фосфата калия (pH 6,5) со скоростью 15 мл/час. Раствор ВК-ДВО (примерно 10 мл, 800000 единиц) наносили на колонну и наблюдали поглощение при 280 нм. ВКДВО элюировали с использованием градиента NaCI от 0 до 1,2 М NaCI. Объем градиента составлял 400 мл. ВК-ДВО элюировали в три пика: один без сродства с гепарином, один с промежуточным.сродством и один с высокой степенью сродства. Эти пики соответствуют фракциям А, Ви С, описанным в примере- 2. После очистки с использованием описанной процедуры почти вся активность имеет тип С, и поэтому был сделан вывод, что он является видимо нативной формой фермента.

Собранная активность составляла 430000 единиц (примерно 4.3 мг). Удельная активность соствляла 81100 (ед. на мл/Агео). Собранная активность составляла примерно 53% от активности, нанесенной на гепарин-Сефарозу.

Пример 7. Аминотерминальная последовательность человеческой ВК-ДВО.

Человеческую ВК-ДВО. полученную в соответствии с описанием, приведенным в предыдущих примерах, анализировали с целью идентификации ее (N-терминальной) аминокислотной последовательности, Было установлено, что последовательность из первых 33 аминокислот имеет следующий вид:

TRP NHR GLY CLU ASP SER ALA GLU PRO ASN SER ASP SER

ALA GLU TRP ILE ARG ASP MET TYR ALA LYSVALTHRCLU

ILE TRP GLN GLU VAL MET GLN

Эта последовательность - или ее соответствующая часть - может быть использована для получения синтетических ДНК-зондов, синтетических деоксиолигонуклеотидов, комплементарных как к кодирующей, так и некодирующей нити ДНК-последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, указанную выше.

Такие зонды могут быть использованы в экспериментах по гибридизации с кДНКбиблиотеками, синтезированными по иРНК из ВК-ДВО-продуцирующих клеток или тканей для того, чтобы изолировать кДНК-копию полной длины или часть ВК-ДВО-гена в соответствии с описанием, приведенным в помещенном ниже примере.

П р и м е р 8. Клонирование и формирование последовательности человеческой ВК-ДВО.

Получение ДНК-зонда.

Человеческую ВЕ-ДВО подвергали очистке из пупочных канатиков в соответствии с описанием примеров 1-6, а последовательность первых 33 N-терминальных аминокислот определяли в соответствии с описанием примера 7. На основе этой аминокислотной последовательности синтезировали 48-мерный диоксиолигонуклеотид:

5-CAGGGACATGTATGCCAAGGTGACT GAGATCTGGCAGGAGGTG

ATGCA-3¹ комплементарный к кодирующей нити ВЕ-ДВО-гена.

Выделение кДНК плаценты человека.

Восемь нитроцеллюлозных фильтров, на которые были помещены 20000 бляшек рекомбинантных фагов, несущих кДНК-библиотеку на каждый фильтр, сначала пропитывали в 5 х КСН, а затем подвергали предварительной гибридизации в течение одного часа при температуре 41°С в 40 мл 20% формамида, 5 х раствор Денхардта, 50 мМ фосфата натрия, pH 6,8 и 50 μ г/мл денатурированной, обработанной ультразвуком, ДНК бычьего тимуса. Далее фильтры гибридизовали с 32р-меченым 48-мерным-зондом, описанным выше. Гибридизацию осуществляли в растворе для предварительной гибридизации, в который добавляли 100 μ Μ АТФ (конечная концентрация) в течение 18 часов при температуре 41 °C. После инкубирования в течение ночи при температуре 41 °C фильтры промывали один раз в 0,2 х КСН при температуре 37°С, а затем 4 раза промывали в 0,2 х КСН, 0,1% ДСН при температуре 37°С и сушили на воздухе. Фильтры в течение ночи экспонировали на рентгеновской пленке. На каждом фильтре содержалось примерно 6 положительных бляшек.

Фаги с положительной реакцией гибридизации изолировали и подвергали очистке, а ДНК из этих фагов экстрагировали. Длину кДНК-вставок определяли при помощи электрофореза в агаровом геле после расщепления ДНК фага эндонуклеазой EcoR1. Рекомбинантный фаг, несущий самую длинну кДНК-вставку, обозначали через λ SP3 и использовали в дальнейших исследованиях, кДНК-вставку фага λ SP3 подвергали анализу эндонуклеазами и вставляли в ДНКплазмиды р V С18 и М13-вектора тр 9. Ёставка из λ SP3 содержала 1396 пар оснований (п.о.) кДНК и открытый для считывания участок, кодирующий протеин из 240 аминокислот, а также нетранслируемую 5¹ область в 60 п.о. и нетранслируемую З¹ -область в 607 п.о.

Субклонирование и анализ с использованием эндонуклеаз рестрикции кДНКвставок, кодирующих человеческую ВК-ДВО. .

Примерно 30 /<гДНК ASP3 переваливали эндонуклеазой EcoR1 и кДНК-вставку отделяли от ДНК λ электрофорезом в 6% полиакриламидном геле. Приблизительно 0,2 μ г кДНК-фрагмента выделяли из геля при помощи электроэлюирования, экстрагирования фенолом и хлорформом, и осаждения этанолом. 0,05 μ г изолированного кДНК-фрагмента лигировали с 1 μ г ДНК Р VC18 по сайту EcoRI. ДНК после лигирования трансформировали в штамм Е. Coll НВ 101. Трансформированные клетки подвергали селекции на пластинках, содержащих ампициллин. Рекомбинантную плазмиду, несущую кДНК-вставку, идентифицировали и обозначили через pLS3. ДНК плазмиды pLS 3 подвергали анализу при помощи эндонуклеаз.

Анализ ДНК-последовательности кДНК, кодирующей человеческую ВК-ДВО.

Последовательную серию перекрывающихся клонов кДНК-вставки формировали в М13-векторе тр 9, определяли полную нуклеотидную последовательность кДНК, при этом было установлено, что она имеет длину 1396 п.,о.

Эта кДНК-вставка имеет открытую для считывания область в 240 аминокислот. Аминокислотная последовательность очищенного зрелого протеина начинается в аминокислоте +1, что наводит на мысль о существовании сигнального пептида из 18 аминокислот. Подобно известным сигнальным пептидам, эта последовательность аминокислот богата гидрофобными аминокислотами и, кроме того, последним остатком является аланин, который является одной из аминокислот, обнаруженной в этой позиции в известных сигнальных пептидах. Аминокислотные последовательно сти были идентифицированы при помощи анализа пептидной последовательности.

Еще одним отличительным свойством ДНЕ-последовательности является последовательность, обнаруженная в кодоне начала трансляции, == CAGCCAUGC -, которая гомологична последовательности для эукариотных свойств начала, CC/JCC-AVG/G/. Кроме того, возможный сигнал полиаденилирования с последовательностью АТТААА-', гомологичной постулированной согласованной последовательности ААТААА, обнаружен через 14 п.о. в направлении вверх от конца полиаденилиования.

Экспрессия человеческой ВК-ДВО в клетках СНО.

Вектор экспрессии, содержащий начало репликации, ранний и поздний промоторы, последовательности полиаденилирования и окончания Вируса Обезьяны 40 (SV 40) использовали для продуцирования человеческой ВК-ДВО, закодированной в кДНК, описанной выше. кДНК длиной 1396 п.о. вставляли в единственный сайт EcoRI, расположенный между ранним промотором SV 40 и последовательностями полиаденилирования и окончания SV 40 так, что экспрессия кодирующей последовательности человеческой ВК-ДВО управляется ранним промотором SV 40. Сконструированную таким образом плазмиду экспрессии ВК-ДВО обозначали как pPS3.

μ г ДНК pPS3 расщепляли эндонуклеазой Pst1 в единственном сайте, расположенном в гене ' /3-лактамазы. Линеаризованную ДНК pPS3 подвергали трансфекции вместе с 0,5 λ г ДНК из плазмиды, содержащей последовательности, отвечающие за устойчивость к Генитицину (Г-418 сульфат), в клетках СНО-ΚΙ (АТСС СС 61). Клетки после трансфекции подвергали селекции при помощи выращивания в среде (среда Ф12 Хэмса, дополненная 10% сывороткой плода теленка, стрептомицином и пенициллином), содержащий 700 μ.Γ на мл Генитицина, Колонии, устойчивые к Генитицину. изолировали и размножали в той же среде. Среду извлекали в определенные промежутки времени и анализировали на присутствие ВКДВО при помощи ЭЛИСА, а активность фермента измеряли в соответствии с описанием, приведенным ниже.

Одну из полученных линий клеток обозначали через CHO-KI/pPS3 Знео-18 и отбирали для последующих исследований

Декретирование ВК-ДВО в культуральную среду клетками СНО, содержащими ген, кодирующий человеческую ВК-ДВО.

Клон СНО-К1/pPS3-Heo-18 и родительские клетки СНО-К1 выращивали в среде Ф-12 Хэма, содержащей 10% сыворотку плода теленка. Спустя три дня среду удаляли, а клетки дважды промывали, инкубировали в растворе, содержащем 40 мМ трис-HCI, 140 мМ NaCI и 1 мМ ЭДТА. Извлеченные клетки (примерно 8x10°) центрифугировали, верхний слой декантировали, а клетки хранили при температуре -80°С в виде осадка. Клетки разрушали ультразвуком в 1,5 мл раствора, содержащего 50 мМ фосфата К, pH 7,4, 0,3 М КВ, 3 мМ ДТПА, 0,5 мМ ФМСФ и 100 ед/мл тразилола. Гомогенаты центрифугировали. Специальное определение количества ВК-ДВО проводили при помощи инкубирования гомогенатов и культуральной среды с иммобилизованными антителами относительно человеческой ВК-ДВО и человеческой CuZn ДВО. Никаких следова ВК-ДВО не было обнаружено в родительских клетках СНО К1 или в их культуральной среде. Было установлено, что культуральная среда после клона клеток CHO-KT/pPS Знео-18 (15 мл) в этом конкретном эксперименте содержит 51 ед/мл ВКДВО, а всего 765 ед. Гомогенат клеток (в 1,5 мл) содержит 71 ед. ДВО-активности, из которой 20 ед. относится к ВК-ДВО. Таким образом, 97,5% ВК-ДВО в культуре СНОК1 /pPS Знео-18 секретировано в среду.

Продуцирование человеческой ВК-ДВО в клетках СНО.

Продуцирование человеческой ВК-ДВО этим клоном в случае, когда клетки выращивали на твердом носителе и в суспензии.

1. Продуцирование ВК-ДВО клетками CHO-K1/pPS Знео-18, выращиваемыми на твердых носителях.

а) В колбу емкостью 175 мл прививали 4,5 х 10.⁶ клеток в 30 мл среды Ф12 Хэма с 10% бычьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, стрептомицина и пенициллина. Клетки инкубировали при температуре 37°С в атмосфере 5% СОг. Среду меняли каждые три дня, а концентрацию человеческой ВК-ДВО, секретированной в среду, определяли. Производительность человеческой ВК-ДВО составляла 1.5 пг. клетку '1 · 24 часа' , что устанавливали при помощи ИФА и определения активности фермента ВК-ДВО.

б) На микроносители 4 мг/мл прививали клетки в среде Ф12 Хэма, в которую добавляли 5% сыворотку плода теленка, 2 мМ L-глютамина. стрептомицин и пенициллин.

Клетки выращивали в колбе с мешалкой емкостью 500 мл при температуре 37°С в атмосфере 5% СО₂, При выращивании слившихся клеток культуру заменяли со скоростью 0,088 час¹.

Производительность человеческой ВКДВО составляла 0,50 пг плетку’¹ -24 часа’¹.

2, Продуцирование ВК-ДВО клетками CHO-K1/pPS Знео-18. выращиваемыми в суспензионной культуре.

На среду объемом 125 мл (среду Ф12 Хэма, в которую добавляли 10% сыворотки плода теленка, 2 мМ L-глютамина, стрептомицин и пенициллин)прививали 2 х 10⁵ клеток/мл. Эту культуру инкубировали во вращающейся колбе при температуре 37°С в воздухе, содержащем 5% СОг.

Каждые три дня среду заменяли. Производительность человеческой ВК-ДВО составила 0,65 пг клетку'¹.· ч'¹.

Анализы на обнаружение экспрессии человеческой ВК-ДВО.

1. Анализ с иммуноадсорбентом, связывающим фермент (ИФА). На микротитрованные пластины наносили 100 μ л на углубление раствор, содержащий 15 μ г на мл поликлональных антител JgG кролика анти-В К-ДВО (пример 3) в 15 мМ №₂СОз, 35 мМ ИаНСОз, 0,02% N₂N3, pH 9,6. После инкубирования в течение ночи при комнатной температуре пластины промывали буфером ПБС (1'0 мМ фосфата натрия, 145 мМ NaCI, pH 7.2), инкубировали в течение 30 минут при температуре 37°С, вносили 200 μ л на углубление раствора, содержащего 3% (в/о) альбумина бычей сыворотки в ПБС и промывали в ПБС. Пробы в 100 μ л разбавленной среды добавили в каждое углубление и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Пластины промывали 1 ч при 37°С с 100 μ л на углубление раствора, содержащего 8 μ г на мл моноклонального антитела мыши антиВК-ДВО в 3% альбумине бычей сыворотки в ПБС. После промывки 5% Твином 20 в ПБС пластины инкубировали в течение 1 ч при 37°С с конъюгированными пероксидазой антителами кролика анти-мыши в 3% альбумине бычьей сыворотки в ПБС. Пластины промывали 5% Твином 20 в ПБС и инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре в темноте с 100 μ л на углубление раствора субстрата (50 мМ цитрата натрия. 100 мМ фосфата натрия, 0,04% (в/о) о-фенилен диамина, 0,01% Н₂О₂, pH 5,0). Реакцию прекращали добавлением 25 μ л 10% ДСН на углубление и измеряли поглощение в области 450 нм.

2. Определение активности фермента ВК-ДВО.

Пробы анализировали перед и после их обработки анти-человеческой ВК-ДВО, иммобилизованной на Сефарозе (пример 4). В качестве активности ВК-ДВО брали раз ность между активностью пробы перед и после адсорбции антителами.

П р и м е р 9. Индуцированное гепарином высвобождение ВК-ДВО в плазме крови человека.

200 ед/кг веса тела гепарина инъекцировали двум здоровым мужчинам, голодавшим в течение ночи (а) в возрасте 34 лет и (б) в возрасте 40 лет. Пробы крови брали перед инъекцией гапарина и с равными интервалами после инъекции. Пробы крови вводили в вакуумные трубки типа Терумо Веноджект, содержащие ЭДТА в качестве антикоагулянта, и затем подвергали центрифугированию. После центрифугирования пробы плазмы хранили при температуре 80°С до проведения анализа.

Кроме того, 20 мл цельной крови брали·· у трех здоровых человек и хранили в трубке с ЭДТА, как это было описано выше. Эту кровь делили на две равные части и в одну из них добавляли 30 ед. гепарина/мл , а в другую равный объем 0,15 М NaCI. После инкубирования в течение 30 минут при комнатной температуре пробу подвергали центрифугированию и плазму собирали для ДВО-анализа.

ДВО-активность анализировали при помощи прямого спектрофотометрического метода с использованием КО₂. Одна единица ДВО-активности соответствует 8,3 нг человеческой CuZn ДВО, 8,8 нг человеческой ВК-ДВО и 65 нг бычей Mn-ДВО. Отличие между изоферментами в плазме усиливают при помощи антител относительно человеческой CuZn ДВО и ВК-ДВО, иммобилизованных на Сефарозе 4Б.

Внутривенная инъекция 200 ед. гепарина на кг веса тела приводит к быстрому трехкратному увеличению ВК-ДВО-активности в плазме. Максимальное увеличение получали спустя 5 минут. Активность остается высокой в течение 15-30 минут, а затем постепенно снижается и достигает первоначального уровня через 6 часов. Ввведенный внутривенным способом гепарин не оказывал никакого влияния на активность CuZn ДВО плазмы и на активность ДВО устойчивости к цианиду. Возрастающие дозы гепарина приводят к увеличению высвобождения ВК-ДВО.

Вопреки результатам, полученным в живом организме, добавление гепарина в цельную кровь, не оказывало какого-либо влияния на активность ВК-ДВО в плазме. Даже добавление гепарина (5 ед. /мл) непосредственно в плазму не приводило к какимлибо изменениям в активности ВК-ДВО. Эти результаты указывают на то, что увеличение активности ВК-ДВО в плазме живого организма не связано с каким-либо высвобождением фермента из кровяных клеток или активацией ВК-ДВО. содержащейся в плазме.

Пробы плазмы 5 здоровых людей (3 мужчины, 2 женщины) подвергали хроматографическому анализу на гепарине-Сефарозе при комнатной температуре в колоннах, содержащих 2 мл гепарина-Сефарозы с 25 мМ фосфата калия. pH 6,5, в качестве элюента. Пробы (2 мл плазмы) вводили со скоростью 4,2 мл/час, а когда А₂80 достигал координатной оси, граничные компоненты элюировали при помощи линейного NaCI-градиента в буфере фосфата калия (0-1 М, общий объем 50 мл) со скоростью 9 мл/час. Средний выход ДВО-активности в элюате составил примерно 95%.

Перед нанесением пробы плазму уравновешивали буфером элюирования с целью хроматографии на небольших колоннах типа Сефадекс Г 15. Хроматография приводила к трехкратному разбавлению проб. Извлечение ДВО-активности было близко к 100%.

Результаты определения фракций А, В и С ВК-ДВО в пяти видах нормальной плазмы приведены в табл. 1, помещенной ниже. Было установлено, что эти три фракции приблизительно составляют равные части в нормальной плазме. Средний выход ВКДВО-активности на хроматограмме составлял 95%’. Разделение на три фракции очевидно не происходит за счет вторичного разрушения в лабораторных условиях, так как структуры для каждого типа плазмы одинаковы как перед, так и после хранения в течение 3 дней в холодильнике. Внутривенная инъекция гепарина пациенту приводит к существенному увеличению только фракции С. Фракции А и В остаются без изменений. У второго испытываемого пациента (эти данные не приведены) влияние инъекции гепарина было по существу идентичным. Фракция С увеличивалась от 7 до 32 единиц/мл плазмы.

Эксперименты, описанные выше, показывают, что внутривенная инъекция гепарина приводит к быстрому увеличению ВК-ДВО-активности в плазме. Гепарин не активирует ВК-ДВО, поэтому никакое высвобождение из клеток крови не может быть доказано, а это наводит на мысль, что поверхности клеток эндотелия являются наиболее вероятным источником высвобожденной ВК-ДВО. Несколько других факторов, имеющих сродство с гепарином, липопротеиновая липаза, печеночная липаза, диамин оксидаза и тромбоцитный фактор 4 ранее были подвергнуты аналогичному анализу и было установлено, что при помощи внутривенной инъекции гепарина наблюдается их быстрое высвобождение. В большинстве этих случаев ясно, что индуцированное гепарином вытеснение протеина из сульфата гепарина на поверхности клеток эндотелия является объяснением этого явления. Весьма правдоподобно, что высвобождение В ΚΑΒΟ можно объяснить теми же эффектами.

Никаких пиков в высвобождении не было получено при введении гепарина в дозах до 200 ед/кг веса тела, это показывает, что для максимального высвобождения ВКДВО необходимо больше гепарина, чем для липопротеиновой липазы, диамин оксидазы, печеночной липазы и тромбоцитного фактора 4. Отношение между сродством для гепарина с сульфатом гепарина может быть ниже для ВК-ДВО, чем для других протеинов.

Основная плазма человека содержит почти равные количества фракций, А, В и С ВК-ДВО. Внутривенная инъекция гепарина приводит к высвобождению только фракции С с высоким сродством к гепарину, которая, .очевидно, является формой, имеющей сродство к поверхностям клеток эндотелия. Здесь, достигали 4-6-кратное увеличение, но весьма правдоподобно, что более высокие дозы гепарина приводили бы к более высоким пропорциям. Намного более высокие пропорции достигали для липопротеиновой липазы, печеночной липазы, диамин оксидазы и тромбоцитного фактора 4. По сравнению с этим протеинами эндотелиальное связывание ВК-ДВО оказывалось намного слабее. Видимо, для фракции С ВК-ДВО имеется равновесие между плазмой и поверхностями клеток эндотелия. Большая часть ВК-ДВО в сосудистой системе оказывается расположенной на поверхностях клеток эндотелия.

Молекулярные основы отличия относительно сродства с гепарином между фракциями А, В и С ВК-ДВО пока не установлены, Аминокислотный и более подробный составы отличаются не очень сильно. Нельзя было также обнаружить каких-либо антигенных различий. Связывание с отрицательно заряженным гепарином, очевидно, не носит общей ионообменной природы, так как никаких различий между фракцией А и С не обнаружено при помощи ионообменной хроматографии и, кроме того, их изоэлектрические точки идентичны (pH 4.5).

Большинство типов клеток организма содержит сульфат гепарина и другие сульфатированные глюкозоаминогликаны на своих поверхностях. Возможно, что большая часть ВК-ДВО, содержащейся в тканях.

расположена на субстанциях клеточных мембран и соединительной ткани.

Пример 10. Инъекции 1251-меченой человеческой ВК-ДВО кроликам

ВК-ДВО пупочных канатиков метили иодом-125. Локализацию обнаруживали на хроматограмме в том же месте, что и для немечениой ВК-ДВО; этот факт показывает, что молекулярный размер не менялся.

Полученную в результате меченую ВК-ДВО подвергали хроматографии на гепарине-Сефарозе. Для последующих экспериментов использовали только материал, обладающий высоким сродством к гепарину.

Меченую ВК-ДВО вводили внутривенным способом кроликам, брали пробы крови с тем, чтобы определить радиоактивность, оставшуюся в плазме. Пробы плазмы осаждали с использованием трихлоруксусной кислоты, а радиоактивность определяли в протеиновых осадках, которые получали центрифугированием. Кроликам давали иодид в воду для питья с тем, чтобы предотвратить повторное введение метки в протеины в живом организме.

С тем, чтобы изучить действие гепарина, через различные промежутки времени кроликам вводили внутривенным способом гепарин (2500 ед.). 100% соответствует радиоактивности, которое плазма должна теоретически содержать при предположении, что общий объем плазмы у кроликов составляет 5% от их общего веса (например, кролик весом 3 кг содержит 150 мл плазмы).

После инъекции меченой ВК-ДВО обнаруживается быстрое снижение активности в течение 5-10 минут на примерно 15% от теоретического максимума. Когда делали инъекцию гепарина до введения ВК-ДВО. то почти вся ВК-ДВО активность сохранялась, имело место только медленное ее снижение. Когда гепарин в водил и-спустя 2, 5.10 и 20 минут после введения 125 1-ВК-ДВО, то ймело место быстрое увеличение радиоактивности и в области пика достигался теоретический максимум.

Пример 11. Анализ нативной ВКДВО пупочных канатиков и рекомбинант. ной ВК-ДВО на гепарине-Сефарозе.

Примерно 500 единиц (4,4 μ г) нативной ВК-ДВО С и рекомбинантной ВК-ДВО подвергали хроматографий на гепарине-Сефарозе, как это описано в примере 9. Было установлено, что оба фермента элюируются при 0,52 М в градиенте NaCl. Таким образом, нативная и рекомбинантная ВК-ДВО ведут себя идентично и этот результат показывает, что рекомбинантная ВК-ДВО имеет С-тип.

Пример 12. Содержание меди и цинка в молекуле ВК-ДВО.

Содержание меди и цинка в нативной ВК-ДВО пупочных канатиков й рекомбинантной ВК-ДВО определяли при помощи методов атомной спектрометрии поглощения в графитной горелке на установке Перкин-Элмер Химан 303 + ХГА. Сравнивали количество протеина ВК-ДВО, меди и цинка в препарациях. Было установлено, что один моль нативной ВК-ДВО (тетрамера) содержит 3,97 моля меди и 4,50 моля цинка. Рекомбинантная ВК-ДВО содержит 3,98 моля меди и 4,45 моля цинка на моль фермента. Результаты подтверждают, что молекула ВК-ДВО содержит четыре атома цинка.

П р и м е р 13. Получение моноклональных антител против человеческой ВК-ДВО.

Мышам делали инъекции ВК-ДВО С, полученной из пупочных канатиков (примеры 4-6). Спустя несколько месяцев, мышам делали инъекции ВК-ДВО три дня подряд. На четвертый день селезенки удаляли и измельчали. Клетки селезенки сливали с линией клеток миеломы в соответствии со стандартными приемами. Клоны, продуцирующие анти-ВК-ДВО. идентифицировали посредством техники 14ФА, а затем подвергали субклонированию. Чтобы получить антитела в больших количествах клоны “14, В7 и 6, Н6 выращивали в брюшной полости мыши. Антитела изолировали из асцитной жидкости при помощи адсорбции из Протеина А-Сефарозы.

Пример 14. Иммобилизация моноклональной анги-ВК-ДВО на CN ВЗ-активированной Сефарозе.

“6, Н6 моноклональное антитело связывает н-ВК-ДВО очень прочно (КД < 10¹² М). Антитело 14. В7 (Кд ~ 1Q° М) выбрали для очистки ВК-ДВО. Перед связыванием с CNBr - активированной Сефарозой азид в ( gG растворе должен быть удален, а буфер должен быть заменен на “соединяющий буфер (0,1 М карбоната натрия, pH 8,3, 0,5 М NaCI). Эту стадию осуществляли на клонне типа ПД10. CNBr- активированной Сефарозе давали возможность разбухнуть, добавляли в раствор IgG (в соединяющем буфере) в количестве 2 мг IgG на мл геля, инкубировали при комнатной температуре в течение примерно 2 часов на вибраторе. Буфер удаляли и анализировали на оставшийся протеин. Было получено более 97% связывание. Оставшиеся активные группы на JgG связывающем геле блокировали 1М этаноламином при pH 9,3 в течение 2 ч при комнатной температуре. Избыток этаноламина и адсорбированный протеин смывали попеременно “соединяющим буфером и 0.1 М ацетатом натрия, pH 4.0. 0.5 М NaCI. и так четыре-пять раз. Гель хранили в растворе 50 мМ фосфата калия. pH 7,4, 0.5 М NaCI 0,02% N2N3. Максимальную связывающую способность моноклональной IgG-Сефарозы определяли инкубированием в течение 3 ч в избытке очищенной ВК-ДВО и последующего анализа оставшейся ВКДВО-активности в верхнем слое после центрифугирования. Этот результат сравнивали с аналогичным инкубированием с использованием Сефарозы 4В.

В 1 мл ВК-ДВО в соединяющем буфере добавляли 10, 50, 100 и 1000 /г л 50% суспензии моноклональной анти-ВК-ДВОСефарозы, инкубировали в том же буфере 80% суспензии Сефарозы ХБ при комнатной температуре в течение 3 часов, центрифугровали, оставшиеся ВК-ДВО-активности определяли в верхнем слое. Используя полученные цифры, можно расчитать, что связывающая ВК-ДВО способность геля составляет примерно 6000 единиц ВК-ДВО на мл 50% суспензии геля (~ 12000 ед/мл геля). Эта цифра равна примерно 6% теоретической максимальной связывающей способности и близка к той, которую в общем случае достигаются при использовании случайно связанного IgG.

П р и м е р 15. Изоляция рекомбинантной ВК-ДВО при использовании на начальной стадии моноклональной антиВК-ДВО-Сефарозы

Процедуру очистки целиком осуществляли при температуре +4°С. % литров среды из культуры клеток СНО-К1/pPSHeo-18, содержащей 30^ единиц ВК-ДВО-активности (~2,6 μ г) на мл, центрифугируют с тем. чтобы удалить любые клеточные осколки и осадки. С тем, чтобы связать ВК-ДВО в среде (~ 1500000 единиц), использовали примерно 125 мл моноклональной анти-ВК-ДВО-Сефарозы. IgG-Сефарозой заполняли хроматографическую колонну диаметром 5 см и высотой примерно 6,5 см. Колонну промывали раствором 50 мМ фосфата натрия, 0,5 М NaCI', pH 7.0, перед нанесением пробы. Культуральную среду наносили на колонну и наблюдали поглощение в области 280 нм. Протеины, слабо связанные с IgG-Сефарозой, элюировали раствором 50 мМ фосфата натрия, pH 6,5, 0,5 М NaCI. Далее колонну промывали 650 мл 50 мМ АМП (1-аминометил-пропано/HCI, pH 9,0), а ВК-ДВО элюировали 50 мМ АМП-НС1, pH 9.0, Ί М KSCN. собирали ВКДВО-активностъ, На следующей стадии всю порцию разбавляли 14 объемами дистиллированной воды и титровали до pH 8,5 с ис пользованием 2 М АМП. Извлечение на стадии I gG - сродство составляло 60%.

мл ДЭАЭ-Сефасела промывали 50 мМ фосфата натрия, pH 6,5, упаковывали в хроматографическую колонну (0,5x5), Разбавленную порцию ВК-ДВО из JgG - колонны наносили на ДЭАЭ-Сефасел, колонну промывали раствором 50 мМ фосфата натрия, pH 8,5, до тех пор, пока поглощение в области 280 нм не станет близким к нулю. Элюцию проводили раствором 50 мМ фосфата натрия, pH 8,5, 0,25 М NaCI. Фракции собирали, подвергали диализу против 50 мМ фосфата натрия, pH 6,5. концентрировали до объема 6 мл. Выход на этой стадии составил 100%.

ВК-ДВО подвергали очистке на гепарине-Сефарозе. 12 мл гепарина-Сефарозы подготавливали и промывали 5. мМ фосфатом натрия, pH 6,5, 1М NaCI.’а затем 50 мМ фосфатом натрия, pH 6,5 и заполняли колонну. Концентрированную и отдиализованную фракцию (6 мл с ВК-ДВО-акгивностью примерно 185000 ед/мл) наносили на колонну, наблюдали поглощение в области 280 нм. Элюирование начинали с 50 мМ фосфата’ натрия, pH 6,5, когда поглощение в области 280 нм приближалось к координатной оси, ВК-ДВО элюировали градиентом NaCI от 0 М до 1 М, Объем градиента составлял 270 мл. Для того, чтобы защитить ВК-ДВО от воздействия высокой NaCI концентрации, фракции разбавляли (с начала подачи градиента) дистиллированной водой. Т-трубку вставляли в пластиковую трубу из выходного конца колонны и дистиллированную воду закачивали в элюирующую жидкость с объемной скоростью, превышающей в два раза скорость элюирования колонны.

ВК-ДВО-активность элюировали при той же концентрации NaCI, что и С-пик в примере 6. В центре этого пика элюат собирали (порция 1). Удельная активность порции 1 (ед/мл разделенное на АДгво) составила 88400. Удельная активность нативной ВК-ДВО, полученной из гомогената пупочного канатика (см. пример 1) при помощи такой же процедуры, составила 88200.

. Пример 16. Определение молекулярного размера нативной ВК-ДВО и рекомбинантной ВК-ДВО при помощи гелевой хроматографии.

Молекулярный вес нативного фермента .из пупочных канатиков и рекомбинантного фермента оценивали при помощи гель-хроматографии на Сефакрил С-300. Калибровку колонны проводили при помощи ферритина (440000), JgG (150000), альбумина бычей сыворотки (76000), яичного альбумина ’(43000), химотрипсиногена (25000) и рибонуклеазы (13700) (молекулярные веса указаны в скобках).

Нативную и рекомбинантную ВК-ДВО элюировали из колонны в положениях, соответствующих мол: м. 136000 и 151000, соответственно. Таким образом, рекомбинантная ВК-ДВО оказалась несколько больше. Часть такого отличия может быть вызвана частичной деградацией субблоков нативного фермента, как это можно видеть в ДВО-ПАГЕ-экспериментах, описанных ниже (пример 17).

Пример 17. Анализ нативной ВК-ДВО пупочных канатиков и рекомбинантной ВКДВО электрофорезом в градиентном полиакриламидном геле.

μ г каждого фермента сушили вымораживанием, растворяли в 50/< г смеси пробы, содержащей 5% сахарозы, 5 мМ ЭДТА, 5% 2-меркапт.оэтанола и 2% ДСН в буфере, состоящем из 0,4 М борной кислоты и 0,41 М Трис, pH 8,64. Пробы кипятили 5 мин и сразу же охлаждали на льду. 1 μ л (примерно 0,2 μ г) каждой пробы наносили на градиентный (10-15%) полиакриламидный гель и разгоняли в электрическом поле, окрашивали в Кумаси. Рекомбинантная ВК-ДВО имеет одну полосу с мол. м. примерно 32000. Нативная ВК-ДВО имеет две полосы, та, что больше, имеет очевидно тот же молекулярный вес, что и рекомбинантная ВК-ДВО, а та, что меньше, имеет мол. м. примерно 28000, что, вероятно, вызвано частичной деградацией фермента.

П р и м е р 18. Сравнение между аминокислотным составом нативной и рекомбинантной ВК-ДВО и аминокислотная последовательность, полученная из кДНКпоследовательности, кодирующей ВК-ДВО.

Аминокислотный состав нативной ВКДВО пупочных канатиков и рекомбинантной ВК-ДВО (триптофан не включен в это сравнение, так как он не может быть надежно получен в аминокислотном анализаторе) показал, что нативный и рекомбинантный ферменты почти идентичны по своему составу. Совпадение с числовыми данными, полученными из кДНК-последовательности, также очень хорошее, Эти результаты указывают на то, что нативный и рекомбинантный ферменты в сущности идентичны и что аминокислотная последовательность, полученная из кДНК-последовательности, является правильной.

Claims (1)

1. Формул дизобретения

   Способ получения внеклеточной перекисной дисмутазы человека, заключающийся в том, что конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pPS3-Heo 18, содержа33 щую фрагмент ДНК, кодирующий внекле- теризующуюся следующей нуклеотидной точную п1лгмитаз\/ высших окислов, и харак- последовательностью

   TrpThrClyGluAspSerAlаСЧиРгоДвпЗ»rA»pS*гА1BGluTrpIlеАгдАарМдV

   TGGACGGOCGAGOACTCGGCGGAOCCCAACTCTGACTCGGCOGAGTGGATCCGAOACATG

   ACCTGCCCGCTCCTGAOCCGCCTCGGGTTGAGACTGAGCCGCCTCACCTAOGCTCTaiAC

   30 40

   ΤυγΑΙaLygValThrCluTleTrpGlnGluValMetGlaArqArqAtpAspA»pQlyTh; TACGCCAAGGTCACGGAGATCTGGCAGOAGGTCATGCAGCOOCGGGACGACGACGGCACO ATCCGGTTCCAGTGCCTCTAGACCGTCCtCCAGTACGTCGCCGCCCTGCTGCTGCCGTGC

   50 60 LeuHlBAlaAJ BCvBGlnValGlnProSerAlaThrLtuABpAlaAlaGlnProArqVal CTCCACGCCGCCIOCCAGGTGCAGCCGTCGGCCACGCTGGACGCCGCGCAGCCCCGGGTfi GAGGTGCGGCGGACGGTCCACGTCGGCAGCCGGTOCGACCTGCGGCGCGTCGGGGCCCA^

   70 ' 8Q ThrGlyValValLeuPhgArgGlnLeuAlaPcoArgAlaLygLevAgpAlaPhePheAl gj accggcgtcgtcctcttccggcagcttgcgccccgcgccaagctcgacgccttcttUgcq TGGCCGCAGCAGGAGAAGGCCGTCGAACGCGGGGCGCGGTTCGAGCTGCGGAAGAAGCGa

   90 100 XteupltiGlyPhePioTJirGluProAsnSarSarSerArgAlalleHi вУа1H1gGlnPhg ,CTGGAGGGCTTCCCGACCGAGCCGAACAGCTCCAGCCGCGCCATCCACGTGCACCAGTTC IGACCTCCCGAAGGGCTGGCICGGCTTGTCGAGGTCGGCGCGGTAGGTGCACGTGGTCAAG

   110 120 GlvABpLeuSerGlnGlyCy»Glug»rThtGlyProHlBTyrAinProteuAlavalPro GGGGACCTGAGCCAGGGCTGCGAGTCCACCGGGCCCCACTACAACCCOCTGGCCGTGCCG CCCCTGGACTCGGTCCCGACGCTCAGGTGGCCCGGGGTGATGTTGGGCGACCGGCACGGC

   130 140 Hi SProGlnHiBProGlyAapPhaGlyABnPheAlaValArqABpGlyScr LeuTrpArq CACCCGCAGCACCCGGGCGACTTCGGCAACTTCGCGGTCCGCGACGGCAGCCTCTGGAGG CTGGGCGTCGTGGGCCCGCTGAAGCCGTTGAAGCGCCAGGGGCTGCCGTCGGAGACCTCC ^{g rLguA1} aGlyProRl в 5· r J1« Va 1G1 уАг q Al aval

   ATGGCW§§?S??rrSri^i^^GCGGG^^CGCACTCCATCGTGGG'CCGGGCCGTG __⁰⁰ 'CoGACCGG.GGA^CGAGCGCCCGGGCGTGAGCTAGCACCCGGCCCGGCACi

   160 V 170

   ValValValHisAlaGlyGluAspAspLeuGlyArgGlyGlyAsnGlnAlaSerValGlu

   GTGGTCGTCCACGCTGGCGAGGACGACCTGGGCCGCGGCGGCAACCAGGCCAGCGTGGAG

   CACCAGCAGGTGCGACCGCTCCTGCTGGACCCGGCGCCGCCGTTGGTCCGGTCGCACCTC

   180 190 .

   A s nGl yAs nAl a G1 у A r g A r g LeuAlaCysCysValValGlvValCysGlv P roGlyLau

   AACGGGAACGCGGG C CGGCGGCTGGCCTGCTGCGXSgTGGGCGTGTGCGGGCCCGGG CTC ' TTGCCCTTGCGCCCGGCCGCCGACCGGACGACGCACCACCCGCACACGCCCGGGCCCGAG 720

   200 210 : TrpGluArgGlnAlaArgGluHisSerGluArgLysLysArgArgArgGluSerGluCys TGGGAGCGCCAGGCGCGGGAGCACTCAGAGCGCAAGAAGCGGCGGCGCGAGAGCGAGTGC .ACCCTCGCGGTCCGCGCCCTCGTGAGTCTCGCGTTCTTCGCCGCCGCGCTCTCGCTCACG . 780

   220

   LysAlaAla*** . AAGGCCGCCTGAGCGCGGCCCCCACCCGGCGGCGGCCAGGGACCCCCGAGGCCQC.CCTCT <35 трансформируют полученной ДНК линии ванные клетки с последующим выделением клеток СНО, культивируют трансформиро- и очисткой целевого продукта.

   Разделение ВК-ДВО-плазмы на фракции А, В и С ВК-ДВО, ед/мл плазмы

   Возраст/пол Фракции А В С 40/самец 5,9 6,2 7,0 34/самец 5.2 4,4 5,1 32/самец 2.3 5,2 6,4 33/самка 2,3 5,9 8,3 29/самка 3.3 6,1 7,3 Среднее значение ± ст. откл. 3,5 ±1,5 5,6 ± 0,8 6,8 ± 1,2