PT84387B - Processo para a preparacao de superoxido-dismutase e de vectores e linhas de celulas que a segregam - Google Patents

Description

A presente invenção refere-se ao processo de prepa jração de superóxido dismutase e à sua utilização para fins terapêuticos.

No corpo humano existem forças motrizes termodinâmicas muito fortes para as reacções entre o oxigénio e os compostos bioquímicos, como por exemplo proteínas, hidratos \ de carbono, lípidos e ácidos nucleicos. Se essas reacções fo 'rem completas formam-se como produtos finais agua, dióxido 'de carbono e produtos residuais em conjunto com a libertação ide grandes quantidades de energia. A fonte de energia dos or ganismos vivos é a oxidação dos compostos biológicos.

Felizmente essas reacções ocorrem de forma espontâ nea muito lentamente devido às barreiras reaccionais. Estas barreiras são vencidas pelas enzimas no metabolismo intermei·diário e a reacção final com o oxigénio toma lugar nos mitojcôndrios, onde o oxigénio é reduzido a água por quatro elecitroes sem libertação de quaisquer produtos intermediários. A ^! reacção é acompanhada pelo complexo citocromo oxidase na cor ! rente de transporte de electrÕes e a energia é controlada pe: formação de ATP.

Porém a redução directa em quatro passos de oxigéI nio a água é quase invulgar e quando o oxigénio reage esponI j j taneamente ou e catalisado por enzimas ou e forçado e reagir ^! num só passo de cada vez por razoes de mecanismo (as reacções \ catalisadas por enzimas necessitam algumas vezes de dois pas i'sos). Forma-se uma série de produtos intermediários reactiI i

-Ί i

il Π i í il i

I

La _ J _ vos e tóxicos, nomeadamente o radical superóxido (Og*), peréxido de hidrogénio (H^O^) e o radical hidroxilo (OH*“)

nessa ordem,	que se apresenta a seguir:
e o2 —>	°2*~θ +“* Η2°2θ 0H* θ ^2°
radical de	peróxido radical
superóxido	de hidrogjé hidroxilo
aniónico	nio

Dois deste, 0₂*“ e OH*”, têm electrões desempare) lhados e são por esse motivo chamados radicais livres. Esti mou-se que uma pequena percentagem do consumo de oxigénio no corpo conduz à formação de produtos intermediários de re dução tóxicos. Os efeitos tóxicos do oxigénio são principal mente imputáveis às acções destes produtos intermediários.

I 0 oxigénio em si reage lentamente com a maior par te dos compostos bioquímicos. As reacções tóxicas são em ge ral iniciadas por processos que dão origem a radicais de í oxigénio que em si mesmos causam prejuízo directo aos comj postos bioquímicos ou iniciam reacções em cadeia envolvendo oxigénio.

Alguns compostos reagem espontaneamente com o oxi I génio, isto é, auto-oxidam-se. Virtualmente as auto-oxidaμ ! ções têm como consequência a formação de produtos interme! diários tóxicos de redução do oxigénio. A auto-oxidação da adrenalina, pirogalhol e vários outros compostos conduz à formação do radical superóxido. 0 radical superóxido é também libertado quando a met-hemoglobina se forma a partir da oxi-hemoglobina. Além disso, algumas oxidases formam supero i xido. Destas enzimas, a mais importante é a xantina oxidase ' que oxida a hipoxantina e a xantina transformando-as em áci i do úrico. Uma pequena parte da redução do oxigénio nas mito _J condrias conduz à formação de superóxido e subsequentemente

de peróxido de hidrogénio. O sistema citocromomicrossomal Ρ^θ também liberta superóxido. Quando uma radiação ionizadora passa através de uma solução aquosa contendo oxigénio, o radical superóxido é o radical formado de concentração mais elevada. Por activação de lencócitos de fagocitose (polimorfonucleares, monécitos, macrófagos, eosinofilos) libertam-se grandes quantidades de superóxido. Os produtos tóxicos de re dução do exigénio assim formados são de importância fundamental para a capacidade de eliminação das células, mas podem também conduzir â danificação dos tecidos vizinhos.

peróxido de hidrogénio forma-se também sempre quando o superóxido se forma a partir da reacção de dismutaçao. A maior parte das oxidases reduzem directamente o oxigé nio, no corpo, para peróxido de hidrogénio.

produto intermediário mais reactivo é o radical hidroxilo que pode ser formado quando o peróxido de hidrogénio reage com iões Pe^⁺ ou Cu⁺, a chamada reacção de Penton.

H₂0₂ + Fe²⁺ —> Fe³⁺ + OH* + OH (Cu⁺) (Cu²⁺)

Estes iões de metais de transição podem também catalisar a reacção entre o peróxido de hidrogénio e o superóxido, conduzindo à produção do radical hidroxilo, a chamada reacção de Haber-Weiss.

, Pe

Cu

I __ ^H2°2 ⁺ °2* --* ^Οϊί* ^{+ +} θ2 ! A radiação ionizadora ionizadora decompõe a água com formação de átomos de hidrogénio e radicais hidroxilo.

Os radicais hidroxilo assim formados são responsáveis pela maior parte dos prejuízos biológicos provocados pelas radia—jições ionizadoras.

— í, - ~ *

Parece que, pela descrição anterior, os vários pro dutos de redução de oxigénio são normalmente formados ao mes mo tempo. No sistema xantina oxidase, por exemplo, não se forma sÓ 0 superóxido mas também 0 peróxido de hidrogénio, ambos directamente e por dismutação do superóxido. Estes com postos podem depois reagir para formar 0 radical hidroxilo. 0 sistema xantina oxidase pode demonstrar-se que danifica proteínas, hidratos de carbono e ácidos nucleicos deteriora dos e elimina células. Dos compostos bioquímicos os lípidos poli-insaturados parecem ser os mais sensíveis à toxicidade do oxigénio. Os produtos intermediários de oxigénio podem ini ciar reacções em cadeia envolvendo oxigénio molecular, a cha mada peroxidação de lípidos. Os hidro-peróxidos lípidos assim somente compre também deterio formados e os seus produtos de degradação não metem a função das membranas das células como ram outros componentes das células.

Os organismos que vivem na presença de oxigénio foram forçados a desenvolver um número de mecanismos de pro tecção contra os metabólitos tóxicos da redução do oxigénio, Os factores de protecção incluem superóxido dismutases (SOD^ que fazem a dismutação do radical superóxido e são encontradas em quantidaes relativamente constantes nas células e te eidos dos mamíferos. A mais conhecida destas enzimas é CuZn SOD que é um dímero com um peso molecular de 33000 contendo dois átomos de cobre e dois átomos de zinco. A CuZn SOD é encontrada no citosol e no espaço inter-membranas das mitocóndrias. Mn SOD é um tetrâmero com um peso molecular de 85000 contendo 4 átomos de Mn e localizada principalmente na matriz das mitocóndrias. Até há pouco tempo considerou-se que os fluídos extracelulares nao possuíam actividade SOD.

Contudo, os presentes inventores demonstraram recentemente a presença de uma superóxido dismutase em fluídoi

extracelulares (por exemplo, sangue, plasma, linfa, fluído sinovial e fluído cerebrospinal) que foi designada EC-SOD (superóxido dismutase extracelular). Nos seres humanos, a actívidade por ml de plasma é menor que 1% da actívidade to tal SOD por g de tecido, mas parece ser activamente regulado pelo corpo (Mark-lund et al., Clin. Chim. Acta 126, 1982 j pp. 41-51). A afinidade para lectinas (Exemplo 12) indica ' que contrariamente à CuZn SOD a enzima é uma glicoproteína.

Parece ser constituída por quatro sub-unidades iguais não covalentemente ligadas com um peso molecular total (tetrãme ro) de 155000 e contendo um átomo de Cu e um átomo de Zn por sub-unidade como teor metálico (Exemplo 14). A enzima catalisa uma dismutação de 12 ordem do radical superóxido tal como o fazem outras SODs contendo Cu.

SOD

A actívidade específica é muito elevada e é prova ! velmente imediata pelos quatro átomos de Cu da molécula.

i Através de cromatografia em heparina - Sefarose^k , a enzima é dividida em três fracções, A sem qualquer afinidade, B com uma afinidade fraca e C com uma afinidade de heparina forte. Ao contrário do comportamento de EC-SOD, CuZn SOD e Mn SOD não se ligam à heparina - Sefarose^. A enzima tem um certo carácter hidrofóbico que pode indicar uma afinidaI de para as membranas das células. A afinidade para a hepari na muitas vezes indica afinidade para o sulfato de heparano que se encontra nas superfícies das células, especialmente no endotélio dos vasos. Pode-se, portanto, supor que a EC-SOD está localizada parcialmente nas superfícies das células e parcialmente nos fluídos extracelulares (Exemplos 9”1-

I a seguir). A composição de aminocícidos e a reactividade an i tigénica são praticamente contrárias às das iso-enzimas SOD

investigadas até agora (Marklund, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 79, 1982, pp. 7634-7638; Biochem. J. 220, 1984, pp. 269-272) jO RNA mensageiro que codifica para EC-SOD compreende uma seíquência que codifica para um peptideo de sinal (Exemplo B), indicando que EC-SOD é uma proteína segregada. 0 mRKA que co jdifica para CuZn SOU, por outro lado, não compreende essa se quência que codifica para um peptideo de sinal. Além disso, a sequência dos aminoácidos de EC-SOD é diferente da sequência dos aminoácidos das outras iso-enzimas SOB. A EO-SOD tem -se verificado que existe no plasma de todas as espécies de ^mamíferos examinadas (Marklund, J. Clin. Invest. 74, 1984, pp. 1398-1403: Biochem. J. 222, 1984, pag. 649-655) bem como em aves e peixes. 0 teor varia largamente entre as especies, mas em cada espécie a variação é muito pequena. 0 plasma dos [roedores contem 10 a 20 vezes mais EC-SOD que o plasma huma!no que contém comparativamente pouco EC-SOD. A EC-SOD tem 'também sido encontrada em todos os diferentes tipos de teci dos animais (Marklund, J. Clin. Invest. 74, 1984, pp. 1398-1403: Biochem. J. 222, 1984, pag. 649-655). Nos tecidos, as diferenças entre as espécies são muito menores. 0 nível de EC-SOD nos tecidos (unidades por grama de peso molhado) é maior do que o nível de EC-SOD de plasma em seres humanos.

Dos roedores, o tecido e o plasma contêm aproximadamente qua.i jtidades iguais de EC-SOD (Marklund, Biochem. J. 222, 1984, [pag. 649-655).

A actividade das SOD torna-as candidatas interessantes a agentes terapêuticos para contrariar os efeitos té xicos do suneróxido e de outros radicais de oxigénio.

Devido ao baixo nível atrás mencionado da activida de de SOD nos fluídos extracelulares, os componentes existen ^!tes nos referidos fluídos e nas superfícies das células são !de longe muito menos protegidos contra os radicais de supero xido que no interior das células. A EC-SOD constitui portanto

iuma substância particularmente interessante para aplicações ; terapêuticas em ligação com a produção do radical superóxido extracelular.

Seria portanto vantajoso proporcionar EC-SOD em iquantidades suficientes para aplicações terapêuticas a par!

!tir de uma fonte facilmente disponível. Essas fontes que com ipreendem fundamentalmente tipos específicos de células, não íforam sugeridas ou descritas previamente.

ji

I Por este motivo, a presente invenção refere-se, i

i num aspecto importante, à EC-SOD de origem recombinante. No j presente contexto o termo recombinante e utilizado para in dicar que a EC-SOD deriva de uma célula que foi submetida a í _z J ;técnicas de DNA recombinante, isto e, nas quais a sequencia i de DNA que codifica para EC-SOD foi inserida e que subsequen temente tenha introduzido a expressar EC-SOD. Mais particularmente, a invenção refere-se a EC-SOD que tem uma estrutura polipeptídica codificada pela seguinte sequência de DNA.

yj ’ .7

TrpThrGlyGluABpSarAlaOluProAgnSarABpSarAlaGluTrpIltArqAapMat TGGACGGGCGAGGACTCGGCGGAGCCCAACTCTGACTCGGCGGAGTGGATCCGAGACATG ACCTGCCCGCTCCTGAGCCGCCTCGGGTTGAGACTGAGCCGCCTCACCTAGGCTCTOTAC

40 yvrAlaLvsValThrGlutleTrpGlnGluvalMetGlnArqArgAspAspAspGlyThr TACGCCAAGGTCACGGAGATCTGGCAGGAGGTCATGCAGCGGCGGGACGACGACGGCACG ATGCGGTTCCAGTGCCTCTAGACCGTCCTCCAGTACGTCGCCGCCCTGCTGCTGCCGTGC | 50 60

LeuHisAlaAlaCvaGlnValGlnProSarAlaThrLauAipAlaAlaGlnProArqVal

CTCCACGCCGCCTGCCAGGTGCAGCCGTCGGCCACGCTGGACGCCGCGCAGCCCCGÔGTG

GAGGTGCGGCGGACGGTCCACGTCGGCAGCCGGTGCGACCTGCGGCGCGTCGGGGCCCAC

80 ThrGlyValv&lLeuPheArgGlnLeuAlaProAr gAlaLyBLauABpAlaPhePheAla ACCGGCGTCGTCCTCTTCCGGCAGCTTGCGCCCCGCGCCÀAGCTCGACGCCTTCTTCGCC TGGCCGCAGCAGGAGAAGGCCGTCGAACGCGGGGCGCGGTTCGAGCTGCGGAAGAAGCGG

100 _rfreuGluGlyPheProThrGlyProAsnSarStrSerArgAlalleHisValBiaGlnPhe CTGGAGGGCTTCCCGACCGAGCCGAACAGCTCCAGCCGCGCCATCCACGTGCACCAGTTC GACÇTCCCGAAGGGCTGGCTCGGCTTGTCGAGGTCGGCGCGGTAGGTGCACGTGGTCAAG

110 120 G1vAspLeuSerGlnGlyÇyBGluãarThtGlyPr oH1b TyrAenProLauAlava1P ro ggggacctgagccagggctGcgãgtccaccgggccccactacaacccgctggccotgccg CCCCTGGACTCGGTCCCGACGCTCAGGTGGCCCGGGGTGATGTTGGGCGACCGGCACGGC

130 140 Hi BProGlnHiaProGlyABDPhaGlyAanPhaAlaValArqABDGlySetLeuTrpAíg CACCCGCAGCACCCGGGCGACTTCGGCAACTTCGCGGTCCGCGACGGCAGCCTCTGGAGG GTGGGCGTCGTGGGCCCGCTGAAGCCGTTGAAGCGCCAGGCGCTGCCGTCGGAGACCTCC

150 160 Ty r A r gAlaGly LeuAlaAlaSerLeuAlaGlyProHigSTllaValGlyA r gAlaVa1 TACCGCGCCGGCCTGGCCGCCTCGCTCGCGGGCCCGCACTCCATCGTGGGCCGGGCCGTG ATGGCGCGGCCGGACCGGCGGAGCGAGCGCCCGGGCGTGAGGTAGCACCCGGCCCGGCAC

170 180 valvalHisAlaGlyGluABpAspLeuGlyArgGlyGlyAsnGlnAlaservalGluAin GTCGTCCACGCTGGCGAGGACGACCTGGGCCGCGGCGGCAACCAGGCCAGCGTGGAGAAC CAGCAGGTGCGACCGCTCCTGCTGGACCCGGCGCCGCCGTTGGTCCGGTCGCACCTCTTG

190 200 G1y ΑεnAlaG1yA r gArgLauAlaCvsCy$ValValGlyValCytGlyPr oGlyLeuT r p ôggaacocgggccggcggctggcctgctgcgtggtgggcgtgtgcgggcccgggctctgg CCCTTGCGCCCGGCCGCCGACCGGACGACGCACCACCCGCACACGCCCGGGCCCGAGACC

210 220

GluArgGlnAlaArgGluHiaSerGluArgLyiLyaArgArgArgGluSerGluCyíLys GAGCGCCAGGCGCGGGAGCACTCAGAGCGCAAGAAGCGGCGGCGCGAGAGCGAGTGCAAG CTCGCGGTCCGCGCCCTCOTGAGTCTCGCGTTCTTCGCCGCCGCGCTCTCGCTCACGTTC

Al&Ala

GCCGCC CGGCÔG f / ^'7 ·*ί lj L i.

ou qualquer modificação que codifica para um polipeptídeo ίque tem a propriedade de dismutação do superóxido da EC-SOD natural. Deve notar-se que a sequência de aminoácidos derivada da sequência de DNA é apresentada por cima da sequência de DNA. Como exemplos de modificações apropriadas da sequência de DNA são as substituições de nucleótidos que não dão origem a uma outra sequência de aminoácidos da proteína, mas que, por exemplo correspondem à utilização do codão do organismo específico no qual se insere a sequência; as substitui çÕes de nucleótidos que dão origem a uma sequência de aminoácidos diferente e, portanto, possivelmente originam uma estrutura da proteína diferente sem, contudo, prejudicar a pro priedade crítica da dismutação do radical superóxido; uma sub-sequência da sequência atrás referida que codifica para um polipeptídeo que reteve a propriedade de dismutação do superóxido da proteína natural; ou uma sequência de DNA hibridan do para pelo menos uma parte de uma amostra de DNA preparada com base na sequência apresentada acima, desde que codifique para um polipeptídeo que tem a propriedade biológica da dismutação do radical superóxido da proteína natural. Neste cor texto, deve-se notar que a expressão “propriedade da dismuta ção de superóxido da EC-SOD natural e expressões relacionadas devem ser entendidas como sendo qualitativas em vez de ^quantitativas, isto é, referindo-se à natureza em vez do nível de actividade do polipeptídeo.

¹ A sequência de DNA que codifica para EC-SOD ou res pectivas modificações ou derivados como se definiu atrás pode ser de origem de DNA (cDNA) complementar, isto é, obtida ipela preparação de uma cultura de cDNA com base em mRNA a ' partir de células que produzem EC-SOD através de vectores Ι terminais de métodos padrões estabelecidos. As experiências de hibridaçao podem então ser levadas a efeito utilizando , oligonucleótidos sintéticos como amostra para identificar a

~,'7 Çru í* sequência de cDEA codificando para EC-SOD. Alternativamente, a sequência de DITA pode ser de origem genómica, isto é, derivada directamente de um genoma celular, por exemplo, por protecção das sequências genómicas hibridando para uma amos tra de DNA preparada com base da sequência de aminoácido parcial ou total de EC-SOD encontrada, por exemplo, no teci do, de acordo com os métodos convencionais; veja-se o Exemplo 8 para uma descrição mais detalhada do processo geral. 0 DEA genómico difere do cDEA, por exemplo, por conter ele‘ mentos de controlo transcricional e os chamados intrões que ί são sequências não codificantes dentro da sequência de DEA ί codificante, sendo o seu significado, presentemente, obscuro. I O cDEA. e o DEA genómico podem ser de origem animal, em particular dos mamíferos. Para fins terapêuticos envolvendos seres humanos, prefere-se geralmente que a EC-SOD seja EC-SOD codificada por uma sequência de DEA de origem humana, de forma a evitar substancialmente reacções imunes adversas não desejáveis.

A sequência de DEA pode também ser de origem sintó tica, isto é, preparada sinteticamente por métodos padrão estabelecidos, por exemplo como descreveu fêatthes et al. EMBO Journal 5» 1984, pág. 801-805· Finalmente, a sequência de DEA pode ser de origem sintética e genómica mista, de or, gem genómica e cDEA mista ou de origem de cDEA e sintética mista preparada por ligação conjunta de fragmentos de DITA, de cDEA, de origem sintética ou genómica (como for apropriado), fragmentos de DEA esses que compreendem parte do gene que codifica para EC-SOD, de acordo com métodos padrão.

Embora a EC-SOD de origem recombinante seja, de acordo com a presente invenção, preferida porque é facilmen te disponível em grandes quantidades, a EC-SOD está também disponível a partir de outras fontes. Deste modo, a invenção descreve também a EC-SOD de origem de linha celular, isto e derivada de uma linha celular

que produz a proteína em quan;i dades significativas, por exemplo uma linha de células deri vada do sangue ou pulmão, vasos sanguíneos, pâncreas, útero.

glândula da próstata, placenta ou tecido do cordão umbilical, possivelmente, tecido neoplástico. As células endoteli ais ou fibroblastos são presentemente fontes possíveis de

EC-SOD.

Finalmente, a EC-SOD pode ser também derivada de tecido relativamente rico em EC-SOD. Em consequência, a pre sente invenção descreve também a EC-SOD de origem da placen ta ou cordão umbilical porque estes tecidos têm sido forma dos para conter quantidades razoavelmente grandes de EC-SOD comparadas com outros tecidos, e são também mais facilmente utilizáveis do que, por exemplo, o tecido do pulmão, útero ou pâncreas. Deve acentuar-se contudo, que apesar destes te eidos conterem quantidades relativamente grandes de EC-SOD, são quantidades muito mais pequenas do que as que se obtêm por técnicas de DNA recombinante, e, portanto a EC-SOD da placenta ou do cordão umbilical é particularmente indicada para fins especiais que necessitam apenas de quantidades me nores de EC-SOD.

Num outro aspecto, a presente invenção refere-se a um vector de expressão replicável que compreende uma sequência de DNA que codifica para EC-SOD. No presente contex to, o termo replicável significa que o vector é capaz de replicar num determinado tipo de célula hospedeira onde ti nha sido introduzido. 0 vector pode ser um vector que contém a sequência de DNA apresentada atrás ou qualquer modifi cação apropriada como se descreveu atrás. Imediatamente a montante desta sequência (a sequência que codifica de EC-SOD) pode-se proporcionar uma sequência que codifica para um peg tídeo marcado, cuja presença assegura a secreção da EC-SOD expressa pelas células hospedeiras que acolhem o vector. A sequência marcada pode, por exemplo, ser a seguinte sequência:

I

-16 -10 -1 MetLeuAlaLeuLeuCyíSerCyBLeuLeuLeuAliAlaGlyAlaSerAepAla Ϊ atGCTGGCGCTACTGTGTTCCTGCCTGCTCCTGGCAGCCGGTGCCTCGGAC GCC

TACGACCGCGATGACACAAGGACGGACGAGGACCGTCGGCCACGGAGCCTG CGG i 120

Deve-se notar que esta sequência marcada (e o peptídeo marcado codificado por ela) constitui ela própria um aspecto da invenção e verifica-se que pode ser inserida em a montani te das sequências de DNA que codificam para outras proteínas : ou peptideos de forma a obter secreção dos produtos resultan tes a partir das células.

ί O vector pode ser qualquer vector que ter±ha a posi ; sibilidade de ser submetido convenientemente aos processos de DITA recombinante, e a escolha do vector dependerá muitas jvezes da célula hospedeira onde vai ser introduzido. Deste ϊ modo, o vector pode ser um vector replicável de forma autó! noma, isto é, um vector que existe como uma entidade extra ; cromossómica cuja replicação é independente da replicação ! cromossómica; são exemplos de tal vector um plasmídeo, um bacteriófago, um cósmídeo, um mini-cromossoma ou um vírus.

Alternativamente, o vector pode ser um vector que, quando introduzido numa,célula hospedeira, é integrado no genoma da i célula hospedeira replicável em conjunto com o cromossoma ou los cromossomas onde foi integrado.

Num outro aspecto, a invenção refere-se a uma linha de células que é capaz de segregar EC-SOD. Embora várias linhas de células humanas derivadas de uma grande variedade de células de tecido bem como de linhas de células de tumores tenham sido previamente analisadas relativamente ao seu conteúdo de EG-SGD (ver Llarklund, J. Glin. Invest. /4, Outubro 1984, pag. 1398-14OJ), não se chegou a resultados conclu

dentes. Apesar de ter sido mencionado que quantidades menores de EC-SOD tinham sido encontradas nalgumas das linhas de células investigadas, os dados apresentados na tabela II do artigo não são significativos e igualmente podiam ser ím putáveis a um erro analítico. Certamente que, um perito na matéria não concluiria, com base nos dados apresentados ne_s ta publicação, que algumas das linhas de células testadas no conteúdo de EC-SOD pudessem possivelmente produzir EC-SOD como uma proteína segregada porque não há nenhuma indi cação dessa possibilidade no artigo.

A linha de células pode ser derivada de mamíferosl em particular, de seres humanos. Prefere-se que a linha de células produza, particularmente, grandes quantidades (com· parada com outras células) de EC-SOD. Deste modo, a linha de células pode derivar do tecido do sangue ou do pulmão, pele, vaso sanguíneo, pâncreas, útero, glândula da próstata placenta ou cordão umbilical ou possivelmente tecido neoplás tico. Em particular, espera-se que as linhas de células de rivadas dos fibroblastos ou das células endoteliais sejam '1

II i| i

especialmente vantajosas como fontes de EC-SOD, porque sao derivadas de células directamente expostas ao espaço extra celular que se podem considerar como necessitadas da protec ção conferida pela EC-SOD em virtude dos radicais de supero xido presentes ou gerados num meio extracelular.

A presente invenção refere-se ainda a uma célula que acolhe um vector de expressão replicável como se definiu atrás. Por princípio, esta célula pode ser qualquer tipo de célula, isto é, uma célula procariótica como por exem pio, uma bactéria, um organismo eucariótico unicelular, um fungo ou uma levedura, uma célula derivada de um organismo multicelular, por exemplo, um animal ou uma planta. Acredita-se, porém, que uma célula de um mamífero pode ser particularmente capaz de expressar EC-SOD que é, afinal, uma mo-

lécula altamente complexa que células de organismos podem não ser capazes de produzir. Um exemplo dessa inferior

célula é

CHO-Kl/pPS3iieO”18 depositada em 2? de Agosto de 1986, na European Collection of Animal Cell Cultures sob o número EC ACC

86082701.

A invenção refere-se também a um fragmento de DNA que codifica EC-SOD e que tem a seguinte sequência de DNA:

-18 -10

MetLeuAlaLeuLeuCyaSerCysLauLeuLeuAlaAlaGlyAlaSerABp

ATGCTGGCGCTACTGTGTTCCTGCCTGCTCCTGGCAGCCGGTGCCTCGGAC TACGACCGCGATGACACAAGGACGGACGAGGACCGTCGGCCACGGAGCCTG

120

-1 41 10

AlaTrpThrGlyGluAspSferAlaGluProAanSerAspSerAlaGluTrpIleArgAsp GCCIGGACGGGCGAGGACICGSCGGAGCCCKACTCTGACTCGGCGGAGTGGATCCGAGAC cggacctgcccgctcctgagccgcctcgggttgagactgagccgcctcacctaggctctg

180 ί 20 30

MetTyrAlaLyjs ValThrGlu!leTrpGlnGluValMetGlnA rgArqAEpAspAapGly atgtacgccaaggtcacggagatctggcaggaggtcatgcagcggcgggacgacgacggc tacatgcggttccagigcctctagaccgtcctccagtacgtcgccgccctgctgctgccg

240

50

ThrLeuHlsAlaAlaCysGlnValGlnProSerAlaThrLeuAspAlBAlaGlnProArg acgctccacgccgccítgccaggtgcagccgtcggccacgctggacgccgcgcagccccgg TGCGAGGTGCGGCGGACGGTCCACGTCGGCAGCCGGTGCGACCTGCGGCGCGTCGGGGCC 300

0'7 cp; ί' τ

70

ValThrGlyValvalLeuPheArgGlnLeuAlaProAr qAlaLygLeuAepAlaPhePhe GTGACCGGCGTCGTCCTCTTCCGGCAGCTTGCGCCCCGCGCCAAGCTCGACGCCTTCTTC CACTGGCCGCAGCAGGAGAAGGCCGTCGAACGCGGGGCGCGGTTCGâGCTGCGGAAGAAG

360

BO 90

AlaLeuG1uG1y Phe P roTh rG1uP r οΑβ n S·r S e r 5 e rA r qAlaIleHi»ValHi«Gln GCCCTGGAGGGCTTCCCGACCGAGCCGAACAGCTCCAGCCGCGCCATCCACGTGCACCAG cgggacctcccgaagggctggctcggcttgtcgaggtcggcgcggtaggtgcacgtggtc

420

100 110 fheGlyAspLeuSeiGlnGlyCysGluSerThrGlyProHi »TyrAanProteuAlaVal

TTCGGGGACCTGAGCCAGGGCTGCGÀGTCCACCGGGCCCCACTACAACCCGCTGGCCGTG AAGCCCCTGGACTCGGTCCCGACGCTCAGGTGGCCCGGGGTGATGTT5GGCGACCGGCAC

S 480

120 130

FroHisProGlnHisProGlyAspPhaGlyAsnPheAlaValArqAspGlySerLeuTrp

CCGCACCCGCAGCACCCGGGCGACTTCGGCAACTTCGCGGTCCGCGACGGCAGCCTCTGG GGCGTGGGCGTCGTGGGCCCGCTGAAGCCGTTGAAGCGCCAGGCGCTGCCGTCGGAGACC

540

140 150

ArqTytAr qAlaGlvLeuAlaAlaSerLeuAlaGlyProHisSerllevalGlyAr gAla AGGTACCGCGCCGGCCTGGCCGCCTCGCTCGCGGGCCCGCACTCCATCGTGGGCCGGGCC TCCATGGCGCGGCCGGACCGGCGGAGCGAGCGCCCGGGCGTGAGGTAGCACCCGGCCCGG

600

160 170

ValValValHlsAlaGlyGluAipAipLeuGlyArgGiyGlyAsnGlnAlasarValGlu gtggtcgtccacgctggcgaogacgacctgggccgcggcggcaaccaggccagcgtggag CACCAGCAGGTGCGACCGCTCCTGCTGGACCCGGCGCCGCCGTTGGTCCGGTCGCACCTC 660

-’/,7

ieo iw

AtnGlyAt nAl aGl yA t gAr qLeuAlaCytCya yalValGlyValCyBGlyP r oGlyLau aacgggaacgcgggccggcggctggcctgctgcgtggtgggcgtgtgcgggcccgggctc ttgcccttgcgcccggccgccgaccggacgacgcaccacccgcacacgcccgggcccgag 720

200 210

TrpGluArgGlnAlaArgGluHiaSerGluArgLysLysArgArgArgGluSerGluCya tgggagcgccaggcgcgggagcactcagagcgcaagaagcggcggcgcoagagcgagtgc ACCCTCGCGGTCCGCGCCCTCGTGAGTCTCGCGTTCTTCGCCGCCGCGCTCTCGCTCACG «a ⁷⁰⁰

220

LyaAlaAla*** aaggccgcctga

TTCCGGCGGACT cia

Deve ser notado que esta sequência inclui a sequên que codifica o peptídeo do sinal acima representada.

A sequência do sinal estende-se a partir do amino-1. A sequência codificando para a EC-SOD mainiciada no aminoácido +1.

ácido -18 até dura é

A sequência de DNA pode ser de 'origem do cDNA, geou sintética ou de origem mista cDKA e sintética a genómica como se descreveu atrás. Ainda num outro asnémica cDNA e pecto importante, a presente invenção refere-se a um método ; de produção de EC-rSOD, em que uma linha de células que proi _t 'duz EC-SOD e desenvolvida sob condiçoes que asseguram a secreção de EC-SOD. A linha de células pode derivar de quaisquer das origens mencionadas atrás. As células dos mamíferos que produzem EC-SOD podem ser identificadas por meios imunoί -histoquímicos, através dos anticorpos dirigidos contra a EC·· í-SOD, ou por análise da EC-SOD segregada para o meio em que células específicas são cultivadas. As células podem desenvolver-se em meios convencionais, adaptados à propagação das linhas de células, por um método conhecido per si.

ι Como se citou atrás, a EC-SOD apresenta uma afiniί dade para a heparina que indica uma afinidade para o sulfa! to de heparano ou outros glucose-aminoglucanos semelhantes ΐ à heparina encontrados nas superfícies das células, especial ímente na superfície das células endoteliais. Considera-se, c as portanto, possível induzir a libertação de EC-SOD a partir superfícies de células e desta forma assegurar um rendimento melhorado de EC-SOD, por desenvolvimento das células de tecido das linhas de células que produzem EC-SOD, num meio contendo heparina ou um análogo da heparina, por exemplo, ! sulfato de heparano ou outro glucose-aminoglucano sulfatado, ^! sulfato de dextrano ou outro composto fortemente carregado negativamente, numa quantidade que é suficiente para induzix a libertação de EC-SOD a partir das superfícies das células (ver Exemplo 9-11).

; Num outro aspecto importante, a invenção refere-se a um método de produção de EC-SOD, em que se insere um fragmento de DNA compreendendo uma sequência DITA, codificando ’ para EC-SOD, num vector que é capaz de se replicar numa célula hospedeira específica, o vector recombinante resultante é introduzido numa célula hospedeira que é desenvolvida num meio de cultura apropriado, sob condições apropriadas ipara a expressão de EC-SOD e a EC-SOD é recuperada. 0 meio ['utilizado para desenvolver as células, pode ser qualquer ! meio convencional apropriado para esse fim, mas pode ser neI' cessário adicionar Cu e/ou Zn extra para a síntese de EC-SOI, [ especialmente se ela tiver de ser produzida em quantidades i aumentadas. Um vector apropriado pode ser um qualquer dos ; vectores descritos atrás e uma célula hospedeira apropriada pode ser uma célula de quaisquer dos tipos de células citai dos atrás. Os métodos empregados para construir o vector e í efectuar a sua introdução na célula hospedeira podem ser i quaisquer métodos conhecidos para tal fim dentro do domínio

do DNA recombinante. A EO-SOD expressa pelas células pode ser segregada, isto é, feita passar através da membrana da célula dependendo do tipo de célula e da composição do vector. Se a EC-SOD é produzida intracelularmente pelo hospedeiro recombinante, isto é, não e segregada pela célula, po de ser recuperada por métodos padrão compreendendo a rotura da célula por meios mecânicos, por exemplo, por ultrassons ou por homogeneização ou por meios químicos ou enzimáticos seguidos de purificação (exemplos do processo de recuperação são dados nos Exemplos 1,4-6 e 17)·

Para ser segregada, a sequencia de DNA que codifi ca para EC-SOD deve ser precedida pela sequência que codifi : ca para um peptídeo de sinal, cuja presença assegura a seí _z s ereção de EC-SOD a partir das células, de forma que, pelo ί menos uma porção significativa da EC-SOD expressa, seja segregada no meio de cultura e recuperada. Estabeleceu-se experimentalmente que parte da EC-30D segregada está presente no meio e parte da EC-SOD está presente nas suzerfícies das células. Assim, a expressão segregada para o meio de cultu ra é entendida como envolvendo qualquer transporte da EC> -SOD através da membrana da célula, quer a enzima eventualmente acabe no meio de cultura quer nas superfícies das cé| lulas (ver Exemplos 9-11). A EC-SOD pode ser recuperada a j partir do meio por métodos padrão compreendendo a filtração Π das células e o isolamento da proteína segregada, por exemI; pio, como se descreve nos Exemplos 1, 4-6 e 17· Com vista a assegurar a libertação da EC-SOD a partir das superfícies í das células e assim se obter um rendimento melhorado, pode ! ser vantajoso adicionar ao meio heparina ou uma das substân j cias com um efeito semelhante, mencionadas atrás, como já foi explicado.

Ainda, num outro aspecto, a invenção refere-se a um método de recuperação de EC-SOD em que um extrato de um

Ί material biológico contendo actividade de EG-30D é absorvi do nu .a matriz contendo anticorpos imobilizados contra EC—

-SOD ou um determinante imunológico respectivo, a actividaí de de EC-SOD é eluída a partir dessa matriz e as fracções ' que contêm a actividade de EC-SOD são reunidas seguindo-se ainda opcionalmente a purificação. Cs anticorpos empregados i podem ser anticorpos criados contra a ou um determinante imunológico respectivo e imobilizados num material de matriz apropriado de forma conhecida per si.

Os anticorpos utilizados para a cromatografia de afinidade de acordo com a invenção podem ser ou policlonais ou monoclonais. Os anticorpos correntemente preferidos são os anticorpos monoclonais porque o maior número de anticorpos monoclonais ligam o antigene menos fortemente do que a mistura de anticorpos policlonais, o que significa que a de sadsorção pode ser levada a efeito sob condições mais suaΐ ves com eluentes mais fracos. Isto dá origem a um rendimen-

i) to melhorado de EC-SOD porque há um grau de desnaturação - mais baixo do que quando se utilizam eluentes fortes para a ' desadsorção.

Visto que toda a IgG se dirigirá contra a EG-50D, ter-se-á que utilizar uma quantidade muito mais pequena de matriz contendo anticorpo para realizar a adsorção de ECI -SOD a partir de material biológico utilizado como material í de partida. A desadsorção de EO-SOD necessitará de um volume de eluente muito mais pequeno, simplificando-se desta forma os processos de eluição que são presentemente inconvenientes devido aos grandes volumes de eluente necessários para a desadsorção.

i

A especificidade dos anticorpos monoclonais para a EO-SOD é provavelmente mais elevada do que a dos anticorpos policlonais. 0 eluído a partir da matriz contendo anti-

corpos será portanto mais puro, o que significa que se podem ₍'omitir um ou mais passos da purificação. Isto significa que ,o processo de produção será muito simplificado e obter-se-á

I um rendimento muito maior de EC-303 a partir da mesma quantidade de material de partida, o que representa uma vantagem económica importante.

Os anticorpos policlonais podem ser obtidos por

I imunização de um animal imunizável com EC-30B ou com um deίterminante imunológico respectivo e por obtenção de anti-sox

I tal como imunoglobulinas a partir do animal de forma conheci cida per si. A imunização é de preferência realizada atra vés de uma solução aquosa estabilizada de EC-S03; o agente de estabilização pode ser um tampão tal como solução de cloreto de sódio tamponizada com fosfato ou um adjuvante (também para aumentar ainda mais a antigenicidade) sendo 0 adjuvante apropriado o adjuvante de Freund ou o hidróxido de alu mínio. Para fins de imunização, preferem-se ratos, coelhos, galinhas, cabras e carneiros. A sangria do animal e o isolamento do anti-soro são realizados de acordo com métodos bem conhecidos. 0 anticorpo é, de preferência, proporcionado de ! forma substancialmente pura o que é vantajoso para se obter ja purificação necessária da EC-SOD.

' Quando se utiliza um anticorpo monoclonal no método da invenção, ele pode ser obtido pela técnica do hibridoma que é um método bem conhecido para a produção de anticorpos. Na Técnica do hibridoma utilizando, por exemplo, ratos , como animais imunizados, os ratos são imunizados com o antigénio em questão e as células do baço dos ratos imunizados são fundidas com células de mieloma, depois do que as célujlas de hibridoma fundidas são clonadas, as células que produzem anticorpos são desenvolvidas num meio de cultura apro' priado e os anticorpos são recuperados a partir da cultura. _ Os anticorpos obtidos pela técnica do hibridoma têm a vanta• gem de possuir uma maior especificidade e, por essa razão, u

wn maior potencial de purificação como se descreveu atrás. Ainda num outro passo possível, utilizando as técnicas de

DNA. recombinante, a sequência de DNA. codificando para o anticorpo é transferida do clone da célula do hibridoma para um vector apropriado, o vector híbrido é transformado num hc pedeiro de bactérias apropriado, o hospedeiro é recuperado da cultura. Deste modo, pode-se obter um rendimento de anticorpo melhorado. 0 hospedeiro pode ser um dos que se empregam normalmente no âmbito da tecnologia do DNA recombinante tal como Eschericia coli or Bacillus subtilis.

Num método alternativo de obtenção de anticorpos monoclonais, as células do hibridoma podem ser implantadas e desenvolvidas na cavidade abdominal deratos e os anticorI pos de anti-EC-SOD resultantes serem recuperados a partir

I do fluído aseítico produzido, de uma formaconhecida ”per si’.

Além disso, a imunização para a obtenção de anticorpos monoI clonais pode ser realizada ”in vitro, utilizando células imunocompetentes de, por exemplo, ratos. Neste caso, não é necessário injectar um antigénio no animal em questão, por exemplo, um rato, embora seja no presente o processo emprega do de forma mais comum. Deve-se notar que os anticorpos monoclonais e o método de os preparar constitui um objectivo da invenção.

material biológico a partir do qual se obtém o extracto contendo a actívidade de EC-SOD pode, por exemplo, ser tecido de mamíferos. Pode ser possível utilizar tecido de bovinos, porcos ou cavalos,visto que para fins de comparação, se verificou que CuZn SOD de bovinos tem uma reactivl dade imunológica relativamente pequena nos seres humanos e as reacções alérgicas não têm constituído um. problema sério. Com base nisto, pode-se portanto concluir que acontece o mes mo para a EC-SOD de bovino, cavalo ou porco. Contudo, ainda se prefere utilizar tecido humano com vista a evitar possi— •24 ; _a π veis reacções imunológicas não desejáveis. 0 tecido humano I normalmente preferido, para este fim, porque contém quantii dades relativamente grandes de EC-SOD é o tecido do pulmão ‘ humano do pâncreas, útero, da próstata, cordão umbilical ou I 9 placenta, especialmente os dois últimos tipos de tecido por ί que são mais facilmente disponíveis. 0 extracto pode ser preparado de maneira convencional num tampão apropriado coI mo por exemplo um tampão de fosfato. Verificou-se ser vanta joso adicionar um sal (por exemplo, K Br, sulfato de amónio ¹ ou tiocianato de potássio) ao tampão com vista a melhorar o rendimento de EC-SOD da extracção. Contudo, visto que a EC-SOD não é produzida em grandes quantidades em qualquer de_s tes tecidos de modo que seriam necessárias quantidades muiI

I to grandes de tecidos para a produzir uma quantidade de E0I ! -SOD para fins terapêuticos, prefere-se obter a EC-SOD a [ partir de uma linha de células de um animal, de preferência, ί de um mamífero, em vez de seres humanos. O material biológi co que contém a actividade de EC-SOD pode também ser o mate rial resultante do crescimento de uma linha de células que produz EC-SOD como se descreveu atras. Com vista a obter particularmente grandes quantidades de EC-SOD, a EC-SOD a ji ser recuperada pelos métodos de invenção pode ser vantajosa mente produzida por métodos de DNA recombinante como se dess

I creveu atrás.

I Na maior parte dos casos, especialmente quando se

I empregam anticorpos policlonais imobilizados para a purifii cação de EO-SOD, o produto eluído da matriz do anticorpo de pois de reunido pode ser absorvido por uma matriz, por exem pio, uma matriz permutadora de iões, seguindo-se a eluição da actividade da EC-SOD a partir da matriz e a reunião das fracções que contêm a actividade da EC-SOD. Pode-se fazer i uma posterior purificação do material eluído depois de reunido submetendo-se a uma coluna cromatográfica contendo uma

matriz compreendendo hepaima ou análogos, por exemplo, sulfa to de iieparano ou um outro glucosaminoglicano sulfatado de dextrano ou outro composto fortemente carregado negativamen ;te e eluído, após o que se reúnem as fracçÕes que mostram ίafinidade para a substância em questão.

| Ainda num outro aspecto muito importante, a presen te invenção refere-se à utilização de EO-SOD para diagnósti co, profilaxia ou tratamento de doenças ou pertubações ligadas à presença ou formação de radicais de superóxido e outros intermediários tóxicos de oxigénio, derivados do radical superóxido.

Exemplos de tais doenças ou pertubações sao seleccionados a partir das condições que envolvem isquemia seguiída por reperfusão, por exemplo, enfartes tais como enfartes de coração, do rim, do cérebro ou dos intestinos, doenças in flamatórias tais como artrite reumatóide, pancreatite, em particular, pancreatite aguda, pielonefrite e outros tipos >de nefrites e hepatite, doenças auto-imunes, diabetes melli, tus dependente da insulina, coagulação intravascular dissemi inada, embolia dificuldade gordurosa, respiratória de adulto, 'dificuldade respiratória infantil, hemorregias cerebrais nos recem-nascidos, queimaduras, efeitos adversos das radiações ionizadoras e carcinogénese.

Assim, a EC-SOD é indicada substancialmente para jas mesmas aplicações que a CuZn SOD cuja actividade terapêutica tem sido minuciosamente documentada como se discutirá a seguir.

Tem-se verificado, porém, que a EC-SOD possui um número de características que a tornam particularmente eficas :para aplicações terapêuticas. A CuZn SOD tem um peso molecuilar baixo (33 000) o que origina a sua eliminação muito rápi ίda por filtração pelos glomérulos nos rins de tal forma que, nos seres humanos, a enzima tem uma vida média de apenas cer ca de 20-30 minutos. Experiências preliminares com a EC-SOD. estabeleceram surpreendentemente uma vida média significativamente muito maior (em coelhos), ver Exemplo 10. Aceita-se que isto seja, em parte, atribuível ao peso molecular eleva do de EC-SOD, 135 000, o que evita ser eliminada por filtra ção pelos glomérulos e, em parte, ao facto de a EC-SOD pare cer ligar-se às superfícies das células endoteliais como se indica a seguir. No uso terapêutico de EC-SOD de acordo a invenção, a enzima tem de preferência uma vida média nos se res humanospelo menos

possivelmente

maior

Como de expôs atrás, a EC-SOD 6, no seu meio natu ral, uma proteína segregada e portanto é provável que seja especificamente sintetizado para uma função no espaço extra celular (em fluídos extracelulares ou nas superfícies das ’ células) 0 que pode originar que exiba propriedades que são particularmente bem adaptadas à protecção dos componentes do plasma ou da superfície exterior de células contra os efeitos tóxicos de radicais superóxidos ou outros radicais de oxigénio. Esta sugestão é baseada na descoberta de que a ίί EC-SOD tem um carácter hidrofóbico fraco 0 que pode dar ori [ gem a uma tendência para se ligar à superfície exterior das células e de que possui afinidade para a heparina, 0 que in * dica uma afinidade para 0 sulfato de heparano que se encontra na superfície exterior das células, parecendo. Ambas e.s tas propriedades parecem significar uma particularmente boa i tendência para proteger 0 tecido, ver Exemplos % 10 e 11 em que os resultados dos testes parecem verificar a ligação [ da EC-SOD ao endotélio dos vasos sanguíneos.

^! A importância da associação aparente de EC-SOD con ^; membranas celulares é ainda baseado na descoberta de que

CuZn SOD que foi modificada com poli-lisina para se ligar àíí . membranas celulares, é mais capaz de proteger os leucócitos

ΓΠ,· “;-£7 superéxique a portanto Salin e

Free radicais in leukocyte metabolism and inem Superoxide and Superoxide Dismuta.ses, i ί i i í polimorfonucleares activados (que produzem radical do) (PMN) da auto-inactivação (morte da célula) do CuZn SOD normal que está carregado negativamente e tende a ser repelida pelas membranas celulares (M. iJ. M. McCord, iflammation, em Superoxide and Superoxide Dismutases, eds. >A.M. Michelson, J. M. McCord e I. Fridovich, Academic Press, 11977, pág. 257-270). 0 facto de que Nocardia asteroides possui uma SOD associada à membrana que parece conferir uma pro !tecção eficiente contra os PMN humanos activados enquanto a ;susceptibilidade da Norcardia para PMN é significativamente aumentada quando as células de Nocardia são tratadas com anticorpos contra esta SOD (B. L. Beaman et al., Infection and Immunity 47, 1985, pág. 135-1^1) também aponta para uma função protectora de membranas celulares pela SOD ligada às superfícies celulares. Ao contrário de EC-SOD, CuZn SOD tem uma função intracelular que pode torná-la menos bem sucedida para a aplicação extracelular, isto é, originada pela ça extracelular de radicais superóxido. Além disso, a curta vida média comparada com a da EC-SOD mencionada íparece tornar necessário administrá-la em quantidades 'jtervalos mais curtos 0 que é semelhante ao caso com EC-SOD.

A actividade de SOD para aplicações terapêuticas potenciais tem sido demonstrada para as seguintes doenças ou perturbações.

presen sua atrás em inI

1.

j Administrada parentericamente, a CuZn SOD tem evidenciado um efeito anti-inflamatório numa série de tipos de inflamações em animais bem como em doenças inflamatórias em animais (Huber and Saifer, em Superóxido e Superóxido Dismutases, eds. Michelson et al. Academia Press, 1977, pág. 517í !Em seres humanos os efeitos positivos de CuZn SOD foram suíportados no caso da artrite reumatóide e artroses, na infla¹ mação da bexiga e outras situações urológicas (Menander-nubec

5*9).

- 28 o·.’ rrv ί em Biological e Climical Aspects of Superoxide e Superoxide Dismutase, eds. Ianmister et al., Elsevier/North Holland, 1980, pag. 408-425) bem como efeitos contrários ao tratamen to com radiação ionizadora (Edsmyr et al», Current Therapy.

: Res. 10, 1976, pag. 198-211; Cividalli et al., Acta. Radiol

I Oncol. 24, 1985, pag. 273-277 (em ratazanas). Nalguns países, a CuZn SOD bovina tem sido registado como um medicamento (0:?

i gotein, Peroxinorm), utilizado principalmente para o tratamento de artrites e artroses em que a composição é administrada intra-articularmente (Goebel e Storck, Am. J. Med. 7^, i 1983, pág. 124-128).

j A CuZn SOD que e administrada por via parenterica não é absorvida pelas células e exerce a sua actividade no espaço extracelular. A CuZn SOD encapsulada em liposomas é absorvida pelas células e é considerado eficaz contra a doença de Crohn, a doença de Bechet, dermatite herpetiformis, colite ulcerativa, doença de Kawasaki e contra os efeitos adversos da terapia com radiações (Ϊ. Niwa et al., Free Rad. Res. Comms. 1, 1985» pág. 137-153)· 0 mecanismo da activida ¹ de anti-inflamatória de CuZn SOD não é totalmente claro. Fo:.

i sugerida a protecção directa contra os radicais de oxigénio formados pelos leucócitos activados (Halliwell, Cell Biol. Int. Rep. 6, 1982, pag. 529-541). Uma outra possibilidade consiste em evitar a formação de uma substância quimiotáxica fortemente induzida por superóxido. (Petrone et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77, 1980, pág. 1159-1163).

I A outra grande área potencial de aplicação de SOD é como factor de protecção contra os danos dos tecidos provocados por isquemia seguida de reperfusão. Se se eliminar o fornecimento de sangue a um tecido, o tecido torna-se len tamente necrótico. Os danos causados desenvolvem-se macroscópica e microscopicamente, lentamente durante várias horas. Se o tecido é reperfusionado depois de , por exemplo, uma ^Ar

- 29 ;·Ύ hora, ocorrerá uma forte aceleração dos danos provocados no ; tecido em vez de um melhoramento. Do mesmo modo, há várias ! razões para o assim chamado paradoxo de reperfusão mas os radicais de oxigénio formados como resultado do reaparecimento de oxigénio no tecido previamente isquémico parecem contribuir para os danos. Visto que os radicais possuem uma vida média extremamente curta e portanto são difíceis de es I tudar directamente, a sua formação e os respectivos efeitos podem ser deduzidos a partir da acção protectora de vários absorvedores de oxigénio. Tem-se demonstrado que a protecção do tecido (através de uma substância protectora) nos modelos de reperfusão na isquemia ou anoxia do rim (SOD [g. L. Baker et al., Am. Surg. 202, pág.628-641; I. Koyama et al., Trans plantation 40, 1985, pág. 590-595], SOD, catalase [j]. Hansssn et al., Clin. Sei. 65, 1983, pág. 605-61θ] e Allopurinol [jL H-pirazolo-(3,4-d) pirimidin-4-οϊ] [Õ. L. Baker et al., cit.; I. Koyama etal

Parks et al., Schoenberg et M. C. Dalsing e Allopurinol |j). A. Parks et al., < (SOD, SOD + catalase, catalase e Allopurinol [h. Sanfey et al *, talase op.

., op. CitTj), intestinos (SOD [ΰ. A. Gastroenterology 82, 1982, pág. 9-15} Μ. H. al., Acta chim. Scand. 150, 1984, pág. 301-30?; et al., J. Surg. Res. 34, 1983, pág. 589-596] op. citT]), do pâncreas

Ann. Surg. 200, 1983, pág. 405-413]), fígado (SOD e caS. L. Atalla et al., Transplantation 40, 1985, pág. 584-589 , pulmão (SOD + catalase ÍR. S. Stuart et al., Trans

J L-l * plant. Proc. 17, 1985, pág. 1454-1456]), musculos ligados ao esqueleto (SOD, catalase e Allopurinol [r. V. Korthuis, Giro. Res. 57, 1985, pág. 599-609]), pele (SOD e Allopurinol [m.JJ Im. et al., Ann. Surg. 201, 1985, pág. 357-359]) θ cérebro (SOD e Allopurinol £j. S. Beckmann et al. , em Superoxide anc. Superoxide Dismutase in Ch.emistry, Biology e Medicine, ed. G· Rotilio, Elsevier, 1986, pág. 602-60?]).

A preservação do funcionamento do coração foi reff O*^? ·^Λ·7 • tf ferida em preparações isoladas, de perfusão do coelho (catalase, Allopurinol; SOD não tinha nenhum efeito £c. L. Myers et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 91, 1986, pág. 281-289 gato (SOD + catalase Ql. Schlafer et al., Girculation 66,

I i

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i gclbU + ϋέλbdlxeLtítí |JV1· O^uidici· cu αχ., uxxutiittuiuii uu,

Suppl. I, 1982, pág. 185-192] ) e ratazanas (Glutadiona [n),

-(N-L- j - Glutamil-8-cisteinil)-glicin.ãj , catalase, SOD Gar. del et al., J. Mol. Cell Cardiol. 16, 1984, pag. 459-47Õ]). Nos modelos in vivo de isquemia-reperfusão local, a redução da gravidade do enfarte foi referida no cão (SOD [t. J. Gar' dner et al., J. Mol. Cell Cardiol. 17, 1985, pág. 145-152;

S. W. Werns et al., Circ. Res. 56, 1985, pág. 89589δ| ); e 0 Allopurinol [d. E-Chambers et al., op. cit.jjjP. J. Gardner et al., op. cit^ e a catalase não tinham nenhum efeito [jã.E. Werns et al., op. cit7| . A injecção de SOD + catalase também foi reportada para preservar 0 funcionamento mecânico do coração depois de uma breve isquemia (15 minutos) local no cãc (M.L. Myers et al., Circulation 72, 1985, pág· 915^-921; K.

Przyklenk e R. A. Kloner, Circ. Res. 58, 1986, pág. 148-156) Além disso, SOD foi também reportada para reduzir a incidêni cia de arritmias provocadas por isquemia-e-reperfusão (B.

Woodward et al., J. Mol. Cell. Cariol. 17, Ί985, pág. 485-495; M. Bernier et al., Circ. Res. 58, 1986, pag. 531-340). A fonte de radicais de oxigénio nesta situação não é comple tamente clara, mas 0 efeito de Allopurinol parece indicar I que é parcialmente provocado pela xantina oxidase que, por isquemia, é convertida a partir da sua forma de xantina de-hidrogenase (Parks et al., op. cit.) na forma de oxidase que produz 0 radical. Forma-se uma grande quantidade de hipoxantina que e 0 substrato para a xantina oxidase devido à degradação do nucleotido da purina induzido por isquemia.

Outras fontes de radicais superóxido podem ser os leucócitos activados captados pelo tecido danificado pela isquemia, a síntese de prostaglandina (θ£*- é um subproduto; Kontos, Cii Res. 57, 1985, pág· 508-516) e a auto-oxidação de vários con.

c.

ípostos acumulados na forma reduzida durante a isquemia. A idescoberta que diz respeito à isquemia seguida por reperfusão tem aplicações clínicas potencialmente importantes. Pode ser possível obter um excelente efeito por reperfusão de tecido em ligação com enfartes de

ção concomitante de uma SOD e/ou de outros factores protecto res contra radicais de oxigénio e factores trombolíticos, por exemplo, activador de plasminogénio de tecido. Os resultados das experiências comSOD indicam também uma aplicação possível em ligação com a cirurgia do coração e transplanta ções do coração. Analogamente, os resultados obtidos com a utilização uma SOD em ligação com a esquemia do rim seguida de reperfusão podem ser utilizados em ligação com transplantações do rim e outras transplantações de órgãos tais como pele, pulmão, fígado ou pâncreas. A doença de isquemia do cé rebro é uma outra indicação possível.

i As SOD apresentam efeitos protectores interessantes em ligação com outras condições patológicas.

: Assim, a pancreatite foi induzida no pâncreas do icão de três maneiras diferentes: infusão do ácido oleico, obstrução parcial dos canais excretórios e isquemia seguida de reperfusão. A SOD, a catalase e a SOD + catalase verifiPcou-se serem protectoras, sendo geralmente mais eficaz o tra itamento com a combinação. No modelo de isquemia, porém, a ÍSOD isolada foi quase tão eficaz como a combinação de SOD e catalase (Sanfey et al., Ann. Surg. 2oo, 1984, pág. 405-415) A catalase + SOD tem sido reportada como servindo para melho rar a pancreatite provocada pela ceruleína em ratazanas (K. 'S. Guice et al., Am. J. of Surg. 151» 1986, pág. 163-169)· :Os resultados indicam a possibilidade de uma terapia activa 'contra esta doença para a qual não existe presentemente nenhuma terapia específica.

Foi também sugerido que o tratamento com SOD é efi

caz contra queimaduras. 0 edema local após uma ligeira queimadura experimental nas ratazanas podia ser diminuído com uma injecção de SOD (Bjõrk e Artursson, Burns 9, 1983, pág.

•249-256)· Num modelo de animal envolvendo um severo dano prç i vocado por uma queimadura grande por exemplo no rato, obtejve-se uma protecção dramática com SOD, pelo que diz respei| to à sobrevivência e aos danos locais (Saez et al. Circulatory Shock 12, 1984, pág. 220-239)·

No caso, por exemplo, de queimaduras, formação imt no-complexas e lesões importantes dos tecidos, acumulam-se leucócitos neutrofílicos nos pulmões. A activação do complemento (C5a) parece muitas vezes mediar a acumulação. Os leucócitos parecem ser activados e libertam radicais de oxigénio, provocando deste modo dano no pulmão que, por exemplo é caracterizado pelo aumento da permeabilidade dos vasos e edema pulmonar (dificuldade respiratória dos adultos). Em vários modelos de animais, a SOD e outros absorvedores de radicais de oxigénio demonstrou-se que têm um efeito protec tor contra a lesão do pulmão (Till Suppl. 12, 1983, pág 383-396).

and Ward, Agents and Acti ons

A CuZn SOD administrada por via parentérica foi re ferida como evitando a displasia bronco-pulmonar nos recém-nascidos prematuros que sofrem de dificuldade respiratória infantil (W. Rosenfeld et al., J. Pediatr. 105, 1984, pág. 781-785)·

No modelo de cachorro Beagle, verificou-se que a injecção de SOD reduz a frequência da hemorragia intraventricular do cérebro a seguir à hipotensão (L. R. Ment et al., J. Neurosurg. 62, 1985, J· 63- J» 69).

A SOD melhora a hepatite provocada em ratazanas por injecção de Corynebacterium parvum (M. J. P. Arthur et al., Castroenterology, 89, 1985, pág. 1114-1122).

-^55 • ΑΛ 2Ί.

Ο factor relaxante dos vasos derivado do endotélio é muito sensível ao superóxido e a administração de SOL aumenta as suas acções (R. J. Gryglewski et al., Nature 320, [1986, pág. 454-456; G. M. Rubanyi et al., Am. J. Physiol. i250, 1986, pág. H 822- H827). A produção do radical superóÍxido pode ocorrer sob muitas circunstâncias no corpo e pode provocar a vasoconstrição e a diminuição da SOD seja capaz [de atenuar a vasoconstrição.

aumento grande e agudo da pressão sanguínea con1 duz a anormalidades morfológicas e funcionais nas arteríolas do cérebro. Os inibidores da síntese da prostaglandina e a [ superóxido dismutase são utilizados para proteger contra essas anormalidades. A libertação de superóxido pode ser detec tada (Η· A. Kontos, Circ. Res. 57» 1985» pág. 508-518)· Uma análise rigorosa do modelo levou à conclusão que os radicais ! superóxido se formam como subprodutos durante a síntese de prostaglandina. Os resultados sugerem que 0 dano dos tecidos provocado pelos radicais superóxido libertados durante a sír. tese de prostaglandina pode ocorrer numa outra situação pato lógica e que a SOD pode exercer acção protectora.

'[ Tem-se atribuído à CuZn SOD + catalase no meio, 0 [i prolongamento da sobrevivência da córnea do coelho isolada \ perfusionada (0. N. Lux et al., Curr. Eye Res. 4, 1985, pag.

_r

153-15Ό· CuZn SOD + catalase protegem a cornea isolado meno contra a fotoperoxidação (S. D. Varma et al., Ophthalmic Res

14, 1982, pag. 167-175)· Os resultados sugerem efeitos benéficos possíveis de SOD nas transplantações da córnea e outros processos cirúrgicos oftálmicos.

Tem sido atribuída à acção de SOD a acção de melho [ ramento, em modelos animais, de estados agudos como por exem pio coagulação intravascular disseminada (T· foshikawa et al., Thromb. Haemostas. 50, 1985, pág. 869-872) e septicemia

~'(H. F. Welter et al., Chirurgisches Fórum '85 f. experim. u. ;Klinischer Forschung, Springer-Verlag, Berlin, 1985)·

Em vários tipos de doenças auto-imunus tais como 'eritematose lupus sistémica (SLE), esclerose sistémica e ar trite reumatóide, tem-se verificado um aumento de frequência de irregularidades cromossómicas nos linfócitos, (Emerit, Properties and action mechanisms of clastogenio factors,

I in Lymphokines, Vol. 8, ed. E. J?ick, Academio Press, 1983, pág. 413-424). As culturas de fibroblastos e as preparações directas de medula óssea apresentam também muitas vezes um i aumento de irregularidades. 0 plasma desses doentes contém um factor clastogénico de rotura de cromossoma. Tem-se verificado algumas vezes a presença de um factor semelhante no fluído sinovial e cerebrospinal (esclerose disseminada). As roturas ou irregularidades ocorrem em linfócitos normais que i são cocultivados com linfócitos de doentes com doença autoί -imune. Os linfócitos dos pacientes condicionam os meios de i cultura para produzir as roturas dos cromossomas. A actividade clastogénica do plasma de SLE pode ser aumentada por irradiação com UV. A produção de superóxido no plasma através da xantina oxidase e xantina resulta na formação da acti i vidade clastogénica. Em todos os modelos descritos atrás, a i adição de CuZn SOD ao meio protegia contra a actividade cias, ^! togénica. (Emerit, ibid.). Isto indica que os radicais superóxido são envolvidos na formação e acções do factor clastoI génico. (Emerit ibid.).

i

No modelo animal de SLE, o rato preto da Nova Ze lândia que possui o factor clastogénico, os cromossomas são j protegidos in vivo nas células da medula óssea -por repetidas I ~ injecções de SOD (Emerit et al., Cytogenet. Oell Genet. 30, 1982, pág. 65-69)· Não está porém ainda claro em que extensão o factor clastogénico contribui para os sintomas mais ^; importantes na doença auto-imune humana e se a administraçãc

de SOD tem qualquer efeito terapêutico.

A transformação neoplástica das células é dividida geralmente em duas fases, isto é, a iniciação seguida pela jpromoção. Nos modelos in vitro onde a iniciação tem sido jprovocada por radiação ionizadora, bleomicina, misonidazol e outros nitroimicLazóis e transformação oncogénico tem sido efectivamente inibida pela presença de SOD no meio. Não é i necessário que a SOD esteja presente durante a exposição às substâncias inibidoras o que parece indicar que a enzima ini i be o passo cLe promoção subsequente (Miller et al., Int. J. jRadiat. Oncol. Biol. Ph.ys. 8, 1982, pág. 771-775; Borek and Troll, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 80, 1983, pág. 1304-1307)· As doses não-tóxicas de xantina + xantina oxidase provocam a promoção do crescimento das células. A adição de SOD ou SOD + catalase inibe este efeito (Zimmerman e Cerutti, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 81, 1984, pág. 2085-2087)· Os esteres de Porbol (1,1a, lb, 4,4a, 7a, 7b, 8, 9,9a-cLeca-h.idro-4a,7b, 9,9a-tetra-hidróxi-3-'(h.idroximetil)-l ,1,6,8-tetrametil-5H azulen-5-ona) são promotores conhecidos. Nos modelos em que os tumores da pele foram induHzidos por iniciação com um benzantraceno seguida por aplicação de um éster de forbol (TPA), o tratamento local com um complexo de cobre lipofílico com actividade SOD reduziu fortemente a formação do tumor (Kenzler et. al. Science 221, ! 1983, pág. 75-77)· 0 resultado indica que, pelo menos em cer tos casos, os radicais superóxido contribuem para a promoção _: I ! da formação do tumor e que a SOD pode proteger contra este i efeito.

Há razão para acreditar que os radicais de oxigénio contribuem para os efeitos prejudiciais de um número de substâncias tóxicas tais como bleomicina, adriamicina, aloxano, 6-hidrodopamina, paraquat, ácido di-hidróxi-fumárico, nitrofurantoina e estreptozotocina. Nos casos em que a for36 -

ITV inação de radical se realiza no espaço extracelular, era possível proteger através de enzima protectora injectada. Deste modo, a SOD pode proteger contra a actividade diabetogénica I de aloxano (células /3 danificadas no pâncreas) in vitro (Grahkvist et al., Biochem. J. 182, 1979, pág. 17-25) θ in vivo (Grankvist et al., Nature 294, 1981, pág. 158-160). 0 efeito danificante do aloxano parece portanto ser mediado pelo radical superoxido ou por outros radicais de oxigénio derivados dele. A razão para a grande sensibilidade das células β do aloxano não está esclarecida e tem-se especulado se haverá qualquer ligação entre a sensibilidade ao eloxano e a incidência dos diabetes mellitus dependentes de insu na. Nos diabetes mellitus há uma infiltração nas ilhotas de

Langerhans pelas células inflamatórias que podem formar potencialmente radicais de oxigénio. Verifica-se, portanto, que se pode proteger as células β com injecções de SOD ao verificar-se o primeiro aparecimento de diabetes mellitus.

Atribuiu-se (Mossman and Landesman, Chest 835, 1983, pág. 50s-51s) à adição de SOD ao meio de crescimento a protecção das células da traqueia contra a acção do amian to.

i Referiu-se que (Roberts et al., J. Urol. 128,1982, | pág. 1394-1400) a CuZn SOD parentérica protege os rins contra a pielonefrite provocada experimentalmente. A SOD e, em particular, a catalase protege contra a nefrite’ nefrotóxica aguda, provocada em ratazanas pelos anticorpos da membrana [ de base antiglomerular (A. Rehan et al., Lab. Invest. 51, [ 1984, pág. 396-403).

! De uma maneira geral a CuZn SOD tem sido utiliza; da como a substância teste nas experiências descritas atrás.

: Admite-se porém que a EC-SOD pode ser utilizada para as mesi mas finalidades e, como se indicou atrás com grande eficiência devido às suas propriedades particulares que podem tor-

Iná-la especialmente atractiva para ser utilizada extracelu! lamente.

A presente invenção refere-se ainda a uma composi[ção farmacêutica que compreende EC-SOD juntamente com um exicipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitavel.

\k EC-SOD incorporada na composição pode derivar de quaisquer das fontes descritas atrás, isto á, ser de origem recombinan te, de linhas de células ou de tecido.

A estimativa duma dosagem apropriada terapeuticaίmente activa para tratamento sistémico é feita na base do I teor de EC-SOD no corpo humano. A EC-SOD é a SOD mais imporI tante no plasma humano e a actividade total (constituída por jfracções A, B e C, ver Exemplo 2) é cerca de 20 U/ml. A inijecção de 200 UI de heparina por quilograma de peso corporal dá origem a um aumento da fracção C de EC-SOD de cerca de 25 U/ml, ver Exemplo 9· Embora esta dosagem de heparina seja muito elevada, não se conseguiu aparentemente uma libertação máxima, ver Exemplo 9· Considerando que a fracção C de EC-

I-SOD se liberta do endotélio dos vasos quando muito duas veBzes aproximadamente, o conteúdo total de EC-SOD nos vasos pcorresponderia a cerca de 66 U/ml de plasma (20 + 2 x 25 U/ /ml). 0 volume de plasma total é cerca de 4,7% do peso do corpo correspondendo a cerca de 5,5 1 numa pessoa de 70 Kg de peso. Uma unidade de EC-SOD é igual a cerca de 8,8 ng. A quantidade de EC-SOD nos vasos sanguíneos (plasma e endoté-

I . , _q lio dos vasos) e portanto 5500 x 66 x 8,8 x 10 ⁷g = 1,92 mg. Um aumento de 10 vezes necessitaria de 19 mg e um aumento de 1500 vezes, 575 ^m6 <3-^a fracção C de EC-SOD. Uma dosagem aprojipriada de EC-SOD pode portanto estar compreendida dentro do ‘ intervalo de cerca de 15-600 mg/dia, dependendo do tipo e da severidade do estado da doença para a qual se indica a administração de EC-SOD. A injecção de, por exemplo, 87 mg da ^!fracção C de EC-SOD (um aumento de 50 vezes) daria origem a

1,

o endotélio). Esif ^llf.

~~ 26 /Ag/ml no plasma (desprezando a ligação tas ou mesmo concentrações mais baixas indicam as fortes pro inriedades protectoras nos testes in vitro (com CuZn SOD) i ' ¹¹.........¹¹ , |(ver A. Baret, I. Emerit, Mutation. Res. 121, 1983, pag. 293“

1—297; K. Grankvist, S. Marklund, J. 0. Sehlin, I. B. Tãlje;dal, Biochem. J. 182, 1979, pág. 17-25)·

I A dosagem e os intervalos entre as injecções de

EC-SOD dependem da vida média da enzima nos vasos sanguíneos humanos que não é ainda conhecida. Nos coelhos, a EC-SOD hu- mana possuía uma vida média de cerca de 18 horas (ver Exem- ί pio 10). A vida média nos organismos de seres humanos é provavelmente maior. Considerando que a cinética é de primeira • ordem e a vida média é de 36 horas, as injecções diárias de i35 mg após uma injecção inicial de 87 mg dariam origem à mes ma concentração que se atingiu após a injecção inicial.

i 0 Exemplo 9 mostra que a fracção 0 de EC-SOD pode ser mobilizada a partir das superfícies das células para o plasma com heparina. A heparina por via parentérica outras glucose-amino-glicanos e outras substâncias fortemente carre gadas negativamente podem ser usadas ção da Fracção C de EC-SOD injectada ou endógena (ver exem|pio 9-11). A localização para a fase do plasma podia ser úti em certos estados patológicos.

I

A EC-SOD ê constituída por três fracções: a fracçãi A sem afinidade para a heparina, B com fraca afinidade para já heparina e C com forte afinidade para a heparina. As razoe IIpara as diferentes afinidades não são ainda conhecidas mas | as fracções são de um modo geral muito semelhantes. A electroforese nos geles PAGE-SDS não revela nenhumas diferenças; as composições de aminoácido parecem ser idênticas (S. Markilund, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79, 1982, pág. 7634-7636) e

I ||os anticorpos cultivados contra A e C parecem reagir da mes-

I — |ma maneira com as três fracções (S. Marklund, Biochem. J.

;!

I i

I para modular a localiza

220, 1984, pág. 269-272). As fracções podem ser produzidas pelo mesmo gene e ser depois modificadas de forma post-trans lacional. Todas as fracções existem no plasma fresco (ver Exemplo 9) e é a farmacocinética da fracção que é descrita atrás. A fracção C é também produzida por técnicas de DNA.

I recombinante (ver Exemplos 13). Porém, verifica-se que as

I fracções A e B de EC-SOD podem também ser terapeuticamente í , , eficazes em estados patologicos em que e importante a alta actividade da SOD em solução.

Para tratamento tépico será provavelmente necessária muito menores quantidades de EC-SOD do que a indicada atrás. Presentemente, administram-se 4-8 mg de CuZn SOD por via intra-articular uma vez por semana para 0 tratamento da artrite. A EC-SOD que tem um peso molecular muito maior tem „

i maior probabilidade do mesmo modo na ligaçao durante um pe1 ríodo de tempo maior. Será apropriado um tratamento semelhar.

te ou possivelmente doses um tanto mais baixas.

Antes de ser utilizada a composição que contém EC-SOD deve ser de preferência armazenada sob a forma seca, por exemplo na forma liofilizada. Para 0 tratamento sistémico e injecções locais a EC-SOD pode ser formulada de forma apropriada para administração parentérica, por exemplo dissolvida num solvente apropriado, não tóxico, fisiologicamen te aceitável tal como uma solução salina isotónica. Para apl cação tópica, a composição farmacêutica pode estar na forma i— de, por exemplo, uma pomada, loção, spray”, creme ou aerossol contendo EC-SOD.

Verifica-se ainda que na composição farmacêutica de acordo com a presente invenção, a EC-SOD pode ser combinada de forma vantajosa com catalase que dismuta 0 péroxido de hidrogénio do seguinte modo:

catalase ^2θ2 ⁺ ^2θ2

0₂ + 2H₂0

A acção combinada de EC-SOD e catalase reduz ainda mais a formação do radical hidroxilo que, como se descre ! veu atrás, é considerado o radical mais tóxico das radicais i de oxigénio. Em vez de catalase, pode-se utilizar um outro ! anti-oxidante que coopera com EC-SOD para reduzir os efeij tos tóxicos dos produtos de redução de oxigénio.

; Verifica-se também que as combinações de EC-SOD e

I outras substâncias tais como alopurinol (inibe a xantina oxidase), as que eliminam os radicais hidroxilo (por exemplo, manipol ou compostos que contêm o grupo sulfidrilo) e os ί formadores de quelatos de iões de metais de transição (por exemplo des-ferrioxamina) podem ser vantajosas.

i Além disso, para aplicações em que é indicada a ! presença de EC-SOD no plasma pode ser vantajoso incorporar heparina ou um análogo, por exemplo, sulfato de heparano ou um outro glucose-aminoglicano sulfatado, sulfato de dextrano ou outro composto fortemente carregado negativamente, na composição com o fim de mobilizar a presença de EC-SOD nas ! superfícies das células do doente a ser tratado, proporeio! nando portanto uma dosagem extra de EC-SOD no plasma.

A invenção refere-se também a um método para evi| tar ou tratar uma doença ou uma perturbação de saúde ligada com a presença ou a formação de radicais superóxido, caracterizado por se administrar a um doente necessitado de tal I tratamento uma quantidade de EC-SOD terapêutica ou profilac·· ticamente eficaz. A doença ou a perturbação pode ser uma das i que se indicaram atrás. A invenção também se refere a um méi : todo para evitar ou tratar lesões provocadas por isquemia ! seguida por reperfusão em ligação com a transplantação de órgãos tais como rins, pulmão, pâncreas, coração, fígado ou pele ou em ligação com a cirurgia do coração, caracterizado ji por se administrar uma quantidade de EC-SOD terapêutica ou profilacticamente eficaz antes, durante ou depois da cirur-

gia. Em qualquer dos métodos uma dosagem terapêutica ou profilacticamente activa pode compreender cerca de 15-600 mg/dia de EC-SOD, dependendo do tipo e da severidade do estado da doença a ser tratada. Neste método, pode ser vantajoso coadministrar heparina ou um outro composto carregado negativamente como se indicou atrás e/ou catalase ou um anti-oxidan te com efeito semelhante como também se indicou atrás.

DESCgIQÁO DOS DESENHOS

A invenção é seguida descrita com referência aos desenhos, em que a Fig. 1 é um gráfico que representa a eluição padrão da proteína e da EC-SOD, após imunoadsorção de um mate rial que contém EC-SOD, para anti-EC-SOD-Sepharose^ (ver Exemplo 4);

i a Fig. 2 é um gráfico que representa a eluição padrão de EC-SOD a partir de DEAE-Sephacel (ver Exemplo 5);

a Fig. 3 é um gráfico que representa a eluição pa drão de EC-SOD a partir de heparina-Sepharose^^ (ver ExemI Pio 6);

> a Fig. 4 e um auto-radiograma que mostra a hibriI dação padrão com uma sonta 48-mérica de um dos filtros de nitrocelulose para a qual se transferiram placas de 20000 Agll. As manchas escuras no auto-radiograma representam pia ' cas que contêm EC-SOD cDNA humana (ver Exemplo 8);

i as Figs. 5& θ 5b apresentam a sequência de DNA e a sequência de aminoácido deduzida da EC-SOD (ver Exemplo 8).

i a Fig. 6 apresenta a estrutura do plasmideo pPS3.

As áreas brancas representam SV40 DNA e os números referem-se às posições dos nucleótidas correspondentes em SV40. Os ji

I ί

pontos de partida SV40 e SV40PE representam o promotor inicial SV4O e o ponto de partida SV4O de replicação respecti' vamente e as setas indicam a direcção de transcrição e a re iplicação de DNA, respectivamente. Os sinais de poli-adenila ção SV4O estão localizados entre as posições 2770 © 2553· A i área sombreada a tracejado representa EC-SOD cDNA humana. A área a preto representa o gene/3-lactamase (AP) do plasmij deo pBR322. As linhas finas representam o plasmídeo pBR322 ! D NA. Também se indica o local do ponto de partida pBR322 de ^! replicação.

I

A Fig. 7 apresenta o efeito da injecção de heparina intravenosa no plasma EC-SOD. Injectaram-se 200 UI de he parina por Kg de peso corporal no instante zero em dois machos sandáveis e recolheu-se o plasma antes e nos intervalos indicados depois. A actividade de EC-SOD foi determinada co ! mo se descreve no Exemplo 9· apresenta a resposta à dose actividade da heparina intravenosa que liberta EC-SOD.

Injectou-se hepari na por via intravenosa nas doses indicadas em dois machos saudáveis e recolheu-se sangue antes e ao fim de 10 e 15 mi nutos após a injecção da heparina. Aos 15 minutos injectou-se uma dose adicional de heparina até 200 UI/Kg de peso de corpo e recolheu-se sangue 10 minutos depois disso. A EC-SOP foi determinada no plasma como se descreveu no Exemplo 9· A diferença entre a actividade de EC-SOD pré-heparina e a actâ. vidade depois da segunda injecção de heparina foi tomada como 100% de libertação. As diferenças entre a actividade de heparina e a actividade média das amostras de 10 e 15 mi nutos após a primeira dose são apresentadas em relação a 100% de libertação. As experiências foram realizadas com intervalos de pelo menos 4 dias (ver Exemplo 9)·

A Fig. 9 apresenta a separação de plasma em heparina-Sepharose^\ O plasma humano recolhido antes (0) e 10

I

I/-'

minutos após a injecção intravenosa de heparina (200 UI/Kg | de peso corporal) (A) foi separado em heparina-Sepharose^^ ^! como se descreveu no Exemplo 9, indica o resultado da croma tografia da amostra de plasma de pré-heparina após pré-traf R j tamento com anti-EC-SOD-Sepharose^K~‘^y para remover EC-SOD. A linha a cheio representa a absorvância a 280 nm e a linha ponteada com o gradiente de NaCl. As fracções de EC-SOD A,

I B e C foram determinadas em séries como se indica na figura A actívidade na série B e C representa apenas EC-SOD, visto que toda a actívidade foi absorvida pela anti-EC-SOD-Sepharose^^R\ A série A contém também CuZn SOD e actívidade de SOD resistente a cianeto. A actívidade de EC-SOD na fracção A foi por consequência determinada com anticorpos imobiliza dos como se descreveu para o plasma no Exemplo 9· A EC-SOD nas fracções A, B e C era igual a 5,2, 4,4 e 5,1 U/ml no plasma de pré-heparina e 7,7, 5,7 ^e 29,4 U/ml no plasma de pós-heparina. As recuperações da actívidade de EC-SOD nos cromatogramas foram 84% e 83%, respectivamente. Note-se que a actívidade de SOD total maior na série A no cromatograma ! do plasma de pré-heparina é devida à hemólise na amostra com libertação de CuZn SOD a partir de eritrócitos (ver Exemplo

As Figuras 10 e 11 são gráficos que mostram o efei to da injecção de EC-SOD humana marcada com 125 T em coelhos: e o efeito da injecção de heparina (ver Exemplo 10).

A Fig. 12 é um gráfico que representa o andamento da eluição de EC-SOD recombinante a partir de anti-EC-SOD-Sepharose^ monoclonal (ver Exemplo 17).

A Fig. 13 é um gráfico que representa o andamento da eluição de EC-SOD recombinante a partir de DEAE-Sephacel*' I (ver Exemplo 17).

A Fig. 14 é um gráfico que representa o andamento

27. ’’ -7 da eluição de EC-SOD recombinante a partir de heparina-Seoharose^R) (ver Exemplo 17).

A Fig. 15 representa a electroforese de EC-SCD natural e recombinante em geles de poliacrilamida em gradiente na presença de dodecilsulfato de sódio (ver Exemplo 19).

EàEíJPLO 1

Preparação de homogenatos de cordão umbélical

Recolheram-se cordões umbilicais humanos na sala da maternidade do Hospital da Universidade de Umeâ. Conservaram-se num frigorífico existente na sala e congelaram-se no laboratório a -80°C, armazenando-se de seguida a -30°C antes de se utilizar.

boc	ados os
ml	de	tampãt
mM	de	DTPA,
mM	de	fluo-
i-se	4	1 de

Após descongelamento, cortaram-se aos cordões umbilicais. Foram então suspensoa em 50 de fosfato de K, pH 7,4, contendo K Br 0,3 M, 5 100 000 KUI/1 de Trasylol^) (aprotinina) e 0,5 reto de fenil-metil-sulf onilo (PL5SF). Utilizarai tampão por Kg de cordão umbilical. Utilizou-se 0 sal caotrópico de K Br para aumentar a extracção de EC-SOD a partir do tecido (cerca de 3 vezes). Adicionaram-se DTPA, Trasylol'^ e PMSF para inibir proteases. A suspensão foi então homogeneizada num misturador de Waring a tratada finalmente por ultrassons. Foi depois agitada a 4^o C durante 1 hora. Os homogenatos resultantes foram centrifugados (6000 x g, 20 min e as substâncias sobrenadantes congeladas rápidamente a —80' e conservadas por fim a -30°C.

), ÍC

EZEMPLO,, 2

Preparação e purificação de EC-SOD de pulmão huma no

Obtiveram-se pulmões humanos, no intervalo de 24

horas após a morte, provenientes da autópsia de nove doentes sem qualquer doença pulmonar aparente. Os pulmões foram cor cados em bocados e o sangue em excesso arrastado em NaCl 0,15 M. Os bocados foram homogeneizados num misturador de Waring em 5 volumes de 50 mM de acetato de Na arrefecido com gelo e a um pH 5,50. 0 homogenato foi então tratado por meios ultrassónicos, extraído durante 30 minutos a 4°C e por fim centrifugado (6000 x g) durante 20 minutos.

A substância sobrenadante foi absorvida de forma descontínua sobre DEAE-Sephacel^^ (obtida a partir de Phar macia, Uppsala, Sweden) (1 volume por 25 volumes de homogenato) equilibrada com 50 mM de acetato de Na a um pH de 5,50.

permutador de iões foi depois lavado com tampão, introduzido numa coluna e eluído com um gradiente de 0-200 mM de

NaCl no tampão de acetato. 0 volume de eluído foi 10 vezes volume da coluna.

| Recolheram-se as fracções activas do passo anteI rior, diluiram-se com 1,5 volumes de água destilada e titu laram-se ate pH de 8,4 com NaOH 1M. A fracçao foi novamente ! adsorvida em cargas descontínuas em DEAE-Sephacel^^E·^ equili brada com 175 *nM de Tris*HCl a pH de 8,4 (= 1 volume de per mutador de iões por 10 volumes de fracção. Lavou-se a DEAEí -Sephacel^^ com 0 tampão, introduziu-se numa coluna e eluíu π í -se com 10 volumes da coluna com um gradiente de 0-200 mlvi • de NaCl no Tris tampão.

As fracções recolhidas do passo anterior foram concentradas e submetidas a diálise contra 150 mM de fosfato de sódio a um pH de 6,5· Aplicou-se a amostra a uma colu 1 na (cerca de 1 ml de gel por 15 mg de proteína na amostra) , com Fenil-Sepharose^ (obtida a partir de Pharmacia, Uppsa la, Sweden) equilibrada com 0 mesmo tampão. A actividade fo:. eluída com 20 volumes da coluna de um gradiente de 0-0,5 M i de K Br em 50 mM de fosfato de sódio a um pH de 6,5·

- 46 • // ?7 'U/ ’ '7

Λ> CR)

As fracções activas de fenil-Sepliarose^{k J} foram reunidas, concentradas e submetidas a diálise contra fosfato de sódio 0,15 M a um pH de 6,5· Aplicou-se a amostra a uma coluna de Con A-Seph.arose^{K J} (obtida a partir de Pharmacia, Uppsala, Sweden) (1 ml de gel por 2 mg de proteína na amostra), equilibrou-se com 0 tampão de fosfato e depois eluíu-se com vibração com 50 mM de «C-metil D-manósido no tampão de fosfato.

As fracções activas da Con A-Sepiiarose^) foram reunidas, concentradas, aplicadas a uma coluna de ACA-54- Ultrogel (2,5 x 83 cm) (obtida a partir de LKB, Estocolmo, SuJ cia) e eluíu-se com 50 mM de fosfato de sodio a um pH de 6,5.

« —1

A velocidade de eluição foi 5 ml.h. .cm

As fracções activas provenientes da eluição foram reunidas, concentradas e aplicadas a uma coluna de lectina de germe de trigo Sepharose^) (10 ml) (obtida a partir de Pharmacia, Uppsala, Suécia) equilibrada com 0,15 M de fosfato de sódio a um pH de 6,5. A enzima foi eluícLa com vibrações com N-acetil-D-glucosamina no tampão de fosfato.

As fracções activas do passo atrás foram reunidas, concentradas, submetidas o diálise contra fosfato de sódio

0,15 M a pH = 6,5 e aplicadas a uma coluna CL-6B de Sepharo

ÍR) ” se^k ' azul (Cibacron Blue P3G-A) (volume de leito 6 ml) (obt da a partir de Ph.armacia, Uppsala, Suécia) equilibrada com tampão de fosfato. Após lavagem da coluna com tampão foi in troduzida um impulso de 10 mM de NAD e 10 mM de NADP. Após os nucléotidos de piridina terem sido lavados com tampão, a enzima foi eluída com K Br O,9M/5O mM de fosfato de sódio a pH igual a 6,5·

As fracções activas da coluna de Seph.arose^·' azul foram reunidas, submetidas a diálise contra 25 mlá de fosfa to de Na a um pH de 6,5 e aplicadas a uma coluna de heparins-

-Sepharose^ (volume do leito 10 ml) (obtida a partir de Piar macia, Uppsala, Suécia) equilibrada com o mesmo tampão. A cc luna foi então eluída com 140 ml de um gradiente de NaCl 0-1 M no tampão de fosfato. A actividade foi eluída em três picos distintos: A não se ligou à heparina, B desadsorveu-se no gradiente no início da eluição e C desadsorveu-se mais tarde.

pico A continha o material que absorve UV que provavelmente se tinha escoado da coluna de heparina-Sepharose' e foi posteriormente purificada numa coluna de Sephacryl^) s-JOO (1,6 x 90 cm) (obtida a partir de Pharmacia, Uppsala, Sweden). A amostra foi eluída com 25 mlí Tris. .HC1 a um pH de 7,5·

As fracções A, B e 0 foram submetidas a diálise contra 25 mki de Tris.HCl a um pH de 7,5 θ depois concentradas para cerca de 1 ml em membranas de ultrafiltração Amicor UM-10. A Fracção 0 foi empregada para produzir anticorpos de EC-SOD como se descreve no exemplo seguinte.

ΞΣμ-lPLO 3

Preparação de EC-SOD anti-humana de coelho

A fracção C de EC-SOD foi preparada como se descre veu no Exemplo 2. Injectou-se um coelho por via subcutânea com 30 yig de EC-SOD num adjuvante completo de Freund. A imunização foi depois reforçada com 5 injecções de 30 /tg de EC-SOD no adjuvante incompleto de Freund em intervalos de um mês. Duas semanas depois de administrada a ultima dose de reforço, o coelho foi sangrado até à morte e o seu soro reco lhido. A fracção IgG do anti-soro foi isolada por adsorção e desadsorção a partir de Proteina A-Sepharose^^ como recomer da o fabricante (Pharmacia, Uppsala, Suécia). A eluição a partir da coluna foi realizada com glicina-HCl 0,1 m de pH •48- _

3,0. Logo a seguir à eluição, a fracção recolhida IgG foi titulada até um pH de 7,0. A fracção IgG foi depois submeti da a diálise contra carbonato de sódio 0,1 m, pH 8,3 + NaCl 0,15 M, tampão de acoplamento.

A Sepharose activada com CN Br foi intumescida e preparada como recomenda o fabricante (Pharmacia, Uppsala, Sweden). A IgG como se descreveu atrás foi diluída até cerI ca de 5^_8 mg/ml com tampão de acoplamento. A CU Br-Sepharose activada foi adicionada e a mistura incubada com agita ção durante a noite a 4°C. Foi acoplado cerca de 5 mg de IgG por ml de gel. 0 tampão foi aspirado do gel e analisado quan to à proteína restante. Atinge-se normalmente um acoplamento acima dos 98%. 0 gel acoplado a IgG foi depois bloqueado por suspensão em etanolamina 1 M durante a noite, a 4°C. De pois, o gel foi lavado com tampão de acoplamento seguido por acetato de sódio 0,1 M, pH 4,0 + NaCl 0,5 M. 0 gel foi depois conservado em tampão de acoplamento com azida como agente anti-bacteriano.

A capacidade de ligação máxima dos anticorpos imo bilizados foi determinada por incubação durante a noite com um excesso de EC-SOD e por análise da EC-SOD restante. Após a centrifugação, o resultado é comparado com uma incubação simulada com Sepharose^) 43.

Adicionaram-se 100 ml de uma suspensão a 50% de anti-EC-SOD-Sepharose a 0,5 ml de EC-SOD em tampão de aco plamento. Realizou-se paralelamente uma incubação simulada (p j com 100 AL de uma suspensão a 50% de Sepharose^ ^J 4B. As sol luções foram agitadas durante a noite a 4°C e depois centri fugadas. A actividade restante da solução tratada em Sepharose(^S)-4B foi 2080 U/ml e da solução tratada em anti-SC-SOD

-Sepharose foi 720 Unidades/ml. Utilizando estes dados foi possível calcular que 1 ml de gel de anti-EC-SOD-Sepharose

se ligou a 13500 unidades de EC-SOD (cerca de 120 jtg). Este número foi utilizado para a programação da adsorção de EC-SOD a partir de homogenatos de tecido humano.

EXEMPLO 4 ~ ίϊ Ί

Imuno-adsorçao de EC-SOD a anti-EC-SOD-Sepnarose^{k 7} Tratou-se de uma só vez 10 1 de extracto de cordãc umbilical preparado como se descreveu no Exemplo 1. 0 conter do de EC-SOD do extracto era de cerca de 150 U/ml. Se o gel ligar 13600 U/ml (ver Exemplo 3), a adsorção de toda a EC-SOD em 10 1 de extracto necessita cerca de 110 ml de anti-EC-SOI -Sepharose.

Em primeiro lugar, centrífuga-se o extracto (6000 x g, 30 min.) para remover a proteína precipitada. Adiciona-se depois à substância sobrenadante 110 ml de anti-EC-SOD-Sepharose e incuba-se a mistura durante a noite a 4°C, com agitação e separa-se o gel do extracto num funil de vidro. 0 gel foi depois lavado no funil com grandes quantidades de foefato de K 50 mívl, pH 7,0 + NaCl 0,5 K.

gel foi colocado numa coluna cromatográfica com um diâmetro de 5 cm. A eluiação iniciou-se com fosfato de K 50 mM, pH 7»0 + NaCl 0,5 X a uma velocidade de 50 ml/hora e regista-se o valor da absorvância a 280 nm. Continuou-se a elutriação até se ter atingido um valor A 280 muito baixo. A EC-SOD foi depois elutriada com um gradiente linear de KSCN, 0,5-2,5 X, cm 50 mM de fosfato de K, pH 7,0. 0 volume total de gradiente é de 500 ml e a eluição é realizada a 30 ml/h. A desadsorção de EC-SOD foi lenta e a eluição não pode ser acelerada.

fluído de eluição foi recolhido num coletor de fracções. Para proteger a EC-SOD eluída da concentração elevada de KSCN, inseriu-se um tubo em T no tubo de plástico a

partir da parte final da eluição da coluna e injectou-se água destilada com um caudal duplo do caudal de eluição da coluna.

A eluição resultante da proteína (a A 280) e da EC-SOD é representada na Fig. 1. Parece que a eluição de EC-SOD não é completa no fim do gradiente KSCN 2,5 M, mas a eluição não deve continuar para que não seja recolhida a EC-SOD que se tornou demasiado desnaturada devido à elevada concentração de KSCN.

A EC-SOD foi reunida como se indica na figura. A primeira actividade no gradiente não foi recolhida visto conter uma relativamente grande quantidade de contaminantes ligados à proteína (A 280). A maior parte de A 280 no gradi ente deriva de KSCN e sómente no começo se vê um pico peque no significativo de proteína. Para a regeneração agita-se depois o gel durante a noite um KSN 2,5 lava-se a seguir com fosfato de potássio 50 mivl, pH 6,5 + NaCl 0,5 M e depois com tampão sem NaCl. Adicionou-se por fim a azida como agen te anti-bacteriano. Antes de utilizado, o gel é lavado com fosfato de K 50 mM sem azida a um pH de 6,5·

EEKP10 5 (R)

Adsorção em eluição a partir de DEAE-Sephacel

Ao eluato recolhido a partir da coluna de anti-EC· -SOD-Sepharose adicionou-se 1-amino-metil-propanol até uma concentração final de 10 mM. A solução foi então titulada até um pH de 9,0 com NaOH 1M e diluída com cerca de 5 volumes de água destilada. À solução resultante adicionaram-se 40 ml de DEAE-Sephacel^^ equilibrada com fosfato de Na 50 mM + NaCl 0,5 M + 175 πικι de Tris-HCl de pH 9,6.

Deixou-se a EC-SOD ser adsorvida em DEAE-Sephacel com agitação durante a noite a 4°C. 0 DEAE-Sephacel^ foi

R)

2Ί.

depois colectado num funil de vidro, lavado com fosfato de Na 50 mK de pH 6,5 e introduzido numa coluna cromatográfica com um diâmetro de 2,5 cm. A coluna foi em primeiro lugar eluída com cerca de 4 volumes do tampão antsrior. A EC-SOD foi então eluída com fosfato de Na 50 de pH 6,5 + NaCl 0,25 M como se indica na fig. 2. A actividade foi reunida como se mostra na Fig. 2, submetida a diálise contra fosfato de Na 25 mM de pH 6,5 θ por fim concentrada até cerca de 2 ml.

EiaiPlO 6

Purificação final de EC-SOD em heparina-Sepharose

Aepararam-se quatro cargas de eluído da DEAE-Sephacel^^R\ como se descreveu atrás, de uma só vez em hepari na-Sepharose^\ As soluções de enzima a ser aplicadas foram submetidas a diálise contra fosfato de K 25 mM de pH 6,5·

Separaram-se 20 ml de gel de heparina-Sepliarose como recomendou 0 fabricante (Pharmacia, Uppsala, Sweden) e lavaram-se com fosfato de K 25 πώϊ de pH 6,5 contendo NaCl 1 M e depois com tampão sem NaCl. A heparina-Sepharose foi in troduzida numa coluna cromatográfica com um diâmetro de 2,5 cm e iniciou-se a eluição com fosfato de K 25 mM de pH 6,5 a 15 ml/h. Aplicou-se depois a solução de EC-SOD (cerca de 10 ml, 800 000 unidades) e a absorvência a 280 nm foi contrc. lada (ver Fig. 5). Quando, após 0 primeiro pico, a A 280 se aproximou da linha da base, a EC-SOD foi eluída com um gradiente de NaCl de 0 a 1,2 M de NaCl. 0 volume do gradiente era de 400 ml. Á EC-SOD eluíu-se em três picos; um com afim dade nula para a heparina, outro com afinidade intermédia e 0 outro com afinidade elevada. Os picos correspondem às frac ções A, B e C descritas no Exemplo 2. Quando purificada pelo processo presente, quase toda a actividade é do tipo C e conclui-se portanto que se assemelha à forma natural da en-

zima. 0 pico C foi obtido como se mostra na Fig. 3.

A actividade reunida era de 450 000 unidades (cerca de 4,3 mg). A actividade específica era 81 100 (U por ml/ /A 280). Encontraram-se subumidades de gel de cerca de 30 00 D em SDS-PAGE. Não se detectou nenhum sinal de contaminação. A actividade reunida representava cerca de 53% da actividade

Cr) aplicada na heparina-Sepharose^k‘'.

EXEMPLO 7

A sequência amino-texminal de EC-SOD humana

Analisou-se a EC-SOD humana obtida como se descreveu nos Exemplos anteriores relativamente à sua sequência de aminoácido (N-terminal) através de processos padrão (Edman et al. Eur. J. Biochem. 1, 1967, pág. 80-87). Verificou-se que a sequência dos primeiros 33 aminoácidos era:

TRP

THR

GLY

GLU

ASP

SER

ALA

GLU

PRO

ASN

SER

ASP

SER

ALA

GLU

TRP

ILE

ARG

ASP

IvIET

TYR

ALA

LYS

VAL

THR

GLU

ILE

TRP

GLN

GLU

VAL

MET

GLN

Esta sequência - ou uma parte apropriada dela - po de ser utilizada para produzir amostras sintéticas de DNA, deoxi-oligonucleótidos complementares a ambas as cadeias codificantes e não codificantes da sequência de DNA que codifi cam para a sequência de aminoácido indicada atrás.

Essas amostras podem ser utilizadas em experiências de hibridação com culturas de cDNA produzidas a partir de mRNA das células ou tecidos produtores de EC-SOD, com vista a isolar uma cópia parcial ou total de cDNA de um gene de 3C· -SOD, como se descreve nos Exemplos seguintes.

EXEMPLO 8

Clonagem e formação da sequência de EC-SOD humana

Preparação de uma amostra de DNA

- 55 a partir dos cor Exemplos 1-6 e

Purificou-se EC-SOD humana obtida does umbilicais como se descreveu atrás nos determinou-se a sequência dos 35 primeiros aminoácidos N-ter minais como se desenvolveu no Exemplo 7· Com base nesta sequência de mainoácido e na utilização do codão postulado (Gr tham et al., Nucl. Acids Ees. 9, 1981, pág. 45-74) para proteínas eucarióticas sintetizou-se de acordo com o processo descrito por Matth.es et al. (EMBO Journal 5, 1984, pág. 801-805) fim deoxi-oligonudeótido sintético 48-mérico complemen tar da cadeia de codificação do gene de EC-SOD.

an

Escolha de uma cultura de cDNA de placenta humana

Obteve-se a cultura de cDNA de placenta humana pre parada no vector ^gt 11 a partir de Clontech Laboratories, Inc., 922 Intustrial Avenue, Paio Alto, CA 94305, Estados Unidos da América (Catalogue No. HL 1008 Lot N2. 1205)· Os bacteriófagos recombinantes foram escolhidos de acordo com as sequências de cDNA de EC-SOD revestindo os bacteriófagos sobre a estirpe indicadora E-coli I 1090. A transferência das placas e o tratamento de filtros de nitrocelulose (Hybord C, Amersham Inc) foram feitos essencialmente como descreveu Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982). Oito filtros de nitrocelu lose para os quais se transferiram 20 000 placas por filtro foram pré-embebidos com 5 x SSC e depois pré-hibridados durante uma hora a 41°C em 40 ml de formamida a 20%, 5 x ^a solução de Denhardt, 50 mM de fosfato de sódio, pH 6,8, e 50 jU,g/ml de DNA de timo de vitela, submetido a tratamento por ultrassons, desnaturado. Os filtros foram então hibridados ate 7 x 10 contagens por minuto e por ml de amostra 48-merica de ^9<iP- &- ATP marcada na extremidade e descrita atrás. A hibridação foi realizada na solução de pré-hibridação suplementada com 100 M ATP (concentração final) durante 18

-5^--

horas a 41 °C. Após a incubação a 41°C durante a noite, lavaram-se os filtros uma vez em 0,2 x SSC a 37°C seguindo-se 4 lavagens em 0,2 x S30, SDS a 0,1% a 57°O e por fim secagem ao ar. Os filtros foram expostos a um filme de raios-X Dupont Cronex 4, durante a noite e a Fig. 4 mostra um dos autorradiogramas. Cada filtro continha cerca de 6 placas positivas.

Os fagos das placas que apresentam uma reacção de hibridação positiva foram isolados é purificados, e o DNA desses fagos foi extraído por métodos descritos por Davis et al. (Advanced Bacterial Genetics Cold Spring Harbor Laboratories, 1980) e o comprimento do que se acrescentou a cDKÍ foi determinado por elutroforese em gel de agarose após clivagem do DNA do fago com a endonuclease de restrição EcoPJ. 0 fago recombinante possuindo a parte inserida de cDNA mais longa foi designado SP3 tendo sido escolhido para outros posteriores estudos.

A parte inserida de cDEA a partir do fago Λ3Ρ3 foi submetida a análise com endonuclease de restrição e formou sequência após sub-clonagem em pUCIS e no vector M 13 mp 9 respectivamente. Demonstrou-se que a parte inserida era DNA que codifica para EC-SOD humana comparando a sequência de aminoácido derivada da sequência de DNA com a sequência peptídica da proteína purificada e pelo seu produto de expressão em células CHO. A parte inserida isolada dehSP3 continha 1396 bp de cDNA e uma estrutura de leitura aberta que co difica para uma proteína de 24C aminoácidos e uma região não traduzida de 69 bp 5’ θ 607 bp 3’. (ver figuras $s. e b).

Subclonação e análise com endonuclease de restrição das partes inseridas de cDNA que codificam para a EC-SOD humana

Fez-se a digestão de 30 >g de DITA ÁSP3 com a endo-

nuclease de restrição EcoRI e separou-se a parte inserida de cDNA de ΛΰΝΑ por electroforese num gel de poliacrilamida a 6%. Isolou-se aproximadamente C,2 de fragmento de cDNA a partir do gel por electro-eluição, extracção com fenol e clorofórmio e precipitação com etanol (Maniatis et al., supra). Ligou-se 0,05 g do fragmento de cDNA isolado a 1 /tg de DNA pUC 18 tratado com fosfatase alcalina digerida com EcoRI de endonuclease de restrição (Norrander et al., Gene 26, 1983, pág. 101-106). 0 DNA ligado foi transformado para a estirpe E.coli HB 101 (J. Mol. Biol. 41, p. 459)· Os trans formantes foram seleccionados em placas que continham ampicilina. Um plasmideo recombinante possuindo a parte inserida de cDNA foi indentifiçado e designado como pLS3· 0 plajs mídeo DNA pLS3 foi submetido a análise com endonuclease de restrição.

Análise da sequência de DNA de cDNA que codifica para EC-SOD humana

A sequência de DNA da parte inserida de cDNA a partir do fago?iSP3 que codifica para EC-SOD humana foi determinada pelos processos de Sanger et al. (Proc. Natl. Acai. Sei. USA 74, 1977, pág. 5463-546?; F. Sanger e A.R. Ooulson, FEBS Letters 87, 1978 pág. 107-110) e Líessing et al. (Nucl. Acids Res. 9, 1981, pág. 309-321; P. H. Schreir e R. Cortese, J. Mol. Biol. 129, 1979, pág. 169-172) após clonagem do fragmento de cDNA M13 no sítio EcoRI do vector mp9 (J. Messing e J. Vieira, Gene 19, 1982, pág. 269-276).

Uma série sequencial de clones de sobreposição da parte de cDNA. inserida foi gerada no vector mp9 1115 de acor do com 0 método descrito por Dale et al. (Plasmid 13, 1985, pág. 31-40). Utilizando este método, determinou-se a sequên cia completa dos nucleótidos, de ambas as estirpes de DNA do cDNA e verificou-se ter um comprimento de 1396 bp.

A sequência de nucleótidos e as sequências de ami noácido deduzidas da parte de cDíTA inserida de F35 não apre sentadas na Figura 5· A parte de cDNA inserida tem uma estrt tura de leitura aberta de 240 aminoácidos. A sequência de aminoácido da proteína madura purificada é iniciada no aminoácido +1 que sugere um peptido de sinal putativo de IS ami noácidos. Como peptidos de sinal conhecidos, esta sequência de aminoácidos é rica em aminoácidos hidrofóbicos e, além disso, o último resíduo é alamina que é ura dos aminoácidos encontrados nesta posição em peptidos de sinal conhecido (G.

quências de aminoácido sublinhadas foram confirmadas pelas sequências de peptido.

Um outro aspecto da sequência de UFA é a sequência encontrada no codão de iniciação de translação, -CAGCCAUGCque é homólogo à sequência de consenso postulada para os sí-

Nucl. Acids, Res. 12, 1984, pág. 857-872). Além disso, um possível sinal de poliadenilaçao com a sequência -ATTAAAhomóloga da sequência de consenso postulada AATAAA é de 14 bp a montante da cauda da poliadenilaçao.

Expressão de EC-SOD humana em células CHO

Utilizou-se um vector de expressão contendo o Simiau Virus 40 (SV40) como origem da replicação, promotores anteriores e posteriores, sequências de poliadenilaçao e ter minação para produzir EC-SOB humana codificada pelo cBEA des crito atrás. 0 cDEA com 1596 bp de comprimento foi inserido num sítio de clivagem por endonuclease de restrição EcoRI único localizado entre o promotor anterior de SV40 e a polia denilação SV40 e as sequências de terminação de tal forma que a eaqçressão da sequência que codifica para EC-SOB humana é controlada pelo promotor anterior de SV40 (Fig. 6). Es te plasmídeo de expressão de EC-SOD construído foi designado pPSJ.

Linearizaram-se 20 /cg de pPS3 DEA por clivagem con a endonuclease de restrição Pstl no sítio Pstl único localizado no gene de /3-lactamase. O pPS3 DNA linearizado foi cotransfectado com 0,5 /g de DNA a partir de um plasmídeo contendo sequências que conferem resistência à Geniticina (sulfato G-418, Gibco Ltd.) em células CH0-K1 (ATOO CCL61) pelo método de Graham e Van der Eb (Virology 52, 1973, pág. 456-467). As células transfectadas foram seleccionadas por cres cimento em meio (meio de Ham F12 suplementado com soro de vitela fetal a 1C$, estreptomicina e penicilina) que contém 700 /cg por ml de Geniticina (sulfato G-418, Gibco Ltd.). As colónias resistentes a Geniticina foram isoladas e propagadas no mesmo meio. 0 meio foi removido em. intervalos e experimentado relativamente à presença de EC-SOD por ELISA e medições de actividade de enzimas como se descreve a seguir.

Varias das linhas de células testadas apresentaram produção comparável de EC-SOD humana e uma das linhas de células obtidas foi denotada CHO-Kl/pPS3neo-18 e seleccionada para posteriores estudos.

Secreção de EC-SOD para o meio lulas CHO que contêm o gene que codifica na.

de cultura por cépara a EC-SOD huma0 clone CHO-Kl/pPS3neo-18 e as células ClíO-Kl parentais foram desenvolvidas para confluir em meio de Ham F-12 que contém soro de vitela fetal a IO;;. Após 5 dias, 0 meio foi removido e as células lavadas duas vezes com solução salina tamporizada com fosfato. As células separadas dos frascos de cultura por incubação que contém 40 mM de Tris-HCl, 140 mil de NaCl e As células recolhidas (cerca de 8 x 10 ) foram foram depois numa solução 1 Ml de EDTA. depois centri

fugadas, a substância sobrenadante retirada e as células armazenadas a -80°C como uma pastilha. As células foram depois desintegradas por meios ultrassónicos em 1,5 ml de uma solução que contém fosfato de K 50 mH de pH 7,4, K Br 0,311, 3ní£ de DTPA, 0,5 mlí de PMSF e 100 ΚΙΞ/ml de trasilol. Os homogenatos foram depois centrifugados. A determinação específica da quantidade de EC-30D foi realizada através da incubação dos homogenatos e meios de cultura com anticorpos imobilizados dirigidos para EC-SOD humana e CuZn SOD humana, descrito em Ohman e Marklund, chim. Sei. 70, 1986, pág. 385-369· Não se encontrou nenhuma EC-SOD nas células CHO Kl parenterais ou no seu meio de cultura. 0 meio de cultura a partir das células de clone CliO-Kl (pPS3neo-18) (15 ml) contém, nes, ta experiência particular, 51 U/ml de EC-SOD num total de 765 U. 0 homogenato das células (em 1,5 ml) contém 71 U 1® actividade de SOD das quais 20 U são de EC-SOD humana. Assim 97,5% de EC-SOD na cultura de CH0-Kl/pPS3neo-18 foi segregada para o meio.

Produção de EC-SOD humana em células de CKO

A produção de EC-30D humana por este clona foi determinada quando as células se desenvolveram num suporte sólido e em suspensão.

1. Produção de EC-SOD através do desenvolvimento de células CHO-Kl/pPS3neo-18 em suportes sólidos.

a) Inoculou-se um frasco de 175 cm' com 4,5 x 10° células em 30 ml de meio de Ham F12 (Flow Laboratories) suplementado com 10% de soro de vitela fetal, 2 mH de L-gluta mina, estreptomicina e penicilina. As células foram incubadas a 37°C em ar contendo 5% de CO . 0 meio foi mudado de

A A 2 tres em tres dias e a concentração de EC-SOD Inumana segrega da no meio de desenvolvimento foi determinada como se descre ve a seguir na secção entitulada Ensaios para a detecção

da expressão de EC-SCD humana. A produtividade de EC-SOD humana foi de 1,5 pg· células .24 horas como se mediu por ELISA e por determinação da actividade de enzima EG-SOD.

b) Inocularam-se 4 mg/ml de microveículos (m.c) (Cytodex 5» Pharmacia, Suécia) com células a uma concentração de 7 células/m.c no meio de Ham F12 (Flow Laboratories) suplementado com 5% de soro de vitela fetal, 2 ml,’ de L-glutamina, estreftomicina e penicilina.

As células foram desenvolvidas num frasco com agitador de 500 ml (Techne) a 57°O em ar com 5% «de 00₂. No desenvolvimento confluente das células, a cultura foi tratada a uma velocidade de 0,088.31^.

A proiutividade de EC-SCD humana foi 0,50 pg. células~1.24 horas~l.

2. Produção de LC-30D por desenvolvimento de células CH0-Kl/pPS5neo-18 em cultura em suspensão.

Inocularam-se 125 ml de meio (liam F12 suplementado com soro de vitela fetal a 10%, 2 míí de L-glutamina, r

ptomicina e penicilina) com 2 x lCr celulas/ml. Incubou·

se a cultura em frascos giratórios (Techne) a 57°O ® em. ar conter do 5% de C0₂.

De três em três dias mudou-se o meio e a produtivi —1 —Ί dade de EC-SOD humana foi 0,65 pg. célula .24 horas .

Ensaios para a detecção da expressão de EC-SOD humana

1. Ensaio da enzima ligada por imuno-adsorção (ELI SA)

Revestiram-se placas de microtitulação (Nunclon, Nunc A/S, Denmark) com 100 pX de uma solução que contém. 15 yltg por ml de anticorpos IgG de anti-EC-SCD de coelho policio nais (preparado como se descreveu no Exemplo 5) ®m 15 mií de f J Ç}’T ^-y

V'¹*

* i

i

Na₂C0p 35 mM de NalICOp NaE^ a 0,02%, pH placas com PBS (fosfato de sódio 10 mia, 145 mlí de NaCl, pH

7,2) após incubação durante a noite e à temperatura ambiente

As placas de microtitulação foram incubadas durante 30 minutos a 37°C com 200 4IL de uma solução que contém albumina de soro bovino a 3% (p/v) em PBS e lavadas com PBS. Adicionaram-se 100 de amostras de meio diluído e incubaram-se durante 1 hora a 37°C· As placas foram, lavadas com Tween''·^ 20 a 5% (v/v) em PBS seguindo-se a incubação durante 1 hora a 37°3 com 100 /tl de uma solução que contém 8 por ml de um anticorpo de rato de anti-EC-SOD monoclonal (ver Exemplo 7) ©& albumina de soro bovino em PBS. Após lavagem com Tween^^ 2C a 5/o ©m PBS, as placas foram incubadas durante 1 hora a 37°C com um anticorpo de anti-rato de coelho conjugado com peroxidase (Dakopatts A/S, Dinamarca) em albumina de soro bo vino a 3% em PBS. As placas foram lavadas com. Tween^¹¹⁷ 20 a

5% em PBS e incubadas durante 20 minutos à temperatura ambi ente, to de no escuro, com 100 /cl de uma solução de substrato (cit sódio 50 mM» 100 ml de fosfato de sódio, 0,04% (p/v) de 0-fenileno-diamina, 0,01% de H₂0₂, pH 5»0). A reacção foi interrompida por adição de 25 yzl de SDS a 10% e a absorvância medida a 450 nm.

2. Determinação da actividade da enzima EC-SOD

A actividade da enzima SOD foi determinada como se descreveu em ...arklund, J. Biol. Ohem. 251» 1976» pág. 7504-750?. Para atingir a especificidade para a EC-SOD humana, as amostras foram analisadas antes e depois do tratamento com EC-SOD anti-humana imobilizada em Sepharose''·’¹·'·' (ver Exem pio 4). A actividade da EC-SOD foi considerada como a diferença entre a actividade da amostra antes e depois da adsorção ao anticorpo.

EXEMPJLO 9

- 61 ι · /Λ -^?rv —

Libertação induzida por heparina de EC-SOD em pias ma de sangue humano

Injectaram-se 200 UI/Kg de peso de corpo de heparina (obtida a partir de AB KABI-VITNUM, Estocolmo, Suécia) por via intravenosa em dois indivíduos do sexo masculino sau dáveis mantidos em jejum durante a noite β) 54 anos de idade e b) 40 anos de idade]. As amostras de sangue foram retiradas antes da injecção da heparina e, depois da injecção, em intervalos, como se indica na Figura 7· As amostras de sangue foram rolhadas em tubos de vácuo Terumo Venoject contendo EDTA como anticoagulante e centrifugadas. Após a centrifugação, as amostras de plasma foram conservadas a -80°C até ao ensaio.

Além disso, tomaram-se 20 ml do sangue total de três pessoas saudáveis e conservaram-se em tubos, contendo EDTA como se descreveu atrás. 0 sangue foi dividido em duas partes iguais tendo sido adicionado a uma 30 UI de heparina/ /ml e à outra um volume igual de NaCl 0,15 M. Após a incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente, as amostras foram centrifugadas e o plasma recolhido para teste de SOD.

A actividade de SOD foi testada através do método espectrofotométrico directo, utilizando KO^ (S.L. Ivíarklund, J. Biol. Chem. 251, 1976, pág. 7504-7507) com modificações como se descreveu em Ohman e Marklund, Clin. Sei. 70, 1986, pág. 365-369· Uma unidade da actividade de SOD corresponde a 8,3 ⁿg Ue CuZn SOD humana, 8,8 ng de EC-SOD humana e 65 ng de MnSOD bovino. A distinção entre as isoenzimas no plasma foi conseguida através de anticorpos dirigidos a CuZn SOD e EC-SOD humanas, imobilizados, em Sepharose^' 4B como se des creveu em Ohmann e Marklund, Clin. Sei. 70, 1986, pág. 365-369·

Os resultados representados na Fig. 7 indicam que

uma injecção intravenosa de 2CC UI por Kg de peso de corpo, conduz a um crescimento três vezes mais rápido da actividade de EC-SOD no plasma. 0 aumento máximo é atingido após 5 minutos. A actívidade permanece elevada durante 15-30 minutos e depois diminui, gradualmente, até atingir o nível inicial, após mais de 6 horas. A heparina injectada por via in travenosa não tinha nenhum efeito sobre o CuZn SOD do plasma nem sobre as actividades de SOD resistentes a cianeto.

efeito da administração ate 200 UI/Kg de peso de corpo de heparina intravenosa na libertação de EC-SOD para o plasma é representado na Fig. 8.

Como mostram as figuras, parece que o aumento das doses de heparina dão origem a um aumento de libertação de EC-SOD. Aparentemente, não se atinge nenhum patamar e é pro vável que as doses acima de 200 UI/Kg de peso de corpo deem origem a uma libertação de EC-SOD mesmo elevada. Considerações éticas, porém, excluem testes com doses mais elevadas.

Contrariamente aos resultados obtidos in vivo, a adição de heparina ao sangue total como se descreveu não tinha nenhum efeito sobre a actívidade de EC-SOD do plasma. Nem tão pouco, a adição de heparina (5 VI/ml) directamente ao plasma, dá origem a qualquer variação da actívidade de EC-SOD. Os resultados indicam que o aumento da actívidade de EC-SOD no plasma, in vivo, como se viu na Figura 7, não é provocada por qualquer libertação da enzima a partir das células de sangue nem por activação da presença de EC-SOD no plasma.

As amostras de plasma a partir de 5 pessoas saudáveis (3 do sexo masculino, 2 do sexo feminino) foram submetidas a cromatografia em heparina-Sepharose^' (adquirida a Pharmacia, Uppsala, Suécia). A cromatografia foi levada a efeito à temperatura ambiente em colunas que contêm 2 ml de

heparina-Sepharose^'-' com fosfato de potássio, 25 Mí, pH 6,5, como eluente. As amostras (2 ml de plasma) foram aplicadas a 4,2 ml/h e quando a A-£qq se aproximou da linha de base, os componentes associados foram eluídos com um gradiente linear de NaCl em tampão de fosfato de potássio (0-1 ..., volume total de 50 ml) a 9 ml/h (ver Fig. 9)· 0 rendimento médio da actividade de SOD, no eluído, foi cerca de 95%·

Antes da aglicação, as amostras de plasma foram, equilibradas com o tampão de eluição através de cromatografia em colunas (ΡΓ-10) pequenas de Sephadex^-' G 15 (também adquiridas em Pharmacia, Uppsala, Uppsala, Suécia). A recuperação da actividade de SOD foi quase igual a 100%.

Os resultados da determinação das fracções A, B e

C de EC-SOB em 5 amostras de plasma normal estão apresenta dos na Tabela 1 a seguir. Verificou-se aproximadamente que, as três fracções eram grandes no plasma normal. Q rendimen to médio da actividade de EG-SOB A separação em três fracções não no crornatograma,

é aparentemente provocada pela degradação secundária, in vitro, visto que os andamentos das curvas para uma espécie de plasma foram idênticos, antes e depois de armazenagem durante 5 dias, sobre a composição das fracções de EC-SCD no plasma é representado na Fig. 9· Verificou-se que a injecção intravenosa de hcparina na pessoa analisada conduz a um aumento apenas insignificante da fracção C. A e 3 permanecem essencialmente invariáveis. Fuma segunda pessoa analisada (dados não apresentados), o efeito da injecção de heparina foi essencialmente idêntico. A fracção C aumentou de 7 para 32 unidades/ml de plasma.

Tabela I

Separação cie EO-.tOI) de plasma plasma

Ç>7 W '*Í7 (Jb*·***

Idade sexo

40/sexo
masculino	5,9	6,2	7,0
34/sexo
masculino	5,2	4,4	5,1
32/sexo
masculino	9 Z	5,2	6,4
33/sexo
feminino	o z —,	5,9	O 7
2 9/sexo
feminino	z z	6,1	7,3
média + desvio
padrão	3,5 + 1,5	5,6 + 0,8	6,8 + 1,2

As experiências descritas atrás mostram que a injecção intravenosa da heparina conduz a um aumento rápido da actividade de EO-SGD do plasma. A heparina não activa a IQ“SOD nem se pode demonstrar qualquer libertação das células do sangue, supondo-se serem, as superfícies das células endoteliais a fonte mais provável de libertação de mC-SOD. Verificou-se já que um. número de outros factores com afinidade para a heparina, lipoproteína lipase, lipase hepática, diamina oxidase e factor 4 das plaquetas são de um modo semel te libertados rapidamente pela heparina intravenosa. Ha maio parte destes casos, é evidente que o deslocamento da proteína induzido pela heparina a partir do sulfato de heparano nas superfícies das células sndoteliais é a explicação do fenómeno (A. Eobinson-white et al., J. Clin. Invest. ?6, 198 iian

pág. 93-100; C. Bush et al., Throm. Ees. 19, 1980, pág. 129-137)♦ á provável que a libertação de EC-SOD possa ser expli cada da mesma maneira.

Não se verificou a existência de nenhum patamar distinto nas placas na libertação para doses de heparina até 200 UI/Kg de peso de corpo, verificando-se que é necessária mais heparina para a libertação máxima de EC-SOD do que para a libertação da lipoproteína lipase, diamina oxida se, lipase hepática e factor das plaquetas 4. A relação entre a afinidade para a heparina e sulfato de heparano pode ser menor para EC-SOD do que para as outras proteínas.

plasma humano basal contem quantidades muito aproximadamente iguais das fracções A, B e C de EC-SOD. A heparina intravenosa libertou apenas a fracção C com elevada afinidade para a heparina, que é evidentemente a forma que tem afinidade para as superfícies das células endoteliais. 0 aumento atingido neste caso foi de 4-6 vezes mais é provável que doses maiores de heparina dessem origem a uma relação maior. Relações muito maiores forem atingidas para a lipoproteína lipase, lipase hepática, diamina oxidase e factor das plaquetas 4. A ligação endotelial de EC-SOD comparada com estas proteínas, parece bastante mais frouxa. Exis te possivelmente um equilíbrio para a fracção C de EC-SOD entre o plasma e as superfícies das células endoteliais. A maior parte de EC-SOD no sistema vascular parece estar loca lizada nas superfícies das células endoteliais.

A base molecular para a diferença da afinidade da heparina entre as fracções A, B e 0 está ainda por resolver. 0 aminoácido e as composições de subunidades não são significativamente diferentes (S. L. Llarklund, Eroc. Fatl. Acad. Sei. USA 79, 1982, pág. 7654-7638). liem quaisquer diferenças antigénicas puderam ser detectadas (S. L. Líarklund, Biochem. J. 220, 1984, pág. 269-2/2). A ligação à heparina carregada ca visto que nenhuma diferença entre as pode detectar na cromatografia de troca de iões tos isocléctricos são fí negativamente não é aparentemente de natureza de tr-oca-iónifracções A e C se os seus ponidenticos (pH = 4,5). A diferença não é devida à degradação in vitro, visto que o armazenamento do num. frigorífico não variou o andamento arina-Seplarose^¹·⁷ . Embora a degradação in , podia-se especular que as fracB sao destinadas especificamente à protecção de com fluídos e a fracção 0 â protecção de superfícies ce plasma durante 5 dias da eluição na hep· vivo seja uma possibilidade çoes A e ponentes lulares.

tipos de células do corpo possui glucose-amino-glicanos sulfatan. iróõE et al., Ann. Rev. Biochem.

É possivel que uma grande parte de 1. Marklund, J. Clin. localizada em tais c no tecido conecdas células peara céluA maior parte dos sulfato de heparano e outros dos nas suas superfícies ( 53, 1984, pág. 847-869).

EO-SOD que se encontra nos tecidos (3. Invest. 74, 1984, pág. 1398-1403) esteja substâncias sobre as membranas celulares tivo. A ligação de EC-SOD às superfícies ser uma maneira especialmente eficaz de protecção das las contra radicais superóxido extracelularmente formados. Ê interessante notar que a substituição de QuZn 3CD por poli lisina para facilitar a associação com membranas celulares carregadas negativamente aumentou bastante a capacidade da enzima para proteger os lucócitos polimorfo-nucleares activa dos contra a sua própria inactivação (d. L. Salin e J. L_. Ec Cord, em Superoxide and Superoxide Dismutases, eds. A. II. Ei chelson, J. L. lícCord and I. Fridovich, Academic Dress, 1977 pág. 257-270). A SOD de Eocardia asteroides associada às mem branas celulares confere protecção eficaz à bactéria contra leucócitos polimorfo-nucleares activados (3. I. Beaman et al Infect. Immun. 47, 1985, pág. 135-140). Os microrganismos que não possuem afinidade para a fracção 0 de EO-SOD não be5

neficiavam de protecção pela enzima ao contrário da maior parte das células do corpo.

Ê evidente que os rad.ica.is superóxido produzidos por leucócitos activados e também por outros tipos de células podem sob certas condições directa ou indirectamente in duzir danos cromassomais (J. Emerit, Lymphokin.es 3, 1985, pág. 413-424; A.

T P. Stossel, J.

3. »7 eito erg, S. A. weiteman, E. P. Clark e Clin. Invest. 75, 1985, pág. 1835-1841; H.

C. Birhboim e 11.

Kanabu s-K amirska, Pro c.

ITatl. Acad. Sei.

USA 82, 1985, pág. 6820-6824)

Borek e W. Troll, Proc. ITatl.

e promover carcinogenese (O. Acad. Sei. USA 80, 1985, pág.

1504-1307; Ϊ. ITakamur-a, K. H. Oolburn cinogenesis 6, 1985, pág. 229-255)· A associada à superfície poderia ser um e T. D. Gindhart, Gar fraeção C de EO-SCD proteetor eficaz in vivn contra tais eventos, te in vitro, grande parte provavelmente desaparecer

Ea maior parte dos sistemas de tes cia fraeção 0 de EO-SOD poderia das células visto que a ligação parecia ser fraca. As descobertas em tais sistemas não são, pois, necessariamente quantitativamente previsíveis para a protecção, in vivo, contra os danos.

Verificou-se que a CuZn 30D parenteral possui mui tas propriedades terapêuticas interessantes como se indicou atrás. 0 que se descobriu agora, sugere que a administração de EC-SOD pode ser um modo eficaz de protecção contra os õa nos celulares provocados pelos radicais superóxido no espaço extracelular.

cordão umbilical preparada como se des Ι?

e 4-6 foi marcada com Ί utilizando o (P. E. P. Salacinski, C. Llclean, Clement-.Jones e 2. J. Lowry, Anal

chem. 117, 1981, pág. 156-146). A EO-SQD marcada da do ^^I-iodeto através de filtração de gel em foi separa r_T

Sephacryl

S-300 (obtida a partir de calização no cromatograma

Pharmacia, Uppsala, Sweden). A lo foi no mesmo sítio que a EC-SOD não marcada, que indica que 0 tamanho molecular não tinha variado.

te foi submetida a croeomo se descreveu atrás) para a heparina (=fraç experiências.

A EC-SOD, marcada, resultam frA

I mato grafia em heparina-Sepharose^¹'' (

I Somente material com grande afinidade ção 0) foi utilizado para posteriores

A EC-SOD marcada foi injectada por via intravenosa em coelhos (pesando cerca de 3 Kg). Amostras de sangue foras, então tomadas para analisar a radioactividade que ficou no plasma. As amostras de plasma foram precipitadas com ácido tricloro-acético (que precipita as proteínas) e a radioactividade foi medida nas pastilhas de proteínas, após centrifu gação. Isto elimina a medição de iodeto radioactivo e dos aminoácidos que contêm iodo no plasma, derivados da EC-SOD degradada. Deu-se aos coelhos iodeto através da água de beoer para evitar nova marcaçao com ^1 de proteínas, m vive

Após intervalos diferentes, injectou-se heparina (25OO UI), por via intravenosa, nos coelhos, para estudar 0 efeito da heparina. Os resultados estão indicados na Fig. 1<> e na Fig. 11. 100% corresponde à radioactividade que 0 plasma deveria conter teoricamente, dada a quantidade injectada e considerando que 0 volume total do plasma nos coelhos é de 5% do seu peso do corpo (por exemplo, coelho de 3 Kg-15C| ml de plasma).

A Fig. 10 indica os resultados quando a heparina

Ί Ο Π é injectada antes e 2,5, 10 e 20 minutos após a ''I-EO-OCD. Após a injecção de EC-SOD marcada, ocorreu um rápido declínio da actividade entre 5-10 minutos, ate cerca de 15% do

valor máximo teórico. Quando a heparina é injectada antes de EC-SCB, quase toda a actividade de Ξ0-30Β permanece, com ape nas um declínio lento. Quando a heparina e injectada 2, 5, 10 e 20 minutos depois da ^yI-E0-30B, ha um aumento rápido da actividade e o pico atinge o máximo teórico.

A Fig. 11 mostra a injecção da heparina após 2 a horas. Como mosti^a a figura, parece haver um rápido aumer to da actividade, que após 2 horas atinge cerca de 50% úo máximo teórico e após 72 horas atinge ainda 5%.

Parece haver um declínio bastante rápido para 50% (em 2 horas) mas, após a eliminação de EC-SOB, ele e muito mais lento. Utilizando os máximos na Fig. 11, calculou-se uma vida média (t 1/2) de cerca de 18 horas. Ú, provávelmen te, maior no homem, visto que a diminuição no corpo de quase todos os componentes é muito mais rápida em animais pequenos.

rápido aumento de EC-SOB no plasma do em 2 minutos) após a injecção i. v. de heparina, indica que a libertação de ^^^I-EC-SOB foi localizada no endotélio dos vasos sanguíneos, o que aponta para a mesmo conclusão que no Exemplo 8.

EXEMPLO 11

Ligação de EC-SOB humana ao endotélio da aorta do porco

Colectaram-se aortas de porcos, conservaram-se em gelo durante o transporte, abriram-se segundo o comprimento e foram postas entre dois blocos de kerspex com 1,5 cm de espessura. Cavaram-se furos com 10 mm de diâmetro, no bloco localizados por cima da aorta cobrindo o lado luminal. Assim, atingiram-se poços com 10 mm de diâmetro com o endotélio da aorta no fundo. Preparou-se uma solução contendo 440 000 cpm de I-EC-SOB (marcada como se descreveu no Exemplo 10) e

um grande excesso de fracção 0 de EC-SCD não marcada (121 yig/ml). 0 solvente cra um meio essencial mínimo de Eagle Tamponizado a pH 7,4 com HEPES e contendo 0,5 /g/ml de albu mina de soro bovino. Puseram-se 150 μΐ da solução em cada um dos três poços e nicubou-se com agitação durante 2,5 horas à temperatura ambiente. A solução foi então aspirada.

Os poços foram depois lavados duas vezes com 500 pl de solvente (2 minutos com agitação) e a seguir duas vezes com 500 μΐ de solvente contendo 15 UI de heparina (5 minutos com agitação), a radioactividade nas soluções (média de 5 ciai incubada), 2,1%, 0,6% (soluções de lavagem), 6,5%, 2,2% (lavagem com heparina). A actividade da enzima SOD foi determinada em soluções a partir de um poço e verificou-se se:? de 84,2% (82,7%) na solução inicial incubada removida e 7,1%¹ (7,0%) na primeira lavagem com heparina (dados correspondeu tes à radioactividade em suportes). Assim, havia uma correjs pondência muito boa entre a actividade da enzima SOD e a ra dioactividade determinada. Os dados mostraram que cerca de 20% de EC-SOD, adicionada, estavam ligados ao endotélio da aorta e que a actividade de EC-SOD podia ser libertada pela adição de heparina.

EXEMPLO 12

Ligação de EC-SOD recombinante e natural a lectinas

Obtiveram-se concanavalina Al, lectina de lenti· lha e lectina de germe de trigo imobilizados em Sepharose''¹¹'· a partir de Pharmacia AB, Uppsala, Suécia· 2 ml de cada gel foram introduzidos em colunas cromatográficas. Utilizou-se fosfato de sódio 50 mM (pH 7,4) + NaCl 0,25 M como eluente.

200 unidades (1,7 yg) de EC-SOD de cordão umbilital natural ou de EC-SOD recombinante dissolvidos em 0,5 ml de tampão de

eluição foram aplicados às colunas de lectina. Aplicaram-se então 3,5 ml de tampão de eluição. As colunas foram lavadas com 10 ml de tampão de eluição, A EC-SOD ligada foi então eluída com 14 ml de «X-metil-manosido 0,5 M (ConA Sepharoe lectina de lentilha-Sepharose^) sobre N-acetil-glu cose-amina 0,5 M (lectina de germe de trigo-Sepharose^. A actividade de SOD foi determinada no fluído eluíto a partir das colunas.

98% da EC-SOD natural e 97% de EC-SOD recombinante ligaram-se à concanavalina A-Sepharose^; 99% de EC-SOD natural, 96% 1® EC-SOD recombinante ligaram-se à lectina de lentilha-Sepharose^; 61% da EC-SOD natural e 95% 1® EC-SOD recombinante ligaram-se à lectina de germe de trigo-Sepharose^).

A afinidade para a concanavalina A e a lectina de lentilha mostra que tanto a EC-SOD natural como a recombinante contêm resíduos de glicosilo e monosilo nas suas porções de hidratos de carbono. A afinidade para a lectina de germe de trigo indica a presença de resíduos de N-acetil-glicose-aminilo. A heterogeneidade de EC-SOD natural em re lação à sua ligação à lectina de germe de trigo e provavelmente explicada por degradação parcial da parte de hidrato de carbono da enzima, quando presente no cordão umbilical ou no homogenato de cordão umbilical, durante o isolamento. Ha menos risco que a enzima recombinante seja exposta às enzimas de degradação. Para concluir, como se deduziu dos resultados destes escudos com lectina, as partes de hidrato de carbono da EC-SOD natural e recombinante são semelhantes.

EXEMPLO 13

Análise de EC-SOD do cordão umbilical natural e de EC-SOD recombinante em heparina-Sepharose^

Submeteram-se cerca de 500 unidades (414 jig) da fracçao C de EC-SOD natural e de EC-SOD recombinante a crofpS matografia em heparina-Sepharose^{kx 7} como se descreveu no Exemplo 9. Ambas as enzimas foram eluídas a 0,52 M no gradiente de NaCl. Deste modo, a EC-SOD natural e recombinante comportaram-se de modo idêntico e o resultado estabelece que a EC-SOD recombinante é do tipo C.

EXEMPLO 14

Conteúdo de cobre e zinco na molécula de EC-SOD conteúdo de Cobre e Zinco na EC-SOD do cordão umbilical natural e na EC-SOD recombinante foi determinado através de espectrometria de absorção atómica numa estufa de grafite, numa aparelhagem de Perkin-Elmer Zeeman 5O5⁺HGA. Compararam-se as quantidades de proteína de EC-SOD e CuZn nas preparações. Uma mole de EC-SOD natural (tetrâmero) contém 3,97 moles de Cu e 4,50 moles de Zn. A EC-SOD recombinan te continha 5,98 moles de Cu e 4,45 moles de Zn por mole de

continham assim quantidades

de Cu e Zn. Os resultados confirmam a descoberta prévia de moles de Cu por mole de EC-SOD (Marklund, Proc. Natl. Acac.. Sei. USA 79, 1982, pág. 7834-7658). Encontraram-se também cerca de 4 átomos de Zn na investigação, mas a presença de zinco na enzima não pôde ser estabelecida com segurança, devido à escassez do material e à possibilidade de contaminação com zinco. Os resultados presentes estabelecem agora que a molécula de EC-SOD contém 4 átomos de Zn.

EXEMPLO 15

Preparação de anticorpos monoclonais contra a EC-SOD humana

Injectaram-se ratos com a fraeção C de EC-SOD pre parada a partir do cordão umbilical (Exemplo 4-6). Após alguns meses, os ratos foram injectados com EC-SOD durante trÉs dias consecutivos. No quarto dia, removeram-se os baços e desintegraram-se. Fundiram-se as células dos baços com uma linha de células de mieloma de rato de acordo com as técni cas padrão (St. Groth e Scheidegger, J. Iimunol. Methods 55, 1980, pág. 1-21). Os clones que produzem anti-EC-SOD foram identificados através de uma técnica ELISA (Fouillard e Hoffman, Methods in Enzymology, 92, 1983, pág. 168) e depois forem subclonados. Finalmente, os dois clones, 14,B7 e 6,H6 foram seleccionados para a preparação de anticorpo, em larga escala, através da cultura na cavidade abdominal dos ratos. Os anticorpos foram então isolados a partir dos ascites por adsorção e desadsorção da Proteína A-Sepharose (í) como recomendou o fabricante (Pharmacia, Uppsala, Suécia). / eluição a partir da coluna, foi realizada com glicina 0,11.1

-HC1 de pH = 3,0. Imediatamente a seguir à eluição, a IgG recclhida foi titulada até pH 7,0 e depois dialisada contra mK de Tris-HCl de pH 8,0 + NaCl 0,15 m + 0,02% NaN5·

EXEMPLO 16

Imobilização de anti-EC-SOD monoclonal em CNB3fpj

-Sepharose^v activada

Visto que o anticorpo monoclonal 6.H6 se liga a n-EC-SOD muito fortemsnte (Kd-c.lO¹^), o anticorpo 14B7 6 (Kd\LO^OM) foi seleccionado para fins de purificação de EC-SOD. Antes da ligação à Sepharose activada com CN Br, removeu-se a azida da solução de IgG (ver Exemplo 15) e o tampãc foi substituído por um tampão de acoplamento (= carbonato de sódio 0,1 M de pH 8,3 + NaCl 0,5 H). Isto foi realizado com uma coluna PD 10 pelo processo recomendado pela fabricai, te (Pharmacia, Uppsala, Suécia). A Sepharose^^L^ activada-CNBr foi inchada e preparada como recomendou o fabricante (Pharmacia, Uppsala, Suécia). A Sepharose^-activada-CNBr foi depois adicionada à solução de IgG (emtampão de acopla fí ' mento) numa quantidade prevista para produzir uma densidade de ligação de cerca de 2 mg de IgG por ml de gel. A mistura foi incubada à temperatura ambiente durante cerca de 2 horas num agitador”. 0 tampão foi então removido do gel e analisado para determinar a proteína restante. Atingiu-se cerca de 97% de acoplamento. Os grupos activos que ficaram no gel ligado-IgG foram então bloqueados por incubação com etanolamina 1 M para pH 9,3 em duas horas à temperatura ambiente. 0 excesso de etanolamina e de proteína adsorvida fo ram lavados finalmente em alternativa com tampão de acopla mento (ver atrás) e acetato de sódio 0,1 M, pH 4,0 + NaCl 0,5 M quatro a cinco vezes. 0 gel foi armazenado em 50 mM de fosfato de potássio, pH 7,4- + NaCl 0,5 M + NaN3~ a 0,02%> A capacidade de ligação da IgG- monoclonal-Sepharose foi determinada por incubação durante 3 horas com um excesso de EC -SOD purificado (Exemplo 4-6) e análise subsequente da acti vidade de EC-SOD restante na substância sobrenadante, após centrifugação. 0 resultado foi comparado com. a incubação analoga com Sepharose^'^M 4B.

A 1 ml de EC-SOD em tampão de acoplamento” adicij» naram-se 10, 50, 100 e 1000 1 de uma suspensão a 50% de an ti-EC-SOD monoclonal-Sepharose^ '. Realizou-se uma incubação paralela no mesmo tampão de uma suspensão a 80% de Sepharose^^ HB. As soluções foram incubadas à temperatura am biente, em 3 horas. Após a centrifugação, determinaram-se as actividades de EC-SOD restante nas substâncias sobrenadantes. Utilizando os números resultantes, calculou-se que a capacidade de ligação de EC-SOD do gel era de aproximadamente 6000 unidades de EC-SOD por ml de suspensão de gel a 50% (= a/12000 U/ml de gel). Este número é igual a cerca de 6% da capacidade de ligação máxima teórica e está próxima do que geralmente se atinge com IgG ligada ao caso.

EXEMPLO 17

Isolamento de EC-SOD recombinante total com Sepharose^) anti-EC-SOD monoclonal

4°C.

processo de purificação total foi realizado a Centrifugaram-se cerca de 5 litros de meio a partir de culturas de células de CHO-Kl/pPSneo-18, contendo cerca de 300 U de actividade de EC-SOD (~2,6 por ml, para remover quaisquer fragmentos de células e precipitados. Para ligar a EC-SOD existente lizaram-se cerca de 125 rose^) (Exemplo 16). A coluna de crornatografia de 6,5 cm. A coluna foi + NaCl 0,5 M, pH 7,0 no meio (a/1 500 000 unidades), utiml de anti-EC-SOD monoclonal-SephaSepharose IgG foi introduzida numa com um diâmetro de 5 cm e uma altura lavada com 50 mM de fosfato de sódio , antes da aplicação da amostra. 0 mei ο

de cultura foi aplicado com uma velocidade de 100 ml/h e cor

Sepharose^) IgG foram eluídas com fosfato de sópH 6,5 + NaCl 0,5 M. A eluição continuou até se valor muito baixo de kdggQ. A coluna foi então 650 ml de 50 mM AMP (= l-aminometil-propanol)-HCl trolou-se a absorvância de 280 nm. As proteínas ligadas livremente à dio 50 mM, atingir um lavada com pH 9,0 e a EC-SOD foi eluída com 1 litro de 50 mM AMP-HC1, pH 9,0 + KSCN 1 Μ. A velocidade de eluição foi de 100 ml/hora. A actividade de EC-SOD é a absorvância a 280 nm foram analisadas e traçadas em função do volume de eluição (Fig.12 A absorvância restante a 280 mm após o pico de proteína resulta do KSCN. 0 pico da actividade EC-SOD foi então associado. Para reduzir a força iónica do gel de permuta de iões no passo lumes de AMP 2 M.

seguinte, a fracção foi deluída com. cerca de 14 voágua destilada e finalmente titulada até pH 8,5 com A recuperação no passo da afinidade IgG foi de 60%.

de 10 ml de DEAE-Sephacel^^ com 6,5 θ introduziram-se numa coludiâmetro de 5 cm e uma altura de de EC-SOD diluída a partir da co(•R j

DEAE-Sephacel^K ' bombeanao a frac

Lavaram-se cerca fosfato de sódio 50 mM, pH na de cromatografia com um cerca de 0,5 cm. A fracção luna IgG foi adsorvida por

ção através da coluna com uma velocidade de 60 ml/h. A coluna foi então lavada com fosfato de sódio 50 mil, pH 8,5 até que a absorvância a 280 nm se aproximasse de zero. A enzima foi eluída com fosfato de sódio 50 miá, pH 8,5 + NaCl 0,25 It· A absorvância a 280 nm e a actividade de EC-SOD foi analisada e traçada em função do volume de eluição (Fig. 15). As fracções do pico foram reunidas, submetidas a diálise contra fosfato de sódio 50 mM, pH 6,5 θ concentradas até cerca de 6 ml. A recuperação neste passo foi de cerca de 100%.

A EC-SOD foi finalmente purificada por adsorção/ /desdsorção em heparina-Sepharose^k '· Prepararam-se 12 ml de heparina-Sepharose^k^) como recomenda 0 fabricante (Pharmacia, Uppsala, Suécia) e lavaram-se com fosfato de sódio 50 mk de pH 6,5 + NaCl 1M e depois com fosfato de sódio 50 mlí, pH 6,5· 0 gel de heparina-Sepharose^ foi introduzido numa coluna de cromatografia com um diâmetro de 2,5 cm (altura cerca de

2,5 cm). A fracção concentrada e submetida a diálise a partir da coluna DEAE-Seph.acel^) (5 ml com uma actividade de EC-SOD de cerca de 185 000 U/ml) foi aplicada à coluna com uma velocidade de eluição de 10 ml/h. Controlou-se a absorvância a 280 nm. Iniciou-se a eluição com fosfato de sódio 50 mM de pH 6,5 e uma velocidade de eluição de 20 ml/h. Quan do a absorvância a 280 nm se aproximou da linha de base, a EC-SOD foi eluída com um gradiente de NaCl 0 M a 1 Li. 0 volume do gradiente foi de 270 ml. Para proteger a EC-SOD a ¹ partir da concentração elevada de NaCl, diluiram-se as fracções (desde 0 início do gradiente) com água destilada. Inseriu- se um tubo em T no tubo plástico a partir do fim da elui ção da coluna e bombeou-se a água destilada para 0 fluido de eluição a uma velocidade duas vezes maior que a velocidade da eluição da coluna.

A actividade de EC-SOD foi eluída num pico (Fig.

14) para a mesma concentração de NaCl que 0 pico da fracção

X t

C no Exemplo 6. As fraeções do centro do pico foram reunidas (Fracção 1). A actividade específica da fracção 1 (U/ml divididas por AD_2Sq) foi de 88 400. A actividade específica da EC-SOD natural preparada, a partir do homogenato do cor dão umbilical (ver Exemplo 1), pelo mesmo processo, foi de 88 200. Os dados são portanto, quase idênticos e um pouco mais elevados em relação aos que se publicaram previamente (Marklund, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79, 1982, pág. 7634-7638). Estas duas preparações foram analisadas nos Exemplos 12-14 e 18-20. As partes laterais do pico foram também reunidas (fracção II). As fraeções foram concentradas e submetidas a diálise contra fosfato de sódio 50 mu, dimento de EC-SOD foi de cerca de 60% no passo -Sepharose^ . As fraeções continham 600 000 U que no seu todo são 40% da actividade original cultura CH0-Kl/pPS3-neo-18.

pH 6,6. 0 ren da heparina(cerca de 5,5 mg) no meio de

EXEMPLO 18

Determinação do tamanho molecular de EC-SOD natural e de EC-SOD recombinante através da cromatografia em gel.

peso molecular da enzima natural do cordão umbi lical e da enzima recombinante foi estimado através da filtração em gel numa coluna Sephacryl S-300^^. A coluna foi calibrada com ferritina (440 000), IgG (150 000), albumina de soro bovino (67 000), ovalbumina (43 000), timotripsinogénio (25 000) e sibonuclease (13 700) (pesos moleculares entre parenteses).

A EC-SOD recombinante e natural foram eluídos a partir da coluna em posições correspondentes aos pesos mole culares de 136 000 e 151 000 respectivamente. A EC-SOD recombinante pareceu, assim, ter um peso molecular levemente maior. Parte da diferença pode ser devida à degradação par-

^— ciai das subunidades da enzima natural como se vê nas experiências SDS-PAGE a seguir (Exemplo 19). A heterogeneidade da EC-SOD natural na cromatografia sobre lectina de germe de trigo (Exemplo 12) também aponta para a degradação parcial da parte do hidrato de carbono das enzimas.

EZEMPLO 19

Análise da EC-SOD natural do cordão umbilical e da EC-SOD recombinante através de electroforese em gel de poliacrilamida em gradiente na presença | de dodecil-sulfato de sódio peso molecular das subunidades da jiC—SCD natural e recombinante foi comparada por electroforese em geles em gradiente (10-15% na presença de SDS).

Liofilizaram-se aproximadamente 25 g de cada enzima (n-EC-SOD e r-EC-SOD) e depois dissolveram-se em 50 g de uma mistura contendo 5% cie sacarose, 5 mm de EDTA, 5% de

2-mercapto-etanol e 2% de SDS num tampão constituído por ác:. do bórico 0,4 lã e Tris 0,41 Lí, pH 8,64. As amostras foram fervidas durante 5 minutos e arrefecidas imediatamente com gelo. Aplicou-se cerca de 1 1 (cerca de 0,2 g) de cada amostra num gel de poliacrilamida, em gradiente de Pharma| cia Phast System (10-15%) θ depois em Pharmacia Phast System Instrument como recomendou o fabricante (Pharmacia, Upo fTIJ A sala, Sweden em Phast System Separation Technique File N2. 110). 0 gel resultante foi manchado com azul brilhante Coomassie, ver Fig. 15· De esquerda para a direita as passagens contêm EC-SOD recombinante, EC-SOD do cordão umbilical natu ral e uma mistura de marcadores de pesos moleculares (94 000, 67 000, 43 000, 29 000, 20 100 e 14 400). 0 marcador com uma mobilidade semelhante à da EC-SOD possui um peso molecular de 29 000. Não se detectaram nenhumas impurezas na EC-SOD.

A EC-SOD recombinante tem uma banda com um peso molecular de cerca de 52 000. A 3C-30D natural apresenta duas bandas, a maior, aparentemente com o mesmo peso molecular que a EC-SOD recombinante e a mais pequena com um peso molecular de cerca de 28 000. As quantidades relativas das duas bandas variam de preparação para preparação da EC-SOD natural e a heterogeneidade é provavelmente devida à degradação parcial da enzima.

EXEAPDO 20

Comparação entre a composição de arainoácido) da EC-SOD recombinante e natural e a sequência de am noácidos deduzida da sequência de cDEA que codifi ca para EC-SOD.

A composição dos aminoácidos da EC-SOD de cordão umbilical natural e da EC-SOD recombinante é apresentada na Tabela II. 0 Triptofano não foi incluído na comparação visto que não podia ser obtido com segurança no detector de aminoácido. Parece que as enzimas recombinantes e naturais da Tabela possuem composições quase idênticas. A concordância entre os números deduzidos da sequência de cDNA é também muito boa. Os resultados indicam que as enzimas recombinantes e naturais são virtualmente idênticas e que a sequência de cDMA está correcta.

Claims (48)

1. REmOICAQÕES:

   ο 7 γ/ί; !!*.· 7 lâ. - Processo para a preparação de superóxido-dismutase (EC-SOD) de origem extracelular, caracterizado pelo facto de

   a) se cultivar uma linha de células animais que produzem EC-SOD em condições que garantem a secreção de EC-SOD e se recuperar a EC-SOD; ou

   b) se inserir um fragmento de DITA (ácido desoxirribonu cleico) que compreende uma sequência de DHA que codifica pa ra EC-SOD num vector que é capaz de se multiplicar numa célula hospedeira específica, se introduzir o vector recombinante num conjunto de células hospedeiras que se cultiva no seio ou sobre a superfície dum meio de cultura apropriado e com condições adequadas para a expressão de EC-SOD e se recuperar a EC-SOD.
2. 2â. - Processo para a preparação de EC-SOD, de acordo com a reivindicação 1, variante de processo a), caracterizado pelo facto de a linha de células cultivadas ser uma linha de células de mamíferos, particularmente, uma linha de células humanas.
3. 3^. - Processo para a preparação de EC-SOD, de acordo com a reivindicação 1, variante de processo a), caracterizado pelo facto de a linha de células derivar de san gue humano ou de tecido de pulmão, pâncreas, vasos sanguíneos, útero, glândula da próstata, placenta ou cordão umbilical humano ou de tecido neoplástico humano.
4. 4ã. - Processo para a preparação de EC-SOD, de acordo com a reivindicação 3, variante de processo a), caracterizado pelo facto de a linha de células derivar de células endoteliais ou de fibroblastos.

   Λ » ^a, _ processo para a preparação de EC-SOD, de acordo com. a reivindicação 1, variante d© processo a), carac terizado pelo facto de, ao meio em que as células estão a ser cultivadas, se adicionar heparina ou um análogo da hepa rina ou um análogo da heparina, por exemplo, sulfato de heparano, glucosaminoglicano, sulfato de dextrano ou outro composto fortemente carregado negativamente, numa quantidade suficiente para provocar a libertação de EC-SOD a partir das superfícies das células.

   õâ. - processo para a preparação de EC-SOD, de acordo com a reivindicação 1, variante de processo b), carac terizado pelo facco de a sequência de DHA compreender uma sequência de sinal que codifica para um peptido de sinal, cuja presença garante a secreção de EC-SOD pelas células e, pelos menos, uma proporção significativa de EC-SOD expressa ser segregada para o meio de cultura e recuperada.
5. 7-. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o fragmento de DEA ser o fragmen to de DNA de origem complementar.

   Ba. - Processo de acordo com a reivindicação 1, variante de processo b), caracterizado pelo facto de ao meio de cultura se adicionar heparina ou um análogo de heparina, por exemplo, sulfato de hcparano ou outra glicosaminoglicona sulfatada ou outro composto fortemente carregado negativamente numa quantidade suficiente para libertar a EC-SOD a partir das superfícies das células.
6. 9&. - Processo para a recuperação de EC-SOD, carac terizado pelo facto de se adsorver um material biológico coi. tendo EC-SOD numa matriz contendo anticorpos imobilizados ou num seu determinante imunológico, alui-se a EC-SOD e reunem-se as fracções que contêm EC-SOD, seguindo-se opcionalmente a posterior purificação.

   rpj ,γ - 82 10â. - Processo de acordo com a reivindicação 9 caracterizado pelo facto de se produzirem anticorpos contra EC-SOD ou um seu determinante imunológico e se imobilizar os anticorpos numa matriz apropriada.

   lia. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de os anticorpos serem anticorpos policlonais ou monoclonais.
7. 12&. - Processo de acordo com a reivindicação 9 , caracterizado pelo facto de o material biológico ser um extracto de tecido ou de sanngue de mamíferos.

   ljâ. - Processo de acordo com a reivindicação

   12, caracterizado pelo facto de o tecido de sangue serem de origem humana, bovina, canina, porcina ou equina.

   14ã. - Processo de acordo com a reivindicação
8. 13, caracterizado pelo facto de o tecido ser tecido humano do pulmão, pâncreas, útero, próstata, placenta ou cordão um bilical.
9. 15-· _ Processo de acordo com. a reivindicação

   12, caracterizado pelo facto de a extração de EC-SOD se rea lizar com um tampão KBr ou outro sal tal como sulfato de amo nio ou tiocdanato de potássio.
10. 16S. - Processo de acordo com a reivindicação 9 caracterizado pelo facto de o material biológico ser o produto das variantes de processo a) ou b) de acordo com a rei vindicação 1.
11. 17-· - Processo de acordo com a reivindicação 9 caracterizado pelo facto de o eluído ser adsorvido numa matriz e a EC-SCD ser eluída da matriz e reunida.

    '/ ·~>Ί ΡΓ',ί ^--7 ” bO
12. 18â. - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de a matriz ser uma matriz que com preende heparina ou um análogo de h ©ar-ina, por exemplo, su. fato de heparano ou outro glucosaminoglicano sulfatado de dextrose ou outro composto fortemente carregado negativamen te.
13. 19-· _ processo para a preparação de EC-SOD, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se obter superóxido-dismutase extracelular de origem recombinante.
14. 20â. - Processo para a preparação de EC-SOD, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto de a EC-SOD ter uma estrutura polipeptídica codificada pela se guinte sequência de DlíA

    TrpThrGlyGluAsp5erAla01qProAtnSarA»pS»rAlaGluTrpneArqAapM|t

    TGGACGGGCGAGOACTCGGCGGAGCCCAACTCTGACTCGGCGGAGTGGATCCGAGACATG ACCTGCCCGCTCCTGAGCCGCCTCGGGTTGAGACTGAGCCGCCTCACCTAGGCTCTGTAC

    30 4C

    TvrAlaLysValThrGluIleTrpGlnGluValMetGlnArqArqAapAspAspGlvThr TACGCCAAGGTCACGGAGATCTGGCAGGAOGTCATGCAGCGGCGGGACGACGACGGCACC ATGCGGTTCCAGTGCCTCTAGACCGTCCTCCAGTACGTCGCCGCCCTGCTGCTGCCGTGC

    50 6( LguHlfiAlaAlaCvaGlnValGlnProSerAlaThrLeuAapAlaAlaGlnProArgVaJ CTCCACGCCGCCTGOCAGGTGCAGCCGTCGGCCACGCTGGACGCCGCGCAGCCCCGGGTG GAGGTGCGGCGGACGGTCCACGTCGGCAGCCGGTGCGACCTGCGGCGCGTCGGGGCCCAC

    70 80

    ThrGlyValValLeuPheArgGlnLeuAlaProAr gAlaLyaLeuAapA1aPhaPhaAli 1 ACCGGCGTCGTCCTCTTCCGGCAGCTTGCGCCCCGCGCCAAGCTCGACGCCTTCfTCGCÍ TGGCCGCAGCAGGAGAAGGCCGTCGAACGCGGGGCGCGGTTCGAGCTGCGGAAGAAGCGG

    90 10) JLauGluGlyPhaPioThrGluProAanSarStrSerArgAlallcHiEValHIsGlnPh ; ctggagggcttcccgaccgagccgaacagctccagccgcgccatccacgtgcaccagtt: GACCTCCCGAAGOGCTGGCTCGGCTTGTCGAGGTCGGCGCGGTAGGTGCACGTGGTCAA¹?

    Π0 12)

    GlvAspLeuSgrGlnGlyCyBGluãerThtGlyProHiBTyrAanProLauAlavalPr) GGGGACCTGAGCCAOGGCTGCGAGTCCACCGGGCCCCACTACAACCCOCTGGCCOTGCC3 cccctggactcggtcccgacgctcaggtggcccggggtgatgttgggcgaccggcacgg:

    130

    Hi sProGlrÍHiBProGlyAgpPheGlvABnPhêAlaValArqABpGlvSeiLeuTrp;

    CACCCGCâGÇACCCGGGCGACTTCGGCAACTTCGCGGTCCGCGAÇGGCAGCCTCTGGÁ gtgggcgtcgtgggcccgctgaagccgttgaagcgccaggcgctgccgtcggagacct

    140

    GG cc

    150 1 Ty r A rgAlaGlyLeuAlaAlaSerLauAlaGlyPrpHÍBSerXlBValGlyAr g A1 a\ TACCGCGCCGGCCTGGCCGCCTCGCTCGCGGGCCCGCACTCCATCGTGGGCCGGGCCC ATGGCGCGGCCGGACCGGCGGAGCGAGCGCCCGGGCGTGAGGTAGCACCCGGCCCGGC

    60 al TG AC ¹⁷⁰ , . ¹ valvalHi6AlaGJyG]uABpA»pL»uGlyArgGlyGlyABn31nAlaSerValGlu/ GTCGTCCACGCTGGCGAGGACGACCTGGGCCGCGGCGGCAACCAGGCCAGCGTGGAGÍ CAGCAGGTGCGACCGCTCCTGCTGGACCCGGCGCCGCCGTTGGTCCGGTCGCACCTCT en

    AC TG

    190 <⁰⁰ GlyAsnAlaGlyArgAr qLeuAlaCycCvsValValGlyValCy»GlyProGlyLttfrp GGGAACGCGGGCCGGCGCTCTGC-CCTGCTGCGrGGTGGGCGTGTGCGGGCCCGGGCTCVCC CCCTTGCGCCCC-GCCGCCGACCGGACGACGCACCACCCGCACACGCCCGGGCCCGAGhCC

    GG

    220 <^:2° GluArgGlnAlaArgGlvHiBBerGluArgLyBLyeArgArgArgGluSerGluCyihys gagcgccaggcgcgggagcactcagaocgcaagaagcggcggcgcgagagcgagtgc|ag CTCGCGGTCCGCGCCCTCGTGAGTCTCGCGTTCTTCGCCGCCGCGCTCTCGCTCACG

    TC

    AlaAla

    ÇCCGCC

    CGGCGG )

    ou qualquer sua modificação que codifica um polipeptido que tem a propriedade de dismutar peróxidos da SO-SOB natural.
15. 21â. - processo para a preparação de EC-SOB, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto de a sequência de BEA ser de origem genómica.

    2qa. - Processo para a preparação de EC-SOB, de acordo com as reivindicações 21 ou 22, caracterizado pelo f.

    íc ογ ’rv •'•'/j to de a sequência de DITA ser de origem animal, particularmente, de mamíferos.
16. 24a. - Processo para a preparação de EC-SOD, de acordo com as reivindicações 21 ou 22, caracterizado pelo facto de a sequência de DITA ser de origem humana.
17. 25â. - Processo para a preparação de EC-SOD, de

    I acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto de a sequencia de DKA ser de origem sintética.
18. 26â. - Processo para a preparação de EC-SOD, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto de a sequência de DNA ser de origem mista genomica e sintética, de origem mista genomica e de DITA complementar ou de origem mista sintética e de DEA complementar.
19. 27â. - Processo para a preparação de EC-SOD, de acordo com qualquer das reivindicações 20 a 26, caracterizado pelo facto de a EC-SOD ser de origem de uma linha de células.
20. 28a. - processo para a preparação de EC-SGD, de acordo com qualquer das reivindicações 20 a 26, caracterizado pelo facto de a linha de células ser de origem da placenta ou do cordão umbilical.
21. 29â. - processo para a obtenção dum vector de expressão replicável, caracterizado pelo facto de o vector conter uma sequência de DSA que codifica EC-SOD.

    50a. - Processo para a obtenção dum vector replicável, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo facto de a sequência ds DITA que codifica EC-SOD ser a seguiu te sequência

    TrpThrGlyG]uAspSerAlaGluFroAcnSerAapgerAlaGluTrpIlaArqAapHet tggacggocgaggactcggcggagcccaactctgactcggcggagtggatccgagacatg ACCTGeCCGCTCCTGAGCCGCCTCGGGTTGAGACTGAGCCGCCTCACCTAGGCTCTGTAC
22. 30 40 ]TvrAlaLysValThrGlulleTrpGlnGluValMetGlnArqArgAEpAfipA s pGlyThr TACGCCAAGGTCACGGAGATCTGGCAGGAGGTCATGCAGCGGCGGGACGACGACGGCACG ATGCGGTTCCAGTGCCTCTAGACCGTCCTCCAGTACGTCOCCGCCCTGCTGCTGCCGTGC

    50 60

    LguHisAlaAlaCYEGlnValGlnProSerAlaThrLeuAEpAlaAlaGlnProArqVal

    CTCCACGCCGCCTGCCAGGTGCAGCCGTCGGCCACGCTGGACGCCGCGCAGCCCCGGGTG gaggtgcggcggacggtccacgtcggcagccggtgcgacctgcggcgcgtcggggcccac

    70 80 yhrGlyyalV&lLeuPheArgGlnLeuAlaProAr gAlaLysLauABpAlaPhaPhgAla ACCGGCGTCGTCCTCITCCGGCAGCTTGCGCCCCGCGCCAAGCTCGACGCCTTCTTCGCC tggccgcagcaggagaaggccgtcgaacgcggggcgcggttcgagctgcggaagaagcgg

    90 100 LguGluGlyPhftPioThrGluProABnSerSgrSgrArqAlalleHiEValHisGlnPhg ctggagggcttcccgaccgagccgaacagctccagccgcgccatccacgtgcaccagttc gacctcccgaagggctggctcggcttgtcgaggtcggcgcggtaggtgcacgtggtcaag

    110 120 G1vAspLeuSerGlnGlyCyBGluggrThrGlyProH1BTy rAenP roLeuAlava1P r o GGGGACCTGAGCCAGGGCTGCGAG7CCACCGGGCCCCACTACAACCCGCTGGCCGTGCCG cccctggactcggtcccgacgctcaggtggcccggggtgatgttgggcgaccggcacggc

    130 140 Hi sProGlnHisFroGlyABDPhgGlyABnPhgAlaValArqABpGlvSet LeuTrpArq CACCCGCAGCACCCGGGCGACTTCGGCAACTTCGCGGTCCGCGACGGCAGCCTCTGGAGG gtgggcgtcgtgggcccgctgaagccottgaagcgccaggcgctgccgtcggagacctcc

    150 160 TyrA r qAlaGlyLguAlaAlaSerLeuAlaGlyPrcHÍBSgrllBVBlGlyAr gAlava1 taccgcgccggcctggccgcctcgctcgcgggcccgcactccatcgtgggccgggccgtg atggcgcggccggaccggcggagcgagcgcccgggcgtgaggtagcacccggcccggcac

    170 180 valvalHi6AlaGlyGluAipA»pLeuGlyArgGlyGlyAan
23. 31nAlaservalGluAtn GTCGTCCACGCTGGCGAGGACôACCTGGGCCGCGGCGGCAACCAGGCCAGCGTGGAGAAC cagcaggtgcgaccgctcctgctggacccggcgccgccgttggtccggtcgcacctcttg

    200 a

    SlyAenAlaGlyArgAr (χϋβηΑ18ΰν8θν8ν&ΐν»101νν»1Γν8σΐγProGlyLeuTtp GGGAACGCGGGCCGGCGGCTGGCCTGCTGCGTGGTGGGCGTGTGCGGGCCCGGGCTCTGG

    CCCTTGCGCCCGGCCGCCGACCGGACGACGCACCACCCGCACACGCCCGGGCCCGAGACC

    210 220

    GluArgGlnAl«ArgGl\jHl»SerGluArgLysLy»ArgArgArgGluSerGl.uCytLyc gagcgccaggcgcgggagcactcagagcgcaagaagcggcggcgcgagagcgagtgcaag ctcgcggtccgcgccctcgtgagtctcgcgttcttcgccgccgcgctctcgctcacgttc

    AlaAla

    GCCGCC cggcgg ou Qualquer sua modificação que codifica um polipeptido que tem a propriedade de dismutar peróxidos da EC-SOD.

    Jlâ. - processo para a obtenção dum vector replicável, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo facto de ser replicante autonomamente.
24. 32^. - Processo para a obtenção dum vector replicável de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo facto de ser um cosmídeo, um minicromosoma ou um vírus.
25. 33-· - Processo para a obtenção dum vector replicável, de acordo cora a reivindicação 29, caracterizado pelo, facto de o referido vector, quando introduzido em células hospedeiras, se integrar no genoma das células hospedeiras.

    • J4â. - Processo pars. a obtenção duma linha de células capaz de segregar SC-oOD.

    I
26. 35-· - Processo para a obtenção duma linha de células, de acordo com a reivindicação 16, caracterizaõ.o pelo facto de serem de origem de mamíferos, particularmente, de | origem humana.
27. 36â. - Processo para a obtenção duma linha de células, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo facto de as células derivar de sangue humano ou de tecido humano proveniente de pulmão, pele, vasos' sanguíneos, pâni <

    O

    T? crif -7““ θ'L Λ . ^! · -9' creas, útero, próstata, placenta cal ou de tecido neoplástico.

    ou tecido de cordão umbili obtenção duma linha de células,
28. 37-· ~ Processo para a de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo facto de as células derivarem de células endolteliais ou fibroplas ticas.
29. 38*.

    - Processo para a obtenção duma linha de célii las, de acordo com qualquer das reivindicações 34 a 37? carne terizado pelo facto de as células acolherem um vector de acordo com qualquer das reivindicações 29 a 53»
30. 39*. - Processo para a obtenção duma linha de células, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo facto de as células serem células de organismos eucarióticos unicelulares, por exemplo dum fungo ou duma levedura, ou células derivadas dum organismo multicelular, por exemplo, dum animal ou duma planta.
31. 40^. - Processo para a obtenção duma linha de células, de acordo com a reivindicação 39? caracterizado pelo facto de as células serem células de um mamífero.
32. 41*. - Processo para a obtenção duma linha de células, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado gelo facto de se obterem células CÃI0-Kl/pPS3neo-18, depositadas na Oolecção Europeia de culturas de Células de Animais sob o número de Acesso ECACC 86082701.
33. 42£. - Processo para a obtenção dum fragmento de D EA que codifica EC-SOD, caracterizado pelo facto de 0 fragmento possuir a seguinte sequência (incluindo a sequência do sinal):

    -18 -10

    MetLguAlaLguLeuCycSerCyBLeuLeuLeuAlaAlaGlyAlaSerABp

    ATGCTGGCGCTACTGTGTTCCTGCCTGCTCCTGGCAGCCGGTGCCTCGGAC TACGACCGCGATGACACAAGGACGGACGAGGACCGTCGGCCACGGAGCCTÇ

    120

    -1 +1 10

    AlaTrpThrGlYGluAspSerAlaGlUFroAsnSerAspSerAlaGluTrpIleArgAsp gcctggacgggcgaggactcggcggagcccàactctgactcggcggagtggatccgagac cggacctgcccgctcctgagccgcctcgggttgagactgagccgcctcacctaggctctg

    180

    20 30

    MetTyrAlaLysValThrGluIleTrpGlnGluValMetGlnArgArqAspAspAs pGlv

    ATGTACGCCAAGGTCACGGAGATCTGGCAGGAGGTCATGCAGCGGCGGGACGACGACGGC

    I TACATGCGGTTCCAGTGCCTCTAGACCGTCCTCCAGTACGTCGCCGCCCTGCTGCTGCCG

    240

    40 50

    ThrLeuHiaAlaAlaÇysGlnvalGlnProSerAlaThrLeuAspAlaAlaGlnPgoArg ACGCTCCACGCCGCCTGCCAGGTGCAGCCGTCGGCCACGCTGGACGCCGCGCAGCCCCGG TGCGAGGTGCGGCGGACGGTCCACGTCGGCAGCCGGTGCGACCTGCGGCGCGTCGGGGCC 300

    60 70

    ValThrGlyValvalLeuPheAr gG1n L e uAla P r oA r qAlaLyaLeuAspAlaPhePhe GTGACCGGCGTCGTCCTCTTCCGGCAGCTTGCGCCCCGCGCCAAGCTCGACGCCTTCTTC CACTGGCCGCAGCAGGAGAAGGCCGTCGAACGCGGGGCGCGGTTCGAGCTGCGGAAGAAG 360

    80 90

    AlaLeuGluGlyPhftProThrGluProABnSerSerSerArqAlallgHisValHisGln GCCCTGGAGGGCTTCCCGACCGAGCCGAACAGCTCCAGCCGCGCCATCCACGTGCACCAG CGGGACCTCCCGAAGGGCTGGCTCGGCTTGTCGAGGTCGGCGCGGTAGGTGCACGTGGTC £11*01 YAspLeuSerGlnGlyCyBGluSer Thr GlyProHiaTyrAsnProLeuAlaVal

    TTCGGGGACCTGAGCCAGGGCTGCGAGTCCACCGGGCCCCACTACAACCCGCTGGCCGTG AAGCCCCTGGACTCGGTCCCGACGCTCAGGTGGCCCGGGGTGATGTTGGGCGACCGGCAC

    480

    120 130

    ProHisProGlnHisProGlyAspPheGlyAsnPheAlaValArqAspGlySefLeuTrp ccgcacccgcagcacccgggcgacttcggcâacttcgcggtccgcgacggcagcctctgg ggcgtgggcgtcgtgggcccgctgaagccgttgaagcgccaggcgctgccgtcggagacc

    540

    140 150

    AíS.Ty r A r qAlaGlyLeuAlaAlaSerLeuAlaGlyProHisSerlleValGlyA r q A1 a aggtaccgcgccggcctggccgcctcgctcgcgggcccgcactccatcgtgggccgggcc tccatggcgcggccggaccggcggagcgagcgcccgggcgtgaggtagcacccggcccgg 600

    160 170

    ValValValHlsAlaGlyGluAspABpLepGlyArgGlyGlyABnGlnAlaServalGlq

    GTGGTCGTCCACGCTGGCGAGGACGACCTGGGCCGCGGCGGCAACCAGGCCAGCGTGGAG CACCAGCAGGTGCGACCGCTCCTGCTGGACCCGGCGCCGCCGTTGGTCCGGTCGCACCTC

    660

    -* - 90 ι * 1/+ ⁷ * |

    -Ί ί

    160 19°

    A » nG1yΑ β nAla G1yA r gA r gLeuAUCyaCyaValValGlyValCyBGlvP r oGlyL« u aacgggaacgcgggccggcggctggcctgctgcôtggtgggcgtgtgcgggcccgogctc TTGCCCTTGCGCCCGOCCGCCGACCGGACGACGCACCACCCGCACACGCCCGGGCCCGAG 720

    200 210

    TrpGluArgGlnAlaArgGluHiaSerGluArgLyetysArgArgArgGluSerGluCya

    TGGGAGCGCCAGGCGCGGGAGCACTCAGAGCGCAAGAAGCGGCGGCGCGAGAGCGAGTGC ACCCTCGCGGTCCGCGCCCTCGTGAGTCTCGCGTTCTTCGCCGCCGCGCTCTCGCTCACG

    760

    220

    LysAlaAla***

    AAGGCCGCCTGA

    TTCCGGCGGACT ou qualquer outra sua modificação que codifique um polipeptido que tem a propriedade de dismutar peróxido de 23-SOD natural.

    45a. - Processo para a obtenção dum fragmento de DKA, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo facto de o fragmento ser de origem de DNA complementar.
34. 44a. - Processo para a obtenção dum fragmento, de D NA, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo facto de o fragmento ser de origem genómica.

    i
35. 45—. - Processo para a obtenção dum. fragmento de DNA de acordo com as reivindicações 43 ou 44, caracterizado pelo facto de ser de origem de mamíferos.
36. 46a, - processo para a obtenção dum fragmento de DNA, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo facto de ser de origem humana.
37. 47a. - Processo para a obtenção dum fragmento de

    DNA, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo facto de o fragmento ser de origem sintética.
38. 48â. - Processo para a obtenção dum. fragmento de DNA, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo facto de o segmento obtido ser de origem mista genómica e sintética, de origem mista genómica e de DNA complementar ou de origem mista de DDA complementar e sintética.
39. 49—. - Processo para a preparação de um anticorpo monoclonal, caracterizado pelo facto de se cultivar uma linha de células de hibridoma que produzem anticorpos dirigidos contra EC-SOD ou se cultivar um seu determinante imunológico num meio de cultura apropx^iado e se recuperarem os anticorpos do meio.
40. 50^. - Processo para a preparação de um anticorpo monoclonal, caracterizado pelo facto de se formar o anticor po contra ou dirigido substancialmente apenas contra a EC-SOD ou contra um seu determinante imunológico.

    512. - Processo para a preparação de um anticorpo monoclonal, caracterizado pelo facto de o anticorpo obtido se encontrar sob uma forma substancialmente pura.
41. 52a. - processo para a obtenção duma sequência de DNA, caracterizado pelo facto de a sequência codificar ura sinal de peptido que tem a seguinte sequência

    -18 -10 -1

    MetLeuAlaLeuLeuCyeSerCyBLeuLeuLeuAlaAlaGlyAlaSerABpAla atgctggcgctactgtottcctgcctgctcctggcagccggtgcctcggacgcc TACGACCGCGATGACACAAGGACGGACGAGGACCGTCGGCCACGGAGCCTGCGG

    120
42. 53-· - Processo para a preparação de composições farmacêuticas para o tratamento de doenças ou perturbações provocadas pela presença ou formação de radicais peróxido, _ 92 - “ caracterizado pelo facto de se misturar EC-SOD com um excipiente, diluente ou mistura veicular farmaceuticamente aceitável.

    p4â. - Processo para a preparação de composições farmacêuticas, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo facto de a EC-SOD ser preparada de acordo com qual, quer das reivindicações 1 a 28.
43. 55-· _ processo para a preparação de composições farmacêuticas, de acordo com a reivindicação 55, caracteriI zado pelo facto de se empregar EC-SOD recuperada pelo prócer so de acordo com a reivindicação 9·

    55a. _ processo para a preparação de composições farmacêuticas, de acordo com qualquer das reivindicações 53 a 55, caracterizado pelo facto de se adicionar heparina, sul fato de heparano, outros glucosaminoglicanos, sulfato de der trano ou outros compostos fortemente carregados negativamente.
44. 57â. - Processo para a preparação de composições farmacêuticas de acordo com qualquer das reivindicações 55 a 55, caracterizado pelo facto de 3Θ cLCLlClOilHI? HÍllCLS. C2L ií3-13.“i ) se ou outro agente antioxidante que coopere com a EC-SOD pa ra reduzir os efeitos tóxicos dos produtos de redução do oxj génio.
45. 58ã. - método para evitar ou tratar doenças ou pei turbações ligadas com a presença ou a formação de radicais peróxido, caracterizado pelo facto de compreender a administração a um paciente que precisa esse tratamento duma quantidade terapêutica ou profilaticamente efectiva de EC-SCD, preparada de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 28, de preferência, numa dosagem compreendida entre cerca de 15 e 600 mg de substância activa por dia.

    -9359^a - Método para o tratamento profiláctico ou terapêutico de pertubaçoes de saúde em seres humanos como resultado da isquemia seguida por reperfusao, por exemplo, enfarte do coraçao, isquemia renal, cerebral ou intestinal ou de doenças inflamatórias tais como artrite reumática , pancreatite, pielonefrite e outras nefrites, hepatite, doenças de autoimunidade, diabetes mellitus,coagulaçao intravascular disseminada, embolias provocadas por gordura, dificuldades respiratórias em adultos e crianças, hemorregias cerebrais em recém-nascidos, queimaduras, efeitos prejudiciais de radiações ionizantes e carcinogénese, de acordo com a reivindicação 58, caracterizadc pelo facto de se administrar aos pacientes, que necessitam esse tratamento, uma quantidade eficaz de EC-SOD, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 28, preferivelmente compreendida entre cerca de 15 e 600 miligramas de substância activa por dia.
46. 60^a - Método para evitar ou tratar‘danos-provocados por isquemia seguida de reperfusao- em ligaçao com á transplántaçao de órgãos como rins, pulmões, pâncreas, fígado ou pele, ou em ligaçao com a cirurgia cardíaca, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo facto de compreender a administraçao duma quantidade terapêutica ou profilaticamente efectiva de EC-SOD antes, durante ou depois de operação cirúrgica, preferivelmente compreendida entre cerca de 15 e 600 miligramas de substância activa por dia.
47. 61^a - Método de acordo com as reivindicações 58 a 60, caracterizado pelo facto de ao paciente se administrar ainda adicio nalmente heparina, sulfato de heparano, outros glucosaiminoglicanos, sulfato de dextrano ou outros compostos fortemente carregados negativamente
48. 62^a - Método de acordo com as reivindicações 58 ou 60, caracterizado pelo facto de ao paciente se administrar ainda adicionalmente catalase ou outro antioxidante que coopera com a EC-SOD de maneira a reduzir os efeitos tóxicos dos produtos da redução do oxigénio.