CN100345973C - 超氧化物歧化酶基因的表达方法及其专用载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种超氧化物歧化酶基因表达的方法及其专用载体。本发明所提供的超氧化物歧化酶基因表达的专用载体，是含有来源于蜡样芽孢杆菌M22的超氧化物歧化酶Mn-sod2基因、AOX1启动子和终止子序列、多克隆位点以及筛选标志的毕赤酵母表达载体。本发明所提供的超氧化物歧化酶基因表达的方法，是构建含有超氧化物歧化酶基因的毕赤酵母表达载体，将构建的毕赤酵母表达载体导入毕赤酵母中，获得重组毕赤酵母，诱导重组毕赤酵母使超氧化物歧化酶基因得到表达。本发明弥补了传统SOD制备方法以及原核表达系统表达方式的不足；此外，若将本发明应用于工业化SOD的生产，则具有原料生物体生长周期短，生产规模大，提取成本低的优点，具有重要的工业应用前景和实际意义。

Description

超氧化物歧化酶基因的表达方法及其专用载体

技术领域

本发明涉及超氧化物歧化酶基因表达的方法及其专用载体。

背景技术

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是广泛存在于生物体内的金属酶，它有多种类型，如：Fe-SOD，Mn-SOD和Cu/Zn-SOD等。SOD酶是机体内唯一一种以超氧阴离子自由基(O^- ₂)为底物的酶，它能专一地催化O^- ₂发生歧化反应，生成H₂O₂和O₂，因而可较好地抵御氧自由基和其它氧化物自由基对细胞质膜的毒性，对防御机体的氧化损伤起到十分重要的作用(赵宝路。氧自由基和天然抗氧化剂。科学出版社，1999，3-125)。SOD在临床上主要用于治疗氧中毒、老年性白内障、糖尿病、心血管疾病、各种炎症等多种疾病；SOD还可作为防辐射剂，用于辅助放疗与化疗以及肾、肝、心脏等器官的保护和移植，以降低大剂量辐射的副作用。SOD在食品工业中主要是作为食品添加剂用于生产口香糖、饮料和啤酒(方允中，李文杰。自由基与酶。科学出版社，1989)。此外，将SOD加入化妆品中，还可起到防晒、防皮肤衰老和脂褐质形成的作用。

目前，SOD的制备来源主要有动物、植物和微生物。目前市场上的SOD产品大部分是从动物血液中提取的。由于原材料有限、纯化困难等原因，导致SOD的纯度低、产量少，特别是随着世界各地疯牛病、禽流感、口啼疫以及由动物传播的SARS等恶性传染病不时报道，生产动物源血液制品的风险加大，此外，对产品纯度要求的增高也增加了生产成本。因此，寻找廉价、高效的外源基因表达系统是突破传统制备方法的有效途径之一。

巴斯德毕赤酵母是甲醇酵母中的一种，迄今为止，已报道有400多种外源蛋白在此体系中成功表达(Cereghino，J L. and cregg J M.Heterologous proteinexpression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris.FEMS micrrobiol.Rev.2001，24，45-66)。与酿酒酵母相比，毕赤酵母具有更强的启动子，因而分泌效率更高，表达质粒更稳定，并可用于高密度发酵(细胞干重＞100g/L)(Romanos MA，Scorer C A，Clare J J.Foreign gene expression in yeast.Yeast，1992，8：423-488)。它可以在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中生长，这是因为其细胞的过氧化物酶体中含有甲醇代谢途径所必需的酶，如醇氧化酶，二羟丙酮合成酶和过氧化氢酶等，其中醇氧化酶(AOX)是甲醇利用途径中的第一个酶，它催化甲醇被氧化戍甲醛和过氧化氢。AOX由AOX1和AOX2两个基因编码，AOX2基因与AOX1基因序列相似，有92％的同源性，其编码蛋白有97％的同源性；AOX1基因严格受甲醇诱导和调控，AOX1基因的编码产物在氧化过程中起主要作用。在甲醇培养的细胞中，醇氧化酶可占总蛋白的30％以上，而在以葡萄糖、甘油、乙醇为碳源生长时，则不能检测到AOX的活性。毕赤酵母表达系统使用的醇氧化酶基因(AOX1)启动子为强诱导型启动子，可有效地调控外源基因的高效表达；采用整合型载体，可将外源基因整合到酵母染色体上，从而获得遗传稳定的菌株；表达量高，有许多蛋白的表达水平可达每克升以上，如破伤风毒素C片段表达量高达12g/L(Clare J J，Rayment F B，Ballantine S P，etal.High-lever expession of tananus toxin fragment C in pichia pastorisstrains containing multiple tandem integration of the gene.BioTechnology，1991，9：455-460.)，明胶表达量达到14.8g/L(Mare W T，et al.High-yield secretion of recombinant gelations by Pichia pastoris.Yeast，1999，15：1087-1096)。

蜡样芽孢杆菌M22(Bacillus.cereus M22)是一种植物内生细菌，其体内富含SOD酶，对从该菌体内获得的SOD进行理化性质测定发现，其稳定性高于从植物、动物中分离的SOD(苏宁，衣文平，王琦等，蜡质芽胞杆菌超氧化物歧化酶理化性质的研究(中国微生态学杂志。1999，11(1)：7-9)。

发明内容

本发明的目的是提供一种超氧化物歧化酶基因表达的方法及其专用载体。

本发明所提供的表达超氧化物歧化酶基因的专用载体，是含有来源于蜡样芽孢杆菌M22的超氧化物歧化酶Mn-sod2基因、AOX1启动子和终止子序列、多克隆位点以及筛选标志的毕赤酵母表达载体。

所述超氧化物歧化酶基因位于毕赤酵母表达载体的多克隆位点处EcoR I和Kpn I限制性内切酶酶切位点之间。

所述筛选标志为组氨醇脱氢酶基因(HIS4)的互补筛选标志或Zeocin^R筛选标志，其中优选的是Zeocin^R标志。

质粒pPICZα具有表达水平高、筛选及纯化快速等特点，并且含有AOX1启动子和终止子序列以及Zeocin抗性基因，可以直接对转化子进行筛选，提高了筛选效率；此外，在其多克隆位点下游，还融合有6×His标签和Myc位点，有助于目的蛋白的纯化和检测。pPICZα质粒的物理图谱如图1所示。利用该质粒为出发质粒构建的表达载体pPICZα-sodM18为最优选的毕赤酵母胞内表达载体。

本发明所提供的超氧化物歧化酶基因的表达方法，是构建含有超氧化物歧化酶基因的毕赤酵母表达载体，将构建的毕赤酵母表达载体导入毕赤酵母中，获得重组毕赤酵母，诱导重组毕赤酵母使超氧化物歧化酶基因得到表达。

为提高转化效率，将重组毕赤酵母表达载体导入毕赤酵母中的方法优选为电激转化法，但也可以采用其它生物工程领域中常用的方法，例如，氯化锂转化法、原生质体转化法等。

诱导重组毕赤酵母时需加入甲醇，所加入甲醇的浓度为0.4％-0.6％。为补偿甲醇的挥发损失，每24小时还要补加甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.4-0.6％。诱导重组毕赤酵母表达的时间为2-6天。

本发明所提供的超氧化物歧化酶基因在毕赤酵母中进行表达的方法弥补了传统SOD制备方法以及原核表达系统表达方式的不足；此外，若将本发明应用于工业化SOD的生产，则具有原料生物体生长周期短，生产规模大，提取成本低的优点，具有重要的工业应用前景和实际意义。

附图说明

图1为pPICZα质粒的物理图谱。

图2含有超氧化物歧化酶基因的载体pPICZα-sodM18的构建图。

图2a含有超氧化物歧化酶基因的载体pET-22b-sod的构建图。

图3为重组质粒pPICZα-sodM18的酶切鉴定结果。

图4为重组转化子在MM、MD培养基上的表型鉴定。

图5为毕赤酵母转化子DNA的PCR鉴定结果。

图6为重组毕赤酵母菌株诱导表达Mn-SOD基因的SDS-PAGE电泳图。

图7为Mn-SOD Native PAGE电泳图。

图8为用氯仿-乙醇处理后的Mn-SOD Native PAGE电泳图。

图9为用KCN处理后的Mn-SOD Native PAGE电泳图。

图10为不同诱导时间对Mn-SOD酶活力的影响。

图11为重组毕赤酵母菌株酶活力测定。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、含有超氧化物歧化酶基因的载体pPICZα-sodM18的构建

目的基因：Mn-sod2(来源于蜡样芽孢杆菌M22)

构建含有超氧化物歧化酶基因的载体pPICZα-sodM18的过程如图2所示，具体步骤如下：

1)载体pET-22b-sod的构建(构建过程如图2a所示)：根据Mn-sod2序列及表达质粒pPICZα的适宜酶切位点设计引物，引物序列如下：

上游引物P1：5′--CG GAATTC(EcoRI)ATGTCTTCATTTCAATTGCC--3′

下游引物P2：5′--GTC GGTACC(KpnI)TGTTTTTGTGATTGAATTGC--3′

以蜡样芽孢杆菌M22的基因组DNA为模板，在引物P1和引物P2的引导下，PCR扩增Mn-sod2片断，再用EcoRI和XhoI双酶切该基因片段，最后将其用T₄ DNA连接酶与用同样酶酶切的载体pET-22b连接，得到含有整合有Mn-sod2的质粒载体，将其命名为pET-22b-sod。

2)限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切整合有Mn-sod2的质粒载体pET-22b-sod后进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后用DNA快速回收试剂盒(上海生工)回收Mn-sod2片断。

3)用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切载体pPICZα(Invitrogen公司)。

4)将回收的Mn-sod2插入到2)中载体pPICZα的EcoRI和XhoI酶切位点之间，得到含有Mn-sod2的重组表达载体，命名为pPICZα-sodM18，获得的质粒保存在大肠杆菌中。

5)重组表达载体pPICZα-sodM18的酶切鉴定

用EcoRI单酶切及用EcoRI和XhoI双酶切pPICZα、pPICZα-sodM18，单酶切及双酶切反应体系如下：

单酶切：

10×reaction buffer      2μl

质粒DNA                  3μl

EcoRI(15U/ml)            0.6μl

ddH₂O                   14.4μl

总量                     20μl

双酶切：

10×reaction buffer      2μl

质粒DNA                  3μl

EcoRI(15U/ml)            0.6μl

XhoI(15U/ml)             0.6μl

ddH₂O                   13.8μl

总量                     20μl

混匀后于37℃酶切3h，用1.2％琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图3所示(泳道1为EcoRI酶切质粒pPICZα；泳道2为EcoRI酶切重组质粒pPICZα-sodM18；泳道3为核酸分子量标准；泳道4为以pET-22b-sod为模板的PCR产物；泳道5为EcoRI和XhoI双酶切pPICZα-sodM18)，泳道1、2、4均只有1个条带，而泳道5则有2个条带，确定所获得的重组质粒是正确的。

实施例2、Mn-sod2基因在毕赤酵母中的表达

1、将待转化的质粒线性化

因线性化的质粒更容易转化进酵母染色体中，应先对重组体质粒进行单酶切，使之线性化。取50μl质粒pPICZα-sodM18用SacI酶切3h。酶切体系为：

酶切

无菌水         适量

DNA            50μl

10×buffer     40μl

SacI           100U

总体积         100μl

将100μl酶切产物依次用等体积的酚∶氯仿、氯仿抽提，加入1/10体积的乙酸钠(pH5.2)及2-3倍体积的无水乙醇沉淀，再用70％乙醇洗一次，真空干燥后溶于10μl水中，待用。

2、毕赤酵母感受态细胞的制备

菌株：毕赤酵母GS115

YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose Mediun)固体培养基(g/L)：在850ml去离子水中加入酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，定容至900ml，再加入20g琼脂粉，冷却至低于50℃后加入8磅湿热灭菌的100ml 20％葡萄糖，倒制平板，4℃保存。

YPD液体培养基(g/L)：高压灭菌，冷却后加入8磅湿热灭菌的100ml 20％葡萄糖，4℃保存。

(1)挑取YPD平板上的毕赤酵母GS115单菌落于5ml YPD液体培养基中，30℃、300rpm摇床过夜；

(2)将摇床过夜的新鲜GS115菌液按1/1000接种量转接至100ml YPD中，30℃、300rpm摇床过夜，OD₆₀₀约为1.3-1.5时，停止振荡；

(3)将预冷的菌液转移至冰预冷的离心管中，4℃、1500g离心5min，沉淀用100ml预冷的无菌水重悬；

(4)4℃、1500g离心5min，沉淀用50ml预冷的无菌水重悬；

(5)4℃、1500g离心5min，沉淀用4ml预冷的1mol/L山梨醇溶液重悬；

(6)4℃、1500g离心5min，沉淀用200μl预冷的山梨醇溶液重悬，备用。

3、质粒的电击转化

质粒DNA：线性化的载体pPICZα-sodM18

宿主菌：毕赤酵母GS115感受态细胞

YPDS(Yeast Extract Peptone Dextrose Mediun With Sorbitol)固体培养基(g/L)：在850ml去离子水中加入酵母提取物10，胰蛋白胨20，山梨醇182.2，琼脂20，定容至900ml，高压灭菌，冷却后加入8磅湿热灭菌的100ml 20％葡萄糖，倒制平板，4℃保存。

(1)将80μl毕赤酵母GS115感受态细胞与10μl线性化待转化质粒DNA混合，并将其转至0.2cm电转化杯中；

(2)将装有混合液的转化杯冰浴5min；

(3)调整基因导入仪的参数(电容20μF、电压2000V)，电击一次，时间约为5ms；

(4)立即往转化杯中加入1ml预冷的1mol/L山梨醇溶液，混匀后，将其转至经灭菌的离心管中；

(5)将混合液涂于YPDS板(含100mg/ml Zeocin)上，每个YPDS板上涂150μl-300μl的混合液；

(6)将YPDS板置于30℃培养箱中培养2-3d，直到长出单菌落为止。

4、转化子表型的筛选

MD(Minimal Dereose)选择性固体培养基(g/L)：在800ml去离子水中加入琼脂粉15，高压灭菌，待冷却至50℃以下时，加入经0.22μm过滤除菌的10×YNB 100ml，500×B 2ml，10×D 100ml，倒制平板，4℃保存。

MM(Minimal Methanol)选择性固体培养基：在800ml去离子水中加入15g琼脂粉，高压灭菌，待冷却至50℃以下时，加入经0.22μm过滤除菌的10×YNB 100ml，500×B 2ml，10×M 100ml，倒制平板，4℃保存。

500×B(生物素)：将20mg生物素溶解于100ml去离子水中，混匀后0.22μm过滤除菌，4℃保存。

10×YNB(酵母氮碱，含硫酸胺，不含氨基酸)：将134g酵母氮碱(含硫酸胺，不含氨基酸)溶解于1000ml去离子水中，混匀后0.22μm过滤除菌，4℃保存。

10×D(葡萄糖)：将200g葡萄糖溶解于1000ml去离子水中，8磅湿热灭菌15min。

10×M(甲醇)：将5ml甲醇加入到950ml去离子水中，混匀后0.22μm过滤除菌，4℃保存。

(1)用灭过菌的牙签从长有转化子的YPDS板上挑取单菌落，按照编号点到MM上，再点到相应编号的MD平板上；

(2)将点有转化子的MM、MD平板置于30℃培养箱中培养1-2天，至长出单菌落。阳性转化子应在MM平板上不生长或生长缓慢，而在MD平板上能正常生长。

结果如图4所示，表明pPICZα-sodM18载体经过同源重组整合到GS115宿主染色体的基因组上，产生的转化子表型多数为Mut⁺，但也会发生外源基因取代宿主细胞染色体的AOX1基因，使转化子表型呈Mut^-(董燕，王捷，张宏斌等.人骨唾液酸蛋白酵母工程细胞的构建与表达。中国生化药物杂志，2003，24(3)：109-112)。本实验将24个转化子分别点接至MM，MD平板上，30℃培养2-3天，发现有6个转化子在MM平板上生长快速，而在MD平板上长势缓慢，表明为Mut⁺型转化子。

5、毕赤酵母转化子的鉴定

A、毕赤酵母基因组的制备

(1)取1.5ml 30℃过夜培养的酵母细胞，12000rpm离心收集菌体，弃上清；

(2)将细胞用100μl STES缓冲液重悬；

(3)向酵母悬浊液液中加入适量酸洗玻璃珠及40μl TE(pH 7.6)；

(4)加入120μl酚：氯仿，充分振荡1min，使有机相和水相充分混合；

(5)12000rpm离心10min，取上清转移至新的离心管；

(6)0℃以下乙醇沉淀20min；

(7)4℃，12000rpm离心10min，弃上清；

(8)200μl 70％乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心1min，弃上清；

(9)将基因组DNA沉淀干燥后溶于60μl TE(pH 7.6)；

(10)取1μl毕赤酵母基因组DNA溶液作为模板。

B、对毕赤酵母基因组稀释一定倍数后作为模板，在引物P1和引物P2的引导下，进行PCR扩增，反应体系如下：

10×Taq reaction buffer               2.5μl

dNTP(2.5mmol/Leach)                   2μl

Primer P1(0.1μg/ml)                  1μl

Primer P2(0.1μg/ml)                  1μl

DNA模板                               1μl

Taq DNA聚合酶                  0.5μl

ddH₂O                          17μl

总体积                         25μl

混合均匀后按以下条件进行PCR反应：

PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图5所示(泳道1-3为毕赤酵母转化子基因组DNA，泳道4为核酸分子量标准，泳道5为原始毕赤酵母菌株GS115基因组DNA)，在627bp左右处有一特异性目的条带的质粒初步确定为阳性重组质粒。

6、目标基因在毕赤酵母中的诱导表达

YPDS(Yeast Extract Peptone Dextrose Mediun With Sorbitol)固体培养基：在850ml去离子水中加入酵母提取物10，胰蛋白胨20，山梨醇182.2，琼脂20，定容至900ml，高压灭菌，冷却后加入8磅湿热灭菌的100ml 20％葡萄糖，倒制平板，4℃保存。

BMGY(Buferred Glycerol-complex Medium)选择性液体培养基：在650ml去离子水中加入酵母提取物10，胰蛋白胨20，溶解后定容至700ml，高压灭菌，待冷却至50℃以下时，加入经0.22μm过滤除菌的10×YNB 100ml，500×B 2ml，10×GY 100ml，1M 100ml，pH6.0，4℃保存。

500×B(生物素)：将20mg生物素溶解于100ml去离子水中，混匀后0.22μm过滤除菌，4℃保存。

10×YNB(酵母氮碱，含硫酸胺，不含氨基酸)：将134g酵母氮碱(含硫酸胺，不含氨基酸)溶解于1000ml去离子水中，混匀后0.22μm过滤除菌，4℃保存。

10×M(甲醇)：将5ml甲醇加入到950ml去离子水中，混匀后0.22μm过滤除菌，4℃保存。

10×GY(甘油)：将100ml甘油加入到1000ml去离子水中，0.22μm过滤除菌或湿热灭菌，室温保存。

1M磷酸盐缓冲液(pH6.0)：在850ml去离子水中加入1M Na₂HPO₄ 12m，1M NaH₂PO₄88ml。

(1)挑取YPDS(含Zecion：1000mg/ml)平板上的单克隆接种于装有10ml BMGY培养基的50ml离心管中，30℃、250-280rpm摇床培养2-3天；

(2)摇床培养2-3天的培养液，4℃，3000g离心15min，取沉淀(尽量将上清除尽)，再往沉淀中加入40ml含有0.5％甲醇的BMMY培养基，在28℃、250-280rpm条件下进行诱导培养；

(3)为补偿甲醇的挥发损失，每24h补加甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5％。

(4)每隔24h取样，4℃，3000g离心15min，收集菌体，待检测蛋白及酶活力。

(5)诱导4-5天后，停止诱导，4℃，3000g离心15min，收集菌体，待检测蛋白及酶活力。

实施例4、超氧化物歧化酶基因表达产物的检测

1、SDS-PAGE分析

挑取鉴定正确的重组菌株及空质粒对照菌株分别接种BMGY培养基培养至OD₆₀₀＝2-6，收集菌体后，转接BMMY培养基进行诱导表达。诱导结束后的菌体经超声波破碎后分别取上清进行SDS-PAGE电泳，结果如图6所示(泳道1为阳性重组菌株，泳道2为转空质粒对照菌株，泳道3为低分子量蛋白标准)，GS115/Mut⁺整合子在23KD处有目的蛋白表达，而阴性对照处无蛋白条带。

2、Native-PAGE分析

将表达产物进行Native PAGE电泳，结果如图7所示(泳道1为阴性对照菌株，泳道2为重组菌株G5，泳道3为.重组菌株G6)，泳道2和3处经Native-PAGE电泳酶活染色显示有亮带，而阴性对照泳道1无活性条带。

Mn-SOD活性明显受氯仿-乙醇抑制，而对KCN的抑制则不敏感，据此可以鉴别Mn-SOD。本实验将Native PAGE电泳胶分别经氯仿-乙醇(3∶5/V∶V)和KCN(5mmol/L)处理，再经过Native-PAGE正常染色光照过程，结果分别如图8和图9所述(1为阴性对照菌株，2为重组菌株G5，3为重组菌株G6)，表明酶活明显受到氯仿-乙醇抑制，而对KCN的抑制不敏感，由此可进一步确定，所表达的SOD为Mn-SOD。

3、不同诱导时间对酶活性的影响

将重组毕赤酵母菌株G经甲醇诱导，不同时间段取样，超声波破碎后取上清通过NBT光化学抑制法测定SOD蛋白活性，结果如图10所示，表明在诱导第四天酶活力达到最高水平：6766U/mg。

4、重组蛋白活性检测

采用NBT光化学抑制法检测重组蛋白活性。吸取30μl样品，放入10ml透明玻璃小烧杯中，加入3ml NBT反应液，混匀，在28℃ SOD光化反应室中，2×15W日光灯光照20min，在560nm处测定吸光度，以NBT反应液作空白对照，每组设两个重复，整个测定过程除光化反应外，均在闭光或弱光条件下进行。以抑制NBT光化还原反应速率的50％所需的酶量定为一个酶活力单位。公式如下：

样品酶活力(U/ml)＝(OD_对照-OD_样品)/(1/20D_对照)×稀释倍数通过NBT光化学抑制法测定转化空质粒对照菌株和阳性重组菌株的SOD蛋白活性，结果如图11所示(1：转pPICZα质粒对照菌株，2：阳性重组菌株)，对照菌株的SOD蛋白活性为935U/mg，阳性重组菌株的SOD蛋白活性为5576U/mg，表明重组菌株的酶活力比对照菌株酶活力提高了接近5倍。

Claims (8)

1、一种表达超氧化物歧化酶基因的载体，它是含有来源于蜡样芽孢杆菌M22的超氧化物歧化酶Mn-sod2基因、AOX1启动子和终止子序列、多克隆位点以及筛选标志的毕赤酵母表达载体。

2、根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述超氧化物歧化酶基因位于毕赤酵母表达载体pPICZα的多克隆位点处EcoR I和Xho I限制性内切酶酶切位点之间。

3、根据权利要求1或2所述的载体，其特征在于：所述筛选标志为Zeocin^R筛选标志。

4、根据权利要求2所述的载体，其特征在于：所述毕赤酵母表达载体为如图2所示的pPICZα-sodM18。

5、一种超氧化物歧化酶基因表达的方法，是构建含有超氧化物歧化酶基因的毕赤酵母表达载体，将构建的毕赤酵母表达载体导入毕赤酵母中，获得重组毕赤酵母，诱导重组毕赤酵母使超氧化物歧化酶基因得到表达；其中，所述毕赤酵母表达载体是含有来源于蜡样芽孢杆菌M22的超氧化物歧化酶Mn-sod2基因、AOX1启动子和终止子序列、多克隆位点以及筛选标志的毕赤酵母表达载体。

6、根据权利要求5所述的超氧化物歧化酶基因表达的方法，其特征在于：所述将构建的毕赤酵母表达载体导入毕赤酵母中的方法为电转化法。

7、根据权利要求5所述的超氧化物歧化酶基因表达的方法，其特征在于：所述诱导重组毕赤酵母表达时加入甲醇，甲醇的浓度保持在0.4-0.6％。

8、根据权利要求7所述的超氧化物歧化酶基因表达的方法，其特征在于：所述诱导重组毕赤酵母表达的时间为2-6天。

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