JPH08317793A - Ｄｎａフラグメント - Google Patents

Ｄｎａフラグメント

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JPH08317793A
JPH08317793A JP8101552A JP10155296A JPH08317793A JP H08317793 A JPH08317793 A JP H08317793A JP 8101552 A JP8101552 A JP 8101552A JP 10155296 A JP10155296 A JP 10155296A JP H08317793 A JPH08317793 A JP H08317793A
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【解決手段】 細胞外液中のＥＣ−ＳＯＤ（細胞外スー
パーオキシドジスムターゼ）をエンコードし、かつ当該
ＤＮＡ配列又はその蛋白質の別のアミノ酸配列を生じな
いヌクレオチド置換体を包含しかつ天然ＥＣ−ＳＯＤの
もつスーパーオキシドを不均化する特性を有するポリペ
プチドをエンコードする前記ＤＮＡ配列の変形配列から
なるＤＮＡフラグメント。 【効果】 治療の必要な患者に治療的に又は予防的に有
効量のＥＣ−ＳＯＤを投与することからなる、スーパー
オキシドラジカルの存在又は形成に関連する疾患や病気
の予防又は治療法、及び、手術前、手術中又は手術後に
治療的又は予防的に有効量のＥＣ−ＳＯＤを投与するこ
とからなる、腎臓、肺、膵臓、心臓、肝臓又は皮膚のよ
うな器官の移植と関連して又は心臓手術と関連して虚血
に続く再灌流によって起こる損傷を予防又は治療法の提
供。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、ＤＮＡフラグメ
ントに関する。
【０００２】
【従来の技術】蛋白質、炭水化物、脂質および核酸のご
とき体内の生化学的化合物と酸素とを反応させるには極
めて強力な熱力学的推進力を要する。この反応が完了す
ると、水、二酸化炭素および多数の排泄物が最終生成物
として形成されると同時に多量のエネルギーが放出され
る。生物学的化合物の酸化反応は生物のエネルギー源で
ある。幸いにもかような反応は、反応バリヤーによって
きわめてゆっくりと、自発的におこる。これらのバリヤ
ーは、中間代謝での酵素によって克服され、酸素との最
終反応がミトコンドリア内で起こり、ミトコンドリア内
では酸素が４つの電子で還元されて水となり、いかなる
中間生成物も遊離されない。この反応は電子伝達チェー
ン内のシトクロム酸化酵素複合体によって完成され、Ａ
ＴＰが形成されてエネルギーが蓄えられる。
【０００３】しかし酸素から水への、直接４段還元反応
はほとんど１段反応であり、酸素が、自発的もしくは酵
素で触媒されて反応する場合、機械作用的理由によって
一度に１段階の反応が強制される（酵素触媒反応は時々
２段階を要する）。一連の反応性中間体や有毒中間体、
すなわちスーパーオキシドラジカル（Ｏ2 ・-）、過酸化
水素（Ｈ2Ｏ2）およびヒドロキシラジカル（ＯＨ・）が
下記に示す順に形成される。
【０００４】
【化１】
【０００５】これらの中のＯ2 ・-とＯＨ・の２つは、単一
の不対電子を有し、それ故、フリーラジカルと呼ばれ
る。体内での酸素消費量の数％が、有毒還元中間体の形
成をもたらすと推定されている。酸素の毒性効力は主と
してこれら中間体の作用に起因している。酸素自体はほ
とんどの生化学的化合物とゆっくり反応する。毒性反応
は一般に、酸素ラジカルを生成する工程で開始され、そ
のラジカル自体は、生化学的化合物を直接に損傷する
か、酸素の関与する連鎖反応を開始させる。
【０００６】いくつかの化合物は酸素と自発的に反応す
る。すなわちこれらは自動酸化する。事実上すべての自
動酸化反応によって、有毒な酸素還元中間体が形成され
る。アドレナリン、ピロガロールおよびいくつかの他の
化合物の自動酸化反応によってスーパーオキシドラジカ
ルが形成される。またこのスーパーオキシドラジカル
は、メトヘモグロビンがオキシヘモグロビンから形成さ
れるときにも放出される。さらにいくつかの酸化酵素が
スーパーオキシドを形成する。これらの酵素のうちで最
も重要なのはキサンチンオキシダーゼであり、これは、
ハイポキサンチンとキサンチンを酸化して尿酸とする。
ミトコンドリア内の酸素還元の小部分がスーパーオキシ
ドを形成し、次いで過酸化水素を形成する。ミクロソー
ムシトクロムＰ450系もスーパーオキシドを放出する。
電離線が酸素を含有する水溶液を通過する際に、最も高
濃度で形成されるラジカルはスーパーオキシドラジカル
である。食作用白血球（多形核白血球、単球、マクロフ
ァージ、好酸球）が活性化すると、大量のスーパーオキ
シドが放出される。このようにして形成された有毒酸素
還元生成物は、細胞を殺す能力を有する点では基本的に
重要であるが、周辺の組織を損傷するかもしれない。
【０００７】スーパーオキシドが不均化反応によって形
成される際には過酸化水素が常に形成される。体内のほ
とんどの酸化酵素は直接に酸素を還元して過酸化水素と
する。中間体の中でもっとも反応性のものはヒドロキシ
ルラジカルである。それは、過酸化水素がＦｅ2+もしく
はＣｕ+イオンと反応するとき〔いわゆるフェントン反
応（Fenton reaction）〕に形成される。
【０００８】
【化２】
【０００９】これら遷移金属のイオンも、過酸化水素
と、ヒドロキシルラジカルの生成をもたらすスーパーオ
キシドとの反応、いわゆるハーバー・ワイス反応（Habe
r-Weiss reaction）を触媒する。
【００１０】
【化３】
【００１１】電離線は水を分解して水素原子とヒドロキ
シルラジカルを生成させる。このようにして生成したヒ
ドロキシルラジカルが、電離線によって起った大部分の
生物学的損傷の原因である。上記の記載からみていくつ
かの酸素還元生成物は通常同時に形成されるようであ
る。キサンチンオキシダーゼ系においては、例えば、ス
ーパーオキシドのみならず過酸化水素が形成され、両者
は直接にスーパーオキシド不均化反応で形成される。次
いでこれらの化合物はさらに反応しヒドロキシルラジカ
ルを形成する。キサンチンオキシダーゼ系が、蛋白質、
炭水化物および核酸に損傷を与えたり細胞を殺すのを示
すことができる。生化学的化合物のうち、ポリ不飽和脂
質は酸素毒性に対しても最も敏感のようである。酸素中
間体は、分子酸素が関連する連鎖反応、いわゆる脂質の
過酸化反応を開始させることができる。このようにして
生成された脂質過酸化物とその分解生成物は細胞膜の機
能を損なうだけでなく他の細胞要素も損傷する。
【００１２】酸素の存在下で生きている生物は、有毒な
酸素還元代謝物に対して、多数の防御機構を発達させざ
るを得なかった。その防御因子には、スーパーオキシド
ラジカルを不均化するスーパーオキシドジスムターゼ
（ＳＯＤ）類が含まれ、哺乳類の細胞や組織に比較的一
定量存在することが見出されている。これら酵素で最も
よく知られているのは、２つの銅原子と２つの亜鉛原子
を含有する分子量33,000の２量体であるＣｕＺｎＳＯＤ
である。ＣｕＺｎＳＯＤは、細胞質ゾルと、ミトコンド
リアの膜間腔とに存在することが知られている。ＭｎＳ
ＯＤは、４つのＭｎ原子を有する分子量85,000の４量体
であり主としてミトコンドリアのマトリックス中に存在
する。最近まで細胞外液はＳＯＤ活性を欠いていると考
えられていた。
【００１３】しかし、この発明の発明者らは最近、細胞
外液（例えば血漿、リンパ、滑液および脳脊髄液）中
に、ＥＣ−ＳＯＤ（細胞外スーパーオキシドジスムター
ゼ）と呼ばれるスーパーオキシドジスムターゼが存在す
ることを示した。ヒトについては、血漿１ml当りの活性
は、組織の１ｇ当りの全ＳＯＤ活性の１％より少ない。
しかし身体によって積極的に調整されるようである（Ma
rklundら、Clin. Chim.Acta 126, 1982年，pp. 41〜5
1）。レクチンに対する親和性（実施例12参照）は、Ｃ
ｕＺｎＳＯＤに反して、酵素が糖蛋白質であることを示
している。それは、全分子量が135,000（４量体）で、
４つの等しい非共有的に結合されたサブユニットを有
し、金属含有物として一つのＣｕ原子と一つの亜鉛原子
／サブユニットを有するようである（実施例14参照）。
その酵素は、他の銅含有ＳＯＤが行うようにスーパーオ
キシドラジカルの一次不均化反応を触媒する。
【００１４】
【化４】
【００１５】その比活性は非常に高く、恐らく分子中の
４つの銅原子によって仲介されるのであろう。ヘパリン
−Ｓｅ−ファロース（登録商標、heparin-Se-pharose）
のクロマトグラフィに付すると、その酵素は３つのフラ
クションに分割され、すなわち全く親和性のないＡ、弱
い親和性を有するＢおよび強いヘパリン親和性を有する
Ｃである。ＥＣ−ＳＯＤの挙動と異なり、ＣｕＺｎＳＯ
ＤとＭｎＳＯＤはヘパリン−セファロース（登録商標）
に結合しない。その酵素はある種の疎水性を有し、全細
胞膜に親和性を示す。ヘパリンに対する親和性は、細胞
表面、特に血管内皮上に見出されるヘパラン硫酸に対す
る親和性を示す場合が多い。それ故ＥＣ−ＳＯＤは一部
が細胞表面に位置し、一部が細胞内液内に位置している
と考えられる（下記実施例９〜11参照）。そのアミノ酸
組成と抗原反応性は、これについて研究されたＳＯＤイ
ソ酵素のそれとは全く異なる（Marklund, Proc. Nat. A
cad. Sci. 米国、79, 1982年，第7634−7638頁；Bioche
m. J. 220, 1984,第269〜272頁）。ＥＣ−ＳＯＤをコー
ドするメッセンジャーＲＮＡは、シグナルペプチドをコ
ードする配列を有し（実施例８参照）、ＥＣ−ＳＯＤは
分泌蛋白質であることを示している。一方ＣｕＺｎＳＯ
ＤをコードするｍＲＮＡは、シグナルペプチドをコード
する配列をもっていない。さらにＥＣ−ＳＯＤのアミノ
酸配列は他のＳＯＤイソ酵素のそれとは異なり、ＥＣ−
ＳＯＤは、試験されたすべての哺乳類の血漿（Marklun
d, J. Clin. Invest. 74, 1984年，第1398−1403頁；Bi
ochem.J. 222, 1984年，第649-655頁）はもとより鳥類
や魚類にも存在する。その含有量は種によって大きく変
動するが、種の中での変動は非常に小さい。齧歯動物の
血漿は、比較的少量のＥＣ−ＳＯＤを含有するヒト血漿
よりも10〜20倍のＥＣ−ＳＯＤを含有している。またＥ
Ｃ−ＳＯＤは、試験された、異なる種類の動物の組織の
すべてに見出された（Marklund, J. Clin. Invest. 74,
1984年，第1398−1403頁；Biochem. J. 222, 1984年，
第649−655頁）。組織内については、種の中での差異は
はるかに小さい。組織中のＥＣ−ＳＯＤのレベル（単位
／ｇ湿重量）は、ヒトの血漿ＥＣ−ＳＯＤのレベル（単
位／ml）より高い。齧歯動物においては、組織と血漿は
ほぼ等量のＥＣ−ＳＯＤを含有している（Marklund, Bi
ochem. J. 222, 1984年，第649〜655頁）。
【００１６】そのＳＯＤの活性によって、それらがスー
パーオキシドや他の酵素ラジカルの毒性効力を中和する
治療試験の重要な候補となる。細胞外液内のＳＯＤ活性
は前記のように低レベルであるので、細胞外液や、細胞
表面の成分は、細胞内のものよりもスーパーオキシドラ
ジカルと他の有毒酸素還元産物に対する保護の程度がは
るかに低い。それ故ＥＣ−ＳＯＤは、細胞外スーパーオ
キシドラジカルの産生と関連する治療用途に特に重要な
物質である。
【００１７】それ故、容易に入手しうるソースから、治
療の目的で実用的な量でＥＣ−ＳＯＤを提供することは
有益なことである。主として、特定のタイプの細胞から
なる前記のソースは、従来示唆も記載もされていない。
したがって、重要な態様としてこの発明は組換え体起源
のＥＣ−ＳＯＤに関する。この明細書において、“組換
え体”という用語は、組換え体ＤＮＡ技術に付され、す
なわちＥＣ−ＳＯＤをコードするＤＮＡ配列が挿入され
次いでＥＣ−ＳＯＤを発現するように誘発された細胞か
ら、ＥＣ−ＳＯＤが誘導されるということを示すもので
ある。特に、この発明は下記ＤＮＡ配列：
【００１８】
【外３】
【００１９】
【外４】
【００２０】又は天然のＥＣ−ＳＯＤのもつスーパーオ
キシドを不均化する性能を有するポリペプチドをコード
する前記配列の変形配列によってコードされるポリペプ
チド構造を有するＥＣ−ＳＯＤに関する。このＤＮＡ配
列から誘導されるアミノ酸配列はそのＤＮＡ配列の上に
示されていることに留意すべきである。そのＤＮＡ配列
の適切な変形の例は、その蛋白質の他アミノ酸配列を生
じないが例えばその配列が挿入される特定の生物のコド
ン使用度に対応するヌクレオチド置換体；異なるアミノ
酸配列を生じそれ故おそらく他の蛋白構造を生じるがス
ーパーオキシドラジカルを不均化する重要な性質を損な
わないヌクレオチド置換体；天然の蛋白質のスーパーオ
キシド不均化性能を保有したポリペプチドをコードする
上記配列のサブ配列；又はそのＤＮＡ配列が天然の蛋白
質のスーパーオキシドラジカルを不均化する生物学的性
質を有するポリペプチドをコードする場合、上記配列に
基づいて作製されたＤＮＡプローブの少なくとも一部に
ハイブリダイズ（雑種形成）するＤＮＡ配列である。こ
の関係において、“天然ＥＣ−ＳＯＤのスーパーオキシ
ドを不均化する性質”という用語とこれに関連する用語
は定量的よりもむしろ定性的であり、すなわちポリペプ
チドの活性のレベルよりもむしろその性質に関係すると
理解すべきである。
【００２１】上記定義の、ＥＣ−ＳＯＤをコードするＤ
ＮＡ配列、その変形もしくは誘導体は、相補的ＤＮＡ
（ｃＤＮＡ）起源のものであってもよく、すなわち、確
立された標準法のエンド・ベクター（end vector）によ
って、ＥＣ−ＳＯＤを産生する細胞からのｍＲＮＡに基
づいてｃＤＮＡライブラリィを作製することによって得
られる。次いでプローブとして合成オリゴヌクレオチド
を用いて雑種形成実験を行いＥＣ−ＳＯＤをコードする
ｃＤＮＡ配列を同定することができる。代わりに、その
ＤＮＡが染色体起源のものであってもよく、すなわち、
例えば通常の方法にしたがって組織中に見出されたＥＣ
−ＳＯＤの全アミノ酸配列もしくは一部のアミノ酸配列
に基づいて作製されたＤＮＡプローブに雑種形成する染
色体配列をスクリーニングすることによって直接に細胞
染色体から誘導されたものであってもよい（一般的な手
順の詳細な説明については実施例８を参照のこと）。染
色体ＤＮＡはｃＤＮＡとは異なる。例えば染色体ＤＮＡ
は、転写調節要素と、コードＤＮＡ配列内の非コード配
列であるいわゆるイントロン（その意義は現在不明確で
ある）とを有していることで異なる。ｃＤＮＡと染色体
ＤＮＡとの両者は、動物特に哺乳類起源のものでもよ
い。ヒトに関する治療を目的とするには、ＥＣ−ＳＯＤ
は、好ましくない有害な免疫反応を実質的に避けるため
に、ヒト起源のＤＮＡ配列によってコードされるＥＣ−
ＳＯＤが好ましい。
【００２２】そのＤＮＡ配列は又、合成由来であっても
よい。すなわち、例えばMatthesらEMBO Journal 3, 198
4年，pp801〜805に述べられているような確立された標
準法によって合成的に調製される。最後にそのＤＮＡ配
列は合成と染色体由来の混合されたもの、又は染色体と
ｃＤＮＡ由来の混合されたもの、又はｃＤＮＡと合成由
来の混合されたものであってもよい。それぞれはＥＣ−
ＳＯＤをコードする遺伝子の１部から成るＤＮＡフラグ
メントである、ｃＤＮＡ、染色体又は合成由来のものを
標準的方法に従って一括して連結させることによって調
製される。
【００２３】その組換え体由来のＥＣ−ＳＯＤは大量に
容易に得られるので、この発明にとって好ましいもので
あるが、ＥＣ−ＳＯＤは他の資源からも入手し得る。か
くしてこの発明は又、セルライン由来のＥＣ−ＳＯＤに
関する。すなわち血液もしくは肺、血管、膵臓、子宮、
前立腺、胎盤もしくは臍帯組織、又は腫瘍組織のような
充分量蛋白を産生するセルラインから導かれるものに関
する。内皮細胞又は繊維芽細胞は現在ＥＣ−ＳＯＤの可
能な資源になると期待される。
【００２４】最後にＥＣ−ＳＯＤはＥＣ−ＳＯＤが比較
的豊富であることが見出されている組織からも誘導され
る。従って、この発明はさらに他の組織に比較してＥＣ
−ＳＯＤのかなり大量をふくむことが見出された胎盤又
は臍帯由来のＥＣ−ＳＯＤに関する。そしてそれらは、
例えば肺、子宮又は膵臓組織より一層たやすく得られる
ものである。しかしながら、たとえこれらの組織が比較
的大量のＥＣ−ＳＯＤを含んでいるとしても、これらは
組換え体ＤＮＡ法によって得られるものよりはるかに少
量であり、それ故、胎盤又は臍帯ＥＣ−ＳＯＤはごく少
量のＥＣ−ＳＯＤを必要とする特別の目的のために特に
示されるということは強調されるべきである。
【００２５】さらに別の態様において、この発明はＥＣ
−ＳＯＤをコードするＤＮＡから成る複製可能な発現ベ
クターに関する。この明細書において、“複製可能な”
という用語は、そのベクターが導入された、与えられた
型の宿主細胞内で複製出来ることを意味する。そのベク
ターは、上記のＤＮＡ配列又は先に説明したようなその
適当な変形体をもったものであってもよい。この配列
（ＥＣ−ＳＯＤのコード領域配列）のすぐ上流に、シグ
ナルペプチドをコードする配列がつながれる。そのシグ
ナルペプチドの存在は、そのベクターをもった宿主細胞
によって発現されたＥＣ−ＳＯＤの分泌を確実に行うも
のである。例えばそのシグナル配列は次のような配列で
あってもよい。
【００２６】
【外５】
【００２７】このシグナル配列（及びそれによってコー
ドされるシグナルペプチド）は、それ自体この発明の１
つの態様を形成することに注目されるべきである。そし
てそれは細胞から目的産物を分泌させるように、他の蛋
白類やペプチド類をコードするＤＮＡ配列の上流に挿入
することが考えられる。そのベクターは組換え体ＤＮＡ
法に便利に付すことができるいかなるベクターであって
もよい。ベクターの選択はそれが導入される宿主細胞に
依存することが多い。かくしてそのベクターは自律的に
複製するベクター、すなわち染色体外実在物として存在
し、その複製が染色体複製と独立しているものであって
もよく、例えばプラスミド、ファージ、コスミド、ミニ
染色体又はウイルスのようなベクターである。代わり
に、そのベクターは、宿主細胞に導入されたときに、宿
主細胞染色体に組込まれ、その組込まれた染色体と共に
複製するものであってもよい。
【００２８】この発明は別の態様として、ＥＣ−ＳＯＤ
を分泌しうるセルラインに関する。広い範囲の組織細胞
由来の種々のヒトセルライン及び腫瘍セルラインは、そ
れらのＥＣ−ＳＯＤ含量についてすでに解析されている
が（Marklund, J. Clin, Invest, 74, 1984年10月，pp1
398〜1403）、何ら結論的な結果は得られていない。少
量のＥＣ−ＳＯＤは調べられたセルラインのいくらかに
見出されたことが述べられているけれども、その論文の
表11に示されているデータは有意ではなく、ほとんど分
析誤差に帰せられるものかも知れない。その論文中にＥ
Ｃ−ＳＯＤ産生の可能性は示していないので、確かに当
業者は、この刊行物の中に示されたデータに基づいて、
ＥＣ−ＳＯＤの含量について試験されたいくらかのセル
ラインが分泌蛋白としてＥＣ−ＳＯＤを産生できるかも
知れないとは結論しないであろう。
【００２９】そのセルラインは哺乳動物、特にヒト由来
であってもよい。そのセルラインは特に多量のＥＣ−Ｓ
ＯＤ（他の細胞と比較して）を産生するものが好まし
い。したがってそのセルラインは血液もしくは肺、血
管、膵臓、子宮、前立腺、胎盤もしくは臍帯組織又は腫
瘍組織由来のものである。特に、繊維芽細胞又は内皮細
胞から導かれたセルラインは特にＥＣ−ＳＯＤの資源と
して有利であると考えられる。なぜならそれらは細胞外
空間に直接さらされる細胞由来のものであり、それゆえ
細胞外環境に存在するか生ずるスーパーオキシドラジカ
ルから、ＥＣ−ＳＯＤによって与えられる保護を必要と
すると考えられるからである。
【００３０】この発明はさらに、上に定義されたような
複製可能な発現ベクターをもった細胞に関するものであ
る。原則として、この細胞はいかなる型の細胞であって
もよい。すなわち細菌のような原核細胞、単細胞真核生
物、カビもしくは酵母、又は多細胞生物、例えば動物又
は植物由来の細胞である。しかしながら哺乳動物細胞
は、とにかく、低級生物の細胞が産生することのできな
い非常に複雑な分子であるＥＣ−ＳＯＤを特に発現する
ことが出来ると信じられる。かような細胞の１つの例
は、1986年８月27日、ＥＣＡＣＣ 86082701の番号で、
ブタペスト条約に基づいて、ザ・ヨーロピアン・コレク
ション・オブ・アニマル・セル・カルチャー（the Euro
pean Collection of Animal Cell Culture）に寄託され
たＣＨＯ−Ｋ１／ｐＰＳ３ネオ−18である。
【００３１】またこの発現は、次のようなＤＮＡ配列を
もち、ＥＣ−ＳＯＤをコードするＤＮＡフラグメントに
関する。
【００３２】
【外６】
【００３３】
【外７】
【００３４】この配列は上に示されたシグナルペプチド
をコードする配列を含んでいることに注目すべきであ
る。そのシグナル配列はアミノ酸−18から−１にわたっ
ている。天然ＥＣ−ＳＯＤをコードする配列はアミノ酸
＋１に始まる。そのＤＮＡ配列は上述のように、ｃＤＮ
Ａ、染色体もしくは合成由来のＤＮＡ、又はｃＤＮＡと
染色体ＤＮＡの混合されたもの、ｃＤＮＡと合成ＤＮＡ
の混合されたものもしくはｃＤＮＡと合成ＤＮＡの混合
されたものであってもよい。
【００３５】さらに重要な態様としてこの発明は、ＥＣ
−ＳＯＤを産生するセルラインがＥＣ−ＳＯＤを確実に
分泌させる条件下で培養するというＥＣ−ＳＯＤの製造
法に関するものである。そのセルラインは上記のいずれ
の資源由来のものであってもよい。ＥＣ−ＳＯＤを産生
する哺乳動物細胞は、ＥＣ−ＳＯＤに向いた抗体によっ
て免疫組織化学的に同定されたか、又は特定の細胞が培
養された培地中に分泌されたＥＣ−ＳＯＤを分析するこ
とによって同定される。細胞はそれ自体は既知の方法で
セルラインの増殖に適した通常の培地中で増殖される。
【００３６】上述のようにＥＣ−ＳＯＤは、細胞表面、
特に内皮細胞表面に見出されるヘパラン硫酸又は他のヘ
パリン様グルコースアミノグルカンに対する親和性を示
すヘパリンに対して親和性を示す。それ故、細胞表面か
らのＥＣ−ＳＯＤの遊離が引き起され、ヘパリン又はヘ
パリン同族体、例えば硫酸ヘパラン又は他の硫酸グルコ
ールアミノグリカン細胞表面からＥＣ−ＳＯＤの遊離を
起させるに充分な量の硫酸デキストラン、又は他の強く
負に荷電した化合物を含む培地中で、ＥＣ−ＳＯＤ産生
セルラインの組織細胞を培養することによってＥＣ−Ｓ
ＯＤの収量が確実に改良されると考えられる（実施例９
〜11参照）。
【００３７】他の重要な態様として、この発明はＥＣ−
ＳＯＤをコードするＤＮＡ配列からなるＤＮＡフラグメ
ントを、特定の宿主細胞で複製出来るベクター中に挿入
し、得られた組換え体ベクターを宿主細胞に導入し、そ
の細胞をＥＣ−ＳＯＤの発現のために適切な条件下、適
切な培地中又は上で増殖させ、ＥＣ−ＳＯＤを回収す
る、ＥＣ−ＳＯＤの製造法に関するものである。その細
胞の増殖に用いられる培地は、その目的に適切ないかな
る通常の培地であってもよい。しかしとくにＥＣ−ＳＯ
Ｄを多量に製造したい場合は、ＥＣ−ＳＯＤの合成のた
めには余分の銅及び／又は亜鉛を加える必要がある。適
切なベクターは上述のベクターのどれであってもよい。
そして適切な宿主細胞は上に掲げた細胞型のどれであっ
てもよい。ベクターを構築し、それを宿主細胞へ導入す
る方法は、組換え体ＤＮＡの分野でかような目的のため
に知られているどのような方法であってもよい。細胞に
よって発現されたＥＣ−ＳＯＤは分泌される。すなわち
細胞の型及びベクターの構成に依存して細胞膜を通過し
て放出される。もしＥＣ−ＳＯＤが組換え体宿主によっ
て細胞内に産生される、すなわち細胞によって分泌され
ないならば、それは機械的手段、例えば超音波破砕又は
ホモジナイゼーション、又は酵素的もしくは化学的手段
によって細胞を破砕し、次いで精製する通常の方法によ
って回収されることが出来る（回収法の例は実施例１，
４〜６及び17に示す）。
【００３８】分泌されるためには、ＥＣ−ＳＯＤをコー
ドするＤＮＡ配列の前にシグナルペプチドをコードする
配列をつなぐべきである。その配列の存在によって、細
胞からＥＣ−ＳＯＤが確実に分泌され、その結果、発現
されたＥＣ−ＳＯＤが少なくとも有意な割合で培地中に
分泌され回収される。分泌されたＥＣ−ＳＯＤの一部は
培地中に存在し、１部は細胞表面に存在することが実験
的にたしかめられている。それ故、“培地中に分泌され
る”という表現はその酵素が結局、培地中に出ようが、
細胞表面に止まろうが、細胞膜を通ってＥＣ−ＳＯＤが
輸送されることを意味しようとするものである（実施例
９〜11参照）。ＥＣ−ＳＯＤは、細胞を濾去し分泌蛋白
を単離することからなる、例えば実施例１，４〜６及び
17に示されるような標準法によって培地から回収され
る。細胞表面からＥＣ−ＳＯＤを確実に遊離させて収量
を改善するために、上に説明されたように培地にヘパリ
ン又は上述の同様な効果をもった物質の１つを添加する
ことが有利である。
【００３９】さらにこの発明はＥＣ−ＳＯＤの回収法に
関するものである。すなわちＥＣ−ＳＯＤの活性を含有
する生物物質の抽出物はＥＣ−ＳＯＤ又はそれの免疫決
定基に対する抗体を固定化したマトリックスに吸着させ
る方法である。そしてＥＣ−ＳＯＤ活性をそのマトリッ
クスから溶出し、ＥＣ−ＳＯＤ活性を含むフラクション
を集め、任意にさらに精製される。用いられた抗体はＥ
Ｃ−ＳＯＤに対して、又はその免疫決定基に対して生じ
た抗体であり、それ自体知られた方法で、適当なマトリ
ックス物質上に固定化される。
【００４０】その発明に従って、アフィニティクロマト
に用いられる抗体はポリクロナルであるかモノクロナル
抗体である。たいていのモノクロナル抗体はポリクロナ
ル抗体混合物より抗原に弱く結合し、それは弱い溶離剤
で緩和な条件で脱着が出来ることが見出されているの
で、現在好ましい抗体はモノクロナル抗体である。これ
によって、脱着に強い溶離剤が用いられる時より変性の
程度が低いので、ＥＣ−ＳＯＤの収量が改善されること
になる。
【００４１】又、すべてのＩｇＧはＥＣ−ＳＯＤの方に
向いているので、抗体鋳型のはるかに少ない量を、出発
物質として用いた生物物質からＥＣ−ＳＯＤを吸着する
のに用いねばならない。ＥＣ−ＳＯＤの脱着は、はるか
に少ない量の溶離剤を必要とするだけで、現在脱着に大
量の溶離剤を要し不便である溶出法が簡便になる。ＥＣ
−ＳＯＤに対するモノクロナール抗体の特異性は、ポリ
クロナール抗体より高そうである。抗体鋳型から溶出物
はそれ故１つ又はそれ以上の精製工程が省略出来るほど
純粋である。これは生産法を大きく単純化し、同量の出
発物質からＥＣ−ＳＯＤがはるかに高い収量で得られ、
それは重要な経済的有利な点である。
【００４２】ポリクロナール抗体は、ＥＣ−ＳＯＤ又は
その免疫決定基によって免疫されうる動物を免疫化しそ
の動物からそれ自体知られた方法で、免疫グロブリンの
ような抗血清を得ることによって得られる。その免疫化
は望ましくはＥＣ−ＳＯＤの安定化された水溶液によっ
て行われる。安定化剤はリン酸バッファー食塩水（ＰＢ
Ｓ）のような緩衝液であるか又はアジュバント（さらに
抗原性を増すために）である。そして適当なアジュバン
トはフロイント アジュバント又は水酸化アルミニウム
である。マウス、ウサギ、ニワトリ、ヤギおよび羊が免
疫化するのに好ましい動物である。動物の採血及び抗血
清の単離はよく知られた方法に従って行われる。その抗
体は、必要な純度のＥＣ−ＳＯＤを得るのに有利なよう
に実質的に純粋な形で提供するのが好ましい。
【００４３】この発明の方法で、モノクロナール抗体を
用いる場合、それは抗体製造のよく知られた方法である
ハイブリドーマ技術によって作られる。例えば、免疫さ
れる動物としてマウスを用いるハイブリドーマ技術にお
いて、マウスは問題の抗原によって免疫され、免疫され
たマウスからの脾細胞がメラノーマ細胞と融合される。
その後、その融合ハイブリドーマ細胞はクローン化さ
れ、抗体産生細胞は適当な培地中で培養され、そして抗
体は培養液から回収される。ハイブリドーマ技術によっ
て得られた抗体は特異性が大きいという利点をもってお
り、よって上述のように高い精製ポテンシャルを有す
る。組換え体ＤＮＡ技術を用いて、さらに可能な段階に
おいて、その抗体をコードするＤＮＡ配列がハイブリド
ーマ細胞クローンから適当なベクターへ移され、その混
成ベクターは適当な微生物宿主へ導入される。その宿主
は適当な培地中で増殖され、そして生じた抗体は培養液
から回収される。このようにして、抗体の改良された収
量が得られる。その宿主はエシエリシヤ・コリ（Escher
icia coli）又はバチルス・サブチリス（Bacillus subt
ilis）のように組換え体ＤＮＡ技術の分野で普通用いら
れるものの１つである。
【００４４】モノクロナール抗体を得る別の方法におい
て、そのハイブリドーマ細胞はマウスの腹腔に植え、増
殖される。そして生じた抗ＥＣ−ＳＯＤ抗体は、それ自
体知られた方法で産生する腹水から回収される。さらに
モノクロナール抗体を得るための免疫化は、例えばマウ
スからの免疫成分細胞を用いて生体外で行われる。この
場合には抗原を問題の動物、例えばマウス中に注射する
必要はないがこれは現在もっとも普通に用いられる方法
である。モノクロナール抗体及びそれを産生する方法は
この発明の１つの態様を形成するものであることは注目
されるべきである。
【００４５】ＥＣ−ＳＯＤ活性を含む抽出物が得られる
生物材料は、例えば哺乳動物組織である。ウシＣｕＺｎ
ＳＯＤはヒト内で比較的少ない免疫的活性を有し、アレ
ルギー反応は重大な問題でないことが知られているので
比較を目的としてウシ、ブタ又はウマの組織を用いるこ
とは可能である。これに基づいてそれ故、ウシ、ウマ又
はブタのＥＣ−ＳＯＤの場合も同じであろうと結論され
る。しかしながら、可能性ある望ましくない免疫反応を
さけるために、いぜんとしてヒト組織を用いるのが好ま
しい。比較的大量のＥＣ−ＳＯＤを含むのでこの目的に
現在好ましいヒト組織はヒト肺、膵臓、子宮、前立腺、
臍帯又は胎盤組織であり、よりたやすく入手できるの
で、特に後者２つの型の組織が用いられる。その抽出液
（エキス）はリン酸緩衝液のような適当な緩衝液中に常
法により調製される。抽出液からのＥＣ−ＳＯＤの収量
を改善するために、緩衝液に例えばＫＢｒ、硫酸アンモ
ニウム又はチオシアン酸カリウムのようなカオトロピッ
ク塩を加えると有利であることが分かった。
【００４６】しかしながらこれらの組織のどれもＥＣ−
ＳＯＤを大量には産生せず、治療目的に充分量のＥＣ−
ＳＯＤを産生するためには、非常に大量の組織が必要な
ので、ＥＣ−ＳＯＤを産生する、動物、好ましくは哺乳
動物、ヒトのセルラインからＥＣ−ＳＯＤを得ることが
好ましい。それ故ＥＣ−ＳＯＤ活性を含む生物材料は上
述のように、ＥＣ−ＳＯＤを産生するセルラインの増殖
から生じる物質であってもよい。特に大量のＥＣ−ＳＯ
Ｄを得るために、この発明の方法によって回収されるＥ
Ｃ−ＳＯＤは上述のように組換え体ＤＮＡ法によって有
利に生産される。
【００４７】たいていの場合に、特にＥＣ−ＳＯＤの精
製のために、固定化ポリクロナール抗体を用いる場合、
抗体マトリックスのプールされた溶出液は例えばイオン
交換マトリックスのようなマトリックスに吸着され、次
いでマトリックスからＥＣ−ＳＯＤ活性を溶出し、その
ＥＣ−ＳＯＤ活性を含むフラクションが集められる。集
められた溶出物のさらに精製は、ヘパリン又はヘパラン
硫酸のようなヘパリン類似体、又は他の硫酸グルコース
アミノグリカン、硫酸デキストラン又は他の強く陰性に
荷電した化合物から成るマトリックスのクロマトグラフ
ィーカラム上にアプライし、次いで溶出し、問題の物質
に親和性を示すフラクションを集める。
【００４８】さらに非常に重要な態様としてこの発明
は、スーパーオキシドラジカル及びこのラジカル由来の
他の毒性のある酸素中間体の存在又は形成に関連する疾
病もしくは障害の診断、予防もしくは治療のためのＥＣ
−ＳＯＤの用途に関するものである。そのような疾病又
は障害は、虚血に続いて再灌流をおこす、例えば心臓、
腎臓、脳又は腸の血栓症のような血栓症、関節リュウマ
チ、膵臓炎、特に急性膵臓病、腎盂腎炎及び他の型の腎
炎及び肝炎のような炎症性疾病、自己免疫疾患、インス
リン依存性真性糖尿病、散性脈管内凝固症、脂肪塞栓
症、成人の呼吸困難症、小児の呼吸困難症、新生児にお
ける脳出血、火傷、電離線の悪影響、及び腫瘍のような
ものである。
【００４９】したがってＥＣ−ＳＯＤは、実質的にＣｕ
ＺｎＳＯＤと同様の用途を示し、その治療活性は以下に
対論されるようにより完全に証明されている。しかしな
がらＥＣ−ＳＯＤは治療用途に特に有用な特徴を有して
いることが見出された。ＣｕＺｎ−ＳＯＤは腎臓におい
て腎臓糸球体濾過によって非常に急速に除去されるよう
な低分子量（33000）であり、その結果ヒトにおいてそ
の酵素は約20〜30分の半減期を有する。ＥＣ−ＳＯＤを
用いた初期の実験では驚くべきことには、著しく長いＥ
Ｃ−ＳＯＤの半減期が確認された（ウサギにおいて）。
実施例１０参照。現在これは、一部はＥＣ−ＳＯＤが高
分子量135,000なので腎臓糸球体濾過による除去が妨害
されること、そして一部はＥＣ−ＳＯＤが以下に示すよ
うに内皮細胞表面に結合するように思われる事実に帰起
因すると信じられる。この発明によるＥＣ−ＳＯＤの治
療用途においてそれ故その酵素はヒトにおいて少なくと
も４時間、おそらくそれ以上長い半減期を有しているこ
とが好ましい。
【００５０】上に説明したようにＥＣ−ＳＯＤは自然環
境下では分泌蛋白であり、それ故、それは細胞外空間
（細胞外液体中又は細胞表面で）で機能するために特に
合成されるようであり、その機能はスーパーオキシドラ
ジカル又は他の酵素ラジカルの毒性に対し、血漿成分又
は細胞の外表面を保護するのに特によく適合した性質を
示す。この示唆はＥＣ−ＳＯＤが細胞の外表面に結合す
る傾向をもたらすわずかに疎水性をもっていること、及
び細胞の外表面上に見出されるヘパラン硫酸に対する親
和性を示すヘパリンに対する親和性を示す事実によって
支持される。そしてその両者の性質は組織を保護する特
に良い能力を示しているように思われる（実施例９，10
および11を参照せよ。これらの実施例では試験結果がＥ
Ｃ−ＳＯＤの血管内皮に対する結合を説明するように思
われる）。
【００５１】細胞膜とＥＣ−ＳＯＤの見掛けの会合の重
要性はさらに次のような事実により支持される。すなわ
ち、細胞膜に結合するためポリリシンによって変形され
たＣｕ・Ｚｎ・ＳＯＤは、活性化された（スーパーオキ
シドラジカルを産生する）多核白血球（ＰＭＮ）が自己
不活性化（細胞死）するのを、負に帯電しそのため細胞
膜によって忌避される傾向がある普通のＣｕ・Ｚｎ・Ｓ
ＯＤよりもよく保護することができる。（M. Salin及び
J. M. McCord“Free radicals in leukocyte metabolis
m and inflammation”in Superoxide and Superoxide D
ismutases, A.M. Michelson, J. M. McCord, およびI.
Fridonch編，Academic Press, 1977年，pp257−270）。
ノカルディア・アステロイデス（Nocardia asteroide
s）が膜に会合したＳＯＤを有し、ノカルディア細胞を
このＳＯＤに対する抗体で処理した時、ノカルディアの
ＰＭＮに対する感受性が著しく増大するので、前記膜に
会合したＳＯＤは活性化されたヒトＰＭＮを有効に保護
するようであるという事実（B. L. BeamanらInfection
and Immunity 47, 1985年，pp135−141）は、細胞表面
に結合したＳＯＤの細胞膜保護機能を示すものである。
ＥＣ−ＳＯＤとは異なって、Ｃｕ・Ｚｎ・ＳＯＤは、そ
れを細胞外での利用に余り適さないようにする細胞内機
能、すなわちスーパーオキシドラジカルが細胞外に存在
することによって引きおこされる細胞内機能を有する。
さらにその半減期は上述のＥＣ−ＳＯＤと比較して短い
ので、ＥＣ−ＳＯＤの場合よりも短い間隔で大量投与す
る必要があるように思われる。
【００５２】可能な治療適用のためのＳＯＤ活性は次の
ような疾病や障害に証明されている。非経口的に投与さ
れたＣｕ・Ｚｎ・ＳＯＤは、一連の動物モデルの炎症及
び動物における炎症病において抗炎症効果を示すことが
示されている（HuberとSaifer、Superoxide and Supero
xide Dismutases、Michelsonら編 Academic Press（197
7年，pp517−549）。ヒトにおいてはＣｕ・Ｚｎ・ＳＯ
Ｄの有効性は、リウマチ性関節炎及び関節症、膀胱の炎
症及び他の泌尿器病（Menander-Huber, “Biological a
nd Clinical Aspects of Superoxide and Superoxide D
ismutase”, Bannisterら編 Elsevier/North Holland 1
980年，pp408−123）およびイオン照射による治療の逆
効果（EdsmyrらCurrent Therapy Res. 10, 1976年 pp19
8−211 ;CiridalliらActa. Radiol Oncol. 24, 1985
年，pp273−277（ラットについて））が報告されてい
る。ある国ではウシＣｕ・Ｚｎ・ＳＯＤが医薬（Orgote
in, Peroxinorm）として登録され、主としてリューマチ
性関節炎や関節病の治療に用いられその組成物が関節内
投与される（GoebelとStorck, Am. J. Med. 74, 1983,p
p124−128）。
【００５３】非経口的に投与されたＣｕ・Ｚｎ・ＳＯＤ
は細胞に吸収されないので細胞外空間にその活性を及ぼ
すにちがいない。リポソーム中に包まれたＣｕ・Ｚｎ・
ＳＯは細胞に吸収されクローン病、ベーチェート病、疱
疹状皮膚炎、潰瘍性大腸炎、川崎病及び照射治療の逆の
効果に対して有効であることが報告されている（Y. Niw
aらFree. Red. Res. Comms. 1, 1985年，pp137−15
3）。Ｃｕ・Ｚｎ・ＳＯＤの抗炎症作用の機構は全く明
らかでない。活性化された白血球によって形成される酸
素ラジカルに対する直接保護が示唆されている（Halliw
ell, Cell Biol. Int. Rep. 6, 1982年，pp529−54
1）。他の可能性は、スーパーオキシドによって誘発さ
れる強い化学走性物質の形成を阻害することである（Pe
troneらProc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 1980年，pp11
59−1163）。
【００５４】ＳＯＤの他の大きな応用分野は、虚血に続
いて再灌流によって起こる組織損傷に対する保護因子と
しての分野である。組織へ血液の供給が絶たれた場合組
織はゆっくり壊死状態になる。肉眼的にも顕微鏡的にも
その損傷は数時間にわたってゆっくり典型的に展がる。
その組織が例えば１時間後に再灌流されると、改善の代
わりに織損傷が強く促進される。このいわゆる再灌流パ
ラドックスに対しておそらくいくつかの理由があるが、
すでに虚血した組織中に酸素が再発生した結果形成され
る酸素ラジカルがその損傷に寄与するようである。その
ラジカルは極端に短命でそれ故直接研究することは困難
なのでその形成や効果は種々のスカンベンジャーの保護
作用から推論される。組織保護（保護物質による）はそ
れぞれ次のように論証されている。腎臓における虚血も
しくは酸素欠乏再灌流モデル、（ＳＯＤ〔GL. BakerらA
m. Surg 202, 1985年，pp628−641 ; I. KoyamaらTrans
plantation 40, 1985年，pp590−595〕；ＳＯＤ，カタ
ラーゼ〔E. HanssonらClin.Sci. 65, 1983年，pp605−6
10〕及びアロプリノール〔GL. Bakerら前出，I. Koyama
ら前出）〕；腸（ＳＯＤ〔D. A. ParksらGastro entero
logy 82, 1982年，pp9−15；MH. SchoenbergらActa Chi
m Scand. 150, 1984年，pp301−309 ; M. C.Dalsingら
J. Surg. Res. 34, 1983年，pp589−596〕及びアロプリ
ノール〔D. A. Parksら前出〕）；膵臓（ＳＯＤ，ＳＯ
Ｄ＋カタラーゼ，カタラーゼとアロプリノール〔H. San
feyらAnn. Surg. 200, 1983年，pp405−413〕）；肝臓
（ＳＯＤ及びカタラーゼ〔S. L. AtallaらTransplantat
ion 40, 1985年，pp584−589〕；肺（ＳＯＤ＋カタラー
ゼ〔R. S. Stuantら、Transplant. Proc. 17, 1985年，
pp1454−1456〕）；骨格筋（ＳＯＤ，カタラーゼ及びア
ロプリノール〔R. V. Korthuis, Circ. Res. 57, 1985
年，pp599−609〕）；皮フ（ＳＯＤ及びアロプリノール
〔M. J. ImらAnn. Surg. 201, 1985年，pp357−359〕）
並びに脳（ＳＯＤ及びアロプリノール（〔J. S. Beckma
nnら、Superoxide and Superoxide Dismutase in Chemi
stry, Biology and Medicine, G. Rotilio編，Elsevier
1986年，pp602−607〕）。
【００５５】心臓機能の保存は、次の各動物から単離さ
れた灌流製剤で報告されている。すなわちウサギ（カタ
ラーゼ，アロプリノール；ＳＯＤは効果がなかった〔C.
L.MyersらJ. Thorac. Cardiovasc. Surg. 91, 1986
年，pp281−289〕），ネコ（ＳＯＤ＋カタラーゼ〔M. S
chlaferら、Circulation 66, Suppl. 1, 1982年，pp185
−192〕）及びラット（グルタチオン，カタラーゼ，Ｓ
ＯＤ，GoudelらJ. Mol. Cell. Cardiol. 16, 1984年，p
p459−470〕）由来のものがある。生体内での部分的な
虚血・再灌流モデルにおいて梗塞の大きさの減少は犬に
ついて報告されている（ＳＯＤ〔T. J. GardnerらSurge
ry 94, 1983年，pp423−427 ; D. E ChambersらJ. Mol.
Cell Cardiol, 17, 1985年，pp145−152 ; S. W. Wern
sらCric. Res. 56, 1985年，pp895−898〕）及びアロプ
リノール〔D. E Chambers前出；T. J.Gardenerら前
出〕、カタラーゼは効果がなかった〔S. E. Wernsら前
出〕、ＳＯＤ＋カタラーゼの注射も犬における短い（15
分間の）部分虚血の後、機械的心臓機能を保護すると報
告されている（M. L. MyersらCirculation 72, 1985
年，pp915−921 ; K. PrzyklenkとR. A. Kloner Circ.
Res. 58, 1986年，pp148−156）。さらにＳＯＤは虚血
及び再灌流で誘発される不整脈の頻度を減少させると報
告されている（B. WoodwardらJ. Mol. Cell. Cariol. 1
7, 1985, pp485〜493 ; M.Bernierら、Circ. Res. 58,
1986年，pp331〜340）。この状態における酸素ラジカル
の源は完全には明らかでないがアロプリノールの効果は
それはキサンチンデヒドロゲナーゼ型（Parksら前出）
からラジカル産出オキシダーゼ型へ虚血によって変換さ
れるキサンチンオキシダーゼによって部分的に生じるこ
とを示しているように思われる。キサンチンオキシダー
ゼの基質であるヒポキサンチンの大量が虚血によって引
き起こされるプリン塩基分解によって形成される。スー
パーオキシドラジカルの他の源は、虚血損傷組織に引付
けられた活性化された白血球、プロスタグランジン合成
（Ｏ2 ・-は１つの副産物、Kontos, Circ. Res. 57, 1985
年，pp508−516）及び虚血の間に還元された形で蓄積さ
れた種々の化合物の自動酸化である。虚血と次いで起こ
る再灌流に関する知見は非常に重要な臨床応用を有す
る。ＳＯＤ及び／又は酸素ラジカルに対する他の保護因
子及び血栓崩壊因子の例えば組織プラスミノーゲンアク
チベーターを付随的に投与することによって、心臓梗塞
と関連する再灌流によるすぐれた効果を得ることができ
る。そのＳＯＤ実験の結果は心臓手術や心臓移植と関連
する応用が可能であることも示している。同様に、腎臓
虚血と続いて起こる再灌流に関してＳＯＤを用いた結
果、腎移植や皮フ，肺，肝臓又は膵臓移植のような他の
器官移植に関して用いることができる。虚血性脳疾患は
他の可能な適応症である。
【００５６】ＳＯＤは他の病変状態に関して興味ある防
御効果を示す。よって、膵臓炎は３つの異なる方法で犬
の膵臓に起こさせた。すなわちオレイン酸の注入、排出
管の部分的閉塞、及び虚血と次いで起こる再灌流であ
る。ＳＯＤ、カタラーゼ及びＳＯＤ＋カタラーゼはその
防御効果を有することが見出され、その併用治療は一般
的に最も効果的である。しかしながら虚血モデルにおい
ては、ＳＯＤ単独でもＳＯＤ＋カタラーゼの併用とほと
んど同等に有効であった（SanfeyらAnn. Surg. 200, 19
84年，pp405−413）。ＳＯＤ＋カタラーゼはラット中の
セルレインによって引き起こされる膵臓炎を回復させる
と報告されている（K. S. GuiceらAm. J. of Surg. 15
1, 1986年，pp163−169）。その結果は何ら特別の治療
法が現在存在しないこの疾患に対する効果的な治療法の
可能性を示す。
【００５７】またＳＯＤによる治療は火傷に対して効果
的であると示唆された。ラットにいて実験的な軽い火傷
後の局部浮腫はＳＯＤの注射によって幾分軽減された
（BjorkとArtursson. Burns 9, 1983年，pp249−25
6）。マウスのひどい火傷損傷を伴う動物モデルにおい
てＳＯＤによって劇的な防御効果が得られたがこの場合
生き残りや局所の損傷が関連する（SaezらCirculatory
Shock 12, 1984年，pp220−239）。
【００５８】例えば火傷、免疫複合体形成や主な組織損
傷の場合に中性好性白血球が肺に蓄積される。補体活性
化（Ｃ５ａ）はしばしばその蓄積を仲介するように思わ
れる。その白血球は活性化され酸素ラジカルを遊離させ
るように思われる。それによって例えば血管浸透性の増
大や肺浮腫（成人性呼吸困難症）に特徴づけられる肺損
傷が引き起される。いくらかの動物モデルにおいてＳＯ
Ｄ及び他の酸素ラジカルスカベンジャーは肺損傷に対し
て防御効果を有していることが示された（TillとWard,
Agents and Actions Suppl. 12, 1983 年，pp383−39
6）。
【００５９】非経口的に投与されたＣｕＺｎＳＯＤは幼
児の呼吸困難症にかかっている未熟新生児における肺臓
気管形成障害を防御すると報告されている（W. Rosenfe
ldらJ. Pediatr 105, 1984年, pp781−785）。ビーグル
子犬モデルにおいて、ＳＯＤの注射は高血圧に続く脳内
出血の頻度を減少すると報告されている（L. R. Ment
ら、J. Neuasourg, 62, 1985年, J. 63−J. 69）。
【００６０】ＳＯＤはコリネバクテリウム・パルバム
（Corynebacterium parvum）の注射で起こるラットにお
ける肝炎を軽減させる（M. J. P ArthurらCastroentero
logy,89, 1985年, pp1114−1122）。内皮由来の血管弛
緩因子はスーパーオキシドに非常に敏感である。そして
ＳＯＤの投与によってその作用が増大される（R. J. Gr
yglewskiら、Nature, 320, 1986年, pp454−456 ; G.
M. Rubanyiら、Am. J. Physiol 250, 1986, ppH882−H8
27）。スーパーオキシドラジカル産生は体内の多くの環
境下で起こり血管収縮を起こし組織灌流を減少させる。
ＳＯＤの投与はそのような血管収縮をやわらげることが
できると信じられる。
【００６１】急性のひどい血圧上昇は脳細動脈の機能的
及び形態的な異常をもたらす。プロスタグランジン合成
阻害剤及びＯＳＤはその異常に対して防御すると考えら
れる。スーパーオキシド遊離は検出することができる
（H. A. Kontos, Circ. Res. 57, 1985年, pp508−51
6）。そのモデルの精密な解析によって、スーパーオキ
シドラジカルはプロスタグランジン合成の間に副産物と
して形成されるとの結論になった。その結果はプロスタ
グランジン合成の間に遊離されるスーパーオキシドラジ
カルによって起こされる組織損傷は他の病的状態におい
て起こるかも知れないし、ＳＯＤは防御作用を示すかも
知れないことを示唆している。
【００６２】媒体中のＣｕＺｎ−ＳＯＤ＋カタラーゼは
灌流され単離されたウサギの角膜の生存を延長すると報
告されている（O. N. Lux ら、Curr. Eye. Res. 4, 198
5 年, pp153-154 ）。ＣｕＺｎ−ＳＯＤ＋カタラーゼは
その単離された小さいものを光過酸化反応に対して防御
する（S. D. Verma ら、Ophthalmic Res. 14, 1982年,
pp167-175)。その結果は角膜移植や他の眼の手術法にお
いてＳＯＤの有益な効果を示唆している。
【００６３】非経口ＳＯＤの期待される作用は広がった
血管内凝固（T. Yoshikawaら，Thromb. Haemostas, 50,
1983 年、pp869-872 及び敗血症（H. F. Welterら Chi
rurgishes Forum '85 f. experim. u. Klinisher Forsc
hung, Springer-Verlag, Berlin, 1985）のような急性
疾患の動物モデルにおいて報告されている。全身性狼瘡
紅斑（ＳＬＥ）、全身性硬化症やリュウマチ性関節炎の
ような自己免疫疾患の種々の型において、白血球中の染
色体破壊の頻度の増加が証明されている（Emerit, “Pr
operties and action mechanisms of clastogenic fact
ors”in Lymphokines, Vol 8, E. Pick編, Academic Pr
ess, 1983年, pp413−424）。また繊維芽細胞培養物や
直接骨髄製剤は時々破損の増加をしめす。かような患者
からの血漿は染色体を破壊する染色体異常誘発性因子を
含む。いくらかの例において同様な因子は滑液及び脳脊
髄液（広がった硬化症）中にも証明されている。自己免
疫疾患をもった患者からの白血球と一緒に培養された正
常白血球中には破壊が起こる。患者からの白血球は、培
養液を染色体破壊が生じるような状態にする。ＳＬＥ血
漿の染色体異常誘発活性はＵＶ照射によって増加させる
ことができる。キサンチンオキシダーゼ及びキサンチン
による血漿中のスーパーオキシドの産生は染色体異常誘
発活性を形成させる。すべての上述のモデルにおいて培
地へのＣｕＺｎＳＯＤの添加によって、染色体異常誘発
活性に対して保護された（Emerit, 前同）。これはスー
パーオキシドラジカルが染色体異常誘発因子の形成と作
用両方に関与していることを示す（Emerit, 前同）。
【００６４】ＳＬＥの動物モデルの、染色体異常誘発因
子をもったニュージーランド黒マウスにおいて、ＳＯＤ
の反復注射によって生体内の骨髄細胞において染色体が
保護される（EmeritらCytogenet. Cell Genet. 30, 198
2年, pp65−69）。しかしながらヒトの自己免疫疾患に
おける主な微候に染色体異常誘発因子がどの程度寄与し
ているか、そしてＳＯＤの投与がいくらかの治療効果を
もっているかどうかはまだ明らかでない。
【００６５】細胞の悪性形質転換は普通２相すなわちイ
ニシエーションとそれに続くプロモーションに分けられ
る。イニシエーションがイオン照射、ブレオマイシン、
ミソニダゾール及び他のニトロイミダゾール類によって
起こされる生体外モデルにおいて、癌形質転換は培地中
にＳＯＤが存在することによって効果的に阻害される。
ＳＯＤはイニシエーション物質にさらされる間に存在す
る必要がなく、その物質は次のプロモーション段階を阻
害することを示しているように思われる（Millerら In
t. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 8, 1982年, pp771
−775 ; BorekとTroll, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 8
0,1983年, pp1304−1307）。キサンチンやキサンチンオ
キシダーゼの非毒性投与量は増殖細胞にプロモーション
をおこす。ＳＯＤまたはＳＯＤ＋カタラーゼの添加はこ
の効果を阻害する（Zimmermann及びCerutti, Proc. Na
t. Acad. Sci. USA 1, 1984, pp2085−2087）。フォル
ボールエステルは知られたプロモーターである。ベンズ
アントラセンによるイニシエーション次いでフォルボー
ルエステル（ＴＰＡ）の適用によって皮膚癌が起こされ
たモデルにおいて、ＳＯＤ活性をもった親油性の銅複合
体によって局所処置すると腫瘍形成を強く減少させた
（Kenzlerら Science 221, 1983年, pp75−77）。その
結果は少なくともある場合にはスーパーオキシドラジカ
ルは腫瘍形成のプロモーションに寄与し、ＳＯＤはこの
効果に対し防御することを示している。
【００６６】酸素ラジカルは、ブレオマイシン、アドリ
アマイシン、アロキサン、６−ヒドロド−パミン、パラ
コート、ジヒドロキシフマリン酸、ニトロフラントイン
及びストレプトゾトシンのような多数の毒物物質の損傷
効果に寄与していると信じられている理由がある。ラジ
カルの形成が細胞外空間で起こるそれらの場合には、注
射された防御酵素によって保護することは可能であろ
う。よってＳＯＤは、アロキサン（膵臓におけるβ細胞
を損傷する）の催糖尿病活性に対して生体外（Grankvis
tら Biochem. J. 182, 1979年, pp17-25 ）及び生体内
で（Grankvist らNature 294, 1981年、pp158−160）防
御することができる。アロキサンの損傷効果はそれ故ス
ーパーオキシドラジカル又はそれから派生される他の酸
素ラジカルによって仲介されるように思われる。β−細
胞のアロキサンに対する大きな感受性の理由は明らかで
はない。そしてアロキサン感受性とインスリン依存性真
性糖尿病の発生との間にいくらかの結びつきがあるかど
うか推測されている。真性糖尿病において酸素ラジカル
を形成する可能性のある炎症細胞によるランゲルハンス
島内への浸潤がある。それ故真性糖尿病の最初の発病時
にＳＯＤの注射によってβ−細胞を保護することが考え
られる。
【００６７】増殖培地に加えられたＳＯＤは石綿に対し
て気管細胞を保護することが報告されている（Massman
とLandesman Chest 835, 1983年, pp50s−51s）。非経
口ＣｕＺｎＳＯＤは実験的に誘発された腎盂腎炎に対し
腎臓を保護することが述べられている（RobertsらJ. Ur
ol. 128, 1982, pp1394−1400）。ＳＯＤと特にカタラ
ーゼは抗糸球体基礎膜抗体によってラットに誘発される
急性腎毒性の腎炎を防御する（A. Rehanら、Lab. Inves
t 51, 1984年, pp396−403）。
【００６８】一般的にＣｕＺｎＳＯＤは上述の実験にお
いて試験物質として用いられてきた。しかしながらＥＣ
−ＳＯＤは、同じ目的のために、そして上に閉めれたよ
うにＥＣ−ＳＯＤを細胞外で適用することを特に魅力的
にさせる特別な性質によって大きな有効性をもって用い
ることが考えられる。さらにこの発明はＥＣ−ＳＯＤと
医薬剤的に受容なく賦形剤、希釈剤、もしくは担体とか
らなる医薬組成物に関するものである。その組成物の中
に加えられるＥＣ−ＳＯＤは上に討論された起源、すな
わち組換え体、セルライン又は組織起源のいずれからで
あってもよい。
【００６９】適当なすなわち治療的に活性な全身治療用
の投与量の見積もりは人体中のＥＣ−ＳＯＤの含量に基
づいてなされる。ＥＣ−ＳＯＤはヒト血漿中の主たるＳ
ＯＤでありその全活性（Ａ，ＢおよびＣフラクションか
らなる、実施例２参照）は約20 U／mlである。200IU／k
g体重のヘパリン注射はＥＣ−ＳＯＤフラクションＣを
約23 U／ml増加させる（実施例９参照）。このヘパリン
投与量は非常に高いけれども最大遊離は明らかに達成さ
れなかった（実施例９参照）。ＥＣ−ＳＯＤフクラクシ
ョンＣがおよそ２倍血管内皮から遊離されると仮定する
と血管内の全ＥＣ−ＳＯＤ含量は約66 U／ml血漿（20＋
２×23U／ml）に相当する。全血漿容量は、体重の約4.7
％であり、70kgのヒトの約3.3ｌに対応する。１単位Ｅ
Ｃ−ＳＯＤは約8.8ngに等しい。血管内（血漿及び血管
内皮）のＥＣ−ＳＯＤの全量はそれ故3300×66×8.8×1
0-9ｇ＝1.92mgである。10倍増加させるには、19mg、300
倍増加には575mgのＥＣ−ＳＯＤ Ｃを必要とする。そ
れ故ＥＣ−ＳＯＤの適当な投与量は、ＥＣ−ＳＯＤの投
与が示される条件のタイプやきびしさに依存するが約15
〜600mg／日の範囲にあってもよい。例えば87mgのＥＣ
−ＳＯＤ Ｃの注射（50倍増加）は血漿中に26μｇ／ml
を生じる（内皮結合を無視して）。これもしくはより低
い濃度においてさえ生体外実験（ＣｕＺｎＳＯＤを用い
た）において強い防御性を示す（A. Baret, I. Emerit,
Mutation Res. 121, 1983年, PP293−297 ; K. Grankv
ist, S. Marklund, J. O. Sehlin, I. B. Taljedal, Bi
ochem. J. 182, 1979, pp17−25参照）。
【００７０】ＥＣ−ＳＯＤ注射の投与量及びタイミング
はヒト血管内におけるその酵素の半減期に依存するがそ
の半減期は知られていない。ウサギにおいてはヒトＥＣ
−ＳＯＤは約18時間の半減期を示す（実施例10参照）。
ヒトにおける半減期はおそらくより長いだろう。一次反
応で半減期が36時間であると仮定すると、初回87mg注射
後毎日35mg注射すれば初回投与後と同じ濃度となるであ
ろう。実施例９はＥＣ−ＳＯＤ Ｃはヘパリンによって
細胞表面から血漿へ移動させることができることを示
す。非経口のヘパリン、他の硫酸グルコースアミノグリ
カン類及び他の強く負に帯電した物質は内因性又は注射
されたＥＣ−ＳＯＤ Ｃの位置を調節するのに用いられ
る（実施例９−11参照）。血漿層への局在化はある病的
状態においては有用であろう。
【００７１】ＥＣ−ＳＯＤは３つのフラクションからな
り、Ａはヘパリン親和性がなく、Ｂは弱く、Ｃは強い親
和性をもっている。その異なる親和性に対する理由はま
だ知られていないけれどそれらのフラクションはたいて
いの点で非常に類似している。ＰＡＧＥ−ＳＤＳゲル電
気泳動は何ら差を示さないしアミノ酸組成は同一のよう
であり（S. Marklund, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7
9, 1982年, pp7634−7636）、Ａ及びＣに対して生じた
抗体は３つの分画すべてに等しく反応するようである
（S. Marklund, Biochem. J. 220, 1984, pp269−27
2）。それらのフラクションは同一の遺伝子によって産
生され翻訳後に変形される。３つのフラクションはすべ
て新鮮血漿中に存在し（実施例９参照）、そのフラクシ
ョンの薬効力は上に討論された。またＣは組換え体ＤＮ
Ａ技術（実施例13参照）によって産生されたフラクショ
ンである。しかしながらＥＣ−ＳＯＤ ＡおよびＢフラ
クションもまた、溶液中の高いＳＯＤ活性が重要である
病態においては治療上有用であると考えられる。
【００７２】局所治療のために上に示されたよりはるか
に少ないＥＣ−ＳＯＤがおそらく必要だろう。現在関節
炎の治療のため４〜８mgのＣｕＺｎ−ＳＯＤが週１回関
節内に投与される。はるかに高い分子量をもったＥＣ−
ＳＯＤは長い時間関節に保持されるようである。同様な
治療プロトコール又はおそらくいくらか低い投与量が適
当であろう。
【００７３】使用前、ＥＣ−ＳＯＤ含有組成物は、乾燥
状態、例えば凍結乾燥された形で貯蔵するのが好まし
い。全身治療及び局所注射のためには、ＥＣ−ＳＯＤを
非経口投与用、例えば等張食塩水のような適当な非毒性
で生理的に受け入れられる溶媒に溶解して製剤するのが
適切である。局所塗布用のためには、その医薬組成物は
例えばＥＣ−ＳＯＤを含む軟膏、ローション、スプレ
ー、クリーム又はエアゾールの形であってもよい。
【００７４】この発明の医薬組成物においてＥＣ−ＳＯ
Ｄは次のようなしかたで過酸化水素を不均化するカタラ
ーゼと有利に組合わせることが考えられる。
【００７５】
【化５】
【００７６】ＥＣ−ＳＯＤとカタラーゼの組合わせた作
用は、上述のように最も毒性が高い酸素ラジカルと考え
られるヒドロキシラジカルの形成を一層減少させる。カ
タラーゼの代わりに、酸素還元産物の毒性効果を減じる
ためにＥＣ−ＳＯＤと協同作用する他の抗酸化剤が用い
ることができる。ＥＣ−ＳＯＤとアロプリノール（キサ
ンチンオキシダーゼを阻害する）、ヒドロキシラジカル
のスカベンジャー（例えばマンニトール又はスルフヒド
リル基を含む化合物）及び遷移金属イオンのキレート剤
（例えばデスフェリオキサミン）のような他の物質との
併用が有利であると考えられる。
【００７７】さらに、血漿中にＥＣ−ＳＯＤの存在が示
されている場合の適用に関しては、治療患者中の細胞表
面に存在するＥＣ−ＳＯＤを移動させて血漿中にＥＣ−
ＳＯＤの余分の投与量を与えるために、ヘパリン又はヘ
パリン同族体例えばヘパラン硫酸又は他の硫酸グルコー
スアミノグリカン、硫酸デキストラン又は他の強く負に
帯電した化合物をその組成物に導入することは有利であ
る。この発明は、治療の必要な患者に治療的に又は予防
的に有効量のＥＣ−ＳＯＤを投与することからなる、ス
ーパーオキシドラジカルの存在又は形成に関連する疾患
や病気の予防又は治療法に関する。その疾患又は病気は
上に討論されたもののどれか１つであってもよい。この
発明は、手術前、手術中又は手術後に治療的又は予防的
に有効量のＥＣ−ＳＯＤを投与することからなる、腎
臓、肺、膵臓、心臓、肝臓又は皮膚のような器官の移植
と関連して又は心臓手術と関連して虚血に続く再灌流に
よって起こる損傷を予防又は治療する方法に関する。ど
ちらかの方法において治療的又は予防的に活性の投与量
は治療の型や条件のきびしさに依存するが約15〜600mg
／日のＥＣ−ＳＯＤを含有する。この方法において上述
のようにヘパリン又は他の強く負に帯電した化合物及び
／もしくは上にまた討論されたような同様の効果をもっ
たカタラーゼ又は抗酸化剤を併用投与することは有利で
ある。 図面の説明 この発明はさらに次のような図を参照して述べられる。
【００７８】第１図はＥＣ−ＳＯＤ含有物質の抗ＥＣ−
ＳＯＤ−セファロースに対する免疫吸着後の蛋白とＥＣ
−ＳＯＤの溶出パターンを示すグラフである（実施例４
参照）。第２図はＥＣ−ＳＯＤのＤＥＡＥ−セファセル
からの溶出パターンを示すグラフである（実施例５参
照）。
【００７９】第３図はＥＣ−ＳＯＤのヘパリン−セファ
ロースからの溶出パターンを示すグラフである（実施例
６参照）。第４図は約20000個のλｇｔ11のプラークが
移されたニトロセルロースフィルターの１つの４８塩基
のプローブによるハイブリダイゼーションパターンを示
すオートラジオグラムである。オートラジオグラム上の
黒いスポットはヒトＥＣ−ＳＯＤ ｃＤＮＡを含むプラ
ークを表す（実施例８参照）。
【００８０】第５図及び第６図はＥＣ−ＳＯＤのＤＮＡ
配列及びそれから引き出されたアミノ酸配列を示す（実
施例８参照）。第７図はプラスミドpPS3の構造を示す。
白い領域はSV40 DNAを示し、数字はSV40中での対応する
塩基位置を示す。SV40PE及びSV40起点はそれぞれSV40初
期プロモーター及びSV40の複製起点を表す。そして矢印
はそれぞれ転写及びＤＮＡ複製の方向を示す。SV40ポリ
アデニル化シグナルは2770〜2533位の間に位置する。斜
線の引いた領域はヒトＥＣ−ＳＯＤ ｃＤＮＡを表す。
黒くぬりつぶした領域はプラスミドpBR322のβ−ラクタ
マーゼ遺伝子（ＡｐR）を表す。細線はプラスミドpBR32
2ＤＮＡを示す。またpBR322の複製起点の位置も示され
ている。
【００８１】第８図は血漿ＥＣ−ＳＯＤに対するヘパリ
ン静脈注射の効果を示す。200IU／kg体重のヘパリンが
２人の健康男子に時間ゼロに注射前と注射後指定された
時間に血漿が集められた。ＥＣ−ＳＯＤ活性は実施例９
に述べられたように測定された。第９図は静脈注射ヘパ
リンのＥＣ−ＳＯＤ遊離活性の投与量応答を示す。ヘパ
リンは２人の健康男子に指定の投与量を静脈注射されヘ
パリン注射前及び注射後10分と15分に採血した。15分後
に追加のヘパリンを200IU／kg体重まで注射されその後1
0分で採血した。血漿中のＥＣ−ＳＯＤを実施例９で述
べたのと同様にして測定した。プレヘパリンＥＣ−ＳＯ
Ｄ活性と第２のヘパリン注射後の活性との間の差を100
％遊離とした。プレヘパリン活性と最初の投与後の10ケ
の数分間のサンプルの平均活性との間の差は100％遊離
に関して示してある。その別々の実験は少なくとも４日
の間隔で行なった（実施例９参照）。
【００８２】第１０図はヘパリンセファロース上での血
漿の分離を示す。ヒト血漿はヘパリン静脈注射（200IU
／kg体重）前（○）、10分後（△）に集められ、実施例
９に述べられたようにしてヘパリンセファロース上で分
離した。（●）はＥＣ−ＳＯＤを除くために抗ＥＣ−Ｓ
ＯＤセファロースによる前処理後のプレヘパリン血漿サ
ンプルのクロマトグラフィーの結果を示す。実線は280n
mにおける吸光度を、点線はＮａＣｌグラジエントを示
す。ＥＣ−ＳＯＤフラクションＡ，ＢおよびＣは図に示
されたようにプールとして測定した。すべての活性は抗
ＥＣ−ＳＯＤセファロースに吸着されたのでプールＢと
Ｃの活性はＥＣ−ＳＯＤのみを示す。プールＡはまたＣ
ｕＺｎＳＯＤとシアニド耐性ＳＯＤ活性を含む。フラク
ションＡにおけるＥＣ−ＳＯＤ活性はそれ故実施例９に
おいて血漿に関して述べられたようにして固定化された
抗体によって測定された。ＥＣ−ＳＯＤフラクション
Ａ，ＢおよびＣはプレヘパリン血漿中で5.2, 4.4および
5.1 U／mlでありポストヘパリン血漿中で7.7, 5.7およ
び29.4 U／mlであった。クロマトグラムにおけるＥＣ−
ＳＯＤ活性の回収率はそれぞれ84％と83％であった。プ
レヘパリン血漿クロマトグラムにおけるプールＡの大き
い方の全ＳＯＤ活性はＣｕＺｎＳＯＤの赤血球からの遊
離によってサンプル中への溶血反応によるものであるこ
とに留意のこと（実施例９参照）。
【００８３】第1１図及び第1２図は125Ｉ−ラベルヒト
ＥＣ−ＳＯＤのウサギへの注射の効果及びヘパリン注射
の効果を示すグラフである（実施例10参照）。第1３図
はモノクロナル抗ＥＣ−ＳＯＤセファロースからの組換
え体ＥＣ−ＳＯＤの溶出パターンを示すグラフである
（実施例17参照）。第1４図は組換え体ＥＣ−ＳＯＤの
ＤＥＡＥ−セファセルからの溶出パターンを示すグラフ
である（実施例17参照）。
【００８４】第1５図は組換え体ＥＣ−ＳＯＤのヘパリ
ン−セファロースからの溶出パターンを示すグラフであ
る（実施例17参照）。第1６図は天然及び組換え体ＥＣ
−ＳＯＤのドデシル硫酸ナトリウム存在下での勾配ポリ
アクリルアミドゲル上の電気泳動を示す（実施例19参
照）。
【００８５】実施例１ ヒトの臍帯を、ウメア大学の病院の産科病院の産科病棟
で収集した。これを病棟の冷蔵庫に保管し、実験室で−
80℃に急速・冷凍し次いで使用するまで−30℃で貯蔵し
た。
【００８６】解凍後、臍帯を細かく切り刻んだ。次いで
0.3ＭのＫＢｒ、３mMのＤＴＰＡ、100,000KIU／I Trasy
lol（登録商標，アプロチニン）および0.5mMフェニルメ
チルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含有する
リン酸カリウム緩衝液（pH7.4）の50mlに懸濁させた。
臍帯kg当り４ｌの緩衝液を用いた。カオトロピック塩Ｋ
Ｂｒを、組織からのＥＣ−ＳＯＤの抽出量を増大させる
（約３倍）のに用いた。ＤＴＰＡ、TrasylolおよびＰＭ
ＳＦを、プロテアーゼを阻害するために添加した。次い
で懸濁液を、ワーリング・ブレンダー（Waring blende
r）でホモジナイズし、最後の音波処理機で処理した。
次いで４℃で１時間振盪した。得られたホモジネートを
遠心分離し（6000×ｇ，20分間）、上澄液を−80℃で急
速冷凍し最後に−30℃で保管した。
【００８７】実施例２ ヒト肺ＩＣ−ＳＯＤの製造と精製 明白な肺の疾病のない９人の患者から検死の際に、死後
24時間以内にヒト肺を得た。その肺を切り刻み、余分の
血液を0.15M NaClで洗浄して除いた。切断片を、氷冷し
た50mM酢酸ナトリウム（pH5.50）の５容量部で、ワーリ
ング・ブレンダーを用いてホモジナイズした。次いで得
られたホモジネートを音波処理し、４℃で30分間抽出さ
せ、最後に20分間遠心分離に付した。（6000×ｇ）。
【００８８】50mM酢酸ナトリウム（pH5.50）と平衡にし
たＤＥＡＥ−セファセル（Sephacel登録商標；ファーマ
シア社、スエーデン、アプサラより入手）（ホモジネー
ト25容量部当り１容量部）に、得られた上澄液をバッチ
で吸着させた。次いでそのイオン交換体を前記緩衝液で
洗浄し、カラムに充填し、０〜200mM NaClグラジエント
含有の前記酢酸塩緩衝液でグラジエント溶離した。グラ
ジエント溶離液の容積はカラム容積の10倍であった。
【００８９】前の段階からの活性フラクションを集め、
1.5容量部の蒸留水で希釈し、１M NaOHでpH8.4まで滴定
した。この収集液を、175mMトリス・塩酸（pH8.4）と平
衡にしたＤＥＡＥ−セファセルにバッチで吸着させた
（10容量部の収集液当り１容量部のイオン交換体）。次
いでこのＤＥＡＥ−セファセルを前記緩衝液で洗浄し、
カラムに充填し、０〜200mM NaClのグラジエント含有の
トリス緩衝液の10カラム容量部で溶離した。
【００９０】前の段階から集めたフラクションを濃縮
し、150mMリン酸ナトリウム（pH6.5）に対して透析し
た。得られた試料を、同じ緩衝液と平衡にしたフェニル
−セファロース（ファーマシア社、アプサア、スエーデ
ンより入手）のカラムに入れた（試料中の蛋白質15mg当
り約１mlのゲル）。活性部分を、０〜0.5MＫＢｒのグラ
ジエント含有の50mMのリン酸ナトリウムpH6.5緩衝液の2
0カラム容積で溶離した。
【００９１】フェニル−セファロースからの活性フラク
ションを集め、濃縮し、0.15Mリン酸ナトリウム（ph6.
5）に対して透析した。得られた試料を上記リン酸緩衝
液に対して平衡にしたConA−セファロースのカラム（フ
ァーマシア社、アプサラ、スエーデンから入手）に入れ
（試料中の蛋白質２mg当り１mlのゲル）、次いで50mMα
−メチルＤ−マンノシド含有のリン酸緩衝液でパルス溶
離した。
【００９２】Ｃon−Ａセファロースから得た活性フラク
ションを集め、濃縮し、ウルトロゲル（Ultrogel）ＡＣ
Ａ−34カラム（2.5×83cm）（ＬＫＢ、ストックホル
ム、スエーデンから入手）に入れ、50mMリン酸ナトリウ
ム（pH6.5）で溶離した。溶離速度は５ml・ｈ-1・cm-2
であった。溶離によって得た活性フラクションを集め、
濃縮し0.15Mリン酸ナトリウム（pH6.5）と平衡にした、
小麦胚レクチン−セファロースカラム（10ml）（ファー
マシヤ社、アプサラ、スエーデンより入手）に入れた。
酵素を0.45M Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン含有の
リン酸緩衝液でパルス溶離した。
【００９３】上記工程からえた活性なフラクションを集
め濃縮し、0.15Mリン酸ナトリウム（pH6.5）に対して透
析し、リン酸緩衝液で平衡にした、ブルー・セファロー
スＣＬ−６Ｂ（シバクロン・ブルーＦ３Ｇ−Ａ）カラム
（ベッド容積６ml；ファーマシヤ社、アプサラ、スエー
デンより入手）に入れた。カラムを緩衝液で洗浄した
後、10ｍＭＮＡＤと10ｍＭＮＡＤＰとを含有する緩衝液
のパルスを導入した。ピリジンヌクレオチドを緩衝液で
洗い流し、酵素が0.9MＫＢｒ／50mMリン酸ナトリウムpH
6.5でパルス溶離した。
【００９４】ブルー・セファロースカラムから得た活性
フラクションを集め、25mMリン酸ナトリウム（pH6.5）
に対して透析し、同じ緩衝液で平衡にしたヘパリン・セ
ファロースカラム（ベッド容積10ml）（ファーマシア
社、アプサラ、スエーデンより入手）に入れた。次いで
カラムをＮａＣｌの０〜１Ｍグラジエントを含有するリ
ン酸緩衝液140mlで溶離した。活性物質が３つの明確な
ピークで溶出された。Ａはヘパリンと結合せず、Ｂはグ
ラジエントに早期に脱着され、Ｃは遅れて脱着された。
【００９５】ピークＡの成分は、おそらくヘパリン・セ
ファロースカラムから漏洩したと思われる紫外線吸収性
物質を含有していたので、セファクリルＳ−300カラム
（1.6×90cm）（登録商標，ファーマシア社、アプサ
ラ、スエーデンより入手）でさらに精製した。その試料
をpH7.5で25mMトリス・塩酸中で溶離した。Ａ，Ｂおよ
びＣのフラクションを、25mMトリス・塩酸（pH7.5）に
透析し、次いでアミコン（Amicon）UM−10限外濾過膜で
約１mlまで濃縮した。Ｃフラクションは下記実施例に記
載したようにしてＥＣ−ＳＯＤ抗体を作製するのに用い
た。
【００９６】実施例３ ウサギ−抗−ヒト−ＥＣ−ＳＯＤの製造 ＥＣ−ＳＯＤ、フラクションＣは実施例２に記載したの
と同様にして作製した。30μｇのＥＣ−ＳＯＤ含有のフ
ロイントの完全アジュバントをウサギに皮下注射した。
次いで１ケ月間隔で30μｇのＥＣ−ＳＯＤ含有のフロイ
ントの完全アジュバントをウサギに５回注射して免疫感
作を追加免疫した。最後の追加免疫投与を行って２週間
後に前記ウサギから採血して殺し血清を集めた。抗血清
のIgMフラクションを、メーカー（ファーマシア社、ア
プサラ、スエーデン）が推薦するのと同様にして、プロ
テインＡ−セファロースから吸着と脱着を行なうことに
よって単離した。カラムからの溶離を0.1Mグリシン塩酸
pH3.0で行った。溶離後直ちに、集めたIgGをpH7.0にタ
イトレートした。その後IgGを0.1M炭酸ナトリウムpH8.3
＋0.15MＮａＣｌ〔カップリング緩衝液（coupling buff
er）〕に対して透析した。
【００９７】メーカー（ファーマシア社、アプサラ、ス
エーデン）の推薦するのと同様にして、ＣＮＢｒで活性
化したセファロースを膨潤させて作製した。前記のIgG
をカップリング緩衝液で５〜８mg／mlまで希釈した。Ｃ
ＮＢｒで活性化させたセファロースを添加して得られた
混合物を振盪しながら一夜４℃で培養した。ゲル１ml当
り約５mgのIgGをカップルさせた。緩衝液をゲルから吸
引除去し、残った蛋白質を分析した。98％以上のカップ
リングが一般に達成される。次いでIgGをカップリング
させたゲルを、1Mエタノールアミン中に４℃で一夜懸濁
させることによってブロックした。次いで得られたゲル
をカップリング緩衝液で洗浄し、次に0.1M酢酸ナトリウ
ムpH4.0＋0.5MＮａＣｌで洗浄した。次にこのゲルを抗
菌剤としてのアジドと共にカップリング緩衝液中に保管
した。
【００９８】固定化された抗体の最大結合容量は、過剰
ＥＣ−ＳＯＤとともに一夜培養し、残ったＥＣ−ＳＯＤ
を分析することによって測定した。遠心分離後、残留物
をセファロース４Ｂとのシャーム培養（sham incubatio
n）で比較した。抗−ＥＣ−ＳＯＤ−セファロースの50
％懸濁液の100μｌを、0.5mlＥＣ−ＳＯＤ含有のカップ
リング緩衝液に添加した。セファロース４Ｂの50％懸濁
液の100μｌとの平行シャーム培養を行った。その溶液
を４℃で一夜振盪し次いで遠心分離した。セファロース
４Ｂで処理した溶液中に残っている活性は2080Ｕ／mlで
あり、抗−ＥＣ−ＳＯＤ−セファロースで処理した溶液
には720単位／mlが残っていた。これらの数値を用い
て、１mlの抗−ＥＣ−ＳＯＤ−セファロースゲルが1350
0単位のＥＣ−ＳＯＤ（約120μｇ）と結合したと計算す
ることができた。この数値を、ヒト組織のホモジネート
からのＥＣ−ＳＯＤの吸着を計画するのに用いた。
【００９９】実施例４ ＥＣ−ＳＯＤの抗−ＥＣ−ＳＯＤ−セファロースへの免
疫吸着 実施例１に記載したのと同様にして作製した臍帯エキス
約10ｌを、一度に処理した。エキスのＥＣ−ＳＯＤ含有
量は約150U／mlであった。ゲルが13,600Ｕ／mlと結合し
ているならば（実施例３参照）、10ｌのエキス中の全Ｅ
Ｃ−ＳＯＤを吸着するには約110mlの抗−ＥＣ−ＳＯＤ
セファロースを要する。
【０１００】第一にエキスを遠心分離に付して（6000×
ｇ、30分間）沈殿した蛋白質を除去する。次いで上澄液
に対して110mlの抗−ＥＣ−ＳＯＤセファロースを添加
し、混合物を撹拌しながら４℃で一夜培養した。ゲル
を、エキスからガラス漏斗で分離した。次いで得られた
ゲルを漏斗上で、大量の50mMリン酸カリウム（pH7.0）
＋0.5MＮａＣｌで洗浄した。
【０１０１】得られたゲルを直径５cmのクロマトグラフ
ィカラムに充填した。50mMリン酸カリウム（pH7.0）＋
0.5MＮａＣｌで50ml／hrの流速によって溶離を開始し、
280nmにおける吸光度を記録した。Ａ280（280nmにおけ
る吸光度）が著しく低下するまで溶離を続けた。次いで
50mMリン酸カリウムに含有させた、ＫＳＣＮの直線的グ
ラジエント0.5〜2.5MでＥＣ−ＳＯＤを溶離した。グラ
ジエントの全容積は500mlで、この溶離は30ml／hrで行
われる。ＥＣ−ＳＯＤの脱着がおそかったので溶離を速
めることはできなかった。
【０１０２】溶出液をフラクションコレクターに集め
た。溶出したＥＣ−ＳＯＤを高濃度のＫＳＣＮから保護
するために、カラムの溶出端からでているプラスチック
チューブにＴ−パイプを挿入し、カラムの溶離速度の２
倍の速度で蒸留水を注入した。蛋白質（Ａ280におけ
る）とＥＣ−ＳＯＤの得られた溶離状況を第１図に示
す。ＥＣ−ＳＯＤの溶離は最後のグラジエント2.5MＫＳ
ＣＮでは完了しないようであるが、高濃度のＫＳＣＮに
よって変性しすぎたＥＣ−ＳＯＤを集めないように溶離
は続けない。
【０１０３】ＥＣ−ＳＯＤを第１図に示すように集め
た。最初の活性のあるグラジエントは、非特異的に結合
して汚染蛋白質（Ａ280）をむしろ大量に含有している
ので集めなかった。そのグラジエント中のＡ280の大部
分はＫＳＣＮによるものであり、はじめにだけ、有意な
小さな蛋白質のピークが認められる。次いで再生のた
め、ゲルを2.5MＫＳＣＮ内で一夜振盪し、50mMリン酸カ
リウム（pH6.5）＋0.5MＮａＣｌで洗浄し、次いでＮａ
Ｃｌなしの緩衝液で洗浄した。アジドを抗菌剤として最
後に加えた。使用する前に、ゲルを、アジドを含有しな
い50mMリン酸カリウムpH6.5で洗浄する。
【０１０４】実施例５ ＤＥＡＥ−セファセルへの吸着とその溶離 抗−ＥＣ−ＳＯＤ−セファロースからの溶出液をため
て、これに、最終濃度１０ｍＭまで１−アミノメチルプ
ロパノールを添加した。次いで得られた溶液を１ＭＮａ
ＯＨでpH9.0まで滴定した。得られた溶液を５容量部の
蒸留水で希釈した。得られた溶液に、50mMリン酸ナトリ
ウム＋0.5MＮａＣｌ＋175mMトリス塩酸pH9.6と平衡にし
た40mlのＤＥＡＥ−セファセル（Sephacel）を添加し
た。
【０１０５】ＥＣ−ＳＯＤを、４℃で一夜撹拌しながら
ＤＥＡＥ−セファセルに吸着させた。次いでＤＥＡＥ−
セファセルをガラス漏斗に集め、50mMリン酸ナトリウム
pH6.5で洗浄し、2.5cm直径のクロマトグラフィ用カラム
に充填した。最初に、そのカラムを約４容量部の上記緩
衝液で溶離した。次いで第２図に示したように50mMリン
酸ナトリウムpH6.5＋0.25MＮａＣｌを用いてＥＣ−ＳＯ
Ｄを溶離した。活性部を第２図に示したように集め、25
mMリン酸ナトリウムpH6.5に透析し、最後に約２mlまで
濃縮した。
【０１０６】実施例６ ヘパリン−セファロース上でのＥＣ−ＳＯＤの最終の精
製 上記のようにして得たＤＥＡＥ−セファセルからの溶出
物のバッチを、一度にヘパリン−セファロースで分離し
た。適用する酵素溶液を、25mMリン酸カリウムpH6.5に
対して透析した。
【０１０７】20mlのヘパリン−セファロースゲルをメー
カー（ファーマシア社、アプサラ、スエーデン）が推薦
するようにして作製し、1MＮａＣｌ含有の25mMリン酸カ
リウムpH6.5で洗浄し、次いでＮａＣｌなしの緩衝液で
洗った。そのヘパリン−セファロースを直径2.5cmのク
ロマトグラフィカラムに充填し、25mMリン酸カリウム
（pH6.5）を用い15ml／hrで溶離を開始した。そのＥＣ
−ＳＯＤ溶液（約10ml,800,000単位）を適用し、280nm
における吸光度を追跡した（第３図参照）。最初のピー
クをすぎてＡ280がベースラインに近づいた時、０〜1.2
MＮａＣｌのＮａＣｌグラジエントでＥＣ−ＳＯＤを溶
離した。グラジエントの容積は400mlであった。ＥＣ−
ＳＯＤは３つのピークで溶出した。一つはヘパリンに親
和性がなく、ひとつはピークで溶出した。一つはヘパリ
ンに親和性がなく、ひとつは中位の親和性を有し、ひと
つは高い親和性を有する。そのピークは実施例２に記載
のフラクションＡ，ＢおよびＣに対応する。通常の方法
で精製すると、ほとんどすべての活性はＣ型のものであ
り、それ故これはおそらく天然型の酵素であると結論し
た。ピークＣを第３図に示したように集めた。集めた活
性部は430,000単位（約4.3mg）であった。比活性部は81
100（ml／Ａ2 80当りの単位）であった。ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅゲル上に約30,000Ｄのサブユニットが見出された。汚
染物は痕跡もみとめられなかった。集められた活性部
は、ヘパリン−セファロースに適用した活性部の約53％
を示した。
【０１０８】実施例７ ヒトＥＣ−ＳＯＤのアミノ末端配列 上記の実施例に記載されたようにして得たヒトＥＣ−Ｓ
ＯＤを、標準の手法（Edmanら、Eur. J. Biochem. 1, 1
967年、第80〜87頁）によって、その（Ｎ末端）アミノ
酸配列を分析した。その最初の33のアミノ酸の配列は、
【０１０９】
【外８】
【０１１０】であることが分かった。この配列またはそ
の適切な部分は、合成のＤＮＡプローブ、すなわち、上
記アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の、コード鎖と
非コード鎖の両者に相補的な合成のデオキシオリゴヌク
レオチドを作製するのに用いることができる。下記の実
施例に記載のようにして、ＥＣ−ＳＯＤ遺伝子の全長の
もしくは一部のｃＤＮＡコピーを単離するために、前記
プローブを、ＥＣ−ＳＯＤ産生細胞もしくは組織由来の
ｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリイとの雑種形
成実験に用いてもよい。
【０１１１】実施例８ ヒトＥＣ−ＳＯＤのクローニングと配列の決定 ＤＮＡプローブの製造 ヒトＥＣ−ＳＯＤを、上記実施例１〜６に記載したのと
実質的に同様にして臍帯から精製し、最初の33Ｎ末端ア
ミノ酸の配列を実施例７に記載したのと同様にして決定
した。このアミノ酸配列と、真核細胞蛋白質用に必要な
コドン用途（Granthamら、Nuch. Acids Res. 9,1981年
第43〜74頁）に基づいて、ＥＣ−ＳＯＤ遺伝子のコード
鎖に相補的な、合成の48の塩基のデオキシオリゴヌクレ
オチド；
【０１１２】
【外９】
【０１１３】をMatthesらの（ＥＭＢＯ Journal 3, 19
84年, 第801〜805頁）に記載の手法で合成した。ヒト胎盤 ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング ベクターλｇｔ11中に作製されたヒト胎盤ｃＤＮＡライ
ブラリーを、クロンテック・ラボラトリイズ インコー
ポレイテッド（Clontech Laboratories, Inc.,922イン
ダストリアル・アベニュー、パロアルト、シイエイ 943
03, 米国）（カタログ番号HL1008ロット番号1205）から
入手した。その組換え体ファージを、支持菌株イー・コ
リ（E. Coli）Ｙ1090上にプレーティングすることによ
ってヒトＥＣ−ＳＯＤｃＤＮＡ配列を得るためにスクリ
ーニングした。プラークの移動とニトロセルロースフィ
ルター〔Hybond C, アマーシャム インコーポレイテッ
ド（Amersham Inc. ）〕の処理は、Maniatisらの〔Mole
cular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Ha
rbor Laboratories, 1982年〕に記載してあるのと本質
的に同様に行った。１枚のフィルター当り20,000のプラ
ークを８枚のニトロセルロースフィルターに写し、５×
ＳＳＣに予備浸漬し、次いで40mlの20％ホルムアミド、
５×デンハート溶液（Denhardt 's solution）、50mMリ
ン酸ナトリウムpH6.8および変性させて超音波処理した
仔ウシ胸腺ＤＮＡの50μｇ／ml中、41℃で１時間予備雑
種形成させた。次いでそのフィルターを、32Ｐ−γ−Ａ
ＴＰ末端ラベルした（Maniat 'sらの上記文献参照）上
記48塩基のプローブであって、ml当り、１分間に７×10
5カウントするものにハイブリダイズさせた。このハイ
ブリダイゼーション（雑種形成）は、100μｍ ＡＴＰ
（最終濃度）を補充した予備雑種形成溶液中41℃で18時
間行った。41℃で一夜培養した後、フィルターを0.2×
ＳＳＣ内で37℃で一回洗い、次いで37℃で0.2×ＳＳ
Ｃ，0.1％ＳＤＳ中で４回洗い、次いで風乾した。その
フィルターをデュポン・クロネックス４（DupontCronex
-4）Ｘ線フィルムに一夜露出させた。第４図にオートラ
ジオグラムのひとつを示す。各フィルターには約６つの
陽性プラーク含まれている。
【０１１４】陽性ハイブリダイゼーション反応を示すプ
ラーク由来のファージを単離精製し、これらのファージ
由来のＤＮＡを、Davisらの〔Advanced Bacterial Gene
tics, Cold Spring Harbor Laboratories, 1980年〕に
記載の方法で抽出し、ｃＤＮＡ挿入物の長さを、ファー
ジＤＮＡを制限酵素ＥcoＲＩで開裂後アガロースゲル電
気泳動法で測定した。最長のｃＤＮＡ挿入物を有する組
換え体ファージをλＳＰ３と命名し、事後の研究用に選
んだ。
【０１１５】ファージλＳＰ３由来のｃＤＮＡ挿入物を
制限酵素分析に付し、ｐＵＣ18とＭ13ベクターmg９との
それぞれにサブクローニングした後塩基配列を決定し
た。その挿入物は、そのＤＮＡ配列由来のアミノ酸配列
を精製蛋白質のペプチド配列と比較し、ＣＨＯ細胞にお
けるその発現産物によって、ヒト−ＥＣ−ＳＯＤをコー
ドするＤＮＡであることが証明された。λＳＰ３から単
離された挿入物は、1396bpのｃＤＮＡ、240のアミノ酸
の蛋白質をコードする読取り枠、69bpの5'−アントラン
スレイティッド（untransulated）領域および607bpの3'
−アントランスレイテッド領域を有していた（第５図と
第６図参照）。ヒトＥＣ−ＳＯＤをコードするｃＤＮＡ挿入物のサブク
ローニングと制限酵素分析 約30μｇのλＳＰ３ＤＮＡを制限酵素ＥcoＲＩで消化
し、６％ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動法によっ
て、ｃＤＮＡ挿入物をλＤＮＡから分離した。電気溶離
法、フエノールとクロロホルムによる抽出およびエタノ
ールによる沈殿によって（前記Maniatisらの文献）、ゲ
ルから約0.2μｇのｃＤＮＡフラグメントを単離した。
0.05μｇの単離されたｃＤＮＡフラグメントを、制限酵
素ＥcoＲＩで消化しアルカリ性ホスファターゼで処理し
たｐＵＣ18ＤＮＡ（Norranderら、Gene 26, 1983年, 10
1〜106頁) の１μｇに連結した。連結されたＤＮＡを、
イー・コリＨＢ 101菌株に導入した（J. Mol. Biol. 4
1, 459頁）。形質転換細胞をアンピシリン含有のプレー
ト上で選別した。ｃＤＮＡ挿入物を有する組換え体プラ
スミドを同定しｐＬＳ３と命名した。プラスミドｐＬＳ
３ＤＮＡを制限酵素分析に付した。
【０１１６】ヒトＥＣ−ＳＯＤをコードするｃＤＮＡの
ＤＮＡ配列分析 ヒトＥＣ−ＳＯＤをコードするファージλＳＰ３由来の
ｃＤＮＡ挿入物のＤＮＡ配列を、ｃＤＮＡフラグメント
をＥcoＲＩ部位でＭ13ベクターmp９に結合させてフラグ
メントをＥcoＲＩ部位でＭ13ベクターmp９に結合させて
クローニングさせた後（J. MessingとJ. Vieira, Jene
19, 1982年, 269〜276頁）、SangerらのProc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 74, 5463〜5467頁 ; F. SangerとA. R. C
oulsonのFEBS Letters 87, 1978年, 107〜110頁；およ
びMessngらのNucl. Acids Res. 9,1981年309〜321頁；
P. H. SchreirとR. CorteseのJ. Mol. Biol. 129, 1979
年,169〜172頁の手法によって決定した。
【０１１７】ｃＤＮＡ挿入物の重複クローンの逐次シリ
ーズを、DaleらのPlasmid 13, 1985年, 31〜40頁に記載
の方法によってＭ13ベクターmp９に生成させた。この方
法を用いてｃＤＮＡの両ＤＮＡストランドの完全ヌクレ
オチド配列を決定し、1396bpの長さを有することを見出
した。λＰＳ３のｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列と
推定アミノ酸配列を第５図及び第６図に示す。そのｃＤ
ＮＡ挿入物は240のアミノ酸の読取り枠を持っている。
精製した成熟蛋白質のアミノ酸配列は、18のアミノ酸の
推定上のシグナルペプチドを示唆するアミノ酸+１から
始まる。公知のシグナルペプチドのように、このアミノ
酸配列は疎水性アミノ酸に富み、その上最後の残基は公
知のシグナルペプチドのこの位置に見出されるアミノ酸
の一つであるアラニンである（G. Von Heijne, Eur. J.
Biochem, 113, 1983年, 17〜21頁）。下線を付けたア
ミノ酸配列は、ペプチド配列決定法で確認した。このＤ
ＮＡ配列の他の特徴は、翻訳開始コドンのところに見出
された配列の−ＣＡＧＣＣＡＵＧＣ−であり、これは真
核細胞の開始部位の推定・合意されている配列の−ＣＣ
A GＣＣ−ＡＵＧ（Ｇ）−（M. Kozak, Nucl. Acids Res.
12, 1984年, 857〜872頁）と同種である。さらに、推
定・合意されている配列のＡＡＴＡＡＡと同種の配列の
−ＡＴＴＡＡＡ−をもったポリアデニル化可能のシグナ
ルがポリアデニル化末端の14bp上流に見出された。
【０１１８】ヒトＥＣ−ＳＯＤのＣＨＯ細胞中への発現 サルウイルス40（SV40）の複製起点、初期と後記とのプ
ロモーター、ポリアデニール化配列と終結配列を有する
発現ベクターを、上記ｃＤＮＡでコードされているヒト
ＥＣ−ＳＯＤを作製するのに用いた。1396bp長のｃＤＮ
ＡをSV40の初期プロモーターおよびSV40のポリアデニル
化と集結の配列の間に位置する唯一のＥcoＲＩ制限酵素
切断部位に挿入し、その結果ヒトＥＣ−ＳＯＤをコード
する配列の発現がSV40初期プロモーターによって制御さ
れる（第７図）。この構築されたＥＣ−ＳＯＤ発現プラ
スミドをｐＰＳ３と命名した。
【０１１９】β−ラクターゼ遺伝子中に位置する唯一の
ＰstＩ部位を制限酵素ＰstＩで切断することによって、
20μｇのｐＰＳ３ＤＮＡを直線化した。この直線化され
たｐＰＳ３ＤＮＡを、GrahamとVan der Ebの（Virology
52, 1973, 456〜467頁）の方法によりＣＨＯ−Ｋ１
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ61）細胞にジエネチシン（Genetici
n）〔Ｇ−418 サルフェート，ギブコ社（Gibco Lt
e.）〕に対する耐性を与える配列を有するプラスミドか
らのＤＮＡ 0.5μｇで同時トランスフェクトした。トラ
ンスフェクトされた細胞は、ml当り700μｇのジエネチ
シン（G 418サルフェート，ギブコ社）を含有する培地
〔10％のウシ胎児血清、ストプトマイシンおよびペニシ
リンを補充したハムスのＦ12培地（Hamss F12 mediu
m）〕中で培養することによって選択した。ジエネチシ
ン耐性のコロニイを単離し、同じ培地内で増殖させた。
間隔をおいて培地を採取し、ＥＬＩＳＡ法によってＥＣ
−ＳＯＤの存在を分析し、下記のようにして酵素活性の
測定を行った。試験されたいくつかのセルラインは、ヒ
トＥＣ−ＳＯＤの同等の生産量を示し、得られたセルラ
インのひとつは、ＣＨＯ−Ｋ １／ｐＰＳ３ネオ−18と
命名され、後の研究用に選択された。
【０１２０】ヒトＥＣ−ＳＯＤをコードする遺伝子を含
有するＣＨＯ細胞による、ＥＣ−ＳＯの培養基への分泌 クローンＣＨＯ−Ｋ１／ｐＰＳ３−18と親のＣＨＯ−Ｋ
１細胞とを、10％のウシ胎児血清を含有するハムのＦ−
12培地中で集密的に培養した。さらに３日後、培地を除
き、細胞をリン酸緩衝液で緩衝された生理的食塩水で２
回洗浄した。次いでその細胞を40mMトリス塩酸、140mM
ＮａＣｌおよび１mM ＥＤＴＡを含有する溶液中で培養
した培養フラスコから取り出した。次いで回収された細
胞（約８×106）を遠心分離し、上澄液を排棄し、細胞
をペレットとして−80℃で貯蔵した。次いでその細胞
を、50mMリン酸カリウムpH7.4、0.3M ＫＢｒ、３mM
ＤＴＰＡ、0.5mM ＰＭＳＦおよび100ＫＩＥ／mlトラシ
ロールを含有する溶液の1.5ml中で音波処理して破壊し
た。得られたホモジネートを遠心分離した。得られたホ
モジネートと、OhmanとMarklundのChim. Sci. 70, 198
6, 365〜369頁に略記されている、ヒトＥＣ−ＳＯＤと
ヒトＣｕＺｎＳＯＤとに向いた固定化抗体を含有する培
養基とを培養することによって、ＥＣ−ＳＯＤの量の特
異的測定を行った。親のＣＨＯ Ｋ１細胞もしくはその
培養基中にＥＣ−ＳＯＤは全く見出せなかった。この特
別の実験において、クローンＣＨＯ−Ｋ１（ｐＰＳ３ネ
オ−18）（15ml）細胞からの培養基が、51Ｕ／mlで合計
765ＵのＥＣ−ＳＯＤを含有していることが分かった。
その細胞ホモジネート（1.5ml中）は71ＵのＳＯＤ活性
を有し、そのうちの20ＵはヒトＥＣ−ＳＯＤによるもの
であった。したがて、ＣＨＯ−Ｋ１／ｐＰＳ３ネオ−１
８培養物のＥＣ−ＳＯＤの97.5％が培養基中に分泌され
たものである。
【０１２１】ＣＨＯ細胞中でのヒトＥＣ−ＳＯＤの産生 この細胞が固体支持体上および懸濁状態で培養された両
方の場合に、このクローンによるヒトＥＣ−ＳＯＤの産
生が測定された。
【０１２２】１．固体支持体上で培養するＣＨＯ−Ｋ１
／ｐＰＳ３ネオ−18細胞によるＥＣ−ＳＯＤの産生 (a) 10％のウシ胎児血清、２mM Ｌ−グルタミン、スト
レプトマイシンおよびペニシリンを補充したハムのＦ12
培地〔フロー・ラボラトリイズ社（Flow Laboratorie
s）〕の30mlを175cm3のフラスコに入れ、これに4.5×10
6の細胞を接種した。その細胞を、５％ＣＯ2を含有する
空気中37℃で培養した。培地を３日毎に変え、後記「ヒ
トＥＣ−ＳＯＤ発現の検出法」の項に記載したのと同様
にして、培養基に分泌されたヒトＥＣ−ＳＯＤの濃度を
測定した。ＥＬＩＳＡ法によって測定してＥＣ−ＳＯＤ
酵素活性を決定した結果、ヒトＥＣ−ＳＯＤの生産性は
1.5pg／細胞・24時間であった。
【０１２３】(b) 細胞を、４mg／mlの濃度の微粒子担体
〔m. C：シトデックス３（Cytodex３）ファーマシヤ
社、スエーデン〕に、５％ウシ胎児血清、２mM Ｌ−グ
ルタミン、ストレプトマイシンおよびペニシリンを補充
したハムのＦ12培地（フロー・ラボラトリイズ）中、７
細胞／微粒子担体の濃度で接種した。その細胞を、５％
ＣＯ2含有の空気雰囲気、37℃の500ml撹拌フラスコ（Te
chne）中で培養した。集密的な細胞生育の状態で、培養
物を0.088h-1の速度でperfundateした。ヒトＥＣ−ＳＯ
Ｄの生産性は0.50pg／細胞・24時間であった。
【０１２４】２．懸濁培養液中で培養したＣＨＯ−Ｋ１
／ｐＰＳ３ネオ−18細胞によるＥＣ−ＳＯＤの産生 125mlの培地（10％ウシ胎児血清、２mM Ｌ−グルタミ
ン、ストレプトマイシンおよびペニシリンを補充したハ
ムのＦ12培地）に２×105細胞／mlを接種した。培養物
を撹拌フラスコ（Techne）中、５％ＣＯ2含有空気雰囲
気下37℃で培養した。３日毎に培地を取換えた。ヒトＥ
Ｃ−ＳＯＤの生産性は0.65pg／細胞・24時間であった。
【０１２５】ヒトＥＣ−ＳＯＤ発現の検出分析法 １．エンザイム−リンクド イムノアドソ−ベントアッ
セイ〔ＥＬＩＳＡ（エリザ法）〕 ポリクロナルウサギ抗−ＥＣ−ＳＯＤ IgG抗体（実施
例３で記載したのと同様にして作製）をml当り15μｇ含
有する、15mM Ｎａ2ＣＯ3、35mM ＮａＨＣＯ 3および
0.02％ＮａＮ3 pH9.6の溶液の100μｌで、マイクロタイ
タープレート〔ヌンクロン（Nunclon）、ＮＵＮＣ Ａ
／Ｓ、デンマーク〕の各ウエルをコートした。室温で一
夜培養後、プレートをＰＢＳ（リン酸緩衝液：10mMリン
酸ナトリウム、145mM ＮａＣｌ、pH7.2）で洗浄した。
そのマイクロタイタープレートを、３％（ｗ／ｖ）ウシ
血清アルブミン含有のＰＢＳ溶液200μｌを各ウエル当
りに用いて、37℃で30分間培養し、ＰＢＳで洗浄した。
稀釈した培地の試料の100μｌを各ウエルに添加して37
℃で１時間培養した。プレートを、５％（ｖ／ｖ）のツ
ィーン20含有のＰＢＳで洗い、次いで３％のウシ血清ア
ルブミン含有のＰＢＳに、マウスモノクロナル抗−ＥＣ
−ＳＯＤ抗体（実施例Ｚ参照）をml当り８μｇ含有する
溶液100μｌを各ウエルに加えて、37℃で１時間培養し
た。５％のツィーン20含有のＰＢＳで洗浄した後、プレ
ートを、ペルオキシダーゼを接合されたウサギ抗−マウ
ス抗体〔ダコパッツ社（Dakopatts A/S）、デンマー
ク〕を含有する、３％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳと
ともに37℃で１時間培養した。そのプレートを５％ツィ
ーン20含有のＰＢＳで洗浄し、（50mMクエン酸ナトリウ
ム、100mMリン酸ナトリウム、0.04％（ｗ／ｖ）ｏ−フ
ェニレンジアミン、0.01％過酸化水素、pH5.0）含有の
基質溶液の100μｌを各ウエル当りに用いて、暗所にて
室温で20分間培養した。ウエル当り25μｌの10％ＳＤＳ
を添加して反応を停止し、450nmの吸光度を測定した。
【０１２６】２．ＥＣ−ＳＯＤ酵素活性の測定 ＳＯＤ酵素活性を、MarklundのJ. Biol. Chem. 251, 19
76, 7504〜7507頁に記載してあるのと同様にして測定し
た。ヒトＥＣ−ＳＯＤに対する特異性を測定するため
に、セファロースに固定化された抗−ヒトＥＣ−ＳＯＤ
（実施例４参照）で試料を処理する前と後に試料を分析
した。ＥＣ−ＳＯＤ活性は、試料が抗体に吸着される前
と後との活性の差とした。
【０１２７】実施例９ ヘパリンの誘導による、ＥＣ−ＳＯＤのヒト血漿への放
出 体重kg当り 200ＩＵのヘパリン（ＡＢ ＫＡＢ−Vitrum
社、ストックホルム、スエーデン）を、一夜絶食した２
名の健康な男性〔(a) 34歳と(b) 40歳〕に静脈注射し
た。ヘパリンの注射前と、注射後第８図に示すような間
隔をおいて、血液試料を採取した。採取した血液試料
を、抗凝血剤としてのＥＤＴＡを入れたテルモ・ヴェノ
ジェクト・バキューム・チューブ（Termo Venoject vac
uum tube）内に入れて遠心分離した。遠心分離した後、
血漿試料を、分析するまで−80℃に保持した。
【０１２８】さらに20mlの全血を３名の健康人から採取
し、前記と同様にしてＥＤＴＡの入ったチューブに入れ
た。その血液を２等分し、一方には30ＩＵヘパリン／ml
を添加し、他方には同容積の0.15M ＮａＣｌを添加し
た。室温で30分間培養後、試料を遠心分離してＳＯＤ分
析用の血漿を集めた。ＫＯ2を用いる直接分光光度分析
法（S. l. Marklund, J. Biol. Chem. 251, 1976年, 75
04〜7507頁) を、OhmannとMarklundのClin. Sci. 70, 1
986年, 365〜369頁に記載されているように改変した方
法でＳＯＤ活性を測定した。ＳＯＤ活性の１単位は、8.
3ngのヒトＣｕＺｎＳＯＤ、8.8ngのヒトＥＣ−ＳＯＤお
よび65ngのウシＭｎＳＯＤに相当する。血漿中のイソ酵
素類の区別は、OhmannとMarklundのClin. Sci. 70, 198
6年, 365〜369頁に記載されているようにしてセファロ
ース４Ｂに固定されたヒトＣｕＺｎＳＯＤとＥＣ−ＳＯ
Ｄに対応する抗体によって行った。
【０１２９】結果を第８図に示したが、kg体重当り 200
ＩＵのヘパリンを静脈注射すると、血漿のＥＣ−ＳＯＤ
活性が急速に３倍も上昇することを示している。５分後
にはすでに最高の増大がみられる。その活性は15〜30分
間高いままで保持され、次いで徐々に減少し、６時間以
上後に最初のレベルになる。静注したヘパリンは、血漿
ＣｕＺｎＳＯＤ活性とシアン耐性ＳＯＤ活性に対して何
ら影響を与えなかった。
【０１３０】kg体重当り 200ＩＵまでのヘパリンの静脈
投与が、ＥＣ−ＳＯＤの血漿への放出に与える効果を第
９図に示した。この図からみてヘパリンの投与量が増大
すると、ＥＣ−ＳＯＤの放出が増大することは明らかで
ある。明確な平坦部には達していないことは明らかであ
り、kg体重当り 200ＩＵ以上投与すると、ＥＣ−ＳＯＤ
放出量がさらに高くなるようである。しかし倫理的配慮
からより高い投与量の試験はできなかった。
【０１３１】生体内で得られた結果とは逆に、前記のよ
うに全血にヘパリンを添加しても血漿のＥＣ−ＳＯＤ活
性に何ら影響がなかった。またヘパリン（５ＩＵ／ml）
を血漿に直接添加してもＥＣ−ＳＯＤ活性に何ら変化を
示さなかった。第８図に示した生体内での血漿ＥＣ−Ｓ
ＯＤ活性の増大は、血液細胞からの酵素の放出もしくは
血漿中に存在するＥＣ−ＳＯＤの活性化によって起らな
いことを上記結果は示している。
【０１３２】５名の健康人（３名の男性、２名の女性）
から得た血漿試料を、ヘパリン−セファロース（ファー
マシヤ社、アプサラ、スエーデンより購入）のクロマト
グラフィに付した。２mlのヘパリン−セファロースの入
ったカラムと、溶離剤として25mMのリン酸カリウムpH6.
5とを用い室温でカラムクロマトグラフィに付した。試
料（２mlの血漿）を4.2ml／ｈで用い、Ａ280がベースラ
インに近づいたとき、結合した要素を、直線的なＮａＣ
ｌのグラジエントを含むリン酸カリウム緩衝液（０〜
Ｍ、全容積50ml）で、９ml／ｈで溶離した（第１０図参
照）。溶出液中のＳＯＤ活性の平均収率は約95％であっ
た。
【０１３３】血漿試料を前記クロマトグラフィにかける
前に、小さなセファデックスＧ15カラム（ＰＤ−10）
（ファーマシヤ社、アプサラ、スエーデンから購入）の
クロマトグラフィによって、前記溶離緩衝液と平衡にし
た。クロマトグラフィによって試料は３倍に稀釈され
た。ＳＯＤ活性の回収率はほぼ100％であった。５つの
正常な血漿試料中のＥＣ−ＳＯＤフラクションＡ，Ｂお
よびＣの測定結果を下記第Ｉ表に示す。これらのフラク
ションは正常な血漿とほぼ等しい大きさであることが分
かった。そのクロマトグラムのＥＣ−ＳＯＤ活性部の平
均収率は95％であった。ひとつの血漿試料のパターン
は、冷蔵庫内に貯蔵する前と、３日間貯蔵後とでは同一
であったので、３つのフラクションへの分離が２次的な
生体外での分解によって起ったものではないことは明ら
かである。血漿のＥＣ−ＳＯフラクションの組成に対す
る静注ヘパリンの影響を第１０図に示す。試験を受けた
人にヘパリンを静注することによってフラクションＣだ
けが有意に増加することが分かった。ＡとＢは特に変わ
らなかった。第２番目の試験を受けた人（データを記載
していない）では、ヘパリン注射の影響は本質的に同一
であった。フラクションＣは７単位／ml血漿から32単位
／ml血漿まで増加した。
【０１３４】
【表１】
【０１３５】上記実験は、ヘパリンの静注が血漿のＥＣ
−ＳＯＤ活性を急激に増大させることを示している。ヘ
パリンはＥＣ−ＳＯＤを活性化せず、また血液細胞から
何の放出も論証できないが、放出されたＥＣ−ＳＯＤの
最も可能性の高いソースとして内皮細胞表面を示唆して
いる。ヘパリンに対して親和性を有する多くの他の因
子、リポ蛋白質リパーゼ、肝性リパーゼ、ジアミンオキ
シダーゼおよび血小板第四因子は、前記したのと同様
に、静注ヘパリンによって速やかに放出されることを示
した。これらのケースのほとんどは、内皮細胞表面のヘ
パラン・硫酸から蛋白質がヘパリンによって誘導されて
移動したということが、この現象を説明しているという
証拠がある（A. Robinson-Whiteら、J. clin, Invest.
76, 1985年,93〜100頁；C. BuschらThrom. Res. 19, 19
80年、129〜137頁）。ＥＣ−ＳＯＤの放出は同様に説明
できるようである。
【０１３６】200ＩＵ／kg体重までのヘパリン投与に対
して放出は明確な平坦域に到達せず、リポ蛋白質リパー
ゼ、ジアミンオキシダーゼ、肝性リパーゼおよび血小板
第四因子に対するよりもＥＣ−ＳＯＤの最大放出のため
にさらに多くのヘパリンを要するということを示した。
ヘパリンやヘパラン硫酸とに対する親和性の比率は、他
の蛋白質よりもＥＣ−ＳＯＤの方が低いかもしれない。
【０１３７】基底ヒト血漿はほぼ同量のＥＣ−ＳＯＤフ
ラクションＡ，ＢおよびＣを含有している。静注ヘパリ
ンによって、高ヘパリン親和性のフラクションＣだけが
放出されたが、このフラクションは明らかに、内皮細胞
表面に対して親和性を有する形態のものである。ここで
得られた増加は４〜６倍であったが、ヘパリンの投与量
が高い程高い比率になるようである。さらに高い比率
が、リポ蛋白質リパーゼ、肝性リパーゼ、ジアミンオキ
シダーゼおよび血小板第４因子に対して得られる。これ
らの蛋白質と比べて、ＥＣ−ＳＯＤの内皮との結合はむ
しろゆるやかのようである。血漿と内皮細胞表面との間
に、ＥＣ−ＳＯＤフラクションＣに対して、おそらく平
衡状態が存在する。血管系におけるほとんどのＥＣ−Ｓ
ＯＤは内皮細胞の表面に位置しているようである。
【０１３８】ＥＣ−ＳＯＤフラクションＡ，ＢおよびＣ
間のヘパリンに対する親和性の差異についての分子的背
景はまだ解明されていない。アミノ酸組成とサブユニッ
トの組成とに有意な差はない（S. L. Marklund, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 79, 1982年，7634〜7638頁）。
またいかなる抗原の差異も検出できなかった。（S. L.M
arklund, Biochem. J. 220, 1984年，269〜272頁）。フ
ラクションＡとＣとの差異はイオン交換クロマトグラフ
ィでは何ら検出できず両フラクションの等電点は同一で
あるから（pH4.5）、マイナスに帯電したヘパリンへの
結合性は、一般的なイオン交換性によるものでないこと
は明らかである。また血漿を冷蔵庫に３日間貯蔵しても
ヘパリン−セファロース上での溶離パターンは変化しな
かったので、上記の差異は生体外での分解が原因ではな
い。生体内で分解した可能性はあるが、フラクションＡ
とＢは流体要素の保護を特異的に意図するものであり、
フラクションＣは細胞表面の保護を意図するものである
と推測することができる。
【０１３９】体内のほとんどの細胞系は、その表面にヘ
パラン硫酸と他の硫酸化グルコースアミノグリカン類を
有している（M. Hookら、Ann. Rev. Biochem. 53, 1984
年，847〜869頁）。組織内に見出された多くのＥＣ−Ｓ
ＯＤ（S. L. Marklund, J. Clin. Invest. 74, 1984
年，1398〜1403頁）は、細胞膜上の前記物質や結合組織
中に位置している可能性がある。ＥＣ−ＳＯＤの細胞表
面との結合は、細胞外で形成されたスーパーオキシドラ
ジカルに対して細胞を保護する特に有効な方法であろ
う。マイナスに帯電した細胞膜との会合を容易にするた
めにＣｕＺｎＳＯＤをポリリシンで置きかえると、酵素
の性能が高度に増強されて、活性化された多形核白血球
が自己失活しないよう保護されるということは興味深い
ことである（A. M. Michelson, J. M. M cCordおよびI.
Fridovich編集、アカデミック・プレス社、1977発行，
M. L. SalinとJ. M. M cCord著の“スーパーオキシドと
スーパーオキシドジスムターゼ類”の257〜270頁）。ノ
カルディア・アステロイデス（Nocardia asteroides）
の細胞膜に会合したＳＯＤは、活性化された多形核白血
球に対してこの細菌を有効に保護する（B. L. Beaman
ら、Infect. Immun. 47, 1985年，1985年，135〜140
頁）。ＥＣ−ＳＯＤのフラクションＣに対する親和性を
欠いた微生物は、体内の殆どの細胞はそうではないが、
酵素による保護から利益を得られない。
【０１４０】活性化された白血球やある種の条件下の他
の細胞系によって産生されるスーパーオキシドラジカル
が、直接もしくは間接に染色体の損傷を誘発し〔J. Eme
rit,Lymphokines 8, 1983年，413〜424頁；A. B. Weitb
erg, S. A. Weitzman, E. P. ClarkおよびT. P. Stosse
l, J. Clin. Invest. 75, 1985年，1835〜1841頁；H.
C. BirnboimおよびM. Kanabus-Kaminska, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 82, 1985年，6820〜6824頁）〕ならび
に発癌を促進する〔C. BorekとW. Troll, Proc.Natl. A
ca. Sci. USA 80, 1983年，1304〜1307頁；Y. Nakamur
a, N. H. ColburnおよびT. D. Gindhart, Carcinogenis
6, 1985年，229〜235頁〕という証拠がある。表面に会
合したＥＣ−ＳＯＤのフラクションＣは、生体内での上
記のような事象に対する有効な保護剤である。殆どの生
体外の試験系において、ＥＣ−ＳＯＤのフラクションＣ
の多くは、その結合力が弱いので、おそらく細胞から失
われるであろう。したがってかような系での所見によっ
て、損傷に対する生体内での保護の状態を、必ずしも定
量的に予測できない。
【０１４１】ＣｕＺｎＳＯＤの非経口投与が、上記のよ
うに多くの興味深い治療性を示した。この知見は、ＥＣ
−ＳＯＤの投与が細胞外空間におけるスーパーオキシド
ラジカルによってひき起こされる細胞損傷に対する保護
の一層有効な方法であるということを示唆している。
【０１４２】実施例１０ 125Ｉで標識を付けたヒトＥＣ−ＳＯＤのウサギへの注
射 実施例１と４〜６とに記載したのと同様にして作製した
臍帯ＥＣ−ＳＯＤに、“イオドジエン”法（Iodogen te
chnique, P. R. P. Salacinski, C. Mclean, J. E. C.
Sykes, U. V. Clement-JonesおよびP. J. Lowry, Anal.
Biochem. 117,1981年，136〜146頁）を用いて125Ｉで
標識を付した。標識を付けたＥＣ−ＳＯＤを、セファク
リルＳ−300（ファーマシヤ社、アプサラ、スエーデン
から入手）でのゲル濾過法によって125Ｉヨウ素から分
離した。クロマトグラム上の位置は、標識を付けていな
いＥＣ−ＳＯＤと同じ場所であったので、分子の大きさ
は変っていないことを示している。
【０１４３】得られた標識を付けたＥＣ−ＳＯＤを、ヘ
パリン−セファロースのクロマトグラフィに付した（上
記したのと同じ）。高いヘパリン親和性を有する物質
（＝フラクションＣ）のみをその後の実験に用いた。そ
の標識を付けたＥＣ−ＳＯＤをウサギ（体重約３kg）に
静脈注射した。次いで血液試料を採取し、その血漿中に
残っている放射能を分析した。血漿試料を三塩化酢酸
（蛋白質を沈殿させる）で沈殿させ、遠心分離した後、
蛋白質ペレットについて放射能を計数した。この操作に
よって、分解されたＥＣ−ＳＯＤ由来の、血漿中の放射
性ヨウ素とヨウ素含有アミノ酸のカウティングが除去さ
れる。ウサギには、生体内蛋白質が125Ｉで再び標識付
けされるのを防止するためにヨウ素入りの飲み水を与え
た。
【０１４４】異なった時間に、ヘパリン（2500ＩＵ）を
ウサギに静脈注射してヘパリンの効果を研究した。その
結果を第1１図と第1２図に示す。図において100％は、
ウサギの全血漿容積が体重の５％と仮定して（例えば３
kgのウサギの場合血漿は150ml）、注射量からみて、血
漿が理論的に含有しているはずの放射能に対応するもの
である。
【０１４５】第1１図は、ヘパリンを、予め注射した場
合と、125Ｉ−ＥＣ−ＳＯＤを投与して２，５，10およ
び20分後に投与した場合の結果を示す。標識を付けたＥ
Ｃ−ＳＯＤを注射した後、５〜10分以内に、活性が、理
論的な最大値の約15％まで急速に低下した。ヘパリンを
ＥＣ−ＳＯＤ投与前に注射すると、ＥＣ−ＳＯＤの活性
はごくゆっくりと低下しているが、ほとんど全活性が残
っている。125Ｉ−ＥＣ−ＳＯＤを投与してから２，
５，10および20分後にヘパリンを注射すると、放射能が
急速に増大し、ピークが理論的最大値に達する。
【０１４６】第1２図は、２〜72時間後にヘパリンを注
射した場合を示す。図面からみて活性が急速に増大する
ことは明らかであり、２時間後投与では理論的最大値の
約50％に達し、72時間後投与でも３％に達する。50％ま
ではむしろ急速に低下（２時間で）するようであるが、
その後ＥＣ−ＳＯＤははるかにゆっくりと排泄される。
第1２図における最大値を用い、約18時間の半減期（ｔ
1/2 ）を計算することができる。ほとんどすべての要素
の体内での代謝は小動物の方が速いので、ヒトの場合の
半減期の方がおそらく長いであろう。ヘパリン静注後に
血漿ＥＣ−ＳＯＤが急速に増大するのは（２分以内に最
大値に達する）、放出された125Ｉ−ＥＣ−ＳＯＤが血
管の内皮に局在していることを示し、このことは実施例
８と同じ結論を示唆している。
【０１４７】実施例１１ ヒトＥＣ−ＳＯＤの、豚大動脈内皮との結合 豚の大動脈を畜殺場で収集し、輸送中は冷蔵庫に入れて
保管し、長さ方向にひらいて、1.5cm厚のパースペック
ス（perspex）のブロック間に置いた。上記大動脈の内
面に面している前記ブロックに、直径10mmの孔をあけ
た。このようにして、底部に大動脈皮質を有する10mm直
径のウエルが得られた。440,000cpmの125Ｉ−ＥＣ−Ｓ
ＯＤ（実施例10に記載したのと同様にして標識を付け
た）と、大過剰の標識を付けていないＥＣ−ＳＯＤフラ
クションＣ（121μｇ／ml）とを含有する溶液を作製し
た。溶媒は、ＨＥＰＥＳでpH7.4に緩衝され0.5μｇ／ml
のウシ血清アルブミンを含有する、イーグルの最小必須
培地であった。溶液の150μｌを３つの各ウエルに入
れ、振盪しながら室温で2.5時間培養した。次いで溶液
を吸引除去した。次にウエルを、500μｌの溶液で２回
（振盪しながら２分間づつ）、続いて15ＩＵのヘパリン
を含有する溶媒500μｌで２回（振盪しながら５分間づ
つ）洗浄した。溶液の放射能（添加した放射能の％、３
つのウエルの平均値）は80.4％（培養された最初の溶
液）、2.1％，0.6％（洗浄溶液）、6.5％，2.2％（ヘパ
リンで洗浄）であった。ＳＯＤ酵素の活性は、ひとつの
ウエルからの溶液について測定し、培養した最初の溶液
の除去されたものに84.2％（82.7％）に見出され、最初
のヘパリン洗浄液中に7.1％（7.0％）（ブラケット内の
放射能のデータに対応する）存在することが見出され
た。かくして、ＳＯＤの酵素活性と測定された放射能と
は極めてよく一致していた。このデータは、添加したＥ
Ｃ−ＳＯＤの約20％が前記大動脈の内皮に結合し、ＥＣ
−ＳＯＤの活性がヘパリンの添加によって放出されると
いうことを示している。
【０１４８】実施例１２ 天然および組換え体ＥＣ−ＳＯＤのレクチン類との結合 コンカナバリン ＡＩ、ヒラマメのレクチン（lentil l
ectin）および小麦麦芽のレクチンのセファロースに固
定化したものをファーマシア社（アプサラ、スエーデ
ン）から入手した。各ゲルの２mlをクロマトグラフィの
カラムに充填した。50mMリン酸ナトリウム（pH7.4）＋
0.25Ｍ ＮａＣｌを溶離液として用いた。0.5mlの溶離
緩衝液に溶解した、200単位（1.7μｇ）の天然臍帯ＥＣ
−ＳＯＤもしくは組換え体ＥＣ−ＳＯＤを前記のレクチ
ンのカラムに入れた。次いで3.5mlの溶離緩衝液を入れ
た。カラムを10mlの溶離緩衝液で洗浄した。次いで結合
されたＥＣ−ＳＯＤを、14ml 0.5Ｍα−メチルマンノシ
ドを用いて（コンカナバリンＡセファロースとヒラマメ
レクチンセファロース）、0.5Ｍ Ｎ−アセチルグルコ
ースアミン上（小麦麦芽のレクチン−セファロース）で
溶離した。ＳＯＤの活性は、カラムから溶出する液体に
ついて測定した。
【０１４９】天然のＥＣ−ＳＯＤの98％と組換え体ＥＣ
−ＳＯＤの96％がレンチルレクチン−セファロースと結
合した。天然のＥＣ−ＳＯＤの99％組換え体ＥＣ−ＳＯ
Ｄの96％がレンチルレクチン−セファロールと結合し
た。また天然ＥＣ−ＳＯＤの61％と組換え体ＥＣ−ＳＯ
Ｄの95％が小麦麦芽レクチン−セファロースと結合し
た。
【０１５０】コンカナバリンＡとレンチルレクチンに対
する親和性は、天然と組換え体のＥＣ−ＳＯＤの両者
が、グルコシル残基とマンノシル残基を、それらの炭水
化物部分に有しているということを示している。小麦麦
芽レクチンに対する親和性は、Ｎ−アセチル−グルコー
スアミニル残基の存在を示す。小麦麦芽レクチンとの結
合に関する天然のＥＣ−ＳＯＤの異質性（heterogeneit
y）は、臍帯内に存在しているかまたは単離工程中の臍
帯ホモジネート内に存在している際に、この酵素の炭水
化物の部分が一部分解したということによって、多分説
明されるであろう。組換え体酵素が分解酵素類にさらさ
れる危険は少ない。結論として、レクチンについてのこ
れらの研究から推論されるように、天然のＥＣ−ＳＯＤ
と組換え体ＥＣ−ＳＯＤの炭水化物の部分は類似したも
のである。
【０１５１】実施例１３ 天然の臍帯ＥＣ−ＳＯＤと組換え体ＥＣ−ＳＯＤのヘパ
リン−セファロースによる分析 約500単位（4.4μｇ）の天然ＥＣ−ＳＯＤ Ｃと組換え
体ＥＣ−ＳＯＤとを、実施例９に記載したのと同様にし
てヘパリン−セファロースのクロマトグラフィに付し
た。両酵素ともにＮａＣｌグラジエント中の0.52Ｍ溶液
で溶出することが分かった。このように天然と組換え体
ＥＣ−ＳＯＤは同一の挙動を示し、その結果、組み換え
体ＥＣ−ＳＯＤはＣタイプであることが立証された。
【０１５２】実施例１４ ＥＣ−ＳＯＤの分子内の銅と亜鉛の含有量 天然の臍帯ＥＣ−ＳＯＤと組換え体ＥＣ−ＳＯＤとの銅
と亜鉛の含有量は、パーキン−エルマツィーマン 303
（Perkin-Elmer Zeeman 303）とＨＧＡ装置とのグラァ
ファイト炉内での分子吸光光度法によって測定した。Ｅ
Ｃ−ＳＯＤ蛋白質の量と、その製剤内の銅と亜鉛の量を
比較した。天然ＥＣ−ＳＯＤ（四量体）の１モルは3.97
モルの銅と4.50モルの亜鉛を含有していることが分かっ
た。組換え体ＥＣ−ＳＯＤは、モル酵素当り3.98モルの
銅と4.45モルの亜鉛を含有していた。このようにこの二
つの製剤は同量の銅と亜鉛を含有している。この試験結
果によって１モルのＥＣ−ＳＯＤ当り４モルの銅を有す
るという以前の知見（Marklund, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 79, 1982年，7634〜7638頁）が確認されてい
る。また上記の研究では、約４つの亜鉛原子が見出され
たが、試料が不足し亜鉛による汚染の可能性があったの
で、該酵素中に亜鉛が存在するということは確認するこ
とができなかった。この発明の試験結果は、ＥＣ−ＳＯ
Ｄ分子が４つの亜鉛原子を有するということを立証して
いる。
【０１５３】実施例１５ ヒトＥＣ−ＳＯＤに対するモノクロナル抗体の製造 臍帯から製造したＥＣ−ＳＯＤ Ｃ（実施例４〜６）を
マウスに注射した。数ヶ月後、そのマウスにＥＣ−ＳＯ
Ｄを３日間連続して注射した。４日目に、膵臓を取り出
して破砕した。脾臓細胞を、標準技術（St. GrothとSch
eidegger, J. Immunol. Methods 35, 1980年，１〜21
頁）によってマウス骨髄腫セルラインと融合させた。抗
−ＥＣ−ＳＯＤを産生するクローンをＥＬＩＳＡ法（Po
uillardとHoffman, Meshods in Enzymology, 92, 1983
年，168頁）によって同定し、さらにサブクローンし
た。マウスの腹腔内での培養による抗体の大量生産用
に、最終的に、２つのクローン14，Ｂ７と６，Ｈ６を選
択した。次いでメーカー（ファーマシヤ社、アプサラ、
スエーデン）が推奨するのと同様にして蛋白質・Ａ−セ
ファロースに吸着させおよびそれから脱着させることに
よって、腹水から抗体を単離し、カラムからの溶離は
0.1Ｍグリシン−塩酸pH3.0で行った。溶離後直ちに、集
めたＩｇＧをpH7.0にタイトレートし、次いで50mMトリ
ス・塩酸pH8.0＋0.15ＭＮａＣｌ＋0.02％ ＮａＮ3に対
して透析した。
【０１５４】実施例１６ モノクロナル抗−ＥＣ−ＳＯＤのＣＮＢ３−活性化セフ
ァロースへの固定化 “６．Ｈ ６”モノクロナル抗体はｎ−ＥＣ−ＳＯＤと
極めて強力に結合する（Ｋｄ＜・1012Ｍ）ことが見出さ
れたので、“14Ｂ ７”抗体（Ｋｄ〜166Ｍ）をＥＣ−
ＳＯＤの精製用に選択した。ＣＮＢｒで活性化されたセ
ファロースにカップリングする前に、ＩｇＧ溶液中のア
ジ化物を除去しなければならず（実施例１５参照）、緩
衝液はカップリング緩衝液（＝0.1Ｍ炭酸ナトリウムpH
8.3＋0.5Ｍ ＮａＣｌ）に変えねばならなかった。この
操作は、メーカー（ファーマシヤ社、アプサラ、スエー
デン）が推奨する方法によりＰＤ10カラムを用いて行っ
た。ＣＮＢｒ活性化セファロースを、メーカー（ファー
マシヤ社、アプサラ、スエーデン）が推奨するとおりに
して膨潤させて作製した。次いでそのＣＮＢｒ活性化セ
ファロースを、ゲルのml当り約２mgのＩｇＧのカップリ
ング密度で生産されるような量で、ＩｇＧ溶液（カップ
リング緩衝液による溶液）に添加した。得られた混合物
を、振盪機上、室温で約２時間培養した。次いで緩衝液
をゲルから除去し残留蛋白質を分析した。97％以上のカ
ップリングが達成された。次にＩｇＧがカップリングさ
れたゲルに残っている活性基を、１Ｍエタノールアミン
とともに、pH9.3、室温で２時間培養することによって
ブロックした。過剰のエタノールアミンと吸着された蛋
白質を最終的にカップリング緩衝液（上記参照）と0.1
Ｍ酢酸ナトリウムpH4.0＋0.5Ｍ ＮａＣｌとで交互に４
〜５回洗浄して除去した。得られたゲルを50mMリン酸カ
リウムpH7.4＋0.5Ｍ ＮａＣｌ＋0.02％ＮａＮ3中に貯
蔵した。モノクロナルＩｇＧ−セファロースの最大結合
容量を、過剰の精製ＥＣ−ＳＯＤ（実施例４〜６）とと
もに３時間培養し次いで遠心分離後に上澄液中に残って
いるＥＣ−ＳＯＤ活性を分析することによって測定し
た。得られた結果を、セファロース４Ｂを用いた類似の
培養と比較した。
【０１５５】ＥＣ−ＳＯＤ含有のカップリング緩衝液の
１mlに、モノクロナル抗−ＥＣ−ＳＯＤ−セファロース
の50％懸濁液を、10，50，100および100μｌ添加した。
セファロースＨＢの80％懸濁液の同じ緩衝液内での培養
を併行して行った。溶液を室温で３時間培養した。遠心
分離した後、上澄液に残っているＥＣ−ＳＯＤ活性を測
定した。得られた測定値を用いて、ゲルのＥＣ−ＳＯＤ
結合容量は50％ゲル懸濁液のml当り約〜6000単位のＥＣ
−ＳＯＤ（ゲルのml当り〜12000Ｕ）であるということ
が計算できた。この数値は、理論的最大結合容量の約６
％に等しく、ランダムにカップルされたＩｇＧによって
一般的に得られる数値にごく近い値である。
【０１５６】実施例１７ モノクロナル抗−ＥＣ−ＳＯＤセファロースで印を付け
た組換え体ＥＣ−ＳＯＤの単離 全精製工程を＋４℃で行った。ml当り約300ＵのＥＣ−
ＳＯＤ活性（〜2.6μｇ）を有する、ＣＨＯ−Ｋ１／ｐ
ＰＳネオ−１８細胞の培養物から得た約５ｌの培地を遠
心分離に付してすべての細胞片と沈澱を除去した。ＥＣ
−ＳＯＤを培地に結合させるために（〜1,500,000単
位）、約125mlのモノクロナル抗−ＥＣ−ＳＯＤ−セフ
ァロースを用いた（実施例１６）。得られたＩｇＧ−セ
ファロースを直径５cm高さ約6.5cmのクロマトグラフィ
のカラムに充填した。このカラムは、試料を入れる前
に、50mMリン酸ナトリウム＋0.5Ｍ ＮａＣｌ pH7.0で
洗浄した。培養基を10ml／ｈの速度で入れ、280nmの吸
光度を追跡した。ＩｇＧ−セファロースに緩く結合した
蛋白質が50mMリン酸ナトリウム pH6.5＋0.5Ｍ ＮａＣ
ｌで溶離された。溶離はＡＤ280が著しく低くなるまで
続けた。次いでカラムを、50mM ＡＭＰ（＝１−アミノ
メチルプロパノール）−ＨＣｌ、 pH9.0の650mlで洗浄
し、ＥＣ−ＳＯＤを、〜１ｌの50mM ＡＭＰ−ＨＣｌ、
pH9.0＋１Ｍ ＫＳＣＮで溶離した。その溶離速度は10
0ml／ｈであった。ＥＣ−ＳＯＤ活性と280nmにおける吸
光度とを測定し、溶出容積に対してプロットした（第１
３図）。蛋白質のピークの後に残っている280nmの吸光
度はＫＳＣＮによるものである。次いでＥＣ−ＳＯＤ活
性のピークの部分を集めた。下記ステップによって、イ
オン強度を低下させて酵素のイオン交換ゲルとの結合を
最適にするために、前記の集めたものを約14容量部の蒸
留水で希釈し最後に２Ｍ ＡＭＰでタイトレートしてpH
を8.5にした。ＩｇＧ親和性工程における回収率は60％
であった。
【０１５７】約10mlのＤＥＡＥ−セファセルを50mMリン
酸ナトリウムpH6.5で洗浄し、直径が５cm高さが約0.5cm
のクロマトグラフィカラムに充填した。ＩｇＧカラムか
ら得たＥＣ−ＳＯＤ収集液の希釈液を、ポンプを用いて
60ml／ｈの速度で上記カラムを通過させることによって
ＤＥＡＥ−セファセルに吸着させた。次いで280nmにお
ける吸光度が零に近くなるまで、カラムを50mMリン酸ナ
トリウムpH8.5で洗った。酵素を、50mMリン酸ナトリウ
ムpH8.5＋0.25Ｍ ＮａＣｌで溶離した。280nmにおける
吸光度とＥＣ−ＳＯＤ活性を測定し溶出容積に対してプ
ロットした（第１４図）。ピークのフラクションを集め
て50mMリン酸ナトリウムpH6.5に対して透析し、約６ml
まで濃縮した。この段階での回収率は約100％であっ
た。
【０１５８】ＥＣ−ＳＯＤをヘパリン−セファロース上
で吸着／脱着させることによって最終的に精製した。メ
ーカー（ファーマシヤ社、アプサラ、スエーデン）が推
奨するとおりにして12mlのヘパリン−セファロースを作
製し、まず50mMリン酸ナトリウムpH6.5＋１Ｍ ＮａＣ
ｌで洗い次に50mMリン酸ナトリウムpH6.5で洗浄した。
得られたヘパリン−セファロースゲルを直径が2.5cm
（高さは約2.5cm）のクロマトグラフィカラムに充填し
た。ＤＥＡＥ−セファセルカラムから集めて透析して濃
縮した前記の液（ＥＣ−ＳＯＤの活性が約185000Ｕ／ml
の６ml）を、上記のヘパリン−セファロースカラムに注
入速度10ml／ｈで注入した。280nmにおける吸光度を追
跡した。溶離は50mMリン酸ナトリウムpH6.5を用い溶離
速度20ml／ｈで開始した。280nmにおける吸光度がベー
スラインに近づいたとき、ＥＣ−ＳＯＤを、０〜１Ｍ
ＮａＣｌのＮａＣｌグラジエントで溶離した。グラジエ
ントの容積は270mlであった。ＥＣ−ＳＯＤを高濃度の
ＮａＣｌから保護するために、フラクションを蒸留水で
希釈した（グラジエント使用開始時から）。カラムの溶
出端から出ているプラスチックチューブにＴ型管を挿入
し、このＴ型管からポンプを用いて蒸留水を溶出液にカ
ラム溶離速度の２倍の速度で注入した。
【０１５９】ＥＣ−ＳＯＤ活性は、実施例６におけるＣ
ピークとほぼ同じＮａＣｌ濃度でひとつのピーク（第１
５図）として溶出した。ピークの中央部を集めた（プー
ルＩ）。プールＩの比活性（Ｕ／mlをＡＤ280で割った
数値）は88,400であった。同じ手順で臍帯ホモジネート
から作製した天然のＥＣ−ＳＯＤ（実施例１参照）の比
活性は88,200であった。それ故、これらの数値は、先に
刊行された刊行物の値（Marklund, Poc. Natl. Acad. S
ci. USA 79, 1982年，7634〜7638頁）と殆ど同一か幾分
高い値である。これら２つの製剤を、実施例12〜14と実
施例18〜20とで分析した。前記のピークの左右両側の部
分を集めた（プールII）。これらのプールを濃縮し、50
mMリン酸ナトリウムpH6.6に対して透析した。ＥＣ−Ｓ
ＯＤの収率はヘパリン−セファロース段階で約60％であ
った。これらのプールは全体で600,000Ｕ（約5.3mg）を
含有していたが、これはＣＨＯ−Ｋ１／ｐＰＳ３ネオ−
18培養基のもとの活性の40％であった。
【０１６０】実施例１８ 天然ＥＣ−ＳＯＤと組換え体ＥＣ−ＳＯＤとの分子の大
きさの、ゲルクロマトグラフィによる測定 臍帯由来の天然酵素と組換え体酵素との分子量を、セフ
ァクリルＳ−300カラム上のゲル濾過法によって推定し
た。そのカラム（直径1.6cm、長さ96cm）を10mMリン酸
カリウムpH7.4＋0.15Ｍ ＮａＣｌを溶離液として用い
て溶離した。カラムには、フェリチン（440,000）、Ｉ
ｇＧ（150,000）、ウシ血清アルブミン（67,000）、オ
ボアルブミン（43,000）、キモトリプシノーゲン（25,0
00）およびリボヌクレアーゼ（13,700）（括弧内は分子
量を示す）で目盛り付けをした。 天然のＥＣ−ＳＯＤ
と組換え体ＥＣ−ＳＯＤはそれぞれ、分子量が136,000
と51,000の位置のカラムから溶出した。したがって組換
え体ＥＣ−ＳＯＤの方がわずかに大きいようである。こ
の差異の一部分は、下記のＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験（実施
例19）に見られるような天然酵素のサブユニットの部分
的な分解によるのかもしれない。小麦麦芽レクチン上で
のクロマトグラフィにおける天然ＥＣ−ＳＯＤの異質性
も（実施例12）、酵素の炭水化物の部分の部分的分解を
示すものである。
【０１６１】実施例１９ ドデシル硫酸ナトリウムの存在下でのグラジエント ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法による天然臍帯ＥＣ−
ＳＯＤおよび組換え体ＥＣ−ＳＯＤの分析 天然ＥＣ−ＳＯＤおよび組換え体ＳＯＤのサブユニット
の分子量をグラジエントゲル（ＳＤＳの存在下10〜15
％）の電気泳動法によって比較した。
【０１６２】各酵素（天然ＥＣ−ＳＯＤと組換え体ＥＣ
−ＳＯＤ）の約25μｇを凍結乾燥し、次いで、５％スク
ロース、５mM ＥＤＴＡ、５％２−メルカプトエタノー
ルおよび２％ＳＤＳの試料混合物50μｇを含有する、0.
4Ｍホウ酸と0.41ＭトリスpH8.64とで構成される緩衝液
に溶解した。得られた試料を５分間沸騰させすぐに氷で
冷却した。各試料の約１μｌ（約0.2μｇ）をファーマ
シヤ社のファスト・システム・グラジエント（Phast Sy
stem gradient）（10〜15％）ポリアクリルアミドゲル
に適用し、次いでそのメーカーで推奨するファーマシア
・ファスト・システム・インストルメント上をランさせ
た（ファーマシア社、アプサラ、スエーデン、ファスト
・システムの分離技術ファイル第110号）。得られたゲ
ルをクーマシーブリリアントブルーで染色した（第１６
図参照）。左から右へのレインはそれぞれ、組換え体Ｅ
Ｃ−ＳＯＤ、天然の臍帯ＥＣ−ＳＯＤおよび分子量マー
カー（94,000, 67,000, 43,000, 29,000, 20,100および
14,400）の混合物のレインである。ＥＣ−ＳＯＤの移動
度と類似の移動度を有するマーカーは分子量が29,000で
ある。ＥＣ−ＳＯＤの移動度には何ら不純物は検出でき
なかった。組換え体ＥＣ−ＳＯＤは、約32,000分子量を
有するひとつのバンドを有する。天然のＥＣ−ＳＯＤは
２つのバンドを示し、大きな分子量のものは明らかに組
換え体ＥＣ−ＳＯＤと同じ分子量を有し、小さな分子量
のものは約28,000の分子量を有する。２つのバンドの相
対量は、天然ＥＣ−ＳＯＤの製剤毎に変化するが、その
異質性は恐らく酵素の部分的な分解によるものであろ
う。
【０１６３】実施例２０ 天然ＥＣ−ＳＯＤと組換え体ＥＣ−ＳＯＤのアミノ酸組
成、およびＥＣ−ＳＯＤをコードするｃＤＮＡ配列から
推定されるアミノ酸配列の比較 天然の臍帯ＥＣ−ＳＯＤと組換え体ＥＣ−ＳＯＤのアミ
ノ酸組成を第II表に示す。トリプトファンは、アミノ酸
分析機ではよい信頼性では得られないので比較の対象に
入れなかった。天然酵素と組換え体酵素とは組成がほと
んど同じであることはこの表から明らかである。ｃＤＮ
Ａ配列から推定される数値との一致も極めて良好であ
る。その結果は、天然酵素と組換え体酵素とは実質的に
同一であり、ｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列が正
しいということを示している。
【０１６４】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＥＣ−ＳＯＤ含有物質の抗ＥＣ−ＳＯＤ−セフ
ァロースに対する免疫吸着後の蛋白とＥＣ−ＳＯＤの溶
出パターンを示すグラフである。
【図２】ＥＣ−ＳＯＤのＤＥＡＥ−セファセルからの溶
出パターンを示すグラフである。
【図３】ＥＣ−ＳＯＤのヘパリン−セファロースからの
溶出パターンを示すグラフである。
【図４】約20000個のλｇｔ11のプラークが移されたニ
トロセルロースフィルターの１つの４８塩基のプローブ
によるハイブリダイゼーションパターンを示すオートラ
ジオグラムである。
【図５】ＥＣ−ＳＯＤのＤＮＡ配列及びそれから引き出
されたアミノ酸配列を示す。
【図６】ＥＣ−ＳＯＤのＤＮＡ配列及びそれから引き出
されたアミノ酸配列を示す。
【図７】プラスミドpPS3の構造を示す。
【図８】血漿ＥＣ−ＳＯＤに対するヘパリン静脈注射の
効果を示す。
【図９】静脈注射ヘパリンのＥＣ−ＳＯＤ遊離活性の投
与量応答を示す。
【図１０】ヘパリンセファロース上での血漿の分離を示
す。
【図１１】125Ｉ−ラベルヒトＥＣ−ＳＯＤのウサギへ
の注射の効果及びヘパリン注射の効果を示すグラフであ
る。
【図１２】125Ｉ−ラベルヒトＥＣ−ＳＯＤのウサギへ
の注射の効果及びヘパリン注射の効果を示すグラフであ
る。
【図１３】モノクロナル抗ＥＣ−ＳＯＤセファロースか
らの組換え体ＥＣ−ＳＯＤの溶出パターンを示すグラフ
である。
【図１４】組換え体ＥＣ−ＳＯＤのＤＥＡＥ−セファセ
ルからの溶出パターンを示すグラフである。
【図１５】組換え体ＥＣ−ＳＯＤのヘパリン−セファロ
ースからの溶出パターンを示すグラフである。
【図１６】天然及び組換え体ＥＣ−ＳＯＤのドデシル硫
酸ナトリウム存在下での勾配ポリアクリルアミドゲル上
の電気泳動を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/44 ＡＣＢ Ａ６１Ｋ 37/50 ＡＢＧ ＡＣＥ ＡＢＷ ＡＣＳ ＡＣＢ ＡＣＶ ＡＣＥ ＡＤＡ ＡＣＳ ＡＤＮ ＡＣＶ Ｃ１２Ｎ 5/10 ＡＤＡ 9/02 ＡＤＮ Ｃ１２Ｐ 21/08 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＥＣ−ＳＯＤをエンコードし、かつ下記
    ＤＮＡ配列： 【外１】 【外２】 又はその蛋白質の別のアミノ酸配列を生じないヌクレオ
    チド置換体を包含しかつ天然ＥＣ−ＳＯＤのもつスーパ
    ーオキシドを不均化する特性を有するポリペプチドをエ
    ンコードする前記ＤＮＡ配列の変形配列からなるＤＮＡ
    フラグメント。
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