FI100252B - Menetelmä superoksididismutaasin valmistamiseksi ja sitä koodittava DN A-fragmentti, ilmentymisvektori ja solu - Google Patents
Menetelmä superoksididismutaasin valmistamiseksi ja sitä koodittava DN A-fragmentti, ilmentymisvektori ja solu Download PDFInfo
- Publication number
- FI100252B FI100252B FI871853A FI871853A FI100252B FI 100252 B FI100252 B FI 100252B FI 871853 A FI871853 A FI 871853A FI 871853 A FI871853 A FI 871853A FI 100252 B FI100252 B FI 100252B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- sod
- dna
- cell
- sequence
- vector
- Prior art date
Links
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims description 20
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims description 7
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 title abstract description 17
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 title abstract description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 39
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 133
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 100
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 74
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 74
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 74
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 53
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims description 46
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims description 44
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 37
- 101000836222 Homo sapiens Extracellular superoxide dismutase [Cu-Zn] Proteins 0.000 claims description 31
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 31
- 102000043543 human SOD3 Human genes 0.000 claims description 31
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 21
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 18
- 108700001268 Extracellular superoxide dismutase [Cu-Zn] Proteins 0.000 claims description 16
- 102100027186 Extracellular superoxide dismutase [Cu-Zn] Human genes 0.000 claims description 16
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 13
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 5
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims 4
- DEFJQIDDEAULHB-IMJSIDKUSA-N L-alanyl-L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DEFJQIDDEAULHB-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims 2
- 108010056243 alanylalanine Proteins 0.000 claims 2
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 claims 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 claims 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 claims 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 22
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 8
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 abstract description 6
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 abstract 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 abstract 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 abstract 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 72
- 101100366137 Mesembryanthemum crystallinum SODCC.1 gene Proteins 0.000 description 70
- 101100096142 Panax ginseng SODCC gene Proteins 0.000 description 70
- 101150017120 sod gene Proteins 0.000 description 70
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 63
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 60
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 58
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 44
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 44
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 36
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 35
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 35
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 34
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 33
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 32
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 32
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 32
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 23
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 23
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 23
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 22
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 22
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 21
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 21
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 19
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 19
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 15
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 13
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 13
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 13
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 13
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 13
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 13
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 13
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 13
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 13
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 13
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 12
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 11
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 11
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 11
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 210000000540 fraction c Anatomy 0.000 description 11
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 11
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 11
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 11
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 11
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- HIMXGTXNXJYFGB-UHFFFAOYSA-N alloxan Chemical compound O=C1NC(=O)C(=O)C(=O)N1 HIMXGTXNXJYFGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 9
- 108010093894 Xanthine oxidase Proteins 0.000 description 9
- OFCNXPDARWKPPY-UHFFFAOYSA-N allopurinol Chemical compound OC1=NC=NC2=C1C=NN2 OFCNXPDARWKPPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229960003459 allopurinol Drugs 0.000 description 9
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 9
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 9
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 9
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 8
- 102100033220 Xanthine oxidase Human genes 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 8
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 8
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 8
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 8
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 8
- 230000003541 clastogenic effect Effects 0.000 description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 7
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 7
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 7
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 6
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 6
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 6
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 6
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 6
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 5
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 5
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 5
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 5
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical group [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 5
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 5
- 150000002303 glucose derivatives Chemical class 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- TUJKJAMUKRIRHC-UHFFFAOYSA-N hydroxyl Chemical compound [OH] TUJKJAMUKRIRHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 5
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 5
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000219739 Lens Species 0.000 description 4
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 4
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 231100000505 clastogenic Toxicity 0.000 description 4
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 4
- 235000021251 pulses Nutrition 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 4
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 4
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 4
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102100039160 Amiloride-sensitive amine oxidase [copper-containing] Human genes 0.000 description 3
- 108010028700 Amine Oxidase (Copper-Containing) Proteins 0.000 description 3
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 3
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 3
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 3
- 108010013563 Lipoprotein Lipase Proteins 0.000 description 3
- 102100022119 Lipoprotein lipase Human genes 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 3
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 3
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 102000004211 Platelet factor 4 Human genes 0.000 description 3
- 108090000778 Platelet factor 4 Proteins 0.000 description 3
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 3
- 238000006701 autoxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 3
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 238000007323 disproportionation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 210000000224 granular leucocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 3
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 229940108519 trasylol Drugs 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 3
- UHEPSJJJMTWUCP-DHDYTCSHSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N UHEPSJJJMTWUCP-DHDYTCSHSA-N 0.000 description 2
- KODLUXHSIZOKTG-UHFFFAOYSA-N 1-aminobutan-2-ol Chemical compound CCC(O)CN KODLUXHSIZOKTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N Cyanide Chemical compound N#[C-] XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 2
- 206010037596 Pyelonephritis Diseases 0.000 description 2
- 206010038687 Respiratory distress Diseases 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 206010047139 Vasoconstriction Diseases 0.000 description 2
- 108010046516 Wheat Germ Agglutinins Proteins 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N adrenaline Chemical compound CNCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 2
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 2
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 2
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 2
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 2
- 231100000516 lung damage Toxicity 0.000 description 2
- 210000003622 mature neutrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 2
- 201000008383 nephritis Diseases 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 108010070915 orgotein Proteins 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 2
- IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M potassium bromide Chemical compound [K+].[Br-] IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N pyrogallol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1O WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 229910001428 transition metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 2
- 230000025033 vasoconstriction Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BIIBYWQGRFWQKM-JVVROLKMSA-N (2S)-N-[4-(cyclopropylamino)-3,4-dioxo-1-[(3S)-2-oxopyrrolidin-3-yl]butan-2-yl]-2-[[(E)-3-(2,4-dichlorophenyl)prop-2-enoyl]amino]-4,4-dimethylpentanamide Chemical compound CC(C)(C)C[C@@H](C(NC(C[C@H](CCN1)C1=O)C(C(NC1CC1)=O)=O)=O)NC(/C=C/C(C=CC(Cl)=C1)=C1Cl)=O BIIBYWQGRFWQKM-JVVROLKMSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DXBHBZVCASKNBY-UHFFFAOYSA-N 1,2-Benz(a)anthracene Chemical compound C1=CC=C2C3=CC4=CC=CC=C4C=C3C=CC2=C1 DXBHBZVCASKNBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJQZXCPWAGYPSD-UHFFFAOYSA-N 1,3,4,6-tetrachloro-3a,6a-diphenylimidazo[4,5-d]imidazole-2,5-dione Chemical compound ClN1C(=O)N(Cl)C2(C=3C=CC=CC=3)N(Cl)C(=O)N(Cl)C12C1=CC=CC=C1 FJQZXCPWAGYPSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HBOMLICNUCNMMY-KJFJCRTCSA-N 1-[(4s,5s)-4-azido-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1O[C@H](CO)[C@@H](N=[N+]=[N-])C1 HBOMLICNUCNMMY-KJFJCRTCSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010063409 Acarodermatitis Diseases 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- -1 Amino- Chemical class 0.000 description 1
- 206010002660 Anoxia Diseases 0.000 description 1
- 241000976983 Anoxia Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L Brilliant Blue Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101100163949 Caenorhabditis elegans asp-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 206010008111 Cerebral haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 241001022645 Chondria <beetle> Species 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- 208000037088 Chromosome Breakage Diseases 0.000 description 1
- 108010038061 Chymotrypsinogen Proteins 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 206010063057 Cystitis noninfective Diseases 0.000 description 1
- 102000000634 Cytochrome c oxidase subunit IV Human genes 0.000 description 1
- 108050008072 Cytochrome c oxidase subunit IV Proteins 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 1
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 1
- 208000011200 Kawasaki disease Diseases 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 235000014647 Lens culinaris subsp culinaris Nutrition 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 101000878457 Macrocallista nimbosa FMRFamide Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- UBQYURCVBFRUQT-UHFFFAOYSA-N N-benzoyl-Ferrioxamine B Chemical compound CC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCN UBQYURCVBFRUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 1
- 206010029098 Neoplasm skin Diseases 0.000 description 1
- 101100366079 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) vsp-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 229940123973 Oxygen scavenger Drugs 0.000 description 1
- 108010064719 Oxyhemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 229920005439 Perspex® Polymers 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 206010037423 Pulmonary oedema Diseases 0.000 description 1
- 206010063897 Renal ischaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010063837 Reperfusion injury Diseases 0.000 description 1
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 238000010632 SOD assay Methods 0.000 description 1
- 241000447727 Scabies Species 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000702208 Shigella phage SfX Species 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101710119418 Superoxide dismutase [Mn] Proteins 0.000 description 1
- 101710202572 Superoxide dismutase [Mn], mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 102100032891 Superoxide dismutase [Mn], mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 201000009594 Systemic Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 206010042953 Systemic sclerosis Diseases 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006993 Weiss annulation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000005773 Xanthine dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010091383 Xanthine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000011358 absorbing material Substances 0.000 description 1
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940009456 adriamycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000007953 anoxia Effects 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 210000001742 aqueous humor Anatomy 0.000 description 1
- 239000010425 asbestos Substances 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000001479 atomic absorption spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 206010006475 bronchopulmonary dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007675 cardiac surgery Methods 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 210000001627 cerebral artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 231100000244 chromosomal damage Toxicity 0.000 description 1
- 231100000005 chromosome aberration Toxicity 0.000 description 1
- YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N cibacron blue Chemical compound C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C1NC(C=C1S(O)(=O)=O)=CC=C1NC(N=1)=NC(Cl)=NC=1NC1=CC=CC=C1S(O)(=O)=O YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005796 circulatory shock Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 150000004699 copper complex Chemical class 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000011461 current therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 1
- 229960000958 deferoxamine Drugs 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N diazepam Chemical compound N=1CC(=O)N(C)C2=CC=C(Cl)C=C2C=1C1=CC=CC=C1 AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- BZCOSCNPHJNQBP-OWOJBTEDSA-N dihydroxyfumaric acid Chemical compound OC(=O)C(\O)=C(/O)C(O)=O BZCOSCNPHJNQBP-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000020774 essential nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N flutamide Chemical compound CC(C)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C(F)(F)F)=C1 MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003918 fraction a Anatomy 0.000 description 1
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 239000010439 graphite Substances 0.000 description 1
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 150000002432 hydroperoxides Chemical class 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 238000001746 injection moulding Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 208000020658 intracerebral hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 1
- OBBCSXFCDPPXOL-UHFFFAOYSA-N misonidazole Chemical compound COCC(O)CN1C=CN=C1[N+]([O-])=O OBBCSXFCDPPXOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950010514 misonidazole Drugs 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008722 morphological abnormality Effects 0.000 description 1
- 208000001725 mucocutaneous lymph node syndrome Diseases 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010309 neoplastic transformation Effects 0.000 description 1
- 210000004493 neutrocyte Anatomy 0.000 description 1
- NXFQHRVNIOXGAQ-YCRREMRBSA-N nitrofurantoin Chemical compound O1C([N+](=O)[O-])=CC=C1\C=N\N1C(=O)NC(=O)C1 NXFQHRVNIOXGAQ-YCRREMRBSA-N 0.000 description 1
- 229960000564 nitrofurantoin Drugs 0.000 description 1
- 150000004957 nitroimidazoles Chemical class 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 230000006548 oncogenic transformation Effects 0.000 description 1
- 229960004534 orgotein Drugs 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 1
- 210000004923 pancreatic tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000005502 peroxidation Methods 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 1
- 150000004633 phorbol derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 210000005059 placental tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 235000021085 polyunsaturated fats Nutrition 0.000 description 1
- 230000015323 positive regulation of phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940116357 potassium thiocyanate Drugs 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 230000009979 protective mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001012 protector Effects 0.000 description 1
- 208000005333 pulmonary edema Diseases 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 239000002213 purine nucleotide Substances 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003222 pyridines Chemical class 0.000 description 1
- 229940079877 pyrogallol Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000003578 releasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 229910052895 riebeckite Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000005687 scabies Diseases 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 1
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- TUGDLVFMIQZYPA-UHFFFAOYSA-N tetracopper;tetrazinc Chemical compound [Cu+2].[Cu+2].[Cu+2].[Cu+2].[Zn+2].[Zn+2].[Zn+2].[Zn+2] TUGDLVFMIQZYPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000035408 type 1 diabetes mellitus 1 Diseases 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/44—Oxidoreductases (1)
- A61K38/446—Superoxide dismutase (1.15)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/16—Central respiratory analeptics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
Description
χ 100252
Menetelmä superoksididismutaasin valmistamiseksi ja sitä koodittava DNA-fragmentti, ilmentymisvektori ja solu Tämä keksintö koskee menetelmää erään superoksidi-5 dismutaasin (EC-SOD) valmistamiseksi ja sitä koodittavia eristettyjä tai rekombinantteja DNA-fragmentteja, replikoitavia ilmentymisvektoreita ja soluja.
Hapen ja sellaisten kehon biokemiallisten yhdisteiden kuin proteiinien, hiilihydraattien, rasvojen ja 10 nukleiinihappojen välisiin reaktioihin liittyy hyvin vahva termodynaaminen pakotevoima. Jos tällaiset reaktiot tapahtuvat loppuun, muodostuu lopputuotteina vettä, hiilidioksidia ja joukko jätetuotteita samanaikaisesti kun vapautuu suuria määriä energiaa. Biologisten yhdisteiden 15 hapettaminen on elävien organismien energian lähde. Onneksi tällaiset reaktiot tapahtuvat reaktioesteiden vuoksi itsestään hvyin hitaasti. Nämä esteet voitetaan väliai-neenvaihdunnassa entsyymien avulla, ja lopullinen reaktio hapen kanssa tapahtuu mitokondrioissa, joissa happi 20 pelkistyy neljällä elektronilla vedeksi, ilman että vapautuu mitään välituotteita. Reaktion suorittaa sytokromioksi-daasikompleksi elektroninsiirtoketjussa ja energia sitoutuu ATP:n muodostukseen.
Kuitenkin hapen suora neliasteinen pelkistyminen ve-:* 25 deksi on melkein ainutlaatuista, ja kun happi reagoi itses tään tai entsyymien katalysoimana, se on mekaanisista syistä pakotettu reagoimaan yhden asteen kerrallaan (entsyymien katalysoimat reaktiot vaativat joskus kaksi astetta). Muodostuu sarja reaktiokykyisiä ja myrkyllisiä välituottei-30 ta, nimittäin superoksidiradikaali (02# ), vetyperoksidi (H202) 3a hydroksyyliradikaali (OH#), tässä järjestyksessä, kuten alla on esitetty: e e *2H e *H e~*H* 35 °2 °2*~ ” H2°2 0H* 2H20 superoksidi- vetyper- hydroksyyli- anicniradikaali oksidi radikaali 2 100252
Kaksi näistä, muodot O2» ja OH*, omaavat yksittäisen parittoman elektronin, ja niitä kutsutaan sen vuoksi vapaiksi radikaaleiksi. Muutaman prosentin kehon hapenkulutuksesta on arvioitu johtavan myrkyllisten pelkistysvä-5 lituotteiden muodostumiseen. Hapen myrkylliset vaikutukset johtuvat pääasiallisesti näiden välituotteiden toiminnasta.
Happi itse reagoi useimpien biokemiallisten yhdisteiden kanssa hitaasti. Myrkylliset reaktiot alkavat yleensä 10 happiradikaaleja synnyttävistä prosesseista, jotka happi-radikaalit aiheuttavat itse suoraa vahinkoa biokemiallisille yhdisteille tai aloittavat ketjureaktioita, joihin osallistuu happi.
Jotkut yhdisteet reagoivat itsestään hapen kanssa, 15 s.o. ne autoksidoituvat. Käytännöllisesti katsoen kaikis ta autoksidaatioista on seurauksena myrkyllisten hapenpel-kistysvälituotteiden muodostuminen. Adrenaliinin, pyrogal-lolin ja useiden muiden yhdisteiden autoksidoituminen johtaa superoksidiradikaalin muodostumiseen. Superoksidiradi-20 kaali vapautuu myös, kun methemoglohiini muodostuu oksi- hemoglobiinista. Lisäksi jotkin oksidaasit muodostavat su-peroksidia. Tärkein näistä entsyymeistä on ksantiinioksi-daasi, joka hapettaa hypoksantiinia ja ksantiinia virtsa-hapoksi. Pieni osa mitokondrioissa tapahtuvasta hapen pel-25 kistyksestä johtaa superoksidin ja sen jälkeen vetyperoksi din muodostumiseen. Mikrosomaalinen sytokromi P^g -systeemi vapauttaa myös superoksidia. Kun ionisoiva säteily kulkee happea sisältävän vesiliuoksen läpi, on superoksidi-radikaali se radikaali, jota muodostuu suurin konsentraa-30 tio. Fagosytoosia suorittavien leukosyyttien (polymorfonuk-leaaristen, monosyyttien, makrofaagien, eosinofiilien) ak- • » tivoituessa vapautuu suuria määriä superoksidia. Näin muodostuneet myrkylliset hapenpelkistystuotteet ovat olennaisen tärkeitä solujen tappamiskyvylle, mutta ne saattavat 35 myös aiheuttaa ympäröivän kudoksen vahingoittumista.
3 100252
Vetyperoksidia muodostuu aina, kun superoksidia muodostuu dismutaatioreaktion avulla. Useimmat kehossa esiintyvistä oksidaaseista pelkistävät suoraan happea vetyperoksidiksi.
5 Välituotteista on kaikkein reaktiivisin hydroksyy- liradikaali. Se voi muodostua, kun vetyperoksidi reagoi Fe2+- tai Cu+-ionien kanssa, niin kutsutussa Fenton-reak-tiossa.
H202 ♦ Fe2* - Fe3* * OH· ♦ OH" 10 (Cu*) (Cu2*) Nämä siirtymämetalli-ionit voivat myös katalysoida vetyperoksidin ja superoksidin välistä reaktiota, joka johtaa hydroksyyliradikaalin muodostukseen, niin kutsut-15 tua Haber-Weiss-reaktiota.
Fe
Cu H2°2 * °2*~ - OH· ♦ OH" ♦ 02 20
Ionisoiva säteily jakaa vettä, jolloin muodostuu vetyatomeja ja hydroksyyliradikaaleja. Näin muodostuneet hydroksyyliradikaalit ovat vastuussa suurimmasta osasta ionisoivan säteilyn aiheuttamaa biologista vaurioitumista. 25 Yllä olevasta kuvauksesta käy ilmi, että normaalis ti muodostuu useita hapen pelkistystuotteita samalla kertaa. Esimerkiksi ksantiinioksidaasisysteemissä ei muodostu pelkästään superoksidia, vaan myös vetyperoksidia, sekä suoraan että superoksidin dismutaation kautta. Nämä yh-30 disteet voivat sitten reagoida edelleen muodostaen hydrok- syyliradikaalia. Ksantiinioksidaasisysteemin voidaan osoittaa vaurioittavan proteiineja, hiilihydraatteja ja nukleiinihappoja ja tappavan soluja. Biokemiallisista yhdisteistä vaikuttavat monityydyttämättömät rasvat olevan kaikkein 35 herkimpiä hapen myrkyllisyydelle. Happivälituotteet voivat 4 100252 panna alulle ketjureaktioita, joihin osallistuu molekyyli-nen happi, niin kutsutun rasvojen peroksidoitumisen. Näin muodostuneet hydroperoksidit ja niiden hajoamistuotteet eivät ainoastaan vahingoita solukalvojen toimintaa, vaan ne 5 voivat myös vaurioittaa muita solun komponentteja.
Organismien, jotka elävät hapen läsnä ollessa, on ollut pakko kehittää joukko suojamekanismeja myrkyllisiä hapenpelkistystuotteita vastaan. Suojääviin tekijöihin kuuluvat superoksididismutaasit (SOD), jotka dismutoivat super-10 oksidiradikaalia ja joita esiintyy suhteellisen muuttumattomina määrinä imettäväisten soluissa ja kudoksessa. Tunnetuin näistä entsyymeistä on CuZn-SOD, joka on molekyylipai-non 33 000 omaava dimeeri ja sisältää kaksi kupari- ja kaksi sinkkiatomia. CuZn-SOD:tä esiintyy sytosolissa ja mito-15 kondrioiden kalvojen välisessä tilassa. Mn-SOD on molekyy-lipainon 85 000 omaava tetrameeri, joka sisältää 4 Mn-ato-mia ja sijaitsee pääasiallisesti mitokondrioiden matriisissa. Viime aikohihin asti on oletettu, että solunulkopuoli-sista nesteistä puuttuu SOD-aktiivisuus.
20 Tämän keksinnön tekijät ovat kuitenkin vastikään osoittaneet solu-ulkopuolisissa nesteissä (esim. veriplasmassa, imunesteessä, nivelvoidenesteessä ja aivoselkäydinnesteessä) esiintyvän superoksididismutaasin, jolle on annettu nimitys EC-SOD (solunulkopuolinen superoksididismu-25 taasi). Ihmisillä on aktiivisuus ml:ssa plasmaa vähemmän kuin 1 % kokonais-SOD-aktiivisuudesta g:a kohden kudosta, mutta keho näyttää säätelevän sitä aktiivisesti (Marklund et ai., Clin. Chim. Acta 126, 1982, ss. 41-51). Affiniteetti lektiinejä kohtaan (vrt. esimerkki 12) osoittaa, että 30 päinvastoin kuin CuZn-SOD, entsyymi on glykoproteiini. Se näyttää koostuvan neljästä samanlaisesta, ei-kovalenttises-ti sitoutuneesta alayksiköstä, kokonais- (tetrameerin) mole-kyylipainon ollessa 135 000, ja omaavan metallipitoisuuden yksi Cu-atomi ja yksi Zn-atomi alayksikköä kohden (vrt. esi-35 merkki 14). Entsyymi katalysoi superoksidiradikaalin ensim- 100252 5 mäisen kertaluvun dismutaatiota, kuten tekevät muutkin Cu:a sisältävät SOD:t.
SOO
02·' ♦ 02·· ♦ 2H °2 * H2°2 5
Ominaisaktiivisuus on hyvin suuri ja siinä toimivat luultavasti välittäjinä molekyylin neljä Cu-atomia. Kroma- tografoltaessa hepariini-Sepharose®:ää käyttäen entsyymi jakautuu kolmeksi fraktioksi, A:ksi, jossa ei ole affini- 10 teettia, B:ksi, jossa on heikko affiniteetti, ja C:ksi, jossa on voimakas affiniteetti hepariinia kohtaan. Vastoin EC-SOD:n käyttäytymistä eivät CuZn-SOD ja Mn-SOD sitoudu © hepariin-Sepharoseen . Entsyymillä on tietty hydrofobinen luonne, joka voi viitata affiniteettiin solun kalvoja koh-15 taan. Affiniteetti hepariinia kohtaan osoittaa usein affiniteettia heparaanisulfaattia kohtaan, joka esiintyy solujen pinnalla, erityisesti suonien endoteelissä. Sen vuoksi voidaan olettaa, että EC-SOD sijaitsee osaksi solujen pinnalla ja osaksi solunulkopuolisissa nesteissä (vrt. esimer-20 kit 9-11 jäljempänä). Aminohappokoostumus ja antigeeninen reaktiivisuus ovat aivan erilaisia kuin tähän mennessä tutkituilla SOD-isoentsyymeillä (Marklund, Proc. Nat. Acad.
Sei. USA 79, 1982, ss. 7634-7638; Biochem. J. 220, 1984, ss. 269-272). EC-SOD:n koodittava lähetti-RNA sisältää sek-25 venssin, joka koodittaa signaalipeptidin (vrt. esimerkki 8), mikä on merkki siitä, että EC-SOD on erittyvä proteiini. CuZn-SOD:n koodittava mRNA sen sijaan ei sisällä tällaista signaalipeptidin koodittavaa sekvenssiä. Lisäksi EC-SOD:n aminohappojärjestys on erilainen kuin muiden SOD-isoentsyy-30 mien; EC-SOD:tä on osoitettu esiintyvän kaikkien tutkittujen imettäväislajien plasmassa (Marklund, J. Clin. Invest.
74, 1984, ss. 1398-1403; Biochem. J. 222, 1984, ss. 649 -655) samoin kuin linnuissa ja kaloissa. Pitoisuus vaihtelee eri lajeilla suuresti, mutta lajinsisäinen vaihtelu on hy-35 vin vähäistä. Jyrsijöiden plasma sisältää 10-20 kertaa 100252 6 vähemmän EC-SOD:tä' kuin ihmisen plasma, joka sisältää suhteellisen vähän EC-SOD:tä. EC-SOD:tä on myös löydetty kaikista erilaisista tutkituista eläinkudostyypeistä (Marklund, J. Clin. Invest, 74, 1984, ss. 1398-1403; ^ Biochem. J. 222, 1984, ss. 649-655). Kudosten kohdalla ovat lajien väliset erot paljon pienempiä. Ihmisillä on EC-SOD:n taso, kudoksissa (yksikköjä grammaa kohden märkää painoa) suurempi kuin plasman EC-SOD:n taso (yksikkö-jä/ml). Jyrsijöillä kudos ja plasma sisältävät suurin 10 piirtein yhtä suuria määriä EC-SOD:tä (Marklund, Biochem.
J. 222, 1984, ss. 649-655).
SOD-entsyymit ovat aktiivisuutensa johdosta mielenkiintoisia ehdokkaita terapeuttisiksi aineiksi vastustamaan superoksidin ja muiden happiradikaalien myrkyllisiä vaikutuksia.
Johtuen yllä mainitusta SOD-aktiivisuuden alhaisesta tasosta solunulkopuolisissa nesteissä ovat solunulkopuo-listen nesteiden komponentit ja solujen pinta paljon heikommin suojattuja superoksidiradikaaleilta ja muilta myrkyllisiltä hapenpelkistystuotteilta kuin solujen sisusta. EC-SOD on sen vuoksi erityisen mielenkiintoinen aine terapeuttista käyttöä varten solujen ulkopuolisen superoksidi-radikaalin tuotannon yhteydessä.
Tämän vuoksi olisi hyödyllistä tuottaa EC-SOD:tä 25 realistisina määrinä terapeuttista tarkoituksia varten helposti saatavissa olevasta lähteestä. Sellaisia lähteitä, jotka pääasiallisesti käsittävät erityisen tyyppisiä soluja, .ei ole aikaisemmin ehdotettu tai kuvattu.
Tästä syystä tämä keksintö liittyy rekombinaation 30 .. avulla saatuun EC~SOD:hen. Tässä yhteydessä tarkoitetaan termin "rekombinaation avulla saatu" merkitsevän, että EC-SOD on peräisin solusta, jota on käsitelty yhdistel-mä-DNA-tekniikan avulla, s.o. johon on sijoitettu EC-SOD:n koodattava DNA-sekvenssi ja joka on sen jälkeen saatettu ilmentämään EC-SOD:tä. Tarkemmin sanoen keksintö koskee 100252 7 menetelmää EC-SOD:n tuottamiseksi, jolla on poly-peptidirakenne, jonka koodittaa seuraava DNA-sekvenssi 5 TrprhrglyCluA«pSgrAla0luProA*n5ffrA«pS»rAlBGluTrnlI»AroAipWft tggacggocgaggactcggcggagcccaactctgactcggcggagtogatccgagacatg acctgcccgctcctgagccqcctcgggttgagactgagccgcctcacctaggctctotac 30 40
TvrAlaLysValThrGluIIeTrpGlnGluValHetGlnArgAroAipAspAspGlvThr tacgccaaggtcacggagatctggcaggaggtcatgcagcggcgggacgacgacggcacg 10 atgcggttccagtgcctctagaccgtcctccagtacgtcgccgccctgctgctgccgtgc 50 60
LeuHi sAlaAlaCytGlnValGlnProSerAlaThrLeuAipAlaAlaGlnProArqVal ctccacgccgcctgccaggtgcagccgtcggccacgctggacgccgcgcagccccgggtg gaggtgcggcggacggtccacgtcggcagccggtgcgacctgcggcgcgtcggggcccac 15 70 60
ThrGlvValValLeuPheArqGlnLeuAlaPrcArqAlaLy»LauA»FAlaPhePhgAla accggcgtcgtcctcttccggcagcttgcgccccgcgccaagctcgacgccttcttcgcc tggccgcagcaggagaaggccgtcgaacgcggggcgcggttcgagctgcggaagaagcgg 90 100 20 JtauGluGlyPhePr cThrGluProAinSerStrSerArqAlaIleHicVa1H1sGInPhg ctggaggccttcccgaccgagccgaacagctccagccgcgccatccacgtgcaccagttc gacctcccgaagggctggctcggcttgtcgaggtcggcgcggtaggtgcacgtcgtcaag
110 120 ClyAEpLeuSerGlnGlyCyiGluSgrThrGlyProHiiTyrAinPcoLauAlaValPro GGGGACCTGAGCCAGGGCTGCGAGTCCACCGGGCCCCACTACAACCCGCTGGCCGTGCCG
25 cccctggactcggtcccgacgctcaggtggcccggggtgatgttgggcgaccggcacggc 130 140
Hi & ProGlnHl»PcoGlyAgpPheGlyAanPheAlaValArqAspGlySe c LeuTrpArq cacccgcagcacccgggcgacttcggcaacttcgcggtccgcgacggcagcctctggagg gtgggcgtcctgggcccgctgaagccgttgaagcgccaggcgctgccgtcggacacctcc β 100252 150 160
TvrArgAlaCl yLeuAlaAliSerLtuAl >GlvPreHliSTlltV»lGlyArQAlaval TACCGCGCCGGCCTGGCCGCCTCGCTCGCGGGCCCGCACTCCATCGT0GGCCGGGCCGTG
atggcgcggccggaccggcggagcgagcgcccgggcgtgaggtagcacccggcccggcac 5 170 180
valvalHi&Al8GlyGluA>pA»?L«uGlyArgGlyGlyAanGlnAlaserValGluAtn GTCGTCCACGCTCGCGAGGACGACCTGGGCCGCGGCGGCAACCAGGCCAGCGTGGAGAAC CAGCAGGTGCGACCGCTCCTGCTGGACCCGGCGCCGCCGTTGGTCCGGTCGCACCTCTTG
190 200
GlvAanAlaGlvArqArgLauAiaCvaCvaValVaiGlvValCvaGlvProGlYLauTgp 10 GGGAACGCGGGCCGGCGGCTGGCCTGCTGCGIGGTGGGCGTGTGCGGGCCCGGGCTCTGG
CCCTTGCGCCCGGCCGCCGACCGGACGACGCACCACCCGCACACGCCCOGGCCCGAGACC
210 220 GluArgGinAlaArgGluHiaStrGluArgLyaLyiArgArgArgGluSerGluCytLye GAGCGCCAGGCGCGGGAGCACTCAGACCGCAAGAAGCGGCGGCGCGAGAGCGAGTGCAAG CTCGCGGTCCGCGCCCTCGTGAGTCTCGCGTTCTTCGCCGCCGCGCTCTCGCTCACGTTC
15
AlaAla
GCCGCC
CGGCGG
20 tai mikä tahansa tämän muunnelma, joka koodittaa alkuperä!-sen EC-SOD:n superoksidia dismutoivan ominaisuuden omaavan polypeptidin. Huomattakoon, että DNA-sekvenssistä saatu aminohappojärjestys on esitetty DNA-sekvenssin yläpuolella. Esimerkkejä sopivista DNA-sekvenssin muunnelmista ovat nuk-25 leotidisubstituutiot, jotka eivät aiheuta proteiinille erilaista aminohappojärjestystä, vaan jotka esimerkiksi vastaavat sen nimenomaisen organismin kodonikäyttöä, johon sekvenssi sijoitetaan; nukleotidisubstituutiot, joista seuraa erilainen aminohappojärjestys ja sen vuoksi mahdollisesti eri-30 lainen proteiinin rakenne, ilman että kuitenkaan kriittinen ominaisuus dismutoita superoksidiradikaalia heikkenee; yllä * esitetyn sekvenssin alasekvenssi, joka koodittaa alkuperäi sen proteiinin superoksidia dismutoivan ominaisuuden säilyttäneen polypeptidin; tai DNA-sekvenssi, joka hybridisoituu 35 vähintään osaan yllä esitetyn sekvenssin perusteella valmis- 9 100252 tettua DNA-koetinta, sillä edellytyksellä, että kyseinen DNA-sekvenssi koodittaa polypeptidin, jolla on alkuperäisen proteiinin biologinen ominaisuus dismutoida superoksi-diradikaalia. Tässä yhteydessä tulisi huomata, että termi 5 "alkuperäisen EC-SOD:n superoksidia dismutoiva ominaisuus" ja vastaavat termit on tarkoitettu kvalitatiivisiksi eikä kvantitatiivisiksi, eli siis koskemaan polypeptidin aktiivisuuden laatua eikä tasoa.
DNA-sekvenssi, joka koodittaa EC-SOD:n tai sen yllä 10 määritellyn mukaisia muunnelmia tai johdannaisia, voi olla alkuperältään komplementaarinen DNA (cDNA), s.o; saatu valmistamalla cDNA-kokoelma EC-SOD:tä tuottavista soluista peräisin olevan mRNA:n perusteella, vakiintuneiden yleisten menetelmien ja vektoreiden avulla. Sitten voidaan suo-15 rittaa hybridisointikokeita käyttäen koettimina synteetti siä oligonukleotideja sen cDNA-sekvenssin tunnistamiseksi, joka koodittaa EC-SOD:n. Vaihtoehtoisesti voi DNA-sekvenssi olla genomialkuperää, s.o. saatu suoraan solun genomis-ta, esimerkiksi seulomalla esiin genomin sekvenssejä, jot-20 ka hybridisoituvat DNA-koettimeen, joka on valmistettu EC-SOD:n, esimerkiksi kudoksesta löydetyn, täydellisen tai osittaisen aminohappojärjestyksen perusteella tavanomaisten menetelmien mukaan; ks. esimerkistä 8 yksityiskohtaisempi kuvaus yleisestä menetelmästä. Genomin DNA eroaa 25 cDNA:sta esimerkiksi siten, että se sisältää transkription kontrollin aineksia ja niin kutsuttuja introneja, jotka ovat koodittavassa DNA-sekvenssissä olevia koodittamatto-mia sekvenssejä ja joiden merkitys on nykyään epäselvä.
Sekä cDNA että genomin DNA voi olla alkuperältään eläimen, 30 erityisesti imettäväisen. Terapeuttisia tarkoituksia var ten, kun on kysymys ihmisistä, pidetään yleensä parhaimpana, että EC-SOD on ihmiseltä peräisin olevan DNA-sekvenssin koodittama EC-SOD, jotta olennaisilta osin vältettäisiin ei-toivotut haitalliset immuunireaktiot.
10 100252 DNA-sekvenssi voi myös olla synteettistä alkuperää, s.o. valmistettu synteettisesti tunnetuilla yleisillä menetelmillä, esim. kuten ovat kuvanneet Matthes et ai., EMBO Journal 3, 1984, ss. 801-805. Ja vihdoin DNA-sekvenssi voi 5 olla yhdistetysti synteettistä ja genomialkuperää, yhdiste- tysti genomi- ja cDNA-alkuperää tai yhdistetysti cDNA- ja synteettistä alkuperää, jolloin se on valmistettu ligoimal-la yhteen cDNA-, genomi- tai synteettistä alkuperää olevia DNA-palasia (asiaankuuluvasti), jotka DNA-palaset käsittä-10 vät osan EC-SOD:n koodittavasta geenistä, yleisten menetelmien mukaan.
Vaikka rekombinaation avulla saatua EC-SOD:tä pidetään parhaimpana, koska sitä voidaan saada helposti suurina määrinä, voidaan EC-SOD:tä saada myös muista lähteis-15 tä esim. solulinjalta s.o. sellaiselta solulinjalta saatua, joka tuottaa proteiinia huomattavia määriä, kuten esimerkiksi solulinjalta, joka on peräisin verestä tai keuhko-, verisuoni-, haima-, kohtu-, eturauhas-, istukka- tai napanuorakudoksesta tai mahdollisesti kasvainkudoksesta.
20 Endoteelisoluja tai fibroblasteja pidetään nykyään mah dollisina EC-S0D:n lähteinä.
Vihdoin voi EC-SOD myös olla peräisin kudoksesta, jonka on todettu sisältävän suhteellisen runsaasti EC-SOD:tä eli istukasta tai napanuorasta peräisin olevaa 25 EC-SOD:tä, sillä näiden kudosten on todettu sisältävän melkoisen suuria määriä EC-SOD:tä verrattuna muihin kudostyyppeihin, ja niitä on myös helpommin saatavissa kuin esimerkiksi keuhko-, kohtu-, tai haimakudosta. Korostettakoon kuitenkin, että vaikka nämä kudokset sisältävät 30 suhteellisesti suurempia määriä EC-SOD:tä, ovat nämä määrät paljon pienempiä kuin ne, joita voidaan saada ' yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla ja sen vuoksi istukka- tai napanuora-EC-SOD tulee erityisesti kysymykseen erikoistarkoituksia varten, jolloin tarvitaan ainoastaan 35 pieniä määriä EC-SOD:tä.
11 100252 Tämä keksintö koskee lisäksi eräänä näkökohtanaan replikoituvaa ilmentämisvektoria, joka sisältää EC-SOD:n koodittavan sekvenssin. Tässä yhteydessä tarkoitetaan termillä "replikoi.tuva", että vektori kykenee replikoitumaan 5 määrätyn tyyppisessä isäntäsolussa, johon se on sijoitettu. Vektori voi sisältää yllä esitetyn DNA-sekvenssin tai sen minkä tahansa sopivan, yllä selostetun mukaisen muunnelman. Välittömästi vastavirtaan tästä sekvenssistä (EC-SOD:n koodittavasta sekvenssistä) voi olla sellaisen signaalipep-10 tidin koodittava sekvenssi, jonka peptidin läsnäolo takaa vektorin sisältävien isäntäsolujen ilmentämän EC-SOD:n erittymisen. Signaalisekvenssi voi olla esimerkiksi seuraava sekvenssi : -18 -10 -1 15 KetLeuAliLeuLeuCysSerCy*LtuLeuLtuAl*AlaClyAlftStrAipAla atgctgocgctactgtgttcctgcctgctcctggcagccggtgcctcggacgcc tacgaccgcgatgacacaaggacggacgaggaccgtcggccacggagcctgcgg 120
Tulisi huomata, että tämä signaalisekvenssi (ja sen koodittama signaalipeptidi) muodostaa sinänsä erään tämän 20 keksinnön näkökohdan, ja tarkoitus on, että se voidaan si joittaa vastavirtaan DNA-sekvensseistä, jotka koodittavat muita proteiineja tai peptidejä, jotta aikaansaataisiin saatujen tuotteiden erittyminen soluista.
Vektori voi olla mikä tahansa vektori, jolle voidaan 25 helposti suorittaa yhdistelmä-DNA-tekniikan toimenpiteitä, ja vektorin valinta tapahtuu usein sen isäntäsolun perusteella, johon se on tarkoitus sijoittaa. Siten vektori voi olla autonomisesti replikoituva vektori, s.o. kromosomin ulkopuolisena yksikkönä esiintyvä vektori, jonka replikoi-30 tuminen ei riipu kromosomin replikoitumisesta; esimerkkejä . tällaisesta vektorista ovat plasmidi, faagi, cosmidi, mini- kromosomi tai virus. Vaihtoehtoisesti voi vektori olla sellainen, että se isäntäsoluun vietynä integroituu isäntäsolun genomiin ja replikoituu yhdessä kromosomin (kromosomien) 35 kanssa, johon se on integroitunut.
100252 12 Tässä yhteydessä kuvataan lisäksi solulinjaa, joka kykenee erittämään EC-SOD:tä. Vaikka erilaisista ihmisen solulinjoista, jotka on saatu suuresta valikoimasta kudossolu- samoin kuin kasvainsolulin-5 joja, on aikaisemmin analysoitu niiden EC-SOD-pitoisuus (vrt. Marklund, J. Clin. Invest. 74, lokakuu 1984, .
ss. 1398-1403), ei ratkaisevia tuloksia ole saatu. Vaikka on mainittu, että joistakin tutkituista solulinjoista on löydetty pieniä määriä EC-SOD:tä, eivät artikkelin taulu-10 kossa II esitetyt tulokset ole merkitseviä ja ne voisivat yhtä hyvin olla analyysivirheen aiheuttamia. Varmastikaan ei alan asiantuntija tekisi tässä julkaisussa esitettyjen tulosten perusteella johtopäätöstä, että jotkut solulinjoista, joiden EC-SOD-pitoisuus on tutkittu, voisivat mah-15 dollisesti tuottaa EC-SOD:tä erittyvänä proteiinina, koska artikkelissa ei ole mitään osoitusta tästä mahdollisuudesta.
Solulinja voi olla peräisin imettäväisestä, erityisesti ihmisestä. Mieluimmin solulinja on sellainen, joka (muihin soluihin verrattuna) tuottaa erityisen suuria mää-20 riä EC-SOD:tä. Siten solulinja voi olla peräisin verestä tai keuhko-, iho-, verisuoni-, haima-, kohtu-, eturauhas-, istukka- tai napanuorakudoksesta tai mahdollisesti kasvain-kudoksesta. Erityisesti pidetään mahdollisena, että fibro-blasteista tai endoteelisoluista saadut solulinjat ovat 25 erikoisen edullisia EC-SOD:n lähteinä, koska ne on saatu solunulkopuoliselle tilalle suoraan alttiina olevista soluista, joiden voidaan siten olettaa tarvitsevan EC-SOD:n antamaa suojaa solunulkopuolisessa ympäristössä läsnä olevilta tai muodostuvilta superoksidiradikaaleilta.
30 Tämä keksintö koskee lisäksi yllä määritellyn mukai sen replikoituvan ilmentämisvektorin sisältävää solua. Peri-aatteessä tämä solu voi olla minkä tahansa tyyppinen solu, s.o. prokaryoottisolu, kuten esimerkiksi bakteeri, yksisoluinen eukaryoottiorganismi, sieni tai hiiva, tai moniso-35 luisesta organismista, esim. eläimestä tai kasvista, peräi- 100252 13 sin oleva solu. Uskotaan kuitenkin, että imettäväisen solu voi olla erityisen kykenevä ilmentämään EC-SOD:tä, joka on loppujen lopuksi erittäin monimutkainen molekyyli, jota aiempien organismien solut saattaisivat olla kykene-5 mättömiä tuottamaan. Yksi esimerkki tällaisesta solusta on CHO-K1/pPS3neo-18, joka on tallennettu 27. elokuuta 1986 kokoelmaan the European Collection of Animal Cell Cultures tulonumerolla ECACC 86082701.
Keksintö koskee myös eristettyä tai rekombinanttia 10 DNA-palasta, joka koodittaa EC-SOD:n ja jonka DNA- sekvenssi on seuraavanlainen .18 -10 M#tLeuAl»LeuLeuCysS*rCyiL«uL#uL*uAlaAlaGlyAlaS#rA8p
ATGCTGGCGCTACTGTGTTCCTGCCTGCTCCTGGCAGCCGGTGCCTCGGAC
tacgaccgcgatgacacaaggacggacgaggaccgtcggccacggagcctc 15 «O
-1 .1 10
AiaTrpThrGlvGluAgpSerAlaGluProAsnSerAtpSgrAlaGluTrrllaArgAgp gcctggacgggcgaggactccgcggagcccaactctgactccgcggagtggatccgagac cggacctgcccgctcctgagccgcctcgggttgagactgagccgcctcacctaggctctg 180 20 20 30
HetTyrAlaL ys V alThrGluIleTrpOInCluValMgtGlnArqArqAspAgpA * PGl v atgtacgccaaggtcacggagatctsgcaggaggicatgcagcgocgggacgacgacggc tacatgcggttccagigcctctagaccgtcctccagtacgtcgccgccctgctgctgccg 2 40 40 50
ThrLauHltAlaAlaCysGlnValGlnProSgrAlaThrL«uAspAl»AlaGlnProArg 25 acgctccacgccgcctgccaggtgcagccgtcggccacgctggacgccgcgcagccccgc tgcgaggtgcggcggacgctccacgtcggcagccggtgcgacctgcggcgcgtcggggcc 300 60 70
ValThrGlyVaIvalLeuPheArgGlnLeuAlaProArgAlaLyiLeuAspAlaPhePha gtgaccggcgtcgtcctcttccggcagcttgcoccccgcgccaagctcgacgccttctic cactcgccgcagcaggagaaggccgtcgaacgcggggcgcggttcgagctgcggaagaag 30 360 80 90
AlaLguGluGlyPhfiProThrGluProABnSTSerSerArgAlalleHl »ValHliCln gccctggagggcttcccgaccgagccgaacagctccagccgcgccatccacgtgcaccag cgggacctcccgaagggctggctcggcttgtcgaggtccgcgcggtaggtgcacgtggtc 420 14 100252 loo no
Phe3lvAspLcu5ctOln3lyCviCluSerThrGivPcoHl«TvrA»nProL»uAlaV«l
TTCGGGGACCTGAGCCAGGGCTGCGAG7CCACCGGGCCCCACTACAACCCGCTGGCCGTG
AAGCCCCTGGACTCGGTCCCGACGCTCAGGTGGCCCGGGGTGATGTTGGGCGACCGGCAC
460 5 120 130
ProHitProGInHitProGlyAEpPheGlyAgnPheAlaValArqAspGlySerLftuTrp CCGCACCCGCAGCACCCGGGCGACTTCGGCAACTTCGCGGTCCGCGACGGCAGCCTCTG3
GGCGTGGGCGTCGTGGGCCCGCTGAAGCCGTTGAAGCGCCAGGCGCTGCCGTCGGAGACC
540 140 150
ArgTvtA roAlaGlvLeuAlaAlaSarLauAlaGlyProHi tSerllevalGlvAr gAla 10 aggtaccgcgccggcctggccgcctcgctcgcgggcccgcactccatcgtgggccgggcc
TCCATGGCGCGGCCGGACCGGCGGAGCGAGCGCCCGGGCGTGAGGTAGCACCCGGCCCGG
600 160 170
ValValValBieAlaGlyGluAspAapLauGlyArgGlyGlyAanGlnAlaSarValGlu
GTGGTCGTCCACGCTGGCGAGGACGACCTG55CCGCGGCGGCAACCAGGCCAGCGTGGAG
CACCAGCACGTGCGACCGCTCCTGCTGGACCCGGCGCCGCCGTTGGTCCGGTCGCACCTC
15 660 160 190
AanGlyAtnAlaGlyAtgArglauAlaCvaCvValValGlyValCyaOlyProGlvLtu
AACGG5AAC5C5GGCCG&CGGCTGGCCTGCTGCGTGGTGSGCGT3TGCGGGCCCGGGCTC
ttgcccttgcgcccgoccgccgaccggacgacgcaccacccgcacacgcccgggcccgag 720 20 200 210
TrpGluArgGlnAlaArgGluHlaSerGluArgLygLygArgArgArgOluSarGluCyt tgggagcgccaggcgcgggagcactcagagcggaagaagcggcggcgcgagagcgagtgc
ACCCTCGCGGTCCGCGCCCTCGTGAGTCTCGCGTTCTTCGCCGCCGCGCTCTCGCTCACG
760 220
LyaAlaAla**·
25 AAGGCCGCCTGA TTCCGGCGGACT
Tulisi huomata, että tämä sekvenssi sisältää edellä esitetyn, signaalipeptidin koodittavan sekvenssin. Signaa-lisekvenssi ulottuu aminohaposta -18 aminohappoon -1. Täy-30 dellisen EC-SOD:n koodittava sekvenssi alkaa aminohaposta +1.
. DNA-sekvenssi voi olla cDNA-, genomi- tai synteet tistä alkuperää tai yhdistetysti cDNA- ja genomi-, yhdiste-tysti cDNA- ja synteettistä tai yhdistetysti genomi- ja synteettistä alkuperää, kuten yllä on selostettu.
15 100252
Edelleen tässä kuvataan EC-SOD:n tuottamismenetelmää, jossa EC-SOD:tä tuottavaa solulinjaa kasvatetaan EC-SOD:n erittymisen takaavissa olosuhteissa. Solulinja voi olla peräisin mistä tahansa yllä mainituista läh-5 teistä. EC-SOD:tä tuottavat imettäväisen solut voidaan tunnistaa immunohistokemiallisesti EC-SOD:tä vastaan suunnattujen vasta-aineiden avulla tai analysoimalla kasvuliuoksesta, jossa määrättyjä soluja viljellään, siihen erittynyt EC-SOD. Soluja voidaan kasvattaa ta-10 vanomaisissa elatusaineissa, jotka on mukautettu solu-linjojen lisääntymiselle sopiviksi sinänsä tunnetulla tavalla.
Kuten yllä on mainittu, osoittaa EC-SOD affiniteettia hepariinia kohtaan, mikä viittaa affiniteettiin hepa-15 raanisulfaattia tai muita solujen pinnalla, erityisesti endoteelisolujen pinnalla esiintyviä hepariinin kaltaisia glukoosiaminoglukaaneja kohtaan. Sen vuoksi on mahdollista aikaansaada EC-SOD:n vapautuminen solujen pinnalta ja siten taata parantunut EC-SOD:n saanto, kasvattamalla 20 EC-SOD:tä tuottavien solulinjojen kudossoluja elatusai- neessa, joka sisältää hepariinia tai hepariinia vastaavaa yhdistettä, esim. heparaanisulfaattia tai muuta sul-fatoitua glukoosiaminoglykaania, dekstraanisulfaattia tai muuta vahvasti negatiivisesti varautunutta yhdistet-25 tä määrän, joka riittää aiheuttamaan EC-SOD:n irtoamisen solujen pinnalta (vrt. esimerkit 9-11).
Tämä keksintö koskee eräänä toisena tärkeänä näkökohtanaan EC-SOD:n tuottamismenetelmää, jossa EC-SOD:n koodittavan DNA-sekvenssin sisältävä DNA-palanen sijoite-30 taan vektoriin, joka kykenee replikoituinaan määrätyssä isäntäsolussa, saatu yhdistelmävektori viedään isäntäso-luun, jota kasvatetaan sopivassa kasvuliuoksessa tai sopivalla kasvualustalla EC-SOD:n ilmentämiseen sopivissa olosuhteissa, ja EC-SOD otetaan talteen. Keksinnön mukaiselle 35 menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuk sessa 1 esitetään. Solujen kasvatukseen käytettävä elatusaine voi olla mikä tahansa tarkoitukseen 16 100252 sopiva tavanomainen elatusaine, mutta voi olla tarpeen lisätä ylimääräistä Cu ja/tai Zn EC-SOD:n synteesiä varten, erityisesti, jos sitä on tarkoitus tuottaa suurempia määriä. Vektoriksi soveltuu mikä tahansa yllä kuvatuista 5 vektoreista, ja tarkoituksenmukainen isäntäsolu voi olla mitä tahansa yllä luetelluista solutyypeistä. Vektorin rakentamisessa ja sen isäntäsoluun sijoittamisessa voidaan käyttää mitä tahansa menetelmiä, jotka yhdistelmä-DNA-tekniikan alalla tunnetaan tätä tarkoitusta varten. Solujen 10 ilmentämä EC-SOD voi erittyä, s.o. tulla kuljetetuksi so lun kalvon lävitse, mikä riippuu solutyypistä ja vektorin rakenteesta. Jos yhdistelmä-DNA isäntä tuottaa EC-SOD:n solun sisään, eli solu ei eritä sitä, se voidaan ottaa talteen käyttäen yleisiä menetelmiä, jotka käsittävät so-15 lun rikkomisen mekaanisin keinoin, esim. sonikoimalla tai homogenoimalla, tai entsymaattisin tai kemiallisin keinoin, ja sen jälkeen puhdistamisen (esimerkkejä talteen-ottomenetelmästä on annettu esimerkeissä 1, 4-6 ja 17).
Jotta EC-SOD erittyisi, pitäisi EC-SOD:n kooditta-20 vaa DNA-sekvenssiä edeltää signaalipeptidin koodittava sek venssi, jonka peptidin läsnä-olo takaa EC-SOD:n erittymisen soluista, niin että ainakin huomattava osa ilmentyneestä EC-SOD:stä erittyy viljelyaineeseen ja saadaan talteen.
On osoitettu kokeellisesti, että osa erittyneestä EC-SOD:stä 25 on läsnä viljelyaineessa ja osa EC-SOD:stä on läsnä solu- * jen pinnalla. Siten ilmauksen "erittyy viljelyaineeseen" on tarkoitus kattaa kaikki EC-SOD:n kuljetus solukalvon lävitse, päätyipä entsyymi sitten lopuksi viljelyaineeseen tai solujen pinnalle (vrt. esimerkkejä 9-11). EC-SOD voi-30 daan ottaa talteen viljelyaineesta yleisillä menetelmillä, jotka käsittävät solujen suodattamisen pois ja erittyneen proteiinin eristämisen, esimerkiksi kuten on pääpiirteittäin esitetty esimerkeissä 1, 4-6 ja 17. Jotta taattaisiin EC-SOD:n irtoaminen solujen pinnalta ja saataisiin siten 35 parempi saanto, voi olla edullista lisätä viljelyaineeseen 17 100252 hepariinia tai jotakin yllä mainituista samanlaisen vaikutuksen omaavista aineista, kuten yllä on selitetty.
Tässä kuvataan edelleen EC-SOD:n talteenottamis-menetelmää, jossa EC-SOD-aktiivisuutta sisältävä bio-5 logisen materiaalin uute adsorboidaan matriisiin, joka sisältää EC-S0D:n tai sen jonkin immunologisen determinantin vastaisia immobilisoituja vasta-aineita, EC-SOD-aktiivisuus eluoidaan matriisista ja EC-SOD-aktiivisuuden sisältävät fraktiot yhdistettään, minkä jäl-10 keen mahdollisesti voidaan suorittaa lisäpuhdistamista.
Käytettävät vasta-aineet voivat olla vasta-aineita, jotka on tuotettu EC-SOD:tä tai sen jotakin immunologista determinanttia vastaan ja immobilisoitu sopivaan matrii-simateriaaliin sinänsä tunnetulla tavalla.
15 Vasta-aineet, joita käytetään affiniteettikromato- grafiassa voivat olla joko polyklonaalisia tai mono— klonaalisia vasta-aineita. Nykyään pidetään parhaina vasta-aineina monoklonaalisia vasta-aineita, koska useimpien monoklonaalisten vasta-aineiden on todettu 20 sitovan antigeenin heikommin kuin polyklonaalisen vasta- aine-seoksen, mikä tarkoittaa, että desorptio voidaan suorittaa lievemmissä olosuhteissa käyttäen heikompia eluentteja. Tämä voi johtaa parantuneeseen EC-S0D:n saantoon, koska denaturaatiota tapahtuu vähemmän kuin sil-.. 25 loin, kun desorptiossa käytetään vahvoja eluentteja.
Koska kaikki IgG on EC-SOD:n vastaista, tarvitsee myös käyttää paljon pienempää määrää vasta-ainemat-riisia lähtöaineena käytetystä biologisesta materiaalista peräisin olevan EC-SOD:n adsorptioon. EC-SOD:n desorp-30 tio vaatiin paljon pienemmän tilavuusmäärän eluenttia, mikä yksinkertaistaa eluutiomenettelyjä, jotka ovat ny-·· kyään epämukavia johtuen desorptioon tarvittavista suu rista eluentin tilavuusmääristä.
Monoklonaalisten vasta-aineiden spesifisyys 35 EC-SOD:lle on todennäköisesti suurempi kuin polyklonaa-listen vasta-aineiden. Vasta-ainematriisista tullut 100252 18 eluaatti on sen vuoksi puhtaampi, mikä merkitsee, että yksi tai useampia lisäpuhdistusvaiheita voidaan jättää pois. Tämä tarkoittaa, että tuottamismenetelmä yksinkertaistuu suuresti ja saadaan paljon suurempi saanto EC-SOD:tä 5 samasta lähtöainemäärästä, mikä merkitsee tärkeää taloudel lista etua.
Polyklonaalisia vasta-aineita voidaan saada immunisoimalla immunisoituva eläin EC-SOD:llä tai sen jollakin immunologisella determinantilla ja ottamalla talteen anti-10 seerumi kuten esimerkiksi immunoglobuliinit eläimestä sinänsä tunnetulla tavalla. Immunisointi suoritetaan mieluimmin käyttäen EC-SOD:n stabiloitua vesiliuosta; stabiloiva aine voi olla puskuriliuos, kuten esimerkiksi fosfaatilla puskuroitu suolaliuos, tai adjuvantti (myös antigeenisyy-15 den vahvistamiseksi), ja sopiva adjuvantti on Freundin adjuvantti tai alumiinihydroksidi. Immunisointia varten pidetään parhaina eläiminä hiiriä, kaniineja, kanoja, vuohia ja lampaita. Veren vuodattaminen eläimestä ja antiseerumin eristäminen suoritetaan tunnettujen menetelmien mu-20 kaan. Vasta-aine tarjotaan mieluimmin käyttöön suurin piir tein puhtaana, mikä on edullista EC-SOD:n välttämättömän puhdistuksen aikaansaamiseksi.
Käytettäessä monoklonaalista vasta-ainetta, se voidaan tuottaa hybridoomatekniikan avulla, joka on tunnettu 25 vasta-aineidentuottamismenetelmä. Käytettäessä hybridooma- tekniikassa esimerkiksi hiiriä immunisoitavina eläiminä, immunisoidaan hiiret kysymyksessä olevalla antigeenillä ja immunisoiduista hiiristä peräisin olevia pernasoluja sulautetaan yhteen myeloomasolujen kanssa, minkä jälkeen fuusioi-30 dut hybridoomasolut kloonataan, vasta-ainetta tuottavia so luja kasvatetaan sopivassa viljelyaineessa ja vasta-aineet otetaan talteen viljelmästä. Hybridoomamenetelmällä saaduilla vasta-aineilla on etuna suurempi spesifisyys ja sen vuoksi suurempi puhdistamispotentiaali, kuten yllä on mainittu.
m 100252
Mahdollisessa lisävaiheessa käytetään yhdistelmä-DNA-tek-niikkaa ja siirretään vasta-aineen koodittava DNA-sekvens-si hybridoomasolukloonista sopivaan vektoriin, yhdistelmä-vektori transformoidaan sopivaan bakteeri-isäntään, isän-5 tää kasvatetaan sopivassa viljelyaineessa ja muodostunut vasta-aine otetaan talteen viljelmästä. Tällä tavoin voidaan saada aikaan parantunut vasta-aineen saanto. Isäntä voi olla sellainen, jota yleensä käytetään yhdistelmä-DNA-tekniikan alalla, kuten esimerkiksi Eschericia coli 10 tai Bacillus subtilis.
Vaihtoehtoisen monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamismenetelmän mukaan hybridoomasolut voidaan istuttaa hiirten vatsaonteloon ja kasvattaa siellä ja muodostuneet EC-SOD:n vastaiset aineet otetaan talteen saadusta vesi-15 vatsanesteestä sinänsä tunnetulla tavalla. Lisäksi voidaan immunisointi monoklonaalisten vasta-aineiden saamista varten suorittaa in vitro käyttäen esim. hiililtä saatuja im-munokompetentteja soluja. Tässä tapauksessa ei ole tarpeen ruiskuttaa antigeeniä kysymyksessä olevaan eläimeen, esim.
20 hiireen, vaikka tämä on nykyään yleisimmin käytetty mene- telmä.
Biologinen materiaali, josta EC-SOD-aktiivisuuden sisältävä uute saadaan, voi olla esimerkiksi imettäväisen kudos. Voi olla mahdollista käyttää naudan, sian tai hevo-:· 25 sen kudosta, sillä, haluttaessa verrata, naudan CuZn-SOD:n on todettu omaavan suhteellisen vähän immunologista reaktiivisuutta ihmisissä, eivätkä allergiset reaktiot ole olleet mikään vakava ongelma. Tämän perusteella voidaan siten päätellä, että asianlaita on samoin naudan, hevosen 30 tai sian EC-SOD:n kohdalla. Kuitenkin pidetään vielä par- '·' haimpana käyttää ihmisen kudosta, jotta vältettäisiin mah dolliset ei-toivotut immunologiset reaktiot. Nykyään pidetään tätä tarkoitusta varten parhaana ihmisen kudoksena, 35 100252 20 koska se sisältää suhteellisen suuria määriä EC-SOD:tä, ihmisen keuhko-, haima-, kohtu-, eturauhas-, napanuora- tai istukkakudosta, erityisesti kahta viimeksi mainittua kudostyyppiä, koska näitä on myös helpommin saatavissa. Uu-5 te voidaan valmistaa tavanomaisesti sopivaan puskuriliuok seen, kuten esimerkiksi fosfaattipuskuriliuokseen. On todettu edulliseksi lisätä kaotrooppista suolaa, esim. KBr, ammoniumsulfaattia tai kaliumtiosyanaattia, puskuriliuokseen, jotta parannettaisiin uutossa saatua EC-SOD-saantoa.
10 Koska EC-SOD:tä ei kuitenkaan valmistu suuria mää riä missään noista kudoksista, niin että tarvitaan hyvin suuria määriä kudosta, jotta saataisiin riittävä määrä EC-SOD:tä terapeuttisia tarkoituksia varten, voidaan pitää parempana hankkia EC-SOD eläimen, mieluimmin imettä-15 väisen, ihmisen, solulinjasta, joka tuottaa EC-SOD:tä.
EC-SOD-aktiivisuutta sisältävä biologinen materiaali voi sen vuoksi olla myös materiaali, joka on saatu kasvattamalla EC-SOD:tä tuottavaa solulinjaa, kuten yllä on kuvattu. Jotta saataisiin erityisen suuria määriä EC-SOD:tä, 20 voidaan keksinnön mukaisilla menetelmillä talteen otettava EC-SOD edullisesti tuottaa yhdistelmä-DNA-menetelmien avulla, kuten yllä on kuvattu.
Useimmissa tapauksissa, erityisesti käytettäessä EC-SOD:n puhdistuksessa immobilisoituja polyklonaalisia 25 vasta-aineita, voidaan yhdistetty vasta-ainematriisin elu- ‘ aatti absorboida matriisiin, esim. ioninvaihtomatriisiin, ja sen jälkeen eluoida EC-SOD-aktiivisuus matriisista ja yhdistää EC-SOD-aktiivisuuden sisältävät fraktiot. Yhdistettyä eluaattia voidaan puhdistaa edelleen syöttömällä 30 se kromatografiapylvääseen, jonka matriisi sisältää hepa- riinia tai hepariinin vastinetta, esim. heparaanisulfaat-tia tai muuta sulfatoitua glukoosiaminoglykaania, dekstraa-nisulfaattia tai muuta vahvasti negatiivisesti varautunutta yhdistettä, ja eluoimalla sekä sen jälkeen yhdistämäl-35 lä kysymyksessä olevaa ainetta kohtaan affiniteettia osoit tavat fraktiot.
21 100252 Tässä esitetään edelleen EC-SOD:n käyttöä sellaisten sairauksien tai häiriöiden diagnosointiin, ehkäisyyn tai hoitoon, joihin liittyy superoksidiradikaalien ja muiden, superoksidiradikaalin avulla muodostuneiden myrkyllisten 5 happivälituotteiden läsnäolo tai muodostus.
Esimerkkejä sellaisista sairauksista tai häiriöistä on valittu seuraavista: tilat, joihin liittyy iskemia ja sen jälkeinen reperfuusio, esim. salpaukset, kuten esimerkiksi sydän-, munuais-, aivo- tai suolisalpaukset, tulehdussai-10 raudet, kuten esimerkiksi nivelreuma, haimatulehdus, erityi sesti äkillinen haimatulehdus, pyelonefriitti ja muun tyyppiset nefriitit, ja hepatiitti, autoimmuunisairaudet, insuliinista riippuvainen sokeritauti, disseminoitu intravaskulaa-rinen koagulaatio, rasvatulppautuminen, aikuisen hengitys-15 häiriö, lapsen hengityshäiriö, vastasyntyneiden aivoveren vuodot, palovammat, ionisoivan säteilyn haittavaikutukset ja syövän synty.
EC-SOD:n on siten ilmoitettu sopivan suurin piirtein samoihin käyttötapauksiin kuin CuZn-SOD:n, jonka terapeut-20 tinen aktiivisuus on selostettu perusteellisemmin, kuten jäljempänä on esitetty.
EC-SOD:n on kuitenkin osoitettu omaavan joukon ominaisuuksia, joiden oletetaan tekevän siitä erityisen hyödyllisen terapeuttisessa käytössä. CuZn-SOD:n molekyylipaino on ·: 25 pienempi (33 000) , minkä johdosta se eliminoituu hyvin no peasti munuaisissa munuaiskeräsissä tapahtuvassa suodatuksessa, niin että ihmisillä entsyymin puoli-ikä on vain noin 20 - 30 minuuttia. Alustavat EC-SOD:llä tehdyt kokeet ovat yllättäen osoittaneet EC-SOD:n omaavan huomattavasti 30 pitemmän puoli-iän (kaniineilla), vrt. esimerkki 10. Tämän uskotaan nykyään johtuvan osittain EC-SOD:n suuresta mole-kyylipainosta, 135 000, joka estää sen eliminoitumisen munuaiskeräsissä tapahtuvassa suodatuksessa, ja osittain siitä, että EC-SOD näyttää sitoutuvan endoteelisolujen pinnalle, 22 100252 kuten jäljempänä on osoitettu. Käytettäessä EC-SOD:tä terapeuttisesti, entsyymillä on sen vuoksi ihmisissä pikemminkin vähintään puoli-ikä 4 tuntia ja mahdollisesti vielä pitempi.
5 Kuten yllä on selitetty, on EC-SOD luonnollisessa ym päristössään erittyvä proteiini, ja sen vuoksi on todennäköistä, että se syntetisoituu erityisesti solunulkopuolises-sa tilassa (solunulkopuolisissa nesteissä tai solujen pinnalla) suoritettavaa tehtävää varten, minkä johdosta sillä 10 voi olla ominaisuuksia, jotka ovat erityisen hyvin mukautu neet suojaamaan plasman komponentteja tai solujen ulkopintaa superoksidiradikaalien tai muiden happiradikaalien myrkyllisiltä vaikutuksilta. Tätä oletusta tukevat havainnot, että EC-SOD:llä on heikosti hydrofobinen luonne, minkä joh-15 dosta sillä voi olla taipumus sitoutua solujen ulkopinnalle, ja että se osoittaa affiniteettia hepariinia kohtaan, mikä viittaa affiniteettiin heparaanisulfaattia kohtaan, jota esiintyy solujen ulkopinnalla, jotka kummatkin ominaisuudet näyttäisivät viittaavan erityisen hyvään kykyyn suojel-20 la kudosta, vrt. esimerkkeihin 9, 10 ja 11, joiden koetulok set näyttävät todistavan EC-SOD:n sitoutumisen verisuoni-endoteeliin.
EC-SOD:n ilmeisen solun kalvoihin kiinnittymisen merkitystä tukee lisäksi havainto, että CuZn-SOD, jota on muun-25 nettu polylysiinillä, jotta se sitoutuisi solukalvoihin, kykenee paremmin suojaamaan aktivoituneita (superoksidira-dikaalia tuottavia) polymorfonukleaarisia leukosyyttejä (PMN) autoinaktivoinnilta (solun kuolemalta) kuin normaali CuZn-SOD, joka on varautunut negatiivisesti ja jota so-30 iukalvoilla on sen vuoksi taipumus hylkiä (M. Salin ja J.M.
McCord, "Free radicals in leukocyte metabolism and inflammation", teoksessa Superoxide and Superoxide Dismutases, toim. A.M. Michelson, J.M. McCord ja I. Fridovich, Academic Press, 1977, ss. 257-270). Se tosiasia, että Nocardia asteroi-35 des omistaa kalvoon kiinnittyneen SOD:n, joka näyttää antavan 23 100252 tehokkaan suojan aktivoituneita ihmisen PMN-soluja vastaan, koskapa Nocardian herkkyys PMN-soluille suurenee huomattavasti, kun Nocardia-soluja käsitellään tämän SOD:n vastaisilla vasta-aineilla (B.L. Beaman et ai Infection and 5 Immunity 47, 1985, ss. 135-141), viittaa myös solujen pintaan sitoutuneen SOD:n solukalvoa suojaavaan toimintaan. Toisin kuin EC-SOD:llä, CuZn-SOD:llä on solunsisäinen tehtävä, minkä johdosta se voi sopia huonommin solunulkopuo-liseen käyttöön, johon siis on antanut aiheen superoksidi-10 radikaalien esiintyminen solujen ulkopuolella. Lisäksi sen EC-SOD:hen verrattuna lyhyt puoli-ikä, joka on mainittu yllä, näyttäisi tekevän välttämättömäksi antaa suurempia annoksia lyhyemmin väliajoin, kuin mitä EC-SOD:n tapauksessa todennäköisesti olisi tarpeen.
15 SOD:n aktiivisuus potentiaalista terapeuttista käyt töä varten on osoitettu seuraavien sairauksien tai häiriöiden kohdalla.
Ruoansulatuskanavan ulkopuolisesti annetun CuZn-SOD:n on osoitettu omaavan tulehdusta vastustavan vaikutuksen 20 sarjassa eläimillä olevia mallitulehduksia samoin kuin eläin ten tulehduksellisissa sairauksissa (Huber ja Saifer, teoksessa Superoxide and Superoxide Dismutases, toim. Michelson et ai., Academic Press, 1977, ss. 517-549). Ihmisillä CuZn-S0D:n myönteisiä vaikutuksia on selostettu nivelreuman 25 ja niveltautien yhteydessä, rakkotulehduksen ja muiden uro logisten tilojen yhteydessä (Menander-Huber teoksessa Biological and Clinical Aspects of Superoxide and Superoxide Dismutase, toim. Bannister et ai. Elsevier/North Holland, 1980, ss. 408-423) samoin kuin ionisoivalla säteilyllä 30 suoritetun käsittelyn haittavaikutusten yhteydessä (Edsmyr et ai., Current Therapy. Res. 10, 1976, ss. 198—211; '* Cividalli et ai. Acta Radiol. Oncol. 24, 1985, ss. 273-277 (rotilla)). Joissakin maissa on naudan CuZn-SOD rekisteröity lääkkeeksi (Orgotein, Peroxinorm), jota käytetään pää-35 asiallisesti nivelreuman ja niveltautien hoitoon, jolloin 24 100252 valmiste annetaan nivelen sisään (Goebel ja Storck, Am. J. Med. 74, 1983, ss. 124-128).
Ruoansulatuskanavan ulkopuolisesti annettua CuZn-SOD:tä eivät solut ota sisäänsä ja sen täytyy toi-5 mia solunulkopuolisessa tilassa. Liposomeihin koteloidun
CuZn-SOD:n solut ottavat sisäänsä ja sen on selostettu olevan tehokas Crohnin tautia, Bechetin tautia, rokahdusihot-tumaa, haavaista paksusuolentulehdusta, Kawasakin tautia ja säteilyhoidon haittavaikutuksia vastaan (Y. Niwa et ai., 10 Free Rad. Res. Comms. 1, 1985, ss. 137-153). CuZn-SOD:n tulehdusta vastustavan vaikutuksen mekanismi ei ole aivan selvä. On ehdotettu suoraa suojaamista aktivoituneiden leukosyyttien muodostamilta happiradikaaleilta (Halliwell, Cell Biol. Int. Rep. 6, 1982, ss. 529-541).
15 Toinen mahdollisuus on superoksidin aikaansaaman vahvasti kemotaksisen aineen muodostumisen estäminen (Petrone et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77, 1980, ss. 1159-1163).
Toinen SOD:n suuri potentiaalinen käyttöalue on suojaavana tekijänä iskemian ja sen jälkeisen reperfuusion 20 aiheuttamaa kuodosvauriota vastaan. Jos veren tulo kudokseen lakkaa, kudos muuttuu hitaasti kuolioiseksi. Paljain silmin ja mikroskoopin avulla voidaan havaita vaurion tyypillisesti kehittyvän hitaasti useiden tuntien aikana. Jos kudokseen tapahtuu reperfuusio esimerkiksi yhden tunnin ku-25 luttua, kiihtyy kudoksen vaurioituminen voimakkaasti, sen sijaan että tapahtuisi paranemista. Tälle niin kutsutulle reperfuusioparadoksille on todennäköisimmin olemassa useita syitä, mutta happiradikaalit, joita muodostuu seurauksena hapen ilmaantumisesta jälleen ennestään verettö-30 mään kudokseen, näyttävät osaltaan edistävän vaurioitumista. Koska radikaalit ovat erittäin lyhytikäisiä ja niitä on sen vuoksi vaikea tutkia suoraan, voidaan niiden muodostumisesta ja vaikutuksista tehdä päätelmiä erilaisten radikaalinpoistajien suojaavan vaikutuksen perusteella.
35 Kudoksen suojelu (suojaavan aineen avulla) on todistettu 100252 25 iskemia- tai anoksiareperfuusiomalleissa munuaisessa (SOD /S.L. Baker et al., Am. Surg. 202, 1985, ss. 628-641; I. Koyama et al., Transplantation 40, 1985, ss. 590-595^, SOD, katalaasi /E.Hansson et al., Clin. Sei. 65, 1983, 5 ss. 605-6107 ja allopurinoli /G.L. Baker et al., op. cit; I. Koyama et al., op. cit.7) suolessa (SOD /D.A. Parks et al., Gastroenterology 82, 1982, ss. 9-15; M.H. Schoenberg et al., Acta Chim. Scand. 150, 1984, ss. 301-309; M.C. Dalsing et al., J. Surg. Res. 34, 1983, ss. 589-5967 10 ja allopurinoli /D.A. Parks et al. op. cit.J), haimassa (SOD, SOD + katalaasi, katalaasi ja allopurinoli /H. Sanfey et al., Ann. Surg. 200, 1983, ss. 405-4137)/ maksassa (SOD ja katalaasi /S.L. Atalla et al., Transplantation 40, 1985, ss. 584-5897» keuhkossa (SOD + katalaasi /R.S. Stuart 15 et al., Transplant. Proc. 17, 1985, ss. 1454-14567) luuran-kolihaksessa (SOD, katalaasi ja allopurinoli /R.V. Korthuis, Circ. Res. 57, 1985, ss. 599-6097)/ ihossa (SOD ja allopurinoli /M.J. Im et al., Ann. Surg. 201, 1985, ss. 357-3597) ja aivossa (SOD ja allopurinoli /j.S. Beckmann et al., teok-20 sessa Superoxide and Superoxide Dismutase in Chemistry,
Biology and Medicine, toim. G. Rotilio, Elsevier, 1986, ss. 602-6077) .
Sydämen toiminnan suojaaminen on selostettu todetun eristetyissä, perfusoiduissa preparaateissa, jotka ovat ol-25 leet peräisin kaniinista (katalaasi, allopurinoli; SODtllä ei ollut vaikutusta /C.L. Myers et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 91, 1986, ss. 281-2897)/ kissasta (SOD + katalaasi /M. Schlafer et al., Circulation 66, Suppl. I, 1982, ss. 185-1927) ja rotasta (glutationi, katalaasi, SOD 30 _/Gaudel et al., J. Mol. Cell. Cardiol. 16, 1984, ss. 459 -4707). Alueellisissa iskemia-reperfuusiomalleissa in vivo on selostettu infarktin koon pienenneen koiralla (SOD /T.J. Gardner et al., Surgery 94, 1983, ss. 423-427; D.E.
Chambers et al., J. Mol. Cell Cardiol. 17, 1985, ss. 145 -^5 152; S.W. Werns et al., Circ. Res. 56, 1985, ss. 895-898/) 26 100252 ja allopurinoli /5.E. Chambers et ai., op. cit.; T.J.
Gardner et ai., op. cit, katalaasilla ei ollut vaikutusta /S.E. Werns et ai., op. cit.,7. SOD:n + katalaasin ruis-kuttamisen on myös selostettu suojanneen sydämen mekaani-5 sen toiminnan lyhyen (15 minuuttia kestäneen) alueellisen iskemian jälkeen koiralla (M.L. Myers et ai., Circulation 72, 1985, ss. 915-921; K. Przyklenk ja R.A. Kloner, Circ. Res. 58, 1986, ss. 148-156). Lisäsksi SOD:n on selostettu vähentävän iskemian ja reperfuusion aiheuttamien sykin-10 nän epäsäännöllisyyksien esiintymistiheyttä (B. Woodward et ai., J. Mol. Cell Cariol. 17, 1985, ss. 485-493; M. Bernier et ai., Circ. Res. 58, 1986, ss. 331-340). Happi-radikaalien alkuperä ei tässä tilanteessa ole täysin selvä, mutta allopurinolin vaikutus näyttää viittaavan siihen, et-15 tä syynä on osittain ksantiinioksidaasi, joka iskemiassa muuttuu ksantiinidehydrogenaasimuodostaan (Parks, et ai., op. cit.) radikaaleja tuottavaan oksidaasimuotoon. Suuri määrä hypoksantiinia, joka on ksantiinioksidaasin substraatti, muodostuu iskemian aiheuttaman puriininukleotidien ha-20 joamisen johdosta. Muita superoksidiradikaalien lähteitä voivat olla iskemian vaurioittaman kudoksen puoleensa ve-tämät aktivoituneet leukosyytit, prostaglandiinisynteesi (C>2* on sivutuote; Kontos, Circ. Res. 57, 1985, ss. 508 -516) ja erilaisten sellaisten yhdisteiden autoksidoitumi-25 nen, joita on kertynyt pelkistyneessä muodossa iskemian ai- | kana. Iskemiaa ja sitä seuraavaa reperfuusiota koskevilla havainnoilla on mahdollisesti tärkeitä kliinisiä hyväksikäyttömahdollisuuksia. Voi olla mahdollista saada aikaan erinomainen vaikutus annettaessa reperfuusion tapahtua ku-30 dokseen sydäninfarktien yhteydessä, antamalla samanaikai sesti SOD:tä ja/tai muita happiradikaaleilta suojaavia tekijöitä ja trombolyyttisiä tekijöitä, esim. kudoksesta peräisin olevaa plasminogeenin aktivaattoria. SOD-kokeissa saadut tulokset viittaavat myös mahdolliseen käyttöön sy-35 dänkirurgian ja sydänsiirtojen yhteydessä. Vastaavasti voi- 100252 27 daan tuloksia, jotka on saatu käytettäessä SODrtä munuaisten iskemian ja sitä seuraavan reperfuusion yhteydessä, soveltaa munuaissiirtojen ja muiden elinsiirtojen, kuten esimerkiksi ihon-, keuhko-, maksa- tai haimasiirtojen yhtey-5 dessä. Iskemia-aivosairaus on vielä eräs mahdollinen hoi- donaihe.
SOD:t osoittavat mielenkiintoisia suojaavia vaikutuksia muiden patologisten tilojen yhteydessä.
Siten koiran haimaan aiheutettiin haimatulehdus kol-10 mella eri tavalla: infusoimalla öljyhappoa, tukkimalla osittain eritystiehyet ja iskemian ja sitä seuraavan perfuu-sion avulla. SOD:n, katalaasin ja S0D:n + katalaasin todettiin suojaavan ja käsittely yhdistelmällä oli yleensä kaikkein tehokkain. Iskemiamallissa SOD oli kuitenkin yksin 15 melkein yhtä tehokas kuin SOD:n ja katalaasin yhdistelmä (Sanfey et ai., Ann. Surg. 200, 1984, ss. 405-413). SOD:n + katalaasin on selostettu parantavan seruleiinilla aiheutettua haimatulehdusta rotilla (K.S. Guice et ai., Am. J. of Surg. 151, 1986, ss. 163-169). Tulokset viittaavat ak-20 tiivisen hoidon mahdollisuuteen tätä tautia vastaan, jol le ei tällä hetkellä ole olemassa erityishoitoa.
On myös esitetty, että käsittely SOD:llä on tehokasta palovammoja vastaan. Rotille kokeellisesti aiheutetun lievän palovamman jälkeistä paikallista turvotusta voitiin 25 jonkin verran vähentää ruiskuttamalla SOD:tä (Björk ja
Artursson, Burns 9, 1983, ss. 249-256). Eläinmallissa, jossa oli kysymys hiirten vakavasta palovammasta, saatiin SOD:n avulla aikaan huomattava suojaus, koskien hengissä säilymistä ja paikallista vahingoittumista (Saez et ai., 30 Circulatory Shock 12, 1984, ss. 220-239).
Kun on kysymys esimerkiksi palovammoista, immuno-kompleksien muodostumisesta ja suuresta kudosvauriosta, kertyy keuhkoihin neutrofiilisiä leukosyyttejä. Komplementin aktivoituminen (C5 a) näyttää usein saavan välittämäl-35 lä aikaan kertymisen. Leukosyytit näyttävät olevan aktivoi- 2β 100252 tuneita ja vapauttavan happiradikaaleja, aiheuttaen siten keuhkon vaurioitumista, jolle on tunnusomaista esimerkiksi lisääntynyt suonten läpäisevyys ja keuhkon turvotus (aikuisen hengityshäiriö). Useissa eläinmalleissa on 5 SOD:n ja muiden happiradikaalien poistajien osoitettu omaavan suojaavan vaikutuksen keuhkon vaurioitumista vastaan (Tili ja Ward, Agents and Actions, Suppl. 12, 1983, ss. 383-396).
Ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta annetun CuZn-SOD:n 10 on selostettu estävän bronkopulmonaalista dysplasiaa keskosilla, jotka kärsivät lapsen hengityshäiriöstä (W. Rosenfeld et ai., J. Pediatr. 105, 1984, ss. 781-785).
Jäniskoiranpentumallissa on SOD:n ruiskuttamisen selostettu vähentävän matalan verenpaineen jälkeisen laski-15 mon sisäisen aivoverenvuodon esiintymistiheyttä (L.R. Ment et ai., J. Neurosurg. 62, 1985, J63-J69).
SOD parantaa rotilla hepatiittia, joka on aiheutettu ruiskuttamalla Corynebacterium parvumia (M.J.P. Arthur et ai., Gastroenterology 89, 1985, ss. 1114-1122).
20 Endoteelistä peräisin oleva verisuonten jännitys tä laukaiseva tekijä on hyvin herkkä superoksidille, ja SOD:n antaminen vahvistaa sen vaikutuksia (R.J. Gryglewski et ai., Nature 320, 1986, ss. 454-456; G.M. Rubanyi et ai., Am. J. Physiol. 250, 1986, ss. H822-H827). Superoksidira-25 dikaalin muodostumista voi tapahtua kehossa monissa olosuh teissa ja se voi aiheuttaa verisuonten supistumista ja vähentynyttä kudosten perfuusiota. SOD:n antamisen uskotaan kykenevän lievittämään tällaista verisuonten supistumista.
Äkillinen voimakas verenpaineen kohoaminen johtaa 30 funktionaalisiin ja morfologisiin poikkeavuuksiin aivojen pikkuvaltimoissa. Prostaglandiinisynteesin inhibiittoreiden \ ja superoksididismutaasin uskotaan voivan suojata näiltä epänormaaliuksilta. Superoksidin vapautumista voidaan todeta (H.A. Kontos, Circ. Res. 57, 1985, ss. 508-516) . Mal-35 Iin lähempi analyysi on johtanut päätelmään, että superoksi- 29 100252 diradikaaleja muodostuu prostaglandiinisynteesin aikana sivutuotteena. Tulokset viittaavat siihen, että prostaglan-diinisynteesissä vapautuneiden superoksidiradikaalien aiheuttamaa kudosten vaurioitumista voi tapahtua muissakin 5 patologisissa tilanteissa ja että SODrllä voi olla suo-jaava vaikutus.
Elatusaineessa olevan CuZn-SOD:n + katalaasin on selostettu pitkittävän perfusoidun eristetyn kaniinin sarveiskalvon kunnossa säilymistä (O.N. Lux et ai., Curr. Eye Res., 10 4, 1985, ss. 153-154). CuZn-SOD + katalaasi suojaavat eris tettyä mykiötä fotoperoksidoitumiselta (S.D. Varma et ai., Ophtalmic Res. 14, 1982, ss. 167-175). Tulokset viittaavat siihen, että S0D:llä voi mahdollisesti olla hyödyllisiä vaikutuksia sarveiskalvosiirtojen ja muiden silmäkirurgis-15 ten toimenpiteiden yhteydessä.
Ruoansulatuskanavan ulkopuolisesti annetulla SODjllä on selostettu olleen parantava vaikutus sellaisten äkillisten tilojen eläinmalleissa kuin disseminoitu intravaskulaa-rinen koagulaatio (T. Yoshikawa et ai., Thromb. Haemostas.
20 50, 1983, ss. 869-872) ja verenmyrkytys (H.F. Welter et ai.,
Chirurgisches Forum '85 f. experim. u. klinischer Forschung, Springer-Verlag, Berlin, 1985).
Eri tyyppisissä autoimmuunisairauksissa, kuten esimerkiksi koko elimistöön vaikuttavassa lupus erythematosus 25 (SLE) -sairaudessa, koko elimistöön vaikuttavassa skleroo sissa ja nivelreumassa, on osoitettu lymfosyyteissä tapahtuvan lisääntyneesti kromosomin katkeamisia (Emerit, "Properties and action mechanisms of clastogenic factors", teoksessa Lymphokines, osa 8, toim. E. Pick, Academic Press, 30 1983, ss. 413-424). Fibroblastiviljelmissä ja suoraan luu- ytimestä saaduissa preparaateissa esiintyy myös joskus lisääntyneesti katkeamisia. Tällaisten potilaiden plasma sisältää kromosomia katkovan - klastogeenisen - tekijän. Joissakin tapauksissa on samanlainen tekijä todettu myös nivel-35 voidenesteessä ja aivoselkäydinnesteessä (disseminoitu skleroosi) , Katkeamia esiintyy normaaleissa lymfosyyteissä, 100252 30 joita viljellään yhdessä autoimmuunisairautta potevilta potilailta peräisin olevien lymfosyyttien kanssa. Potilailta peräisin olevat lymfosyytit saavat viljelyaineen tuottamaan kromosomin murtumia. SLE-plasman klastogeenistä aktiivisuut-5 ta voidaan lisätä UV-säteilytyksen avulla. Superoksidin muo dostuminen plasmassa ksantiinioksidaasin ja ksantiinin vaikutuksesta johtaa klastogeenisen aktiivisuuden muodostumiseen. Kaikissa yllä kuvatuissa malleissa suojasi CuZn-SOD:n lisääminen elatusaineeseen klastogeenistä aktiivisuutta vas-10 taan (Emerit, imibd.). Tämä viittaa siihen, että sekä klastogeenisen tekijän muodostumiseen että sen vaikutuksiin liittyy superoksidiradikaaleja (Emerit, ibid.).
SLE:n eläinmallissa Uuden Seelannin mustassa hiiressä, jolla on klastogeeninen tekijä, luuydinsolujen kromoso-15 mit saadaan suojattua in vivo ruiskuttamalla yhä uudelleen SOD:tä (Emerit et ai., Cytogenet. Cell Genet. 30, 1982, ss. 65-69). On kuitenkin vielä epäselvää, missä määrin klastogeeninen tekijä myötävaikuttaa ihmisen autoimmuunisairauden pääoireisiin ja onko SOD:n antamisella mitään te-20 rapeuttista vaikutusta.
Solujen neoplastinen transformoituminen jaetaan yleensä kahteen vaiheeseen, s.o. aloitukseen, jota seuraa edistyminen. In vitro-malleissa, joissa alkamisen on aiheuttanut ionisoiva säteily, bleomysiini, misonidatsoli ja muut 25 nitroimidatsolit, onkogeenisen transformoitumisen on estä nyt tehokkaasti SOD:n läsnäolo elatusaineessa. SOD:n ei ole välttämätöntä olla läsnä annettaessa alkuunpanevien aineiden vaikuttaa, mikä näyttää viittaavan siihen, että entsyymi inhiboi myöhempää edistymisvaihetta (Miller et ai., 30 Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 8, 1982, ss. 771-775; , Borek ja Troll, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 80, 1983, ss. 1304-1307). Ei-myrkylliset annokset ksantiinia + ksan-tiinioksidaasia aiheuttavat tällaista edistymistä kasvavissa soluissa. SOD:n tai SOD:n + katalaasin lisääminen es-35 tää tämän vaikutuksen (Zimmerman ja Cerutti, Proc. Nat.
100252 31
Acad. Sei. USA 81, 1984, ss. 2085-2087). Forbolinesterit ovat tunnettuja edistäjiä. Mallissa jossa aiheutettiin ihokasvaimia suorittamalla aloitus bentsantraseenilla ja käyttämällä sen jälkeen forbolin esteriä (TPA), ulkoinen käsit-5 tely SOD-aktiivisuuden omaavalla lipofiilisella kuparikomp- leksilla vähensi suuresti kasvaimen muodostumista (Kenzler et ai., Science 221, 1983, ss. 75-77). Tulos osoittaa, että superoksidiradikaalit ainakin joissakin tapauksissa myötävaikuttavat kasvaimen muodostuksen edistymiseen ja 10 että SOD voi suojata tätä vaikutusta vastaan.
On syytä uskoa, että happiradikaalit ovat lisäsyynä vahingoittaviin vaikutuksiin, joita on joukolla myrkyllisiä aineita, kuten esimerkiksi bleomysiinillä, adriamy-siinillä, alloksaanilla, 6-hydrodopamiinilla, parakvaa-15 tiliä, dihydroksifumaarihapolla, nitrofurantoiinilla ja streptotsotosiinilla. Niissä tapauksissa, joissa radikaalien muodostus tapahtuu solunulkopuolisessa tilassa, saattaisi olla mahdollista suojata ruiskutetun suojaavan entsyymin avulla. Siten SOD voi suojata alloksaanin sokeritautia 20 aiheuttavaa vaikutusta (se vaurioittaa β-soluja haimassa) vastaan in vitro (Grankvist et ai., Biochem. J. 182, 1979, ss. 17-25) ja in vivo (Grankvist et ai. Nature 294, 1981, ss. 158-160). Alloksaanin vahingoittavassa vaikutuksessa näyttää sen vuoksi toimivan välittäjänä superoksidiradikaa-25 li tai muut siitä saadut happiradikaalit. J?-solujen suuren alloksaaniherkkyyden syy ei ole selvä, ja on pohdittu saattaisiko olla yhteyttä alloksaaniherkkyyden ja insuliinista riippuvaisen sokeritaudin esiintymisen välillä. Sokeritaudissa Langerhansin saarekkeisiin tunkeutuu tulehduksellisia 30 soluja, jotka voivat mahdollisesti muodostaa happiradikaa- , leja. Sen vuoksi voi olla mahdollista suojata y?-soluja : antamalla ruiskeina SODrtä aivan sokeritaudin alussa.
On selostettu (Mossman ja Landesman, Chest 835, 1983, ss. 50s-51s), että elatusaineeseen lisätty SOD suojaa henki-35 torven soluja asbestin vaikutuksia vastaan.
32 100252
On kuvattu (Roberts et ai., J. Urol. 128, 1982, ss. 1394-1400), että ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta annettu CuZn-SOD suojaa munuaisia kokeellisesti aiheutettua pyelonefriittiä vastaan. SOD ja etenkin katalaasi suo-5 jaa äkillistä nefrötöksistä nefriittiä vastaan, joka on aiheutettu rotille kerästen peruskalvon vastaisten vasta-aineiden avulla (A. Rehan et ai., Lab. Invest. 51, 1984, ss. 396-403).
Yllä kuvatuissa kokeissa on yleensä käytetty koeai-10 neena CuZn-SOD:tä. Otaksutaan kuitenkin, että EC-SOD:tä voidaan käyttää samoihin tarkoituksiin ja, kuten edellä on esitetty, suuremmalla tehokkuudella, johtuen sen erityisominaisuuksista, joiden ansiosta EC-SOD:tä voidaan erityisen mielellään haluta käyttää solunulkopuolisessa tilassa.
Tässä yhteydessä esitetään lisäksi farmaseuttista valmistetta, joka sisältää EC-SOD:tä yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän täyteaineen, laimennusaineen tai ve-hikkelin kanssa. Valmisteen sisältämä EC-SOD voi olla peräisin mistä tahansa yllä käsitellyistä lähteistä, s.o. yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla, solulinjasta tai kudoksesta saatu.
Sopiva, s.o. terapeuttisesti tehokas annostus koko elimistöön kohdistuvaa hoitoa varten arvioidaan ihmisen kehon EC-SOD-pitoisuuden perusteella. EC-SOD on tär-25 kein SOD ihmisen plasmassa, ja kokona!saktiivisuus (joka koostuu fraktioista A, B ja C, vrt. esimerkki 2) on noin 20 U/ml. Ruiskuttamalla 200 IU hepariinia kg:a kohden ruumiin painoa saadaan aikaan EC-SOD-fraktion C suureneminen noin 23.U/ml, vrt. esimerkki 9. Vaikka tämä hepa-30 riiniannos on hyvin suuri, ei ilmeisesti saatu aikaan maksimaalista vapautumista, vrt. esimerkki 9. Olettaen, että suonten endoteelistä voi vapautua suurin piirtein kaksi kertaa niin paljon EC-SOD-fraktiota C, vastaisi suonten koko EC-SOD-pitoisuus noin määrää 66 U/ml plasmaa (20+2 x 35 23 U/ml). Plasman kokonaistilavuus on noin 4,7 % ruumiin painosta vastaten noin 3,3 1 70 kg painavalla henkilöllä.
1 yksikkö EC-SOD:tä vastaa noin 8,8 ng. EC-SOD:n kokonais- 33 100252 määrä verisuonissa (plasmassa ja suonten endoteelillä) on _g sen vuoksi 3300 x 66 x 8,8 x 10 g = 1,92 mg. Kymmenkertainen lisäys vaatisi 19 mg ja 300-kertäinen lisäys 575 mg EC-SOD-C:tä. Sopiva EC-SOD:n annostus voi sen vuoksi olla 5 väliltä noin 15-600 mg/päivä, riippuen mm. EC-SOD:n antamisen aiheena olevan tilan tyypistä ja vakavuudesta. Ruiskuttamalla esimerkiksi 87 mg EC-SOD-C:tä (50-kertainen lisäys) saataisiin tulokseksi määrä 26 ^ug/ml plasmaan (jättäen huomioimatta endoteeliin sitoutuminen). Tällä tai 10 jopa alemmilla konsentraatioilla ilmenee voimakkaita suo-jaavia ominaisuuksia in vitro -kokeissa (käytettäessä CuZn-SOD:tä) (vrt. A. Baret, I. Emerit, Mutation Res. 121, 1983, ss. 293-297; K. Grankvist, S. Marklund, J.O. Sehlin, I.B. Täljedal, Biochem. J. 182, 1979, ss. 17-25).
15 EC-SOD-ruiskeiden annostus ja ajoitus riippuu ent syymin puoli-iästä ihmisen verisuonissa, jota ei vielä tunneta. Kaniineilla ihmisen EC-SOD:n puoli-iäksi saatiin noin 18 tuntia (vrt. esimerkki 10). Ihmisissä puoli-ikä on luultavasti pitempi. Olettaen että kinetiikka on ensim-20 mäisen kertaluvun ja puoli-ikä 36 tuntia, olisi päivittäisistä 35 mg:n ruiskeista, aluksi annetun 87 mg:n ruiskeen jälkeen, sen vuoksi tuloksena sama konsentraatio kuin ensimmäisenä annetun ruiskeen jälkeen.
Esimerkki 9 osoittaa, että EC-SOD-C voidaan saada . . 25 irtoamaan solujen pinnalta plasmaan hepariinin avulla.
Ruoansulatuskanavan ulkopuolisesti annettua hepariinia, muita sulfatoituja .glukoosiaminoglykaaneja ja muita vahvasti negatiivisesti varautuneita aineita voidaan käyttää endo-geenisen tai ruiskutetun EC-SOD-C:n sijainnin muuttamiseen 30 (vrt. esimerkit 9-11). Sijaitseminen plasmafaasissa voi olla hyödyllistä eräissä patologisissa tiloissa.
EC-SOD koostuu kolmesta fraktiosta, A:sta, jolla ei ole ollenkaan, B:stä, jolla on heikko, ja C:stä, jolla on voimakas affiniteetti hepariiniin. Erilaisten affini-35 teettien syitä ei vielä tiedetä mutta fraktiot ovat useiirt- 34 1 0 0 2 5 2 missä suhteissa hyvin samanlaisia. Elektroforeesi PAGE-SDS-geeleissä ei paljasta eroja, aminohappokoostumukset näyttävät olevan identtiset (S. Marklund, Proc. Natl. Acad.
Sei. USA 79, 1982, ss. 7634-7636), ja A:ta ja C:tä vastaan 5 tuotetut vasta-aineet näyttävät reagoivan samoin kaikkien kolmen fraktion kanssa (S. Marklund, Biochem. J. 220, 1984, ss. 269-272). Fraktiot voi tuottaa sama geeni ja muuntaminen voi tapahtua translaation jälkeen. Kaikki kolme fraktiota ovat olemassa tuoreessa plasmassa (vrt. esi-10 merkki 9) ja ovat fraktio, jonka farmakokinetiikkaa on käsitelty yllä. C on myös se fraktio, joka valmistetaan yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla (vrt. esimerkki 13). On kuitenkin mahdllista että myös EC-SOD-fraktiot A ja B voivat olla terapeuttisesti hyödyllisiä patologisissa tilois-15 sa, joissa suuri SOD-aktiivisuus liuoksessa on tärkeä.
Paikallista hoitoa varten tarvitaan luultavasti paljon vähemmän EC-SOD:tä kuin yllä on ilmoitettu. Nykyään annetaan 4-8 mg CuZn-SOD:tä nivelen sisään kerran viikossa hoidettaessa niveltulehdusta. EC-SOD, jonka molekyyli-20 paino on paljon suurempi, jää todennäköisesti niveleen pitemmäksi ajaksi. Samanlainen hoito-ohjelma tai mahdollisesti gonkin verran pienemmät annokset ovat luultavasti sopivia.
Ennen käyttöä tulisi EC-SOD:tä sisältävä valmiste ' 25 mieluimmin säilyttää kuivana, s.o. lyofilisoituna. Koko elimistöön kohdistuvaa hoitoa ja paikallisia ruiskeita varten EC-SOD voidaan sopivasti valmistaa ruoansulatuskanavan ulkopuolista antamista varten, esim. liuottaa sopivaan, myrkyttömään, fysiologisesti hyväksyttävään liuot-30 ttimeen, kuten esimerkiksi isotooniseen suolaliuokseen.
Ulkoista käyttöä varten tarkoitettu farmaseuttinen valmiste voi olla esimerkiksi salvana, huuhtelunesteenä, suihkeena, voiteena tai aerosolina, joka sisältää EC-SOD:tä.
Lisäksi on mahdollista, että EC-SOD voi farma-35 seuttisessa valmisteessa olla edullisesti yhdistettynä katalaasin kanssa, joka dismutatoi vetyperoksidia seu-raavalla tavalla: 100252 35 katalaasi H2°2 * H2°2 ^ °2 * 2H2° EC-SOD:n ja katalaasin yhteinen vaikutus vähentää 5 lisäksi hydroksyyliradikaalin muodostumista, jonka radikaa lin uskotaan, kuten yllä on kuvattu, olevan happiradikaa-leista myrkyllisimmän. Katalaasin sijasta voidaan käyttää muuta antioksidanttia, joka toimii yhdessä EC-SOD:n kanssa hapenpelkistystuotteiden myrkyllisten vaikutusten vähentä-10 miseksi.
On myös mahdollista, että yhdistelmät, joissa on EC-SOD:tä ja muita aineita, kuten esimerkiksi allopurino-lia (inhiboi ksantiinioksidaasia), hydroksyyliradikaalin poistajia (esim. mannitolia tai sulfhydryyliryhmän sisäl-15 täviä yhdisteitä) ja siirtymämetalli-ioneja kelatoivia aineita (esim. desferrioksamiinia), voivat olla hyödyllisiä.
Lisäksi sellaisissa käyttötapauksissa, joissa halutaan EC-SOD:n olevan läsnä plasmassa, voi olla edullista sisällyttää valmisteeseen hepariinia tai jotakin heparii-20 nin vastinetta, esim. heparaanisulfaattia tai muuta sulfa- toitua glukoosiaminoglykaania, dekstraanisulfaattia tai muuta vahvasti negatiivisesti varautunutta yhdistettä, jotta saataisiin hoidettavalla potilaalla solujen pinnalla läsnä oleva EC-SOD irtoamaan siten tuotettaisiin plasmaan lisä-* 25 annos EC-SOD:tä.
Sellaisen sairauden tai häiriön ehkäisemiseksi tai hoitamiseksi, johon liittyy superoksidiradikaalien läsnäolo tai muodostus, voidaan sellaisen hoidon tarpeessa olevalle potilaalle antaa terapeuttisesti tai ehkäisevänä tehokas määrä EC-SOD:tä. Sairaus tai häiriö voi olla mikä tahansa yllä käsitellyistä. Iskemian ja sitä seuraavan reperfuusion aiheuttaman vaurioitumisen ehkäisemiseksi tai hoitamiseksi sellaisten elinten kuin munuaisen, keuhkon, haiman, sydämen, maksan tai ihon siirron yhteydessä tai sydänkirur-*5 gian yhteydessä, voidaan antaa terapeuttisesti « 100252
Jo tai ehkäisevänä tehokas määrä EC-SOD:tä ennen kirurgiaa, sen aikana tai sen jälkeen. Kummassakin menetelmässä voi terapeuttisesti tai ehkäisevänä tehokas annostus käsittää noin 15-600 mg/päivä EC-SOD:tä, riippuen mm. hoidet-5 tavan tilan tyypistä ja vakavuudesta. Tässä menetelmässä voi olla edullista antaa samalla hepariinia tai muuta vahvasti negatiivisesti varautunutta yhdistettä, kuten yllä on esitetty, ja/tai katalaasia tai samankaltaisen vaikutuksen omaavaa antioksidanttia, kuten myös on esi-10 tetty yllä.
Kuvaus piirroksista
Keksintöä on kuvattu lisäksi piirrosten avulla, joissa
Kuvio 1 on graafinen esitys, joka kuvaa proteiinin 15 ja EC-SOD:n eluoitumista sen jälkeen kun EC-SOD:tä sisäl tävän materiaalin on annettu immunoadsorboitua anti-EC- <fö SOD-Sepharoseen*^ (vrt. esimerkki 4).
Kuvio 2 on graafinen esitys, joka kuvaa EC-SOD:n eluoitumista DEAE-Sephacelistä®(vrt. esimerkki 5).
20 Kuvio 3 on graafinen esitys, joka kuvaa EC-SOD:n eluoitumista hepariini-Sepharosesta® (vrt. esimerkki 6).
Kuvio 4 on autoradiogrammi, jossa näkyy yhdellä sellaisella nitroselluloosasuodattimella, jolle oli siirretty noin 20 000 'X gtll-plakkia, tpahtunut hybridisoituminen 25 48-meerisen koettimen kanssa. Autoradiogrammissa olevat tum-mat täplät edustavat ihmisen EC-SOD -cDNArta sisältäviä plakkeja (vrt. esimerkki 8).
Kuviot 5a ja 5b esittävät EC-SOD:n DNA-sekvenssiä ja pääteltyä aminohappojärjestystä (vrt. esimerkki 8).
30 Kuvio 6 esittää plasmidin pPS3 rakennetta. Valkeat alueet edustavat SV40:n DNA:ta ja numerot merkitsevät vas-:* taavia nukleotidiasemia SV40:ssä. SV40PE ja SV40-aloitus- kohta esittävät vastaavasti SV40:n aikaista promoottoria ja SV40:n replikaation aloituskohtaa, ja nuolet osoittavat 35 vastaavasti transkription ja DNA:n replikoitumisen suunnan.
37 10C2S2
SV40:n polyadenylointisignaalit sijaitsevat asemien 2770 ja 2533 välillä. Viivoilla varjostettu alue edustaa ihmisen EC-SOD -cDNA:ta. Yhtenäinen musta alue edustaa plasmi-o R
din pBR322 Aj-laktamaasigeeniä (AP ). Ohuet viivat edus-5 tavat plasmidin pBR322 DNA:ta. On myös osoitettu pBR322:n replikaation aloituskohta.
Kuvio 7 esittää laskimoon ruiskutetun hepariinin vaikutusta plasman EC-SOD:hen. 200 IU hepariinia kg:a kohden ruumiin painoa annettiin ruiskeena kahdelle terveel-10 le miehelle ajankohtana nolla ja plasmaa otettiin talteen ennen tätä ja osoitettuina ajankohtina tämän jälkeen.
EC-SOD-aktiivisuus määritettiin kuten on kuvattu esimerkissä 9.
Kuvio 8 esittää laskimoon ruiskutetun hepariinin 15 EC-SOD:tä vapauttavan aktiivisuuden riippuvuutta annok sesta. Hepariinia ruiskutettiin kahdelle terveelle miehelle laskimoon ilmoitettuina annoksina ja verta otettiin talteen ennen hepariiniruisketta ja 10 ja 15 minuuttia sen jälkeen. Ajankohtana 15 minuuttia annettiin ruiskee-20 na lisäannos hepariinia määrään 200 IU/kg ruumiin painoa saakka ja verta otettiin talteen 10 minuuttia sen jälkeen. EC-SOD määritettiin plasmasta kuten on kuvattu esimerkissä 9. Ennen hepariinin ruiskuttamista saadun EC-SOD-aktii-visuuden ja toisen hepariiniruiskeen jälkeen saadun aktii-25 visuuden välistä eroa pidettiin 100-prosenttisena vapautu misena. Ennen hepariinin ruiskuttamista saadun aktiivisuuden ja 10 minuuttia ensimmäisen annoksen jälkeen otettujen näytteiden keskimääräisen aktiivisuuden välinen ero on esitetty suhteessa "100-prosenttiseen vapautumiseen".
30 Erilliset kokeet suoritettiin pitäen vähintään 4 päivän väliajat (vrt. esimerkki 9) .
.. Kuvio 9 esittää plasman erottelemista hepariini-
Sepharosen®avulla. Ihmisen plasmaa, joka oli otettu talteen ennen hepariinin antamista (o) ja 10 minuuttia las-35 kimoon annetun hepariiniruiskeen (200 IU/kg ruumiin painoa) 38 100252 (6) jälkeen (Δ>) , eroteltiin hepariini-Sepharosen^ avulla kuten on kuvattu esimerkissä 9. (·) merkitsee ennen hepariinin antamista otetun plasmanäytteen kromatografiän tulosta, kun on suoritettu esikäsittely anti-EC-SOD-Sepharosella®
5 EC-SOD:n poistamiseksi. Yhtenäinen viiva esittää absorbans-sia 280 nm:n aallonpituudella ja pisteviiva NaCl-gradient-tia. EC-SOD-fraktiot A, B ja C määritettiin kuvassa esitetyistä yndistämällä saaduista eluaatin osista. Osissa B
ja C oleva aktiivisuus edustaa ainoastaan EC-SOD:tä, Siirto) 10 lä kaikki aktiivisuus adsorboitui anti-EC-SOD-Sepharoseen**. Osa A sisältää myös CuZn-SOD:tä ja syanidille vastustuskykyistä SOD-aktiivisuutta. Fraktion A EC-SOD-aktiivisuus määritettiin sen vuoksi immobilisoitujen vasta-aineiden avulla kuten on kuvattu esimerkissä 9 plasmaa varten. EC-SOD-frak-15 tiot A, B ja C käsittivät 5,2, 4,4 ja 5,1 U/ml ennen hepariinin antamista otetussa plasmassa ja 7,7, 5,7 ja 29,4 U/ml hepariinin antamisen jälkeen otetussa plasmassa. EC-SOD-aktiivisuuden talteensaanti oli kromatogrammeissa vastaavasti 84 % ja 83 %. Huomattakoon, että osan A suurempi 20 SOD:n kokonaisaktiivisuus ennen hepariinin antamista otetun plasman kromatogrammissa johtuu näytteessä tapahtuneesta hemolyysistä, joka on vapauttanut punasoluista CuZn-SOD:tä (vrt. esimerkki 9).
Kuviot 10 ja 11 ovat graafisia esityksiä, jotka ku-125 25 vaavat ihmisen, I:lla leimatun eC-SOD:n kaniineihin ruis-. kuttamisen vaikutusta ja hepariinin ruiskuttamisen vaiku tusta (vrt. esimerkki 10).
Kuvio 12 on graafinen esitys, joka kuvaa yhdistelmä-DNA-tekniikan a saadun EC>SOD:n eluoitumista monoklonaalinen 30 anti-EC-SOD -Sepharosesta^-'{vrt. esimerkki 17).
Kuvio 13 on graafinen esitys, joka kuvaa yhdistelmä-DNA-tekniikalla saadun EC-S0D:n eluoitumista DEAE-Sephace- (Gs lista0' (vrt. esimerkki 17) .
Kuvio 14 on graafinen esitys, joka kuvaa yhdistelmä-35 DNA-tekniikalla saadun EC-SOD:n eluoitumista hepariini-
Sepharosesta® (vrt. esimerkki 17).
39 100252
Kuvio 15 esittää alkuperäisen ja yhdistelmä-DNA-tekniikalla saadun EC-SOD:n elektroforeesia gradientti-polyakryyliamidigeeleissä natriumdodesyylisulfaatin läsnä ollessa (vrt. esimerkki 19).
5 Esimerkki 1
Napanuorahomogenaattien valmistus
Ihmisen napanuoria otettiin talteen Umeän yliopistollisen sairaalan synnytysosastolla. Ne pidettiin osastolla jääkaapissa ja jäädytettiin laboratoriossa nopeas-10 ti -80°C:ssa ja säilytettiin sitten -30°C:ssa ennen käyttöä.
Sulattamisen jälkeen napanuorat hienonnettiin.
Ne suspendoitiin sitten 50 ml:aan K-fosfaattipuskuria, pH 7,4, joka sisälsi 0,3 M KBr:a, 3 mM DTPA:ta, 15 100 000 kIU/1 Trasylolii^ (aprotiniinia) ja 0,5 mM fe- nyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF). Käytettiin 4 1 puskuriliuosta kg:a kohden napanuoraa. Käytettiin kaotrooppista suolaa KBr lisäämään EC-S0D:n uuttumista kudoksesta (noin 3-kertaisesti). DTPA:ta, Trasylolia® 20 ja PMSF:ä lisättiin inhiboimaan proteaaseja. Suspensio • homogenoitiin sitten Waring-sekoittimessa ja sitä käsiteltiin lopuksi sonikaattorilla. Sitä ravisteltiin sitten 4°C:ssa 1 tunnin ajan. Saadut homogenaatit sentri-fugoitiin (6000 x g, 20 min.) ja supernatantit jäädytet-25 tiin nopeasti -80°C:ssa ja säilytettiin lopuksi -30°C:ssa.
Esimerkki 2
Ihmisen keuhkon EC-SOD:n valmistus ja puhdistaminen
Ihmisen keuhkot saatiin 24 tunnin sisällä kuoleman jälkeen suoritetussa ruumiinavauksessa yhdeksältä 30 potilaalta, joilla ei ollut ilmennyt keuhkosairautta.
Keuhkot leikattiin kappaleiksi ja ylimäärä verta pestiin : pois 0,15 M NaCl:ssa. Palaset homogenoitiin Waring-sekoit timessa 5 tilavuudessa jääkylmää 50 mM Na-asetaattia pH:ssa 5,50. Homogenaatti sonikoitiin sitten, sen an-35 nettiin uuttua 30 minuutin ajan 4°C:ssa ja lopuksi sent-rifugoitiin (6000 x g) 20 minuutin ajan.
40 100252
Supernatantti adsorboitiin kertaeränä DEAE-Sephaceliiii^ (hankittu toiminimeltä Pharmacia, Uppsala, Ruotsi) (1 tilavuus 25 tilavuutta kohden homogenaattia), joka oli tasapainoitettu pH:n 5,50 omaavalla 50 mM Na-ase-5 taatilla. Ioninvaihdin pestiin sitten puskuriliuoksella, pakattiin pylvääseen ja eluoitiin gradientilla, jonka muodosti 0-200 mM NaCl asetaattipuskurissa. Gradientin tilavuus oli 10 kertaa kolonnin tilavuus.
Edellisessä vaiheessa saadut aktiiviset fraktiot 10 yhdistettiin, laimennettiin 1,5 tilavuudella tislattua vettä ja titrattiin pH:hon 8,4 1 M NaOH:lla. Saatu liuos adsorboitiin jälleen kertaeränä DEAE-SephaceliiitB> joka oli tasapainotettu pH:n 8,4 omaavalla 175 mM Tris*HCl:lla ( = 1 tilavuus ioninvaihdinta 10 tilavuutta kohden saatua 15 liuosta). DEAE-Sephacer4^ pestiin tämän jälkeen puskuri-liuoksella, pakattiin pylvääseen ja eluoitiin 10 kolonnin tilavuutta käsittävällä 0-200 mM NaCl-gradientilla Tris-puskuriliuoksessa.
Yhdistetyt edellisessä vaiheessa saadut fraktiot 20 konsentroitiin ja dialysoitiin 150 mM Na-fosfaattia vas
taan, jonka pH oli 6,5. Näyte syötettiin fenyyli-Sepha-rose®'- (hankittu toiminimeltä Pharmacia, Uppsala, Ruotsi) pylvääseen (noin 1 ml geeliä 15 mg:a kohden näytteessä olevaa proteiinia), joka oli tasapainoitettu samalla pus-25 kuriliuoksella. Aktiivisuus eluoitiin 20 kolonnin tila-. vuutta käsittävällä 0 - 0,5 M KBr-gradientilla 50 mM
Na-fosfaatissa, jonka pH oli 6,5.
(r)
Fenyyli-Sepharosesta^ saadut aktiiviset fraktiot yhdistettiin, konsentroitiin ja dialysoitiin 0,15 M 30 Na-fosfaattia vastaan, jonka pH oli 6,5. Näyte syötettiin (K)
Con A -Sepharose^- (hankittu toiminimeltä Pharmacia, ; Uppsala, Ruotsi) pylvääseen (1 ml geeliä 2 mg:a kohden näytteessä olevaa proteiinia), joka oli tasapainotettu fosfaattipuskurilla, ja pulssi eluoitiin sitten fosfaat-35 tipuskuriliuoksessa olevalla 50 mMc^-metyyli-D-mannosi-dilla.
41 100252 (R)
Con A -Sepharosesta^ saadut aktiiviset fraktiot yhdistettiin, konsentroitiin, syötettiin Ultrogel ACA -34 -pylvääseen (2,5 x 83 cm) (hankittu toiminimeltä LKB,
Tukholma, Ruotsi) ja eluoitiin 50 mM Na-fosfaatilla, jon- -1 -2 5 ka pH oli 6,5. Eluutionopeus oli 5 ml»tunti *cm
Eluutiossa saadut aktiiviset fraktiot yhdistettiin, konsentroitiin ja syötettiin vehnänalkiolektiini-Sepharose® -pylvääseen (10 ml) (hankittu toiminimeltä Pharmacia, Uppsala, Ruotsi), joka oli tasapainotettu 10 0,15 M Na-fosfaatilla, jonka pH oli 6,5. Entsyymi pulssi- eluoitiin fosfaattipuskurissa olevalla 0,45 M N-asetyyli-D-glukosamiinilla.
Yllä olevasta vaiheesta saadut aktiiviset fraktiot yhdistettiin, konsentroitiin, dialysoitiin 0,15 M Na-fos-15 faattia vastaan, jonka pH oli 6,5, ja syötettiin sininen Sepharose®CL-6B (Cibacron Blue F3G-A) -pylvääseen (pakatun kolonnin tilavuus 6 ml) (hankittu toiminimeltä Pharmacia, Uppsala, Ruotsi), joka oli tasapainotettu fosfaattipuskurilla. Sen jälkeen kun pylvästä oli pesty puskuriliuoksel-20 la, aloitettiin pulssieluutio 10 mM NAD:llä ja 10 mM
NADPillä puskuriliuoksessa. Sen jälkeen kun pyridiininukleo-tidit oli pesty pois pylväästä puskuriliuoksella, pulssi-eluoitiin entsyymi 0,9 M KBr/50 mM Na-fosfaatilla, pH 6,5.
Sininen Sepharose® -pylväästä saadut aktiiviset 25 fraktiot yhdistettiin, dialysoitiin 25 mM Na-fosfaattia vastaan, jonka pH oli 6,5, ja syötettiin hepariini-Sepha-ros^ -pylvääseen (pakatun kolonnin tilavuus 10 ml) (hankittu toiminimeltä Pharmacia, Uppsala, Ruotsi), joka oli tasapainotettu samalla puskuriliuoksella. Pylväs eluoi-30 tiin sitten 140 ml:a käsittävällä fosfaattipuskuriliuok- sessa olevalla 0-1 M NaCl-gradientilla. Aktiivisuus eluoi-tui kolmena erillisenä piikkinä: A ei sitoutunut heparii-niin, B desorboitui gradientin aikaisessa vaiheessa ja C desorboitui myöhään.
42 1 0 0 2 5 2
Piikki A sisälsi UV-valoa absorboivaa materiaalia, joka oli todennäköisesti vuotanut hepariini-Sepharo-se®-pylväästä, ja puhdistettiin lisäksi Sephacryl® S-300 -pylväässä (1,6 x 90 cm) (hankittu toiminimeltä Pharmacia, 5 Uppsala, Ruotsi). Näyte eluoitiin 25 mM Tris*HCl:lla, jonka pH oli 7,5.
Fraktiot A, B ja C dialysoitiin 25 mM Tris«HCl:a vastaan, jonka pH oli 7,5, ja konsentroitiin sitten noin 1 ml:ksi Amicon UM-10 -ultra suodatuskalvojen avul-10 la. Fraktiota käytettiin EC-SOD:n vastaisten vasta-aineiden tuottamiseen, kuten on kuvattu seuraavassa esimerkissä.
Esimerkki 3
Kaniinin anti- ihmisen EC-SOD -vasta-aineiden valmistus 15 EC-SOD, fraktio C, valmistettiin kuten on kuvattu esimerkissä 2. Kaniinille ruiskutettiin ihon alle 30 ^ug EC-SOD:tä Freundin täydellisessä adjuvantissa. Immunisointia tehostettiin ruiskuttamalla 5 kertaa 30 ^ug EC-SOD:tä Freundin epätäydellisessä adjuvantissa yhden kuukauden 20 väliajoin. 2 viikkoa viimeisen tehosteannoksen jälkeen kaniinista vuodatettiin veri kuoliaaksi asti ja seerumi otettiin talteen. Antiseerumin IgGxtraktio eristettiin adsorboimalla Proteiini A -Sepharose^ -pylvääseen ja desor-boimalla tuottajan suositusten mukaan (Pharmacia, Uppsala, 25 Ruotsi). Eluointi pylväästä suoritettiin 0,1 M glysiini- HCl:lla, jonka pH oli 3,0. Välittömästi eluoinnin jälkeen yhdistetty IgG titrattiin pH:hon 7,0. IgG:tä dialysoitiin sen jälkeen 0,1 M Na-karbonaattia, pH 8,3 + 0,15 M NaCl:a, "kytkentäpuskuria", vastaan.
(K) 30 CNBr-aktivoitu Sepharose^ turvotettiin ja valmistet- , tiin kuten tuottaja on suositellut (Pharmacia, Uppsala,
Ruotsi). Yllä kuvattu IgG laimennettiin noin 5-8 mg:ksi/ml "kytkentäpuskurilla". Lisättiin CNBr-aktivoitu Sepharose0^ ja seosta inkuboitiin ravistellen yön ajan 4°C:ssa. Kytket-35 tiin noin 5 mg IgG:tä ml:a kohden geeliä. Puskuriliuos 43 100252 imettiin pois geelistä ja siitä analysoitiin jäljelle jäänyt proteiini. Yleensä saadaan aikaan yli 98 % kytkeytyminen. IgG:hen kytketty geeli suojattiin sitten pitämällä sitä suspendoituna 1 M etanoliamiiniin yli yön 5 4°C:ssa. Sitten geeli pestiin "kytkentäpuskurilla" ja sen jälkeen 0,1 M Na-asetaatilla, pH 4,0 + 0,5 M NaCl:lla. Geeli säilytettiin sitten "kytkentäpuskurissa” atsidin toimiessa bakteerinvastaisena aineena.
Immobilisoitujen vasta-aineiden maksimaalinen si-10 tomiskapasiteetti määritettiin inkuboimalla yön yli lii- kamäärän EC-SOD:tä kanssa ja analysoimalla jäljelle jäänyt EC-SOD. Sentrifugoinnin jälkeen verrattiin tulosta (g) näennäisinkubointiin Sepharosen4* 4B kanssa.
100 ^ul 50 % anti-EC-SOD-Sepharose-suspensiota 15 lisättiin 0,5 ml:aan "kytkentäpuskurissa” olevaa EC-SOD:tä.
Suoritettiin rinnakkainen näennäisinkubointi käyttäen 100 yul 50 % Sepharose® 4B -suspensiota. Liuoksia ravisteltiin yön ajan 4°C:ssa ja sitten sentrifugoitiin. Jäljellä oleva aktiivisuus oli Sepharosella® 4B käsitellyssä 20 liuoksessa 2080 U/ml ja anti-EC-SOD-Sepharosella käsitel lyssä liuoksessa se oli 720 yksikköä (U)/ml. Näitä lukuja käyttäen voitiin laskea, että 1 ml anti-EC-SOD-Sepharose-geeliä sitoi 13500 yksikköä EC-SOD:tä (noin 120 ^ug). Tätä lukua käytettiin suunniteltaessa ihmisen 25 kudoksen homogenaateista peräisin olevan EC-SOD:n adsorp- • tiota.
Esimerkki 4 S) EC-SOD:n immunoadsorptio anti-EC-SOD-Sepharoseen*^
Kerrallaan käsiteltiin noin 10 1 esimerkissä 1 ku-30 vatulla tavalla valmistettua napanuorauutetta. Uutteen EC-SOD-pitoisuus oli noin 150 U/ml. Jos geeli sitoo • 13 600 U/ml (vrt. esimerkki 3), vaati kaiken 10 litrassa uutetta olevan EC-SOD:n adsorboituminen noin 110 ml anti-EC-SOD-Sepharosea.
44 100252
Ensin uute sentrifugoitiin (6000 x g, 30 min.) Saostuneen proteiinin poistamiseksi. Supernatanttiin lisättiin sitten 110 ml anti-EC-SOD-Sepharosea ja seosta inkuboitiin yön ajan 4°C:ssa sekoittaen. Geeli erotettiin 5 uutteesta lasisuppilossa. Geeli pestiin sitten suppilossa suurilla määrillä 50 mM K-fosfaattia, pH 7,0 + 0,5 M NaCl:a.
Geeli pakattiin kromatografiapylvääseen, jonka halkaisija oli 5 cm. Eluointi aloitettiin liuoksella, joka 10 sisälsi 50 mM K-fosfaattia, pH 7,0 + 0,5 M NaCl:a, nopeudella 50 ml/tunti ja rekisteröitiin absorbanssi 280 nm:n aallonpituudella. Eluointia jatkettiin, kunnes saavutettiin hyvin alhainen A^gg. EC-SOD eluoitiin sitten käyttäen lineaarista KSCN-gradienttia, 0,5 - 2,5 M, 50 mM K-fosfaa-15 tissa, pH 7,0. Gradientin kokonaistilavuus oli 500 ml, ja eluutio suoritettiin nopeudella 30 ml/tunti. EC-SOD:n desorboituminen oli hidasta eikä eluointia voitu nopeuttaa.
Eluoituva neste otettiin talteen fraktionkerääjään. Jotta suojattaisiin EC-SOD:tä suurelta KSCN-konsentraa-20 tiolta, sijoitettiin kolmihaarainen putki pylvään eluaatin luovuttavasta päästä tulevaan muoviletkuun ja johdettiin sisään tislattua vettä pylvää eluointinopeuteen verrattuna kaksinkertaisella nopeudella.
Aikaansaatu proteiinin ^280^ 3a EC"S0D:n eluoitu-25 minen on esitetty kuviossa 1. Kuviosta ilmenee, että !* EC-SOD:n eluoituminen ei ole tapahtunut täydellisesti gradientin päättyessä 2,5 M KSCNsään, mutta eluutiota ei jatkettu, jotta ei otettaisi talteen suuren KSCN-kon-sentraation vaikutuksesta liikaa denaturoitunutta EC-SOD:tä. 30 EC-SOD-fraktiot yhdistettiin kuten kuviossa on esi tetty. Gradientin vaikutuksesta ensimmäisenä eluoitunutta aktiivisuutta ei otettu talteen, sillä se sisälsi melko suuren määrän epäpuhtautena olevaa, epäspesifisesti sitoutunutta proteiinia (A^gg). Suurimman osan gradientin ai-35 kana saadusta A2ggistä on aiheuttanut KSCN, ja ainoastaan 45 100252 alussa on nähtävissä selvä pieni proteiinipiikki. Regene-rointia varten geeliä ravistellaan sitten yön ajan 2,5 M KSN:ssä, pestään sitten liuoksella, joka sisältää 50 mM K-fosfaattia, pH 6,5 + 0,5 M NaCl:a, ja sitten puskuri-5 liuoksella, joka ei sisällä NaCl:a. Lopuksi lisätään at-sidia bakteerinvastaiseksi aineeksi. Ennen käyttöä geeli pestään atsidittomalla 50 mM K-fosfaatilla, jonka pH an 6,5.
Esimerkki 5 - dö
Adsorptio DEAE-Sephaceliiir* ja eluointi siitä 10 Yhdistettyyn anti-EC-SOD-Sepharose-pylväästä saatuun eluaattiin lisättiin 1-aminometyylipropanolia siten, että lopulliseksi konsentraatioksi tuli 10 mM. Liuos titrat- tiin sitten pH:hon 9,0 1 M NaOH:lla. Liuos laimennettiin noin 5 tilavuudella tislattua vettä. Saatuun liuokseen (g) 15 lisättiin 40 ml DEAE-Sephacelia , joka oli tasapainotettu liuoksella 50 mM Na-fosfaatti + 0,5 M NaCl + 175 mM Tris-HCl, pH 9,6.
EC-SOD:n annettiin adsorboitua DEAE-Sephaceliin*^ sekoittaen yön ajan 4°C:ssa. DEAE-Sephacel® otettiin 20 sitten talteen lasisuppilossa, pestiin 50 mM Na-fosfaa tilla, pH 6,5, ja pakattiin kromatografiapylvääseen, jonka halkaisija oli 2,5 cm. Pylvästä eluoitiin ensin noin 4 tilavuudella yllä olevaa puskuriliuosta. EC-SOD eluoitiin sitten liuoksella, joka sisälsi 50 mM Na-fos-25 faattia, pH 6,5 + 0,25 M NaCl:a, kuten on esitetty ku- viossa 2. Aktiivisuus yhdistettiin kuten kuviossa 2 on esitetty, dialysoitiin 25 mM Na-fosfaattia, pH 6,5, vastaan ja konsentroitiin lopuksi noin 2 ml:ksi.
Esimerkki 6 30 EC-SOD:n lopullinen puhdistaminen käyttäen hepa- riini-Sepharosea® I Neljä erää yllä kuvattua DEAE-Sephacelista^ saa tua eluaattia eroteltiin kerrallaan hepariini-Sepharoseri^ avulla. Käytettävät entsyymiliuokset dialysoitiin 25 mM 35 K-fosfaattia, pH 6,5, vastaan.
46 100252 © 20 ml hepariini-Sepharose^-geeliä valmistettiin kuten tuottaja on suositellut (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi) ja pestiin 25 mM K-fosfaatilla, pH 6,5, joka sisälsi 1 M NaCl:a, ja sitten puskuriliuoksella, jossa ei ollut 5 NaCl:a. Hepariini-Sepharose^ pakattiin kromatografiapyl-vääseen, jonka halkaisija oli 2,5 cm, ja eluutio aloitettiin 25 mM K-fosfaatilla, pH 6,5, nopeudella 15 ml/tun-ti. EC-SOD-liuos (noin 10 ml, 800 000 yksikköä) syötettiin sitten pylvääseen ja rekisteröitiin absorbanssi aal-10 lonpituudella 280 nm (vrt. kuvio 3). Kun A2qq ensimmäisen piikin jälkeen lähestyi perusviivaa, eluoitiin EC-SOD käyttäen NaCl-gradienttia 0 - 1,2 M NaCl. Gradientin tilavuus oli 400 ml. EC-SOD eluoitui kolmena huippuna; yhdellä ei ollut affiniteettia hepariiniin, yhdellä oli 15 keskinkertainen affiniteetti, ja yhdellä oli suuri affi niteetti. Piikit vastaavat esimerkissä 2 kuvattuja fraktioita A, B ja C. Tällä menetelmällä puhdistettaessa on melkein kaikki aktiivisuus tyyppiä C, ja sen vuoksi pääteltiin, että tämä on todennäköisesti entsyymin alku-20 peräinen muoto. Piikki C yhdistettiin kuten on esitetty kuviossa 3.
Yhdistetty aktiivisuus oli 430 000 yksikköä (noin 4,3 mg). Spesifinen aktiivisuus oli 81100 (U mltssa/-A280^ ‘ SDS-PAGE-9eelist^ löydettiin noin 30 000 daltonin 25 alayksikköjä. Jälkeäkään epäpuhtaksista ei havaittu. Yh distetty aktiivisuus edusti noin 53 %:a hepariini-Sepha-roseen® syötetystä aktiivisuudesta.
Esimerkki 7
Ihmisen EC-SOD;n amino-terminaalinen sekvenssi 30 Edellä olevissa esimerkeissä kuvatulla tavalla saa dun ihmisen EC-SOD:n aminohappojärjestys (N-pään) analy-·, soitiin käyttäen yleisiä menetelmiä (Edman et ai.,
Eur. J. Biochem. 1, 1967, ss. 80-87). 33 ensimmäisen aminohapon järjestyksen todettiin olevan seuraava: 47 100252
TRP THR CLY GLU ASP SER ALA GLU PRO ASN SER ASP SER ALA GLU TRP ILE ARG ASP MET TYR ALA LYS VAL THR GLU 5 ILE TRP GLN GLU VAL MET GLN
Tätä sekvenssiä - tai sopivaa osaa siitä - voidaan käyttää synteettisten DNA-koettimien, yllä esitetyn aminohapposekvenssin koodittavan DNA-sekvenssin sekä koodattavalle että ei-koodittavalle säikeelle komplementaaristen syn-10 teettisten deoksioligonukleotidien, tuottamiseen
Sellaisia koettimia voidaan käyttää hybridisointiko-keissa cDNA-kokoelmien kanssa, jotka on tuotettu EC-SOD:tä tuottavista soluista tai kudoksista saadun mRNA:n avulla, jotta saataisiin eristettyä EC-SOD-geenin täysipitkä tai 15 osittainen cDNA-kopio, kuten on kuvattu seuraavassa esimerkissä.
Esimerkki 8
Ihmisen EC-SOD:n kloonaaminen ja sekvensointi DNA-koettimen valmistus 20 Ihmisen EC-SOD:tä puhdistettiin napanuorista suurin piirtein kuten on kuvattu yllä esimerkeissä 1-6 ja N-pään 33 ensimmäisen aminohapon järjestys määritettiin kuten on kuvattu esimerkissä 7. Tämän aminohappojärjestyksen ja eu-karyoottien proteiinien kohdalla edellytetyn kodonikäytön 25 perusteella (Grantham et ai., Nucl. Acids. Res. 3, 1981, ! ss. 43-47), sytentisoitiin seuraava synteettinen 48-meerinen deoksioligonukleotidi.
5'-CAGGGACATCTATGCCAAGGTGACTGAGATCTGGCAGGAGGTG
ATGCA-3' 30 joka on komplementaarinen EC-SOD-geenin koodattavalle säi-: keelle, Matthesin et ai. (EMBO Journal 3, 1984, ss. 801 - 805) kuvaaman menetelmän mukaan.
48 100252
Ihmisen istukan cDNA - kirjaston seulominen
Ihmisen istukan cDNA - kirjaston, joka oli valmistettu vektoriin Xgt11, hankittiin toiminimeltä Clontech Laboratories, Inc., 922 Industrial Avenue, Palo Aito, 5 CA 94303, USA (luettelon nro HL 1008, erä nro 1205). Yhdiste lmäfaagit seulottiin ihmisen EC-SOD -cDNA-sekvenssien suhteen sijoittamalla faagit levyviljelmiksi indikaatto-rikannalle E. coli Y 1090. Plakkien siirtäminen nitrosel-luloosasuodattimille (Hybond C, Amersham Inc.) ja näiden 10 käsittely suoritettiin pääpiirteittäin kuten ovat kuvanneet Maniatis et ai. (Molecular Cloning, A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982). Kahdeksaa nitroselluloosasuodatinta, joille oli siirretty 20 000 plakkia suodatinta kohden, esiliotettiin 5xSSC:ssä ja 15 esihybridisoitiin sitten yhden tunnin ajan 41°C:ssa 40 ml:ssa liuosta, joka sisälsi 20 % formamidia. 5xDen-hardtin liuoksen, 50 mM natriumfosfaattia, pH 6,8, ja 50 ,ug/ml denaturoitua sonikoitua vasikan kateenkorvan ' 5 DNA:ta. Suodattimia hybridisoitiin sitten määrän 7x10 20 pulssia minuutissa ml:ssa kanssa ^P-tf*-ATP: llä päätelei-mattua (vrt. Maniatis et ai., op. cit.) yllä kuvattua 48-meeristä koetinta. Hybridisointi suoritettiin esihyb-ridisointiliuoksessa, johon oli lisätty 100 ^,uM ATP:tä (lopullinen konsentraatio), 18 tunnin aikana 41°C:ssa. Sen 25 jälkeen kun oli inkuboitu yli yön 41°C:ssa, suodattimet pestiin kerran 0,2x SSC:ssä 37°C:ssa ja sen jälkeen suoritettiin 4 pesua 0,2x SSCrssä, 0,1 % SDSrssä 37°C:ssa ja suodattimien annettiin sitten kuivua ilmassa. Suodattimille asetettiin yön ajaksi alttiiksi DuPont Cronex 4 -rönt-30 genfilmi. Kuvio 4 esittää yhtä autoradiogrammeista. Kukin suodatin sisälsi noin 6 positiivista plakkia.
Positiivista hybridisointireaktiota osoittavien plakkien faagit eristettiin ja puhdistettiin ja näiden faagien DNA eristettiin Davisin et ai. kuvaamilla mene-35 telmillä (Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor
Laboratories, 1980) ja cDNA-lisäysten pituus määritettiin 49 100252 agaroosigeelielektroforeesin avulla, sen jälkeen kun faagin DNA oli katkottu restriktioendonukleaasin EcoRI avulla. Pisimmän cDNA-liitteen omaavalle yhdistelmäfaa-gille annettiin nimitys XsP3 ja se valittiin lisätutki-5 muksia varten.
Faagista X SP3 saadulle cDNA-liitteelle suoritettiin restriktioendonukleaasianalyysi ja se sekvenssoitiin sen jälkeen kun se oli subkloonattu pUC18:aan ja M13-vek-toriin mp9, vastaavasti. Liitteen osoitettiin olevan ihmi-10 sen EC-SOD:n koodittava DNA vertaamalla DNA-sekvenssin pe rusteella saatua aminohapposekvenssiä puhdistetun proteiinin peptidisekvenssiin ja sen CHO-soluissa ilmennetyn tuotteen perusteella. VsP3:sta eristetty liite sisälsi 1396 emäsparia cDNA:ta ja omasi avoimen lukuraamin, joka 15 kooditti 240 aminohappoa käsittävän proteiinin, ja 69 emäs- paria käsittävän 5'-alueen, jolle ei suoriteta translaatiota, ja 607 emäsparia käsittävän 3'-alueen, jolle ei suoriteta translaatiota. (Katso kuviot 5a ja 5b).
Ihmisen EC-S0D:n koodittavien cDNA-Uitteiden sub-20 kloonaaminen ja restriktioendonukleaasianalyysi
Noin 30 ^ug ^SP3 -DNA:ta pilkottiin restriktioendonukleaasin EcoRI avulla ja cDNA-liite erotettiin \-DNA:sta elektroforeesin avulla 6 % polyakryyliamidigeelissä. Suurin piirtein 0,2 ^ug cDNA-palasia eristettiin geelistä säh-25 köeluution, fenoli- ja kkloroformiuuton ja etanolisaostuk- sen avulla (Maniatis et ai. supra). 0,05 ^,ug eristettyä cDNA-palasta yhdistettiin ligoimalla 1 ^,ug:aan restrik-tioendonukleaasilla EcoRI pilkottua, alkalisella fosfataa-silla käsiteltyä pUC18-DNA:ta (Norrander et ai., Gene 26, 30 1983, ss. 101-106). Ligoimalla yhdistetty DNA transformoi tiin E. coli -kantaan HB101 (J.Mol. Biol. 41, s. 459).
Transformantteja selektoitiin ampisilliinia sisältävillä levyillä. cDNA-liitteen sisältävä yhdistelmäplasmidi tunnistettiin ja sille annettiin nimi pLS3. Plasmidin pLS3 35 DNA:lie suoritettiin restriktioendonukleaasianalyysi.
so 100252
Ihmisen EC-SOD:n koodittavan cDNA:n DNA-sekvens-sin analyysi
Faagista AsP3 peräisin olevan, ihmisen EC-SOD:n koodittavan cDNA-liitteen DNA-sekvenssi määritettiin 5 Sangerin et ai. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 1977, ss. 5463-5467; F. Sanger ja A.R. Coulson, FEBS Letters 87, 1978, ss. 107-110) ja Messingin et ai. menetelmillä (Nucl. Acids. Res. 9, 1981, ss. 309-321; P.H. Schreir ja R. Cortese, J. Mol. Biol. 129, 1979, ss. 169-172) sen 10 jälkeen kun cDNA-palanen oli kloonattu M13-vektorin mp9
EcoRI-kohtaan (J. Messing ja J. Vieira, Gene 19, 1982, ss. 269-276).
Aikaansaatiin perättäinen sarja cDNA-liitteen osittain päällekkäin meneviä klooneja M13-vektorissa mp9 mene-15 telmällä, jonka ovat kuvanneet Dale et ai. (Plasmid 13, 1985, ss. 31-40). Käyttäen tätä menetelmää määritettiin cDNA:n kummankin DNA-säikeen täydellinen nukleotidijärjestys ja sen pituuden todettiin olevan 1396 emäsparia.
?lPS3:n cDNA-liitteen nukleotidi järjestys ja päätel-20 tyjä aminohapposekvenssejä on esitetty kuviossa 5. cDNA- liitteessä on avoin lukuraami, joka käsittää 240 aminohappoa. Puhdistetun valmiin proteiinin aminohapposekvenssi alkaa aminohaposta +1, mikä viittaa oletettuun 18 aminohappoa käsittävään signaalipeptidiin. Kuten tunnetut signaa-25 lipeptidit, sisältää tämä aminohapposekvenssi runsaasti hydrofobisia aminohappoja, ja lisäksi viimeinen jäännös on alaniini, joka on yksi tunnetuissa signaalipeptideis-sä tässä asemassa todetuista aminohapoista (G. Von Heijne, Eur. J. Biochem. 133, 1983, ss. 17-21). Alleviivatut ami-30 nohapposekvenssit on varmistettu peptidisekvenssoinnin avulla.
Eräs toinen DNA-sekvenssin ominaisuus on translaation aloituskodonin kohdalla esiintyvä sekvenssi, -CAGCCAUGC-, joka on homologinen eukaryoottinen aloitus-35 kohtien oletetun konsensussekvenssin kanssa, -CC„CC-AUG(G)- (M. Kozak, Nucl. Acids Res. 12, 1984, ss. 857-872). Lisäk- 51 100252 si on todettu mahdollinen polyadenylointisignaali, jonka sekvenssi -ATTAAA- on homologinen oletetun konsensus-sekvenssin AATAAA kanssa, 14 emäsparia vastavirtaan poly-adenylaation loppupäästä.
5 Ihmisen EC-SOD:n ilmentäminen CHO-soluissa
Yllä kuvatun cDNA:n koodittaman ihmisen EC-SOD:n tuottamiseen käytettiin ilmentämisvektoria, joka sisälsi Simian Virus 40:n (SV40:n) replikaation aloituskohdan, aikaisen ja myöhäisen promoottorin, polyadenylointi- ja 10 päättämissekvenssit. 1396 emäsparin pituinen cDNA sijoitettiin laatuaan ainoaan EcoRI-restriktioendonukleaasin katkaisukohtaan, joka sijaitsi SV40:n aikaisen promoottorin ja SV40:n polyadenylointi- ja päätössekvenssien välissä, niin että ihmisen EC-SOD:n koodittavan sekvenssin il-15 mentymistä kontrolloi SV40:n aikainen promoottori (kuvio 6). Tälle rakennetulle EC-SOD:n ilmentämisplasmidille annettiin nimi pPS3.
20 yug pPS3-DNA:ta saatettiin lineaariseksi katkaisemalla restriktioendonukleaasilla PstI laatuaan ainoas-20 ta Pstl-kohdasta, joka sijaitsi ^-laktamaasigeenissä. Li neaariseksi saatettu pPS3-DNA transfektoitiin yhdessä 0,5 ^ug:n kanssa DNA:ta, joka oli peräisin Geniticin-(G-418-sulfaatti, Gibco Ltd.)-resistenssin aikaansaavia sekvenssejä sisältävästä plasmidista, CHO-K1- (ATCC CCL61) 25 -soluihin menetelmällä, jonka ovat esittäneet Graham ja
Van der Eb (Virology 52, 1973, ss. 456-467). Transfektoi-tuja soluja selektoitiin kasvattamalla viljelyaineessa (Hamsin F12-viljelyaine, johon oli lisätty 10 % sikiö-kautisen vasikan seerumia, streptomysiiniä ja penisillii-30 niä), joka sisälsi ml:ssa 700 ^ug Geniticiniä (G-418-sul- faattia, Gibco Ltd.). Eristettiin Geniticin-resistenttejä kolonioita ja niitä kasvatettiin samassa viljelyaineessa.
Viljelyainetta poistettiin ajoittain ja siitä analysoitiin EC-S0D:n ensiintyminen ELISA:n ja entsyymiaktiivi-35 suuden määritysten avulla kuten jäljempänä on kuvattu.
52 100252
Useilla tutkituista solulinjoista ilmeni toisiinsa verrattavaa ihmisen EC-SOD:n tuottamista ja yhdelle saaduista solulinjoista annettiin nimitys CHO-K1/pPS3neo-18 ja se valittiin jatkotutkimuksia varten.
5 Ihmisen EC-SOD:n koodittavan geenin sisältävien CHO-solujen suorittama EC-SOD:n erittäminen viljelyalueeseen
Kloonia CHO-K1/pPS3neo-18 ja kantasoluja CHO-K1 kasvatettiin konfluenttiin tilaan Hamin F-12-viljelyai-10 neessa, joka sisälsi 10 % sikiökautisen vasikan seerumia.
Kun oli kulunut vielä 3 päivää, poistettiin viljelyaine ja solut pestiin kaksi kertaa fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella. Solut irroitettiin sitten viljelypul-loista inkuboimalla liuoksessa, joka sisälsi 40 mM 15 Tris-HCl:ä, 140 mM NaCl:a ja 1 mM EDTA:a. Talteen otetut solut (noin 8x10^) sentrifugoitiin sitten, supernatantti heitettiin pois ja solut varastoitiin -80°C:een solunap-pina. Solut hajoitettiin sitten sonikoimalla 1,5 ml:ssa liuosta, joka sisälsi 50 mM K-fosfaattia, pH 7,4, 0,3 M 20 KBr:a, 3 mM DTPA:ta, 0,5 mM PMSF:ä ja 100 KIE/ml trasylolia.
Homogenaatit sentrifugoitiin. EC-SOD:n määrän spesifinen määrittäminen suoritettiin inkuboimalla homogenaatteja ja kasvuliuosta immobilisoitujen, ihmisen EC-SOD:tä ja ihmisen CuZn-SOD:tä vastaan suunnattujen vasta-aineiden 25 kanssa, kuten on pääpiirteittäin esitetty julkaisussa Öhman ja Marklund, Chim. Sei. 70, 1986, ss. 365-369.
EC-SOD:tä ei löytynyt ollenkaan kantasoluista CHO-K1 eikä niiden kasvuliuoksesta. Kloonin CHO-K1/pPS3neo-18 solujen kasvuliuoksen (15 ml) todettiin tässä nimenomai-30 sessa kokeessa sisältävän 51 U/ml EC-SOD:tä, kaikkiaan 765 U. Soluhomogenaatti sisälsi (1,5 ml:ssa) 71 U SOD-ak-tiivisuutta, josta 20 U oli ihmisen EC-SOD:tä. Siten oli 97,5 % CHO-K1/pPS3neo-18-viljelmän EC-SOD:stä erittynyt kasvuliuokseen.
53 100252
Ihraisen EC-SOD:n tuottaminen CHO-soluissa Tämän kloonin suorittama ihmisen EC-SOD:n tuottaminen määritettiin sekä kasvattamalla soluja kiinteällä alustalla että suspensiossa.
5 1. EC-SOD:n tuottaminen kiinteillä alustoilla kasvavien CHO-K1/pPS3neo-18-solujen avulla 3 6 a) 175 cm :n pulloon istutettiin 4,5x10 solua 30 ml:aan Hamin F12-viljelyainetta (Flow Laboratories), johon oli lisätty 10 % sikiökautisen vasikan seerumia, 10 2mM L-glutamiinia, streptomysiiniä ja penisilliiniä. So luja inkuboitiin 37°C:ssa ilmassa, joka sisälsi 5 % CC^sta. Elatusaine vaihdettiin joka kolmas päivä ja kasvuliuok-seen erittyneen ihmisen EC-SOD:n konsentraatio määritettiin kuten on kuvattu jäljempänä kappaleessa, joka on ot-15 sikoitu "Analyysejä ihmisen EC-SOD:n ilmentymisen osoittamiseksi". Ihmis-EC-SOD:n tuottamiskyky oli 1,5 pg-so--1 -1 lu *24 tuntia mitattuna ELISA:n avulla ja määrittämällä EC-SOD:n entsyymiaktiivisyys.
b) Mikrokantimiin (m.c) (Cytodex 3, Pharmacia, 20 Ruotsi), 4 mg/ml, isutettiin soluja konsentraatioksi 7 solua/m.c Hamin F12-elatusaineessa (Flow Laboratories), johon oli lisätty 5 % sikiökautisen vasikan seerumia, 2 mM L-glutamiinia, streptomysiiniä ja penisilliiniä.
Soluja kasvatettiin sekoittimella varustetussa 25 500 ml:n pullossa (Techne) 37°C:ssa 5 % CC^sta sisältä vässä ilmassa. Kun solut olivat kasvaneet konfluenttiin tilaan, viljelmä perfundoitiin nopeudella 0,088-tunti Ihmis-EC-SOD:n tuottamiskyky oli 0,50 pg*solu ^ * 24 tuntia ^.
30 2. EC-SOD:n tuottaminen suspensioviljelmässä kas vatettujen CHO-K1/pPS3neo-18-solujen avulla 125 ml:aan viljelyainetta (Hamin F12, johon oli lisätty 10 % sikiökautisen vasikan seerumia, 2 mM L-glutamiinia, streptomysiiniä ja penisilliiniä) isutettiin 35 2x10^ solua/ml. Viljelmää inkuboitiin sekoitetuissa 54 100252 (spinner-) pulloissa (Techne) 37°C:ssa ilmassa, joka sisälsi 5 % C02:ta.
Joka kolmas päivä vaihdettiin elatusaine. Ihmis- -1 -1 EC-SOD:n tuottamiskyky oli 0,65 pg*solu *24 tuntia 5 Analyysejä ihmisen EC-SOD:n ilmentymisen osoit tamista varten 1. Entsyymiin kytketty immunoadsorbentti -analyysi (ELISA)
Mikrotiitterilevyjä (Nunclon, NUNC A/S, Tanska) 10 päällystettiin 100 ^ulzlla syvennystä kohden liuosta, joka sisälsi 15 ^ug ml:a kohden polyklonaalisia kaniinin anti-EC-SOD-IgG-vasta-aineita (valmistettu kuten on kuvattu esimerkissä 3) ja 15 mM Na2CO.j> 35 mM NaHCO^,
0,02 % NaN^, pH 9,6. Sen jälkeen kun oli inkuboitu yön 15 ajan huoneen lämpötilassa, levyt pestiin PBSzllä (10 mM
natriumfosfaatti, 145 mM NaCl, pH 7,2). Mikrotiitterilevyjä inkuboitiin 30 minuutin ajan 37°C:ssa 200 ^ul:n kanssa syvennystä kohden liuosta, joka sisälsi 3 % (paino/tilavuus) naudan seerumin albumiinia PBS:ssä, ja 20 pestiin PBS:llä. 100 ^ul laimennettuja kasvuliuosnäyt-teitä lisättiin kuhunkin syvennykseen ja inkuboitiin 1 tunnin ajan 37°C:ssa. Levyt pestiin 5 % Tweer^ 20:tä (tilavuus/tilavuus) sisältävässä PBS:ssä ja sen jälkeen inkuboitiin 1 tunnin ajan 37°C:ssa 100 ^ul:n kanssa sy-25 vennystä kohden liuosta, joka sisälsi 8 ^,ug ml:a koh- den hiiren monoklonaalista anti-EC-SOD-vasta-ainetta (katso esimerkki Z) liuoksessa, jossa oli 3 % naudan seerumin albumiini PBS:ssä. Kun oli pesty 5 % Tween® 20:tä PBS:ssä sisältävällä liuoksella, levyjä inkuboi-30 tiin 1 tunnin ajan 37°C:ssa peroksidaasiin konjugoidun kaniinin anti- hiiren vasta-aineen kanssa (Dakopatts A/S, ; Tanska) 3 % naudan seerumin albumiinia sisältävässä PBS:ssä. Levyt pestiin 5 % Tweeii^20:tä sisältävässä PBSsssä ja inkuboitiin 20 minuutin ajan huoneen lämpöti-35 lassa pimeässä 100 yul:n kanssa syvennystä kohden 55 100252 substraattiliuosta (50 mM natriumsitraatti, 100 mM nat-riumfosfaatti, 0,04 % (paino/tilavuus) o-fenyleenidia-miini, 0,01 % pH 5,0). Reaktio pysäytettiin lisää mällä 25 yul 10 % SDS syvennystä kohden ja mitattiin 5 absorbanssi 450 nm:n aallonpituudella.
2. EC-SOD:n entsyymiaktiivisuuden määrittäminen SOD:n entsyymiaktiivisuus määritettiin kuten on kuvattu julkaisussa Marklund, J. Biol. Chem. 251, 1976, 10 ss. 7504-7507. Jotta saataisiin aikaan spesifisyys ihmisen EC-SOD:lle, näytteet analysoitiin ennen käsittelyä (R)
Sepharoseen®' immobilisoiduilla anti- ihmisen EC-SOD -vasta-aineilla (katso esimerkki 4) ja käsittelyn jälkeen. EC-SOD-aktiivisuutena pidettiin näytteelle ennen 15 vasta-aineeseen adsorbointia saadun aktiivisuuden ja adsorption jälkeen saadun aktiivisuuden välistä eroa.
Esimerkki 9
Hepariinin aiheuttama EC-SOD:n vapautuminen ihmisen veriplasmaan 20 Hepariinia (hankittu toiminimeltä AB KABI-Vitrum,
Tukholma, Ruotsi) annettiin ruiskeena laskimoon 200 IU/kg ruumiin painoa kahdelle terveelle mieshenkilölle, jotka olivat paastoneet yön ajan ( a) 34 vuoden ikäinen ja b) 40 vuoden ikäinen). Verinäytteitä otettiin ennen he-25 pariinin ruiskuttamista ja aika ajoin ruiskeen antamisen jälkeen, kuten on esitetty kuviossa 7. Verinäytteet otettiin Terumo Venoject -vakuumiputkiin, jotka sisälsivät EDTA:a hyytymistä estävänä aineena, ja sentrifugoi-tiin. Sentrifugoinnin jälkeen plasmanäytteet säilytet-30 tiin -80°C:ssa analysointiin asti.
Lisäksi otettiin 20 ml kokoverta kolmelta terveeltä henkilöltä ja se säilytettiin EDTA-putkissa kuten yllä on kuvattu. Veri jaettiin kahteen yhtä suureen osaan ja toiseen lisättiin 30 IU hepariinia/ml ja toiseen 35 sama tilavuusmäärä 0,15 M NaCl:a. Sen jälkeen kun oli 56 100252 inkuboitu 30 minuutin ajan huoneen lämpötilassa, näytteet sentrifugoitiin ja plasma otettiin talteen SOD-mää-ritystä varten.
SOD-aktiivisuus määritettiin suoran spektrofoto-5 metrisen menetelmän avulla käyttäen KC^sta (S.L. Mark-lund, J. Biol. Chem. 251, 1976, ss. 7504, 7507) tehden muunnelmat, jotka on kuvattu julkaisussa öhmann ja Marklund, Clin. Sei. 70, 1986, ss. 365-369. Yksi yksikkö DOS-aktiivisuutta vastaa 8,3 ng:a ihmisen CuZn-SOD:tä, 10 8,8 ng:a ihmisen EC-SOD:tä ja 65 ng:a naudan MnSOD:tä.
Saatiin tehtyä ero plasmassa olevien isoentsyymien vä- dö
Iillä käyttämällä Sepharoseen^ 4B immobilisoituja ihmisen CuZn-SOD:n ja EC-SOD:n vastaisia vasta-aineita, kuten on kuvattu julkaisussa öhmann ja Marklund, Clin.
15 Sei. 70, 1986, ss. 365-369.
Tulokset on esitetty kuviossa 7 ja niistä ilmenee, että laskimoon ruiskutettu 200 IU hepariinia kg:a kohden ruumiin painoa johtaa plasman EC-SOD-aktiivisuu-den nopeaan kohoamiseen kolminkertaiseksi. Maksimaalis-20 ta lisääntymistä lähestytään jo 5 minuutin kuluttua. Aktiivisuus pysyy suurena 15-30 minuutin ajan ja heikkenee sitten vähitellen läheten alkuperäistä tasoa yli 6 tunnin kuluttua. Laskimoon ruiskutetulla hepariinilla ei ollut mitään vaikutusta plasman CuZn-SOD- ja syanidia kes-25 tävään SOD-aktiivisuuteen.
Vaikutus EC-SOD:n plasmaan vapautumiseen, joka saadaan aikaan antamalla hepariinia laskimoon määrään 200 IU/kg ruumiin painoa saakka, on esitetty kuviossa 8. Kuviosta ilmenee, että kasvavat hepariiniannokset johta-30 vat lisääntyneeseen EC-SOD:n vapautumiseen. Ilmeisesti ei saavuteta selvää tasannetta, ja on todennäköistä, että määrän 200 IU/kg ruumiin painoa ylittävät annokset johtaisivat vielä suurempaan EC-SOD:n vapautumiseen. Eettiset näkökohdat estivät kuitenkin suurempien annoksien 35 testaamisen.
57 100252
Vastoin in vivo saatuja tuloksia ei hepariinin lisääminen kokovereen, kuten on kuvattu, vaikuttanut plasman EC-SOD-aktiivisuuteen. Samoin ei hepariinin lisääminen (5 IU/ml) suoraan plasmaan johtanut minkäänlaiseen EC-SOD-5 aktiivisuuden muutokseen. Tulokset osoittavat, ettei kuviossa 7 nähtävää plasman EC-SOD-aktiivisuuden lisääntymistä in vivo ole aiheuttanut entsyymin vapautuminen verisoluista eikä plasmassa läsnä olevan EC-SOD:n aktivoituminen.
10 5 terveeltä henkilöltä (3 mieheltä, 2 naiselta) saadut plasmanäytteet kromatografoltiin käyttäen heparii- S) ni-Sepharosea (hankittu toiminimeltä Pharmacia, Uppsala, Ruotsi). Kromatografia suoritettiin huoneen lämpötilassa (r) pylväissä, jotka sisälsivät 2 ml hepariini-Sepharosea , 15 käyttäen eluenttina 25 mM kaliumfosfaattia, pH 6,5. Näytteet (2 ml plasmaa) syötettiin nopeudella 4,2 ml/tunti, ja kun Ä£gQ läheni perusviivaa, sitoutuneet komponentit eluoitiin kaliumfosfaattipuskurissa olevan lineaarisen NaCl-gradientin avulla (0-1 M, kokonaistilavuus 50 ml) 20 nopeudella 9 ml/tunti (vrt. kuvio 9). Keskimääräinen SOD-aktiivisuuden saanto eluaatissa oli noin 95 %.
Ennen käyttöä plasmanäytteet tasapainotettiin eluoin-tipuskurilla suorittamalla kromatografia pienissä Sephadej^ G 15 -pylväissä (PD-10) (myös hankittu toiminimeltä Pharmacia, 25 Uppsala, Ruotsi). Kromatografiästä oli seurauksena näyttei den laimentuminen kolminkertaisesti. SOD-aktiivisuuden tal-teensaanti oli lähes 100 %.
Tulokset, jotka on saatu määritettäessä EC-SOD-frak-tiot A, B ja C viidestä normaalista plasmanäytteestä, on 30 esitetty alla olevassa taulukossa I. Todettiin, että nämä kolme fraktiota ovat normaalissa plasmassa suurin piirtein yhtä suuret. Kromatogrämmissä oli EC-SOD-aktiivisuuden keskimääräinen saanto 95 %. Erottumista kolmeen fraktioon ei ilmeisesti aiheuta sekundaarinen hajoaminen in 35 vitro, sillä plasmanäytteen fraktioihinjakautumismalli 58 100252 oli identtinen ennen 3 päivää kestänyttä jääkaapissa säilyttämistä ja sen jälkeen. Laskimoon ruiskutetun hepa-riinin vaikutus plasman EC-SOD-fraktioiden kokoonpanoon on esitetty kuviossa 9. Todettiin, että laskimoon ruisku-5 tettu hepariini johti tutkitulla henkilöllä ainoastaan fraktion C huomattavaan suurenemiseen. A ja B jäävät käytännöllisesti katsoen muuttumattomiksi. Toisella tutkitulla henkilöllä (tuloksia ei ole esitetty) oli hepariini-ruiskeen vaikutus olennaisesti täysin samanlainen. Frak-10 tio C suureni 7 yksiköstä 32 yksikköön/ml plasma.
Taulukko I
Plasman EC-SOD:n erottaminen fraktioihin A, B ja C
15 EC-SOD, U/ml plasmaa
Fraktiot
Ikä/sukupuoli ABC
40/mies 5,9 6,2 7,0 20 34/mies 5,2 4,4 5,1 32/mies 2,3 5,2 6,4 33/nainen 2,3 5,9 8,3 29/nainen 3,3 6,1 7,3 keskiarvo _+ 3,5 s 1,5 5,6 s 0,8 6,8 t 1,2 25 keskihajonta—.____
Yllä kuvatuista kokeista ilmenee, että laskimoon ruiskutettu hepariini johtaa plasman EC-SOD-aktiivisuu-den pikaiseen kohoamiseen. Hepariini ei aktivoi EC-SOD:tä 30 eikä voida myöskään osoittaa verisoluista vapautumista, mikä viittaa siihen, että endoteelisolujen pinnat ovat todennäköisin vapautuneen EC-SOD:n lähde.
Joukon muita tekijöitä, joilla on affiniteetti he-pariinia kohtaan, lipoproteiinilipaasin, maksan lipaasin, 35 diamiinioksidaasin ja verihiutaleiden tekijä 4:n, on ai- 59 100252 kaisemmin samoin osoitettu vapautuvan nopeasti laskimoon ruiskutetun hepariinin vaikutuksesta. Useimmissa näistä tapauksista on osoitusta siitä, että hepariinin aiheuttama proteiinin irtoaminen endoteelisolujen pinnalla olevasta 5 heparaanisulfaatista on ilmiön selitys (A. Robinson-White et ai., J. Clin. Invest. 76, 1985, ss. 93-100; C. Busch et ai., Thromb. Res. 19, 1980, ss. 129-137). On todennäköistä, että EC-SOD:n vapautuminen voidaan selittää samalla tavoin.
10 Vapautuminen ei saavuttanut selvää tasannetta hepa- riiniannoksilla suuruuteen 200 IU/kg ruumiin painoa saakka, mikä osoittaa, että tarvitaan enemmän hepariinia aiheuttamaan EC-SOD:n mahdollisimman suuri vapautuminen kuin tarvitaan lipoproteiinilipaasin, diamiinioksidaasin, maksan 15 lipaasin ja verihiutaleiden tekijä 4:n tapauksessa.
EC-SOD:llä voi hepariiniin kohdistuvan affiniteetin ja he-paraanisulfaatiin kohdistuvan affiniteetin välinen suhde olla alhaisempi kuin muilla proteiineilla.
Ihmisen perusplasma sisältää lähes yhtä suuria mää-20 riä EC-SOD-fraktioita A, B ja C. Laskimoon ruiskutettu he- pariini vapautti vain suuren hepariiniaffiniteetin omaavaa fraktiota C, joka on ilmeisesti endoteelisolujen pintaan kohdistuvan affiniteetin omaava muoto. Tässä saavutettu lisäys oli 4-6 kertainen, mutta on todennäköistä, että suu-25 remmat hepariiniannokset johtaisivat suurempaan kertoimeen.
Paljon suurempia kertoimia saavutetaan lipoproteiinilipaasin, maksan lipaasin, diamiinioksidaasin ja verihiutaleiden tekijä 4:n tapauksessa. Näihin proteiineihin verrattuna vaikuttaa EC-SOD:n sitoutuminen endoteeliin melko löy-30 häitä. Mahdollisesti on olemassa tasapaino plasmassa olevan ja endoteelisolujen pinnalla olevan EC-SOD-fraktion välillä. Suurin osa verisuonistossa olevasta EC-SOD:stä sijaitsee ilmeisesti endoteelisolujen pinnalla.
EC-SOD-fraktioiden A, B ja C erilaisen hepariiniaf-35 finiteetin syy molekyylitasolla on vielä epäselvä. Aminohappo- ja alayksikkökoostumukset eivät olleet merkitsevästi 60 100252 erilaisia (S.L. Marklund, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79, 1982, ss. 7634-7638). Myöskään antigeenisiä eroja ei voitu havaita (S.L. Marklund, Biochem. J. 220, 1984, ss. 269-272). Sitoutuminen negatiivisesti varautunee-5 seen hepariiniin ei ilmeisesti ole tavanomaisen ionin vaihdon luonteista, koska fraktioiden A ja C välillä ei voida havaita eroa ioninvaihtokromatografiässä, ja niiden isoelektriset pisteet ovat identtiset (pH 4,5).
Ero ei johdu hajoamisesta in vitro, sillä plasman säi-10 lyttäminen 3 päivän ajan jääkaapissa ei muuttanut hepa- riini-Sepharosesta^ eluoitumisen mallia. Vaikka hajoi-tus in vivo on eräs mahdollisuus, voitaisiin otaksua, että fraktioiden A ja B ontarkoitus erityisesti suojata nesteen komponentteja ja fraktion C suojella solujen pin-15 toja.
Useimmilla kehon solutyypeillä on pinnallaan he-paraanisulfaattia ja muita sulfatoituja glukoosiamino-glykaaneja (M. Höök et ai., Ann. Rev. Biochem. 53, 1984, ss. 847-869). On mahdollista, että suuri osa ku-20 doksista löydetystä EC-SOD:stä (S.L. Marklund, J. Clin.
Invest. 74, 1984, ss. 1398-1403) sijaitsee tällaisiin aineisiin kiinnittyneenä solukalvoilla ja sidekudoksessa. EC-SOD:n sitoutuminen solujen pinnalle saattaa olla erityisen tehokas tapa suojata soluja solujen ulkopuo-25 lella muodostuneilta superoksidiradikaaleilta. On mie lenkiintoinen havainto, että CuZn-SOD:n substituointi polylysiinillä negatiivisesti varautuneisiin solukalvoihin liittymisen helpottamiseksi vahvisti suuresti entyy-min kykyä suojata aktivoituneita polymorfonukleaarisia 30 leukosyyttejä itse-inaktivoinnilta (M.L. Salin ja J.M.
McCord teoksessa Superoxide and Superoxide Dismutases, . toim. A.M. Michelson, J.M. McCord ja I. Fridovich,
Academic Press, 1977, ss. 257-270). Nocardia asteroides-bakteerin solukalvoon liittynyt SOD antaa bakteerille 35 tehokkaan suojan aktivoituneita polymorfonukleaarisia 6i 100252 leukosyyttejä vastaan (B.L. Beaman et ai., Infect. Immun.
47, 1985, ss. 135-140). Mikro-organismit, joilta puuttuu affiniteetti EC-SOD-fraktiota C kohtaan, eivät, toisin kuin useimmat kehossa olevat solut, hyötyisi entsyymin 5 tarjoamasta suojauksesta.
On näyttöä siitä, että aktivoituneiden leukosyyttien ja myös muiden solutyyppien määrätyissä olosuhteissa tuottamat superoksidiradikaalit voivat, suoraan tai välillisesti, aiheuttaa kromosomivaurioita (J. Emerit, 10 Lymphokines 8, 1983, ss. 413-424; A.B. Weitberg, S.A.
Weitzman, E.P. Clark ja T.P. Stossel, J. Clin. Invest. 75, 1985, ss. 1835-1841; H.C. Birnboim ja M. Kanabus-Kaminska, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 1985, ss. 6820-6824) ja edistää syövän syntyä (C. Borek ja W. Troll, Proc. Natl.
15 Acad. Sei. USA 80, 1983, ss. 1304-1307; Y. Nakamura, N.H. Colbum ja T.D. Gindhart, Carcinogenesis 6, 1985, ss. 229-235). Pintoihin liittynyt EC-SOD-fraktio C olisi tehokas suojaaja tällaisia tapahtumia vastaan in vivo. Useimmissa in vitro -koesysteemeissä suuri osa EC-SOD-20 fraktiosta C hävisi luultavasti solujen pinnalta, sillä sitoutuminen vaikuttaa heikolta. Tällaisten systeemien yhteydessä tehtyjen havaintojen perusteella ei siten välttämättä voida ennustaa määrällisesti in vivo saatavaa suojaa vaurioitumista vastaan.
25 Ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta annetun CuZn- ' SOD:n on osoitettu omaavan monia mielenkiintoisia tera peuttisia ominaisuuksia, kuten yllä on esitetty. Nykyiset havainnot viittaavat siihen, että EC-SOD:n antaminen voi olla vielä tehokkaampi tapa suojata solunulkopuolisessa ti-30 lassa esiintyvien superoksidiradikaalien aiheuttamaa solu jen vaurioitumista vastaan.
62 100252
Esimerkki 10 125
Ihmisen I:llä leimatun EC-SODin ruiskuttaminen kaniineihin
Napanuoran EC-SOD:tä, joka oli valmistettu kuten 125 5 on kuvattu esimerkeissä 1 ja 4-6, leimattiin I:llä käyttäen "jodogeeni"-tekniikkaa (P.R.P. Salacinski, C. Mc Lean, J.E.C. Sykes, U.V. Clement-Jones ja P.J.
Lowry, Anal. Biochem. 117, 1981, ss. 136-146). Leimat- 125 tu EC-SOD erotettiin I-jodidista geelisuodatuksen 10 avulla käyttäen Sephacryl® S-300:a (hankittu toiminimel-tä Pharmacia, Uppsala, Ruotsi). Sijainti kromatogrammis-sa oli samalla kohtaa kuin leimaamattomalla EC-SOD:llä, mikä osoittaa, että molekyylin koko ei ollut muuttunut.
Saatu leimattu EC-SOD kromatografoitiin käyttäen (r) 15 hepariini-Sepharosea^ (kuten yllä on kuvattu). Ainoastaan materiaalia, jolla oli suuri affiniteetti heparii-nia kohtaan (=fraktio C), käytettiin jatkokokeisiin.
Leimattu EC-SOD ruiskutettiin laskimoon kaniineille (jotka painoivat noin 3 kg). Sitten otettiin verinäyt-20 teitä plasmassa jäljellä olevan radioaktiivisuuden analysointia varten. Plasmanäytteet saostettiin trikloorietik-kahapolla (joka saostaa proteiinit) ja radioaktiivisuus määritettiin proteiinisakoista sentrifugoinnin jälkeen.
Täten saadaan eliminoitua määrityksestä plasmassa oleva 25 radioaktiivinen jodidi ja jodia sisältävät aminohapot, • jotka ovat peräisin hajottuneesta EC-SOD:stä. Kaniineil le annettiin jodidia niiden juomavedessä, jotta estet- 1 25 taisixn proteiinien uudelleenleimautuminen I:lla in vivo.
30 Kaniineille ruiskutettiin eri pituisten aikojen kuluttua laskimoon hepariinia (2500 IU), jotta voitaisiin tutkia hepariinin vaikutusta. Tulokset on esitetty kuviossa 10 ja kuviossa 11. 100 % vastaa radioaktiivisuuden määrää, joka plasman teoreettisesti pitäisi sisältää 35 ruiskutetun määrän perusteella ja olettaen että plasman 63 100252 kokonaistilavuus oli kaniineilla 5 % niiden ruumiin painosta (esim. 3 kg painava kaniini - 150 ml plasmaa).
Kuviossa 10 on esitetty tulokset, jotka saatiin, 125 kun hepariinia ruiskutettiin ennen I-EC-SOD:tä ja 5 2, 5, 10 ja 20 minuuttia sen jälkeen.
Leimatun EC-SOD:n ruiskuttamisen jälkeen tapahtuu 5-10 minuutin sisällä nopea aktiivisuuden väheneminen noin 15 %:ksi teoreettisesta maksimimäärästä. Kun ruiskutetaan hepariinia ennen EC-SOD:tä, melkein koko 10 EC-SOD-aktiivisuus pysyy, väheten ainoastaan hitaasti.
Kun hepariinia ruiskutetaan 2, 5, 10 ja 20 minuuttia 1 25 I-EC-SOD:n jälkeen, tapahtuu nopea radioaktiivisuuden lisääntyminen ja huippu saavuttaa teoreettisen maksimiarvon.
15 Kuviossa 11 on esitetty hepariinin ruiskuttami nen 2-72 tunnin jälkeen. Kuviosta ilmenee, että tapahtuu nopea aktiivisuuden lisääntyminen, joka 2 tunnin kuluttua saavuttaa noin 50 % teoreettisesta maksimiarvosta ja 72 tunnin kuluttua vielä saavuttaa 3 %.
20 Näyttää tapahtuvan melko nopea väheneminen 50 %:iin (ajankohtaan 2 tuntia mennessä), mutta sen jälkeen EC-SOD eliminoituu paljon hitaammin. Käyttäen kuviossa 11 olevia maksimiarvoja voidaan puoli-iäksi (t 1/2) laskea noin 18 tuntia. Se on ihmisessä luultavasti pitempi, kos-25 ka pienillä eläimillä on melkein kaikkien aineosien vaih tuminen kehossa nopeampaa.
Plasman EC-SOD:n nopea lisääntyminen (maksimiarvo saavutetaan 2 minuutissa) hepariinin laskimoon ruiskut- 125 tamisen jälkeen viittaa siihen, että vapautunut I-EC-30 SOD oli sijainnut verisuonten endoteelillä, mikä merkitsee samaa johtopäätöstä kuin esimerkissä 8.
64 100252
Esimerkki 11
Ihmisen EC-SOD-C:n sitoutuminen sian aortan en-doteeliin
Sian aorttoja koottiin teurastamossa, säilytet-5 tiin jäissä kuljetuksen aikana, avattiin pituudeltaan ja pantiin kahden 1,5 cm:n paksuisen perspexikappaleen väliin. Kappaleeseen, joka oli aortan yläpuolella ontelon puolta vasten, oli porattu halkaisijaltaan 10 mm olevia aukkoja. Siten saatiin aikaan halkaisijaltaan 10 mm ole-10 via syvennyksiä, joiden pohjana oli aortan endoteeli. Valmistettiin liuos, joka sisälsi 440 000 pulssia minuutis-125 sa I-EC-SOD:tä (leimattu, kuten on kuvattu esimerkissä 10) ja suuren ylimäärän leimaamatonta EC-SOD-fraktiota C (121 ^,ug/ml) . Liuottimena oli Eagle'in vähimmäismäärän 15 välttämättömiä ravintoaineita sisältävä elatusaine, joka oli puskuroitu pH:hon 7,4 HEPES-puskurilla ja sisälsi 0,5 y.ug naudan seerumin albumiinia. 150 ^ul liuosta pantiin kuhunkin kolmeen syvennykseen ja inkuboitiin ravistellen 2,5 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Liuos imet-20 tiin sitten pois. Syvennykset pestiin sitten kaksi ker taa 500 ^ul:lla liuotinta (2 minuuttia ravistellen) ja sitten kaksi kertaa 500 ^ulilla liuotinta, joka sisälsi 15 IU hepariinia (5 minuuttia ravistellen). Liuosten radioaktiivisuus (kolmen syvennyksen keskiarvo, %:a lisätystä 25 radioaktiivisuudesta) oli 80,4 % (inkuboitu alkuperäinen liuos), 2,1 %, 0,6 % (pesuliuokset), 6,5 %, 2,2 % (pesu * hepariinin kanssa). SOD-entsyymiaktiivisuus määritettiin yhden syvennyksen liuoksista ja sen todettiin olevan 84,2 % (82,7 %) poistetussa inkuboidussa alkuperäisessä liuokses- 30 sa ja 7,1 % (7,0 %) ensimmäisessä hepariinipesuliuokses- sa (vastaavat radioaktiivisuusarvot suluissa). Vastaavuus SOD-entsyymiaktiivisuuden ja määritetyn radioaktiivisuu- * den välillä oli siten erittäin hyvä. Tulokset osoittavat, että noin 20 % lisätystä EC-SOD:stä sitoutui aortan endo- 35 teeliin ja että EC-SOD-aktiivisuutta voitiin vapauttaa lisäämällä hepariinia.
65 100252
Esimerkki 12
Alkuperäisen ja yhdistelmä-DNA-tekniikalla saadun EC-SOD:n sitoutuminen lektiineihin
Sepharoseen® immobilisoitua konkanavaliini AI:tä, 5 linssilektiiniä ja vehnänalkiolektiiniä hankittiin toimi- nimeltä Pharmacia AB, Uppsala, Ruotsi. 2 ml kutakin geeliä pakattiin kromatografiapylväisiin. 50 mM natriumfos-faattia (pH 7,4) + 0,25 M NaCl käytettiin eluenttina. Lek-tiinipylväisiin syötettiin 200 yksikköä (1,7 ^ug) alkupe-10 räistä napanuoran EC-SOD:tä tai yhdistelmä-DNA-tekniikalla saatua EC-SOD:tä liuotettuna 0,5 ml:aan eluutiopuskuriliuos-ta. Sitten lisättiin 3,5 ml eluutiopuskuriliuosta. Pylväät pestiin 10 ml:11a eluutiopuskuria. Sitoutunut EC-SOD eluoi-tiin sitten 14 ml:11a 0,5 M«^-metyylimannosidia (ConA- (S) (r) 15 Sepharose4* ja linssilektiini-Sepharose^ tai 0,5 M N-asetyy- liglukosamiinia (vehnänalkiolektiini-Sepharose^). Määritettiin SOD-aktiivisuus pylväistä eluoituvasta nesteestä.
98 % alkuperäisestä EC-SOD:stä ja 97 % yhdistelmä-DNA-tekniikalla saadusta EC-SOD:stä sitoutui konkanavalii-20 ni A -Sepharoseerf®. 99 % alkuperäisestä EC-SOD: stä, 96 % yhdistelmä-DNA-tekniikalla saadusta EC-SOD:stä sitoutui linssilektiini-Sepharoseen®. 61 % alkuperäisestä EC-SOD:stä ja 95 % yhdistelmä-DNA-tekniikalla saadusta EC-SOD:stä si- (S) toutui vehnänalkiolektiini-Sepharoseen .
25 Affiniteetti konkanavaliini A:ta ja linssilektiiniä • kohtaan osoittaa, että sekä alkuperäinen että yhdistelmä- DNA-tekniikalla saatu FC-SOD sisältää glukosyyli- ja man-nosyylijäännöksiä hiilihydraattiosissaan. Affiniteetti vehnänalkiolektiiniä kohtaan viittaa N-asetyyliglukosami-30 nyylijäännösten läsnäoloon. Alkuperäisen EC-SOD:n hetero geenisyys vehnänalkiolektiiniin sitoutumisen suhteen johtuu luultavasti entsyymin hiilihydraattiosan osittaisesta hajoamisesta sen ollessa napanuorassa tai napanuorahomoge-naatissa eristyksen aikana. On vähemmän vaaraa, että yhdis-35 telmä-DNA-tekniikalla saatu entsyymi joutuu kosketuksiin hajottavien entsyymien kanssa. Näiden lektiinillä suoritet- 66 100252 tujen kokeiden tulosten perusteella voidaan päätellä, että alkuperäisen ja yhdistelmä-DNA-tekniikalla saadun EC-SOD:n hiilihydraattiosat ovat samanlaiset.
Esimerkki 13 5 Alkuperäisen napanuorasta saadun EC-SOD:n ja yhdis- telmä-DNA-tekniikalla saadun EC-SOD:n analyysi hepariini-Sepharose® -pylväässä
Noin 500 yksikköä (4,4 ^ug) alkuperäistä EC-SOD:tä ja yhdistelmä-DNA-tekniikalla saatua EC-SOD:tä kromato-10 grafoitiin käyttäen hepariini-Sepharosea^kuten on kuvattu esimerkissä 9. Kummankin entsyymin todettiin eluoitu-van väkevyydellä 0,52 M NaCl-gradientissa. Alkuperäinen ja yhdistelmä-DNA-tekniikalla saatu EC-SOD käyttäytyivät siten täysin samoin, ja tulos osoittaa, että yhdistelmä-15 DNA-tekniikana saatu EC-SOD on C-tyyppiä.
Esimerkki 14 EC-SOD-molekyylin sisältämä kupari ja sinkki
Alkuperäisen napanuorasta saadun EC-SOD:n ja yhdistelmä-DNA-tekniikalla saadun EC-SOD:n Cu- ja Zn-pitoisuus 20 määritettiin atomiabsorptiospektrometrian avulla grafiitti- uunissa Perkin-Elmer Zeeman 303 + HGA -laitteessa. Valmisteiden EC-SOD-proteiini- ja Cu- ja Zn-määriä verrattiin.
Yhden moolin alkuperäistä EC-SOD:tä (tetrameerin) todettiin sisältävän 3,97 moolia kuparia ja 4,50 moolia sink-25 kiä. Yhdistelmä-DNA-tekniikalla saatu EC-SOD sisälsi 3,98 moolia kuparia ja 4,45 moolia sinkkiä moolia kohden entsyymiä. Kyseiset kaksi valmistetta sisältävät siten yhtä suuret määrät Cu:a ja Zn:ä. Tulokset vahvistavat todeksi aikaisemman havainnon, että moolia kohden EC-SOD:tä 30 on 4 moolia kuparia (Marklund, Proc. Natl. Acad. Sei.
USA 79, 1982, ss. 7634-7638). Tuossa tutkimuksessa löydettiin myös noin neljä Zn-atomia, mutta sinkin läsnäolosta entsyymissä ei voitu saada varmuutta johtuen materiaalin niukkuudesta ja mahdollisuudesta, että sinkkiä oli läs-35 nä epäpuhtautena. Nyt saadut tulokset vahvistavat, että EC-SOD-molekyyli sisältää neljä Zn-atomia.
«7 100252
Esimerkki 15
Ihmisen EC-SOD:n vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden valmistus
Hiirille ruiskutettiin EC-SOD-C:tä, joka oli val-5 mistettu napanuorasta (esimerkit 4-6). Muutaman kuukauden kuluttua, hiirille annettiin EC-SOD:tä ruiskeena kolmena perättäisenä päivänä. Neljäntenä päivänä pernat poistettiin ja hienonnettiin. Pernasoluja fuusioitiin hiiren myeloomasolulinjan kanssa yleisten menetelmien mu-10 kaan (St. Groth ja Scheidegger, J. Immunol. Methods 35, 1980, ss. 1-21). Anti-EC-SOD:tä tuottavia klooneja tunnistettiin ELISA-tekniikan avulla (Pouillard ja Hoffman, Methods in Enzymology, 92, 1983, s. 168) ja subkloonat-tiin edelleen. Lopuksi valittiin kaksi kloonia, "14,B7" 15 ja "6,H6" vasta-aineiden tuottamista varten suuremmas sa mitassa viljelemällä hiirten vatsaontelossa. Vasta-aineet eristettiin sitten vesivatsanesteestä adsorboimal-la proteiini A -Sepharoseen0' ja desorboimalla siitä tuottajan suositusten mukaan(Pharmacia, Uppsala, Ruotsi).
20 Eluutio pylväästä suoritettiin 0,1 M glysiini-HCl:lla, pH 3,0. Välittömästi eluution jälkeen titrattiin yhdistetty IgG pH:hon 7,0 ja dialysoitiin sitten liuosta 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 + 0,15 M NaCl + 0,02 % NaN3 vastaan.
25 Esimerkki 16
Monoklonaalisen anti-EC-SOD:n immobilisointi CNBr-aktivoituun Sepharoseen®
Koska monoklonaalisen vasta-aineen "6,H6" todet- 1 2 tiin sitoutuvan n-EC-SOD:hen hyvin lujasti (Kd<*10 M), 30 valittiin vasta-aine "14B7" (Kd n. 10^M) EC-SOD:n puh distukseen. Ennen kytkemistä CNBr:lla aktivoituun Sepha-roseen oli IgG-liuoksen sisältämä atsidi (vrt. esimerkki 15) poistettava ja puskuri oli vaihdettava "kytkentä-puskuriin" (=0,1 M Na-karbonaatti, pH 8,3 + 0,5 M NaCl).
35 Tämä suoritettiin käyttäen PD10-pylvästä ja noudattaen 68 100252 tuottajan suosittelemaa menetelmää (Pharmacia, Uppsala,
(S
Ruotsi). CNBr:lla aktivoitu Sepharose turvotettiin ja valmistettiin kuten tuottaja on suositellut (Pharmacia, (S)
Uppsala, Ruotsi). CNBrrlla aktivoitua Sepharosea^ lisät-5 tiin sitten IgG-liuokseen (kytkentäpuskurissa) määrä, jonka oli arvioitu tuottavan kytkemistiheyden noin 2 mg IgGitä ml:a kohden geeliä. Seosta inkuboitiin huoneen lämpötilassa noin kahden tunnin ajan "ravistelijassa". Puskuriliuos poistettiin sitten geelistä ja siitä analy-10 soitiin jäljellä oleva proteiini. Saatiin aikaan yli 97 % kytkeytyminen. IgGrhen kytketyssä geelissä jäljellä olevat aktiiviset ryhmät suojattiin sitten inkuboi-malla 1 M etanoliamiinin kanssa pH:ssa 9,3 2 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Ylimäärä etanoliamiinia ja adsorboi-15 tunut proteiini pestiin lopuksi pois käyttäen vuorotellen "kytkentäpuskuria" (katso ylempää) ja liuosta 0,1 M Na-asetaatti, pH 4,0 + 0,5 M NaCl, neljä tai viisi kertaa. Geeli säilytettiin liuoksessa 50 mM kaliumfosfaatti, pH 7,4 + 0,5 M NaCl + 0,02 % NaN,. Monoklonaalisen IgG- d?) ** 20 Sepharosen^maksimaalinen sitomiskapasiteetti määritet tiin ikuboimalla 3 tunnin ajan ylimäärän kanssa puhdistettua EC-SOD:tä (esimerkit 4-6) ja analysoimalla sitten sent-rifugoinnin jälkeen supernatantista jäljellä oleva EC-SOD-aktiivisuus. Tulosta verrattiin vastaavaan inkubointiin (S) . .25 Sepharoserv£y 4B kanssa.
' 1 ml:aan "kytkentäpuskurissa" olevaa EC-SOD:tä li sättiin 10, 50, 100 ja 1000 ,ul monoklonaalinen anti-EC- SOD -Sepharoseen 50 % suspensiota. Suoritettiin rinnakas) kainen inkubointi samassa puskuriliuoksessa Sepharosen^ 30 HB 80 % suspensiolle. Liuoksia inkuboitiin huoneen lämpötilassa 3 tunnin ajan. Sentrifugoinnin jälkeen määritet-‘ tiin supernatanteissa jäljellä olevat EC-SOD-aktiivisuu det. Käyttäen saatuja lukuja voitiin laskea, että geelillä oli EC-SOD:n sitomiskapasiteetti noin 6000 yksikköä 35 EC-SOD:tä ml:a kohden 50 % geelisuspensiota ( = n. 12000 U/ml geeliä). Tämä luku vastaa noin 6 %:a teoreettisesta 69 100252 maksimisitomiskapasiteetista ja on lähellä tulosta, joka yleensä saadaan summittaisesti kytkeytyneellä IgG:llä.
Esimerkki 17
Yhdistelmä-DNA-tekniikalla saadun EC-SOD:n eristä-5 minen käyttäen aluksi monoklonaalinen anti-EC-SOD -Sepha-rosea
Koko puhdistusmenetelmä suoritettiin +4°C:ssa.
Noin 5 litraa CHO-K1/pPSneo-18-solujen viljelmistä saatua kasvuliuosta, joka sisälsi noin 300 U EC-SOD-aktiivi-10 suutta (n. 2,6 ^ug) mlrssa, sentrifugoitiin solujääntei- den ja saostumien poistamiseksi. Jotta saataisiin sidottua kasvuliuoksessa oleva EC-SOD (n. 1 500 000 yksikköä), käytettiin noin 125 ml monoklonaalinen anti-EC-SOD -Sepha-rosea® (esimerkki 16). IgG-Sepharose pakattiin kromatogra-15 fiapylvääseen, jonka halkaisija oli 5 cm ja korkeus noin 6,5 cm. Pylvästä pestiin liuoksella 50 mM natriumfosfaat-ti + 0,5 M NaCl, pH 7,0, ennen "näytteen lisäämistä". Kas-vuliuos syötettiin pylvääseen nopeudella 100 ml/tunti ja rekisteröitiin absorbanssi 280 nm:n aallonpituudella.
20 IgG-Sepharoseen löyhästi sitoutuneet proteiinit eluoitiin liuoksella 50 mM natriumfosfaatti, pH 6,5 + 0,5 M NaCl. Eluutiota jatkettiin kunnes saavutettiin hyvin alhainen Ä280' pestiin sitten 650 ml:11a 50 mM AMP- (= 1-aminometyylipropanoli)-HCl:a, pH 9,0, ja EC-SOD 25 eluoitiin noin 1 litralla liuosta 50 mM AMP-HC1, pH 9,0 + 1 M KSCN. Eluutionopeus oli 100 ml/tunti. Analysoitiin EC-SOD-aktiivisuus ja absorbanssi aallonpituudella 280 nm ja ne esitettiin graafisesti eluutiotilavuutta vastaan (kuvio 12). Proteiinipiikin jälkeen jäljellä oleva absor-30 banssi 280 nm:n aallonpituudella johtuu KSCNrstä. EC-SOD- aktiivisuushuipun käsittävä eluaatti yhdistettiin sitten. Jotta pienennettäisiin ioninvahvuutta ja saataisiin entsyymin sitoutuminen ioninvaihtogeeliin optimaaliseksi seuraavassa vaiheessa, yhdistämällä saatu liuos laimennet-35 tiin noin 14 tilavuudella tislattua vettä ja titrattiin 70 100252 lopuksi pH:hon 8,5 2 M AMPrllä. Talteensaanti oli IgG-affiniteettivaiheessa 60 %.
(p)
Noin 10 ml DEAE-Sephacelia4* pestiin 50 mM natrium-fosfaatilla, pH 6,5, ja pakattiin kromatografiapylvääseen, 5 jonka halkaisija oli 5 cm, noin korkeudeksi 0,5 cm. IgG-pylväästä saadun ja laimennetun EC-SOD-liuoksen annettiin adsorboitua DEAE-SephaceliirP^ pumppaamalla liuos pylvään lävitse nopeudella 60 ml/tunti. Pylvästä pestiin sitten 50 mM natriumfosfaatilla, pH 8,5, kunnes absorbanssi aal-10 lonpituudella 280 nm oli lähellä nollaa. Entsyymi eluoi- tiin liuoksella 50 mM natriumfosfaatti, pH 8,5 + 0,25 M NaCl. Analysoitiin absorbanssi aallonpituudella 280 nm ja EC-SOD-aktiivisuus ja ne esitettiin graafisesti eluu-tiotilavuutta vastaan (kuvio 13). Huipun fraktiot yhdistet-15 tiin, dialysoitiin 50 mM natriumfosfaattia, pH 6,5, vas taan ja konsentroitiin noin 6 ml:ksi. Takaisinsaanti oli tässä vaiheessa noin 100 %.
EC-SOD puhdistettiin lopuksi adsorboimalla hepariini-(R)
Sepharoseen^ ja desorboimalla siitä. 12 ml hepariini-Sepha-20 rosea valmistettiin kuten tuottaja on suositellut (Pharma cia,Uppsala, Ruotsi) ja pestiin liuoksessa 50 mM natrium- fosfaatti, pH 6,5, + 1 M NaCl ja sitten 50 mM natriumf©sfäärit tiliä, pH 6,5. Hepariini-Sepharose -geeli pakattiin kromatograf iapylvääseen, jonka halkaisija oli 2,5 cm (korkeu-25 deksi noin 2,5 cm). DEAE-Sephacel^ -pylväästä saatu, yhdis-.. tetty, konsentroitu ja dialysoitu liuos (6 ml, omaten EC- SOD- aktiivisuuden noin 185 000 U/ml) syötettiin pylvääseen eluutionopeudella 10 ml/tunti. Rekisteröitiin absorbanssi aallonpituudella 280 nm. Eluutio aloitettiin 50 mM 30 natriumfosfaatilla, pH 6,5, ja käyttäen eluutionopeutta 20 ml/tunti. Kun absorbanssi aallonpituudella 280 nm lä-V hestyi perusviivaa, EC-SOD eluoitiin käyttäen NaCl-gra- dienttia 0-1 M NaCl. Gradientin tilavuus oli 270 ml. EC-SOD:n suojaamiseksi suurelta NaCl-konsentraatiolta frak-35 tiot laimennettiin (gradientin alusta lähtien) tislatulla 7i 100252 vedellä. Pylvään eluaatin luovuttavasta päästä tulevaan muoviletkuun asennettiin kolmihaaraputki ja tislattua vettä pumpattiin eluaattiin nopeudella, joka oli kaksinkertainen pylvään eluutionopeuteen verrattuna.
5 EC-SOD-aktiivisuus eluoitui yhtenä piikkinä (kuvio 14) suurin piirtein samalla NACl-konsentraatiolla kuin C-piikki esimerkissä 6. Piikin keskikohdan fraktiot yhdistettiin (yhdistetty liuos I). Yhdistetyn liuoksen I spesifinen aktiivisuus (U/ml) jaettuna A^gilla) oli 88 400.
10 Napanuorahomogenaatista valmistetun alkuperäisen EC-SOD:n (vrt. esimerkki 1) spesifiseksi aktiivisuudeksi saatiin samassa menetelmässä 88 200. Nämä luvut ovat siis miltei identtisiä ja jonkin verran suurempia kuin aikaisemmin julkaistut (Marklund, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79, 1982, 15 ss. 7634-7638). Näitä kahta valmistetta analysoitiin esimerkeissä 12-14 ja 18-20. Piikin kylkien fraktiot yhdistettiin myös (yhdistetty liuos II). Yhdistetyt liuokset I ja II konsentroitiin ja dialysoitiin 50 mM natriumfosfaattia, ph 6,6, vastaan. EC-SOD:n saanto oli hepariini-Sepharose 20 -vaiheessa noin 60 %. Liuokset I ja II sisälsivät kaikkiaan 600 000 U (noin 5,3 mg), mikä on 40 % alkuperäisestä CHO-K1/pPS3neo-18-kasvuliuoksessa olleesta aktiivisuudesta.
Esimerkki 18
Alkuperäisen EC-SOD:n ja yhdistelmä-DNA-tekniikan 25 avulla saadun EC-SOD:n molekyylikoon määrittäminen geeli-. kromatografiän avulla
Napanuorasta saadun alkuperäisen entsyymin ja yhdis- telmä-DNA-tekniikalla saadun entsyymin molekyylipaino mää- (r) ritettiin geelisuodatuksen avulla käyttäen Sephacryl S-300^ 30 -pylväästä. Pylväs (halkaisija 1,6 cm, pituus 96 cm) eluoi-tiin käyttäen eluenttina liuosta 10 mM kaliumfosfaatti, pH 7,4 +0,15 M NaCl. Pylväs kalibroitiin ferritiinin • (440 000), IgG:n (150 000), naudan seerumin albumiinin (67 000), ovalbumiinin (43 000), kymotrypsinogeenin (25 000) 35 ja ribonukleaasin (13 700) avulla (molekyylipainot suluissa).
72 100252
Alkuperäinen ja yhdistelmä-DNA-tekniikalla saatu EC-SOD eluoituivat pylväästä kohdissa, jotka vastasivat molekyylipainoja 136 000 ja 151 000, vastaavasti. Yhdistelmä-DNA-tekniikalla saatu EC-SOD vaikutti siten ole-5 van hiukan suurempi. Ero voi osittain johtua akuperäisen entsyymin alayksikköjen osittaisesta hajottamisesta, mikä näkyy jäljempänä esitetyissä SDS-PAGE-kokeissa (esimerkki 19). Alkuperäisen EC-SOD:n heterogeenisyys kro-matografoltaessa käyttäen vehnänalkiolektiiniä (esimerk-10 ki 12) viittaa myös entsyymien hiilihydraattiosan osittaiseen hajoamiseen.
Esimerkki 19
Alkuperäisen napanuorasta saadun EC-SOD:n ja yhdistelmä-DNA-tekniikalla saadun EC-SOD:n analysointi elektro-15 foreesin avulla gradienttipolyakryyliamidigeeleissä nat- riumdodesyylisulfaatin läsnä ollessa
Alkuperäisen ja yhdistelmä-DNA-tekniikalla saadun EC-SOD:n alayksikköjen molekyylipainoa verrattiin suorittamalla elektroforeesi gradienttigeeleissä 20 (10-15 %, SDS:n läsnä ollessa).
Suurin piirtein 25 ^,ug kumpaakin entsyymiä (n-EC-SOD:tä ja yhdistelmä-DNA-tekniikalla saatua eli r-EC-S0D:tä) pakastekuivattiin ja liuotettiin sitten 50 yug:aan näyteseosta, joka sisälsi 5 % sakkaroosia, 25 5 mM EDTA:a, 5 % 2-merkaptoetanolia ja 2 % SDS:ä pusku riliuoksessa, jonka muodostivat 0,4 M boorihappo ja 0,41 M Tris, pH 8,64. Näytteitä keitettiin 5 minuutin ajan ja jäähdytettiin välittömästi jäissä. Noin 1 ^,ul (noin 0,2 ^,ug) kumpaakin näytettä sijoitettiin Pharmacia 30 Phast System -gradientti- (10-15 %) -polyakryyliamidi- geeliin ja sitten suoritettiin ajo Pharmacia Phast System -laitteessa tuottajan suositusten mukaan (Pharmacia,
TM
Uppsala, Ruotsi, Phast System Separation Technique File nro 110). Ajon tuloksena saatu geeli värjättiin Coomassie-35 loistavansinisellä, vrt. kuvio 15. Kaistat sisältävät 73 100252 vasemmalta oikealle yhdistelmä-DNA-tekniikalla saatua EC-SOD:tä, napanuorasta saatua alkuperäistä EC-SOD:tä ja molekyylipainomerkkiaineiden seosta (94 000, 67 000, 43 000, 29 000, 20 100 ja 14 400). Merkkiaineella, jonka liikkuvuus on samanlainen kuin EC-SOD:eillä, molekyylipaino on 29 000. Kummassakaan EC-SOD:ssä ei voitu havaita epäpuhtauksia.
5 Yhdistelmä-DNA-tekniikalla saadulla EC-S0D:llä on yksi vyöhyke, jonka molekyylipaino on noin 32 000. Alkuperäisellä EC-SOD:llä esiintyy kaksi vyöhykettä, joista suuremmalla on ilmeisesti sama molekyylipaino kuin yhdistelmä-DNA-tekniikalla saadulla EC-SOD:llä ja pienemmän molekyylipaino on 10 noin 28 000. Näiden kahden vyöhykkeen suhteelliset määrät vaihtelevat valmisteesta valmisteeseen alkuperäistä EC-SOD:tä, ja heterogeenisyys johtuu luultavasti entsyymin osittaisesta hajoamisesta.
Esimerkki 20 15 Alkuperäisen ja yhdistelmä-DNA-tekniikalla saadun EC-S0D:n aminohappokoostumuksen ja EC-SOD:n koodittavasta cDNA-sekvenssistä päätellyn aminohapposekvenssin keskeinen vertailu
Alkuperäisen napanuorasta saadun EC-SOD:n ja yhdis-20 telmä-DNA-tekniikan avulla saadun EC-SOD:n aminohappokoos tumus on esitetty taulukossa II. Tryptofaani ei ollut mukana vertailussa, koska sitä ei saada luotettavasti määritettyä aminohappoanalysaattorissa. Taulukosta ilmenee, että ·: alkuperäinen ja yhdistelmä-DNA-tekniikalla saatu entsyymi 25 ovat koostumukseltaan miltei identtisiä. Yhteensopivuus cDNA-sekvenssistä pääteltyjen lukujen kanssa on myös erittäin hyvä. Tulokset osoittavat, että alkuperäinen ja yhdistelmä-DNA-tekniikalla saatu entsyymi ovat käytännöllisesti katsoen identtisiä ja että cDNA-sekvenssistä päätelty ami-30 nohapposekvenssi on oikea.
74 100252
Taulukko II
Ihmisen EC-S0D:n aminohappokoostumus % jäännöksiä/jäännösten kokonaismäärä DNA-sekvenssin alkuperäi- yhdistelmä-DNA- mukaan nen ent- tekniikalla saa- ___svvmi_tu entsyymi_
Amino- *yrp -Trp -Trp -Trp 10 happo
Phe 3,2 3,2 3,3 3,2
Leu 6,3 6,5 6,8 6,7
Ile 1,8 1;8 1.6 1,4 15 Met 0,9 0,9 1.2 0,9
Vai 7,7 7,8 6,4 6.2
Ser 6,8 6,9 6,8 7,8
Pro 5,9 6,0 6,1 6.2
Thr 3,2 3,2 2,9 3,4 20 Ala 12,2 12.4 13.1 12,5
Tyr 1,4 1.4 1,5 1,4
His 4.1 4.1 4.2 3,9
Gin 5,0 5.1
Glu 6,8 6,9 25 Glx 11,7 12,0 11,7 12.1 il 1 i "· Asn 3,2 3,2
Asp 5.9 6.0
Asx 9,0 9.2 9,3 9.3
Lys 2,3 2,3 1,9 2.5 30 Cys 2,7 2,8 2.8 2.8
Trp 2,3
Arg 9,0 9,2 9,8 9.4
Gly 9,9 10,1 10,5 10.4
Claims (12)
1. Menetelmä EC-SOD:n valmistamiseksi, tunnettu siitä, että DNA-fragmentti, joka sisältää seu-5 raavan EC-SOD:tä koodittavan DNA-sekvenssin, TrpThrGlyGluAspSerAlaGluProAsnSerAspSerAlaGluTrpIleArgAspMet TGGACGGGCGAGGACTCGGCGGAGCCCAACTCTCACTCGGCGGAGTGGATCCGAGACATG ACCTGCCCGCTCCTGAGCCGCCTCGGGTTGAGACTGAGCCGCCTCACCTAGGCTCTGTAC 10 30 40 TvrAlaLvsValThrGlulleTrpGlnGluValMetGlnAraAraAspAspAspGlvThr TACGCCAAGGTCACGGAGATCTGGCAGGAGGTCATGCAGCGGCGGGACGACGACGGCACG ATGCGGTTCCAGTGCCTCTAGACCGTCCTCCAGTACGTCGCCGCCCTGCTGCTGCCGTGC 15 50 60 LeuHisAlaAlaCysGlnValGlnPrcSerAlaThrLeuAspAlaAlaGlnProArqVal CTCCACGCCGCCTGCCAGGTGCAGCCGTCGGCCACGCTGGACGCCGCGCAGCCCCGGGTG GAGGTGCGGCGGACGGTCCACGTCGGCAGCCGGTGCGACCTGCGGCGCGTCGGGGCCCAC 70 80 ThrGlvValVa ILeuPheArgGlnLeuAlaProAraAlaLvsLeuAspAlaPhePheAla ACCGGCGTCGTCCTCTTCCGGCAGCTTGCGCCCCGCGCCAAGCTCGACGCCTTCTTCGCC TGGCCGCAGCAGGAGAAGGCCGTCGAACGCGGGGCGCGGTTCGAGCTGCGGAAGAAGCGG 90 ^ 100 LeuGluGlyPheProThrGlvProAsnSerSerSerArgAlalleHisValHisGlnPhe CTGGAGGGCTTCCCGACCGAGCCGAACAGCTCCAGCCGCGCCATCCACGTGCACCAGTTC •: GACCTCCCGAAGGGCTGGCTCGGCTTGTCGAGGTCGGCGCGGTAGGTGCACGTGGTCAAG 25 110 120 GlvAsnLeuSerGlnGlvcysGluSerThrGlvProHisTvrAsnProLeuAlaValPro GGGGACCTGAGCCAGGGCTGCGAGTCCACCGGGCCCCACTACAACCCGCTGGCCGTGCCG CCCCTGGACTCGGTCCCGACGCTCAGGTGGCCCGGGGTGATGTTGGGCGACCGGCACGGC 130 140
30 HisProGlnHisProGlvAspPheGlvAsnPheAlaValAraAspGlvSerLeuTrpArq • · CACCCGCAGCACCCCGGCGACTTCGGCAACTTCGCGGTCCGCGACGGCAGCCTCTGGAGG GTGGGCGTCGTGGGCCCGCTGAAGCCGTTGAAGCGCCAGGCGCTGCCGTCGGAGACCTCC 150 160 TyrArgAlaGlvLeuAlaAlaSerLeuAlaGLyProHisSerlleValGlvAraAlaVal TACCGCGCCGGCCTGGCCGCCTCGCTCGCGGGCCCGCACTCCATCGTGGGCCGGGCCGTG
35 ATGGCGCGGCCGGACCGGCGGAGCGAGCGCCCGGGCGTGAGGTAGCACCCGGCCCGGCAC 100252
170 ISO ValValHisAlaGLyGluAspAspLeuGlyArgGlyGlyAsnGlnAlaSerValGluAsn GTCGTCCACGCTGGCGAGGACGACCTGGGCCGCGGCGGCAACCAGGCCAGCGTGGAGAAC CAGCAGGTGCGACCGCTCCTGCTGGACCCGGCGCCGCCGTTGGTCCGGTCGCACCTCTTG 5 190 200 GlvAsnAlaGlyAroArqLeuAlaCvsCvsValValGlvValCvsGlvProGlvLeuTrp GGGAACGCGGGCCGGCGGCTGGCCTGCTGCGTGGTGGGCGTGTGCGGGCCCGGGCTCTGG CCCTTGCGCCCGGCCGCCGACCGGACGACGCACCACCCGCACACGCCCGGGCCCGAGACC 210 220 10 GluArgGlnAlaArgGluHisSerGluArgLysLysArgArgArgGluSerGluCysLys GAGCGCCAGGCGCGGGAGCACTCAGAGCGCAAGAAGCGGCGGCGCGAGAGCGAGTGCAAG CTCGCGGTCCGCGCCCTCGTGAGTCTCGCGTTCTTCGCCGCCGCGCTCTCGCTCACGTTC AlaAla GCCGCC CGGCGG 15 tai sen muunnos, joka koodittaa polypeptidiä, jolla on natiivin EC-SOD:n superoksididismutaatio-vaikutus ja hepa-riinia sitova vaikutus ja joka sitoutuu vasta-aineeseen, 20 joka sitoo ihmisen EC-SOD tyyppi C:n mutta ei ihmisen CuZnSOD:tä, joka DNA-fragmentti lisäksi käsittää signaali-sekvenssin, joka koodittaa signaalipeptidiä, jonka läsnäolo varmistaa EC-SOD:n erittymisen soluista, insertoidaan vektoriin, jolla on kyky replikoitua tietyssä isäntäsolus-25 sa, saatu yhdistelmävektori viedään isäntäsoluun, joka kasvatetaan sopivassa kasvualustassa tai sopivalla kasvualustalla EC-SOD:n ilmentämisen kannalta sopivissa olosuhteissa, ja vähintään merkittävä osa ilmennetystä EC-SOD:sta erittyy kasvualustaan ja otetaan talteen.
2. ACCGGCGTCGTCCTCTTCCGGCAGCTTGCGCCCCGCGCCAAGCTCGACGCCTTCTTCGCC TGGCCGCAGCAGGAGAAGGCCGTCGAACGCGGGGCGCGGTTCGAGCTGCGGAAGAAGCGG 90 100 LeuGluGlyPheProThrClyProAsnSerSerSerAraAlalleHisValHisGlnPhe CTGGAGGGCTTCCCGACCGAGCCGAACAGCTCCAGCCGCGCCATCCACGTGCACCAGTTC GACCTCCCGAAGGGCTGGCTCGGCTTGTCGAGGTCGGCGCGGTAGGTGCACGTGGTCAAG 25 110 120 GlvAspLeuSerGlnGlvCvsGluSerThrGlvProHisTvrAsnProLeuAlaVa 1 Pro GGGGACCTGAGCCAGGGCTGCGAGTCCACCGGGCCCCACTACAACCCGCTGGCCGTGCCG CCCCTGGACTCGGTCCCGACGCTCAGGTGGCCCGGGGTGATGTTGGGCGACCGGCACGGC 130 140 ; 30 Ηΐ5ΡΓθ01πΗΐ3ΡΓθΰ1νΑ5ρΡΐΊ6αΐνΑ5ηΡΜ6Α^νΒΐΑΓθΑ3Ρΰ1ν5€Γΐ,βυΤΓΡΑΓσ CACCCGCAGCACCCGGGCGACTTCGGCAACTTCGCGGTCCGCGACGGCAGCCTCTGGAGG GTGGGCGTCGTGGGCCCGCTGAAGCCGTTGAAGCGCCAGGCGCTGCCGTCGGAGACCTCC 150 160 TvrAraAlaGlvLeuAlaAlaSerLeuAlaGlvProHisSerlleValGlvAraAlaVal TACCGCGCCGGCCTGGCCGCCTCGCTCGCGGGCCCGCACTCCATCGTGGGCCGGGCCGTG 35 ATGGCGCGGCCGGACCGGCGGAGCGAGCGCCCGGGCGTGAGGTAGCACCCGGCCCGGCAC 80 100252 170 180 ValValHisAlaGlyGluAspAspLeuGlyArgGlyGlyAsnGlnAlaSerValGluAsn GTCGTCCACGCTGGCGAGGACGACCTGGGCCGCGGCGGCAACCAGGCCAGCGTGGAGAAC CAGCAGGTGCGACCGCTCCTGCTGGACCCGGCGCCGCCGTTGGTCCGGTCGCACCTCTTG ® 190 200 GlvAsnAlaGlvArqArqLeuAlaCvsCvsValValGlvValCvsGlvProGlvLeuTrp GGGAACGCGGGCCGGCGGCTGGCCTGCTGCGTGGTGGGCGTGTGCGGGCCCGGGCTCTGG CCCTTGCGCCCGGCCGCCGACCGGACGACGCACCACCCGCACACGCCCGGGCCCGAGACC 210 220 _ _ GluArgGlnAlaArgGluHisSerGluArgLysLysArgArgArgGluSerGluCysLys iU GAGCGCCAGGCGCGGGAGCACTCAGAGCGCAAGAAGCGGCGGCGCGAGAGCGAGTGCAAG CTCGCGGTCCGCGCCCTCGTGAGTCTCGCGTTCTTCGCCGCCGCGCTCTCGCTCACGTTC AlaAla GCCGCC CGGCGG 15 eller en modifikation därav, som kodar en polypeptid, vil-ken har det nativa EC-SOD:ts superoxiddismuterande verkan och heparinbindande verkan och binds av en antikropp, som 20 binder human EC-SOD typ C men inte human CuZnSOD, vilket DNA-fragment ytterligare omfattar en signalsekvens, vilken kodar en signalpeptid, vars närvaro tillförsäkrar sekre-tion av EC-SOD frän cellerna, insätts i en vektor, vilken förmär replikera i en specifik värdcell, den resulterande 25 rekombinanta vektorn införs i en värdcell, som odlas i eller pä ett lämpligt odlingsmedium under lämpliga för-hällanden för expression av EC-SOD, och ätminstone en be-tydande del av det uttryckta EC-SOD:t utsöndras i odlings-mediet och tillvaratas. 30 2. Förfarande enligt patentkrav 1, känne- t e c k n a t därav, att DNA-sekvensen är komplementärt DNA, genom-DNA eller syntetiskt DNA, eller blandning av genom-DNA och syntetiskt DNA, en blandning av genom DNA och komplementärt DNA eller en blandning av komplementärt 35 DNA och syntetiskt DNA. 100252
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi on komplementaarista DNA:sta, genomi-DNA:ta tai synteettistä DNA:ta, tai osaksi genomi- ja osaksi synteettistä DNA:ta, osaksi genomi- ja osaksi komplementaarista DNA:ta tai osaksi kom-35 plementaarista ja osaksi synteettistä DNA:ta. 100252
3. Förfarande enligt patentkrav 1 eller 2, k ä n -netecknat därav, att DNA-sekvensen Mr av dägg-djursursprung, speciellt av mänskligt ursprung.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA sekvenssi on peräisin nisäkkäästä, erityisesti ihmisestä.
4. Förfarande enligt patentkrav 1, kanne- 5 tecknat därav, att signalsekvensen har följande sekvens -18 -10 -1 MetLeuAlaLeuLeuCysSerCysLeuLeuLeuAlaAlaGlyAlaSerAspAla ATGCTGGCGCTACTGTGTTCCTGCCTGCTCCTGGCAGCCGGTGCCTCGGACGCC 10 TACGACCGCGATGACACAAGGACGGACGAGGACCGTCGGCCACGGAGCCTG CGG 120
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että signaalisekvenssillä on seu-raava sekvenssi -18 -10 -1 MetLeuAlaLeuLeuCysSerCysLeuLeuLeuAlaAlaGlyAlaSerAspAla 10 ATGCTGGCGCTACTGTGTTCCTGCCTGCTCCTGGCAGCCGGTGCCTCGGACGCC TACGACCGCGATGACACAAGGACGGACGAGGACCGTCGGCCACGGAGCCTGCGG 120
5. Replikationsduglig expressionsvektor, k ä n -netecknad därav, att den omf attar den i patent- 15 kravet 1 angivna DNA-sekvensen.
5. Replikoituva ilmentymisvektori, tunnettu 15 siitä, että se sisältää patenttivaatimuksessa 1 esitetyn DNA-sekvenssin.
6. Vektor enligt patentkrav 5, känneteck-n a d därav, att den är en autonomt replikerande vektor, säsom en plasmid, en fag, en kosmid, en minikromosom eller ett virus, eller en vektor som d4 den införs i en värd- 20 cell, integreras med värdcellgenomen.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen vektori, tunnettu siitä, että se on autonomisesti replikoituva vektori, kuten plasmidi, faagi, kosmidi, minikromoso- 20 mi tai virus, tai vektori, joka vietynä isäntäsoluun integroituu isäntäsolun genomiin.
7. Cell, kännetecknad därav, att den innehäller en vektor enligt patentkravet 5 eller 6.
7. Solu, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukaisen vektorin.
8. Cell enligt patentkrav 7, kännetecknad därav, att den är en prokaryotisk cell, säsom en 25 bakterie, en encellig eukaryotisk organism, säsom en svamp eller jäst, eller en cell som härstammar frän en flercel-lig organism, säsom ett djur eller en växt, speciellt en däggdjurscell, t.ex. CHO-Kl/pPS3neo-18, vilken deponerats i the European Collection of Animal Cell Cultures med de-30 poneringsnumret ECACC 86082701.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen solu, t u n -25 n e t t u siitä, että se on prokaryoottisolu, kuten bakteeri, yksisoluinen eukaryoottinen organismi, kuten sieni tai hiiva, tai monisoluisesta organismista, kuten eläimestä tai kasvista, peräisin oleva solu, erityisesti nisäkäs-solu, esimerkiksi CHO-Kl/pPS3neo-18, joka on talletettu 30 kokoelmaan the European Collection of Animal Cell Cultures talletusnumerolla ECACC 86082701.
9. Isolerat eller rekombinant DNA-fragment, kännetecknat därav, att det kodar EC-SOD och har den i patentkravet 1 angivna DNA-sekvensen.
9. Eristetty tai rekombinantti DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että se koodittaa EC-S0D:ta ja sillä on patenttivaatimuksessa 1 esitetty DNA-sekvenssi. 100252
10. DNA-fragment enligt patenkrav 9, k ä n n e -35 tecknat därav, att det är komplementärt DNA, genom- 100252 DNA eller syntetiskt DNA, eller blandning av genom-DNA och syntetiskt DNA, en blandning av genom-DNA och komplemen-tärt DNA eller en blandning av komplementärt DNA och syntetiskt DNA.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että se on komplementaarista DNA:-ta, genomi-DNA:ta tai synteettistä DNA:ta, tai osaksi ge-nomi- ja osaksi synteettistä DNA:ta, osaksi genomi- ja 5 osaksi komplementaarista DNA:ta tai osaksi komplementaa rista ja osaksi synteettistä DNA:ta.
11. DNA-fragment enligt patenkrav 10, känne- t e c k n a t därav, att det är av däggdjursursprung, specielllt av mänskligt ursprung.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että se on peräisin nisäkkäästä, erityisesti ihmisestä.
12. Jonkin patenttivaatimuksista 9-11 mukainen DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää seuraavan signaalisekvenssin -18 -10 -1 15 MetLeuAlaLeuLeuCysSerCysLeuLeuLeuAlaAlaGlyAlaSerAspAla ATGCTGGCGCTACTGTGTTCCTGCCTGCTCCTGGCAGCCGGTGCCTCGGACGCC TACGACCGCGATGACACAAGGACGGACGAGGACCGTCGGCCACGGAGCCTG CGG 120 100252 l. Förfarande för framställning av EC-SOD, k ä n -netecknat därav, att ett DNA-fragment, som omfat-5 tar följande DNA-sekvens, vilken kodar EC-SOD, TrpTh rGl vCluAspSerAlaGiuProAsnSerAspSerA laGluTrpIleAcgAspMet TGGACGGGCGAGGACTCGGCGGAGCCCAACTCTCACTCGGCGGAGTGGATCCGAGACATG ACCTGCCCGCTCCTGAGCCGCCTCGGGTTGAGACTGAGCCGCCTCACCTAGGCTCTGTAC 10 30 40 TvrAlaLvsValThrGluIleTrpGlnGluValMetGlnAraAraAspAspAspGlvThr TACGCCAAGGTCACGGAGATCTGGCAGGAGGTCATGCAGCGGCGGGACGACGACGGCACG ATGCGGTTCCAGTGCCTCTAGACCGTCCTCCAGTACGTCGCCGCCCTGCTGCTGCCGTGC 15 50 60 LeuHisAlaAlaCysGlnValGlnPrcSerAlaThrLeuAspAlaAlaGlnProArqVal CTCCACGCCGCCTGCCAGGTGCAGCCGTCGGCCACGCTGGACGCCGCGCAGCCCCGGGTG GAGGTGCGGCGGACGGTCCACGTCGGCAGCCGGTGCGACCTGCGGCGCGTCGGGGCCCAC 70 80 ThrGlvValValLeuPheArCTGlnLeuAlaProArCTAlaLvsLeuAspAlaPhePheAla
12. DNA-fragment enligt nägot av patentkraven 9 -11, kännetecknat därav, att det ytterligare 10 omfattar följande signalsekvens -18 -10 -1 MetLeuAlaLeuLeuCysSerCysLeuLeuLeuAlaAlaGlyAlaSerAspAla ATGCTGGCGCTACTGTGTTCCTGCCTGCTCCTGGCAGCCGGTGCCTCGGACGCC TACGACCGCGATGACACAAGGACGGACGAGGACCGTCGGCCACGGAGCCTG CGG 15 120 • · ·
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK402785A DK402785D0 (da) | 1985-09-03 | 1985-09-03 | Fremgangsmaade til fremstilling af et enzym |
| DK402785 | 1985-09-03 | ||
| DK8600098 | 1986-09-02 | ||
| PCT/DK1986/000098 WO1987001387A1 (en) | 1985-09-03 | 1986-09-02 | A superoxide dismutase |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI871853A0 FI871853A0 (fi) | 1987-04-28 |
| FI871853A FI871853A (fi) | 1987-04-28 |
| FI100252B true FI100252B (fi) | 1997-10-31 |
Family
ID=8129425
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI871853A FI100252B (fi) | 1985-09-03 | 1987-04-28 | Menetelmä superoksididismutaasin valmistamiseksi ja sitä koodittava DN A-fragmentti, ilmentymisvektori ja solu |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5130245A (fi) |
| EP (1) | EP0236385B1 (fi) |
| JP (2) | JP2643934B2 (fi) |
| KR (1) | KR920008738B1 (fi) |
| CN (1) | CN1030718C (fi) |
| AT (1) | ATE69466T1 (fi) |
| AU (1) | AU598756B2 (fi) |
| CA (1) | CA1340329C (fi) |
| DE (1) | DE3682505D1 (fi) |
| DK (2) | DK402785D0 (fi) |
| FI (1) | FI100252B (fi) |
| HU (1) | HU215937B (fi) |
| IE (1) | IE59078B1 (fi) |
| IL (1) | IL79926A (fi) |
| NO (1) | NO301132B1 (fi) |
| SU (1) | SU1779263A3 (fi) |
| WO (1) | WO1987001387A1 (fi) |
| ZA (1) | ZA871267B (fi) |
Families Citing this family (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0213628A3 (en) * | 1985-09-03 | 1988-09-21 | Yeda Research And Development Company, Ltd. | Expression of superoxide dismutase in eukaryotic cells |
| US6610520B1 (en) * | 1985-11-22 | 2003-08-26 | Bio-Technology General Corp. | Gene encoding human manganese superoxide dismutase and recombinant polypeptide encoded thereby |
| JPS63132820A (ja) * | 1986-11-22 | 1988-06-04 | Minoru Nakano | 口腔用組成物 |
| EP0676472A1 (de) * | 1987-03-14 | 1995-10-11 | BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH | Humane Mangan-Superoxiddismutase (hMn-SOD) |
| US5260204A (en) * | 1987-03-14 | 1993-11-09 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Human manganese superoxide dismutase (hMn-SOD) |
| DE3854678T2 (de) * | 1987-03-27 | 1996-06-13 | Bio Technology General Corp | Menschliches Mangansuperoxiddismutase und Behandlungsverfahren. |
| DK310788A (da) * | 1987-06-09 | 1988-12-10 | Int Cardiovascular Med Inc | Praeparat indeholdende superoxid-dismutase, dets fremstilling og anvendelse til behandling af global iskaemi |
| JPH01238537A (ja) * | 1988-03-18 | 1989-09-22 | Toyo Jozo Co Ltd | 肝障害治療剤 |
| JPH01246225A (ja) * | 1988-03-28 | 1989-10-02 | Toyo Jozo Co Ltd | 膵炎治療剤 |
| JPH0262829A (ja) * | 1988-05-18 | 1990-03-02 | Nippon Kayaku Co Ltd | 虚血に基づく傷害の予防及び治療剤 |
| DK455789D0 (da) * | 1989-09-15 | 1989-09-15 | Symbicom Ab | Polypeptid |
| DE4038563A1 (de) * | 1990-12-04 | 1992-06-11 | Gruenenthal Gmbh | Verwendung von superoxiddismutasen zur prophylaxe und/oder behandlung von organversagen bei risikopatienten mit polytrauma |
| DE4239877C1 (de) * | 1992-11-27 | 1994-03-17 | Boehringer Ingelheim Int | Stabilisierte Superoxid-Dismutase (SOD)-Zusammensetzung |
| EP0627486A1 (en) * | 1993-06-04 | 1994-12-07 | N.V. Innogenetics S.A. | New extracellular superoxide dismutase, a process for preparing the same and compositions containing the same |
| DK75393D0 (da) * | 1993-06-24 | 1993-06-24 | Symbicom Ab | Production of protein |
| US5747026A (en) * | 1993-10-15 | 1998-05-05 | University Of Alabama At Birmingham Research Foundation | Antioxidants |
| US5994339A (en) * | 1993-10-15 | 1999-11-30 | University Of Alabama At Birmingham Research Foundation | Oxidant scavengers |
| US6127356A (en) * | 1993-10-15 | 2000-10-03 | Duke University | Oxidant scavengers |
| DE4336641C2 (de) * | 1993-10-22 | 1995-09-07 | Deutsches Rheuma Forschungszen | Verwendung von Superoxid-Dismutase (SOD) zur Behandlung retroviraler Erkrankungen |
| AU3758695A (en) * | 1994-09-20 | 1996-04-09 | Duke University | Oxidoreductase activity of manganic porphyrins |
| ATE205723T1 (de) * | 1994-11-04 | 2001-10-15 | Polymun Scient Immunbio Forsch | Applikation von sod in liposomen |
| MY128323A (en) * | 1996-09-30 | 2007-01-31 | Otsuka Pharma Co Ltd | Thiazole derivatives for inhibition of cytokine production and of cell adhesion |
| WO1999006059A2 (en) * | 1997-07-30 | 1999-02-11 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions relating to no-mediated cytotoxicity |
| US6171856B1 (en) | 1997-07-30 | 2001-01-09 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions relating to no-mediated cytotoxicity |
| JP2001521939A (ja) | 1997-11-03 | 2001-11-13 | デューク・ユニバーシティー | 置換されたポルフィリン類 |
| JP4648542B2 (ja) | 1998-04-24 | 2011-03-09 | デューク ユニバーシティ | 置換ポルフィリン |
| WO2000043395A1 (en) | 1999-01-25 | 2000-07-27 | National Jewish Medical And Research Center | Substituted porphyrins |
| ES2330728T3 (es) * | 2001-01-19 | 2009-12-15 | National Jewish Health | Medicamento para proteccion en radioterapia. |
| FI20010898A0 (fi) * | 2001-04-30 | 2001-04-30 | Ylae Herttuala Seppo | Ekstrasellulaarinen superoksididismutaasi (EC-SOD) geeniterapia restenoosoin ehkäisemiseksi |
| AU2002312194B8 (en) * | 2001-06-01 | 2008-05-15 | Aeolus Sciences, Inc. | Oxidant scavengers for treatment of diabetes or use in transplantation or induction of immune tolerance |
| EP1499344A1 (en) * | 2002-04-30 | 2005-01-26 | FIT Biotech Oyj Plc | Medical device |
| JP2006501163A (ja) * | 2002-06-07 | 2006-01-12 | デューク・ユニバーシティー | 置換ポルフィリン |
| EP1692187B1 (en) * | 2003-10-31 | 2012-06-27 | Tae-Yoon Kim | EC SOD and cell transducing EC SOD and use thereof |
| CN100345973C (zh) * | 2004-11-18 | 2007-10-31 | 中国农业大学 | 超氧化物歧化酶基因的表达方法及其专用载体 |
| RU2506083C2 (ru) | 2008-05-23 | 2014-02-10 | Нэшнл Джуиш Хелт | Способ лечения поражений, ассоциированных с воздействием алкилирующих веществ |
| US20100098768A1 (en) * | 2008-10-16 | 2010-04-22 | Clarkson University | Method of neuroprotection from oxidant injury using metal oxide nanoparticles |
| CN102660580A (zh) * | 2012-05-18 | 2012-09-12 | 深圳市北科生物科技有限公司 | Sod基因修饰间充质干细胞的构建方法及其应用 |
| MX363474B (es) * | 2013-03-15 | 2019-03-25 | Baxter Int | Inmovilizacion de un agente activo en un sustrato. |
| EP3003413B1 (en) | 2013-06-07 | 2017-12-13 | Baxter International Inc. | Immobilization of an active agent on a substrate using compounds including trihydroxyphenyl groups |
| CN104342409B (zh) * | 2014-06-17 | 2018-05-25 | 吉林金梓源生物科技股份有限公司 | 重组人参超氧化物歧化酶的制备方法 |
| CN104342408B (zh) * | 2014-06-18 | 2018-05-25 | 吉林金梓源生物科技股份有限公司 | 重组蛹虫草超氧化物歧化酶的制备方法 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK145950C (da) * | 1979-05-17 | 1983-09-26 | Forenede Bryggerier As | Fremgangsmaade til isolering af cu,zn-superoxid-dismutase fra vandige oploesninger indeholdende dette enzym sammen med ledsagende proteiner |
| US4530901A (en) * | 1980-01-08 | 1985-07-23 | Biogen N.V. | Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides |
| JPS56102787A (en) * | 1980-01-18 | 1981-08-17 | Mamoru Sugiura | Preparation of human placenta superoxide dismutase |
| JPS5729285A (en) * | 1980-07-30 | 1982-02-17 | Takeda Chem Ind Ltd | Superoxide dismutase and its preparation |
| JPS57155991A (en) * | 1981-03-23 | 1982-09-27 | Green Cross Corp:The | Preparation of superoxide dismutase derived from human placenta |
| EP0091539B2 (en) * | 1982-03-31 | 1996-11-27 | Ajinomoto Co., Inc. | Gene coding for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying said gene, cell lines possessing the recombinant DNA,and method for producing interleukin-2 using said cells |
| IT1150598B (it) * | 1982-12-14 | 1986-12-17 | Ines Bianchi | Procedimento per la purificazione della superossidodismutasi mediante cromatografia di affinita' |
| EP0138111B1 (en) * | 1983-10-03 | 1991-11-21 | Chiron Corporation | Superoxide dismutase cloning and expression in microorganisms |
| JPS61111690A (ja) * | 1984-11-06 | 1986-05-29 | Ube Ind Ltd | 組換えｄｎａおよびその用途 |
| JPS61139390A (ja) * | 1984-12-13 | 1986-06-26 | Nippon Kayaku Co Ltd | ひとｓｏｄをコ−ドする新規ｄｎａおよびそれを有する微生物 |
-
1985
- 1985-09-03 DK DK402785A patent/DK402785D0/da unknown
-
1986
- 1986-09-02 HU HU864441A patent/HU215937B/hu not_active IP Right Cessation
- 1986-09-02 KR KR1019870700381A patent/KR920008738B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1986-09-02 EP EP86905243A patent/EP0236385B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-09-02 WO PCT/DK1986/000098 patent/WO1987001387A1/en active IP Right Grant
- 1986-09-02 DE DE8686905243T patent/DE3682505D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-09-02 IL IL7992686A patent/IL79926A/en not_active IP Right Cessation
- 1986-09-02 CN CN86106774A patent/CN1030718C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1986-09-02 JP JP61505070A patent/JP2643934B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-09-02 AT AT86905243T patent/ATE69466T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-09-02 IE IE234286A patent/IE59078B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-09-02 AU AU63708/86A patent/AU598756B2/en not_active Ceased
- 1986-09-03 CA CA000517419A patent/CA1340329C/en not_active Expired - Fee Related
-
1987
- 1987-02-20 ZA ZA871267A patent/ZA871267B/xx unknown
- 1987-04-28 FI FI871853A patent/FI100252B/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-04-30 SU SU874202612A patent/SU1779263A3/ru active
- 1987-04-30 NO NO871816A patent/NO301132B1/no unknown
- 1987-05-01 DK DK224587A patent/DK224587A/da not_active Application Discontinuation
-
1990
- 1990-08-27 US US07/576,114 patent/US5130245A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-04-23 JP JP8101552A patent/JP2688190B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2688190B2 (ja) | 1997-12-08 |
| IL79926A0 (en) | 1986-12-31 |
| WO1987001387A1 (en) | 1987-03-12 |
| FI871853A0 (fi) | 1987-04-28 |
| DK224587D0 (da) | 1987-05-01 |
| DE3682505D1 (de) | 1991-12-19 |
| HUT46059A (en) | 1988-09-28 |
| AU6370886A (en) | 1987-03-24 |
| KR920008738B1 (ko) | 1992-10-08 |
| CN86106774A (zh) | 1987-07-15 |
| IE862342L (en) | 1987-03-03 |
| JPS63501473A (ja) | 1988-06-09 |
| CA1340329C (en) | 1999-01-26 |
| IL79926A (en) | 1994-10-07 |
| AU598756B2 (en) | 1990-07-05 |
| EP0236385B1 (en) | 1991-11-13 |
| ZA871267B (en) | 1987-10-28 |
| FI871853A (fi) | 1987-04-28 |
| CN1030718C (zh) | 1996-01-17 |
| NO871816L (no) | 1987-07-02 |
| JP2643934B2 (ja) | 1997-08-25 |
| KR880700066A (ko) | 1988-02-15 |
| ATE69466T1 (de) | 1991-11-15 |
| SU1779263A3 (ru) | 1992-11-30 |
| IE59078B1 (en) | 1994-01-12 |
| HU215937B (hu) | 1999-03-29 |
| JPH08317793A (ja) | 1996-12-03 |
| DK402785D0 (da) | 1985-09-03 |
| DK224587A (da) | 1987-05-01 |
| NO301132B1 (no) | 1997-09-15 |
| NO871816D0 (no) | 1987-04-30 |
| EP0236385A1 (en) | 1987-09-16 |
| US5130245A (en) | 1992-07-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI100252B (fi) | Menetelmä superoksididismutaasin valmistamiseksi ja sitä koodittava DN A-fragmentti, ilmentymisvektori ja solu | |
| US5248603A (en) | Superoxide dismutase | |
| EP0593435B1 (en) | A polypeptide | |
| JP5912152B2 (ja) | Ｎ末端ポリシアリル化 | |
| HU216302B (hu) | Eljárás fibrintartalmú anyagok leképezésére és fibrinkötő domén polipeptidek előállítására | |
| JP2008231107A (ja) | 抗血管新生性ポリペプチド及び血管新生を抑制するための方法 | |
| CA1339299C (en) | Human manganese superoxide dismutase dna; its expression; method of recovering human manganese superoxide dismutase, human manganese superoxide dismutase analogs or human manganese superoxide dismutase mutants; uses;compositions; and methods of treatment | |
| EP0414915A1 (en) | New superoxide dismutase | |
| CA1341362C (en) | Human manganese superoxide dismutase cdna, its expression in bacteria and method of recovering enzymatically active human manganese superoxide dismutase | |
| EP0173280B1 (en) | Plasmids containing lambda pl promoter, and engineered restriction site for convenient replacement of ribosomal binding site, hosts containing the plasmids and related methods | |
| EP0460072A1 (en) | Human elastase inhibitor | |
| WO1998024473A1 (fr) | Inhibiteur de fibrose des tissus | |
| NZ219393A (en) | Extracellular superoxide dismutase and its production by genetic engineering | |
| PT84387B (pt) | Processo para a preparacao de superoxido-dismutase e de vectores e linhas de celulas que a segregam | |
| IE911587A1 (en) | Clot imaging agents and use thereof | |
| CA2332571A1 (en) | Novel sugar chain-bonded thrombomodulin-like peptide | |
| JP4588279B2 (ja) | エンド−β−ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: SYMBICOM AKTIEBOLAG |