HU216302B - Eljárás fibrintartalmú anyagok leképezésére és fibrinkötő domén polipeptidek előállítására - Google Patents

Eljárás fibrintartalmú anyagok leképezésére és fibrinkötő domén polipeptidek előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU216302B
HU216302B HU9203516A HU351692A HU216302B HU 216302 B HU216302 B HU 216302B HU 9203516 A HU9203516 A HU 9203516A HU 351692 A HU351692 A HU 351692A HU 216302 B HU216302 B HU 216302B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
polypeptide
fbd
fibrin
binding
amino acid
Prior art date
Application number
HU9203516A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9203516D0 (en
HUT66189A (en
Inventor
Rachel Guy
Jacob Hartman
Avigdor Levanon
Amos Panet
Hadassa Shaked
Tikva Vogel
Moshe Werber
Original Assignee
Bio-Technology General Corp.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bio-Technology General Corp. filed Critical Bio-Technology General Corp.
Publication of HU9203516D0 publication Critical patent/HU9203516D0/hu
Publication of HUT66189A publication Critical patent/HUT66189A/hu
Publication of HU216302B publication Critical patent/HU216302B/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0002—General or multifunctional contrast agents, e.g. chelated agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/082—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins the peptide being a RGD-containing peptide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/088—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins conjugates with carriers being peptides, polyamino acids or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M25/00—Catheters; Hollow probes
    • A61M25/0043—Catheters; Hollow probes characterised by structural features
    • A61M25/0045—Catheters; Hollow probes characterised by structural features multi-layered, e.g. coated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C07K14/3153—Streptokinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2123/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

A találmány értelmében őlyan leképezőszert alkalmaznak, amelyleképezhető markerrel jelölt pőlipeptidből áll, amelynek aminősav-szekvenciája lényegében azőnős a természetes hűmán fibrőnekt n N-terminális fibrinkötő dőménjében található szekvenciával, fibrinmegkötésére alkalmas, móltömege legalább mintegy 6 kD és legfeljebbmintegy 20 kD, és N-terminális aminősav-szekvenciája gln-ala-g n-glnvagy met-gln-ala-gln-gln. A találmány kiterjed a fenti pőlipeptidelőállítására és kinyerésére. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás fibrintartalmú anyagok leképezésére és fibrinkötő dómén polipeptidek előállításra.
A leírásban különböző irodalmi forrásokra hivatkozunk zárójelbe tett arab számok megadásával. Az irodalmak felsorolását a leírás végén, az igénypontok előtt adjuk meg.
Az endotéliás sérülés a feltételezések szerint a trombuszképződés kezdeti lépése, és kiváltó oka lehet például hemodinamikus megerőltetés, fokozott vérkoleszterinszint, magas vérnyomás és immun komplex betegség. Az endotéliás sérülés az ér belhártya vastagodásához, sejtszaporodáshoz, koleszterinfelhalmozódáshoz, és kötőszöveti rostok képződéséhez vezethet. A sérült endotéliás sejtekben és nem endotelializált ér belhártyában megfigyelhető az IgG és a komplementer C3 faktor felhalmozódása. Ateroszklerotikus sérülésnél a sejtpopulációban megfigyelhetők a vérből származó mononukleáris sejtek. A plakk-képződés mechanizmusát még nem ismerjük teljes egészében. Az egyik feltételezett mechanizmus szerint a legkorábbi sérülések, T-sejtek és monocita eredetű makrofágok keverékéből álló zsírszalagok képződnek a szubendotéliumban, amit különböző citokinok kiválása követ. Ez a sima sejteknek az ér belhártyába történő migrálásához és felhalmozódásához vezet.
Az ateroszklerózis és a trombózis diagnosztizálására és kezelésére ismert legtöbb eljárás igényli a szervezetbe történő behatolást, emellett ezek a megoldások költségesek, és az esetek legtöbb százalékában kevésbé eredményesek.
Ismert, hogy a plakkok festékek alkalmazásával kiemelhetők [Spears J. és munkatársai: J. Clin. Invest. 71, 395-399 (1983)]. Ezek a festékek a plakk felületét fluoreszcens vegyülettel jelölik meg. A plakk szétroncsolását hematoporfirin-származékok fotoaktiválásával végzik, amihez intraluminális lézer transzmissziós optikai szálat használnak [Abela G. és munkatársai: Am. J. Cardiol. 50, 1199-1205 (1982)]. Ismert továbbá a tetraciklin festékként történő alkalmazása [MurphyChutorian D. és munkatársai: Am. J. Cardiol. 55, 1293-1297 (1985)].
A fenti festékeket aszerint szelektálták, hogy milyen mértékben kötődnek az ateroszklerotikus plakk komponenseihez. A festék elvben abszorbeálja a lézerfényt, és ezáltal a megfestett felületre koncentrálja. Az egészséges szöveteknél megfigyelhető bizonyos mértékű elszíneződés hatására az alkalmazott festék károsítja a körülvevő szöveteket. Mivel a lézerfény hullámhosszúsága a festék abszorpciós hullámhosszúságára korlátozódik, a megfelelően szabályozott kezeléshez a lézerfény optimális abszorpcióját biztosító kromofórokat kell használni.
A koronáriás vérrög, a pulmonáris embólia, a mélyvénás trombózis és az ateroszklerotikus sérülés leképezése és detektálása klinikai fontossággal bír, különösen az újonnan kifejlesztett trombolitikus szerek vonatkozásában. Több kísérlet történt a vérrög nem behatoló jellegű detektálására radiofarmakológiai szerek alkalmazásával, de egyik se biztosított széles körű klinikai eredményeket az egyes szerekhez kapcsolódó különböző hátrányok miatt.
Az intravaszkuláris ateroszklerotikus sérülés és vérrög korai kimutatására alkalmas radiofarmakológiai szerekkel kapcsolatos alapvető jellemzők az alábbiak szerint foglalhatók össze:
i) nagy affinitás a vérrög komponenseivel szemben;
ii) viszonylag gyors farmakokinetikai vérkiürülési ráta (annak érdekében, hogy nagy legyen az arány a trombusz (kötött) és a vér (kötetlen) radiojelölésű nyomjelzője között;
ifi) biztonság: nem toxikus és nem immunogén, valamint iv) egyszerű előállítás és alkalmazás.
A vérrög leképezésére alkalmas ismert szerek és hátrányaik a következők:
a) 11'In izotóppal jelölt autológ vérlemezke, az eljárás fáradságos, időigényes és a vérből történő kiürülési idő viszonylag hosszú, mintegy 2 nap (2);
b) 131I fibrinogén, a vizsgálat a befecskendezett radiojelölésű fibrinogénnek a vérröggel szemben mutatott (alacsony) affinitásán alapszik, de hosszú felezési ideje miatt megfelelő gyors leképezési teszthez nem alkalmazható, emellett, idősebb vérrögökbe vagy heparin jelenlétében nem épül be (3,36);
c) humán fibrin El fragmense, bár a fibrinogénnél előnyösebben alkalmazható, a széles körű klinikai alkalmazáshoz szükséges mennyiségben nehezen állítható elő (4);
d) egér antifibrin monoklonális antitest, bár ezek az antitestek specifikusak és a vérrög vonatkozásában megfelelő affinitást mutatnak, a vérben mutatott felezési idejük viszonylag hosszú, és humán betegekre potenciálisan immunogének (5, 33, 34);
e) aktivált vérlemezkére specifikus egér monoklonális antitestek, hátrányuk ugyanaz (6, 7);
f) jelölt fibronektin (1), a fibronektin a vérrögben előforduló különböző anyagokkal szemben megfelelő affinitást mutat, felezési ideje a vérben viszonylag hosszú, és a radioaktivitás lebomlása a vérrögben lassú.
Szükség van tehát olyan trombuszspecifikus radiofarmakológiai anyag kidolgozására, amely lehetővé teszi a vérrög gyors leképezését.
A 4343 734 számú USA-beli szabadalmi leírás specifikus gamma-karboxi-glutaminsav (GLA) antitesteket ismertet, amelyek fluoreszceinnel jelölve felhasználhatók a szövetek immunofluoreszcenciás megfestésére, és így GLA jelenlétének kimutatására. A specifikus GLA antitestek a kalciumot felhalmozó ateroszklerotikus plakkban előforduló GLA-hoz kötődnek. Az irodalom szerint GLA nem mutatható ki a kalciummentes plakkban, de megtalálható a szívbillentyűben és aortában, a keringő fehérjékben, így a protrombinban, a VII, IX és X alvadásfaktorokban, a C fehérjében és az S fehérjében. Az ismertetett GLA-megkötő antitestek azonban nemcsak az ateroszklerotikus plakkhoz kötődnek, ezért szelektivitásuk nem kielégítő.
HU 216 302 Β
A fibronektin egy glikofehérje, amely két azonos, egyenként mintegy 220 000 móltömegű alegységből áll. A fibronektin két fő formában termelődik, és választódik ki a humán sejtek tenyészetében és in vivő (8). A sejthez társult fibronektin viszonylag oldhatatlan és részt vesz a sejtadhézióban, a sebgyógyulásban, a sejtek differenciálódásában és a fagocitózisban. A plazmafibronektin, amely elsősorban a májban képződik, egy oldható szérumfehérje, amelynek biológiai tulajdonságai hasonlóak a sejt fibronektin tulajdonságaihoz.
A fibronektin egy többfunkciós, elemekből felépült fehérje, mivel a korlátozott proteolitikus hasítás során különböző hatással rendelkező polipeptidek keletkeznek. A fibronektinmolekula fő funkcionális doménjei részleges proteolitikus hasítással nyerhetők és azonosíthatók, ide tartoznak a heparin, DNS, fibrin, kollagén vagy zselatin és a sejtkötő domének (8,13).
A 207751 számú európai közrebocsátási irat a fibronektin teljes cDNS-szekvenciáját, valamint egy olyan fúziós fehérje kifejezését ismerteti, amely a fíbronektin kollagénkötő doménjének részét és Escherichia coli fehéije β-galaktozidázt tartalmaz. Hasonló fúziós fehérjéket ismert Owens és Baralle (14). Obara és munkatársai a humán fibronektin sejtkötő doménjének egy részének kifejezését ismertetik Escherichia coli βgalaktozidázzal fuzionálva (15). Obara és munkatársai leírják továbbá a β-galaktozidázhoz fuzionált sejtkötő dómén szakaszainak kifejezését, amit előzetesen a sejtkötő dómén egyes szakaszainak helyspecifikus kiiktatásával módosítottak (16). A humán fibronektin fibrinkötő doménjének karboxi-terminális részét egér L-sejtekben fejezték ki a humán C fehérje inhibitor szignál szekvenciájával képzett fúziós fehérje formájában (17).
Az ismert irodalmak nem említik a fibronektin fibrinkötő doménje N-terminális részének kifejezését, illetve az összes ismertetett rekombináns fehéije fúziós fehéije.
A találmány olyan polipeptid előállítására vonatkozik, amelynek aminosav-szekvenciája lényegében azonos a fibronektin fibrinkötő doménje N-terminális részén található szekvenciával. A polipeptidek SDS gélen redukáló körülmények között összehasonlító markerekkel szemben meghatározott móltömege mintegy 32 kD, 20 kD, 18,5 kD és 12 kD, és a következő jellemzőkkel rendelkeznek, amelynek alapján gyógyszerhatóanyagként alkalmazhatók:
i) humán fehérjében megtalálható aminosav-szekvenciával rendelkeznek, és ezért feltételezhető, hogy nem immunogének;
ii) fibrinspecifikusak, mivel kovalens keresztkötést alakítanak ki a transz-glutaminázzal katalizált reakcióban a keletkező és a kialakult vérröggel;
iii) az extracelluláris mátrixhoz kötődnek, amely tulajdonság felhasználható az ateroszklerotikus plakk detektálására;
iv) viszonylag rövid felezési időt mutatnak a vérben;
v) heparin jelenlétében beépülnek a rögbe; és vi) rekombináns technikával állíthatók elő, ezért nagy mennyiségben termelhetők.
A találmány szerinti megoldás tehát egy olcsó és megfelelő módszert javasol fibrintartalmú anyagok, például vérrög és ateroszklerotikus plakk in vitro és in vivő leképezésére. Emellett, a találmány kiterjed az olyan plazmidok előállítására, amelyek kifejezik a természetes humán fibronektin fibrinkötő doménjében jelen lévő aminosav-szekvenciával lényegében azonos, és fibrinhez kötődő polipeptideket, amelyek megfelelő jelölést hordoznak, és fibrintartalmú anyagok leképezésére használhatók.
A találmány lényegének ismertetése
A találmány tárgya eljárás fibrintartalmú anyagok, így trombus vagy ateroszklerotikus plakk leképezésére, amelynek során a leképezendő fibrintartalmú anyagot leképezhető markerrel jelölt polipeptiddel érintkeztetjük, ahol a polipeptid aminosav-szekvenciája lényegében azonos a természetes humán fibronektin N-terminális fibrinkötő doménjében található szekvenciával, fibrin megkötésére alkalmas, móltömege legalább mintegy 6 kD és legfeljebb mintegy 20 kD, és N-terminális aminosavszekvenciája gln-ala-gln-gln vagy met-gln-ala-gln-gln.
A találmány tárgya továbbá eljárás a fent alkalmazott polipeptid előállítására oly módon, hogy a polipeptidet kódoló DNS-t és megfelelő szabályozó elemeket kódoló DNS-t tartalmazó plazmidot, ahol az utóbbi DNS-nek a polipeptid kódoló DNS-hez viszonyított elhelyezkedése biztosítja a polipeptid kifejezését, tartalmazó sejtet kezelünk, a DNS-sel irányítjuk a polipeptid kifejezését, a sejttel polipeptidet fejezünk ki, és az így kifejezett polipeptidet a sejtből feltárjuk.
A találmány tárgya továbbá eljárás az ilyen polipeptidek feltárására, hajtogatására és oxidálására, valamint felhasználásukra.
Az ábrák rövid ismertetése
Az ábrákon az egyes restrikciós enzimhelyek szomszédságában zárójelben megadott számok a humán fibronektin cDNS nukleotidszekvenciája mentén megadott azonos számozott pozícióknak felelnek meg, mint ez a 2. ábrán látható (lásd továbbá a 207751 számú európai közrebocsátási irat 3. ábráját).
A megadott ábrák a polipeptidek kifejezésére alkalmas plazmidok előállítását ismertetik, ahol a polipeptidek aminosav-szekvenciája lényegében azonos a fibronektin aminoterminális fibrinkötő doménjében (FBD) jelen lévő szekvenciával. Az FBD az érett fibronektin 1. számú aminosavjánál kezdődik, amely egy glutamin és megfelel a 2A. ábrán szereplő negyedik aminosavnak (Q), vagyis az FBD szekvencia N-terminális része Q-A-Q-Q (glutamin-alanin-glutamin-glutamin); a 2A. ábra szerinti cDNS-szekvencia megfelelő első nukleotidja tehát a 14. számú, amit nyíl jelöl. A leírásban és az ábrákon szereplő valamennyi rekombináns FBD polipeptidet ettől az első glutamintól, mint
1. számú aminosavtól kiindulva számozunk, és az összes megfelelő cDNS-szekvenciát a 2. ábrán megadott módon számozzuk.
Néhány ábra olyan plazmid előállítását mutatja, amely C-terminális részén a fibronektin sejtkötő doménjének (CBD) egy részéhez kapcsolódó FBD polipeptidet fejez ki. A CBD-nek cDNS-szekvencia, amit klónoztunk
HU 216 302 Β és kifejeztünk, nem tartalmazza azt a 270 bp extradomén (ED) szegmenst, amely a Baralle-térkép 4811 -5080 nukleotidja között helyezkedik el (lásd a 2. ábrát). Ezért az a cDNS-szekvencia, amely a Baralle-térképen a 3317-5566 nukleotid között helyezkedik el, csak 1980 nukleotidot tartalmaz, mivel hiányzik az ED szegmens 270 nukleotidja, nevezetesen a 4811-5080 nukleotid közötti szakasz; amely szakasz az irodalomban ED-A szakaszként is ismert. Mivel az 5081 nukleotidot G-ről A-ra cseréljük, az 1690. aminosav alaninról treoninra cserélődik. Hasonlóképpen, az ilyen DNS-fragmens által kifejezett polipeptid a Baralle-térkép szerinti 1102-1851 közötti aminosavnak felel meg, de nem tartalmazza az ED szakasz által kódolt 90 aminosavat, nevezetesen az 1600-1689 aminosavakat, és ezért csak 660 aminosavat tartalmaz. Ez igaz valamennyi leírt CBD polipeptidre, amely tartalmazza az ED szakaszt. (Az irodalomban ED-B szakasznak nevezett részlet hiányzik a Baralle-szekvenciából és a találmány szerinti DNS-ből is.)
A 31 kD, 20 kD, 18,5 kD, 12 kD és 33 kD méretben kifejezett polipeptidek definíciója egy műveleti definíció, amely az SDS poliakrilamid gélen redukáló körülmények között ismert móltömegű markerhez viszonyítva meghatározott közelítő móltömegen alapszik.
Az 1. ábra a különböző fibronektin doméneket és az előállított rekombináns polipeptideket mutatja.
A 2. ábra a humán fibronektin cDNS nukleotidszekvenciáját mutatja.
A 3. ábra a hét pár, kémiailag szintetizált oligomert mutatja. A szintetikus oligomerek a humán fibronektin (FN) első 153 N-terminális aminosavját kódolják. Az ábra a hét pár szintetikus oligomer szekvenciáját adja meg.
A 4. ábra azt a folyamatot mutatja, amelynek során a humán FN N-terminális doménjének 1-153 aminosavját kódoló DNS-ífagmenst a 3. ábra szerinti hét pár, kémiailag szintetizált oligomerhez kapcsoljuk. Ehhez a 3/4, 5/6, 7/8 és 9/10 oligomer párokat egyenként külön csőben anelláljuk, és 5’ végén T4 polinukleotid kináz enzimmel foszforiláljuk.
A második lépésben a 3/4 és 5/6 párokat egymáshoz Egáljuk T4 DNS ligáz alkalmazásával. Hasonló módon Egáljuk a 7/8 és 9/10 párokat. Minden ligáló lépés után a ligáló elegy alikvot részét analizáljuk, és gélen meghatározzuk a kapott fragmens méretét és a Egálás hatékonyságát.
A harmadik lépésben a két fent említett ligáló elegyet összekeverjük, és a 6. párt, vagyis az előzetesen külön anellált és foszforilezett 11/12 oligomert hozzáadjuk az elegyhez. A fenti ligáló elegyben 326 bp DNS-fragmenst kapunk, ezt az agaróz gélről izoláljuk, és tisztítjuk.
A tisztított szintetikus 326 fragmenst hozzáadjuk két további szintetikus linker párhoz: 1 pár =1/2 oligomer; 7 pár =13/14 oligomer. Az 1 párban csak a 2 oligomert foszforiláljuk az 5’ végén, míg a 7 párban csak a 13 oligomert foszforiláljuk az 5’ végén.
T4 DNS ligázzal végzett Egálás után az elegyet további tisztítás nélkül EcoRI és BamHI endonukleázzal emésztett pBR322 vektor DNS-hez adjuk.
A kapott, pFN 932-18 jelű plazmid a pBR322 vektorban tartalmazza a humán FN N-terminális 153 aminosavját kódoló teljes szintetikus EcoRI (5’ vég) BamHI (3’ vég) restrikciós fragmenst.
Az 5. ábra az FN N-terminális 153 aminosav-szekvenciájának kifejezését mutatja.
A pFN 932-18 plazmidot Ndel és BamHI endonukleázzal emésztjük. Az FN első 153 aminosavját és a további N-terminális metionint kódoló Ndel-BamHI DNS-fragmenst izoláljuk, és a pTV301 plazmid Ndel és BglII endonukleázzal emésztett nagy fragmensével Egáljuk. (A pTV301 plazmid humán növekedési hormont, hGH-t fejez ki a lambda PL promoter és cll RBS szabályozása alatt.)
Az eljárás során a pFN 949-2 plazmidot kapjuk.
A 6. ábra a TAA terminációs kodonnak az FN Nterminális doménjének 3’ végébe (262 aminosav) történő beiktatását mutatja.
A TAA terminációs kodont és egy BglII helyet tartalmazó szintetikus oligonukleotidot, amelynek szekvenciája :
CTGTTTAAGCA
GACAAATTCGTCTAG a p931-5 cDNS plazmidból (lásd a 6. ábrát) EcoRI és PvuII emésztéssel izolált EcoRI-PvuII FN fragmens 3’ végéhez (PvuII hely) Egáljuk. A ligálást EcoRI és BamHI enzimmel emésztett pBR322 DNS vektor plazmid (nagy fragmens) jelenlétében végezzük. Az eljárás folyamán a pFN935-12 plazmidot kapjuk.
A 7. ábra a fibronektin (FN) és az r31 kD FBD patkányban felvett farmakokinetikus görbéjét adja meg.
125I-FN-t (0,1 mg/kg; 5xl06 cpm) vagy 125Ir31 FBD-t (0,1 mg/kg; őxlO6 cpm) injektálunk intravénásán, és a megadott időpontokban vérmintát veszünk. A vérminta oldhatatlan radioaktivitását triklórecetsavas kicsapással határozzuk meg; a zéró időpontban megadott 100%-os érték 40000 cpm/ml értéknek felel meg az FN vonatkozásában és 46 000 cpm/ml értéknek felel meg az FBD vonatkozásában.
A 8. ábra S. aureus katéterhez történő kötődését mutatja.
3,0x106 PFU/ml 125I-S. aureus-t (1 CPM/3 PFU) kötünk FN-nel bevont „Unó” műanyag hörgőkatéterhez (reakciónként 3 cm, két parallel) az ismertetett módon. A kompetitív reakciók esetén a baktériumot és az adagolt fehérjét szobahőmérsékleten 30 percen keresztül előinkubáljuk, majd a további inkubáláshoz a katéterhez adjuk.
A kompetitív reakciókban a következő polipeptideket használjuk: P-31 (p31 kD), r-20 (rekombináns 20 kD FBD polipeptid fragmens) és r-31 (oxidált és hajtogatott r31 kD). Néhány reakciót (lásd az ábrán) 5 pmol/l heparin (sertésbél nyálkahártya; móltömeg 10000, Sigma) jelenlétében mérünk.
A kontrollreakcióban kompetitor (8,8% bevitt baktérium) távollétében mért kötést 100%-ra normalizáljuk.
A 9. ábrán a fibronektin domének rekombináns polipeptidjeit hasonlítjuk a teljes hosszúságú fibronektinhez.
Az ábra a különböző rekombináns polipeptideket kódoló cDN kiónokat sorakoztatja fel egymáshoz, és a teljes hosszúságú fibronektin cDNS-szekvenciához, va4
HU 216 302 Β lamint a humán fibronektinmolekulában található különböző domének sematikus ábrázolásához viszonyítva.
A 10. ábra az rl2 kD FBD polipeptidet kifejező pFN 196-2 plazmid előállítását mutatja.
A pFN 975-25 plazmid (10. ábra) BspMI és HindlII enzimekkel végzett hasításával kapott nagy BspMIHindlII fragmenst T4 DNS ligázzal A szintetikus linkerpárhoz (15. ábra) Egáljuk. A kapott pFN 1962 plazmidot Escherichia coli A1645 törzsbe, majd Escherichia coli A4255 törzsbe transzformáljuk. A pFN
196- 2 plazmid a fíbronektín cDNS 5’ terminális szekvenciáját tartalmazza a 14-340 nukleotid között, vagyis a fíbronektín FBD első 109 aminosavját kódolja, amit egy argininmaradék zár le. A végső polipeptidben egy további N-terminális metionin található. A pFN 1962 plazmid lambda-promoter és béta-laktamáz riboszomális kötőhely szabályozása alatt jól kifejezi az rl2 kD FBD polipeptidet. A plazmidot az ATCC 68 328 szám alatt deponáltuk.
A 11. ábra a pFN 197-10 plazmid előállítását mutatja, amely módosított 12 kD FBD polipeptidet (12 kD’) fejez ki.
A pFN 975-25 plazmidot a 10. ábrán ismertetett módon kezeljük azzal a különbséggel, hogy B szintetikus linkért (15. ábra) alkalmazunk. A ligálás során pFN
197- 10 plazmidot kapunk, amely az FN-ből származó FBD N-terminális szekvenciáját kódolja, azonban a 340. nukleotid után bevitt módosítás hatására, amely egy Ndel helyet (CATATG) hoz létre a stop kodon előtt, olyan polipeptidet kódol, amely 111 aminosavat tartalmaz, amelyek közül az első 109 aminosav megfelel az rl2 kD polipeptid szekvenciájának, amit két további aminosav-maradék, pontosabban hisztidin és metionin követ. A végső polipeptidben egy további Nterminális metioninmaradék található. A pFN 19710 plazmidot Escherichia coli A1645 törzsbe, majd Escherichia coli A4255 törzsbe transzformáljuk. A plazmid a lambda-promoter és a béta-laktamáz riboszomális kötőhely szabályozása alatt jó hatásfokkal fejezi ki a módosított rl2 kD (12 kD’) FBD polipeptidet.
A 12. ábra a pFN 202-5 plazmid előállítását mutatja, amely a fíbronektín r33 kD sejtkötő doménjével (CBD) fuzionált rl2 kD’ FBD-t fejezi ki.
A pFN 197-10 plazmid (11. ábra) Ndel és HindlII enzimmel végzett emésztésével kapott nagyméretű fragmenst T4 DNS ligáz segítségével a pFN 1372 plazmid Ndel-HindlII CBD ffagmenséhez (sejtkötő dómén fragmens) Egáljuk. A pFN 137-2 plazmidot ATCC 67 910 számon deponáltuk, és a 345 952 számú USA-beli szabadalmi bejelentés ismerteti. Az r33 kD CBD szekvencia a fíbronektín 1329-1722 számú aminosavjait (2. ábra) tartalmazza az ED-A szakasz által kódolt 1600-1689 közötti 90 aminosav kivételével (lásd az ábrák rövid ismertetésének bevezetését).
A kapott pFN 202-5 plazmidot Escherichia coli A1645 törzsbe, majd Escherichia coli A4255 törzsbe transzformáljuk. A pFN 202-5 plazmid a pFN 197-10 plazmid által kódolt cDNS-szekvencia 111 aminosavját tartalmazza, amit szerin kodonnal induló (az r33 kD
CBD első aminosavja) r33 kD CBD-re vonatkozó cDNS-szekvencia követ. Ez a plazmid jól kifejezi azt a mintegy 45 kD polipeptidet, amely az rl2 kD fibrinkötő domént és a fíbronektín 33 kD sejtkötő doménjét tartalmazza. Ez a fuzionált polipeptid a lambda-promoter és a béta-laktamáz riboszomális kötőhely szabályozása alatt fejeződik ki.
A 13. ábra a pFN 195-4 plazmid előállítását mutatja, amely a DGRGDS szekvenciával fuzionált r31 kD FBD-t fejezi ki.
A pFN 975-25 plazmid PvuII és HindlII enzimekkel végzett emésztésével kapott nagy fragmenst izoláljuk, és T4 DNS ligázzal C szintetikus linker párral (15. ábra) Egáljuk. A kapott pFN 195-4 plazmidot Escherichia coli A1645 törzsbe, majd Escherichia coli A4255 törzsbe transzformáljuk. A pFN 195-4 plazmid a teljes hosszúságú FBD cDNS-szekvenciát tartalmazza a 14793 nukleotid között (260 aminosavat kódol), amit asp-gly-arg-gly-asp-ser szekvenciát kódoló szakasz követ, vagyis a kódolt polipeptid összesen 260 aminosavat tartalmaz, amit a DGRGDS szekvencia követ. A végső polipeptidben egy további N-terminális metioninmaradék található. A pFN 195-4 plazmid jól kifejezi az asp-gly-arg-gly-asp-ser (DGRGDS) szekvenciával fuzionált r31 kD fibrinkötő domént a lambda-promoter és a béta-laktamáz riboszomális kötőhely szabályozása alatt.
A 14. ábra a pFN 194-2 plazmid előállítását mutatja, amely fuzionált 31 kD FBD-33 kD CBD polipeptidet fejez ki.
A pFN 975-25 plazmid PvuII és HindlII enzimmel végzett emésztésével kapott nagy PvuII-HindlII fragmenst izoláljuk, és T4 DNS ligázzal D linkerpárhoz (15. ábra) Egáljuk, majd a pFN 137-2 plazmid (ATCC 67 910) Ndel és HindlII enzimmel végzett emésztésével kapott sejtkötő dómén (CBD) ffagmenshez Egáljuk, lásd a 12. ábrán a CBD dómén definícióját. A kapott pFN 194-2 plazmidot Escherichia coli A1645 törzsbe, majd Escherichia coli A4255 törzsbe transzformáljuk. A pFN 194-2 plazmid kis hatásfokkal fejezi ki a fuzionált r31 kD FBD-r33 kD CBD polipeptidet, amelynek móltömege mintegy 64 kD, a lambda-PL promoter és a béta-laktamáz riboszomális kötőhely szabályozása alatt. A pFN 194-2 plazmid által kódolt polipeptid a fibronektin első 265 aminosavját kódoló DNS-t tartalmazza egy metionin kodonnal fuzionálva, amit a fibronektinből származó CBD cDNS-szekvenciája követ, amely utóbbi a CBD 1. helyzetében szerin aminosavra vonatkozó kodonnal kezdődik.
Szakember számára nyilvánvaló, hogy a pFN 1942 plazmid által kifejezett polipeptid vonatkozásában nagy hatásfokú kifejezés is elérhető. A nagy hatásfokú kifejezésre példaként említhető a 25. ábrán ismertetett pFN 205-5 plazmid.
A 15. ábra a plazmidok előállításához alkalmazott oligonukleotid linkereket mutatja.
Négy pár kémiailag szintetizált oligomert (A, B, C és D) állítunk elő, és használunk a 10., 11., 13. és 14. ábrán ismertetett plazmid előállításához.
A 16. ábra a rozsdamentes acélkarikával indukált vénás vérrög r31 kD FBD felvételét mutatja.
HU 216 302 Β
A vízszintes vonalak és a függőleges oszlopok a specifikus radioaktivitás átlagértékéti szórását (N=10) jelölik az izolált vérrög, a vérrögöt hordozó vénás szegmens (in situ vérrög) vagy perifériás vérminta vonatkozásában a l25I-31 kD FBD adagolását követő 24 óra elteltével. A részleteket lásd a 7. példa A pontjában.
A 17. ábra ajelölt rl2 kD, r20 kD és r31 kD FBD polipeptidek összehasonlítását mutatja patkány vénás vérrög modellben.
A vízszintes vonalak és a függőleges oszlopok a specifikus radioaktivitás átlagértékéti szórását (N=5) jelölik az izolált vérrög (T) vagy vér (V) vonatkozásában a megadott l25I jelölésű rekombináns polipeptidek adagolását követő 24 óra elteltével. A részleteket lásd a 7. példa B pontjában.
A 18. ábra a l25l jelölésű r31 kD FBD patkányban mért metabolikus stabilitását mutatja.
A patkányoknak intravénásán t25I-r31 kD FBD-t (5xl06 cpm/állat) adunk a 7. ábra szerinti kísérlettel azonos módon. A megadott időpontokban vérmintát veszünk, nátrium-citrát tartalmú csövekbe (végső nátrium-citrát koncentráció 0,38%) töltjük, és a kapott vér alikvot részeit az alábbiak szerint dolgozzuk fel:
a) 20% TCA-val kezeljük, és az oldhatatlan TCA-t (TCA kicsapás után) méljük, vagy
b) előzetesen kialakított röggel inkubáljuk (ehhez a kontroll patkánytól vett 20 μΐ teljes vért használunk);
a 125I-31 kD FBD-nek az előre kialakított röghöz történő kötődését a II kétlépéses reakció szerint (6. példa) mérjük. A gamma-számlálóban mért radioaktivitást és az egyes minták aktivitását a reakcióelegyben lévő összcpm százalékában fejezzük ki. (A TCA kicsapást általában úgy végezzük, hogy a minta alikvot részét szűrőre helyezzük, amelyen számoljuk az összcpmértéket, a szűrőt háromszor 20% TCA-val, majd a TCA extrahálásához kétszer 20% etanollal mossuk, és a szűrőn ismét számoljuk a TCA oldhatatlan részeit, amelynek alapján számoljuk a TCA oldhatatlan részeinek százalékát.)
A 19. ábra a fibrinkötő dómén polipeptidek fibrinröghöz történő kötődését mutatja.
A kísérletet lényegében a II kétlépéses reakcióban (6. példa) leírt módon végezzük. A fibrinkötő dómén polipeptid 0,15 pmol/l 125I származékát 37 °C hőmérsékleten 20 μΐ citrátozott teljes vérből előre kialakított fibrinröggel inkubáljuk. A kötést 5 mmol/1 kalciumklorid és 0,02 egység/ml transz-glutamináz jelenlétében mérjük. A reakciót 45 perc inkubálás után centriíügálással lezárjuk, a pelletet háromszor PBS-sel mossuk, majd a radioaktivitást gamma-számlálóban mérjük.
A vizsgált minták a következők:
1. plazma 31 kD FBD (p31 kD)
2. rl2 kD
3. r20 kD
4. r31 kD (A tétel)
5. r31 kD (B tétel)
6. r31 kD (C tétel).
A 20. ábra a I25I-rl2 kD kötődését hasonlítja össze friss és fagyasztott fibrinrögön.
A kísérletet lényegében a II kétlépéses reakcióban (6. példa) leírt módon végezzük. A fibrinrögöt 20 μΐ citrátozott teljes humán vérből állítjuk elő, és -70 °C hőmérsékleten 7 napon keresztül fagyasztjuk (fagyasztott rög), vagy előállítás után közvetlenül felhasználjuk (friss rög).
A fibrinrögöket 0,15 pmol/l 125I-rl2 kD molekulával inkubáljuk 0,02 egység/ml tengerimalac máj transzglutamináz (Sigma) jelenlétében vagy távollétében. A fibrinröghöz történő kötődést a 6. példában leírt módon mérjük.
A 21. ábra az r20 kD polipeptid hajtogatását és tisztítását mutatja a szuperóz 12 oszlopon (FPLC) felvett elúciós profilok alapján.
Az r20 kD polipeptid hajtogatása és tisztítása közben különböző stádiumban 200 μΐ alikvot részt szuperóz 12 oszlopra (FPLC) viszünk. Az oszlopot kiegyensúlyozzuk, és 150 mmol/1 nátrium-klorid/20 mmol/1 TriszHC1 (pH=7,8) elegyével eluáljuk 0,8 ml/perc áramlási sebességgel. Az alsó küszöbértéket FPLC Controller LCC-500 segítségével határozzuk meg.
A: r20 kD polipeptid pellet 6 mol/1 guanidinhidrokloriddal szolubilizálva és 50 mmol/1 βmerkapto-etanollal redukálva;
B: hajtogatott és levegőn oxidált r20 kD polipeptid; C: Q-szefarózon kötött polipeptid, vagyis a tisztított r20 kD polipeptidről elválasztott anyag;
D: szefaróz oszlopon átfolyt anyag;
E : heparin-szefaróz oszlopon átfolyt anyag, vagyis a tisztított r20 kD polipeptidtől elválasztott anyag;
F: tisztított 20 kD polipeptid (retenciós idő 18,16 perc), a heparin-szafaróz oszlopról 0,5 mol/1 nátrium-kloriddal eluálva.
Megfigyelhető, hogy a 18,16 perc retenciós időnél nem található csúcs az A profilnál, amely a redukált anyagot mutatja, a C és E profilnál, amelyek hibásan hajtogatott 20 kD polipeptidet mutatnak.
A 22. ábra az rl2 kD polipeptid hajtogatását és tisztítását mutatja a szuperóz 12 oszlopon (Waters HPLC) felvett elúciós profilok alapján.
Az rl2 kD polipeptid hajtogatása és tisztítása során 25-100 μΐ alikvot részeket szuperóz 12 oszlopra (Waters HPLC) viszünk. Az oszlopot kiegyensúlyozzuk, és 150 mmol/1 nátrium-klorid/20 mmol/1 Trisz HC1 (pH=7,8) eleggyel eluáljuk 0,8 ml/perc áramlási sebesség mellett.
A: rl2 kD polipeptid pellet 6 mol/1 guanidin-hidrokloridban szolubilizálva és 50 mmol/1 β-merkapto-etanollal redukálva;
B: hajtogatott és levegőn oxidált rl2 kD polipeptid; C: Q-szefarózon kötött polipeptid, vagyis a tisztított rl2 kD polipeptidtől elválasztott anyag;
D: a Q- és a heparin-szefaróz oszlopon átfolyt anyag (az oszlopokat sorba kapcsoljuk, és a Q-szefaróz oszlopon átfolyt anyagot automatikusan a heparin-szefaróz oszlopra vezetjük), vagyis a tisztított rl2 kD polipeptidtől elválasztott anyag;
E: tisztított rl2 kD polipeptid (retenciós idő 18,83 perc), heparin-szefaróz oszlopról 0,5 mol/1 nátrium-kloriddal eluálva.
HU 216 302 Β
Látható, hogy nincs csúcs a 18,83 perc retenciós időnél az A profilnál, ahol az anyag redukált formában van, valamint a C és D profilnál, amely hibásan hajtogatott rl2 kD polipeptidet mutat.
A 23. ábra a pFN 208-13 plazmid előállítását mutatja.
A pFN 975-25 plazmid (ATCC 67 832) két alikvot részét egymástól elkülönítve XmnI és Xbal-StyI enzimekkel emésztjük. Az egyes emésztések során kapott nagy fragmenseket izoláljuk, és 8. ábra szerinti szintetikus olígomerrel elkeveqük. Az elegyet 2,5 percen keresztül forraljuk, majd 60 perc alatt fokozatosan 30 °C hőmérsékletre, további 60 perc alatt 4 °C hőmérsékletre, végül 30 perc alatt 0 °C hőmérsékletre hűtjük. Az ily módon újra anellált DNS-t Klenow-fragmenssel feltöltjük, és T4 DNS ligázzal ligáljuk. A DNS-t E. coli A1645 törzsbe transzformáljuk, és a transzformánsokat az oligomer vonatkozásában pozitív kiónokra vizsgáljuk. A pozitív kiónból kinyerhető plazmid a pFN 20813 plazmid, amit E. coli A4255 törzsben az ATCC 68456 számon deponáltunk. Ez a plazmid egy 18,5 kD FBD polipeptidet fejez ki, amelynek aminoterminális vége a lambda-PL promoter és a béta-laktamáz riboszomális kötőhely szabályozása alá esik.
A 24. ábra a pFN 208-13 plazmid előállításához alkalmazott szintetikus linkért mutatja.
A 25. ábra a pFN 205-5 plazmid előállítását mutatja.
A pFN 194-2 plazmidot (14. ábra) Xbal és HindHI enzimmel hasítjuk, és izoláljuk a kis ffagmenst. A pFN 962-3 plazmidot (WO 90/07577 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés 45-49. ábrája) Ndel és HindHI enzimekkel hasítjuk, és izoláljuk a kis ffagmenst. Ezt a két fragmenst a pMLK-100 plazmid (ATCC 68605) Ndel és HindHI enzimmel végzett emésztésével kapott izolált nagy fragmenssel ligáljuk. A kapott plazmid a 205-5 jelet kapja, amely nagy hatásfokkal kifejezi a 31 kD FBD-t, és a 33 kD CBD-t tartalmazó 64 kD polipeptidet, a lambda-PL promoter és a CII riboszomális kötőhely szabályozása alatt, amely trp transzkripciós terminátort (tér) tartalmaz közvetlenül a szerkezeti gén alatt. A polipeptidet lényegében a 31 kD FBD polipeptidnél leírt módon tisztítjuk és hajtogatjuk.
A 26. ábra a pFN 201-3 plazmid előállítását mutatja.
A pFN 949-2 plazmidot (ATCC 67831) HindHI és StyI enzimmel emésztjük, és izoláljuk a nagy fragmenst. A pFN 196-2 plazmidot (ATCC 68328) HindHI és StyI enzimmel emésztjük, és izoláljuk a kis ffagmenst. Ezt az előbbi nagy ffagmenssel ligáljuk. A kapott pFN 201-3 plazmid 12 kD FBD polipeptidet fejez ki a lambda-PL promoter és CII riboszomális kötőhely szabályozása alatt.
A 27. ábra a pFN 203-2 plazmid előállítását mutatja.
A pMLK-100 plazmidot (E. coli 4300 törzsben deponálva az ATCC 68605 számon) Ndel és HindHI enzimmel emésztjük, és izoláljuk a nagy fragmenst. A pFN 201-3 plazmidot Ndel és HindHI enzimmel emésztjük, és izoláljuk a kis fragmenst. Ezt az előbbi nagy fragmenssel ligáljuk. A kapott pFN 203-2 plazmid 12 kD FBD polipeptidet fejez ki a lambda-PL promoter és CII riboszomális kötőhely szabályozás alatt, amely trp transzkripciós terminátorszekvenciát (tér) tartalmaz. A plazmidot E. coli A4255 törzsben ATCC 68606 számon deponáltuk. A pFN 203-2 plazmid pFN 203-23 néven is ismert.
A 28. ábra az FBD polipeptid fragmensek vaszkuláris komponenshez történő kötődését mutatja.
Az ábra szerint a 12 kD polipeptid kismértékben kötődik a vaszkuláris komponensekhez, így az endotéliás sejtekhez, az extracellulárís mátrixhoz, és immobilizált fíbronektinhez, a 9. példa szerinti 31 kD polipeptiddel összehasonlítva. A 12 kD kötődése erősebb, de a 31 kD polipeptidhez hasonlítva még mindig viszonylag alacsony az exogén transz-glutamináz hozzáadása esetén is.
A 29. ábra különböző FBD polipeptid ffagmenseknek az S. aureus endotéliás sejtekhez (EC) történő kötődésére kifejtett hatását mutatja.
A jelölt S. aureus előállítását és az endotéliás sejtek (EC) megkötésének vizsgálatát a 9. példa ismerteti. Vizsgáltuk a plazma és rekombináns 31 kD, rekombináns
18,5 kD és rekombináns 12 kD polipeptidnek az S. aureus EC-hez történő kötődésére kifejtett gátló hatását.
Az ábra a különböző FBD polipeptidek dózistól függő hatását mutatja az S. aureus endotéliás sejtekhez történő kötődésére 4 °C hőmérsékleten magzati borjúszérum (FCS) jelenlétében vagy távollétében. (Az előzetes kísérletek szerint két-háromszorosára növekszik az S. aureus EC-hez történő kötődése FCS jelenlétében 37 °C hőmérsékleten, míg a növekedés csak kismértékű 4 °C hőmérsékleten. A növekedés feltehetően az FCS-ben található plazmafíbronektin jelenlétével magyarázható.) A jelen kísérletet 4 °C hőmérsékleten végezzük, ezért az adagolt FCS nem gyakorol szignifikáns hatást a kötődésre. A plazma és a rekombináns 31 kD polipeptid erős dózistól függő gátlást mutat, míg a rekombináns 18,5 kD és 12 kD polipeptid fragmensek látszólag nem gátolják a kötődést, mivel egyáltalán nem vagy legfeljebb alacsony S. aureus kötőhatással rendelkeznek.
A 30. ábra különböző FBD polipeptid fragmensek előre előállított fibrinröghöz történő kötődését (II reakció) mutatja.
Az ábra különböző FBD polipeptidek specifikusságát mutatja az előre előállított fibrinrög vonatkozásban (9. példa). A vizsgálatban a 31 kD, 20 kD, 18,5 kD és 12 kD FBD polipeptideket teszteljük. Emellett, vizsgálunk egy 45 kD fúziós polipeptidet, amely 12 kD FBD fragmenst és 33 kD CBD-t (40. példa) tartalmaz. Kontrollként egy 33 kD CBD polipeptidet (WO 90/07577 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés) alkalmazunk. A vizsgált valamennyi FBD polipeptid a 45 kD fúziós polipeptiddel együtt hasonló mértékben (25-38%) kötődik az előre előállított fibrinröghöz. A 33 kD CBD önmagában csak kismértékben kötődik a röghöz. A transz-glutamináz inhibitor jód-acetát (IAC) 50-75%-ban gátolja a kötődést, ami arra utal, hogy a transz-glutamináz a kötési reakció aktív komponense. A 33 kD CBD polipeptid kötődését nem befolyásolja a jód-acetát, mivel ez eltérő mechanizmussal kötődik.
A 31. ábra in vivő vérrög jelölést mutat, amelyhez 13. példa szerinti 12 kD és 18,5 kD FBD polipeptid
HU 216 302 Β fragmenst alkalmazunk. Az ábrán a vérrög (csíkozott oszlop) és a vér (nyitott oszlop) specifikus radioaktivitását adjuk meg rozsdamentes acélhurkot viselő patkányokban 24 órával a 11'In izotóppal jelölt rekombináns FBD fehérjék intravénás adagolása után. Az oszlopok és a vízszintes vonalak az átlagértéket és a standard szórást mutatják cpm/g nedves tömeg értékben. A vérrög/vér arány azonos a 32. ábrán megadott aránnyal.
A 32. ábra a vérrög/vér arányt mutatja a 11'In izotóppal jelölt 12 kD, 18,5 kD és 31 kD FBD adagolását követő 24 órában mért specifikus radioaktivitás esetében a 31. ábra ismertetésénél említett patkánynál.
A 33. ábra a humán Glu plazminogén aktivációs kinetikájának Lineweaver-Burke grafikonját ábrázolja pH=7,4 értéken 37 °C hőmérsékleten, amelyhez SK vagy FBD-SK komplexet használunk aktivátorként. 200 μΐ térfogatban egy 96 mérőhelyes lemezen a plazminogén szubsztrátum koncentrációja 0,9χ 10 6 és 2,7x10 6 mol/1 érték között változik. Az S-2251 szubsztrátum (H-D-Val-Leu-Lys-pNS) végső koncentrációja 5 x 10 4 mol/1, az aktivátor végső koncentrációja 2x10 9 mol/1. A reakciórátát (v) a 405 nm hullámhosszon mért abszorpció változása (A, abszorpciós egység) mutatja a t (perc) időtartamra vonatkoztatva.
A 34. ábrához fibrin-agar lemezeket állítunk elő 5 ml (2 mg/ml) fibrinogén, 5 ml (0,4%) nemes agar, 0,5 ml (1 mol/1) kalcium-klorid és 0,5 ml (10 u/ml) trombin összekeverésével imidazollal pufferolt sóoldatban (pH=7,4). A polimerizálás után kis lyukakat képezünk pasztörpipettával vákuumban, amelyekbe az SK vagy FBD-SK komplex alikvot részeit töltjük 102—104 ng/ml koncentrációban. Egy éjszakán keresztül 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után mérjük a roncsolási zónát.
A 35. ábra a 14C-putreszcin tengerimalac transzglutaminázzal katalizált beépülését mutatja FBD vagy FBD-SK komplexbe.
A vizsgálatot 30 percen keresztül szobahőmérsékleten végezzük 6 pmol/l FBD SK vagy FBD-SK komplexszel, 0,05 u/ml transz-glutaminázzal, 6 pmol/l 14Cputreszcinnel, 6 pmol/l hideg putreszcinnel, 50 mmol/1 Trisz-HCl-lel (pH=7,5) és 10 mmol/1 kalcium-kloriddal. Kontrollként 20 mmol/1 EDTA-t (pontozott vonal) vagy 5 mmol/1 DTT-t (folyamatos vonal) alkalmazunk. A háromszög az SK-t, a pontozott négyszög az FBD-t és a négyszög az FBD-SK komplexet jelöli.
A találmány részletes ismertetése
A pFN 975-25, pFN 949-2, pFN 137-2 és pFN 1962 plazmidokat a Budapesti Szerződés előírásai szerint az Amerikai Törzsgyűjteményben deponáltuk az ATCC 67832, 67831, 67910 és 68328 számon. Hasonló módon, a leírásban az ATCC-szám megadásával jellemzett további letétbe helyezések is követik a Budapesti Szerződés előírásait.
A humán fibronektin primer szekvenciája három homológ ismétlődő egységből áll, I típus, II típus és III típus. A fíbrinkötő dómén (FBD), amely 259 aminosavat tartalmaz, és látszólagos móltömege 31 kD, öt darab I típusú ismétlődő egységből (újból) áll, amelyek mindegyike 45 aminosav hosszúságú, és két diszulfidkötést tartalmaz. Ezek egyenként mintegy 20 aminosavból álló szakaszokat kötnek össze a fehérje N-terminális és C-terminális végén.
A fibronektin domének szerkezetét és az előállított rekombináns molekulákat sematikus ábrázolásban az 1. ábra mutatja.
A találmány szerinti rekombináns fibrinkötő dómén (FBD) polipeptidek a fibrinkötő dómén polipeptid fragmenseit (r20 kD, rl8,5 kD és rl2 kD polipeptidek) tartalmazzák. Ezek a polipeptidek kisebbek, mint a 31 kD polipeptid, és a fíbrinkötő dómén szekvenciájának egy részét tartalmazzák. A fibrinkötő dómén többi polipeptidje további plazmidokkal fejezhető ki, amelyek a szokásos módon előállíthatok az ismertetett plazmidokból; és ezek a polipeptidek a szokásos módon hajtogathatok, oxidálhatok és tisztíthatok.
A teljes hosszúságú rekombináns fibrinkötő dómén (az r31 kD polipeptid) a fibronektin első 262 aminosavját tartalmazza, és karboxi-terminális végének szekvenciája arg-ala-ala-val. Egy további aminoterminális metioninmaradék található az FBD összes végső polipeptidjében és polipeptid fragmensében. A plazmafibronektin tripszines emésztésével kapott plazma fibrinkötő dómén a fibronektin első 259 aminosavját tartalmazza, vagyis karboxi-terminális végén argininmaradékot hordoz, és az első kódolt aminosav, a glutamin piroglutamátmaradékra van cserélve.
Az r31 kD polipeptid öt darab I típusú homológ hurkot vagy ujjat tartalmaz (vagyis tíz diszulfidkötést hordoz), mig az r20 kD polipeptidben és az rl 8,5 kD polipeptidben három hurok (vagyis hat diszulfidkötés), és az rl2 kD polipeptidben két hurok (vagyis négy diszulfidkötés) található. A diszulfidkötések jelenléte megmagyarázza a hajtogatás/oxidációs folyamat szükségességét és bonyolultságát, ami elengedhetetlen a megfelelően hajtogatott, és megfelelő diszulfidkötéseket tartalmazó FBD polipeptidek előállításához és tisztításához. A megfelelően hajtogatott FBD polipeptidek biológiailag hatékonyak, vagyis a fibrinhez kötődnek, míg az r31 kD polipeptid a Staphylococcus aureus megkötésére is képes.
A rekombináns FBD polipeptidek olyan zárványtestekben termelődnek, amelyek a sejtmassza elroncsolása után kapott pelletben találhatók.
A találmány kiteljed a fibronektin fibrinkötő dómén (FBD) rekombináns polipeptid fragmenseinek előállítására, amelyek felhasználhatók vérrögök leképezésére és a vérrögképződés megelőzésére. Lehetőség van továbbá arra is, hogy ezeket a polipeptideket trombolitikus szerhez kötjük, és ezáltal a szert a vérröghöz szállítjuk.
Az FBD polipeptid fragmenseinek előállítására rekombináns sejtként bármely olyan sejt felhasználható, amelybe rekombináns DNS-technikával egy FBD polipeptid fragmenst kódoló DNS-szekvenciát vittünk be. Szükséges továbbá, hogy a sejt képes legyen a DNS-szekvencia kifejezésére, és a polipeptid termék termelésére. A sejt lehet emlőssejt, gombasejt, így élesztősejt, valamint baktériumsejt.
Baktériumsejtként bármely auxotróf, prototróf és litikus törzs, valamint F+ és F törzs, a lambda-profág CI857 represszor szekvenciáját hordozó törzs felhasz8
HU 216 302 Β nálható. Alkalmazhatók továbbá azok a törzsek, amelyekben a deo represszort vagy deo gént kiiktatták.
A vad típusú Escherichia coli törzsek közül alkalmazható a prototróf ATCC 12435 számon letétbe helyezett, és az auxotróf MC 1061 törzs (ATCC 67361).
A lambda CI857 represszorszekvenciát hordozó Escherichia coli törzsekre példaként említhető a pTVR 279-8 plazmidot hordozó auxotróf A1645 törzs (ATCC 53216), a pTV 104(2) plazmidot hordozó A1637 törzs (ATCC 39384), és a pSODa2 plazmidot hordozó A2097 törzs (ATCC 39786), valamint a pFN 97525 plazmidot hordozó prototróf A4255 törzs (ATCC 67832) és a pHG44 plazmidot hordozó biotinfüggetlen A4346 törzs (ATCC 53218).
A lírikus Escherichia coli törzsekre példaként említhető a pHG44 plazmidot hordozó A4048 törzs (ATCC 53217).
Az F Escherichia coli törzsekre példaként említhető a pMF 5534 plazmidot hordozó S093O (F ) törzs (ATCC 67703), és a pMFS 929 plazmidot hordozó W31100 (F) törzs (ATCC 67705).
Azokra az Escherichia coli törzsekre, amelyekben hiányzik a deo gén vagy deo represszor, példaként említhető a pMF 2005 plazmidot hordozó S0732 törzs (ATCC 67362), a pJBF 5401 plazmidot hordozó S054O törzs (ATCC 67359) és a pEFF 920 plazmidot hordozó S093O törzs (ATCC 67706) (0 303 972 számú európai közrebocsátási irat).
A találmány szerinti plazmidok megfelelő bakteriális gazdasejtbe, előnyösen Escherichia coli sejtbe bevihetők. Az előnyösen alkalmazható Escherichia coli sejtekre példaként említhető az A4255 (F+) törzs (ATCC 67832), valamint más Escherichia coli törzsek és más baktériumok. A további baktériumokra példaként említhető a Pseudomonas aeruginosa és Bacillus subtilis.
Az említett valamennyi Escherichia coli törzs a plazmid vonatkozásában a szokásos módon kezelhető, például az ismert etidium-bromid módszerrel (R.P. Novick: Bacteriol. Rév. 33, 210 (1969)).
A bakteriális sejt az FBD polipeptidet kódoló FBDszekvenciát előnyösen egy vektor DNS-molekula testében, így plazmidban tartalmazza. A vektort vagy plazmidot rekombináns DNS-technikával állítjuk elő úgy, hogy az FBD polipeptidet kódoló szekvenciát megfelelő pozícióban beépítjük a molekulába.
Az FBD polipeptid termelésére használt plazmidok különböző promotereket, így lambda-promotert vagy deo promotert hordozhatnak.
Az FBD polipeptidek termelésére használt plazmidokra példaként említhetők a következők:
a) pFN 975-25 plazmid, amely r31 kD FBD-t fejez ki, és Escherichia coli A4255 törzsben az ATCC 67832 számon került deponálásra;
b) pFN 949-2 plazmid, amely r20 kD FBD-t fejez ki, és Escherichia coli A4255 törzsben az ATCC 67831 számon került deponálásra;
c) pFN 196-2 plazmid, amely rl2 kD FBD-t fejez ki, és Escherichia coli A4255 törzsben az ATCC 68328 számon került deponálásra;
d) pFN 197-10 plazmid, amely módosított 12 kD FBD-t fejez ki, és amelyet all. ábra ismertet;
e) pFN 195-4 plazmid, amely DGRGDS szekvenciával fuzionált r31 kD polipeptidet fejez ki, és amelyet a 13. ábra ismertet;
f) pFN 201-3 plazmid, amely 12 kD FBD polipeptid ffagmenst fejez ki lambda-PL és CII rbs szabályozása alatt, és amelyet a 26. ábra ismertet;
g) pFN 203-2 plazmid, amely 12 kD FBD polipeptid ffagmenst fejez ki lambda-PL és CII rbs szabályozása alatt, és „tér” transzkripciós terminátort tartalmaz, és amelyet a 27. ábra ismertet, és Escherichia coli A4255 törzsben az ATCC 68606 számon deponáltunk;
h) pFN 205-5 plazmid, amely 64 kD polipeptidet fejez ki, amely tartalmazza a 31 kD teljes hosszúságú FBD polipeptidet, és ehhez fuzionálva a 33 kD fíbronektin sejtkötő dómén (CBD) fragmenst, és amelyet a 25. ábra ismertet;
i) pFN 208-13 plazmid, amely 18,5 kD FBD polipeptid fragmenst fejez ki, amit a 23. ábra ismertet, amelyet Escherichia coli A4255 törzsben az ATCC 68456 számon deponáltunk;
j) a fenti plazmidokból származó bármely olyan plazmid, amely hordozza a fenti plazmidok által kódolt FBD szekvenciákat; és
k) bármely olyan plazmid, amely a fenti plazmidok által kódolt FBD szekvenciákat tartalmazza.
A találmány szerinti leképezőszer olyan leképezhető markerrel jelölt polipeptidből áll, amelynek aminosavszekvenciája lényegében azonos a természetes humán fíbronektin fibrinkötő doménjében található szekvenciával, és fibrin megkötésére alkalmas. A találmány kiterjed az olyan készítményekre, amelyek a fenti leképezőszer hatékony mennyiségét tartalmazzák fiziológiailag alkalmazható hordozóanyagok mellett.
A leképezhető markerrel jelölt polipeptid lehet a humán fíbronektin fibrinkötő doménjének valamely polipeptid fragmense, előállítható rekombináns DNStechnikával, vagy DNS-szintetizátorban előállított génnel kódolható. Az ilyen polipeptidekre három példát adunk meg, amelyek közül előnyös megvalósítási módként említhető a 18,5 kD és 12 kD polipeptid. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti polipeptideknek az a jellemzője, hogy aminosav-szekvenciája lényegében azonos a természetes humán fíbronektin fibrinkötő doménjében jelen lévő szekvenciával, felöleli többek között a természetes eredetű alléi variánsokat és rekombináns variánsokat, így helyspecifikus mutációval nyerhető variánsokat. A találmány szerinti polipeptidekkel szemben az egyetlen korlátozó jellegű megkötés, hogy képes legyen fibrin megkötésére.
A leképezésre alkalmas marker kiválasztása szakember feladata. Markerként előnyösen alkalmazható valamely radioaktív izotóp, röntgensugarak számára átjárhatatlan elem vagy paramágneses ion.
A radioaktív izotópok a gyógyászatban általánosan elteljedtek, és szakember számára ismertek. A találmány értelmében markerként előnyösen alkalmazható
HU 216 302 Β az indium-111, technécium-99m, a jód-123, a jód-125, a jód-131, a kripton-81m, a xenon-133 vagy a gallium67 izotóp, illetve ezek elegyei. Ezen belül különösen előnyös a technécium-99m vagy az indium-111 izotóp.
Kimutatható markerként alkalmazható továbbá valamely paramágneses ion. Ezek a gyógyászatban széles körben elterjedtek. Példaként említhetők a kelátozott fémionok, így a króm(III)-, mangán(II)-, vas(III)-, vas(II)-, kobalt(II)-, réz(II)-, prazeodimium(III)-, neodímium(III)-, szamárium(III)-, gadolinium(III)-, terbium(III)-, diszprózium(III)-, holmium(III)-, erbium(III)-, itterbium(III)ion, valamint ezek elegyei.
A leképezőszer előnyösen egy 20 kD polipeptidet tartalmaz, amely megfelel a humán fibronektin fibrinkötő doménjében jelen lévő aminosav-szekvenciának, és a
2. ábra szerinti 1-153 aminosavnak megfelelő aminosavszekvenciát és mintegy 20 további aminosavat tartalmaz; vagy 18,5 kD polipeptidet tartalmaz, amely megfelel a humán fibronektin fibrinkötő doménjében jelen lévő aminosav-szekvenciának, és a 2. ábra szerinti 1-154 aminosav közötti aminosav-szekvenciát tartalmazza; vagy egy 12 kD polipeptidet tartalmaz, amely megfelel a humán fibronektin fibrinkötő doménjénben jelen lévő aminosavszekvenciának, és a 2. ábra szerinti 1-109 aminosav közötti aminosav-szekvenciát tartalmazza. A részleges aminosav-szekvencia analízis szerint a 12 kD és a 20 kD polipeptid a korábban említett 31 kD polipeptiddel együtt egy további N-terminális metioninmaradékot tartalmaz. Mivel az FBD polipeptid fragmensek mindegyike azonos N-terminális-szekvenciát mutat, feltételezhető, hogy a
18,5 kD, a 45 kD és a 64 kD polipeptid szintén hordozza a további N-terminális metioninmaradékot. A találmány kiterjed azonban az említett N-terminális metioninmaradék nélküli polipeptidekre is.
A találmány értelmében tehát a fibrintartalmú anyagok, így vérrög vagy ateroszklerotikus plakk leképezéséhez a leképezendő fibrintartalmú anyagot a fent ismertetett szerrel érintkeztetjük a szemek a fibrintartalmú anyaghoz történő kötődését biztosító körülmények között, majd a megkötött szert, és ezáltal a fibrintartalmú anyagot leképezzük.
A találmány szerinti megoldás felhasználható fibrintartalmú anyagnak betegben történő leképezésére, amelynek során
a) a betegnek a fent említett készítményt adagoljuk a leképezőszemek a véráramba történő belépését és a véredényekben jelen lévő fibrinhez történő kötődését biztosító körülmények között;
b) a lekötött szert a véredényen belül leképezzük, és ezáltal
c) a fibrintartalmú anyagot leképezzük.
A fibrintartalmú anyagok leképezése során reagensként előnyösen alkalmazható a 20 kD polipeptid, amely megfelel a humán fibronektin fibrinkötő doménjében jelen lévő aminosav-szekvenciának, és a 2. ábra szerinti 1-153 aminosav közötti aminosav-szekvenciát tartalmazza; a 20 kD polipeptid, amely legfeljebb 20 további aminosavat tartalmaz; a 18,5 kD polipeptid, amely megfelel a humán fibronektin fibrinkötő doménjében jelen lévő aminosav-szekvenciának, és a 2. ábra szerinti
1-154 aminosav közötti aminosav-szekvenciát tartalmazza; vagy a 12 kD polipeptid, amely megfelel a humán fibronektin fibrinkötő doménjében jelen lévő aminosav-szekvenciának, és a 2. ábra szerint 1-109 aminosav közötti aminosav-szekvenciát tartalmazza.
A fibrintartalmú anyagok leképezésére szolgáló eljárás során markerként előnyösen alkalmazható valamely radioaktív izotóp, a röntgensugarak számára átjárhatatlan elem vagy paramágneses ion, ezen belül elsősorban radioaktív izotóp, így indium-111, technécium99m, jód-123, jód-125, jód-131, kripton-81m, xenon133 és gallium-67 izotóp.
A leképezés bármely, szakember számára ismert módon megvalósítható. Példaként említhető a röntgensugár-, a CAT-vizsgálat, PET-vizsgálat, NMRI és fluoroszkópia. A fibrintartalmú anyagok leképezése előnyösen megvalósítható gamma-kamera segítségével.
A találmány értelmében a polipeptid kifejezésére alkalmas az olyan plazmid, ahol a polipeptid aminosavszekvenciája lényegében azonos a természetes humán fibronektin fibrinkötő doménjében jelen lévő szekvenciával, és fibrin megkötésére alkalmas. A plazmid az említett polipeptidet kódoló DNS-t és megfelelő szabályozó elemeket kódoló DNS-t tartalmaz a polipeptidet kódoló DNS-hez viszonyítva olyan pozícióban, amely lehetővé teszi a polipeptidnek megfelelő gazdasejtben történő kifejezését.
A leírásban három példát adunk meg a fibronektin fibrinkötő doménjének polipeptid fragmenseire. Ezek az r20 kD, rl8,5 kD és rl2 kD polipeptidek. Ezek a polipeptidek hordozzák a természetes humán fibronektin szakaszainak kötő és adhezív tulajdonságait. Az oltalmi kör nem korlátozódik erre a három FBD polipeptid fragmensre, amelyek csupán a példaszerű bemutatást szolgálják.
Polipeptidként előnyösen alkalmazható mintegy 20 kD polipeptid, amely a humán fibronektin fibrinkötő doménjében jelen lévő aminosav-szekvenciának felel meg; a mintegy 18,5 kD polipeptid, amely a humán fibronektin fibrinkötő doménjében jelen lévő aminosav-szekvenciának felel meg; vagy a mintegy 12 kD polipeptid, amely a humán fibronektin fibrinkötő doménjében jelen lévő aminosav-szekvenciának felel meg.
Polipeptidként különösen előnyösen alkalmazható a
18,5 kD polipeptid, amely a fibrinkötő doménben jelen lévő aminosav-szekvenciának felel meg, és a 2. ábra szerinti 1-154 aminosav közötti aminosav-szekvenciát tartalmazza; a 20 kD polipeptid, amely a humán fibronektin fibrinkötő doménjében jelen lévő aminosavszekvenciának felel meg, és a 2. ábra szerinti 1-153 aminosav közötti aminosav-szekvenciát tartalmazza; a 20 kD polipeptid, amely legfeljebb 20 további aminosavat tartalmaz; vagy a 12 kD polipeptid, amely a humán fibronektin fibrinkötő doménjében jelen lévő aminosavszekvenciának felel meg, és a 2. ábra szerinti 1-109 aminosav közötti aminosav-szekvenciát tartalmazza. Mint fent említettük, a polipeptidek további N-terminális metioninmaradékot tartalmazhatnak. Az oltalmi kör azonban felöleli az N-terminális metionin nélküli polipeptideket is.
HU 216 302 Β
Természetes humán fibronektin alatt az emberi szervezetben (a plazmában) előforduló fibronektint értjük.
A leírás keretein belül a „lényeges rész” kifejezés alatt legalább 1/5-öd részt értünk. A természetes humán fibronektin fibrinkötő doménjével azonos biológiai hatást mutató polipeptid a természetes humán fibronektin fibrinkötő doménjével hasonló kötési és adhéziós tulajdonságokkal rendelkezik akkor, ha a hatékonyság szintjét mérjük vagy meghatározzuk.
A találmány keretein belül a különböző funkcionális domének aminosav-szekvenciáját a domént kódoló cDNS restrikciós enzimekkel végzett hasításával határozzuk meg, ami nem feltétlenül azonos a fibronektin proteolitikus emésztésével kapott, és definiált domének aminosav-szekvenciájával.
A fent említett plazmid további komponensként megfelelő szabályozóelemeket tartalmaz, amelyek a polipeptidet kódoló DNS-hez viszonyítva úgy helyezkednek el, hogy biztosítsák a polipeptid megfelelő gazdasejtben történő kifejezését. Ezekre példaként említhetők a promoterek és operátorok, például lambda-PLOL, riboszomális kötőhelyek, így CII, valamint represszorok. Alkalmazhatók további szabályozóelemek is, így lac, trp, tac, lpp és deo promoterek (0303 972 számú európai közrebocsátási irat).
A megfelelő szabályozóelemeket a polipeptidet kódoló DNS-hez viszonyítva úgy helyezzük el, hogy biztosítsák a polipeptidnek megfelelő baktériumsejtben történő kifejezését. A találmány szerinti megoldás egyik előnyös megvalósítási módja szerint a szabályozóelemeket a polipeptidet kódoló DNS mellett vagy felett helyezzük el.
A plazmidra példaként említhető a pFN 9492 plazmid, amelyet Escherichia coli A1645 törzsben az ATCC 67831 számon deponáltunk. A pFN 9492 plazmid a 20 kD polipeptid fragmenst kódolja, amely a 2. ábra szerinti 1-153 közötti aminosavakat tartalmazza a további N-terminális metioninnal és legfeljebb 20 további aminosavval együtt.
A plazmid lehet továbbá a pFN 196-2 plazmid, amit Escherichia coli A4255 törzsben az ATCC 68328 számon deponáltunk. A pFN 196-2 plazmid a humán fibronektin fibrinkötő dómén 12 kD polipeptid fragmensét kódolja, amely az 1 -109 aminosavakat tartalmazza.
A plazmid lehet továbbá a pFN 208-13 plazmid, amit Escherichia coli A4255 törzsben az ATCC 68456 számon deponáltunk. A pFN 208-13 plazmid a humán fibronektin fibrinkötő dómén 18,5 kD polipeptid fragmensét kódolja, amely a 2. ábra szerinti 1-154 aminosavakat tartalmazza, és feltehetően további N-terminális metioninmaradékot hordoz.
A plazmid lehet továbbá a pFN 203-2 plazmid, amit Escherichia coli A4255 törzsben az ATCC 68606 számon deponáltunk. A pFN 203-2 plazmid a humán fibronektin fibrinkötő dómén 12 kD polipeptid fragmensét fejezi ki, amely 2. ábra szerinti 1-109 aminosavat tartalmaz, és további N-terminális metioninmaradékot hordoz.
A plazmid lehet továbbá a pFN 205-5 plazmid, amely egy 64 kD polipeptidet fejez ki, amely 31 kD teljes hosszúságú FBD polipeptidet, és ehhez fuzionálva egy 33 kD fibronektin CBD fragmenst tartalmaz (25. ábra).
Mint említettük, feltételezhető, hogy valamennyi plazmid által termelt polipeptid további N-terminális metionint hordoz.
A találmány szerinti megoldás egyik megvalósítási módja szerint előnyös a pFN 975-25 plazmidot tartalmazó Escherichia coli sejt, amelyet az ATCC 67832 számon deponáltunk; a pFN 949-2 plazmidot tartalmazó Escherichia coli sejt, amit az ATCC 67831 számon deponáltunk; a pFN 196-2 plazmidot tartalmazó Escherichia coli sejt, amit az ATCC 68328 számon deponáltunk; a pFN 203-2 plazmidot tartalmazó Escherichia coli sejt, amit az ATCC 68606 számon deponáltunk; és a pFN 208-13 plazmidot tartalmazó Escherichia coli sejt, amit az ATCC 68456 számon deponáltunk.
A találmány tárgya továbbá eljárás polipeptid előállítására, amelynek aminosav-szekvenciája lényegében azonos a természetes humán fibronektin fibrinkötő doménjében jelen lévő szekvenciával, és fibrin megkötésére alkalmas, amelynek során a polipeptidet kódoló DNS-t hordozó plazmidot tartalmazó sejtet kezelve a polipeptidet kifejezzük, és a sejtből feltáljuk.
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható a fibrinkötő dómén 18,5 kD, 20 kD vagy 12 kD polipeptid fragmensének előállítására.
A találmány szerint előállított tisztított polipeptid további humán eredetű anyagoktól lényegében mentes, aminosav-szekvenciája lényegében azonos a természetes humán fibronektin fibrinkötő doménjében jelen lévő szekvenciával, és fibrin megkötésére alkalmas.
A polipeptidekre előnyös példaként említhető a 20 kD polipeptid, amelynek aminosav-szekvenciája megfelel a humán fibronektin fibrinkötő doménjében jelen lévő szekvenciának, és a 2. ábra szerinti 1-153 aminosav közötti aminosav-szekvencíát tartalmazza; a 20 kD polipeptid, amely legfeljebb 20 további aminosavat tartalmaz; vagy a 18,5 kD polipeptid, amelynek aminosav-szekvenciája megfelel a humán fibronektin fibrinkötő doménjében jelen lévő szekvenciának, és a 2. ábra szerinti 1-154 aminosav közötti aminosav-szekvenciát tartalmazza; vagy a 12 kD polipeptid, amelynek aminosav-szekvenciája megfelel a humán fibronektin fibrinkötő doménjében jelen lévő szekvenciának, és a 2. ábra szerinti 1-109 aminosav közötti aminosav-szekvenciát tartalmazza. Mint említettük, ezek a polipeptidek további N-terminális metioninmaradékot tartalmazhatnak. Az oltalmi kör azonban az N-terminális metionin nélküli polipeptidekre is kiterjed.
Ezek a rövidebb FBD polipeptid fragmensek, vagyis a 20 kD, 18,5 kD és 12 kD fragmensek előnyösebbek, mint a 31 kD FBD polipeptid. Ezek a fragmensek könnyebben hajtogathatok, nem tartalmazzák a baktériumkötő domént, és sokkal kisebb specifikus kötést mutatnak más vaszkuláris komponenssel, így endotéliás sejtekkel, az extracelluláris mátrixszal, vagy a fibronektinnel szemben, mint a 31 kD polipeptid, de fibrinkötő aktivitásuk azonos a 31 kD polipeptid hatásával.
HU 216 302 Β
A találmány értelmében ezek a tisztított, más humán eredetű anyagoktól lényegében mentes polipeptidek egy második polipeptiddel fuzionálhatok, ahol a második polipeptid a természetes humán fibronektin sejtkötő doménje aminosav-szekvenciájának fő részét tartalmazza.
A fuzionált polipeptidre előnyös példaként említhető a 45 kD fuzionált polipeptid, ahol a tisztított polipeptid egy 12 kD polipeptid, és a második polipeptid, amely a természetes humán fibronektin sejtkötő doménjének fő részét tartalmazza, egy 33 kD polipeptid. A fuzionált polipeptid állhat továbbá egy 31 kD tisztított polipeptidből és egy olyan második polipeptidből, amely a DGRGDS aminosav-szekvenciát tartalmazza. A fuzionált polipeptidre további példaként említhető a 64 kD fuzionált polipeptid, ahol a tisztított polipeptid egy 31 kD polipeptid, és a második polipeptid, amely a természetes humán fibronektin sejtkötő doménjének fő részét tartalmazza, egy 33 kD polipeptid.
A fuzionált polipeptid kifejezésére alkalmas plazmid előnyösen a 45 kD fuzionált polipeptid kifejezésére alkalmas pFN 202-5 plazmid, a 31 kD/GRGDS fuzionált polipeptid kifejezésére alkalmas pFN 1954 plazmid, és a 64 kD fuzionált polipeptid kifejezésére alkalmas pFN 194-2 plazmid.
A leírás keretein belül a fuzionált vagy kötött kifejezés kiterjed a kovalens kötésű, nem kovalens kötésű és konjugált polipeptidekre. A polipeptidek konjugációja megvalósulhat más kémiai csoportokon keresztül, így aminosavon vagy polipeptid keresztkötésen keresztül, amelyek szakember számára általánosan ismertek.
A vérrög detektálására különböző eljárások ismertek, így a radioaktív jelölés (izotópok alkalmazásán alapuló radioaktív gyógyszerek), a radioaktív sugarak számára át nem látható jelölés (például CAT-vizsgálat), valamint a mágneses rezonancia leképezés (Magnetic Resonance Imaging, MRI). Az ismert jelölési módszerek bármelyike alkalmazható a vérrög találmány szerinti kimutatásához. Ezek mindegyikében a polipeptidet diagnosztizálószerként alkalmazzuk a vérrög detektálárához.
A találmány szerinti megoldás kiterjed az olyan polipeptidek hajtogatására és oxidálására, amelyeknek aminosav-szekvenciája lényegében azonos a természetes humán fibronektin fibrinkötő doménjében jelen lévő szekvenciával, de hiányoznak a természetes humán fibronektin diszulfidkötései, és fibrin megkötésére képes, amelynek során a polipeptidet tioltartalmú vegyülettel érintkeztetjük diszulfid jelenlétében vagy távollétében, és a polipeptidet hajtogatjuk és oxidáljuk.
Tioltartalmú vegyületként előnyösen alkalmazható a glutation, tioredoxin, β-merkapto-etanol és tisztein.
Előnyösen úgy járunk el, hogy tioltartalmú vegyületként β-merkapto-etanolt alkalmazunk, és a diszulfidot levegő bevezetésével in situ állítjuk elő.
Az eljárás során polipeptidként előnyösen alkalmazható a 18,5 kD polipeptid, a 20 kD polipeptid, a 12 kD polipeptid és a 45 kD polipeptid. A 45 kD kimér polipeptidet, amely a 12 kD FBD polipeptidből és az ehhez kapcsolt 33 kD CBD polipeptidből áll, pontosan ugyanazzal az eljárással hajtogatjuk, és oxidáljuk, mint a kisebb FBD polipeptideket.
A hajtogatás és oxidálás során eljárhatunk továbbá úgy is, hogy további lépésként a polipeptidet egy denaturálószerrel kezeljük, ahol denaturálószerként előnyösen alkalmazható a guanidin-hidroklorid és a karbamid.
A polipeptidet előnyösen kis koncentrációban, például legfeljebb 1000 μg/ml koncentrációban alkalmazzuk.
A találmány tárgya továbbá eljárás tisztított, biológiailag aktív polipeptid feltárására, amelynek aminosav-szekvenciája lényegében azonos a természetes humán fibronektin fibrinkötő doménjében jelen lévő szekvenciával, és fibrin megkötésére alkalmas, amelynek során
a) a polipeptidet kódoló DNS-t tartalmazó plazmidot kifejező baktériumsejtben egy első polipeptidet termelünk, amelynek aminosav-szekvenciája azonos a polipeptid szekvenciájával, de nem tartalmazza a diszulfidkötéseket;
b) a sejtet roncsolva az első polipeptidet tartalmazó lizátumot állítunk elő;
c) a lizátumot centrifugálva koncentráljuk az első polipeptidet;
d) a koncentrált első polipeptidet elválasztjuk;
e) az elválasztott koncentrált első polipeptidet szolubilizáljuk;
1) a szolubilizált első polipeptidet hajtogatjuk és oxidáljuk, amikor is biológiailag aktív polipeptidet kapunk;
g) a hajtogatott és oxidált, biológiailag aktív polipeptidet elválasztjuk;
h) a tisztított, hajtogatott és oxidált, biológiailag aktív polipeptidet feltárjuk; és
i) a feltárt biológiailag aktív polipeptidet tisztítjuk. A hajtogatás és az oxidálás megvalósításához a polipeptidet előnyösen tioltartalmú vegyülettel érintkeztetjük diszulfid jelenlétében vagy távollétében. Tioltartalmú vegyületként előnyösen alkalmazható a glutation, tioredoxon, β-merkapto-etanol és cisztein.
Előnyösen úgy járunk el, hogy tioltartalmú vegyületként β-merkapto-etanolt alkalmazunk, és a diszulfidot levegő bevezetésével in situ állítjuk elő.
Polipeptidként előnyösen alkalmazható a 18,5 kD polipeptid, a 20 kD polipeptid, a 12 kD polipeptid és a 45 kD polipeptid. Mint fent említettük, a 45 kD kimér polipeptidet, amely a 12 kD FBD polipeptidből és a vele fuzionált 33 kD CBD polipeptidből áll, pontosan ugyanúgy hajtogatjuk és oxidáljuk, mint a kisebb FBD polipeptideket.
Eljárhatunk továbbá úgy is, hogy további lépésként a polipeptidet denaturálószerrel, így guanidin-hidrokloriddal vagy karbamiddal érintkeztetjük.
A polipeptidet előnyösen kis koncentrációban, így 1000 gg/ml alatti koncentrációban alkalmazzuk.
A koncentrált polipeptid c) lépés szerinti elválasztását előnyösen kromatográfiásan, így heparin-szefaróz kromatográfiásan végezzük.
A találmány szerinti megoldás lehetővé teszi a vérrögképződés megakadályozását erre hajlamos betegben, amelyhez a betegnek a vérrög képződésének megakadályozásához szükséges mennyiségben valamely fenti polipeptidet vagy fuzionált polipeptidet adagolunk.
HU 216 302 Β
A polipeptid alkalmazható például redukált formában, vagy lehetőség van arra is, hogy az S-H csoportokat védjük (például az oxidálódás megelőzése érdekében karboxi-metilezéssel vagy karboxamido-metilezéssel).
A találmány szerint alkalmazhatók olyan polipeptidek, amelyeket egy trombolitikus szerhez kapcsolunk, a trombolitikus szemek a kívánt célhoz történő eljuttatása érdekében. Trombolitikus szerként alkalmazható például szövetplazminogén-aktivátor (TPA), urokináz, sztreptokináz, prourokináz, anizoilezett plazminogén sztreptokináz aktivátor komplex (emináz), TPA analógok vagy proteáz.
Ennek egyik megvalósítási módjában a polipeptid aminosav-szekvenciája lényegében azonos a természetes humán fibronektin fibrinkötő doménjében jelen lévő szekvenciával, és fibrin megkötésére alkalmas, továbbá móltömege legalább mintegy 6 kD, és legfeljebb mintegy 20 kD, N-terminális aminosav-szekvenciája glnala-gln-gln vagy met-gln-ala-gln-gln, és a trombolitikus szer sztreptokináz.
Az előnyös megvalósítási forma szerint a polipeptid a 12 kD polipeptid és a trombolitikus szer a sztreptokináz.
A találmány szerinti megoldás felhasználható vérrög feloldására, amelynek során a betegnek a trombolízishez szükséges mennyiségben trombolitikus szerhez kötött polipeptidet adagolunk.
Alkalmazható továbbá sérült beteg kezelésére, amelynek során a betegnek a sérülés kezeléséhez szükséges mennyiségben humán eredetű anyagoktól lényegében mentes, tisztított polipeptidet adagolunk, amelynek aminosav-szekvenciája lényegében azonos a természetes humán fibronektin N-terminális fibrinkötő doménjében jelen lévő szekvenciával, és fibrin megkötésére képes, és ezzel együtt olyan polipeptidet adagolunk, amely a természetes humán fibronektin sejtkötő doménjének fő részét tartalmazza. Ennek egyik megvalósítási módjában sejtkötő dómén polipeptidként 40 kD polipeptidet vagy 33 kD polipeptidet alkalmazunk.
A sérült beteg kezelése során eljárhatunk úgy is, hogy a betegnek fuzionált polipeptidet adagolunk, amelynek egyik komponense humán eredetű anyagoktól lényegében mentes, tisztított polipeptid, amelynek aminosav-szekvenciája lényegében azonos a természetes humán fibronektin fibrinkötő doménjében jelen lévő szekvenciával, és fibrin megkötésére alkalmas, míg a másik polipeptid a természetes humán fibronektin sejtkötő doménjének fő részét tartalmazza. Ennek egyik megvalósítási módjában fuzionált polipeptidként 45 kD polipeptidet alkalmazunk, amely polipeptidként 12 kD polipeptidet és második polipeptidként 33 kD polipeptidet tartalmaz. Egy másik megvalósítási mód szerint fuzionált polipeptidként 64 kD fuzionált polipeptidet alkalmazunk, amely polipeptidként 31 kD polipeptidet és második polipeptidként 33 kD polipeptidet tartalmaz.
Ez a megoldás különböző sérülések kezelésére alkalmazható, példaként említhetők a bőrsérülések, így a vágott sebek, a borhiányból származó sérülések, a bőrátültetések és az égési sérülések. Az eljárás alkalmazható szemsérülések, így szaruhártya hámsérülés vagy szaruhártyaváz-sérülés kezelésére, továbbá ínsérülés kezelésére is.
A találmányt közelebbről az alábbi példákkal mutatjuk be anélkül, hogy az oltalmi kör a példákra korlátozódna.
Példák
Az egyes hasítási térképek pozícióira történő hivatkozás során a humán fibronektin cDNS 2. ábra szerinti nukleotidszekvenciája mentén megadott számozást alkalmazzuk (lásd a 207 751 számú európai közrebocsátási irat 3. ábráját is).
A jelen bejelentés az N-terminális fibrinkötő dómén (FBD) polipeptid fragmenseire vonatkozik. A 31 kD polipeptidre vonatkozóan megadott kísérleti adatok a rövidebb fragmensek viszonyítási alapját jelentik. Az említett fehéijék egy része fúziós fehérje, amely FBD fragmenst tartalmaz C-terminális végén a sejtkötő dómén (CBD) N-terminális részéhez kapcsolódva.
A klónozott és kifejezett CBD-nek megfelelő cDNS-szekvenciák nem tartalmazzák azt a 270 bp extradomén (ED) szegmenst, amely a Baralle-térképen a 4811 -5080 nukleotid között helyezkedik el (lásd a 2. ábrát). Ennek megfelelően, az a cDNS-szekvencia, amely a Baralle-térképen a 3317-5566 nukleotid között helyezkedik el, csak 1980 nukleotidot tartalmaz, mivel hiányzik az ED szegmensnek megfelelő 270 nukleotid, nevezetesen a 4811-5080 közötti nukleotid. Ez a szakasz az irodalomban ED-A szakaszként is ismert. Mivel az 5081. nukleotidot G-ről A-ra cseréltük, az 1690. aminosav alaninról treoninra cserélődik. Hasonlóképpen, az ilyen DNS-fragmens által kifejezett polipeptid a Baralle-térképen a 1102-1851. aminosavnak felel meg, de nem tartalmazza az ED szakasz által kódolt 90 aminosavat, nevezetesen az 1600-1689. aminosavakat, és így csak 660 aminosavból áll. Ez érvényes az említett összes CBD ffagmensre, amelyek felölelik az ED szakaszt. (Az irodalomban ED-B szakaszként ismert szakasz hiányzik a Baralle-térképen, és a találmány szerinti cDNS-ben is.)
A 3317 pozícióban található EcoRI hasítóhelyet klónozási eljárással alakítottuk ki EcoRI linker felhasználásával. A 3313-3318 pozícióban található fenti GAATTC szekvencia egy nukleotidban tér el a megfelelő Baralle-féle GATTC szekvenciától. A csere értelmében a 3315 nukleotidnál C helyett A található. Ennek következtében az 1100. aminosav Thr-ről Asn-re cserélődik.
1. példa
Fibronektin cDNS-tár előállítása cDNS-tárat állítunk elő lambda-gtl 1-ben humán májból izolált poli A+ mRNS-ből a 13) és 14) számú irodalom szerint. A cDNS-fragmenseket EcoRI linkerek segítségével klónozzuk, és a cDNS-tárat fibronektin (FN) pozitív plazmidokra vizsgáljuk az alábbi szintetikus DNSminták alkalmazásával.
HU 216 302 Β
A sejtkötő dómén (CBD) mintái:
(3 ’) CACTCTATAATGTCCTAGTGAATGCCTCTTTGTCCTCC (3 ’) AGAATCTCCTTCTGTCTTTTGTCCAGAACTAAG (3 ’) CCGGTTGTTAGTTGTCAAAGACTACAAGGCTCCCTGGACC AzN-terminális fibrinkötő dómén (FBD) mintái:
(3 ’) GGGGGTCGGAGGGATACC GGTGACACAGTGTCTTAA (3 ’) CGACGGGTGCTCCTTTAGACGTGTTGGTTACTTCCCCAGTAC A teljes fibrin, kollagén, heparin és sejtkötő domént felölelő FN cDNS-klónok sorozatát azonosítjuk és izoláljuk (9. ábra). A cDNS-fragmenseket pBR322 plazmid EcoRI helyére szubklónozzuk.
Az FN mRNS-t hasonló módon hasították, és ezért az irodalomban különböző hosszúságú cDNS-ek kerültek ismertetésre. A sejtkötő doménnek megfelelő találmány szerinti cDNS-molekulából egy 270 bp szakasz hiányzik az FN fizikai térképén megjelölt 4811-5080. bázis között (teljes, nem hasított cDNS).
2. példa
Fibrinkötő dómén (FBD) polipeptidek kifejezése és tisztítása
A. Parciális FBD 20 kD polipeptid kifejezése
Az 1. példa szerint előállított, és a 9. ábrán bemutatott FN cDNS-klónok nem tartalmazzák azt a DNS-t, amely az FN-molekula 1-190 aminosavját kódolja. Ezek az aminosavak az FBD részét képezik. A 14-472 nukleotidoknak megfelelő és az 1-153 aminosavakat kódoló DNS-t (2A. ábra) hét pár, kémiailag szintetizált nukleotid (3. és 4. ábra) ligálásával állítjuk elő. A szintetikus DNS-fragmens egy ATG iniciátor kondont tartalmaz az 5’ végén, és megfelelő restrikciós helyeket hordoz különböző expressziós vektorokba történő beépítéshez. Az FBD-t kódoló DNS-szekvencia további feldolgozásához a 19. nukleotid helyén álló timidint (T) adeninra (A) cseréljük, és ezáltal az aminosav-szekvencia megváltoztatása nélkül kiiktatunk egy Ddel restrikciós helyet (a nukleotidcsere helyét csillaggal jelöljük a 3A. ábra 1. számú linkeijében). A kapott szintetikus DNS-fragmensnek az EcoRI és BamHI enzimekkel hasított pBR322 plazmidba történő klónozását a 4. ábra mutatja. Az eljárás során a pFN 93218 plazmidot kapjuk. A fibronektin első 153 N-terminális aminosavját kódoló DNS-fragmenst a pFN 93218 plazmidból a pTV 301 plazmidba, egy lambda-PL expressziós vektorba építjük be az Ndel és BglII helyek közé a humán növekedési hormont (hGH) kódoló DNSszekvencia helyére (5. ábra).
A kapott pFN 949-2 plazmidot az ATCC 67831 számon deponáltuk. A pFN 949-2 plazmidot a prototrof Escherichia coli A4255 törzsbe transzformáljuk. A transzformált Escherichia coli sejtek a parciális FBD polipeptidet mintegy 5% mennyiségben fejezik ki az ossz celluláris fehérjére vonatkoztatva. A polipeptid redukált SDS poliakrilamid gélen az ismert méretű molekulákkal összehasonlítva mintegy 20 kD értéknek megfelelő mobilitást mutat. A polipeptid a fibronektin első 153 aminosavját tartalmazza, amit a szintetikus linker által kódolt négy aminosav követ. Ezután több olyan aminosav található, amely a pBR322 vektor átolvasásából származik a TAA terminációs kodon hiánya miatt, (4355-4392) (3967-3999) (4200-4239) (817-850) (1310-1340).
vagyis összesen 153 aminosavat és legfeljebb 20 további aminosavat tartalmaz a további N-terminális metioninnal együtt. A kapott polipeptidet a továbbiakban r20 kD polipeptidnek vagy r20 kD FBD polipeptidnek nevezzük.
B. A „ teljes ” FBD polipeptid kifejezése
Az 1-262 aminosavakat tartalmazó teljes FBD polipeptid kifejezéséhez a következő plazmidokat állítjuk elő:
1. TAA terminációs kodon beépítése a 3 ’ végen
TAA terminációs kodont és BglII hasítóhelyet tartalmazó szintetikus oligonukleotidot, amelynek szekvenciája
5’ CTGTTTAATAAGCA
3’ GACAAATTCGTCTAG a p931-5 FN cDNS kiónból izolált EcoRI-PvuII fragmens 3’ végéhez és a pBR322 vektor EcoRI és BamHI enzimekkel hasított fragmenséhez ligáljuk a 6. ábra szerint. így a pFN935-12 plazmidot kapjuk.
2. Az FBD karboxi-terminális szakaszának szubklónozása lambda-PL expressziós vektorban
Az FBD karboxi-terminális szakaszát kódoló EcoRI-HincII DNS-fragmenst izolálunk a pFN93512 plazmidból, és az EcoRI és Smal enzimekkel emésztett pTV 194-80 plazmidhoz ligáljuk a WO 90/07577 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés szerint (46. ábra). így a pFN 94612 plazmidot kapjuk.
3. Az FN 468-599 nukleotidjának megfelelő DNS szintézise és klónozása
Három pár, kémiailag szintetizált nukleotidot Egálunk a pFN 932-18 plazmidból (4. ábra) izolált EcoRIDdel FN fragmenshez az EcoRI és Xbal enzimekkel hasított pUC19 vektor DNS (Gibco BRL Co.) jelenlétében a fent idézett közrebocsátási iratban leírt módon (47. ábra). így a pFN 948-4 plazmidot kapjuk.
4. A teljes FBD szakaszt kódoló plazmid előállítása Az 1 -262 aminosavakat tartalmazó teljes FBD-t kódoló plazmid előállításához a pFN 948-4 plazmidból FN-t kódoló EcoRI-Xbal DNS-fragmenst izolálunk, és az EcoRI és Xbal enzimekkel emésztett pFN 946-12 plazmidba inszertáljuk a fent idézett közrebocsátási irat szerint (48. ábra. így a pFN-957 plazmidot kapjuk. Ez a plazmid tartalmazza az FBD-t kódoló teljes szekvenciát, de nem fejezi ki az FBD polipeptidet, mivel hiányzik a riboszomális kötőhely (RBS).
5. Az FBD kifejezése lambda-PL promoter és cll RBS szabályozása alatt
A pFN-957 plazmidból izoláljuk az FBD kódoló szakaszt és a T,T2 transzkripciós terminátorokat tartalmazó Ndel-HindlII fragmenst, és az Ndel és HindHI enzimekkel emésztett pTV 301 plazmidba inszertáljuk az idézett közrebocsátási irat szerint (49. ábra). így a pFN 96214
HU 216 302 Β plazmidot kapjuk, amely egy FBD polipeptid kifejezését irányítja a lambda-PL promoter és a cll riboszomális kötőhely szabályozása alatt. A plazmiddal transzformált Escherichia coli A1645 és A4255 törzsek csak kismértékben fejezik ki az FBD polipeptidet. Az FBD polipeptid kifejezése csak Westem-foltanalizissel mutatható ki, amelyhez humán plazmából származó FN-re vonatkozó poliklonális antitesteket alkalmazunk.
6. FBD polipeptid kifejezése lamba-PL promoter és ^i-laktamáz promoter, valamint riboszomális kötőhely szabályozása alatt
Mivel a pFN 962-3 plazmiddal kapott FBD polipeptid kifejeződési szintje alacsony, kiegészítőként olyan DNS-fragmenst alkalmazunk, amely β-laktamáz promotert és β-laktamáz RBS-t kódol (PBLA). A PBLA-t kódoló DNS-fragmenst pBLAll plazmidból (ATCC 39788) izoláljuk, és Ndel enzimmel emésztett, Klenow-enzimmel feltöltött és EcoRI enzimmel emésztett pFN 962-3 plazmidba inszertáljuk (lásd az idézett közrebocsátási iratot). így pFN 975-25 plazmidot kapunk, amit az ATCC 67832 számon deponáltunk. Ezt a plazmidot prototrof Escherichia coli A4255 (F+) törzsbe transzformáljuk.
Az Escherichia coli sejtek a „teljes” FBD polipeptidet mintegy 5-8%-os szinten fejezik ki az ossz celluláris fehérjére vonatkoztatva. A polipeptid SDSPAGE gélen redukáló körülmények között 31 kD látszólagos móltömegnek megfelelő szinten migrál, ezért a továbbiakban 31 kD polipeptidnek vagy r31 kD FBD polipeptidnek nevezzük.
C. Fermentálás és növesztés
Az r31 kD FBD polipeptidet kifejező kiónt dús tápközegen (élesztő extraktum és kazein hidrolizátum) fermentáljuk, amely ampicillint tartalmaz. A növesztést 30 °C hőmérsékleten végezzük. Az expresszálást 42 °C hőmérsékleten 2 órán keresztül végzett hőkezeléssel indukáljuk, és ezek után r31 kD FBD polipeptidet tartalmazó bakteriális sejtmasszát kapunk. Hasonlóképpen az r20 kD FBD polipeptidet kifejező kiónt fermentáljuk, és r20 kD FBD polipeptidet tartalmazó bakteriális sejtmasszát kapunk.
D. Rekombináns fibrinkötő dómén (r31 kD) polipeptid hajtogatása és tisztítása
Az elvégzett folyamat három lépésből áll:
1. A bakteriális sejtmassza nyers feldolgozása
2. Hajtogatás és oxidálás
3. Tisztítás
1. Nyers feldolgozás
A sejtmasszát először 5 térfogatrész 50 mmol/1 Trisz HC1 és 50 mmol/1 nátrium-EDTA (pH=8) elegyben (1. puffer) elroncsoljuk, a pelletet 1,2 térfogatrész
1. számú pufferrel kezeljük, amely 100 mg/1 lizozimot tartalmaz (2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten kevertetjük). A kapott szuszpenzióhoz Triton Χ-100-at adunk (1% koncentrációig), majd 30 percen keresztül szobahőmérsékleten tartjuk, végül centrifugáljuk, a pelletet újra szuszpendáljuk, és vízzel kétszer mossuk. A pellet roncsolása és centrifugálása során a 31 kD polipeptid az SDS-PAGE gélen végzett vizsgálat szerint a pelletben marad.
A mosott pelletet 14 térfogatrész 10 mmol/1 Trisz HC1, 5 mmol/1 EDTA, 2 mmol/1 PMSF és 2 mmol/1 6amino-kaproát (pH=7,5) elegyében (A puffer) szuszpendáljuk, és egymás után 1% decil-szulfátot, 1% decilszulfátot és 5% glicerint, majd 5% glicerint tartalmazó A pufferrel kezeljük. Végül adalékanyag nélküli A puffért használunk.
2. Hajtogatás és oxidálás
A pelletet 6 mol/1 guanidin-hidrokloridban (GuCl) oldjuk tiol redukálószer, így glutation (GSH) jelenlétében, és alacsony GuCl koncentráció mellett oxidált glutation-GSSG hozzáadása mellett hajtogatjuk és oxidáljuk.
Az 1. lépés során kapott, mosott pelletet 150-700 térfogatrész A pufferben felvett 6 mol/1 GuCl és 3 mmol/1 GSH elegyben oldjuk. A GuCl koncentrációját fokozatosan csökkentjük, vagyis először 2 mol/1, majd 1 mol/1, végül 0,5 mol/1 értékre állítjuk, miközben a többi komponens koncentrációját állandó értéken tartjuk a térfogat kivételével, amit ebben a lépésben 500-1000-szeresére állítunk a pellet térfogatához viszonyítva. Az egyik köztes GuCl koncentrációértéknél, vagyis 0,5 mol/1 és 2 mol/1 között a hajtogatást 0,3 mmol/1 GSSG hozzáadásával és szobahőmérsékleten 24-48 órán keresztül végzett inkubálással beindítjuk. A hajtogatott 31 kD polipeptidet ezután adalékanyag nélküli A pufferrel szemben dializáljuk.
3. Tisztítás
A nagy térfogatú elegyben található hajtogatott 31 kD polipeptidet először centrifugálva eltávolítjuk az oldhatatlan pelletet, amely 31 kD polipeptidet nem tartalmaz, majd Trisz HCl-lel szemben (pH = 7,8) dializáljuk, bekoncentráljuk, és heparin/szefaróz oszlopon tisztítjuk.
Az FBD polipeptid fragmensek hajtogatásának, oxidálásának és tisztításának javított eljárását mutatja be az 5. és 10. példa.
3. példa
Az r31 kD, r20 kD, rl8,5 kD és rl2 kD fibrinkötő dómén polipeptidfragmensekfarmakodinamikája A vérrög leképezésének intenzitását és feloldóképességét a radioaktív gyógyszer hatóanyag beépülési aránya és vérből történő kitisztulási mértéke határozza meg. Az r31 kD fibrinkötő dómén metabolikus viselkedésének meghatározásához és a fibronektin (FN) viselkedéséhez történő hasonlításához az r31 kD fibrinkötő domént és a plazmafibronektint 125jód-izotóppal jódozzuk az IC1 módszerrel (24) irodalom, majd intravénásán patkányoknak injektáljuk. A 7. ábrán megadott eredmények a 125jód r31 kD FBD és a 125jód FN farmakokinetikai viselkedését reprezentálják. A vérmintákat a grafikonon megjelölt időpontban vesszük.
A 7. ábra igazolja, hogy a két radioaktív molekula kitisztulási mértéke különböző, és 5 óra elteltével csak 3% r31 kD FBD marad a keringésben a 20% FN-nel szemben.
Néhány kísérleti állatot egyedi metabolikus ketrecben tartunk, és 7 órán keresztül, valamint 24 órán keresztül gyűjtjük a vizeletet és a székletet. A befecsken15
HU 216 302 Β dezett l25jód r31 kD radioaktivitásának mintegy 30%-a a vizelettel kiválasztódik az első 7 órában, és több, mint 90% kiválasztódik 24 óra elteltével. A vizeletben mért teljes radioaktivitás triklór-ecetsavban oldódik, ami proteolitikus lebontásra utal. A különböző szervek (vese, gyomor, máj, tüdő, méh, petefészek, mellékvese, vastagbél, vékonybél, bőr, agy, szem, izom, hólyag, szív, lép, légcső, aorta és vénakáva) vizsgálata szerint specifikus felhalmozódás nem mutatható ki, és a radioaktivitás eltűnésének kinetikája a vérrel azonos mintát mutat. A specifikus radioaktivitás (cpm/g szövet) a legtöbb szervben alacsonyabb, mint a szérumban.
Az eredmények szerint az exogén rekombináns 31 kD aminoterminális FN polipeptid közepes mértékben bomlik le, és választódik ki a szervezetbe. A farmakokinetikai viselkedés nincs összhangban az elsőrendű kinetikával, ami arra utal, hogy a polipeptid közepes mértékben eloszlik a szövetekben és a vértől eltérő testrészekben. Ez abból a megfigyelésből is következik, hogy a lebontás mértéke nem növekszik a 4-24 órás periódusban, vagyis a polipeptid fokozatosan szabadul fel a testrészekből. Az a tény, hogy a metabolitok kizárólagosan és viszonylag gyorsan megjelennek a vizeletben, arra utal, hogy a polipeptid könnyen kiválasztódik a vesék által. Az a tény, hogy az anyag nem halmozódik fel a májban, arra utal, hogy ez a szerv nem jelenti a lebontás fő központját, és nem vesz részt a detoxifikálásban.
Az r31 kD FBD polipeptid viszonylag rövid felezési ideje fontos jellemző a vérrög leképezési diagnosztikája szempontjából. A rekombináns 31 kD FBD polipeptid (r31 kD polipeptid) radioaktív anyaggal vagy más módon jelölhető, és a vérrög leképezése érdekében a vérbe juttatható.
A molekula rövid felezési ideje fontos akkor is, ha vérrögképződés megelőzése érdekében használjuk. A jelenlegi terápiás szerként alkalmazott heparin felezési ideje nagyon hosszú.
Hasonló kísérletet végeztünk a plazmafibronektin jódozott 31 kD fibrinkötő doménjével, és hasonló farmakokinetikai és radioaktivitás eloszlási eredményeket kaptunk.
A 31 kD polipeptidet a plazma-FN hasításával állítjuk elő az alábbi eljárással:
A plazma-FN-t zselatin/szefaróz oszlopon tisztítjuk, ahonnan 1 mol/1 guanidinium-hidrokloriddal eluáljuk, és ebben tároljuk. Ezután 206 mg FN-t 10 mmol/1 Trisz HCl-lel szemben végzett dialízis után 0,01% TPCK tripszinnel emésztünk 37 °C hőmérsékleten 5 percen keresztül. A tripszines emésztéssel kapott elegyet 6 ml DE52 oszlopra visszük, és az átfolyt frakció egyötödét (50 ml) 3 ml CM-szefaróz oszlopra visszük, és nátriumklorid gradienssel (0-0,5 mol/1) eluáljuk. A polipeptid mintegy 80%-a feltárható a só gradiensben (csúcs mintegy 220 mmol/1 értéknél), és a só eltávolítását szolgáló dialízis után a polipeptid felét 1,5 ml heparín/szefaróz oszlopra visszük, és 0,5 mol/1 nátrium-kloriddal eluáljuk. A polipeptid mintegy 75%-a, vagyis közel 1 mg (az elméleti kitermelés mintegy 40%-a) feltárható ebben a frakcióban. Ez a frakció több, mint 90%-ban tiszta 31 kD polipeptid, amit a fent leirt módon jódozunk. Eljárhatunk úgy is, hogy a CM-szefaróz lépést kihagyjuk, és a heparin/szefaróz lépést közvetlenül a DE52 oszlop után alkalmazzuk.
Megjegyezzük, hogy a plazma 31 kD FBD az FN első 259 aminosavját tartalmazza, míg a rekombináns 31 kD FBD az FN első 262 aminosavját és egy további N-terminális metioninmaradékot tartalmaz.
Az r20 kD, rl8,5 kD és rl2 kD fibrinkötő dómén polipeptidek farmakokinetikája
Hasonló kísérletet végzünk a 2., 4., 5. és 10. példa szerint előállított jelölt r20 kD, rl8,5 kD és rl2 kD fibrinkötő dómén polipeptidekkel. A polipeptidek farmakokinetikája nagyon hasonlít az r31 kD polipeptid kinetikájához.
4. példa
További fibrinkötő dómén (FBD) polipeptidek kifejezése és fermentálása
A 2. példában a parciális r20 kD FBD polipeptid és a teljes hosszúságú r31 kD FBD polipeptid kifejezését ismertetjük. A WO 90/07577 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés 24. példája a 31 kD FBD polipeptid hajtogatását és tisztítását ismerteti. Ebben a példában további polipeptid fragmensek kifejezésére alkalmas plazmidok előállítását mutatjuk be.
A. rl2 kD FBD polipeptid kifejezése
A pFN 975-25 plazmid (ATCC 67832) a teljes hosszúságú r31 kD FBD polipeptidet fejezi ki, és ebből a parciális FBD polipeptidet kifejező pFN 1962 plazmidot állítunk elő a 10. ábrán bemutatott módon. Ezt a plazmidot Escherichia coli A1645 törzsbe, majd Escherichia coli A4255 törzsbe transzformáljuk, és az A4255 törzsben ATCC 68328 számon deponáltuk. A transzformált sejtek mintegy 5% mértékben kifejezik a parciális FBD polipeptidet az ossz celluláris fehérjére vonatkoztatva. A polipeptid mobilitása SDS poliakrilamid gélen redukáló körülmények között ismert méretű molekulák mobilitásához viszonyítva mintegy 14,4 kD értéknek felel meg. A polipeptid a fibronektin első 109 aminosavját tartalmazza. Egy további metioninmaradék található a végső polipeptid N-terminális végén. A továbbiakban ezt a polipeptidet rl2 kD polipeptid fragmensnek, vagy rl2 kD FBD polipeptidnek nevezzük.
B. Módosított 12 kD (12 kD’) parciális FBD polipeptid kifejezése
A teljes hosszúságú r31 kD FBD polipeptidet kifejező pFN 975-25 plazmidból (ATCC 67832) módosított rl2 kD polipeptidet (rl2 kD’ polipeptidet) kifejező pFN 197-10 plazmidot állítunk elő a 11. ábrán bemutatott módon. A fibronektin FBD szekvencia módosításával egy Ndel helyet alakítunk ki közvetlenül a 340. nukleotid után. Ezt a plazmidot Escherichia coli A1645 törzsbe, majd Escherichia coli A4255 törzsbe transzformáljuk. A transzformált sejtek mintegy 5% mennyiségben kifejezik a módosított rl2 kD parciális FBD polipeptidet az ossz celluláris fehéijére vonatkoztatva. A polipeptid mobilitása azonos a módosítatlan 12 kD FBD polipeptid mobilitásával, amit redukált
HU 216 302 Β
SDS poliakrilamid gélen határozunk meg. A polipeptid a fibronektin első 109 aminosavját tartalmazza, amit további aminosavként hisztidin és metionin követ. Egy további metioninmaradék található a végső polipeptid N-terminális végén. A polipeptidet a továbbiakban rl2 kD’ polipeptidnek vagy rl2 kD’ FBD polipeptidnek nevezzük.
C. 33 kD sejtkötő doménnel fuzionált módosított r!2 kD ’ FBD polipeptid kifejezése
A módosított 12 kD FBD 3’ végén Ndel helyet hordozó pFN 197-10 plazmidból pFN 202-5 plazmidot állítunk elő, amely a 33 kD sejtkötő doménnel (CBD) fuzionált módosított 12 kD FBD polipeptidet kódolja. Az eljárást a 12. ábra mutatja, ahol a 33 kD CBD fragmenst a pFN 137-2 plazmidból (ATCC 67910) vesszük. A pFN 202-5 plazmidot Escherichia coli A1645 törzsbe, majd Escherichia coli A4255 törzsbe transzformáljuk, ahol az összfehéijére vonatkoztatva 8%-os szinten kifejeződik. A 45 kD polipeptid 33 kD CBD-vel fuzionált 12 kD’ FBD-t tartalmaz (vagyis az FBD első 109 aminosavját hisztidin és metioninmaradék, majd szerinnel kezdődő CBD követi, és a végső polipeptid N-terminális végén egy további metioninmaradék található).
D. DGRGDS aminosav-szekvenciával fuzionált 31 kD
FBD polipeptid kifejezése
A karboxi-terminális végén asp-gly-arg-gly-asp-ser (DGRGDS) szekvenciával fuzionált 31 kD FBD polipeptid kifejezéséhez az alábbi szerkezetet állítjuk elő. A 31 kD FBD polipeptidet kifejező pFN 97525 plazmidot PvuII és HindlII enzimmel emésztjük, és a 13. ábrán megadott szintetikus linkerrel Egáljuk. A kapott pFN 195-4 plazmidot Escherichia coli A1645 törzsbe, majd Escherichia coli A4255 törzsbe transzformáljuk. A sejtek mintegy 8% mennyiségben fejezik ki a 31 kD-DGRGDS polipeptidet az összcelluláris fehérjére vonatkoztatva. A polipeptid szekvenciáját a 13. ábra mutatja.
E. Fuzionált 31 kD FBD-33 kD CBD polipeptid kifejezése
A teljes hosszúságú r31 kD FBD polipeptid és a hozzá kapcsolódó r33 kD CBD polipeptid kifejezéséhez az alábbi szerkezetet állítjuk elő. A 31 kD FBD polipeptidet kifejező pFN 975-25 plazmidot PvuII és HindlII enzimmel emésztjük, és a kapott nagy fragmenst egy szintetikus linkerrel és a pFN 137-2 plazmidból Ndel és HindlII-mal végzett emésztéssel kapott r33 kD sejtkötő doménnel Egáljuk (14. ábra). A kapott pFN 194-2 plazmid a 33 kD CBD polipeptíddel fuzionált r31 kD FBD polipeptidet fejezi ki, A pFN 194-2 plazmidot Escherichia coli A1645 törzsbe, majd Escherichia coli A4255 törzsbe transzformáljuk, és a kapott sejtek kismértékben kifejezik a 64 kD polipeptidet, amely 31 kD FBD polipeptidet, és ehhez kapcsolódó 33 kD CBD polipeptidet tartalmaz. A polipeptid szekvenciáját a 14. ábra mutatja.
Fermentálás és növesztés
Az rl2 kD FBD polipeptidet kifejező kiónt ampicilinnel kiegészített dús közegben (élesztőextraktum és kazeinhidrolizátum) fermentáljuk. A növesztést 30 °C hőmérsékleten végezzük. Az expresszálást 42 °C hőmérsékleten 2 órán keresztül végzett hőkezeléssel indukáljuk, és végül rl2 kD FBD polipeptidet tartalmazó bakteriális sejtmasszát kapunk. Hasonlóképpen állíthatók elő a más fehérjéket tartalmazó sejtmasszák.
F. További plazmidszerkezetek előállítása
1.18, 5 kD FBD polipeptid fragmens
Mint fent említettük (2A példa), a pFN 9492 plazmid (ATCC 68456) által kifejezett 20 kD FBD fragmens legfeljebb 20 további aminosavat tartalmaz a pBR322 vektorból az FN gén végét követő átolvasás miatt a megfelelően lokalizált TAA transzkripciós terminátor kodon hiánya miatt. A 2A. példában leírt 20 kD ffagmensnél autentikusabb „háromujjú” FBD polipeptid fragmens előállítása érdekében 18,5 kD FBD polipeptidet kódoló plazmidot állítunk elő.
Az előállítást a 23. ábra mutatja. A kapott pFN 20813 plazmid 18,5 kD FBD polipeptidet fejez ki a PL promoter és a β-laktamáz riboszomális kötőhely szabályozása alatt. A pFN 208-13 plazmidot Escherichia coli A4255 törzsbe az ATCC 68456 számon deponáltuk. Ez a plazmid a fibronektin első 154 aminosavját fejezi ki további N-terminális metioninmaradékkal együtt.
2. Javított expressziós vektor a 12 kD FBD polipeptid fragmens kifejezésére
A pFN 196-2 plazmid (ATCC 68328) 12 kD FBD polipeptid fragmenst (kétujjú) fejez ki a lambda-PL promoter és a β-laktamáz riboszomális kötőhely szabályozása alatt. A 12 kD fragmens kifejezési szintjének javítása érdekében pFN 203-2 plazmidot állítunk elő a 26. és 27. ábrán bemutatott módon. A pFN 203-2 plazmid a 12 kD fragmenst fejezi ki a lambda-PL promoter, ell riboszomális kötőhely és egy 36 bp trp transzkripciós terminátorszekvencia szabályozása alatt. A pFN 2032 plazmidot Escherichia coli A4255 törzsben az ATCC 68606 számon deponáltuk. A transzformált sejtek mintegy 12-18% szinten fejezik ki a 12 kD FBD polipeptid fragmenst az ossz celluláris fehérjére vonatkoztatva.
3. 31 kD FBD-33 kD CBD fuzionált fehérje magas szintű kifejezése
A pFN 194-2 plazmid 64 kD fuzionált FBD-CBD polipeptidet fejez ki alacsony szinten a lambda-PL promoter és a β-laktamáz riboszomális kötőhely szabályozása alatt. Olyan plazmidot állítunk elő, amely lehetővé teszi a 64 kD polipeptid nagy mennyiségben történő kifejezését a lambda-PL promoter, a ell riboszomális kötőhely és egy 36 bp trp transzkripciós terminátorszekvencia szabályozása alatt. A megfelelő pFN 2055 plazmid előállítását a 25. ábra mutatja.
A fenti expressziós plazmidok (1-3) fermentálását és növesztését lényegében a többi FBD polipeptid esetében leírt módion (2C példa) végezzük. A tisztítást és a hajtogatást az 5. és 10. példa ismerteti.
5. példa
Rekombináns 20 kD és 12 kD fibrinkötő polipeptidek hajtogatása és tisztítása
Az r20 kD és az rl2 kD polipeptidek hajtogatását és tisztítását három lépésben végezzük:
HU 216 302 Β
1. A baktérium sejtmassza nyers tisztítása.
2. Hajtogatás és oxidálás.
3. Tisztítás.
1. Nyers tisztítás
1.1 A pellet mosása és extrahálása
A bakteriális sejtmasszát, amit az r20 kD polipeptid vonatkozásában a 2. példában leírt módon, és az rl2 kD polipeptid vonatkozásában a 4. példában leírt módon állítunk elő, roncsoljuk, és lényegében az r31 kD polipeptid ismertetésénél alkalmazott módon mossuk (WO 90/07577 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés), azzal a különbséggel, hogy némi módosítást hajtunk végre az extrakciós folyamatban az r20 kD és az rl2 kD polipeptidek esetében. A következőkben az r20 kD polipeptid bakteriális sejtmasszájának mosását és extrahálását ismertetjük, az rl2 kD polipeptid esetében ugyanezt az eljárást alkalmazzuk.
1.2 Eljárás
Az r20 kD polipeptidet tartalmazó bakteriális sejtmasszát a 2. példában a pFN 949-2 plazmidot hordozó Escherichia coli A4255 törzs fermentálásánál leírt módon állítjuk elő. A bakteriális sejtmassza egy részét (14,8 g) 10 térfogatrész 50 mmol/1 Trisz HC1, és 50 mmol/1 EDTA elegyében (B puffer, pH=7,5) szuszpendáljuk. A szuszpenziót 15-30 másodpercen keresztül közepes sebességen homogenizáljuk, majd háromszor 4 percen keresztül ultrahanggal besugározzuk, végül 15000 fordulatszám mellett 30 percen keresztül centrifugáljuk. A pelletet 2,4 térfogatrész (36 ml) B pufferben szuszpendáljuk. Hozzáadunk 0,1 mg/ml lizozimot, és a szuszpenziót vízfürdőn 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk kevertetés közben. Ezután Triton X-100-at adunk hozzá 1 % végső koncentrációig, szobahőmérsékleten 30 percen keresztül kevertetjük, majd centrifugáljuk. A pelletet háromszor 148 ml vízben (vagyis az eredeti pellettérfogat tízszeresében) szuszpendáljuk, homogenizáljuk, 30 percen keresztül szobahőmérsékleten kevertetjük, és centrifugáljuk. A végső pellet mennyisége mintegy 1,5 g, vagyis az eredeti tömeg 10%-a, de a pelletben megtalálható az r20 kD és az rl2 kD polipeptid, amit SDS poliakrilamid gélelektroforézissel ellenőrzünk. A mosott és extrahált pelletet -20 °C hőmérsékleten tároljuk.
2. Az extrahált pellet szolubilizálása és hajtogatása
2.1 A hajtogatáshoz és oxidáláshoz az r31 kD polipeptidnél említettől eltérő reagenseket és eljárást alkalmazunk. Az r20 kD vagy az rl2 kD polipeptid extrahált pelletét 6 mol/l guanidin-hidrokloridban (GuCl) oldjuk 50 mmol/1 β-merkapto-etanol jelenlétében, majd tízszeresére hígítjuk, és levegőn oxidáljuk.
2.2 Eljárás
1,5 g fagyasztott r20 kD pelletet szolubilizálunk, és 10 tömegrész 10 mmol/1 Trisz-HCl és 5 mmol/1 EDTA elegyében (C puffer, pH=8,0) homogenizáljuk, ahol az elegy további 6 mol/l guanidin-HCl-t tartalmaz. A mintát 50 μΐ hígítatlan β-merkapto-etanol hozzáadásával (végső koncentráció 50 mmol/1) redukáljuk, és levegő kizárása mellett, vagyis lezárt edényben 30 percen keresztül kevertetjük. Ezután mintegy 5 ml/perc sebességgel 10 térfogatrész (148 ml) C pufferhez csepegtetjük (pH=8,0), és folyamatos óvatos kevertetés mellett nyitott edényben 48-72 órán keresztül szobahőmérsékleten oxidáljuk. Eljárhatunk úgy is, hogy az oxidálást zárt edényben 0,3 mmol/1 GSSG jelenlétében végezzük. Bár ebben a lépésben kevés polipeptid csapadék leválik, a szuszpenziót a csapadékkal együtt 24 órán keresztül 15 térfogatrész C pufferrel (pH=8,5) szemben dializáljuk, amelynek során a puffért háromszor cseréljük. A dializált anyagot 45 percen keresztül 15 000 fordulatszámon (22 500 g) centrifugáljuk JA17 rotorral ellátott nagy sebességű Beckman-centrifügán. Ezzel az eljárással eltávolítjuk a legtöbb szennyező fehérjét, és aggregáljuk az r20 kD vagy rl2 kD polipeptidet, amely oxidált állapotban található az elegyben.
3. Tisztítás és jellemzés
Mivel a fibrinkötő doménen belül ismeretlen a heparinkötő hely elhelyezkedése, nem lehet előre tudni, hogy az új rövid r20 kD és rl2 kD polipeptidek kötődnek-e heparin/szefaróz oszlopon. Azt találtuk, hogy a rövidebb molekulák megkötődnek a heparin/szefaróz oszlopon.
Azt találtuk továbbá, hogy az r31 kD polipeptidtől eltérően nincs szükség fenil/szefaróz oszlopos tisztításra az oxidált r20 kD vagy rl2 kD polipeptid tisztítása során. A gyakorlatban az anyag közvetlenül heparin/szefaróz oszlopon tisztítható, de jelentős javulás érhető el a szennyezőanyagok, helytelenül hajtogatott molekulák és dimerek eltávolítása vonatkozásában, ha a mintát Q-szefaróz oszlopon kromatografáljuk a heparin/szefaróz oszlopos kromatografálás előtt. Bizonyos esetekben a polipeptidet Pellicon rendszeren (Millipore Corp.) koncentráljuk, amelynek során megfelelő küszöbértékű membránokat használunk. így például 10 kD értékű membránt használunk az r20 kD polipeptid esetében, és 3 kD értékű membránt használunk az rl2 kD polipeptid esetében a Q-szefaróz oszlopra történő felvitel előtt. A heparin/szefaróz oszlop is használható a két polipeptid koncentrálásához. A továbbiakban az r20 kD polipeptid esetében alkalmazott tisztítási eljárást részletezzük.
3.1 Q-szefaróz kromatografálás
Az oxidált r20 kD polipeptid egyharmadát (47 ml) 10 ml-es Q-szefaróz gyorsan áramló oszlopra visszük, amit előzetesen C pufferrel szemben (pH=8,5) egyensúlyoztunk ki 1,2 ml/perc áramlás mellett. Az átfolyó frakciót összegyűjtjük, és tároljuk (70 ml). Az oszlopon kötött polipeptidet 0,5 mol/l nátrium-kloridot tartalmazó C pufferrel (pH = 8,5) eluáljuk, és az oszlopot 0,5 mol/l nátrium-hidroxiddal regeneráljuk.
3.2 Heparin/szefaróz kromatografálás
A Q-szefaróz oszlopon átfolyt frakciót 10 ml heparin/szefaróz oszlopra visszük, amit előzetesen pH=8,5 pufferrel egyenlítünk ki 0,5 ml/perc áramlás mellett. Az átfolyt frakció főként szennyező anyagokat és hibásan hajtogatott r20 kD polipeptidet tartalmaz. A tisztított (tisztaság legalább 95%) r20 kD polipeptidet 0,5 mol/l nátrium-kloridot tartalmazó C pufferrel (pH=8,5) eluáljuk, és az oszlopot 6 mol/l guanidin18
HU 216 302 Β hidrokloridot tartalmazó fenti pufferrel regeneráljuk. Az r20 kD polipeptid tisztításának adatait az A táblázatban, az rl2 kD polipeptid tisztításának adatait a B táblázatban adjuk meg.
3.3 Jellemzés
Az r20 kD polipeptid és az rl2 kD polipeptid előállítása során kapott bakteriális sejtmassza feldolgozásánál keletkezett felülúszót, valamint az ezt követő oszlopkromatográfiás vizsgálatoknál nyert frakciók alikvot részében SDS poliakrilamid gélelektroforézissel vizsgáljuk a polipeptideket, amelynek során az elúciós profilokat szuperóz 12 oszlopon FPLC vagy HPLC technikával vesszük fel. A hajtogatás és a tisztítás különböző lépéseinél felvett profilokat az r20 kD polipeptid esetében a 21. ábrán, és az rl2 kD polipeptid esetében a 22. ábrán adjuk meg. A tisztított r20 kD vagy rl2 kD polipeptid éles csúcsban eluálódik. Ez a profil összhangban van az SDS-PAGE gélen nem redukáló körülmények között kapott eredményekkel, amikor is az r20 kD és az rl2 kD polipeptidek sávja nem diffúz, és egyetlen molekulaformára utal. Az r20 kD polipeptid esetében a nem redukált polipeptid sávja (az r31 kD polipeptidhez hasonló módon) gyorsabban halad, mint a redukált forma sávja, ugyanilyen hatás látható az r31 kD polipeptid esetében. Nem figyelhető meg ilyen különbség az rl2 kD polipeptid esetében. Az FBD polipeptidek további jellemzőit all. példában adjuk meg.
Ezek az FBD polipeptidek radioaktív anyaggal jelölhetők, és így radioaktív gyógyszerhatóanyagként alkalmazhatók vérrög és ateroszklerotikus sérülés leképezésére.
A kisebb (r20 kD és r 12 kD) FBD polipeptideknek a fenti célra történő alkalmazása előnyösebb a nagyméretű r31 kD polipeptid alkalmazásánál, mivel jelentős sikereket értünk el a kisméretű molekulák előállítására szolgáló eljárás és egyszerűsítésében. Az r20 kD és rl2 kD polipeptidek hajtogatására és tisztítására fent is15 mertetett eljárás ugyanis gyorsabb és egyszerűbb, mint az r31 kD polipeptid hajtogatása és tisztítása. Emellett, ezek a módszerek nagyobb kitermelést eredményeznek, mint az r31 kD polipeptid esetében, és nagyobb koncentráció érhető el a polipeptid vonatkozásában a rövi20 debb FBD polipeptid fragmensek esetében (egészen 10 mg/ml koncentrációig).
Az FBD polipeptid fragmensek hajtogatására és tisztítására szolgáló javított eljárást a 10. példában ismertetjük.
A táblázat kD FBD polipeptid tisztítása
Lépés Térfogat (ml) Fehérje- koncentráció (mg/ml) Összfehérje (mg) Tisztaság (%)a) FBD mennyiség (mg) Kitermelés (%) A tisztítás mértéke
Szolubilizált és redukált pellet 14,8 12,4 183,5 35 64,2 100 1
Oxidált felülúszó 148 0,72 106,5 45 48,0 74,7 1,3
Oxidált felülúszó (1/3) 47 33,8 15,2
Q-szefaróz átfolyás 70 0,20 14,0 80 11,2 54,9 2,3
Heparin-szefaróz 0,5 mol/1 NaCl 9 0,71 6,1 98 6,0 29,4 2,8
a: Becsült érték a redukált körülmények között végzett SDS-PAGE gélvizsgálat és a szefaróz 12 elúciós profil alapján
B táblázat r20 kD FBD polipeptid tisztítása
Lépés Térfogat (ml) Fehérje- koncentráció (mg/ml) Összfehérje (mg) Tisztaság (%) a) FBD mennyiség (mg) Kitermelés (%) A tisztítás mértéke
Szolubilizált és redukált pellet 100 6,66 666 10 66,6 100 1
Oxidált b) felülúszó 500 0,20 100 58 58,0 87,1 5,8
Q-szefaróz átfolyás 500 0,13 65 80 52 78,1 8,0
Heparin-szefaróz 0,5 mól/lNaCl 14 0,75 10,5 98 10,3 15,4 9,8
a : Becsült érték a redukált körülmények között végzett SDS-PAGE gélvizsgálat és a szefaróz 12 elúciós profil alapján, b: Pellicon rendszeren koncentrálva.
HU 216 302 Β
6. példa
Az r31 kD, r20 kD és r!2 kD fibrinkötő dómén polipeptidek biológiai aktivitása
Az r31 kD FBD biológiai aktivitását a WO
90/07577 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés ismerteti az in vivő és in vitro fibrinröghöz történő kötődés, baktériumokhoz történő kötődés, és az extracellulárís mátrixhoz történő kötődés vonatkozásában. Ebben a példában további eredményeket mutatunk be az r31 kD polipeptidre vonatkozóan, és bemutatjuk a 20 kD és a 12 kD FBD polipeptidek biológiai hatását.
A példában a rekombináns fibrinkötő domének fibrinröghöz történő kötődését az alábbiak szerint méijük:
'25jód-rFBD (r31 kD, r20 kD vagy r!2 kD) kötődése előre kialakított fibrinröghöz (II kétlépéses reakció)
1. lépés:
Fibrinrög kialakítása
Ez két módon valósítható meg:
(a) 37 °C hőmérsékleten 20 μΐ citrátozott humán teljes vért 5 mmol/1 kalcium-kloriddal, 1 egység/ml trombinnal és PBS-sel inkubálunk 250 μΐ végső térfogatban. A reakciót 45 perc elteltével centrifugálással leállítjuk, és a pelletet kétszer 1 ml PBS-sel mossuk.
(b) 37 °C hőmérsékleten 20 μΐ nem citrátozott teljes humán vért (natív vér) inkubálunk. A reakciót 150 perc elteltével centrifiigálással leállítjuk, és a pelletet az (a) pontban leírt módon mossuk.
2. lépés
125I-FBD polipeptid kötődése az előre kialakított fibrinröghöz
A rögöket 37 °C hőmérsékleten 250 μΐ PBS-ben 125I-rFBD polipeptiddel inkubáljuk. Az elegyhez további komponensek adagolhatok az egyes kísérleteknél részletezett módon. A kötési reakciót 45 perc elteltével centrifiigálással megállítjuk, és az elegyet háromszor PBS-sel mossuk. A 125I-rFBD-fibrin pelletet tartalmazó csövek radioaktivitását gamma-számlálóban méijük.
Eredmények
A. l25jóddal jelölt r31 kD FBD metabolikus stabilitása patkányban: ex vivő fibrinkötődés a TCA oldhatatlansághoz viszonyítva
Patkányoknak intravénásán 125jód-izotóppal jelölt r31 kD FBD polipeptidet injektálunk, és a megadott időpontokban vérmintát veszünk, és nátrium-citráthoz adjuk. A vérminta alikvot részét az alábbiak szerint kezeljük:
a) 20% TCA-val kezeljük és az oldhatatlan TCA részeket mérjük, vagy
b) előre kialakított röggel inkubáljuk (20 μΐ teljes vért használunk a kontroll patkánytól), majd a 125jód 31 kD FBD kötődését II kétlépéses reakciónál ismertetett módon méijük.
A radioaktivitást gamma-számlálóban mérjük, és az egyes minták hatékonyságát a reakcióelegyben mért összcpm százalékában fejezzük ki.
A 18. ábrán megadott eredmények szerint megfelelő összhang mutatható ki az r31 kD polipeptid fizikai bomlása (a TCA oldhatatlanság csökkenése) és funkcionális bomlása (a fibrinröghöz történő ex vivő kötődés csökkenése) között. Jelentős különbség mérhető azonban az összehasonlító vizsgálatok első lépésében, 30 perc időpontban a funkcionális bomlás mértéke többszöröse a fizikai bomlás mértékének. Ezek az eredmények, amelyek feltételezik, hogy a funkcionális stabilitás sokkal gyorsabban romlik, mint a fizikai lebontás, magyarázhatók azzal, hogy az FBD és a fibrinrög közötti kovalens reakció fő helye az FBD molekula 3. számú aminosavjánál elhelyezkedő glutaminmaradék, amely az 1. típusú homológ szerkezeten kívül elhelyezkedő 20 aminosav között található, és az FBD dómén maradék részére jellemző tercier szerkezet nem védi.
B. ríl kD fibrinhez történő kötődésének specifikussága : a transz-glutamináz hatása
A plazmafíbronektin fibrinkötő doménje és a rögben lévő fibrin között kialakuló kovalens kötés főként a fibronektin 3. számú aminosavjának (glutamin) a fibrinnel szembeni reakcióján alapul, ezt a kötési reakciót a transz-glutamináz enzim szabályozza, amely specifikus módon felismeri a glutaminmaradékot tartalmazó aminosav-szekvenciát.
A következő kísérletet végezzük el annak igazolására, hogy a transz-glutamináz részt vesz a rekombináns r31 kD FBD polipeptidnek a röghöz történő kötődésében. A kísérlet során exogén transz-glutaminázként tengerimalac máj transz-glutaminázt (Sigma) alkalmazunk.
μΐ teljes humán vérből fibrinrögöt képezünk, és a vizsgált molekulák kötődését 0,3 pmol/l oldatban transzglutamináz jelenlétében és távollétében mérjük a II kétlépéses reakcióban. A vizsgálatban a l4C-putreszcinr31 kD FBD polipeptidet, a 125jód-r31 kD FBD polipeptidet és kontrollként l25jód rekombináns boíjú-növekedési hormont vizsgálunk. A l4C-putreszcin-r31 kD fehéqekomplexet, ahol a 3. helyzetű glutaminmaradék a 14C-putreszcinnel kialakított kovalens reakció következtében blokkolva van, az alábbiak szerint állítjuk elő:
pmol/l r31 kD FBD polipeptidet, 10 mmol/1 kalcium-kloridot, 0,015 egység/ml transz-glutaminázt és 60 pmol/l 14C-putreszcint (specifikus aktivitás 100 mc/mmól) tartalmazó oldatot 37 °C hőmérsékleten inkubálunk 5 órán keresztül. A 31 kD FBD polipeptidbe beépült 14C-putreszcin mennyiségét a reakció oldat alikvot részének TCA kicsapása alapján mérjük. Az eredmények szerint az r31 kD fehéqébe 2,83 pmol/l 14C-putreszcin oldatnak megfelelő mennyiség épült be. Ez azt jelenti, hogy az FBD 3. helyzetében található glutamin több, mint 90%-a kovalens reakcióba lépett a 14C-putreszcinnel. A 14C-putreszcin r31 kD anyagot 0 °C hőmérsékleten tároljuk, és néhány napon belül további kezelés nélkül felhasználjuk. Az r31 kD FBD polipeptidet és a 131 843 számú európai közrebocsátási irat szerint előállított kontroll rekombináns borjú-növekedésihormon analógot (bGH) 125jód-izotóppal jelöljük a 3. példában ismertetett IC1 módszerrel.
Eredmények
A II kétlépéses reakcióban transz-glutamináz jelenlétében és távollétében meghatározzuk a kötött radioak20
HU 216 302 Β tivitást, és a transz-glutamináz jelenlétében mért radioaktivitást a transz-glutamináz távollétében mért radioaktivitáshoz viszonyítjuk minden vizsgált polipeptid esetében. Ez az arány jelentős különbséget mutat akkor, ha a 31 kD FBD polipeptidet a putreszcin FBD polipeptidhez (blokkolt FBD polipeptid) vagy a kotroll bGHhoz viszonyítjuk. Ez utóbbi két esetben az arány egyhez közelít, ami arra utal, hogy a transz-glutamináz nem befolyásolja a kötődést, és a rögben mérhető összcpm a reakcióelegyben mérhető összcpm 10-15%-a. Az ép 31 kD FBD polipeptid esetében az arány sokkal nagyobb, mint egy (az arány a különböző kísérletekben 1,8-7 között változik az alkalmazott vér és transzglutamináz minőségétől és frissességétől függően), a rögben mért összcpm a reakcióelegyben mért összcpm 40-70%-a, ami azt jelenti, hogy a transz-glutamináz nagymértékben növeli az r31 kD polipeptidnek a vérröghöz történő kötődését.
Az eredmények igazolják a 3. helyzetben található szabad glutamin hatékonyságát az r31 FBD polipeptidnek a fibrinröghöz történő kötődésében transzglutamináz jelenlétében.
Más kísérletek igazolják, hogy a II kétlépéses reakcióhoz adagolt transz-glutamináz növeli az r20 kD és az rl2 kD polipeptideknek a röghöz történő kötődését, ami összhangban van az r31 kD polipeptid esetében megfigyelt eredményekkel.
C. r31 kD FBD/fibrin komplex jellemzése SDS poliakrilamid gélelektroforézissel Az r31 kD polipeptidnek a fibrinröghöz történő kötődése során keletkező komplex méretének meghatározásához a következő vizsgálati sorozatot végezzük el. Rögöket állítunk elő 20 μΐ teljes humán vérből (A) vagy 250 μΐ 0,8 μιηοΐ/l humán fíbrinogén oldatból (B). A fíbrinogén kísérletek némelyikében fogászati hurkot (7. példa) adunk a csőhöz a fibrinogénnel együtt.
A 125jód-r31 FBD polipeptidnek a fibrinröghöz történő kötődését a fenti II kétlépéses reakcióval mérjük 0,15 pmol/l 125jód-r31 kD FBD és 5 mmol/1 kalcium-klorid jelenlétében. A reakciót háromszoros PBS mosással záijuk le. A pelletet a különböző kezelések után centrifugáljuk, és a felülúszóból (vagyis az oldható anyagból) 15 μΐ alikvot részt poliakrilamid gélelektroforézissel elválasztunk, amelynek során szeparáljuk a 106 feletti móltömegű anyagot a 105 feletti móltömegű anyagtól és az alacsonyabb móltömegű anyagoktól. A kapott autoradiogramról a következők olvashatók le:
Transz-glutamináz jelenlétében nagy tömegű r31 kD/fibrinkomplex keletkezik, amely az erősen ionos detergens SDS és a kénhidakat redukáló βmerkapto-etanol jelenlétében ellenáll a forralásnak.
Emellett, ha 4 mol/1 karbamidot adunk a forralt reakcióelegyhez, akkor a nagy móltömegű forma (106 feletti) kvantitatív módon közepes móltömegű formává (100000 feletti) alakul, mint ez a nagy móltömegű fibrinrög hidrofób kötésű aggregátjainál feltételezhető volt. A szabad r31 kD polipeptid mennyisége a rögben a normálisnak megfelelő alacsony értéken marad, ez az anyag csak a foszfát pufferolt sóoldattal végzett forralás során szabadul fel. A közepes móltömegű formának a további karbamidos kezeléssel szemben mutatott ellenállóképessége igazolja a )25jód-r31 kD és a fibrin közötti kovalens kapcsolatot.
D. A fibronektin és a heparin hatása a ,25jöd-r31 kD és az előre kialakított fibrinrög közötti kötődésre
i) A fibronektin (FN) hatása
A humán plazma lényeges mennyiségű FN-t (300 pg/ml) tartalmaz, amelyről feltételezhető, hogy a 125jód-r31 kD polipeptid mellett részt vesz a kialakított rög megkötésében. Az ilyen kompetitív kötődés befolyásolhatja a rög radioaktív jelölésének hatékonyságát, és ezáltal a leképezési eljárást. Az FN hatásának vizsgálatához 0,15 pmol/l l25jód-r31 kD polipeptidet adagolunk 1 pmol/l tisztított FN-nel együtt az előre kialakított röghöz PBS-ben. Bár az FN-t a 125jód-r31 kD polipeptidhez képest hétszeres feleslegben adagoljuk, ez utóbbi polipeptid kötődése csak kismértékben változik (20%-os gátlás). Az a megfigyelés, hogy a feleslegben alkalmazott FN sem befolyásolja a J25jód-r31 kD polipeptid kötődését, két módon magyarázható:
A rögben feleslegben vannak azok a keresztkötésre alkalmas helyek, amelyek felhalmozzák az FN molekulát és a 125jód-FBD polipeptidet, vagy az FBD affinitása a rög vonatkozásában sokkal nagyobb, mint az FN aktivitása. A különböző megfigyelések alapján feltételezzük, hogy mind a kötőhelyek feleslege, mind a 125jódr31 kD nagyobb affinitása szerepet játszik a röghöz történő kötődésben a plazmakoncentrációnak megfelelő FN jelenlétében.
ii) A heparin hatása
Különböző radioszcintigráfikus szerek, így a 11'In izotóppal jelölt vérlemezkék, és a jelölt fíbrinogén hatástalanok terápiás heparin jelenlétében. Szükség volt tehát arra, hogy a heparin hatását vizsgáljuk a 125jódr31 kD polipeptidnek a rögbe történő beépülésére. Az eredmények szerint a heparin nem gyakorol szignifikáns hatást az r31 kD FBD polipeptid és az előre kialakított rög közötti kötődésben. Más kísérletek azonban azt igazolják, hogy azonos mennyiségű heparin jelentős mértékben befolyásolja az r31 kD polipeptidnek a fibrinröghöz történő kötődését, például az I. típusú reakcióban.
E. Különböző rekombináns FBD polipeptidek és plazma FBD polipeptid kötődésének összehasonlítása előre kialakított rögben
Az előre kialakított rögnek különböző rekombináns
FBD polipeptidekhez (r31 kD, r20 kD és rl2 kD) és plazma 31 kD FBD polipeptidhez történő kötődése összehasonlításához kísérleti sorozatot végzünk a II kétlépéses reakció alapján (19. ábra). Az eredmények szerint a plazma 31 kD polipeptid hasonló módon kötődik, mint az r31 kD polipeptid, míg az r20 kD polipeptid és az rl2 kD polipeptid kötődési szintje mintegy fele a nagy molekula (31 kD) kötődési szintjének. Az r20 kD és az rl2 kD polipeptidek kötődési szintje még mindig kielégítően magas ahhoz, hogy a radiojelölésű r20 kD és rl2 kD polipeptidet radioaktív gyógyszer hatóanyagként alkalmazzuk vérrög leképezéséhez. Az r31 kD-DGRGDS polipeptiddel (4D példa
HU 216 302 Β és 13. ábra) végzett hasonló kísérletek szerint ez a polipeptid körülbelül ugyanolyan szinten kötődik, mint az r31 kD polipeptid.
F. !25-jód-rl2 kD polipeptid kötődése friss vagy fagyasztott röghöz
A következő kísérletben vizsgáljuk, hogy a rög fagyasztása milyen mértékben befolyásolja az FBD polipeptidek kötődését. A frissen előállított vagy -70 °C hőmérsékleten tárolt fibrinrögöket II kétlépéses reakcióban 125jód-rl2 kD FBD polipeptidhez (5. példa) kötjük.
A kísérletet a 15. ábrán bemutatott módon végezzük transz-glutamináz jelenlétében vagy távollétében. A 20. ábra szerint a fagyasztás csak kismértékben változtatja meg az rl2 kD FBD polipeptid röghöz történő kötődését. A fagyasztott rög transz-glutamináz adagolása nélkül hasonlóképpen kötődik, mint a friss rög transzglutamináz jelenlétében, nem befolyásolja a kötődési reakciót, ha exogén transz-glutaminázt adagolunk a fagyasztott röghöz, feltehetően ezért, mert a fagyasztott vörös vérsejtekből endogén transz-glutamináz szabadul fel.
Mint a B. pontban említettük, az exogén transzglutamináz adagolása a II. reakcióban különböző válaszokat vált ki.
G. ,25jód-r31 kD FBD polipeptid előre kialakított röghöz történő kötődésének feltételei
A 125jód-r31 kD polipeptid előre kialakított röghöz történő kötődésének feltételei meghatározásához az alábbi vizsgálati sorozatot végezzük. Vizsgáljuk a 125jód-r31 kD polipeptidnek a citrátozott vagy natív vérből kialakított röghöz történő kötődését a II kétlépéses reakcióban, és különböző komponensek (kalcium, hirudin, transz-glutamináz) jelenlétében és távollétében. A citrátozott vér és a natív vérrög esetén kapott eredmények hasonlóak, bár az r31 kD polipeptid kötődése nagyobb a citrátozott vér esetében.
A hirudin (Sigma) specifikus módon gátolja a trombin által közvetített reakciókat, és ezért hirudin adagolásával vizsgálható a trombinnak a kötődési reakcióra (két lépés) gyakorolt hatása. A hirudin adagolása nem befolyásolja a kötődést, ami azt jelenti, hogy a trombin nem gyakorol hatást az r31 kD polipeptidnek a röghöz történő kötődésére. Azonos mennyiségű hirudin azonban teljes egészében gátolja a kötődést akkor, ha az első lépésben, vagyis a fibrin fibrinogénből történő kialakulása során adagoljuk.
Ezek az eredmények azt is igazolják, hogy az exogén transz-glutamináz növeli az r31 kD FBD polipeptidnek röghöz történő kötődését, és azt, hogy ez a transz-glutamináz reakció kalciumionok jelenlététől függ. Mivel az alkalmazott exogén transz-glutamináz egy szövet transz-glutamináz (aktív formában), feltételezhető, hogy a szérum transz-glutamináz, a XIII. faktor, amely a trombin aktiváló hatására XHIa faktorrá alakul, erősen érzékeny a hirudin gátló hatására.
H. ,25jód-r3l kD FBD polipeptidnek extracelluláris mátrixhoz (ECM) történő kötődésének feltételei
A 125jód-r31 kD polipeptidnek az endotéliás sejtek extracelluláris sejtmátrixához (ECM) történő kötődését a WO 90/07577 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés ismerteti. Ezt a kötődési folyamatot tovább jellemeztük 0,3 pmol/l 125jód-r31 kD FBD polipeptidnek ECM-hez történő kötődésének vizsgálatával exogén transz-glutamináz jelenlétében és távollétében; emellett a transz-glutamináz jelenlétében történő kötődést vizsgáltuk heparin, fibronektin és spermadin jelenlétében.
A kapott eredmények szerint az r31 kD FBD polipeptidnek az ECM-hez történő kötődését fokozza transz-glutamináz hozzáadása. A heparin nem gyakorolt szignifikáns hatást a kötésre, míg a spermadin, a transz-glutamináz ismert inhibitora, gátolja a kötést. A kollagén szintén gátolja a kötést, ami arra utal, hogy a kollagén akceptor molekulaként működik az endotéliás sejtek mátrixán. A fibronektin csak kis hatást gyakorol a kötési reakcióra.
Ezek az eredmények ismét alátámasztják a radioaktív jelölésű rekombináns FBD polipeptidnek a felhasználhatóságát a kezdeti plakk-képződésnek lecsupaszított vérerekben történő leképezésére. A fibronektin FBD különböző polipeptid fragmenseinek biológiai hatását további kísérletekkel igazoljuk a 9. példában.
7. példa
Rekombináns l25jód-31 kD FBD és fragmenseinek felvétele rozsdamentes acélhurokkal indukált vénás vérrögben patkányoknál
Patkányokban rozsdamentes acélhurokkal indukált vénás vérrög modellt használunk a jelölt r31 kD, r20 kD és r 12 kD FBD polipeptidek felvételének tanulmányozásához. Az alkalmazott kísérleti modellt közelebbről Maffrand a munkatársai ismertetik [Thrombosis and Haemostasis 59, 225-230 (1988)],
A kísérlet részletes ismertetése
A. !25jód-31 kD polipeptid felvételének vizsgálata rozsdamentes acélhurokkal indukált vénás vérrögben
Wistar típusú nőstény patkányokat (200-250 g) ketamin HC1 és xilazin HC1 adagolásával elaltatunk. Középvonali, alhasi bemetszést végzünk, és az alsó vénakávát eltávolítjuk. Egy rozsdamentes acélhurkot (fogászati pasztahordozó, finomság 31, hosszúság 21 mm) vezetünk be a véna üregébe közvetlen az elágazás mellett, és a bemetszést elvanjuk. A beépített eszközöket előzetesen egyenként leméijük, és a tömegüket feljegyezzük. 3 órával a műtét után az állatoknak i.v. injekció formájában 1 ml 0,9% nátrium-jodid oldatot adunk a tiroid jódüreg telítése érdekében. 1 órával később a patkányoknak i.v. injekció formájában 125jód-r31 kD FBD polipeptidet (5xl06 cpm, 100 pg/kg) adunk. Az r31 kD polipeptidet a 3. példában leírt módon jelöljük. A jelölt polipeptid adagolását követő 24 óra elteltével szívcsapolással vért veszünk, majd az állatokat megöljük. A hurkot tartalmazó vénaszegmenst eltávolítjuk, amelynek során ügyelünk arra, hogy a maradék vért távol tartsuk. Az egyik csoportban a hurkot tartalmazó szegmenst leméijük és meghatározzuk a radioaktivitás mértékét (trombusz in situ csoport). Egy másik csoportban a vénás szakaszt hosszában felvágjuk, a vérrögöt tartalmazó hurkot óvatosan eltávolítjuk, leméijük, és meghatározzuk a radioaktivitást. A vér radioaktivitásszintjét perifériás vérben mérjük.
HU 216 302 Β
Az eredmények számítása
A két csoportban a hurok kezdeti tömegét levonjuk a végső tömegből, és a specifikus radioaktivitást a cpm értéknek a nettó tömeggel történő elosztásával számoljuk. Szintén meghatározzuk a perifériás vérminta specifikus aktivitását.
Eredmények óra elteltével a vérben mérhető radioaktivitás 5000-10 000 cpm/g, míg az izolált vérrög specifikus radioaktivitása kereken 300000 cpm/g, vagyis 30-60szor nagyobb (16. ábra). Ha a hurkot tartalmazó teljes vénaszegmenst analizáljuk, és az úgynevezett specifikus radioaktivitásértékét meghatározzuk, a kapott értékek 4-5-ször nagyobbak, mint a vér esetében kapott értékek, ami azt jelenti, hogy megfelelő jel/zaj viszony kapható a vérrög jelölt r31 kD FBD polipeptiddel végzett in vivő gamma-kamerás leképezésénél.
A heparinos előkezelés hatását ebben a modellben tanulmányozzuk. Az ilyen típusú kísérlet azért lényeges, mivel a vérrög leképezésére jelölt betegek gyakran antikoagulációs szert kapnak. A kérdés tanulmányozásához a patkányok egy csoportját heparinnal (500 egység/patkány intravénásán) kezeljük 10 perccel ajelölt polipeptid adagolása előtt. A heparinkezelés nem befolyásolja a jelölt anyag felvételét, mint ezt a 24 órás mérési eredmények igazolják.
A kapott eredmények szerint az FN FBD alkalmazásával végzett vérrögleképezés heparin jelenlétében is megvalósítható.
B. A rekombináns 12 kD, 20 kD és 31 kD-FBD polipeptidek összehasonlítása rozsdamentes acélhurokkal indukált vénás vérrög modellben A három rekombináns polipeptidet 125jóddal jelöljük a 3. példában leírt módon, és patkány modellben használjuk az A. pontban leírt módon. A 17. ábrán bemutatott eredmények szerint mindhárom molekula specifikusan lokalizálódik a vérrögben a vérhez viszonyítva, ami a specifikus radioaktivitásértékek összehasonlításából adódik. A rög specifikus radioaktivitása hosszabb molekuláknál nagyobb, mint rövidebb polipeptideknél (143 000, 78 500 és 63 000 cpm/g rög az r31 kD, r20 kD és rl2 kD polipeptid esetében), de a különbség nem statisztikusan szignifikáns. A vér specifikus radioaktivitásértéke (24 óra elteltével) hasonló összefüggést mutat a molekulamérettel (7040, 5016 és 3300 cpm/g az r31 kD, r20 kD és rl2 kD polipeptid esetében), ami a molekulák kiürülési rátájában található különbségeket mutatja. A rögben mérhető specifikus radioaktivitásnak a vérben mérhető specifikus radioaktivitásra vonatkozó aránya a három különböző polipeptid esetében hasonló, értéke mintegy 20. A kapott eredmények szerint mindhárom FBD polipeptid (vagy az FBD egyéb ffagmensei) a vérrög leképezésére felhasználhatók.
8. példa
Fibrinkötő dómén polipeptidek jelölése ateroszklerotikus sérülés és vérrög leképezésére Az említett fibrin kötő dómén polipeptidek (r31 kD, r20 kD és rl2 kD polipeptidek), vagy az FBD más polipeptid ffagmensei radioaktív jelöléssel láthatók el, és így radioaktív nyomjelzőt juttatnak el a vérröghöz, lehetővé téve a belső gamma-kamerás leképezést. A 3. példában ezt a felhasználást 125jód-izotópos jelöléssel végezzük, amelynek felezési ideje viszonylag hosszú, 60 nap.
Az FBD polipeptidek ismert módon történő jelölésére (Uehara és munkatársai idézett műve, 1) alkalmazható továbbá a 131jód-izotóp is, ennek 8 napos felezési ideje még mindig viszonylag hosszú.
Az ateroszklerotikus sérülés és a vérrög klinikai leképezése során a radioaktív hatóanyagtól pozitív eredményt várunk el a befecskendezést követő néhány órán belül (33). Az ilyen vizsgálathoz rövid életű radioaktív jelölés használható. A vizsgálatok szerint radioaktív nyomjelzőként előnyösen alkalmazható a 111indium izotóp vagy a 99mtechnécium-izotóp, amelyek felezési ideje 67 óra és 6 óra (32), míg egy másik rövid életű és kis energiájú jelölő anyag a 123jód-izotóp, amelynek felezési ideje 13,3 óra.
Az FBD polipeptideket 99mtechnécium-izotóppal a szokásos módon jelöljük (21, 33, 34, 35). A 99mtechnécium-izotóp különösen megfelelő diagnosztikai egyfotonú radionuklid, mivel felezési ideje rövid, kimutatási határa gamma-számlálóval 140 KeV, nem eredményez részecskesugárzást, olcsó és könnyen hozzáférhető. Ezek a tulajdonságok lehetővé teszik a rutinszerű adagolást 30m Ci dózisban, ami magas fotonfluxus szintet biztosít, és lehetővé teszi a sérülés detektálását egy fotonemissziós komputerizált tomográfiái (32, 35).
Az FBD polipeptidek jelölésére alkalmazható radioizotópokra további példaként említhető a kripton-81m izotóp és a xenon-133 izotóp, amelynek felezési ideje
5,3 nap (4). Alkalmazható továbbá a gallium-67 izotóp, amelynek felezési ideje 78 óra (36).
Az r31 kD, r20 kD, rl8,5 kD és rl2 kD polipeptideket, valamint a plazma 31 kD ffagmenst 1Hindium-izotóppal jelöljük a humán szérumalbumin vonatkozásában Hnatowich D. J., Layne W. W. és Childs R. L.: J. Appl. Radiat. Inst. 33, 327 (1982) helyen leírt módon. Az előzetes kísérletek szerint a jelölt FBD polipeptid in vitro kötődik az előre kialakított vérröghöz a II kétlépéses reakcióban (6. példa), és az in vivő vérröghöz a 7. példa szerinti modellben mérve, amelynek során magas rög/vér arányt kapunk a 80-200 tartományban 24 óra után mérve.
A 12 kD és 18,5 kD fehérjék radioaktív jelölése
Az FBD 12 kD és 18,5 kD polipeptid fragmensének DTPA módosítását az ismert módon végezzük [Hnatowich D. J., Layne W. W. és Childs R. L.: Int. J. Appl. Radiat-Isot. 33, 327-332 (1982); Knight L. C. Kollman M., Maurer A. H. és Budzynski A. Z.: Biochím. Biophys. Acta 924,45-53 (1987)], amelynek során a DTPA ciklikus anhidridjét alkalmazzuk. Számolt mennyiségű DTPA ekvivalenst tartalmazó száraz kloroformos oldat alikvot részét bepároljuk, és a fehérjével reagáltatjuk foszfát vagy hidrogén-karbonát pufferolt sóoldatban (pH = 7,4, illetve pH = 8,0±0,2). A (hidrolizált) DTPA feleslegét dialízissel távolítjuk el. A jelölést hordozómentes lllindium-izotóppal végez23
HU 216 302 Β zük sósavas oldatban, amit nátrium-acetáttal mintegy pH=6 értékre semlegesítünk. Az egyik kísérletben (PBS) az 5. példa szerint előállított 12 kD polipeptidet jelöljük, és a patkánymodellben 86-os vérrög/vér arányt kapunk, amikor is a DTPA számolt mólfeleslege - a 12 kD fehéijére vonatkoztatva - 5 (5 lizil ε-aminocsoport és la aminocsoport található a 12 kD fehérjében). A H1indiummal végzett jelölés esetében a szabad (kötetlen) 111indium-izotóp mennyisége 15% alatt marad (vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat szerint).
Egy másik kísérletben (BBS) a DTPA anhidridet 1:1 arányban alkalmazzuk a 12 kD vagy a 18,5 kD fehérjére vonatkoztatva.
A 12 kD polipeptid egy molekulájába beépült DTPA maradékok számának meghatározásához a DTPA módosított fehérjét (a felesleges DTPA elválasztása előtt) 111 indium-izotóppal j elöljük (lásd Knight és munkatársai idézett művét). A beépült DTPA maradékok száma 0,12 molekulánként a 12 kD polipeptid esetében. A DTPA jelölt 12 kD és 1,5 kD fehérjék azonos szuperóz 12 (gélszűrési) elúciós profilt mutatnak, mint a kontroll módosítatlan fehéqe (retenciós idő 19,17 perc, illetve 18,29 perc, a kontrollérték az E táblázatban található). A felesleges DTPA elválasztása után végzett 'indium-izotópos jelölés esetében a szabad (kötetlen) Hlindium-izotóp mennyisége 28% és 29% a 12 kD és a
18,5 kD fehéqe esetében, amelynek megfelelően a vérrög/vér arány (patkánymodellben) 27 és 25.
Fémkelátokkal megvalósítható NMRI, ultrahang és röntgensugár leképezést ismertet a 4 647 447 számú USA-beli szabadalmi leírás. Emellett antitestek fémkeláthoz történő hozzákapcsolását ismerteti a 7. oszlop 42. sorában. Polimer paramágneses kelátokkal jelölt monoklonális antitestek és ezek NMRI módszerrel történő felhasználása ismert [Shreve P. és munkatársai: Magnetit Resonance in Medicine, 3, 336-340(1986); Brady T. és munkatársai: Proceedings of the Society of Magnetit Resonance in Medicine, Second Annual Peeting, Soc. of Magnetit Resonance in Medicine, Inc. San Francisco, 10, (1983) idézi Koutcher J. és munkatársai: J. Nucl. Med. 25, 506-513 (1984)].
9. példa
Különböző FBD polipeptidek biológiai hatását bemutató további kísérletek
Az r31 kD, r20 kD, rl2 kD FBD polipeptidek biológia hatását a 6. példa ismerteti. Ebben a példában különböző FBD polipeptid fragmensekkel kapott további eredményeket mutatunk be. Az alkalmazott polípeptidek a 4. és 5. példa szerint előállított 12 kD polipeptid, és a 18,5 kD polipeptid, amelynek előállítását, hajtogatását és oxidálását, továbbá tisztítását a 4. és
10. példa ismerteti.
I. Fibrinröghöz történő kötődés
A rög kialakítását és az FBD megkötését a 6. példa szerinti II kétlépéses reakció szerint végezzük. Az FBD polipeptid mesterséges aggregálódásának és kicsapódásának elkerülése érdekében a végső centrifügálási lépést elhagyjuk, és a rögöt új csőbe helyezzük, és intenzíven mossuk.
a. Előre kialakított rög vizsgálata
A gamma-számláló szilikonozott műanyag fioláiba (7 ml) a következő reakcióelegyet (300 μΐ) töltjük:
150 μΐ I keverék [0,2 X tiróda puffer (1 X tiróda puffer:
mmol/1 hepes, pH=7,35; 0,2% dextróz; 27 mmol/1 nátrium-klorid; 0,76 mmol/1 NaH2PO4; 0,54 mmol/1 KC1 és 0,2 mmol/1 MgCl2), 3 egység/ml trombin (Sigma), 0,6% BSA (Sigma), 15 mmol/1 CaCl2, 150 mmol/1 NaCl, 20 mmol/1 NaHCO3 (pH=8,0)] és 150 μΐ frissen citrátozott teljes humán vér.
Előírás: Inkubálás 37 °C hőmérsékleten 3 órán keresztül. A szérumot vákuumban eltávolítjuk, és a fibrinrögöt tartalmazó csöveket -70 °C hőmérsékleten tároljuk. Az előre kialakított rögök több hónapon keresztül felhasználhatók.
b. Az FBD kötődése az előre kialakított röghöz
Az előre kialakított rögöket tartalmazó fiolákat (szobahőmérsékletre melegítve) feltöltjük 300 μΐ 150 mmol/1 nátrium-klorid, 20 mmol/1 nátrium-hidrogén-karbonát (pH=8,0) elegyével, amely 1 X tiróda puffért, 0,6% BSA-t, 5 mmol/1 CaCl2-t és 0,15 pmol/l 125jód-FBD polipeptidet tartalmaz. A kötési reakciót 37 °C hőmérsékleten 18 órán keresztül végezzük (0,03% nátrium-jód-acetát távollétében vagy jelenlétében, amely gátolja az endogén transz-glutamináz, a XHIa faktor hatását). A rögöt ezután szilikonozott fiolába visszük, háromszor 1 ml mosó pufferrel (20 mmol/1 NaHCO3, 1% BSA, 1 mmol/1 PMSF és mmol/1 EDTA) mossuk és gamma-számlálóban számláljuk.
A plazma és rekombináns 31 kD polipeptid, a rekombináns 18,5 kD, 12 kD, 45 kD (12 kD FBD 33 kD CBD-vel fuzionálva, 12. ábra) és 33 kD CBD polipeptidek esetében kapott eredményeket a 30. ábra mutatja. Az összes vizsgált FBD polipeptid fragmens hasonló mértékben kötődik, míg a CBD polipeptid csak nagyon kis mértékben kötődik. A transz-glutamináz (XIII. faktor) inhibitor hatású jód-acetát adagolásával elért 50-75-os gátlás azt mutatja, hogy a transzglutamináz aktívan részt vesz a kötési reakcióban. Az a tény, hogy nem befolyásolja a 33 kD CBD polipeptidnek a röghöz történő kötődését, azt mutatja, hogy a CBD polipeptid kötődését más, feltehetően nem specifikus mechanizmus közvetíti. Az FBD kovalens kötéssel kötődik a fibrinröghöz (WO 90/07577 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés). A transz-glutamináz részvétele és a ,25jód FBD fibrinkomplex biokémiai jellemzése arra utal, hogy az FBD polipeptidnek legalább 70%-a kovalens kötéssel kötődik a fibrinhez.
II. Vaszkuláris komponensekhez történő kötődés
A fibrinnel szemben mutatott specifikus kötés mellett az FBD polipeptidek bizonyos mértékű specifikus kötés kialakítására is képesek más vaszkuláris komponensekkel, amelyekkel kontaktusba kerülnek. A vaszkuláris komponensekre példaként említhetők az endotéliás sejtek (EC), az extracelluláris mátrix (ECM), és maga a fibronektin (FN) is. Ez a nem specifikus kötés az egyik olyan faktor, amely meghatározza a háttérszintet a diagnosztikai leképezési eljárás során. Mi24
HU 216 302 Β nél alacsonyabb a nem specifikus kötés, annál hatékonyabb a leképezés, és annál kevesebb radioaktív reagenst kell adagolni a betegnek. Ezért olyan kísérleteket végzünk, amelyben összehasonlítjuk a 12 kD FBD fragmens és a 31 kD FBD polipeptid vaszkuláris komponensekkel történő nem specifikus kötődését.
ml 0,3 pmol/l 125jód-12 kD vagy 125jód-31 kD polipeptidet (5xlO5 cpm/pg és 7,5 χ 105 cpm/pg PBSben, amely 0,1% BSA-t tartalmaz) adagolunk két párhuzamosban 35 mm-es Petri-csészékbe (Falcon), amelyek egybefolyó endotéliás sejteket (EC), extracelluláris mátrixot (ECM) [Eldor és munkatársai: Blood, 65, 1477 (1985)] vagy immobilizált humán fibronektint (FN) tartalmaznak (1 ml PBS, amely 50 pg/ml FN-t tartalmaz, 4 °C hőmérsékleten egy éjszakán keresztül inkubálunk, majd 2 órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk 1% BSA-t tartalmazó 1 ml PBS-sel). Egyes lemezeknek transz-glutaminázt adunk (jelölése +TG) 0,02 egység/ml mennyiségben (Sigma). A kísérleti lemezeket 60 percen keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk CO2 inkubátorban, háromszor 1 ml mosóoldattal (2 mmol/1 PMSF-t és 2 mmol/1 EDTA-t tartalmazó PBS) mossuk. A kötött radioaktivitást extraháljuk, amelyhez a lemezt 60 percen keresztül extrakciós oldattal (l%o deoxikolátot, 2 mmol/1 PMSF-t, 2 mmol/1 EDTA-t, 2 mmol/1 NME-t és 2 mmol/1 jód-ecetsavat tartalmazó mosóoldat) inkubáljuk. Az oldatot ezután csövekbe visszük, és a radioaktivitást gammaszámlálóval méijük.
A 28. ábrán megadott eredmények szerint a 12 kD FBD polipeptid csak gyengén kötődik a vaszkuláris komponensekhez, vagyis az endotéliás sejtekhez, az extracelluláris mátrixhoz és a fibronektinhez, a 31 kD FBD polipeptidhez viszonyítva.
III. Bakteriális kötődés
Ismert, hogy a fíbronektin hozzátapad és elárasztja a különböző Gram-pozitív baktériumok által okozott sérüléseket (18). A plazma FN fibrinkötő doménje nagy affinitással kölcsönhatásba lép a baktérium felületén található specifikus receptorokkal. Az a hely, ahol a Staphylococcus aureus általában megkezdi a fertőzést, dús FN-molekulákban, ilyen a vérrög és a szubendotélium. Az exogén FN elősegíti a bakteriális megtapadást ezeken a helyeken. Az FN az S. aureushoz telíthető, specifikus felületi fehérjereceptorokon keresztül kötődik. A vizsgálatok szerint a nagy affinitású receptorok kötési konstansa 5χ10~9 M, mennyiségük 100-20000 baktériumonként (19). Az FN receptorok kifejezése összhangban van a klinikai izolátum behatolóképességével és patogén hatásával. Az FN receptoroknak az S. aureusról történő mechanikai eltávolítása vagy a baktériumoknak antibiotikum jelenlétében történő tenyésztése csökkenti az FN megkötőképességet. Mivel az FN egy divalens molekula, amely több funkcionális domént tartalmaz a baktériumkötő hatás mellett sejtkötő és kollagénkötő hatással, a baktérium a sérülésen rögzülhet az extracelluláris mátrix különböző komponensein keresztül, valamint a szöveti sejtek FN receptorán keresztül.
Az FN-molekula és az S. aureus közötti kölcsönhatás jobban megérthető az FBD polipeptid fragmenseknek az S. aureus endotéliás sejtekhez történő kötődését gátló hatásán keresztül.
A 31 kD FBD polipeptidnek S. aureushoz történő kötődése ismert (WO 90/07577 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés). Az elvégzett hasonló kísérletek azt mutatják, hogy a 31 kD FBD polipeptiddel ellentétben a 12 kD és a 18,5 kD FBD polipeptid fragmens nem kötődik az S. aureushoz, és nem gátolja az S. aureust a kötési reakcióban. A 20 kD polipeptid azonban gátolja az S. aureus kötődését (8. ábra), ami a további (nem autentikus) C-terminális aminosavakkal (2. példa) magyarázható, amelyek specifikus hajtogatáson keresztül közvetve vagy közvetlenül befolyásolhatják az aktivitást.
A következő vizsgálatokban a 31 kD FBD polipeptidet más FBD polipeptid fragmensekhez viszonyítjuk az S. aureus közvetlen kötésének, valamint az S. aureusnak az endotéliás sejtekhez történő kötése gátlásának vizsgálatával.
Anyagok és módszerek
A. Jelölt FN vagy FBD kötődése a baktériumhoz
1. Közvetlen kötés oldatban
Különböző koncentrációjú 125I-r31 kD FBD polipeptidet vagy 125I-FN polipeptidet adunk 5 χ 108 S. aureus baktérium PBS-ben felvett oldatához, amely 0,1% Tween-t és 1% BSA-t tartalmaz. A végső térfogat 1 ml. Az összradioaktivitás meghatározásához 20 μΐ alikvot részt közvetlenül a baktériumhoz történő adagolás után kiveszünk.
Az elegyet 2 órán keresztül 20 °C hőmérsékleten inkubáljuk rázás közben.
A kötés vizsgálatához 100 μΐ inkubációs elegyet kiveszünk, és 5 ml szilikonozott csőben elhelyezett ml 10% Percoll és 0,15 mol/1 nátrium-kloridra rétegezett 0,5 ml PBS tetejére rétegezzük. Ezt 1350 g értéken (4000 fordulatszám SW vödrös rotorban) 15 percen keresztül 20 °C hőmérsékleten centrifugáljuk. A felülúszót leszívatjuk, és a pelletet radioaktivitásra vizsgáljuk.
2. Kompetitív vizsgálat jelöletlen FN, FBD és ezekkel rokon molekulákkal
A fenti eljárást ismételjük meg azzal a különbséggel, hogy 3 pg/ml 125jód-p31 kD polipeptidet alkalmazunk, és meghatározott mennyiségű kompetitív molekulát (FN vagy FBD) adunk a kezdeti kötőelegyhez.
3. Radioaktív jelöléssel ellátott baktérium kötődése immobilizált FN polipeptidhez
Műanyag fiolákat 0,3 ml 50 pg/ml FN polipeptiddel vagy 1% BSA-val vonunk be.
A csöveket rázás közben egy éjszakán keresztül °C hőmérsékleten inkubáljuk. A csöveket ezután 5 ml PBS-sel háromszor mossuk, majd 0,3 ml 1% BSA-t adunk hozzá PBS-ben, és rázás közben 2-3 órán keresztül 20 °C hőmérsékleten tovább inkubáljuk (a szabad helyek blokkolása érdekében).
A közvetlen kötési vizsgálatban a baktériumokat inhibitorral előinkubáljuk 4 °C hőmérsékleten 2 órán keresztül.
A baktériumot (4χ 106 pfu/ml, 3 pfu/cpm) az ábrán megadott koncentrációban hozzáadjuk a fiolához.
HU 216 302 Β
A vizsgálati elegy végső térfogata 0,3 ml PBS. Az elegyet lassan kevergetjük 4 °C hőmérsékleten 90-120 percen keresztül.
A csöveket ezután dekantáljuk, és 5 ml PBS-sel háromszor mossuk.
ml szcintillációs folyadékot adunk az elegyhez a 3H-jelölt baktérium kötésének vizsgálatához.
B. AzS. aureus endoté/iális sejtekhez történő kötődésének gátlása FBD fragmensekkel
I. 5. aureus jódozása
S. aureus SA113 törzset (ATCC 35556) tenyésztünk triptikus szója táptalajban (Difco Laboratories, USA) 37 °C hőmérsékleten 1 literes fermentorban. A baktériumokat a logaritmikus fázis közepén 2,30 OD értéken (660 nm) begyűjtjük. A bakteriális pelletet 500 ml PBS oldatban szuszpendáljuk, amely 5 mmol/1 PMSF-t tartalmaz, és háromszor mossuk. A sejteket 1 mmol/1 PMSF-t és 5 mmol/1 NEM-t (N-etil-maleinimid, Sigma, E-3876) tartalmazó 100 ml PBS-ben szuszpendáljuk, 88 °C hőmérsékleten 20 percen keresztül inaktiváljuk, jeges vízben lehűtjük, és kis alikvot részekben -20 °C hőmérsékleten tároljuk. Felhasználás előtt a baktériumkoncentrációt 5 χ 109 pfu/ml értékre állítjuk. 100 pCi alikvot résznek megfelelő Bolton-Hunter reagenst (Amersham) egy üvegcsőben jégen bepárolunk. 1 ml baktériumszuszpenziót adunk a bepárolt reagenshez és 10 percen keresztül jégen óvatosan keveijük. A reakció leállításához 1 ml 0,2 mol/1 glicint adunk hozzá 50 mmol/1 kálium-foszfát pufferben (pH=8,5). A reakcióelegyet 1 mmol/1 PMSF-t tartalmazó 20 ml PBS-ben szuszpendáljuk. 3000 fordulatszámon 10 percen keresztül 5 °C hőmérsékleten centrifugáljuk, majd a mosási lépést kétszer megismételjük. A végső pelletet 1 mmol/1 PMSF-t tartalmazó 2,2 ml PBS-ben szuszpendáljuk, és -20 °C hőmérsékleten tároljuk. A specifikus aktivitás általában 20-100 pfü/cpm.
II. Endotéliális sejtek tenyésztése
Boqúaorta endotéliás sejtek A5P7 tenyészetét (A. Eldor, Hadassa Hospital, Jerusalem, Izrael) szövettenyész közegben tartjuk fenn [Ogawa S. K. és munkatársai: Infect. Immunoi. 50, 218-224 (1985)]. A tenyészközeg DMEM/+1% D-glukóz és 10% FCS (Biological Industries, Kibbutz Beth-Haemek, Izrael), valamint 7 mmol/1 L-glutamin és 5 mg/ml gentamicin (mindkettő Sigma Chemicals).
A sejteket 37 °C hőmérsékleten 5,5% CO2 jelenlétében 150 ml-es szövettenyésztő üvegekben (Falcon) tartjuk fenn.
A kötési vizsgálatokhoz összefolyó, egy sejtből álló réteget állítunk elő 24 mérőhelyes szövettenyésztő lemezeken vagy 35 mm-es szövettenyésztő lemezeken (Corning Glassware, Corning New York, USA). A mérőhelyeket és a lemezeket 30 percen keresztül 0,5 ml vagy 1 ml teljes közeg jelenlétében előinkubáljuk a sejtszuszpenzió hozzáadása előtt. Ehhez a mérőhelyeket és lemezeket 5xl04 és 105 sejttel ültetjük be, és 3-4 nap elteltével használjuk, amikor a telepek összefolynak.
ΠΙ. ,25jód-S. aureus kötődése az endotéliális sejtekhez
A vizsgálatot a hivatkozott irodalomban megadott módon végezzük (Ogawa és munkatársai idézett műve). A fent leírt módon előállított, jelölt S. aureus készítmény alikvot részét PBS-ben 108/ml koncentrációra hígítjuk. 3,5 μΐ jelölt baktériumot adunk 200 μΐ DMEM + 10% FCS, 33 μΐ 150 mmol/1 nátrium-klorid és 20 mmol/1 nátrium-hidrogén-karbonát, 15 μΐ PBS vagy a vizsgált kompetitor elegyéhez, majd 2 órán keresztül óvatos kevertetés közben inkubáljuk. A baktériumokat ezután az összefolyó monoréteg endotéliás sejtekhez adjuk. Az endotéliális sejteket sóoldattal mossuk közvetlenül a vizsgálat megkezdése előtt. Az elegyet 4 °C hőmérsékleten 1 órán keresztül óvatos rázás közben, majd 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten 5% CO2 jelenlétében rázás nélkül inkubáljuk. A kötetlen jelölt baktériumot eltávolítjuk, ehhez háromszor hideg PBS-sel mossuk, amely 2 mmol/1 PMSF-t és 2 mmol/1 EDTA-t tartalmaz. A kötött jelölt baktériumot extraháljuk, ehhez szobahőmérsékleten 1 órán keresztül 1% deoxikolátot, 20 mmol/1 Trisz-HCl-t (pH = 8,3), 2 mmol/1 PMSF-t, 2 mmol/1 EDTA-t, 2 mmol/1 NEM-t és 2 mmol/1 jód-ecetsavat tartalmazó PBS-sel rázzuk. Az extrakciót egyszer megismételjük, és az egyesített extraktumokat gamma-számlálóban számláljuk.
Eredmények
A. Baktériumok kötődése 125jód-FN vagy FBD polipeptidhez oldatban
1. Közvetlen kötés
Kísérleteket végzünk a 125jód-FN vagy 125jód-rFBD polipeptidnek S. aureus baktériumhoz történő kötődésének meghatározásához szuszpenzióban. Különböző mennyiségű radioaktív FN vagy r31 kD polipeptidet adunk 5xl08 baktériumhoz, 2 órán keresztül inkubáljuk, és 10% Percoll sóoldaton centrifugáljuk. A radioaktivitást a pelletben mérjük.
Az eredmények szerint a l25jód-rFBD polipeptid (r31 kD polipeptid) szuszpenzióban jobban kötődik a baktériumhoz, mint a l25jód-FN polipeptid.
A 125jód-rFBD polipeptid S. aureus vonatkozásában mutatott fokozott kötőképessége a 125jód-FN polipeptid kötéséhez viszonyítva a monovalens dómén nagyobb affinitásával magyarázható az ép plazma FN bivalens multidoménjeihez viszonyítva.
Hasonló kísérleteket végzünk a 12 kD és 18,5 kd FBD fragmensekkel, amelyek kötést nem mutatnak.
2. Kompetitív vizsgálat natív jelöletlen FN, FBD és rokon molekulákkal pg/ml l25jód-p31 kD polipeptidet inkubálunk 5 χ 108 baktérium jelenlétében növekvő mennyiségű különböző FBD molekulákkal.
Az eredmények szerint a natív FN, valamint a megfelelően hajtogatott p31 kD vagy r31 kD FBD polipeptid gátolja a l25jód-p31 kD polipeptid kötődését az S. aureushoz, ami arra utal, hogy a rekombináns 31 kD polipeptid ugyanolyan aktív, mint a természetes plazmamolekula. A rekombináns vagy plazma FBD redukált formája azonban csak minimális mértékben gátolja a 125jód-FBD molekula baktériumhoz történő kötődését, ami arra utal, hogy a megfelelő hajtogatás szükséges a kötődéshez. Emellett, az rl8,5 kD és rl2 kD FBD polipeptidek, valamint a CBD polipeptid (33 kD sejtkö26
HU 216 302 Β tő dómén) nem verseng a 125jód-pFBD polipeptid kötődésével, mivel csak a teljes 31 kD FBD dómén rendelkezik baktériumkötő képességgel, a rövidebb FBD fragmensek nem kötik meg a baktériumot.
B. Jelölt S. aureus kötődése immobilizált FN molekulához
Az rFBD polipeptid (r31 kD polipeptid) azon képességének meghatározásához, hogy milyen mértékben vesz részt a baktériumnak az extracelluláris mátrixhoz történő tapadásában, kompetitív vizsgálatot végzünk. A vizsgálatban az S. aureus FN-nel bevont műanyag felületre tapad, és méljük az FBD kölcsönhatását a kötési folyamatban.
Az eredmények szerint az S. aureus megtapadását FN-nel bevont műanyag fiolán gátolja az S. aureus FNnel, pFBD-vel (31 kD polipeptid) vagy rFBD-vel (31 kD polipeptid) végzett előinkubálása. A különböző molekulák gátló hatása hasonló. A vizsgált polipeptidekkel nem rokon fehéije, a BSA, ami nem rendelkezik S. aureuskötő helyekkel, nem gátolja a radioaktív jelölésű S. aureus FN bevonattal ellátott műanyag fiolán történő megtapadását.
Hasonló kísérletet végzünk 12 kD FBD fragmensekkel, amelyek nem gátolják az S. aureus kötődését az immobilizált FN molekulán.
C. S. aureus kötődésének gátlása endotéliális sejtekhez
A 29. ábrán az FBD fragmensek gátló hatását mutatjuk be az S. aureus endotéliális sejtekhez történő kötődésére. A 31 kD polipeptid lényeges és dózisfüggő hatást gyakorolt az S. aureus endotéliális sejtekhez történő kötődésére. A 18,5 kD polipeptid és a 12 kD polipeptid gátló hatással nem rendelkezik, ami arra utal, hogy az FBD S. aureus receptorokra vonatkozó kötőhelyei nincsenek jelen a 12 kD és a 18,5 kD fragmensekben. Ez meglepő eredmény, mivel ez az első jele annak, hogy a fibronektin FBD bakteriális kötődoménje elválasztható az S. aureus kötődoméntől.
Összegzés és következtetés
A különböző FBD palipeptid fragmensek fent tárgyalt hatásait a C táblázatban foglaljuk össze.
C táblázat
Hatás 31 kD 18,5 kD 12 kD
fibrinkötés magas magas magas
vaszkuláris komponensek megkötése magas alacsony alacsony
baktérium megkötése igen nem nem
S. aureus endotéliális sejtekhez történő megkötésének gátlása igen nem nem
Látható, hogy a 18,5 kD és 12 kD FBD polipeptid fragmensek magas kovalens kötési specifitással rendelkeznek a fibrin vonatkozásában, emellett hatás-spektrumuk keskenyebb, és kisebb specifitást mutatnak más ligandumok, így vaszkuláris komponensek és baktériumok vonatkozásában, mint a 31 kD polipeptid. Ez előnyös jellemző egy vérrögleképező szer esetében, mivel biztosítja, hogy diagnosztikai reagensként történő alkalmazása esetén nagy affinitást mutat a fibrintartalmú vérrög vonatkozásában, de a háttérszínt alacsony marad. A fentieket igazoló in vivő kísérletet a 13. példában mutatjuk be.
10. példa
Javított eljárás rövidebb FBD polipeptid fragmensek hajtogatására, oxidálására és tisztítására
Rekombináns FBD fehérjéket - r31 kD (ötujjas),
18,5 kD (a háromujjas autentikusabb változata, mint a korábbi 20 kD) és rl2 kD (kétujjas) - fejezünk ki E. coli sejtekben, és tisztítás előtt (98% feletti tisztaság) hajtogatjuk és oxidáljuk. A teljes 31 kD FBD polipeptid (ötujjas) és a rövidebb 12 kD és 18,5 kD FBD polipeptid fragmensek (kettő és háromujjas) esetében alkalmazott hajtogatási és oxidációs eljárás eltér egymástól, és a 2. és 5. példa ismerteti. Az 5. példa szerinti eljárás alkalmazható az összes ismert kettő- és háromujjas FBD fehérje esetében, de nem használható az ötujjas 31 kD fehéije esetében még akkor sem, ha az oxidálás után redukálást végzünk a tisztított plazma 31 kD fehérjén, vagyis felnyitjuk, és hajtogatjuk a fehérjét. Ezt az eljárást javítottuk a hajtogatási folyamat lényegének megváltoztatása nélkül, és a javított eljárás alkalmazható a 12 kD, 18,5 kD és 20 kD polipeptid, valamint a 45 kD FBD-CBD hibrid polipeptid (12 kD-33 kD) esetében, de nem használható a 31 kD polipeptidhez.
A folyamat lényegében azonos az 5. példa szerinti folyamattal. A következő leírás a 12 kD polipeptidre vonatkozik, de hasonló eredmények nyerhetők a
18,5 kD FBD polipeptiddel és a 45 kD FBD-CBD hibrid polipeptiddel, ezeket a polipeptideket a pFN 2032 plazmid (27. ábra), a pFN 208-13 plazmid (23. ábra) és a pFN 202-5 plazmid (12. ábra) fejezi ki.
Bakteriális sejtmasszát állítunk elő a 2. példában leírt módon a pFN 203-2 plazmidot (27. ábra) hordozó E. coli A4255 törzs tenyésztésével.
A. A bakteriális sejtmassza nyers feldolgozása
A pellet mosását és extrahálását hasonló módon végezzük, mint a két- és háromujjas FBD fehérjék esetében (5. példa). A bakteriális sejtmasszát 20 térfogatrész 50 mmol/1 Trisz-HCl és 50 mmol/1 EDTA (pH=7,4) elegyében szuszpendáljuk. 15 percen keresztül kevertetjük, majd kétszer Dynomill kD 5 ágyon vezetjük át 50 1/óra áramlási sebességgel. Az elroncsolt szuszpenziót 14000 g értéken Cepa 101 centrifugán centrifugáljuk 501/óra adagolási sebesség mellett. A pelletet a fenti pufferben szuszpendáljuk az eredeti bakteriális sejtmassza száraz sejttömegének tízszeresét kitevő végső térfogatban. A szuszpenziót 37 °C hőmérsékletre melegítjük, és 2500 U/ml lizozimot adunk hozzá. Két órán keresztül 37 °C hőmérsékleten kevertetjük, majd 1% Triton Χ-100-at adunk hozzá, és az inkubálást kevertetés közben 30 percen keresztül szobahőmérsékleten folytatjuk. A szuszpenziót ezután azonos térfogatrész ionmentesített vízzel hígítjuk, W 370 készülékkel ultrahanggal besugározzuk, és 14000 g értéken a fenti körülmények mellett centrifugáljuk. A pelletet kétszer mossuk úgy, hogy ionmentesített vízben szuszpendál27
HU 216 302 Β juk az eredeti baktérium sejtmassza száraz sejttömegének 16-szorosát kitevő végső térfogatban, és 15 percen keresztül szobahőmérsékleten kevertetjük pH=7,4 értéken. Ezután a szuszpenziót W 370 készülékkel ultrahanggal besugározzuk, és 14000 g értéken a fenti körülmények között centrifugáljuk. A mosott és extrahált pellet FBD polipeptid zárványtesteket tartalmaz, és felhasználásig -20 °C hőmérsékleten tároljuk.
B. Hajtogatás és oxidálás
A kapott mosott zárványtesteket (100 g, ami megfelel 19,2 g száraz tömegnek) 5 térfogatrész 10 mmol/1 Trisz-HCl (pH=8,0), 5 mmol/1 EDTA, 1 mmol/1 fenilmetán-szulfonil-fluorid (PMSF), 10 mmol/1 ε-aminokapronsav, és 6 mol/1 guanidin-hidroklorid elegyében (végső térfogat 600 ml) szolubiliziáljuk. A mintát 2,27 ml β-merkapto-etanol (végső koncentráció 50 mmol/1) hozzáadásával redukáljuk, és szobahőmérsékleten levegő kizárása mellett, vagyis lezárt edényben 90 percen keresztül kevertetjük. A redukált fehérjét oxidáljuk (fehérjekoncentráció 0, 81 mg/ml), amit 0,54 mol/1 guanidin-hidrokloridban végzünk a következők szerint: 6 liter oxidációs puffért [10 mmol/1 Trisz HC1 (pH = 8,0), 5 mmol/1 EDTA, 1 mmol/1 PMSF, 10 mmol/1 ε-amino-kapronsav, 0,3 mmol/1 oxidált glutation (GSSG)] adunk a redukált fehérje oldatához. Az adagolást kevertetés közben 150 ml/perc sebességgel végezzük. Az oxidációs folyamat szobahőmérsékleten 65 órán keresztül tart lezárt edényekben, amit folyamatosan és óvatosan kevertetünk. Az oxidált fehéqe oldatát Whatman 3. számú szűrőpapíron szűrve eltávolítjuk a csapadékot, majd tízszeresére koncentráljuk Pellicon tangenciális áramlású ultraszűrő egységen, amely 3 kD értékű móltömeg membránnal van ellátva, és a guanidin-hidroklorid, a β-merkapto-etanol és a GSSG eltávolítása érdekében ugyanezen a membránon diaszűrjük. A további csapadékot, amely 4 °C hőmérsékleten egy éjszakán keresztül történő állás közben keletkezik, 22 500 g értéken 45 percen keresztül végzett centrifugálással távolítjuk el. (A 18,5 kD és 45 kD polipeptidek esetében az ultraszűrést és a diaszűrést 10 kD értékű móltömeg membránon végezzük.)
C. Tisztítás
A koncentrált és tiszta oldatot (700 ml) Q-szefaróz oszlopra (2,5 x 28,5 cm) visszük, amit 10 mmol/1 TriszHCl, 5 mmol/1 EDTA, 1 mmol/1 PMSF és 10 mmol/1 ε-amino-kapronsav (pH = 8,0) elegyével kiegyensúlyozunk. Az oszlopon átfolyt elegyet, amely 45 kD fehérjét tartalmaz, részletekben (170-350 mg) heparinszefaróz oszlopra (2 x 6,5 cm) visszük, amit 10 mmol/1 Trisz-HCl (pH = 8,0) és 5 mmol/1 EDTA elegyével egyensúlyozunk ki. A meg nem kötött fehérje fenti pufferrel történő mosása után a kötött fehérjét ugyanezzel a pufferrel eluáljuk, amely további 500 mmol/1 nátriumkloridot tartalmaz. Az eluátumokat összegyűjtjük, és -20 °C hőmérsékleten tároljuk.
Mint fent említettük, ez a folyamat kis módosítással a 18,5 kD polipeptid és a 45 kD FBD-CBD hibrid polipeptid esetében is alkalmazható. A fenti két polipeptiddel kapott eredmények nagyon hasonlóak a 12 kD polipeptiddel kapott eredményekhez.
A heparin/szefaróz oszlop eluálásához és a tároláshoz legalább 0,5 mol/1 nátrium-klorid tartalom szükséges a polipeptidek stabilitásának biztosításához, amelyek egyébként gyorsan elveszítik aktivitásukat. Ez érvényes a 31 kD polipeptidre is.
11. példa
Az FBD polipeptid fragmensekjellemzése
I. Eljárás
A találmány szerint előállított FBD polipeptid fragmenseket a következő jellemző tesztekben hasonlítjuk össze.
1. SDS-PAGE +ME (ME= β-merkapto-etanol)
12,5% akril-amid lapgélt fehérjével töltünk meg, amelyet előzetesen 5 percen keresztül 1% SDS-t tartalmazó mintapufferben forraltunk redukáló körülmények között (+1% ME). Az elektroforézist mezőnként 20 μg anyaggal végezzük, és a gélt Coomassie Brilliant Blue festékkel színezzük. A mért paraméterek:
a) mobilitás, amely móltömeg jelzőkkel (94, 67, 43, 30, 20,1 és 14,4 kD) összehasonlítva kifejezhető a fehéije látszólagos móltömege;
b) homogenitás vagy tisztaság, ami a fő- és kisebb sávok relatív intenzitásából következtethető.
2. SDS-PAGE -ME
12,5% akrilamid lapgélre fehérjét viszünk, amelyet előzetesen 5 percen keresztül 1% SDS-t tartalmazó mintapufferben forralunk nem redukáló körülmények (-ME) között. Az elektroforézist mezőnként 20 pg anyaggal végezzük, és a gélt Coomassie Brilliant Blue festékkel színezzük. A mért paraméterek:
a) mobilitás, amely móltömeg jelzővel (94, 67, 43, 30, 20,1 és 14,4 kD) összehasonlítva látszólagos móltömegben fejezhető ki;
b) homogenitás és tisztaság, amely a fő- és melléksávok relatív intenzitása alapján fejezhető ki, továbbá a fenti körülmények lehetővé teszik a diszulfidkötésű dimerek mennyiségének meghatározását.
3. Gélszűrés szuperóz 12 gélen
A fehérjekészítmények látszólagos móltömegét és homogenitását a szuperóz 12 oszlopon (HR10/30, Pharmacia Fine Chemicals) meghatározott elúciós profil alapján számoljuk. A mérést FPLC készüléken mérjük, amely LCC-500 folyadékkromatográfiás szabályozóval és rekorderrel (Pharmacia Fine Chemicals) van ellátva, vagy HPLC rendszeren (Waters Associates) végezzük, amely két szivattyúval (Model 501), egy injektorral (Model U6K) és automatizált gradiensszabályozóval (Model 580) van ellátva, amelyhez változtatható hullámhosszúságú detektor (Spectro-Monitor 3000, LDC/Milton Roy) és kromato-integrátor (MerckHitachi, Model 2000) csatlakozik. Az oszlopot a következő móltömeg standardekkel kalibráljuk, amelyeknek meghatározzuk retenciós idejét: boíjú-szérumalbumin (67 kD), ovalbumin (43 kD), kimotripszinogén (25 kD) és ribonukleáz (13,7 kD). Az adagolási sebesség 0,8 ml/perc, a standard futtató puffer összetétele 150 mmol/1 nátrium-klorid és 20 mmol/1 Trisz-HCl (pH=7,8-8,0). A jelölt két paraméter a retenciós idő és a sávszéleség felezőmagassága.
HU 216 302 Β
4. UV spektroszkópia
A spektrumokat szobahőmérsékleten BBS-ben vagy PBS-ben vesszük fel 0,2-1 mg/ml koncentrációban Phillips UV/látható spektrofotométeren Model PU8720, sávszélesség 2 nm, amely nyomtatóval van ellátva. A spektrumot Pye Unicam UV szilícium-dioxid küvettában mérjük 10 mm szélességben. Meghatározzuk az abszorpciós koefficinenst, vagyis a spektrum lambda,^ értékénél mérhető ε,0/ο értéket, valamint a lambdan,.^ és a larnbdamin közötti arányt.
5. Belső fluoreszcencia
Az adatokat Jasco spektrofluorométeren (Model FP770) mérjük 25±0,l °C hőmérsékleten. A gerjesztési hullámhossz 280 nm, a gerjesztési és az emissziós rés szélessége 5 nm. A vizsgált fehérjék koncentrációja 8-25 pg/ml PBS-ben vagy friss BBS-ben (pH=7,5). A mért két paraméter, vagyis a lambda,^ érték (a maximális spektrumot eredményező hullámhossz), valamint a specifikus intenzitás (a maximális spektrumnál mérhető fluoreszcencia intenzitás a mg/ml értékben kifejezett fehéijekoncentráció alapján normalizálva) erős pH-függőséget mutat.
6. Aminosav összetétel
A vizsgálatot a Stein és Moore féle aminosav analízis szerint végezzük. A fehéijehidrolízist száraz fehérjén Speed Vác centrifugában (Savant) végezzük 6,0 N sósav hozzáadásával, 1 mg fehéijére számolva 1 ml térfogatban. A levegőt folyamatosan leszívatjuk, és nitrogénbefuvatással helyettesítjük. A csövet lezárjuk és 22 órán keresztül 110±0,l °C hőmérsékleten melegítjük. Az alkalmazott módszer összhangban van az USP Drafts of Biotechnology-Derived Products, 1989, USP Convention Inc., 954, 96-98 előírásaival. Az alkalmazott analizátor Biotronic LC 5000, sorozatszáma 51501. A fenti módszerrel meghatározzuk az egyes aminosavmaradékok számát, a Cys és a Trp kivételével.
7. Heparin/szefaróz kromatográfia
A legfeljebb 200 μΐ mennyiségű mintát analitikai heparin/szefaróz oszlopra (5,5 x 0,5 cm) injektáljuk, amely HPLC rendszerhez (Waters Associates) csatlakozik, amely két szivattyúból (Model 501), egy befecskendezőbői (Model U6K) és egy automata gradiensszabályozóból (Model 580) áll, amelyhez változtatható hullámhosszúságú detektor (Spectro-Monitor 3000, LDC/Milton Roy) és egy kromato-integrátor (MerckHitachi, Model 2000) csatlakozik. Az oszlopot 10 mmol/1 nátrium-foszfát (pH=6,5) és 75 mmol/1 nátrium-klorid elegyével egyensúlyozzuk ki 0,5 ml/perc áramlási sebességgel, majd 5 percen keresztül a fenti pufferrel mossuk. A fehérjéket 75-500 mmol/1 nátrium-klorid pufferben felvett elegyének lineáris gradiensével eluáljuk 37,5 perc elteltével. A meghatározott két paraméter a retenciós idő, amely a fehérje eluálásához szükséges sókoncentrációval van összhangban, valamint a sávszélesség felezőmagassága, amely a csúcs homogenitását mutatja.
8. Reverz fázisú HPLC kromatográfia
A mintákat analitikai Waters C1S Bondapak reverz fázisú oszlopra (30 x 0,39 cm) injektáljuk, amely egy HPLC rendszerhez csatlakozik, ez azonos az 1.7 alatt ismertetett rendszerrel. Az oszlopot 80% víz, 0,1% TFA/20% acetonitril és 0,08% TFA elegyével egyensúlyozzuk ki 1 ml/perc áramlási sebességgel, majd 5 percen keresztül a fenti oldószerekkel mossuk. A fehérjéket 40% víz - 0,1% TFA: 60% acetonitril - 0,08% TFA lineáris gradienssel eluáljuk 40 perc alatt. A mért két paraméter a retenciós idő és a sávszélesség felezési magassága, amely a csúcs homogenitását mutatja.
9. Tripszintérkép
200 pg mintát 10 percen keresztül 37 °C hőmérsékleten különböző tömegarányú tripszin jelenlétében emésztünk. A tripszin koncentrációja 0,25,0,5, 1,0,2,5, 5,0 és 10,0%. A reakciót 5 mmol/1 PMSF segítségével megállítjuk, majd 30 percen keresztül jégen tartjuk, végül minta pufferrel adott estben ME jelenlétében (lásd
1.1 és 1.2 pontokat) kezeljük, és 20% akrilamid lapgélen a fent leírt módon futtatjuk. A minta sávok közötti ekvivalencia mértékét Coomassie Brillíant Blue festékkel végzett színezés után határozzuk meg.
\Q.Ellman módszere tiol meghatározására fehérjékben
A meghatározást denaturált fehérjén végezzük a tiolcsoportok teljes meghatározása érdekében.
Törzsoldat:
1. guanidín-HCI (a lehető legtisztább minőség)
7,1 mol/1 10 mmol/1 Trisz-HCl-ben (pH = 8) (GuCl);
2. DTNB (Ellman-reagens) 5x 10 3 mollOO mmol/1 kálium-foszfát pufferben (pH=7).
Módszer: 10-100 pmol/l tiolcsoportot tartalmazó fehérjemintát 0,15 ml térfogatra töltünk; DTNB vak minta (vagyis fehérje nélküli minta); 0,75 ml 7,2 mol/1 GuCl-t adunk hozzá, és a végső koncentrációt 6 mol/1 értékre állítjuk. 15-30 percen keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk, majd a fehérjeoldat vakértékét 412 nm-en leolvassuk. Ezután 100 μΐ DTNB-t adunk hozzá 5x10 4 mol/1 végső koncentrációban. 30 percen keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk, és a mintákat 412 nm hullámhosszon leolvassuk a DTNB vakhoz viszonyítva. A koncentrációt ε=13600Μ 'cm ' segítségével határozzuk meg, vagyis 100 pmol/l tiolcsoport 1,36 abszorbancia értéket ad.
11. Kicsapás/adszorpció
Fagyasztott 125jód-FBD polipeptidet tartalmazó Eppendorf-csöveket szobahőmérsékletre melegítünk, majd felkeverjük. 2 χ 5 μΐ alikvot részt kiveszünk a radioaktivitás meghatározásához. Nagy specifikus aktivitású 125jód-FBD polipeptid alkalmazása esetén a számlálás előtt a mintát a szilikonozott csőben nagy sótartalmú pufferrel (0,6 mol/1 nátrium-klorid és 20 mmol/1 NaHCO3, pH=8-9) hígítjuk. A törzsoldatot az Eppendorf-centrifugában nagy sebességgel centrifugáljuk, majd a felülúszót egy másik szilikonozott csőbe visszük. 2 x 5 μΐ alikvot részt ismét számlálunk. A centrifugálás előtt és után mért radioaktivitás különbsége jelzi a százalékos kicsapást.
A 125jód-FBD polipeptid -70 °C hőmérsékleten fagyasztva szilikonozott csövekben nagy sótartalmú pufferben (0,6 mol/1 nátrium-klorid) viszonylag stabilan tárolható. Csak minimális mennyiségű, 0-7% 125jód29
HU 216 302 Β
FBD csapadékot találtunk 2 hét alatt. Nem szilikonozott csövekben és alacsony sótartalmú pufferben (150 mmol/1 nátrium-klorid) a 125jód-FBD polipeptid 2-3 nap alatt 60-80%-ban kicsapódik. Ilyen körülmények között a kicsapódás, és a cső falán történő adszorpció is jelentős mértéket érhet el.
12. FBD polipeptid reakciója ^C-putreszcinnel
A reakcióban az FBD Gin #3 reakcióképességét merjük a transz-glutamináz reakcióban a XlIIa faktorral szemben.
Módszer: 100 μΐ reakcióelegyet szilikonozott Eppendorf-csövekben reagáltatunk. Összetétele:
mmol/1 CaCl2, mmol/1 Trisz-HCl (pH=7,5), mmol/1 DTT,
120 pmol/l 14C-putreszcin (Sigma), pmol/l FBD és
0,05 egység/ml tengerimalacmáj transz-glutamináz (Sigma).
A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 0,15,30 és 60 percen keresztül inkubáljuk, majd 10 μΐ alíkvot részt 200 μΐ stop reagenst tartalmazó csövekbe töltünk (0,4 mg/ml BSA, 50 mmol/1 EDTA, 150 mmol/1 NaCl, 20 mmol/1 NaHCO3, pH=8,0) 0 °C hőmérsékleten (jégen). 250 μΐ 20%-os hideg TCA-t adunk hozzá, majd 10 percen keresztül jégen inkubáljuk, és további 3 ml 20%-os hideg TCA-t adunk hozzá, majd a csövek tartalmát üvegszűrőn (Whatman GF/C) szűrjük. A szűrletet háromszor 20%-os hideg TCA-val és egyszer 70%-os etanollal mossuk. A TCA-val kicsapható radioaktív anyagot béta-számlálóban számoljuk. Az FBD Gin #3 reakcióképességét a transz-glutamináz reakcióban a 14C-putreszcin specifikus aktivitása, és a reakcióelegyben alkalmazott FBD koncentráció alapján számoljuk. Az összszámlált érték 5%-a 100% reakcióképességnek felel meg.
13. Önasszociáció
A reakciót 300 μΐ 150 mmol/1 nátrium-klorid és 20 mmol/1 NaHCO3 (pH=8,0) elegyében végezzük, amely 0,1 X Tyrode puffért, 0,6% BSA-t, 5 mmol/1 CaCl2-t, 0,15 pmol/l 125jód-FBD polipeptidet és 6 μΐ transz-glutaminázt (0,02 egység/ml) tartalmaz (lásd a
12. pontot).
A reakcióelegyet 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 18 órán keresztül, majd vákuumban bepároljuk, és háromszor 1 ml mosópufferrel mossuk, végül a radioaktivitást gamma-számlálóban mérjük.
II. Eredmények
Az FBD fehérjék egy külön metioninmaradékot tartalmaznak amino-terminális végükön, és a piroglutaminmaradék helyett, amely a p31 kD blokkolt N-terminális maradéka (a kódolt Gin poszt-transzlációs módosítása) az N-terminális metioninmaradékot egy Gln-maradék követi. Az FBD fehérjék pozitív azonosítását az anti20 kD polipeptiddel kifejlesztett gél Westem-foltanalízisével ellenőriztük. A 45 kD polipeptidet az anti-20 kD polipeptiddel és az anti-33 kD sejtkötő doménnel végzett foltanalízissel azonosítottuk.
Az FBD ffagmenseket és a 45 kD FBD-CBD hibrid polipeptidet tovább jellemeztük:
a) fiziko-kémiai tesztek, amelyben a 31 kD poli10 pepiidhez hasonlítottuk (C és D táblázat);
b) in vitro biokémiai és biológiai tesztek a Gin #3 reakcióképessége transz-glutaminázzal katalizált transz-amidálásban (C és D táblázat), önasszociálás, fibrinröghöz történő kötődés (9. pél15 da);
c) in vivő biológiai teszt: vénás vérröghöz történő kötődés patkányban (13. példa).
A D táblázat az FBD polipeptidek és FBD-CBD hibrid polipeptid kémiai és fiziko-kémiai jellemzésével kapott 20 adatokat mutatja. A 12 kD, 18,5 kD és 45 kD polipeptideket a pFN 203-2 plazmiddal, a pFN 20813 plazmiddal és a pFN 202-5 plazmiddal állítjuk elő.
Az E táblázat az FBD polipeptidek gyakorlati mérési eredményeit tartalmazza.
D táblázat
Az FBD fehérjék paramétereinek jellemzése
Módszer Paraméterek
1. SDS-PAGE +ME móltömeg, tisztaság és homogenitás
2. SDS-PAGE -ME móltömeg, tisztaság és homogenitás
3. gélszűrés (szuperóz 12) retenciós idő és sávszélesség felezőmagassága
4. UV spektroszkópia abszorpciós koefficiens (lambdanwx-l%), abszorpciós arány (lambdamM/larnbdamin)
5. belső fluoreszcencia specifikus intenzitás, lambdamlx
6. aminosav-összetétel maradékok száma az elméleti értekhez viszonyítva
7. heparin/szefaróz retenciós idő és sávszélesség felezőmagassága
8. RP-HPLC retenciós idő és sávszélesség felezőmagassága
9. Ellman szabad tiolcsoportok mennyisége
10. reakció l4Cputreszcinnel az elméleti kötés%-a: Gin #3 reakcióképessége a transzglutamináztól függő transzamidálásban (0,5% alatti kötés az enzim távollétében)
E táblázat
FBD fehérjék mért értékei
Fehérje rl8,5kD rl2kD r45 kD r31 kD
1. SDS-PAGE +ME 18,5 kD>98% 14,2 kD>98% 42 kD>90% 31 kD>98%
2. SDS-PAGE -ME 17,7 kD>98% 14,4 kD>98% 41 kD>90% 28 kD>98%
3. Gélszűrés (Szuperóz 12) 18,29 perc; 3 mm 19,03 perc; 2,5 mm 16,56 perc; 2 mm 17,41 perc; 3 mm
HU 216 302 Β
E táblázat (folytatás)
Fehérje rl8,5 kD rl2kD r45 kD r31 kD
4. UV-spektroszkópia 19,2; 1,84 13,5; 2,02 - 17,7; 1,55
5. Belső fluoreszcencia 340 nm; 10,3 339 nm; 14,4 - 3,43 nm; 18,1
6. Aminosav-összetétel azonos az elméleti értékkel azonos az elméleti értékkel - azonos az elméleti értékkel
7. Heparin-szefaróz 32,77 perc; 8 mm 31,14 perc; 8 mm 34,00 perc; 8,5 mm 36,50 perc; 9 mm
8. RP-HPLC 23,02 perc; 1 mm 21,50 perc; 1 mm - 23,76 perc; 2 mm
9. Ellman <0,2% <0,2% - <1%
10. Reakció 14C-putreszcinnel 86,0% 100,0% - 91%
12. példa
Irányított trombolízis FBD-SR komplex alkalmazásával
I. Bevezetés
A gyógyszeripar egyik fő célja egy egyszerű és hatékony fibrin irányított trombolitikus szer kidolgozása. Az ilyen szer kifejlesztésére irányuló találmány szerinti megoldás azon a megfigyelésen alapszik, hogy a fibronektin N-terminális fibrinkötő doménje (FBD) specifikus keresztkötést alakít ki a fibrinröggel a XHIa faktoron keresztül. Mivel az újonnan képződött vérrög az egyetlen olyan környezet, amely nagy mennyiségben tartalmaz aktivált XIII. faktort, az FBD szívesebben kötődik az új vérröghöz, mint a régebbi vérrögökhöz, és sokoldalúan felhasználható hordozóanyagot képez. Kémiai keresztkötéssel kimér FBD-sztreptokináz konjugátumot állítunk elő, és vizsgáljuk hatékonyságát a vérrög feloldásában.
A szövet plazminogén aktivátor (TPA) és a sztreptokináz (SK) a legjobb ismert fibrinolitikus szerek, amelyek a kardiovaszkuláris terápiában felhasználhatók. A TPA és az SK lebontja a fibrint, de különböznek a hatás mechanizmusában. A TPA fibrin szelektív plazminogénaktiválást eredményez. A TPA szelektivitása a molekula amino-terminális szakaszán található fibrinkötő helyeknek köszönhető. A TPA Kd=0,16 pmol/l értékkel kötődik a fibrinhez. A fibrinhez kötve a Km értéke a plazminogénaktiválás folyamatában 83 pmol/l értékről 0,18 pmol/l értékre változik a plazminogén plazminná történő hatékony enzimatikus átalakulásának következtében.
Az SK kölcsönhatásba lép a plazminogénnel és aktivációs komplexet képez, amely katalizálja a plazmin kialakulását. Ez a kölcsönhatás nem függ a fibrinkötődéstől. Az akvitált SK-plazminogénkomplex a véráramban katalizálja a keringő plazminogén plazminná történő szisztematikus átalakítását. Az aktivált plazmint általában az a2-antiplazmin gátolja. A gátló kapacitás kimerítése után a szabad fibrinogén, fibrin és néhány más plazmafehéije lebomlik a plazmin hatására. A bekövetkező fibrinogenolízis tönkreteszi a normális koagulációs mechanizmust, és fokozza a vérzés veszélyét.
A TPA fibrinnel mutatott affinitása alapján feltételezhető, hogy előnyösebben alkalmazható fibrinolitikus szerként, mint a fibrint nem kötő SK. A TPA és az SK terápiás hatékonyságát kiterjedt humán klinikai vizsgálatokban hasonlították össze. A felgyűlt adatok szerint az SK a legtöbb beteg esetében előnyösen alkalmazható (Scrip No. 1597, 22-23. oldal, 1991. március 8.). Továbbra is szükség van azonban olyan javított fibrinolitikus szer kidolgozására, amely fokozott fibrinszelektivitást mutat. A kívánt molekulák előállításához igénybe vettük a kémiai keresztkötés módszerét és a rekombináns DNS-technológiát. Több kimér plazminogén aktivátor molekulát állítottunk elő, amelyek különböző affmitású fibrinkötő doméneket tartalmaznak különböző plazmafehéqékből vagy antifibrin monoklonális antitestet tartalmaznak a TPA katalitikus doménjéhez kötve. Ezeket a molekulákat különböző farmakológiái vizsgálatokban analizáltuk terápiás hatékonyságuk vonatkozásában.
Az aktivált XIII faktor (transz-glutamináz) a fibrinmolekulák keresztkötését katalizálja a vérkoaguláció utolsó lépésében, ezáltal növeli a rög mechanikai stabilitását. Mint a 6B példa említi, a sértetlen plazmafibronektin (FN) szintén keresztkötéseket alakít ki a fibrinnel a XlIIa faktor segítségével.
Mint a 2. és 4. példa ismerteti, különböző FN EBD polipeptid fragmenseket klónoztunk és fejeztünk ki (12 kD, 18,5 kD, 20 kD és 31 kD fragmensek). Ezeket a polipeptideket in vitro és in vivő vizsgáltuk a fibrinröggel és a vérröggel XlIIa faktor jelenlétében kialakított kovalens kötésekre vonatkozó reakcióképességben (6., 9. és 13. példa). Kihasználtuk az FBD-molekulák fokozott képességét a fibrinnel kialakított kovalens kötésben, és kémiai keresztkötés módszerével (vagy rekombináns DNS-technikával) kimér FBD-SK-molekulákat állítottunk elő, amelyek az SK-molekulát a vérröghöz szállítják, és ezáltal csökkentik a vérzés veszélyét.
II. Kémiai származékképzés és keresztkötés kialakítása
FBD- és SK-molekulával
Az FN amino-terminális szakaszát magában foglaló FBD polipeptideket és fragmenseket N-szukcinimidil3-(2-piridil-ditio)-propionáttal (SPDP) származékká alakítottuk, amely hetero-bifunkcionális keresztkötő anyag.
Az SPDP lúgos pH-η primer aminnal reagálva 2-piridil-diszulfid-csoportokat visz be a fehérjébe. A fényelnyelés 343 nm-en történő mérésével, ami ebben a pH tartományban a módosított FBD redukciója után felszabaduló tio-piridin-csoportra specifikus, meghatározható a keresztkötéses csoportok FBD-molekulára vonatkoztatott száma. A plazma 31 kD FBD-molekula nagyon alacsony kitermelést eredményez, mivel a
HU 216 302 Β kémiai módosításhoz alkalmazott körülmények között könnyen kicsapódik. További kísérleteket végeztünk a pFN 196-2 plazmíddal előállított rekombináns 12 kD FBD-molekulával (10. ábra). A vizsgálatok szerint mintegy két keresztkötéses maradék épül be minden 12 kD FBD-molekulába.
Az SK-molekulát, amely ciszteinmaradékot nem tartalmaz, 2-imino-tiolánnal alakítottuk át. Ez a reagens primer aminokkal reagál, és tiolcsoporttal végződő térkitöltőt visz be a molekulába. Az SK-molekulába bevitt tiolcsoportok számát Ellman-reagenssel határozzuk meg. Az alkalmazott körülmények között mintegy két tiolcsoportot viszünk be minden SK-molekulába.
A két polipeptidszármazék összekeverésével a szabad tiolcsoport 2-piridil-szulfid-csoportra cserélődik, miáltal diszulfidkötés képződik a két fehérje között, és piridin-2-tiol szabadul fel. A konjugáció akkor optimális, ha az FBD-származék négy-nyolcszoros mólfeleslegben van jelen. Ilyen körülmények között gyakorlatilag minden SK-származékmolekula reagál az FBD-molekulákkal. A konjugációs folyamatot SDSPAGE vizsgálattal és Superose 12 oszlophoz kapcsolt FPLC vizsgálattal analizáljuk. A komplexképződés mintegy 10 perc alatt befejeződik, és különböző menynyiségű FBD- és SK-molekulákat tartalmazó elegyet kapunk.
A kémiai módosítást és a keresztkötés kialakítását Runge és munkatársai: PNAS, USA, 84, 7659-7662 (1987) szerint végezzük.
A kémiai módosításra meghatározott optimális körülmények között az egyes FBD- és SK-molekulákra számolt piridil-diszulfid- és tiolcsoportok száma mintegy 2. A kapott konjugációs elegy főként a kívánt 1:1 hibridet tartalmazza.
Az FBD-SR-komplex izolálása
A konjugált és a szabad SK- és FBD-molekulák elválasztását két lépésben végezzük. Először gélszűrést alkalmazunk Superose 6-gélen, és eltávolítjuk a felesleges 12 kD FBD polipeptidet. Ezután heparin/szefaróz oszlopon kromatografálunk, és elválasztjuk a szabad sztreptokinázt a konjugátumtól, amely a gyantához kötődik 25 mmol/1 nátrium-klorid, 10 mmol/1 Trisz-HCl (pH=7,4) elegy esetében, majd ugyanebben a pufferben felvett 0,5 mol/1 nátrium-kloriddal eluálható. A szabad SK-szennyeződés mennyisége gélelektroforézis vizsgálat szerint a végső készítményben legfeljebb 5%.
Az FBD-SR-komplex funkcionális jellemzése
A heparin/szefaróz kromatográfiásan tisztított keresztkötéses FBD-SK-komplexet a természetes SKmolekulához viszonyítjuk a következő kritériumok alapján:
1. a plazminogén aktiválás kinetikája kromogén S2251 szubsztrátum alkalmazásával (33. ábra);
2. fibrinolítikus aktivitás fibrinlemez vizsgálat alapján (34. ábra), Neville Marsh, Fibrinolysis, 1981 szerint;
3. humán plazmarög roncsolása 125jód fibrinogént tartalmazó rög esetében.
Az eredmények szerint a komplex megtartja az SK plazminogén aktivátor hatékonyságát. A 33. ábra szerint a látszólagos Km érték a plazminogén szubsztrátumra Kp|g=3,l x 106 mol/1 és 1,8 x 106 mol/1 az SK és az FBD-SK-komplex esetében, míg a katalitikus ráta konstans értéke, is Kplg, a komplex esetében 2-es faktorral kisebb, mint az SK-molekula esetében. Emellett, a 34. ábra nem mutat szignifikáns különbséget a roncsolási zónában az SK-molekulával vagy az FBD-SKkomplexszel végzett egy éjszakás inkubálás után.
A 14C-putreszcin tengerimalacmáj transz-glutaminázzal történő beépülésének mértéke az E táblázat és all. példa szerinti adattal összehasonlítva mintegy 40%-a a 12 kD FBD polipeptidnél kapott értéknek (35. ábra). A DTT beépülése a komplex esetén 140%-ra nő. Az SK-molekulában beépülés nem mutatható ki. Ezek az adatok arra utalnak, hogy az FBD-SK-konjugátum megtartja azt a potenciális képességét, hogy XIII. faktor aktiválásán keresztül keresztkötést alakítson ki a vérröggel.
A találmány szerinti megoldás lehetővé teszi rekombináns plazmid által kódolt kimér FBD-SK polipeptid előállítását is.
13. példa
Vérrög in vivő jelölése 111 indium-izotóppal jelölt kD és 18,5 kD FBD polipeptid felhasználásával patkány rozsdamentes acélhurok modellben A kísérletet a 7. példában leírt módon végezzük.
Rekombináns 12 kD, 18,5 kD és 31 kD FBD polipeptid fragmenseket 11‘indium-izotóppal jelölünk a DTPA módszenei (8. példa). A jelölt anyagot (specifikus aktivitás mintegy 5xl06cpm/pg) intravénásán adagoljuk (5χ 106 cpm/patkány) a hurkot hordozó állatoknak (7. példa) 5 órával a hurok beépítése után. A vérrögöt tartalmazó hurkot eltávolítjuk, és az adagolást követő 24 óra elteltével mérjük a radioaktivitást. A 31. ábra a vérrögben és a vérben mért specifikus radioaktivitást, a 32. ábra a vérrög/vér arányt mutatja. Látható, hogy nagy vérrög specifikus radioaktivitást nyerünk a három vizsgált vegyülettel. Magasabb értékek mérhetők a rögben a 31 kD FBD csoportban, mint a 12 kD és a
18,5 kD FBD fragmensek esetében. A vérrög/vér arány azonban nagyobb a 12 kD és a 18,5 kD FBD fragmenseknél, ami a 31 kD FBD polipeptidhez viszonyított alacsonyabb vérszintnek köszönhető. Ez magyarázható a rövidebb fragmensek keskenyebb spektrumával a specifikusság és hatékonyság vonatkozásában a 31 kD polipeptidhez hasonlítva (9. példa, C táblázat).
14. példa
FBD polipeptidek alkalmazása sebgyógyításban
A seb gyógyulás korai szakaszában az epitélium fibrin és fibronektin rétegű gélen migrál a membrán állandó komponenseinek, így a lamininnak és a IV típusú kollagénnek a kialakulása előtt. A fibrint és fibronektint tartalmazó kezdeti plazmagélt könnyen elárasztják a fibroblasztok, és hemosztatikus és adhéziós funkciókat tölt be, és ezáltal átmeneti mátrixként szolgál a sejtmigráció vonatkozásában, és tárolja a kemotaktikus és növekedési faktorokat („seb hormonok”). A fibrin extravaszkuláris gél, amely gyorsan rácsot képez, beépíti a
HU 216 302 Β fibronektint. Kimutatták, hogy a fibroblasztok in vivő jobban kapcsolódnak a fibrinrácshoz, mint a fibronektin [Grinnell F. és munkatársai: Cell, 19, 517-525 (1980); Colvin R. B. és munkatársai: Láb Invest. 41, 464-473 (1979); Knox P. és munkatársai: J. Cell. Bioi. 102, 2318-2323 (1986)]. Ezért feltételezhető, hogy a sebgyógyulás kezdeti folyamatában részt vesz a fibronektin fibrinkötő doménje és sejtkötő doménje. Mivel a fibronektin a fibrinhez főként a fibronektin Gin #3 maradéka transz-glutaminázzal katalizált transzamidálásával kapcsolódik a fibrin lizinmaradékához, minden olyan fibrinkötő dómén polipeptid, amely sértetlen formában tartalmazza a Gin #3 maradékot körülvevő szakaszt, képes lesz reakcióba lépni a fenti rendszerrel. Ezért a találmány szerinti 12 kD és 18,5 kD FBD polipeptid fragmensek a CBD polipeptiddel együtt felhasználhatók a sebgyógyulás elősegítésére. Ennek során felhasználhatók rekombináns CBD polipeptidek, így a WO 90/07577 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentésben ismertetett r33kD és r40kD polipeptidek.
A humán fibronektin FBD sebgyógyulást elősegítő potenciáljának meghatározásához a molekulát sejtszaporodási vizsgálatban teszteljük. A vizsgálat során fibroblasztokat növesztünk üveg fedőlemezen, amelyhez CBD polipeptidet kötöttünk FBD polipeptid jelenlétében vagy távollétében. Ezáltal vizsgáljuk az FBD dómén polipeptid azon képességét, hogy a fibronektin sejtkötő dómén koszubsztrátumaként milyen mértékben fokozza a celluláris gócos adhéziót. A borjú plazmafibronektinből származó 75 kD sejtkötő doménnel (CBD) együtt alkalmazva a plazma FBD, a p31kD és a rekombináns FBD, az r31 kD, mindkettő humán eredetű, azonos módon segíti az NRK fibroblasztok gócos adhézióját. Mindkét humán fehérjedomén sokkal hatékonyabb, mint a megfelelő borjúfragmens, ha azonos koncentrációban alkalmazzuk, vagyis 100 μΐ 10 pg/ml 1:1 arányú FBD és CBD fehérjekeverék esetében (lásd a kísérleti részleteket). A 75 kD CBD önmagában és FBD-vel kombinálva mért hatásának különbsége meglepő. A 75 kD CBD-n vizsgált sejtszaporodás interferencia reflexiós mikroszkopikus vizsgálata (IRM) csak amorf „szürke” sávokat és foltokat mutat [ami a hasi membránreplikátumok elektronmikroszkópikus vizsgálata (EM) szerint clatrinalapú szerkezetekkel társul], de a rekombináns vagy plazma FBD koszubsztrátumként történő beépülése jól definiálható gócos adhéziós szerkezetek képződését váltja ki, ami az IRM-ben sűrű fekete csíkok formájában jelenik meg (a szín erőssége közelebbi kontaktust mutat a hasi felület és a szubsztrátum között). Az IRM/EM összefüggések szerint ez a szoros szabályos adhézió a citoszkeletális megfeszített rostok végének felel meg.
Az FBD és a CBD sebgyógyulásra gyakorolt kombinált hatásának további vizsgálatához 45 kD polipeptidet (12 kD FBD és 33 kD CBD) és 64 kD polipeptidet (31 kD FBD és 33 kD CBD) állítunk elő (12. és 25. ábra). Hasonló hibrid polipeptideket vizsgálunk a 31 kD FBD polipeptid helyett 12 kD vagy
18,5 kD FBD polipeptidet, és a 33 kD CBD polipeptid helyett 40 kD CBD polipeptidet alkalmazva.
Kísérleti részletek
A p75kD CBD polipeptidet (borjú eredetű) és a 31 kD FBD polipeptidet (rekombináns humán eredetű) 10pg/ml koncentrációban 100 μΐ össztérfogatú PBSben nedves atmoszférában 1 órán keresztül szobahőmérsékleten 13 mm-es üveg fedőlemezen (Chance Propper Ltd., Warley, UK) adszorbeáljuk, amit előzetesen egy éjszakán keresztül koncentrált kénsavval kezelünk, majd desztillált vízzel bőségesen leöblítjük. PBSsel (pH = 7,1) végzett mosás után a fedőlemezeket mg/ml PBS-ben felvett ovalbuminnal (Sigma Chemical Co.) 10 percen keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk, és redukáljuk a nem specifikus kapcsolásokat. A szaporodási vizsgálatokat NRK-sejteken végezzük. A sejteket 18 órán keresztül előtenyésztjük, 0,1 mg/ml TPCK tripszinnel (Sigmal Chemical Co.) leválasztjuk, és 20 percen keresztül 37 °C hőmérsékleten Ca2+ iont tartalmazó Eagle-féle minimum tápközegben (EMEM) szuszpendáljuk. A sejteket hipodermikus tűvel ellátott, 5 ml-es fecskendőbe óvatosan felszíva és vegyes% ovalbumint tartalmazó EMEM közeggel háromszor mosva egysejtű szuszpenziót állítunk elő. A sejtek elszaporodását a mosott NRK-sejteknek a fedőlemezen 1 χ 104 sejt/cm2 sűrűség mellett végzett fehéijeszubsztrátumban történő szuszpendálásával mutatjuk ki. Ezt interferencia reflexiós és fáziskontraszt mikroszkóppal vizsgáljuk, amelyhez x50/l,0 és xl00yi,32 PHACO RK objektívvei és fényképezőgéppel (Kodak technical Pan 241535 mm-es film) ellátott Leitz Ortholux II mikroszkópon mérjük. Két óra elteltével az élő sejteket 2,5 térfogat% glutár-aldehiddel (TAAB Labs, Reading, Berk, UK) 0,1 mol/1 nátriumkakodilát pufferben fixáljuk, és a fixált sejteket elektronmikroszkóppal vizsgáljuk.
15. példa
Nagy radiokémiái tisztaságú 111 indium-izotóppal jelölt DTPA-val módosított FBD fehérjék alkalmazása nagy vérrög/vér arány elérése érdekében patkány modellben 1. FBD fehérjék módosítása és radiojelölése Javítottuk az FBD fehérjék DTPA-val történő módosításának és a DTPA módosított FBD fehérjék radiojelölésének 8. példában ismertetett módszerét. A javítások következtében nagy vérrög/vér arány érhető el a patkány hurok modellben.
1.1 DTPA-módosítás: A három rekombináns r31kD, rl8,5kD és rl2kD polipeptidet hússzoros feleslegű DTPA-val módosítjuk 0,1 mol/1 hepes pufferben (pH=7,0), és a DTPA feleslegét gélszűréssel távolítjuk el.
1.2 Radiojelölés: Az egyik bevezetett változás szerint a radiojelölést niInCl3 vegyülettel végezzük alacsony pH-értéken (0,2 mol/1 citrátpuffer, pH=5,7), amellyel minimális mértékre csökkentettük a radiokolloidok mennyiségét. Egy további óvatossági rendszabállyal biztosítjuk a szennyező nehézfémionok eltávolítását, amelyek képesek a DTPA módosított fehérje 11 'indium-izotóppal kialakított kelátjának a helyére lépni. Ehhez a radiojelölésű FBD oldat pufferét Chelex100-zal kezelt pufferre cseréljük.
HU 216 302 Β
2. Az FBD fehérjék módosítása és radiojelolése
Az r31 kD, rl 8,5 kD és rl2 kD polipeptid fragmensek javított DTPA módosítását és radiojelölését az alábbiak szerint végezzük:
2.1 Só mentesítés: A fehérjéket 0,5 mol/l nátriumklorid oldatban, amely millimol mennyiségben EDTA-t és más proteát inhibitort tartalmaz, sómentesítjük, és HEPES pufferbe (0,1 mol/l, pH=7) visszük. A 31 kD FBD polipeptid (27 ml, 0,6 mg/ml) sómentesítését dialízissel, míg a 18,5 kD FBD polipeptid (5 ml, 8,7 mg/ml) és a 12 kD FBD polipeptid (5 ml, 5,6 mg/ml) sómentesítését PD-10 gélszűrő oszlopon végezzük.
2.2 DTPA-módosítás: A módosítást 20-szoros feleslege DTPA anhidriddel 1 órán keresztül szobahőmérsékleten végezzük 27 ml térfogatban a 31 kD FBD polipeptid esetében, és 7 ml térfogatban a 12 kD és a
18,5 kD FBD polipeptid esetében. A módosított elegy alikvot részét (100 μΐ) félretesszük a fehérjébe beépült DTPA maradékok számának meghatározásához, és a szabad DTPA-t a maradék elegyből gélszűréssel 20 2,6x60 cm-es Sephadex G-25 oszlopon eltávolítjuk, amit előzetesen HEPES pufferrel egyensúlyoztunk ki és fejlesztettünk ki. A fehérjét tartalmazó frakciókat (30 ml) összegyűjtjük, és a kapott fehérjekoncentráció 0,35 mg/ml az r31 kD polipeptid esetében, 0,8 mg/ml 25 az rl8,5 kD polipeptid esetében, és 0,9 mg/ml az rl2 kD FBD polipeptid esetében. A módosítás mértéke szilikagélen végzett vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat szerint (kifejlesztés 85% metanolban) 1,1, 0,8 és 1,6 a megadott FBD fehérjék vonatkozásában. A DTPA módosítású FBD fehérjéket -20 °C hőmérsékleten tároljuk, és alikvot részét felolvasztva radiojelölést végzünk 'indium-izotóppal.
2.3 Radiojelölés: A jelölést *InCl3 vegyülettel végezzük, amelyet 0,2 mol/l nátríum-citrátban (pH=5,7) 35 veszünk fel, ehhez 125 μΐ 1 mol/l nátrium-citrátot (pH=-5,7) adva 500 μΐ hordozómentes *InCl3 törzsoldatot kapunk ('In izotóp 3,2 mCi/ml). A radiojelöléshez alkalmazott reakcióelegy összetétele (végső koncentrációkban): 0,2 pg/ml FBD fehérje, 60 mmol/1 HEPES, 10 mmol/1 HC1, 0,2 mol/l nátrium-citrát és 0,8 μΟί/μΙ 'In izotóp. A reakciót 1 órán keresztül szo5 bahőmérsékleten végezzük. A radiokémiái tisztaságot szilikagélen, vékonyréteg-kromatográfiásan ellenőrizzük (kifejlesztve 85% metanolban), és ennek értéke a vizsgált FBD polipeptid fragmensek esetében 91-95%. Ennek megfelelően, a radioaktív jelölésű FBD poli10 peptid specifikus aktivitása mintegy 3,6 pCi/pg (8 χ 106 cpm/pg). Mivel az alkalmazott pufferben nyomelemként jelen lévő nehézfémionok lecserélhetik a 'indium-izotópot, amely a DTPA módosított FBD fehérjéhez kötődik, a radiojelölésű FBD fehérjéket 10 ml 15 Sephadex G-25 ágyon visszük át, amit előzetesen BSAt tartalmazó BBS pufferrel egyenlítünk ki és fejlesztünk ki. Ezt előzetesen Chelex-100-zal kezeljük (a fémion szennyeződések eltávolítása érdekében).
3. Biológiai aktivitás
A biológiai aktivitást in vitro a 'In jelölésű DTPA módosított FBD-nek előre kialakított rögökhöz történő kötődésében és in vivő rozsdamentes acélhurokkal indukált vénásvérrög-modellben patkányokon vizsgáljuk.
3.1 Előre kialakított röghöz történő kötődés
A vizsgálatot lényegében a 6. példában jódozott
FBD polipeptid vonatkozásában ismertetett módon végezzük. A három 'In jelölésű DTPA módosított FBD fehérjespecifíkus aktivitása 6xl06 cpm/pg fehérje. A vizsgálat eredményeit az F táblázatban (2. oszlop) adjuk meg.
3.2 Vénás vérrög patkányban
Az alkalmazott modellt (hurokkal indukált vénás vérrög patkányban) a 7. példában ismertetjük. A kísérletek során minden csoport 7 állatból áll, amelyeknek 5 χ 106 cpm 'In jelölésű DTPA módosított FDB fehérjét (specifikus aktivitás 6χ 106 cpm/pg fehérje) adagolunk. A kísérletek eredményeit az F táblázatban (3. oszlop) adjuk meg.
F táblázat
In vitro vizsgálat Vénás vérrög patkányban
Specifikus radioaktivitás (cpm/ g) Vérrög/vér arány
FBD fehérje Bevitt radioaktivitás százaléka a) Vérrög Vér
rl2kD 24% 24264±2700 375 ±77 78,2 ±17,3
rl8,5kD 26% 28548±5028 289±41 98,3± 13,3
r31kD 24% 19796±4144 1198±83 15,6± 2,4
a) Az értékek mintegy 50%-át a transz-glutaminázt gátló jód-acetát jelenlétében határoztuk meg.
HU 216 302 Β
Irodalmi hivatkozások
1) Uehara A. és munkatársai: J. Nuclear Med. 29, 1264-1267(1988)
2) Zoghbi S. S. és munkatársai: Invest. Rádió. 20, 198-202 (1985)
3) Kakkar V. V. és munkatársai: Láncét, I, 540-542 (1970)
4) Knight L. C.: Nuclear Med. Commun. 9, 849-857(1988)
5) Knight L. C.: Nuclear Med. Commun. 9, 823-829 (1988)
6) Som P. és munkatársai: J. Nuc. Med. 27, 1315-1320 (1986)
7) Palabrica T.M. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1036-1040 (1989)
8) Akiyama S. K. és Yamada K. M.: Adv. Enzymol. 57, 1-57 (1987)
9) Pierschbacher M. D. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 257, 9593-9597 (1982)
10) Pande H. és Shively J. E.: Arch. Biochem. Biophys. 213, 258-265 (1982)
11) Hayashi M. és Yamada K. M.: J. Bioi. Chem. 258, 3332-3340(1983)
12) Sekiguchi K. és Hakomori S. I.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2661-2665 (1980)
13) Ruoslahti E. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 256, 7277-7281 (1981)
14) Owens R. J. és Baralle F. E.: EMBO J. 5, 2825-2830(1988)
15) Obara M. és munkatársai: FEBS Letters 213, 261-264(1987)
16) Obara M. és munkatársai: Cell 53, 699 (1988)
17) Ichihara-Tanaka K. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 265, 401-407 (1990)
18) Mandel és munkatársai: Principal and Practice of Infectious Disease 2, 1531-1552(1979)
19) Proctor R. A. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 255, 1181-1188(1980)
20) Eldor A. és munkatársai: Thrombosis and Haemostatis 56(3), 333-339 (1986)
21) Fritzberg A. R.: Nucl. Med. 26, 7-12 (1987)
22) Young R. A. és Davis R. W.: Proc. Natl, Acad. Sci. USA 80, 1194-1198(1983)
23) Hugh T. és munkatársai: DNA Cloning: A Practical Approach (D. Glover), IRL Press, Oxford, (1984)
24) Vogel és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 3180-3184(1972)
25) Bagly D. és munkatársai: Methods in Enzymol. 45, 669-678(1976)
26) Wagner és Hynes: J. Bioi. Chem. 254, 6746-6754 (1979)
27) McDonagh R. P. és munkatársai: FEBS Lett. 127, 174-178(1981)
28) Mosher és munkatársai: J. Bioi. Chem. 255, 1181-1188 (1980)
29) Russel P. B. és munkatársai: J. Clin. Micro. 25, 1083-1087 (1987)
30) Bolton A. E. és Hunter W.M.: Biochem. J. 133, 529 (1973)
31) Obara és munkatársai: Cell 53, 649-657 (1988)
32) Fritzberg A. R. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 4025-4029 (1988)
33) Knight L. C. és munkatársai: Radiology 173, 163-169(1989)
34) Wasser Μ. N. J. M. és munkatársai: Blood 74, 708-714(1989)
35) Burger J. J. és munkatársai: Methods in Enzymology 112, 43-56 (1985)
36) Yamamoto K. és munkatársai: Eur. J. Nucl. Med. 14, 60-64(1988)
37) Peterson és munkatársai: Fibronectin (kiadó: Moshen, Academic Press USA), 1-24. oldalak (1989) [különösen az 5. oldalon lévő 2. ábra].

Claims (35)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás fibrintartalmú anyagok leképezésére, azzal jellemezve, hogy a leképezendő fibrintartalmú anyagot leképezhető markerrel jelölt polipeptiddel érintkeztetjük, ahol a polipeptid aminosav-szekvenciája lényegében azonos a természetes humán fibronektin N-terminális fibrinkötő doménjében található szekvenciával, fibrin megkötésére alkalmas, móltömege legalább mintegy 6 kD és legfeljebb mintegy 20 kD, és N-terminális aminosav-szekvenciája gln-ala-gln-gln vagy met-glnala-gln-gln.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fibrintartalmú anyag trombusz.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fibrintartalmú anyag ateroszklerotikus plakk.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptid móltömege legalább mintegy 12 kD és legfeljebb mintegy 18,5 kD.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptid egy 18,5 kD polipeptid, amely a humán fibronektin N-terminális fibrinkötő doménjében található szekvenciával lényegében azonos aminosavszekvenciaként 2. ábra szerint 1-154 aminosavból álló aminosav-szekvenciával rendelkezik.
  6. 6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptid egy 12 kD polipeptid, amely a humán fibronektin N-terminális fibrinkötő doménjében található szekvenciával lényegében azonos aminosav-szekvenciaként 2. ábra szerint 1-109 aminosavból álló aminosav-szekvenciával rendelkezik.
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptid egy 20 kD polipeptid, amely a humán fibronektin N-terminális fibrinkötő doménjében található szekvenciával lényegében azonos aminosav-szekvenciaként 2. ábra szerint 1-153 aminosavból álló aminosav-szekvenciával rendelkezik.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptid legfeljebb 20 további aminosavat tartalmaz.
  9. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy markerként radioaktív izotópot, röntgensugarak számára átlátszatlan elemet vagy paramágneses iont, előnyösen indium-111, technécium-99m, jód-123, jód35
    HU 216 302 Β
    125, jód-131, kripton-81m, xenon-133 és gallium67 izotóp közül megválasztott izotópot alkalmazunk.
  10. 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a leképezést gamma-kamera segítségével végezzük.
  11. 11. Eljárás a természetes humán fibronektin N-terminális fibrinkötő doménjében található szekvenciával lényegében azonos aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptid előállítására, amely képes a fibrin megkötésére, móltömege legalább mintegy 6 kD és legfeljebb mintegy 20 kD, és N-terminális aminosav-szekvenciája gln-ala-gln-gln vagy met-gln-ala-gln-gln, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet kódoló DNS-t és megfelelő szabályozó elemeket kódoló DNS-t tartalmazó plazmidot, ahol az utóbbi DNS-nek a polipeptidkódoló DNS-hez viszonyított elhelyezkedése biztosítja a polipeptid kifejezését, tartalmazó sejtet kezelünk, a DNS-sel irányítjuk a polipeptid kifejezését, a sejttel polipeptidet fejezünk ki, és az így kifejezett polipeptidet a sejtből feltárjuk.
  12. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptid egy 12kD polipeptid.
  13. 13. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptid egy 20kD polipeptid.
  14. 14. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejt baktériumsejt.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a baktériumsejt Escherichia coli sejt.
  16. 16. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a plazmid E. coli A1645 törzsben ATCC 67831 számon deponált pFN949-2 plazmid.
  17. 17. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a plazmid E. coli A4255 törzsben ATCC 68328 számon deponált pFN949-2 plazmid.
  18. 18. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a plazmid E, coli A4255 törzsben ATCC 68606 számon deponált pFN949-2 plazmid.
  19. 19. Eljárás olyan polipeptid hajtogatására és oxidálására, amelynek aminosav-szekvenciája lényegében azonos a természetes humán fibronektin N-terminális fibrinkötő doménjében található szekvenciával, fibrin megkötésére alkalmas, móltömege legalább mintegy 6 kD és legfeljebb mintegy 20 kD, és N-terminális aminosav-szekvenciája gln-ala-gln-gln vagy met-gln-alagln-gln, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet tioltartalmú vegyülettel és diszulfiddal érintkeztetjük, és a polipeptidet hajtogatjuk és oxidáljuk.
  20. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tioltartalmú vegyületként glutationt, tioredoxint, β-merkapto-etanolt és/vagy ciszteint alkalmazunk.
  21. 21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tioltartalmú vegyületként β-merkapto-etanolt és diszulfidként levegő bevezetésével in situ előállított diszulfidot alkalmazunk.
  22. 22. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további lépésként a polipeptidet denaturálószerrel kezeljük.
  23. 23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy denaturálószerként guanidin-hidrokloridot vagy karbamidot alkalmazunk.
  24. 24. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet alacsony koncentrációban alkalmazzuk.
  25. 25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet 1000 pg/ml alatti koncentrációban alkalmazzuk.
  26. 26. Eljárás tisztított, biológiailag aktív polipeptid kinyerésére, amelynek aminosav-szekvenciája lényegében azonos a természetes humán fibronektin N-terminális fibrinkötő doménjében található szekvenciával, fibrin megkötésére alkalmas, móltömege legalább mintegy 6 kD és legfeljebb mintegy 20 kD, és N-terminális aminosav-szekvenciája gln-ala-gln-gln vagy met-gln-alagln-gln, azzal jellemezve, hogy
    a) a polipeptidet kódoló DNS-t tartalmazó plazmid kifejezésével baktériumsejtben egy első polipeptidet állítunk elő, amely a kívánt polipeptid aminosav-szekvenciáját tartalmazza, de hiányoznak a diszulfidkötések;
    b) a sejtet roncsolva az első polipeptidet tartalmazó lizátumot állítunk elő;
    c) a lizátumot centrifugálva koncentráljuk az első polipeptidet;
    d) a koncentrált első polipeptidet elválasztjuk;
    e) az elválasztott, koncentrált első polipeptidet szolubilizáljuk;
    f) a szolubilizált első polipeptidet hajtogatjuk és oxidáljuk, és így biológiailag aktív polipeptidet képezünk;
    g) a hajtogatott és oxidált, biológiailag aktív polipeptidet elválasztjuk;
    h) a tisztított, hajtogatott és oxidált, biológiailag aktív polipeptidet visszanyeljük, és
    i) a biológiailag aktív polipeptidet tisztítjuk.
  27. 27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hajtogatáshoz és oxidáláshoz a polipeptidet tioltartalmú vegyülettel és diszulfiddal kezeljük.
  28. 28. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tioltartalmú vegyületként glutationt, tioredoxint, βmerkapto etanolt és/vagy ciszteint alkalmazunk.
  29. 29. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tioltartalmú vegyületként β-merkapto-etanolt és diszulfidként levegő bevezetésével in situ előállított diszulfidot alkalmazunk.
  30. 30. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további lépésként a polipeptidet denaturálószerrel kezeljük.
  31. 31. A 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy denaturálószerként guanidin-hidrokloridot vagy karbamidot alkalmazunk.
  32. 32. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet alacsony koncentrációban alkalmazzuk.
  33. 33. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet 1000 rig/ml alatti koncentrációban alkalmazzuk.
  34. 34. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a koncentrált első polipeptid d) lépés szerinti elválasztását kromatográfiásan végezzük.
  35. 35. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kromatografálást heparin-szefaróz kromatográfiával végezzük.
HU9203516A 1990-05-21 1991-05-21 Eljárás fibrintartalmú anyagok leképezésére és fibrinkötő domén polipeptidek előállítására HU216302B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/526,397 US5270030A (en) 1988-12-29 1990-05-21 Fibrin binding domain polypeptide and method of producing

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9203516D0 HU9203516D0 (en) 1993-04-28
HUT66189A HUT66189A (en) 1994-10-28
HU216302B true HU216302B (hu) 1999-06-28

Family

ID=24097174

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9203516A HU216302B (hu) 1990-05-21 1991-05-21 Eljárás fibrintartalmú anyagok leképezésére és fibrinkötő domén polipeptidek előállítására

Country Status (18)

Country Link
US (4) US5270030A (hu)
EP (1) EP0651799B1 (hu)
JP (1) JP3419772B2 (hu)
AT (1) ATE183545T1 (hu)
AU (1) AU660618B2 (hu)
CA (1) CA2083271C (hu)
DE (1) DE69131539T2 (hu)
DK (1) DK0651799T3 (hu)
ES (1) ES2137928T3 (hu)
FI (1) FI108298B (hu)
GR (1) GR3031708T3 (hu)
HK (1) HK1013255A1 (hu)
HU (1) HU216302B (hu)
IL (1) IL98197A0 (hu)
NO (1) NO310559B1 (hu)
NZ (1) NZ238208A (hu)
RU (1) RU2109750C1 (hu)
WO (1) WO1991017765A1 (hu)

Families Citing this family (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5972890A (en) * 1988-05-02 1999-10-26 New England Deaconess Hospital Corporation Synthetic peptides for arterial imaging
US5679320A (en) * 1988-12-29 1997-10-21 Bio-Technology General Corp. Fibrin binding domain polypeptides and uses and methods of producing same
US5270030A (en) * 1988-12-29 1993-12-14 Bio-Technology General Corp. Fibrin binding domain polypeptide and method of producing
US7087722B1 (en) * 1988-12-29 2006-08-08 Savient Pharmaceuticals, Inc. Fibrin binding domain polypeptides and uses and methods of producing same
US6034233A (en) * 1990-05-04 2000-03-07 Isis Pharmaceuticals Inc. 2'-O-alkylated oligoribonucleotides and phosphorothioate analogs complementary to portions of the HIV genome
US5792742A (en) * 1991-06-14 1998-08-11 New York University Fibrin-binding peptide fragments of fibronectin
CA2110283A1 (en) * 1992-03-31 1993-10-14 Tatsutoshi Nakahata Physiologically active protein and hemotopoietic stem cell growth agent
US5968476A (en) * 1992-05-21 1999-10-19 Diatide, Inc. Technetium-99m labeled peptides for thrombus imaging
DK145092D0 (hu) * 1992-12-03 1992-12-03 Novo Nordisk As
US5750088A (en) 1993-03-30 1998-05-12 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Stable hydrazones linked to a peptide moiety as reagents for the preparation of radiopharmaceuticals
US5879657A (en) * 1993-03-30 1999-03-09 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Radiolabeled platelet GPIIb/IIIa receptor antagonists as imaging agents for the diagnosis of thromboembolic disorders
US6218529B1 (en) * 1995-07-31 2001-04-17 Urocor, Inc. Biomarkers and targets for diagnosis, prognosis and management of prostate, breast and bladder cancer
US6288214B1 (en) * 1996-05-16 2001-09-11 Texas A&M University Systems Collagen binding protein compositions and methods of use
US20030176663A1 (en) * 1998-05-11 2003-09-18 Eidgenossische Technische Hochscule Specific binding molecules for scintigraphy
JP4199420B2 (ja) * 1998-05-15 2008-12-17 ジーイー・ヘルスケア・リミテッド 標識化グルタミンおよびリジンアナログ
IN190822B (hu) 1998-12-24 2003-08-23 Council Scient Ind Res
US6808698B1 (en) 1999-03-26 2004-10-26 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Method for localization of blood clots
US6426145B1 (en) 1999-05-20 2002-07-30 Scimed Life Systems, Inc. Radiopaque compositions for visualization of medical devices
US6254852B1 (en) 1999-07-16 2001-07-03 Dupont Pharmaceuticals Company Porous inorganic targeted ultrasound contrast agents
US6685914B1 (en) 1999-09-13 2004-02-03 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Macrocyclic chelants for metallopharmaceuticals
CA2400622A1 (en) * 2000-02-24 2001-08-30 Eidgenossische Technische Hochschule Zurich Antibody specific for the ed-b domain of fibronectin, conjugates comprising said antibody, and their use for the detection and treatment of angiogenesis
US20020197700A1 (en) * 2000-09-07 2002-12-26 Schering Ag Receptor of the EDb-fibronectin domains
AU2002213003A1 (en) * 2000-10-03 2002-04-15 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Method for detecting and excising nonpalpable lesions
US20030027135A1 (en) 2001-03-02 2003-02-06 Ecker David J. Method for rapid detection and identification of bioagents
US7226739B2 (en) 2001-03-02 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations
US20040121309A1 (en) 2002-12-06 2004-06-24 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bioagents in blood, bodily fluids, and bodily tissues
US7666588B2 (en) 2001-03-02 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy
US20040121314A1 (en) * 2002-12-06 2004-06-24 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bioagents in containers
US20020169288A1 (en) * 2001-03-15 2002-11-14 Magnus Hook Collagen-binding adhesin from staphylococcus epidermidis and method of use
US8073627B2 (en) 2001-06-26 2011-12-06 Ibis Biosciences, Inc. System for indentification of pathogens
US7217510B2 (en) 2001-06-26 2007-05-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for providing bacterial bioagent characterizing information
US20030224476A1 (en) * 2002-03-01 2003-12-04 Szu-Yi Chou Method of producing transglutaminase reactive compound
EP1578399A4 (en) 2002-12-06 2007-11-28 Isis Pharmaceuticals Inc METHODS FOR RAPID IDENTIFICATION OF PATHOGENS IN HUMANS AND BEETS
US8046171B2 (en) 2003-04-18 2011-10-25 Ibis Biosciences, Inc. Methods and apparatus for genetic evaluation
US8057993B2 (en) 2003-04-26 2011-11-15 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of coronaviruses
US7964343B2 (en) 2003-05-13 2011-06-21 Ibis Biosciences, Inc. Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US8158354B2 (en) 2003-05-13 2012-04-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US7319149B2 (en) * 2003-06-13 2008-01-15 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Chelants and macrocyclic metal complex radiopharmaceuticals thereof
US7317104B2 (en) 2003-06-13 2008-01-08 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Chelants and macrocyclic metal complex radiopharmaceuticals thereof
US8242254B2 (en) 2003-09-11 2012-08-14 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of bacteria
US8097416B2 (en) 2003-09-11 2012-01-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US8546082B2 (en) 2003-09-11 2013-10-01 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
WO2005072057A2 (en) 2004-01-30 2005-08-11 Quark Biotech, Inc. Oligoribonucleotides and methods of use thereof for treatment of fibrotic conditions and other diseases
US7666592B2 (en) 2004-02-18 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent
US8119336B2 (en) 2004-03-03 2012-02-21 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of alphaviruses
EP2458619B1 (en) 2004-05-24 2017-08-02 Ibis Biosciences, Inc. Mass spectrometry with selective ion filtration by digital thresholding
US20050266411A1 (en) 2004-05-25 2005-12-01 Hofstadler Steven A Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA
US7811753B2 (en) 2004-07-14 2010-10-12 Ibis Biosciences, Inc. Methods for repairing degraded DNA
EA012799B1 (ru) 2004-08-16 2009-12-30 Кварк Фармасьютикалс, Инк. Терапевтические применения ингибиторов rtp801
WO2006135400A2 (en) 2004-08-24 2006-12-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapid identification of recombinant organisms
KR101409241B1 (ko) 2004-09-28 2014-06-24 쿠아크 파마수티칼스 인코퍼레이티드 탈모증, 급성신부전증 및 다른 질환의 치료를 위한 올리고리보뉴클레오티드 및 그것의 사용방법
US8084207B2 (en) 2005-03-03 2011-12-27 Ibis Bioscience, Inc. Compositions for use in identification of papillomavirus
US8182992B2 (en) 2005-03-03 2012-05-22 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of adventitious viruses
JP5162447B2 (ja) * 2005-04-13 2013-03-13 アイビス バイオサイエンシズ インコーポレイティッド アデノウイルスの同定に用いる組成物
US7414254B2 (en) * 2005-06-28 2008-08-19 United Pharmacy Partners, Inc. Tungsten pig for radio-pharmaceuticals
AU2006272776B2 (en) 2005-07-21 2012-01-19 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid identification and quantitation of nucleic acid variants
NL2000439C2 (nl) 2006-01-20 2009-03-16 Quark Biotech Therapeutische toepassingen van inhibitoren van RTP801.
US9149473B2 (en) 2006-09-14 2015-10-06 Ibis Biosciences, Inc. Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens
JP2010507387A (ja) 2006-10-25 2010-03-11 クアーク・ファーマスーティカルス、インコーポレイテッド 新規のｓｉＲＮＡおよびその使用方法
US8871471B2 (en) 2007-02-23 2014-10-28 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic DNA analysis
WO2008151023A2 (en) 2007-06-01 2008-12-11 Ibis Biosciences, Inc. Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids
AU2008306455C1 (en) 2007-10-03 2014-04-17 Quark Pharmaceuticals, Inc. Novel siRNA structures
US8253725B2 (en) * 2007-12-28 2012-08-28 St. Jude Medical, Atrial Fibrillation Division, Inc. Method and system for generating surface models of geometric structures
EP2293800B1 (en) 2008-06-06 2016-10-05 Quark Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of ear disorders
WO2010033627A2 (en) 2008-09-16 2010-03-25 Ibis Biosciences, Inc. Sample processing units, systems, and related methods
US8534447B2 (en) 2008-09-16 2013-09-17 Ibis Biosciences, Inc. Microplate handling systems and related computer program products and methods
US8550694B2 (en) 2008-09-16 2013-10-08 Ibis Biosciences, Inc. Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, systems, and methods
US8864821B2 (en) 2008-11-26 2014-10-21 Visen Medical, Inc. Methods and compositions for identifying subjects at risk of developing stent thrombosis
WO2010080452A2 (en) 2008-12-18 2010-07-15 Quark Pharmaceuticals, Inc. siRNA COMPOUNDS AND METHODS OF USE THEREOF
WO2010093943A1 (en) 2009-02-12 2010-08-19 Ibis Biosciences, Inc. Ionization probe assemblies
GB0905328D0 (en) * 2009-03-27 2009-05-13 Ge Healthcare Ltd Indole derivatives
WO2011008971A1 (en) 2009-07-17 2011-01-20 Ibis Biosciences, Inc. Lift and mount apparatus
US9194877B2 (en) 2009-07-17 2015-11-24 Ibis Biosciences, Inc. Systems for bioagent indentification
ES2628739T3 (es) 2009-10-15 2017-08-03 Ibis Biosciences, Inc. Amplificación por desplazamiento múltiple
JP2013511990A (ja) 2009-11-26 2013-04-11 クォーク ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド 末端置換を含むｓｉＲＮＡ化合物
WO2011072091A1 (en) 2009-12-09 2011-06-16 Quark Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating diseases, disorders or injury of the cns
WO2011084193A1 (en) 2010-01-07 2011-07-14 Quark Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compounds comprising non-nucleotide overhangs
CN103097534B (zh) 2010-06-24 2017-07-28 夸克制药公司 针对rhoa的双链rna化合物及其用途
CA2818024C (en) 2010-12-06 2019-09-24 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double stranded oligonucleotide compounds comprising positional modifications
CA2828544A1 (en) 2011-03-03 2012-09-07 Quark Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide modulators of the toll-like receptor pathway
US9796979B2 (en) 2011-03-03 2017-10-24 Quark Pharmaceuticals Inc. Oligonucleotide modulators of the toll-like receptor pathway
MX356814B (es) 2011-11-03 2018-06-13 Quark Pharmaceuticals Inc Métodos y composiciones para neuroprotección.
WO2013070821A1 (en) 2011-11-08 2013-05-16 Quark Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating diseases, disorders or injury of the nervous system
JP2016528161A (ja) 2012-01-12 2016-09-15 クォーク ファーマシューティカルズ インコーポレーティッドＱｕａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． 聴覚およびバランス障害を治療するための併用療法
WO2014043291A1 (en) 2012-09-12 2014-03-20 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded nucleic acid compounds
CN104619844A (zh) 2012-09-12 2015-05-13 夸克制药公司 靶向p53的双链寡核苷酸分子及其使用方法
EP2895608B1 (en) 2012-09-12 2018-12-05 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded oligonucleotide molecules to p53 and methods of use thereof
WO2015015498A1 (en) 2013-07-31 2015-02-05 Qbi Enterprises Ltd. Methods of use of sphingolipid polyalkylamine oligonucleotide compounds
WO2015015496A1 (en) 2013-07-31 2015-02-05 Qbi Enterprises Ltd. Sphingolipid-polyalkylamine-oligonucleotide compounds
US9459201B2 (en) 2014-09-29 2016-10-04 Zyomed Corp. Systems and methods for noninvasive blood glucose and other analyte detection and measurement using collision computing
US9554738B1 (en) 2016-03-30 2017-01-31 Zyomed Corp. Spectroscopic tomography systems and methods for noninvasive detection and measurement of analytes using collision computing
EP3671511B1 (en) 2018-12-19 2022-07-06 Rohde & Schwarz GmbH & Co. KG Communication system and method
EP3922720A1 (en) 2020-06-09 2021-12-15 Universidad de Murcia Therapy to prevent adverse cardiac remodeling following an acute myocardial infarction
ES2894201B2 (es) * 2020-08-05 2022-09-29 Fundacion Para La Investig Biomedica Del Hospital Gregorio Maranon Compuestos radioactivos basados en proteinas selectivas de bacterias para la deteccion no invasiva de focos infecciosos

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4315906A (en) * 1979-05-21 1982-02-16 New England Nuclear Corporation Cold insoluble globulin, its purification and use
US4455290A (en) * 1981-04-02 1984-06-19 Research Corporation Inhibition of fibrin polymerization by a peptide isolated from fibrin Fragment D1
US4663146A (en) * 1983-07-29 1987-05-05 Codon Genetic Engineering Laboratories Methods and compositions for the diagnosis of bloodclots using plasminogen activator
US4587122A (en) * 1985-04-23 1986-05-06 The Green Cross Corporation Fibronectin-dextran-drug complex and method of preparation thereof
GB8516421D0 (en) * 1985-06-28 1985-07-31 Biotechnology Interface Ltd Fibronectins
US4734362A (en) * 1986-02-03 1988-03-29 Cambridge Bioscience Corporation Process for purifying recombinant proteins, and products thereof
WO1989000051A1 (en) * 1987-07-07 1989-01-12 Cytrx Biopool Ltd. Fibrin-binding compound and method
US4839464A (en) * 1987-08-25 1989-06-13 Regents Of The University Of Minnesota Polypeptides with fibronectin activity
JP2561122B2 (ja) * 1988-04-13 1996-12-04 寳酒造株式会社 機能性ポリペプチド
JP2561131B2 (ja) * 1988-06-30 1996-12-04 寳酒造株式会社 細胞接着活性ポリペプチド
US5270030A (en) * 1988-12-29 1993-12-14 Bio-Technology General Corp. Fibrin binding domain polypeptide and method of producing
JP3095771B2 (ja) * 1988-12-29 2000-10-10 バイオ―テクノロジー・ジエネラル・コーポレイシヨン ヒトフィブロネクチンポリペプチド類似体のクローニング及び製造並びにこのようなポリペプチド類似体の使用法
US5026537A (en) * 1989-04-06 1991-06-25 Centocor, Inc. Methods for imaging atherosclerotic plaque

Also Published As

Publication number Publication date
JPH05508766A (ja) 1993-12-09
ES2137928T3 (es) 2000-01-01
US5270030A (en) 1993-12-14
US5455158A (en) 1995-10-03
HU9203516D0 (en) 1993-04-28
IL98197A0 (en) 1992-06-21
NO924405D0 (no) 1992-11-13
ATE183545T1 (de) 1999-09-15
WO1991017765A1 (en) 1991-11-28
NO924405L (no) 1993-01-13
JP3419772B2 (ja) 2003-06-23
EP0651799B1 (en) 1999-08-18
US6121426A (en) 2000-09-19
FI925296A (fi) 1992-11-20
DE69131539D1 (de) 1999-09-23
NZ238208A (en) 1993-01-27
US5965383A (en) 1999-10-12
RU2109750C1 (ru) 1998-04-27
FI925296A0 (fi) 1992-11-20
AU660618B2 (en) 1995-07-06
CA2083271A1 (en) 1991-11-22
CA2083271C (en) 2002-04-09
EP0651799A4 (en) 1993-10-05
HUT66189A (en) 1994-10-28
AU8076091A (en) 1991-12-10
GR3031708T3 (en) 2000-02-29
FI108298B (fi) 2001-12-31
DE69131539T2 (de) 2000-05-04
EP0651799A1 (en) 1995-05-10
HK1013255A1 (en) 1999-08-20
DK0651799T3 (da) 2000-03-06
NO310559B1 (no) 2001-07-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU216302B (hu) Eljárás fibrintartalmú anyagok leképezésére és fibrinkötő domén polipeptidek előállítására
JP2801236B2 (ja) フィブリン結合性蛋白質を用いる血餅の診断方法
US5371184A (en) Radiolabelled peptide compounds
KR102414718B1 (ko) 암의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법
MX2010010759A (es) Mutantes de estreptocinasa y sus formas covalentemente modificadas.
US5869616A (en) Fibrin binding domain polypeptides and uses and methods of producing same
WO1989002752A1 (en) Method of diagnosing blood clots using fibrin-binding proteins
AU6521490A (en) Method for rapidly radiolabeling monovalent antibody fragments with technetium
CN108210910A (zh) 预防和治疗系统性硬化症的药物及其用途
WO1989012680A1 (en) USE OF MODIFIED tPA TO DETECT BLOOD CLOTS
US20230211023A1 (en) Reporter system for radionuclide imaging
US7087722B1 (en) Fibrin binding domain polypeptides and uses and methods of producing same
KR100219115B1 (ko) 피브린 결합 도메인 폴리펩티드, 그의 용도 및 그의 제조방법
JP3095771B2 (ja) ヒトフィブロネクチンポリペプチド類似体のクローニング及び製造並びにこのようなポリペプチド類似体の使用法
US6080384A (en) Methods for radionuclide-labeling of biomolecules and kits utilizing the same
Ezov et al. Recombinant polypeptides derived from the fibrin binding domain of fibronectin are potential agents for the imaging of blood clots
Blok et al. A new method for protein labeling with 99mTc
MacPherson Leveraging Bio-Inspired Molecules for Cancer Theranostics
EP0569531A1 (en) Stabilized antibody fragments
Wasser Detection of thrombi using a Tc-99m labelled antifibrin monoclonal antibody (MoAb)
JPS63267734A (ja) 腫瘍および炎症用診断薬

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: SAVIENT PHARMACEUTICALS, INC., US