CN103097534B - 针对rhoa的双链rna化合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于下调RhoA基因的化合物，包含所述化合物的药物组合物及其使用方法和药盒。这些化合物、组合物、方法和药盒在治疗患与其中RhoA表达具有不利后果的疾病或病症有关的疾病或病症和或症状的受治疗者方面以及对于提供神经保护方面是有用的。

Description

针对RHOA的双链RNA化合物及其用途
相关专利申请
本申请要求2010年6月24日递交的名称为“siRNA COMPOUNDS TO RHOA AND USETHEREOF”的美国临时申请序列号为61/358012的权益并为了所有目的通过引用将其全部并入本文。
序列表
本申请包含2011年6月21日创建且大小为38kb，名称为221-PCT1_ST25_21-June-2011.txt的所谓的ASCII拷贝的序列表，在此通过引用将其全部并入。
遍布本申请，引用了各种专利和出版物。在此这些文献的公开内容被通过引用全部并入到本申请中以更充分地描述本申请涉及的最新技术。
发明领域
本申请涉及双链核苷酸化合物，包含该化合物的药物组合物及其用于下调Ras同源物基因家族成员A(RhoA)的表达的使用方法。
发明背景
转让给本发明的受让人的PCT专利公布第WO2008/050329和WO2009/044392号公开了在制备化学修饰的siRNA化合物中有用的某些RhoA寡核苷酸和结构基序。
发明概述
本文提供了用于下调RhoA表达的核酸分子，包含该分子的组合物和药盒及其使用方法。这些组合物、方法和药盒可涉及结合编码RhoA的核苷酸序列(例如mRNA序列)例如由SEQ ID NO：2例示的人RhoA蛋白质的mRNA编码序列(SEQ ID NO：1)的核酸分子(例如，短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA))的使用。
在某些优选的实施方式中，本文公开的组合物、方法和药盒抑制RhoA的表达。在多个实施方式中，核酸分子选自由下调RhoA表达的未修饰的或化学修饰的dsRNA化合物或siRNA或shRNA组成的组。在目前优选的实施方式中，抑制剂是下调RhoA表达的合成的、化学修饰的双链RNA(dsRNA)化合物。当与未修饰的分子相比时，化学修饰的核酸分子和组合物显示出有益的性质，包括增加的血清稳定性、改善的细胞吸收、减少的离靶活性(offtargetactivity)、减少的免疫原性、改善的内体释放、改善的对靶组织或细胞的特异性递送以及增加的敲减活性中的至少一种。
本文还公开了用于治疗或预防有相应需要的受治疗者体内的疾病或病症的发生或严重度的方法，其中所述疾病或病症和/或与其有关的症状与RhoA基因的表达有关，例如中枢神经系统(CNS)的疾病、损伤、病症或病理学。在某些实施方式中，所述受治疗者是哺乳动物。在优选的实施方式中，所述受治疗者是人受治疗者。
在特定实施方式中，本文提供了靶向RhoA的化学修饰的dsRNA化合物，包含该化合物的组合物和药盒及其在治疗CNS病症或病理学，特别是神经性疼痛(例如，触摸痛(allodynia))、脊髓损伤(SCI)和青光眼中的使用方法。待治疗的其他病症包括其中RhoA表达对神经元存活、神经元生长、神经再生(neural regeneration)或其他细胞功能有害的任何病症。因此，用本发明的化合物治疗需要神经元再生或神经元或神经系统的保护的病症，包括但不限于多发性硬化、中风、创伤性脑损伤、周围神经病变和急性及慢性神经变性疾病。
在治疗上述疾病、病症、损伤和疾患中有用的稳定且有效的dsRNA化合物及包含该化合物的组合物将是具有极大治疗价值的。
一方面，提供了核酸分子(例如，dsRNA分子)，其中(a)所述核酸分子是包括有义链和互补的反义链的双链体；(b)所述核酸分子的每条链独立地是18至49个核苷酸的长度；(c)反义链的18至49个核苷酸的序列与编码哺乳动物RhoA的mRNA(例如，SEQ ID NO：1)的连续序列互补；以及(d)所述有义链和反义链包含表I、II、III或IV中的任何一个列出的序列对。
在某些实施方式中，与编码人RhoA的mRNA(列出在SEQ ID NO：1中)的连续序列互补的反义链的序列包括与SEQ ID NO：1的290-350；或350-414；或414-507；或531-551；或557-627；或634-651；或627-698；或698-757；或919-973；或973-990或1134-1346；或1346-1369；或1804-1926范围内的核苷酸序列互补的序列。
在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义链包括对应于表III上所示的反义序列(SEQ ID NO：149-162)中的任何一个的序列。在某些实施方式中，所述有义链和反义链选自表III中所示的序列对。在某些实施方式中，所述有义链和反义链选自以下列出的序列对：RHOA_31(SEQ ID NO：135和149)、RHOA_33(SEQ ID NO：136和150)、RHOA_37(SEQ ID NO：137和151)、RHOA_38(SEQ ID NO：138和152)、RHOA_43(SEQ IDNO：139和153)、RHOA_52(SEQ ID NO：140和154)、RHOA_56(SEQ ID NO：141和155)、RHOA_57(SEQ ID NO：142和156)、RHOA_58(SEQ ID NO：143和157)、RHOA_68(SEQ ID NO：144和158)、RHOA_69(SEQ ID NO：145和159)、RHOA_70(SEQ ID NO：146和160)、RHOA_73(SEQ ID NO：147和161)和RHOA_76(SEQ ID NO：148和162)。
在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_31(SEQ ID NO：135和149)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_33(SEQ ID NO：136和150)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_37(SEQ ID NO：137和151)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_38(SEQ ID NO：138和152)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_43(SEQ ID NO：139和153)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_52(SEQ ID NO：140和154)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_56(SEQ ID NO：141和155)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_57(SEQ ID NO：142和156)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_58(SEQ ID NO：143和157)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_68(SEQ ID NO：144和158)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_69(SEQ ID NO：145和159)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_70(SEQ ID NO：146和160)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_73(SEQ ID NO：147和161)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_76(SEQ ID NO：148和162)中列出的序列对。
在某些优选的实施方式中，所述有义链和反义链包含RHOA_58(SEQ ID NO：143和157)中列出的序列对。在某些优选的实施方式中，所述有义链和反义链包含RHOA_70(SEQID NO：146和160)中列出的序列对。
在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义链包括对应于表IV上所示的反义序列(SEQ ID NO：160-170)中的任何一个的序列。在某些实施方式中，所述有义链和反义链选自表IV所示的序列对和选自以下列出的序列对：RHOA_23(SEQ IDNO：163和167)、RHOA_24(SEQ ID NO：164和168)、RHOA_26(SEQ ID NO：165和169)或RHOA_29(SEQ ID NO：166和170)。
在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义链包括对应于表II所示的反义序列中的任何一个的序列。在某些优选的实施方式中，所述反义链和链选自表II中所示的序列对。
在某些实施方式中，本文公开的核酸分子包括选自以下列出的序列对的反义和有义链：RHOA_32(SEQ ID NO：67和101)、RHOA_34(SEQ ID NO：68和102)、RHOA_35(SEQ ID NO：69和103)、RHOA_36(SEQ ID NO：70和104)、RHOA_39(SEQ ID NO：71和105)、RHOA_40(SEQ IDNO：72和106)、RHOA_41(SEQ ID NO：73和107)、RHOA_42(SEQ ID NO：74和108)、RHOA_44(SEQID NO：75和109)、RHOA_45(SEQ ID NO：76和110)、RHOA_46(SEQ ID NO：77和111)、RHOA_47(SEQ ID NO：78和112)、RHOA_48(SEQ ID NO：79和113)、RHOA_48u(SEQ ID NO：80和114)、RHOA_49(SEQ ID NO：81和115)、RHOA_50(SEQ ID NO：82和116)RHOA_51(SEQ ID NO：83和117)、RHOA_53(SEQ ID NO：84和118)、RHOA_54(SEQ ID NO：85和119)、RHOA_55(SEQ ID NO：86和120)、RHOA_59(SEQ ID NO：87和121)、RHOA_60(SEQ ID NO：88和122)、RHOA_61(SEQ IDNO：89和123)、RHOA_61u(SEQ ID NO：90和124)、RHOA_62(SEQ ID NO：91和125)、RHOA_63(SEQ ID NO：92和126)RHOA_64(SEQ ID NO：93和127)、RHOA_65(SEQ ID NO：94和128)、RHOA_66(SEQ ID NO：95和129)、RHOA_67(SEQ ID NO：96和130)、RHOA_71(SEQ ID NO：97和131)、RHOA_72(SEQ ID NO：98和132)、RHOA_74(SEQ ID NO：99和133)和RHOA_75(SEQ IDNO：100和134)。
在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_32(SEQ ID NO：67和101)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_34(SEQ ID NO：68和102)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_35(SEQ ID NO：69和103)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_36(SEQ ID NO：70和104)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_39(SEQ ID NO：71和105)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_40(SEQ ID NO：72和106)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_41(SEQ ID NO：73和107)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_42(SEQ ID NO：74和108)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_44(SEQ IDNO：75和109)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_45(SEQ ID NO：76和110)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_46(SEQ ID NO：77和111)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_47(SEQ ID NO：78和112)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_48(SEQ ID NO：79和113)、RHOA_48u(SEQ ID NO：80和114)、RHOA_49(SEQ ID NO：81和115)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_50(SEQ ID NO：82和116)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_51(SEQ ID NO：83和117)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_53(SEQ IDNO：84和118)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_54(SEQ ID NO：85和119)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_55(SEQ ID NO：86和120)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_59(SEQ ID NO：87和121)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_60(SEQ ID NO：88和122)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_61(SEQ ID NO：89和123)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_61u(SEQ ID NO：90和124)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_62(SEQ ID NO：91和125)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_63(SEQ ID NO：92和126)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_64(SEQ ID NO：93和127)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括对应于RHOA_65(SEQ ID NO：94和128)。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_66(SEQ ID NO：95和129)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_67(SEQ ID NO：96和130)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_71(SEQ IDNO：97和131)、RHOA_72(SEQ ID NO：98和132)、RHOA_74(SEQ ID NO：99和133)中列出的序列对。在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_75(SEQ ID NO：100和134)中列出的序列对。
在某些优选的实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的反义和有义链包括RHOA_48(SEQ ID NO：79和113)、RHOA_48u(SEQ ID NO：80和114)、RHOA_50(SEQ IDNO：82和116)、RHOA_61(SEQ ID NO：89和123)、RHOA_61u(SEQ ID NO：90和124)或RHOA_75(SEQ ID NO：100和134)中列出的序列对。
在某些优选的实施方式中，所述反义链和有义链包含RHOA_48(SEQ ID NO：79和113)中列出的序列对。在某些优选的实施方式中，所述反义链和有义链包含RHOA_48u(SEQID NO：80和14)中列出的序列对。在某些优选的实施方式中，所述反义链和有义链包含RHOA_50(SEQ ID NO：82和116)中列出的序列对。
在本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的多个实施方式中，反义链可以是18至49个核苷酸的长度(例如，18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个核苷酸的长度)；或18-35个核苷酸的长度；或18-30个核苷酸的长度；或18-25个核苷酸的长度；或18-23个核苷酸的长度；或19-21个核苷酸的长度；或25-30个核苷酸的长度；或26-28个核苷酸的长度。在如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的某些实施方式中，反义链是19个核苷酸的长度。相似地，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的有义链可以是18至49个核苷酸的长度(例如，18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个核苷酸的长度)；或18-35个核苷酸的长度；或18-30个核苷酸的长度；或18-25个核苷酸的长度；或18-23个核苷酸的长度；或19-21个核苷酸的长度；或25-30个核苷酸的长度；或26-28个核苷酸的长度。在如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的某些实施方式中，有义链是19个核苷酸的长度。在如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的某些实施方式中，反义链和有义链中的每一个是19个核苷酸的长度。如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的双链体区域(duplex region)可以是18-49个核苷酸的长度(例如，约18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个核苷酸的长度)；18-35个核苷酸的长度；或18-30个核苷酸的长度；或约18-25个核苷酸的长度；或18-25个核苷酸的长度；或18-23个核苷酸的长度；或18-21个核苷酸的长度；或25-30个核苷酸的长度；或25-28个核苷酸的长度。在如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的多个实施方式中，双链体区域是19个核苷酸的长度。
在某些实施方式中，如本文提供的核酸(例如，dsRNA核酸分子)的有义链和反义链是单独的多核苷酸链。在某些实施方式中，所述单独的有义链和反义链通过氢键合，例如Watson-Crick碱基配对形成也称为双链体的双链结构。在某些实施方式中，一个或多个核苷酸对形成非Watson-Crick碱基配对。在某些实施方式中，所述有义链和反义链是互相共价连接的两条单独的链。在其他实施方式中，有义链和反义链是具有有义和反义区域的多核苷酸单链的一部分；在某些优选的实施方式中，所述多核苷酸链具有发夹结构。
在某些实施方式中，所述核酸分子是关于突出端对称且在两端上具有平端的双链核酸(dsRNA)分子。在其他实施方式中，所述核酸分子是关于突出端对称且在该dsRNA分子的两端上具有核苷酸突出端或非核苷酸突出端或核苷酸和非核苷酸突出端的组合的dsRNA分子。在某些优选的实施方式中，所述核酸分子是关于突出端不对称且在该分子的一端上具有平端而在该分子的另一端上具有突出端的dsRNA分子。在某些实施方式中，不对称的dsRNA分子在双链体的一侧上具有出现在有义链上的3’-突出端；而在分子的另一侧具有平端。在某些实施方式中，不对称的dsRNA分子在双链体的一侧上具有出现在有义链上的5’-突出端；而在分子的另一侧具有平端。在其他实施方式中，不对称的dsNA分子在双链体的一侧上具有出现在反义链上的3’-突出端；而在分子的另一侧具有平端。在某些实施方式中，不对称的dsRNA分子在双链体的一侧上具有出现在反义链上的5’-突出端；而在分子的另一侧具有平端。在某些实施方式中，所述突出端是核苷酸突出端，在其他实施方式中，所述突出端是非核苷酸突出端。在某些实施方式中，所述突出端是5’突出端；在替代实施方式中，所述突出端是3’突出端。
在某些实施方式中，核酸分子具有发夹结构(在一条多核苷酸上具有有义链和反义链)，在一端上具有环结构而在另一端上具有平端。在某些实施方式中，核酸分子具有发夹结构，在一端上具有环结构而在另一端上具有突出端；在某些实施方式中，所述突出端是3’突出端；在某些实施方式中，所述突出端是5’突出端；在某些实施方式中，所述突出端在有义链上；在某些实施方式中，所述突出端在反义链上。
本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)可包括一种或多种修饰或例如本文所述的修饰的核苷酸。例如，如本文提供的核酸分子(例如，dsRNA分子)可包括具有修饰的糖的修饰的核苷酸；具有修饰的核碱基(nucleobase)的修饰的核苷酸；或者具有修饰的磷酸基团的修饰的核苷酸。相似地，如本文提供的核酸分子(例如，dsRNA分子)可包括修饰的磷酸二酯骨架和/或可包括修饰的末端磷酸基团。
如所提供的核酸分子(例如，dsRNA分子)可具有包括修饰的糖部分，例如2’烃氧基(alkoxy)修饰的糖部分的一个或多个核苷酸。在某些优选的实施方式中，所述修饰的糖包括2’-O-甲基。
如所提供的核酸分子(例如，dsRNA分子)可具有例如本文所述的一个或多个修饰的核碱基，所述一个或多个修饰的核碱基可选自由以下组成的组：黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烃基(alkyl)衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烃基衍生物、5-卤素尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤素、氨基、硫醇、硫代烃基、羟基和其他8-位取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-三氟甲基和其他5-位取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤以及无环核苷酸(acyclonucleotide)。
例如如本文所述的，如所提供的核酸分子(例如，dsRNA分子)可具有对磷酸二酯骨架的一种或多种修饰。在某些优选的实施方式中，通过用硫代磷酸酯、3’-(或-5’)脱氧-3’-(或-5’)硫代-硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenate)、3’-(或-5’)脱氧亚磷酸酯、硼代磷酸酯(borano phosphate)、3’-(或-5’)脱氧-3’-(或5’-)氨基氨基磷酸酯、氢磷酸酯、硼代磷酸酯(borano phosphate ester)、氨基磷酸酯、烃基或芳基磷酸酯和磷酸三酯取代磷酸二酯键来修饰磷酸二酯键。
在多个实施方式中，所提供的核酸分子(例如，dsRNA分子)可包括未修饰的反义链和具有一种或多种修饰的有义链。在某些实施方式中，所提供的核酸分子(例如，dsRNA分子)包括未修饰的有义链和具有一种或多种修饰的反义链。在优选的实施方式中，所提供的核酸分子(例如，dsRNA分子)在有义链和反义链中都包括一个或多个修饰的核苷酸。
如本文提供的核酸分子(例如，dsRNA分子)可在有义链和/或反义链的5’端包括磷酸基团。在某些实施方式中，本文公开的dsRNA分子在反义链的5’末端包括磷酸基团。
在某些实施方式中，提供了对下调RhoA表达有用的双链核酸化合物。在某些实施方式中，本文提供了具有以下结构(A1)的双链RNA化合物：
(A1)5’(N)x-Z3’(反义链)
3’Z’-(N’)y-z”5’(有义链)
其中每个N和N’是可以未修饰或修饰的核糖核苷酸，或非常规部分；
其中(N)x和(N’)y中的每一个是寡核苷酸，其中每个连续的N或N’通过共价键被连接到下一个N或N’；
其中Z和Z’中的每一个独立地存在或不存在，但是如果存在的话，则独立地包含共价连接在其所存在的链的3’末端的1-5个连续的核苷酸、1-5连续的非核苷酸部分或其组合；
其中z”可能存在或不存在，但是如果存在的话，则是共价连接在(N’)y的5’末端的封端部分(cap moiety)；
x和y中的每一个独立地是18至40的整数；
其中，(N’)y的序列与(N)x的序列互补；且
其中(N)x包含表III或表IV中列出的反义序列。
表III中提供的在产生dsRNA化合物方面有用的有义和反义序列为RHOA_31(SEQID NO：135和149)、RHOA_33(SEQ ID NO：136和150)、RHOA_37(SEQ ID NO：137和151)、RHOA_38(SEQ ID NO：138和152)、RHOA_43(SEQ ID NO：139和153)、RHOA_52(SEQ ID NO：140和154)、RHOA_56(SEQ ID NO：141和155)、RHOA_57(SEQ ID NO：142和156)、RHOA_58(SEQ IDNO：143和157)、RHOA_68(SEQ ID NO：144和158)、RHOA_69(SEQ ID NO：145和159)、RHOA_70(SEQ ID NO：146和160)、RHOA_73(SEQ ID NO：147和161)和RHOA_76(SEQ ID NO：148和162)。表IV中提供的在产生dsRNA化合物方面有用的有义和反义序列被列出在RHOA_23(SEQID NO：163和167)、RHOA_24(SEQ ID NO：164和168)、RHOA_26(SEQ ID NO：165和169)或RHOA_29(SEQ ID NO：166和170)中。
在某些实施方式中，连接每个连续的N和/或N’的共价键是磷酸二酯键。
在某些实施方式中x＝y且x和y中的每一个是19、20、21、22或23。在优选的实施方式中，x＝y＝19。
在如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的某些实施方式中，双链核酸分子是siRNA、siNA或miRNA。
在某些实施方式中，所述有义链和反义链包含RHOA_58(SEQ ID NO：143和157)中列出的序列对。在某些实施方式中，所述有义链和反义链包含RHOA_70(SEQ ID NO：146和160)中列出的序列对。
在某些实施方式中，所述双链核酸分子包含反义链的位置1(5’末端)处的DNA部分或针对靶的错配。本文描述了该双链体结构。根据一个实施方式，提供了具有以下列出的结构(A2)的双链siRNA化合物：
(A2)5’N1-(N)x-Z3’(反义链)
3’Z’-N2-(N’)y-z”5’(有义链)
其中每个N1、N2、N和N’独立地是未修饰的或修饰的核苷酸或非常规部分；
其中(N)x和(N’)y中的每一个是寡核苷酸，其中每个连续的N或N’通过共价键被连接到相邻的N或N’；
其中x和y中的每一个独立地是17和39之间的整数；
其中N2与(N’)y共价键合；
其中N1与(N)x共价键合并与靶mRNA(SEQ ID NO：1)错配或是与靶mRNA互补的DNA部分；
其中N1是选自由天然的或修饰的：尿苷、脱氧核糖尿苷、核糖胸苷、脱氧核糖胸苷、腺苷或脱氧腺苷、脱碱基核糖部分和脱碱基脱氧核糖部分组成的组的部分；
其中z”可能存在或不存在，但是如果存在的话，则是共价连接在N2-(N’)y的5’末端的封端部分；
其中Z和Z’中的每一个独立地存在或不存在，但是如果存在的话，则独立地是共价连接在其所存在的链的3’末端的1-5个连续的核苷酸、1-5个连续的非核苷酸部分或其组合；且
其中，(N’)y的序列与(N)x的序列互补；且
其中(N)x的序列包含表I中列出的反义序列。
在多个实施方式中，N1-(N)x的序列包含表II中列出的反义序列。在某些实施方式中，在产生dsRNA化合物方面有用的N2-(N’)y和N1-(N)x被展示在表II中并列出在RHOA_32(SEQ ID NO：67和101)、RHOA_34(SEQ ID NO：68和102)、RHOA_35(SEQ ID NO：69和103)、RHOA_36(SEQ ID NO：70和104)、RHOA_39(SEQ ID NO：71和105)、RHOA_40(SEQ ID NO：72和106)、RHOA_41(SEQ ID NO：73和107)、RHOA_42(SEQ ID NO：74和108)、RHOA_44(SEQ ID NO：75和109)、RHOA_45(SEQ ID NO：76和110)、RHOA_46(SEQ ID NO：77和111)、RHOA_47(SEQ IDNO：78和112)、RHOA_48(SEQ ID NO：79和113)、RHOA_48u(SEQ ID NO：80和114)、RHOA_49(SEQ ID NO：81和115)、RHOA_50(SEQ ID NO：82和116)、RHOA_51(SEQ ID NO：83和117)、RHOA_53(SEQ ID NO：84和118)、RHOA_54(SEQ ID NO：85和119)、RHOA_55(SEQ ID NO：86和120)、RHOA_59(SEQ ID NO：87和121)、RHOA_60(SEQ ID NO：88和122)、RHOA_61(SEQ ID NO：89和123)、RHOA_61u(SEQ ID NO：90和124)、RHOA_62(SEQ ID NO：91和125)、RHOA_63(SEQID NO：92和126)、RHOA_64(SEQ ID NO：93和127)、RHOA_65(SEQ ID NO：94和128)、RHOA_66(SEQ ID NO：95和129)RHOA_67(SEQ ID NO：96和130)、RHOA_71(SEQ ID NO：97和131)、RHOA_72(SEQ ID NO：98和132)、RHOA_74(SEQ ID NO：99和133)和RHOA_75(SEQ ID NO：100和134)中。
在某些实施方式中，如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的(N)x包括对应于表I所示的反义序列中的任何一个的序列。在某些优选的实施方式中，(N)x和(N’)y选自表I中所示的序列对。
在某些实施方式中，本文公开的核酸分子包括选自以下列出的序列对的(N)x和(N’)y：RHOA_32-1(SEQ ID NO：3和35)、RHOA_34-1(SEQ ID NO：4和36)、RHOA_35-1(SEQ IDNO：5和37)、RHOA_36-1(SEQ ID NO：6和38)、RHOA_39-1(SEQ ID NO：7和39)、RHOA_40-1(SEQID NO：8和40)、RHOA_41-1(SEQ ID NO：9和41)、RHOA_42-1(SEQ ID NO：10和42)、RHOA_44-1(SEQ ID NO：11和43)和RHOA_45-1(SEQ ID NO：12和44)、RHOA_46-1(SEQ ID NO：13和45)、RHOA_47-1(SEQ ID NO：14和46)、RHOA_48-1(SEQ ID NO：15和47)、RHOA_49-1(SEQ ID NO：16和48)、RHOA_50-1(SEQ ID NO：17和49)、RHOA_51-1(SEQ ID NO：18和50)、RHOA_53-1(SEQID NO：19和51)、RHOA_54-1(SEQ ID NO：20和52)、RHOA_55-1(SEQ ID NO：21和53)、RHOA_59-1(SEQ ID NO：22和54)、RHOA_60-1(SEQ ID NO：23和55)、RHOA_61-1(SEQ ID NO：24和56)、RHOA_62-1(SEQ ID NO：25和57)、RHOA_63-1(SEQ ID NO：26和58)RHOA_64-1(SEQ IDNO：27和59)、RHOA_65-1(SEQ ID NO：28和60)、RHOA_66-1(SEQ ID NO：29和61)、RHOA_67-1(SEQ ID NO：30和62)、RHOA_71-1(SEQ ID NO：31和63)、RHOA_72-1(SEQ ID NO：32和64)、RHOA_74-1(SEQ ID NO：33和65)和RHOA_75-1(SEQ ID NO：34和66)。
在某些实施方式中，(N’)y的序列与(N)x的序列完全互补。在多个实施方式中，N2-(N’)y的序列与N1-(N)x的序列互补。在某些实施方式中，(N)x包含与靶mRNA中约17至约39个连续的核苷酸完全互补的反义序列。在其他实施方式中，(N)x包含与SEQ ID NO：1中列出的靶mRNA中约17至约39个连续的核苷酸基本互补的反义序列。
在某些实施方式中，N1和N2形成Watson-Crick碱基对。在其他实施方式中，N1和N2形成非Watson-Crick碱基对。在某些实施方式中，碱基对在核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸之间形成。
在某些实施方式中x＝y＝18、x＝y＝19或x＝y＝20。在优选的实施方式中，x＝y＝18。当在N1-(N)x中x＝18时，N1指位置1且位置2-19包括在(N)18中。当在N2-(N’)y中y＝18时，N2指位置19且位置1-18包括在(N’)18中。
在某些实施方式中，N1共价键合到(N)x并与靶mRNA错配。在多个实施方式中，N1共价键合到(N)x并且是与靶mRNA互补的DNA部分。
在某些实施方式中，反义链的位置1的尿苷被选自天然或修饰的：腺苷、脱氧腺苷、尿苷、脱氧尿苷(dU)、核糖胸苷或脱氧胸苷组成的组的N1取代。在多个实施方式中，N1选自天然或修饰的腺苷、脱氧腺苷或脱氧尿苷。例如，在某些实施方式中，位置1的胞苷被腺嘌呤或尿苷取代；位置1的鸟苷被腺嘌呤或尿苷取代；或腺嘌呤被尿苷取代。
在某些实施方式中，反义链的位置1(N1)的鸟苷被天然或修饰的：腺苷、脱氧腺苷、尿苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷取代。在多个实施方式中，N1选自天然或修饰的：腺苷、脱氧腺苷、尿苷或脱氧尿苷。
在某些实施方式中，反义链的位置1(N1)的胞苷被天然或修饰的：腺苷、脱氧腺苷、尿苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷取代。在多个实施方式中，N1选自天然或修饰的：腺苷、脱氧腺苷、尿苷或脱氧尿苷。
在某些实施方式中，反义链的位置1(N1)的腺苷被天然或修饰的：脱氧腺苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷取代。
在某些实施方式中，N1和N2在天然或修饰的：尿苷或脱氧尿苷与腺苷或脱氧腺苷之间形成碱基对。在其他实施方式中，N1和N2在天然或修饰的：脱氧尿苷和腺苷之间形成碱基对。
在某些实施方式中，所述双链核酸分子是siRNA、siNA或miRNA。如本文提供的双链核酸分子也被称为“双链体”。
在结构A2的某些优选实施方式中，x＝y＝18。在某些实施方式中x＝y＝18且(N)x由表I展示的反义寡核苷酸组成。在某些实施方式中，N1选自天然尿苷和修饰的尿苷。在某些实施方式中，N1是天然尿苷。在某些实施方式中，N1-(N)x由表II中展示的反义寡核苷酸组成。在某些实施方式中，x＝y＝19或x＝y＝20。在某些实施方式中x＝y＝19或x＝y＝20且(N)x包含表I中展示的反义寡核苷酸。
在某些实施方式中，在产生dsRNA化合物方面有用的优选的有义链和反义序列选自表II中列出的序列对：RHOA_48(SEQ ID NO：79和113)、RHOA_48u(SEQ ID NO：80和114)、RHOA_50(SEQ ID NO：82和116)、RHOA_61(SEQ ID NO：89和123)、RHOA_61u(SEQ ID NO：90和124)和RHOA_75(SEQ ID NO：100和134)中。
在结构(A2)的某些实施方式中，N1是2’OMe糖-修饰的尿苷或2’OMe糖-修饰的腺苷。在结构(A2)的某些实施方式中，N2是2’OMe糖修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
在结构(A1)和/或结构(A2)的某些实施方式中，每个N由未修饰的核糖核苷酸组成。在结构(A1)和/或结构(A2)的某些实施方式中，每个N’由未修饰的核苷酸组成。在优选的实施方式中，N和/或N’中的至少一个包含化学修饰的核苷酸或非常规部分。在某些实施方式中，所述非常规部分选自镜像核苷酸、脱碱基核糖部分和脱碱基脱氧核糖部分。在某些实施方式中，所述非常规部分是镜像核苷酸，优选地是L-DNA部分。在某些实施方式中，N或N’中的至少一个包含2’OMe糖-修饰的核糖核苷酸。
在结构(A1)和/或结构(A2)的某些实施方式中，(N’)y的序列与(N)x的序列完全互补。在结构(A1)和/或结构(A2)的某些实施方式中，(N’)y的序列与(N)x的序列基本互补。
在结构(A1)和/或结构(A2)的某些实施方式中，(N)x包括与靶mRNA中约17至约39个连续的核苷酸完全互补的反义序列。在结构(A1)和/或结构(A2)的其他实施方式中，(N)x包括与靶mRNA中约17至约39个连续的核苷酸基本互补的反义序列。在结构(A1)和/或结构(A2)的某些实施方式中，所述dsRNA化合物是平端的，例如，其中z”、Z和Z’中的每一个都不存在。在替代实施方式中，z”、Z或Z’中的至少一个是存在的。
在多个实施方式中，Z和Z’独立地包括一个或多个共价连接的修饰的和或未修饰的核苷酸，包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，或一个或多个非常规部分，例如，倒置的脱碱基脱氧核糖部分或脱碱基核糖部分或镜像核苷酸；一个或多个非核苷酸的C3、C4或C5部分，氨基-C6部分及类似物。在某些实施方式中，Z’是不存在的而Z是存在的且包括一个或多个非核苷酸的C3部分。在某些实施方式中，Z是不存在的而Z’是存在的且包括一个或多个非核苷酸的C3部分。在某些实施方式中，Z和Z’中的每一个独立地包含一个或多个非核苷酸的C3部分或一个或多个氨基-C6部分。在某些实施方式中，z”是存在的且选自镜像核苷酸、脱碱基部分和倒置的脱碱基部分。在结构A1和A2的某些实施方式中，Z和Z’中的每一个包括脱碱基部分，例如脱氧核糖脱碱基部分(本文称为“dAb”)或核糖脱碱基部分(本文称为“rAb”)。在某些实施方式中，Z和/或Z’中的每一个包含两个共价连接的脱碱基部分且为例如dAb-dAb或rAb-rAb或dAb-rAb或rAb-dAb，其中每个部分优选地通过基于磷酸基的键(phospho-based bond)与相邻部分共价连接。在某些实施方式中，所述基于磷酸基的键包括硫代磷酸酯键、膦酰基乙酸酯(phosphonoacetate)键或磷酸二酯键。在优选的实施方式中，所述基于磷酸基的键包括磷酸二酯键。
在某些实施方式中，Z和/或Z’中的每一个包括烃基部分，任选地丙烷[(CH2)3]部分(C3)或其衍生物，包括丙醇(C3OH)和丙二醇的磷酸衍生物(“C3Pi”)。在某些实施方式中，Z和/或Z’中的每一个包括两个烃基部分且在某些实例中，为C3Pi-C3OH。反义链的3’末端和/或有义链的3’末端通过基于磷酸基的键与C3部分共价连接且所述C3部分通过基于磷酸基的键与C3OH部分共价偶联。在某些实施方式中，所述基于磷酸基的键包括硫代磷酸酯键、膦酰基乙酸酯键或磷酸二酯键。在优选的实施方式中，所述基于磷酸基的键包括磷酸二酯键。
在结构A1和A2的特定实施方式中，Z包含C3Pi-C3OH。在结构A1和A2的特定实施方式中，Z’包含C3Pi或C3OH。在结构A1和A2的某些实施方式中，双链核酸分子包括共价连接到反义链的3’末端的C3Pi-C3OH部分和共价连接到有义链的3’末端的C3Pi或C3OH部分。
在结构(A1)和/或结构(A2)的某些实施方式中，每个N由未修饰的核苷酸组成。在结构(A1)和/或结构(A2)的某些实施方式中，每个N’由未修饰的核苷酸组成。在优选的实施方式中，N和/或N’中的至少一个是修饰的核糖核苷酸或非常规部分。
在其他实施方式中，结构A1和/或结构A2的化合物包括其糖残基被修饰的至少一个核糖核苷酸。在某些实施方式中，该化合物包含糖残基的2’位置的修饰。在某些实施方式中，2’位置的修饰包含氨基、氟、烃氧基或烃基部分的存在。在某些实施方式中，2’修饰包括烃氧基部分。在优选的实施方式中，所述烃氧基部分是甲氧基部分(也称为2’-O-甲基；2’OMe；2’-OCH3)。在某些实施方式中，核酸化合物在反义链和有义链中之一或二者中包括2’OMe糖修饰的交替的核糖核苷酸。在其他实施方式中，化合物仅在反义链、(N)x或N1-(N)x中包括2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在某些实施方式中，反义链的中间核糖核苷酸，例如在19-mer链的位置10的核糖核苷酸未修饰。在多个实施方式中，核酸化合物包括至少5个交替的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核苷酸。在另外的实施方式中，结构A1和/或结构A2的化合物在交替位置包括修饰的核糖核苷酸，其中(N)x或N1-(N)x的5’和3’末端的每个核糖核苷酸在其糖残基中被修饰，而(N’)y或N2-(N)y的5’和3’末端的每一个核糖核苷酸在其糖残基中未修饰。在多个实施方式中，交替位置的这些核糖核苷酸在糖残基的2’位置被修饰。
在某些实施方式中，例如在位置1、3、5、7和9或位置11、13、15、17、19(5’＞3’)核酸化合物包括至少5个交替的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核苷酸。在某些实施方式中，结构(A1)的(N)x或结构(A2)的N1-(N)x在位置2、4、6、8、11、13、15、17和19包括2’OMe修饰的核糖核苷酸。在某些实施方式中，结构(A1)的(N)x或结构(A2)的N1-(N)x在位置1、3、5、7、9、11、13、15、17和19包括2’OMe修饰的核糖核苷酸。在某些实施方式中，结构(A1)的(N)x或结构(A2)的N1-(N)x在一个或嘧啶中包括2’OMe修饰的核糖核苷酸。
在结构(A1)和/或结构(A2)的某些实施方式中，有义链和反义链在3’和5’末端都未被磷酸化。在其他实施方式中，有义链或反义链之一或二者在3’末端被磷酸化。在其他实施方式中，有义链或反义链之一或二者在5’末端被磷酸化。
在某些实施方式中，本文公开的双链分子包括下列修饰中的一种或多种：
来自反义链的5’末端的位置5、6、7、8或9的至少一个位置中的N选自DNA、TNA、2’5’核苷酸或镜像核苷酸；
来自有义链的5’末端的位置9或10中的至少一个位置的N’选自TNA、2’5’核苷酸和假尿苷；以及
(N’)y的3’末端位置处的4、5或6个连续位置的N’包含2’5’核苷酸。
在某些实施方式中，双链分子包括下列修饰的组合：
反义链在自5’末端的位置5、6、7、8或9的至少一个位置中包括DNA、TNA、2’5’核苷酸或镜像核苷酸；以及
有义链在自5’末端的位置9或10中包括TNA、2’5’核苷酸或假尿苷中的至少一个。
在某些实施方式中，双链分子包括下列修饰的组合：
反义链在自5’末端的位置5、6、7、8或9的至少一个位置中包括DNA、2’5’核苷酸或镜像核苷酸；以及
有义链在3’的倒数(penultimate)位置或3’末端位置上包括4、5、或6个连续的2’5’核苷酸。
在结构A1和/或结构A2的某些实施方式中，(N)y包括选自镜像核苷酸、2’5’核苷酸和TNA的至少一个非常规部分。在某些实施方式中，所述非常规部分是镜像核苷酸。在多个实施方式中，镜像核苷酸选自L-核糖核苷酸(L-RNA)和L-脱氧核糖核苷酸(L-DNA)。在优选的实施方式中，镜像核苷酸是L-DNA。在某些实施方式中，有义链在位置9或10(自5’末端)包含非常规部分。在优选的实施方式中，有义链在位置9(自5’末端)包含非常规部分。在某些实施方式中，有义链为19个核苷酸的长度且在位置15(自5’末端)包含4、5或6个连续的非常规部分。在某些实施方式中，有义链在位置15、16、17和18包含4个连续的2’5’核糖核苷酸。在某些实施方式中，有义链在位置15、16、17、18和19包含5个连续的2’5’核糖核苷酸。在多个实施方式中，有义链还包含Z’。在某些实施方式中，Z’包括C3OH部分或C3Pi部分。
在结构A1和/或结构A2的某些实施方式中，(N)y包含通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键连接到相邻核苷酸的选自镜像核苷酸和核苷酸的至少一个非常规部分。在某些实施方式中，所述非常规部分是镜像核苷酸。在多个实施方式中，所述镜像核苷酸选自L-核糖核苷酸(L-RNA)和L-脱氧核糖核苷酸(L-DNA)。在优选的实施方式中，所述镜像核苷酸是L-DNA。
在结构A1的某些实施方式中，(N’)y包含至少一个L-DNA部分。在某些实施方式中x＝y＝19且(N’)y由位置1-17和19处的未修饰的核糖核苷酸和3’倒数第二位(位置18)的一个L-DNA组成。在其他实施方式中x＝y＝19且(N’)y由位置1-16和19处的未修饰的核糖核苷酸和3’倒数位置(位置17和18)的两个连续的L-DNA组成。在多个实施方式中，所述非常规部分是通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键连接到相邻核苷酸的核苷酸。根据多个实施方式，(N’)y包含3’末端处通过2’-5’核苷酸间键连接的2、3、4、5或6个连续的核糖核苷酸。在一个实施方式中，(N’)y的3’末端处的四个连续的核苷酸通过三个2’-5’磷酸二酯键连接。在一个实施方式中，(N’)y的3’末端处的五个连续的核苷酸通过四个2’-5’磷酸二酯键连接。在某些实施方式中，其中2’-5’核苷酸中的一个或多个形成2’-5’磷酸二酯键，该核苷酸还包含3’-O-甲基(3’OMe)糖修饰。在某些实施方式中，(N’)y的3’末端核苷酸包含3’OMe糖修饰。在某些实施方式中，x＝y＝19且(N’)y包含位置15、16、17、18和19处的两个或更多个连续的核苷酸，包含通过2’-5’核苷酸间键连接到相邻核苷酸的核苷酸。在多个实施方式中，形成2’-5’核苷酸间键的核苷酸包含3’脱氧核糖核苷酸或3’甲氧基核苷酸。在某些实施方式中，x＝y＝19且(N’)y包含通过位置15-16、16-17和17-18之间或位置16-17、17-18和18-19之间的2’-5’核苷酸间键连接到相邻核苷酸的核苷酸。在某些实施方式中，x＝y＝19且(N’)y包含通过位置16-17和17-18之间或位置17-18和18-19之间或位置15-16和17-18之间的2’-5’核苷酸间键连接到相邻核苷酸的核苷酸。在其他实施方式中，(N’)y中的嘧啶核糖核苷酸(rU、rC)被通过2’-5’核苷酸间键连接到相邻核苷酸的核苷酸取代。
在结构A2的某些实施方式中，(N)y包含至少一个L-DNA部分。在某些实施方式中x＝y＝18且N2-(N’)y由位置1-17和19处的未修饰的核糖核苷酸和3’倒数第二位(位置18)的一个L-DNA组成。在其他实施方式中，x＝y＝18且N2-(N’)y由位置1-16和19处的未修饰的核糖核苷酸和3’倒数两个位置(位置17和18)的两个连续的L-DNA组成。在多个实施方式中，所述非常规部分是通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键连接到相邻核苷酸的核苷酸。根据多个实施方式，N2-(N’)y包含3’末端处通过2’-5’核苷酸间键连接的2、3、4、5或6个连续的核糖核苷酸。在一个实施方式中，N2-(N’)y的3’末端处的四个连续的核苷酸通过三个2’-5’磷酸二酯键连接，其中形成2’-5’磷酸二酯键的2’-5’核苷酸中的一个或多个还包含3’-O-甲基(3’OMe)糖修饰。在某些实施方式中，N2-(N’)y的3’末端核苷酸包含2’OMe糖修饰。在某些实施方式中，x＝y＝18且N2-(N’)y包含位置15、16、17、18和19处的两个或更多个连续的核苷酸，包含通过2’-5’核苷酸间键连接到相邻核苷酸的核苷酸。在多个实施方式中，形成2’-5’核苷酸间键的核苷酸包含3’脱氧核糖核苷酸或3’甲氧基核苷酸。在某些实施方式中，x＝y＝18且N2-(N’)y包含通过位置16-17和17-18之间或位置17-18和18-19之间或位置15-16和17-18之间的2’-5’核苷酸间键连接到相邻核苷酸的核苷酸。在其他实施方式中，(N’)y中的嘧啶核苷酸(rU、rC)包含通过2’-5’核苷酸间键连接到相邻核苷酸的核苷酸。
在结构A1和A2另外的实施方式中，(N’)y包含1-8个修饰的核糖核苷酸，其中所述修饰的核糖核苷酸是脱氧核糖(DNA)核苷酸。在某些实施方式中，(N’)y包含1、2、3、4、5、6、7或最多8个DNA部分。
在某些实施方式中，本文提供了一种双链RNA分子，该双链RNA分子包括选自表II中列出的寡核苷酸对的有义链和反义链并在本文中被鉴定为：RHOA_48(SEQ ID NO：79和113)、RHOA_48u(SEQ ID NO：80和114)、RHOA_50(SEQ ID NO：82和116)、RHOA_61(SEQ IDNO：89和123)以及RHOA_61u(SEQ ID NO：90和124)。
在某些实施方式中，本文提供了一种双链RNA分子，该双链RNA分子包括选自表II中列出的寡核苷酸对的有义链和反义链并在本文中被鉴定为：RHOA_48(SEQ ID NO：79和113)、RHOA_48u(SEQ ID NO：80和114)、RHOA_50(SEQ ID NO：82和116)、RHOA_61(SEQ IDNO：89和123)以及RHOA_61u(SEQ ID NO：90和124)。除非另外指明，沿有义链或反义链的所有位置从5’至3’(5’＞3’)计算。
在某些实施方式中，双链核酸分子包括SEQ ID NO：113中列出的反义链和SEQ IDNO：79中列出的有义链；在本文中被鉴定为RHOA_48。在某些实施方式中，所述双链核酸分子具有以下结构：
其中，每个“|”表示核糖核苷酸之间的碱基配对；
其中A、C、G、U中的每个独立地是未修饰的或修饰的核糖核苷酸或非常规部分；
其中Z和Z’中的每一个独立地存在或不存在，但是如果存在的话，则独立地是共价连接在其所存在的链的3’末端的1-5个连续的核苷酸或非核苷酸部分或其组合；且
其中z”可能存在或不存在，但是如果存在的话，则是共价连接在有义链的5’末端的封端部分。
在优选的实施方式中，所述双链核酸分子包含修饰的核糖核苷酸和非常规部分。
在某些实施方式中，提供了一种双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：113)包括在位置5、6、7或8(5’＞3’)中的一个或多个位置处的镜像核苷酸或2’-5’连接的核苷酸，以及共价连接在3’末端的核苷酸或非核苷酸部分。在某些实施方式中，反义链还包括一个或多个2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在某些实施方式中，有义链(SEQ ID NO：79)包括3’末端位置或倒数位置处的4或5个连续的2’-5’连接的核苷酸，共价连接在3’末端的核苷酸或非核苷酸部分，一个或多个2’OMe糖修饰的核苷酸，以及共价连接在5’末端的封端部分。该分子可在反义链上包括5’磷酸。
在某些实施方式中，提供了一种双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：113)包括(5’＞3’)位置1、3、11、14、15、17和18处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH部分；且有义链(SEQ ID NO：79)包括(5’＞3’)位置15、16、17、18和19处的2’-5’连接的核糖核苷酸，3’末端核苷酸或非核苷酸突出端；以及共价连接在5’末端的封端部分。在某些实施方式中，反义链还在位置6、位置7或位置6和7包括2’-5’连接的核糖核苷酸。
在某些实施方式中，提供了一种双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：113)包括(5’＞3’)位置1、3、6、11、14、15、17和18处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH部分；且有义链(SEQ ID NO：79)包括(5’＞3’)位置15、16、17、18和19处的2’-5’连接的核糖核苷酸，共价连接在3’末端的C3Pi或C3OH部分；以及共价连接在5’末端的封端部分。
在某些实施方式中，提供了如化合物RHOA_48S1833中列出的双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：113)包括(5’＞3’)位置1、3、6、11、14、15、17和18处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH部分；且有义链(SEQ ID NO：79)包括(5’＞3’)位置15、16、17、18和19处的2’-5’连接的核糖核苷酸，共价连接在3’末端的C3Pi以及共价连接在5’末端的倒置的脱碱基脱氧核糖核苷酸封端部分。
在某些实施方式中，提供了一种双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：113)包括(5’＞3’)位置1、3、11、14、15、17和18处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，位置6、7和8中的一个或多个位置处的2’-5’连接的核苷酸或镜像核苷酸，以及共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH部分；且有义链(SEQ ID NO：79)包括(5’＞3’)位置15、16、17、18和19处的2’-5’连接的核糖核苷酸，3’末端核苷酸或非核苷酸突出端；以及共价连接在5’末端的封端部分。
在某些实施方式中，提供了一种双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：113)包括(5’＞3’)位置1、3、11、14、15、17和18处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，位置6处的2’-5’连接的核糖核苷酸以及共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH部分；且有义链(SEQ ID NO：79)包括(5’＞3’)位置15、16、17、18和19处的2’-5’连接的核糖核苷酸，共价连接在3’末端的C3Pi或C3OH部分；以及共价连接在5’末端的选自脱碱基部分、倒置的脱碱基部分、C6氨基和镜像核苷酸的封端部分。
在某些实施方式中，提供了化合物RHOA_48_S1857中列出的双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：113)包括(5’＞3’)位置1、3、11、14、15、17和18处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，位置6处的2’-5’连接的核糖核苷酸和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH部分；且有义链(SEQ ID NO：79)包括(5’＞3’)位置15、16、17、18和19处的2’-5’连接的核糖核苷酸，共价连接在3’末端的C3Pi以及共价连接在5’末端的倒置的脱碱基脱氧核糖核苷酸封端部分。
在某些实施方式中，提供了化合物RHOA_48_S1873中列出的双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：113)包括(5’＞3’)位置1、3、11、14、15、17和18处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，位置6处的2’-5’连接的核糖核苷酸和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH部分；且有义链(SEQ ID NO：79)包括(5’＞3’)位置15、16、17、18和19处的2’-5’连接的核糖核苷酸，共价连接在3’末端的C3Pi以及共价连接在5’末端的镜像核苷酸(L-脱氧核糖鸟苷-3’-磷酸)。
在某些实施方式中，提供了一种双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：113)包括(5’＞3’)位置1、3、6、11、14、15、17和18处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、位置7处的2’-5’连接的核糖核苷酸以及共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH部分；且有义链(SEQ ID NO：79)包括(5’＞3’)位置1处的任选的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，位置15、16、17、18和19处的2’-5’连接的核糖核苷酸，共价连接在3’末端的C3Pi或C3OH部分；以及共价连接在5’末端的选自脱碱基部分、倒置的脱碱基部分、C6氨基和镜像核苷酸的封端部分。
在某些实施方式中，提供了如化合物RHOA_48_S1856中列出的双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：113)包括(5’＞3’)位置1、3、6、11、14、15、17和18处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，位置7处的2’-5’连接的核糖核苷酸和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH部分；且有义链(SEQ ID NO：79)包括(5’＞3’)位置1处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，共价连接在3’末端的C3Pi部分以及共价连接在5’末端的倒置的脱碱基脱氧核糖核苷酸封端部分。
在某些实施方式中，提供了如化合物RHOA_48_S1872中列出的双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：113)包括(5’＞3’)位置1、3、6、11、14、15、17和18处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，位置7处的2’-5’连接的核糖核苷酸和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH部分；且有义链(SEQ ID NO：79)包括(5’＞3’)位置1处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸以及位置15、16、17、18和19处的2’-5’连接的核糖核苷酸、共价连接在3’末端的C3Pi以及共价连接在5’末端的镜像核苷酸(L-脱氧核糖鸟苷-3’-磷酸)。
在某些实施方式中，提供了一种双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：113)包括(5’＞3’)位置1、3、11、14、15、17和18处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸以及位置6和7处的2’-5’连接的核糖核苷酸以及共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH部分；且有义链(SEQ ID NO：79)包括(5’＞3’)位置1处的任选的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸以及位置15、16、17、18和19处的2’-5’连接的核糖核苷酸，共价连接在3’末端的C3Pi或C3OH部分以及共价连接在5’末端的选自脱碱基部分、倒置的脱碱基部分和镜像核苷酸的封端部分。
在某些实施方式中，提供了如化合物RHOA_48_S1858中列出的双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：113)包括(5’＞3’)位置1、3、11、14、15、17和18处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，位置6和7处的2’-5’连接的核糖核苷酸和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH部分；且有义链(SEQ ID NO：79)包括(5’＞3’)位置1处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸以及位置15、16、17、18和19处的2’-5’连接的核糖核苷酸，共价连接在3’末端的C3Pi部分以及共价连接在5’末端的倒置的脱碱基脱氧核糖核苷酸封端部分。
在某些实施方式中，提供了如化合物RHOA_48_S1859中列出的双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：113)包括(5’＞3’)位置1、3、11、14、15、17和18处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，位置6处的镜像核苷酸和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH部分；且有义链(SEQ IDNO：79)包括(5’＞3’)位置1处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸以及位置15、16、17、18和19处的2’-5’连接的核糖核苷酸、共价连接在3’末端的C3Pi部分以及共价连接在5’末端的倒置的脱碱基脱氧核糖核苷酸封端部分。
在某些实施方式中，提供了如化合物RHOA_48_S1860中列出的双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：113)包括(5’＞3’)位置1、3、11、14、15、17和18处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，位置8处的镜像核苷酸和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH部分；且有义链(SEQ IDNO：79)包括(5’＞3’)位置1处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸以及位置15、16、17、18和19处的2’-5’连接的核糖核苷酸、共价连接在3’末端的C3Pi部分以及共价连接在5’末端的倒置的脱碱基脱氧核糖核苷酸封端部分。
在某些实施方式中，提供了一种双链核酸分子，其中有义链(SEQ ID NO：79)包括(5’＞3’)位置1处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸以及位置15、16、17、18和19处的2’-5’连接的核糖核苷酸，共价连接在3’末端的C3Pi部分以及共价连接在5’末端的倒置的脱碱基脱氧核糖核苷酸封端部分，且反义链(SEQ ID NO：113)选自
包括(5’＞3’)位置1处的U至dT置换、共价连接到位置1处的脱氧核糖胸苷的5’磷酸、位置3、11、14、15、17和18处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、位置7处的2’-5’连接的核糖核苷酸和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH部分的反义寡核苷酸；且如化合物RHOA_48_S1884中列出的；或
包括(5’＞3’)共价连接到位置1处的尿苷的5’磷酸、位置3、11、14、15、17和18处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、位置7处的2’-5’连接的核糖核苷酸和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH部分的反义寡核苷酸；且如化合物RHOA_48_S1885中列出的；或
包括(5’＞3’)位置1处的U至C3置换、共价连接到位置1处的C3的5’磷酸、位置3、11、14、15、17和18处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、位置7处的2’-5’连接的核糖核苷酸和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH部分的反义寡核苷酸；且如化合物RHOA_48_S1886中列出的；或
包括(5’＞3’)共价连接到位置1处的尿苷的5’磷酸、位置1、3、11、14、15、17和18处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、位置7处的2’-5’连接的核糖核苷酸和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH部分的反义寡核苷酸；且如化合物RHOA_48_S1887中列出的。
在某些实施方式中，所述双链核酸分子包括SEQ ID NO：114中列出的反义链和SEQID NO：80中列出的有义链；在本文被鉴定为RHOA_48u。在某些实施方式中，所述双链核酸分子具有以下结构：
其中，每个“|”表示核糖核苷酸之间的碱基配对；
其中A、C、G、U中的每一个独立地是未修饰的或修饰的核糖核苷酸或非常规部分；
其中Z和Z’中的每一个独立地存在或不存在，但是如果存在的话，则独立地是共价连接在其所存在的链的3’末端的1-5个连续的核苷酸或非核苷酸部分或其组合；且
其中z”可能存在或不存在，但是如果存在的话，则是共价连接在有义链的5’末端的封端部分。
在优选的实施方式中，所述双链核酸分子包含修饰的核糖核苷酸和非常规部分。
在某些实施方式中，提供了一种双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：114)包括(5’＞3’)一个或多个2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、位置5、6、7或8(5’＞3’)中的一个或多个位置处的镜像核苷酸或2’-5’连接的核糖核苷酸以及3’末端的核苷酸或非核苷酸突出端。反义链还可包括5’末端磷酸。在某些实施方式中，有义链(SEQ ID NO：80)包括(5’＞3’)在3’末端位置或倒数位置处的4或5个连续的2’-5’连接的核苷酸，共价连接在3’末端的核苷酸或非核苷酸部分，以及共价连接在5’末端的封端部分。在其他实施方式中，有义链(SEQID NO：80)还包括一个或多个2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。
在某些实施方式中，提供了化合物RHOA_48u_S1812中列出的双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：114)包括(5’＞3’)在位置(5’＞3’)3、6、11、14、15、17和18处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，位置7处的2’-5’核糖核苷酸和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH部分；且有义链(SEQ ID NO：80)包括(5’＞3’)位置15、16、17、18和19处的2’-5’核糖核苷酸，共价连接在3’末端的C3Pi部分；以及共价连接在5’末端的倒置的脱碱基脱氧核糖核苷酸部分。
在某些实施方式中，提供了化合物RHOA_48u_S1813中列出的双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：114)包括(5’＞3’)在位置(5’＞3’)3、6、11、14、15、17和18处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，位置7处的2’-5’核糖核苷酸和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH部分；且有义链(SEQ ID NO：80)包括(5’＞3’)位置13和16处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，位置9处的2’-5’连接的核糖核苷酸，共价连接在3’末端的C3Pi部分以及共价连接在5’末端的倒置的脱碱基脱氧核糖核苷酸部分。
在某些实施方式中，提供了化合物RHOA_48u_S1870中列出的双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：114)包括(5’＞3’)在位置(5’＞3’)3、6、11、14、15、17和18处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，位置7处的2’-5’核糖核苷酸和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH部分；且有义链(SEQ ID NO：80)包括(5’＞3’)位置1处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，和位置15、16、17、18和19处的2’-5’核糖核苷酸，共价连接在3’末端的C3Pi部分；以及共价连接在5’末端的镜像核苷酸(L-脱氧核糖鸟苷-3’-磷酸)。
在某些实施方式中，提供了化合物RHOA_48u_S1871中列出的双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：114)包括(5’＞3’)在位置(5’＞3’)3、6、11、14、15、17和18处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，位置7处的2’-5’核糖核苷酸和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH部分；且有义链(SEQ ID NO：80)包括(5’＞3’)位置1处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，和位置15、16、17、18和19处的2’-5’核糖核苷酸，共价连接在3’末端的C3Pi部分；以及共价连接在5’末端的倒置的脱碱基脱氧核糖核苷酸。
在某些实施方式中，所述双链核酸分子包括SEQ ID NO：116中列出的反义链和SEQID NO：82中列出的有义链；在本文被鉴定为RHOA_50。在某些实施方式中，所述双链核酸分子具有以下结构：
其中，每个“|”表示核糖核苷酸之间的碱基配对；
其中A、C、G、U中的每个独立地是未修饰的或修饰的核糖核苷酸或非常规部分；
其中Z和Z’中的每一个独立地存在或不存在，但是如果存在的话，则独立地是共价连接在其所存在的链的3’末端的1-5个连续的核苷酸或非核苷酸部分或其组合；且
其中z”可能存在或不存在，但是如果存在的话，则是共价连接在有义链的5’末端的封端部分。
在某些实施方式中，提供了一种双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：116)包括(5’＞3’)位置5、6、7或8中的一个或多个位置处的DNA、镜像核苷酸或2’-5’连接的核苷酸，共价连接在3’末端的核苷酸或非核苷酸部分以及一个或多个2’OMe糖修饰的核苷酸。在某些实施方式中，反义链(反义SEQ ID NO：116)包括(5’＞3’)位置5、6、7或8中的一个或多个位置处的交替的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、镜像核苷酸或2’-5’连接的核糖核苷酸，以及共价连接在3’末端的核苷酸或非核苷酸部分。在某些实施方式中，反义链还包括位置1中的U(尿苷)至dU(脱氧尿苷)的置换。反义链还可包括5’末端磷酸。
在某些实施方式中，有义链(SEQ ID NO：82)包括(5’＞3’)位置9或10的一个或多个位置处的镜像核苷酸或2’-5’连接的核苷酸、共价连接在3’末端的核苷酸或非核苷酸部分、一个或多个2’OMe糖修饰的核苷酸，以及共价连接在5’末端的封端部分。
在某些实施方式中，提供了RHOA_50_S1796中列出的双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：116)包括(5’＞3’)位置3、5、9、11、13、15、17和19中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，位置7中的2’-5’连接的核糖核苷酸，共价连接在3’末端的C3Pi-C3OH非核苷酸部分以及位置1中的U(尿苷)至dU(脱氧尿苷)置换；且有义链(SEQ ID NO：82)包括(5’＞3’)共价连接在3’末端的C3Pi非核苷酸部分、位置11、13和18处的2’OMe糖修饰的核苷酸、位置9处的2’-5’连接的核苷酸以及共价连接在5’末端的倒置的脱碱基脱氧核糖核苷酸封端部分。
在某些实施方式中，提供了RHOA_50_S1798中列出的双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：116)包括(5’＞3’)位置4、6、8、11、13、15、17和19中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，位置7中的2’-5’连接的核糖核苷酸、共价连接在3’末端的C3Pi-C3OH非核苷酸部分以及位置1中的U(尿苷)至dU(脱氧尿苷)置换；且有义链(SEQ ID NO：82)包括(5’＞3’)共价连接在3’末端的C3Pi非核苷酸部分、位置18处的2’OMe糖修饰的核苷酸、位置9处的2’-5’连接的核苷酸以及共价连接在5’末端的倒置的脱碱基脱氧核糖核苷酸封端部分。
在某些实施方式中，提供了RHOA_50_S1799中列出的双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：116)包括(5’＞3’)位置3、5、9、11、13、15、17和19中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，位置7中的2’-5’连接的核糖核苷酸和共价连接在3’末端的C3Pi-C3OH非核苷酸部分以及位置1中的U(尿苷)至dU(脱氧尿苷)置换；且有义链(SEQ ID NO：82)包括(5’＞3’)共价连接在3’末端的C3Pi非核苷酸部分、位置18处的2’OMe糖修饰的核苷酸、位置9处的2’-5’连接的核苷酸以及共价连接在5’末端的倒置的脱碱基脱氧核糖核苷酸封端部分。
在某些实施方式中，提供了RHOA_50_S1865中列出的双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：116)包括(5’＞3’)位置4、6、8、11、13、15、17和19处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、位置7处的2’-5’连接的核糖核苷酸、共价连接在3’末端的C3Pi-C3OH非核苷酸部分以及位置1处的U(尿苷)至dU(脱氧尿苷)置换；且有义链(SEQ ID NO：82)包括(5’＞3’)共价连接在3’末端的C3Pi非核苷酸部分、位置17和18处的2’OMe糖修饰的核苷酸、位置9处的2’-5’连接的核苷酸以及共价连接在5’末端的倒置的脱碱基脱氧核糖核苷酸封端部分。
在某些实施方式中，提供了RHOA_50_S1866中列出的双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：116)包括(5’＞3’)位置3、5、9、11、13、15、17和19处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，位置7处的2’-5’连接的核糖核苷酸、共价连接在3’末端的C3Pi-C3OH非核苷酸部分以及位置1处的U(尿苷)至dU(脱氧尿苷)置换；且有义链(SEQ ID NO：82)包括(5’＞3’)共价连接在3’末端的C3Pi非核苷酸部分、位置17和18处的2’OMe糖修饰的核苷酸、位置9处的2’-5’连接的核苷酸以及共价连接在5’末端的倒置的脱碱基脱氧核糖核苷酸封端部分。
在某些实施方式中，双链核酸分子包括SEQ ID NO：123中列出的反义链和SEQ IDNO：89中列出的有义链；在本文被鉴定为RHOA_61。在某些实施方式中，所述双链核酸分子具有以下结构：
其中，每个“|”表示核糖核苷酸之间的碱基配对；
其中A、C、G、U中的每一个独立地是未修饰的或修饰的核糖核苷酸或非常规部分；
其中Z和Z’中的每一个独立地存在或不存在，但是如果存在的话，则独立地是共价连接在其所存在的链的3’末端的1-5个连续的核苷酸或非核苷酸部分或其组合；且
其中z”可能存在或不存在，但是如果存在的话，则是共价连接在有义链的5’末端的封端部分。
在优选的实施方式中，所述双链核酸分子包含修饰的核糖核苷酸和非常规部分。
在某些实施方式中，提供了一种双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：123)包括位置5、6、7或8(5’＞3’)中的一个或多个位置处的DNA、镜像核苷酸或2’-5’连接的核苷酸、共价连接在3’末端的核苷酸或非核苷酸部分以及一个或多个2’OMe糖修饰的核苷酸。在某些实施方式中，有义链(SEQ ID NO：89)包括3’末端位置或倒数位置处的4或5个连续的2’-5’连接的核苷酸或一个或多个2’OMe糖修饰的核苷酸、共价连接在3’末端的核苷酸或非核苷酸部分，以及共价连接在5’末端的封端部分。在某些实施方式中，有义链还包括位置9和10中的一个或两个位置处的DNA、镜像核苷酸或2’-5’连接的核苷酸。
在某些实施方式中，双链核酸分子包括SEQ ID NO：124中列出的反义链和SEQ IDNO：90中列出的有义链；在本文被鉴定为RHOA_61U。在某些实施方式中，所述双链核酸分子具有以下结构：
其中，每个“|”表示核糖核苷酸之间的碱基配对；
其中A、C、G、U中的每一个独立地是未修饰的或修饰的核糖核苷酸或非常规部分；
其中Z和Z’中的每一个独立地存在或不存在，但是如果存在的话，则独立地是共价连接在其所存在的链的3’末端的1-5个连续的核苷酸或非核苷酸部分或其组合；且
其中z”可能存在或不存在，但是如果存在的话，则是共价连接在有义链的5’末端的封端部分。
在优选的实施方式中，所述双链核酸分子包含修饰的核糖核苷酸和非常规部分。
在某些实施方式中，提供了一种双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：124)包括位置5、6、7或8(5’＞3’)中的一个或多个位置处的DNA、镜像核苷酸或2’-5’连接的核糖核苷酸、共价连接在3’末端的核苷酸或非核苷酸部分以及一个或多个2’OMe糖修饰的核苷酸。在某些实施方式中，有义链(SEQ ID NO：90)包括3’末端位置或倒数位置处的4或5个连续的2’-5’连接的核苷酸或一个或多个2’OMe糖修饰的核苷酸，共价连接在3’末端的核苷酸或非核苷酸部分，以及共价连接在5’末端的封端部分。在某些实施方式中，有义链还包括位置9和10中的一个或两个位置中的DNA、镜像核苷酸或2’-5’连接的核苷酸。
在某些实施方式中，本文提供了一种双链RNA分子，该双链RNA分子包括选自表III中列出的寡核苷酸对的有义链和反义链并在本文中被鉴定为RHOA_58(SEQ ID NO：143和157)和RHOA_70(SEQ ID NO：146和160)。
在某些实施方式中，双链核酸分子包括SEQ ID NO：157中列出的反义链和SEQ IDNO：143中列出的有义链；在本文被鉴定为RHOA_58。在某些实施方式中，所述双链核酸分子具有以下结构：
其中，每个“|”表示核糖核苷酸之间的碱基配对；
其中A、C、G、U中的每一个独立地是未修饰的或修饰的核糖核苷酸或非常规部分；
其中Z和Z’中的每一个独立地存在或不存在，但是如果存在的话，则独立地是共价连接在其所存在的链的3’末端的1-5个连续的核苷酸或非核苷酸部分或其组合；且
其中z”可能存在或不存在，但是如果存在的话，则是共价连接在有义链的5’末端的封端部分。
在优选的实施方式中，所述双链核酸分子包含修饰的核糖核苷酸和非常规部分。
在某些实施方式中，提供了一种双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：157)包括位置5、6、7或8(5’＞3’)中的一个或多个位置处的镜像核苷酸或2’-5’连接的核糖核苷酸，以及共价连接在3’末端的核苷酸或非核苷酸部分以及一个或多个2’OMe糖修饰的核苷酸。在某些实施方式中，反义链还包括5’末端磷酸。在某些实施方式中，有义链(反义SEQ IDNO：143)包括3’末端位置或倒数位置处的4或5个连续的2’-5’连接的核苷酸或一个或多个2’OMe糖修饰的核苷酸、共价连接在3’末端的核苷酸或非核苷酸部分，以及共价连接在5’末端的封端部分。在某些实施方式中，有义链还包括(5’＞3’)位置9和10中的一个或两位置个中的DNA、镜像核苷酸或2’-5’连接的核苷酸。
在某些实施方式中，提供了RHOA_58_S1801中列出的双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：157)包括(5’＞3’)位置4、6、8、11、13、15、17和19处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、位置7处的2’-5’连接的核糖核苷酸和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH非核苷酸部分；且有义链(SEQ ID NO：79143)包括(5’＞3’)位置15、16、17、18和19处的5个连续的2’-5’连接的核苷酸、共价连接在3’末端的C3Pi非核苷酸部分以及共价连接在5’末端的倒置的脱碱基脱氧核糖核苷酸封端部分。
在某些实施方式中，提供了RHOA_58_S1804中列出的双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：157)包括(5’＞3’)位置4、6、8、11、13、15、17和19处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、位置7处的2’-5’连接的核糖核苷酸和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH非核苷酸部分；且有义链(SEQ ID NO：143)包括(5’＞3’)位置15、16、17、18和19处的5个连续的2’-5’连接的核苷酸、共价连接在3’末端的C3Pi非核苷酸部分、位置9处的2’-5’连接的核苷酸以及共价连接在5’末端的倒置的脱碱基脱氧核糖核苷酸封端部分。
在某些实施方式中，提供了RHOA_58_S1806中列出的双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：1157)包括(5’＞3’)位置3、5、9、11、13、15、17和19处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、位置7处的2’-5’连接的核糖核苷酸和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH非核苷酸部分且有义链(SEQ ID NO：143)包括(5’＞3’)共价连接在3’末端的C3Pi非核苷酸部分、位置11、13和17处的2’OMe糖修饰的核苷酸、位置9处的2’-5’连接的核苷酸以及共价连接在5’末端的倒置的脱碱基脱氧核糖核苷酸封端部分。
在某些实施方式中，提供了RHOA_58_S1861中列出的双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：157)包括(5’＞3’)位置4、8、11、13、15、17和19处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、位置6处的2’-5’连接的核苷酸和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH非核苷酸部分；且有义链(SEQ ID NO：143)包括(5’＞3’)共价连接在3’末端的C3Pi非核苷酸部分、位置11、13和17处的2’OMe糖修饰的核苷酸、位置9处的2’-5’连接的核苷酸以及共价连接在5’末端的倒置的脱碱基脱氧核糖核苷酸封端部分。
在某些实施方式中，提供了RHOA_58_S1862中列出的双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：157)包括(5’＞3’)位置4、8、11、13、15、17和19处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、位置6中的U至dT置换和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH非核苷酸部分；且有义链(SEQID NO：143)包括(5’＞3’)共价连接在3’末端的C3Pi非核苷酸部分、位置11、13和17处的2’OMe糖修饰的核苷酸、位置9处的2’-5’连接的核苷酸以及共价连接在5’末端的倒置的脱碱基脱氧核糖核苷酸封端部分。
在某些实施方式中，提供了RHOA_58_S1877中列出的双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：157)包括(5’＞3’)位置3、5、9、11、13、15、17和19处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、位置7处的2’-5’连接的核糖核苷酸和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH非核苷酸部分且有义链(SEQ ID NO：143)包括(5’＞3’)共价连接在3’末端的C3Pi非核苷酸部分、位置11、13和17处的2’OMe糖修饰的核苷酸、位置9处的2’-5’连接的核苷酸以及共价连接在5’末端的镜像核苷酸(L-脱氧核糖鸟苷-3’-磷酸)封端部分。
在某些实施方式中，提供了RHOA_58_S1878中列出的双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：157)包括(5’＞3’)位置4、8、11、13、15、17和19处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、位置6处的2’-5’连接的核苷酸和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH非核苷酸部分；且有义链(SEQ IDNO：143)包括(5’＞3’)共价连接在3’末端的C3Pi非核苷酸部分、位置11、13和17处的2’OMe糖修饰的核苷酸、位置9处的2’-5’连接的核苷酸以及共价连接在5’末端的镜像核苷酸(L-脱氧核糖鸟苷-3’-磷酸)封端部分。
在某些实施方式中，提供了RHOA_58_S1879中列出的双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：157)包括(5’＞3’)位置4、8、11、13、15、17和19处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、位置6处的dT和共价连接在3’末端的C3Pi-C3OH非核苷酸部分；且有义链(SEQ ID NO：143)包括(5’＞3’)共价连接在3’末端的C3Pi非核苷酸部分、位置11、13和17处的2’OMe糖修饰的核苷酸、位置9处的2’-5’连接的核苷酸以及共价连接在5’末端的镜像核苷酸(L-脱氧核糖鸟苷-3’-磷酸)封端部分。
在某些实施方式中，双链核酸分子包括SEQ ID NO：160中列出的反义链和SEQ IDNO：146中列出的有义链；在本文被鉴定为RHOA_70。在某些实施方式中，所述双链核酸分子具有以下结构：
其中，每个“|”表示核糖核苷酸之间的碱基配对；
其中A、C、G、U中的每一个独立地是未修饰的或修饰的核糖核苷酸或非常规部分；
其中Z和Z’中的每一个独立地存在或不存在，但是如果存在的话，则独立地是共价连接在其所存在的链的3’末端的1-5个连续的核苷酸或非核苷酸部分或其组合；且
其中z”可能存在或不存在，但是如果存在的话，则是共价连接在有义链的5’末端的封端部分。
在优选的实施方式中，所述双链核酸分子包含修饰的核糖核苷酸和非常规部分。
在某些实施方式中，提供了一种双链核酸分子，其中反义链(SEQ ID NO：160)包括位置5、6、7或8(5’＞3’)中的一个或多个位置处的DNA、镜像核苷酸或2’-5’连接的核苷酸、共价连接在3’末端的核苷酸或非核苷酸部分以及一个或多个2’OMe糖修饰的核苷酸。在某些实施方式中，反义链还包括5’末端磷酸。在某些实施方式中，有义链(反义SEQ ID NO：146)包括3’末端位置或倒数位置处的4或5个连续的2’-5’连接的核苷酸或一个或多个2’OMe糖修饰的核苷酸、共价连接在3’末端的核苷酸或非核苷酸部分，以及共价连接在5’末端的封端部分。在某些实施方式中，有义链还包括(5’＞3’)位置9和10中的一个或两个位置中的DNA、镜像核苷酸或2’5’连接的核苷酸。
第二方面，本发明提供了包含根据本发明的一种或多种这类核酸化合物的药物组合物；以及药学上可接受的赋形剂。在某些实施方式中，所述dsRNA作为裸露的dsRNA施用。在其他实施方式中，所述化合物被包封在药物载体中。
第三方面，本发明涉及根据本申请的化合物在治疗患CNS、PNS、前庭感官系统、视觉系统和/或循环(血管、动脉)系统方面的疾病或疾患的受治疗者中的用途，或在治疗患恶性疾病或疾患例如癌症的受治疗者中的用途。本文提供了用于预防、抑制或治疗由中枢神经系统(CNS)和/或周围神经系统(PNS)中的损伤、疾病、疾患或病症造成的神经元变性的方法，包括对需要其的个体施用有效地治疗所述损伤、疾病、疾患或病症的量的根据结构A1和/或结构A2的核酸化合物。还提供了用于对罹患神经性损伤的个体提供神经保护的方法，该方法包括对所述个体施用有效地减轻与所述神经损伤有关的神经变性的量的根据结构A1和/或结构A2的化合物或其药学上可接受的盐。
另一方面，提供了本文公开的核酸化合物对于制备用于治疗CNS、PNS、前庭感官系统、视觉系统和/或循环(血管，动脉)系统中的疾病或疾患的药剂的用途。另一方面，提供了本文公开的核酸化合物对于制备治疗恶性疾病或疾患例如癌症的药剂的用途。在特定实施方式中，本发明提供了化学修饰的dsRNA寡核苷酸，包含该dsRNA寡核苷酸的组合物及其在治疗中枢神经系统(CNS)的疾病、疾患、损伤和病症，包括但不限于与神经变性和神经保护有关的病症、中枢神经系统(CNS)的损伤、脊髓损伤(SCI)、脑损伤、周围神经损伤(PNI)、神经疾患、眼科疾病和疾患及前庭系统的疾病和疾患中的使用方法。在某些实施方式中，本文公开的化合物减轻神经元变性。神经元变性包括例如，视神经和视网膜包括视网膜神经节细胞的变性。其还包括负责将声音和平衡信息从内耳传输到脑的听觉神经(也称为前庭蜗神经或听神经)的变性。内耳的毛细胞通过听觉神经将信息传输到脑，听觉神经由耳蜗神经和前庭神经组成，且从延髓出现并通过颞骨中的内部听道(或内耳道)与面神经一起进入内部头骨。
在某些实施方式中，本发明提供了减轻受治疗者的视神经和或视网膜神经节细胞中的神经元变性的方法，包括对该受治疗者施用治疗有效量的本文公开的核酸分子。在某些实施方式中，所述受治疗者罹患青光眼或NAION。
在某些实施方式中，本发明提供了减轻受治疗者的听觉神经中的神经元变性的方法，包括对该受治疗者施用治疗有效量的本文公开的核酸分子。在某些实施方式中，所述受治疗者罹患梅尼尔氏症。
在某些实施方式中，本发明提供了对受治疗者体内的视神经和或视网膜神经节细胞提供神经保护的方法，包括对该受治疗者施用治疗有效量的本文公开的核酸分子。在某些实施方式中，所述受治疗者罹患青光眼或NAION。
在某些实施方式中，本发明提供了对受治疗者体内的听觉神经和或脊髓神经节细胞提供神经保护的方法，包括对该受治疗者施用治疗有效量的本文公开的核酸分子。在某些实施方式中，所述受治疗者罹患梅尼尔氏病。
在某些实施方式中，本发明提供了治疗受治疗者体内的神经病变的方法，包括对该受治疗者施用治疗有效量的本文公开的核酸分子。在某些实施方式中，所述受治疗者罹患自主神经病变、癌症相关的神经病变、压迫性神经病变、糖尿病性神经病变、药物引起的神经病变、毒性神经病变、化疗引起的神经病变、胃肠神经病变、营养相关的神经病变、遗传性神经病变、免疫介导的神经病变和慢性免疫介导的多神经病变、感染性神经病变或神经性疼痛。在某些实施方式中，所述受治疗者罹患糖尿病性神经病变。在某些实施方式中，所述受治疗者患有触摸痛。在某些实施方式中，本发明提供了治疗患与异常和/或被破坏的细胞运动性、细胞骨架调节和/或微管组织有关的疾病或疾患的受治疗者的方法，包括对该受治疗者施用治疗有效量的本文公开的核酸分子。在某些实施方式中，所述受治疗者患有血管生成性疾患、血管疾病和/或动脉疾病。在某些实施方式中，受治疗者患选自以下的视觉血管生成性疾病或疾患：角膜血管生成性疾病或疾患、视网膜血管生成性疾病或疾患、脉络膜血管生成性疾病或疾患或其组合。在某些实施方式中，所述受治疗者患有视网膜病例如糖尿病性视网膜病。在某些实施方式中，所述受治疗者是处于角膜移植排斥的风险之下或经受角膜移植排斥的角膜移植患者。在某些实施方式中，所述受治疗者正处于再狭窄的风险之下或患有再狭窄。
这些方法包括对需要该治疗的哺乳动物施用预防上或治疗上有效量的抑制或减少RhoA的表达或其活性的一种或多种本文公开的核酸分子。
另一方面，本发明涉及用于治疗需要治疗的受治疗者的与RhoA的表达有关的疾病或疾患或与所述疾病或疾患有关的症状的方法，包括对所述治疗者施用某种量的SEQ IDNO：1中列出的减少或抑制RhoA表达的核酸分子。
附图简述
图1提供了所合成的示例性dsRNA的表。在不同浓度下体外测试了一些分子并提供了％剩余mRNA。
图2：在测量递增剂量的dsRhoA化合物在大鼠视神经挤压(optic nerve crush)后引发RGC轴突再生的能力的体内研究中dsRhoA治疗之后的平均RGC存活
图3：在测量递增剂量的dsRhoA化合物在大鼠的视神经挤压后引发RGC轴突再生的能力的体内研究中与dsEGFP相比RGC存活的促进
图4：通过IT泵植入和加巴喷丁治疗施用的受试物(test item)
图5：通过IT单次腰椎注射施用的受试物。
发明详述
本文公开了下调RhoA表达的化合物，特别是新型的化学修饰的双链RNA寡核苷酸(dsRNA)，及这些新型dsRNA在治疗各种疾病和医学病症，特别是中枢神经系统(CNS)的疾病和疾患中的用途。根据一个方面，本发明提供了包含未修饰的和修饰的核苷酸和或非常规部分的抑制性寡核苷酸化合物。该化合物包括选自由糖修饰、碱基修饰和核苷酸间键修饰组成的组的至少一种修饰的核苷酸且还可包括DNA和修饰的核苷酸或非常规部分，修饰的核苷酸或非常规部分包括LNA(锁核酸)、ENA(亚乙基-桥接的核酸)、PNA(肽核酸)、阿拉伯糖苷、PACE、镜像核苷酸、通过2’-5’核苷酸间键连接到相邻核苷酸的核苷酸或具有6碳糖的核苷酸。
RhoA是控制CNS神经元(包括RGC)中的细胞功能例如运动性、生长、分化和凋亡的小GTP酶蛋白质。RhoA还通过在神经免疫细胞(小胶质细胞和巨噬细胞)和星形胶质细胞中的信号传导参与继发炎症反应和瘢痕形成的CNS损伤(scarring CNSinjury)反应。待治疗的具体疾病和病症包括SCI、青光眼、AMD、神经变性疾病包括阿尔茨海默病和帕金森病、ALS、中风、TBI及类似的疾病和病症。
表I、表II和表III中提供了在产生根据本公开内容的siRNA化合物方面有用的优选的有义和反义序列的列表。
下调RhoA的方法、核酸分子和组合物被本文详细地讨论且所述分子和/或组合物中的任何一种可被有益地用于患所述病症中的任何一种的受治疗者的治疗中。
本文提供的核酸化合物具有可增加活性、增加稳定性和或最小化毒性的结构和修饰；在产生本文公开的dsRNA化合物方面有用的新型修饰可被有益地应用于在阻止或减弱RhoA表达方面有用的双链RNA。
在某些实施方式中，本文提供了具有结构(A1)的双链RNA化合物：
(A1)5’(N)x-Z3’(反义链)
3’Z’-(N’)y-z”5’(有义链)
其中每个N和N’是可以未修饰或修饰的核糖核苷酸，或非常规部分；
其中(N)x和(N’)y中的每一个是寡核苷酸，其中每个连续的N或N’通过共价键被连接到下一个N或N’；
其中Z和Z’中的每一个独立地存在或不存在，但是如果存在的话，则独立地包含共价连接在其所存在的链的3’末端的1-5个连续的核苷酸、1-5连续的非核苷酸部分或其组合；
其中z”可能存在或不存在，但是如果存在的话，则是共价连接在(N’)y的5’末端的封端部分；
x和y中的每一个独立地是18至40的整数；
其中，(N’)y的序列与(N)x的序列互补；且其中(N)x包含表III或表IV中列出的反义序列。
表III中提供的在产生dsRNA化合物方面有用的有义和反义序列为RHOA_31(SEQID NO：135和149)、RHOA_33(SEQ ID NO：136和150)、RHOA_37(SEQ ID NO：137和151)、RHOA_38(SEQ ID NO：138和152)、RHOA_43(SEQ ID NO：139和153)、RHOA_52(SEQ ID NO：140和154)、RHOA_56(SEQ ID NO：141和155)、RHOA_57(SEQ ID NO：142和156)、RHOA_58(SEQ IDNO：143和157)、RHOA_68(SEQ ID NO：144和158)、RHOA_69(SEQ ID NO：145和159)、RHOA_70(SEQ ID NO：146和160)、RHOA_73(SEQ ID NO：147和161)和RHOA_76(SEQ ID NO：148和162)。在产生表IV中提供的dsRNA化合物方面有用的有义和反义序列被列出在RHOA_23(SEQID NO：163和167)、RHOA_24(SEQ ID NO：164和168)、RHOA_26(SEQ ID NO：165和169)或RHOA_29(SEQ ID NO：166和170)中。
在某些实施方式中，连接每个连续的N和/或N’的共价键是磷酸二酯键。
在某些实施方式中x＝y且x和y中的每一个是19、20、21、22或23。在优选的实施方式中，x＝y＝19。
在如本文公开的核酸分子(例如，dsRNA分子)的某些实施方式中，所述双链核酸分子是siRNA、siNA或miRNA。
在某些优选的实施方式中，所述有义链和反义链包含RHOA_58(SEQID NO：143和157)中列出的序列对。在某些实施方式中，所述有义链和反义链包含RHOA_70(SEQ ID NO：146和160)中列出的序列对。
在某些实施方式中，所述双链核酸分子包含在反义链(5’末端)的位置1处的DNA部分或针对靶的错配。本文描述了该双链体结构。根据一个实施方式，提供了具有以下列出的结构(A2)的双链siRNA化合物：
(A2)5’N1-(N)x-Z3’(反义链)
3’Z’-N2-(N’)y-z”5’(有义链)
其中每个N1、N2、N和N’独立地是未修饰的核苷酸或修饰的核苷酸或非常规部分；
其中(N)x和(N’)y中的每一个是寡核苷酸，其中每个连续的N或N’通过共价键被连接到相邻的N或N’；
其中x和y中的每一个独立地是17和39之间的整数；
其中N2与(N’)y共价键合；
其中N1与(N)x共价键合并与靶mRNA(SEQ ID NO：1)错配或是与靶mRNA互补的DNA部分；
其中N1是选自由天然的或修饰的：尿苷、脱氧核糖尿苷、核糖胸苷、脱氧核糖胸苷、腺苷或脱氧腺苷、脱碱基核糖部分和脱碱基脱氧核糖部分组成的组的部分；
其中z”可能存在或不存在，但是如果存在的话，则是共价连接在N2-(N’)y的5’末端的封端部分；
其中Z和Z’中的每一个独立地存在或不存在，但是如果存在的话，则独立地是共价连接在其所存在的链的3’末端的1-5个连续的核苷酸、1-5连续的非核苷酸部分或其组合；且
其中，(N’)y的序列与(N)x的序列互补；且
其中(N)x的序列包含表I中列出的反义序列。
在多个实施方式中，N1-(N)x的序列包含表II中列出的反义序列。在某些实施方式中，在产生dsRNA化合物方面有用的N2-(N’)y和N1-(N)x被展示在表II中并列出在RHOA_32(SEQ ID NO：67和101)、RHOA_34(SEQ ID NO：68和102)、RHOA_35(SEQ ID NO：69和103)、RHOA_36(SEQ ID NO：70和104)、RHOA_39(SEQ ID NO：71和105)、RHOA_40(SEQ ID NO：72和106)、RHOA_41(SEQ ID NO：73和107)、RHOA_42(SEQ ID NO：74和108)、RHOA_44(SEQ ID NO：75和109)、RHOA_45(SEQ ID NO：76和110)、RHOA_46(SEQ ID NO：77和111)、RHOA_47(SEQ IDNO：78和112)、RHOA_48(SEQ ID NO：79和113)、RHOA_48u(SEQ ID NO：80和114)、RHOA_49(SEQ ID NO：81和115)、RHOA_50(SEQ ID NO：82和116)RHOA_51(SEQ ID NO：83和117)、RHOA_53(SEQ ID NO：84和118)、RHOA_54(SEQ ID NO：85和119)、RHOA_55(SEQ ID NO：86和120)、RHOA_59(SEQ ID NO：87和121)、RHOA_60(SEQ ID NO：88和122)、RHOA_61(SEQ ID NO：89和123)、RHOA_61u(SEQ ID NO：90和124)、RHOA_62(SEQ ID NO：91和125)、RHOA_63(SEQID NO：92和126)、RHOA_64(SEQ ID NO：93和127)、RHOA_65(SEQ ID NO：94和128)、RHOA_66(SEQ ID NO：95和129)、RHOA_67(SEQ ID NO：96和130)、RHOA_71(SEQ ID NO：97和131)、RHOA_72(SEQ ID NO：98和132)、RHOA_74(SEQ ID NO：99和133)和RHOA_75(SEQ ID NO：100和134)中。
本文列出了利用了该有义链(过客链(passenger strand))序列和反义链(引导链(guide strand))序列的新型dsRNA化合物。
定义
为了方便，本文描述了说明书、实施例和权利要求中采用的某些术语。
应指出，除非内容明确地另外指出，如本文所用的单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数形式。
当根据马库什组(Markush group)或其他替代分组描述本发明的方面或实施方式时，本领域技术人员将认识到因此还根据该组的任何单个的成员或成员的亚组描述本发明。
“抑制剂”是能够在足以实现期望的生物学或生理学效应的程度上(部分地或全部地)下调或减少基因的表达或该基因的产物活性的化合物。如本文所用的术语“抑制剂”是指包括dsRNA、siRNA、shRNA、合成的shRNA；miRNA、反义RNA和DNA及核酶的寡核苷酸或核酸抑制剂中的一种或多种。
“dsRNA抑制剂”是能够在足以实现期望的生物学或生理学效应的程度上下调或减少基因的表达或该基因的产物活性的化合物。如本文所用的术语“dsRNA抑制剂”是指dsRNA、siRNA、shRNA、合成的shRNA；miRNA中的一种或多种。抑制还可称为下调或对于RNAi来讲，称为沉默。
如本文所用的“抑制”是指在足以实现期望的生物学或生理学效应的程度上下调或减少基因的表达或该基因的产物活性。抑制可以是完全的或部分的。
如本文所用的，术语RhoA的“抑制”或“下调”意思是基因表达(转录或翻译)或多肽活性的下调或抑制。靶mRNA序列的多核苷酸序列是指优选地与SEQ ID NO：1中列出的RhoAmRNA具有至少70％的同一性，更优选地80％的同一性，甚至更优选地90％或95％的同一性的mRNA序列或其任何同源序列。因此，已经历如本文所述的突变、改变或修饰的多核苷酸序列被包括在本发明中。术语“mRNA多核苷酸序列”和“mRNA”被互换地使用。RhoA是调控肌动蛋白细胞骨架的GTP酶且其在脊髓损伤后被上调并已表明在眼睛的小梁网中表达。
如本文所用的，术语“多核苷酸”和“核酸”可互换地使用且指包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的核苷酸序列。这些术语还应被理解成包括由核苷酸类似物构成的RNA或DNA类似物作为等同物。遍布本申请，列出了表示相应基因的mRNA序列。
“寡核苷酸”或“寡聚物”是指约2至约50个核苷酸的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的序列。每个DNA或RNA核苷酸可独立地是天然的或合成的，和或修饰的或未修饰的。修饰包括对糖部分、碱基部分和或寡核苷酸中的核苷酸之间的键的改变。本文公开的化合物包括包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸及其组合的分子。
“核苷酸”意在包括可以是天然的或合成的，和或修饰的或未修饰的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。修饰包括对糖部分、碱基部分和或寡核糖核苷酸中的核糖核苷酸之间的键的改变。如本文所用的，术语“核糖核苷酸”包括天然的和合成的、未修饰的和修饰的核糖核苷酸。修饰包括对糖部分、对碱基部分和/或对寡核苷酸中核糖核苷酸之间的键的改变。
根据某些实施方式，提供了包含未修饰的和修饰的核苷酸和或非常规部分的抑制性寡核苷酸化合物。该化合物包含选自由糖修饰、碱基修饰和核苷酸间键修饰组成的组的至少一种修饰的核苷酸且可包含DNA和修饰核苷酸例如LNA(锁核酸)、ENA(亚乙基-桥接的核酸)、PNA(肽核酸)、阿拉伯糖苷、PACE、镜像核苷酸、或具有6碳糖的核苷酸。
核苷酸/寡核苷酸的所有类似物或对核苷酸/寡核苷酸的所有修饰可采用本文公开的修饰，条件是所述类似物或修饰没有显著不利地影响所述核苷酸/寡核苷酸的功能。可接受的修饰包括糖部分的修饰、碱基部分的修饰、核苷酸间键的修饰及其组合。
在一个实施方式中，该化合物包含至少一个核糖核苷酸的糖部分的2’修饰(“2’糖修饰”)。在某些实施方式中，该化合物任选地在交替位置上包含2’O-烃基或2’-氟或2’O-烯丙基或任何其他2’修饰。其他稳定性修饰也是可能的(例如，末端修饰)。在某些实施方式中，优选的2’O-烃基是2’O-甲基(甲氧基，2’OMe)糖修饰。如欧洲专利EP0586520B1或EP0618925B1以及其他专利中描述的，糖修饰包括糖残基的2’部分上的修饰且包括氨基、氟、烃氧基例如甲氧基、烃基、氨基、氟、氯、溴、CN、CF、咪唑、羧酸酯、硫代酯(thioate)、C1至C10低级烃基、取代的低级烃基、烃芳基或芳烃基、OCF3、OCN、O-、S-或N-烃基；O-、S或N-烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2、N3；杂环烃基；杂环烃芳基；氨基烃氨基；聚烃氨基或取代的甲硅烷基。
在某些实施方式中，寡核苷酸的骨架被修饰且包含磷酸-D-核糖实体但还可包含硫代磷酸-D-核糖实体、三酯、硫代酯、2’-5’桥接的骨架(也可称为5’-2’)、PACE及类似物。
如本文所用的，术语“非配对核苷酸类似物”意思是包含非碱基配对部分的核苷酸类似物，所述非碱基配对部分包括但不限于：6去氨基腺苷(水粉蕈素)、4-Me-吲哚、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、Ds、Pa、N3-Me核糖U、N3-Me核糖T、N3-Me dC、N3-Me-dT、N1-Me-dG、N1-Me-dA、N3-乙基-dC、N3-Me dC。在某些实施方式中，非碱基配对核苷酸类似物是核糖核苷酸。在其他实施方式中，其为脱氧核糖核苷酸。
其他修饰包括在寡核苷酸的5’和/或3’部分上的末端修饰且也被称为封端部分。这些末端修饰选自核苷酸、修饰的核苷酸、脂质、肽和糖。
“烃基(alkyl)部分或其衍生物”是指直链或支链碳部分和部分本身或还包含包括醇、磷酸二酯、硫代磷酸酯、膦酰基乙酸酯的官能团且还包括胺、羧酸、酯、酰胺、醛。“烃部分”和“烃基部分”互换地使用。
“末端官能团”包括卤素、醇、胺、羧酸、酯、酰胺、醛、酮、醚基团。
“核苷酸”意在包括可以是天然的或合成的，和可以是修饰的或未修饰的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。修饰包括对糖部分、碱基部分和/或核苷酸间键的改变和取代。
修饰的核糖核苷酸包括脱氧核糖核苷酸和修饰的脱氧核糖核苷酸。修饰的脱氧核糖核苷酸包括例如可被用作5’末端位置(位置编号1)的核苷酸的5’OMe DNA(5-甲基-脱氧核糖鸟苷-3’-磷酸)；PACE(脱氧核糖腺嘌呤3’膦酰基乙酸酯、脱氧核糖胞苷3’膦酰基乙酸酯、脱氧核糖鸟苷3’膦酰基乙酸酯、脱氧核糖胸苷3’膦酰基乙酸酯。本文还提供用于体内抑制RhoA表达的方法和组合物。一般地，该方法包括以足以例如通过RNA干扰机制下调RhoA的表达的量施用靶向由RhoA转录的mRNA的寡核糖核苷酸，特别是双链RNA(即dsRNA)或可在细胞内产生dsRNA的核酸材料。特别地，该主题方法可用来下调RhoA的表达以治疗疾病、疾患或损伤。根据本发明，这些核酸分子或RhoA的抑制剂被用作治疗各种病理学的药物。根据本发明，这些核酸分子或RhoA的抑制剂被用作治疗CNS、PNS、前庭感官系统、视觉系统和/或循环(血管、动脉)系统中的各种疾病或疾患的药物。
dsRNA和RNA干扰
RNA干扰(RNAi)是涉及双链(ds)RNA依赖性的基因特异性的转录后沉默的现象。通过实验研究该现象并操控哺乳动物细胞的初步努力受到响应于长dsRNA分子而激活的有活性的、非特异性的抗病毒防御机制的阻碍(Gil等人，Apoptosis，2000.5：107-114)。后来，发现合成的21个核苷酸RNA的双链体可介导哺乳动物细胞中基因特异性的RNAi，而不刺激一般的抗病毒防御机制(Elbashir等人Nature2001，411：494-498和Caplen等人PNAS2001，98：9742-9747)。因此，为短的双链RNA的小干扰RNA(siRNA)已被广泛地用来抑制基因表达和理解基因功能。
RNA干扰(RNAi)由小干扰RNA(siRNA)(Fire等人，Nature1998，391：806)或微小RNA(miRNA)(Ambros V.Nature2004，431：350-355)；和Bartel DP.Cell.2004116(2)：281-97)介导。相应的过程在植物中观察时通常被称为特异性转录后基因沉默而当在真菌中观察时被称为压抑(quelling)。
siRNA化合物是下调或沉默(即，完全或部分地抑制)内源或外源基因/mRNA表达的双链RNA。RNA干扰基于某些dsRNA物质进入特定蛋白质复合物的能力，然后在所述蛋白质复合物中其被靶向到互补的细胞RNA并特异性地降解它们。因此，RNA干扰响应以通常称作RNA诱导的沉默复合物(RISC)的包含siRNA的核酸内切酶复合物为特征，该复合物介导具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA的裂解。靶RNA的裂解可发生在与siRNA双链体的反义链互补的区域的中间(Elbashir，等人，Genes Dev.，2001，15：188)。更详细地，较长的dsRNA被III型RNA酶(DICER、DROSHA等)消化成短的(17-29bp)dsRNA片段(也称为短的抑制性RNA或“siRNA”)(参见，Bernstein等人，Nature，2001，409：363-6和Lee等人，Nature，2003，425：415-9)。RISC蛋白质复合物识别这些片段和互补的mRNA。整个过程以核酸内切酶对靶mRNA的切割结束(McManus和Sharp，Nature Rev Genet，2002，3：737-47；Paddison和Hannon，Curr Opin Mol Ther.2003，5(3)：217-24)。(对于关于这些术语和所提出的机制的另外的信息，参见例如，Bernstein，等人，RNA.2001，7(11)：1509-21；Nishikura，Cell.2001，107(4)：415-8和PCT公布第WO01/36646号)。
研究已表明siRNA在哺乳动物和人体中可能都是体内有效的。特别地，Bitko等人表明当经鼻内施用时，定向针对呼吸道合胞体病毒(RSV)核衣壳N基因的特异性siRNA在治疗小鼠方面是有效的(Nat.Med.2005，11(1)：50-55)。对于对siRNA的治疗性应用的综述，参见例如Barik(Mol.Med2005，83：764-773)和Chakraborty(Current Drug Targets20078(3)：469-82)。另外，已在人患者中进行了关于靶向VEGFR1受体以治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)的短siRNA的临床研究(Kaiser，Am JOphthalmol.2006142(4)：660-8)。关于siRNA作为治疗剂的用途的另外的信息可在Durcan，2008.Mol.Pharma.5(4)：559-566；Kim和Rossi，2008.BioTechniques44：613-616；Grimm和Kay，2007，JCI，117(12)：3633-41中发现。
化学合成
本发明的化合物可通过本领域熟知的用于合成核糖核酸(或脱氧核糖核酸)寡核苷酸的任何一种方法合成。除其他以外，Beaucage和Iyer，Tetrahedron1992；48：2223-2311；Beaucage和Iyer，Tetrahedron1993；49：6123-6194和Caruthers，等人，MethodsEnzymol.1987；154：287-313中描述了该合成；除其他以外，硫代酯的合成描述在Eckstein，Annu.Rev.Biochem.1985；54：367-402中，RNA分子的合成描述在Sproat，由HerdewijnP.编辑的Humana Press2005；Kap.2：17-31中且除其他以外，各自的下游过程描述在Pingoud等人，由Oliver R.W.A.编辑的IRL Press1989；Kap.7：183-208中。
其他合成方法是本领域已知的，例如Usman等人，1987，J.Am.Chem.Soc，109，7845；Scaringe等人，1990，NAR.，18，5433；Wincott等人，1995，NAR.23，2677-2684；和Wincott等人，1997，Methods Mol.Bio.，74，59中描述的程序，且这些程序可利用常用的核酸保护基团和偶联基团，例如5’-端的二甲氧基三苯甲基和3’-端的亚磷酰胺。如所期望地并入了修饰的(例如2’-O-甲基化的)核苷酸和未修饰的核苷酸。
本发明的寡核苷酸可单独合成并在合成后例如通过连接(Moore等人，1992，Science256，9923；Draper等人，国际专利公布第WO93/23569号；Shabarova等人，1991，NAR19，4247；Bellon等人，1997，Nucleosides&Nucleotides，16，951；Bellon等人，1997，Bioconjugate Chem.8，204)或通过在合成和/或去保护以后的杂交连接在一起。
应注意可使用市售的设备(尤其是可从Applied Biosystems获得的)；根据本文公开的序列制备这些寡核苷酸。化学合成的片段的重叠对可使用本领域熟知的方法连接(例如，参见美国专利第6,121,426号)。单独地合成这些链并然后在管中互相退火。然后，通过HPLC将双链siRNA与未退火的单链寡核苷酸(例如，由于其中之一过量)分离。关于本发明的siRNA或siRNA片段，可合成两种或更多种这类序列并将其连接在一起以用于本发明。
本发明的化合物还可通过例如在美国专利公布第US2004/0019001号(McSwiggen)中描述的串联合成方法合成，其中两条siRNA链被合成为被可裂解的接头分开的单一连续的寡核苷酸片段或链，所述接头随后被裂解以提供单独的siRNA片段或链，所述单独的siRNA片段或链杂交并允许siRNA双链体的纯化。所述接头可以是多核苷酸接头或非核苷酸接头。
本发明还提供了包含用于治疗本文提到的任何一种疾病和病症的两种或更多种siRNA分子的药物组合物，其中所述两种分子可以以产生相等的或在其他方面有益的活性的量在所述药物组合物中被物理地混合在一起，或可共价或非共价结合，或通过长度在2-100，优选地2-50或20-30个核苷酸范围内的核酸接头连接在一起。在一个实施方式中，siRNA分子由如本文所述的双链核酸结构构成，其中所述两种siRNA序列选自表I、II、III或IV中列出的核酸。因此，这些siRNA分子可通过接头共价或非共价地结合或连接以形成串联siRNA化合物。包含两种siRNA序列的这些串联siRNA化合物通常具有38-150个核苷酸的长度，更优选地38或40-60个核苷酸的长度，且如果串联分子中包括多于两种siRNA序列的话相应地更长。还设想了由编码经过内部细胞处理产生的siRNA的两种或更多种更长的序列构成的更长的串联化合物，例如长dsRNA，同样还设想了编码两种或更多种shRNA的串联分子。这些串联分子还可被认为是本公开内容的一部分。设想了包含本文公开的两种(串联)或更多种(RNAi星”(RNAistar”))dsRNA序列的化合物。转让给本发明的受让人的PCT专利公布第WO2007/091269号中提供了这些“串联”或“星状”分子的实例且其被通过引用全部并入本文。
靶向RhoA的dsRNA分子可能是药物组合物中的主要活性组分，或可能是包含两种或更多种dsRNA(或者编码或内源地产生两种或更多种dsRNA的分子，不论其是分子的混合物或编码两种或更多种dsRNA的一种或更多种串联分子)的药物组合物中的一种活性组分，所述药物组合物还包括靶向一个或多个另外的基因的一种或多种另外的dsRNA分子。对所述另外的基因的同时抑制将可能对本文公开的疾病的治疗具有加和作用或协同作用。
另外，本文公开的dsRNA或包含该dsRNA的任何核酸分子或编码该dsRNA的任何核酸分子可被连接或结合(共价地或非共价地)到针对靶细胞上表达的细胞表面可内化的分子的抗体(包括适体分子)以实现对于本文公开的疾病的治疗的增强的靶向。例如，抗-Fas抗体(优选中和抗体)可与任何dsRNA结合(共价地或非共价地)。在另一个实例中，例如，能够像配体/抗体一样发挥作用的适体可与任何dsRNA结合(共价地或非共价地)。
本发明的核酸化合物可被直接递送或用病毒或非病毒载体递送。当直接递送时，通常使这些序列变得抗核酸酶。可选择地，如本文以下讨论的，这些序列可被并入到表达盒或构建体中使得该序列在细胞中表达。通常，构建体包含合适的调控序列或启动子以允许序列在靶细胞中表达。任选地用于递送本发明的化合物的载体是市售的，且可通过本领域技术人员已知的方法被修饰为用于递送本发明的化合物的目的。
化学修饰
核苷酸/寡核苷酸的所有类似物(anologue)或对核苷酸/寡核苷酸的所有修饰、核苷酸/寡核苷酸的所有类似物(anolog)或对核苷酸/寡核苷酸的所有修饰可用于本发明，条件是所述类似物或修饰不显著影响所述核苷酸/寡核苷酸的功能。所述核苷酸可选自天然存在的碱基或合成的修饰的碱基。天然存在的碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。核苷酸的修饰的碱基包括肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基、2-丙基和其他烃基腺嘌呤、5-卤素尿嘧啶、5-卤素胞嘧啶、6-氮杂胞嘧啶和6-氮杂胸腺嘧啶、假尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-卤素腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-硫醇腺嘌呤、8-硫代烃基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤和其他8-取代的腺嘌呤、8-卤素鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-硫醇鸟嘌呤、8-硫代烃基鸟嘌呤、8-羟基尿嘌呤和其他取代的鸟嘌呤、其他氮杂和去氮腺嘌呤、其他氮杂和去氮鸟嘌呤、5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶。在某些实施方式中，寡聚物中的一个或多个核苷酸被肌苷置换。
另外，可制备多核苷酸的类似物，其中一个或多个核苷酸的结构被根本地改变且更适合作为治疗试剂或实验试剂。核苷酸类似物的实例是肽核酸(PNA)，其中DNA(或RNA)中的脱氧核糖(或核糖)磷酸骨架被与肽中发现的骨架相似的聚酰胺骨架替代。已表明PNA类似物抵抗酶促降解且具有延长的体内和体外稳定性。可对寡核苷酸进行的其他修饰包括聚合物骨架、环状骨架、非环状骨架、硫代磷酸-D-核糖骨架、三酯骨架、硫代酯骨架、2’-5’桥接的骨架、人工核酸、吗啉基核酸、锁核酸(LNA)、二醇核酸(glycol nucleic acid，GNA)、苏阿糖核酸(TNA)、阿拉伯糖苷和镜像核苷(例如，β-L-脱氧核苷而不是β-D-脱氧核苷)。Elmen等人(NAR2005，33(1)：439-447)中公开了包含LNA核苷酸的siRNA化合物的实例。
本发明的核酸化合物可使用一种或多种倒置的核苷酸，例如倒置的胸苷或倒置的腺嘌呤来合成(参见，例如Takei，等人，2002，JBC277(26)：23800-06)。
如本文所用的术语“非常规部分”是指脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、脱氧核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸、非碱基配对核苷酸类似物和通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键连接到相邻核苷酸的核苷酸；C3、C4、C5和C6部分；包括LNA和亚乙基桥接的核酸的桥接的核酸。
如本文所用的术语“封端部分”包括脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、包括2’O烃基修饰的修饰的脱碱基核糖和脱碱基脱氧核糖部分；倒置的脱碱基核糖和脱碱基脱氧核糖部分及对其的修饰；C6-亚氨基-Pi；包括L-DNA和L-RNA的镜像核苷酸；5’OMe核苷酸；以及包括4’，5’-亚甲基核苷酸的核苷酸类似物；1-(β-D-呋喃赤藓糖基)核苷酸(1-(β-D-erythrofuranosyl)nucleotide)；4’-硫代核苷酸、碳环核苷酸；磷酸5’-氨基-烃基酯；磷酸1，3-二氨基-2-丙酯、磷酸3-氨基丙酯；磷酸6-氨基己酯；磷酸12-氨基十二酯；磷酸羟丙酯；1，5-失水己糖醇核苷酸；α-核苷酸；苏式-呋喃戊糖基核苷酸；非环状3’，4’-断裂核苷酸；3，4-二羟丁基核苷酸；3，5-二羟戊基核苷酸、5’-5’-倒置的脱碱基部分；磷酸1，4-丁二醇酯；5’-氨基；和桥接或非桥接的膦酸甲酯和5’-巯基部分。
脱碱基脱氧核糖部分包括例如，脱碱基脱氧核糖-3’-磷酸；1，2-二脱氧-D-呋喃核糖-3-磷酸；1，4-失水-2-脱氧-D-核糖醇-3-磷酸。倒置的脱碱基脱氧核糖部分包括倒置的脱碱基脱氧核糖(deoxyriboabasic)；3’，5’倒置的脱碱基脱氧核糖5’-磷酸(3’，5’inverted deoxyriboabasic5’-phosphate)。
“镜像”核苷酸是具有与天然存在或通常采用的核苷酸相反的手性的核苷酸，即为天然存在的(D-核苷酸)的镜像(L-核苷酸)。核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸且还可包含至少一个糖、碱基和或骨架修饰。美国专利第6,602,858号公开了包含至少一种L-核苷酸置换的核酸催化剂。镜像核苷酸包括例如L-DNA(L-脱氧核糖腺苷-3’-磷酸(镜像dA)；L-脱氧核糖胞苷-3’-磷酸(镜像dC)；L-脱氧核糖鸟苷-3’-磷酸(镜像dG)；L-脱氧核糖胸苷-3’-磷酸(镜像dT))以及L-RNA(L-核糖腺苷-3’-磷酸(镜像rA)；L-核糖胞苷-3’-磷酸(镜像rC)；L-核糖鸟苷-3’-磷酸(镜像rG)；L-核糖尿嘧啶-3’-磷酸(镜像dU)。
在结构A1或结构A2的多个实施方式中，Z和Z’是不存在的。在其他实施方式中，Z或Z’是存在的。在某些实施方式中，Z和/或Z’中的每一个独立地包括C2、C3、C4、C5或C6烃基部分，任选地C3[丙烷、-(CH2)3-]部分或其衍生物，包括丙醇(C3-OH/C3OH)、丙二醇及丙二醇的磷酸二酯衍生物(“C3Pi”)。在优选的实施方式中，Z和/或Z’中的每一个包括两个烃部分且在某些实例中，为C3Pi-C3OH或C3Pi-C3Pi。每个C3与相邻的C3通过共价键，优选基于磷酸基的键共价偶联。在某些实施方式中，所述基于磷酸基的键为硫代磷酸酯键、膦酰基乙酸酯键或磷酸二酯键。
在结构A1的特定实施方式中，x＝y＝19且Z包含至少一个C3烃基突出端。在结构A2的特定实施方式中，x＝y＝18且Z包含至少一个C3烃基突出端。在某些实施方式中，C3-C3突出端与(N)x或(N’)y的3’末端通过共价键，优选磷酸二酯键共价连接。在某些实施方式中，第一个C3和第二个C3之间的键是磷酸二酯键。在某些实施方式中，3’非核苷酸突出端是C3Pi-C3Pi。在某些实施方式中，3’非核苷酸突出端是C3Pi-C3Ps。在某些实施方式中，3’非核苷酸突出端是C3Pi-C3OH(OH是羟基)。在某些实施方式中，3’非核苷酸突出端是C3Pi-C3OH。
在多个实施方式中，所述烃基部分包含烃基衍生物，包括包含末端羟基、末端氨基或末端磷酸基团的C3烃基、C4烃基、C5烃基或C6烃基部分。在某些实施方式中，所述烃基部分是C3烃基或C3烃基衍生部分。在某些实施方式中，所述C3烃基部分包含丙醇、磷酸丙酯、硫代磷酸丙酯或其组合。所述C3烃基部分与(N’)y的3’末端和/或(N)x的3’末端通过磷酸二酯键共价连接。在某些实施方式中，所述烃基部分包含丙醇、磷酸丙酯或硫代磷酸丙酯。在某些实施方式中，Z和Z’中的每一个独立地选自丙醇、磷酸丙酯、硫代磷酸丙酯、其组合或其中多个，特别是2个或3个共价连接的丙醇、磷酸丙酯、硫代磷酸丙酯或其组合。在某些实施方式中，Z和Z’中的每一个独立地选自磷酸丙酯、硫代磷酸丙酯、丙基磷酸-丙醇；硫代磷酸丙基磷酸-丙酯(propyl phospho-propyl phosphorothioate)；磷酸丙基磷酸-丙酯(propylphospho-propyl phosphate)；(磷酸丙酯)3、(磷酸丙酯)2-丙醇、(磷酸丙酯)2-硫代磷酸丙酯((propyl phosphate)2-propyl phosphorothioate)。任何丙烷或丙醇偶联的部分可被包括在Z或Z’中。
示例性的3’末端非核苷酸部分的结构如下：
适应症
本文公开的分子和组合物在治疗CNS、PNS、前庭感觉系统、视觉系统和/或循环(血管、动脉)系统的疾病和疾患以及与细胞运动性、细胞骨架调控和微管组织有关的疾病和疾患以及本文描述的其他疾病和病症中是有用的。
CNS疾患和损伤
在多个方面和实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗与RhoA基因有关的疾病、疾患和损伤，例如中枢神经系统(CNS)的与细胞或组织中的RhoA水平相关或将对其响应的疾病、疾患和损伤，特别是对于治疗患CNS的疾病或损伤或受到CNS的疾病或损伤的影响或易患CNS的疾病或损伤的受治疗者是有用的。
与神经再生和神经保护有关的病症
本文公开的dsRhoA化合物可被用于保护脊髓神经元免受继发损伤并促进轴突(神经)再生，从而促成功能的修复。
存在其中轴突再生将是有益的许多适应症。轴突损失促成疾患例如多发性硬化、中风、创伤性脑损伤、周围神经病变和慢性神经变性疾病中的神经学症状。
中枢神经系统(CNS)的损伤
在多个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于治疗中枢神经系统(CNS)的损伤，特别是对于治疗患CNS损伤或受到CNS损伤的影响或易患CNS的损伤的受治疗者是有用的，所述CNS损伤包括但不限于，创伤性和非创伤性脊髓损伤，和由头骨的断裂或穿透(即，交通事故、跌倒、枪伤)、疾病推进(即，神经毒素、感染、肿瘤、代谢异常等)导致的脑损伤(例如创伤性脑损伤(TBI))或例如头部的快速加速或减速的实例(即，摇晃婴儿综合征，冲击(blast))中的闭锁性头部损伤、钝挫伤、脑震荡和脑震荡综合征。
另外，缺血性事件可由对中枢神经系统的机械损伤导致，例如由对头部或脊椎的打击引起。创伤可涉及组织损害例如擦伤、切伤、挫伤、刺伤、压迫等，例如可由异物与属于或附属于头部、颈部或脊柱的任何位点的创伤性接触产生。其他形式的创伤性损伤可因通过不适当的流体积累(例如，正常脑脊液或玻璃状体液产生、回转或体积调节的阻碍或功能障碍或硬膜下或颅内血肿或水肿)而压缩或压迫CNS组织产生。相似地，创伤性压缩或压迫可由大量的异常组织例如转移性肿瘤或原发肿瘤的存在产生。
脊髓损伤(SCI)
根据来自2009年4月的由美国脊髓损伤统计中心(National Spinal Cord InjuryStatistical Center)编写的Spinal Cord Injury Facts and Figuers at a glance，仅在美国每年存在约10,000-12,000例脊髓损伤(SCI)，超过约一百万的四分之一的美国人目前在脊髓损伤下生活。在患SCI的人群中，一半以上(57.5％)报道在其损伤的时候被雇佣。管理脊髓损伤患者的护理的成本接近$40亿/年，但是不包括任何间接成本例如薪水、额外福利和生产力损失，生产力损失以2008年12月美元计平均每年$64,443。
目前，不存在有效的用于SCI的治疗，且自从美国急性脊髓损伤研究(NASCIS)I、II和III以来，持续24小时给予、损伤后8小时内施用的高剂量的类固醇甲基强的松龙(MP)是目前的护理标准。然而，其作用小且有争议且在许多国家，例如加拿大，MP作为护理标准已被中断且现在仅被分类为治疗选择(Hugenholtz，2003)。近来，已有研究表明SCI后的早期手术介入(脊髓去压迫手术)表现出有希望的结果。根据急性脊髓损伤研究的手术治疗(STASCIS)，当通过美国脊柱损伤协会(ASIA)的量表测量时在其最初损伤一天内进行去压迫手术的人群的24％表现出显著的改善，但是关于这些结果的确定性结论仍言之过早。如今，存在列为涉及SCI的接近250种临床试验，但是，这些中的绝大多数涉及患者复原。因此，存在对新疗法的需要，这需要在模型系统中形成新的疗法及将其转移到临床。
在一个实施方式中，对CNS的损伤是脊髓损伤(SCI)或脊髓病。SCI或脊髓病是对脊髓的困扰，这种困扰导致感觉和/或运动性的丧失。两种常见类型的脊髓损伤归因于创伤和疾病。创伤性损伤可归因于尤其是汽车事故、跌倒、枪击、跳水事故，而可影响脊髓的疾病包括脊髓灰质炎、脊柱裂、肿瘤、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、多发性硬化(MS)、脊髓空洞症、横贯性脊髓炎和弗里德赖希共济失调。
在多个实施方式中，本发明的核酸化合物和药物组合物被用于治疗或预防由脊髓损伤导致的损害，特别是由机动车事故、跌倒、运动损伤、工业事故、枪伤导致的脊髓创伤，由脊椎衰弱(例如由风湿性关节炎或骨质疏松症)导致的脊髓创伤，或如果保护脊髓的椎管已由于正常的衰老过程变得太窄(椎管狭窄)的话，当脊髓被拉伸、侧向挤压或压缩时发生的直接损伤，在脊髓内部或脊髓外部(但在脊索内)的出血、流体积累和肿胀后对脊髓的损害。
因此，本发明还提供了治疗需要治疗的受治疗者体内的SCI的方法，该方法包括对受治疗者以治疗SCI有效的量施用包含治疗有效量的下调RhoA在受治疗者的CNS中的表达的至少一种寡核苷酸化合物的药物组合物。
脑损伤
在一个实施方式中，对CNS的损伤是脑损伤。脑损伤例如创伤和中风居于西方世界中死亡率和残疾率的首要原因之列。创伤性脑损伤(TBI)是现代社会中住院和残疾的最严重的原因之一。临床经验表明TBI可分为损伤后立即发生的原发损伤和损伤后几天之内发生的继发损伤。目前对TBI的治疗是手术或者主要是症状学手段。
因此，本发明提供了治疗需要治疗的受治疗者体内的脑损伤的方法，该方法包括对受治疗者以治疗脑损伤有效的量施用包含治疗有效量的下调RhoA在受治疗者的CNS中的表达的至少一种寡核苷酸化合物的药物组合物。
周围神经损伤(PNI)
PNI可导致运动功能、感觉功能或二者的损失。周围神经损伤可由于创伤(例如，钝伤或贯通伤口、创伤)或急性压迫而发生。拉伸相关的损伤是最常见的类型。裂伤例如由刀片造成的裂伤也是常见的。在北美，认为创伤患者的约2-3％具有主要神经的损伤。基于回顾性研究，四肢创伤的发生率是寻求医疗救助的人群的约1.4％，83％小于55周岁且50％是男性。在同一人群中，上肢创伤或下肢创伤的90天内神经损伤的总发生率为1.64％。周围神经损伤可导致脱髓鞘或轴突变性。临床上，脱髓鞘和轴突变性都导致受伤神经的感觉和/或运动功能的破坏。功能的恢复随髓鞘再生且随轴突再生和感觉受体、肌肉终板或二者的神经再支配而发生。恢复的方式是混合的且不完全的。第4至第6度的损伤需要手术。神经损伤手术的适应症是：
闭锁性神经损伤：临床上或对于电反应诊断研究，在损伤后3个月时，没有恢复的证据。
开放性神经损伤(即，裂伤)：推荐尽可能快的手术探测。具有已报道的感觉丧失或运动衰退的所有裂伤应被手术探测。
挤压性神经损伤(crush nerve injury)：电学上或临床上无神经再支配的迹象3个月后，预示着通过修复或移植的手术重建。
围手术期的神经损伤。甚至在手术期间或由于手术的结果可发生神经损伤。围手术期的神经损伤是相对稀少的但对患者是毁灭性的。认为永久性损伤发生在5000例中的1例中。神经损伤还可因大的骨科手术例如膝部置换而发生(罕见)。最常见的膝部置换术中损伤的神经是针对使足部向上朝向面部的肌肉的神经(腓神经)。发生该事件的几率是大约数百个中有一个。目前，在美国，每年进行多于550,000例关节置换术-最经常地涉及髋部和膝部，对踝、肘、肩和手指进行的全关节置换不太常见。每年进行多于193,000例人工髋部置换手术。如在美国骨科医师协会(AAOS)的第73次年会上陈述的，在接下来的25年内预计需求将急剧增加，到2030年美国待进行约348万例髋部和膝部置换术。
前庭系统的疾病和病症
在多个实施方式中，本发明的核酸化合物和药物组合物对于治疗影响前庭系统的疾患和疾病，例如梅尼尔病是有用的，在这些疾患和疾病中RhoA的表达是有害的。大多数哺乳动物，包括人的前庭感觉系统有助于平衡和对空间定向和稳定性的感知。其与耳蜗一起构成内耳的迷路。前庭系统包含两个部件：指示旋转运动的半规管系统；和指示线性加速的耳石。
梅尼尔病
也称为特发性内淋巴积水(ELH)的梅尼尔病是内耳疾患，导致眩晕和耳鸣，且最终导致促成听觉丧失的神经元损伤。梅尼尔病的确切原因是未知的但是认为根本机制是由内淋巴的积累引起的膜迷路的扭曲。内淋巴主要由耳蜗内的血管纹产生且还由前庭迷路内的半月面和闰细胞产生(Sajjadi H，Paparella MM.Meniere’s disease.Lancet.372(9636)：406-14)。如果内淋巴从内淋巴液空间穿过前庭小管到内淋巴囊的流动被阻碍，则内淋巴积水将发生。梅尼尔病可影响受治疗者的一个耳朵或两个。与梅尼尔病有关的主要发病是眩晕和进行性听觉丧失的衰弱本性。目前的治疗在阻止神经元变性和有关的听觉丧失的推进方面尚未成功，将在梅尼尔病患者中保护包括前庭蜗神经的内耳的神经元免受损伤和或引发前庭蜗神经的再生并从而减弱或防止听觉丧失的治疗性治疗将是高度期望的。
本文提供的核酸、组合物、方法和药盒在治疗处于梅尼尔病的风险之下或患梅尼尔病的受治疗者方面是有用的。
神经疾患
在多个实施方式中，本发明的核酸化合物和药物组合物对于治疗神经疾患是有用的。
在多个实施方式中，神经疾患选自但不限于中风、中风样状况(例如，脑、肾、心脏衰竭)、神经元细胞死亡、癫痫、帕金森症、谷蛋白共济失调、脑缺血和脑血管意外。
癫痫
在一个实施方式中，神经疾患是癫痫。癫痫是以脑的正常运行方面的问题为标志的一组疾患。这些问题可产生痉挛、不正常的身体运动、丧失意识或意识变化，以及精神问题或关于感官的问题。
因此，本发明还提供了治疗需要治疗的受治疗者体内的癫痫的方法，该方法包括对受治疗者以治疗癫痫有效的量施用包含治疗有效量的下调RhoA在受治疗者的CNS中的表达的至少一种寡核苷酸化合物的药物组合物。
中风
在另一个实施方式中，神性疾患是中风。中风是由于中断的血液供应而发生的急性神经损伤，导致对脑的损害。大多数脑血管疾病表现为局部神经缺陷的突然发病。该缺陷可能保持固定，或其可改善或进行性地恶化，通常导致缺血病灶的中心处的不可逆转的神经元损伤，然而半影(penumbra)内的神经元功能障碍可能是可治疗的和/或可逆转的。长时间的缺血导致明显的组织坏死。在随后的2至4天内伴随脑水肿并推进。如果梗塞的区域大的话，水肿可产生极大的质量效应，造成所有其伴随的后果。
对神经元组织的损伤可导致严重的残疾和死亡。损伤的程度主要受损伤组织的位置和程度影响。响应急性损害而激活的内源性级联反应在功能结果中起作用。最小化、限制和/或逆转该损伤的尝试具有减轻临床后果的极大潜力。
因此，本发明还提供了治疗需要治疗的受治疗者体内的心血管病症的方法，该方法包括对受治疗者以治疗心血管病症有效的量施用包含治疗有效量的下调RhoA在受治疗者的CNS中的表达的至少一种寡核苷酸化合物的药物组合物。
帕金森症
在一个实施方式中，神经疾患是帕金森症-一组以受损的运动控制为特征的疾患，其特征是运动过缓、肌肉强直；震颤；和姿势不稳定(postural instability)。帕金森病通常分为原发性帕金森症、继发性帕金森症和遗传形式。这些病症与基底神经节中的多巴胺能或密切相关的运动整合神经元通路的功能障碍有关。
因此，本发明还提供了治疗需要治疗的受治疗者体内的帕金森症的方法，该方法包括对受治疗者以治疗帕金森症有效的量施用包含治疗有效量的下调RhoA在受治疗者的CNS中的表达的至少一种寡核苷酸化合物的药物组合物。
神经变性疾病
神经变性疾病是其中丢失了CNS(脑和/或脊髓和/或眼睛)的细胞的病症。这些CNS细胞不易于一同再生，所以过度的损害可能是毁灭性的。神经变性疾病可由随时间推移导致功能障碍和残疾的神经元或其髓鞘的退化引起。根据表型效应，其被粗分为两组：影响运动的病症，例如共济失调；和影响记忆且与痴呆有关的病症，但是这两组不是相互排除的。痴呆的标志是丧失智力功能例如记忆、学习、推理、问题解决和抽象思维而植物功能保持完好。神经变性疾病的非限制性实例是阿尔茨海默病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS，也称为葛雷克氏症)、亨廷顿病、路易体痴呆和帕金森病。
另一种类型的神经变性疾病包括由错误折叠的蛋白质或朊病毒导致的疾病。人类中朊病毒疾病的非限制性实例是克雅病(CJD)及变异的CJD(疯牛病)。
眼部神经变性疾病的非限制性实例包括罹患黄斑变性、糖尿病性视网膜病、色素性视网膜炎、青光眼及类似的疾病的受治疗者的视网膜内的光感受器损失。
在多个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于治疗神经变性疾病和病症是有用的。
本发明的药物组合物在治疗患神经变性疾患或受神经变性疾患影响或易患神经变性疾患的受治疗者是特别有用的，所述神经变性疾患包括但不限于帕金森病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、朊病毒疾病性痴呆、阿尔茨海默病、路易体痴呆、皮克病、共济失调-毛细血管扩张(AT)、额颞痴呆(FTD)、额颞叶变性(FTLD)、亨廷顿病、HIV相关的痴呆、中风后痴呆或任何其他疾病引起的痴呆；和眼部神经变性疾病。
阿尔茨海默病(AD)
在一个实施方式中，神经变性疾患是阿尔茨海默病(AD)。AD是进行性的神经变性疾病，特征是脑中各个区域内的神经细胞的功能丧失和死亡，导致例如记忆和语言的认知功能的丧失。
因此，本发明还提供了治疗需要治疗的受治疗者体内的AD的方法，该方法包括对受治疗者以治疗AD有效的量施用包含治疗有效量的下调RhoA在受治疗者的CNS中的表达的至少一种寡核苷酸化合物的药物组合物。
肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)
在一个实施方式中，神经变性疾患是肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)。ALS是由运动神经元，即中枢神经系统中控制随意肌(voluntary muscle)运动的神经细胞的变性引起的进行性的，通常是致命的神经变性疾病。因为上部运动神经元和下部运动神经元都变性，停止向肌肉发送消息，所以该疾患导致遍布全身的肌肉无力和萎缩。由于去神经支配而不能发挥功能，肌肉渐渐衰弱，形成肌束震颤(抽搐)，并最终由于所述去神经支配而萎缩。患ALS的受治疗者最终可能丧失引发和控制所有随意运动的能力；膀胱和肠括约肌和负责眼睛运动的肌肉通常(但不总是)不受影响。
因此，本发明还提供治疗需要治疗的受治疗者体内的ALS的方法，该方法包括对受治疗者以治疗ALS有效的量施用包含治疗有效量的下调RhoA在受治疗者的CNS中的表达的至少一种寡核苷酸化合物的药物组合物。在某些实施方式中，RhoA的下调赋予CNS的神经保护特性。
帕金森病(PD)
在一个实施方式中，神经变性疾患是帕金森病(PD)。帕金森病是标志为肌肉震颤、肌肉强直、减少的运动性、弯腰姿势、缓慢的随意运动和面具样面部表情的神经系统的进行性疾患。
因此，本发明还提供了治疗需要治疗的受治疗者体内的PD的方法，该方法包括对受治疗者以治疗PD有效的量施用包含治疗有效量的下调RhoA在受治疗者的CNS中的表达的至少一种寡核苷酸化合物的药物组合物。
共济失调-毛细血管扩张(AT)
在一个实施方式中，神经变性疾患是共济失调-毛细血管扩张(AT)。AT是罕见的神经变性遗传病，其影响身体的许多部分并导致严重的残疾。共济失调是指差的协调且毛细管扩张是指小的扩张的血管，二者都是该疾病的标志。AT影响着小脑(身体的运动协调控制中心)并还在约70％的病例中削弱免疫系统，导致呼吸疾患和增加的癌症风险。
因此，本发明还提供了治疗需要治疗的受治疗者体内的AT的方法，该方法包括对受治疗者以治疗AT有效的量施用包含治疗有效量的下调RhoA在受治疗者的CNS中的表达的至少一种寡核苷酸化合物的药物组合物。
中风后痴呆(PSD)
在一个实施方式中，所述疾患是中风后痴呆(PSD)。约25％的人在中风后患痴呆，其他许多人在随后的5至10年内形成痴呆。另外，许多个体经历更微小的对其高级脑功能的损害(例如计划技能和处理信息的速度)且处于非常高的随后形成痴呆的风险下。该过程中的极少的脑深处部分的中风(叫作微血管疾病)看起来是导致中风后痴呆特有的所识别的脑萎缩模式的过程不必可少的。
因此，本发明还提供了治疗需要治疗的受治疗者体内的PSD的方法，该方法包括对受治疗者以治疗PSD有效的量施用包含治疗有效量的下调RhoA在受治疗者的CNS中的表达的至少一种寡核苷酸化合物的药物组合物。
眼部神经变性疾病
在一个实施方式中，神经变性疾病是眼睛的神经变性疾病，包括但不限于罹患黄斑变性、糖尿病性视网膜病、色素性视网膜炎、青光眼及其他眼部疾病的受治疗者的视网膜内的视网膜神经节细胞(RGC)和/或光感受器细胞的丢失。
因此，本发明还提供了治疗需要治疗的受治疗者体内的眼部神经变性疾病的方法，该方法包括对受治疗者以治疗眼部神经变性疾病有效的量施用包含治疗有效量的下调RhoA在受治疗者的CNS中的表达的至少一种寡核苷酸化合物的药物组合物。
神经保护
在另外的实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物旨在在CNS的疾病、疾患或损伤中提供神经保护，和/或提供脑保护，和/或减轻急性或慢性神经元损伤。
脑血管疾患
在一个实施方式中，神经疾患是脑血管疾患，脑血管意外是由缺血或出血性颅内血管事件引起的神经功能的突然的、非抽搐性损失。一般来讲，脑血管意外通过在脑中的解剖学位置、血管分布、病因学、所影响的个体的年龄以及出血性对非出血性性质来分类(对于额外的信息，参见Adams等人，Principles of Neurology，第6版，第777-810页)。
脑血管疾病主要发生在生命的中年和晚年。在美国其每年导致约200,000例死亡以及大量的神经性残疾。中风的发生率随年龄增加并影响许多老年人，老年人是迅速增长的人口部分。这些疾病导致缺血-梗塞或颅内出血。
眼部缺血病症
缺血性视神经病变(ION)包括产生视神经缺血的各种疾患。通过定义，如果视盘水肿急性地存在，表明视神经最接近眼球的部分的梗塞，则ION被称为是前位的。ION也可被称为是后位的，位于眼球后方几厘米处。缺血性视神经病变通常仅发生在年龄60周岁以上的人群中。大多数病例是非动脉炎性的且归因于动脉粥样硬化、糖尿病或高血压对视神经灌注的作用。暂时性动脉炎导致约5％的病例(动脉炎性ION)。
症状和征兆是突然的、部分或完全的视力丧失，伴随着视神经头的肿胀且经常出血。视野缺损可表现为损失一半的具有水平分界的视野，或表现为中心暗点或哑铃型暗点(围绕自然盲点)。视力减弱后不久伴随视盘苍白。
前部缺血性视神经病变
非动脉炎性前部缺血性视神经病变(NAION)是两种主要类型的前部缺血性视神经病变(AION)之一，即对视神经的血液供应不足损害了视神经，导致视力丧失的病症。NAION由具有密集的视盘的患者的某些心血管风险因素的组合引起。另一方面，另一种主要类型的AION，动脉炎性前部缺血性视神经病变(AAION)是不太经常发生的中型尺寸的血管的炎性病症，其发生于较患NAION的人群通常稍微年老的人群中。
虽然未充分理解造成该病症的原因背后的机制，但是神经-眼科医师一般同意应归咎于两个问题的交叉。在大多数人中，视神经所穿透的眼壁中孔的直径比视神经的直径大百分之20-30。在往往形成NAION的人群中，这两个问题中的第一个是他们不具备该百分之20-30的误差幅度。第二个问题涉及导致差的对视盘的血液供应或缺血的心血管风险因素，所述视盘是视神经的前部部分。因此视盘肿胀，且因为没有用于肿胀的空间，所导致的对视神经的压迫导致更多的缺血。
这些心血管风险因素中最常见的因素包括糖尿病、高血压和高胆固醇水平。存在遗传因素，这些因素在形成这些风险因素的可能性方面起作用。存在其他遗传因素也可能在形成NAION的可能性方面起作用的证据。
在多个方面和实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗NAION是有用的。
青光眼
青光眼是世界上失明的首要原因之一。其在全世界影响着约6680万人且每年至少12,000名美国人因该疾病失明(Kahn和Milton，Am JEpidemiol.1980，111(6)：769-76)。在美国，青光眼是第二个最常见失明的原因，占所有失明病例的＞11％。
青光眼的特征是由升高的眼内压(IOP)、免疫系统的感染和缺乏营养因子的递送引起的视神经头中轴突的变性。也称为原发性开角青光眼(POAG)的一种最常见形式的青光眼由小梁网(TM)内的眼房水外流的阻力增加，造成IOP升高和最终的视神经损伤引起的。
目前存在靶向青光眼并被通过滴眼液或软膏施用的许多药物，但是其全部都聚焦于单独地降低IOP而未解决防止对神经视网膜的损伤。如在α-2-肾上腺素能受体激动剂的实例中，某些可获得的药物具有相当严重的副作用例如增加的心率、升高的血压、头痛、模糊的视觉、疲劳、口干和眼内或眼周发红。这些副作用中的许多不仅源于对药物的全身暴露而且归因于α-肾上腺素能受体小分子激动剂的低特异性。本申请的受让人建议将抑制人RhoAmRNA和蛋白质作为用于青光眼的新型、多层面的治疗。
原则上，开角青光眼、升高的眼内压(IOP)由于受损的眼房水排放而形成，且这与视神经病变、随后的进行性视网膜神经节细胞(RGC)轴突变性和RGC凋亡有关。目前对青光眼的治疗集中在降低IOP。但是，存在不伴随有IOP增加的青光眼类型；且视力损失实际上是由对视神经和RGC的损害引起的。目前，在临床试验中存在非常少的解决青光眼患者中的神经保护和/或神经变性的药物。FDA-批准用于阿尔茨海默病的神经保护药物Namenda(美金刚)近来已结束了具有令人失望的结果的用于青光眼的III期临床试验，因为其呈现为当与安慰剂对比时，不具有对青光眼患者的益处。RhoA是在CNS神经元包括RGC中控制细胞功能例如运动性、生长、分化和凋亡的小GTP酶蛋白质。RhoA还通过在神经免疫细胞(小胶质细胞和巨噬细胞)和星形胶质细胞中的信号传导参与继发炎症反应和瘢痕形成的CNS损伤反应。视神经挤压(ONC)损伤激活了神经轴索断裂的RGC中的RhoA且这发出凋亡信号并抑制轴突再生。通过对比，用包括siRhoA和C3转移酶胞外酶的RhoA拮抗剂治疗损伤的RGC明显地增强了RGC存活和神经营养蛋白驱使的轴突再生。表明RhoA的活化还通过调节细胞收缩和细胞外基质产生参与调控眼睛的小梁网对眼房水外流的阻力，导致增加的IOP(Zhang等人，Am JPhysiol Cell Physiol，259：1057.2008)。不期望被理论束缚，阻断青光眼性眼睛内的RhoA信号传导可能通过多种效应具有治疗益处：(A)纠正眼房水排放的动态平衡；(B)阻断RGC凋亡信号传导；以及(C)增强RGC轴突再生。
在某些实施方式中，本文提供的dsRNA分子、组合物、方法和药盒在治疗处于青光眼的风险之下或患青光眼的受治疗者方面是有用的。不被理论束缚，相信本文提供的治疗性dsRhoA分子通过多种机制治疗青光眼，产生对视网膜神经节细胞(RGC)的神经保护，增强的RGC轴突再生和降低的眼内压(IOP)。
神经病变
自主神经病变
自主神经病变是当存在对管理每天的身体功能例如血压、心率、肠和膀胱的排空和消化的神经的损害时发生的一组症状。
自主神经系统由服务于心脏、GI消化道和泌尿系统的神经组成。自主神经病变可影响这些器官系统中的任何一种。糖尿病中最为普遍公认的自主性功能障碍是当患者站立时的直立性低血压或不舒适的昏厥感觉。在糖尿病自主神经病变的情形中，是由于心脏和动脉不能适当地调节心率和血管紧张度以保持血液持续且足够地流向脑。这种症状通常伴随窦呼吸变化的丧失，也就是，伴随正常呼吸看到的心率的一般变化的丧失。当存在这两种发现时，心脏自主神经病变存在。
GI消化道表现包括延迟的胃排空、胃不全麻痹、呕吐、饱胀和腹泻。因为许多糖尿病患者对其糖尿病采用口服用药，所以这些药物的吸收极大地受延迟的胃排空的影响。当已存在正常或低的血糖时在饭前服用口服的糖尿病药物且数小时或有时数几天后仍未被吸收时，这可导致低血糖。小肠的运动迟缓可导致细菌过度生长，因高血糖的存在变得更糟。这导致饱胀、胀气和腹泻。
泌尿系统症状包括尿频、尿急、尿失禁和尿潴留。再次地，由于甜尿的潴留，尿道感染是经常的。尿潴留可导致膀胱憩室、结石、逆流性肾病。
在某些实施方式中，本文提供的核酸、组合物、方法和药盒在治疗处于自主神经病变的风险之下或患自主神经病变的受治疗者方面是有用的。
颅神经病变
当颅神经受影响时，眼球运动(第3种)神经病变是最常见的。眼球运动神经控制使眼睛运动的除了外直肌和上斜肌以外的所有肌肉。其还用来使瞳孔收缩并使眼睑打开。糖尿病性第三神经麻痹的发作通常是突然的，从额部或眶周疼痛开始且然后是复视。受第三神经支配的所有眼球运动肌肉可被影响，控制瞳孔大小的肌肉除外。第六神经，支配眼睛的外直肌的外展神经(使眼睛横向运动)也经常受影响但是第四神经，滑车神经(支配使眼睛向下运动的上斜肌)的受累不常见。胸椎或腰椎神经的单神经病变可能发生并导致类似心肌梗塞、胆囊炎或阑尾炎的疼痛综合征。糖尿病患者具有更高的受压性神经病变例如腕管综合征的发生率。
在某些实施方式中，本文提供的核酸、组合物、方法和药盒在治疗处于颅神经病变的风险之下或患颅神经病变的受治疗者方面是有用的。
癌症相关的神经病变
周围神经病变在最常见的癌症神经并发症之列。区别诊断癌症患者的周围神经系统功能障碍是广泛的且包括：肿瘤对神经的直接压迫或浸润；癌症治疗的神经毒性；营养缺乏；代谢失调和副肿瘤疾患。在存在有周围神经病变但无已知的癌症诊断的患者中，考虑神经病变是之前未诊断出的赘生物的远程效应的可能性是重要的。
在某些实施方式中，本文提供的dsRNA分子、组合物、方法和药盒在治疗处于癌症相关的神经病变的风险之下或患癌症相关的神经病变的受治疗者方面是有用的。
压迫性神经病变
受压性神经病变：术语受压性神经病变是指发生在特定位置的单独的周围神经损伤，在所述特定位置神经被机械地压缩在纤维管或纤维骨性管中或被纤维带变形。在某些实例中，神经受长期直接压迫损害，而在其他实例中，扭曲力或拉伸力导致对神经的机械损害。纤维骨性管中的神经压迫的常见实例为腕管综合征和肘管处的尺神经病变。扭曲和拉伸损伤是与肘关节的总变形(“缓慢的尺神经麻痹”)有关的尺神经病变以及神经性胸廓出口综合征的神经损伤的重要机制。外力对神经的周期性压迫还可导致病灶性神经损伤例如肘处的尺神经病变和手中尺神经的深处支化病变。虽然后面这些神经病变不满足“受压性神经病变”的严格定义，但是其通常在对该话题的讨论中被考虑。所有这些单独的神经病变的病理学特征包括病灶的脱髓鞘和瓦氏轴突变性(wallerian axonal degeneration)的不同组合。
在多个方面和实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗压迫性神经病变和/或受压性神经病变是有用的。
糖尿病性神经病变
糖尿病性神经病变是糖尿病的常见并发症，其中神经由于高的血糖水平(高血糖)而受到损伤。糖尿病性神经病变可发生在I型和II型糖尿病中。
患糖尿病的人通常形成对神经组织的暂时或永久性损害。神经损伤由减少的血流和高的血糖水平引起，且如果血糖水平未被良好地控制的话则更可能形成。平均地，症状开始于糖尿病诊断后的10至20年。约50％的患糖尿病的人最终将形成神经损伤。周围神经损伤可影响头骨内的神经(颅神经)或来自脊柱及其分支的神经。这种类型的神经损伤(神经病变)往往分阶段形成。自主神经病变影响包括心肌和平滑肌的调控重要功能的神经。
糖尿病性神经病变中的微血管病
血管和神经疾病密切相关且互相交织。血管依赖正常的神经功能且神经依赖足够的血流。微血管系统中的第一种病理学变化是血管收缩。当疾病推进时，神经功能障碍与促成减少的氧张力和低氧的血管异常例如毛细血管基底膜增厚和内皮增生不全的形成紧密关联。神经元缺血是糖尿病性神经病变的得到确认的特征。血管扩张剂(例如，血管紧张肽转换酶抑制剂，α1-拮抗剂)可导致神经元血流的实质性改善，伴随着神经传导速度的相应提高。因此，微血管功能障碍发生在糖尿病的早期，与神经功能障碍的推进并行，且可能足以支持糖尿病性神经病变中观察到的结构、功能和临床变化的严重程度。周围神经病变(腿)，运动感觉神经病变是糖尿病中腿溃疡的发病机理的重要组成部分。
神经传导研究表明在糖尿病诊断的时候神经病变就已经存在于10-18％的患者中，暗示周围神经损伤发生在疾病的早期阶段并伴随较温和的血糖失调。40多年前提出了神经病变是糖尿病的早期临床征兆的观念，且大多数研究报道了IGT和神经病变之间的联系。患IGT及相关神经病变的大多数患者患有伴随明显的神经学疼痛的对称的、末梢感觉多发性神经病变。IGT神经病变(Microvascular complications of impaired glucosetolerance-Perspectives in Diabetes，J.Robinson Singleton，于Diabetes中，2003年12月1日)表型上与早期糖尿病性神经病变相似，其也引起感觉性症状，包括疼痛和自主性功能障碍。在对患早期糖尿病性神经病变的669名患者的调查中，＞60％患者中存在感觉性症状，几乎40％患者中存在阳痿而33％患者中存在其他自主性受累，但是仅12％患者中存在运动受累的迹象。这些临床发现表明了运载疼痛、温度和自主性信号的小的无髓鞘神经纤维的明显的早期受累。对来自皮肤活检的无髓鞘表皮内神经纤维的直接定量显示了患与IGT和早期糖尿病相关的神经病变的患者中的相似的纤维损失和形态改变。
自主性功能障碍，特别是勃起功能障碍和改变的心脏迷走神经反应是糖尿病中神经病变损伤的常见早期特征。关于IGT患者的工作还表明了普遍的迷走神经家族性自主神经机能失调(vagal dysautonomia)：单独的研究已在比年龄匹配的血糖正常的对照受治疗者更大分数的IGT患者中发现锻炼之后的异常心率恢复、对深呼吸的迟钝的R-R间隔变化能力以及减少的呼气与吸气比(对迷走神经家族性自主神经机能失调的全部测量)。
糖尿病中的神经损伤影响运动、感觉和自主纤维。运动神经病变导致肌肉无力、萎缩和轻瘫。感觉神经病变导致丧失对疼痛、压力和热的保护性感觉。对于无知觉的足部，无疼痛感导致许多问题，包括溃疡、察觉不到的创伤和Charcot神经性关节病。患者可能不会寻求治疗直到伤口已向前发展后。感觉和运动功能障碍的组合可导致患者对足部施加异常的应力，导致创伤，该创伤可促发感染。自主性交感神经病变导致血管舒张和出汗减少，这导致特别易发皮肤裂纹，以及微血管流动的功能改变的暖热、过度干燥的足部。自主性功能障碍(以及真皮结构的去神经支配)还导致皮肤完整性的损失，这为微生物侵入提供了理想的部位。神经病变的足部并不自发地溃疡；更确切地，它是伴随神经病变的某种形式的创伤的组合。
微血管功能障碍发生在糖尿病的早期，与神经功能障碍的推进并行，且可能足以支持糖尿病性神经病变中观察的结构、功能和临床变化的严重程度。
在多个方面和实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗糖尿病性神经病变是有用的。
药物引起的神经病变和毒性神经病变
常规的临床实践中遇到的大多数毒性神经病变归因于医源性药物中毒；就大的医药公司来讲，流行病的职业暴露是不同寻常的。毒性神经病变的大多数，且遗憾地最为困难的病例是由小规模的，通常是偶然的职业暴露或有意和凶杀性摄入引起的个体中毒。
特发性多发性神经病变构成周围神经病变病例的重要比例。另外，一些可被确定的神经病变的原因没有可利用的预防性或治疗性介入，只有对症治疗。因此，对毒性或用药引起的神经病变的检测可能是影响生活质量的重要诊断。用药引起的神经病变是不常见的(一个门诊神经学环境(one outpatient neurology setting)中病例的2-4％)，但是识别这些病变是关键的，因为介入可产生显著的改善或症状消除。
在某些实施方式中，本文提供的dsRNA分子、组合物、方法和药盒在治疗处于毒性神经病变的风险之下或患毒性神经病变的受治疗者方面是有用的。在某些实施方式中，本文提供的dsRNA分子、组合物、方法和药盒在治疗处于药物引起的神经病变的风险之下或患药物引起的神经病变的受治疗者方面是有用的。
化疗引起的神经病变
还可被认为是药物引起的神经病变或毒性神经病变以及癌症相关的神经病变的化疗引起的神经病变发生在化疗中所用的用于某些癌症治疗的化学物质损害或破坏周围神经时。
在某些实施方式中，本文提供的dsRNA分子、组合物、方法和药盒在治疗处于化疗引起的神经病变的风险之下或患化疗引起的神经病变的受治疗者方面是有用的。
胃肠和营养相关的神经病变
最通常地认为与胃肠系统有关的神经病变由营养缺乏引起。这些缺乏可能归因于营养不良(例如，酗酒)或由物理改变(例如，手术切除/分流)或由肠壁浸润(例如，克罗恩病)引起的减小的吸收表面。免疫介导的机制被疑为在现在被认定为具有多系统表现的某些胃肠病症(例如，腹腔病、炎性肠病)中的神经病变的形成中起作用。
在某些实施方式中，本文提供的dsRNA分子、组合物、方法和药盒在治疗处于胃肠神经病变的风险之下或患胃肠神经病变的受治疗者方面是有用的。在某些实施方式中，本文提供的dsRNA分子、组合物、方法和药盒在治疗处于营养相关的神经病变的风险之下或患营养相关的神经病变的受治疗者方面是有用的。
遗传性神经病变
Charcot-Marie-Tooth病
Charcot-Marie-Tooth病(CMT)是指以1800年代晚期描述它们的三位研究者命名的遗传性周围神经病变。因为CMT病影响2500个人中的约一个，它们居于最常见的遗传性神经疾患之列。大多数CMT患者具有常染色体显性遗传，但是X连锁显性形式和常染色体隐性形式也存在。表现为零散病例的事情也会发生，因为甚至显性遗传性疾患可能作为在给定患者体内的新突变开始。大多数病例是脱髓鞘，但是最多三分之一呈现为原发性轴突或神经元疾患。大多数患者具有“典型的”CMT表型，其特征是肢端无力、感觉丧失、足部变形(弓形足和锤状趾)和缺乏反射。但是，某些患者在婴儿期形成严重的残疾(Dejerine Sottas病或先天性髓鞘形成减少(congenital hypomyelination))而其他患者很少形成(如果有任何疾病症状的话)。
在多个方面和实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗遗传性神经病变是有用的。在多个方面和实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗Charcot-Marie-Tooth病是有用的。
免疫介导的神经病变和长期免疫介导的多发性神经病变
应经受免疫治疗的多种慢性神经病变综合征中牵涉自身免疫机制。总地来说，这些神经病变是相对常见的；Barohn等人(1998)和Verghese等人(2001)。但是，实际上，由于缺乏普遍接受的临床诊断标准或可信的血清学测试的可利用性，许多自身免疫性神经病变难以诊断。因此，患自身免疫性神经病变的许多患者反而被诊断为患“特发性神经病变”，且尽管其疾病推进却未被治疗。
慢性自身免疫性神经病变是由免疫介导的对周围神经的损害引起的一组不同的综合征。对于这些疾患中的许多疾患，不存在确定性的诊断测试，而只有几种或没有可控的治疗试验。因此，诊断可能被遗漏而患者仍未受到治疗。
在多个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗免疫介导的神经病变是有用的。在多个方面和实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗长期免疫介导的多发性神经病变是有用的。
传染性神经病变
传染性神经病变的非限制性实例包括：与人免疫缺陷病毒(HIV)感染有关的神经病变；莱姆神经病变；与麻风病有关的神经病变；带状疱疹(Herpes zoster)神经病变(带状疱疹(shingles)和疱疹后神经痛)；丙型肝炎神经病变；单纯疱疹神经炎；白喉神经炎；和恰加斯病。
在多个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗传染性神经病变是有用的。在一个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗与人免疫缺陷病毒(HIV)感染有关的神经病变是有用的。在一个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗莱姆神经病变是有用的。在一个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗与麻风病有关的神经病变是有用的。在一个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗带状疱疹神经病变是有用的。在一个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗丙型肝炎神经病变是有用的。在一个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗单纯疱疹神经炎是有用的。在一个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗白喉神经炎是有用的。在一个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗恰加斯病是有用的。
神经性疼痛(NP)
国际疼痛研究协会(IASP)将NP定义为“由周围或中枢神经系统的疾病或损伤，以及由神经系统的功能障碍引起的疼痛”。
疼痛通常具有混合的伤害感受性和神经病性类型，例如，伴随神经根或脊髓病的机械性脊椎痛。未被公认的是伤害感受性脊椎痛可像根的分布一样广泛地发散。可能难以确定主导性的疼痛类型并适当地治疗。这些患者需要仔细的检查，成像和神经生理学研究。
造成NP的病理生理学特征可大致分为五组：损伤的初级传入纤维中异位脉冲的产生、纤维相互作用、中枢敏化、去抑制(正常抑制机制的失效或衰退)和可塑性(与改变的连接性(connectivity)有关的退行性和再生性变化)。
疼痛是神经疾病的常见症状且虽然已存在一些治疗进展，但是疼痛经常对所有治疗模式保持无响应。关于神经性疼痛的综述，参见，例如Scadding J.ACNR，v.3n.22003年5月/6月，第8-14页。由于癌症对周围神经的直接作用结果(例如，被肿瘤压迫)以及由于许多化疗药物的副作用，神经性疼痛在癌症中是常见的。
触摸痛
字面意思是“其他力量”的触摸痛是由正常情况下不引起疼痛且可以是热源性的或机械性的刺激引起的疼痛。触摸痛是许多疼痛性病症例如神经病变、复杂的区域性疼痛综合征、疱疹后神经痛、纤维肌痛和偏头痛的临床特征。触摸痛还可由用来处理神经损伤包括脊髓损伤的干细胞的某些群体引起。
存在不同种类或类型的触摸痛，包括：机械性触摸痛(也称为触觉性触摸痛)；静态机械性触摸痛-响应于轻轻触摸/按压的疼痛；动态机械性触摸痛-响应于擦拭的疼痛；热学(热或冷)触摸痛-由通常温和的皮肤温度造成的在受影响的区域中的疼痛。
在多个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗神经性疼痛是有用的。在某些实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗触摸痛是有用的。
感觉运动性多发性神经病变
较长的神经纤维相比于较短的神经纤维在更大的程度上受影响，因为神经传导速度与神经长度成比例地变缓。在该综合征中，减少的感觉和反射的丧失首先双边地发生在脚趾中，然后向上延伸。其通常被描述为麻木的手套-袜子样分布、感觉丧失、感觉迟钝和夜间疼痛。疼痛可感觉像痛苦的或麻木的灼痛、刺痛感觉。钉刺感和针刺感是常见的。早期影响到本体感受的丧失，本体感受也就是对四肢在空间内的位置的感知。这些患者不能感觉到何时他们踩踏在异物，如碎片上，或何时他们因鞋子不合适而形成老茧。因此，他们处于在足和腿上形成溃疡和感染的风险下，这种风险可导致截肢。相似地，这些患者可能遭受膝、踝或足的多处骨折并形成Charcot关节。运动功能的丧失导致脚趾的背屈挛缩，所谓的锤状趾。这些挛缩不仅发生在足部而且发生在手部。
在某些实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗感觉运动性多发性神经病变是有用的。
细胞骨架调控
细胞运动性，细胞骨架调控、微管组织
Rho家族的GTP酶是将表面受体与肌动蛋白细胞骨架的组织联系起来并在基础细胞程序中起主要作用的调控分子。RhoA具有发挥使肌动蛋白聚合并影响微管形成的功能的支架特征。肌动蛋白受Rho家族的小GTP酶的调控。正在迁移的细胞表现出肌动蛋白细胞骨架的特征性极化。肌动蛋白丝在细胞突起的前部聚合而肌动蛋白丝束在胞体内收缩，这促使细胞后部的回缩。肌动蛋白细胞骨架为细胞迁移提供了驱动力。近期研究表明，除了组织肌动蛋白细胞骨架，Rho GTP酶可能还影响微管的组织和动力学。
在多个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地预防或治疗与细胞运动性、细胞骨架调控、微管组织有关的疾患或疾病是有用的。
血管发生、血管疾病、动脉疾病
血管发生，即由已存在的血管形成新血管，是复杂的多步骤程序。其包括刺激血管内皮细胞上血管生成生长因子受体、蛋白酶分解内皮细胞基底膜、内皮细胞增殖和迁移、降解周围细胞外基质、血管成熟、召集支持细胞(例如，周细胞)及最终新形成的动静脉环的闭合(Folkman J.1971.Tumour angiogenesis：therapeutic implications.NEJM285：1182-1185；Yancopoulos GD等人.2000.Vascular-specific growth factors and bloodvessel formation.Nature407：242-248；Carmeliet P.2003.Angiogenesis in healthand disease.Nat Med9：653-660)。这些步骤中的每一个受刺激性分子(血管生成因子)和抑制性分子(血管生成抑制剂)的作用的紧密调控(Carmeliet P&JainJK.2000.Angiogenesis in cancer and other diseases.Nature407：249-257)。正常状态中，当血管生成抑制剂的作用占主导时，血管是静态的。在激活血管生成因子的某些条件下，例如低氧或炎症，该平衡可向有利于血管发生的方向移动，即称为“血管生成开关(angiogenic switch)”的事件。
作为对各种病理学的治疗，抑制血管发生是期望的以例如诸如预防与增生性视网膜病有关的失明和限制肿瘤生长。研究确定了对于Rho在调节将内皮细胞组装成新血管方面的活性的关键性和选择性作用，且将对Rho活性的抑制作为用于抑制各个组织阶段的新血管形成的策略。
在血管结构中，Rho信号通路密切参与调控内皮屏障功能、炎症和经内皮的白细胞迁移，血小板活化、血栓形成和氧化应激，以及平滑肌收缩、迁移、增殖和分化，且因此牵涉与血管发生有关的许多变化。的确，认为抑制素的许多有益的、降低非脂质的作用由于其抑制Rho蛋白质活化的能力而发生(参见，例如Hoang MV等人.Rho activity critically andselectively regulates endothelial cell organization during angiogenesis.PNASU S A.2004年2月17日；101(7)：1874-1879；Rolfe BE等人.Rho and Vasculardisease.Atherosclerosis.20052005年11月；183(1)：1-16.)
在多个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地抑制血管发生是有用的。在多个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗血管疾病是有用的。
在多个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗动脉疾病是有用的。
眼部血管发生-角膜、视网膜、脉络膜
眼部血管发生，即由现存的血管树形成新血管，是严重的视力损失的主要原因。其可影响眼睛中不同的结构，包括视网膜、脉络膜和角膜。
视网膜血管发生，通常见于增殖性糖尿病性视网膜病、视网膜静脉闭塞或早产儿视网膜病中，是对视网膜缺血或低氧的异常血管响应的结果。视网膜血管发生期间，视网膜血管内皮细胞开始增殖，穿过内部限制性膜进入玻璃体，在玻璃体内这些细胞可导致玻璃体出血或牵引性视网膜脱离。
脉络膜(视网膜下)血管发生。在年龄相关的黄斑变性(AMD)的新血管形式中，脉络膜血管穿过变性的布鲁赫膜生长进入视网膜下的空间，导致视网膜下溢泌和出血(AmbatiJ等人.2003.Age-related macular degeneration：aetiology，pathogenesis andtherapeutic strategies.Surv Ophthalmol48：257-293)。该脉络膜血管生成响应的最初刺激仍受到争议。目前最受支持的是其中局部炎症激发血管向内生长的模型(Tezel TH等人.2004.Pathogenesis of age-related macular degeneration.Trends Mol Med10：417-420)。
角膜血管发生。角膜的新血管形成破坏其透明度并导致严重的视力损害(ChangJH等人.2001.Corneal neovascularization.Curr Opin Ophthalmol12：242-249)。其是对长期低氧或各种炎性刺激，例如，传染性角膜炎、碱烧伤和植入物排斥的响应中看到的常见临床问题。角膜血管发生从缘血管出现且因此眼部表面疾患偏向于表面新血管形成，而基质角膜炎导致深层的血管浸润。
在多个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地预防或治疗与视网膜血管发生有关的疾病、疾患或损伤是有用的。
在多个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地预防或治疗与脉络膜(视网膜下)血管发生有关的疾病、疾患或损伤是有用的。
在多个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地预防或治疗与角膜血管发生有关的疾病、疾患或损伤是有用的。
黄斑变性
在美国，年龄65周岁以上的个体中最佳矫正视力降低的最常见的原因是称为年龄相关的黄斑变性(AMD)的视网膜疾患。当AMD推进时，该疾病的特征是丧失敏锐、集中的视力。眼睛受AMD影响的区域是主要由光感受器细胞构成的斑-视网膜中心的小的区域。占AMD患者的约85％-90％的所谓的“干性”AMD包括由细胞的整体萎缩引起的眼睛色素分布的变化、光感受器的丢失和减弱的视网膜功能。所谓的“湿性”AMD包括异常脉络膜血管的增生，在视网膜下的空间内导致凝块或疤。因此，湿性AMD的发作由于神经性视网膜下方的异常脉络膜新血管网络的形成(脉络膜新血管形成，CNV)而发生。新形成的血管是过渡渗漏的。这导致视网膜下液体和血液的积累，从而导致视敏度的损失。最后，因为形成包括脉络膜和视网膜的大的盘状疤，受累的区域中完全丢失功能性视网膜。虽然干性AMD患者可能保持质量减退的视力，但是湿性AMD经常导致失明。(Hamdi&Kenney，Age-related Maculardegeneration-a new viewpoint，Frontiers in Bioscience，e305-314，2003年5月)。CNV不仅发生在湿性AMD中而且发生在其他眼部病理学例如眼部组织胞浆菌病综合征、血管样条纹、布鲁赫膜的破裂、近视性变性、眼部肿瘤和某些视网膜变性疾病中。
在多个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗视网膜变性疾病是有用的。在多个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗年龄相关的黄斑变性(AMD)是有用的。在某些实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗湿性年龄相关的黄斑变性(AMD)是有用的。在某些实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗干性年龄相关的黄斑变性(AMD)是有用的。在某些实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗眼部组织胞浆菌病综合征是有用的。在某些实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗血管样条纹是有用的。在某些实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗布鲁赫膜的破裂是有用的。在某些实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗近视性变性是有用的。在某些实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗眼部肿瘤是有用的。
微血管疾患
微血管疾患由广泛的一组主要影响显微毛细血管和淋巴管的病症构成且因此在直接手术干预的范围之外。微血管疾病可大致分为血管痉挛、血管炎和淋巴管闭塞。另外，许多已知的血管病症具有针对它们的微血管元件。
血管痉挛疾病
血管痉挛疾病是一组相对常见的病症，其中由于未知的原因，周围血管收缩反射是高度灵敏的。这导致不当的血管收缩和组织缺血，甚至到了失去组织的程度。血管痉挛症状通常与温度或震动仪器的使用有关但可能继发于其他病症。
血管炎疾病
血管炎疾病是原发性炎症过程参与微循环的疾病。血管炎通常是自身免疫或结缔组织疾患的组成部分且通常不经受手术治疗但是如果症状严重的话，则需要免疫抑制性治疗。
淋巴管闭塞疾病
下肢或上肢的长期肿胀(淋巴水肿)是周围淋巴管闭塞的结果。这是一种相对罕见的病症，其具有大量的原因，一些是遗传性的，一些是获得性的。治疗的主要依靠是合身的压力服装(compression garment)和间歇性加压装置(intermittent compressiondevice)的使用。
与糖尿病有关的微血管病理学
糖尿病是失明的首要原因、截肢和阳痿的第一号原因且是最经常发生的慢性儿童期疾病之一。在美国，糖尿病也是末期肾病的首要原因，与其他肾病相比，患病率为31％。糖尿病也是对占所有移植手术的22％的肾移植的最常见的适应症。
一般地，糖尿病并发症可大致分为微血管或大血管疾病。微血管并发症包括神经病变(神经损伤)、肾病(肾疾病)和视觉疾患(例如，视网膜病、青光眼、白内障和角膜疾病)。在视网膜、肾小球和神经滋养血管中，相似的病理生理学特征表征了糖尿病特有的微血管疾病。与糖尿病有关的微血管病理学被定义为可发生在例如已长期患糖尿病的人群中的最小血管(毛细血管)的疾病。血管壁虽然变得异常地厚但是脆弱。因此，血管壁流血、渗漏蛋白质并减缓穿过身体的血流。
临床和动物模型数据表明长期高血糖是对于所有类型的糖尿病性微血管疾病的关键引发因素。高血糖的持续时间和强度都与糖尿病性微血管疾病的程度和推进速度强烈相关。虽然所有糖尿病性细胞被暴露于升高的胞质葡萄糖水平，但是高血糖损害被局限于形成细胞内高血糖的那些细胞类型(例如，内皮细胞)。内皮细胞形成细胞内高血糖，因为当暴露于细胞外高血糖时，不像许多其他细胞那样，它们不能下调葡萄糖运输。
异常的内皮细胞功能：糖尿病进程的早期，在结构变化变得明显之前，高血糖导致视网膜、肾小球和周围神经滋养血管的血流和血管通透性的异常。血流和毛细血管内压力的增加被认为反映了在毛细血管床的输出侧上高血糖引起的一氧化氮(NO)产生减少且可能反映出对血管紧张肽II的增加的敏感性。由于增加的毛细血管内压力和内皮细胞功能障碍的结果，视网膜毛细血管显示出增加的荧光蛋白渗漏且肾小球毛细血管具有升高的白蛋白分泌速率(AER)。可比较的变化发生在周围神经的神经滋养血管中。在糖尿病进程的早期，增加的通透性是可逆的；但是，随着时间推进，其变得不可逆。
增加的血管壁蛋白质积累
糖尿病性微血管疾病常见的病理生理学特征是进行性的狭窄和最终的血管腔的闭塞，这导致受影响的组织的灌注和功能不足。早期高血糖引起的微血管高血压和增加的血管通透性通过三个过程促成了不可逆的微血管闭塞：
第一个是储存在毛细血管壁中且可刺激血管周细胞例如周细胞和系膜细胞制造生长因子和细胞外基质的过碘酸-希夫(PAS)-阳性的、含碳水化合物的血浆蛋白质(plasmaprotein)的异常渗漏。
第二个是生长因子例如直接刺激细胞外基质组分过度产生且可在某些并发症相关的细胞类型中引起凋亡的转化生长因子β1(TGF-β1)的溢出。
第三个是高血压引起的对内皮细胞和支持细胞的病理性基因表达的刺激，这些病理性基因包括glut-1葡萄糖转运蛋白、生长因子、生长因子受体、细胞外基质组分和可活化正在循环的白细胞的黏着分子。观察到糖尿病性微血管疾病的严重性的单边减小发生在具有眼动脉狭窄或肾动脉狭窄的一侧上是与该观念一致的。
微血管细胞丢失和血管闭塞
糖尿病性微血管腔的进行性狭窄和闭塞也伴随有微血管细胞损失。在视网膜中，糖尿病引发苗勒细胞(Müller cell)和神经节细胞、周细胞和内皮细胞的程序性细胞死亡。在肾小球中，衰退的肾功能与普遍的毛细血管闭塞和足细胞损失有关，但是肾小球细胞损失背后的机制是尚且未知的。在神经滋养血管中，内皮细胞和周细胞变性发生，且这些微血管变化呈现为在形成糖尿病性周围神经病变之前。糖尿病中轴突变性的多病灶分布支持对微血管闭塞的因果作用，但是高血糖引起的神经营养蛋白的减少可通过防止正常的轴突修复和再生促进这种因果作用。
糖尿病性微血管疾病的另一个常见特征已被称作高血糖记忆，或高血糖引起的微血管变化在随后的正常血糖动态平衡期间的持续或推进。该现象最显著的实例是患糖尿病的狗的组织学上正常的眼睛中严重的视网膜病的形成，所述视网膜病全部发生在2.5年的高血糖之后的正常化血糖的2.5年时期内。高血糖引起的所选择的基质基因转录的增加在恢复体内正常血糖后也维持了数周，且不太明显但定性地讲相似的高血糖引起的所选择的基质基因转录的增加的延长发生在培养的内皮细胞中。
对于另外的信息，参见例如“Shared pathophysiologic features ofmicrovascular complications of diabetes”(Larsen：Williams Textbook ofEndocrinology，第10版，2003Elsevier)。
微血管并发症不仅发生在显性糖尿病中而且还归因于葡萄糖耐量受损(IGT)。IGT的微血管并发症：神经病变、视网膜病和肾微量蛋白尿。在多个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地治疗微血管疾患是有用的。
糖尿病性四肢缺血和糖尿病性足部溃疡
糖尿病和压迫也损害微血管循环并导致下肢上皮肤的变化，这反过来可导致溃疡的形成和随后的感染。微血管变化导致四肢肌肉微血管病以及形成外周缺血的倾向以及减弱的对缺血事件的血管发生补偿反应。微血管病理学加重了外周血管疾病(PVD)(或外周动脉疾病(PAD)或下肢动脉疾病(LEAD)-大血管并发症-由动脉粥样硬化引起的腿部动脉的狭窄。PVD发生在糖尿病的更早期，更为严重和普遍，且经常涉及影响腿、眼睛和肾的间发性微循环问题。
足部溃疡和坏疽是PAD的常见伴随病症。伴随感觉受损的并发性周围神经病变使得足部易患创伤、溃疡和感染。作为周围神经病变的这种伴随疾病以及足部和下肢对疼痛和创伤的感觉迟钝加剧了糖尿病中PAD的推进。由于循环受损和感觉受损，溃疡和感染发生。推进成骨髓炎和坏疽可能需要截肢。
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糖尿病中的冠状微血管功能障碍
糖尿病中组织病理学和微循环功能障碍之间的相互联系是从年久的实验研究和从尸体解剖熟知的，其中经常发现基底膜的增厚、血管周纤维化、血管稀薄化和毛细血管出血。虽然最近的文献表明了病理学和眼部微血管功能障碍之间的相互联系(Am JPhysiol2003；285)，但是体内确认这些数据仍是困难的。然而，大量的临床研究表明不仅显性糖尿病而且受损的代谢控制可影响冠状动脉微循环(Hypert Res2002；25：893)。Werner间接提到Sambuceti等人的重要文献(Circulation2001；104：1129)，该文献表明成功地重新打开梗塞关联的动脉后患者体内微血管功能障碍的持续，且该文献可解释这些患者中增加的心血管发病率和死亡率。存在来自大型急性再灌注研究的越来越多的证据，发病率和死亡率与梗塞关联的动脉的自身重新打开无关，而是更加取决于TIMI流+/-心肌呈色(Stone2002；Feldmann Circulation2003)。Herrmann指出，除其他以外，冠状动脉微循环的完整性可能是该背景中最重要的临床和预后因素(Circulation2001)。保护设备的中性作用(对于TIMI流、对于ST分辨率或对于MACE，无相关变化)可表明对微循环的功能性损害是预后的主要决定因素。还存在冠状微血管功能障碍在非阻塞性CAD中起主要作用的递增的证据。冠状动脉内皮功能障碍仍是这些患者中强有力的预后预测因素(predictor)。
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糖尿病性神经病变(患糖尿病的患者的肾功能障碍)
糖尿病性神经病变包括微量白蛋白尿(微血管疾病的影响)、蛋白尿和ESRD。糖尿病是肾衰竭最常见的原因，占新病例的多于百分之40。甚至当药物和膳食能够控制糖尿病时，该疾病可能导致神经病变和肾衰竭。患糖尿病的大多数人未形成严重得足以导致肾衰竭的神经病变。在美国约1600万人患有糖尿病，且约100,000人由于糖尿病患肾衰竭。
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视网膜病
视网膜病是指对眼睛的视网膜的非炎性损害的通用术语。视网膜病的原因是不同的且包括例如，糖尿病(糖尿病性视网膜病)、动脉高血压(高血压性视网膜病)、新生儿的早产(早产儿视网膜病)、视网膜静脉或动脉闭塞。许多类型的视网膜病是进行性的且可导致失明或严重的视力损失或损害。
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在多个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地预防或治疗支架内视网膜病是有用的。
在多个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地预防或治疗支架内视网膜病是有用的。
在多个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地预防或治疗高血压性视网膜病是有用的。
在多个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地预防或治疗早产儿视网膜病是有用的。
糖尿病性视网膜病
糖尿病性视网膜病是糖尿病的并发症和失明的首要原因。其发生在糖尿病损害视网膜内细小血管时。糖尿病性视网膜病具有四个阶段：
-温和的非增生性视网膜病：视网膜血管中的微动脉瘤。
-中度非增生性视网膜病。当该疾病推进时，为视网膜提供营养的某些血管被堵塞。
-严重的非增生性视网膜病。更多的血管被堵塞，剥夺了视网膜多个区域的血液供应，这通过新血管的生长克服。
-增生性视网膜病。新血管沿视网膜和沿玻璃体凝胶的表面生长。当血管渗漏血液时，严重的视力损失且甚至失明可发生。
对于患糖尿病的女性，在怀孕期间，糖尿病性视网膜病可能成为问题。
不期望被理论束缚，因糖尿病性视网膜病而损伤的血管可以以两种方式导致视力损失：脆弱的异常血管可形成并向眼睛中心渗漏血液，使视觉模糊。这是增生性视网膜病且是该疾病的第四阶段和最晚期的阶段。流体可渗漏到斑的中心，产生模糊的视觉。该病症被称为黄斑水肿。其可发生在糖尿病性视网膜病的任何阶段，但是更可能发生在疾病推进时且被称为糖尿病性黄斑水肿(DME)。
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糖尿病性黄斑水肿(DME)
DME是糖尿病视网膜病的并发症，糖尿病视网膜病是影响视网膜的血管的一种疾病。糖尿病性视网膜病导致视网膜内的多种异常，包括视网膜增厚和水肿、出血、血流受阻、从血管过多地渗漏流体和在最后阶段，异常的血管生长。这种血管生长可导致大的出血和严重的视网膜损伤。当糖尿病性视网膜病的血管渗漏导致斑中肿胀时，其被称作DME。DME的主要症状是中心视力的损失。与DME有关的风险因素包括控制得差的血糖水平、高的血压、造成流体潴留的异常的肾功能、高的胆固醇水平和其他一般的系统因素。
根据世界卫生组织，糖尿病性视网膜病是工龄成人失明的首要原因和糖尿病视力损失的首要原因。美国糖尿病协会(American Diabetes Association)报道在美国存在约1800万糖尿病患者且每年美国有约130万新诊断的糖尿病病例。美国预防失明和国家眼科研究所(Prevent Blindness America and the National Eye Institute)估计在美国，存在超过530万年龄18或更年长的患糖尿病性视网膜病的人，包括患DME的约500,000人。CDC估计，在美国每年有约75,000个新的DME病例。
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视网膜微血管病(AIDS视网膜病)
视网膜微血管病见于100％的AIDS患者。其特征是视网膜内出血、微动脉瘤、Roth斑(Roth spot)、棉絮状斑(cotton-wool spot)(神经纤维层的微梗塞)和血管周鞘(perivascular sheathing)。视网膜病的病因学是未知的，但是认为其由循环的免疫复合物、细胞毒性物质的局部释放、异常的血液流变学和内皮细胞的HIV感染引起。不存在对AIDS视网膜病的专用治疗。
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骨髓移植(BMT)视网膜病
骨髓移植视网膜病首先报道于1983年。其通常在BMT后的六个月内发生，但是其可发生在迟至BMT后的62个月。风险因素例如糖尿病和高血压可通过加强缺血性微血管病促进BMT视网膜病的形成。对于BMT视网膜病的形成，不存在已知的年龄、性别或种族偏好。患者呈现有视敏度减弱和/或视野缺损。眼后段发现通常是双边且对称的。临床表现包括多个棉絮状斑、毛细血管扩张、微动脉瘤、黄斑水肿、硬质渗出物和视网膜出血。荧光蛋白血管造影术表明毛细血管无灌注和放空(dropout)、视网膜内微血管异常、微动脉瘤和黄斑水肿。虽然BMT视网膜病的准确病因尚未阐明，但是其呈现为受多种因素：环孢菌素毒性、全身辐射(TBI)和化疗剂的影响。环孢菌素是抑制移植物-对-宿主免疫应答的强有力的免疫调节剂。其可导致内皮细胞损伤和神经学副作用，且因此，其被认为成BMT视网膜病的原因。然而，BMT视网膜病可在无环孢菌素使用下形成，且未表明环孢菌素导致自体或同基因骨髓接受者中BMT视网膜病。因此，环孢菌素好像不是BMT视网膜病的唯一原因。全身辐射(TBI)也被牵涉为BMT视网膜病的原因。辐射损害视网膜微血管系统并导致缺血性血管病。变量例如辐射的总剂量以及辐射和骨髓消融之间的时间间隔好像是重要的。然而，BMT视网膜病可发生在未接受TBI的患者中，且未在接受相似剂量辐射的实体器官移植物接受者中观察到BMT视网膜病。因此，TBI不是唯一的原因，而是BMT视网膜病的形成中的另一个促进因素。化疗剂已被认为是BMT视网膜病中潜在的促进因素。药剂例如顺铂、卡莫司汀和环磷酰胺可导致眼部副作用包括视乳头水肿、视神经炎、视野缺损和皮质性盲。已提出这些化疗药物可使患者易受辐射引起的视网膜损害并增强辐射的有害作用。一般地，患BMT视网膜病的患者具有良好的预后。视网膜病通常在停止环孢菌素或降低其剂量之后的二至四个月内消除。
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角膜移植
如今人类中最常见的移植程序之一是穿透性角膜移植术(角膜移植或植入)。目前，全世界每年进行超过40,000例角膜植入以预防由获得性(例如，感染)和遗传性(史蒂文斯-约翰逊综合征)角膜疾病引起的失明。角膜植入的主要目的是提高视力、减少疼痛并修复结构损伤，且成功的视力结果取决于植入物的长期存活。随时间推移，角膜植入失败的可能性增加，因此，与许多血管化器官植入相比，角膜植入物的损耗速率通常慢但无法改变。对失败的角膜移植物进行重新植入的需要是对于角膜移植的主要适应症之一。
角膜植入的失败可由于差的供体组织(主要的失败)或由于早期或晚期手术并发症而发生。但是，角膜植入失败最常见的原因之一是发生在约30％的病例中的免疫学角膜植入物排斥。
角膜植入的成功主要依赖于通过多种机制，包括血管的缺乏、淋巴管的缺乏、血液-眼睛屏障、角膜中心内成熟的抗原递呈细胞(APC)的相对缺乏以及眼房水中免疫调节因子的存在来保持眼睛的免疫赦免状态。然而，角膜内的炎症和创伤和所导致的新血管形成导致眼睛内免疫赦免的丧失并导致产生角膜移植排斥的细胞介导的免疫应答。
正常无血管宿主角膜内的新血管形成作为角膜植入排斥最为认可和公认的风险因素占优势。正常的角膜是无血管的，缺少血液和淋巴管，这对于透明度和视力，和对于给予对角膜的免疫赦免，对于保护供体角膜免受排斥是必不可少的，使其成为角膜植入物长期存活重要的预后因素。如果新血管形成存在于角膜植入之前或之后，则新血管的生长(血管发生)提供了免疫介导细胞进入植入物的通道，而新淋巴管的生长(淋巴管发生)使得APC和抗原材料能够从植入物排出到达区域的淋巴结。结果，角膜因免疫反应调节因子而变得浸润并对其变得敏感，且虽然角膜本身内无免疫反应，但是新血管形成引发可导致免疫学角膜植入物排斥的免疫应答。
从无血管的眼睛到其中在眼睛的所有四个象限都看到新血管形成的眼睛，角膜植入物排斥的风险升高了三分之二。
目前，所认可的治疗包括抗炎药物(即，皮质甾类)和/或免疫抑制剂的使用来控制眼睛中的免疫应答，这在排斥的早期而不是晚期可能是有帮助的。因此，需要控制角膜植入物排斥的新方法来保证患者在角膜植入后保持其视力。已对预防或治疗新血管生成，而不是治疗随后的免疫反应或炎症的可能性进行了研究。然而，迄今为止没有特异性的治疗被批准治疗角膜新血管形成。
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新生内膜增生和平滑肌细胞迁移的抑制(支架)
支架内再狭窄是由血管平滑肌细胞(VSMC)增殖、迁移和过度的基质产生引起的病理生物学过程。
对RhoA在人内乳动脉的活体外器官培养模型中的活性的分析(J VascRes.2005Jan-Feb；42(1)：21-8)表明支架术引发与同时的p27表达减少有关的RhoA活性的时间依赖性的增加。用RhoA抑制剂治疗被支撑的动脉抑制了新生内膜形成和p27表达的减少。支架植入引发持续的RhoA活化且表明雷帕霉素对RhoA表达的抑制性作用在其抗再狭窄作用方面起关键作用。
在多个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地预防或治疗支架内再狭窄是有用的。
肺高血压
肺动脉高血压(PAH)是一种毁灭性疾病，其特征是由肺血管收缩和血管重构以及炎症引起的肺动脉压力和血管阻力的进行性升高。
肺动脉高血压(PAH)特征是休息时大于25mmHg或用力后大于30mmHg的肺动脉压力的上升性的、持续的增加，是一种具有差的预后且如果不被治疗通常5年内发生死亡的进行性疾病。另外，由于右心室衰竭而未治疗，原发性或特发性肺动脉高压(IPAH)可在平均3年内导致死亡，不管目前的治疗怎样，具有15％的1年死亡率。促成PAH的因素包括长期的血管收缩、血管重构、炎症细胞迁移以及导致血管病变形成的原位血栓形成。目前认为发生于PAH中的肺血管阻力升高的主要原因是由于来自血管重构的机械性梗阻。另外，病理学发现表明PAH与内膜的和/或中层的肥大、内膜纤维化和丛状病变有关。
在多个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地预防或治疗肺动脉高血压是有用的。
炎症
炎症是血管组织对有害的刺激，例如病原体、破损的细胞或刺激物的复杂生物学响应的一部分。与炎症有关的异常包括公认无关的一大组疾患，其是各种各样的人类疾病的基础。免疫系统通常参与表现在过敏反应和某些肌肉病中的炎性疾患，其中许多免疫系统疾患导致异常炎症。具有炎症过程中的病因来源的非免疫疾病被认为包括癌症、动脉粥样硬化和缺血性心脏病。
在多个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地预防或治疗炎症是有用的。在多个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地预防或治疗炎性疾患是有用的。
肿瘤发生
近来，研究已表明Rho家族的蛋白质参与肿瘤生长、推进、转移和血管发生。虽然Rho蛋白质参与的通路实际上是未知的，但是Rho蛋白质和癌症之间的联系是实质性的。特别地，Rho蛋白质似乎与某些类型的癌症具有广泛的联系。已发现RhoA过表达与结肠、乳腺、肺、睾丸生殖细胞、以及头部和颈部鳞状细胞癌的肿瘤有关。
RhoA的过表达水平可能与增加的其三种已知效应因子的活化相互关联，所述效应因子继而产生可允许肿瘤发生的可能的功能。所述三种效应因子包括ROCK I、II家族。这些效应因子是导致肌动球蛋白收缩、SRF基因的转化和转录的激酶。另外，这些效应因子表现出发挥使肌动蛋白聚合并影响微管形成的功能的支架特征。第二种效应因子是导致细胞内吞的PRK1/PKN蛋白质。且最后RhoA结合导致胞质分裂的效应因子Citron。这些效应因子似乎表明RhoA参与细胞运动性和细胞极性。RhoA表达对这两种功能的影响看起来将是肿瘤形成的可能原因。实际上，为最经常导致癌症的组织的内皮细胞中极性的丢失及其增加的细胞运动性看起来将制造异常的细胞系。
RhoA过表达与结肠、乳腺、肺和睾丸生殖细胞癌症以及头部和颈部鳞状细胞癌有关。正在探究关于RhoA在这些癌症中的作用的不同假设。一个是RhoA的GTP酶活性为肿瘤发生所必需的过程，例如囊泡运输和细胞形状变化提供能量。另一个并不是不相容的假设是癌症的转移可能受RhoA在细胞运动性和过程形成中的作用的影响。
“癌症”和“癌性疾病”互换地使用且指由不合理的高水平的细胞分裂、不合理的低水平的凋亡或二者引起或导致上述两种情形的疾病。癌性疾病的实例包括但不限于白血病(例如，急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、急性成髓细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、急性髓单核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金病、非霍奇金病)、Waldenstrom巨球蛋白血症(Waldenstrom′smacroglobulinemia)、重链病和实体肿瘤如肉瘤和癌(例如，纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤(Wilm′stumor)、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、肺小细胞癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤)。在某些优选的实施方式中，本发明的化合物在治疗肺癌和肺部转移中是有用的。
如本文所用的，术语“增生性疾病”指其中恶性或良性的细胞增殖有助于病症的病理学的疾病。这种不想要的增殖是癌症和许多慢性炎性疾病的特点，因此“增生性疾病”的实例包括上文列出的癌症和慢性炎性增生性疾病例如牛皮癣、炎性肠病和类风湿性关节炎；增生性心血管疾病如再狭窄；增生性眼部疾患如糖尿病性视网膜病变；和良性过度增生性疾病如血管瘤。
在多个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地预防或治疗癌症是有用的。在多个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地预防或治疗癌、肿瘤和/或恶性疾病是有用的。
在一个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地预防或治疗结肠癌是有用的。在一个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地预防或治疗乳腺癌是有用的。在一个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地预防或治疗肺癌是有用的。在一个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地预防或治疗睾丸生殖细胞癌是有用的。在一个实施方式中，本文公开的核酸化合物和药物组合物对于单独地或与其他治疗组合地预防或治疗颈部鳞状细胞癌是有用的。
治疗上述疾病和疾患的更有效的疗法将是具有极大治疗价值的。
总之，不存在用于预防和/或治疗本文公开的病症(例如，青光眼、SCI、CNS损伤、神经变性疾病)的有效治疗方式且当然不存在对组织收缩的有效治疗，也不存在对眼部结疤的有效治疗。可利用的治疗受尤其是由缺乏选择性靶向引起的严重的副作用的缺点的限制，且因此仍存在研发用于这些目的的新型化合物和治疗方法的需要。
在多个实施方式中，本发明的化合物和药物组合物在治疗或预防影响中枢神经系统(CNS)的各种疾病、疾患和损伤，例如但不限于本文以下公开的疾病、疾患和损伤方面是有用的。不被理论束缚地，相信本文提供的治疗性dsRhoA分子通过多种机制治疗CNS疾患、疾病和损伤，导致神经保护和神经再生。
RhoA蛋白质
RhoA是小GTP酶的Ras同源家族的成员。通过将GTP水解成GDP，这些蛋白质从其活性构象(结合GTP)循环到其失活构象(结合GDP)。特异性鸟嘌呤交换因子(GEF)通过催化GDP被新的GTP取代来使GTP酶再活化。其他调控因子包括通过增强RhoA的GTP酶活性使RhoA失活(从而更迅速地将蛋白质转化成其结合GDP的失活形式)的GTP酶活化蛋白(GAP)和抑制GAP的功能发挥并因此减缓RhoA的GTP酶活性的鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂(GDI)。
RhoA在细胞中的功能主要与细胞骨架调节有关。最近的研究已表明其间接参与(通过相关因子)肌球蛋白磷酸化和细胞对应激的响应，例如粘着斑(focal adhesion)和肌动蛋白应激纤维的形成。还已表明其与肌球蛋白链延长、肌动蛋白丝重排、基因表达、细胞形状决定和细胞增殖直接相关。
RhoA过表达与结肠、乳腺、肺、和睾丸生殖细胞癌以及头部和颈部鳞状细胞癌有关。正在探究关于RhoA在这些癌症中的作用的不同假设。一个是RhoA的GTP酶活性为肿瘤发生所必需的过程例如囊泡运输和细胞形状变化提供能量。另一个并不是不相容的假设是癌症的转移可能受RhoA在细胞运动性和过程形成中的作用的影响。
dsRNA寡核苷酸化合物
表I、II、III和IV提供了在制备未修饰的和化学修饰的RhoA_dsRNA化合物方面有用的有义和对应的反义寡核苷酸的核酸序列。表I、II和III中提供的有义和反义寡核苷酸提供了对产生在下调RhoA表达和治疗本文公开的疾病、疾患和损伤方面有用的合成的siRNA化合物(双链体)有用的优选的寡核苷酸。
对应于已知基因的dsRNA化合物的选择和合成已被广泛报道；参见例如Ui-Tei等人，J Biomed Biotechnol.2006；65052；Chalk等人，BBRC.2004，319(1)：264-74；Sioud和Leirdal，Met.Mol Biol；2004，252：457-69；Levenkova等人，Bioinform.2004，20(3)：430-2；Ui-Tei等人，NAR2004，32(3)：936-48。对于使用和产生修饰的siRNA的实例，参见Braasch等人，Biochem.，2003，42(26)：7967-75；Chiu等人，RNA，2003，9(9)：1034-48；PCT公布WO2004/015107(atugen)；WO02/44321(Tuschl等人)和美国专利第5,898,031和6,107,094号。
一些小组已经描述了能够在细胞内产生siRNA的基于DNA的载体的形成。该方法通常包括被有效地加工以在细胞内形成siRNA的短发夹RNA的转录(Paddison等人PNASUSA2002，99：1443-1448；Paddison等人Genes&Dev2002，16：948-958；Sui等人PNASUSA2002，8：5515-5520；以及Brummelkamp等人Science2002，296：550-553)。这些报道描述了产生能够特异性靶向许多内源和外源表达基因的siRNA的方法。
本发明提供了双链寡核苷酸(例如dsRNA)，其根据本发明下调RhoA的表达。本发明的dsRNA化合物是双链体寡核苷酸，其中有义链衍生自RhoA的mRNA序列，且反义链与有义链互补。一般地，与靶mRNA序列的某些偏差被耐受而不损害dsRNA的活性(参见，例如Czauderna等人，2003，NAR31(11)，2705-2716)。本发明的dsRNA化合物在转录后水平上下调基因表达，破坏或不破坏mRNA。不被理论束缚地，dsRNA可靶向mRNA使其特异性裂解和降解和/或可抑制所靶向的信息的翻译。
根据本文公开的结构中列出的修饰对本文公开的dsRNA化合物进行化学和或结构上的修饰或将其修饰为串联dsRNA或RNA星(RNAstar)。
用于抑制RhoA的药物组合物
提供了通过使用能够介导RhoA基因表达的下调或介导针对RhoA基因表达的RNA干扰的小的核酸分子例如短干扰核酸(siNA)、干扰RNA(RNAi)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)和短发夹RNA(shRNA)分子来下调RhoA表达的组合物和方法。本文公开的组合物和方法在治疗各种神经变性疾患和神经性疾患和疼痛方面也是有用的。
本发明的核酸分子和/或方法被用来下调编码例如Genbank登记NM_001664表示的mRNA的RhoA的表达。
虽然以原料化学物质施用本发明的化合物可能是可行的，但是优选将其以药物组合物提供。因此，本发明提供了包含根据本发明的一种或多种化合物以及药学上可接受的载体的药物组合物。该组合物可包含两种或更多种不同核酸化合物的混合物。
本文提供的组合物、方法和药盒可包括一种或多种核酸分子(例如，dsRNA)和独立地或组合地调节(例如，下调)RhoA蛋白质和/或编码RhoA蛋白的基因、与和RhoA有关的疾病、病症或疾患，诸如例如CNS疾患、疾病和损伤的维持和/或形成有关的蛋白质和/或基因(例如，编码包含由GenBank登记号NM_001664表示的那些序列的序列的基因)或RhoA基因家族成员的表达的方法，其中这些基因或基因家族序列共享序列同源性。参考示例性基因RhoA提供了对多个方面和实施方式的描述。然而，所述多个方面和实施方式还涉及其他相关的RhoA基因，例如与某些RhoA基因有关的同源基因和转录物变体，和多态性(例如，单核苷酸多态性(SNP))。这样一来，所述多个方面和实施方式还涉及参与RhoA介导的信号转导或基因表达通路的其他基因，所述RhoA介导的信号转导或基因表达通路参与例如本文描述的疾病、特质(trait)或病症的维持或形成。可使用本文对RhoA基因描述的方法分析这些另外的基因的靶点。因此，可如本文所述地进行、确定和测量对其他基因的下调和其他基因的此类调节的作用。
本发明还提供了包含以有效地下调RhoA表达的量共价或非共价结合到本发明的一种或多种化合物的至少一种本发明的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。该化合物可被内源性细胞复合物细胞内加工以产生本发明的一种或多种寡核苷酸。
本发明还提供了包含药学上可接受的载体和有效地抑制人RhoA的细胞内表达的量的本发明的一种或多种化合物的药物组合物，该化合物包含与(N)x的序列基本互补的序列。
基本互补(substantially complementary)是指与另一序列的互补性(complementarity)大于约84％。例如，在由19个碱基对组成的双链体区域，一个错配导致94.7％的互补性，两个错配导致约89.5％的互补性而3个错配导致约84.2％的互补性，使得双链体区域基本互补。因此，基本相同是指与另一序列的同一性大于约84％。
另外，本发明提供了与对照相比，至少40％，优选50％、60％或70％，更优选75％、80％或90％地抑制RhoA的表达的方法，包括使本发明的RhoA的mRNA转录物与本发明的一种或多种化合物接触。
在一个实施方式中，本文公开的寡核苷酸化合物、组合物和方法抑制/下调RhoA基因，其中所述抑制/下调选自包括基因功能的抑制/下调、多肽的抑制/下调和mRNA表达的抑制/下调的组。
在一个实施方式中，本文提供的组合物和方法包括下调RhoA基因(例如，由SEQ IDNO：1例示的人RhoA的mRNA编码序列)表达的双链短干扰核酸(siNA)化合物，其中所述核酸分子包括约15至约49个碱基对。
在一个实施方式中，本文公开的核酸可用来抑制RhoA基因或RhoA基因家族的表达，其中这些基因或基因家族的序列共享序列同源性。如本领域已知的，可使用例如序列比对鉴定这些同源序列。例如使用完全互补的序列或通过并入可提供另外的靶序列的非标准碱基对，例如错配和/或摆动碱基对，可将核酸分子设计成靶向这些同源序列。在其中鉴定到错配的实例中，非标准碱基对(例如，错配和/或摆动碱基)可用来产生靶向多于一种基因序列的核酸分子。在非限制性实例中，非标准碱基对例如UU和CC碱基对用来产生能够靶向共享序列同源性的不同RhoA靶的序列的核酸分子。这样一来，使用本文公开的dsRNA的一个优点是可将单一的核酸设计成包括与在同源基因之间保守的核苷酸序列互补的核酸序列。在该方法中，单一的核酸可用来抑制多于一种基因的表达，而不是使用多于一种的核酸分子来靶向不同基因。
核酸分子可用来靶向对应于一个基因家族或多个基因家族例如RhoA家族基因的保守序列。这样一来，靶向多个RhoA靶的核酸分子可提供增加的治疗作用。另外，核酸可用来在多种应用中表征基因功能的通路。例如，核酸分子可用来抑制靶基因在某通路中的活性以在基因功能分析、mRNA功能分析或翻译分析中确定未被表征的基因的功能。这些核酸分子可用来确定参与药物研发所针对的各种疾病和病症的可能的靶基因通路。这些核酸分子可用来理解参与例如CNS疾患例如神经变性疾患和/或炎性疾病、疾患和/或病症的基因表达通路。
在一个实施方式中，本文提供的核酸化合物、组合物和方法抑制RhoA多肽，其中所述抑制选自包括功能抑制(其可用尤其是原始基因/多肽的已知相互作用因子(interactor)通过酶学测定或结合测定来验证)、蛋白质抑制(其可通过尤其是蛋白质印迹、ELISA或免疫沉淀来验证)和mRNA表达抑制(其可通过尤其是RNA印迹法、定量RT-PCR、原位杂交或微阵列杂交来验证)的组。
在一个实施方式中，本文提供的组合物和方法包括具有针对RhoARNA的RNAi活性的核酸分子，其中所述核酸分子包括与具有RhoA编码序列，例如SEQ ID NO：1中列出的序列的任何RNA互补的序列。在另一个实施方式中，核酸分子可具有针对RhoA RNA的RNAi活性，其中所述核酸分子包括与具有变体RhoA编码序列的RNA互补的序列，所述变体RhoA编码序列例如SEQ ID NO：1中未示出但是本领域已知与神经变性和/或神经病变例如SNP的发作和/或维持和/或形成有关的其他突变RhoA基因。如本文所述的化学修饰可应用于本文公开的任何核酸构建体。在另一个实施方式中，本文公开的核酸分子包括可与RhoA基因的核苷酸序列相互作用并从而介导RhoA基因表达的下调或沉默的核苷酸序列，例如，其中所述核酸分子通过调节核染色质结构或RhoA基因的甲基化模式并阻止RhoA基因的转录的细胞程序介导RhoA基因表达的调控。
在另外的实施方式中，本发明提供了治疗患伴随着升高的RhoA水平的疾病的受治疗者的方法，该方法包括对所述受治疗者以治疗有效剂量施用本发明的化合物，从而治疗所述受治疗者。
更特别地，本发明提供了一种寡核糖核苷酸，其中一条链包括从5’至3’具有表I、II、III和IV中列出的化合物或其同源物的连续的核苷酸，其中每个末端区域中的核糖核苷酸中的最多两个被改变。
核酸分子和药物制剂的递送
通过直接应用与载体或稀释剂一起制备的裸露的分子，本发明的核酸分子可被递送到靶组织。
术语“裸露的核酸”或“裸露的dsRNA”或“裸露的siRNA”是指不需要任何递送媒介物的核酸分子，所述递送媒介物发挥作用以帮助、促进或促使进入细胞，包括病毒序列、病毒颗粒、脂质体制剂、lipofectin或沉淀剂及类似物。例如，PBS中的dsRNA是“裸露的dsRNA”。
核酸分子可适合用来单独地或与其他治疗组合地预防或CNS疾患(例如，神经变性的、眼部的、耳部的疾患)疾病、特质、病症和/或疾患，和/或与细胞或组织内RhoA的水平有关或将对其响应的任何其他特质、疾病、疾患或病症。
本文公开的核酸分子可直接与载体或稀释剂一起递送或施用，但是没有任何递送媒介物，所述递送媒介物发挥作用以帮助、促进或促使进入细胞，包括病毒载体、病毒颗粒、脂质体制剂、lipofectin或沉淀剂及类似物。
核酸分子可包括递送媒介物，包括用于向受治疗者施用的脂质体、载体和稀释剂及其盐，和/或可存在于药学上可接受的制剂中。在某些实施方式中，本发明的dsRNA分子在脂质体制剂和lipofectin制剂及其类似物中递送且可通过本领域技术人员熟知的方法制备。例如，在美国专利第5,593,972、5,589,466和5,580,859号中描述了这些方法，其被通过引用并入本文。
已研发出具体目的是增强和改善的对哺乳动物细胞的siRNA递送的递送系统(参见，例如，Shen等人，FEBS Let.2003，539：111-114；Xia等人，Nat.Biotech.2002，20：1006-1010；Reich等人，Mol.Vision2003，9：210-216；Sorensen等人，J.Mol.Biol.2003.327：761-766；Lewis等人，Nat.Gen.2002，32：107-108和Simeoni等人，NAR2003，31，11：2717-2724)。近来siRNA已被成功地用于抑制灵长类中的基因表达(参见例如，Tolentino等人，Retina24(4)：660)。
促进将核酸引入到期望的受治疗者中的多肽是本领域已知的，例如，诸如美国申请公布第20070155658号中描述的多肽(例如三聚氰胺衍生物例如2，4，6-三胍基三嗪和2，4，6-Tramidosarcocyl Melamine、聚精氨酸多肽和包括交替的谷氨酰胺和天冬酰胺残基的多肽)。
药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和媒介物以及植入载体通常指不与本发明的活性成分反应的惰性、无毒性的固体或液体填充剂、稀释剂或包封材料且其包括脂质体和微球。在本发明中有用的递送系统的实例包括美国专利第5,225,182、5,169,383、5,167,616、4,959,217、4,925,678、4,487,603、4,486,194、4,447,233、4,447,224、4,439,196、和4,475,196号。许多其他的这类植入装置、递送系统和模块是本领域技术人员熟知的。
用于递送核酸分子的方法被描述在Akhtar等人，Trends Cell Bio.，2：139(1992)；Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics，Akhtar编辑，(1995)，Maurer等人，Mol.Membr.Biol，16：129-140(1999)；Hofland和Huang，Handb.Exp.Pharmacol，137：165-192(1999)；以及Lee等人，ACS Symp.Ser.，752：184-192(2000)；美国专利第6,395,713、6,235,310、5,225,182、5,169,383、5,167,616、4,959217、4.925,678、4,487,603；和4,486,194号；以及Sullivan等人，PCT WO94/02595、PCT WO00/03683和PCT WO02/08754；以及美国专利申请公布第2003077829号中。这些操作说明可被用于递送几乎任何核酸分子。可通过本领域技术人员已知的各种方法来将核酸分子施用到细胞，所述方法包括但不限于包封在脂质体中，通过离子电渗疗法、或通过掺入到其他媒介物例如可生物降解的聚合物、水凝胶、环糊精(参见，例如Gonzalez等人，BioconjugateChem.，10：1068-1074(1999)；Wang等人，国际PCT公布第WO03/47518和WO03/46185号)、聚(乳酸-共-甘醇)酸(PLGA)和PLCA微球(参见例如美国专利第6,447,796号和美国申请公布第2002130430号)、可生物降解的纳米囊和生物粘合微球或通过蛋白质性载体(O’Hare和Normand，国际PCT公布第WO00/53722号)。可选择地，核酸/媒介物的组合可通过直接注射或通过使用输注泵局部地递送。无论是玻璃体内、皮下、经鼓膜、肌肉内还是皮内，本发明的核酸分子的直接注射可使用标准的针头和注射器方法学或通过无针技术例如在Corny等人，Clin.Cancer Res.，5：2330-2337(1999)和Barry等人，国际PCT公布号WO99/31262中描述的技术进行。本发明的分子可用作药剂。药剂防止、调节发病率或在一定程度上治疗或减轻受治疗者体内的某种疾病状态的症状(优选地所有症状)。在本发明的一个特定实施方式中，可选择局部和经皮制剂。
施用本发明的dsRNA或药物组合物并根据良好的医学实践给药，将单独的受治疗者的临床状况、待治疗的疾病、施用的部位和方法、施用的时间安排、患者年龄、性别、体重和医疗从业者已知的其他因素考虑在内。
在另一个实施方式中，所述施用包含局部(topical)或局部(local)施用例如通过滴眼剂、滴耳剂或软膏。在非限制性实例中，靶向RhoA的dsRNA化合物在治疗遭受神经视网膜损伤的受治疗者方面是有用的，其中通过局部递送(例如，滴眼剂、滴耳剂或软膏)对眼睛递送所述dsRNA化合物。在非限制性实例中，靶向RhoA的dsRNA化合物在治疗遭受视网膜神经节细胞(RGC)损失的受治疗者方面是有用的，其中通过局部递送(例如，滴眼剂、滴耳剂或软膏)对眼睛递送所述dsRNA化合物。在非限制性实例中，靶向RhoA的dsRNA化合物在治疗患青光眼的患者方面是有用的，其中通过局部递送(例如，滴眼剂、滴耳剂或软膏)对眼睛递送所述dsRNA化合物。
核酸分子可与包装在脂质体内的阳离子脂质络合，或以其他方式被递送到靶细胞或组织。可通过直接的皮肤应用、经皮应用或注射对活体外或体内的相关组织局部施用被或未被掺入到生物聚合物中的核酸或核酸复合物。本发明的核酸分子可包括本文在表I-IV中所示的序列。这些核酸分子的实例主要由表I-IV中提供的序列组成。
递送系统可包括包含聚(乙二醇)脂质的表面改性的脂质体(PEG-改性的或长期循环的脂质体或隐形脂质体)。这些制剂提供了用于增加药物在靶组织中的积累的方法。这类药物载体抵抗单核巨噬细胞系统(MPS或RES)的调理作用和清除作用，从而促成更长的血液循环时间和对所包封的药物的增强的组织暴露(Lasic等人Chem.Rev.1995，95，2601-2627；Ishiwata等人，Chem.Pharm.Bull.1995，43，1005-1011)。
核酸分子可与下列分子一起配制或与之复合：聚乙烯亚胺(例如，直链或支链的PEI)和/或聚乙烯亚胺衍生物，包括例如聚乙烯亚胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亚胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-三GAL)衍生物，接枝的PEI例如半乳糖PEI、胆固醇PEI、抗体衍生化的PEI及其聚乙二醇PEI(PEG-PEI)衍生物(参见例如Ogris等人，2001，AAPA PharmSci，3，1-11；Furgeson等人，2003，Bioconjugate Chem.，14，840-847；Kunath等人，2002，Pharmaceutical Research，19，810-817；Choi等人，2001，Bull.Korean Chem.Soc，22，46-52；Bettinger等人，1999，Bioconjugate Chem.，10，558-561；Peterson等人，2002，Bioconjugate Chem.，13，845-854；Erbacher等人，1999，Journalof Gene Medicine Preprint，1，1-18；Godbey等人，1999.，PNAS USA，96，5177-5181；Godbey等人，1999，Journal of Controlled Release，60，149-160；Diebold等人，1999，Journal of Biological Chemistry，274，19087-19094；Thomas和Klibanov，2002，PNASUSA，99，14640-14645；Sagara，美国专利第6,586,524号和美国专利申请公布第20030077829号)。
核酸分子可与膜破坏剂(membrane disruptive agent)，例如美国专利申请公布第20010007666号描述的膜破坏剂复合。一种或多种膜破坏剂和核酸分子还可与阳离子脂质或辅助型脂质分子，例如美国专利第6,235,310号中描述的那些脂质复合。
本文公开的核酸分子可被施用到中枢神经系统(CNS)或周围神经系统(PNS)。实验已经表明了神经元对核酸的有效的体内吸收。参见例如，Sommer等人，1998，AntisenseNuc.Acid Drug Dev.，8，75；Epa等人，2000，Antisense Nuc.Acid Drug Dev.，10，469；Broaddus等人，1998，J.Neurosurg.，88(4)，734；Karle等人，1997，Eur.J.Pharmocol.，340(2/3)，153；Bannai等人，1998，Brain Research，784(1，2)，304；Rajakumar等人，1997，Synapse，26(3)，199；Wu-pong等人，1999，BioPharm，12(1)，32；Bannai等人，1998，BrainRes.Protoc，3(1)，83；以及Simantov等人，1996，Neuroscience，74(1)，39。因此核酸分子可经受被递送到CNS和/或PNS中的细胞例如，神经元、巨噬细胞、白质轴突和内皮细胞并被所述细胞吸收。
通过各种不同的策略提供核酸分子对CNS的递送。可被使用的CNS递送的传统方法包括但不限于鞘内和脑室内的施用、导管和泵的植入、在损伤或病变部位直接注射或灌注、注射到脑动脉系统或通过化学开放或渗透开放血脑屏障。向CNS递送核酸分子的非侵入性方法也是已知的且可包括例如，鼻内、眼部(滴眼剂)或耳内(例如，滴耳剂)施用。还可使用侵入性和非侵入性施用方法的组合。其他方法可包括使用各种转运蛋白和载体系统，例如通过使用偶联物和可生物降解的聚合物。另外，例如，如Kaplitt等人，美国专利第6,180,613号和Davidson，WO04/013280中描述的，基因治疗方法可用来在CNS中表达核酸分子。
递送系统可包括例如，水凝胶和非水凝胶、膏剂、多重乳液、微乳液、脂质体、软膏、水溶液和非水溶液、洗液、气溶胶、烃基料(hydrocarbon base)和粉末，并且可以包含赋形剂例如增溶剂、渗透促进剂(例如，脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)和亲水性聚合物(如聚卡波非和聚乙烯吡咯烷酮)。在一个实施方式中，药学上可接受的载体是脂质体或经皮增进剂。
可与本发明的化合物一起使用的脂质体的非限制性实例包括下列：(1)CellFectin，1∶1.5(M/M)的阳离子脂质N，NI，NII，NIII-四甲基-N，NI，NII，NIII-四棕榈基-精胺和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)(GIBCOBRL)的脂质体制剂；(2)Cytofectin GSV，2∶1(M/M)的阳离子脂质和DOPE(Glen Research)的脂质体制剂；(3)DOTAP(N-[1-(2，3-二油酰氧基)-N，N，N-三-甲基-铵甲基硫酸酯)(Boehringer Manheim)；以及(4)Lipofectamine，3∶1(M/M)的聚阳离子脂质DOSPA、中性脂质DOPE(GIBCO BRL)和二烃基化的氨基酸(DiLA2)的脂质体制剂。
递送系统可包括贴片、片剂、栓剂、阴道栓、凝胶、水溶液和非水溶液、洗液和膏剂且可包含赋形剂例如增溶剂和增进剂(例如，丙二醇、胆汁盐和氨基酸)及其他媒介物(例如，聚乙二醇、甘油、脂肪酸酯及衍生物和亲水性聚合物例如羟丙基甲基纤维素和透明质酸)。
核酸分子可包括生物偶联物，例如，Vargeese等人，美国序列号10/427,160、美国专利第6,528,631号、美国专利第6,335,434号、美国专利第6,235,886号、美国专利第6,153,737号、美国专利第5,214,136号、美国专利第5,138,045号中描述的核酸偶联物。
本文公开的组合物、方法和药盒可包括表达载体，所述表达载体以允许核酸分子表达的方式包括编码本发明的至少一种核酸分子的核酸序列。将能够表达dsRNA链的核酸分子或一种或多种载体引入到细胞环境中的方法将取决于细胞的类型和其环境的组成。可将核酸分子或载体构建体直接引入到细胞内(即，细胞内地)；或通过细胞外引入到腔、间隙空间内，引入到生物体的血液循环中，通过口服引入，或可通过使生物体或细胞沐浴在包含dsRNA的溶液中而引入。细胞优选地是哺乳动物细胞，更优选地是人细胞。表达载体的核酸分子可包括有义区域和反义区域。反义区域可包括与编码RhoA的RNA或DNA序列互补的序列，而有义区域可包括与反义区域互补的序列。核酸分子可包括具有互补的有义区域和反义区域的两条不同的链。核酸分子可包括具有互补的有义区域和反义区域的单链。
与靶RNA分子相互作用并下调编码靶RNA分子的基因(例如，RHOAmRNA，SEQ ID NO：1)的核酸分子可由被插入到DNA或RNA载体中的转录单元表达。重组载体可以是DNA质粒或病毒载体。表达病毒载体的核酸分子可基于但不限于腺相关病毒、逆转录病毒、腺病毒或甲病毒构建。可如本文所述地递送能够表达核酸分子的重组载体并维持在靶细胞中。可选择地，可使用提供核酸分子的瞬时表达的病毒载体。如必要的话，这些载体可被重复施用。一旦表达，所述核酸分子结合基因并例如通过RNA干扰(RNAi)下调基因功能或表达。核酸分子表达载体的递送可以是全身的，例如通过静脉内或肌肉内施用、通过局部施用、通过施用到来自所述受治疗者的外植的靶细胞接下来重新引入到受治疗者，或通过将允许向期望的靶细胞引入的任何其他手段。
表达载体可以以允许核酸分子表达的方式包括编码本文公开的至少一种核酸分子的核酸序列。例如，所述载体可包含编码包括双链体的核酸分子的两条链的序列。所述载体还可包含编码单个核酸分子的序列，所述单个核酸分子自身互补且因此形成一个核酸分子。这些表达载体的非限制性实例被描述在Paul等人，2002，Nature Biotechnology，19，505；Miyagishi和Taira，2002，Nature Biotechnology，19，497；Lee等人，2002，NatureBiotechnology，19，500；以及Novina等人，2002，Nature Medicine，提前在线发表，doi:10.1038/nm725中。表达载体也可被包括在哺乳动物(例如，人)细胞中。
表达载体可包括编码可能相同或不同的两种或更多种核酸分子的核酸序列。表达载体可包括与由Genbank登记号NM_001664表示的核酸分子互补的核酸分子的序列，例如，表I、II、III和IV中所示的序列。
表达载体可编码核酸双链体的一条或两条链或自身杂交成一个核酸双链体的单条自身互补的链。编码核酸分子的核酸序列可以以允许所述核酸分子表达的方式被可操作连接(参见，例如在Paul等人，2002，Nature Biotechnology，19，505；Miyagishi和Taira，2002，Nature Biotechnology，19，497；Lee等人，2002，Nature Biotechnology，19，500；以及Novina等人，2002，Nature Medicine，提前在线发表doi:10.1038/nm725)。
表达载体可包括下列区域中的一个或多个：a)转录起始区域(例如，真核pol I、II或III起始区域)；b)转录终止区域(例如，真核pol I、II或III终止区域)；c)内含子以及d)编码所述核酸分子中的至少一种的核酸序列，其中所述序列以允许所述核酸分子的表达和/或递送的方式被可操作连接到所述起始区域和终止区域。所述载体可任选地包括被可操作连接到编码所述核酸分子的序列的5’侧或3’侧上的蛋白质的开放阅读框(ORF)；和/或内含子(间插序列)。
核酸分子序列的转录可由真核RNA聚合酶I(pol I)、RNA聚合酶II(polII)或RNA聚合酶III(pol III)的启动子驱动。来自pol II或pol III启动子的转录物以高水平表达在所有细胞中；在给定的细胞类型中的给定的polII启动子的水平取决于附近存在的基因调控序列(增强子、沉默子等)的性质。还使用原核RNA聚合酶启动子，只要原核RNA聚合酶在合适的细胞中表达(Elroy-Stein和Moss，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，6743-7；Gao和Huang1993，Nucleic Acids Res.，21，2867-72；Lieber等人，1993，Methods Enzymol，217，47-66；Zhou等人，1990，Mol.Cell.Biol，10，4529-37)。一些研究者已经表明由这些启动子表达的核酸分子可在哺乳动物细胞中发挥功能(例如，Kashani-Sabet等人，1992，Antisense Res.Dev.，2，3-15；Ojwang等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，10802-6；Chen等人，1992，Nucleic Acids Res.，20，4581-9；Yu等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，6340-4；L’Huillier等人，1992，EMBO J.，11，4411-8；Lisziewicz等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，90，8000-4；Thompson等人，1995，Nucleic Acids Res.，23，2259；Sullenger&Cech，1993，Science，262，1566)。更特别地，转录单元例如源自于编码U6小核(snRNA)、转移RNA(tRNA)和腺病毒VA RNA的基因的转录单元在细胞内产生高浓度的期望的RNA分子例如siNA方面是有用的(Thompson等人，见上文；Couture和Stinchcomb，1996，见上文；Noonberg等人，1994，Nucleic Acid Res.，22，2830；Noonberg等人，美国专利第5,624,803号；Good等人，1997，Gene Ther.，4，45；Beigelman等人，国际PCT公布号WO96/18736)。以上核酸转录单元可被整合到待被引入到哺乳动物细胞内的各种载体中，包括但不限于，质粒DNA载体、病毒DNA载体(例如，腺病毒或腺相关病毒载体)，或病毒RNA载体(例如，逆转录或甲病毒载体)(参见Couture和Stinchcomb，1996见上文)。
核酸分子可由真核启动子表达在细胞内(例如，Izant和Weintraub，1985，Science，229，345；McGarry和Lindquist，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA83，399；Scanlon等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，10591-5；Kashani-Sabet等人，1992，AntisenseRes.Dev.，2，3-15；Dropulic等人，1992，J.Virol，66，1432-41；Weerasinghe等人，1991，J.Virol，65，5531-4；Ojwang等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，10802-6；Chen等人，1992，Nucleic Acids Res.，20，4581-9；Sarver等人，1990Science，247，1222-1225；Thompson等人，1995，Nucleic Acids Res.，23，2259；Good等人，1997，GeneTherapy，4，45。本领域技术人员认识到任何核酸可由合适的DNA/RNA载体表达在真核细胞内。这些核酸的活性可通过经酶解性核酸(enzymatic nucleic acid)将其从初级转录物中释放出来而扩大(Draper等人，PCT WO93/23569，以及Sullivan等人，PCT WO94/02595；Ohkawa等人，1992，Nucleic Acids Symp.Ser.，27，15-6；Taira等人，1991，Nucleic Acids Res.，19，5125-30；Ventura等人，1993，Nucleic Acids Res.，21，3249-55；Chowrira等人，1994，J.Biol.Chem.，269，25856)。
被包装到病毒颗粒内的病毒构建体将完成表达构建体向细胞中的有效引入和由该表达构建体编码的dsRNA构建体的转录。
用于口服引入的方法包括直接混合RNA与生物体的食物，以及基因工程途径，其中用作食物的物质被构建成表达RNA，然后给予受影响的生物体。可采用物理方法向细胞引入核酸分子的溶液。引入核酸的物理方法包括注射包含该核酸分子的溶液，经被该核酸分子覆盖的颗粒轰击，将细胞或生物体浸在RNA的溶液中，或在该核酸分子的存在下对细胞膜电穿孔。
可使用本领域已知的用于向细胞中引入核酸的其他方法，例如化学物质介导的运输，例如磷酸钙及类似物。因此，可连同执行下列活性中的一种或多种的组分引入核酸分子：增强细胞对RNA的吸收，促进双链体链的退火，稳定退火后的链或以其他方式增加对靶基因的抑制/下调。
聚合物纳米囊或微胶囊有助于将胶囊化的或结合的dsRNA运输或释放到细胞中。其包括聚合和单体材料，尤其是包括聚氰基丙烯酸丁酯。已发表了对材料及制造方法的归纳(参见，Kreuter，1991)。在聚合/纳米颗粒产生步骤中由单体和/或寡聚前体形成的聚合物材料本身是现有技术中已知的，聚合物材料的分子量和分子量分布也一样是现有技术中已知的，制造纳米颗粒领域内的技术人员可根据常规技术适当地选择的聚合物材料的分子量和分子量分布。
核酸分子可被制造成微乳液。微乳液是水、油和两亲物质的体系，该体系是单一的光学各向同性且热动力学上稳定的液体溶液。通常微乳液通过先将油分散在含水的表面活性剂溶液中且然后加入足量的第4种组分，通常是中等链长度的醇以形成透明体系。
可用于制备微乳液的表面活性剂包括但不限于单独的或与辅助表面活性剂组合的离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、Brij96、聚氧乙烯油基醚、聚甘油脂肪酸酯、四甘油单月桂酸酯(ML310)、四甘油单油酸酯(MO310)、六甘油单油酸酯(PO310)、六甘油五油酸酯(PO500)、十甘油单癸酸酯(MCA750)、十甘油单油酸酯(MO750)、十甘油倍半油酸酯(decaglycerol sequioleate)(SO750)、十甘油十油酸酯(DA0750)。通常是短链醇例如乙醇、1-丙醇和1-丁醇的辅助表面活性剂用来通过向表面膜中渗透并从而由于表面活性剂分子之间产生的空的空间来产生无序的膜来增加界面流动性。
递送制剂可包括水溶性可降解的交联聚合物，所述交联聚合物包括一种或多种可降解的交联的脂质部分、一个或多个PEI部分和/或一个或多个mPEG(PEG的甲基醚衍生物(甲氧基聚(乙二醇))。
剂量
如本领域技术人员将易于明白的，待施用的有用剂量和施用的具体方式将随以下因素如细胞类型，或对于体内使用，随年龄、重量和具体的动物和其待治疗的区域、具体的核酸分子和所使用的递送方法、所设想的治疗或诊断用途以及制剂的形态，例如悬浮液、乳液、胶束或脂质体而变化。通常，剂量以较低的水平施用并增加直到实现期望的作用。
因此通过如本领域已知的这些考虑因素确定用于本文的目的的“治疗有效剂量”。剂量必须有效地实现改进，包括但不限于提高的存活率或更快的恢复，或症状和如本领域技术人员选择作为合适的措施的其他指标的改善或消除。
可引入适量的核酸分子且这些量可根据经验使用标准方法确定。单个核酸分子种类在细胞环境中的有效浓度可以是约1飞摩尔、约50飞摩尔、100飞摩尔、1皮摩尔、1.5皮摩尔、2.5皮摩尔、5皮摩尔、10皮摩尔、25皮摩尔、50皮摩尔、100皮摩尔、500皮摩尔、1纳摩尔、2.5纳摩尔、5纳摩尔、10纳摩尔、25纳摩尔、50纳摩尔、100纳摩尔、500纳摩尔、1微摩尔、2.5微摩尔、5微摩尔、10微摩尔、100微摩尔或更多。
一般地，在单一剂量、每天用药一次或每天两次或三次或更多次持续1-4周或更长的时间的方案中，核酸化合物对于人的有效剂量在每天1ng/kg至约20-100毫克每千克(mg/kg)接受者体重，优选每天约0.01mg至约2-10mg/kg接受者体重的范围内。核酸分子的合适剂量单位可以在每天0.001至0.25毫克每千克接受者体重的范围内，或在每天0.01至20微克每千克体重的范围内，或在每天0.01至10微克每千克体重的范围内，或在每天0.10至5微克每千克体重的范围内，或在0.1至2.5微克每千克体重每天的范围内。剂量可以是0.01ug至1g每kg体重(例如，0.1ug、0.25ug、0.5ug、0.75ug、1ug、2.5ug、5ug、10ug、25ug、50ug、100ug、250ug、500ug、1mg、2.5mg、5mg、10mg、25mg、50mg、100mg、250mg、或500mg每kg体重)。
每天从约0.1mg至约140mg每千克体重量级的剂量水平在以上提到的病症的治疗中是有用的(每个受治疗者每天约0.5mg至约7g)。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量根据所治疗的主体和具体的施用方式变化。剂量单位形式通常包含约1mg至约500mg之间的活性成分。
应理解对于任何特定受治疗者的特定剂量水平取决于多种因素，包括所采用的特定化合物的活性、年龄、体重、总的健康状况、性别、饮食、施用时间、施用途径和排泄率、药物组合和进行治疗的具体疾病的严重度。
本发明的化合物可通过任何一种常规的施用途径施用。应注意该化合物可以以化合物或以药学上可接受的盐施用且可单独施用或作为与药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和媒介物组合的活性成分施用。这些化合物可经口服、皮下或肠胃外，包括静脉内、动脉内、肌肉内、腹膜内、鼻内、眼部和/或耳部施用以及鞘内和灌注技术施用。这些化合物的植入物也是有用的。可制备用于注射的液体形式，该术语包括皮下、经皮肤、静脉内、肌肉内、鞘内、经鼓膜注射和其他肠胃外施用途径。液体组合物包括含和不含有机共溶剂的水溶液，含水悬浮液或油悬浮液、具有可食用油的乳液，以及相似的药学媒介物。在一个实施方式中，所述施用包括静脉内施用。在优选的实施方式中，所述施用包括局部施用，特别是对耳道的局部施用，对鼓膜的局部施用，对眼睛的局部施用或其组合。在某些实施方式中，本申请的化合物以滴耳剂被应用到鼓膜。在某些实施方式中，本申请的化合物以滴眼剂被应用到眼睛。在某些优选的实施方式中，通过鼓膜注射或通过滴耳剂施用本文公开的dsRNA分子。在其他实施方式中，通过硬脑膜外或鞘内施用来施用本文公开的dsRNA分子。
包括本文公开的核酸分子的药物组合物可一天一次(QD)、一天两次(bid)、一天三次(tid)、一天四次(qid)或以任何间隔并持续医学上合适的任何时间地施用。然而，治疗剂还可以以包含贯穿整天以合适的间隔施用的二、三、四、五、六或更多个亚剂量的剂量单位给药。在那种情况下，每个亚剂量中包含的核酸分子可相应地更少以达到总的日剂量单位。还可例如使用在几天时间内提供dsRNA的持续且始终如一的释放的常规缓释制剂将剂量单位混合成几天之内的单一剂量。缓释制剂是本领域熟知的。剂量单位可包含相应的多个日剂量。可以以如下方式混合组合物：使得多个单位的核酸的总和一起包含足够的剂量。
药物组合物、药盒和容器
还提供了包括本文提供的用于下调RhoA的表达核酸分子(例如siNA分子)的组合物、药盒、容器和制剂以对患者施用或分配该核酸分子。药盒可包括至少一个容器和至少一个标签。合适的容器包括例如瓶、小管、注射器和试管。这些容器可由各种材料例如玻璃、金属或塑料形成。该容器可容纳氨基酸序列、小分子、核酸序列、细胞群和/或抗体和/或相关的实验、预后、诊断、预防和治疗目的所需要的任何其他组分。对这些用途的标示和/或指导可包括在该容器上或附带于该容器，用于这些目的的试剂和其他组分或工具也一样。
可选择地，该容器可容纳对治疗、诊断、预后或预防某种病症有效的组合物，且可具有灭菌进入孔(例如，容器可以是具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的静脉注射用溶液袋或小管)。组合物中的活性剂可以是能够特异性地结合RHOAmRNA和/或下调RhoA的功能的核酸分子。
药盒还可包括第二容器，所述第二容器包括药学上可接受的缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和/或葡萄糖溶液。从商业和使用者的立场，其还可包括所需要的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、搅拌器、针头、注射器和/或带有用途标示和/或说明的包装插入物。
联邦法律要求药物组合物在对人的治疗中的使用必须得到联邦政府的机构许可。在美国，执行是食品和药品管理局的责任，食品和药品管理局发布用于保证此类许可的安全性的21U.S.C.§301-392中详述的合适的规定。根据42U.S.C.§262提供了用于生物材料包括由动物组织制成的产品的规定。类似的许可是大多数外国国家所要求的。规定因国家而异，但是具体的程序是本领域人员熟知的且本文提供的组合物和方法优选相应地遵守。
本文公开的核酸分子可用来单独地或与其他治疗组合地治疗与RhoA有关的疾病、病症或疾患，例如诸如CNS、PNS、前庭感觉系统、视觉系统和/或循环(血管、动脉)系统的疾病、损伤、病症或病理学以及与细胞或组织内RhoA的水平有关或将对其响应的任何其他疾病或病症(例如，与异常和/或受破坏的细胞运动性、细胞骨架调控和/或微管组织有关的疾病或疾患)。这样一来，本文公开的组合物、药盒和方法可包括包装本文公开的核酸分子，该包装包括标签或包装插入物。所述标签可包括对核酸分子的用途例如对治疗或预防中枢神经系统(CNS)、周围神经系统(PNS)、眼部系统、循环(血管、动脉)系统或前庭系统的疾病、疾患、损伤和病症，包括但不限于脊髓损伤(SCI)、青光眼、NAION、阿尔茨海默病、梅尼尔病和本文公开的任何其他疾病或病症的用途的标示。标签可包括对核酸分子的用途例如对治疗或预防神经元变性的衰减的用途的标示。神经元变性包括例如，视神经和视网膜包括视网膜神经节细胞的变性；听觉神经(也称为前庭蜗神经或听神经并负责将声音和平衡信息从内耳传输到脑)的变性；经由听觉神经将信息传输到脑的内耳的毛细胞的变性，所述听神经由耳蜗神经和前庭神经组成，且从延髓出现并通过颞骨中的内部听道(或内耳道)与面神经一起进入内部头骨。标签可包括对核酸分子的用途例如对治疗或预防恶性肿瘤或癌症的用途的标示。标签可包括对核酸分子的用途例如对单独地或与其他治疗组合地治疗或预防与细胞或组织内RhoA的水平有关或将对其响应的任何其他疾病或病症的用途的标示。标签可包括对减少和/或下调RhoA表达的用途的标示。“包装插入物”用来指习惯上被包括在治疗产品的商业包装内的说明书，说明书包含关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症、待与所包装的产品组合的其他治疗产品，和/或关于使用该治疗产品的警告等的信息。
本领域技术人员将认识到本领域已知的其他治疗、药物和疗法可与本文的核酸分子(例如，dsNA分子)容易地组合并因此被本文设想到。
治疗方法
另一方面，本发明涉及用于治疗需要对与RhoA的异常表达有关的疾病或疾患的治疗的受治疗者的方法，包括对所述治疗者施用减少或抑制RhoA的表达的量的抑制剂。
RhoA是参与细胞骨架调控且因此参与同细胞骨架重构有关的所有过程，包括例如细胞运动性、侵入、增殖的GTP酶。其与神经变性的相关性直接来源于这些性质。
在一个实施方式中，核酸分子可用来下调或抑制来自于与疾病或病症(例如，神经变性)有关的RhoA和/或RhoA单体型多态性的RhoA和/或RhoA蛋白质的表达。对RhoA和/或RhoA基因或RhoA和/或RhoA蛋白质或RNA水平的分析可用来确定具有这些多态性的受治疗者或处于形成本文描述的特质、病症或疾病的风险之下的那些受治疗者。这些受治疗者应经受治疗，例如，用本文公开的核酸分子和在治疗与RhoA和/或RhoA基因表达有关的疾病方面有用的任何其他组合物治疗。这样一来，对RhoA和/或RhoA蛋白质或RNA水平的分析可用来确定治疗受治疗者时的治疗类型和治疗进程。对RhoA和/或RhoA蛋白质或RNA水平的监测可用来预测治疗结果和确定调节与特质、病症或疾病有关的某些RhoA和/或RhoA蛋白质的水平和/或活性的化合物和组合物的功效。
提供了用于通过使用本文提供的能够下调RhoA基因表达或能够介导针对RhoA基因表达的RNA干扰的小核酸分子来抑制RhoA表达的组合物和方法，所述小核酸分子例如短干扰核酸(siNA)、干扰RNA(RNAi)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)和短发夹RNA(shRNA)分子。本文公开的组合物和方法在治疗各种病症或疾病，诸如例如，CNS、PNS和前庭感觉系统的疾患、疾病和损伤、眼部疾患、梅尼尔病和疼痛方面也是有用的。
本文公开的核酸分子可单独地或与其他药物组合或联合地使用以预防或治疗与RhoA有关的疾病、特质、病症和/或疾患，例如本文描述的疾病、疾患和损伤。
本文公开的核酸分子能够以序列特异性的方式下调RhoA的表达。核酸分子可包括有义链和反义链，所述有义链和反义链包括与RhoA mRNA的一部分至少部分地互补(反义)的连续的核苷酸。
在某些实施方式中，RhoA特异性的dsRNA可与有助于神经保护和/或神经再生和/或神经发生的其他治疗剂和/或对其他分子靶特异的dsRNA联合使用，例如，但不限于神经类固醇(例如，孕酮、孕烯醇酮)、抗焦虑药物(例如，Etifoxin)、生长因子、神经营养因子(例如，CNTF)、降低眼内压(IOP)的药物(例如，拉坦前列素())、干细胞。
神经变性、神经学、肿瘤学和脑血管疾患可使用本文公开的核酸分子通过RNA干扰治疗。示例性的神经变性疾患包括阿尔茨海默病、帕金森病、脊髓损伤和眼部神经变性疾患。本文公开的核酸分子可以以序列特异性的方式下调RhoA的表达。
用于治疗或预防受治疗者或生物体内的RhoA相关疾病或病症的方法可包括使所述受治疗者或生物体与如本文提供的核酸分子在适合下调所述RhoA基因在所述受治疗者或生物体内的表达的条件下接触。
用于治疗或预防与受治疗者或生物体内的神经变性的方法可包括使所述受治疗者或生物体与核酸分子在适合下调所述RhoA基因在所述受治疗者或生物体内的表达的条件下接触。
用于治疗或预防与受治疗者或生物体内的选自由阿尔茨海默病(AD)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、帕金森病(PD)、共济失调-毛细管扩张(AT)、中风后痴呆(PSD)、眼部神经变性疾病和/或听觉神经变性疾病组成的组的神经变性疾患的方法可包括使所述受治疗者或生物体与核酸分子在适合下调所述RhoA基因在所述受治疗者或生物体内的表达的条件下接触。
用于治疗或预防受治疗者或生物体内的选自由脊髓损伤(SCI)、脑损伤、神经疾患、中风和帕金森症组成的组的中枢神经系统的损伤的方法可包括使所述受治疗者或生物体与核酸分子在适合下调所述RhoA基因在所述受治疗者或生物体内的表达的条件下接触。
用于治疗或预防受治疗者或生物体内的选自由眼缺血病症，例如前部缺血性视神经病变组成的组的脑血管疾患的方法可包括使所述受治疗者或生物体与核酸分子在适合下调所述RhoA基因在所述受治疗者或生物体内的表达的条件下接触。
用于治疗或预防受治疗者或生物体内的神经病变的方法可包括使所述受治疗者或生物体与核酸分子在适合下调所述RhoA基因在所述受治疗者或生物体内的表达的条件下接触。
用于治疗或预防受治疗者体内的选自由自主神经病变、癌症相关的神经病变、压迫性神经病变、糖尿病性神经病变、药物引起的神经病变、毒性神经病变、化疗引起的神经病变、胃肠神经病变、营养相关的神经病变、遗传性神经病变、免疫介导的神经病变和长期免疫介导的多发性神经病变、传染性神经病变和神经性疼痛组成的组的神经病变的方法可包括使所述受治疗者或生物体与核酸分子在适合下调所述RhoA基因在所述受治疗者或生物体内的表达的条件下接触。在某些实施方式中，本发明提供了治疗患糖尿病性神经病变的受治疗者的方法。在某些实施方式中，受治疗者罹患触摸痛。
用于促进受治疗者或生物体内的神经再生的方法可包括使所述受治疗者或生物体与核酸分子在适合下调所述RhoA基因在所述受治疗者或生物体内的表达的条件下接触。
用于为受治疗者或生物体提供神经保护的方法可包括使所述受治疗者或生物体与核酸分子在适合下调所述RhoA基因在所述受治疗者或生物体内的表达的条件下接触。
用于为处于神经病变的风险之下或患所述神经病变的受治疗者或生物体提供神经保护的方法可包括使所述受治疗者或生物体与核酸分子在适合下调所述RhoA基因在所述受治疗者或生物体内的表达的条件下接触，所述神经病变选自由自主神经病变、癌症相关的神经病变、压迫性神经病变、糖尿病性神经病变、药物引起的神经病变、毒性神经病变、化疗引起的神经病变、胃肠神经病变、营养相关的神经病变、遗传性神经病变、免疫介导的神经病变、传染病介导的神经病变、神经性疼痛和触摸痛组成的组。
用于为罹患神经损伤或神经变性疾病的受治疗者或生物体提供神经保护的方法可包括使所述受治疗者或生物体与核酸分子在适合下调所述RhoA基因在所述受治疗者或生物体内的表达的条件下接触。
用于治疗或预防受治疗者或生物体内的与异常和/或被破坏的细胞运动性、细胞骨架调节和/或微管组织有关的疾病或疾患的方法可包括使所述受治疗者或生物体与核酸分子在适合下调所述RhoA基因在所述受治疗者或生物体内的表达的条件下接触。
用于治疗或预防受治疗者或生物体内的血管生成性疾患、血管疾病和/或动脉疾病的方法可包括使所述受治疗者或生物体与核酸分子在适合下调所述RhoA基因在所述受治疗者或生物体内的表达的条件下接触。
用于治疗或预防受治疗者或生物体内的眼血管生成性疾病或疾患的方法可包括使所述受治疗者或生物体与核酸分子在适合下调所述RhoA基因在所述受治疗者或生物体内的表达的条件下接触。
用于治疗或预防选自由角膜血管生成性疾病或疾患、视网膜血管生成性疾病或疾患、脉络膜血管生成性疾病或疾患或其组合组成的组的眼血管生成性疾病或疾患的方法可包括使受治疗者或生物体与核酸分子在适合下调所述RhoA基因在所述受治疗者或生物体内的表达的条件下接触。
用于治疗或预防受治疗者或生物体内的视网膜病的方法可包括使所述受治疗者或生物体与核酸分子在适合下调所述RhoA基因在所述受治疗者或生物体内的表达的条件下接触。
用于治疗或预防受治疗者或生物体内的糖尿病性视网膜病的方法可包括使所述受治疗者或生物体与核酸分子在适合下调所述RhoA基因在所述受治疗者或生物体内的表达的条件下接触。
用于治疗或预防角膜移植受治疗者或生物体内的角膜移植排斥的方法可包括使所述受治疗者或生物体与核酸分子在适合下调所述RhoA基因在所述受治疗者或生物体内的表达的条件下接触。
用于治疗或预防受治疗者或生物体内的再狭窄的方法可包括使所述受治疗者或生物体与核酸分子在适合下调所述RhoA基因在所述受治疗者或生物体内的表达的条件下接触。
用于治疗或预防受治疗者或生物体内的癌症或恶性肿瘤或癌或肿瘤发生的方法可包括使所述受治疗者或生物体与核酸分子在适合下调所述RhoA基因在所述受治疗者或生物体内的表达的条件下接触。
在优选的实施方式中，待治疗的受治疗者是温血动物且特别地，是包括人的哺乳动物。
本发明的方法包括对受治疗者以治疗有效的剂量施用下调RhoA表达的一种或多种抑制性化合物；且特别是siRNA以由此有效地治疗所述受治疗者。
术语“治疗”指治疗性治疗和预防性(prophyactic)或预防性(preventative)措施，其中目的是防止或放慢(减小)如上列出的相关疾患。需要治疗的受治疗者包括已经历所述疾病或病症的受治疗者、易于患所述疾病或病症的受治疗者以及待预防疾病或病症的受治疗者。本发明的化合物可在所述疾病或病症或与其有关的症状发作之前、发作期间或发作之后施用。在其中治疗用于预防目的的情形中，本发明涉及用于延迟所述疾病或疾患的发作或避免所述疾病或疾患的形成的方法。
本发明涉及下调RhoA的表达的化合物，特别是新型双链RNA化合物(dsRNA)在治疗其中下调RhoA的表达是有益的疾病或病症中的用途。
本文详细地讨论了下调RhoA的方法、分子和组合物，且所述分子和/或组合物中的任何一种可被有益地用于治疗患任何一种所述病症的受治疗者。在制备针对RhoA的siRNA中有用的优选的寡聚物序列列出在表I、II、III或IV中。
本文描述了其中本发明的化合物用作治疗剂的某些适应症的细节。
下文参考实施例详细地阐述了本发明，但不应解释为本发明局限于此。
本文对任何文献的引述并非旨在承认该文献是对于本申请的任何权利要求的可专利性的相关的现有技术、或考虑材料。关于任何文献的内容或日期的任何陈述基于在递交的时候对于申请人来讲可获得的信息且并不构成对关于该陈述的正确性的承认。
实施例
分子生物学中的常规方法
本领域中已知且未专门描述的标准分子生物学技术一般遵循如在Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork(1989)，以及如在Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)，以及如在Perbal，A Practical Guide toMolecular Cloning，John Wiley&Sons，New York(1988)，以及如在Watson等人，Recombinant DNA，Scientific American Books，New York，以及在Birren等人(编辑)Genome Analysis：A Laboratory Manual Series，第1-4卷Cold Spring HarborLaboratory Press，New York(1998)中的以及如在美国专利4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中列出并通过引用并入本文的方法学。通常按照PCRProtocols：A Guide To Methods And Applications，Academic Press，San Diego，CA(1990)进行聚合酶链式反应(PCR)。可使用与流式细胞术组合的原位(细胞内)PCR检测包含特异性DNA和mRNA序列的细胞(Testoni等人，1996，Blood87：3822)。进行RT-PCR的方法也是本领域熟知的。
实施例1：对RhoA有活性的dsRNA化合物的序列的产生和所述dsRNA化合物的制备
使用专有算法(proprietary algorithm)和人RhoA mRNA(SEQ ID NO：1)的序列，产生了许多潜在的dsRNA化合物的序列。使用该方法所产生的序列与相应的人类RhoA mRNA序列完全互补(表I的“18mer”，表III和IV的“19mer”)，或包括反义链的5’末端核苷酸与靶mRNA之间的错配(表II，“18+1-mer”)。选择使用专有算法通过生物信息学预测针对人RhoAmRNA，以及包括大鼠、小鼠、猕猴和/或黑猩猩的至少一个或多个物种的RhoA mRNA最有效的候选dsRNA化合物。
人RhoA mRNA的多核苷酸序列被鉴定为NCBI参考序列：NM_001664.2，并被列出在SEQ ID NO：1中。RhoA mRNA编码SEQ ID NO：2列出的、鉴定为NCBI参考序列：NP_001655.1的多肽。在表中列出了每条有义和反义寡核苷酸的SEQ ID NO.。在本文的表中，使用了下列缩写：“X＝-物种”是指与其他动物：Rt-大鼠、Rh-猕猴、Ms-小鼠、Cp-黑猩猩的跨物种同一性。ORF：开放阅读框。19-mer和18+1-mer分别指长度为19和18+1(U在反义链的第1位，A在有义链的第19位)核糖核酸的寡聚物。
每个所选择的序列对(双链体)作为具有3’末端二核苷酸dTdT突出端的19mer双链体(_S709化合物)被检测。
表I：18-mer寡核苷酸对
表II：18+1-mer寡核苷酸对
表III：19-mer寡核苷酸对
表IV提供了在产生化学修饰的dsRNA分子方面有用的寡核苷酸对。转让给本申请的受让人的WO2009/044392中公开了这些寡核苷酸对。
表IV：
表V提供了用于对比性活性研究的寡核苷酸对。
表V：
合成了这些RhoA dsRNA(dsRhoA)分子，以及之前已经被鉴定并与至少人和大鼠物种相容的有活性的dsRhoA化合物，并使用在人细胞系中的剩余RhoA mRNA水平的qPCR分析筛选其体外RNAi活性。在大鼠细胞系内重新测试在＝＜5nM浓度时产生至少85％敲减的dsRNA化合物(在5mM下，＜15％的剩余mRNA)并进行进一步的优化。所选择的候选dsRNA分子通过并入提供核酸酶抗性、在保留或增加在靶活性的同时减少离靶活性以及减少促炎性反应的化学修饰来优化。评价了不同类型的化学修饰和dsRNA序列。图1中示出了所合成的化学修饰的dsRNA。合成这些修饰的dsRNA化合物并在细胞培养物中筛选其RNAi活性。相对于亲本分子具有相似或提高的活性的化合物进入进一步表征。首先，在人血浆、人血清、CSF(脑脊液)和/或细胞裂解物中评估dsRNA化合物的核酸酶抗性。在血浆、血清、CSF或细胞裂解物中显示出至少10小时的稳定性的dsRNA化合物进入离靶测定，对于所述离靶测定，使用psiCHECKTM(Promega)萤光素酶报告系统。在细胞培养物中分析RNAi介导的对萤光素酶表达的抑制。
使用以下三种不同的体外方法测试dsRNA化合物对先天性免疫的潜在激活：(a)评估TLR/RIG-I/Mda5-依赖性的萤光素酶报告分子的dsRNA激活；(b)评估dsRNA处理的人外周血单核细胞(PBMC)中的细胞因子产生；(c)通过分析干扰素(IFN)-应答基因在dsRNA处理过的人PBMC中的表达来评估对IFN应答的激活。这些方法是本领域技术人员所熟悉且容易进行的。
对照组的体外测试
对照组包括具有19-mer双链体和共价连接在有义链和反义链的3’末端的二核苷酸dTdT的dsRNA化合物。对照化合物被命名为RHOA_X_S709。
将约2×105个内源性表达RhoA基因的人PC3细胞接种在1.5mL生长培养基中以在24小时后达到30-50％的汇合。用dsRNALipofectamineTM2000试剂以达到每个被转染的细胞0.3-5nM的终浓度转染细胞。在37±1℃，5％二氧化碳下孵育细胞48小时。Cy3-标记的dsRNA双链体用作转染效率的阳性对照。仅用LipofectamineTM2000试剂处理的细胞用作敲减活性的阴性对照。收集dsRNA转染的细胞并使用EZ-RNATM试剂盒[Biological Industries(#20-410-100)]分离RNA。使用该操作说明测试的dsRNA化合物包括表I、II、III和V中列出的对。以下在表A中提供对于未修饰的18+A双链体的活性数据。18+A指19个碱基对的双链体，其中具有位置1-18[(N’)y]处的与靶mRNA的完全匹配和位置19处的A(N2，腺苷)的寡核苷酸(N’)y-N2与互补寡核苷酸(N)x-N1形成双链体。这些化合物未修饰且被合成为具有3’dTdT突出端以用于测试体外活性。表A和表B中的活性结果被提供为以5nM、0.5nM和0.1nM的浓度应用dsRNA后的％剩余靶。
表A-包括两条链中未修饰的核糖核苷酸以及有义链和反义链的3’末端处的dTdT二核苷酸突出端的18+1mer dsRNA的敲减活性结果(％剩余mRNA)
表B-包括两条链中未修饰的核糖核苷酸和两条链的3’末端处的dTdT二核苷酸突出端的19mer dsRNA的敲减活性结果(％剩余mRNA)
表C中示出了与对照分子(78-84)相比某些优选分子(48、50、58)的活性。
表C
剩余％ 剩余％ 剩余％ 剩余％
20nM 5nM 1.25nM 0.3125nM
RHOA_48_S709 11 13 30 25
RHOA_50_S709 16 21
RHOA_58_S709 10 10 18 21
RHOA_78_S709
RHOA_79_S709 26 23 39 61
RHOA_80_S709 20 22 58
RHOA_81_S709 47 62 74 60
RHOA_82_S709 23 44 77 81
RHOA_83_S709 42 63 66 62
RHOA_84_S709
图1中提供了化学修饰的dsRNA分子和活性(敲减)特征。修饰的图例如下：前缀“z”表示共价连接到3’或5’末端核苷酸的部分(核苷酸或非核苷酸)。例如zdT表示dT突出端；zdT；zdT表示dTdT突出端。前缀“y”表示核苷酸置换，例如yLdA指用L-脱氧核糖腺嘌呤置换有义链或反义链中的核糖核苷酸；且yrU指用尿苷置换有义或反义寡聚核苷酸中的另一个核糖核苷酸。前缀“m”是指2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。下文在表D中列出了另外的代码。
表D-化学修饰的dsRNA分子的图例
RhoA核酸化合物的体外测试
细胞系：使人前列腺腺癌PC3细胞(ATCC，Cat#CRL-1435)在补充有10％FBS和2mML-谷氨酰胺的RPMI培养基中生长，并将人上皮宫颈癌HeLa细胞(ATCC，Cat#CCL-2)保持在补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中。将细胞保持在37℃下的5％CO2中。
将约2×105个内源性表达RhoA基因的人PC-3细胞接种在1.5mL的生长培养基中以在24小时后达到30-50％的汇合。用dsRNA和LipofectamineTM2000试剂以达到每个转染的细胞0.1-5nM的终浓度转染细胞。在37±1℃、5％CO2下孵育细胞48小时。Cy3-标记的dsRNA双链体用作转染效率的阳性对照。用LipofectamineTM2000试剂处理的细胞用作siRNA活性的阴性对照。收集dsRNA转染的细胞并使用EZ-RNATM试剂盒[Biological Industries(#20-410-100)]分离RNA。
通过来自细胞的靶mRNA的qPCR分析确定每种被测试的dsRNA双链体对靶基因表达的抑制的百分比。通过合成来自细胞的cDNA并通过实时qPCR确定靶基因mRNA水平来进行反转录。对于每个样品将所测量的细胞mRNA水平标准化为亲环蛋白A(CYNA，PPIA)mRNA水平。基于dsRNA处理的样品对未转染的对照样品中的靶基因mRNA量的比确定敲减活性。
通过来自细胞的靶mRNA的qPCR分析确定每种被测试的dsRNA双链体对靶基因表达的抑制的百分比。通过合成来自细胞的cDNA并通过实时qPCR确定靶基因mRNA水平来进行反转录。对于每个样品将所测量的细胞mRNA水平标准化为亲环蛋白A(CYNA，PPIA)mRNA水平。基于dsRNA处理的样品对未转染的对照样品中的靶基因mRNA量的比确定敲减活性。
RhoA dsRNA的核酸酶稳定性的表征
如下确定dsRNA RhoA化合物的内切核酸酶和外切核酸酶稳定性
(1)人血浆和/或人脑脊液(CSF)(内切核酸酶的稳定性)
通过非变性凝胶的溴化乙锭(EthBr)染色评估dsRNA完整性
通过序列特异性探针与从变性凝胶获得的RNA印迹的杂交评估双链体中每条dsRNA链的稳定性
(2)人HCT116提取物(外切核酸酶的稳定性)
通过序列特异性探针与从变性凝胶获得的RNA印迹的杂交评估双链体中每条dsRNA链的稳定性。
(3)血浆中的稳定性(内切核酸酶抗性)
将RhoA dsRNA化合物孵育在37℃下的完全人血浆或CSF中最多24小时。在孵育的第1、3、6、12和24小时，收集3μL小份并速冻在液氮中。通过(1)穿过非变性的15％非变性聚丙烯酰胺凝胶的(PAGE)电泳(～40ng/泳道)，随后溴化乙锭(EthBr)染色(仅人血浆样品)并通过(2)穿过变性8M尿素的8％PAGE的电泳(1ng/泳道)(在甲酰胺中1∶87稀释)，随后电印迹到尼龙膜(Hybond-XL)并与用于检测dsRNA双链体的有义或反义链的放射性标记的寡核苷酸探针杂交，来分析dsRNA完整性。将40ng或1ng的dsRNA溶解在5μL PBS中并分别上样到非变性或变性的PAGE中，用作完整的未经处理的dsRNA分子的迁移参考。未修饰的dsRNA对应物，即具有与所有未修饰的核糖核苷酸相同的核苷酸序列的dsRNA化合物用作内切核酸酶稳定性的阴性对照。
在人HCT116细胞溶质提取物中的稳定性(外切核酸酶抗性)：通过在37℃下孵育持续不同的时间间隔(1，3，6，12或24小时)在人HCT116的细胞溶质提取物中评估dsRNA RhoA化合物的外切核酸酶抗性。通过穿过变性凝胶(PAGE)的电泳、印迹和随后与放射性标记的链特异性探针(检测dsRNA化合物双链体的有义或反义链的寡核苷酸探针)的杂交分析不同孵育时间后dsRNA完整性。
本文在以下表E、F和G中示出了所测试的化合物的稳定性结果。稳定性数据被呈现为小时，即24表示24小时。一些优选的分子在血浆和或血清中稳定多于3小时。
表E示出了对照化合物(RHOA_48、50和58(S709))和基于RHOA48以及RHOA_48u的化学修饰的dsRNA的稳定性。
表E
表F示出了基于RHOA_50的化学修饰的dsRNA的稳定性数据。
表F
表G示出了基于RHOA_58的化学修饰的dsRNA的稳定性数据。
表G
RhoA化合物的在靶与离靶敲减活性的评估
在人HeLa细胞中的活性：使用“在靶”psi-CHECK测试(分析含有针对dsRNA化合物的引导链的相应的匹配的互补靶序列的萤光素酶报告质粒构建体的活性)在人HeLa细胞中测试dsRNA RhoA化合物(相比未修饰的对应物)的敲减效率。以从4pM到100nM的5个浓度转染每种dsRNA。Lipofectamine暴露的细胞用作阴性对照。
离靶活性：在psi-CHECK质粒报告系统(PromegaTM)中分析dsRNARHOA化合物的潜在的种子介导的离靶效应。这个系统使得能够评估下列的内在潜能(intrinsic potency)：
引导链(GS)-对完全匹配序列的“在靶”活性；
引导链的种子区域-“离靶”miRNA样活性；
过客链(PS)-由过客链竞争性地加载到RISC(PS-CM)中引起的“离靶”效应。
将所有靶序列插入到萤光素酶报告基因构建体的3’-UTR中并将siRNA活性确定为dsRNA转染后萤光素酶报告分子发光的特异性减少。对于每个候选的dsRNA一级序列制备四个基于psiCHECKTM-2的构建体。psiCHECK构建体包含单拷贝的匹配的互补引导链(GS-CM)或过客链(PS-CM)序列，或其间以最佳距离克隆的三个拷贝的与引导链的种子区域互补的序列(GS-SM)(以测试最严格条件中潜在的种子介导的离靶效应)，或“全感应(full-sensor)”psiCHECK构建体包含四个串联拷贝的引导链的“全感应”序列，该序列由以下构成：种子区域、有义链和反义链RNA链的位置2-8(5’＞3’)，接下来是4个非靶核苷酸的间隔区且然后是反义链的中心区域、位置13-19(制备这些构建体以模拟非常广泛的碱基配对离靶)。
以下在表H、J、K、L、M、N、P、Q、R、S、T和U中提供了在靶和离靶活性的结果。
表H：dsRHOA_48和dsRHOA_48u分子的反义链与靶的完全匹配(在靶)
表J：dsRHOA_48和dsRHOA_48u分子的反义链与其靶的种子匹配(离靶)
表K：dsRHOA_48和dsRHOA_48u分子的有义链与靶的完全匹配(离靶)
表L：dsRHOA_48和dsRHOA_48u分子的反义链与其种子核苷酸和核苷酸13-17的匹 配(离靶)
表M：dsRHOA_50分子的反义链与其靶的完全匹配(在靶)
表N：dsRHOA_50分子的反义链与种子的种子匹配(离靶效应)
表P：dsRHOA_50分子的有义链与其靶的完全匹配(离靶)
表Q：dsRHOA_50分子的反义链与种子核苷酸+核苷酸13-17的匹配(离靶)
表R：dsRHOA_58分子的反义链与靶的完全匹配。
表S：dsRHOA_58分子的反义链与种子的种子匹配(离靶)
表T：dsRHOA_58分子的有义链与其靶的完全匹配(离靶)
表U：dsRHOA_58分子的反义链与种子核苷酸+核苷酸13-17的匹配(离靶)
候选分子
表W中列出了某些目前优选的dsRNA(dsRHOA)分子，提供了每个分子的敲减活性(qPCR)、在靶(Psi-AS-CM)、离靶(Psi-AS-SM和Psi-S-SM)以及反义链稳定性的数据。
表W
na：不可获得。未被测试或测定未通过QC。
5nM下的qPCR敲减：+++≤15％；++15＜30％；+31＜50％
对RHOA dsRNA分子的先天性免疫应答：
将新鲜的人血(在室温)与无菌的0.9％NaCl以1∶1的比例在室温下混合，并轻柔地上样(1∶2比例)到Ficoll(Lymphoprep，Axis-Shield cat#1114547)上。在室温下的摇摆离心机中离心样品(22℃，800g)30分钟，用RPMI1640培养基洗涤并离心(RT，250g)10分钟。对细胞计数并以1.5×106细胞/ml的终浓度接种在生长培养基(RPMI1640+10％FBS+2mM L-谷氨酰胺+1％Pen-Strep)中并在dsRNA处理前在37℃下孵育1小时。
根据厂家说明使用LipofectamineTM2000试剂(Invitrogen)将细胞与不同浓度的受试dsRNA接触并在37℃下的5％CO2培养箱中孵育24小时。
作为IFN应答的阳性对照，用终浓度为0.25-5.0μg/mL的聚(I∶C)，一种为TLR3配体的双链RNA(dsRNA)的合成类似物(InvivoGen Cat#tlrl-pic)，或用终浓度为0.075-2μg/mL的噻唑喹诺酮(CLO75)，一种TLR7/8配体(InvivoGen Cat#tlrl-c75)处理细胞。用LipofectamineTM2000试剂处理的细胞用作IFN应答的阴性(参考)对照。
孵育后约24小时，收集细胞并将上清液转移到新的管中。将样品立即冷冻在液氮中，并使用IL-6、DuoSet ELISA试剂盒(R&D System DY2060)以及TNF-α、DuoSet ELISA试剂盒(R&D System DY210)根据厂家说明测试IL-6和TNF-α细胞因子的分泌。从细胞沉淀(cellpellet)中提取RNA，并通过qPCR测量人基因IFIT1(具有三十四肽重复1的干扰素诱导的蛋白质)和MX1(粘病毒(流感病毒)抗性1，干扰素可介导的蛋白质p78)的mRNA水平。将所测量的mRNA量标准化成参考基因肽基脯氨酰异构酶A(亲环蛋白A；CycloA)的mRNA量。与IFIT1和MX1基因在未处理的细胞中的量相比，通过比较来自处理过的细胞的IFIT1和MX1基因的mRNA的量评价IFN-信号传导的引发。qPCR结果是通过QC标准的结果，即标准曲线的斜率的值是在区间[-4，-3]内，R2＞0.99，没有引物二聚体。没有通过QC要求的结果被取消分析资格。
实施例2：动物模型
青光眼模型系统
在例如在Maeda，K.等人，“A Novel Neuroprotectant against RetinalGanglion Cell Damage in a Glaucoma Model and an Optic Nerve Crush Model inthe rat”，Investigative Ophthalmology and visual Science(IOVS)，2004年3月，45(3)851中描述的大鼠视神经挤压伤动物模型中进行用于治疗或预防青光眼的本发明的活性dsRNA化合物的测试。具体地说，对于视神经的横切(transection)，通过眼窝上途径使麻醉过的大鼠的眼窝视神经(ON)暴露，割断脑膜并通过在距离筛板2mm处用钳子(forceps)挤压10秒钟来横切ON中的所有轴突。
在该动物模型中测试本文公开的RhoA dsRNA化合物，且结果表明这些RhoA dsRNA化合物在治疗和/或预防青光眼方面是有用的。
大鼠视神经挤压(ONC)模型：玻璃体内(IVT)dsRNA递送和滴眼剂dsRNA递送
对于视神经的横切，通过眼窝上途径使麻醉过的大鼠的眼窝视神经(ON)暴露，割断脑膜并通过在距离筛板2mm处用钳子挤压10秒钟来横切ON中的所有轴突。
这些dsRNA化合物作为滴眼剂被单独地或组合地以5μL体积(10ug/uL)递送。视神经挤压(ONC)后立即对成体Wistar大鼠的一只或两只眼睛施用20ug/10ul的受试dsRNA化合物或10ul PBS，并测定在注射后5小时和1天时，以及后来的2、4、7、14和21天时被吸收到所解剖并速冻的整个视网膜中的dsRNA的水平。进行相似的实验以测试通过滴眼剂施用的dsRNA化合物的活性和功效。
用于脊髓损伤的MASCIS大鼠模型
大多数人脊髓损伤包括脊髓挫伤。如在各种测量方法(包括细胞外钾和钙的变化、递减的诱发响应和脊髓病变体积)中反映的，大鼠脊髓挫伤的撞击器(Impactor)模型产生一致性损伤并提供用于测试药物候选物的宝贵体内模型(Pinzon等人，2008a；Pinzon等人，2008b)。该模型可用仅7只大鼠检测出由用甲基强的松龙(MP)治疗引起的显著的病变体积变化(在(Young，2002)中综述)。另外，MASCIS组证实了Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)运动功能评分，与碰撞部位的组织学变化呈线性相关的一种21-点顺序量表(Basso等人，1995)。该模型产生极为一致的慢性组织学变化(Beattie等人，1997)。在最近几年中，趋势已倾向于使用大鼠用于脊髓损伤研究。MASCIS撞击器是相当标准的大鼠脊髓挫伤模型，其产生级别非常一致的脊髓损伤，线性预测大鼠的24-小时病变体积、6周白质保留(sparing)以及运功功能恢复(Young，2002)。然而，其他脊髓损伤模型对于研究与这些损伤有关的多种机制是有用的，脊髓的横切并不产生大量的与继发性损伤的最坏方面有关的创伤性损伤。因此，在横切方面有效的治疗在挫伤性损伤中可能不是有效的(Iseda等人，2008)。
在此动物模型中测试本文公开的dsRNA化合物，结果表明这些dsRNA化合物在治疗和/或预防脊髓损伤中是有效的。
实施例3：dsRhoA化合物治疗SCI的体内研究
挫伤性SCI之后的RhoA免疫组织化学
研究了损伤后1、2和4周时的SCI后RhoA的免疫定位以确认蛋白质在RhoA dsRNA化合物未处理的动物中的上调。观察到相对于未损伤的对照动物，SCI后RhoA蛋白质的增加。贯穿4周，RhoA蛋白质的增加维持且呈现为在第1和第2周之间的某个地方到达顶峰。背根和前根以及内皮细胞内衬的血管表现出强烈的RhoA免疫定位。共聚焦显微镜分析表明大部分RhoA定位在质膜附近(D′Alessandro等人，2004)，表明SCI之后其处于其活化状态。
脊髓损伤和实质内(intraparenchymal)递送后dsRNA化合物在大鼠脊髓中的细胞 定位
与Cy3.5荧光团偶联的裸露的核酸酶稳定的dsRNA表现出被整合到运动神经元、巨噬细胞、白质轴突以及背根内的神经元和内皮细胞中。因此，当在挫伤性损伤后立即注射时，dsRNA可被其中RhoA的作用已牵涉SCI的许多细胞，包括神经元、星形细胞、小胶质细胞、巨噬细胞和内皮细胞吸收。因此所有这些细胞代表用于抑制RhoA的可能的靶，这被预测为是神经保护性的(Dubreuil等人，2003；Lord-Fontaine等人，2008)、抗炎的(Schwab等人，2004)和神经再生性的(Bertrand等人，2007；McKerracher和Higuchi，2006)。
SCI后RhoA蛋白质诱导的抑制
为分析本文公开的RhoA dsRNA化合物改变RhoA蛋白质水平的能力，从5mm的脊髓组织段中提取了蛋白质，并在免疫印迹之后测量了RhoA蛋白质的相对水平。用dsRhoA化合物处理的注射的挫伤部位的RhoA蛋白质水平与siGFP对照相比更低，表明对RhoA蛋白质诱导的抑制。通过与siGFP对照相比，用抗RhoA抗体对同一提取物的免疫印迹表现出相似的与针对Rho的RhoA dsRNA化合物的免疫反应性方面的减弱。
SCI和实质内注射siRNA后大鼠后肢行走的功能恢复(Basso、Beattie和Bresnahan(BBB)评分测试)
持续6周的运动功能的BBB分析使用针对RhoA的本文公开的dsRNA化合物进行。观察到与作为对照的dsGFP化合物相比，脊椎内注射dsRhoA化合物之后明显的运动功能改善。在测试的最早时候观察到表明了BBB行走评分提高的该作用，暗示着除了可能需要更长时间使轴突生长的促进再生以外，siRNA的作用可能归因于保护性机制。
腰椎穿刺注射后SCI部位的dsRNA吸收
将本文公开的dsRNA化合物经鞘内引入到脑脊液中。挫伤一天后使用推注施用(bolus administration)向腰椎膨大部分施用Cy3.5-标记的裸露的dsRNA化合物，以比较实质内递送与鞘内递送。结果表明染料被普遍地掺入到损伤中心处的脊髓以及相邻的脊髓吻端区域和尾端区域内。冷冻切片表明dsRNA最强劲地渗透进入损伤部位附近和周围的白质以及灰质。虽然在更远处观察到弱的实质信号，但是这些信号在中央管和脊髓周围是强烈的。结果表明损伤部位附近的实质内的更多吸收可能是因为损伤区域中增加的dsRNA渗透。腰椎区域内的鞘内递送产生脊髓的胸椎区域中的损伤部位内和附近的dsRNA的优先吸收。
经腰椎穿刺注射dsRNA3天后对RhoA mRNA表达的抑制
本文公开的RhoA dsRNA化合物抑制SCI-引起的RhoA mRNA增加的能力通过定量RT-PCR测量。挫伤一天后，经腰椎穿刺注射RhoAdsRNA化合物并在三天后分析脊髓组织的相对RhoA mRNA水平。结果表明，在损伤部位RhoA mRNA的相对水平到SCI后4天增加并且当注射40μg和100μg时，dsRhoA化合物的治疗减少了这种增加。
腰椎穿刺后大鼠后肢行走(BBB)的功能恢复
使用BBB评分测量与挫伤损伤后一天施用的dsGFP对照相比，本文公开的dsRhoA化合物的腰椎穿刺注射的治疗作用。dsRhoA化合物的治疗产生了比dsGFP高的得分。
采用了本申请中提供的寡核苷酸序列和结构的dsRhoA化合物在治疗SCI方面是有用的。
实施例4：关于眼部疾病、疾患和损伤的模型系统和结果
模型系统包括视神经挤压(ONC)、升高的IOP和视神经轴突切断(axotomy)模型
在大鼠青光眼模型中经玻璃体内注射(IVT)或以滴眼剂(ED)递送后dsRhoA化合物 的降低IOP的活性
为诱导升高的IOP，每周一次地将微珠注射到Wistar大鼠眼睛的前房内直到IOP升高大于30％(时间指定为第0天)。使用TonoPen XL眼压计一周三次地测量IOP以评估dsRhoA化合物在IOP降低中的相对功效。通过滴眼剂(ED)递送：在诱导升高的IOP后以滴眼剂在多个剂量之间每天递送在3μl的2％甲基纤维素(MC)中的100μg的dsRhoA化合物或对照dsRNA化合物(siCNL)或60ng的拉坦前列素(阳性对照)或单独的3μl的2％MC，持续14天(n＝4)。通过玻璃体内注射递送：在第0和第7天，通过玻璃体内注射(IVT)递送在10μl PBS中的20μg的dsRhoA或siCNL或60ng的拉坦前列素或单独的10μl PBS(n＝4)。组合的IVT-ED治疗：在第0天通过玻璃体内注射(IVT)递送在10μl PBS中的20μg的dsRhoA或siCNL或单独的10μl PBS，并且接下来以ED每天递送在3μl的2％甲基纤维素(MC)中的100μg的dsRhoA化合物或对照dsRNA化合物(siCNL)或单独的3μl的2％MC，持续14天。
dsRhoA在大鼠ONC模型中的神经保护功效：
暴露麻醉的成体Wistar大鼠的眼窝视神经(ON)，割断脑膜并通过在距离筛板2mm处用经校准的钳子挤压10秒钟来横切ON中的所有轴突。在ONC后的第0天通过IVT注射递送在10μl PBS中的10μg的dsRhoA化合物或对照dsRNA化合物(siCNL)或单独的10μl PBS(n＝4)。用5μg脑来源的神经营养因子(BDNF)类似地注射的眼睛用作阳性对照。结束前两天，通过对ON的荧光金注射逆行标记视网膜神经节细胞(RGC)。结束时(ONC后的第7天)，用4％的多聚甲醛穿心灌注实验动物。摘除具有ON的眼睛，用刀片切除角膜并轻柔地去除晶状体/玻璃体。然后剖出视网膜，再在4％的多聚甲醛中固定30分钟并准备用于在具有UV滤镜(365/420nm)的荧光显微镜下检查所标记的RGC。通过从每个视网膜全包埋标本的四个象限中的每一个捕获到的图像确定逆行标记的荧光RGC的数目。完好的眼睛中的RGC密度用作基线对照。
dsRhoA在ONC模型中的功效：
如上所述地挤压成体Fischer大鼠的ON并同时将新近切除的坐骨神经片段植入到眼睛的玻璃体中以驱动轴突再生。在ONC后第0、7和14天通过三次IVT注射递送在10μl PBS中的20μg的dsRhoA化合物或对照dsRNA化合物(siCNL)或单独的10μl PBS(n＝4)。用5μgBDNF注射的组用作阳性对照。在第21天终止实验。用GAP43抗体对ON切片的免疫组织化学允许对每个治疗组中挤压点以外的RGC轴突再生的程度的定量和定性测量。
dsRhoA化合物在青光眼模型中降低IOP的功效：
如已描述地诱导增加的IOP。通过在所进行的实验中表现出最佳结果的递送途径(例如，IVT注射、滴眼剂、滴耳剂或其任何组合)中的一种递送dsRhoA受试化合物或对照dsRNA化合物(siCNL)或60ng的拉坦前列素或单独的赋形剂中的每一种。使用TonoPen XL眼压计一周三次地测量IOP以评估所测试的RhoA dsRNA化合物对于IOP降低的相对功效。
先导药物候选物被选择为基于三种动物模型的结果表现出最佳的体内功效。利用了本文提供的寡核苷酸序列和结构的dsRhoA化合物在治疗眼部疾病、疾患和损伤(例如，青光眼)方面是有用的。
使用最重要的dsRhoA药物候选物优化治疗方案(视神经挤压(ONC)损伤模型、视网膜神经节细胞(RGC)轴突再生模型、升高的眼内压(IOP)模型中的剂量响应研究)。
测量青光眼模型中递增剂量的最重要的dsRhoA化合物降低IOP的能力
如上所述地诱导增加的IOP并分析结果。递增剂量的最重要的dsRhoA化合物经IVT(10μl的5、10、20和40μg作为单一剂量)或当以3μL的体积持续14天以剂量之间的间隔为20分钟每天一次、两次或三次地递送100μg siRNA时通过滴眼剂(ED)，或当以XμL的体积持续14天以剂量之间的间隔为XX分钟每天一次、两次或三次地递送XXμg siRNA时通过滴耳剂(ErD)递送(n＝4)。siCNL用作阴性对照且拉坦前列素-作为阳性对照。使用TonoPen XL眼压计每周三次地测量IOP以评估dsRhoA化合物在IOP降低方面的功效。
在大鼠中测量递增剂量的dsRhoA化合物在ONC之后引发RGC存活的能力：
如上所述地制备ONC模型并分析结果。在ONC之后的第0天通过单次IVT注射递送在10μl PBS中的递增剂量的5、10、20或40μg的dsRhoA受试化合物或40ug的siCNL或单独的10μl PBS(n＝4)。BDNF-注射的眼睛用作阳性对照。在ONC之后的第7天结束研究。
实施例5：在大鼠中测量递增剂量的dsRhoA化合物在神经挤压伤之后引发RGC轴突 再生的能力的体内研究
如对以上ONC模型所述的进行研究并分析结果。在ONC之后的0、10和20天通过玻璃体内(IVT)注射递送在10μl PBS中的递增剂量的10、20和40μg的受试dsRhoA化合物或40ug的dsEGFP化合物或单独的10μl PBS(n＝4)。睫状神经营养因子(CNTF)-注射的组用作阳性对照。在第30天结束实验。
ONC和dsRNA注射
用Hypnorm/Hypnovel麻醉剂(Janssen Pharmaceuticals，Oxford，UK)腹膜内麻醉成体的雌性200-250g Wistar大鼠，并眼窝内挤压两只眼睛的视神经(ON)(ONC模型)以完全横切所有RGC轴突。使用玻璃微量移液器以10μl的终体积玻璃体内注射所有试剂。在ONC后的第0、10和20天用下列处理动物：
(i)PBS；
(ii)20μg的dsEGFP对照化合物EGFP_5_S763_L1dsRNA；
有义链：
rG；mG；rC；mU；rA；mC；rG；mU；rC；mC；rA；mG；rG；mA；rG；mC；rG；mC；rA；mC；rC$；
反义链：
mG；rG；mU；rG；mC；rG；mC；rU；mC；rC；mU；rG；mG；rA；mC；rG；mU；rA；mG；rC；mC$；
(mC、mG、mA和mU表示2’OMe糖修饰的核糖核苷酸；C、G、A和U表示未修饰的核糖核苷酸；$表示没有末端Pi)，
(iii)10μg、20μg或40μg的dsRhoA化合物RHOA_4_S500，还指定为“第1批RhoA”：
有义链：
rG；mC；rC；mA；rC；mU；rU；mA；rA；mU；rG；mU；rA；mU；rG；mU；rU；mA；rC
反义链：
mG；rU；mA；rA；mC；rA；mU；rA；mC；rA；mU；rU；mA；rA；mG；rU；mG；rG；mC
(mC、mG、mA和mU表示2’OMe糖修饰的核糖核苷酸；C、G、A和U表示未修饰的核糖核苷酸)；
(iv)10μg、20μg或40μg的dsRhoA化合物RHOA_29_S73，“第2批RhoA2”：
有义链：
U；mC；G；mA；C；mA；G；mC；C；mC；U；mG；A；mU；A；mG；U；mU；U$
(SEQ ID NO：166)
反义链：
mA；A；mA；C；mU；A；mU；C；mA；G；mG；G；mC；U；mG；U；mC；G；mA$
(SEQ ID NO：170)
(mC、mG、mA和mU表示2’OMe糖修饰的核糖核苷酸；C、G、A和U表示未修饰的核糖核苷酸；$表示没有末端Pi)；或者
(v)5μg CNTF(Peprotech Ltd，London，UK)；
在ONC后30天时，通过暴露于CO2处死动物并用4％的甲醛(TAABLaboratories，Aldermaston，UK)心内(intracardially)灌注。剖出视网膜并在4％的甲醛(TAABLaboratories)中浸没固定30分钟，然后在PBS中洗涤3次，每次30分钟。然后在10％、20％和30％的蔗糖中对眼睛和ON进行冷冻保护，各持续2小时，之后在O.C.T化合物中封闭样品，并在干冰上冷冻。使用低温恒温器切割15μm厚的切片并将其粘贴到Superfrost载玻片上并储存在-20℃下直到需要。
RGC计数
促使在可看到视盘的点获取的眼睛切片在室温融化30分钟，之后在Haemotoxylin(Sigma，Poole，UK)中染色2分钟，在流动的自来水中洗涤2分钟，在Scotts自来水中洗涤1分钟，之后在曙红(Sigma)中染色30秒钟。然后在流动的自来水中洗涤切片2分钟并通过分梯度的一系列醇各自脱水1分钟并浸没在Histoclear中1分钟和3分钟，之后在Vectamount(Vector Labs，Peterborough，UK)中封固。使用每个视网膜的五个彼此等距离并覆盖视网膜的整个圆周的区域对神经节细胞层中存在的RGC数目计数。将来自4个视网膜的、5个区域/条件的计数加在一起并计算平均数以表示平均的RGC计数/视网膜±SD。
免疫组织化学
对于免疫荧光双染，将切片后固定在100％乙醇中1分钟，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤3次，在0.1％Triton X-100中透化，洗涤，封闭并用稀释在包含0.5％牛血清白蛋白(BSA；Sigma)和0.05％Tween20的PBS(PBST-BSA)(Sigma)中的合适一抗(表3)在4℃下孵育过夜。
表3-所使用的抗体的性质。
抗体 来源 稀释
小鼠抗GAP43 Zymed Labs 1∶500
兔抗层粘连蛋白 Sigma 1∶200
小鼠抗大鼠CD68(ED1) Serotec 1∶500
兔抗人纤连蛋白 Sigma 1∶500
兔抗NG2 Chemicon 1∶500
小鼠抗GFAP Sigma 1∶500
然后在PBS中洗涤切片并用1∶400稀释在PBST-BSA中的合适的荧光标记的二抗(Alexa-488或Texas Red；Molecular Probes，Oregon，USA)在室温下孵育1小时并之后在PBS中进一步洗涤，封固在包含DAPI的Vectashield(Vector Labs，Peterborough，UK)中。对照包括省略了一抗或特定IgG对照的切片。在Zeiss落射荧光显微镜(Zeiss，Hertfordshire，UK)下观察切片并使用由软件(Zeiss，版本4，2)控制的 HRc在x10放大倍数(x100原始放大倍数)下捕捉图像。在Adobe PhotoshopCS3(Adobe Systems，San Jose，CA，USA)中编辑所有图像。
结果：图2中示出了dsRhoA治疗之后的平均RGC存活。
图3中示出了与dsEGFP化合物相比，RhoA dsRNA化合物对RGC存活的促进。
结果表明还被指定为“第2批RhoA”的dsRhoA化合物RHOA_29_S73在30天时促进显著的RGC存活。经用该dsRhoA化合物治疗后，在损伤后30天时，观察到与PBS处理的对照相比，＞50％以上的RGC存活并观察到与CNTF处理的对照相比，约20％以上的RGC存活，这表现出对目前的神经保护治疗的显著提高。
受试dsRhoA化合物在大鼠视网膜及其组织分布中的剂量依赖性药物动力学效应：
用递增剂量的受试dsRhoA化合物或对照dsRNA化合物(siCNL)(5、10、20和40μg)IVT注射数组8只完好的大鼠(n＝8)并在24小时后将其处死。摘除每组6只大鼠的眼睛，切下视网膜并用于dsRNA定量，mRNA敲减测量和使用RLM-RACE的RNAi确认。用4％PFA穿心灌注每组剩余的两只大鼠，摘除眼睛，后固定，石蜡包埋并用于dsRNA在眼睛中的分布的原位杂交检测。
实施例6：每种模型每种递送途径的最佳剂量的选择
对dsRNA作用的持续时间的评价：
在所发现的如上所述的最佳条件下分析受试dsRhoA化合物的单次施用的治疗作用的持续时间。评价终点是青光眼模型中降低IOP的活性的持续时间和视网膜中RhoA敲减作用的持续时间。
高IOP模型中dsRhoA受试化合物作用的持续时间：
如上所述地诱导高IOP模型。用最佳剂量的受试dsRhoA化合物经IVT注射或用所发现的如上所述的最佳ED方案(一天之内)处理大鼠(n＝4)。用siCNL类似地处理对照动物。受试dsRhoA候选化合物的作用的功效和持续时间通过每天监测IOP来检查直到其在dsRhoA组中在药物停止工作后再次升高。不被理论束缚地，认为该时间间隔等于小梁网中dsRhoARNAi作用的持续时间。
视网膜中dsRhoA受试化合物药物动力学(RNAi)作用的持续时间：
为确定视网膜中受试dsRhoA候选化合物的作用的持续时间，将所发现的如上所述的最佳IVT剂量的dsRhoA化合物经单次IVT注射对首次用于实验的大鼠施用。对单独的一组大鼠施用同一IVT剂量的siCNL。在注射后1、2、3、5、7、10和14时处死动物(每个时间点n＝6)。摘除眼睛，切下视网膜并用于(1)使用Stem&Loop qPCR的dsRNA定量；(2)使用qPCR的靶敲减测量；以及(3)使用RLM-RACE的RNAi确认。
实施例7：大鼠视神经挤压(ONC)模型中靶向RhoA的dsRNA化合物对神经元存活和 轴突再生的作用
研究设计：对于各个组的结束是ONC后30或50天。通过双侧玻璃体内注射(IVT)每10天对所有组施用dsRNA。
第1-12组进行双侧ONC。每双眼睛接受同样的治疗。
表4-研究设计
实验设计
测量终点：
组织学固定的和冷冻组织的切片：
a)GAP43用于视神经中的RGC轴突再生
b)TUJ1用于视网膜中的RGC存活
遍布本申请公开了受试dsRNA。CNTF-注射的组用作阳性对照。对于除第2组以外的所有组，实验在第30天结束，第2组在第50天结束。
ONC和siRNA注射
用Hypnorm/Hypnovel麻醉剂(Janssen Pharmaceuticals，Oxford，UK)腹膜内麻醉成体的雌性200-250g Wistar大鼠，并眼窝内挤压两只眼睛的视神经(ON)(ONC)以完全横切所有RGC轴突。使用玻璃微量移液器以10μl的终体积玻璃体内注射所有试剂。根据表4中的研究设计处理动物。
在ONC后30天或ONC后50天(根据研究设计)时，通过暴露于CO2处死动物并用4％的甲醛(TAAB Laboratories，Aldermaston，UK)心内灌注。剖出视网膜并在4％的甲醛(TAABLaboratories)中浸没固定30分钟，然后在PBS中洗涤3次，每次30分钟。然后在10％、20％和30％的蔗糖中对眼睛和ON进行冷冻保护各持续2小时，之后在OCT中封闭样品，并在干冰上冷冻。使用低温恒温器切割15μm厚的切片并将其粘贴到Superfrost载玻片上并储存在-20℃下直到需要。
RGC计数
促使在可看到视盘的点获取的眼睛切片在室温化融化30分钟，之后在Haemotoxylin(Sigma，Poole，UK)中染色，在流动的自来水中洗涤2分钟，在Scotts自来水中洗涤1分钟，之后在曙红(Sigma)中染色30秒钟。然后在流动的自来水中洗涤切片2分钟并通过分梯度的一系列醇各自脱水1分钟并浸没在Histoclear中1分钟和3分钟，之后在Vectamount(Vector Labs，Peterborough，UK)中封固。使用每个视网膜的五个彼此等距离并覆盖视网膜的整个圆周的区域对神经节细胞层中存在的RGC数目计数。将来自4个视网膜的5个区域/条件的计数加在一起并计算平均数以表示平均的RGC计数/视网膜±SD。
免疫组织化学
对于免疫荧光双染，将切片后固定在100％乙醇中1分钟，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤3次，在0.1％Triton X-100中透化，洗涤，封闭并用稀释在包含0.5％牛血清白蛋白(BSA；Sigma)和0.05％Tween20的PBS(PBST-BSA)(Sigma)中的合适一抗(表3)在4℃下孵育过夜。
然后在PBS中洗涤切片并用1∶400稀释在PBST-BSA中的合适的荧光标记的二抗(Alexa-488或Texas Red；Molecular Probes，Oregon，USA)在室温下孵育1小时，在PBS中进一步洗涤之后，封固在包含DAPI的Vectashield中(Vector Labs，Peterborough，UK)。对照包括省略了一抗或特定IgG对照的切片。在Zeiss落射荧光显微镜(Zeiss，Hertfordshire，UK)下观察切片并使用由软件(Zeiss，版本4，2)控制的 HRc在x10放大倍数(x100原始放大倍数)下捕捉图像。在Adobe PhotoshopCS3(Adobe Systems，San Jose，CA，USA)中编辑所有图像。
在该实验中测试本文公开的dsRhoA化合物且表明其诱导神经保护。相比于用dsEGFP对照dsRNA处理的组，在dsRhoA处理的组中，ONC后挽救的RGC的数目明显更高。
实施例8：对皮层神经元的保护
为评估dsRhoA化合物的体外神经保护作用，将生长在培养物中小鼠皮质神经元暴露于NMDA5分钟，并通过测量乳酸脱氢酶(LDH)的释放监测24小时后的细胞死亡(Choi等人，J.Neurosci.7：357，1987)。确定潜在的治疗功效的另外的测试涉及体内中风模型。在这些模型中，通过夹紧通往脑的主要动脉暂时阻断大脑的血液供应。
实施例9：用于梅尼尔病的模型系统
本文公开的dsRhoA化合物在减轻或治疗患梅尼尔病的患者的听力损失方面是有效的，并且，不希望被理论约束，起到保护听觉神经元免受与梅尼尔病有关的神经元损伤的作用。用于测试dsRhoA化合物在治疗梅尼尔病方面/作为梅尼尔病中的神经保护和或神经再生因子的功效的示例性模型如下：
Sheykholeslami K，Megerian CA，Zheng QY.Vestibular evoked myogenicpotentials in normal mice and Phex mice with spontaneous endolymphatichydrops.Otol Neurotol.2009年6月；30(4)：535-44；Megerian CA，Semaan MT，Aftab S，Kisley LB，Zheng QY，Pawlowski KS，Wright CG，Alagramam KN.A mouse model withpostnatal endolymphatic hydrops and hearing loss.Hear Res.2008年3月；237(1-2)：90-105；Semaan MT，Alagramam KN，Megerian CA.The basic science of Meniere′sdisease and endolymphatic hydrops.Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg.2005年10月；13(5)：301-7。
实施例10：在梅尼尔病的小鼠模型中测量dsRhoA化合物在减轻或治疗听力损失方 面的功效的体内研究
研究目的：
通过使用功能和组织学评价在梅尼尔病的小鼠遗传模型中评估所选择的四种dsRNA化合物的功效。
研究设计
表5：研究设计。
注意：“P”是“出生后第...天(postnatal day)”的缩写。
从施用受试或对照制品的当天即第29天起以及在其施用之前每周进行功能测试。dsRNA施用需要动物固定(麻醉)40-60分钟。相同年龄的完好、未处理的小鼠中的功能测试作为基线对照。
通过滴耳剂应用受试物
麻醉：用4ml/kg体重的Equithesine(腹膜内，I.P.)麻醉小鼠。
外听道(右侧(REAC)滴耳剂(ErD)递送：使用钝性移液器吸头将3μL的样品体积(暖的基于10％甘油的滴耳剂，37℃)慢慢地灌输到右外听道(REAC)。在REAC ErD施用期间和之后，使小鼠保持对侧侧卧持续一小时，并在它们恢复意识后送回其笼子。
制备在10％甘油中的所配制的受试物-对受试材料的描述：
在无菌条件下，通过冷冻干燥沉淀dsRNA。
将10％甘油溶液加入到受试化合物中并使其静置15分钟。然后将其漩涡混合10秒钟。在应用之前使滴耳剂达到37℃的温度。
结束后，切下小鼠的内耳，固定，包埋在石蜡中并切片以代表听觉和前庭区室以及螺旋神经节。这些载玻片被用于内耳形态学的组织学评价。
每只耳朵的6片载玻片(包括每片载玻片两个5微米切片)用于dsRNA在内耳中的分布的原位杂交分析。未处理的、完好的小鼠耳朵的十五(15)片载玻片被用于系统校准。
在该研究中测试本文公开的RhoA dsRNA化合物，该研究表明模型产生6周时，与媒介物处理的组相比以及与对照dsRNA处理的组相比，RhoA dsRNA在RhoA dsRNA处理的小鼠的所有功能测试中引发显著改善。这种改善被保持至直到研究结束。这些结果表明，本文公开的RhoAdsRNA化合物在治疗梅尼尔病方面是有用的。
实施例11：用于角膜新血管形成的模型系统
本研究的目的是在角膜新血管形成的小鼠缝合模型中评估通过结膜下注射应用的RhoA dsRNA化合物的治疗作用。
研究设计包括各包含6只小鼠的9个实验组。用11-0尼龙在2个点缝合每只小鼠的两个眼睛的角膜来诱导角膜新血管形成。与刮擦相比，缝合在约2周内提供新血管形成，其在眼睛之间提供血管生长方面的更大的一致性；并诱导更多的新血管形成。角膜缝合后一天，对两只眼睛结膜下注射受试物dsRhoA化合物或对照PBS媒介物。此后，在第3、7和10天每周两次注射dsRhoA化合物或对照PBS媒介物(总共4次应用)。
为控制结膜下注射诱导新血管形成的可能性，包括了使用不含dsRNA化合物的媒介物注射的对照组#9(表6)。
表6.研究设计
麻醉：小鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪或阿佛丁麻醉。用5微升丙美卡因麻醉所有小鼠的角膜(局部麻醉)。
角膜缝合程序：用11-0尼龙线在2个点缝合(每只小鼠的两个眼睛的)角膜。角膜缝合的目的是诱导角膜新血管形成。缝合在约2周内提供新血管形成。(与刮擦相反，缝合在眼睛之间提供血管生长方面的更大的一致性并且其诱导更多的新血管形成)。
手术程序：
A)用阿佛丁麻醉小鼠。
B)用剪刀剪去小鼠的胡须和过长的眼睫毛。
C)在角膜中心和角膜缘之间的12点钟位置使用2-1-1结进行第1次11-0尼龙缝合。角膜内皮穿刺缝合意在诱导新血管形成并维持缝合在适当位置。
D)在角膜中心和角膜缘之间的6点钟位置(第一次缝合的相反位置)使用2-1-1结进行第2次11-0尼龙缝合。
E)对眼睛表面应用局部杆菌肽抗生素软膏。
F)将小鼠放回其笼子并监控直到能走动。
G)下一日对小鼠进行检查并再次应用抗生素软膏。
结膜下注射：
缝合后一天和此后在第3、7、和10天每周两次。如下给予小鼠双侧结膜下注射：
a.用阿佛丁麻醉小鼠。
b.将小鼠放置在JMEC A0612手术用显微镜下的水再循环加热垫上。
c.使用微量移液器对每只眼睛局部施用5微升的托吡卡胺(扩张)&5微升的丙美卡因(局部麻醉剂)。
d.用vannas剪刀修剪任何过长的眼睫毛。
e.将32标准尺寸(gauge)的气密性微量注射器(Hamilton Company)插入到结膜下以将dsRhoA化合物或PBS(对照组)递送到两只眼睛内的角膜缘后方1毫米处。
f.取出针头，并对眼睛表面应用局部杆菌肽抗生素软膏。
g.将小鼠放回其笼子并监控直到能走动。
h.下一日对小鼠进行检查并再次应用抗生素软膏。
评价
数据产生和分析
角膜血管结构(新血管形成)的图像：用连接到手术用显微镜的摄像机捕获显微照片。在研究的每一步骤对比同一位置(每周，两只眼睛的角膜缝合线周围)。根据血管面积和密度从0到5对角膜新血管进行分级。
a.0-(无新血管形成)；
b.1-(来自角膜缘的脆弱且细小的血管)；
c.2-(在角膜缘和角膜缝合处之间生长的新血管)；
d.3-(一直到缝合处为止和缝合处周围的新血管)；
e.4-(一直到缝合处为止和缝合处周围的厚、弯曲的新血管)，以及
f.5-(越过缝合处并朝向角膜中心的厚、弯曲的新血管)。
血管内皮细胞的免疫组织化学染色：收集小鼠眼睛(双眼)并修剪角膜的剩余角膜缘和虹膜。由不知情的研究者在角膜平面封片上进行血管内皮细胞的免疫组织化学染色。切除新鲜的角膜，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中清洗30分钟，并在100％丙酮(Sigma)中固定20分钟。在PBS中洗涤后，在4℃温度下用0.1M PBS和2％白蛋白(Sigma)阻断非特异性结合，持续3晚。在4℃用在0.1M PBS和2％白蛋白中的1∶500浓度的异硫氰酸荧光素(FITC)-偶联的单克隆抗小鼠CD31抗体(BD Pharmingen)和在0.1MPBS和2％白蛋白中的1∶200浓度的LYVE-1(兔，ab14917)孵育过夜，接下来用1∶1000的抗兔抗体-A546(A11010)孵育1小时并随后在室温下的PBS中洗涤。用抗褪色剂(Gelmount；Biomeda，San Francisco，CA)封固角膜并用荧光显微镜观察。
新血管形成的数字定量：在对血管内皮细胞免疫化学染色并对角膜平面封固后，用附接到荧光显微镜的摄像机捕获角膜血管结构的图像。用商购软件(MicroscopeSoftware AxioVision LE)在计算机上分析该图像并对角膜的新血管形成定量。进行角膜新血管形成的数字定量。使用附接到荧光显微镜的CD-330电荷耦合的设备(CCD)的摄像机捕获角膜血管结构的图像。使用在6243480像素下分辨的LSM-5Image Examiner(Zeiss，Hamburg，Germany)分析这些图像并将其转化成标记图像文件格式(TIFF)的文件。通过设置荧光阈值水平对新血管形成和淋巴管发生进行定量，在所述阈值水平以上只有血管被捕获。分析整体封固的角膜以将抽样偏差降至最小。以盲法方式进行新血管形成和淋巴管发生的定量。使用角膜缘(角膜的边缘)的拱形边的最里面血管作为边界，标出整个角膜区域的轮廓。将新血管形成和淋巴管发生的总面积标准化成总的角膜面积。
在该模型中测试利用了本文提供的寡核苷酸序列和结构的dsRhoA化合物并发现其在诱导发生CNV的眼睛中的新血管形成减少方面是有用的。当与dsEGFP化合物处理的组相比时，在dsRhoA化合物处理的组中计数的血管的数目明显较低。
实施例12：遵循不同的施用方式在正常大鼠中评估靶向RhoA的dsRNA化合物在视 网膜神经节细胞(RGC)中对RhoA mRNA的裂解
本研究的目的是使用本文所述的dsRhoA化合物获得对大鼠视网膜神经节细胞(RGC)中的RhoA mRNA的定向裂解的证据。本文描述的dsRhoA化合物的三种不同的施用方式：经鼓膜(TT)、滴耳剂(ErD)或玻璃体内注射(IVT)之后，进行RACE(cDNA末端快速扩增)测定。
受试物品
(i)物质(未配制的化合物)针对RhoA mRNA的本文所述的dsRNA化合物
(ii)配制的(配制的化合物)对于IVT组1-6为在PBS中的2mg/ml的dsRNA化合物(在672μl PBS溶液中的1344μg dsRNA化合物(2mg/ml)分成六个112μl的管)
(iii)配制的(配制的化合物)(400μg/30μl/耳朵)在PBS中的dsRNA化合物-对于TT组7-10(四个包含在168μl PBS溶液中的4.48mg siRNA(13.3mg/ml)的管)
(iv)配制的(配制的化合物)(200μg/10μl/耳朵)在10％甘油中的dsRNA化合物-对于ErD组11-14(四个管，各包含在56μl10％甘油溶液中的2.24mg siRNA(20mg/ml))。
对照物品(包括阳性/阴性对照和媒介物)
(i)媒介物PBS x1-对于TT和IVT
(ii)媒介物-为实验新鲜制备在无热原水中的10％无菌甘油溶液-对于ErD
测试系统
动物饲养：饮食：为动物提供随意的商购啮齿动物饮食(啮齿动物的HarlanTeklad饮食)和对饮用水的自由获取。
环境：(i)至少5天的驯化。(ii)在整个研究期间将所有动物限制在具有环境控制的居住条件的进入受限的设施中，并按照批准的标准操作程序(SOP)维持。自动控制的环境条件被设置为研究室内维持温度在20-24℃，相对湿度(RH)为30％-70％，12-小时光/12小时暗周期和15-30次空气交换/小时。通过控制设备监控温度、RH和光周期。
实验设计
原则：实验设置包括16个实验组(各4/或12只大鼠；(研究设计表7))。对来自实验组1-6的大鼠双侧注射(IVT)20μg/10μl的RhoAdsRNA化合物。对来自实验组7-10的大鼠单侧注射TT(左耳)在30μlPBSx1中的400μg RhoA dsRNA化合物。通过在右耳(REAC)中单次单侧应用滴耳剂(ErD)治疗来自实验组11-14的大鼠：用在10μl甘油10％中的200μg RhoA dsRNA化合物。组15-16作为完好的对照进行。根据研究设计(表7)完成安乐死和样本收集。如在表7中所述，将切除的视网膜转移至阳性细胞分离或qPCR分析。
表7：研究设计
麻醉&术前用药：
对于IVT注射：通过使用异氟烷专用回路系统(Isoflurane special circuitsystem)(Stoelting，USA)麻醉动物；工作设置：O2流速为600-200ml/min的O2中的3-4.5％异氟烷。
对于ErD和TT治疗：在全身麻醉前，使用异氟烷专用回路系统(Stoelting，USA)对所有动物进行轻度麻醉；工作设置：O2流速为600-800ml/min的O2中的3-4.5％异氟烷(3-4分钟)，并此后通过Equithesin(腹膜内，I.P；4ml/kg)深度麻醉。
经鼓膜注射(TT)：使用0.3毫升缓慢地TT灌注30μl的样品体积(温暖的受试制品)。将该体积递送到左中耳腔。在TT灌注期间和之后，使大鼠保持对侧侧卧约一小时，并在其恢复意识后放回笼子。在双目显微镜下进行TT灌注。
右外耳道(REAC)的ErD应用：使用钝性移液器吸头将10μl的样品体积(温暖的基于10％甘油的滴耳剂)缓慢地灌注到REAC中。在REAC灌注期间和之后，随后的约一小时使大鼠保持对侧侧卧，并在其恢复意识能力后放回笼子。
计划的安乐死：通过Equithesin(4ml/kg；I.P)深度麻醉所有动物并根据研究设计进行安乐死(表7；时间点)
组织收集：将双眼摘除，并将切除视网膜并处理视网膜以便进一步分析如下：
“破碎处理”：将来自组“视网膜分析处理A”的双眼摘除并储存在冰上。切除眼睛。每支管含有从一只动物切除的2个视网膜。将切除的视网膜转移到填充有6ml的包含Ca+2和Mg+2的PBS的15ml管中。在室温下转移这些管以分离RGC。
RGC分离：使用“Neural Tissue-Dissociation Kit-Postnatal Neurons”Miltenyi Biotec Cat#130-094-202按操作说明书描述离解来自视网膜管的细胞。然后按操作说明书描述使用抗CD11b微珠(BD IMagTM，Cat#IMAG558013)去除巨噬细胞并用抗CD90.1-PE Ab(eBioscience，Cat N12-0900-83，Lot N E0138-253)对来自“CD11b未结合”部分的细胞染色用于通过PE_微珠(BD IMagTM，Cat#557899)分离RGC，以制备“CD90.1结合和“CD90.1未结合”的群体。通过FACS测定RGC的纯度(根据在“结合”群体中的CD90.1纯度水平取消样品TBD的资格)。
完整视网膜的处理：摘除来自组“视网膜分析处理B”的切除的视网膜并储存在冰上。切除眼睛并收集到合适的试管(每支管含有从一只动物切除的2个视网膜)中并立即在液氮中冷冻，并转移以用于总RNA的提取和进一步分析。
评价
将来自每个汇集的视网膜对的分析处理A&B的所有样品转移以用于RNA提取，随后是RhoA的裂解产物的RACE分析或基因表达评估。
RACE分析：在来自所有研究组的汇集的视网膜对中通过使用RACE(cDNA末端快速扩增)测定检测裂解产物确定dsRNA化合物对大鼠视网膜内的RhoA的定向裂解。裂解位点通过序列分析验证。
样品的RNA分离：处理来自所有组的RNA，来自RGC(结合的)和相应的未结合的样品的RNA(From all groups RNA is processed fromboth RGCs(bound)and unboundsamples according)。用EZ RNA通过双提取分离总RNA。将部分RNA转移以用于cDNA制备和qPCR分析。
在该研究中测试本文所描述的dsRNA化合物并发现其产生对RhoAmRNA的定向裂解。
实施例13：dsRhoA化合物在大鼠神经性疼痛的脊神经结扎(SNL或Chung)模型中的 抗伤害感受性(anti-nociceptive)活性和镇痛活性的体内研究
本研究的目的是评价本文公开的dsRhoA化合物在用于大鼠神经性疼痛的脊神经结扎(SNL或Chung)模型中的抗伤害感受性活性和镇痛活性。
在研究第0天，对所有动物进行Chung手术，Chung手术由其中左侧L5-L6脊神经被隔离和切断的操作组成。在手术当天对来自组1M、5M、7M和9M的动物经皮下植入ALZET渗透泵并持续用受试物治疗。泵性能的持续时间是28天，但是从第0到第14天泵释放受试物而从第14至第28天释放盐水，或者从第0到第14天泵释放盐水而从第14至第28天释放受试物。在伤害后的第1天或第14天通过插入L4-L5层处脊椎空间内的鞘内(IT)管缓慢地以推注形式(in bolus)将受试物对来自组2M、4M、6M和8M的动物用药。
表8中提供了研究设计。缩写：IT泵-鞘内泵植入；IT腰椎注射-腰椎区域中的鞘内注射。
表8：研究设计
*说明：在未施用TI的那些天对来自这些组的动物通过鞘内泵植入给予盐水。从第15天直到第28天，对组5M和9M经IT施用12μl/天的0.9％盐水。从第0天直到第13天对组7M经IT施用12μl/天的0.9％盐水。
**说明：泵的速度是0.5μl/小时(±0.1μl/小时)。泵性能的持续时间为14天。储存体积为200μl。
测试程序：
Chung诱导模型的原理：Chung模型是用于神经性疼痛的可靠模型，其使得能够在动物从手术苏醒后立即测量动物疼痛的阈值。
图4和图5中示出了操作和处理的图解说明。
图4为通过it泵植入施用的受试物和加巴喷丁治疗。
(*说明：在最初的14天(从第0天直到第14天)期间应用盐水滴，而然后对于从第14天直到第28天的另外14天应用药物(组7M))。
图5为通过it单次腰椎注射施用的受试物。
表9：研究的时间安排(研究第1天至研究第28天)：
天数 任务
-1 Von Frey响应测量(基线)；体重测量(基线)。
0 Chung操作，AlZET IT泵植入(组1M、5M、7M和9M)。
1 腰椎TT注射(组4M和8M)
7 体重测量：选择。
14 体重测量，Von Frey响应测量。腰椎注射(组6M)。
16 仅对于组2M和6M的Von Frey响应测量。
21 体重测量，Von Frey响应测量。
28 体重测量，Von Frey响应测量，结束
神经性疼痛诱导：在使用氯胺酮/甲苯噻嗪钠的麻醉下的同时并在对该区域剃毛后，将大鼠放置在俯卧位并从L4-S2层处的棘突中分离左椎旁肌。用小的咬骨钳小心地取出L6脊椎横突以可视地识别出L5-L6脊神经。切除左侧L5-L6脊神经。然后用4-0丝缝合线闭合肌肉，并通过夹具闭合皮肤。手术后，将大鼠放回笼子，并将其保持在加热灯下直到其苏醒。
用于预选的纳入/排除标准：
a.在研究第7天进行选择。
b.当满足下述标准中的一个或多个时检测疼痛：
c.舔被操作的爪子，伴随着用嘴轻柔地咬或扯拉指甲；
d.将腿放在空中；
e.使重量施加在与神经损伤对侧的一侧上；
f.后爪的变形和异常的姿势和行走；
g.左后爪的无力。
h.所有这些都是纳入标准。
i.动物必须能够移动其腿部以保证L4是完好的。如果动物不能移动其腿部，则其被从研究中排除。
另外，在测试日进行仔细的临床检查。观察包括皮肤、毛、眼睛、粘膜、分泌和排泄(例如，腹泻)的发生以及自主性活动(例如，流泪、流口水、立毛、瞳孔大小、异常的呼吸方式)的变化。还观察了步态、姿势和对触摸的响应的变化，以及怪异行为的存在、震颤、惊厥、睡觉和昏迷。从研究中去除表现出以上迹象中的一种或多种的动物。
ALZET渗透泵制备和植入：在手术当天对来自组1M、5M、7M和9M的动物皮下植入渗透泵。然后用4-0丝缝合线闭合皮肤切口。将聚乙烯管植入到脊髓的鞘内空间，终止于脊椎的L4层。然后将插管连接到渗透泵上并用2周施用所需量的盐水填充。然后，用少量的空气填充插管。泵速为0.5μl/小时(±0.1μl/小时)。泵性能的持续时间为14天。用200μl体积的TI填充泵。以尽可能地匹配小脑延髓池和L4椎骨之间的长度的长度插入鞘内导管使得TI被施用在L4区域。如表8中具体描述地处理来自组1M、5M、7M和9M的动物。
腰椎注射：将鞘内管插入到L4-L5层处的脊椎空间内并且受试物以推注形式缓慢地给药。
治疗
治疗开始：使用ALZET泵通过IT途径连续治疗14天(组5M、7M和9M)。使用ALZET泵通过IT途径连续治疗28天(组1M)。
腰椎区域中通过IT途径的急性单次治疗。
在研究第1天，手术后24小时，使用腰椎区域的经鞘注射进行一次预防性治疗(组4M和8M)。
在VF测试之前，在研究第14天，使用腰椎注射进行一次治疗性治疗(组6M)。
在研究第14、21和28天的疼痛测试之前2小时，每天一次地施用阳性对照，加巴喷丁(组3M)。
施用途径
表10中描述了用于该研究中的施用途径。
表10：施用途径
结束
在研究结束时，用CO2安乐死动物。
观察和计算
疼痛反应评价：使用用于机械性触摸痛的Von Frey测试评价疼痛反应。用于机械性触摸痛的Von Frey测试基于对首次用于实验的动物施加无痛的短脉冲压力。实际上，为了实现首次用于实验的动物的爪回缩，所施加的压力有时高于60g。这经常需要研究者用Von Frey丝施加足以实际上抬起首次用于实验的动物的爪子的压力。然而，在患病条件下，动物对低得多的压力是敏感的并经历由正常情况下无痛刺激引起的疼痛。
机械性触摸痛评价(Von Frey测试)：使用Von Frey设备()评估对触觉刺激的触摸痛反应。将大鼠放入围封装置内并放置在金属网表面上，但是允许其自由移动。用红色玻璃纸罩住大鼠的小柜以减少环境干扰。测试在试探行为结束后开始。如由Von Frey设备的制造商(Ugo Basil)提供的，一组Von Frey单丝提供约对数尺度(logarithmicscale)的实际作用力和线性尺度(linear scale)的感受强度。
操作原则：当抵着皮肤呈直角地按压给定长度和直径的纤维的尖部时，只要研究者继续使探针前行直到纤维弯曲，施加的力增加。纤维弯曲后，探针继续前进，导致纤维弯曲得更多，但是没有对爪子施加另外的力。
表11示出了力(g)及其对应的单丝的尺寸。
表11：力(g)及其对应的单丝的尺寸
尺寸 1.65 2.36 2.44 2.83 3.22 3.61 3.84 4.08 4.17 4.31
力(g) 0.008 0.02 0.04 0.07 0.16 0.40 0.60 1.00 1.40 2.00
尺寸 4.56 4.74 4.93 5.07 5.18 5.46 5.88 6.10 6.45 6.65
力(g) 4.00 6.00 8.00 10 15 26 60 100 180 300
当啮齿动物的爪子被出乎意料地触摸时，其表现出爪子回缩反射。可在大鼠足部的足底表面上使用Touch TestTM Sensory Evaluator。动物将通过拉回其爪子表明感觉。提高回缩反射所需要的最小力被指定/考虑为参考值。
统计学/数据评价：
所有数据被呈现为平均值±SEM。使用单因素ANOVA、接下来是Tukey后-检验(Tukey post-test)(软件：GraphPad Prism)对每个治疗组与其相关的媒介物组进行比较。使用单因素ANOVA重复测量、接下来是Tukey后-检验来比较对于每个测试组的治疗前疼痛反应和治疗后疼痛反应。认为p值＜0.05代表显著性差异。
结果
体重：在研究第-1、7、14、21和28天测量体重。
Von Frey测试：结果被呈现为左腿回缩的平均力(g)。随着在研究第14、16、21和28天的不同时间点动物对Von Frey丝的敏感性的增加观察机械性触摸痛。
使用ALZET泵通过IT途径治疗的动物的Von Frey反应：测量了媒介物治疗的动物(组1M)的被操作的左腿的回缩所需要的基线平均力。在研究第14、21和28天，再次测量了左腿的回缩力，并与基线测量值比较。
在该研究中测试了本文公开的dsRhoA化合物且发现当使用预防性治疗通过IT泵施用时，其在减少SNL引起的神经性疼痛方面是有效的。
在该研究中测试了本文公开的dsRhoA化合物且发现当使用治疗性治疗通过IT泵施用时，其在减少SNL引起的神经性疼痛方面是有效的。
实施例14：糖尿病性神经病变的模型系统
本研究的目的是在角膜新血管形成的啮齿动物缝合模型中评估通过鞘内(IT)泵植入或IT单次腰椎注射-腰椎区域的鞘内注射应用的RhoAdsRNA化合物的治疗作用。
物种/品系：SD大鼠
总数量：120；每组的数量：12
测试组：1个媒介物组
2个dsRNA对照组
6个受试物(包括以不同给药方案/途径的dsRhoA和dsTLR4化合物或组合)
1个阳性对照组
给药方案：在选择后在研究第16天一次
链脲佐菌素(STZ)-诱导的糖尿病大鼠的研究概要。在研究第0天经IV以STZ给药。在研究第3天测试BGL并此后每周一次。在研究第16天测试疼痛阈值。将表现出疼痛反应的动物纳入研究并使用IT途径用受试物给药。然后在研究第21和28天再次测试疼痛阈值。
结束时，取出脊髓和DRG以便进一步分析如下：收集来自6只动物的组织用于组织学并收集来自6只动物的组织用于RNA分析。
体重：每周一次地测量动物体重。
读数：对Von Frey的反应
在该模型系统中测试本文公开的dsRhoA化合物且表明当单独施用或与靶向TLR4基因的另一种dsRNA化合物组合施用时，其在减少神经性疼痛方面是有效的。
实施例15：用于微血管疾患的模型系统
在如下所述的一系列微血管疾患的动物模型中测试了本文公开的dsRhoA化合物。
1.糖尿病性视网膜病
在C57B16小鼠中诱导糖尿病，这些小鼠随后被用于玻璃体内注射本发明的dsRhoA化合物和对照dsRNA化合物。对于糖尿病的诱导，对小鼠注射链脲佐菌素(禁食过夜后，STZ90mg/kg/天，持续2天)。贯穿整个研究监测动物生理学以获得血糖、体重和血细胞比容的变化。媒介物注射的小鼠用作对照。通过玻璃体内注射1ug本发明的抗-RhoA dsRNA化合物或1ug抗-GFP对照dsRNA化合物治疗合适的动物。在研究过程中，dsRNA化合物被注射两次-进行第一次STZ注射的第0天和STZ注射后第14天。
在糖尿病持续4周后，使用伊文思蓝(EB)染料技术对动物测量视网膜血管渗漏。在伊文思蓝(EB)测量前24小时，将导管植入小鼠的右颈静脉。对每只动物的双眼的视网膜渗透性测量遵循标准的伊文思蓝操作说明。
在该模型系统中测试本文公开的dsRhoA化合物，并表明其在降低糖尿病引起的视网膜血管渗漏方面是有效的。
2.早产儿视网膜病
通过将受试动物暴露于低氧和高氧条件下诱导早产儿视网膜病，并随后测试对视网膜影响。在该模型系统中测试本文公开的dsRhoA化合物，并表明其在保护动物免受早产儿视网膜病方面是有效的。
3.心肌梗塞
通过小鼠的左前降动脉结扎诱导短期和长期心肌梗塞。在该模型系统中测试本文公开的dsRhoA化合物，并表明其在梗塞后24小时减少所测试的动物的血液中总肌酸磷酸激酶(CPK-MB)水平中的肌钙蛋白-T(TnT)和MB的分数方面是有效的。在梗塞后28天时，与用对照dsRNA化合物处理的动物相比，本文公开的dsRhoA化合物处理的动物具有更好的超声心动图(射血分数体积)。
4.闭合性脑损伤(Closed Head Injury，CHI)
实验TBI产生了促成神经性和神经代谢级联反应的一系列的事件，这些级联反应与行为缺陷的程度和范围有关。在麻醉下诱导CHI，同时允许重物从覆盖中间冠状面(midcoronal plane)中的左半球的被暴露的头骨上方的预先固定的高度处自由落下(Chen等人，J.Neurotrauma13，557，1996)。
在该模型系统中测试本文公开的dsRhoA化合物并表明其在治疗TBI方面是有效的。
实施例16：黄斑变性模型系统
在具有脉络膜新血管形成(CNV)的以下动物模型中测试本文公开的dsRhoA化合物。在模型动物中通过激光处理诱导这一湿性AMD的标志。
小鼠模型：脉络膜新血管形成(CNV)诱导
由对药物组的分配不知情的一个人在第0天对每只小鼠的双眼进行激光光凝(532nm，200mW，100ms，75μm)(OcuLight GL，Iridex，Mountain View，CA)激发脉络膜新血管形成(CNV)，即湿性AMD的标志。使用裂隙灯传递系统和盖玻片作为接触透镜，以标准化的方式将激光点应用于视神经周围。
治疗组：在以下几组小鼠(年龄为6-8周的雄性小鼠)中诱导CNV：
12只WT小鼠；
在第0天和第7天一只眼睛中注射(IVT)了0.25μg本文所述的RhoAdsRNA化合物而对侧眼睛中注射(IVT)了失活的抗-GFP dsRNA化合物(阴性对照)的12只WT小鼠；
在第0天和第7天一只眼睛中注射(IVT)了0.1μg本文所述的RhoAdsRNA化合物而对侧眼睛中注射(IVT)了PBS(阴性对照)的12只WT小鼠；
在第0天和第7天一只眼睛中注射(IVT)了0.05μg本文所述的RhoAdsRNA化合物而对侧眼睛中注射(IVT)了PBS(阴性对照)的12只WT小鼠。
对每只小鼠的双眼激光治疗。所注射的体积是2μl。
评估
在第14天结束实验。对于评价，摘除眼睛并在4℃下用4％的多聚甲醛固定30分钟。从视神经上分离并切除神经感受性视网膜。将剩余的RPE-脉络膜-巩膜复合体平面封固在Immu-Mount(Vectashield Mounting Medium，Vector)上和盖上盖玻片。用激光扫描共聚焦显微镜(TCS SP，Leica，Germany)检查平面封片。通过用蓝色氩激光激发显现血管。获得来自RPE-脉络膜-巩膜复合体的表面的水平光学切片(1μm步长(step))。其中可识别与病变连接的周围脉络膜血管网络的最深处的聚焦平面被判断为病变的底面。激光处理区域中和该参考平面表面的任何血管被判断为CNV。数字化存储每片切片的图像。使用Leica TCS SP软件通过计算机化图像分析测量CNV相关荧光的面积。将每个水平切片中的全部荧光面积的总和用作CNV体积指数。
单独的WT小鼠(每组5只眼睛)被用于使用对从RPE/脉络膜或从神经视网膜中提取的RNA的实时PCR来评价CNV中RhoA mRNA的表达(以及与AMD有关的其他基因的表达)(未处理的和本文公开的dsRNA化合物处理的)。
在该模型系统中测试本文公开的dsRhoA化合物并表明其引起CNV体积的减少。
实施例17：针对RHOA的dsRNA用于衰减肿瘤生长的评估
方法：
(a)皮下肿瘤异种移植：将约5×106A549细胞注入到雄性无胸腺裸鼠的后腿中并每周测量皮下肿瘤。使用下列公式测量肿瘤体积：[长度(mm)×宽(mm)×宽(mm)×0.52]。对于向皮下肿瘤体内递送dsiRNA，在PBS中稀释受试dsRNA双链体并使用胰岛素注射器以10μg/ml的浓度注射到后腿肿瘤中。在其他动物中，以40mg/kg体重的剂量提供卡铂的腹膜内注射。每周两次地施用dsRNA和卡铂，持续4周。为了测试本发明的dsRNA的体内抗肿瘤活性，每周两次持续4周用受试dsRNA通过对肿瘤直接注射和通过卡铂治疗携带皮下肿瘤的小鼠，并在实验结束时测量肿瘤重量。
(b)肺转移实验：对SCID-Beige小鼠(Charles River，MA)静脉内注射约2x106A549-C8-luc细胞，并每周测量发育中的肺肿瘤。对于向肺肿瘤气溶胶递送受试或对照dsRNA，使用雾化器雾化在PBS中稀释的100μgdsRNA。每周给予小鼠三次剂量(100μg/剂量)的dsRNA，持续4周。在对照小鼠中，两次/周地以30mg/kg体重的剂量提供卡铂的腹膜内注射。在实验结束时测量肿瘤重量。
在这些动物模型中测试本文公开的dsRNA分子且其在体内减轻肿瘤负荷以及在治疗癌症方面是有效的。
在如同每一份单独的出版物被明确且单独地指明被通过引用并入的相同程度上，本文提及或引用的文章、专利和专利申请以及所有其他文献和电子可利用的信息的内容在此被通过引用全部并入。
申请人保留向本申请物理地并入来自任何这类文章、专利和专利申请或其他物理和电子文献的任何和全部材料及信息的权利。
对于本领域技术人员将易于明白的是，可对本文公开的发明进行不同的替换和修改而不偏离本发明的范围和精神。因此，这些另外的实施方式落在本发明和下列权利要求的范围内。本发明教导本领域技术人员测试本文所述的化学修饰的不同组合和/或替换来产生具有用于介导RNAi活性的提高的活性的核酸构建体。该提高的活性可包括提高的稳定性、提高的生物利用率和/或改善的对介导RNAi的细胞反应的激活。因此，本文所述的具体实施方式不是限制性的且本领域技术人员可容易地理解对于鉴定具有提高的RNAi活性的核酸分子，可测试本文所述的修饰的特定组合而不需要过度的实验。
本文示例性地描述的这些发明可适合在缺少本文未明确公开的任何一种要素(element)或多种要素、一种限制或多种限制时实践。因此，除非本文另外指明或与上下文明显抵触，否则例如，在描述本发明的上下文中(尤其是在下列权利要求的上下文中)术语“一个(a)”和“一个(an)”和“该(the)”及类似的引述方式应解释为覆盖单数和复数。术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”、“含有(containing)”等应被广泛而无限制地理解(例如，意思是“包括，但不限于”)。除非本文另外指明，本文对值的范围的陈述仅意在用作单独地述及落在该范围内的每个单独的值的便捷方法，且每个单独的值被如同其被本文单独提到地并入到本说明书中。除非本文另外指明或在其他方面与上下文明显抵触，本文描述的所有方法可以任何合适的顺序进行。除非另外要求保护，本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅意在更好地阐述本发明而未对本发明的范围施加限制。本说明书中的语言都不应解释为表示任何未被要求保护的要素为对本发明的实践所必不可少的。另外，本文采用的术语和表达被用作描述性而不是限制性的术语，且不存在使用这些术语和表达排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物的意图，且应认识到在本发明要求保护的范围内不同的修改是可能的。因此，应当理解虽然已通过优选的实施方式和可选的特征特别地公开本发明，但是本领域技术人员可借助于其中体现的对本文公开的发明的修改和改变，且这些修饰和改变应被认为落在本发明的范围内。
本文已概括性且一般性地描述了本发明。落在该一般性公开内容内的更狭窄的物种和亚属分组(subgeneric grouping)中的每一种也形成本发明的一部分。这包括用将任何主题从该属中去除的附带条件或不利限制一般性地描述本发明，而不管所去除的材料是否被本文明确地提及。其他实施方式落在下列权利要求内。另外，在根据马库什组描述本发明的特征或方面时，则本领域技术人员应认识到因此还根据马库什组的任何单个的成员或成员的亚组描述本发明。

Claims (26)

1.一种用于下调基因RHOA的表达的双链核酸分子，其中所述双链核酸分子是描述为RHOA_48，包含有义链和反义链，其中所述有义链的寡核苷酸序列是SEQ ID NO:79且所述反义链的寡核苷酸序列是SEQ ID NO:113；或该核酸分子的药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的双链核酸分子，其中所述反义链的序列是5’UGUAGCAAGAUGACUUCUG 3’(SEQ ID NO:113)且其中所述有义链的序列是5’CAGAAGUCAUCUUGCUACA 3’(SEQ ID NO:79)，或该核酸分子的药学上可接受的盐。
3.一种用于下调基因RHOA的表达的双链核酸分子，具有下列结构：
其中每个“|”表示碱基配对；
其中A、C、G和U中的每一个独立地是未修饰的核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸或非常规部分；
其中Z和Z’中的每一个独立地存在或不存在，但是如果存在的话，则独立地是共价连接在其所存在的链的3’末端的1-5个连续的核苷酸或非核苷酸部分或其组合；
其中z”可能存在或不存在，但是如果存在的话，则是共价连接在所述有义链的5’末端的封端部分；
其中所述双链核酸分子被描述为RHOA_48_S1857、RHOA_48_S1873、RHOA_48_S1856或RHOA_48_S1872，
其中在所述双链核酸分子RHOA_48_S1857中，所述反义链(SEQ ID NO:113)包括5’>3’位置1、3、11、14、15、17和18处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，位置6处的2’-5’连接的核糖核苷酸和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH部分；且所述有义链(SEQ ID NO:79)包括5’>3’位置15、16、17、18和19处的2’-5’连接的核糖核苷酸，共价连接在3’末端的C3Pi以及共价连接在5’末端的倒置的脱碱基脱氧核糖核苷酸封端部分；
其中在所述双链核酸分子RHOA_48_S1873中，所述反义链(SEQ ID NO:113)包括5’>3’位置1、3、11、14、15、17和18处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，位置6处的2’-5’连接的核糖核苷酸和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH部分；且所述有义链(SEQ ID NO:79)包括5’>3’位置15、16、17、18和19处的2’-5’连接的核糖核苷酸，共价连接在3’末端的C3Pi以及共价连接在5’末端的镜像核苷酸L-脱氧核糖鸟苷-3’-磷酸；
其中在所述双链核酸分子RHOA_48_S1856中，所述反义链(SEQ ID NO:113)包括5’>3’位置1、3、6、11、14、15、17和18处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，位置7处的2’-5’连接的核糖核苷酸和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH部分；且所述有义链(SEQ ID NO:79)包括5’>3’位置1处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，共价连接在3’末端的C3Pi部分以及共价连接在5’末端的倒置的脱碱基脱氧核糖核苷酸封端部分；并且
其中在所述双链核酸分子RHOA_48_S1872中，所述反义链(SEQ ID NO:113)包括5’>3’位置1、3、6、11、14、15、17和18处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，位置7处的2’-5’连接的核糖核苷酸和共价连接到3’末端的C3Pi-C3OH部分；且所述有义链(SEQ ID NO:79)包括5’>3’位置1处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸以及位置15、16、17、18和19处的2’-5’连接的核糖核苷酸、共价连接在3’末端的C3Pi以及共价连接在5’末端的镜像核苷酸L-脱氧核糖鸟苷-3’-磷酸；或
该核酸分子的药学上可接受的盐。
4.一种药物组合物，包含权利要求1-3中任一项所述的核酸分子或该核酸分子的药学上可接受的盐；以及药学上可接受的载体。
5.一种药物组合物，包含有效地下调RHOA基因的表达的量的权利要求1-3中任一项所述的核酸分子或该核酸分子的药学上可接受的盐；以及药学上可接受的载体。
6.权利要求1-3中任一项所述的核酸分子或该核酸分子的药学上可接受的盐在制备用于治疗处于经受与RHOA表达有关的损伤或疾病的风险下或患与RHOA表达有关的损伤或疾病的个体的药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述与RHOA表达有关的损伤或疾病是中枢神经系统的损伤或疾病。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述中枢神经系统的损伤或疾病包括神经元变性。
9.根据权利要求6所述的用途，其中所述损伤或疾病选自由心脏停搏；创伤性损伤、脑缺血、中风、血栓栓塞性中风产生的脑损伤、阿尔茨海默病、帕金森病、克雅病、贝尔面神经麻痹、多发性硬化、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、HIV感染、梅尼尔病、青光眼、黄斑变性、前部缺血性视神经病变和癌症组成的组。
10.根据权利要求6所述的用途，其中所述损伤或疾病是神经损伤。
11.根据权利要求6所述的用途，其中所述损伤或疾病是神经变性疾病。
12.根据权利要求6所述的用途，其中所述损伤或疾病是脑血管疾病。
13.根据权利要求6所述的用途，其中所述损伤或疾病是痴呆。
14.根据权利要求6所述的用途，其中所述损伤或疾病是增生性疾病。
15.根据权利要求6所述的用途，其中所述损伤或疾病选自由路易体痴呆、血管性痴呆、由帕金森病造成的痴呆、创伤性脑损伤、原发性开角青光眼、年龄相关性黄斑变性、非动脉炎性前部缺血性视神经病变和动脉炎性前部缺血性视神经病变组成的组。
16.根据权利要求6所述的用途，其中所述损伤是颅-脑创伤性损伤。
17.根据权利要求6所述的用途，其中所述损伤是脊髓损伤。
18.权利要求1-3中任一项所述的核酸分子或该核酸分子的药学上可接受的盐在制备用于治疗处于经受与RHOA表达有关的紊乱的风险下或患与RHOA表达有关的紊乱的个体的药物中的用途。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述与RHOA表达有关的紊乱是中枢神经系统的紊乱。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述中枢神经系统的紊乱包括神经元变性。
21.根据权利要求18所述的用途，其中所述紊乱选自由神经变性紊乱、脑血管紊乱、听力紊乱、神经性疼痛和触摸痛组成的组。
22.根据权利要求21所述的用途，其中所述听力紊乱是听力损失。
23.根据权利要求12所述的用途，其中所述听力损失是与神经元变性有关的听力损失。
24.根据权利要求21所述的用途，其中所述紊乱是神经性疼痛或触摸痛。
25.权利要求1-3中任一项所述的核酸分子或该核酸分子的药学上可接受的盐在制备用于实现对被中枢神经系统的损伤或疾病损害的或处于被其损害的风险之下的神经元的神经保护或神经再生的药物中的用途。
26.权利要求1-3中任一项所述的核酸分子或该核酸分子的药学上可接受的盐在制备用于实现对被中枢神经系统的紊乱损害的或处于被其损害的风险之下的神经元的神经保护或神经再生的药物中的用途。
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