CN108245528A

CN108245528A - 一种视神经保护的药物

Info

Publication number: CN108245528A
Application number: CN201810102888.8A
Authority: CN
Inventors: 刘茜
Original assignee: Henan Provincial Eye Hospital (henan Institute Of Ophthalmology)
Current assignee: Henan Provincial Eye Hospital (henan Institute Of Ophthalmology)
Priority date: 2018-02-01
Filing date: 2018-02-01
Publication date: 2018-07-06

Abstract

本发明公开了一种视神经保护的药物。该药物以以RNA干扰序列RhoA siRNA作为活性成份，所述的RhoA siRNA其正义链为5'GAAGUCAAGCAUUUCUGUC dTdT 3'，反义链为3'dTdT CUUCAGUUCGUAAAGACAG 5'。本发明的RhoA siRNA能干扰特定基因RhoA，下调其表达，从而降低促凋亡基因Caspase3,Nogo Receptor的表达和活性，显著降低视网膜神经节细胞的凋亡率，同时凋亡拮抗因子Bcl‑2的表达量增加，进一步抑制细胞凋亡。慢性高眼压动物模型中RhoA siRNA玻璃体腔注射可以有效的降低RhoA的表达，为RhoA siRNA治疗青光眼和视神经保护提出了新方法，并提供了初步实验基础证实了其可行性。

Description

一种视神经保护的药物

技术领域：

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种视神经保护的药物。

背景技术：

光眼是一类慢性、进行性视神经病变，以视盘与视野进行性损伤为特征。有研究表明，约50％～85％的青光眼性视神经损害是病理性高眼压所导致。研究表明，预计到2020年全球范围内青光眼患者将增长至7960万。而在我国，青光眼的患病率为0.21％～1.64％，40岁以上人群的患病率高达1％～2％。无论在我国还是世界、发达国家还是发展中国家，青光眼严重威胁着人类的健康，成为致盲和视功能损伤的重要原因之一。世界卫生组织(WHO)已将其列为第二大致盲性眼病，是不可逆盲最重要的原因。

青光眼以病理性高眼压视网膜神经节细胞的损伤凋亡并最终致盲为特点。细胞凋亡(Apoptosis)又名程序性细胞死亡(Programmed cell death,PCD)。神经损伤发生时，微环境发生急剧变化，氧化应激反应被启动，许多抑制神经再生的物质被损伤及周围组织释放，阻碍了神经组织的修复和再生。研究表明，RhoA在这些抑制物质引起的抑制性信号传导中发挥了重要作用。脊髓损伤后神经细胞RhoA表达量升高，而通过降低活性Rho GTP酶的表达量，能够显著降低损伤后脊髓神经细胞的凋亡。C3转移酶抑制RhoA的激活后，能拮抗CSPG的抑制作用，促进RGCs轴突在胶质瘢痕上生长，促进神经再生。

目前，视神经保护治疗主要集中在药物治疗方面，临床上以药物口服为主和局部点眼为主。而药物治疗的方法可引起多种全身的和局部的毒副作用。目前，局部视神经药物治疗主要肾上腺能受体激动剂等。例如，溴莫尼定能减缓眼压性青光眼所致视野缺损的进展。但亦可引起包括口干，眼部充血，烧灼感及刺痛感，头痛，视物模糊等不良反应，还易出现中枢抑制作用引起嗜睡，对儿童的应用尤不安全。而全身口服药物如川穹、灯盏细辛、银杏叶等药物同样存在这些问题，甚至出现更为严重的毒副作用。此类副作用可以导致患者适从性降低或终止治疗。鉴于青光眼视神经保护的重要性及目前传统药物治疗的不当，针对青光眼发展基础性原因的基因靶向治疗越来越受到重视；然而，作为基因靶向性治疗手段之一的基因转染，病毒载体的安全性及伦理性成为限制其临床应用的主要原因。例如，慢病毒载体是目前广泛使用的高效转染载体，它是人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)来源的病毒载体。鉴于HIV病毒复杂的生物学特性，其安全性未得有效解决。

RNA干扰技术作为基因治疗的主要手段之一，具有低浓度、高特异性、高效作用的优点，已经成为哺乳动物及细胞中抑制特定基因表达的有力工具。由于病毒载体致瘤性，较低的靶向性和潜在的安全威胁及伦理性限制了病毒载体在临床的应用。非病毒载体作为基因治疗的主要载体之一，具有高靶向性，低毒性，不受伦理限制的优势，并逐渐受到研究者的重视。因此，基于RNA干扰的基因治疗为眼科疾病的诊治，带来了新的思路，开辟了新的方向。

发明内容：

本发明的目的是提供一种治疗青光眼和/或视神经保护的药物。

本发明的治疗青光眼和/或视神经保护的药物是以RNA干扰序列RhoA siRNA作为活性成份，所述的RhoA siRNA其正义链为5'GAAGUCAAGCAUUUCUGUC dTdT 3'，反义链为3'dTdT CUUCAGUUCGUAAAGACAG 5'。

优选，还含有转让试剂，所述的转染试剂是LipofectamineTM RNA iMAX。

本发明的第二个目的是提供RhoA siRNA在制备治疗青光眼和/或视神经保护的药物中的应用，所述的RhoA siRNA其正义链为5'GAAGUCAAGCAUUUCUGUC dTdT 3'，反义链为3'dTdT CUUCAGUUCGUAAAGACAG 5'。

本发明的RhoA siRNA能干扰特定基因RhoA，下调其表达，从而降低促凋亡基因Caspase3,Nogo Receptor的表达和活性，显著降低视网膜神经节细胞的凋亡率，同时凋亡拮抗因子Bcl-2的表达量增加，进一步抑制细胞凋亡。慢性高眼压动物模型中RhoA siRNA玻璃体腔注射可以有效的降低RhoA的表达，为RhoA siRNA治疗青光眼和视神经保护提出了新方法，并提供了初步实验基础证实了其可行性。

附图说明：

图1是小鼠视网膜神经节细胞培养48h后倒置相差显微镜下细胞形态(400×)；

图2是200uM 30％H₂O₂培养0小时细胞形态图片(400×)；

图3是200uM 30％H₂O₂培养1小时后细胞形态图片(400×)；

图4是Real Time PCR检测视网膜神经节细胞凋亡Rho GTP酶家族表达量；

图5是Cy3-SiRhoA培养24小时后Cy3荧光显微镜下转染率；

图6是小鼠视网膜神经节细胞RhoA基因表达，siRhoA应用后细胞RhoA基因显著降低；

图7是凋亡损伤RGC细胞，应用NC-siRNA后RhoA蛋白表达及定位(400×)；

图8是凋亡损伤RGC细胞RhoA蛋白表达及定位(400×)，可见siRhoA应用后荧光表达量降低；

图9是流式细胞检测转染siRNA后RGC细胞凋亡变化情况；

图10是TUNEL检测转染NC siRNA后RGC细胞凋亡变化情况；

图11是TUNEL检测转染siRhoA后RGC细胞凋亡变化情况；

图12是损伤模型下，视网膜神经节细胞凋亡相关基因表达量变化情况；

图13是损伤模型下，视网膜神经节细胞凋亡相关蛋白表达量变化情况；

图14是地塞米松作用实验动物眼压变化情况；

图15是地塞米松作用后小鼠视网膜神经节细胞RhoA蛋白表达量升高(红色箭头：视网膜神经节细胞)；

图16是玻璃体腔注射RhoA siRNA下调地塞米松诱导慢性高眼压动物模型视网膜RhoA基因表达。

具体实施方式：

以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

第一部分组织取材及细胞培养

1.小鼠视网膜神经节细胞系培养

1.1实验细胞小鼠视网膜神经节细胞系mRGC购自长沙赢润生物技术有限公司。

1.2细胞复苏：冻存于液氮的细胞在37℃温水中快速融化，立即将细胞悬液移入已有3ml细胞培养液的离心管中，离心1000rpm×5min，去上清，加3ml含10％新生牛血清的DMEM(Gibco公司)完全培养基重悬，转入60mm的细胞培养皿中，于5％CO₂孵箱37℃静置培养，2-3天更换培养液(图1)。

1.3细胞传代：用PBS洗涤细胞，加1ml 0.25％胰酶消化液，置37℃孵箱消化2-5分钟至肉眼观察细胞成片脱落，加入DMEM完全培养基2ml终止消化反应，1000rpm×5min离心，去上清，用5ml完全培养基重悬细胞，取1ml细胞悬液加入新的60mm培养皿，并加入完全培养基6ml，继续培养。

1.4细胞冻存：对数生长期细胞达到80－90％汇合，PBS洗涤细胞，0.25％胰酶消化2-5分钟，加完全培养基中止消化反应，离心1000rpm×5min收集细胞。用5ml培养基重悬细胞，逐滴加入等体积2×冻存液，冻存管分装并放入梯度降温盒，-80℃过夜，次日放入液氮保存。

第二部分细胞损伤模型的建立及差异表达

1.细胞凋亡损伤模型构建

1.1细胞准备：RGC细胞含10％新生牛血清的DMED完全培养基，37℃，5％CO₂常规培养。待细胞进入快速生长期，胰酶消化，1000rpm×5min离心，重悬，台盼蓝染色计数确定细胞数量，以1×10⁵/孔接种于6孔板，培养24h后细胞达到融合状态时进行实验，建立H₂O₂诱导凋亡的细胞模型，选择最佳诱导浓度和诱导时间。

1.2浓度梯度分组：细胞融合时加入H₂O₂(30％双氧水)。浓度梯度设立对照组、50uM组、100uM组、200uM组、400uM组、800uM组。细胞培养30分钟后，收集细胞进行流式检测，筛选最小有效浓度。

1.3时间梯度分组：细胞融合时加入H₂O₂(30％双氧水)200uM，设立孵育时间梯度0小时组、1小时组、2小时组、3小时组、4小时组，收集细胞进行流式检测，筛选最短有效时间。

1.4流式细胞仪检测细胞凋亡：

1)吸取3ml Binding Buffer(10×)，用27ml去离子水稀释30ml(1×)。

2)用胰酶将细胞消化下来，收集后用预冷的PBS洗涤1次。

3)用1ml 1×的Binding Buffer悬浮细胞，300g离心10min，弃上清。

4)用适量1×的Binding Buffer重悬细胞，调整细胞密度为1×10⁶个/ml。

5)每管加入100μl细胞悬液(每管细胞量为1×105个)。

6)再向管中加入5μlAnnexinV-FITC，轻轻地混匀。

7)室温，避光，避光孵育10min。

8)加入5μl PI，室温，避光，孵育5min。

9)孵育完毕，加PBS至500μL，轻轻混匀。

10)在1小时内用流式细胞仪进行检测。

根据流式细胞凋亡检测结果，最终选取H₂O₂(30％双氧水)200uM作用1小时，建立凋亡模型进行后续实验。

2.RT-PCR检测各组视网膜神经节细胞Rho GTP酶基因表达变化情况

GreenⅠReal Time PCR方法检测样本中目的基因mRNA转录水平的变化情况。

2.1引物设计

Real Time PCR检测目的基因引物序列：

2.2实验步骤

2.1.1提取样本总RNA：用Trizol提取细胞样本中总RNA。

实验操作步骤如下：

1)弃去培养瓶中的细胞培养基，漂洗2次，加入1ml Trizol，轻轻吹打细胞使其混匀，转移至1.5ml离心管中静置5-10min；

2)加入0.2ml氯仿上下剧烈混匀15-30s，然后静置3min(冰浴或室温)；

3)4℃，12,000rpm离心15min；

4)取水相到新的EP管中，加入0.5ml异丙醇，混匀，冰浴10min；

5)4℃，12,000rpm离心10min；

6)倾倒上层液体，用75％冰乙醇沉淀(1ml)，混匀；

7)4℃，12,000rpm离心5min；

8)干燥。加入DEPC处理水溶解RNA，测浓度，-80℃保存。

2.1.2反转录

用TIANScript RT KIT进行反转录，步骤如下：

按下表向反应管中加入50ul反应体系的第一部分，混匀。

试剂	50ul反应体系
		总RNA	1μg
Oligo(dT)	2μl
		SuperPuredNTP	2μl
RNase-FreeddH2O	定容至14.5μl

70℃加热5分钟，迅速在冰上冷却2分钟，简短离心收集反应液后加入以下各组分：

试剂	50μl反应体系
		混合物	14.5μl
5xFirst-StrandBuffer	0.5μl
		RNasin	0.5μl
TIANScripM-MLV	1μl

轻轻吸打混匀,25℃温浴10分钟，42℃温浴50分钟,95℃加热5分钟。用RNase-FreeddH₂O将反应体系稀释到50μl，-20℃保存。

2.1.3Real Time-PCR检测

用荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。

试剂	20μl反应体系
		2*SuperReal PreMix Plus	10μl
上游引物(10μM)	0.6μl
		下游引物(10μM)	0.6μl
cDNA	100ng
		50*ROX Reference Dye△	0.4μl
RNase-Free ddH₂O	至20μl

反应程序：

对RhoA以及内参照GAPDH基因进行扩增。特异性PCR引物序列。

3.主要实验结果及意义前景

3.1细胞凋亡损伤模型：浓度梯度设立对照组、50uM组、100uM组、200uM组、400uM组、800uM组，培养30分钟后，收集细胞进行流式检测，筛选最小有效浓度。最终选取30％H₂O₂的有效作用浓度为200uM。在此浓度基础上，设立孵育时间梯度0小时组、1小时组、2小时组、3小时组、4小时组，收集细胞进行流式检测，筛选最短有效时间。根据流式细胞凋亡检测结果，最终选取H₂O₂(30％双氧水)200uM作用1小时(图2-3)。

该部分成功建立视网膜神经节细胞凋亡损伤模型，探讨出简单稳定有效的建模方式，为后续实验进行奠定基础。凋亡细胞体积变小、皱缩、变圆等形态变化，部分可见凋亡小体。

3.2Real Time PCR检测视网膜神经节细胞凋亡Rho GTP酶家族表达的影响：设计RhoA，CDC42,Rac1引物，RT-PCR检测基因表达情况。结果显示，H₂O₂作用后，Rho GTP酶家族RhoA，CDC42，Rac1基因表达量均升高(图4)，其中RhoA和CDC42表达升高更为显著。

第三部分RNA干扰下调RhoA表达转染体系构建

1.转染体系的筛选和建立

1.1siRNA的设计合成，RhoA siRNA由RIBOBIO根据RhoA cDNA序列设计合成。RhoAsiRNA序列如下：

RhoA siRNA核苷酸序列为：

正义链(5'-3')：5'-GAAGUCAAGCAUUUCUGUC dTdT-3'

反义链(3'-5')：3'-dTdT CUUCAGUUCGUAAAGACAG-5'；

然后标记荧光基团Cy3，得到Cy3-SiRhoA(其是上述RhoAsiRNA核苷酸序列上含有荧光基团Cy3)

1.2细胞准备：RGC细胞用含10％新生牛血清的DMED完全培养基，37℃，5％CO₂常规培养。待细胞进入快速生长期，胰酶消化，离心，重悬，台盼蓝染色计数确定细胞数量，以5000/孔接种于96孔板，培养24h后进行实验，建立mRGC细胞的SiRNA转染体系，选择最佳转染浓度和转染时间。

1.3Cy3-siRhoA转染视网膜神经节细胞筛选最佳转染体系：

1)RGC细胞以5000-10000/孔接种于96孔板，设立空白对照组、转染试剂组、Cy3-SiRhoA 10nM组、Cy3-SiRhoA 20nM组、Cy3-SiRhoA 50nM组，每组3复孔，培养24h，细胞密度达到30-50％进行后续转染步骤。

2)稀释siRNA：用6ul 1×riboFECT CP Buffer稀释Cy3-SiRhoA储存液，轻轻混匀。

3)混合液制备：加入0.6ul riboFECT CP Reagent，轻轻吹打混匀，室温孵育15min。

4)将riboFECT CP混合液加入到培养基中，轻轻混匀。各浓度孵育体系如下：

5)将培养板置于37℃,5％CO₂培养箱中培养24、48h后，于荧光显微镜下观察转染效率，确定最佳转染浓度和时间。

分析实验结果，根据荧光显微镜结果选用Cy3-SiRhoA 50nM，作用24小时建立转染体系。

2.RhoA siRNA转染视网膜神经节细胞效率检测

2.1细胞准备：RGC细胞用含10％新生牛血清的DMED完全培养基，37℃，5％CO2常规培养。待细胞进入快速生长期，胰酶消化，离心，重悬，台盼蓝染色计数确定细胞数量，以1×10⁵/孔接种于6孔板，培养24h后进行实验，利用已经建立的转染体系处理细胞，检测干扰效率。

2.2RhoA siRNA转染视网膜神经节细胞：

1)RGC细胞以1×10⁵/孔接种于6孔板，设立空白对照组、转染试剂组、NC-SiRNA10nM组、RhoA SiRNA 50nM组(riboFECT CP Reagent)，培养24h后，进行后续转染步骤。

2)稀释siRNA：用120ul 1×riboFECT CP Buffer稀释5ul RhoA siRNA储存液，轻轻混匀。

3)混合液制备：加入12ul riboFECT CP Reagent，轻轻吹打混匀，室温孵育15min。

4)将riboFECT CP混合液加入到培养基中，轻轻混匀。孵育体系如下：

孔板

RhoAsiRNA终浓度

每孔体积

培养基

Buffer

siRNA

Reagent

6孔板

50nM

2ml

1863.00ul

120ul

5ul

12ul

5)将培养板置于37°，5％CO₂培养箱中培养24h后，收集细胞，Real-Time RT-PCR验证RhoA基因的干扰效率。

3.统计分析：所得数据以平均值±标准差(x±s)表示，采用SPSS19.0软件ANOVA对数据进行统计分析，比较组间差异，显著性检验水准以**p<0.05为有统计学差异。

4.细胞免疫荧光检测视网膜神经节细胞RhoA定位及表达

1)细胞爬片上封闭液，室温30分钟,甩去多余液体，不洗；

2)细胞爬片上滴加的RhoA第一抗体4℃过夜，次日取出来后待切片恢复至室温后,放入0BS洗3次，每次5min；

3)切片上滴加1:50稀释的罗丹明标记的二抗，室温避光90分钟后，放入PBS中充分水洗后；

4)滴加DAPI染色液，室温孵育10min，充分水洗；

5)晾干，防淬灭封片剂封片；

6)荧光显微镜观察拍照

5.主要实验结果及意义前景

5.1RhoA siRNA转染RGC细胞模型的建立：RGC细胞接种于96孔板，培养24h后进行实验，建立RGC细胞的siRhoA转染体系，选择最佳转染浓度和转染时间。根据荧光显微镜结果选用RhoA siRNA 50nM，作用24小时建立转染体系(图5)。

5.2RhoA siRNA转染与干扰效率检测:设立空白对照组、转染试剂组、NC-SiRNA10nM组、RhoA SiRNA 50nM组(riboFECT CP Reagent)，培养24h后，进行后续转染步骤。Real-Time RT-PCR结果显示，干扰效率71.8％(图6)。

5.3细胞免疫荧光化学法检测视网膜神经节细胞RhoA蛋白表达:RhoA主要分布于视网膜神经节细胞浆中。与阴性对照组相比，RhoA siRhoA转染组视网膜神经节细胞RhoA蛋白表达明显降低(图7和图8)。

分析实验结果，该siRNA干扰片段(RhoA siRNA)能有效的干扰小鼠视网膜神经节细胞RhoA的表达(图6)，构建并合成了稳定的RhoA siRNA片段，成功建立简单有效的转染体系，为后续凋亡信号通路的功能性探索提供了有力的研究工具。

第三部分RhoA siRNA转染影响视网膜神经节细胞凋亡的研究

1.流式细胞仪检测RhoA siRNA下调RhoA表达对视网膜神经节细胞凋亡的影响

1.1细胞准备：RGC细胞用含10％新生牛血清的DMED完全培养基，37℃，5％CO₂常规培养。待细胞进入快速生长期，胰酶消化，离心，重悬，台盼蓝染色计数确定细胞数量，以1×10⁵/孔接种于6孔板，培养24h后进行实验。

1.2实验设置如下分组：

1)空白对照组：未经RhoA siRNA转染的细胞，但是与转染细胞同步换液。

2)转染试剂组：未经RhoA siRNA转染的细胞，但是与转染细胞同步换液并用同样剂量riboFECT CP Reagent处理。

3)阴性对照组(NC组)：转染非特异siRNA。

4)siRNA干扰组：细胞转染RhoA siRNA。

5)空白对照+H₂O₂组：30％H₂O₂诱导细胞损伤凋亡。

6)转染试剂+H₂O₂组：经由30％H₂O₂诱导细胞损伤凋亡，同时未经RhoA siRNA转染的细胞，但是与转染细胞同步换液并用同样剂量riboFECT CP Reagent处理。

7)阴性对照组+H₂O₂(NC+H2O2组)：经由30％H₂O₂诱导细胞损伤凋亡，同时转染非特异siRNA。

8)siRNA+H₂O₂干扰组：30％H₂O₂诱导细胞损伤凋亡，同时细胞转染RhoA siRNA

1.3流式细胞仪视网膜神经节细胞凋亡检测：

1)RGC细胞转染RhoA siRNA，细胞转染如上所述，37℃5％CO₂常规培养24小时。

2)24小时后，PBS洗涤细胞三次，加入用DMEM培养基稀释30％H₂O₂，作用浓度200um，作用时间1h，诱导细胞凋亡。

3)1h后PBS洗细胞三次，收集细胞，按Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂说明进行染色，1小时内上机行流式细胞检测。

2.TUNEL实验检测siRNA下调RhoA基因表达对RGC细胞凋亡的影响

2.1细胞准备：RGC细胞用含10％新生牛血清的DMED完全培养基，37℃5％CO₂常规培养。待细胞进入快速生长期，胰酶消化，离心，重悬，台盼蓝染色计数确定细胞数量，以2.5×10⁴/孔接种于24孔板，培养24h后进行实验。

2.2细胞爬片

1)10*10盖玻片，用于24孔板，泡酸过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，随后用三蒸水冲洗3遍，放在玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒、烤干。

2)盖玻片浸泡75％乙醇10分钟消毒，然后酒精灯上烤干，直接放入培养皿，开始种细胞。

2.4TUNEL实验检测RNA干扰细胞凋亡变化情况

1)用PBS浸洗细胞爬片2次，每次3min；

2)用Proteinase K工作液处理组织20min在37℃；

3)PBS漂洗2次，每次5min；

4)制备TUNEL反应混合液，用50μl TdT+450μl荧光素标记的dUTP液混匀；

5)玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50μl荧光素标记的dUTP液)于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h；

6)PBS漂洗3次；

7)加50μl converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃,30min；

8)PBS漂洗3次；

9)在玻片组织上加足量DAB显色液，反应1min，显微镜观察至有阳性显色，立即终止显色；

10)PBS漂洗3次；

11)苏木素复染，几秒后立即用自来水冲洗；

12)梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片；

13)用光学显微镜观察凋亡细胞并拍照。

3.统计分析：所得数据以平均值±标准差(x±s)表示，采用SPSS19.0软件T-test对数据进行统计分析，比较组间差异，显著性检验水准以**p<0.05为有统计学差异。

4.主要实验结果及意义前景

4.1流式细胞仪检测siRNA下调RhoA基因表达对视网膜神经节细胞凋亡的影响：RGC细胞转染RhoA siRNA，加入用DMEM培养基稀释的H₂O₂，作用浓度200um，作用时间1h，诱导细胞凋亡。Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒流式细胞仪检测不同实验组细胞凋亡情况(图9)。实验结果提示，siRhoA(RhoA siRNA)显著降低视网膜神经节细胞凋亡率。

4.2TUNEL实验检测RhoA siRNA下调RhoA基因表达对RGC细胞凋亡的影响：RGC细胞转染RhoA siRNA，加入用DMEM培养基稀释30％H₂O₂，作用浓度200um，作用时间1h，诱导细胞凋亡。制作细胞爬片，TUNEL反应混合液于标本上。用光学显微镜观察凋亡细胞并拍照。未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体。结果显示，RhoA siRNA(siRhoA)组细胞凋亡数量较NC组明显减少(图10-11)。

实验结果显示,RhoA siRNA干扰特定基因RhoA的表达，能够显著降低视网膜神经节细胞的凋亡率。为进一步探讨其在青光眼视网膜神经节细胞凋亡损伤修复中的作用机制奠定了实验基础，并为新的药物治疗靶点和给药方式提供了可行性。

第四部分Rho GTP酶对视网膜神经节细胞损伤修复作用及其机制研究

1.siRNA下调RhoA对视网膜神经节细胞凋亡相关基因表达的影响

1.1细胞准备：细胞培养、凋亡损伤和siRNA分组及处理与第三部分相同。

1.2Real Time PCR检测各组视网膜神经节细胞RhoA基因表达：用SYBR GreenⅠReal Time PCR方法检测样本中目的基因mRNA转录水平的变化情况。

1.2.1引物设计

Real Time PCR检测目的基因引物序列：

其余具体实验步骤同前

1.siRNA下调RhoA对视网膜神经节细胞凋亡相关蛋白表达的影响

2.1细胞准备：细胞培养、凋亡损伤和siRNA处理与第三部分相同。

2.2样品的准备和蛋白浓度测定：习惯吸弃去原细胞培养液，用PBS洗三遍，倒置晾干。加入蛋白提取液(30μl/孔板)，用细胞刮子收集细胞于1.5ml EP管中，12000rpm 4℃离心30min高速离心机离心。吸取上清即为细胞可溶性蛋白，小心不要碰到细胞沉淀。-20℃冻存。行BCA法测定蛋白浓度：

1)每个反应标准：每个反应孔应用200μl A+B混合液(Solution A:Solution B＝50:1)，每个样品做3个平行反应。

2)BSA标准品的准备：设置两个空白对照，不添加蛋白，用去离子水代替，用于调零。并将1mg/ml的BSA进行稀释，浓度由0mg/ml至1.0mg/ml用于绘制标准曲线。

3)检测样品的准备：将不同样品稀释10倍，设置3个平行复孔。

4)蛋白孵育：将标准蛋白和样品蛋白反应液置于37℃水浴箱孵育30min。

5)30min孵育结束后。酶联免疫检测仪调节波长至562nm，调零，测定标准品及样品的光吸收值(OD值)。

6)绘制标准曲线，并根据公式和稀释倍数，求出各样品的实际浓度。

2.3蛋白样品的处理:按总蛋白20μg/孔的上样量上样。取已经定量的蛋白溶液，将样品与2×上样缓冲液以1:1比例混合置于1.5ml EP管中，差异体积用去离子水补齐，盖紧盖子，封口胶封闭管口。120℃沸水煮5min，冷却至室温后1000rpm短暂离心数秒，加样器上样。

2.4SDS-聚丙烯氨酰凝胶电泳:用海绵清洁剂清洗电泳玻璃板至不挂珠，放置室温自然干燥备用。取间隔为1.0mm的厚薄两块玻板，底面对齐，专用夹子固定，垂直固定于制胶架上。配制总体积7.5ml 10％的分离胶，每次加入一个成分就搅拌均匀，注意尽量不要产生气泡。将倾斜玻璃板15°，将配制好的分离胶沿玻板壁的夹缝缓慢加入距离玻璃板上缘约1cm处停止。用1ml枪吸加适量正丁醇封胶，室温静置15～30min，至液态分离胶凝固。倒出正丁醇，用去离子水冲洗。滤纸吸干多余水分。配制总体积3ml 5％浓缩胶，每加入一个成分就搅拌均匀，注意不要产生气泡。倾斜玻璃板15°，将混匀的浓缩胶沿玻板壁缓缓加入分离胶，直立玻璃板后立刻插梳子，室温静置5～10min，待分离胶凝固。胶板置于电泳槽中，注意不要留有缝隙。配制1×电泳缓冲液共600ml倒入电泳槽，液面需稍没过电泳槽下面铜丝线。连接电泳仪，调节电压为65V，，预跑3min。将已经处理好的蛋白样品和预染marker缓慢加到加样孔底部。两边的泳道加入约5μl的5×上样缓冲液，以防边缘效应。60V恒压电泳至跑过浓缩胶后改用120V恒压电泳至溴酚蓝指示剂到达分离胶底部，关闭电源，整个过程时间大约1-1.5h。取出电泳玻板，小心取下凝胶，切去右上方一角标记方位。

2.5全湿电转移:配制1×电转移缓冲液640ml，加入甲醇160ml。裁剪出与比凝胶大小稍大的PVDF膜和Whatman滤纸。用无水甲醇浸泡PVDF膜15s。电泳结束后卸下分离胶，于电转液中平衡10min。从黑板到白板放置的顺序依次为纤维海绵垫、三层Whatman滤纸、凝胶、PVDF膜、三层Whatman滤纸、纤维海绵垫(注意每一层之间不要留气泡)。各层铺好后，用玻璃试管滚动轻压赶出多余空气。装好后将夹子夹起，置于加入冰盒的转移槽中，板的黑极对黑极。接通电源，恒流100mA，电转2h。电转结束后取出PVDF膜，将SDS-PAGE胶以考马斯亮蓝染色约2h检测蛋白转移效率。

2.6免疫印迹反应:取出PVDF膜，防止膜的干燥，尽快浸入1×TBS液中，摇床15min。5％脱脂奶粉-TBST封闭液室温摇床室温孵育2h。取出PVDF膜，置于摇床用1×TBST液洗膜三次，每次5min。兔抗人RhoA抗体用TBST稀释为1:1000，4℃过夜摇床上孵育。1×TBST液洗膜三次，摇床，每次10min。准备保鲜膜、滤纸、暗盒。洗膜结束后，在暗室中，将PVDF膜与5ml的LumiGLO(4.5ml去离子水，0.25ml的20×LumiGLO发光试剂，0.25ml的20×过氧化物)作用一定时间至荧光条带显现。PVDF膜至吸水纸上轻轻沥干后，用保鲜膜包裹，于成像系统视发光强度曝光1～15min。曝光后的PVDF膜用1×TBST液洗膜15min,淬灭液淬灭室温摇床1h，再用1×TBST液洗膜三次，每次10min。5％脱脂奶粉-TBST封闭液室温摇床室温孵育2h，加小鼠抗GAPDH一抗(1:5000)室温摇床孵育1h，洗膜，加山羊抗小鼠二抗(1:5000)室温摇床孵育1h，其余同前。

3.主要实验结果及意义前景

3.1RhoA siRNA下调RhoA基因表达对凋亡相关基因表达的影响：设计引物，用RealTime RT-PCR对基因进行扩增。结果显示与阴性对照组相比，RhoA，Nogo Receptor,Caspase3转染组视网膜神经节细胞蛋白表达减少(p<0.05)。与阴性对照组相比，Bcl-2基因表达量增加(p<0.05)(图12)。

3.2RhoA siRNA下调RhoA表达对凋亡相关蛋白表达的影响：各组视网膜神经节细胞可检测到蛋白的表达，其他区域无明显杂带。与阴性对照组相比，RhoA，ROCK1,ROCK2,Nogo Receptor,Caspase3转染组视网膜神经节细胞蛋白表达减少(p<0.05)。与阴性对照组相比，Bcl-2蛋白表达量增加(p<0.05)(图13)。

本研究结果提示，Rho GTP酶(RhoA,CDC42,Rac1)在视网膜神经节细胞凋亡中表达量显著增加。同时，应用RhoA siRNA能够下调细胞RhoA的表达，从而降低促凋亡基因Caspase3,Nogo Receptor的表达和活性，减少细胞凋亡。同时，在该干扰体系下，凋亡拮抗因子Bcl-2的表达量增加，进一步抑制细胞凋亡。上述研究基础，提示其在青光眼疾病发生发展中的可能重要作用，为研究和开发青光眼视神经保护新的治疗药物提供靶点。同时，RNA干扰因其靶向性高，不良反应少，为临床新型药剂及给药方式提供了实验理论基础。

第六部分地塞米松诱导慢性高眼压动物模型的实验研究

1.实验动物：

SPF级小鼠，60只，周龄4-6周，体重16-21g，郑州大学动物实验动物中心提供并饲养，手术及饲养过程符合伦理委员会要求。

2.地塞米松诱导慢性高眼压动物模型：

采用0.1％地塞米松滴眼液(河南省眼科研究所药剂室配制)滴左眼，每天四次(约10ul/d),共4周。

2.眼压测量

用TONA-PENAVIA眼压计测量眼压。测量时注意不要粗暴操作，尽量使小鼠处于安静状态。4.3％水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠。倍诺喜(盐酸奥布卡因滴眼液，参天制药株式会社)表面麻醉滴眼液局部滴眼。眼压计调准后，将其测量头迅速垂直稳定的触碰小鼠角膜中央，并记录有效读数。测量时，切不可用力撑拉小鼠眼睑以暴露眼球，以免产生测量误差。系统误差控制在5％范围内。每只眼测量10次，取平均值。测量完毕后，局部妥布霉素滴眼液(爱尔康，美国)滴眼。

3.统计学分析

用SPSS 19.0软件单因素方差分析法(ANOVA)对数据进行统计分析，比较组间差异，显著性检验水准以*p<0.05,**p<0.01为有统计学差异。

4.组织免疫荧光检测高眼压动物视网膜RhoA表达情况

1)制作小鼠眼球组织冰冻切片，上封闭液，室温30分钟,甩去多余液体，不洗；

2)组织片上滴加的RhoA第一抗体4℃过夜，次日取出来后待切片恢复至室温后,放入PBS洗3次，每次5min；

4)滴加DAPI染色液，室温孵育10min，充分水洗；

5)晾干，防淬灭封片剂封片；

6)荧光显微镜观察拍照

5.实验结果

5.1地塞米松诱导慢性高眼压动物模型眼压变化情况：地塞米松局部点眼后眼压由7d开始逐步升高，14d时部分小鼠眼压升高至13.58±1.58mmHg而PBS点眼对照组眼压维持在8.99±0.89mmHg，直至地塞米松局部应用后28d，实验小鼠眼压均较正常对照组眼压明显升高(17.89±4.01mmHg vs 9.12±1.01；p<0.01)(图14)。

5.2组织免疫荧光检测高眼压动物视网膜RhoA表达情况：制作小鼠眼球组织冰冻切片，组织片上滴加的RhoA第一抗体，标记二抗。结果显示，慢性高眼压动物视网膜组织RhoA表达显著升高(图15)。

地塞米松诱导的慢性高眼压疾病模型视网膜神经节细胞损伤过程中RhoA表达增加，为进一步深入比较慢性高眼压动物与未用药动物视网膜神经节细胞编码和非编码基因的表达差异研究奠定基础，为视神经保护基因治疗药物和新的药物靶点的进行初步探讨。

本课题上述研究基础发现，地塞米松诱导的慢性高眼压疾病模型视网膜神经节细胞损伤过程中RhoA表达增加，为研究体内应用siRNA应用情况奠定了基础，进行视神经保护基因治疗药物和新的药物靶点的初步探讨。

1.实验动物：

2.地塞米松诱导慢性高眼压动物模型：采用0.1％地塞米松滴眼液(河南省眼科研究所药剂室配制)滴左眼，每天四次(约10ul/d),共4周。

6.眼压测量：用TONA-PENAVIA眼压计测量眼压。具体操作步骤同本文第六部分。

7.配置Rho siRNA体内转染试剂：用PBS溶解7μg RhoA siRNA,再按7μg：1.5μl转染试剂LipofectamineTM RNA iMAX混合。注射总量定容至5μl，余不足用PBS补齐。静置30min至完全反应。

8.玻璃体腔注射

BALB/c小鼠腔注射4.3％水合氯醛，裸小鼠腹腔注射4.3％水合氯醛，麻醉成功后将裸小鼠固定在手术显微镜下。用眼科镊挣开眼睑，充分暴露眼球，用微量注射器由角巩膜缘后0.5-1mm 15°斜向下进针，快速注射入5μl生理盐水或Rho siRNA体内转染试剂。进针时，注意避开晶体。

9.统计学分析

10.实验结果

10.1Real Time RT-PCR检测RhoA基因表达情况：RhoA siRNA前房注射后24h断颈处死动物，取眼球，体式显微镜下取出小梁组织加入Trizol。设计RhoA引物(见第二部分的2.1)，用Real Time RT-PCR对RhoA基因进行扩增。结果显示与对照组相比，地塞米松诱导培养下RhoA siRNA(siRhoA)组基因表达较同等培养条件下阴性对照组RhoA基因显著减少(p<0.05)

应用RhoA siRNA后与非siRhoA实验组相比，RhoA表达显著减少。以上的实验结果显示慢性高眼压动物模型中siRhoA玻璃体腔注射可以有效的降低RhoA的表达(图16)，为RhoA siRNA治疗青光眼和视神经保护提出了新方法，并提供了初步实验基础证实了其可行性。

序列表

<110> 河南省立眼科医院（河南省眼科研究所）

<120> 一种视神经保护的药物

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagcaaagac caaagatg 18

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acaagatgag gcaccca 17

Claims

1.RhoA siRNA在制备治疗青光眼和/或视神经保护的药物中的应用，所述的RhoAsiRNA其正义链为5'-GAAGUCAAGCAUUUCUGUC dTdT-3'，反义链为3'-dTdTCUUCAGUUCGUAAAGACAG-5'。

2.一种治疗青光眼和/或视神经保护的药物，其特征在于，含有RNA干扰序列RhoAsiRNA作为活性成份，所述的RhoA siRNA其正义链为5'-GAAGUCAAGCAUUUCUGUC dTdT-3'，反义链为3'-dTdT CUUCAGUUCGUAAAGACAG-5'。

3.根据权利要求2所述的治疗青光眼和/或视神经保护的药物，其特征在于，还含有转染试剂。

4.根据权利要求3所述的治疗青光眼和/或视神经保护的药物，其特征在于，所述的转染试剂是LipofectamineTM RNA iMAX。