CN103998454A - 用于治疗听力障碍和平衡障碍的双链寡核苷酸化合物 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及双链核酸化合物、包含所述双链核酸化合物的组合物以及在有此需要的受试者中用其治疗听力损失的方法。所述化合物优选地是化学合成的且修饰的dsRNA分子，其抑制选自由以下组成的组中表达的基因的表达：HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B以及NOTCH1。

Description

用于治疗听力障碍和平衡障碍的双链寡核苷酸化合物
相关申请
本申请要求2011年8月3日提交的标题为“Compounds,Compositionsand Methods For Treating Hearing Loss”的美国临时申请系列号61/514,541和2012年1月12日提交的标题为“Compounds,Compositions and MethodsFor Treating Hearing Loss”的美国临时申请系列号61/585,672的权益，为了所有目的将所述临时申请通过引用整体并入本文。
序列表
本申请通过引用并入存在于名为“120803_2094_84407_PCT_Sequence_Listing_BI”的文件中的核苷酸和/或氨基酸序列，该文件大小为5.097兆，且以具有与MS-Windows的操作系统兼容性的IBM-PC机格式创建于2012年8月3日，并随本申请提交。
发明领域
本发明涉及化合物、包含所述化合物的药物组合物以及使用其下调包含HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的与听力损失有关的基因的方法，所述基因的抑制有益于用于治疗听力损失，治疗平衡障碍（balance impairment），促进替代、再生或保护内耳耳毛（感觉）细胞或实现听力恢复/再生。
发明背景
siRNA和RNA干扰
RNA干扰（RNAi）是涉及双链（ds）RNA-依赖的基因特异性转录后沉默的现象。
听力障碍/听力损失
后天性听力障碍/听力损失可由几个因素引起，包含例如，暴露于有害噪声水平、机械性内耳创伤、衰老过程、暴露于毒性药物诸如但不限于顺铂和氨基糖苷类抗生素以及衰老。
属于本申请的受让人的PCT申请公布号WO2007084684和WO2009/147684涉及在治疗听力障碍和听力疾病中有用的化合物及组合物。
属于本申请的受让人的美国专利号7,825,099涉及p53寡核苷酸抑制剂用于治疗听力障碍的用途。
需要在治疗或减弱听力损失，治疗平衡损伤，促进替代、再生或保护内耳耳（感觉）毛细胞和或实现听力恢复/再生有用的分子、组合物、方法及药盒。
发明概述
本文中提供用于下调HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1表达的核酸分子、包含所述核酸分子的组合物以及药盒及其使用方法。该组合物、方法及药盒可涉及应用核酸分子（例如，短干扰核酸（siNA）、短干扰RNA（siRNA）、双链RNA（dsRNA）、微小RNA（miRNA）或短发夹RNA（shRNA）），其结合编码HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的核苷酸序列（例如mRNA序列）或其部分，例如，用于人HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、或CDKN1B的mRNA编码序列（SEQ ID NO:1-11），编码一种或多种由SEQ ID NO:12-22列举的蛋白质或蛋白质亚基。在某些优选的实施方案中，本文中公开的分子、组合物、方法及药盒下调或抑制HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B基因的表达。在各种实施方案中，所述核酸分子选自由以下组成的组中：未修饰的或化学修饰的dsRNA化合物，例如，下调HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1表达的siRNA或shRNA。
在一些优选的实施方案中，所述抑制剂是下调HES1表达的合成的、化学修饰的双链RNA（dsRNA）化合物。在某些优选的实施方案中，“HES1”是指人HES1。在一些优选的实施方案中，所述抑制剂是下调HES5表达的合成的、化学修饰的双链RNA（dsRNA）化合物。在某些优选的实施方案中，“HES5”是指人HES5。在一些优选的实施方案中，所述抑制剂是下调HEY1表达的合成的、化学修饰的双链RNA（dsRNA）化合物。在某些优选的实施方案中，“HEY1”是指人HEY1。在一些优选的实施方案中，所述抑制剂是下调HEY2表达的合成的、化学修饰的双链RNA（dsRNA）化合物。在某些优选的实施方案中，“HEY2”是指人HEY2。在一些优选的实施方案中，所述抑制剂是下调ID1表达的合成的、化学修饰的双链RNA（dsRNA）化合物。在某些优选的实施方案中，“ID1”是指人ID1。在一些优选的实施方案中，所述抑制剂是下调ID2表达的合成的、化学修饰的双链RNA（dsRNA）化合物。在某些优选的实施方案中，“ID2”是指人ID2。在一些优选的实施方案中，所述抑制剂是下调ID3表达的合成的、化学修饰的双链RNA（dsRNA）化合物。在某些优选的实施方案中，“ID3”是指人ID3。在一些优选的实施方案中，所述抑制剂是下调CDKN1B表达的合成的、化学修饰的双链RNA（dsRNA）化合物。在某些优选的实施方案中，“CDKN1B”是指人CDKN1B。在一些优选的实施方案中，所述抑制剂是下调NOTCH1表达的合成的、化学修饰的双链RNA（dsRNA）化合物。在某些优选的实施方案中，“NOTCH1”是指人NOTCH1。在各种实施方案中，优选针对两个或多个靶基因的dsRNA组合。在某些优选的实施方案中，“靶基因”是指人基因HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1。在一些实施方案中，优选的靶基因选自由以下组成的组中：HES1、HES5、HEY2、CDKN1B和NOTCH1。
当与相应的未修饰的核酸分子相比时，本文中提供的化学修饰的核酸分子及组合物显示包含以下的至少一种的有益的性质：增加的血清稳定性、提高的细胞摄取、降低的脱靶（off-target）活性、降低的免疫原性、提高内体释放、提高的至靶组织或细胞的特异递送以及的增加敲低/下调活性。
本文中还公开了在有此需要的受试者中用于治疗或预防病症、疾病、损伤或病况的发生或严重程度的方法，其中所述疾病或病况和/或与其相关的症状或病理与HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1基因的表达相关，例如，内耳的病症、疾病、损伤、病况或病理。在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在优选的实施方案中，所述受试者是人受试者。
在具体的实施方案中，本文中提供了靶向HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的化学修饰的dsRNA化合物、包含所述dsRNA化合物的组合物和药盒及其在治疗耳（耳、听觉）的病况或病理、尤其涉及内耳的耳（感觉）毛细胞死亡的病理中的使用方法。治疗的其他病况包含在其中HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1表达不利的任何病况，然后被用本发明的化合物治疗。
在一个方面，提供核酸分子（例如，dsRNA分子），其中（a）所述核酸分子是包含有义链和互补反义链的双链体；（b）所述核酸分子的每条链的长度独立地是18至49个核苷酸；（c）所述反义链的18至49个核苷酸的序列与编码哺乳动物HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的mRNA（例如，SEQ ID NO:1-11）的连续序列或其部分互补；和（d）所述有义链和反义链包含SEQ ID NO:23-26,666中的任一种所示的序列对。在一些实施方案中，所述有义链和反义链包含SEQID NO:26,667-26,912中的任一种所示的序列对。
在另一个方面，提供用于治疗，包含预防听力损失的发生或严重程度的方法，其中HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B和NOTCH1基因中的一个或多个的表达与听力障碍/听力损失的病因或进展有关。
在又另一个方面，提供用于治疗，包含预防平衡障碍的发生或严重程度的方法，其中HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B和NOTCH1基因中的一个或多个的表达与平衡障碍的病因或进展有关。
在另一个方面，提供用于治疗，包含预防内耳的耳（感觉）毛细胞的损失的发生或严重程度的方法，其中HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B和NOTCH1基因中的一个或多个的表达与耳（感觉）毛细胞的损失的病因或进展有关。
本文中提供的抑制性核酸优选地是具有修饰的dsRNA分子，当与相应的未修饰的dsRNA化合物相比时，其可增加活性、增加稳定性、和/或最大限度地减小毒性。这些分子，当与影响所述核酸递送至中耳及内耳的药物媒介物混合时，提供在治疗各种内耳病症中有用的有效的、安全的且患者应允的治疗化合物。设计所述dsRNA分子以下调靶基因表达并且减弱靶基因功能。在某些实施方案中，所述靶基因转录为在表1A中列出的SEQ ID NO:1-11中所示的mRNA多核苷酸中的任一种。
本文中提供的dsRNA分子是双链的化学修饰的寡核苷酸。在一些实施方案中，在生成化学修饰的dsRNA分子中有用的有义寡核苷酸和反义寡核苷酸RNA选自在SEQ ID NO:23-26912中所示的有义链寡核苷酸及相应的反义链寡核苷酸。
在如本文中公开的核酸分子（例如，dsRNA分子）的各种实施方案中，所述反义链长度可为18至49个核苷酸（例如，长度为18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个核苷酸）；或者长度为18至35个核苷酸；或者长度为18至30个核苷酸；或者长度为18至25个核苷酸；或者长度为18至23个核苷酸；或者长度为19至21个核苷酸；或者长度为25至30个核苷酸；或者长度为26至28个核苷酸。在如本文中公开的核酸分子（例如，dsRNA分子）的一些实施方案中，所述反义链长度为19个核苷酸。相似地本文中公开的核酸分子（例如，dsRNA分子）的有义链长度可为18至49个核苷酸（如，长度为18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个核苷酸）；或者长度为18至35个核苷酸；或者长度为18至30个核苷酸；或者长度为18至25个核苷酸；或者长度为18至23个核苷酸；或者长度为19至21个核苷酸；或者长度为25至30个核苷酸；或者长度为26至28个核苷酸。在如本文中公开的核酸分子（例如，dsRNA分子）的一些实施方案中，有义链长度为19个核苷酸。在如本文中公开的核酸分子（例如，dsRNA分子）的一些实施方案中，所述反义链及所述有义链的每一种的长度为19个核苷酸。如本文中公开的核酸分子（例如，dsRNA分子）的双链体区长度可为18至49个核苷酸（如，长度为大约18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个核苷酸），长度为18至35个核苷酸；或者长度为18至30个核苷酸；或者长度为18至25个核苷酸；或者长度为18至23个核苷酸；或者长度为18至21个核苷酸；或者长度为25至30个核苷酸；或者长度为25至28个核苷酸。在如本文中公开的核酸分子（例如，dsRNA分子）的各种实施方案中，双链体区长度为19个核苷酸。
在某些实施方案中，如本文中提供的核酸（例如，dsRNA核酸分子）的有义链和反义链是单独的寡核苷酸链。在一些实施方案中，所述单独的有义链与反义链，通过氢键例如沃尔森-克里克（Watson-Crick）碱基配对形成双链结构，也被称为双链体。在一些实施方案中，一个或多个核苷酸对形成非沃尔森-克里克碱基配对。在一些实施方案中，所述有义链和所述反义链是彼此共价连接的两个单独的链。在其他实施方案中，所述有义链和所述反义链是具有有义区与反义区的单一寡核苷酸的部分；在一些优选的实施方案中，所述寡核苷酸具有发夹结构。
在某些实施方案中，所述核酸分子是关于突出端对称的双链核酸（dsRNA）分子，并且在两个末端上具有平末端。在其他的实施方案中，所述核酸分子是关于突出端对称的dsRNA分子，并且在dsRNA分子的两个末端上具有核苷酸或非苷核酸或核苷酸与非核苷酸突出端的组合。在某些优选的实施方案中，所述核酸分子是关于突出端不对称的dsRNA分子，并且在所述分子的一个末端上具有平末端而在所述分子的另一个末端上具有突出端。在一些实施方案中，不对称的dsRNA分子具有在双链体的一侧上在所述有义链上出现的3’-突出端；和在分子的另一侧上在所述有义链5’-末端与所述反义链5’-末端上出现的平末端。在一些实施方案中，不对称的dsRNA分子具有在双链体的一侧上在所述有义链上出现的5’-突出端；和在分子的另一侧上在所述有义链3’-末端与所述反义链3’-末端上出现的平末端。在其他的实施方案中，不对称的dsRNA分子具有在双链体的一侧上在所述反义链上出现的3’-突出端；和在分子的另一侧上在所述有义链5’-末端与所述反义链5’-末端上出现的平末端。在一些实施方案中，不对称的dsRNA分子具有在双链体的一侧上在所述反义链上出现的5’-突出端；和在分子的另一侧上在所述有义链3’-末端与所述反义链3’-末端上出现的平末端。在一些实施方案中所述突出端是核苷酸突出端，在其他的实施方案中所述突出端是非核苷酸突出端。在一些实施方案中所述突出端是5’突出端；在替代性实施方案中所述突出端是3’突出端。
在一些实施方案中，所述核酸分子具有在一个末端上具有环结构而另一个末端上具有平末端的发夹结构（在一个寡核苷酸上具有所述有义链和反义链）。在一些实施方案中，所述核酸分子具有在一个末端上具有环结构而另一个末端上具有突出端的发夹结构；在某些实施方案中，所述突出端是3’-突出端；在某些实施方案中所述突出端是5’-突出端；在某些实施方案中所述突出端是在所述有义链上；在某些实施方案中所述突出端是在所述反义链上。
本文中公开的核酸分子（例如，dsRNA分子）可包含一个或多个例如本文中描述的修饰或修饰的核苷酸。例如，如本文中提供的核酸分子（例如，dsRNA分子）可包含具有修饰的糖的修饰的核苷酸；具有修饰的核碱基（nucleobase）的修饰的核苷酸；或具有修饰的磷酸基团的修饰的核苷酸。相似地，如本文中提供的核酸分子（例如，dsRNA分子）可包含修饰的磷酸二酯骨架和/或可包含修饰的末端磷酸基团。
如本文中提供的核酸分子（例如，dsRNA分子）可具有一个或多个包含例如如本文中描述的修饰的糖部分的核糖核苷酸。修饰的糖部分的非限定性实例是2’烃氧基修饰的糖部分。在一些优选的实施方案中，所述核酸包含至少一种2’-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸。
如本文中提供的核酸分子（例如，dsRNA分子）可具有一个或多个例如如本文中描述的修饰的核碱基。
如本文中提供的核酸分子（例如，dsRNA分子）可具有一个或多个例如如本文中描述的对所述磷酸二酯骨架的修饰。
如本文中提供的核酸分子（例如，dsRNA分子）可具有一个或多个例如如本文中描述的修饰的磷酸基团。
在各种实施方案中，所提供的核酸分子（例如，dsRNA分子）可包含未修饰的反义链和具有一个或多个修饰的有义链。在一些实施方案中，所提供的核酸分子（例如，dsRNA分子）可包含未修饰的有义链和具有一个或多个修饰的反义链。在优选的实施方案中，所提供的核酸分子（例如，dsRNA分子）在所述有义链与所述反义链中可包含一个或多个修饰的核苷酸。
如本文中提供的核酸分子（例如，dsRNA分子）在所述有义链和/或所述反义链的5’末端上可包含磷酸基团（即，5’-末端磷酸基团）。在一些实施方案中，本文中公开的dsRNA分子在所述反义链的5’末端上可包含磷酸基团。
如本文中提供的核酸分子（例如，dsRNA分子）在所述有义链和/或所述反义链的3’末端上可包含磷酸基团（即，3’-末端磷酸基团）。在一些实施方案中，本文中公开的dsRNA分子在所述反义链的3’末端上可包含磷酸基团。
在一些实施方案中，本文中公开的核酸分子（例如，dsRNA分子）在所述反义链和所述有义链的3’末端上可包含磷酸基团。
在一些实施方案中，本文中公开的核酸分子（例如，dsRNA分子），所述核酸分子的反义链和有义链在所述3’末端与所述5’末端上是非磷酸化的。
在一些实施方案中，提供对于下调HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1基因的表达有用的双链核酸化合物。在一些实施方案中，本文中提供了具有结构（A1）的双链RNA（dsRNA）分子：
（A1）        5’   (N)x-Z   3’      (反义链)
        3’ Z’-(N’)y-z”  5’     (有义链)
其中每一个N和N’为可为未修饰的或修饰的核糖核苷酸，或非常规部分；其中(N)x和(N’)y的每一个是其中每一个连续的N或N’通过共价键连接至下一个N或N’的寡核苷酸；
其中Z和Z’的每一个独立地存在或不存在，但如果存在，则独立地包含在其所存在的链的3’末端上共价连接的1-5个连续的核苷酸、1-5个连续的非核苷酸部分或其组合。
其中z”可存在或不存在，但如果存在，则为在(N’)y的5’末端上共价连接的加帽部分；
x和y的每一个独立地为从18到40的整数；
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补；并且其中(N)x包含反义序列而(N’)y包含以下任一种中所示的有义序列：SEQ ID NO:23-693和SEQ IDNO:26691-26706(HES1)；SEQ ID NO:1496-2029和SEQ IDNO:26725-26732(HES5)；SEQ ID NO:2704-3025和SEQ IDNO:26809-26816(ID1)；SEQ ID NO:3634-5053和SEQ ID NO:26825-26832(ID2)；SEQ ID NO:6206-6671和SEQ ID NO:26851-26866(ID3)；SEQ IDNO:7444-9007和SEQ ID NO:26887-26900(CDKN1B)；SEQ IDNO:10534-11549和SEQ ID NO:26761-26778(HEY1)；SEQ IDNO:13004-14801和SEQ ID NO:26785-26788(HEY2)；SEQ IDNO:16622-18643和SEQ ID NO:26922-26912(NOTCH1)。
在一些实施方案中，优选的(N)x和(N’)y示于以下任一种中：SEQ IDNO:26691-26706(HES1)；SEQ ID NO:26725-26732(HES5)；SEQ ID NO:26809-26816(ID1)；SEQ ID NO:26825-26832(ID2)；SEQ ID NO:26851-26866(ID3)；SEQ ID NO:26887-26900(CDKN1B)；SEQ ID NO:26761-26778(HEY1)；SEQ ID NO:26785-26788(HEY2)；SEQ ID NO:26922-26912(NOTCH1)。
在一些实施方案中，连接每一个连续的N和/或N’的共价键是磷酸二酯键。
在一些实施方案中，x=y并且x和y的每一个是19、20、21、22或23。在优选的实施方案中x=y=19。
在一些实施方案中，所述双链核酸分子包含选自描述为HES5_8（SEQID NO:26732和SEQ ID NO:26728）的核酸的(N)x和(N’)y。在一些实施方案中，(N)x包含至少一个2’OMe糖修饰的嘧啶或嘌呤核糖核苷酸；任选在位置7中的2’5’核糖核苷酸以及共价连接至3’末端的核苷酸或非核苷酸部分（Z）；而且其中(N’)y包含在3’末端位置（5’>3’）中的至少一个2’OMe糖修饰的核糖核苷酸和/或3-5个连续的2’5’核糖核苷酸；z’是存在的并且其中核苷酸或非核苷酸部分（Z”）共价连接到3’末端。在一些实施方案中，在(N)x中的1-8个嘧啶是2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，2’5’核糖核苷酸存在于位置7中；并且Z是存在的；而且其中(N’)y包含在位置15-19中的5个2’-5’核糖核苷酸；其中z”是存在的并且其中Z’是存在的。在优选的实施方案中，z”包含反向无碱基部分；其中Z’包含C3Pi部分；并且其中Z包含C3Pi-C3OH部分。
在一些实施方案中，所述双链核酸分子包含选自描述为CDKN1B_4（SEQ ID NO:26894和26887）的核酸的(N)x和(N’)y。在一些实施方案中，(N)x包含至少一种2’OMe糖修饰的嘧啶或嘌呤核糖核苷酸；任选在位置7中的2’5’核糖核苷酸以及共价连接至3’末端的核苷酸或非核苷酸部分（Z）；而且其中(N’)y包含在3’末端位置（5’>3’）中的至少一个2’OMe糖修饰的核糖核苷酸和/或3-5个连续的2’5’核糖核苷酸；z’是存在的并且其中核苷酸或非核苷酸部分（Z”）共价连接至3’末端。在一些实施方案中，在(N)x中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸存在于位置1、13和17中，任选地2’5’核糖核苷酸存在于位置7中；并且Z是存在的；而且其中(N’)y包含在位置2、11、15及18中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸；其中z”是存在的而且其中Z’是存在的。在优选的实施方案中，z”包含反向无碱基部分或氨基C3部分；其中Z’包含C3Pi部分；并且其中Z包含C3Pi-C3OH部分。
在如在本文中的结构（A1）中公开的核酸分子（例如，dsRNA分子）的一些实施方案中，所述双链核酸分子是siRNA，siNA或miRNA。在如本文中公开的结构（A1）的核酸分子（例如，dsRNA分子）的一些实施方案中，所述双链核酸分子是化学修饰的siRNA。
在一些实施方案中，所述双链核酸分子包含DNA部分或在所述反义链的位置1（5’末端）中与靶的错配。这样的双链体结构描述于本文中。根据一种实施方案，本文中提供了具有下面所示结构（A2）的双链dsRNA分子：
（A2）       5’    N1-(N)x-Z           3’(反义链)
             3’ Z’-N2-(N’)y-z”      5’(有义链)
其中每一个N1、N2、N和N’独立地是未修饰的或修饰的核苷酸或非常规部分；
其中(N)x和(N’)y的每一个是其中每一个连续的N或N’通过共价键连接至相邻的N或N’的寡核苷酸；
其中x和y的每一个独立地为17与39之间的整数；
其中N2共价地结合至(N’)y；
其中N1共价地结合至(N)x，并且与所述靶RNA（SEQ ID NO:1-11）错配或为与所述靶RNA互补的DNA部分；
其中N1为选自由以下组成的组中的部分：天然的或修饰的：尿苷、脱氧核糖尿苷、核糖胸苷、脱氧核糖胸苷、腺苷或脱氧腺苷，无碱基核糖部分以及无碱基脱氧核糖部分；
其中z”可以存在或不存在，但如果存在，则为N2-(N’)y的5’末端上共价连接的加帽部分；
其中Z和Z’的每一个独立地存在或不存在，但如果存在，则独立地为在其所存在的链的3’末端上共价连接的1-5个连续的核苷酸、1-5个连续的非核苷酸部分或其组合；以及
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补；并且其中(N)x的序列包含反义序列而(N’)y包含以下任一种中所示的有义序列：SEQ ID NO:694-1495和SEQ ID NO:26667-26690(HES1)；SEQ ID NO:2030-2703和SEQ IDNO:26707-26724(HES5)；SEQ ID NO:3026-3633和SEQ IDNO:26789-26808(ID1)；SEQ ID NO:5054-6205和SEQ ID NO:26817-26824(ID2)；SEQ ID NO:6672-7443和SEQ ID NO:26833-26850(ID3)；SEQ IDNO:9008-10533和SEQ ID NO:26867-26886(CDKN1B)；SEQ IDNO:11550-13003和SEQ ID NO:26733-26760(HEY1)；SEQ IDNO:14802-16389和SEQ ID NO:26779-26784(HEY2)；SEQ IDNO:18644-26666和SEQ ID NO:2601-26910(NOTCH1)。优选的(N)x和(N’)y示于以下任一种中：SEQ ID NO:26667-26690(HES1)；SEQ ID NO:26707-26724(HES5)；SEQ ID NO:26789-26808(ID1)；SEQ ID NO:26817-26824(ID2)；SEQ ID NO:26833-26850(ID3)；SEQ ID NO:26867--26886(CDKN1B)；SEQ ID NO:26733-26760(HEY1)；SEQ ID NO:26779-26784(HEY2)；SEQ ID NO:2601-26910(NOTCH1)。由结构（A2）的描述涵盖的分子在本文中还称为“18+1”或“18+1mer”。
在一些实施方案中，在产生dsRNA化合物中有用的N2-(N’)y和N1-(N)x存在于表I-IX中，特别是设计为“18+1”型的序列。
在结构（A2）的一些实施方案中，如本文中公开的核酸分子（例如，dsRNA分子）的(N)x包含相应于所述反义序列SEQ ID NO:23-26912中的任一种的序列。在某些优选的实施方案中，(N)x和(N’)y选自在表I-IX（SEQID NO:26667-26912）中显示的序列对。
在结构（A2）的一些实施方案中，(N’)y的序列与(N)x的序列完全互补。在各种实施方案中，N2-(N’)y的序列与N1-(N)x的序列互补。在一些实施方案中，(N)x包含与在SEQ ID NO:1-11中所示的靶mRNA中的约17至约39个连续的核苷酸完全互补的反义序列。在其他实施方案中，(N)x包含与在SEQ ID NO:1-11中所示的靶mRNA中的约17至约39个连续的核苷酸大体上互补的反义序列。在结构（A2）的一些实施方案中，N1与N2形成沃尔森-克里克(Watson-Crick)碱基对。在其他实施方案中，N1与N2形成非沃尔森-克里克碱基对。在一些实施方案中，碱基对形成于核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸之间。
在结构（A2）的一些实施方案中，x=y=18、x=y=19或x=y=20。在优选实施方案中，x=y=18。当在N1-(N)x中x=18时，N1是指位置1以及位置2-19包含于(N)18中。当在N2-(N’)y中y=18时，N2是指位置19以及位置1-18包含于(N’)18中。
在结构（A2）的一些实施方案中，N1共价地结合至(N)x并且与在SEQID NO:1-11中所示的靶mRNA错配。在各种实施方案中，N1共价结合至(N)x并且是与在SEQ ID NO:1-11中所示的靶mRNA互补的DNA部分。
在结构（A2）的一些实施方案中，在所述反义链的位置1中的尿苷被选自以下的N1取代：天然的或修饰的：腺苷、脱氧腺苷、尿苷、脱氧尿苷（dU）、核糖胸苷或脱氧胸苷。在各种实施方案中，N1选自天然的或修饰的：腺苷、脱氧腺苷或脱氧尿苷。例如，在一些实施方案中，在位置1中的胞苷被腺嘌呤或尿苷取代；在位置1中的鸟苷被腺嘌呤或尿苷取代；或腺嘌呤被鸟苷取代。
在结构（A2）的一些实施方案中，在所述反义链的位置1（N1）中的鸟苷被天然的或修饰的：腺苷、脱氧腺苷、尿苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷取代。在各种实施方案中，N1选自天然的或修饰的：腺苷、脱氧腺苷、尿苷或脱氧尿苷。
在结构（A2）的一些实施方案中，在所述反义链的位置1（N1）中的胞苷被天然的或修饰的：腺苷、脱氧腺苷、尿苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷取代。在各种实施方案中，N1选自天然的或修饰的：腺苷、脱氧腺苷、尿苷或脱氧尿苷。
在结构（A2）的一些实施方案中，在所述反义链的位置1（N1）中的腺苷被天然的或修饰的：脱氧腺苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷取代。
在结构（A2）的一些实施方案中，N1与N2在天然的或修饰的：尿苷或脱氧尿苷，与腺苷或脱氧腺苷之间形成碱基对。在其他实施方案中，N1与N2在天然的或修饰的：脱氧尿苷与腺苷之间形成碱基对。
在结构（A2）的一些实施方案中，所述双链核酸分子为siRNA、siNA或miRNA。如本文中提供的双链核酸分子还被称为“双链体”。在根据如本文中公开的结构（A2）的核酸分子（例如，dsRNA分子）的一些实施方案中，所述双链核酸分子是化学修饰的siRNA。
结构（A2）的某些优选的实施方案中，x=y=18。在一些实施方案中，x=y=18并且(N)x由存在于以下的反义寡核苷酸组成：SEQ ID NO:694-1495和SEQ ID NO:26667-26690(HES1)；SEQ ID NO:2030-2703和SEQ IDNO:26707-26724(HES5)；SEQ ID NO:3026-3633和SEQ IDNO:26789-26808(ID1)；SEQ ID NO:5054-6205和SEQ ID NO:26817-26824(ID2)；SEQ ID NO:6672-7443和SEQ ID NO:26833-26850(ID3)；SEQ IDNO:9008-10533和SEQ ID NO:26867-26886(CDKN1B)；SEQ IDNO:11550-13003和SEQ ID NO:26733-26760(HEY1)；SEQ IDNO:14802-16389和SEQ ID NO:26779-26784(HEY2)；SEQ IDNO:18644-26666和SEQ ID NO:2601-26910(NOTCH1)。
在一些实施方案中，N1选自天然尿苷及修饰的尿苷。在一些实施方案中，N1为天然尿苷。在一些实施方案中，(N)x包含反义寡核苷酸而(N’)y包含存在于以下所示的序列对中的有义寡核苷酸：SEQ ID NO:694-1495(HES1)；SEQ ID NO:2030-2703(HES5)；SEQ ID NO:3026-3633(ID1)；SEQID NO:5054-6205(ID2)；SEQ ID NO:6672-7443(ID3)；SEQ IDNO:9008-10533(CDKN1B)；SEQ ID NO:11550-13003(HEY1)；SEQ IDNO:14802-16389(HEY2)；SEQ ID NO:18644-26666(NOTCH1)。
在一些实施方案中。x=y=18并且N1-(N)x包含反义寡核苷酸而N2-(N)y包含存在于以下所示的序列对中的有义寡核苷酸：SEQ ID NO:26667-26690(HES1)；SEQ ID NO:26707-26724(HES5)；SEQ ID NO:26789-26808(ID1)；SEQ ID NO:26817-26824(ID2)；SEQ ID NO:26833-26850(ID3)；SEQ ID NO:26867-26886(CDKN1B)；SEQ ID NO:26733-26760(HEY1)；SEQ ID NO:26779-26784(HEY2)；SEQ ID NO:2601-26910(NOTCH1)。
在一些实施方案中。x=y=18并且N1选自天然的或修饰的尿苷、天然的或修饰的腺嘌呤、和天然的或修饰的胸苷。
在结构（A2）的一些实施方案中，N1为2’OMe糖修饰的尿苷或2’OMe糖修饰的腺苷。在结构（A2）的某些实施方案中，N2为2’OMe糖修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
在一些实施方案中，所述双链核酸分子包含选自描述为HES1_36(SEQID NO:26690和26678)的核酸的(N)x和(N’)y。在一些实施方案中，(N)x包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，和任选的在位置5、6或7中的至少一个中的2’-5’核糖核苷酸；其中(N’)y包含至少一个2’5’核糖核苷酸或2’OMe修饰的核糖核苷酸；其中z”是存在的；并且其中Z和Z’的每一个是存在的而且由共价连接至其所存在的链的3’末端的非核苷酸部分组成。在优选的实施方案中，(N)x包含在位置3、9、11及15中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸；而其中(N’)y包含在3’末端的位置15、16、17、18及19中的5个2’5’核糖核苷酸。在优选的实施方案中，z”包含反向无碱基部分；其中Z’包含C3Pi部分；而其中Z包含C3Pi-C3OH部分。
在一些实施方案中，所述双链核酸分子包含选自描述为HES1_14(SEQID NO:26681和26669)的核酸的(N)x和(N’)y。在一些实施方案中，(N)x包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，和任选的在位置5、6或7的至少一个中的2’-5’核糖核苷酸；其中(N’)y包含至少一个2’5’核糖核苷酸或2’OMe糖修饰的核糖核苷酸；其中z”是存在的；并且其中Z和Z’的每一个是存在的而且由共价连接至其所存在的链的3’末端的非核苷酸部分组成。在一些实施方案中，(N)x包含在位置1、3、9、11、15及18（5’>3’）中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸；而其中(N’)y包含在位置1中2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，和在3’末端的位置15、16、17、18及19（5’>3’）中的5个连续的2’5’核糖核苷酸。在一些实施方案中，(N)x包含在位置1、3、9、11、14、15及18（5’>3’）中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，和在位置7中的2’5’核糖核苷酸；而其中(N’)y包含在位置1中2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，和在3’末端的位置15、16、17、18及19（5’>3’）中的5个连续的2’5’核糖核苷酸。在一些实施方案中，(N)x包含在位置1、3、9、11、14、15及18（5’>3’）中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，存在于位置7中的2’5’核糖核苷酸，并且其中Z是存在的；而其中(N’)y包含在位置1、4、8、10、12及16中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，并且其中z”和Z’是存在的。在优选的实施方案中，z”包含反向无碱基部分；其中Z’包含C3Pi部分；而其中Z包含C3Pi-C3OH部分。
在一些实施方案中，所述双链核酸分子包含选自描述为HEY2_1(SEQID NO:26747和26733)的核酸的(N)x和(N’)y。在一些实施方案中，(N)x包含至少一个2’OMe糖修饰的嘧啶的核糖核苷酸；任选的在位置7中的2’5’核糖核苷酸以及共价连接至3’末端的核苷酸或非核苷酸部分；而其中(N’)y包含在3’末端位置（5’>3’）中的至少一个2’OMe糖修饰的核糖核苷酸和/或3-5个连续的2’5’核糖核苷酸；z’是存在的并且其中核苷酸或非核苷酸部分共价地连接至3’末端。在一些实施方案中，在(N)x中所述嘧啶核糖核苷酸中的1-8个为2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，2’5’核糖核苷酸存在于位置7中；并且Z是存在的；而其中(N’)y包含所述嘧啶核糖核苷酸的1-8个为2’OMe糖修饰的核糖核苷酸；其中z”是存在的并且其中Z’是存在的。在优选的实施方案中，z”包含反向无碱基部分；其中Z’包含C3Pi部分；而其中Z包含C3Pi-C3OH部分。
在一些实施方案中，所述双链核酸分子包含选自描述为HEY2_2(SEQID NO:26748和26734)的核酸的(N)x和(N’)y。在一些实施方案中，所述双链核酸分子包含选自描述为HEY2_1(SEQ ID NO:26747和26733)的核酸的(N)x和(N’)y。在一些实施方案中，(N)x包含至少一个2’OMe糖修饰的嘧啶核糖核苷酸；任选的在位置7中的2’5’核糖核苷酸以及共价连接至3’末端的核苷酸或非核苷酸部分；而其中(N’)y包含在3’末端位置（5’>3’）中的至少一个2’OMe糖修饰的核糖核苷酸和/或3-5个连续的2’5’核糖核苷酸中；z’是存在的并且其中核苷酸或非核苷酸部分共价地连接至3’末端。在一些实施方案中，在(N)x中的嘧啶核糖核苷酸中的1-8个为2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，2’5’核糖核苷酸存在于位置7中；并且Z是存在的；而且其中(N’)y包含嘧啶核糖核苷酸中的1-8个为2’OMe糖修饰的核糖核苷酸；其中z”是存在的并且Z’是存在的。在优选的实施方案中，z”包含反向无碱基部分；其中Z’包含C3Pi部分；而其中Z包含C3Pi-C3OH部分。
在一些实施方案中，所述双链核酸分子包含选自描述为CDKN1B_31(SEQ ID NO:26879和26869)的核酸的(N)x和(N’)y。在一些实施方案中，所述双链核酸分子包含选自描述为HEY2_1(SEQ ID NO:26747和26733)的核酸的(N)x和(N’)y。在一些实施方案中，(N)x包含至少一个2’OMe糖修饰的嘧啶的核糖核苷酸；任选的在位置7中的2’5’核糖核苷酸以及共价连接至3’末端的核苷酸或非核苷酸部分；而其中(N’)y包含在3’末端位置（5’>3’）中的至少一个2’OMe糖修饰的核糖核苷酸和/或3-5个连续的2’5’核糖核苷酸；z’是存在的并且其中核苷酸或非核苷酸部分共价地连接至3’末端。在一些实施方案中，在(N)x中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸存在于位置1、13及17中或存在于位置1、9、13、15及18中，任选的2’5’核糖核苷酸存在于位置7中；并且Z是存在的；而其中(N’)y包含在位置2、6、11、12、13、16及18中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸；其中z”是存在的；并且其中Z’是存在的。在一些实施方案中，在(N)x中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸存在于位置1、13及17中或在位置1、9、13、15及18中，任选的2’5’核糖核苷酸存在于位置7中；并且Z是存在的；而其中(N’)y包含在位置15-19中的2’5’核糖核苷酸；其中z”是存在的并且Z’是存在的。在优选的实施方案中，z”包含反向无碱基部分；其中Z’包含C3Pi部分；而其中Z包含C3Pi-C3OH部分。
在一些实施方案中，所述双链核酸分子包含选自描述为NOTCH1_2(SEQ ID NO:26907和26902)的核酸的(N)x和(N’)y。在一些实施方案中，(N)x包含至少一个2’OMe糖修饰的嘧啶或嘌呤核糖核苷酸；任选的在位置7中的2’5’核糖核苷酸以及共价连接至3’末端的核苷酸或非核苷酸部分（Z）；而其中(N’)y包含在3’末端位置（5’>3’）中的至少一个2’OMe糖修饰的核糖核苷酸和/或3至5个连续的2’5’核糖核苷酸；z’是存在的并且其中核苷酸或非核苷酸部分（Z”）共价地连接至3’末端。在一些实施方案中，在(N)x中2’OMe糖修饰的核糖核苷酸存在于位置1、13及17中或存在于位置1、3、5、9、11及17中，任选的2’5’核糖核苷酸存在于位置7中；并且Z是存在的；而其中(N’)y包含在位置15与17中2’OMe糖修饰的核糖核苷酸；其中z”是存在的并且其中Z’是存在的。在一些实施方案中，在(N)x中2’OMe糖修饰的核糖核苷酸存在于位置1、13及17中或存在于位置1、3、5、9、11及17中，任选地2’5’核糖核苷酸存在于位置7中；并且Z是存在的；而其中(N’)y包含在位置15-19中的5个2’-5’核糖核苷酸；其中z”是存在的并且Z’是存在的。在优选的实施方案中，z”包含反向无碱基部分；其中Z’包含C3Pi部分；而其中Z包含C3Pi-C3OH部分。
在结构（A1）和/或结构（A2）的实施方案中，每一个N由未修饰的核糖核苷酸组成。在结构（A1）和/或结构（A2）的实施方案中，每一个N’由未修饰的核糖核苷酸组成。在优选的实施方案中，N和/或N’的至少一个包含化学修饰的核糖核苷酸、未修饰的脱氧核糖核苷酸、化学修饰的脱氧核糖核苷酸或非常规部分。在一些实施方案中，所述非常规部分选自镜像核苷酸、无碱基核糖部分和无碱基脱氧核糖部分。在一些实施方案中，所述非常规部分为镜像核苷酸，优选L-DNA部分。在一些实施方案中，N或N’中的至少一个包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。
在结构（A1）和/或结构（A2）的一些实施方案中，(N’)y的序列与(N)x的序列完全互补。在结构（A1）和/或结构（A2）的其他实施方案中，(N’)y的序列与(N)x的序列大体上互补。
在结构（A1）和/或结构（A2）的一些实施方案中，(N)x包含与在SEQID NO:1-11的任一种中所示的靶mRNA中的约17至约39个连续核苷酸完全互补的反义序列。在结构（A1）和/或结构（A2）的其他实施方案中，(N)x包含与在SEQ ID NO:1-11的任一种中所示的靶mRNA中的约17至约39个连续核苷酸大体上互补的反义序列。在结构（A1）和/或结构（A2）的一些实施方案中，所述dsRNA化合物是平末端的，例如，其中z”、Z和Z’的每一个是不存在的。在替代性实施方案中，z”、Z和Z’中的至少一个是存在的。
在各种实施方案中，Z和Z’独立地包含如本文中限定的一个或多个共价连接的修饰的和或未修饰的核苷酸，包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，或一个或多个非常规部分例如反向无碱基脱氧核糖部分或无碱基核糖部分或镜像核苷酸；一个或多个非核苷酸的C3部分或其衍生物、非核苷酸的C4部分或其衍生物或非核苷酸的C5部分或其衍生物、非核苷酸的氨基-C6部分或其衍生物等。在一些实施方案中，Z’是不存在的而Z是存在的且包含一个或多个非核苷酸的C3部分。在一些实施方案中，Z是不存在的而Z’是存在的且包含一个或多个非核苷酸的C3部分。在一些实施方案中，Z和Z’的每一个独立地包含一个或多个非核苷酸的C3部分或一个或多个非核苷酸的氨基-C6部分。在一些实施方案中，z”是存在的并且选自镜像核苷酸、无碱基部分和反向无碱基部分。在结构（A1）和/或结构（A2）的一些实施方案中，Z和Z’的每一个包含无碱基部分，例如脱氧核糖无碱基部分(在本文中称为“dAb”)或核糖无碱基部分(在本文中称为“rAb”)。在一些实施方案中，Z和/或Z'的每一个包含两个共价连接的无碱基部分并且是例如dAb-dAb或rAb-rAb或dAb-rAb或rAb-dAb，其中每一个部分优选地通过基于磷酸的键（phospho-based bond）共价连接至相邻的部分。在一些实施方案中，所述基于磷酸的键包含硫代磷酸酯（phosphorothioate）、膦酰乙酸酯（phosphonoacetate）或磷酸二酯键。在优选的实施方案中，所述基于磷酸的键是磷酸二酯键。
在一些实施方案中，Z和/或Z’的每一个独立地包含烃基部分，任选丙烷[(CH2)3]部分（C3）或其衍生物，包括丙醇（C3OH）和丙二醇的磷酸衍生物（“C3Pi”）。在一些实施方案中，Z和/或Z'的每一个包含两个烃基部分，并且在一些实例中为C3Pi-C3OH。在C3Pi-C3OH的实例中，所述反义链的3’末端和/或所述有义链的3’末端通过基于磷酸的键共价地连接至C3部分并且所述C3部分通过基于磷酸的键共价地连接至C3OH部分。在一些实施方案中，所述基于磷酸的键包含硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯或磷酸二酯键。在优选的实施方案中，所述基于磷酸的键是磷酸二酯键。
在结构（A1）和（A2）的具体实施方案中，Z包含C3Pi-C3OH。在结构（A1）和（A2）的具体实施方案中，Z’包含C3Pi或C3OH。在结构（A1）和（A2）的一些实施方案中，双链核酸分子包含共价连接至所述反义链的3’末端的C3Pi-C3OH部分及共价连接至所述有义链的3’末端的C3Pi或C3OH部分。
在结构（A1）和/或结构（A2）的一些实施方案中，每一个N由未修饰的核糖核苷酸组成。在结构（A1）和/或结构（A2）的一些实施方案中，每一个N’由未修饰的核糖核苷酸组成。在优选的实施方案中，N和/或N’的至少一个是化学修饰的核糖核苷酸、未修饰的脱氧核糖核苷酸、化学修饰的脱氧核糖核苷酸或非常规部分。
在其他实施方案中，结构（A1）和/或（A2）的化合物包含至少一个在其糖残基中修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，所述化合物在糖残基的2’位置中包含修饰。在一些实施方案中，在2’位置中的修饰包含氨基、氟、烃氧基或烃基部分的存在。在某些实施方案中，所述2’修饰包含烃氧基部分。在优选的实施方案中，所述烃氧基部分是甲氧基部分（也称为2’-O-甲基、2’OMe、2’OMe、2’-OCH3）。在一些实施方案中，核酸化合物在所述反义链和所述有义链中的一个或两个中包含2’OMe糖修饰的交替核糖核苷酸。在其他实施方案中，化合物只在反义链(N)x或N1-(N)x中包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，所述2’OMe糖修饰的核糖核苷酸与未修饰的核苷酸相间。在某些实施方案中，所述反义链的中间核糖核苷酸，例如，在19-mer链中位置10中的核糖核苷酸，是未修饰的。在各种实施方案中，所述核酸化合物包含至少5个交替的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核苷酸。在另外的实施方案中，结构（A1）和/或（A2）的化合物在交替位置中包含修饰的核糖核苷酸，其中在(N)x或N1-(N)x的5’末端和3’末端的每一个核糖核苷酸在其糖残基中是修饰的，而在(N’)y或N2-(N’)y的5’末端和3’末端的每一个核糖核苷酸在其糖残基中是未修饰的。在各种实施方案中，在交替位置中的核糖核苷酸在所述糖残基的2’位置中是修饰的。
在一些实施方案中，所述核酸化合物包含至少5个交替的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核苷酸，例如，在位置1、3、5、7和9或在位置11、13、15、17、19（5’>3’）中。在一些实施方案中，结构（A1）的(N)x或结构（A2）的N1-(N)x包含在位置2、4、6、8、11、13、15、17和19中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，结构（A1）的(N)x或结构（A2）的N1-(N)x包含在位置1、3、5、7、9、11、13、15、17和19中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，结构（A1）的(N)x或结构（A2）的N1-(N)x在一个或多个嘧啶中包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。
在结构（A1）和/或（A2）的一些实施方案中，所述有义链与所述反义链在所述3’末端和所述5’末端都未磷酸化。在其他实施方案中，所述有义链和/或所述反义链中的一个或两个在所述3’末端磷酸化。在其他实施方案中，所述有义链和/或所述反义链中的一个或两个在所述5’末端磷酸化。
在一些实施方案中，本文中公开的双链分子包含下述修饰的一个或多个：
自所述反义链5’末端的位置5、6、7、8或9中的至少一个中的N选自DNA、TNA、2’5’核苷酸或镜像核苷酸；
自所述有义链5’末端的位置9或10中的至少一个中的N’选自TNA、2’5’核苷酸和假尿苷；
在(N’)y的3’末端上的4、5或6个连续位置中的N’包含2’5’核糖核苷酸；
在所述有义链、所述反义链或所述有义链与所述反义链二者中的一个或多个嘧啶核糖核苷酸是2’糖修饰的。
在一些实施方案中，本文中公开的双链分子包含下述修饰的组合：
所述反义链在自所述5’末端的位置5、6、7、8或9中的至少一个中包含DNA、TNA、2’5’核苷酸或镜像核苷酸；
所述有义链在自所述5’末端的位置9或10中包含TNA、2’5’核苷酸或假尿苷中的至少一种；以及
在所述有义链、所述反义链或所述有义链与所述反义链二者中的一个或多个嘧啶核糖核苷酸是2’修饰的。
在一些实施方案中，本文中公开的双链分子包含下述修饰的组合：
所述反义链在自所述5’末端的位置5、6、7、8或9中的至少一个中包含DNA、2’5’核苷酸或镜像核苷酸；
所述有义链在3’倒数（penultimate）位置或3’末端的位置上包含4、5或6个连续的2’5’核苷酸；以及
在所述有义链、所述反义链或所述有义链与所述反义链二者中的一个或多个嘧啶核糖核苷酸是2’糖修饰的。
在结构（A1）和/或（A2）的一些实施方案中，(N)y包含至少一个选自镜像核苷酸、2’5’核糖核苷酸以及TNA的非常规部分。在一些实施方案中，所述非常规部分是镜像核苷酸。在各种实施方案中，所述镜像核苷酸选自L-核糖核苷酸（L-RNA）和L-脱氧核糖核苷酸（L-DNA）。在优选的实施方案中，所述镜像核苷酸是L-DNA。在某些实施方案中，所述有义链在位置9或10（自所述5’末端）中包含非常规部分。在优选的实施方案中，所述有义链在位置9（自所述5’末端）中包含非常规部分。在一些实施方案中，所述有义链长度为19个核苷酸并且在位置15（自所述5’末端）中包含4、5或6个连续非常规部分。在一些实施方案中，所述有义链在位置15、16、17和18中包含4个连续的2’5’核糖核苷酸。在一些实施方案中，所述有义链在位置15、16、17、18和19中包含5个连续的2’5’核糖核苷酸。在各种实施方案中，所述有义链还包含Z’。在一些实施方案中，Z’包含C3OH部分或C3Pi部分。
在结构（A1）和/或（A2）的一些实施方案中，(N)y包含选自镜像核苷酸和通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键连接至相邻核苷酸的核苷酸的至少一个非常规部分。在一些实施方案中，所述非常规部分是镜像核苷酸。在各种实施方案中，所述镜像核苷酸选自L-核糖核苷酸（L-RNA）与L-脱氧核糖核苷酸（L-DNA）。在优选的实施方案中，所述镜像核苷酸是L-DNA。
在结构A1的一些实施方案中，(N’)y包含至少一个L-DNA部分。在一些实施方案中，x=y=19并且(N’)y由在位置1-17和19中的未修饰的核糖核苷酸以及在3’倒数第二的位置（位置18）上的一个L-DNA组成。在其他实施方案中，x=y=19并且(N’)y由在位置1-16和19中的未修饰的核糖核苷酸以及在3’倒数两位的位置（位置17和18）上的两个连续的L-DNA核苷酸组成。在各种实施方案中，所述非常规部分是通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键连接至相邻核苷酸的核苷酸。根据各种实施方案，(N’)y包含在所述3’末端上的通过2’-5’核苷酸间键连接的2、3、4、5或6个连续核糖核苷酸。在一种实施方案中，在(N’)y的3’末端上的4个连续的核糖核苷酸通过3个2’-5’磷酸二酯键连接。在一种实施方案中，在(N’)y的3’末端上的5个连续的核糖核苷酸通过4个2’-5’磷酸二酯键连接。在一些实施方案中，其中一个或多个2’-5’核糖核苷酸形成2’-5’磷酸二酯键，所述核苷酸还包含3’-O-甲基（3’OMe）糖修饰。在一些实施方案中，(N’)y的3’末端核苷酸包含3’OMe糖修饰。在某些实施方案中，x=y=19并且(N’)y包含在位置15、16、17、18和19中的通过2’-5’核苷酸间键连接至相邻核苷酸的2个或多个连续的核苷酸。在各种实施方案中，形成2’-5’核苷酸间键的核苷酸包含核糖核苷酸。在优选的实施方案中，所述2’-5’核苷酸间键是磷酸二酯核苷酸间键。在各种实施方案中，形成2’-5’核苷酸间键的核苷酸包含3’脱氧核糖核苷酸或3’甲氧基核苷酸。在各种实施方案中，形成2’-5’核苷酸间键的核糖核苷酸包含3’脱氧核糖核糖核苷酸或3’甲氧基核糖核苷酸。在一些实施方案中，x=y=19并且(N’)y包含在位置15-16、16-17与17-18之间或在位置16-17、17-18与18-19之间的通过2’-5’核苷酸间键连接至相邻核苷酸的核苷酸。在一些实施方案中，x=y=19并且(N’)y包含在位置16-17与17-18之间或在位置17-18与18-19之间或在位置15-16与17-18之间的通过2’-5’核苷酸间键连接至相邻核苷酸的核苷酸。在各种实施方案中，形成2’-5’核苷酸间键的核苷酸包含核糖核苷酸。在各种实施方案中，形成2’-5’核苷酸间键的核苷酸是核糖核苷酸。在其他实施方案中，在(N’)y中的嘧啶核糖核苷酸（rU，rC）被通过2’-5’核苷酸间键连接至相邻核糖核苷酸的核糖核苷酸取代。
在结构（A2）的一些实施方案中，(N)y包含至少一个L-DNA部分。在一些实施方案中，x=y=18并且N2-(N’)y由在位置1-17和19中的未修饰的核糖核苷酸以及在3’倒数第二的位置（位置18）中的一个L-DNA组成。在其他实施方案中，x=y=18并且N2-(N’)y由在位置1-16和19中的未修饰的核糖核苷酸以及在3’倒数两位的位置（位置17和18）中的2个连续的L-DNA组成。在各种实施方案中，所述非常规部分是通过2’-5’核苷酸间磷酸键连接至相邻核苷酸的核苷酸。根据各种实施方案，N2-(N’)y包含在3’末端上的通过2’-5’核苷酸间键连接的2、3、4、5或6个连续核糖核苷酸。在一个实施方案中，在N2-(N’)y的3’末端上的4个连续的核糖核苷酸通过3个2’-5’磷酸二酯键连接，其中形成2’-5’磷酸二酯键的一个或多个2’-5’核糖核苷酸还包含3’-O-甲基（3’OMe）糖修饰。在一些实施方案中，N2-(N’)y的3’末端核糖核苷酸包含2’OMe糖修饰。在某些实施方案中，x=y=18并且N2-(N’)y包含在位置15、16、17、18和19中的通过2’-5’核苷酸间键连接至相邻核苷酸的两个或多个连续的核苷酸。在各种实施方案中，形成2’-5’核苷酸间键的核苷酸包含3’脱氧核糖核苷酸或3’甲氧基核苷酸。在各种实施方案中，形成2’-5’核苷酸间键的核糖核苷酸包含3’脱氧核糖核糖核苷酸或3’甲氧基核糖核苷酸。在一些实施方案中，x=y=18并且N2-(N’)y包含在位置16-17与17-18之间或在位置17-18与18-19之间或在位置15-16与17-18之间的通过2’-5’核苷酸间键连接至相邻核苷酸的核苷酸。在各种实施方案中，形成2’-5’核苷酸间键的核苷酸包含核糖核苷酸。在各种实施方案中，形成2’-5’核苷酸间键的核苷酸是核糖核苷酸。在其他实施方案中，在(N’)y中的嘧啶核糖核苷酸（rU，rC）包含通过2’-5’核苷酸间键连接至相邻核糖核苷酸的核糖核苷酸。
在结构（A1）和/或（A2）的其他实施方案中，(N’)y包含1-8个修饰的核糖核苷酸，其中所述修饰的核糖核苷酸是脱氧核糖（DNA）核苷酸。在某些实施方案中，(N’)y包含1、2、3、4、5、6、7或最多达到8个的DNA部分。
在本发明优选的实施方案中，本文中提供的抑制剂是合成的、化学修饰的双链RNA（dsRNA）化合物，其下调HES1的表达并且包含选自表I的寡核苷酸对。在本优选的实施方案中，本文中提供的抑制剂是合成的、化学修饰的双链RNA（dsRNA）化合物，其下调HES5的表达并且包含选自表II的寡核苷酸对。在本优选的实施方案中，本文中提供的抑制剂是合成的、化学修饰的双链RNA（dsRNA）化合物，其下调HEY1的表达并且包含选自表III的寡核苷酸对。在本优选的实施方案中，本文中提供的抑制剂是合成的、化学修饰的双链RNA（dsRNA）化合物，其下调HEY2的表达并且包含选自表IV的寡核苷酸对。在本优选的实施方案中，本文中提供的抑制剂是合成的、化学修饰的双链RNA（dsRNA）化合物，其下调ID1的表达并且包含选自表V的寡核苷酸对。在本优选的实施方案中，本文中提供的抑制剂是合成的、化学修饰的双链RNA（dsRNA）化合物，其下调ID2的表达并且包含选自表VI的寡核苷酸对。在本优选的实施方案中，本文中提供的抑制剂是合成的、化学修饰的双链RNA（dsRNA）化合物，其下调ID3的表达并且包含选自表VII的寡核苷酸对。在本优选的实施方案中，本文中提供的抑制剂是合成的、化学修饰的双链RNA（dsRNA）化合物，其下调CDKN1B的表达并且包含选自表VIII的寡核苷酸对。在本优选的实施方案中，本文中提供的抑制剂是合成的、化学修饰的双链RNA（dsRNA）化合物，其下调NOTCH1的表达并且包含选自表IX的寡核苷酸对。本文中提供的表I至IX如下。
表I选取的HES1 dsRNA
在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26699和266901中所示的HES1_10的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26700和26692中所示的HES1_11的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26679和26667中所示的HES1_12的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26680和26668中所示的HES1_13的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ IDNO:26681和26669中所示的HES1_14的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26701和26693中所示的HES1_15的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26682和26670中所示的HES1_16的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26702和26694中所示的HES1_17的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQID NO:26703和26695中所示的HES1_18的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26683和26671中所示的HES1_19的反义序列及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26684和26672中所示的HES1_20的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26685和26673中所示的HES1_21的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26686和26674中所示的HES1_22的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ IDNO:26687和26675中所示的HES1_24的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26704和26696中所示的HES1_26的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26705和26697中所示的HES1_27的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26688和26676中所示的HES1_28的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQID NO:26689和26677中所示的HES1_33的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26690和26678中所示的HES1_36的反义及有义序列的反义链和有义链。
在一些优选的实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26681和26669中所示的HES1_14的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些优选的实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26690和26678中所示的HES1_36的反义序列及有义序列的反义链和有义链。
在所述有义链上和在所述反义链上的所有给出的位置为5’>3’。
在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26,681和26,669中所示的HES1_14的反义及有义序列的反义链和有义链并且包含下述修饰：
所述有义链包含在位置15、16、17、18和19中的5个连续的2’5’核糖核苷酸、共价连接在5’末端的加帽部分以及共价连接在3’末端的C3Pi部分；而所述反义链包含在位置1、3、9、11、14、15和18中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，任选在位置7中的2’5’核糖核苷酸以及共价连接至3’末端的C3Pi-C3OH部分；或
所述有义链包含在位置1、4、8、10、12和16中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，共价连接在5’末端的加帽部分以及共价连接在3’末端的C3Pi部分；而所述反义链包含在位置1、3、9、11、14、15和18中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，任选在位置7中的2’5’核糖核苷酸以及共价连接至3’末端的C3Pi-C3OH部分。
在具有HES1_14序列（在SEQ ID NO:26681和26669中所示的反义及有义序列）和如上述提供的修饰的dsRNA的优选的实施方案中，所述加帽部分是反向无碱基脱氧核糖核苷酸部分。
在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26690和26678中所示的HES1_36的反义及有义序列反义链和有义链并且包含下述修饰：
所述有义链包含在位置15、16、17、18和19中的5个连续的2’5’核糖核苷酸、共价连接在5’末端的加帽部分以及共价连接在3’末端的非核苷酸部分；而所述反义链包含在位置3、9、11和15中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，任选地在位置7中的2’5’核糖核苷酸以及共价连接至3’末端的非核苷酸部分。
在优选的实施方案中，所述有义链包含在位置15、16、17、18和19中的5个连续的2’5’核糖核苷酸、共价连接在5’末端的加帽部分以及共价连接在3’末端的C3Pi部分；而所述反义链包含在位置3、9、11和15中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸以及共价连接至3’末端的C3Pi-C3OH部分。在优选的实施方案中，所述加帽部分是反向无碱基脱氧核糖核苷酸部分。
表II选取的HES5 dsRNA
在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26732和26728中所示的HES5_8的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26729和26725中所示的HES5_10的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26716和26707中所示的HES5_19的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26717和26708中所示的HES5_20的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ IDNO:26730和26726中所示的HES5_21的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26718和26709中所示的HES5_22的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26719和26710中所示的HES5_23的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26720和26711中所示的HES5_24的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQID NO:26731和26727中所示的HES5_25的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26721和26712中所示的HES5_26的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26722和26713中所示的HES5_27的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26723和26714中所示的HES5_28的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26724和26715中所示的HES5_29的反义及有义序列的反义链和有义链。
在一些优选的实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26732和26728中所示的HES5_8的反义及有义序列的反义链和有义链。
表III选取的HEY1 dsRNA
在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26747和26733中所示的HEY1_1的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26748和26734中所示的HEY1_2的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26749和26735中所示的HEY1_3的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26770和26761中所示的HEY1_4的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ IDNO:26750和26736中所示的HEY1_5的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26751和26737中所示的HEY1_6的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26771和26762中所示的HEY1_7的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26772和26763中所示的HEY1_8的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ IDNO:26752和26738中所示的HEY1_9的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26753和26739中所示的HEY1_10的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26773和26764中所示的HEY1_11的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26754和26740中所示的HEY1_12的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26774和267658中所示的HEY1_13的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ IDNO:26755和26741中所示的HEY1_14的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26775和26766中所示的HEY1_15的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26756和26742中所示的HEY1_16的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26776和26767中所示的HEY1_17的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26757和26743中所示的HEY1_18的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ IDNO:267582和26744中所示的HEY1_19的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26777和26768中所示的HEY1_20的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26759和26745中所示的HEY1_21的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26760和26746中所示的HEY1_22的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26778和26769中所示的HEY1_23的反义及有义序列的反义链和有义链。
表IV选取的HEY2 dSRNA
在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26782和26779中所示的HEY2_1的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26783和26780中所示的HEY2_2的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26785和26787中所示的HEY2_3的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26786和26788中所示的HEY2_4的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ IDNO:26784和26781中所示的HEY2_5的反义及有义序列的反义链和有义链。
在一些优选的实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26782和26779中所示的HEY2_1的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些优选的实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26783和26780中所示的HEY2_2的反义及有义序列的反义链和有义链。
在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26782和26779中所示的HEY2_1的反义及有义序列的反义链和有义链并且包含下述修饰：
所述有义链包含在位置6和12中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、在5’末端上共价连接的加帽部分、在3’末端上共价连接的非核苷酸部分以及任选的在位置15、16、17、18和19中的5个连续的2’5’核糖核苷酸或在位置16和18中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸；而所述反义链包含在位置1、3、9、11、13、15、17和19中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、任选的在位置7中的2’5’核糖核苷酸以及共价连接至3’末端的非核苷酸部分。在优选的实施方案中，所述加帽部分是反向无碱基脱氧核糖核苷酸部分。在优选的实施方案中，在所述有义链的3’末端上共价连接的非核苷酸部分是C3Pi部分。在优选的实施方案中，在所述反义链的3’末端上共价连接的非核苷酸部分是C3PiC3OH或C3PiC3Pi部分。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26783和26780中所示的HEY2_2的反义及有义序列的反义链和有义链并且包含下述修饰：
所述有义链包含在位置4、11和13中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、在5’末端上共价连接的反向无碱基脱氧核糖核苷酸部分、在3’末端上共价连接的非核苷酸部分以及任选的在位置15、16、17、18和19中的5个连续的2’5’核糖核苷酸或在位置16中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸；而所述反义链包含在位置1、3、8、11、13、15、17和19中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、任选的在位置7中的2’5’核糖核苷酸以及共价连接至3’末端的非核苷酸部分。在优选的实施方案中，所述加帽部分是反向无碱基脱氧核糖核苷酸部分。在优选的实施方案中，在所述有义链的3’末端上共价连接的非核苷酸部分是C3Pi部分。在优选的实施方案中，在所述反义链的3’末端上共价连接的非核苷酸部分是C3PiC3OH或C3PiC3Pi部分。
表V选取的ID1 dsRNA
在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26799和26789中所示的ID1_10的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26800和26790中所示的ID1_11的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26813和26809中所示的ID1_12的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26801和26791中所示的ID1_13的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ IDNO:26802和26792中所示的ID1_14的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26803和26793中所示的ID1_15的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26814和26810中所示的ID1_16的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26815和26811中所示的ID1_17的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ IDNO:26804和26794中所示的ID1_18的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26805和26795中所示的ID1_19的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26806和26796中所示的ID1_20的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26807和26797中所示的ID1_21的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ IDNO:26808和26798中所示的ID1_22的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26816和26812中所示的ID1_23的反义及有义序列的反义链和有义链。
表VI选取的ID2双链体
在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26821和26817中所示的ID2_11的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26829和26825中所示的ID2_12的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26822和26818中所示的ID2_13的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26823和268192中所示的ID2_14的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ IDNO:26830和26826中所示的ID2_15的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26831和26827中所示的ID2_16的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26832和26828中所示的ID2_17的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26824和26820中所示的ID2_18的反义及有义序列的反义链和有义链。
表VII选取的ID3双链体
在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26859和26851中所示的ID3_9的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26860和26852中所示的ID3_10的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26861和26853中所示的ID3_11的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26842和26833中所示的ID3_25的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ IDNO:26843和26834中所示的ID3_26的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26844和26835中所示的ID3_27的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26845和26836中所示的ID3_28的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26846和26837中所示的ID3_29的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ IDNO:26862和26854中所示的ID3_30的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26863和26855中所示的ID3_31的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26847和26838中所示的ID3_32的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26864和26856中所示的ID3_33的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ IDNO:26848和26839中所示的ID3_34的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26849和26840中所示的ID3_35的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26865和26857中所示的ID3_36的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26850和26841中所示的ID3_37的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ IDNO:26866和26858中所示的ID3_38的反义及有义序列的反义链和有义链。
在一些优选的实施方案中，所述dsRNA包含具有ID3_32的反义及有义序列（SEQ ID NO:26847和26838）的反义链和有义链。在一些优选的实施方案中，所述dsRNA包含具有ID3_38的反义及有义序列（SEQ IDNO:26866和26858）的反义链和有义链。
在一些优选的实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26847和26838中所示的ID3_32的反义及有义序列的反义链和有义链并且包含下述修饰：
所述有义链包含在位置1中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、在5’末端上共价连接的加帽部分、在3’末端上共价连接的非核苷酸部分以及在位置15、16、17、18和19中的5个连续的2’5’核糖核苷酸；而所述反义链包含在位置2、5、8、13、15和18中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、任选地在位置5、6或7中包含2’5’核糖核苷酸以及共价连接至3’末端的非核苷酸部分。在一些实施方案中，所述反义链在其5’末端磷酸化。在优选的实施方案中，所述加帽部分是反向无碱基脱氧核糖核苷酸部分。在优选的实施方案中，在所述有义链的3’末端上共价连接的非核苷酸部分是C3Pi部分。在优选的实施方案中，在所述反义链的3’末端上共价连接的非核苷酸部分是C3PiC3OH或C3PiC3Pi部分。
在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26866和26858中所示的ID3_38的反义及有义序列的反义链和有义链并且包含下述修饰：
所述有义链包含在位置1和3中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、在5’末端上共价连接的加帽部分、在3’末端上共价连接的非核苷酸部分以及在位置15、16、17、18和19中的5个连续的2’5’核糖核苷酸；而所述反义链包含在位置1、6、9、13、16和18中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸以及共价连接至3’末端的非核苷酸部分。在一些实施方案中，所述反义链在其5’末端磷酸化。在优选的实施方案中，所述加帽部分是反向无碱基脱氧核糖核苷酸部分。在优选的实施方案中，在所述有义链的3’末端上共价连接的非核苷酸部分是C3Pi部分。在优选的实施方案中，在所述反义链的3’末端上共价连接的非核苷酸部分是C3PiC3OH或C3PiC3Pi部分。
表VIII选取的CDKN1B(p27)的双链体
在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26894和26887中所示的CDKN1B_3的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26895和26888中所示的CDKN1B_4的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26896和26889中所示的CDKN1B_10的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26897和26890中所示的CDKN1B_11的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26898和26891中所示的CDKN1B_18的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ IDNO:26866和26858中所示的CDKN1B_28的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26899和26892中所示的CDKN1B_29的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26878和26868中所示的CDKN1B_30的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26879和26869中所示的CDKN1B_31的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26900和26893中所示的CDKN1B_32的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26880和26870中所示的CDKN1B_33的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:268881和26871中所示的CDKN1B_34的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ IDNO:26882和26872中所示的CDKN1B_35的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26883和26873中所示的CDKN1B_36的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26884和26874中所示的CDKN1B_37的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26885和26875中所示的CDKN1B_38的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26886和26876中所示的CDKN1B_40的反义及有义序列的反义链和有义链。
在一些优选的实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26895和26888中所示的CDKN1B_4的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些优选的实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26879和268698中所示的CDKN1B_31的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些优选的实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26886和26876中所示的CDKN1B_40的反义及有义序列的反义链和有义链。
表IX选取的NOTCH1的dsRNA
在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26906和26901中所示的NOTCH1_1的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26907和26902中所示的NOTCH1_2的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26908和26903中所示的NOTCH1_3的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26909和26904中所示的NOTCH1_4的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26910和26905中所示的NOTCH1_5的反义及有义序列的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ IDNO:26912和26911中所示的NOTCH1_6的反义及有义序列的反义链和有义链。
在一些优选的实施方案中，所述dsRNA包含具有在SEQ ID NO:26907和26902中所示的NOTCH1_2的反义及有义序列的反义链和有义链。
在一些实施方案中，本文中提供包含选自在表I-IX中所示的寡核苷酸对的有义链和反义链的双链RNA分子。除非另外说明，沿着有义链或反义链的所有位置从5’至3’计数（5’-3’）。
在一些实施方案中，双链核酸分子包含在SEQ ID NO:23-26,666中所示的、优先在表I-IX（SEQ ID NO:26,667-26,912）中显示的具体有义链和具体反义链。在一些实施方案中，所述双链核酸分子具有结构：
其中每一个“|”表示核糖核苷酸之间的碱基配对。
其中每一个X为A、C、G、U中的任一个并且独立地为未修饰的或修饰的核糖核苷酸、未修饰的或修饰的脱氧核糖核苷酸或非常规部分；
其中Z和Z’的每一个独立地存在或不存在，但如果存在，则独立地为在其所存在的链的3’末端上共价连接的1-5个连续的核苷酸或非核苷酸部分或其组合；并且
其中z”可存在或不存在，但如果存在，则为在所述有义链的5’末端上共价连接的加帽部分。
在优选的实施方案中，所述双链核酸分子包含修饰的核糖核苷酸和非常规部分。
在一些实施方案中，提供双链核酸分子，其中所述反义链包含在位置5、6、7或8（5’-3’）的一个或多个中的镜像核苷酸或2’-5’连接的核糖核苷酸，以及在3’末端上共价连接的核苷酸或非核苷酸部分。在一些实施方案中，所述反义链还包含一个或多个2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，在所述反义链中的1、2、3、4、5、6或7个嘧啶核糖核苷酸为2’OMe糖修饰的嘧啶核糖核苷酸。在一些实施方案中，所述有义链包含在3’末端位置或3’倒数位置上的4个或5个连续的2’-5’连接的核苷酸、在3’末端上共价连接的核苷酸或非核苷酸部分、一个或多个2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、以及在5’末端上共价连接的加帽部分。所述dsRNA分子在反义链上可包含5’磷酸。
在一些实施方案中，提供双链核酸分子，其中所述反义链包含（5’>3’）在位置1、3、11、14、15、17和18中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、以及共价连接至3’末端的C3Pi-C3OH部分；而所述有义链包含（5’>3’）在位置15、16、17、18和19中的2’-5’连接的核糖核苷酸，3’末端的核苷酸或非核苷酸突出端；以及在5’末端上共价连接的加帽部分。在一些实施方案中，所述反义链在位置6中、在位置7中或在位置6与7中还包含2’-5’连接的核糖核苷酸。
在一些实施方案中，提供双链核酸分子，其中所述反义链包含（5’>3’）在位置1、3、6、11、14、15、17和18中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、以及共价连接至3’末端的C3Pi-C3OH部分；而所述有义链包含（5’>3’）在位置15、16、17、18和19中的2’-5’连接的核糖核苷酸、共价连接至3’末端的C3Pi或C3OH部分以及在5’末端上共价连接的加帽部分。
在一些实施方案中，提供双链核酸分子，其中所述反义链包含（5’>3’）在位置1、3、6、11、14、15、17和18中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、以及共价连接至3’末端的C3Pi-C3OH部分；而所述有义链包含（5’>3’）在位置15、16、17、18和19中的2’-5’连接的核糖核苷酸、共价连接至3’末端的C3Pi以及在5’末端上共价连接的反向无碱基脱氧核糖核苷酸加帽部分。在一些实施方案中，提供双链核酸分子，其中所述反义链包含（5’>3’）在位置1、3、11、14、15、17和18中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、在位置6、7和8中的一个或多个中的2’-5’连接的核糖核苷酸或镜像核苷酸、以及共价连接至3’末端的C3Pi-C3OH部分；而所述有义链包含（5’>3’）在位置15、16、17、18和19中的2’-5’连接的核糖核苷酸、3’末端的核苷酸或非核苷酸突出端；以及在5’末端上共价连接的加帽部分。
在一些实施方案中，提供双链核酸分子，其中所述反义链包含（5’>3’）在位置1、3、11、14、15、17和18中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、在位置6中的2’-5’连接的核糖核苷酸、以及共价连接至3’末端的C3Pi-C3OH部分；而所述有义链包含（5’>3’）在位置15、16、17、18和19中的2’-5’连接的核糖核苷酸、共价连接至3’末端的C3Pi或C3OH部分；以及在5’末端上共价连接的选自无碱基部分、反向无碱基部分、C6氨基和镜像核苷酸的加帽部分。
在一些实施方案中，提供双链核酸分子，其中所述反义链包含（5’>3’）在位置1、3、11、14、15、17和18中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、在位置6中的2’-5’连接的核糖核苷酸、以及共价连接至3’末端的C3Pi-C3OH部分；而所述有义链包含（5’>3’）在位置15、16、17、18和19中的2’-5’连接的核糖核苷酸、共价连接至3’末端的C3Pi以及在5’末端上共价连接的反向无碱基脱氧核糖核苷酸的加帽部分。
在一些实施方案中，提供双链核酸分子，其中所述反义链包含（5’>3’）在位置1、3、11、14、15、17和18中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、在位置6中的2’-5’连接的核糖核苷酸、以及共价连接至3’末端的C3Pi-C3OH部分；而所述有义链包含（5’>3’）在位置15、16、17、18和19中的2’-5’连接的核糖核苷酸、共价连接至3’末端的C3Pi以及在5’末端上共价连接的镜像核苷酸（L-脱氧核糖鸟苷-3’-磷酸）。
在一些实施方案中，提供双链核酸分子，其中所述反义链包含（5’>3’）在位置1、3、6、11、14、15、17和18中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、在位置7中的2’-5’连接的核糖核苷酸、以及共价连接至3’末端的C3Pi-C3OH部分；而所述有义链包含（5’>3’）在位置1中的任选的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、在位置15、16、17、18和19中的2’-5’连接的核糖核苷酸、共价连接至3’末端的C3Pi或C3OH部分；以及在5’末端上共价连接的选自无碱基部分、反向无碱基部分、C6氨基和镜像核苷酸的加帽部分。
在一些实施方案中，提供双链核酸分子，其中所述反义链包含（5’>3’）在位置1、3、6、11、14、15、17和18中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、在位置7中的2’-5’连接的核糖核苷酸、以及共价连接至3’末端的C3Pi-C3OH部分；而所述有义链包含（5’>3’）在位置1中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、共价连接至3’末端的C3Pi部分以及在5’末端上共价连接的反向无碱基脱氧核糖核苷酸的加帽部分。
在一些实施方案中，提供双链核酸分子，其中所述反义链包含（5’>3’）在位置1、3、6、11、14、15、17和18中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、在位置7中的2’-5’连接的核糖核苷酸、以及共价连接至3’末端的C3Pi-C3OH部分；而所述有义链包含（5’>3’）在位置1中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、以及在位置15、16、17、18和19中的2’-5’连接的核糖核苷酸、共价连接至3’末端的C3Pi部分以及在5’末端上共价连接的镜像核苷酸（L-脱氧核糖鸟苷-3’-磷酸）。
在一些实施方案中，提供双链核酸分子，其中所述反义链包含（5’>3’）在位置1、3、11、14、15、17和18中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、在位置6和7中的2’-5’连接的核糖核苷酸以及共价连接至3’末端的C3Pi-C3OH部分；而所述有义链包含（5’>3’）在位置1中的任选的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、在位置15、16、17、18和19中的2’-5’连接的核糖核苷酸、共价连接至3’末端的C3Pi或C3OH部分以及在5’末端上共价连接的选自无碱基部分、反向无碱基部分和镜像核苷酸的加帽部分。
在一些实施方案中，提供双链核酸分子，其中所述反义链包含（5’>3’）在位置1、3、11、14、15、17和18中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、在位置6和7中的2’-5’连接的核糖核苷酸、以及共价连接至3’末端的C3Pi-C3OH部分；而所述有义链包含（5’>3’）在位置1中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、在位置15、16、17、18和19中的2’-5’连接的核糖核苷酸、共价连接至3’末端的C3Pi部分以及在5’末端上共价连接的反向无碱基脱氧核糖核苷酸的加帽部分。
在一些实施方案中，提供双链核酸分子，其中所述反义链包含（5’>3’）在位置1、3、11、14、15、17和18中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、在位置6中的镜像核苷酸以及共价连接至3’末端的C3Pi-C3OH部分；而所述有义链包含（5’>3’）在位置1中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、以及在位置15、16、17、18和19中的2’-5’连接的核糖核苷酸、共价连接至3’末端的C3Pi部分以及在5’末端上共价连接的反向无碱基脱氧核糖核苷酸的加帽部分。在一些实施方案中，提供双链核酸分子，其中所述反义链包含（5’>3’）在位置1、3、11、14、15、17和18中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、在位置8中的镜像核苷酸以及共价连接至3’末端的C3Pi-C3OH部分；而所述有义链包含（5’>3’）在位置1中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、在位置15、16、17、18和19中的2’-5’连接的核糖核苷酸、共价连接至3’末端的C3Pi部分以及在5’末端上共价连接的反向无碱基脱氧核糖核苷酸的加帽部分。
在一些实施方案中，提供双链核酸分子，其中所述有义链包含（5’>3’）在位置1中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、在位置15、16、17、18和19中的2’-5’连接的核糖核苷酸、共价连接至3’末端的C3Pi部分以及在5’末端上共价连接的反向无碱基脱氧核糖核苷酸的帽部分，而所述反义链选自反义寡核苷酸，其包含（5’>3’）在位置1中以dT置换U、共价连接至在位置1中的脱氧核糖胸苷的5’磷酸、在位置3、11、14、15、17和18中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、在位置7中的2’-5’连接的核糖核苷酸以及共价连接至3’末端的C3Pi-C3OH部分；或
反义寡核苷酸，其包含（5’>3’）共价连接至在位置1中的尿苷的5’磷酸、在位置3、11、14、15、17和18中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、在位置7中的2’-5’连接的核糖核苷酸以及共价连接至3’末端的C3Pi-C3OH部分；或
反义寡核苷酸，其包含（5’>3’）在位置1中以C3置换U、共价连接至在位置1中的C3的5’磷酸、在位置3、11、14、15、17和18中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、在位置7中的2’-5’连接的核糖核苷酸以及共价连接至3’末端的C3Pi-C3OH部分；或
反义寡核苷酸，其包含（5’>3’）共价连接至在位置1中的尿苷的5’磷酸、在位置1、3、11、14、15、17和18中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸、在位置7中的2’-5’连接的核糖核苷酸以及共价连接至3’末端的C3Pi-C3OH部分。
上述修饰可应用于在SEQ ID NO:23-26,666中所示的核酸对（有义寡核苷酸及相应的反义寡核苷酸），并且，更具体地，可应用于在表I-IX（SEQID NO:26667-26,912）中所列出的dsRNA。
某些优选的双链体本文阐述于下表A中
表A
例如，HES1_12_S1938，为包含如下有义链和反义链的双链体：具有寡核苷酸序列5’>3’GCCAGCUGAUAUAAUGGAA的有义链，其中在位置1、2、4、5、6、8、9、11、13、14、16、17、18和19中的核糖核苷酸是未修饰的核糖核苷酸，在位置3、7、10、12和15中的核糖核苷酸是2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，反向无碱基部分共价连接至5’末端而C3-Pi部分共价连接至3’末端；和具有寡核苷酸序列5’>3’UUCCAUUAUAUCAGCUGGC的反义链，其中在位置2、3、5、6、8、10、11、13、14、15、17和18中的核糖核苷酸是未修饰的核糖核苷酸，在位置1、4、9、12、16和19中的核糖核苷酸是2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，在位置7中的核糖核苷酸是2’-5’连接的核糖核苷酸，磷酸任选地共价连接至5’末端而C3Pi-C3Pi部分共价连接至3’末端。
在第二个方面中，提供包含一种或多种本文中公开的这样的核酸化合物；以及药学上可接受的载体或赋形剂的组合物。在一些实施方案中，所述dsRNA分子作为裸dsRNA施用。在其他的实施方案中，dsRNA分子与药学上可接受的载体混合。在又其他实施方案中，所述dsRNA封装于药物载体中。
在第三个方面中，提供本文中公开的分子在治疗患有耳疾病或耳障碍的受试者中的用途。本文中提供在有此需要的受试者中用于治疗或预防听力损失的发生或严重程度的方法，其中所述听力损失与选自表1A中所示的、在SEQ ID NO:1-11的任何一个中所示的基因的靶基因的表达有关。此类方法包括对需要这样治疗的哺乳动物施用预防上或治疗上有效量的一种或多种此类化合物，所述化合物抑制或减少至少一种这样的靶基因的表达或活性。在各种实施方案中，本文中公开的方法提供用本文中公开的一个或多个dsRNA分子抑制一个以上的与耳病症有关的靶基因。
因此，在一种实施方案中，所述方法涉及通过抑制两种或多种靶基因来治疗在感染或患有耳病症的风险中的受试者，所述的靶基因为CDKN1B与ID3中的至少一个，任选地与HES1、HES5、HEY1或HEY2中的至少一个组合。
在优选的实施方案中，所述方法包含在施用针对HES1、HES5中的至少一个的寡核苷酸之前施用针对CDKN1B与ID3中的至少一个的寡核苷酸。在另一个实施方案中，所有的寡核苷酸一起施用。
在一些实施方案中，共施用针对HES1与HES5的dsRNA。
在一些实施方案中，共施用针对HES1的dsRNA及针对HES5及任选HEY2的dsRNA。在一些实施方案中，施用靶向CDKN1B的dsRNA，随后为针对HES1的dsRNA、或针对HES5的dsRNA、或针对HES1的dsRNA与针对HES5的dsRNA、或针对HES1的dsRNA与针对HEY1的dsRNA、或针对HES5的dsRNA与针对HEY1的dsRNA、或针对HES1的dsRNA与针对HEY2的dsRNA、或针对HES5的dsRNA与针对HEY2的dsRNA；任选的随后为针对ID1的dsRNA或针对ID2的dsRNA、或针对ID3的dsRNA。
在一些实施方案中，施用靶向HES1或HES5的dsRNA，随后为针对HEY1的dsRNA或针对HEY2的dsRNA；随后为任选的针对ID1的dsRNA或针对ID2的dsRNA、或针对ID3的dsRNA。在一些实施方案中，施用靶向NOTCH1的dsRNA，随后为针对HEY1的dsRNA或针对HEY2的dsRNA；随后为任选的针对ID1的dsRNA或针对ID2的dsRNA、或针对ID3的dsRNA。
在一些实施方案中，例如，同时地或依次地共施用至少两种dsRNA剂。在其他实施方案中，至少两种dsRNA剂以包含其组合的药物组合物施用。在一些实施方案中，所述dsRNA剂为组合抑制剂（combinedinhibitor），其是指能够下调选自由以下组成的组中的至少两种基因和/或基因产物的表达和/或活性的单剂：HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B和NOTCH1。这样的单剂的非限制性实例是在PCT专利公布号WO2007/091269中公开的串联与多臂的RNAi分子。
在另一个方面中，提供本文中公开的核酸分子化合物用于制备用于治疗内耳或中耳的疾病或病症的药物的用途。
在具体的实施方案中，本文中提供化学修饰的dsRNA寡核苷酸、包含化学修饰的dsRNA寡核苷酸的组合物以及用其在治疗听觉和前庭病、病症、损伤及病况的方法，包括，但不限于，耳毒素（ototoxin）诱导的听力损失、衰老相关的听力损失、由于末梢器官病变累及内耳毛细胞引起的听力损伤，例如，声损伤、病毒性内淋巴迷路炎、美尼尔症(Meniere’sdisease)；可为间歇性或持续性的耳鸣，其中有诊断为神经性亏损，由于细菌或病毒感染引起的听力损失，例如在耳部带状疱疹；由急性中耳炎引起的化脓性迷路炎、化脓性脑膜炎、慢性中耳炎、包括病毒起源的突发性耳聋，例如，由包括腮腺炎、麻疹、流感、水痘、单核细胞增多症及腺病毒的病毒引起的病毒性内淋巴迷路炎；先天性听力损失，例如其由风疹、分娩过程中的缺氧症、由于递送过程的创伤使血流入内耳、对母亲施用耳毒性药物、胎儿溶血症以及包括瓦登伯格氏综合征（Waardenburg's syndrome）和赫尔勒氏综合征（Hurler's syndrome）的遗传病况而引起。
还提供预防负责从内耳向大脑传送声音和平衡信息的听神经（也被称为前庭蜗神经或听神经）变性的方法。内耳毛细胞通过由耳蜗神经和前庭神经组成的听神经向大脑传送信息，并且自延髓出现然后随同面神经在颞骨中通过内耳道（或内听道）进入内颅骨。
此类方法包括对需要这样的治疗的哺乳动物施用预防性或治疗性有效量的一种或多种本文中公开的此类核酸分子，所述核酸分子抑制或减少HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1基因的表达或活性。
在另一方面，本文中提供用于治疗需要治疗与如下疾病或病症有关的疾病或病症或症状的受试者的方法：所述疾病或病症与HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的表达有关，所述方法包括对受试者施用减少或抑制在SEQ ID NO:1-11中所示的HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的表达的量的核酸分子。
另外，提供了具有有益的性质的双链寡核苷酸的新结构，并且其应用于针对任何靶序列的dsRNA分子，以便抑制靶基因特别是显示在SEQ IDNO:1-11中的mRNA序列的表达。本文中提供包含如本文中公开的各种修饰的功能性dsRNA核酸、其用于制造医药的用途、包含这样的修饰的功能性核酸的药物组合物以及用于治疗患有或易感如本文中公开的疾病或病症的患者的方法。
在又另一个实施方案中，提供用于治疗或预防患者中听力损伤发生或严重程度的方法，其包含对患者施用包含有效量的裸的、化学合成的dsRNA化合物的组合物。优选地，所述裸的dsRNA化合物被直接应用于耳蜗的圆窗膜或通过经鼓室注射或通过包含导管的经鼓室装置施用。
现在将要描述的优选的方法、材料以及实例仅是说明性的，而不旨在限制；类似或等同于本文中描述的那些材料和方法的材料和方法可用于本发明的实践或测试中。本发明的其他特征和优势将从下述的附图、详细描述以及从权利要求书中变得明显。
附图简述
图1：在CBA/J小鼠中氨基糖苷（AG）诱导的前庭感觉上皮损伤的小鼠模型的实验设计。将链霉素注入到后半规管（posterior semi-circular canal）（PSC）中，一周后将针对HES5的dsRNA注入PSC并且在注入dsRNA后两周进行评估。读数如下：利用用于计数毛细胞的肌球蛋白（Myosin）VIIa抗体（毛细胞特异性标志物）的全封固染色（whole-mount staining）；用于Atoh1阳性细胞（用于早期发育毛细胞的标志物）的全封固染色；Atoh1表达（mRNA水平）和HES5表达（mRNA水平）。
图2A-2B：Cy3标记的dsRNA在局部注入PSC后递送至AG-损伤的前庭感觉上皮。用鬼笔环肽（phalloidin）标记细胞。图2A：PSC，图片2B：椭圆囊（utricle）。箭头表示Cy3标记的dsRNA。
图3A-3B：用针对HES5的dsRNA的处理导致AG-损伤的前庭上皮中毛细胞的量增多。图3A：dsRNA处理的。图3B：媒介物处理的。箭头表示肌球蛋白VIIa-阳性细胞，其被确定为转分化（transdifferentiated）毛细胞。已报道肌球蛋白VIIa是毛细胞标志物（Hasson等人，1995，PNAS92:9815-9819）。
图4显示用针对HES5的dsRNA的处理促进毛细胞再生的数据。
图5显示在dsRNA HES5处理的样品中抗-Atoh1和抗-肌球蛋白VIIa的双重染色。实线箭头表示Atoh1染色中的一些，虚线箭头表示肌球蛋白7a染色中的一些。
图6显示用针对HES5的dsRNA的处理下调HES5的mRNA而上调Atoh1的mRNA的数据。
图7A-7B显示本文中公开的各种dsRNA核酸分子的血清稳定性结果。图7A显示与1ng未处理的双链体（“盒（box）”）比较时两个不同的HES1_14dsRNA在小鼠及大鼠血清（3、8和24小时）中及在大鼠CSF（CS）以及HCT116（HCT1）细胞提取物（3、8和24小时）中的稳定性。图7B显示与1ng未处理的双链体（“B”）比较时HES1_36_S2036双链体在CSF、大鼠血浆、细胞提取物和人血浆（3、8和24小时）中的血清稳定性。图8A-8B显示与1ng未处理的双链体（“盒”）比较时ID3dsRNA双链体在HCT116和CSF（3、8和24小时）中的稳定性
图8A显示与1ng未处理的双链体（“盒”）比较时ID3dsRNA双链体在小鼠和大鼠血清（3、8和24小时）中的血清稳定性。图8B显示与1ng未处理的双链体（“盒”）比较时ID3dsRNA双链体在HCT116和CSF（3、8和24小时）中的稳定性。
图9A显示CDKN1B dsRNA在大鼠CSF和大鼠血浆中的稳定性。图9B显示各种浓度的CDKN1B dsRNA的敲低活性。
图10A-10B显示4种不同的HEY1dsRNA核酸分子的血浆、CSF（脑髓液）以及细胞提取物的稳定性。图10A显示4种dsRNA在小鼠（Ms）和大鼠（Rt）血浆中以及大鼠CSF中3、8和24小时的稳定性。图10B显示4种dsRNA在人细胞提取物（HCT116）中的稳定性。
发明详述
本文中提供下调与听力损失有关的某些基因的表达的分子和组合物以及它们在治疗患有听力损失的受试者中的用途。在优选的实施方案中，所述方法包括部分或全部听力再生。HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B和NOTCH1的表达的抑制显示有益于听力的再生。本申请具体涉及抑制HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B和NOTCH1的表达的包括小干扰RNA（siRNA）化合物的dsRNA分子，并且涉及这些dsRNA分子在治疗听力损失中的用途。在SEQ IDNO:23-26912中所示为在产生dsRNA分子中有用的有义链及互补反义链。某些目前优选的有义链及反义链对示于在上的表I-IX中。
本文中详尽讨论了用于抑制HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的化合物、组合物和方法，并且所述化合物和/或组合物中的任一个可有益地应用于治疗患有听力障碍/听力损失的患者。
本发明提供用于抑制在体内靶HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1基因的表达的方法和组合物。一般地，所述方法包含以足以通过RNA干扰机制下调靶基因的表达的量施用包含靶向于选自SEQ ID NO:1-11中的任何一个的具体mRNA并且在生物学状态下（在细胞内）与mRNA杂交或相互作用的寡核糖核苷酸，例如包含小干扰RNA的dsRNA分子（即，dsRNA），或在细胞内可产生siRNA的核酸材料。
本发明一般地涉及下调在耳细胞中（例如在耳蜗的毛细胞中）表达的基因的表达的化合物，尤其涉及新的小干扰RNA（siRNA），并且涉及这些新的siRNA在治疗患有与耳中这些基因的表达有关的听力损失的受试者中的用途。
本文中详尽讨论了用于递送化学修饰的dsRNA分子至耳的方法，并且所述分子和/或组合物中的任一个可有益地应用于治疗患有听力损失的受试者。听力再生可为完整的或部分的，并且容易地由本领域技术人员来确定。
本文中公开的dsRNA具有可，例如，增加活性、增加稳定性、和或将毒性减到最少的结构和修饰；本文中公开的化学修饰的dsRNA分子用于防止或减弱靶基因表达，尤其本文中讨论的靶基因。
每个指示靶基因的非限定实例的详细内容列于下文表1A中。
表1A：用于治疗听力损失的靶基因
表1A提供本发明的寡核苷酸抑制剂所针对的人mRNA的多聚核苷酸序列的实例的gi（GeneInfo identifier）（基因信息标识符）和登录号。（“v”是指转录本变体（transcript variant））。
在表1A中的基因的任何一个或多个的抑制在治疗听力损失中以及用于听力再生是有用的。
靶基因简述如下：
1.HES1发状分裂相关增强子（hairy and enhancer of split）1，（果蝇）。官方标志HES1及名称：发状分裂相关增强子1，（果蝇）
别名：FLJ20408、HES-1、HHL、HRY、发状分裂相关增强子1、多毛同源物（hairy homolog）、转录因子HES-1。
HES1蛋白属于碱性螺旋-环-螺旋的转录因子家族。它是对于转录需要bHLH蛋白的基因的转录阻遏因子。人HES1mRNA多核苷酸序列示于SEQID NO:1中。人HES1多肽示于SEQ ID NO:12中。
2.HES5为发状分裂相关增强子5（果蝇）。官方标志HES1及名称：发状分裂相关增强子5（果蝇）
人HES5基因是关节软骨细胞中的Notch信号传导的下游标志物。人HES5mRNA多核苷酸序列示于SEQ ID NO:2中。人HES5多肽序列示于SEQ ID NO:13中。
3.DNA结合抑制因子1，显性负螺旋-环-螺旋蛋白。官方标志ID1及名称：DNA结合抑制因子1，显性负螺旋-环-螺旋蛋白[智人]。别名：ID、DNA-结合蛋白抑制因子ID-1；dJ857M17.1.2（DNA结合抑制因子1，显性负螺旋-环-螺旋蛋白）；DNA结合抑制因子1；分化抑制因子1
ID1是可与碱性HLH转录因子家族成员形成异二聚体的螺旋-环-螺旋（HLH）蛋白。关于这个基因发现了编码不同亚型的两个转录本变体。人ID1mRNA多核苷酸序列示于SEQ ID NO:3和4中。人ID1多肽序列分别示于SEQ ID NO:14和15中。
4.DNA结合抑制因子2，显性负螺旋-环-螺旋蛋白。官方标志ID2及名称：DNA结合抑制因子2，显性负螺旋-环-螺旋蛋白[智人]。别名：GIG8、ID2A、ID2H、MGC26389、DNA-结合蛋白抑制因子ID2；细胞生长抑制基因8；螺旋-环-螺旋蛋白ID2；DNA结合抑制因子2；分化抑制因子2
人ID2mRNA多核苷酸序列示于SEQ ID NO:5中。人ID2多肽序列示于SEQ ID NO:16中。
5.DNA结合抑制因子3，显性负螺旋-环-螺旋蛋白。官方标志ID3及名称：DNA结合抑制因子3，显性负螺旋-环-螺旋蛋白[智人]。别名：HEIR-1
人ID3mRNA多核苷酸序列示于SEQ ID NO:6中。人ID3多肽序列示于SEQ ID NO:17中。
6.周期素依赖性蛋白激酶抑制因子（cyclin-dependent kinase inhibitor）1B（p27，Kip1）。官方标志CDKN1B及名称：周期素依赖性蛋白激酶抑制因子1B（p27，Kip1）。别名：CDKN4、KIP1、MEN1B、MEN4、P27KIP1
周期素依赖性蛋白激酶抑制因子，其与CDK抑制因子CDKN1A/p21共享有限的相似性。人CDKN1B mRNA多核苷酸序列示于SEQ ID NO:7中。人CDKN1B多肽序列示于SEQ ID NO:18中。
7.HEY1-与YRPW基序相关的发状分裂相关增强子1。人HEY1mRNA多核苷酸序列示于SEQ ID NO:8和9中。人HEY1多肽序列示于SEQ IDNO:19和20中。
8.HEY2-与YRPW基序相关的发状分裂相关增强子2。人HEY2mRNA多核苷酸序列示于SEQ ID NO:10中。人HEY2多肽序列示于SEQ ID NO:21中。
9.NOTCH1-智人Notch同源物1，易位相关（果蝇）。人NOTCH1mRNA多核苷酸序列示于SEQ ID NO:11中。人NOTCH1多肽序列示于SEQ IDNO:22中。
在各种实施方案中，提供包含化学修饰的小干扰RNA（siRNA）的双链RNA（dsRNA），以及dsRNA在治疗各种疾病和医学病况中的用途。治疗的具体疾病及病症涉及听力损失。具体的靶基因呈现在表1A中。
在产生dsRNA中有用的优选的序列提供在SEQ ID NO:23-26912中。根据专有算法基于序列的评分优先考虑序列作为用于靶向人基因表达的最好序列。SEQ ID NO:23-693和26691-26706(HES1)、SEQ IDNO:1496-2029和26725-26732(HES5)、SEQ ID NO:2704-3025和26809-26816(ID1)、SEQ ID NO:3634-5053和26825-26832(ID2)、SEQ IDNO:6206-6671和26851-26866(ID3)、SEQ ID NO:7444-9007和26887-26900(CDKN1B)、SEQ ID NO:10534-11549和26761-26778(HEY1)、SEQ IDNO:13004-14801和26785-26788(HEY2)、SEQ ID NO:16622-18643和26922-26912(NOTCH1)所示的19-mer寡聚物。SEQ ID NO:694-1495(HES1)；SEQ ID NO:2030-2703(HES5);SEQ ID NO:3026-3633(ID1)；SEQ IDNO:5054-6205(ID2)；SEQ ID NO:6672-7443(ID3)；SEQ ID NO:9008-10533(CDKN1B)；SEQ ID NO:11550-13003(HEY1);SEQ ID NO:14802-16389(HEY2)；SEQ ID NO:18644-26666(NOTCH1)所示的18-mer寡聚物。所述寡聚物在根据结构A2产生dsRNA分子中是有用的。
本文中公开下调HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1表达的化合物，尤其公开新的化学修饰的双链RNA寡核苷酸（dsRNA），以及公开这些新的dsRNA在治疗各种疾病和医学病况（尤其耳的疾病和病症）中的用途。根据一方面，本发明提供包含未修饰的以及修饰的核苷酸和或非常规部分的抑制性的寡核苷酸化合物。所述化合物包含至少一个选自由糖修饰、碱基修饰以及核苷酸间键修饰组成的组中的修饰的核苷酸，而且还可包含DNA及修饰的核苷酸或非常规部分，其中所述非常规部分包含LNA（锁核酸）、ENA（乙烯桥接的核酸）、PNA（肽核酸）、阿拉伯糖苷、PACE、镜像核苷酸、通过2’-5’核苷酸间键连接至相邻核苷酸的核苷酸或具有6碳糖的核苷酸。
本文中详尽讨论了下调HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的方法、核酸分子和组合物，并且所述分子和/或组合物中的任一个可有益地应用于治疗患有所述任何述病症的受试者。
本文中提供的核酸化合物具有可增加活性、增加稳定性、和或将毒性减到最少的结构和修饰；在产生本文中公开的dsRNA化合物中有用的新的修饰可有益地应用于在预防或减弱HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1表达中有用的双链RNA。
在一些实施方案中，本文中提供具有结构（A1）的双链RNA化合物：
（A1）       5’    (N)x-Z  3’         (反义链)
             3’ Z’-(N’)y-z”5’      (有义链)
其中N和N’的每一个为可为未修饰的或修饰的核糖核苷酸，或非常规部分；
其中(N)x和(N’)y的每一个是其中每一个连续的N或N’通过共价键连接至下一个N或N’的寡核苷酸；
其中Z和Z’的每一个独立地存在或不存在，但如果存在，则独立地包含在其所存在的链的3’末端上共价连接的1-5个连续的核苷酸、1-5个连续的非核苷酸部分或其组合；
其中z”可存在或不存在，但如果存在，则为在(N’)y的5’末端上共价连接的加帽部分；
x和y的每一个独立地为从18到40的整数；
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补；并且其中(N)x包含反义序列而(N’)y包含以下所示的有义序列：SEQ ID NO:23-693和SEQ IDNO:26691-26706(HES1)、SEQ ID NO:1496-2029和SEQ IDNO:26725-26732(HES5)、SEQ ID NO:2704-3025和SEQ IDNO:26809-26816(ID1)、SEQ ID NO:3634-5053和SEQ ID NO:26825-26832(ID2)、SEQ ID NO:6206-6671和SEQ ID NO:26851-26866(ID3)、SEQ IDNO:7444-9007和SEQ ID NO:26887-26900(CDKN1B)、SEQ IDNO:10534-11549和SEQ ID NO:26761-26778(HEY1)、SEQ IDNO:13004-14801和SEQ ID NO:26785-26788(HEY2)、SEQ IDNO:16622-18643和SEQ ID NO:26922-26912(NOTCH1)。
优选的(N)x和(N’)y示于以下任一种中：SEQ ID NO:26691-26706(HES1)；SEQ ID NO:26725-26732(HES5)；SEQ ID NO:26809-26816(ID1)；SEQ ID NO:26825-26832(ID2)；SEQ ID NO:26851-26866(ID3)；SEQ IDNO:26887-26900(CDKN1B)；SEQ ID NO:26761-26778(HEY1)；SEQ IDNO:26785-26788(HEY2)；SEQ ID NO:26922-26912(NOTCH1)。
在一些实施方案中，连接每一个连续的N和/或N’的共价键是磷酸二酯键。
在一些实施方案中，x=y并且x与y的每一个为19、20、21、22或23。在优选的实施方案中，x=y=19。
在如本文中公开的核酸分子（例如，dsRNA分子）的一些实施方案中，所述双链核酸分子为siRNA、siNA或miRNA。
在一些实施方案中，所述双链核酸分子包含DNA部分或与反义链（5’末端）的位置1中的靶的错配。这种双链体结构在本文中描述。根据一种实施方案，提供具有如下所示的结构（A2）的双链dsRNA分子：
（A2）       5’    N1-(N)x-Z           3’(反义链)
             3’ Z’-N2-(N’)y-z”      5’(有义链)
其中每一个N1、N2、N和N’独立地是未修饰的或修饰的核苷酸或非常规部分；
其中(N)x和(N’)y的每一个是其中每一个连续的N或N’通过共价键连接至相邻的N或N’的寡核苷酸；
其中x和y的每一个独立地为17与39之间的整数；
其中N2共价地结合至(N’)y；
其中N1共价地结合至(N)x，并且与所述靶mRNA（SEQ ID NO:1-11）错配或为与所述靶mRNA互补的DNA部分；
其中N1为选自由以下组成的组中的部分：天然的或修饰的：尿苷、脱氧核糖尿苷、核糖胸苷、脱氧核糖胸苷、腺苷或脱氧腺苷、无碱基核糖部分以及无碱基脱氧核糖部分；
其中z”可存在或不存在，但如果存在，则为在N2-(N’)y的5’末端上共价连接的加帽部分；
其中Z和Z’的每一个独立地存在或不存在，但如果存在，则独立地为在其所存在的链的3’末端上共价连接的1-5个连续的核苷酸、1-5连续的非核苷酸部分或其组合；以及
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补；并且其中(N)x的序列包含反义序列而(N’)y包含以下所示的有义序列：SEQ ID NO:694-1495(HES1)、SEQID NO:2030-2703(HES5)、SEQ ID NO:3026-3633(ID1)、SEQ IDNO:5054-6205(ID2)、SEQ ID NO:6672-7443(ID3)、SEQ ID NO:9008-10533(CDKN1B)、SEQ ID NO:11550-13003(HEY1)、SEQ ID NO:14802-16389(HEY2)、SEQ ID NO:18644-26666(NOTCH1)。
优选的N1-(N)x和N2-(N’)y示于以下任一种中：SEQ IDNO:26667-26690(HES1)、SEQ ID NO:26707-26724(HES5)、SEQ ID NO:26789-26808(ID1)、SEQ ID NO:26817-26824(ID2)、SEQ IDNO:26833-26850(ID3)、SEQ ID NO:26867-26886(CDKN1B)、SEQ IDNO:26733-26760(HEY1)、SEQ ID NO:26779-26784(HEY2)、SEQ IDNO:2601-26910(NOTCH1)。
定义
为方便起见，对说明书、实施例和权利要求中所用的某些术语在本文进行描述。
应指出，如本文中所用，除非内容另外明确地指明，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数形式。
当依据Markush组或供选方案的其它分组描述本发明的方面或实施方案时，本领域技术人员将承认本发明从而也依据组的任意单个成员或成员的亚组的进行描述。
“抑制剂”是能够使基因的表达或该基因的产物的活性降低(部分或完全)至足以实现期望的生物或生理效应的程度的化合物。如本文中所用，术语“抑制剂”是指包含siRNA、shRNA、合成shRNA；miRNA、反义RNA及DNA以及核酶的寡核苷酸抑制剂的一种或多种。
“dsRNA分子”或“dsRNA抑制剂”是能够使基因的表达或该基因产物的活性下调或降低至足以实现期望的生物或生理效应的程度的化合物，并且包含siRNA、shRNA、合成shRNA、miRNA的一种或多种。抑制还称为下调，或对于RNAi而言称为沉默。
如本文中所用，术语“抑制”是指使基因的表达或该基因产物的活性降低至足以实现期望的生物或生理效应的程度。抑制是完全的或部分的。
如本文中所用，术语靶基因的“抑制”意指基因表达(转录或翻译)或靶基因的多肽活性的抑制，其中该靶基因选自转录成在SEQ ID NO:1-11的任一个中所示的mRNA的基因或SNP（单核苷酸多态性）或其其他变体。用于每一个靶基因的mRNA的gi号示于表1A中。该靶mRNA序列的多核苷酸序列，或具有mRNA序列的靶基因序列是指在SEQ ID NO:1-11中所示的mRNA序列，或优选与在SEQ ID NO:1-11中所示的mRNA的任何一种具有至少70%的同一性、更优选80%的同一性，甚至更优选90%或95%的同一性的其任何同源序列。因此，来自SEQ ID NO:1-11中的任一种的已经历如本文中描述的突变、改变或修饰的多核苷酸序列涵盖在本发明中。术语“mRNA多核苷酸序列”、“mRNA序列”和“mRNA”可互换使用。
如本文中所用，术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用并且是指包含脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的核苷酸序列。该术语应理解为包括从核苷酸类似物产生的RNA或DNA的类似物作为等同物。在本申请的通篇中，mRNA序列作为代表相应的基因列出。
“寡核苷酸”或“寡聚物”是指约2至约50个核苷酸的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列。每一个DNA或RNA核苷酸可独立地是天然的或合成的和或修饰的或未修饰的。修饰包括对寡核苷酸中的糖部分、碱基部分和或核苷酸之间的键之间的改变。本发明的化合物涵盖包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸以及其组合的分子。
“大体上互补”是指与另一个序列具有大于约84%的互补性。例如在由19个碱基对组成的双链体区域中，一个错配导致94.7%的互补性，两个错配导致约89.5%的互补性，并且3个错配导致约84.2%的互补性，这使得双链体区域大体上互补。因此大体上同一的是指与另一个序列具有大于约84%的同一性。
“核苷酸”意指涵盖脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，其可以是天然的或合成的、和或修饰的或未修饰的。修饰包括对寡核糖核苷酸中的糖部分、碱基部分和或核糖核苷酸之间的键的改变。如本文中所用，术语“核糖核苷酸”涵盖天然的和合成的、未修饰的和修饰的核糖核苷酸。修饰包括对寡核苷酸中的糖部分、碱基部分和/或核糖核苷酸之间的键的改变。
核苷酸可选自天然存在的或合成修饰的碱基。天然存在的碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。核苷酸的修饰的碱基包括肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基、2-丙基和其它烃基腺嘌呤、5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶、6-氮杂胞嘧啶和6-氮杂胸腺嘧啶(6-azathymine)、假尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-卤代腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-硫代腺嘌呤、8-硫代烃基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤和其它8-取代的腺嘌呤、8-卤代鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-硫代鸟嘌呤、8-硫代烃基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤和其它取代的鸟嘌呤、其它含氮腺嘌呤和脱氮腺嘌呤、其它含氮和脱氮鸟嘌呤、5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶。在一些实施方案中，寡聚物中的一个或多个核苷酸被肌苷取代。
根据一些实施方案，本发明提供包含未修饰的及修饰的核苷酸和或非常规部分的抑制性寡核苷酸化合物。该化合物包含至少一种选自由糖修饰、碱基修饰和核苷酸间键的修饰组成的组中的修饰的核苷酸，并且可含有DNA、以及修饰的核苷酸例如LNA（锁核酸）、ENA（乙烯桥接的核酸）、PNA（肽核酸）、阿拉伯糖苷、膦酰基羧酸酯(phosphonocarboxylate)或膦基羧酸核苷酸（PACE核苷酸）、镜像核苷酸或具有6碳糖的核苷酸。
将核苷酸/寡核苷酸的所有类似物或对其的修饰用于本发明，只要所述类似物或修饰不显著不利地影响核苷酸/寡核苷酸的功能。可接受的修饰包括糖部分的修饰、碱基部分的修饰、核苷酸间键的修饰及其组合。
糖修饰包括糖残基的2’部分上的修饰，并且涵盖氨基、氟、烃氧基例如甲氧基、烃基、氨基、氟、氯、溴、CN、CF、咪唑、羧酸酯、硫酯(thioate)、C1至C10低级烃基、取代的低级烃基、烃芳基或芳烃基、OCF3、OCN、O-、S-或N-烃基；O-、S-或N-烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2、N3；杂环烃基；杂环烃芳基；氨基烃基氨基；聚烃氨基或取代的甲硅烷基等，如欧洲专利EP 0 586 520 B1或EP 0 618 925 B1中所描述的。
在一个实施方案中，所述dsRNA分子包含至少一个在糖部分上包含2’修饰（“2’糖修饰”）的核糖核苷酸。在某些实施方案中，所述化合物包含2’O-烃基或2’-氟或2’O-烯丙基或任何其它2’修饰（任选地在交替的位置上）。其它稳定化修饰也是可能的（例如末端修饰）。在一些实施方案中，优选的2’O-烃基是2’O-甲基（甲氧基）糖修饰。
在一些实施方案中，寡核苷酸的主链被修饰，并且含有磷酸-D-核糖实体但也可含有硫代磷酸-D-核糖实体、三酯、硫酯、2’-5’桥接的主链(也可称为5’-2’)、PACE等。
如本文中所用，术语“非配对核苷酸类似物”意指包含非碱基配对部分的核苷酸类似物,包括但不限于6脱氨基腺苷(水粉蕈素(Nebularine))、4-Me-吲哚、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、Ds、Pa、N3-Me核糖U(N3-Me riboU)、N3-Me核糖T(N3-Me riboT)、N3-Me dC、N3-Me-dT、N1-Me-dG、N1-Me-dA、N3-乙基-dC、N3-Me dC。在一些实施方案中，非碱基配对核苷酸类似物为核糖核苷酸。在其它实施方案中，非碱基配对核苷酸类似物为脱氧核糖核苷酸。此外，可制备多核苷酸的类似物，其中一个或多个核苷酸的结构被根本改变并且更好地适合作为治疗性或实验性试剂。核苷酸类似物的实例为肽核酸(PNA)，其中DNA(或RNA)中的脱氧核糖(或核糖)磷酸主链被与在肽中发现的主链相似的聚酰胺主链替代。已显示PNA类似物抗酶促降解并且具有增强的体内和体外稳定性。可对核苷酸做出的其它修饰包括聚合物主链、环状主链、非环状主链、硫代磷酸-D-核糖主链、三酯主链、硫酯主链、2’-5’桥接的主链、人工核酸、吗啉代核酸、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、阿拉伯糖苷和镜像核苷(例如，β-L-脱氧核糖核苷而非β-D-脱氧核糖核苷)。包含LNA核苷酸的dsRNA分子的实例公开于Elmen等,(NAR2005,33(1):439-447)中。
本发明的化合物可用一种或多种反向核苷酸例如反向胸苷或反向腺苷来合成(参见，例如，Takei,等，2002,JBC277(26):23800-06)。
“镜像”核苷酸是具有与天然存在的或通常使用的核苷酸相反的手性的核苷酸，即，天然存在的(D-核苷酸)的镜像(L-核苷酸)，在镜像核糖核苷酸的情况下也称为L-RNA，和“spiegelmer”。核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，并且还可包含至少一个糖、碱基和或主链修饰。参见美国专利号6,586,238。同样地，美国专利号6,602,858公开了包含至少一个L-核苷酸置换的核酸催化剂。
其它修饰包括在寡核苷酸的5’和/或3’部分上的末端修饰并且也称为加帽部分。此类末端修饰选自核苷酸、修饰的核苷酸、脂质、肽、糖及反向无碱基部分。
“烃基（alkyl）部分或其衍生物”是指直链或支链碳部分以及本身部分或还包含官能团，包括醇、磷酸二酯、硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯，以及还包括胺、羧酸、酯、酰胺、醛。“烃（hydrocarbon）部分”和“烃基部分”可互换使用。
“末端官能团”包括卤素、醇、胺、羧酸、酯、酰胺、醛、酮、醚基团。
提供用于抑制体内靶基因表达的方法和组合物。一般地，所述方法包含以足以通过RNA干扰机制下调靶基因的表达的量施用寡核糖核苷酸，尤其是靶向从靶基因转录的mRNA的小干扰RNA（即，siRNA）。尤其，本发明的方法可用于抑制用于治疗疾病的靶基因的表达。本文中提供了针对本文中公开的靶基因并且作为治疗各种耳及前庭系统病理的有用的治疗剂的dsRNA分子。
提供用于抑制体内听力损失相关基因表达的方法和组合物。一般地，所述方法包含施用寡核糖核苷酸，尤其是足以通过RNA干扰机制以下调靶基因的表达的量靶向mRNA的双链RNA（例如，举例，siRNA），或包含它们的药物组合物。尤其，本发明的方法可用于抑制用于治疗本文中公开的疾病或病症或病况的与听力损失相关的基因的表达。
本文中公开化学修饰的dsRNA化合物，其下调转录成具有SEQ IDNO:1-11的任一种所示的多核苷酸序列的mRNA的靶基因的表达，以及包含一种或多种此类化合物的药物组合物。
本文中提供用于抑制体内HES1表达的方法和组合物。本文中提供用于抑制体内HES5表达的方法和组合物。本文中提供用于抑制体内HEY1表达的方法和组合物。本文中提供用于抑制体内HEY2表达的方法和组合物。本文中提供用于抑制体内ID1表达的方法和组合物。本文中提供用于抑制体内ID2表达的方法和组合物。本文中提供用于抑制体内ID3表达的方法和组合物。本文中提供抑制体内CDKN1B表达的方法和组合物。本文中提供用于抑制体内NOTCH1表达的方法和组合物。一般地，所述方法包含以足以通过例如RNA干扰机制下调HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1或BNOTCH1的表达的量施用靶向由HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1或BNOTCH1基因转录的mRNA的寡核糖核苷酸，尤其双链RNA（即，dsRNA）或可在细胞内产生dsRNA的核酸材料。尤其，本发明的方法可用于下调HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1或BNOTCH1的表达来治疗疾病、病症或损伤。根据本发明，所述核酸分子或HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1或BNOTCH1的抑制剂用作治疗耳内疾病或病症的药物。
本发明的dsRNA是双链体寡核糖核苷酸，其中有义链与靶基因的mRNA多核酸序列的18-40个连续的核苷酸片段大体上互补，并且反义链与所述有义链大体上互补。一般地，与靶mRNA序列的一些偏差可被耐受而不削弱siRNA活性(参见例如，Czauderna等，Nuc.Acids Res2003,31(11),2705-2716)。本发明的siRNA在转录后水平上抑制基因表达，破坏或不破坏mRNA。不希望受理论束缚，siRNA可靶向mRNA以特异性切割和降解和/或可抑制从靶向信使的翻译。
在一些实施方案中，所述dsRNA在一端或两端上为平端的。更具体地，所述dsRNA在由第一条链的5’末端和第二条链的3’末端定义的末端上、或由第一条链的3’末端和第二条链的5’末端定义的末端上可为平端的。
在其他的实施方案中，两条链中的至少一条链在5’末端上可具有至少一个核苷酸的突出端；该突出端可由至少一个脱氧核糖核苷酸组成。所述链中的至少一个在3’末端上也可任选地具有至少一个核苷酸的突出端。该突出端可由从约1个至约5个核苷酸组成。
RNA双链体的长度从约18至约40个核糖核苷酸，优选19个至23个核糖核苷酸。每一个链（寡聚物）的长度还可独立地具有选自由以下组成的组中的长度：约18个至约40个碱基、优选地18个至23个碱基以及更优选地19个、20个或21个核糖核苷酸。
另外，在某些优选的实施方案中，所述第一条链与靶核酸之间的互补性是完全的。在一些实施方案中，所述链大体上互补，即，在所述第一条链与靶核酸之间具有1个、2个或至多3个错配。
所述siRNA的第一条链的5’末端还可连接至第二条链的3’末端，或第一条链的3’末端可连接至第二条链的5’末端，所述连接经由核酸连接体连接，该核酸连接体通常具有3-100个核苷酸、优选约3个至约10个核苷酸长度。
本发明的siRNA化合物具有赋予增加活性、增加稳定性、降低毒性、降低脱靶效应和/或降低免疫反应中的一种或多种的结构和修饰。本发明的siRNA结构有益地应用于对防止或减弱靶基因表达、尤其本文中讨论的靶基因有用的双链RNA。
根据一个方面，本发明提供化学修饰的双链寡核苷酸，其包含至少一种选自由糖修饰、碱基修饰和核酸间键修饰组成的组中的修饰的核苷酸。因此，本发明的化学修饰的双链寡核苷酸化合物可含有修饰的核苷酸，例如，DNA、LNA（锁核酸）、ENA（乙烯桥接的核酸）、PNA（肽核酸）、阿拉伯糖苷、PACE、镜像核苷酸或具有6碳糖的核苷酸。PACE核苷酸及类似物的实例公开于美国专利号6,693,187和7,067,641，这两个专利通过引用并入本文。寡核苷酸还可包含2’O-甲基或2’-氟或2’O-烯丙基或任何其它2’修饰（任选地在交替的位置上）。不显著降低活性的其它稳定化修饰也是可能的（例如末端修饰）。寡核苷酸的活性部分的主链可包含磷酸-D-核糖实体但也可含有硫代磷酸-D-核糖实体、三酯、硫酯、2’-5’桥接的主链(也可称为5’-2’)、PACE或任何其他类型的修饰。在寡核苷酸的5’和/或3’部分上的末端修饰也是可能的。此类末端修饰可为脂质、肽、糖、反向无碱基部分或其他分子。
本发明还涉及下调本文中公开的基因的表达的化合物，尤其涉及新的ds RNA，并且涉及这些新的dsRNA在治疗各种疾病和医学病况中的用途。治疗的具体疾病和病况涉及本文中公开的听力损失或障碍。在本发明中所用的siRNA的列表被提供在表2A-10D中。21-或23-mer siRNA序列也可通过本文中公开的19-mer序列的5’和/或3’延伸生成。此类延伸优选与相应的mRNA序列互补。本发明的dsRNA具有可增加活性、增加稳定性、降低脱靶效应、降低免疫反应和/或降低毒性的结构和修饰。本发明的dsRNA结构有益地应用于对防止或减弱本文中公开的靶基因中的一种或多种的表达的有用的双链RNA。
本文中详尽讨论了抑制本文中公开的基因的本发明的方法、分子和组合物，并且所述分子和/或组合物的任一种可有益地应用于治疗患有一种或多种所述病况的受试者。
当依据Markush组或供选方案的其它分组描述本发明的方面或实施方案时，本领域技术人员将承认本发明从而也依据组的任意单个成员或成员的亚组进行描述。
人耳
耳包括3个主要结构部分：外耳、中耳和内耳，其共同起作用将声波转换为神经脉冲传送至大脑，在脑中它们被感知为声音。内耳还有助于保持平衡。
对于中耳和外耳的解剖是本领域的普通技术人员众所周知（参见，例如，Atlas of Sensory Organs:Functional and Clinical Analysis,Andrs Csillag,Humana Press(2005),第1-82页，通过引用并入本文）。简言之，中耳由鼓室和小充气腔组成，小充气腔含有3个连续的很小的称为听小骨的骨，其将鼓室连接至内耳。
内耳（迷路（labyrinth））是由耳蜗和前庭系统组成的复杂结构，其中耳蜗是听觉器官而前庭系统是平衡器官。前庭系统由球囊和椭圆囊及半规管组成，其中球囊和椭圆囊确定位置感觉，而半规管有助于保持平衡。
形如蜗牛壳的柯蒂氏器（the organ of Corti），其部分地由大约20,000个专门感觉细胞，称为“内耳毛细胞”或“毛细胞”组成。这些细胞具有小细毛突出（纤毛），其延伸进入耳蜗液。从中耳内的听小骨传送至内耳中的卵圆窗的声音震动引起液体和纤毛震动。在耳蜗的不同部位的毛细胞震动以响应不同的声音频率并且将震动转换为发送至脑用于加工处理和译码的神经脉冲。内耳毛细胞由内耳支持细胞环绕。支持细胞成为基础，至少部分地环绕，且物理上支持在内耳中的感觉毛细胞。支持细胞的代表性实例包括内杆（柱细胞）、外杆（柱细胞）、内指状细胞、外指状细胞（代特氏核的）、Held细胞、亨森细胞、柯拉狄乌氏细胞、Boettcher细胞、牙间细胞以及听齿（Huschke的）。
螺旋神经节是神经细胞群，其将声音的描述从耳蜗传送至脑。螺旋神经节神经元的细胞体发现于耳蜗的螺旋结构中并且为中枢神经系统的部分。它们的树突使突触与毛细胞的基底相接触，并且它们的轴突聚集成束以形成第八颅神经的听觉部分（前庭蜗神经）。
听力损失
听毛细胞是感觉感受器，其位于参与检测听觉的耳蜗的柯蒂氏器中。耳蜗毛细胞分为解剖上和功能上2种不同类型：外毛细胞及内毛细胞。听毛细胞将声音信息转换为电信号，其经由神经纤维传送至脑并且进行加工。
位于内耳（椭圆囊、球囊、壶腹）的前庭器官中的前庭毛细胞检测头位的变化并将此信息输送至脑以帮助保持平衡姿势和眼位。
在缺失听觉毛细胞时，声波不能转换为神经信号并且听力缺陷随之发生，例如，听力敏感性下降，即，感觉神经听力损失。在缺失前庭毛细胞时，平衡缺陷随之发生。
尽管听觉反射的保护效应，但是强声噪声仍可损伤并破坏毛细胞。不可逆的毛细胞坏死是由涉及活性氧簇（ROS）毛细胞内的代谢或生物化学变化引起的。暴露于某些药物及持续暴露于强声噪音中，除其他外，造成渐进破坏，最终导致在耳中的鸣声（耳鸣）和或听力损失。
后天性听力损失可由包括以下的一些因素造成：暴露于有害噪声水平、暴露于耳毒性药物例如顺铂和氨基糖苷类抗生素以及衰老。
属于本发明的受让人的美国系列号11/655,610涉及一般地通过抑制促凋亡基因并且尤其p53来治疗听力损伤的方法。国际专利公布号WO2005/119251涉及治疗耳聋的方法。国际专利公布号WO/2005/055921涉及用于治疗耳病症的发泡组合物。美国专利号7,087,581涉及治疗内耳的疾病和病症的方法。转让给本申请的受让人并且通过引用完整并入本文的PCT公布号WO2009/147684，公开了某些用于治疗耳病症与疾病的化合物和组合物。
dsRNA和RNA干扰
RNA干扰（RNAi）是涉及双链（ds）RNA-依赖的基因特异性转录后沉默的现象。由于存在响应于长链dsRNA分子而被激活的主动的、非特异性抗病毒防御机制，研究该现象和实验性操作哺乳动物细胞的最初尝试均以失败告终（Gil等人，Apoptosis,2000.5:107-114）。随后发现21个核苷酸RNA的合成双链体可在哺乳动物细胞中介导基因特异性RNAi，而不刺激通用抗病毒防御机制。（Elbashir等人Nature2001,411:494-498和Caplen等人PNAS USA2001,98:9742-9747）。因此，小干扰RNA（siRNA），其是短双链RNA，已广泛应用于抑制基因表达与理解基因功能。
RNA干扰（RNAi）是由小干扰RNA（siRNA）（Fire等人，Nature1998,391:806）或微小RNA（miRNA）（Ambros V.Nature2004,431:350-355)；和Bartel DP.Cell.2004116(2):281-97）介导的。在植物中观察到的相应的过程通常称为特异性转录后基因沉默或在真菌中观察到的称为压抑(quelling)。
siRNA化合物是双链RNA，其下调或沉默（即完全或部分抑制）内源或外源基因/mRNA的表达。RNA干扰是基于某些dsRNA种类进入特异蛋白复合物的能力，然后dsRNA在该复合物中靶向互补的细胞RNA并将其特异性降解。因此，RNA干扰反应表征了通常称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的含有siRNA的内切核酸酶复合物，其介导具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA的切割。靶RNA的切割在与siRNA双链体的反义链互补的区域的中间发生(Elbashir等人，Genes Dev.,2001,15，188)。更详细地，较长dsRNA被III型核糖核酸酶（DICER、DROSHA等（参见Bernstein等人，Nature,2001,409:363-6和Lee等人，Nature,2003,425:415-9）消化为短（17-29bp）dsRNA片段（也称为短抑制性RNA或“siRNA”）。此RISC蛋白复合物识别这些片段和互补的mRNA。整个过程以内切核酸酶裂解靶mRNA结束（McManus和Sharp,Nature Rev Genet,2002,3:737-47；Paddison和Hannon,Curr Opin Mol Ther.2003,5(3):217-24）。（关于这些术语和提出机理的其他信息，参见例如，Bernstein,等人,RNA.2001,7(11):1509-21；Nishikura,Cell.2001,107(4):415-8以及PCT公布号WO01/36646）。
相应于已知基因的dsRNA化合物的选择和合成被广泛地报道；参见例如Ui-Tei等人，J Biomed Biotechnol.2006；65052；Chalk等人，BBRC.2004,319(1):264-74；Sioud和Leirdal,Met.Mol Biol.；2004,252:457-69；Levenkova等人，Bioinform.2004,20(3):430-2；Ui-Tei等人，NAR2004,32(3):936-48。修饰的siRNA的用途和产品的实例参见Braasch等人，Biochem.,2003,42(26):7967-75；Chiu等人，RNA,2003,9(9):1034-48；PCT公布WO2004/015107(双环胺)；WO02/44321(Tuschl等人),以及美国专利号5,898,031和6,107,094。
一些团体已描述了具有在细胞内生成siRNA能力的基于DNA的载体的开发。方法通常包括在细胞内经有效处理以形成siRNA的短发夹RNA的转录（Paddison等人，PNAS USA2002,99:1443-1448；Paddison等人，Genes&Dev2002,16:948-958；Sui等人，PNAS USA2002,8:5515-5520；和Brummelkamp等人，Science2002,296:550-553）。这些报道描述了生成能够特异性靶向众多内源和外源表达基因的siRNA的方法。
若干研究显示siRNA可能在哺乳动物和人类二者体内都是有效的。特别地，Bitko等人表明当鼻内施用时，针对呼吸道合胞病毒（RSV）核壳体N基因的特异性siRNA分子有效治疗小鼠（Nat.Med.2005,11(1):50-55）。关于siRNA疗法应用的综述参见例如Barik（Mol.Med2005,83:764-773）和Chakraborty(Current Drug Targets20078(3):469-82)。此外，为了治疗年龄相关性黄斑变性（AMD），利用靶向VEGFR1受体的短siRNA的临床研究已在人患者中进行（Kaiser,Am J Ophthalmol.2006142(4):660-8）。有关作为治疗剂的siRNA的应用的更多信息可在Durcan，2008.Mol.Pharma中找到。5(4):559-566；Kim和Rossi,2008.BioTechniques44:613-616；Grimm和Kay,2007,JCI,117(12):3633-41。
化学合成
通过本领域熟知的用于合成核糖核酸(或脱氧核糖核酸)寡核苷酸的任何方法可合成本发明的化合物。这样的合成，除其它以外，描述于Beaucage和Iyer,Tetrahedron1992；48:2223-2311；Beaucage和Iyer,Tetrahedron1993；49:6123-6194和Caruthers,等人，Methods Enzymol.1987；154:287-313；硫酯的合成，除其它以外，描述于Eckstein,Ann.Rev.Biochem.1985；54：367-402，RNA分子的合成描述于由Herdewijn P.编著的Sproat，在HumanaPress2005；Kap.2：17-31，并且各自的下游过程，除其它以外，描述于由Oliver R.W.A.编著的Pingoud等，在IRL Press1989；Kap.7：183-208。
其它合成程序在本领域是已知的，例如Usman等，1987,J.Am.Chem.Soc.,109,7845；Scaringe等，1990,NAR.,18,5433；Wincott等，1995,NAR.23,2677-2684；以及Wincott等，1997,Methods Mol.Bio.,74,59描述的程序，而且这些程序可利用常用的核酸保护和偶联基团例如5′端上的二甲氧三苯甲基和3′端上的亚磷酰胺。需要时，并入修饰的(例如2′-O-甲基化的)核苷酸和未修饰的核苷酸。
单独地合成本发明的寡核苷酸，并且合成后例如通过连接(Moore等,1992,Science256,9923；Draper等，国际专利公布号WO93/23569；Shabarova等，1991,NAR19,4247；Bellon等，1997,Nucleosides&Nucleotides,16,951；Bellon等，1997,Bioconjugate Chem.8,204)或通过合成和/或去保护后杂交来将其连接在一起。
值得注意的是，可使用商购可得的机器(除其它以外，可从AppliedBiosystems获得)；根据本文中公开的序列制备寡核苷酸。可使用本领域熟知的方法(例如，参见美国专利号6,121,426)连接化学合成的片段的重叠对。单独地合成链，随后在管中使其彼此退火。然后，通过HPLC将双链siRNA与未退火的单链寡核苷酸(例如，由于它们之一的过量)分离。关于本发明的siRNA或siRNA片段，可合成两个或更多个此类序列，并将其连接在一起以用于本发明。
本发明的化合物也可通过串联合成方法合成，例如美国专利公布号US2004/0019001（McSwiggen）所描述，其中两条siRNA链作为单一的连续寡核苷酸片段或是通过可裂解的连接体隔开的链合成，随后裂解该连接体以提供分离的siRNA片段或是杂交并允许siRNA双链体纯化的链。该连接体可为多核苷酸连接体或者非核苷酸连接体。
本发明进一步提供包含用于治疗本文提到的任何疾病和病症的两种或多种siRNA分子的药物组合物，其中所述两个分子可以以产生相同或其他有益活性的量在药物组合物中物理混合到一起或可共价或非共价地结合，或通过长度介于2-100，优选2-50或2-30个核苷酸的核酸连接体连接到一起。在一种实施方案中，所述siRNA分子由如本文中描述的双链核酸结构组成，其中两个dsRNA分子选自本文中描述的寡核苷酸。因此，所述siRNA分子可共价或非共价地结合或通过连接体连接以形成串联siRNA化合物。包含两个siRNA序列的此类串联dsRNA分子通常为38-150个核苷酸长度，更优选38或40-60个核苷酸长度，并且如果串联分子中含有两个以上siRNA序列则相应的更长。还可以设想更长的串联化合物由两个或多个更长的编码由内部细胞加工产生的siRNA的序列组成，例如，长dsRNA，如编码两个或多个shRNA的串联分子。此类串联分子也被考虑为本公开内容的一部分。包含两个（串联）或多个（RNAi星状）本文中公开的dsRNA序列的化合物被设想。此类“串联”或“星状”分子的实例在转让给本申请受让人并通过引用完整并入本文的PCT专利公布号WO2007/091269中提供。
靶向HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的dsRNA分子可以是药物组合物中的主要活性成分，或可以是是含有两个或多个dsRNA（或者编码或内源产生两个或多个dsRNA的分子，分子混合物或编码两个或多个dsRNA的一个或多个串联分子）的药物组合物中的一种活性成分，所述药物组合物还由一个或多个靶向一个或多个其他基因的其他dsRNA分子组成。所述其他基因的同时抑制可能对本文中公开的疾病的治疗具有加性或协同效应。
另外，为了实现对本文中公开的疾病治疗的增强的靶向，本文中公开dsRNA或包含或编码该dsRNA的任何核酸分子可被连接或结合（共价或者非共价）到针对表达于靶细胞的细胞表面内化分子的抗体（包括适体分子）。例如抗-Fas抗体（优选中和抗体）可与任何dsRNA结合（共价或者非共价）。在另一个实例中，可像配体/抗体一样起作用的适体可与任何dsRNA结合（共价或者非共价）。
本文中公开的核酸分子可或直接或利用病毒或非病毒载体递送。当直接递送时，所述序列通常呈现核酸酶抗性。备选地，序列可被并入到表达盒或构建体中，使得序列在如本文中下述讨论的细胞中表达。通常构建体含有适当的调节序列或启动子以允许序列在靶细胞中表达。任选地用于递送本发明的化合物的载体是商购可得的，并且为了递送本发明的化合物的目的可被本领域技术中的一种已知方法修饰。
化学修饰
核苷酸/寡核苷酸的所有类似物或对其的修饰可用于本发明，只要所述类似物或修饰不显著影响核苷酸/寡核苷酸的功能。所述核苷酸可选自天然存在的或合成修饰的碱基。天然存在的碱基包含腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。核苷酸的修饰的碱基在本文中描述。
此外，可制备多核苷酸的类似物，其中一个或多个核苷酸的结构被根本改变并且更好地适合作为治疗性或实验性试剂。核苷酸类似物的实例为肽核酸(PNA)，其中DNA(或RNA)中的脱氧核糖(或核糖)磷酸主链被与在肽中发现的主链相似的聚酰胺主链替代。已显示PNA类似物抗酶促降解并且具有增强的体内和体外稳定性。对寡核苷酸可进行的其它修饰包括聚合物主链、环状主链、非环状主链、硫代磷酸-D-核糖主链、三酯主链、硫酯主链、2’-5’桥接的主链、人工核酸、吗啉代核酸、锁核酸(LNA)、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、阿拉伯糖苷和镜像核苷(例如，β-L-脱氧核糖核苷而非β-D-脱氧核糖核苷)。包含LNA核苷酸的dsRNA分子的实例公开于Elmen等,(NAR2005,33(1):439-447)中。
本发明的核酸化合物可用一种或多种反向核苷酸例如反向胸苷或反向腺苷来合成(参见，例如，Takei,等，2002,JBC277(26):23800-06)。
如本文中所用，术语“非常规部分”是指无碱基核糖部分、无碱基脱氧核糖部分、脱氧核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸、无碱基配对核苷酸类似物和通过2’-5’核苷酸间磷酯键连接至相邻核苷酸的核苷酸；C3、C4、C5和C6部分；桥接的核酸包括LNA和乙烯桥接的核酸。
如本文中所用，术语“加帽部分”包括无碱基核糖部分、无碱基脱氧核糖部分、无碱基核糖的修饰和无碱基脱氧核糖部分，包括2’O烃基修饰；反向无碱基核糖和无碱基脱氧核糖部分及其修饰；C6-亚胺基-Pi；镜像核苷酸，包括L-DNA和L-RNA；5’O-Me核苷酸；和核苷酸类似物，包括4',5'-亚甲基核苷酸；1-(β-D-赤呋喃基)核苷酸；4'-硫代核苷酸，碳环核苷酸；5'-氨基-烃基磷酸酯；1,3-二氨基-2-丙基磷酸酯、3-氨基丙基磷酸酯；6-氨基己基磷酸酯；12-氨基十二烷基磷酸酯；羟丙基磷酸酯；1,5-脱水己糖醇核苷酸；α-核苷酸；苏式-呋喃基核苷酸；无环3',4'-开环核苷酸；3,4-二羟丁基核苷酸；3,5-二羟戊基核苷酸、5'-5'-反向无碱基部分；1,4-丁二醇磷酸酯；5'-氨基；以及桥接或非桥接甲基磷酸酯5'-巯基部分。
无碱基脱氧核糖部分包括例如无碱基脱氧核糖-3’-磷酸；1,2-二脱氧-D-呋喃核糖-3-磷酸；1,4-脱水-2-脱氧-D-核糖醇-3-磷酸。反向无碱基脱氧核糖部分包括反向脱氧核糖无碱基；3’,5’反向脱氧无碱基5’-磷酸。
“镜像”核苷酸是具有与天然存在的或通常使用的核苷酸相反的手性的核苷酸，即，天然存在的(D-核苷酸)的镜像(L-核苷酸)。核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，并且还可包含至少一个糖、碱基和/或主链修饰。美国专利号6,602,858公开了包含至少一个L-核苷酸置换的核酸催化剂。镜像核苷酸包括例如L-DNA(L-脱氧核糖腺苷-3’-磷酸(镜像dA)；L-脱氧核糖胞苷-3’-磷酸(镜像dC)；L-脱氧核糖鸟苷-3’-磷酸(镜像dG)；L-脱氧核糖胸苷-3’-磷酸(镜像dT)和L-RNA(L-核糖腺苷-3’-磷酸(镜像rA)；L-核糖胞苷-3’-磷酸(镜像rC)；L-核糖鸟苷-3’-磷酸(镜像rG)；L-核糖尿苷-3’-磷酸(镜像dU)。
在结构A1或结构A2的各种实施方案中，Z和Z’不存在。在其他实施方案中，Z或Z’存在。在一些实施方案中，Z和/或Z’的每一个独立地包括C2、C3、C4、C5或C6烃基部分，任选地C3[丙烷，-(CH2)3-]部分或其衍生物，包括丙醇(C3-OH/C3OH)、丙二醇和丙二醇的磷酸二酯衍生物(“C3Pi”)。在优选的实施方案中，Z和/或Z’的每一个包含两个烃部分，并且在一些实例中为C3Pi-C3OH或C3Pi-C3Pi。每一个C3通过共价键，优选基于磷酸的键共价缀合至相邻C3。在一些实施方案中，基于磷酸的键是硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯或磷酸二酯键。
在结构A1的具体实施方案中，x=y=19并且Z包括至少一个C3烃基突出端。在结构A2的具体实施方案中，x=y=18并且Z包括至少一个C3烃基突出端。在一些实施方案中，C3-C3突出端通过共价键优选磷酸二酯键共价连接至(N)x或(N’)y的3’末端。在一些实施方案中，第一C3与第二C3之间的键是磷酸二酯键。在一些实施方案中，3’非核苷酸突出端是C3Pi-C3Pi。在一些实施方案中，3’非核苷酸突出端是C3Pi-C3P。在一些实施方案中，3’非核苷酸突出端是C3Pi-C3OH(OH是羟基)。在一些实施方案中，3’非核苷酸突出端是C3Pi-C3OH。
在各个实施方案中，烃基部分包括烃基衍生物，包括包含末端羟基、末端氨基或末端磷酸基团的C3烃基、C4烃基、C5烃基或C6烃基部分。在一些实施方案中，烃基部分为C3烃基或C3烃基衍生物部分。在一些实施方案中，C3烃基部分包含丙醇、磷酸丙酯、丙基硫代磷酸酯或其组合。C3烃基部分通过磷酸二酯键共价地连接至(N’)y的3’末端和/或(N)x的3’末端。在一些实施方案中，烃基部分包含丙醇、磷酸丙酯或丙基硫代磷酸酯。在一些实施方案中，Z和Z’的每一个独立地选自丙醇、磷酸丙酯、丙基硫代磷酸酯、其组合或其多联体(multiple)(特别地2或3个共价连接的丙醇、磷酸丙酯、丙基硫代磷酸酯或其组合)。在一些实施方案中，Z和Z’的每一个独立地选自磷酸丙酯、丙基硫代磷酸酯、丙基磷酸-丙醇；丙基磷酸-丙基硫代磷酸酯；丙基磷酸-磷酸丙酯；(磷酸丙酯)3、(磷酸丙酯)2-丙醇、(磷酸丙酯)2-丙基硫代磷酸酯。任何丙烷或丙醇缀合的部分可包括在Z或Z’中。
示例性3’末端非核苷酸部分的结构如下:
适应症
本文中公开的分子和组合物对治疗耳疾病和病症以及本文中描述的其他疾病和病况是有用的。
耳病症
本发明涉及对治疗患有各种耳病症或在各种耳病症的风险中的患者有用的组合物和方法。耳病症包括例如由耳毒素（ototoxin）、过度噪音或衰老诱导的听力损失。中耳和内耳病症产生许多相同症状，而且中耳病症可影响内耳病症，并且反之亦然。
除了听力损失，耳病症包括鼓膜炎、由各种病毒和细菌引起的鼓膜感染；例如由于对头部的碰撞的颞骨骨折；听神经瘤（听神经纤维瘤、听神经鞘瘤、前庭神经鞘瘤、第八神经瘤）。
在各种实施方案中，本文中公开的方法和组合物对治疗听力损失的各种病况是有用的。不限于理论，听力损失可能由于细胞凋亡引起的内耳毛细胞损伤或损失（Zhang等人，Neuroscience2003.120:191-205；Wang等人，J.Neuroscience23((24):8596-8607），其中损伤或损失由感染、机械性损伤、强声噪声（噪音）、衰老（老年性耳聋）或化学诱导的耳毒性引起的。
就本文中公开的上下文中的“耳毒素”来说是指如下物质：通过它的化学作用损伤、损害或抑制与听力相关的神经系统的声音感受器部分的活性，其进而损害听力（和/或平衡）。在本发明的上下文中，耳毒性包括对内耳耳毛细胞的有害影响。耳毒素包括包含抗肿瘤剂的治疗性药物、水杨酸盐、髓袢利尿剂（loop-diuretics）、奎宁和氨基糖苷类抗生素、食品或医药中的污染物以及环境或工业污染物。通常，进行治疗以预防或降低尤其施用治疗药物引起的或将引起的耳毒性。在暴露于耳毒素后，优选立即给予包含本发明的治疗有效量的化学修饰的siRNA化合物的组合物以预防或降低耳毒性影响。更优选，在用耳毒性药物或暴露于耳毒素之前或同时，通过施用本发明的药物组合物预防地进行治疗。通过引用并入本文的是第14版（1982）的The Merck Manual of Diagnosis and Therapy的第196、197、198和199章，Merck Sharp&Dome Research Laboratories,N.J.以及在最新的第16版中的相应章，包括第207和210章）中涉及听力和平衡损害的描述和诊断。
因此，在一个方面，提供用于治疗哺乳动物、优选人的方法和药物组合物，通过对需要这样治疗的哺乳动物施用本发明的化学修饰的siRNA化合物以预防、降低或治疗听力损伤、病症或失衡、优选耳毒素诱导的听力病况。一种实施方案涉及用于治疗听力病症或损伤的方法，其中耳毒性起因于施用治疗有效量的耳毒性药物。典型的耳毒性药物为化学治疗剂，例如抗肿瘤剂和抗生素。其他可能的候选者包括髓袢利尿剂、奎宁或奎宁样化合物、PDE-5抑制剂和水杨酸或水杨酸样化合物。
耳毒性是施用抗生素的剂量限制性副作用。持续超过1周每天接受1克抗生素的患者中的从4%至15%发展成可测量的听力损失，其慢慢变得严重并且如果继续治疗可能导致完全永久性耳聋。耳毒性氨基糖苷类抗生素包括但不限于新霉素、巴龙霉素、核糖霉素、利维霉素、卡那霉素、阿米卡星、托普霉素、紫霉素、庆大霉素、西苏霉素、奈替霉素、链霉素、地贝卡星、健霉素和二双氢链霉素或其组合。具体抗生素包括新霉素B、卡那霉素A、卡那霉素B、庆大霉素C1、庆大霉素C1a和庆大霉素C2以及已知的具有严重毒性的尤其耳毒性和肾毒性的类似物，其降低此类抗微生物剂的有效性（参见Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis ofTherapeutics,6th ed.,A.Goodman Gilman等人，编著；Macmillan PublishingCo.,Inc.,New York,第1169-71页(1980)）。
耳毒性也是用抗癌剂的严重剂量限制性副作用。耳毒性的肿瘤剂包括但不限于长春新碱、长春碱、顺铂及顺铂样化合物和紫杉酚及紫杉酚样化合物。顺铂样化合物除其它以外，包括碳铂（）、四铂、奥沙利铂、铂衍生物脂质体（aroplatin）及反式铂，且为基于铂的化学治疗剂。
具有已知耳毒性副作用的利尿剂，尤其“髓袢”利尿剂包括，但不限于，利尿磺酸、乙基丙烯酸和汞制剂。
耳毒性奎宁包括但不限于，通常用于治疗疟疾的奎宁合成代用品。在一些实施方案中，听力病症为包括西地那非（）、伐地那非（）和他达拉非（Cialis）的5型磷酸二酯酶（PDE-5）的抑制剂的副作用。
水杨酸盐，例如阿司匹林，因为它们的抗炎、止痛、退热及抗凝血的效果，是最常用的治疗性药物。不幸地，它们也具有耳毒性副作用。它们常常导致耳鸣（“在耳中的鸣声”）和暂时性听力损失。而且，如果药物以高剂量被用于延长时间使用，则听力损失可能变成永久性的且不可逆的。
在一些实施方案中，提供通过施用氨基糖苷抗生素治疗哺乳动物感染的方法、包括对需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的一种或多种化学修饰的下调靶基因表达的siRNA化合物以降低或预防与抗生素相关的耳毒素引起的听力损伤的改善。
本文中描述的分子和药物组合物对治疗声损伤或机械性损伤（优选导致内耳毛细胞损伤的声或机械性损伤）也是有效的。对于更严重的暴露，损伤可从相邻支持细胞损失发展到柯蒂氏器的完全破坏。感觉细胞的死亡可导致渐进性沃勒变性(Wallerian degeneration)和初级听神经纤维的损失。提供的方法对治疗声损伤，用于治疗机械性内耳损伤，或用于预防或减少与该操作相关的对内耳毛细胞的损害是有用的，其中声损伤由单一的暴露于极端强声噪音或随后长期暴露于超过85分贝的日常强声噪音引起的，其中机械性内耳损伤，例如，由电子设备插入内耳引起的。
另一类型的听力损失是老年性耳聋，其是大多数个体随着他们变老逐渐发生的听力损失。约30-35%年龄介于65-75岁之间的成年人和40-50%年龄在75岁和以上的人经历听力损失。本发明的方法对预防、降低或治疗与老年性耳聋相关的内耳病症和听力损伤的发生和/或严重程度是有用的。
声损伤
声损伤是长期暴露于高噪声所导致的听力损失类型。不限于理论，暴露于高噪声导致耳蜗上的毛细胞敏感性降低。对于更加严重的暴露，损伤可从相邻支持细胞的损失发展到柯蒂氏器的完全破坏。感觉细胞死亡可导致渐进性沃勒变性(Wallerian degeneration)和初级听神经纤维的损失。本文中公开了对减弱由于声损伤引起的听力损失是有用的分子、药物组合物和方法。本文提供用于治疗或预防暴露于声损伤的受试者中声损伤的靶向HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1中的任何一个的dsRNA分子。
提供治疗患有耳病症或在耳病症风险中的受试者的方法，其包含对受试者的耳道局部施用包含寡核苷酸抑制剂和药学上可接受的赋形剂或其混合物的药物组合物，从而以有效量降低与受试者耳中病症相关基因的表达来治疗受试者。还提供治疗患有耳病症或在耳病症风险中的受试者的方法，其包含对受试者耳道经鼓膜施用包含寡核苷酸抑制剂和药学上可接受的赋形剂或其混合物的药物组合物，从而以有效量降低与受试者耳中病症相关基因的表达来治疗受试者。在一种实施方案中，所述dsRNA经由后半规管造瘘（posterior semicircular canalostomy）递送。在一种实施方案中，所述dsRNA作为滴耳剂递送。
在一些实施方案中，当受试者的头部倾斜到一侧并且受治疗的耳朝上时，所述药物组合物应用于耳道。在一些实施方案中，利用用于滴耳剂的接受器，例如用例如每滴10至100微升的滴管或管芯针，将药物组合物应用于耳。
在一些实施方案中，耳病症涉及化学诱导的听力损失；例如由除其它以外的顺铂及其类似物；氨基糖苷抗生素、奎宁及其类似物；水杨酸盐及其类似物；5型磷酸二酯酶（PDE5）抑制剂或髓袢利尿剂诱导的听力损失。在一些实施方案中，耳病症是指噪声诱导的听力损失。在其他实施方案中，耳病症是与衰老相关的听力损失。
不限于理论，任选通过增加Atoh1的表达，抑制HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1可引起毛细胞再生。本发明的化合物对治疗、改善或预防其中需要促进支持细胞或耳蜗中外毛细胞或内毛细胞的增殖的、任选与耳毒素诱导的听力损失有关的任何疾病、病症或损伤是有用的。
前庭系统的疾病和病症
在各种实施方案中，本发明的核酸化合物和药物组合物用于治疗影响前庭系统的病症和疾病（其中HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的表达是有害的，例如美尼尔症）是有用的。在包括人的大多数哺乳动物中的前庭感觉系统，有利于平衡以及有利于空间取向和稳定感。前庭感觉系统连同耳蜗构成内耳迷路。前庭系统包括两部分：指示旋转运动的半规管系统和指示直线性加速的耳石。
美尼尔症
美尼尔症，也称为特发性膜迷路积水（ELH），是导致眩晕和耳鸣的内耳病症，并且是导致听力损失的最终神经元损伤的病症。美尼尔症的确切原因是未知的，但是根本机制被认为是由于内淋巴的积累引起膜迷路的畸变。内淋巴主要产生于耳蜗中的血管纹并且也产生于前庭迷路中的半月面和暗细胞（Sajjadi H,Paparella MM.Meniere's disease.Lancet.第372(9636):406-14）。如果内淋巴液从内淋巴流体空间通过前庭导水管到内淋巴囊的流动受阻，就会发生内淋巴积液。美尼尔症可影响受试者的一个或两个耳。与美尼尔症相关的主要发病是眩晕和渐进性听力损失的虚弱性质。现在的疗法没有成功预防神经元变性和相关听力损失的进展。将保护包括前庭蜗神经的内耳神经元不受损伤和/或将诱导前庭蜗神经的再生并且从而将减弱或预防美尼尔症患者中的听力损失的治疗学的治疗将是非常被期望的。
本文中提供的核酸、组合物、方法和药盒对治疗在美尼尔症的风险中或患有美尼尔症的受试者是有用的。
总之，没有用于预防和/或治疗本文中公开的病况的疗法的有效模式。可用的治疗，除其它外，由于缺少靶向性具有严重副作用的缺点，而且因此仍有需要为了上述目的开发新的治疗化合物和方法。
在各种实施方案中，本发明的化合物和药物组合物对治疗或预防各种影响耳的疾病、病症和损伤是有用的，例如，不限于，本文中下述公开的疾病、病症和损伤。不限于理论，据信本发明的分子预防耳内的各种类型细胞的死亡。
药物组合物
提供通过用能够介导下调HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1基因表达或介导对HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1基因表达的RNA干扰的小核酸分子，例如短干扰核酸（siNA）、干扰RNA（RNAi）、短干扰RNA（siRNA）、双链RNA（dsRNA）、微小-RNA（miRNA）和短发夹RNA（shRNA）分子，下调HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1表达的组合物和方法。
虽然本文中公开的分子可有可能作为粗制化学药品施用，但优选将其提供为药物组合物。因此，本发明提供了包含一种或多种本文中公开的dsRNA分子以及药学上可接受的载体的药物组合物。此组合物可包含两种或更多种不同的核酸化合物的混合物。
本文中提供的组合物、方法和药盒可包含一种或多种核酸分子（例如，dsRNA）和方法，所述方法独立地或联合地调节（例如，下调）HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1蛋白的表达和/或编码HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1蛋白的基因，所述蛋白和/或基因与以下疾病、病况或病症的维持和/或发展相关：所述疾病、病况或病症与HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1相关，尤其与耳相关的病症。参考示例性基因HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1提供各个方面及实施方案的说明。然而，各个方面及实施方案还涉及到其他相关基因，例如同源基因及转录本变体以及与某些HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1基因相关的多态性（例如，单核苷酸多态性，（SNP））。因此，各个方面及实施方案还涉及其他基因，所述基因涉及HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1介导的信号转导通路或涉及基因表达，所述基因表达例如，涉及本文中描述的疾病、特征或病况的维持或发展。这些其他基因可用本文中用于描述HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1基因的方法来分析靶。因此，其他基因的下调和其他基因此类调节的影响可被如本文中描述的那样进行、确定和测量。
还提供药物组合物，所述药物组合物包含有效下调HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1表达的量的至少一种本发明的共价或非共价地结合至一种或多种本发明的化合物的化合物；和药学上可接受的载体。所述化合物可被内源性细胞复合物细胞内加工，以产生一种或多种本发明的寡核糖核苷酸。
还提供了药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和一种或多种有效抑制人HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1在细胞内表达的量的本发明的化合物，所述化合物包含与(N)x的序列大体上互补的序列。
大体上互补是指与另一个序列具有大于约84%的互补性。例如在由19个碱基对组成的双链体区域中，一个错配导致94.7%的互补性，两个错配导致约89.5%的互补性，并且3个错配导致约84.2%的互补性，这使得双链体区域大体上互补。因此大体上同一的是指与另一个序列具有大于约84%的同一性。
此外，本发明提供与对照相比抑制HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的表达至少20%、至少30%、至少40%，优选50%、60%或70%，更优选75%、80%或90%的方法，包括将本发明的mRNA转录本与一种或多种本发明的化合物接触。
在一个实施方案中，本文中公开的寡核糖核苷酸化合物、组合物和方法抑制/下调HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1基因，从而所述抑制/下调选自包含抑制/下调基因功能、抑制/下调多肽以及抑制/下调mRNA表达的组。
在一个实施方案中，本文中提供的组合物和方法包含双链短干扰核酸（siNA）化合物，其下调HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B基因的表达（例如，由SEQ ID NO:1-11例证的用于人HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的mRNA编码序列），其中核酸分子包含约15个至约49个碱基对。
在一个实施方案中，本文中公开的核酸可用于抑制HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1基因或HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1基因家族的表达，其中所述基因或基因家族序列共享序列同源性。可例如用序列比对将此类同源序列鉴定为是本领域已知的。例如用完全互补序列或通过掺入可提供其他靶序列的非经典碱基对例如错配和/或摆动碱基对，可将核酸分子设计为靶向此类同源序列。在错配被鉴定的情况下，非经典碱基对（例如，错配和/或摆动碱基）可用于产生靶向多于一个基因序列的核酸分子。在非限定性实例中，非经典碱基对例如UU和CC碱基对用于产生能够靶向用于区分共享序列同源性的HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1靶的序列的核酸分子。因此，用本文中公开的dsRNA的一个优势是单核酸可被设计包含与在同源基因间保守的核苷酸序列互补的核酸序列。在这种方法中，代替用一个以上的核酸分子靶向不同基因，单核酸可被用于抑制一个以上的基因表达。
核酸分子可被用于靶向相应于一个或多个基因家族或例如HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1家族基因的保守序列。因此，靶向多种HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1靶的核酸分子可提供增加的疗效。此外，核酸可用于表征在各种应用中的基因功能通路。例如，核酸分子可用于抑制通路中靶基因的活性以在基因功能分析、mRNA功能分析或翻译分析中确定未表征基因的功能。所述核酸分子可用于确定涉及各种疾病和病况的朝向药物开发的潜在的靶基因通路。所述核酸分子可用于理解涉及例如耳病症的基因表达通路。
在一个实施方案中，本文中提供的核酸化合物、组合物和方法抑制HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1多肽，其中所述抑制选自包含抑制功能（除其它以外，其可通过酶促测定或用天然基因/多肽的已知相互作用因子（interactor）的结合测定来检查）、下调蛋白或抑制蛋白（除其它以外，其可通过蛋白质印迹、ELISA或免疫沉淀来检查）以及抑制mRNA表达（除其它以外，其可通过Northern印迹、定量RT-PCR、原位杂交或微阵列杂交来检查）的组。
在一个实施方案中，本文中提供的组合物和方法包含具有抗HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1RNA的RNAi活性核酸分子，其中所述核酸分子包含与任一种具有HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1编码序列例如在SEQ ID NO:1-11中所示的那样序列的RNA互补的序列。在另一个实施方案中，核酸分子可具有抗HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1RNA的RNAi活性，其中所述核酸分子包含与具有变异的HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1编码序列的RNA互补的序列，所述变异的HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1编码序列例如在SEQ ID NO:1-11中未显示的但在本领域中已知与神经变性和/或神经病变的发病和/或维持和/或发展有关的其他突变HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1基因，例如SNP。本文中描述的化学修饰可应用于本文中公开的任何核酸构建体。在另一个实施方案中，本文中公开的核酸分子包含可与HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1基因的核苷酸序列相互作用并且从而介导下调或沉默HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的基因表达的核苷酸序列，例如，其中所述核酸分子通过调节染色质结构或基因的甲基化模式并且预防基因转录的细胞进程介导HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1基因表达的调节。
更特别地，提供双链核酸分子，其中一条链包含从5’到3’具有在表SEQID NO:23-26912所示的化合物的连续核苷酸或其同源物，其中在每一个末端区域中至多两个核糖核苷酸被改变。
递送和制剂
本发明的RNA分子可通过对外耳直接应用药物组合物、通过经鼓膜注射或通过滴耳剂被递送至耳。在一些实施方案中，所述药物组合物被应用于耳道。对耳的递送还可涉及如包含siRNA、渗透促进剂及药学上可接受的媒介物的耳（aural）或耳部（otic）的递送。
本发明的核酸分子可通过直接应用利用载体或稀释剂制备的裸的分子被递送至靶组织。
术语“裸的核酸”或“裸的dsRNA”或“裸的siRNA”是指不含用于帮助、促进或有利于进入细胞的任何递送媒介物(包括病毒序列、病毒颗粒、脂质体制剂、lipofectin或沉淀剂等)的核酸分子。例如，PBS中的dsRNA是“裸的dsRNA”。
本文中公开的核酸分子可利用用于帮助、促进或有利于进入细胞的载体或稀释剂(包括病毒载体、病毒颗粒、脂质体制剂、lipofectin或沉淀剂等)直接递送或施用。
核酸分子可包含用于对受试者施用的递送媒介物，其包含脂质体，载体和稀释剂以及它们的盐和/或可存在于药学上可接受的制剂中。在一些实施方案中，以脂质体制剂和lipofectin制剂等递送本发明的dsRNA分子，并且可通过本领域技术人员熟知的方法来制备所述dsRNA分子。此类方法描述于例如美国专利号5,593,972、5,589,466和5,580,859，将所述专利通过引用并入本文。
已开发了目的明确地在于增强和改善siRNA至哺乳动物细胞内的递送的递送系统(参见，例如，Shen等FEBS Let.2003，539：111-114,Xia等，Nat.Biotech.2002，20：1006-1010,Reich等，Mol.Vision2003，9：210-216,Sorensen等，J.Mol.Biol.2003，327：761-766,Lewis等，Nat.Gen.2002，32：107-108和Simeoni等，NAR2003，31，11：2717-2724。siRNA最近已被成功地用于抑制灵长类动物的基因表达；(参见例如，Tolentino等，Retina24(1):660)。
对耳、任选内耳的裸的或配制的RNA分子的递送，除其它以外，通过经鼓膜注射或通过作为滴耳剂配制的所期望的化合物的施用得以实现。包含dsRNA的耳用组合物公开于本申请的受让人并通过引用以整体并入本文的美国公布号20110142917中。
有助于将核酸引入到所需的受试者体内的多肽在本领域是已知的，例如诸如在美国申请公布号20070155658中描述的那些(例如，三聚氰胺衍生物如2,4,6-三胍基三嗪和2,4,6-Tramidosarcocyl Melamine、聚精氨酸多肽以及包括交替的谷氨酰胺和天冬酰胺残基的多肽)。
药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和媒介物以及埋植载体通常是指不与本发明的活性成分反应的惰性无毒固体或液体填充剂、稀释剂或封装材料，并且它们包括脂质体和微米球。在本发明中使用的递送系统的实例包括美国专利号5,225,182；5,169,383；5,167,616；4,959,217；4,925,678；4,487,603；4,486,194；4,447,233；4,447,224；4,439,196和4,475,196。许多其他此类埋植剂、递送系统和模块（module）对于本领域技术人员来说是熟知的。
在具体的实施方案中，所述施用包括经鼓膜施用。在另一个实施方案中，所述施用包括局部的（topical）或局域的（local）施用。所述化合物作为耳滴剂、耳乳剂、耳软膏、泡沫、奶油冻（mousse）或上述的任何一种与递送媒介物组合施用。化合物的埋植剂也是有用的。液体形式作为滴剂制备。液体组合物包括水溶液(具有和不具有有机共溶剂)、水性或油性悬浮剂、具有可食用油的乳剂以及类似的药物媒介物。这些组合物还可经鼓膜注射。耳滴剂还可是指作为耳用滴剂或耳滴剂。在优选的实施方案中，为了预防滴剂溢出耳道外，耳滴剂在耳道中持续保持大约30分钟。因而优选的是，接受滴剂的受试者保持他的用于治疗的耳的头那侧面朝向上以预防滴剂溢出耳道外。
用于递送核酸分子的方法描述在以下文献中：Akhtar等,Trends CellBio.,2:139(1992)；Delivery Strategies for Antisense OligonucleotideTherapeutics,编著,Akhtar,(1995),Maurer等,Mol.Membr.Biol.,16:129-140(1999)；Hofland和Huang,Handb.Exp.Pharmacol.,137:165至-192(1999)；以及Lee等,ACS Symp.Ser.,752:184-192(2000)；美国专利号6,395,713；6,235,310；5,225,182；5,169,383；5,167,616；4,959217；4.925,678；4,487,603；以及4,486,194和Sullivan等，PCT WO94/02595；PCT WO00/03683和PCT WO02/08754；以及美国专利申请公布号2003077829。这些方案可用于递送几乎任何核酸分子。通过本领域技术人员已知的多种方法可将核酸分子施用到细胞中，所述方法包括但不限于囊封于脂质体中、通过离子导入法或通过并入到其它媒介物中，所述媒介物例如生物可降解的聚合物、水凝胶、环糊精(参见例如Gonzalez等,Bioconjugate Chem.,10:1068-1074(1999)；Wang等，国际PCT公布号WO03/47518和WO03/46185)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)和PLCA微米球(参见例如美国专利号6,447,796和美国申请公布号2002130430)、生物可降解的纳米胶囊以及生物粘附微米球或者通过蛋白质载体(O’Hare和Normand，国际PCT公布号WO00/53722)。或者，通过直接注射、或通过使用输液泵来局部递送核酸/媒介物组合。直接注射本发明的核酸分子，无论玻璃体内、皮下、经鼓膜、肌肉内或皮肤内，都可使用标准针头和注射器方法或通过无针技术来进行，所述无针技术如在Conry等,Clin.Cancer Res.,5:2330-2337(1999)和Barry等，国际PCT公布号WO99/31262中所述的那些。本发明的分子可用作药剂。药剂预防受试者的疾病病况、调节疾病病况的发生或治疗疾病病况或将症状减轻至一定程度(优选为全部症状)。在本发明的一个具体实施方案中，局部的和经皮肤的制剂可被选择。
通过考虑个体受试者的临床状况、待治疗的疾病、施用的位置和方法、施用的时间安排、患者年龄、性别、体重和医师已知的其它因素，按照医疗管理规范(good medical practice)对本发明的dsRNA或药物组合物进行施用和给药。
在另一个实施方案中，施用包括局部或局域施用，例如通过滴眼剂、滴耳剂或软膏剂。在非限制性实例中，靶向HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的dsRNA化合物对治疗患有耳损伤的受试者是有用的，其中所述dsRNA化合物通过局部递送被递送至耳（例如，滴剂或软膏）。核酸分子可与阳离子脂质复合、包装在脂质体中或者以其它方式递送至靶细胞或组织。在有或没有并入到生物聚合物中的情况下，通过直接真皮应用、经皮肤应用或注射，可将核酸或核酸复合物离体或体内局部施用到相关组织中。本文中公开对产生dsRNA分子有用的优选寡核苷酸。
递送系统包括含有聚(乙二醇)脂质的表面修饰的脂质体(PEG修饰的或长循环脂质体或隐形脂质体)。这些制剂提供了一种用于增加药物在靶组织中的积累的方法。此类药物载体耐受由单核吞噬细胞系统(MPS或RES)进行的调理作用和消除，借此使囊封药物的血液循环时间能够更长并且提高其组织暴露(Lasic等Chem.Rev.1995,95,2601-2627；Ishiwata等,Chem.Pharm.Bull.1995,43,1005-1011)。
核酸分子可与聚乙烯亚胺(例如，直链或支链的PEI)和/或聚乙烯亚胺衍生物一起配制或复合，所述聚乙烯亚胺和/或聚乙烯亚胺衍生物包括例如聚乙烯亚胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亚胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-三GAL)衍生物、接枝的PEI如半乳糖PEI、胆固醇PEI、抗体衍生的PEI及其聚乙二醇PEI(PEG-PEI)衍生物(参见例如Ogris等,2001,AAPA PharmSci,3,1-11；Furgeson等,2003,Bioconjugate Chem.,14,840-847；Kunath等,2002,Pharmaceutical Research,19,810-817；Choi等,2001,Bull.Korean Chem.Soc.,22,46-52；Bettinger等,1999,Bioconjugate Chem.,10,558-561；Peterson等,2002,BioconjugateChem.,13,845-854；Erbacher等,1999,Journal of Gene Medicine Preprint,1,1-18；Godbey等,1999,PNAS USA,96,5177-5181；Godbey等,1999,Journalof Controlled Release,60,149-160；Diebold等,1999,Journal of BiologicalChemistry,274,19087-19094；Thomas和Klibanov,2002,PNAS USA,99,14640-14645；Sagara,美国专利号6,586,524和美国专利申请公布号20030077829)。
核酸分子可与膜破裂试剂复合，所述试剂如美国专利申请公布号20010007666中所述的那些。一种或多种膜破裂试剂和核酸分子还可与阳离子脂质或辅助脂质分子复合，所述脂质分子如美国专利号6,235,310中所述的那些脂质。
本文中公开的核酸分子可施用于中枢神经系统（CNS）或外周神经系统（PNS）。实验已经证明由神经元在体内有效的摄取核酸分子。参见例如，Sommer等人,1998,Antisense Nuc.Acid Drug Dev.,8,75；Epa等人,2000,Antisense Nuc.Acid Drug Dev.,10,469；Broaddus等人,1998,J.Neurosurg.,88(4),734；Karle等人,1997,Eur.J.Pharmocol.,340(2/3),153；Bannai等人,1998,Brain Research,784(1,2),304；Rajakumar等人,1997,Synapse,26(3),199；Wu-pong等人,1999,BioPharm,12(1),32；Bannai等人,1998,Brain Res.Protoc.,3(1),83；和Simantov等人,1996,Neuroscience,74(1),39。因此核酸分子适合于递送至在CNS和/或PNS中的细胞（例如神经细胞、巨噬细胞、白质轴突和上皮细胞）并且被在CNS和/或PNS中的细胞摄取。
递送系统可包括例如水性和非水性凝胶剂、乳膏剂、多种乳液、微米乳液、脂质体、软膏剂、水性和非水性溶液、洗剂、气雾剂、烃基质以及粉剂，并且可含有赋形剂如增溶剂、渗透促进剂(例如，脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇以及氨基酸)以及亲水聚合物(例如，聚卡波非和聚乙烯吡咯烷酮)。在一种实施方案中，药学上可接受的载体为脂质体或透皮促进剂。可利用本发明的化合物来使用的脂质体的非限定性实例包括以下：(1)CellFectin，阳离子脂质N,NI,NII,NIII-四甲基-N,NI,NII,NIII-四软脂酰-y-精胺和二油酰基磷脂酰-乙醇胺(DOPE)(GIBCO BRL)的1:1.5(M/M)脂质体制剂；(2)Cytofectin GSV，阳离子脂质和DOPE(Glen Research)的2:1(M/M)脂质体制剂；(3)DOTAP(N-[1-(2,3-二油酰氧基)-N,N,N-三-甲基-硫酸二甲酯铵)(Boehringer Manheim)；以及(4)Lipofectamine，聚阳离子脂质DOSPA、中性脂质DOPE(GIBCO BRL)和二烃基化氨基酸(DiLA2)的3:1(M/M)脂质体制剂。
递送系统可包括贴剂、片剂、栓剂、阴道栓剂、凝胶剂、水性和非水性溶液、洗剂和乳膏剂，并且可包含赋形剂例如增溶剂和促进剂（例如，丙二醇、胆汁盐以及氨基酸）以及其他媒介物（例如，聚乙二醇、甘油、脂肪酸酯及衍生物以及亲水聚合物例如羟丙基甲基纤维素和透明质酸）。
核酸分子可包含生物缀合物，例如如在Vargeese等，美国序列号10/427,160；美国专利号6,528,631；美国专利号6,335,434；美国专利号6,235,886；美国专利号6,153,737；美国专利号5,214,136；美国专利号5,138,045中所述的核酸缀合物。
本文中公开的组合物、方法和药盒可包括表达载体，所述载体以允许核酸分子表达的方式包含编码本发明的至少一种核酸分子的核酸序列。将能够表达dsRNA链的核酸分子或一种或多种载体引入到细胞环境中的方法将取决于细胞的类型及其环境的组成。可将核酸分子或载体构建体直接引入到细胞中(即，细胞内)；或者引入到细胞外的腔、胞间隙中、到生物体循环中，口服引入，或者可通过在含有dsRNA的溶液中温育（bathing）生物体或细胞而引入。所述细胞优选为哺乳动物细胞；更优选为人细胞。表达载体的核酸分子可包含有义区和反义区。反义区可包含与编码HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的RNA或DNA序列互补的序列；并且有义区可包含与所述反义区互补的序列。核酸分子可包含具有互补的有义区和反义区的两条不同的链。核酸分子可包含具有互补的有义区和反义区的单链。
与靶RNA分子相互作用并下调编码靶RNA分子（例如，HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH mRNA，SEQ ID NO:1-11）的基因的核酸分子可由插入到DNA或RNA载体中的转录单元来表达。重组载体可为DNA质粒或病毒载体。表达核酸分子的病毒载体可基于但不限于腺相关病毒、逆转录病毒、腺病毒或甲病毒来构建。能够表达核酸分子的重组载体可如本文所述进行递送并存留于靶细胞中。或者，可使用提供核酸分子的瞬时表达的病毒载体。必要时，这些载体可重复施用。一旦表达，则核酸分子经由例如RNA干扰(RNAi)结合和下调基因功能或表达。核酸分子表达载体的递送可以是全身性的，例如通过静脉内或肌肉内施用、通过局部施用、通过施用到从受试者中取出的靶细胞之后再次引入到所述受试者体内、或者通过允许引入到所需靶细胞中的任何其它方式。
表达载体可以允许核酸分子表达的方式包含编码本文中公开的至少一种核酸分子的核酸序列。例如，所述载体可含有编码包含双链体的核酸分子的两条链的序列。所述载体还含有编码自身互补从而形成核酸分子的单核酸分子的序列。这些表达载体的非限制性实例描述在以下文献中：Paul等,2002,Nature Biotechnology,19,505；Miyagishi和Taira,2002,NatureBiotechnology,19,497；Lee等,2002,Nature Biotechnology,19,500；以及Novina等,2002,Nature Medicine,高级在线出版物doi:10.1038/nm725。表达载体也可包含在哺乳动物(例如，人)细胞中。
表达载体可编码核酸双链体的一条链或两条链或自身杂交成核酸双链体的单一自身互补的链。编码核酸分子的核酸序列可以允许核酸分子表达的方式可操作地连接（参见例如Paul等,2002,Nature Biotechnology,19,505；Miyagishi和Taira,2002,Nature Biotechnology,19,497；Lee等,2002,Nature Biotechnology,19,500；以及Novina等,2002,Nature Medicine,高级在线出版物doi:10.1038/nm725）。
表达载体可包含以下的一种或多种：a)转录起始区(例如，真核pol I、II或III起始区)；b)转录终止区(例如，真核pol I、II或III终止区)；c)内含子以及d)编码至少一种所述核酸分子的核酸序列，其中所述序列以允许所述核酸分子表达和/或递送的方式可操作地连接至起始区和终止区。所述载体可任选地包含用于蛋白质的可操作地连接在编码核酸分子的序列的5’-侧或3’-侧上的开放阅读框(ORF)；和/或内含子(插入序列)。
核酸分子序列的转录可由真核RNA聚合酶I(pol I)、RNA聚合酶II(polII)或RNA聚合酶III(pol III)的启动子来驱动。来自pol II或pol III启动子的转录本在所有细胞中以高水平进行表达；在给定的细胞类型中给定的polII启动子的水平取决于附近所存在的基因调控序列(增强子、沉默子等)的性质。也使用原核RNA聚合酶启动子，条件是原核RNA聚合酶在适当细胞中表达(Elroy-Stein和Moss,1990,PNAS USA,87,6743-7；Gao和Huang1993,Nucleic Acids Res.,21,2867-72；Lieber等,1993,Methods Enzymol.,217,47-66；Zhou等,1990,Mol.Cell.Biol.,10,4529-37)。若干研究者已证明由这些启动子表达的核酸分子可在哺乳动物细胞中起作用(例如，Kashani-Sabet等人,1992,Antisense Res.Dev.,2,3-15；Ojwang等人,1992,PNAS USA,89,10802-6；Chen等人,1992,Nucleic Acids Res.,20,4581-9；Yu等人,1993,PNAS USA,90,6340-4；L’Huillier等人,1992,EMBO J.,11,4411-8；Lisziewicz等人,1993,PNAS USA,90,8000-4；Thompson等人,1995,Nucleic Acids Res.,23,2259；Sullenger&Cech,1993,Science,262,1566)。更具体地说，转录单元如来源于编码U6小核酸RNA(snRNA)、转运RNA(tRNA)和腺病毒VA RNA的基因的转录单元适用于在细胞中产生高浓度的所需RNA分子如siNA(Thompson等，见上文；Couture和Stinchcomb,1996，见上文；Noonberg等人,1994,Nucleic Acid Res.,22,2830；Noonberg等人，美国专利号5,624,803；Good等人,1997,Gene Ther.,4,45；Beigelman等人，国际PCT公布号WO96/18736)。上述核酸转录单元可并入到多种载体中以用于引入到哺乳动物细胞中，所述载体包括但不限于质粒DNA载体、病毒DNA载体(如腺病毒或腺相关病毒载体)或者病毒RNA载体(如逆转录病毒或甲病毒载体)(参见Couture和Stinchcomb,1996见上文)。
核酸分子可在细胞内由真核启动子表达(例如，Izant和Weintraub,1985,Science,229,345；McGarry和Lindquist,1986,PNAS USA83,399；Scanlon等人,1991,PNAS USA,88,10591-5；Kashani-Sabet等人,1992,AntisenseRes.Dev.,2,3-15；Dropulic等人,1992,J.Virol.,66,1432-41；Weerasinghe等人,1991,J.Virol.,65,5531-4；Ojwang等人,1992,PNAS USA,89,10802至10806；Chen等人,1992,Nucleic Acids Res.,20,4581-9；Sarver等,1990Science,247,1222-1225；Thompson等,1995,Nucleic Acids Res.,23,2259；Good等人,1997,Gene Therapy,4,45)。本领域的技术人员认识到任意核酸可在真核细胞中由适当DNA/RNA载体来表达。这些核酸的活性可通过经由酶性核酸使其从初级转录本中释放来增强(Draper等,PCT WO93/23569和Sullivan等,PCT WO94/02595；Ohkawa等人,1992,Nucleic Acids Symp.Ser.,27,15-6；Taira等人,1991,Nucleic Acids Res.,19,5125-30；Ventura等,1993,Nucleic Acids Res.,21,3249-55；Chowrira等,1994,J.Biol.Chem.,269,25856)。
包装到病毒粒子中的病毒构建体会同时实现表达构建体到细胞中的有效引入和由表达构建体编码的dsRNA构建体的转录。
用于口服引入的方法包括直接混合RNA和生物体的食物以及其中将用作食物的物质进行工程改造来表达RNA、然后喂给欲被影响的生物体的工程改造方法。可使用物理方法将核酸分子溶液引入到细胞中。引入核酸的物理方法包括注射含有核酸分子的溶液、利用由核酸分子覆盖的粒子进行轰击、在RNA溶液中浸泡细胞或生物体或者在核酸分子存在下对细胞膜进行电穿孔。在一种实施方案中，本文中提供包含本文中公开的核酸分子的细胞。
可使用本领域已知的用于将核酸引入到细胞中的其它方法，例如化学介导的转运、例如磷酸钙等。因此，核酸分子可连同执行以下活性中的一个或多个的组分一起引入：增强细胞的RNA摄取、促进双链体链的退火、使退火的链稳定或以其它方式增强靶基因的抑制/下调。
聚合的纳米胶囊或微胶囊促进囊封或结合的dsRNA到细胞中的转运和释放。它们包含聚合的或单体的材料，特别包含聚氰基丙烯酸丁酯。材料和制备方法的概述已被公布(参见Kreuter,1991)。由单体和/或寡聚物前体在聚合作用/纳米粒子产生步骤中形成的聚合材料根据现有技术本身是已知的，聚合材料的分子量和分子量分布也是已知的，制造纳米粒子领域中的技术人员可根据常见技术对其进行适当选择。
可将核酸分子配制成微米乳液。微米乳液是水、油和两亲分子的系统，它是单一光学各向同性和热力学稳定的液体溶液。通常通过首先在水性表面活性剂溶液中分散油并且然后添加足够量的4个组分(通常为中等链长度的醇)以形成透明的系统来制备微米乳液。
可在微米乳液的制备中使用的表面活性剂包括但不限于单独或与共表面活性剂组合的离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、Brij96、聚氧乙烯油烯醚、聚甘油脂肪酸酯、四甘油单月桂酸酯(ML310)、四甘油单油酸酯(MO310)、六甘油单油酸酯(PO310)、六甘油五油酸酯(PO500)、十甘油单癸酸酯(MCA750)、十甘油单油酸酯(MO750)、十甘油硬油酸酯(SO750)、十甘油十油酸酯(DA0750)。所述共表面活性剂，通常为短链醇如乙醇、1-丙醇以及1-丁醇，用于通过渗入表面活性剂薄膜并随后由于表面活性剂分子间产生的孔隙空间而形成无序薄膜来增加界面流动性。
递送制剂可包含水溶性可降解交联聚合物，所述交联聚合物可包含一个或多个可降解的交联脂质部分、一个或多个PEI部分和/或一个或多个mPEG(PEG(甲氧基聚(乙二醇)的甲基醚衍生物)。
剂量
待施用的有用剂量和具体的施用模式将取决于此类因素如细胞类型或（对于体内用途）年龄、体重和具体动物及其待治疗的区域、使用的具体核酸和递送方法、预期的治疗性或诊断性用途，以及制剂的形式，例如，悬浮剂、乳剂、胶束或脂质体，这对于本领域技术人员来说将是很显然的。通常，以更低的水平施用剂量，随后增加剂量直致实现期望的效应。
用于本文中的目的的“治疗有效剂量”因而通过如本领域已知的考虑因素来进行测定。剂量对于实现改善必须是有效的，所述改善包括但不限于如被本领域技术人员选择作为适当的度量的改善的存活率或更快速的恢复，或症状和其它指征的改善或消除。
可导入适当量的核酸分子，并且可使用标准方法根据经验确定这些量。单个核酸分子种类在细胞环境中的有效浓度可以为约1飞摩尔、约50飞摩尔、100飞摩尔、1皮摩尔、1.5皮摩尔、2.5皮摩尔、5皮摩尔、10皮摩尔、25皮摩尔、50皮摩尔、100皮摩尔、500皮摩尔、1纳摩尔、2.5纳摩尔、5纳摩尔、10纳摩尔、25纳摩尔、50纳摩尔、100纳摩尔、500纳摩尔、1微摩尔、2.5微摩尔、5微摩尔、10微摩尔、100微摩尔或更多。
一般地，核酸化合物对人类的有效剂量为每天从1ng/kg到约20-100毫克每千克（mg/kg）受体体重，优选每天约0.01mg到约2-10mg/kg受体体重，在以下方案中：单次剂量、每天1个剂量、或每天2次或3次或更多次，持续1-4周或更久。核酸分子的适当剂量单位可在每天每千克受体体重0.001至0.25毫克的范围内，或在每天每千克体重0.01至20微克的范围内，或在每天每千克体重0.01至10微克的范围内，或在每天每千克体重0.10至5微克的范围内，或在每天每千克体重0.1至2.5微克的范围内。剂量可为每kg体重0.01ug至1g(例如，0.1ug、0.25ug、0.5ug、0.75ug、1ug、2.5ug、5ug、10ug、25ug、50ug、100ug、250ug、500ug、1mg、2.5mg、5mg、10mg、25mg、50mg、100mg、250mg或500mg/kg体重)。
每天每千克体重约0.1mg至约140mg级别的剂量水平在治疗上文中指定的病况中是有用的(每天每个受试者约0.5mg至约7g)。可与载体材料组合以产生单次剂量形式的活性成分的量取决于所治疗的主体和具体的施用模式而变化。剂量单位形式通常含有约1mg至约500mg的活性成分。
应理解用于任何特定受试者的具体剂量水平取决于多个因素，包括所使用的具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康、性别、饮食、施用时间、施用途径以及排泄率、药物组合以及正在治疗的特定疾病的严重程度。
可每日一次(QD)、每日两次(bid)、每日三次(tid)、每日四次(qid)或以任意间隔施用包含本文中公开的核酸分子的药物组合物持续医学上适当的任意持续时间。然而，还可以以包含2、3、4、5、6或更多个在一整天中以适当的间隔施用的亚剂量的剂量的剂量单位对治疗剂进行给药。在该情况下，每一个亚剂量中包含的核酸分子可以相应地更小以实现总的日剂量单位。还可以例如使用常规持续释放制剂将剂量单位混合以形成进行数天的单次剂量，所述持续释放制剂在数天的时期中提供持续且恒定的dsRNA释放。持续释放制剂在本领域是熟知的。剂量单位可包含相应的多个日剂量。可以以使多个单位的核酸一起的总量含有足够的剂量的方式混合组合物。
药学组合物、药盒和容器
还提供了用于对患者施用或分配核酸分子的组合物、药盒、容器和制剂，所述组合物、药盒、容器和制剂包含如本文中提供的用于下调HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的表达的核酸分子（例如，siNA分子）。药盒可包括至少一个容器和至少一个标签。适当的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可由多种材料例如玻璃、金属或塑料形成。容器可装有氨基酸序列、小分子、核酸序列、细胞群和/或抗体和/或对于相关实验室、预后、诊断、预防和治疗目的所需要的任何其他组件。此容器可包含或具有用于这样用途的指示和/或指导，如可包含用于此目的而使用的试剂和其他组合物或工具。
容器可备选地装有对于治疗、诊断、预后或预防病况的有效组合物并且可具有无菌入口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的活性剂可以是能够特异结合HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1mRNA和/或下调HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的功能的核酸分子。
药盒可进一步包含第二容器，所述第二容器包含药学上可接受的缓冲剂，如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer’s solution)和/或右旋糖溶液。它可进一步包含从商业或使用者立场来看合乎需要的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、搅拌器、针、注射器和/或具有关于使用的指示和/或说明书的包装插页。
联邦法律规定药物组合物在人的疗法中的使用应获得联邦政府机构的批准。在美国，强制执行是食品和药品管理局的责任，所述机构颁布了用于保护这种批准的适当法规，详见21U.S.C.§301-392。在42U.S.C.§262下提供了生物材料的法规，所述生物材料包括由动物组织所制成的产品。大多数国家要求相似的批准。法规随着国家不同而变化，但是个别程序对于本领域技术人员而言已熟知，并且因此本文所提供的组合物和方法优选遵循。
本文中公开的核酸分子可单独或与其他疗法组合地用于治疗与HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1相关的疾病、病况或病症，例如在耳、前庭感觉系统中的疾病、损伤、病况或病理，以及与细胞或组织中HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的水平相关的或对该水平将有反应的任何其他疾病或病况。因此，本文中公开的组合物、药盒和方法可包含包装本文中公开的包含标签或包装插页的核酸分子。所述标签可包含用于所述核酸分子的用途的指示，例如用于治疗或预防耳或前庭系统的疾病、病症、损伤以及病况，上述疾病、病症、损伤以及病况包括，但不限于，美尼尔症、声损伤、耳聋、听力损失、老年性耳聋以及本文中公开的任何其他疾病或病况。所述标签还包含用于所述核酸分子的用途的指示，例如用于治疗或预防神经元变性的减弱。神经元变性包括例如听神经变性，（也被称为前庭蜗神经或听神经并且负责从内耳向大脑传送声音和平衡信息）；耳毛细胞通过听神经向脑传送信息的内，听神经由耳蜗神经和前庭神经组成并且从延髓出现并且通过颞骨中的内耳道（或内听道）随同面神经一起进入内耳颅骨。所述标签可包含单独或与其他疗法组合地用于核酸分子的用途的指示，例如用于治疗或预防与细胞或组织中HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的水平相关的或对该水平将有反应的任何其他疾病或病况。标签可包含用于对降低和/或下调HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1表达的用途的指示。“包装插页”是用于表示通常包含在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症、待与包装的产品组合的其它治疗产品和/或涉及使用这些治疗产品的警告等信息。
本领域技术人员将认识到本领域已知的其他的治疗、药物和疗法可容易地与本文中的核酸分子（例如dsRNA分子）来组合并因此涵盖在本文中。
治疗方法
在另一个方面，本发明涉及用于治疗需要治疗对于与HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的异常表达相关的疾病或病症的受试者的方法，所述方法包含对受试者施用降低或抑制HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的表达的抑制剂的量。
在一个实施方案中，核酸分子可用于下调或抑制HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的表达和/或从HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1产生的HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1蛋白和/或与疾病或病况（例如，神经变性）相关的单倍型多态性。对HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1和/或HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1基因，和/或蛋白质或RNA水平的分析可用于鉴定具有此类多态性的受试者或那些在本文中描述的特征、病况或疾病的发展的风险中的受试者。这些受试者适合于治疗，例如，用本文中公开的核酸分子和对治疗与HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1和/或HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1基因表达相关的疾病中有用的任何其他组合物的治疗。因此，HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1和/或蛋白质或RNA水平的分析可用于确定治疗类型和对治疗受试者的疗法过程。蛋白质或RNA水平的监测可用于预测治疗结果并且可用于确定调节与特征、病况或疾病相关的某些基因和/或蛋白质的水平和/或活性的化合物及组合物的功效。
此外，本发明提供与对照相比抑制选自由转录成SEQ ID NO:1-11的任一种中所示的mRNA的基因的组中的任一种靶基因的表达至少40%，优选50%、60%或70%，更优选75%、80%或90%的方法，包括将本发明的靶基因的mRNA转录本与一种或多种本发明的化合物接触。
在一种实施方案中，寡核糖核苷酸抑制一种或多种本文中公开的靶基因，其中所述抑制选自包含基因功能的抑制、多肽的抑制以及mRNA表达的抑制的组中。
在一个实施方案中，所述化合物抑制靶多肽，其中抑制选自包含功能的抑制(这例如，除其它以外，通过酶促测定或利用天然基因/多肽的已知相互作用子（interactor）的结合测定来检查)、蛋白质的抑制(这例如，除其它以外，通过蛋白质印迹、ELISA或免疫沉淀来检查)和mRNA表达的抑制(这例如，除其它以外，通过Northern印迹、定量RT-PCR、原位杂交或微阵列杂交来检查)的组中。
在一种实施方案中，所述化合物下调哺乳动物多肽，其中所述下调选自包含功能的下调(这例如，除其它以外，通过酶促测定或利用天然基因/多肽的已知相互作用子的结合测定来检查)、蛋白质的下调(这例如，除其它以外，通过蛋白质印迹、ELISA或免疫沉淀来检查)和mRNA表达的下调(这例如，除其它以外，通过Northern印迹、定量RT-PCR、原位杂交或微阵列杂交来检查)的组中。
在另外的实施方案中，提供治疗患有伴随有升高水平的哺乳动物基因（所述基因选自由转录成SEQ ID NO:1-11的任何一种所示的mRNA的基因组成的组中）的疾病的患者的方法，所述方法包括对患者施用治疗有效剂量的本发明的化合物或组合物，从而治疗患者。
本文中详细讨论了抑制本发明的哺乳动物基因或多肽的方法、分子和组合物，并且所述分子和/或组合物的任一个被有益地用于治疗遭受任一种所述病症的患者。但应明确理解，已知的化合物被排除在本发明之外。用已知化合物和组合物治疗的新方法落在本发明的范围内。
本发明的方法包含施用治疗有效量的一种或多种下调听力损失相关基因表达的化合物。“暴露于毒性剂”意指使得毒性剂可为哺乳动物获得或与哺乳动物接触。毒性剂可以是对神经系统有毒的。暴露于毒性剂可通过直接施用(例如，通过摄入或施用)食物、药物或治疗剂例如化学治疗剂，通过意外污染或通过环境暴露例如空气或水暴露发生。
还提供制备药物组合物的方法，其包括：
提供一种或多种本文中公开的双链分子；以及
将所述分子与药学上可接受的载体混合。
在优选的实施方案中，将用于制备药物组合物的分子以药学上有效剂量与载体混合。在具体的实施方案中，可将本发明的化合物缀合至类固醇或缀合至脂质或缀合至另一种适当的分子例如缀合至胆固醇。
提供通过用如本文中提供的小核酸分子抑制HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1表达的组合物和方法，所述的小核酸分子能够下调HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1基因表达或能够介导抗HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1基因表达的RNA干扰，所述的小核酸分子为例如短干扰核酸（siNA）、干扰RNA（RNAi）、短干扰RNA（siRNA）、双链RNA（dsRNA）、微小-RNA（miRNA）和短发夹RNA（shRNA）分子。本文中公开的组合物及方法对治疗各种病况或疾病例如耳和前庭感觉系统病症、疾病和损失也是有用的。
本文中公开的核酸分子可单独地或与其他药物组合或相结合一起用于预防或治疗与HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1相关的疾病、性状、病况和/或病症，例如本文中描述的疾病、病症和损伤。
本文中公开的核酸分子能够以序列特异性性方式下调HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的表达。所述核酸分子可包含有义链和反义链，所述链包含与HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的mRNA的部分至少部分互补（反义）的连续核苷酸。
在一些实施方案中，对于HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1具有特异性的dsRNA可与其他治疗剂和/或对于其他分子靶具有特异性的dsRNA一起结合使用，例如，但不限于各种促细胞凋亡基因。
用于治疗或预防在受试者或生物体中的HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1相关的疾病或病况的方法可包含在适合下调所述受试者或生物体的基因表达的条件下使所述受试者或生物体与本文中提供的核酸分子接触。
用于治疗或预防在受试者或生物体中的耳病症的方法可包含在适合下调所述受试者或生物体的HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1基因表达的条件下使所述受试者或生物体与核酸分子接触。。
在优选的实施方案中被治疗的受试者是温血动物并且尤其是包括人在内的哺乳动物。
本文中公开的方法包含对受试者施用下调HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的表达的一种或多种抑制性化合物；并且尤其是治疗有效剂量的siRNA以便从而治疗所述受试者。
本文中公开的分子在治疗其中下调HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的表达是有益的疾病或病况中下调HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1表达，尤其指新双链RNA化合物（dsRNAs）。
本文中详细讨论了下调HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的方法、分子和组合物，并且所述分子和/或组合物的任一个可有益地应用于治疗患有任何所述病况的受试者。在产生dsRNA时有用的有义链和反义链寡核苷酸序列示于SEQ ID NO:23-26912中。在下调HES1表达的dsRNA的制备中有用的优选的寡核苷酸序列示于SEQID NO:26667-26690和SEQ ID NO:26691-26706中，在下调HES5表达的dsRNA的制备中有用的优选的寡核苷酸序列示于SEQ ID NO:26707-26724和SEQ ID NO:26725-26732中；在下调HEY1表达的dsRNA的制备中有用的优选的寡核苷酸序列示于SEQ ID NO:26733-26760和SEQ IDNO:26761-2677中，在下调HEY2表达的dsRNA的制备中有用的优选的寡核苷酸序列示于SEQ ID NO:26779-26784和SEQ ID NO:26785-26788中，在下调ID1表达的dsRNA的制备中有用的优选的寡核苷酸序列示于SEQID NO:26789-26808和SEQ ID NO:26809-26816中，在下调ID2表达的dsRNA的制备中有用的优选的寡核苷酸序列示于SEQ ID NO:26817-26824和SEQ ID NO:26825-26832中，在下调ID3表达的dsRNA的制备中有用的优选的寡核苷酸序列示于SEQ ID NO:26833-26850和SEQ IDNO:26851-26866中，在下调CDKN1B表达的dsRNA的制备中有用的优选的寡核苷酸序列示于SEQ ID NO:26867-26886和SEQ ID NO:26887-26900中，或在下调NOTCH1表达的dsRNA的制备中有用的优选的寡核苷酸序列示于SEQ ID NO:26901-26910和SEQ ID NO:26911-26912中。在优选的实施方案中被治疗的受试者是温血动物并且尤其是包括人在内的哺乳动物。
本文中公开的方法包含对受试者施用一种或多种抑制性化合物，所述化合物下调表1A（SEQ ID NO:1-11）的基因的表达；并且尤其是治疗有效剂量的siRNA以便从而治疗所述受试者。
“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其中目的是预防病症或减少病症的症状，例如听力病症或损伤（或平衡障碍），或指预防或减少与如本文中列出的听力损失相关疾病相关的细胞死亡。需要治疗的受试者包括已经历疾病或病况的受试者、易于患有疾病或病况的受试者以及其中待预防疾病或病况的受试者。在疾病或病况发生之前、发生过程中或之后施用本发明的化合物。
不限于理论，所述听力损伤可能是由于细胞凋亡引起的内耳耳毛细胞损伤或损失，其中所述损伤或损失是由感染、机械性损伤、强声噪音、衰老或尤其化学引起的耳毒性引起的。耳毒素包括包含抗肿瘤剂、水杨酸盐、奎宁和氨基糖苷类抗生素的治疗性药物、食品或医药中的污染物及环境或工业污染物。通常，进行治疗以预防或降低尤其施用治疗性药物引起的或将引起的耳毒性。优选在暴露后立即给予治疗有效量的组合物以预防或降低耳毒性作用。更优选，通过在用耳毒性药物或暴露于耳毒素之前或同时施用所述组合物提供预防地治疗。
就本发明的上下文中的“耳毒素”来说是指如下物质：通过它的化学作用损伤、损害或抑制与听力相关的神经系统的声音感受器部分的活性，其进而损害听力（和/或平衡）。在本发明的上下文中，耳毒性包括对内耳毛细胞的有害作用。引起听力损伤的耳毒性剂包括，但不限于，肿瘤剂例如长春新碱、长春碱、顺铂及顺铂样化合物、紫杉酚及紫杉酚样化合物、双脱氧化合物、例如双脱氧肌苷；乙醇；金属；从事职业或环境接触的工业毒素；食品或医药的污染物；以及过量的维生素或治疗性药物，例如抗生素例如青霉素或氯霉素以及大剂量的维生素A、维生素D或维生素B6、水杨酸盐、奎宁和髓袢利尿剂。就“暴露于耳毒性剂”来说是指耳毒性剂使哺乳动物可得到或与哺乳动物相接触。暴露于耳毒性剂可通过直接施用发生，例如，通过摄取或施用食物、药品或治疗剂、例如化学治疗剂发生，通过意外污染发生，或通过环境暴露，例如，空气或水暴露发生。
与本发明有关的听力损伤可能是由于终末器官（end-organ）损伤引起的内耳毛细胞损伤，例如，声损伤、病毒性内淋巴迷路炎、美尼尔症。听力损伤包括耳鸣，其是在不存在听觉刺激时感知声音，并且可为间歇的或持续的，其中存在被诊断出感觉神经损失。听力损失可能是由于细菌或病毒感染引起的，例如在耳部带状疱疹、由急性中耳炎引起的化脓性迷路炎、化脓性脑膜炎、慢性中耳炎、包括病毒起源的突发性耳聋，例如，由病毒引起的病毒性内淋巴迷路炎，包含腮腺炎、麻疹、流行性感冒、水痘、单核细胞增多症以及腺病毒。听力损失可能是先天性的，例如其由风疹、分娩期间缺氧症、递送过程的创伤使血流入内耳、对母亲施用毒性药物、胎儿溶血症以及包括瓦登伯格氏综合征和赫尔勒氏综合征的遗传病况而引起。
所述听力损失可由噪音诱导，通常由于超过85分贝（db）的损伤内耳的噪声引起的。在一个特别的方面，听力损失由影响内耳听觉部分尤其内耳毛细胞的耳毒性药物引起。通过引用并入本文的是第14版（1982）的The Merck Manual of Diagnosis and Therapy的第196、197、198和199章，Merck Sharp&Dome Research Laboratories,N.J.以及在最新的第16版中的相应章，包括第207和210章）中涉及听力和平衡损害的描述和诊断。
在一种实施方案中，提供用于治疗患有或易于患有听力（或平衡）损伤的哺乳动物或在其中本发明的基因的抑制是有益的条件下预防性治疗哺乳动物的方法。所述方法将预防或降低听力（或平衡）损伤的发生或严重程度，所述损伤将由内耳细胞损伤、损失或变性导致，尤其由耳毒性剂引起的。所述方法包括施用治疗有效量的一种或多种下调HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的表达的化合物，尤其本发明的新siRNA。
目的是提供用于治疗哺乳动物的方法和组合物，目的是通过对需要此类治疗的哺乳动物施用本发明的组合物预防、降低或治疗听力损伤、病症或失调，任选耳毒素引起的听力病况。本发明的一种实施方案是用于治疗听力病症或损伤的方法，其中所述耳毒性是由施用治疗有效量的耳毒性医药药物引起的。代表性的耳毒性药物是化学治疗剂，例如抗肿瘤剂以及抗生素。其他可能的候选者包括髓袢利尿剂、奎宁或奎宁样化合物以及水杨酸盐或水杨酸盐样化合物。
当耳毒性化合物是抗生素，优选氨基糖苷抗生素时，本文中公开的方法和组合物也是有效的。耳毒性氨基糖苷类抗生素包括，但不限于，新霉素、巴龙霉素、核糖霉素、利维霉素、卡那霉素、阿米卡星、托普霉素、紫霉素、庆大霉素、西苏霉素、奈替米星、链霉素、地贝卡星、健霉素以及双氢链霉素或其组合。具体抗生素包括新霉素B、卡那霉素A、卡那霉素B、庆大霉素C1、庆大霉素C1a和庆大霉素C2。当耳毒性化合物是肿瘤剂例如长春新碱、长春碱、顺铂及顺铂样化合物、以及紫杉酚及紫杉酚样化合物时，所述方法和组合物也是有效的。所述方法和组合物对治疗声损伤或机械性损伤（优选导致内耳毛细胞损失或外耳毛细胞损失的声或机械性损伤）也是有效的。在本发明中将被治疗的声损伤可由单一暴露于超过120-140分贝的极端强声噪音或随后长期暴露于超过85分贝的日常强声噪音而引起。作为对声损伤的预期患者的预防性治疗，本发明的组合物也是有效的。在本发明中将被治疗的机械性内耳损伤是例如随着用于将电子设备插入内耳的操作引起的内耳损伤。本文中公开的分子和组合物预防损伤或将损伤减低到最小，所述损伤是与此类操作相关的对内耳毛细胞的损伤。
在一些实施方案中，本文中提供的分子和组合物与耳毒素共施用。例如，改善的方法被提供用于治疗由施用氨基糖苷抗生素引起感染的哺乳动物，所述改善包括对需要此类治疗的患者施用治疗有效量的下调HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的表达的一种或多种化合物（尤其新siRNA）以降低或预防耳毒素引起的与抗生素相关的听力损伤。下调HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的表达的化合物，尤其新siRNA被优选局部施用于内耳内部。
在又另一实施方案中，提供通过施用化学疗法的化合物治疗哺乳动物中癌症的改善方法，其中所述改善包括对需要此类治疗的患者施用治疗有效量的本发明的组合物以降低或预防耳毒素引起的与所述化学治疗药相关的听力损伤。降低或预防耳毒素引起的听力损伤的化合物，除其它以外，例如本文中公开的dsRNA分子，作为媒介物例如PBS或其他生理溶液中的裸的dsRNA被优选直接施用于耳蜗，但也可利用如上述描述的递送媒介物施用。
在另一个实施方案中，治疗方法应用于治疗由施用化学治疗剂引起的听力损伤以便治疗其耳毒性副作用。适合于本发明的方法的耳毒性化学治疗剂包括，但不限于，抗肿瘤剂，包括顺铂或顺铂样化合物、紫杉酚或紫杉酚样化合物、以及被认为导致耳毒素引起的听力损伤的其他化学治疗剂，例如，长春新碱，其是用于治疗血液恶性肿瘤和肉瘤的抗肿瘤药物。顺铂样化合物包括碳铂（）、四铂、奥沙利铂、铂衍生物脂质体（transplatin）及反式铂，除其它以外。
在另一个实施方案中，所述方法应用于由施用通常用于治疗疟疾的奎宁以及其合成取代物的施用引起的听力损伤以治疗其耳毒性副作用。
在另一个实施方案中，所述方法被应用于由施用利尿剂引起的听力损伤以治疗其耳毒性副作用。利尿剂，尤其“髓袢”利尿剂，即最初在亨氏环（the Loop of Henle）中起作用的那些是候选的耳毒素。用作说明的实例，不限于本发明的方法，包括利尿磺酸、乙基丙烯酸和汞制剂。利尿剂通常用于预防或消除水肿。利尿剂也用于非水肿状态例如高血压、高钙血综合征、特发性高钙尿症以及肾性尿崩症。
在一些实施方案中，组合治疗是优选的。组合治疗通过施用每一个被单独配制和施用的两种或多种剂（例如两种或多种dsRNA或至少一种dsRNA以及至少一种另一治疗剂）、或通过施用在单制剂中的两种或多种剂来实现。其他组合也涵盖在组合治疗中。例如，两种剂可被一起配制并且与含有第三剂的单独制剂结合被施用。虽然在组合治疗中的两种或多种剂可被同时施用，但它们不需要。例如，施用第一个剂（或剂的组合）可先于施用第二个剂（或剂的组合）的数分钟、数小时、数天或数周施用。因此，所述两种或多种剂可在彼此间隔数分钟内或彼此间隔一或几个小时内或彼此间隔一或几天内或彼此间隔几周内被施用。在一些情况下，甚至更长的时间间隔也是可能的。用于组合治疗的两种或多种剂可以是或可以不是在患者体内同时存在。组合疗法包含用于所述组合的剂的一种或多种的两次或更多次施用。例如，如果dsRNA1和dsRNA2（即其中dsRNA1靶向基因1而dsRNA2靶向基因2）用于组合中，可在任何组合中顺序地施用它们一次或多次，例如，以次序dsRNA1-dsRNA2,dsRNA2-dsRNA1,dsRNA1-dsRNA2-dsRNA1,dsRNA2-dsRNA1-dsRNA2,dsRNAl-dsRNAl-dsRNA2,dsRNAl-dsRNA2-dsRNA2等。
听力再生
感觉祖细胞可以发展为或毛细胞或支持细胞。切除研究表明除去毛细胞改变从支持细胞到毛细胞的周围细胞命运。这种反应表明毛细胞产生防止邻近细胞发育成毛细胞的抑制性信号。这种类型的相互作用与Notch-介导的侧抑制效应一致。与这种假说一致，两个Notch配体，Jag2和deta1（Dll1）在Atoh1-阳性细胞的受试者中迅速上调。这些配体的表达导致激活Notch1并且增加两个Notch通路靶基因的转录，两个Notch通路靶基因为将发育为支持细胞的细胞中的Hes1和hes5。此通路中的任何基因的缺失导致毛细胞的生产过剩，表明Notch信号传导对把祖细胞从所述毛细胞命运转移开具有作用。这种转移机制用Kolliker’s器官中的细胞被检查。首先，用Atoh1和Hes1对Kolliker’s器官细胞的共转染充分抑制毛细胞形成，表明Atoh1的转录是耳中HES1的靶。其次，在Kolliker’s器官细胞斑（patch）中ATOH1的瞬时激活导致激活了在这些细胞中的Notch信号传导通路并且抑制了在这些细胞亚群中的ATOH1和毛细胞命运。
有丝分裂再生从未在出生后的哺乳动物耳蜗中被证实。然而，最近的研究显示在哺乳动物的内耳细胞中强制表达Mathl(Atoh1)导致内耳细胞分化成毛细胞。不像在鸟中再生，此类分化发生时似乎没有伴随支持细胞增殖。在人中有效的治疗策略可能需要新的支持细胞的产生以及新的毛细胞，所以测试哺乳动物支持细胞在出生后的时期的分裂和分化能力是重要的。White等人证明前瞻性鉴定的、有丝分裂后的、出生后的支持细胞是具有增殖并且随后转分化成毛细胞的能力。此外，在支持细胞下调p27Kip1的能力中与年龄相关的变化提出了对于培养的与体内的支持细胞增殖未能响应毛细胞损失的机理解释。
细胞周期退出和细胞分化的协调作用在细胞和组织图式发育（patterning）中具有关键作用。在一些系统中，bHLH基因例如Atoh1的活性必须被积极的抑制以预防过早分化。在此类抑制中具有作用的因子的一个家族是Id（分化的抑制因子）家族。这些是通过竞争共同的二聚体配偶体E47抑制bHLH活性的HLH分子。在毛细胞形成之前，三个Id基因-Id1、Id2及Id3-广泛表达于包括Atoh1表达区域的整个耳蜗管底部。随着发育继续，Id在发育中的毛细胞中的表达被特别下调，表明Id功能的损失减轻那些细胞中的Atoh1活性的抑制。与这种假设一致，在感觉先祖细胞中Id3的延长表达抑制毛细胞形成，表明所述Id家族的下调是毛细胞发育中的关键步骤。
Zine等人.(J Neurosci.200121(13):4712-20.)证明Hes1和Hes5活性对于可能通过拮抗Math1抑制将祖细胞分别定型为IHC及OHC的命运是重要的。此类负调控对产生毛细胞的正确数量是关键的，并且对IHC单排的以及OHC三排的正常耳蜗嵌合体的建立是关键的。在前庭系统中，Hes1和Hes5还作为在椭圆囊和球囊上皮中的毛细胞分化的负调节物。在耳蜗中的Hes1和Hes5的二个的同时下调可用于刺激损失的听觉毛细胞的更换是可能的。此类研究可具有重要的治疗价值，因为贯穿疾病、创伤及衰老的听觉毛细胞的损失是听力损失和/或耳聋的常见原因。
本文中描述了本文中公开的化合物作为治疗药是有用的某些指示的详细内容。
本发明已以举例说明的方式进行了描述，并且应理解所使用的术语意欲具有描述而非限制的词语的性质。
显然，根据上述教导，许多修改和变化是可能的。因此，应理解在所附权利要求的范围内，本发明可以以具体描述以外的方式被实施。
在整个本申请中，包括美国专利的各种出版物通过作者和年份及专利编号被引用。这些出版物和专利及专利申请的公开内容在此通过引用整体并入本申请以更全面地描述本发明所属的领域的状态。
在下文中参考实施例详细地举例说明本发明，但不应将本发明解释为是被限定于实施例。
本文中任何文献的引用无意承认这样的文献是相关现有技术或对本申请的任何权利要求的可专利性的考虑材料。关于任何文献的内容或日期的任何声明基于在提交时申请人可获得的信息并且不构成关于这样的声明的正确性的承认。
实施例
无需进一步详细说明，据信本领域技术人员可使用先前的描述，最大程度地利用本发明。因此以下优选的具体实施方案被解释为仅是举例说明性的，并且不是以任何方式对要求保护的本发明的限制。
在本文中未明确描述的本领域内已知的标准分子生物学技术通常基本按照以下参考资料中所示的方法来进行：Sambrook等人，Molecularcloning：A laboratory manual,Cold Springs Harbor Laboratory,New-York(1989,1992)，和Ausubel等人，Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1988)，以及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)和Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley&Sons,New York(1988)，以及Watson等人，Recombinant DNA,ScientificAmerican Books,New York和Birren等(编著)Genome Analysis：A LaboratoryManual Series,第1-4卷Cold Spring Harbor Laboratory Press,NewYork(1998)，以及美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057并通过引用并入本文。聚合酶链式反应(PCR)通常按照PCRProtocols：A Guide To Methods And Applications,Academic Press,San Diego,CA(1990)中所述的方法来进行。与流式细胞术组合的原位PCR用于检测含有特定DNA和mRNA序列的细胞(Testoni等，Blood1996,第87卷:第3822页)。进行RT-PCR的方法在本领域也是熟知的。
实施例1：dsRNA分子的体外测试
约1.5-2x105个测试细胞（对于靶向人基因的siRNA为HeLa细胞和/或293T细胞，而对于靶向大鼠/小鼠基因的siRNA为NRK52（正常大鼠肾近曲小管细胞）细胞和/或NMuMG细胞（小鼠乳腺上皮细胞系））接种于6孔板的每孔中（70-80%汇合）。
24小时后，利用终浓度为5nM或20nM的LipofectamineTM2000试剂（Invitrogen）以dsRNA分子转染细胞。细胞在37℃于CO2培养箱中培养72h。
用PTEN-Cy3标记的dsRNA分子被用作转染的阳性对照。GFP dsRNA分子被用作siRNA活性的阴性对照。
转染后72h，收获细胞，并从细胞中提取RNA。通过荧光显微术测试转染效率。
利用特定的优选siRNA结构时的基因表达抑制百分比使用靶基因在表达该内源基因的细胞中的qPCR分析来测定。
体液/细胞稳定性测定
如下测试本文中公开的修饰的化合物在人、大鼠或小鼠血浆或人、大鼠或小鼠血清中（在模式系统中测试），或CSF（脑髓液；人、小鼠或大鼠）或人细胞提取物中的双链体稳定性:
例如：将终浓度为7uM的dsRNA分子在37℃于100%人血清(Sigma目录号H4522)中进行孵育。(siRNA原液100uM在人血清中以1:14.29稀释或在来自各种组织类型的人组织提取物中稀释)。在不同的时间点(例如0、30分钟、1小时、3小时、6小时、8小时、10小时、16小时和24小时)将五ul(5ul)添加至15ul1.5xTBE上样缓冲液中。立即在液氮中冷冻样品，并将其保存于-20℃下。
将每一个样品加载至根据本领域已知的方法制备的非变性20%的丙烯酰胺凝胶上。在紫外光下通过溴化乙锭显现寡聚物（oligo）。
外切核酸酶稳定性测定
为了研究3’非核苷酸部分对核酸分子的稳定化作用，将有义链、反义链和退火的dsRNA双链体在由不同细胞类型制备的胞质提取物中进行孵育。
提取物：HCT116胞质提取物(12mg/ml)。
提取缓冲液：37℃下25mM Hepes pH-7.3；8mM MgCl；150mMNaCl，并在临使用时新鲜添加1mM DTT。
方法：将3.5ml的测试dsRNA(100mM)与含有120mg的HCT116胞质提取物的46.5ml混合。46.5ml由12ml的HCT116提取物和34.5ml的补充有DTT和蛋白酶抑制剂混合物/100(Calbiochem,setIII-539134)的提取缓冲液组成。siRNA在孵育试管中的终浓度为7mM。将样品在37℃下进行孵育，在指定的时间点将5ml转移至新试管，与15ml的1XTBE-50%甘油上样缓冲液混合，随后于液态N2中快速冷冻。siRNA在上样缓冲液中的终浓度为1.75mM(21ng siRNA/ml)。为了利用非变性PAGE和EtBr染色进行分析，每泳道上样50ng。为了进行Northern分析，每泳道上样1ng的测试siRNA。
图7A、7B、8A、8B、9A、10A和10B显示本文中公开的dsRNA的血浆和/或细胞提取物的稳定性。
对dsRNA分子的固有免疫反应：
将新鲜人血(在室温下)以1:1的比率与无菌0.9%NaCl在室温下混合，并轻轻地上样至(1:2的比率)Ficoll(Lymphoprep,Axis-Shield目录号1114547)上。在摇摆式离心机(swinging centrifuge)中在室温(22OC,800g)下离心样品，进行30分钟，用RPMI1640培养基洗涤，并离心(室温，250g)10分钟。计数细胞，并将其以1.5X106个细胞/ml的终浓度接种在生长培养基(RPMI1640+10%FBS+2mM L-谷氨酰胺+1%Pen-Strep)中，并在37℃下孵育1小时，随后进行dsRNA处理。随后根据制造商的说明书使用LipofectamineTM2000试剂(Invitrogen)将细胞暴露于不同的浓度的测试dsRNA，并将细胞在37℃于5%CO2培养箱中孵育24小时。
作为IFN反应的阳性对照，以0.25-5.0μg/mL的终浓度用聚(I:C)，一种作为TLR3配体的双链RNA(dsRNA)的合成类似物，(InvivoGen目录号tlrl-pic)或以0.075-2μg/mL的终浓度用Thiazolaquinolone(CLO75)，一种TLR7/8配体，(InvivoGen目录号tlrl-c75)处理细胞。将用LipofectamineTM2000试剂处理的细胞用作IFN反应的阴性(参照)对照。
在孵育后约24小时，收集细胞，并将上清液转移至新管。将样品立即在液氮中进行冷冻，并按照制造商的说明书，使用IL-6,DuoSet ELISA试剂盒(R&D System DY2060)和TNF-α,DuoSet ELISA试剂盒(R&DSystem DY210)测试IL-6和TNF-α细胞因子的分泌。从细胞沉淀（cell pellet）提取RNA，并通过qPCR测量人基因IFIT1(具有三十四肽重复的干扰素诱导蛋白1)和MX1(粘液病毒(流感病毒)抗性1，干扰素可诱导的蛋白质p78)的mRNA水平。将测量的mRNA的量针对参照基因肽基脯氨酰异构酶A(亲环素A；CycloA)的mRNA的量进行标准化。通过将来自处理的细胞的IFIT1和MX1基因的mRNA的量与它们在非处理的细胞中的量相比较来评估IFN信号传导的诱导。qPCR结果是通过QC标准的结果，即标准曲线斜率的值在区间[-4,-3]中，R2>0.99，无引物二聚体。未通过QC要求的结果丧失分析的资格。
通常，选择用于体外测试的具有特定序列的dsRNA对人和第二物种如大鼠或兔基因是特异的。测试dsRNA对人（Hu）、小鼠（Ms）、大鼠（Rt）南美洲栗鼠（Chh）和或豚鼠（GP）靶基因的活性。例如，在栗鼠中的活性通过克隆栗鼠靶基因（即CDKN1B）并且表达在293或HeLa细胞系中被测试。利用具有这些RNA序列并如本文所述地修饰的siRNA获得了相似的结果。
下表B显示dsRNA核酸的修饰模式并且概述对于具有各种修饰的核酸分子中的一些获得的体外结果。在实验中所用的siRNA都是19-mer。在表B中的体外活性相对于对照表现为%残余靶mRNA。_S500dsRNA分子具有下述修饰：交替的2’-O-甲基（Me）糖修饰的核糖核苷酸存在于反义链的第1、第3、第5、第7、第9、第11、第13、第15、第17和第19位置处，由此完全相同的修饰，即2’-O-Me糖修饰的核糖核苷酸存在于反义链的第2、第4、第6、第8、第10、第12、第14、第16和第18位置处。
_S129和_s505dsRNA分子具有下述修饰：在位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19处（_S129）或在位置2、4、6、8、11、13、15、17、19处（_S505）的2’-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸而有义链在5’端具有下述修饰：在位置18处的L-DNA核苷酸；在位置15处的DNA核苷酸（_S215），以及任选反向无碱基核苷酸、镜像核苷酸或C6-磷酸胺（C6-aminephosphate）。
表B
本文中下表C提供在制备本文中公开的dsRNA分子时所利用的修饰的核糖核苷酸/非常规部分的图例。
表C：图例
代码 修饰
核苷
5medG 5-甲基-脱氧核糖鸟苷-3’-磷酸
c6Np 氨基修饰的C6（Glen Research10-1906-xx）
dA 脱氧核糖腺苷-3’-磷酸
dB 无碱基脱氧核糖-3’-磷酸
dC 脱氧核糖胞苷-3’-磷酸
dG 脱氧核糖鸟苷-3’-磷酸
dT 胸苷-3’-磷酸
dT$ 胸苷（无磷酸）
enaA$ 乙烯-桥接核酸腺苷（无磷酸）
enaC 乙烯-桥接核酸胞苷3’磷酸
enaG 乙烯-桥接核酸鸟苷3’磷酸
enaT 乙烯-桥接核酸胸苷3’磷酸
iB 反向脱氧无碱基
LdA L-脱氧核糖腺苷-3’-磷酸(镜像dA)
LdA$ L-脱氧核糖腺苷（无磷酸）(镜像dA)
LdC L-脱氧核糖胞苷-3’-磷酸(镜像dC)
LdC$ L-脱氧核糖胞苷（无磷酸）(镜像dC)
LdG L-脱氧核糖鸟苷-3’-磷酸(镜像dG)
LdT L-脱氧核糖胸苷-3’-磷酸(镜像dT)
LdT$ L-脱氧核糖胸苷（无磷酸）(镜像dT)
mA 2’-O-甲基腺苷-3’-磷酸
mA$ 2’-O-甲基腺苷（无磷酸）
mC 2’-O-甲基胞苷-3’-磷酸
mC$ 2’-O-甲基胞苷（无3’-磷酸）
mG 2’-O-甲基鸟苷-3’-磷酸
mG$ 2’-O-甲基鸟苷（无磷酸）
mU 2’-O-甲基尿苷-3’-磷酸
mU$ 2’-O-甲基尿苷（无磷酸）
rA 核糖腺苷-3’-磷酸
rA$ 核糖腺苷（无磷酸）
rA2p 核糖腺苷-2’-磷酸
rC 核糖胞苷-3’-磷酸
rC$ 核糖胞苷（无磷酸）
rC2p 核糖胞苷-2’-磷酸
rG 核糖鸟苷-3’-磷酸
rG2p 核糖鸟苷-2’-磷酸
rU 核糖尿苷-3’-磷酸
rU$ 核糖尿苷（无磷酸）
rU2p 核糖尿苷-2’-磷酸
p 5'磷酸
z 加帽部分的前缀
zc3p 共价连接的C3Pi
zc3p$ 共价连接的C3OH
$ 无末端磷酸
表D：在所述AS-CM（反义完全匹配）序列上用psiCHECK系统测定的在HeLa细胞中的活性（%残留mRNA）
表E：通过qPCR在大鼠REF52细胞中的活性（%残留mRNA）结果是残留（%对照）的大鼠HES1基因
表F：通过qPCR的在外源表达豚鼠HES1基因的大鼠Rat-1细胞中的活性
表G：活性（%残留mRNA）：siCDKN1B_4反义完全匹配psiCHECK
表H：siCDKN1B_4显示有义链的脱靶敲低潜能的有义完全匹配psiCHECK。
CDKN1B_4_S2018，CDKN1B_4_S2075和CDKN1B_4_S2076就反义链和有义链SEQ ID NO（26895和26888），以及反义链和有义链修饰（反义链包含在位置1、13和17处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸；在位置7中的2’5’核糖核苷酸和在3’末端上共价连接的C3Pi-C3OH部分；有义链包含在位置2、6、15和18处的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸和在3’末端上共价连接的C3Pi部分）而言是同一的，并且不同之处在于CDKN1B_4_S2018在其有义链上没有5’加帽部分，而CDKN1N_4_S2075和CDKN1N_4_S2076在其有义链上分别具有反向脱氧无碱基加帽部分和氨基C6加帽部分。所有三个的活性是相似的（表G）但CDKN1N_4_S2075和CDKN1N_4_S2076的脱靶敲低潜能小于CDKN1N_4_S2018的脱靶敲低潜能。CDKN1N_4CDKN1B_4_S2075和CDKN1B_4_S2076的血浆稳定性显示于图9A中。敲低活性显示于图9B中。
实施例2：针对靶基因的活性dsRNA分子的序列的产生和siRNA的 产生
使用专有算法和本文中公开的靶基因的mRNA的已知序列，产生许多潜在的dsRNA、即siRNA的序列。序列表的关键示于下文：
SEQ ID NO:23-26,912显示用于生成下调下述基因表达有用的dsRNA的有义和反义寡核苷酸序列：HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1。每个有义和反义寡核苷酸序列以5’至3’方向提供。
具体地，SEQ ID NO:23-381提供人19-mer寡核苷酸；SEQ IDNO:382-693提供最好的19-mer人跨物种（human-cross species）寡核苷酸；SEQ ID NO:694-1367提供人18mer寡核苷酸；以及SEQ ID NO:16-1495提供在生成下调HES1表达的dsRNA中有用的最好的18-mer人跨物种寡核苷酸；表I包含在生成下调HES1表达的dsRNA中有用的基于结构A1、显示于SEQ ID NO:26,667-26,690以及基于结构A2、显示于SEQ IDNO:26,691-26,706的某些优选19mer寡核苷酸。
SEQ ID NO:1496-1759提供人19mer寡核苷酸；SEQ ID NO:1760-2029提供最好的19-mer人跨物种寡核苷酸；SEQ ID NO:2030-2575提供人18mer寡核苷酸；以及SEQ ID NO:2576-2703提供在生成下调HES5表达的dsRNA中有用的最好的18-mer人跨物种寡核苷酸；表II包含在生成下调HES5表达的dsRNA中有用的基于结构A1、显示于SEQ IDNO:26,707-26,724以及基于结构A2、显示于SEQ ID NO:26,725-26,732的某些优选19mer寡核苷酸。
SEQ ID NO:10534-11267提供人19mer寡核苷酸；SEQ IDNO:11268-11549提供最好的19-mer人跨物种寡核苷酸；SEQ IDNO:11550-12903提供人18mer寡核苷酸；以及SEQ ID NO:12904-13003提供在生成下调HEY1表达的dsRNA中有用的最好的18-mer人跨物种寡核苷酸；表III包含在生成下调HEY1表达的dsRNA中有用的基于结构A1、显示于SEQ ID NO:26,733-26,760以及基于结构A2、显示于SEQ IDNO:26,761-26,778的某些优选19mer寡核苷酸。
SEQ ID NO:13004-14077提供人19mer寡核苷酸；SEQ IDNO:14078-14801提供最好的19-mer人跨物种寡核苷酸；SEQ IDNO:14802-16839提供最好的人18mer寡核苷酸；以及SEQ IDNO:16390-16621提供在生成下调HEY2表达的dsRNA中有用的最好的18-mer人跨物种寡核苷酸；表IV包含在生成下调HEY2表达的dsRNA中有用的基于结构A1、显示于SEQ ID NO:26,779-26,784以及基于结构A2、显示于SEQ ID NO:26,785-26,788的某些优选19mer寡核苷酸。
SEQ ID NO:2704-2941提供人19mer寡核苷酸；SEQ ID NO:2942-3025提供最好的19-mer人跨物种寡核苷酸；SEQ ID NO:3026-3575提供人18mer寡核苷酸；以及SEQ ID NO:3576-3633提供在生成下调ID1表达的dsRNA中有用的最好的18-mer人跨物种寡核苷酸；表V包含在生成下调ID1表达的dsRNA中有用的基于结构A1、显示于SEQ ID NO:26,789-26,808以及基于结构A2、显示于SEQ ID NO:26,809-26,816的某些优选19mer寡核苷酸。
SEQ ID NO:3634-4107提供人19mer寡核苷酸；SEQ ID NO:4108-5053提供最好的19-mer人跨物种寡核苷酸；SEQ ID NO:5054-5751提供人18mer寡核苷酸；以及SEQ ID NO:5752-6205提供在生成下调ID2表达的dsRNA中有用的最好的18-mer人跨物种寡核苷酸；表VI包含在生成下调ID2表达的dsRNA中有用的基于结构A1、显示于SEQ IDNO:26,817-26,8240以及基于结构A2、显示于SEQ ID NO:26,8251-26,832的某些优选19mer寡核苷酸。
SEQ ID NO:6206-6531提供人19mer寡核苷酸；SEQ ID NO:6532-6671提供最好的人跨物种寡核苷酸；SEQ ID NO:6672-7353提供人18mer寡核苷酸；以及SEQ ID NO:7354-7443提供在生成下调ID3表达的dsRNA中有用的最好的18-mer人跨物种寡核苷酸；表VII包含在生成下调ID3表达的dsRNA中有用的基于结构A1、显示于SEQ ID NO:26,833-26,850以及基于结构A2、显示于SEQ ID NO:26,851-26,866的某些优选19mer寡核苷酸。
SEQ ID NO:7444-8185提供人19mer寡核苷酸；SEQ ID NO:8186-9007提供最好的人跨物种寡核苷酸；SEQ ID NO:9008-10233提供人18mer寡核苷酸；以及SEQ ID NO:10234-10533提供在生成下调CDKN1B表达的dsRNA中有用的最好的18-mer人跨物种寡核苷酸；表VIII包含在生成下调CDKN1B表达的dsRNA中有用的基于结构A1、显示于SEQ IDNO:26,867-26,886以及基于结构A2、显示于SEQ ID NO:26,887-26,900的某些优选19mer寡核苷酸。
SEQ ID NO:16622-18469提供人19mer寡核苷酸；SEQ IDNO:18470-18643提供最好的人跨物种寡核苷酸；SEQ ID NO:18644-26211提供人18mer寡核苷酸；以及SEQ ID NO:26212-26666提供在生成下调NOTCH1表达的dsRNA中有用的最好的18-mer人跨物种寡核苷酸；表IX包含在生成下调NOTCH1表达的dsRNA中有用的基于结构A1、显示于SEQ ID NO:26,901-26,910以及基于结构A2、显示于SEQ IDNO:26,911-26,912的某些优选19mer寡核苷酸。
所述寡核苷酸序列基于它们在专有算法中作为用于靶向人基因表达的最好预测序列的分数排序。
“18+1”指的是长度为19个核苷酸的分子并且根据结构A2在反义链的位置1处包含对mRNA靶的错配。在优选实施方案中，有义链是与反义链完全互补的。在一些实施方案中，有义链在位置1、2或3处是与反义链错配的。
实施例3：双链RNA分子的中靶（On-target）和脱靶测试：
psiCHECKTM系统使得能够通过监测它们的靶序列的表达水平的变化来评估引导链GS(反义链)和过客链PS(有义链)引发靶向效应（中靶）和脱靶效应。制备4种基于psiCHECKTM-2(Promega)的构建体以用于评估每一种测试分子的GS和PS链的靶向活性和潜在脱靶活性。在每一种构建体中，将测试分子的PS和GS的1个拷贝或3个拷贝的完全靶序列或种子靶序列克隆进入位于3'-UTR区域中的海肾萤光素酶翻译终止密码子的下游的多克隆位点。所得的载体称为：
GS-CM(引导链，完全匹配)载体，其含有1个拷贝的完全靶序列(与测试分子的GS的整个19个碱基的序列完全互补的核苷酸序列);
PS-CM(过客链，完全匹配)载体，其含有1个拷贝的完全靶序列(与测试分子的PS的整个19个碱基的序列完全互补的核苷酸序列);
GS-SM(引导链，种子匹配)载体，其含有1个拷贝或3个拷贝的种子区域靶序列(与测试分子的GS的核苷酸1-8互补的序列);
PS-SM(过客链，种子匹配)载体，其含有1个拷贝的种子区域靶序列(与测试分子的PS的核苷酸1-8互补的序列)。
命名：
引导链：进入RISC复合物并且引导互补RNA序列的切割/沉默的siRNA链
种子序列：自引导链的5’端的核苷酸2-8。
cm（完全匹配）：与siRNA的引导链完全互补的DNA片段。将该DNA片段克隆入报告基因的3’UTR中，并且用作用于明确的RNA沉默的靶。
sum（种子匹配）：具有与siRNA的引导链的ns2-8完全互补的ns12-18的核苷酸的19-mer DNA片段。将该DNA片段克隆入报告基因的3’UTR中，并且用作用于“脱靶”沉默的靶。
X1：克隆进入报告基因的3’UTR的单拷贝的cm或sum。
X3：克隆进入报告基因的3’UTR的三拷贝的cm或sum，用4核苷酸使一个与另一个分开。
实施例4：靶基因dsRNA治疗对在南美洲栗鼠耳蜗中碳铂诱导的毛细 胞死亡的效果
通过向每只动物的左耳直接施用盐水中的HES1、HES5、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的siRNA（如在表2A-10D中公开的化合物）对8只南美洲栗鼠进行预处理。向各动物右耳施用盐水作为安慰剂。siRNA施用后两天，用碳铂（75mg/kg iP）处理动物。在南美洲栗鼠处死（碳铂处理后两周）后，计算左耳（siRNA处理）和右耳（盐水处理）内毛细胞（IRC）和外毛细胞（ONC）中死细胞的%。因为siRNA的效果是跨剂量相似的，所以从3种剂量汇总数据。如上述所示，碳铂在75mg/kg的剂量优先损伤南美洲栗鼠的内毛细胞，而外毛细胞保持完整。本文中提供的dsRNA化合物降低在耳蜗中的耳毒素诱导（例如碳铂诱导的）的内毛细胞损失。
实施例5：dsRNA处理对在南美洲栗鼠耳蜗中声音诱导的毛细胞死亡 的影响
在南美洲栗鼠中研究声损伤模型中本发明的dsRNA分子的活性。一组7只动物通过将它们暴露于105dB的居中于4kHz的噪声倍频带2.5h遭受声损伤。暴露于噪音的南美洲栗鼠的左耳用～10μL盐水中的约30μgsiRNA预处理（在声损伤前48h），右耳用媒介物（盐水）预处理。化合物的动作电位（CAP）是测定从耳蜗传播的神经活动的方便和可靠的电生理学方法。为了检测当声刺激，如咔哒声或短纯音（tone burst）突然打开时产生的局部场电位，通过在接近耳蜗基底安置电极记录CAP。声损伤后约2.5周评定各耳的功能状况。特别地，为了测定在dsRNA-处理的耳朵中的阈值是否比未经处理的（盐水）耳朵的阈值低（好），在声损伤后2.5周测定从圆窗记录的化合物动作电位的平均阈值。另外，在siRNA-处理和对照耳朵中测定内毛细胞和外毛细胞的损失量。此结果表明本文中提供的dsRNA能够降低耳蜗中的声损伤诱导的ONC损失。
实施例6：dsRNA处理对在大鼠耳蜗中治疗顺铂诱导的毛细胞死亡的 效应
在顺铂处理之前用8、16及32kHz咔哒声信号测试雄性Wistar大鼠基底听性脑干反应（basal auditory brainstem response）（ABR）阈值。在基底听性脑干反应测试后，以腹膜内灌输12mg/kg持续30分钟施用顺铂。处理过的耳接受各l ug/4微升的在PBS中的本文中公开的dsRNA（直接应用于圆窗膜）。或用非相关GFP dsRNA或用PBS处理对照耳。在施用顺铂之前的3至5天之间施用dsRNA分子以允许对耳蜗的保护作用。
施用顺铂3天后重复听性脑干反应（ABR）测试。比较预处理和处理后听性脑干反应阈值，并且测量阈值中的位移。顺铂处理后阈值的位移更高指示耳蜗中的毛细胞损失更严重。重复听性脑干反应测试后，处死动物并取耳蜗且用扫描电子显微镜（SEM）处理耳蜗以量化在钩区域（高频区域）中的外毛细胞（ONC）损失。通过将丢失或严重损伤的细胞数量除以照相视野中的外毛细胞总数计算外毛细胞损失的%。结果表明在施用耳毒素（例如顺铂）之前施用本文中公开的dsRNA化合物对耳蜗提供保护效应。
实施例7：其他听力损失模型
A）在豚鼠中的听力再生（可塑性）模型
利用单次ic注射卡那霉素（450-500mg/kg）随后通过单次iv（颈部）注射依他尼酸（EA）系统地处理白变种豚鼠（albino guinea pig）诱导耳聋（deafening）。大约1至2天后，这种药理学耳聋消除两侧所有毛细胞并留下分化的支持细胞。治疗性核酸通过经鼓膜注射（TT）被应用于中耳或通过滴耳剂（ErD）进入外耳道或鼓室。
如上所述应用靶向HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的dsRNA。
dsRNA的功效被如下检查：
1）用肌球蛋白VIIa（毛细胞标志物）和鬼笔环肽的全封固染色（whole-mount）从形态学上分析耳蜗。
2）BrdU的掺入被作为毛细胞增殖率的指示剂来测量。
B）在豚鼠中噪声诱导的急性听力损失模型
噪声可引起具有暂时性或永久性感觉神经性听力损失（SNHL）以及耳鸣的听力损伤。SNHL和耳鸣可单独发生或联合发生。在人中，通过在纯音听力图中的阈移、在复聪中的阈移、在超阈值听力测试的病理结果中的阈移以及在耳声发射的振幅下降中的阈移证明噪声诱导的听力损失（NIHL）。听力损伤被通过暴露于连续噪声或脉冲噪声来诱导。此外，脉冲噪声损伤或爆炸损伤的可能性应被予以考虑。暴露于脉冲噪声比暴露于连续噪声可导致更严重的内耳损伤。用于噪声损伤发展的重要标准是声压级（SPL）、级别增长速度、暴露时间以及个体易感性（“弱势内耳”）。噪声暴露通常导致可随后被部分地分辨的阈值的提高，这样的暂时性组分被称为“暂时性听阈位移”（TTS）。在TTS后，如果在恢复期没有完全恢复，这可导致永久性内耳损伤（永久性听阈位移=PTS）。非常高的声音强度可导致直接的细胞死亡和内耳中结构的机械性破裂以及PTS。
在这个模型中，两侧损伤利用噪声暴露被诱导；豚鼠暴露于117dB SPL频带噪声持续6小时。
在根据这个模型的初步研究中，靶向HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1的dsRNA应用于这个模型，具有相似的结果。
实施例8：在聋动物的支持细胞中的dsRNA
实验设计基本上如在图1中描绘。在小鼠中，氨基糖苷、链霉素用于诱导内耳毛损失。链霉素（200mg/kg）被注射到后半规管（PSC）并且7天后针对HES5的dsRNA（2ug/ug）被注射到PSC。在dsRNA注射后两周，内耳毛细胞再生被评估。
预实验被进行以表明，通过对PSC应用Cy3标记的dsRNA，dsRNA可被递送至在PSC中的靶细胞。通过局部注射到PSC，dsRNA被递送至正常前庭感觉上皮。（图未显示）。更重要地，通过局部注射到PSC，dsRNA被递送至AG-损伤的前庭感觉上皮（图2A-2B）。
图3A-3B显示用针对HES5的dsRNA的处理增加在AG-损伤的前庭上皮中毛细胞的量。
图4显示用针对HES5的dsRNA的处理促进毛细胞再生。y-轴显示毛细胞计数。柱被如下标记：ASCC-前半规管，LSCC-外半规管，PSCC-后半规管。
用针对HES5的dsRNA的处理增加前庭毛细胞（Atoh1-阳性）的量，如用双抗-Atoh1和抗肌球蛋白VIIa染色所鉴定的（图5）。
图6显示用针对HES5的dsRNA的处理下调HES5并且上调Atoh1表达。
结论
1.通过后半规管造瘘给予的siRNA可影响在正常与AG损伤的小鼠前庭中的前庭感觉上皮。
2.通过施用Hes5siRNA促进在AG损伤后3周的前庭毛细胞再生。
所用的Hes5的dsRNA的序列为如下：
有义链：GGGUUCUAUGAUAUUUGUA(SEQ ID NO:26728)；结构：rG;mG;rG;mU;rU;mC;rU;mA;rU;mG;rA;mU;rA;mU;rU;mU;rG;mU;rA
反义链：UACAAAUAUCAUAGAACCC(SEQ ID NO:26732)；结构：mU;rA;mC;rA;mA;rA;mU;rA;mU;rC;mA;rU;mA;rG;mA;rA;mC;rC;mC
3.在AG损伤后2周Atoh1阳性细胞数目在Hes5 dsRNA处理的小鼠中是较高的。
4.在siRNA处理组中Hes5的mRNA的表达被更进一步下调。
5.在siRNA处理组中Atoh1的mRNA的表达被更进一步上调。
实施例9：靶基因siRNA处理对噪声诱导的内耳听觉细胞死亡的影响
模式系统：使豚鼠暴露于居中于6kHz、130dB SPL的一个-倍频程-带 （one-octave-band）噪音持续2小时（Futon等人,NeuroReport19:277-281, 2008）
实验组
具有正常普赖尔氏反射（Preyer’s reflex）的哈特利（Hartley）成年白变种豚鼠（3个月龄），暴露于噪声并且随机分配到以下组：未处理的噪声对照组（n=6），使用媒介物的噪声对照动物（n=6），用本文中提供的下调HES1基因表达的dsRNA化合物以1ug的剂量处理的动物（n=6）；用本文中提供的下调HES1基因表达的dsRNA化合物以5ug的剂量处理的动物（n=6）；用本文中提供的下调HES1基因表达的dsRNA化合物以10ug的剂量处理的动物（n=6）；用本文中提供的下调HES1基因表达的dsRNA化合物以50ug的剂量处理的动物（n=6）；使用下调EGFP基因表达的对照dsRNA化合物的4组噪声对照动物（每组n=6），分别为1μg、5μg、10ug和50ug的剂量。
在噪声暴露前1h进行处理并且此后每日一次持续3天。
以下示例性媒介物被用于这个实验中：PBS、人工外淋巴液。
dsRNA测试化合物及dsRNA对照化合物被配制用于在实验的媒介物中施用。
媒介物、dsRNA测试化合物或dsRNA对照化合物，被向腹膜内注射或通过弹丸注射。在功能评估后所有动物被用致死剂量的麻醉剂处死：在1天时每组3个动物用于免疫标记和在21天时的剩余动物，其中三个被更进一步处理用于扫描电子显微镜（SEM）。
噪声暴露
声损伤被通过由波形发电机（例如：Generator LAG-120B，LeaderElectronic Corp,Yokohama,Japan）产生并由声频放大器（例如：A-207R,Pioneer Electronics,Long Beach,California,USA）放大的6kHz的连续纯音诱导。所有动物，在麻醉下，暴露于持续40min的6kHz、120db SPL（声压级）的存在于开放场地（例如：圆顶高频扬声器TW340x0,Audax,Chateau de Loir,France）的声波中。
听觉功能的电生理测量
在噪声暴露之前及在噪声暴露后1h、3天、7天和21天时测量听性脑干反应（ARB）。动物被轻度麻醉并被放置在隔音室中。三个电极被皮下地插入右乳突（有效）、顶点（参比）和左乳突（地线）。电脑控制的数据采集系统，例如具有实时数字信号处理的TDT系统3（Tucker-DavisTechnologies,Alachu,Florida,USA）的数据采集系统被用于记录ABR并且被用于产生听觉刺激。从2至24kHz（上升/落下时间，1ms；总持续时间，10ms；重复率，20/s）变化的纯音的短纯音（tone burst）单音地存在于开放场地。在各频率等级组合，反应被过滤（0.3至3kHz）、被数字化并被跨500个离散样品平均。
形态学研究：扫描电子显微镜
进行SEM分析，例如如在Sergi B，等人Protective properties ofidebenone in noise-induced hearing loss in the guinea pig.NeuroReport2006；第17卷:第857-861页中描述的。简言之，每组三只动物的耳蜗被具有2.5%戊二醛的0.1M磷酸盐缓冲液灌注（n=3）并被后固定过夜且然后被在2%四氧化锇二甲砷酸盐缓冲液中孵育持续2h。经过显微解剖后，所述耳蜗被用从30%至100%的渐增浓度的乙醇脱水并在临界点被干燥且最后被用金涂覆。每个样品被通过例如Zeiss Supra50场致发射（Field Emission）装置（Carl Zeiss Inc.,Gottingen,Germany）的工具观察并被照相。柯蒂氏器表面形态的定量EM观测被通过确定20个区段（每个基膜的长度为1mm）中毛细胞的数目来进行。如果静纤毛束是不存在的或聚束的静纤毛是完全融合的则毛细胞被计数为缺失。毛细胞计数的结果被表达为超过耳蜗整个长度的内毛细胞和外毛细胞的每一行中剩余毛细胞的百分比。
末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP切口（nick）末端标记测定法
为每组三个动物的耳蜗（n=3）被通过用如在以下中描述的TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP切口末端标记）测定法（例如，MolecularProbes,Inc.,Carslbad,California,USA）染色：B Sergi等人Protectiveproperties of idebenone in noise-induced hearing loss in the guinea pig.NeuroReport(2006)第17卷:第857-861页。简言之，耳蜗被用pH7.3的具有10%甲醛的0.1M磷酸盐缓冲盐水（PBS）固定。经过显微解剖后，柯蒂氏器表面制品被在冰冷的70%（v/v）的乙醇中孵育过夜且然后在含有10μl的反应缓冲液、0.75μl的TdT酶、8.0μl的BrdUTP及31.25μl的dH2O的新配制的DNA标记溶液中在室温下持续16h。然后组织被包含在TUNEL测定试剂盒中（例如，Molecular Probes Inc.,Carlsbad,California,USA）的用Alexa Fluor488染料标记的抗BrdU的抗体染色（5μl的抗体加上95μl的柯蒂被用碘化丙啶（propidium iodide）（5μg/ml在10mM PBS中）双染色在室温下持续20min。）。在PBS中漂洗后，柯蒂氏器被包埋在含有抗退色介质（例如，延长金，Molecular Probes,Inc.）的载玻片上。样品被用共聚焦激光扫描显微镜观察（例如，Leica TCS-SP2,Leica Inc.,Wetzlar,Germany）。
结果
在这个模型中观察的结果表明本文中提供的dsRNA：
（a）减弱噪声诱导的阈移；
（b）减少噪声诱导的外毛细胞损失；提供针对噪声诱导的听力损失（NIHL）的保护。
这个模型用于测试具有下调，例如HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1基因的潜能的dsRNA分子的功效是有用的。
尽管上述实施例已举例说明了进行本发明的实施方案的特定方法，但在实践中，本领域技术人员将理解进行本发明的实施方案的替代性方法，所述方法未在本文中明确地显示。应理解，本公开内容被认为是本发明的原理的范例，并且无意将本发明限定于举例说明的实施方案。
本领域技术人员将承认或能够使用仅常规实验确定本文中描述的本发明的具体实施方案的等同物。此类等同物意欲由以下权利要求所涵盖。

Claims (65)

1.一种双链核酸分子，所述双链核酸分子具有以下所示的结构（A2）：
（A2）       5’    N1-(N)x-Z           3’(反义链)
             3’ Z’-N2-(N’)y-z”      5’(有义链)
其中N2、N和N’的每一个是未修饰的或修饰的核糖核苷酸或非常规部分；
其中(N)x和(N’)y的每一个是其中每一个连续的N或N’通过共价键连接至相邻的N或N’的寡核苷酸；
其中x和y的每一个独立地为17与39之间的整数；
其中(N’)y的序列与(N)x的序列具有互补性，并且(N)x与HES1 mRNA（SEQ ID NO:1）内的连续序列具有互补性；
其中N1共价地结合至(N)x，并且与所述HES1 mRNA错配或为与所述HES1 mRNA互补的脱氧核糖核苷酸部分；
其中N1为选自由以下组成的组中的部分：天然的或修饰的尿苷、脱氧核糖尿苷、核糖胸苷、脱氧核糖胸苷、腺苷或脱氧腺苷；
其中z”可存在或不存在，但如果存在，则为在N2-(N’)y的5’末端上共价连接的加帽部分；以及
其中Z和Z’的每一个独立地存在或不存在，但如果存在，则独立地为在其所存在的链的3’末端上共价连接的1-5个连续的核苷酸、连续的非核苷酸部分或其组合。
2.如权利要求1所述的双链核酸分子，其中x=y=18。
3.如权利要求2所述的双链核酸分子，所述双链核酸分子包含选自描述为HES1_14（SEQ ID NO:26681和26669）以及HES1_36（SEQ IDNO:26690和26678）的核酸的(N)x和(N’)y。
4.如权利要求3所述的双链核酸分子，其中(N)x为SEQ ID NO:26681而(N’)y为SEQ ID NO:26669。
5.如权利要求4所述的双链核酸分子，其中(N)x为SEQ ID NO:26681而(N’)y为SEQ ID NO:26669；其中(N)x包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸以及任选的在位置5、6或7的至少一个中的2’-5’核糖核苷酸；其中(N’)y包含至少一个2’5’核糖核苷酸或2’OMe修饰的核糖核苷酸；其中z”是存在的；并且其中Z和Z’的每一个是存在的，而且由共价连接至其所存在的链的3’末端的非核苷酸部分组成。
6.如权利要求5所述的双链核酸分子，其中(N)x包含在位置1、3、9、11、15和18（5’>3’）中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸；而其中(N’)y包含在位置1中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，和在3’末端位置15、16、17、18和19（5’>3’）中的5个连续的2’5’核糖核苷酸。
7.如权利要求5所述的双链核酸分子，其中(N)x包含在位置1、3、9、11、14、15和18（5’>3’）中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，以及在位置7中的2’5’核糖核苷酸；而其中(N’)y包含在位置1中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，以及在3’末端位置15、16、17、18及19（5’>3’）中的5个连续的2’5’核糖核苷酸。
8.如权利要求5所述的双链核酸分子，其中(N)x包含在位置1、3、9、11、14、15和18（5’>3’）中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，以及存在于位置7中的2’5’核糖核苷酸；而其中(N’)y包含在位置1、4、8、10、12和16中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。
9.如权利要求4至8中的任一项所述的双链核酸分子，其中z”包含反向无碱基部分；其中Z’包含C3Pi部分；而其中Z包含C3Pi-C3OH部分。
10.如权利要求3所述的双链核酸分子，其中(N)x为SEQ ID NO:26690而(N’)y为SEQ ID NO:26678。
11.如权利要求10所述的双链核酸分子，其中(N)x为SEQ IDNO:26690而(N’)y为SEQ ID NO:26678；其中(N)x包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸以及任选的在位置5、6或7的至少一个中的2’-5’核糖核苷酸；其中(N’)y包含至少一个2’5’核糖核苷酸或2’OMe修饰的核糖核苷酸；其中z”存在；并且其中Z和Z’的每一个存在，而且由共价连接至其所存在的链的3’末端的非核苷酸部分组成。
12.如权利要求11所述的双链核酸分子，其中(N’)x包含在位置3、9、11及15中的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸；而其中(N’)y包含在3’末端位置15、16、17、18及19中的5个2’5’核糖核苷酸。
13.如权利要求10至12中的任一项所述的双链核酸分子，其中z”包含反向无碱基部分；其中Z’包含C3Pi部分；而其中Z包含C3Pi-C3OH部分。
14.如权利要求1或2所述的双链核酸分子，所述双链核酸分子包含选自描述为以下的核酸的反义链及有义链：HES1_12(SEQ ID NO:26679和26667)、HES1_13(SEQ ID NO:26680和26668)、HES1_16(SEQ IDNO:26682和26670)、HES1_19(SEQ ID NO:26683和26671)、HES1_20(SEQID NO:26684和26672)、HES1_21(SEQ ID NO:26685和26673)、HES1_22(SEQ ID NO:26686和26674)、HES1_24(SEQ ID NO:26687和26675)、HES1_28(SEQ ID NO:26688和26676)以及HES1_33(SEQ IDNO:26689和26677)。
15.如前述权利要求中的任一项所述的双链核酸分子，其中所述共价键是磷酸二酯键。
16.如权利要求1至15中的任一项所述的双链核酸分子，所述双链核酸分子用于减少在耳细胞中HES1的表达。
17.一种组合物，所述组合物包含如权利要求17所述的双链核酸分子；以及药学上可接受的载体。
18.一种在受试者中治疗听力障碍/听力损失的方法，其中HES1基因的表达与所述听力障碍/听力损失的病因或进展有关，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求18所述的组合物，从而在所述受试者中治疗所述听力障碍/听力损失。
19.一种在受试者中治疗平衡障碍的方法，其中HES1基因的表达与所述平衡障碍的病因或进展有关，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求18所述的组合物，从而在所述受试者中治疗所述平衡障碍。
20.一种在受试者中预防内耳耳（感觉）毛细胞损失的方法，其中HES1基因的表达与内耳耳（感觉）毛细胞损失的病因学或进展有关，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求18所述的组合物，从而在所述受试者中预防所述内耳耳（感觉）毛细胞损失。
21.一种双链核酸分子，所述双链核酸分子具有以下所示的结构（A2）：
（A2）     5’  N1-(N)x-Z           3’(反义链)
           3’ Z’-N2-(N’)y-z”    5’(有义链)
其中N2、N和N’的每一个是未修饰的或修饰的核糖核苷酸或非常规部分；
其中(N)x和(N’)y的每一个是其中每一个连续的N或N’通过共价键连接至相邻的N或N’的寡核苷酸；
其中x和y的每一个独立地为17与39之间的整数；
其中(N’)y的序列与(N)x的序列具有互补性，并且(N)x与靶基因内的连续序列具有互补性；
其中N1共价地结合至(N)x，并且与所述靶基因错配或为与所述靶基因互补的脱氧核糖核苷酸部分；
其中N1为选自由以下组成的组中的部分：天然的或修饰的尿苷、脱氧核糖尿苷、核糖胸苷、脱氧核糖胸苷、腺苷或脱氧腺苷；
其中z”可存在或不存在，但如果存在，则为在N2-(N’)y的5’末端上共价连接的加帽部分；以及
其中Z和Z’的每一个独立地存在或不存在，但如果存在，则独立地为在其所存在的链的3’末端上共价连接的1-5个连续的核苷酸、连续的非核苷酸部分或其组合；以及其中所述有义链和反义链包含以下任何所示的序列对：SEQ ID NO:2030-2703和SEQ ID NO:26707-26724(HES5)；SEQ IDNO:3026-3633和SEQ ID NO:26789-26808(ID1)；SEQ ID NO:5054-6205和SEQ ID NO:26817-26824(ID2)；SEQ ID NO:6672-7443和SEQ IDNO:26833-26850(ID3)；SEQ ID NO:9008-10533和SEQ ID NO:26867-26886(CDKN1B)；SEQ ID NO:11550-13003和SEQ ID NO:26733-26760(HEY1)；SEQ ID NO:14802-16389和SEQ ID NO:26779-26784(HEY2)；SEQ IDNO:18644-26666和SEQ ID NO:2601-26910(NOTCH1)。
22.如权利要求21所述的双链核酸分子，其中x=y=18。
23.如权利要求22所述的双链核酸分子，其中(N)x和(N’)y为以下任一种中所示的序列对：SEQ ID NO:26707-26724(HES5)；SEQ ID NO:26789-26808(ID1)；SEQ ID NO:26817-26824(ID2)；SEQ IDNO:26833-26850(ID3)；SEQ ID NO:26867-26886(CDKN1B)；SEQ IDNO:26733-26760(HEY1)；SEQ ID NO:26779-26784(HEY2)；SEQ IDNO:2601-26910(NOTCH1)。
24.如权利要求23所述的双链核酸分子，所述双链核酸分子包含选自描述为HEY2_1(SEQ ID NO:26747和SEQ ID NO:26733)和HEY2_2(SEQID NO:26748和SEQ ID NO:26734)的核酸的(N)x和(N’)y。
25.如权利要求24所述的双链核酸分子，所述双链核酸分子包含选自描述为CDKN1B_31(SEQ ID NO:26879和SEQ ID NO:26869)的核酸的(N)x和(N’)y。
26.一种双链RNA（dsRNA）分子，具有结构（A1）：
（A1）       5’   (N)x-Z  3’       (反义链)
             3’ Z’-(N’)y-z”5’   (有义链)
其中每个N和N’为可为未修饰的或修饰的核糖核苷酸或非常规部分；其中(N)x和(N’)y的每一个是其中每一个连续的N或N’通过共价键连接至下一个N或N’的寡核苷酸；
其中Z和Z’的每一个独立地存在或不存在，但如果存在，则独立地包含在其所存在的链的3’末端上共价连接的1至5个连续的核苷酸、1至5个连续的非核苷酸部分或其组合；
其中z”可存在或不存在，但如果存在，则为在(N’)y的5’末端上共价连接的加帽部分；
x和y的每一个独立地为从18到40的整数；
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补；并且其中(N)x包含以下任一种中所示的反义序列且(N’)y包含以下任一种中所示的有义序列：SEQ IDNO:23-693和SEQ ID NO:26691-26706(HES1)；SEQ ID NO:1496-2029和SEQ ID NO:26725-26732(HES5)；SEQ ID NO:2704-3025和SEQ IDNO:26809-26816(ID1)；SEQ ID NO:3634-5053和SEQ ID NO:26825-26832(ID2)；SEQ ID NO:6206-6671和SEQ ID NO:26851-26866(ID3)；SEQ IDNO:7444-9007和SEQ ID NO:26887-26900(CDKN1B)；SEQ IDNO:10534-11549和SEQ ID NO:26761-26778(HEY1)；SEQ IDNO:13004-14801和26785-26788(HEY2)；SEQ ID NO:16622-18643和SEQID NO:26922-26912(NOTCH1)。
27.如权利要求26所述的双链核酸分子，其中y=19。
28.如权利要求27所述的双链核酸分子，其中(N)x和(N’)y为以下任一种中所示的序列对：SEQ ID NO:26691-26706(HES1)；SEQ IDNO:26725-26732(HES5)；SEQ ID NO:26809-26816(ID1)；SEQ IDNO:26825-26832(ID2)；SEQ ID NO:26851-26866(ID3)；SEQ IDNO:26887-26900(CDKN1B)；SEQ ID NO:26761-26778(HEY1)；SEQ IDNO:26785-26788(HEY2)；SEQ ID NO:26922-26912(NOTCH1)。
29.如权利要求28所述的双链核酸分子，包含选自描述为HES5_8(SEQ ID NO:26732和SEQ ID NO:26728)的核酸的(N)x和(N’)y。
30.如权利要求28所述的双链核酸分子，包含选自描述为CDKN1B(SEQ ID NO:26690和SEQ ID NO:26887)的核酸的(N)x和(N’)y。
31.如权利要求21至30中的任一项所述的双链核酸分子，其中连接每一个连续的N和/或N’的共价键是磷酸二酯键。
32.如前述权利要求中的任一项所述的双链核酸分子，其中所述核酸分子包含一个或多个包含修饰的糖部分的核糖核苷酸。
33.如前述权利要求中的任一项所述的双链核酸分子，其中所述核酸分子包含一个或多个包含修饰的糖部分的核糖核苷酸；并且其中所述修饰的糖部分独立地选自由以下组成的组中：2’-O-甲基、2’-甲氧基乙氧基、2’-脱氧、2’-氟以及2’-烯丙基。
34.如前述权利要求中的任一项所述的双链核酸分子，其中所述核酸分子包含一个或多个修饰的核碱基。
35.如前述权利要求中的任一项所述的双链核酸分子，其中所述核酸分子包含一个或多个修饰的核碱基；并且其中所述一个或多个修饰的核碱基独立地选自由以下组成的组中：黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤及鸟嘌呤的6-甲基衍生物和其它烃基衍生物，腺嘌呤及鸟嘌呤的2-丙基衍生物和其它烃基衍生物，5-硫尿嘧啶及胞嘧啶，5-丙烯基尿嘧啶及胞嘧啶，6-氮杂尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶，5-尿嘧啶（假尿嘧啶），4-硫尿嘧啶，8-卤代、氨基、硫醇、硫代烃基、羟基以及其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤，5-三氟甲基以及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤以及无环核苷酸。
36.如前述权利要求中的任一项所述的双链核酸分子，其中所述核酸分子包含一个或多个对磷酸二酯骨架的修饰。
37.如前述权利要求中的任一项所述的双链核酸分子，其中所述核酸分子包含一个或多个对磷酸二酯骨架的修饰；并且其中所述一个或多个对磷酸二酯骨架的修饰独立地选自由以下组成的组中：硫代磷酸酯、3’-（或-5’）脱氧-3’-（或-5’）硫代-硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、3’-（或-5’）脱氧亚膦酸酯、硼酸磷酸盐、3’-（或-5’）脱氧-3’-（或5’-）氨基氨基磷酸酯、氢磷酸酯、硼酸磷酸酯、氨基磷酸酯、烃基或芳基膦酸酯以及磷酸三酯或磷酸键。
38.如前述权利要求中的任一项所述的双链核酸分子，其中所述核酸分子在有义链而不是反义链中包含一个或多个修饰。
39.如前述权利要求中的任一项所述的双链核酸分子，其中所述核酸分子在反义链而不是有义链中包含一个或多个修饰。
40.如前述权利要求中的任一项所述的双链核酸分子，其中所述核酸分子在有义链与反义链中均包含一个或多个修饰。
41.如前述权利要求中的任一项所述的双链核酸分子，其中所述有义链包含交替修饰模式。
42.如前述权利要求中的任一项所述的双链核酸分子，其中所述反义链包含交替修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核苷酸模式。
43.如前述权利要求中的任一项所述的双链核酸分子，其中所述有义链包含交替修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核苷酸模式，并且其中所述修饰为对所述核糖核苷酸的糖部分，优选地导致2’-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸。
44.如前述权利要求中的任一项所述的双链核酸分子，其中所述反义链包含交替修饰的核糖核苷酸及未修饰的核糖核苷酸模式，并且其中所述修饰为对所述核糖核苷酸的糖部分，优选地导致2’-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸。
45.如权利要求43所述的双链核酸分子，其中所述模式开始于所述有义链的5’末端上的修饰的核糖核苷酸。
46.如权利要求44所述的双链核酸分子，其中所述模式开始于所述反义链的5’末端上的修饰的核糖核苷酸。
47.如权利要求43所述的双链核酸分子，其中所述模式开始于所述有义链的3’末端上的修饰的核糖核苷酸。
48.如权利要求44所述的双链核酸分子，其中所述模式开始于所述反义链的3’末端上的修饰的核苷酸。
49.如前述权利要求中的任一项所述的双链核酸分子，其中所述有义链与所述反义链都包含交替修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核苷酸模式；其中所述修饰为对所述核糖核苷酸的糖部分，优选地导致2’-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸；并且其中所述模式被配置为使得所述有义链的此类修饰的核糖核苷酸与所述反义链中未修饰的核糖核苷酸相对，而且反之亦然。
50.如权利要求49所述的双链核酸分子，其中所述模式被配置为使得所述有义链的每一个修饰的核糖核苷酸与所述反义链中修饰的核糖核苷酸相对。
51.如前述权利要求中的任一项所述的双链核酸分子，其中所述有义链和/或所述反义链中的一个或两个在3’末端上包含1-3个脱氧核糖核苷酸。
52.如前述权利要求中的任一项所述的双链核酸分子，其中所述有义链和/或所述反义链中的一个或两个在5’末端上包含磷酸基团。
53.如前述权利要求中的任一项所述的双链核酸分子，其中所述有义链包含至少一个切口或缺口。
54.一种在细胞中下调靶基因表达的方法，其中所述靶基因选自由以下组成的组中：HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B和NOTCH1，所述方法包含向所述细胞引入有效下调所述靶基因的表达的量的如前述权利要求中任一项所述的双链核酸分子。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述细胞为耳细胞。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述耳细胞为内耳细胞。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述内耳细胞为内毛细胞或外毛细胞。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述方法在体外进行。
59.如权利要求57所述的方法，其中所述方法在体内进行。
60.一种组合物，所述组合物包含为患者使用而包装的如权利要求1至16及21至53中的任一项所述的双链核酸分子。
61.如权利要求60所述的组合物，其中所述组合物包含提供某些有关可如何使用如权利要求1至16及21至53中的任一项所述的核酸分子的信息的标签或包装插页。
62.如权利要求61所述的组合物，其中所述标签或包装插页包含给药信息。
63.如权利要求62所述的组合物，其中所述标签或包装插页包含使用指示。
64.如权利要求61至63中的任一项所述的组合物，其中所述标签或包装插页指示如权利要求1至16及21至53中的任一项所述的核酸分子适合用于治疗。
65.如权利要求60至64中的任一项所述的组合物，其中所述标签或包装插页指示如权利要求1至16及21至53中的任一项所述的核酸分子适合用于治疗患有与HES1、HES5、HEY1、HEY2、ID1、ID2、ID3、CDKN1B或NOTCH1基因的任一个的表达相关的疾病的患者。
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