JP2013537404A - Ｒｈｏａに対する二本鎖ｒｎａ化合物およびその使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ＲｈｏＡ遺伝子の下方制御のための化合物、それを含む薬学的組成物、その使用方法、およびキットに関する。本化合物、組成物、方法、およびキットは、ＲｈｏＡ発現が悪影響を与える疾患もしくは状態および／またはそれらの疾患もしくは状態に関連する症状を患っている対象の治療、および神経保護を与えるために有用である。

Description

関連出願
本願は、２０１０年６月２４日に出願され、全体として、および全ての目的で、参照により本明細書に組み込まれる米国特許仮出願第６１／３５８０１２号（名称「ｓｉＲＮＡ ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ ＴＯ ＲＨＯＡ ＡＮＤ ＵＳＥ ＴＨＥＲＥＯＦ」）の利益を主張する。
配列表
本願は、２２１−ＰＣＴ１＿ＳＴ２５＿２１−Ｊｕｎｅ−２０１１．ｔｘｔと題する配列表を包含し、２０１１年６月２１に作成された、３８ｋｂのサイズの前記ＡＳＣＩＩコピーは、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
本願全体にわたり様々な特許および出版物が引用される。これらの文献の開示は、その全体が、本発明が関連する最先端技術をより完全に説明するために、参照により本願に組み込まれる。
発明の分野
本願は、Ｒａｓホモログ遺伝子ファミリーメンバーＡ（ＲｈｏＡ）の発現の下方制御のための二本鎖ヌクレオチド化合物、それを含む薬学的組成物、およびその使用方法に関する。
発明の背景
本発明の譲受人に譲渡されたＰＣＴ特許出願ＷＯ２００８／０５０３２９号および第ＷＯ２００９／０４４３９２号は、化学修飾したｓｉＲＮＡ化合物の調製において有用な、ある特定のＲｈｏＡオリゴヌクレオチドおよび構造的モチーフを開示する。
ＲｈｏＡの発現を下方制御するための核酸分子、それを含む組成物およびキット、ならびにその使用方法が、本明細書において提供される。この組成物、方法、およびキットは、ＲｈｏＡをコードするヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ配列など）、例えば配列番号２に例示されるヒトＲｈｏＡタンパク質のｍＲＮＡコード配列（配列番号１）に結合する核酸分子（例えば、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））の使用を含み得る。ある特定の好ましい実施形態において、本明細書において開示される組成物、方法、およびキットは、ＲｈｏＡの発現を阻害する。種々の実施形態において、核酸分子は、ＲｈｏＡ発現を下方制御する、非修飾または化学修飾したｄｓＲＮＡ化合物またはｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡからなる群から選択される。現在好ましい実施形態において、阻害剤は、ＲｈｏＡ発現を下方制御する、合成の化学修飾した二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物である。化学修飾した核酸分子および組成物は、非修飾分子と比較した場合、血清安定性の改善、細胞取り込みの改善、オフターゲット活性の減少、免疫原性の低下、エンドソーム放出の改善、標的組織または細胞への特異的送達の改善、およびノックダウン活性の向上のうちの少なくとも１つを含む有利な特性を示す。
さらに、本明細書において、必要性のある対象において、疾患または状態の発生率または重症度を治療または防止するための方法であって、疾患あるいはそれに関連する状態および／または症状が、中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患、傷害、状態、または病態など、ＲｈｏＡ遺伝子の発現に関連する方法も開示する。いくつかの実施形態において、対象は哺乳動物である。好ましい実施形態において、対象はヒト対象である。
特定の実施形態では、ＲｈｏＡを標的とする化学修飾したｄｓＲＮＡ化合物、それを含む組成物およびキット、ならびにＣＮＳの状態または病態、とりわけニューロパシー性疼痛（例えば、アロディニア）、脊髄傷害（ＳＣＩ）、および緑内障の治療におけるその使用方法が、本明細書において提供される。治療される他の状態には、ＲｈｏＡ発現がニューロン生存、ニューロン成長、神経再生、または他の細胞機能にとって有害であるあらゆる状態が含まれる。したがって、多発性硬化症、脳卒中、外傷性脳傷害、末梢性ニューロパシー、および急性および慢性の神経変性疾患を含むがこれらに限定されない、ニューロンの再生またはニューロンもしくは神経系の保護を必要とする状態は、本発明の化合物で治療される。
上述の疾患、状態、傷害、および障害を治療する際に有用な、安定かつ活性を有するｄｓＲＮＡ化合物およびそれを含む組成物は、大きな治療的価値を有するであろう。
一態様において、（ａ）核酸分子は、センス鎖と相補的アンチセンス鎖とを含む二重鎖であり、（ｂ）核酸分子の各鎖は、独立して、１８〜４９個のヌクレオチドの長さであり、（ｃ）アンチセンス鎖の１８〜４９ヌクレオチドの配列は、哺乳動物のＲｈｏＡをコードするｍＲＮＡの連続的配列（例えば、配列番号１）に相補的であり、（ｄ）センス鎖およびアンチセンス鎖は、表Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶのいずれかに記載の配列対を含む、核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）が提供される。
ある特定の実施形態において、ヒトＲｈｏＡをコードするｍＲＮＡの連続的配列（配列番号１に示す）に相補的なアンチセンス鎖の配列は、配列番号１の２９０〜３５０、または３５０〜４１４、または４１４〜５０７、または５３１〜５５１、または５５７〜６２７、または６３４〜６５１、または６２７〜６９８、または６９８〜７５７、または９１９〜９７３、または９７３〜９９０、または１１３４〜１３４６、または１３４６〜１３６９、または１８０４〜１９２６の範囲のヌクレオチド配列に相補的な配列を含む。
ある特定の実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖は、表ＩＩＩに示すアンチセンス配列（配列番号１４９〜１６２）のうちのいずれか１つに相当する配列を含む。いくつかの実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、表ＩＩＩに示す配列対から選択される。いくつかの実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿３１（配列番号１３５および１４９）、ＲＨＯＡ＿３３（配列番号１３６および１５０）、ＲＨＯＡ＿３７（配列番号１３７および１５１）、ＲＨＯＡ＿３８（配列番号１３８および１５２）、ＲＨＯＡ＿４３（配列番号１３９および１５３）、ＲＨＯＡ＿５２（配列番号１４０および１５４）、ＲＨＯＡ＿５６（配列番号１４１および１５５）、ＲＨＯＡ＿５７（配列番号１４２および１５６）、ＲＨＯＡ＿５８（配列番号１４３および１５７）、ＲＨＯＡ＿６８（配列番号１４４および１５８）、ＲＨＯＡ＿６９（配列番号１４５および１５９）、ＲＨＯＡ＿７０（配列番号１４６および１６０）、ＲＨＯＡ＿７３（配列番号１４７および１６１）、ならびにＲＨＯＡ＿７６（配列番号１４８および１６２）に示す配列対から選択される。
いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿３１（配列番号１３５および１４９）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンスおよびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿３３（配列番号１３６および１５０）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿３７（配列番号１３７および１５１）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿３８（配列番号１３８および１５２）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿４３（配列番号１３９および１５３）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿５２（配列番号１４０および１５４）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿５６（配列番号１４１および１５５）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿５７（配列番号１４２および１５６）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿５８（配列番号１４３および１５７）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿６８（配列番号１４４および１５８）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿６９（配列番号１４５および１５９）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿７０（配列番号１４６および１６０）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿７３（配列番号１４７および１６１）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿７６（配列番号１４８および１６２）に示す配列対を含む。
いくつかの好ましい実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿５８（配列番号１４３および１５７）に示す配列対を含む。いくつかの好ましい実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿７０（配列番号１４６および１６０）に示す配列対を含む。
ある特定の実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖は、表ＩＶに示すアンチセンス配列（配列番号１６７〜１７０）のうちのいずれか１つに相当する配列を含む。いくつかの実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、表ＩＶに示す配列対から選択され、ＲＨＯＡ＿２３（配列番号１６３および１６７）、ＲＨＯＡ＿２４（配列番号１６４および１６８）、ＲＨＯＡ＿２６（配列番号１６５および１６９）、またはＲＨＯＡ＿２９（配列番号１６６および１７０）に示される配列対から選択される。
ある特定の実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖は、表ＩＩに示すアンチセンス配列のうちのいずれか１つに相当する配列を含む。ある特定の好ましい実施形態において、アンチセンス鎖および鎖は、表ＩＩに示す配列対から選択される。
いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子は、ＲＨＯＡ＿３２（配列番号６７および１０１）、ＲＨＯＡ＿３４（配列番号６８および１０２）、ＲＨＯＡ＿３５（配列番号６９および１０３）、ＲＨＯＡ＿３６（配列番号７０および１０４）、ＲＨＯＡ＿３９（配列番号７１および１０５）、ＲＨＯＡ＿４０（配列番号７２および１０６）、ＲＨＯＡ＿４１（配列番号７３および１０７）、ＲＨＯＡ＿４２（配列番号７４および１０８）、ＲＨＯＡ＿４４（配列番号７５および１０９）、ＲＨＯＡ＿４５（配列番号７６および１１０）、ＲＨＯＡ＿４６（配列番号７７および１１１）、ＲＨＯＡ＿４７（配列番号７８および１１２）、ＲＨＯＡ＿４８（配列番号７９および１１３）、ＲＨＯＡ＿４８ｕ（配列番号８０および１１４）、ＲＨＯＡ＿４９（配列番号８１および１１５）、ＲＨＯＡ＿５０（配列番号８２および１１６）、ＲＨＯＡ＿５１（配列番号８３および１１７）、ＲＨＯＡ＿５３（配列番号８４および１１８）、ＲＨＯＡ＿５４（配列番号８５および１１９）、ＲＨＯＡ＿５５（配列番号８６および１２０）、ＲＨＯＡ＿５９（配列番号８７および１２１）、ＲＨＯＡ＿６０（配列番号８８および１２２）、ＲＨＯＡ＿６１（配列番号８９および１２３）、ＲＨＯＡ＿６１ｕ（配列番号９０および１２４）、ＲＨＯＡ＿６２（配列番号９１および１２５）、ＲＨＯＡ＿６３（配列番号９２および１２６）、ＲＨＯＡ＿６４（配列番号９３および１２７）、ＲＨＯＡ＿６５（配列番号９４および１２８）、ＲＨＯＡ＿６６（配列番号９５および１２９）、ＲＨＯＡ＿６７（配列番号９６および１３０）、ＲＨＯＡ＿７１（配列番号９７および１３１）、ＲＨＯＡ＿７２（配列番号９８および１３２）、ＲＨＯＡ＿７４（配列番号９９および１３３）、ならびにＲＨＯＡ＿７５（配列番号１００および１３４）に示される配列対から選択される、アンチセンスおよびセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿３２（配列番号６７および１０１）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿３４（配列番号６８および１０２）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿３５（配列番号６９および１０３）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿３６（配列番号７０および１０４）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿３９（配列番号７１および１０５）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿４０（配列番号７２および１０６）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿４１（配列番号７３および１０７）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿４２（配列番号７４および１０８）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿４４（配列番号７５および１０９）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿４５（配列番号７６および１１０）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿４６（配列番号７７および１１１）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿４７（配列番号７８および１１２）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿４８（配列番号７９および１１３）、ＲＨＯＡ＿４８ｕ（配列番号８０および１１４）、ＲＨＯＡ＿４９（配列番号８１および１１５）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿５０（配列番号８２および１１６）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿５１（配列番号８３および１１７）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿５３（配列番号８４および１１８）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿５４（配列番号８５および１１９）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿５５（配列番号８６および１２０）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿５９（配列番号８７および１２１）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿６０（配列番号８８および１２２）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿６１（配列番号８９および１２３）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿６１ｕ（配列番号９０および１２４）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿６２（配列番号９１および１２５）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿６３（配列番号９２および１２６）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿６４（配列番号９３および１２７）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿６５（配列番号９４および１２８）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿６６（配列番号９５および１２９）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿６７（配列番号９６および１３０）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿７１（配列番号９７および１３１）、ＲＨＯＡ＿７２（配列番号９８および１３２）、ＲＨＯＡ＿７４（配列番号９９および１３３）に示す配列対を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿７５（配列番号１００および１３４）に示す配列対を含む。
いくつかの好ましい実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿４８（配列番号７９および１１３）、ＲＨＯＡ＿４８ｕ（配列番号８０および１１４）、ＲＨＯＡ＿５０（配列番号８２および１１６）、ＲＨＯＡ＿６１（配列番号８９および１２３）、ＲＨＯＡ＿６１ｕ（配列番号９０および１２４）、またはＲＨＯＡ＿７５（配列番号１００および１３４）に示す配列対を含む。
いくつかの好ましい実施形態において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿４８（配列番号７９および１１３）に示す配列対を含む。いくつかの好ましい実施形態において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿４８ｕ（配列番号８０および１１４）に示す配列対を含む。いくつかの好ましい実施形態において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿５０（配列番号８２および１１６）に示す配列対を含む。
本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）の種々の実施形態において、アンチセンス鎖は、１８〜４９個のヌクレオチドの長さ（例えば、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、または４９個のヌクレオチドの長さ）、または１８〜３５個のヌクレオチドの長さ、または１８〜３０個のヌクレオチドの長さ、または１８〜２５個のヌクレオチドの長さ、または１８〜２３個のヌクレオチドの長さ、または１９〜２１個のヌクレオチドの長さ、または２５〜３０個のヌクレオチドの長さ、または２６〜２８個のヌクレオチドの長さであってよい。本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のいくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は、１９個のヌクレオチドの長さである。同様に、本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のセンス鎖は、本明細書において、１８〜４９個のヌクレオチドの長さ（例えば、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、または４９個のヌクレオチドの長さ）、または１８〜３５個のヌクレオチドの長さ、または１８〜３０個のヌクレオチドの長さ、または１８〜２５個のヌクレオチドの長さ、または１８〜２３個のヌクレオチドの長さ、または１９〜２１個のヌクレオチドの長さ、または２５〜３０個のヌクレオチドの長さ、または２６〜２８個のヌクレオチドの長さであってよい。本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のいくつかの実施形態において、センス鎖は、１９個のヌクレオチドの長さである。本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のいくつかの実施形態において、アンチセンス鎖およびセンス鎖のそれぞれは、１９個のヌクレオチドの長さである。本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）の二重鎖領域は、１８〜４９個のヌクレオチドの長さ（例えば、約１８個、約１９個、約２０個、約２１個、約２２個、約２３個、約２４個、約２５個、約２６個、約２７個、約２８個、約２９個、約３０個、約３１個、約３２個、約３３個、約３４個、約３５個、約３６個、約３７個、約３８個、約３９個、約４０個、約４１個、約４２個、約４３個、約４４個、約４５個、約４６個、約４７個、約４８個、または約４９個のヌクレオチドの長さ）、１８〜３５個のヌクレオチドの長さ、または１８〜３０個のヌクレオチドの長さ、または約１８〜２５個のヌクレオチドの長さ、または１８〜２５個のヌクレオチドの長さ、または１８〜２３個のヌクレオチドの長さ、または１８〜２１個のヌクレオチドの長さ、または２５〜３０個のヌクレオチドの長さ、または２５〜２８個のヌクレオチドの長さであってよい。本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）の種々の実施形態において、二重鎖領域は、１９個のヌクレオチドの長さである。
ある特定の実施形態において、本明細書において提供される核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ核酸分子）のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、別個のポリヌクレオチド鎖である。いくつかの実施形態において、別個のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、水素結合、例えばワトソン・クリック塩基対合を介して、二重鎖としても知られる二本鎖構造を形成する。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のヌクレオチド対は、非ワトソン・クリック塩基対を形成する。いくつかの実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、互いに共有結合した２つの別個の鎖である。他の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、センス領域およびアンチセンス領域の両領域を有する単一のポリヌクレオチド鎖の一部であり、いくつかの好ましい実施形態において、ポリヌクレオチド鎖は、ヘアピン構造を有する。
ある特定の実施形態において、核酸分子は、オーバーハングに関して対称的であり、両端に平滑末端を有する、二本鎖核酸（ｄｓＲＮＡ）分子である。他の実施形態において、核酸分子は、オーバーハングに関して対称的であり、ｄｓＲＮＡ分子の両端にヌクレオチド、または非ヌクレオチド、またはヌクレオチドと非ヌクレオチドの組み合わせのオーバーハングを有する、ｄｓＲＮＡ分子である。ある特定の好ましい実施形態において、核酸分子は、オーバーハングに関して非対称的であり、分子の一端に平滑末端を有し、分子の他端にオーバーハングを有する、ｄｓＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、非対称ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖に生じる二重鎖の片側に３’−オーバーハングを有し、分子の反対側に平滑末端を有する。いくつかの実施形態において、非対称ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖に生じる二重鎖の片側に５’−オーバーハングを有し、分子の反対側に平滑末端を有する。他の実施形態において、非対称ｄｓＮＡ分子は、アンチセンス鎖に生じる二重鎖の片側に３’−オーバーハングを有し、分子の反対側に平滑末端を有する。いくつかの実施形態において、非対称ｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖に生じる二重鎖の片側に５’−オーバーハングを有し、分子の反対側に平滑末端を有する。いくつかの実施形態において、オーバーハングはヌクレオチドオーバーハングであり、他の実施形態において、オーバーハングは非ヌクレオチドオーバーハングである。いくつかの実施形態において、オーバーハングは５’オーバーハングであり、代替的実施形態において、オーバーハングは３’オーバーハングである。
いくつかの実施形態において、核酸分子は、一端にループ構造を有し、他端に平滑末端を有する、ヘアピン構造（１つのポリヌクレオチドにセンス鎖およびアンチセンス鎖を有する）を有する。いくつかの実施形態において、核酸分子は、一端にループ構造を有し、他端にオーバーハングを有する、ヘアピン構造を有し、ある特定の実施形態において、オーバーハングは３’−オーバーハングであり、ある特定の実施形態において、オーバーハングは５’−オーバーハングであり、ある特定の実施形態において、オーバーハングはセンス鎖にあり、ある特定の実施形態において、オーバーハングはアンチセンス鎖にある。
本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、１つまたは複数の本明細書に記載するような修飾または修飾ヌクレオチドを含んでもよい。例えば、本明細書において提供される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、修飾糖を有する修飾ヌクレオチド、修飾核酸塩基を有する修飾ヌクレオチド、または修飾リン酸基を有する修飾ヌクレオチドを含んでもよい。同様に、本明細書において提供される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、修飾リン酸ジエステル骨格を含んでもよく、および／または修飾末端リン酸基を含んでもよい。
本明細書において提供される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、修飾糖部分、例えば２’アルコキシ修飾糖部分を含む、１つまたは複数のヌクレオチドを有してもよい。いくつかの好ましい実施形態において、修飾糖は２’−Ｏ−メチルを含む。
本明細書において提供される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、例えば本明細書に記載するような１つまたは複数の修飾核酸塩基を有してもよく、これはキサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシン、およびチミン、５−ウラシル（擬似ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル、ならびに他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、ならびにアシクロヌクレオチドからなる群から選択することができる。
本明細書において提供される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、例えば本明細書に記載するような、リン酸ジエステル骨格に対する１つまたは複数の修飾を有してもよい。いくつかの好ましい実施形態において、リン酸ジエステル結合は、リン酸ジエステル結合をホスホロチオエート、３’−（または−５’）デオキシ−３’−（または−５’）チオ−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、３’−（または−５’）デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、３’−（または−５’）デオキシ−３’−（または５’−）アミノホスホルアミデート、水素ホスホネート、ボラノホスフェートエステル、ホスホラミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステルで置換することによって修飾される。
種々の実施形態において、提供される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、非修飾アンチセンス鎖および１つまたは複数の修飾を有するセンス鎖を含んでもよい。いくつかの実施形態において、提供される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、非修飾センス鎖および１つまたは複数の修飾を有するアンチセンス鎖を含む。好ましい実施形態において、提供される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、センス鎖およびアンチセンス鎖の両鎖に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む。
本明細書において提供される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’末端にリン酸基を含んでもよい。いくつかの実施形態において、本明細書において開示されるｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の５’末端にリン酸基を含む。
いくつかの実施形態において、ＲｈｏＡの発現を下方制御するのに有用な二本鎖核酸化合物が提供される。いくつかの実施形態において、構造（Ａ１）：
（Ａ１） ５’ （Ｎ）ｘ‐Ｚ ３’ （アンチセンス鎖）
３’ Ｚ’−（Ｎ’）ｙ‐ｚ" ５’ （センス鎖）
を有する二本鎖ＲＮＡ化合物が本明細書において提供され、式中、それぞれのＮおよびＮ’は、修飾されていなくても修飾されていてもよいリボヌクレオチド、または非従来的部分であり、
それぞれの（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、それぞれの連続するＮまたはＮ’が、共有結合によって次のＮまたはＮ’と接合するオリゴヌクレオチドであり、
それぞれのＺおよびＺ’は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端で共有結合した、１〜５個の連続するヌクレオチド、１〜５個の連続する非ヌクレオチド部分、またはそれらの組み合わせを含み、
ｚ"は、存在しても不在でもよいが、存在する場合は、（Ｎ’）ｙの５’末端で共有結合したキャッピング部分であり、
それぞれのｘおよびｙは、独立して、１８〜４０の整数であり、
（Ｎ’）ｙの配列は（Ｎ）ｘの配列に相補的であり、（Ｎ）ｘは、表ＩＩＩまたは表ＩＶに記載されるアンチセンス配列を含む。
表ＩＩＩに提示するｄｓＲＮＡ化合物を生成する際に有用なセンス配列およびアンチセンス配列は、ＲＨＯＡ＿３１（配列番号１３５および１４９）、ＲＨＯＡ＿３３（配列番号１３６および１５０）、ＲＨＯＡ＿３７（配列番号１３７および１５１）、ＲＨＯＡ＿３８（配列番号１３８および１５２）、ＲＨＯＡ＿４３（配列番号１３９および１５３）、ＲＨＯＡ＿５２（配列番号１４０および１５４）、ＲＨＯＡ＿５６（配列番号１４１および１５５）、ＲＨＯＡ＿５７（配列番号１４２および１５６）、ＲＨＯＡ＿５８（配列番号１４３および１５７）、ＲＨＯＡ＿６８（配列番号１４４および１５８）、ＲＨＯＡ＿６９（配列番号１４５および１５９）、ＲＨＯＡ＿７０（配列番号１４６および１６０）、ＲＨＯＡ＿７３（配列番号１４７および１６１）、ならびにＲＨＯＡ＿７６（配列番号１４８および１６２）である。表ＩＶに提示するｄｓＲＮＡ化合物を生成する際に有用なセンス配列およびアンチセンス配列は、ＲＨＯＡ＿２３（配列番号１６３および１６７）、ＲＨＯＡ＿２４（配列番号１６４および１６８）、ＲＨＯＡ＿２６（配列番号１６５および１６９）、またはＲＨＯＡ＿２９（配列番号１６６および１７０）に示される。
いくつかの実施形態において、連続するＮおよび／またはＮ’それぞれを接合する共有結合はリン酸ジエステル結合である。
いくつかの実施形態において、ｘ＝ｙであり、それぞれのｘおよびｙは、１９、２０、２１、２２、または２３である。好ましい実施形態において、ｘ＝ｙ＝１９である。
本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のいくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子はｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、またはｍｉＲＮＡである。
いくつかの実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿５８（配列番号１４３および１５７）に示される配列対を含む。いくつかの実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿７０（配列番号１４６および１６０）に示される配列対を含む。
いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、アンチセンス鎖の１位（５’末端）にＤＮＡ部分または標的に対するミスマッチを含む。かかる二重鎖構造を本明細書において説明する。一実施形態によると、下に示す構造（Ａ２）を有する二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物が提供され、
（Ａ２） ５’ Ｎ１−（Ｎ）ｘ−Ｚ ３’（アンチセンス鎖）
３’ Ｚ’−Ｎ２−（Ｎ’）ｙ‐ｚ" ５’（センス鎖）
式中、それぞれのＮ１、Ｎ２、Ｎ、およびＮ’は、独立して、非修飾もしくは修飾ヌクレオチド、または非従来的部分であり、
それぞれの（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙはオリゴヌクレオチドであり、それぞれの連続するＮまたはＮ’は、共有結合によって隣接するＮまたはＮ’と接合され、
それぞれのｘおよびｙは、独立して、１７〜３９の整数であり、
Ｎ２は、（Ｎ’）ｙと共有結合し、
Ｎ１は、（Ｎ）ｘと共有結合し、標的ｍＲＮＡ（配列番号１）と一致しないか、または標的ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ部分であり、
Ｎ１は、天然または修飾された、ウリジン、デオキシリボウリジン、リボチミジン、デオキシリボチミジン、アデノシン、またはデオキシアデノシン、脱塩基リボース部分、および脱塩基デオキシリボース部分からなる群から選択される部分であり、
ｚ"は、存在しても不在でもよいが、存在する場合は、Ｎ２−（Ｎ’）ｙの５’末端で共有結合したキャッピング部分であり、
それぞれのＺおよびＺ’は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端で共有結合した、１〜５個の連続するヌクレオチド、１〜５個の連続する非ヌクレオチド部分、またはそれらの組み合わせであり、
（Ｎ’）ｙの配列は（Ｎ）ｘの配列に相補的であり、（Ｎ）ｘの配列は、表Ｉに記載されるアンチセンス配列を含む。
種々の実施形態において、Ｎ１−（Ｎ）ｘの配列は、表ＩＩに記載されるアンチセンス配列を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡ化合物を生成する際に有用なＮ２−（Ｎ’）ｙおよびＮ１−（Ｎ）ｘは、表ＩＩに提示され、ＲＨＯＡ＿３２（配列番号６７および１０１）、ＲＨＯＡ＿３４（配列番号６８および１０２）、ＲＨＯＡ＿３５（配列番号６９および１０３）、ＲＨＯＡ＿３６（配列番号７０および１０４）、ＲＨＯＡ＿３９（配列番号７１および１０５）、ＲＨＯＡ＿４０（配列番号７２および１０６）、ＲＨＯＡ＿４１（配列番号７３および１０７）、ＲＨＯＡ＿４２（配列番号７４および１０８）、ＲＨＯＡ＿４４（配列番号７５および１０９）、ＲＨＯＡ＿４５（配列番号７６および１１０）、ＲＨＯＡ＿４６（配列番号７７および１１１）、ＲＨＯＡ＿４７（配列番号７８および１１２）、ＲＨＯＡ＿４８（配列番号７９および１１３）、ＲＨＯＡ＿４８ｕ（配列番号８０および１１４）、ＲＨＯＡ＿４９（配列番号８１および１１５）、ＲＨＯＡ＿５０（配列番号８２および１１６）、ＲＨＯＡ＿５１（配列番号８３および１１７）、ＲＨＯＡ＿５３（配列番号８４および１１８）、ＲＨＯＡ＿５４（配列番号８５および１１９）、ＲＨＯＡ＿５５（配列番号８６および１２０）、ＲＨＯＡ＿５９（配列番号８７および１２１）、ＲＨＯＡ＿６０（配列番号８８および１２２）、ＲＨＯＡ＿６１（配列番号８９および１２３）、ＲＨＯＡ＿６１ｕ（配列番号９０および１２４）、ＲＨＯＡ＿６２（配列番号９１および１２５）、ＲＨＯＡ＿６３（配列番号９２および１２６）、ＲＨＯＡ＿６４（配列番号９３および１２７）、ＲＨＯＡ＿６５（配列番号９４および１２８）、ＲＨＯＡ＿６６（配列番号９５および１２９）、ＲＨＯＡ＿６７（配列番号９６および１３０）、ＲＨＯＡ＿７１（配列番号９７および１３１）、ＲＨＯＡ＿７２（配列番号９８および１３２）、ＲＨＯＡ＿７４（配列番号９９および１３３）、ならびにＲＨＯＡ＿７５（配列番号１００および１３４）に示される。
ある特定の実施形態において、本明細書において開示される核酸分子（例えばｄｓＲＮＡ分子）の（Ｎ）ｘは、表Ｉに示すアンチセンス配列のうちの１つに対応する配列を含む。特定の好ましい実施形態において、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、表Ｉに示す配列対から選択される。
いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子は、ＲＨＯＡ＿３２−１（配列番号３および３５）、ＲＨＯＡ＿３４−１（配列番号４および３６）、ＲＨＯＡ＿３５−１（配列番号５および３７）、ＲＨＯＡ＿３６−１（配列番号６および３８）、ＲＨＯＡ＿３９−１（配列番号７および３９）、ＲＨＯＡ＿４０−１（配列番号８および４０）、ＲＨＯＡ＿４１−１（配列番号９および４１）、ＲＨＯＡ＿４２−１（配列番号１０および４２）、ＲＨＯＡ＿４４−１（配列番号１１および４３）、ＲＨＯＡ＿４５−１（配列番号１２および４４）、ＲＨＯＡ＿４６−１（配列番号１３および４５）、ＲＨＯＡ＿４７−１（配列番号１４および４６）、ＲＨＯＡ＿４８−１（配列番号１５および４７）、ＲＨＯＡ＿４９−１（配列番号１６および４８）、ＲＨＯＡ＿５０−１（配列番号１７および４９）、ＲＨＯＡ＿５１−１（配列番号１８および５０）、ＲＨＯＡ＿５３−１（配列番号１９および５１）、ＲＨＯＡ＿５４−１（配列番号２０および５２）、ＲＨＯＡ＿５５−１（配列番号２１および５３）、ＲＨＯＡ＿５９−１（配列番号２２および５４）、ＲＨＯＡ＿６０−１（配列番号２３および５５）、ＲＨＯＡ＿６１−１（配列番号２４および５６）、ＲＨＯＡ＿６２−１（配列番号２５および５７）、ＲＨＯＡ＿６３−１（配列番号２６および５８）、ＲＨＯＡ＿６４−１（配列番号２７および５９）、ＲＨＯＡ＿６５−１（配列番号２８および６０）、ＲＨＯＡ＿６６−１（配列番号２９および６１）、ＲＨＯＡ＿６７−１（配列番号３０および６２）、ＲＨＯＡ＿７１−１（配列番号３１および６３）、ＲＨＯＡ＿７２−１（配列番号３２および６４）、ＲＨＯＡ＿７４−１（配列番号３３および６５）、ならびにＲＨＯＡ＿７５−１（配列番号３４および６６）に示される配列対から選択される（Ｎ）ｘおよび(Ｎ’）ｙを含む。
いくつかの実施形態において、（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に完全に相補的である。種々の実施形態において、Ｎ２−（Ｎ’）ｙの配列は、Ｎ１−（Ｎ）ｘの配列に相補的である。いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘは、標的ｍＲＮＡ中の約１７個〜約３９個の連続するヌクレオチドに完全に相補的なアンチセンスを含む。他の実施形態において、（Ｎ）ｘは、配列番号１に示す標的ｍＲＮＡ中の約１７個〜約３９個の連続するヌクレオチドに実質的に相補的なアンチセンスを含む。
いくつかの実施形態において、Ｎ１およびＮ２は、ワトソン・クリック塩基対を形成する。他の実施形態において、Ｎ１およびＮ２は、非ワトソン・クリック塩基対を形成する。いくつかの実施形態において、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの間で塩基対が形成される。
いくつかの実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８、ｘ＝ｙ＝１９、またはｘ＝ｙ＝２０である。好ましい実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８である。Ｎ１−（Ｎ）ｘにおいてｘ＝１８である場合、Ｎ１は１位を指し、２位〜１９位は、（Ｎ）１８に含まれる。Ｎ２−（Ｎ’）ｙにおいてｙ＝１８である場合、Ｎ２は１９位を指し、１位〜１８位は、（Ｎ’）１８に含まれる。
いくつかの実施形態において、Ｎ１は、（Ｎ）ｘに共有結合し、標的ｍＲＮＡと一致しない。種々の実施形態において、Ｎ１は、（Ｎ）ｘに共有結合し、標的ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ部分である。
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の１位のウリジンは、天然または修飾された、アデノシン、デオキシアデノシン、ウリジン、デオキシウリジン（ｄＵ）、リボチミジン、またはデオキシチミジンから選択されるＮ１で置換されている。種々の実施形態において、Ｎ１は、天然または修飾された、アデノシン、デオキシアデノシン、またはデオキシウリジンから選択される。例えばいくつかの実施形態において、１位のシチジンは、アデニンまたはウリジンに置き換えられ、１位のグアノシンは、アデニンまたはウリジンに置き換えられ、あるいはアデニンがウリジンに置き換えられる。
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の１位（Ｎ１）のグアノシンは、天然または修飾された、アデノシン、デオキシアデノシン、ウリジン、デオキシウリジン、リボチミジン、またはデオキシチミジンで置換されている。種々の実施形態において、Ｎ１は、天然または修飾された、アデノシン、デオキシアデノシン、ウリジン、またはデオキシウリジンから選択される。
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の１位（Ｎ１）のシチジンは、天然または修飾された、アデノシン、デオキシアデノシン、ウリジン、デオキシウリジン、リボチミジン、またはデオキシチミジンで置換されている。種々の実施形態において、Ｎ１は、天然または修飾された、アデノシン、デオキシアデノシン、ウリジン、またはデオキシウリジンから選択される。
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の１位（Ｎ１）のアデノシンは、天然または修飾された、デオキシアデノシン、デオキシウリジン、リボチミジン、またはデオキシチミジンで置換されている。
いくつかの実施形態において、Ｎ１およびＮ２は、天然または修飾された、ウリジンまたはデオキシウリジンとアデノシンまたはデオキシアデノシンとの間で塩基対を形成する。他の実施形態において、Ｎ１およびＮ２は、天然または修飾された、デオキシウリジンとアデノシンとの間で塩基対を形成する。
いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、またはｍｉＲＮＡである。本明細書において提供される二本鎖核酸分子は、「二重鎖」とも称される。
構造Ａ２のある特定の好ましい実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８である。いくつかの実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ）ｘは、表Ｉに示すアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態において、Ｎ１は、天然ウリジンおよび修飾ウリジンから選択される。いくつかの実施形態において、Ｎ１は天然ウリジンである。いくつかの実施形態において、Ｎ１−（Ｎ）ｘは、表ＩＩに示すアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態において、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２０である。いくつかの実施形態において、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２０であり、（Ｎ）ｘは、表Ｉに示すアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡ化合物を生成する際に有用な好ましいセンス配列およびアンチセンス配列は、表ＩＩに記載する配列対から選択される：ＲＨＯＡ＿４８（配列番号７９および１１３）、ＲＨＯＡ＿４８ｕ（配列番号８０および１１４）、ＲＨＯＡ＿５０（配列番号８２および１１６）、ＲＨＯＡ＿６１（配列番号８９および１２３）、ＲＨＯＡ＿６１ｕ（配列番号９０および１２４）、ならびにＲＨＯＡ＿７５（配列番号１００および１３４）。
構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、Ｎ１は、２’ＯＭｅ糖修飾ウリジンまたは２’ＯＭｅ糖修飾アデノシンである。構造（Ａ２）の特定の実施形態において、Ｎ２は、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。
構造（Ａ１）および／または構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、各Ｎは、非修飾リボヌクレオチドからなる。構造（Ａ１）および／または構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、各Ｎ’は、非修飾ヌクレオチドからなる。好ましい実施形態において、Ｎおよび／またはＮ’のうちの少なくとも１つは、化学修飾ヌクレオチドまたは非従来的部分を含む。いくつかの実施形態において、非従来的部分は、ミラーヌクレオチド、脱塩基リボース部分、および脱塩基デオキシリボース部分から選択される。いくつかの実施形態において、非従来的部分は、ミラーヌクレオチド、好ましくはＬ−ＤＮＡ部分である。いくつかの実施形態において、ＮまたはＮ’のうちの少なくとも１つは、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。
構造（Ａ１）および／または構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に完全に相補的である。構造（Ａ１）および／または構造（Ａ２）の他の実施形態において、（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に実質的に相補的である。
構造（Ａ１）および／または構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘは、標的ｍＲＮＡ中の約１７個〜約３９個の連続するヌクレオチドに完全に相補的なアンチセンス配列を含む。構造Ａ１および／または構造Ａ２の他の実施形態において、（Ｎ）ｘは、標的ｍＲＮＡ中の約１７個〜約３９個の連続するヌクレオチドに実質的に相補的なアンチセンスを含む。構造（Ａ１）および／または構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡ化合物は、平滑末端であり、例えば、ここでｚ"、Ｚ、およびＺ’のそれぞれが不在である。代替的実施形態において、ｚ"、Ｚ、またはＺ’のうちの少なくとも１つが存在する。
種々の実施形態において、ＺおよびＺ’は、独立して、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む１つまたは複数の共有結合した修飾および／または非修飾ヌクレオチド、あるいは１つまたは複数の非従来的部分、例えば逆位脱塩基デオキシリボース部分もしくは脱塩基リボース部分、またはミラーヌクレオチド、１つまたは複数の非ヌクレオチドＣ３、Ｃ４、もしくはＣ５部分、アミノ−Ｃ６部分などを含む。いくつかの実施形態において、Ｚ’は不在であり、Ｚは存在し、１つまたは複数の非ヌクレオチドＣ３部分を含む。いくつかの実施形態において、Ｚは不在であり、Ｚ’は存在し、１つまたは複数の非ヌクレオチドＣ３部分を含む。いくつかの実施形態において、それぞれのＺおよびＺ’は、独立して、１つまたは複数の非ヌクレオチドＣ３部分あるいは１つまたは複数のアミノ−Ｃ６部分を含む。いくつかの実施形態では、ｚ"が存在し、ミラーヌクレオチド、脱塩基部分、および逆位脱塩基部分から選択される。構造Ａ１および構造Ａ２のいくつかの実施形態において、それぞれのＺおよびＺ’は、脱塩基部分、例えば、デオキシリボ脱塩基部分（本明細書において「ｄＡｂ」とする）またはリボ脱塩基部分（本明細書において「ｒＡｂ」とする）を含む。いくつかの実施形態において、それぞれのＺおよび／またはＺ’は、２つの共有結合した脱塩基部分を含み、これは例えばｄＡｂ−ｄＡｂ、またはｒＡｂ−ｒＡｂ、またはｄＡｂ−ｒＡｂ、またはｒＡｂ−ｄＡｂであり、各部分は、好ましくはリンに基づく結合を介して、隣接する部分と共有結合する。いくつかの実施形態において、リンに基づく結合には、ホスホロチオエート、ホスホノアセテート、またはリン酸ジエステル結合が含まれる。好ましい実施形態において、リンに基づく結合は、リン酸ジエステル結合を含む。
いくつかの実施形態において、それぞれのＺおよび／またはＺ’は、独立して、アルキル部分、場合により、プロパン［（ＣＨ２）３］部分（Ｃ３）またはその誘導体、例えばプロパノール（Ｃ３ＯＨ）、およびプロパンジオールのリン誘導体（「Ｃ３Ｐｉ」）を含む。いくつかの実施形態において、それぞれのＺおよび／またはＺ’は、２つのアルキル部分を含み、いくつかの例では、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨである。アンチセンス鎖の３’末端および／またはセンス鎖の３’末端は、リンに基づく結合を介してＣ３部分と共有結合し、Ｃ３部分は、リンに基づく結合を介してＣ３ＯＨ部分に共有結合的に共役する。いくつかの実施形態において、リンに基づく結合には、ホスホロチオエート、ホスホノアセテート、またはリン酸ジエステル結合が含まれる。好ましい実施形態において、リンに基づく結合には、リン酸ジエステル結合が含まれる。
構造Ａ１および構造Ａ２の具体的な実施形態において、ＺはＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨを含む。構造Ａ１および構造Ａ２の具体的な実施形態において、Ｚ’はＣ３ＰｉまたはＣ３ＯＨを含む。構造Ａ１および構造Ａ２のいくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、アンチセンス鎖の３’末端と共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、およびセンス鎖の３’末端と共有結合したＣ３ＰｉまたはＣ３ＯＨ部分を含む。
構造（Ａ１）および／または構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、各Ｎは非修飾ヌクレオチドからなる。構造（Ａ１）および／または構造（Ａ２）のいくつかの実施形態において、各Ｎ’は非修飾ヌクレオチドからなる。好ましい実施形態において、Ｎおよび／またはＮ’のうちの少なくとも１つは、修飾リボヌクレオチドまたは非従来的部分である。
他の実施形態において、構造Ａ１および／または構造Ａ２の化合物は、糖残基において修飾された少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、化合物は、糖残基の２’位に修飾を含む。いくつかの実施形態において、２’位における修飾は、アミノ部分、フルオロ部分、アルコキシ部分、またはアルキル部分の存在を含む。ある特定の実施形態において、２’修飾はアルコキシ部分を含む。好ましい実施形態において、アルコキシ部分はメトキシ部分（２’−Ｏ−メチル、２’ＯＭｅ、２’−ＯＣＨ３としても知られている）である。いくつかの実施形態において、核酸化合物は、アンチセンス鎖およびセンス鎖のうち一方または両方に、２’ＯＭｅ糖修飾交互リボヌクレオチドを含む。他の実施形態において、化合物は、アンチセンス鎖（Ｎ）ｘまたはＮ１−（Ｎ）ｘのみに２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、アンチセンス鎖の中央のリボヌクレオチド、例えば、１９−ｍｅｒ鎖の１０位のリボヌクレオチドは非修飾である。種々の実施形態において、核酸化合物は、少なくとも５個の、交互の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドおよび非修飾リボヌクレオチドを含む。さらなる実施形態において、構造Ａ１および／または構造Ａ２の化合物は、交互の位置に修飾リボヌクレオチドを含み、（Ｎ）ｘまたはＮ１−（Ｎ）ｘの５’末端および３’末端の各リボヌクレオチドは、それらの糖残基において修飾されており、（Ｎ’）ｙまたはＮ２−（Ｎ）ｙの５’末端および３’末端の各リボヌクレオチドは、それらの糖残基において非修飾である。種々の実施形態において、交互の位置のリボヌクレオチドは、糖残基の２’位で修飾されている。
いくつかの実施形態において、核酸化合物は、例えば、１位、３位、５位、７位、および９位、または１１位、１３位、１５位、１７位、１９位（５’から３’の方向で）に、少なくとも５個の、交互の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドおよび非修飾リボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、構造（Ａ１）の（Ｎ）ｘまたは構造（Ａ２）のＮ１−（Ｎ）ｘは、２位、４位、６位、８位、１１位、１３位、１５位、１７位、および１９位に、２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、構造（Ａ１）の（Ｎ）ｘまたは構造（Ａ２）のＮ１−（Ｎ）ｘは、１位、３位、５位、７位、９位、１１位、１３位、１５位、１７位、および１９位に、２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、構造（Ａ１）の（Ｎ）ｘまたは構造（Ａ２）のＮ１−（Ｎ）ｘは、ピリミジンの１つに、２’ＯＭｅ修飾のリボヌクレオチドを含む。
構造Ａ１および／または構造Ａ２のいくつかの実施形態において、センス鎖もアンチセンス鎖も３’末端および５’末端でリン酸化されていない。他の実施形態において、センス鎖またはアンチセンス鎖のうちの一方または両方が、３’末端でリン酸化されている。他の実施形態において、センス鎖またはアンチセンス鎖のうちの一方または両方が、５’末端でリン酸化されている。
いくつかの実施形態において、本明細書において開示される二本鎖分子は、以下の修飾のうちの１つまたは複数を含む。
アンチセンス鎖の５’末端から５位、６位、７位、８位、または９位のうちの少なくとも１つ位置のＮは、ＤＮＡ、ＴＮＡ、２’５’ヌクレオチド、またはミラーヌクレオチドから選択され、
センス鎖の５’末端から９位または１０位のうちの少なくとも１つの位置のＮ’は、ＴＮＡ、２’５’ヌクレオチド、および擬似ウリジンから選択され、
（Ｎ’）ｙの３’末端における４個、５個、または６個の連続する位置のＮ’は、２’５’ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、二本鎖分子は、以下の修飾の組み合わせを含む。
アンチセンス鎖は、５’末端から５位、６位、７位、８位、または９位のうちの少なくとも１つの位置に、ＤＮＡ、ＴＮＡ、２’５’ヌクレオチド、またはミラーヌクレオチドを含み、
センス鎖は、５’末端から９位または１０位の位置に、ＴＮＡ、２’５’ヌクレオチド、および擬似ウリジンのうちの少なくとも１つを含む。
いくつかの実施形態において、二本鎖分子は、以下の修飾の組み合わせを含む。
アンチセンス鎖は、５’末端から５位、６位、７位、８位、または９位のうちの少なくとも１つの位置に、ＤＮＡ、２’５’ヌクレオチド、またはミラーヌクレオチドを含み、
センス鎖は、３’末端から２番目の位置または３’末端位置に、４個、５個、または６個の連続する２’５’ヌクレオチドを含む。
構造Ａ１および／または構造Ａ２のいくつかの実施形態において、（Ｎ）ｙは、ミラーヌクレオチド、２’５’ヌクレオチド、およびＴＮＡから選択される、少なくとも１つの非従来的部分を含む。いくつかの実施形態において、非従来的部分はミラーヌクレオチドである。種々の実施形態において、ミラーヌクレオチドは、Ｌ−リボヌクレオチド（Ｌ−ＲＮＡ）およびＬ−デオキシリボヌクレオチド（Ｌ−ＤＮＡ）から選択される。好ましい実施形態において、ミラーヌクレオチドはＬ−ＤＮＡである。特定の実施形態において、センス鎖は、９位、または１０位（５’末端から）に、非従来的部分を含む。好ましい実施形態において、センス鎖は、９位（５’末端から）に、非従来的部分を含む。いくつかの実施形態において、センス鎖は、１９個のヌクレオチドの長さであり、１５位（５’末端から）に、４個、５個、または６個の連続する非従来的部分を含む。いくつかの実施形態において、センス鎖は、１５位、１６位、１７位、および１８位に、４個の連続する２’５’リボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、センス鎖は、１５位、１６位、１７位、１８位、および１９位に、５個の連続する２’５’リボヌクレオチドを含む。種々の実施形態において、センス鎖は、さらにＺ’を含む。いくつかの実施形態において、Ｚ’は、Ｃ３ＯＨ部分またはＣ３Ｐｉ部分を含む。
構造Ａ１および／または構造Ａ２のいくつかの実施形態において、（Ｎ）ｙは、ミラーヌクレオチドおよび２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合により隣接するヌクレオチドと接合するヌクレオチドから選択される、少なくとも１つの非従来的部分を含む。いくつかの実施形態において、非従来的部分はミラーヌクレオチドである。種々の実施形態において、ミラーヌクレオチドは、Ｌ−リボヌクレオチド（Ｌ−ＲＮＡ）およびＬ−デオキシリボヌクレオチド（Ｌ−ＤＮＡ）から選択される。好ましい実施形態において、ミラーヌクレオチドはＬ−ＤＮＡである。
構造Ａ１のいくつかの実施形態において、（Ｎ’）ｙは、少なくとも１つのＬ−ＤＮＡ部分を含む。いくつかの実施形態において、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、１位〜１７位および１９位の非修飾リボヌクレオチドと、３’末端から２番目の位置（１８位）の１個のＬ−ＤＮＡとからなる。他の実施形態において、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、１位〜１６位および１９位の非修飾リボヌクレオチドと、３’末端から２番目の位置（１７位および１８位）の２個の連続するＬ−ＤＮＡとからなる。種々の実施形態において、非従来的部分は、２’−５’ヌクレオチド間リン酸連結により隣接するヌクレオチドと接合したヌクレオチドである。種々の実施形態によると、（Ｎ’）ｙは、３'末端に、２’−５’ヌクレオチド間連結によって連結した２個、３個、４個、５個、または６個の連続するリボヌクレオチドを含む。一実施形態において、（Ｎ’）ｙの３’末端の４個の連続するヌクレオチドは、３個の２’−５’リン酸ジエステル結合によって接合する。一実施形態において、（Ｎ’）ｙの３’末端の５個の連続するヌクレオチドは、４個の２’−５’リン酸ジエステル結合によって接合する。２’−５’ヌクレオチドのうちの１つまたは複数が２’−５’リン酸ジエステル結合を形成するいくつかの実施形態において、ヌクレオチドは、３’−Ｏ−メチル（３’ＯＭｅ）糖修飾をさらに含む。いくつかの実施形態において、（Ｎ’）ｙの３’末端ヌクレオチドは、３’ＯＭｅ糖修飾を含む。特定の実施形態において、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、１５位、１６位、１７位、１８位、および１９位に、２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接するヌクレオチドと接合したヌクレオチドを含む、２個以上の連続するヌクレオチドを含む。種々の実施形態において、２’−５’ヌクレオチド間結合を形成するヌクレオチドは、３’デオキシリボースヌクレオチドまたは３’メトキシヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、１５位−１６位間、１６位−１７位間、および１７位−１８位間、または１６位−１７位間、１７位−１８位間、および１８位−１９位間の２’−５’ヌクレオチド間結合によって隣接するヌクレオチドと接合したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、１６位〜１７位間および１７位〜１８位間、または１７位〜１８位間および１８位〜１９位間、または１５位〜１６位間および１７位−１８位間の２’−５’ヌクレオチド間結合によって隣接するヌクレオチドと接合したヌクレオチドを含む。他の実施形態において、（Ｎ’）ｙ中のピリミジンリボヌクレオチド（ｒＵ、ｒＣ）は、２’−５’ヌクレオチド間結合によって隣接するヌクレオチドと接合したヌクレオチドで置換されている。
構造Ａ２のいくつかの実施形態において、（Ｎ）ｙは、少なくとも１つのＬ−ＤＮＡ部分を含む。いくつかの実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、１位〜１７位および１９位の非修飾リボヌクレオチドと、３’末端から２番目の位置（１８位）のＬ−ＤＮＡとからなる。他の実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、１位〜１６位および１９位の非修飾リボヌクレオチドと、３’末端から２番目の位置（１７位および１８位）の２個の連続するＬ−ＤＮＡとからなる。種々の実施形態において、非従来的部分は、２’−５’ヌクレオチド間リン酸連結により隣接するヌクレオチドと接合したヌクレオチドである。種々の実施形態によると、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、３'末端に、２’−５’ヌクレオチド間連結により連結した２個、３個、４個、５，個、または６個の連続するリボヌクレオチドを含む。一実施形態において、Ｎ２−（Ｎ’）ｙの３’末端の４個の連続するヌクレオチドは、３個の２’−５’リン酸ジエステル結合によって接合し、２’−５’リン酸ジエステル結合を形成する２’−５’ヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、３’−Ｏ−メチル（３’ＯＭｅ）糖修飾をさらに含む。いくつかの実施形態において、Ｎ２−（Ｎ’）ｙの３’末端ヌクレオチドは、２’ＯＭｅ糖修飾を含む。特定の実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、１５位、１６位、１７位、１８位、および１９位に、２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接するヌクレオチドと接合したヌクレオチドを含む、２個以上の連続するヌクレオチドを含む。種々の実施形態において、２’−５’ヌクレオチド間結合を形成するヌクレオチドは、３’デオキシリボースヌクレオチドまたは３’メトキシヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、１６位−１７位間および１７位−１８位間、または１７位−１８位間および１８位−１９位間、または１５位−１６位間および１７位−１８位間の２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接するヌクレオチドと接合したヌクレオチドを含む。他の実施形態において、（Ｎ’）ｙ中のピリミジンリボヌクレオチド（ｒＵ、ｒＣ）は、２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接するヌクレオチドと接合したヌクレオチドを含む。
構造Ａ１および構造Ａ２のさらなる実施形態において、（Ｎ’）ｙは、１〜８個の修飾リボヌクレオチドを含み、この修飾リボヌクレオチドは、デオキシリボース（ＤＮＡ）ヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、（Ｎ’）ｙは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または最大８個のＤＮＡ部分を含む。
いくつかの実施形態において、表ＩＩに示され、本明細書において、ＲＨＯＡ＿４８（配列番号７９および１１３）、ＲＨＯＡ＿４８ｕ（配列番号８０および１１４）、ＲＨＯＡ＿５０（配列番号８２および１１６）、ＲＨＯＡ＿６１（配列番号８９および１２３）、ならびにＲＨＯＡ＿６１ｕ（配列番号９０および１２４）として特定されるオリゴヌクレオチド対から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む、二本鎖ＲＮＡ分子が本明細書において提供される。
いくつかの実施形態において、表ＩＩに示され、本明細書において、ＲＨＯＡ＿４８（配列番号７９および１１３）、ＲＨＯＡ＿４８ｕ（配列番号８０および１１４）、ＲＨＯＡ＿５０（配列番号８２および１１６）、ＲＨＯＡ＿６１（配列番号８９および１２３）、ならびにＲＨＯＡ＿６１ｕ（配列番号９０および１２４）として特定されるオリゴヌクレオチド対から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む、二本鎖ＲＮＡ分子が本明細書において提供される。特に指定のない限り、センス鎖またはアンチセンス鎖に沿った全ての位置は、５’から３’へと数えられる（５’から３’の方向で）。
いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、配列番号１１３に示すアンチセンス鎖および配列番号７９に示すセンス鎖を含み、本明細書においてＲＨＯＡ＿４８として特定される。いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、以下の構造を有し、
式中、「│」は、リボヌクレオチド間の塩基対合を表し、
それぞれのＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕは、独立して、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非従来的部分であり、
それぞれのＺおよびＺ’は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端で共有結合した、１〜５個の連続するヌクレオチドもしくは非ヌクレオチド部分、またはそれらの組み合わせであり、
ｚ"は、存在しても不在でもよいが、存在する場合は、センス鎖の５’末端で共有結合したキャッピング部分である。
好ましい実施形態において、二本鎖核酸分子は、修飾リボヌクレオチドおよび非従来的部分を含む。
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖（配列番号１１３）が、５位、６位、７位、または８位のうちの１つまたは複数（５’から３’の方向で）においてミラーヌクレオチドまたは２’−５’連結ヌクレオチドと、３’末端で共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は、１つまたは複数の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、センス鎖（配列番号７９）は、３’末端または３’末端から２番目の位置の４個または５個の連続する２’−５’連結ヌクレオチドと、３’末端で共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分と、１つまたは複数の２’ＯＭｅ糖修飾ヌクレオチドと、５’末端で共有結合したキャップ部分とを含む。この分子は、アンチセンス鎖に、５’ホスフェートを含んでもよい。
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖（配列番号１１３）が、（５’から３’の方向で）１位、３位、１１位、１４位、１５位、１７位、および１８位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖（配列番号７９）が、（５’から３’の方向で）１５位、１６位、１７位、１８位、および１９位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドオーバーハングと、５’末端で共有結合したキャップ部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は、６位、７位、または６位および７位に、２’−５’連結リボヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖（配列番号１１３）が、（５’から３’の方向で）１位、３位、６位、１１位、１４位、１５位、１７位、および１８位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖（配列番号７９）が、（５’から３’の方向で）１５位、１６位、１７位、１８位、および１９位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分と、５’末端で共有結合したキャップ部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、化合物ＲＨＯＡ＿４８＿Ｓ１８３３に示される、アンチセンス鎖（配列番号１１３）が、（５’から３’の方向で）１位、３位、６位、１１位、１４位、１５位、１７位、および１８位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖（配列番号７９）が、（５’から３’の方向で）１５位、１６位、１７位、１８位、および１９位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３末端に共有結合したＣ３Ｐｉと、５’末端で共有結合した逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチドキャップ部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖（配列番号１１３）が、（５’から３’の方向で）１位、３位、１１位、１４位、１５位、１７位、および１８位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、６位、７位、および８位のうちの１つまたは複数の位置の２’−５’連結ヌクレオチドまたはミラーヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖（配列番号７９）が、（５’から３’の方向で）１５位、１６位、１７位、１８位、および１９位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドオーバーハングと、５’末端で共有結合したキャップ部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖（配列番号１１３）が、（５’から３’の方向で）１位、３位、１１位、１４位、１５位、１７位、および１８位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、６位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖（配列番号７９）が、（５’から３’の方向で）１５位、１６位、１７位、１８位、および１９位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分と、５’末端で共有結合した、脱塩基部分、逆位脱塩基部分、Ｃ６アミノ、およびミラーヌクレオチドから選択されるキャップ部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、化合物ＲＨＯＡ＿４８＿Ｓ１８５７に示される、アンチセンス鎖（配列番号１１３）が、（５’から３’の方向で）１位、３位、１１位、１４位、１５位、１７位、および１８位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、６位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖（配列番号７９）が、（５’から３’の方向で）１５位、１６位、１７位、１８位、および１９位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３末端に共有結合したＣ３Ｐｉと、５’末端で共有結合した逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチドキャップ部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、化合物ＲＨＯＡ＿４８＿Ｓ１８７３に示される、アンチセンス鎖（配列番号１１３）が、（５’から３’の方向で）１位、３位、１１位、１４位、１５位、１７位、および１８位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、６位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖（配列番号７９）が、（５’から３’の方向で）１５位、１６位、１７位、１８位、および１９位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３末端に共有結合したＣ３Ｐｉと、５’末端で共有結合したミラーヌクレオチド（Ｌ−デオキシリボグアノシン−３’−ホスフェート）とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖（配列番号１１３）が、（５’から３’の方向で）１位、３位、６位、１１位、１４位、１５位、１７位、および１８位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖（配列番号７９）が、（５’から３’の方向で）１位の任意の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、１５位、１６位、１７位、１８位、および１９位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３ＰｉまたはＣ３ＯＨ部分と、５’末端で共有結合した、脱塩基部分、逆位脱塩基部分、Ｃ６アミノ、およびミラーヌクレオチドから選択されるキャップ部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、化合物ＲＨＯＡ＿４８＿Ｓ１８５６に示される、アンチセンス鎖（配列番号１１３）が、（５’から３’の方向で）１位、３位、６位、１１位、１４位、１５位、１７位、および１８位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖（配列番号７９）が、（５’から３’の方向で）１位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、３末端に共有結合したＣ３Ｐｉ部分と、５’末端で共有結合した逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチドキャップ部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、化合物ＲＨＯＡ＿４８＿Ｓ１８７２に示される、アンチセンス鎖（配列番号１１３）が、（５’から３’の方向で）１位、３位、６位、１１位、１４位、１５位、１７位、および１８位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖（配列番号７９）が、（５’から３’の方向で）１位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、１５位、１６位、１７位、１８位、および１９位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３末端に共有結合したＣ３Ｐｉと、５’末端で共有結合したミラーヌクレオチド（Ｌ−デオキシリボグアノシン−３’−ホスフェート）とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖（配列番号１１３）が、（５’から３’の方向で）１位、３位、１１位、１４位、１５位、１７位、および１８位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、６位および７位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖（配列番号７９）が、（５’から３’の方向で）１位の任意の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、１５位、１６位、１７位、１８位、および１９位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３ＰｉまたはＣ３ＯＨ部分と、５’末端で共有結合した、脱塩基部分、逆位脱塩基部分、およびミラーヌクレオチドから選択されるキャップ部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、化合物ＲＨＯＡ＿４８＿Ｓ１８５８に示される、アンチセンス鎖（配列番号１１３）が、（５’から３’の方向で）１位、３位、１１位、１４位、１５位、１７位、および１８位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、６位および７位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖（配列番号７９）が、（５’から３’の方向で）１位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、１５位、１６位、１７位、１８位、および１９位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３末端に共有結合したＣ３Ｐｉ部分と、５’末端で共有結合した逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチドキャップ部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、化合物ＲＨＯＡ＿４８＿Ｓ１８５９に示される、アンチセンス鎖（配列番号１１３）が、（５’から３’の方向で）１位、３位、１１位、１４位、１５位、１７位、および１８位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、６位のミラーヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖（配列番号７９）が、（５’から３’の方向で）１位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、１５位、１６位、１７位、１８位、および１９位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３末端に共有結合したＣ３Ｐｉと、５’末端で共有結合した逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチドキャップ部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、化合物ＲＨＯＡ＿４８＿Ｓ１８６０に示される、アンチセンス鎖（配列番号１１３）が、（５’から３’の方向で）１位、３位、１１位、１４位、１５位、１７位、および１８位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、８位のミラーヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖（配列番号７９）が、（５’から３’の方向で）１位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、１５位、１６位、１７位、１８位、および１９位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３末端に共有結合したＣ３Ｐｉ部分と、５’末端で共有結合した逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチドキャップ部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、センス鎖（配列番号７９）が、（５’から３’の方向で）１位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、１５位、１６位、１７位、１８位、および１９位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３末端に共有結合したＣ３Ｐｉ部分と、５’末端で共有結合した逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチドキャップ部分とを含み、アンチセンス鎖（配列番号１１３）が、
（５’から３’の方向で）１位におけるＵからｄＴへの置換と、１位でデオキシリボチミジンに共有結合した５’ホスフェートと、３位、１１位、１４位、１５位、１７位、および１８位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、化合物ＲＨＯＡ＿４８＿Ｓ１８８４に示される、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または
（５’から３’の方向で）１位でウリジンに共有結合した５’ホスフェートと、３位、１１位、１４位、１５位、１７位、および１８位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、化合物ＲＨＯＡ＿４８＿Ｓ１８８５に示される、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または
（５’から３’の方向で）１位におけるＵからＣ３への置換と、１位でＣ３に共有結合した５’ホスフェートと、３位、１１位、１４位、１５位、１７位、および１８位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、化合物ＲＨＯＡ＿４８＿Ｓ１８８６に示される、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または
（５’から３’の方向で）１位でウリジンに共有結合した５’ホスフェートと、１位、３位、１１位、１４位、１５位、１７位、および１８位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、化合物ＲＨＯＡ＿４８＿Ｓ１８８７に示される、アンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、配列番号１１４に示されるアンチセンス鎖および配列番号８０に示されるセンス鎖を含み、本明細書においてＲＨＯＡ＿４８ｕとして特定される。いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、以下の構造を有し、
式中、「│」は、リボヌクレオチド間の塩基対合を表し、
それぞれのＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕは、独立して、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非従来的部分であり、
それぞれのＺおよびＺ’は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端で共有結合した、１〜５個の連続するヌクレオチドもしくは非ヌクレオチド部分、またはそれらの組み合わせであり、
ｚ"は、存在しても不在でもよいが、存在する場合は、センス鎖の５’末端で共有結合したキャッピング部分である。
好ましい実施形態において、二本鎖核酸分子は、修飾リボヌクレオチドおよび非従来的部分を含む。
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖（配列番号１１４）が、５位、６位、７位、または８位（５’から３’の方向で）のうちの１つまたは複数の位置の（５’から３’の方向で）１つまたは複数の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、または２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドオーバーハングとを含む、二本鎖核酸分子が提供される。アンチセンス鎖は、５’末端ホスフェートをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、センス鎖（配列番号８０）は、（５’から３’の方向で）３’末端または３’末端から２番目の位置の４個または５個の連続する２’−５’結合ヌクレオチドと、３’末端で共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分と、５’末端で共有結合したキャップ部分とを含む。他の実施形態において、センス鎖（配列番号８０）は、１つまたは複数の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドをさらに含む。
いくつかの実施形態において、化合物ＲＨＯＡ＿４８ｕ＿Ｓ１８１２に示される、アンチセンス鎖（配列番号１１４）が、（５’から３’の方向で）３位、６位、１１位、１４位、１５位、１７位、および１８位の（５’から３’の方向で）２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位の２’−５’リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖（配列番号８０）が、（５’から３’の方向で）１５位、１６位、１７位、１８位、および１９位の２’−５’リボヌクレオチドと、３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ部分と、５’末端で共有結合した逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチド部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、化合物ＲＨＯＡ＿４８ｕ＿Ｓ１８１３に示される、アンチセンス鎖（配列番号１１４）が、（５’から３’の方向で）３位、６位、１１位、１４位、１５位、１７位、および１８位の（５’から３’の方向で）２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位の２’−５’リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖（配列番号８０）が、（５’から３’の方向で）１３位および１６位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、９位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ部分と、５’末端で共有結合した逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチド部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、化合物ＲＨＯＡ＿４８ｕ＿Ｓ１８７０に示される、アンチセンス鎖（配列番号１１４）が、（５’から３’の方向で）３位、６位、１１位、１４位、１５位、１７位、および１８位の（５’から３’の方向で）２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位の２’−５’リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖（配列番号８０）が、（５’から３’の方向で）１位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、１５位、１６位、１７位、１８位、および１９位の２’−５’リボヌクレオチドと、３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ部分と、５’末端で共有結合したミラーヌクレオチド（Ｌ−デオキシリボグアノシン−３’−ホスフェート）とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、化合物ＲＨＯＡ＿４８ｕ＿Ｓ１８７１に示される、アンチセンス鎖（配列番号１１４）が、（５’から３’の方向で）３位、６位、１１位、１４位、１５位、１７位、および１８位の（５’から３’の方向で）２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位の２’−５’リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、センス鎖（配列番号８０）が、（５’から３’の方向で）１位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、１５位、１６位、１７位、１８位、および１９位の２’−５’リボヌクレオチドと、３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ部分と、５’末端で共有結合した逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチド部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、配列番号１１６に示されるアンチセンス鎖および配列番号８２に示されるセンス鎖を含み、本明細書においてＲＨＯＡ＿５０として特定される。いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、以下の構造を有し、
式中、「│」は、リボヌクレオチド間の塩基対合を表し、
それぞれのＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕは、独立して、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非従来的部分であり、
それぞれのＺおよびＺ’は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端で共有結合した、１〜５個の連続するヌクレオチドもしくは非ヌクレオチド部分、またはそれらの組み合わせであり、
ｚ"は、存在しても不在でもよいが、存在する場合は、センス鎖の５’末端で共有結合したキャッピング部分である。
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖（配列番号１１６）が、（５’から３’の方向で）５位、６位、７位、または８位のうちの１つまたは複数の位置のＤＮＡ、ミラーヌクレオチド、または２’−５’連結ヌクレオチドと、３’末端で共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分と、１つまたは複数の２’ＯＭｅ糖修飾ヌクレオチドとを含む、二本鎖核酸分子が提供される。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖（配列番号１１６）は、（５’から３’の方向で）５位、６位、７位、または８位のうちの１つまたは複数の位置の交互２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、または２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端で共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は、１位におけるＵ（ウリジン）からｄＵ（デオキシウリジン）への置換をさらに含む。アンチセンス鎖は、５’末端ホスフェートをさらに含んでもよい。
いくつかの実施形態において、センス鎖（配列番号８２）は、（５’から３’の方向で）９位または１０位のうちの１つまたは複数の位置のミラーヌクレオチドまたは２’−５’連結ヌクレオチドと、３’末端で共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分と、１つまたは複数の２’ＯＭｅ糖修飾ヌクレオチドと、５’末端で共有結合したキャップ部分とを含む。
いくつかの実施形態において、ＲＨＯＡ＿５０＿Ｓ１７９６に示される、アンチセンス鎖（配列番号１１６）が、（５’から３’の方向で）３位、５位、９位、１１位、１３位、１５位、１７位、および１９位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分と、１位におけるＵ（ウリジン）からｄＵ（デオキシウリジン）への置換とを含み、センス鎖（配列番号８２）が、（５’から３’の方向で）３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ非ヌクレオチド部分と、１１位、１３位、および１８位の２’ＯＭｅ糖修飾ヌクレオチドと、９位の２’−５’連結ヌクレオチドと、５’末端で共有結合した逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチドキャップ部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、ＲＨＯＡ＿５０＿Ｓ１７９８に示される、アンチセンス鎖（配列番号１１６）が、（５’から３’の方向で）４位、６位、８位、１１位、１３位、１５位、１７位、および１９位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分と、１位におけるＵ（ウリジン）からｄＵ（デオキシウリジン）への置換とを含み、センス鎖（配列番号８２）が、（５’から３’の方向で）３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ非ヌクレオチド部分と、１８位の２’ＯＭｅ糖修飾ヌクレオチドと、９位の２’−５’連結ヌクレオチドと、５’末端で共有結合した逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチドキャップ部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、ＲＨＯＡ＿５０＿Ｓ１７９９に示される、アンチセンス鎖（配列番号１１６）が、（５’から３’の方向で）３位、５位、９位、１１位、１３位、１５位、１７位、および１９位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分と、１位におけるＵ（ウリジン）からｄＵ（デオキシウリジン）への置換とを含み、センス鎖（配列番号８２）が、（５’から３’の方向で）３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ非ヌクレオチド部分と、１８位の２’ＯＭｅ糖修飾ヌクレオチドと、９位の２’−５’連結ヌクレオチドと、５’末端で共有結合した逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチドキャップ部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、ＲＨＯＡ＿５０＿Ｓ１８６５に示される、アンチセンス鎖（配列番号１１６）が、（５’から３’の方向で）４位、６位、８位、１１位、１３位、１５位、１７位、および１９位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分と、１位におけるＵ（ウリジン）からｄＵ（デオキシウリジン）への置換とを含み、センス鎖（配列番号８２）が、（５’から３’の方向で）３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ非ヌクレオチド部分と、１７位および１８位の２’ＯＭｅ糖修飾ヌクレオチドと、９位の２’−５’連結ヌクレオチドと、５’末端で共有結合した逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチドキャップ部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、ＲＨＯＡ＿５０＿Ｓ１８６６に示される、アンチセンス鎖（配列番号１１６）が、（５’から３’の方向で）３位、５位、９位、１１位、１３位、１５位、１７位、および１９位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分と、１位におけるＵ（ウリジン）からｄＵ（デオキシウリジン）への置換とを含み、センス鎖（配列番号８２）が、（５’から３’の方向で）３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ非ヌクレオチド部分と、１７位および１８位の２’ＯＭｅ糖修飾ヌクレオチドと、９位の２’−５’連結ヌクレオチドと、５’末端で共有結合した逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチドキャップ部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、配列番号１２３に示すアンチセンス鎖および配列番号８９に示すセンス鎖を含み、本明細書においてＲＨＯＡ＿６１として特定される。いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、以下の構造を有し、
式中、「│」は、リボヌクレオチド間の塩基対合を表し、
それぞれのＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕは、独立して、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非従来的部分であり、
それぞれのＺおよびＺ’は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端で共有結合した、１〜５個の連続するヌクレオチドもしくは非ヌクレオチド部分、またはそれらの組み合わせであり、
ｚ"は、存在しても不在でもよいが、存在する場合は、センス鎖の５’末端で共有結合したキャッピング部分である。
好ましい実施形態において、二本鎖核酸分子は、修飾リボヌクレオチドおよび非従来的部分を含む。
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖（配列番号１２３）が、（５’から３’の方向で）５位、６位、７位、または８位のうちの１つまたは複数の位置のＤＮＡ、ミラーヌクレオチド、または２’−５’連結ヌクレオチドと、３’末端で共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分と、１つまたは複数の２’ＯＭｅ糖修飾ヌクレオチドとを含む、二本鎖核酸分子が提供される。いくつかの実施形態において、センス鎖（配列番号８９）は、３’末端または３’末端から２番目の位置の４個または５個の連続する２’−５’連結ヌクレオチド、あるいは１つまたは複数の２’ＯＭｅ糖修飾ヌクレオチドと、３’末端で共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分と、５’末端で共有結合したキャップ部分とを含む。いくつかの実施形態において、センス鎖は、９位および１０位のうちの一方または両方に、ＤＮＡ、ミラーヌクレオチド、または２’５’連結ヌクレオチドをさらに含む。
いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は配列番号１２４に示されるアンチセンス鎖および配列番号９０に示されるセンス鎖を含み、本明細書においてＲＨＯＡ＿６１Ｕとして特定される。いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、以下の構造を有し、
式中、「│」は、リボヌクレオチド間の塩基対合を表し、
それぞれのＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕは、独立して、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非従来的部分であり、
それぞれのＺおよびＺ’は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端で共有結合した、１〜５個の連続するヌクレオチドもしくは非ヌクレオチド部分、またはそれらの組み合わせであり、
ｚ"は、存在しても不在でもよいが、存在する場合は、センス鎖の５’末端で共有結合したキャッピング部分である。
好ましい実施形態において、二本鎖核酸分子は、修飾リボヌクレオチドおよび非従来的部分を含む。
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖（配列番号１２４）が、（５’から３’の方向で）５位、６位、７位、または８位のうちの１つまたは複数の位置のＤＮＡ、ミラーヌクレオチド、または２’−５’連結ヌクレオチドと、３’末端で共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分と、１つまたは複数の２’ＯＭｅ糖修飾ヌクレオチドとを含む、二本鎖核酸分子が提供される。いくつかの実施形態において、センス鎖（配列番号９０）は、３’末端または３’末端から２番目の位置の４個または５個の連続する２’−５’連結ヌクレオチド、あるいは１つまたは複数の２’ＯＭｅ糖修飾ヌクレオチドと、３’末端で共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分と、５’末端で共有結合したキャップ部分とを含む。いくつかの実施形態において、センス鎖は、９位および１０位のうちの一方または両方に、ＤＮＡ、ミラーヌクレオチド、または２’５’連結ヌクレオチドをさらに含む。
いくつかの実施形態において、表ＩＩＩに示され、本明細書において、ＲＨＯＡ＿５８（配列番号１４３および１５７）およびＲＨＯＡ＿７０（配列番号１４６および１６０）として特定されるオリゴヌクレオチド対から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む、二本鎖ＲＮＡ分子が本明細書において提供される。
いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、配列番号１５７に示すアンチセンス鎖および配列番号１４３に示すセンス鎖を含み、本明細書においてＲＨＯＡ＿５８として特定される。いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、以下の構造を有し、
式中、「│」は、リボヌクレオチド間の塩基対合を表し、
それぞれのＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕは、独立して、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非従来的部分であり、
それぞれのＺおよびＺ’は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端で共有結合した、１〜５個の連続するヌクレオチドもしくは非ヌクレオチド部分、またはそれらの組み合わせであり、
ｚ"は、存在しても不在でもよいが、存在する場合は、センス鎖の５’末端で共有結合したキャッピング部分である。
好ましい実施形態において、二本鎖核酸分子は、修飾リボヌクレオチドおよび非従来的部分を含む。
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖（配列番号１５７）が、（５’から３’の方向で）５位、６位、７位、または８位のうちの１つまたは複数の位置のミラーヌクレオチドまたは２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端で共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分と、１つまたは複数の２’ＯＭｅ糖修飾ヌクレオチドとを含む、二本鎖核酸分子が提供される。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は、５’末端ホスフェートをさらに含む。いくつかの実施形態において、センス鎖（配列番号１４３）は、３’末端または３’末端から２番目の位置の４個または５個の連続する２’−５’連結ヌクレオチド、あるいは１つまたは複数の２’ＯＭｅ糖修飾ヌクレオチドと、３’末端で共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分と、５’末端で共有結合したキャップ部分とを含む。いくつかの実施形態において、センス鎖は、（５’から３’の方向で）９位および１０位のうちの一方または両方に、ＤＮＡ、ミラーヌクレオチド、または２’−５’連結ヌクレオチドをさらに含む。
いくつかの実施形態において、ＲＨＯＡ＿５８＿Ｓ１８０１に示される、アンチセンス鎖（配列番号１５７）が、（５’から３’の方向で）４位、６位、８位、１１位、１３位、１５位、１７位、および１９位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分とを含み、センス鎖（配列番号１４３）が、（５’から３’の方向で）１５位、１６位、１７位、１８位、および１９位の５個の連続する２’−５’連結ヌクレオチドと、３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ非ヌクレオチド部分と、５’末端で共有結合した逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチドキャップ部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、ＲＨＯＡ＿５８＿Ｓ１８０４に示される、アンチセンス鎖（配列番号１５７）が、（５’から３’の方向で）４位、６位、８位、１１位、１３位、１５位、１７位、および１９位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分とを含み、センス鎖（配列番号１４３）が、（５’から３’の方向で）１５位、１６位、１７位、１８位、および１９位の５個の連続する２’−５’連結ヌクレオチドと、３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ非ヌクレオチド部分と、９位の２’−５’連結ヌクレオチドと、５’末端で共有結合した逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチドキャップ部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、ＲＨＯＡ＿５８＿Ｓ１８０６に示される、アンチセンス鎖（配列番号１１５７）が、（５’から３’の方向で）３位、５位、９位、１１位、１３位、１５位、１７位、および１９位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分とを含み、センス鎖（配列番号１４３）が、（５’から３’の方向で）３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ非ヌクレオチド部分と、１１位、１３位、および１７位の２’ＯＭｅ糖修飾ヌクレオチドと、９位の２’−５’連結ヌクレオチドと、５’末端で共有結合した逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチドキャップ部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、ＲＨＯＡ＿５８＿Ｓ１８６１に示される、アンチセンス鎖（配列番号１５７）が、（５’から３’の方向で）４位、８位、１１位、１３位、１５位、１７位、および１９位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、６位の２’−５’連結ヌクレオチドと、３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分とを含み、センス鎖（配列番号１４３）が、（５’から３’の方向で）３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ非ヌクレオチド部分と、１１位、１３位、および１７位の２’ＯＭｅ糖修飾ヌクレオチドと、９位の２’−５’連結ヌクレオチドと、５’末端で共有結合した逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチドキャップ部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、ＲＨＯＡ＿５８＿Ｓ１８６２に示される、アンチセンス鎖（配列番号１５７）が、（５’から３’の方向で）４位、８位、１１位、１３位、１５位、１７位、および１９位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、６位におけるＵからｄＴへの置換と、３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分とを含み、センス鎖（配列番号１４３）が、（５’から３’の方向で）３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ非ヌクレオチド部分と、１１位、１３位、および１７位の２’ＯＭｅ糖修飾ヌクレオチドと、９位の２’−５’連結ヌクレオチドと、５’末端で共有結合した逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチドキャップ部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、ＲＨＯＡ＿５８＿Ｓ１８７７に示される、アンチセンス鎖（配列番号１５７）が、（５’から３’の方向で）３位、５位、９位、１１位、１３位、１５位、１７位、および１９位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、７位の２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分とを含み、センス鎖（配列番号１４３）が、（５’から３’の方向で）３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ非ヌクレオチド部分と、１１位、１３位、および１７位の２’ＯＭｅ糖修飾ヌクレオチドと、９位の２’−５’連結ヌクレオチドと、５’末端で共有結合したミラーヌクレオチド（Ｌ−デオキシリボグアノシン−３’−ホスフェート）キャップ部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、ＲＨＯＡ＿５８＿Ｓ１８７８に示される、アンチセンス鎖（配列番号１５７）が、（５’から３’の方向で）４位、８位、１１位、１３位、１５位、１７位、および１９位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、６位の２’−５’連結ヌクレオチドと、３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分とを含み、センス鎖（配列番号１４３）が、（５’から３’の方向で）３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ非ヌクレオチド部分と、１１位、１３位、および１７位の２’ＯＭｅ糖修飾ヌクレオチドと、９位の２’−５’連結ヌクレオチドと、５’末端で共有結合したミラーヌクレオチド（Ｌ−デオキシリボグアノシン−３’−ホスフェート）キャップ部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、ＲＨＯＡ＿５８＿Ｓ１８７９に示される、アンチセンス鎖（配列番号１５７）が、（５’から３’の方向で）４位、８位、１１位、１３位、１５位、１７位、および１９位の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、６位のｄＴと、３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分とを含み、センス鎖（配列番号１４３）が、（５’から３’の方向で）３’末端で共有結合したＣ３Ｐｉ非ヌクレオチド部分と、１１位、１３位、および１７位の２’ＯＭｅ糖修飾ヌクレオチドと、９位の２’−５’連結ヌクレオチドと、５’末端で共有結合したミラーヌクレオチド（Ｌ−デオキシリボグアノシン−３’−ホスフェート）キャップ部分とを含む、二本鎖核酸分子が提供される。
いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、配列番号１６０に示すアンチセンス鎖および配列番号１４６に示すセンス鎖を含み、本明細書においてＲＨＯＡ＿７０として特定される。いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、以下の構造を有し、
式中、「│」は、リボヌクレオチド間の塩基対合を表し、
それぞれのＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕは、独立して、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非従来的部分であり、
それぞれのＺおよびＺ’は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端で共有結合した、１〜５個の連続するヌクレオチドもしくは非ヌクレオチド部分、またはそれらの組み合わせであり、
ｚ"は、存在しても不在でもよいが、存在する場合は、センス鎖の５’末端で共有結合したキャッピング部分である。
好ましい実施形態において、二本鎖核酸分子は、修飾リボヌクレオチドおよび非従来的部分を含む。
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖（配列番号１６０）が、（５’から３’の方向で）５位、６位、７位、または８位のうちの１つまたは複数の位置のＤＮＡ、ミラーヌクレオチド、または２’−５’連結ヌクレオチドと、３’末端で共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分と、１つまたは複数の２’ＯＭｅ糖修飾ヌクレオチドとを含む、二本鎖核酸分子が提供される。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は、５’末端ホスフェートをさらに含む。いくつかの実施形態において、センス鎖（配列番号１４６）は、３’末端または３’末端から２番目の位置の４個または５個の連続する２’−５’連結ヌクレオチド、あるいは１つまたは複数の２’ＯＭｅ糖修飾ヌクレオチドと、３’末端で共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分と、５’末端で共有結合したキャップ部分とを含む。いくつかの実施形態において、センス鎖は、（５’から３’の方向で）９位および１０位のうちの一方または両方に、ＤＮＡ、ミラーヌクレオチド、または２’５’連結ヌクレオチドをさらに含む。
第２の態様において、本発明は、１つまたは複数の本発明によるこのような核酸化合物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ネイキッドｄｓＲＮＡとして投与される。他の実施形態において、化合物は、薬物担体中にカプセル化される。
第３の態様において、本発明は、ＣＮＳ、ＰＮＳ、前庭感覚系、視覚系、および／または循環（脈管、動脈）系に疾患または障害を患っている対象を治療する際に使用するため、あるいは悪性疾患または障害、例えば癌を患っている対象を治療する際に使用するための本願による化合物に関する。中枢神経系（ＣＮＳ）および／または末梢神経系（ＰＮＳ）の傷害、疾患、障害、または状態に起因するニューロン変性の防止、抑制、または治療のための方法であって、前記傷害、疾患、障害、または状態を治療するのに有効な量の構造Ａ１および／または構造Ａ２による核酸化合物を必要性のある個人に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。また、神経系の傷害に罹患した個人に神経保護を与えるための方法であって、構造Ａ１および／または構造Ａ２による化合物、またはその薬学的に許容される塩を前記神経系の傷害に関連する神経変性を改善するのに有効な量で、前記個人に投与することを含む方法も提供される。
別の態様において、ＣＮＳ、ＰＮＳ、前庭感覚系、視覚系、および／または循環（脈管、動脈）系の疾患または障害の治療用の薬物を調製するための、本明細書において開示される核酸化合物の使用が提供される。別の態様において、悪性の疾患または障害、例えば癌の治療用の薬物を調製するための、本明細書において開示される核酸化合物の使用が提供される。特定の実施形態において、本発明は、化学修飾ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチド、それを含む組成物、および中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患、障害、傷害、および状態（神経再生および神経保護に関する状態、中枢神経系（ＣＮＳ）の傷害、脊髄傷害（ＳＣＩ）、脳傷害、末梢神経傷害（ＰＮＩ）、神経系の障害、眼の疾患および障害、ならびに前庭系の疾患および障害を含むがこれらに限定されない）の治療におけるその使用方法を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される化合物は、ニューロン変性を軽減する。ニューロン変性には、例えば、視神経および網膜神経節細胞を含む網膜の変性が含まれる。また、これは、内耳から脳への音および平衡情報の伝達に関与する聴神経（内耳神経または聴覚神経としても知られている）の変性も含む。内耳の有毛細胞は、蝸牛神経と前庭神経とからなり、延髄から出て、顔面神経と共に側頭骨内の内耳道（または内聴道）を通って頭蓋内に入る聴神経を介して、脳に情報を伝達する。
いくつかの実施形態において、本発明は、治療的有効量の本明細書において開示される核酸分子を対象に投与することを含む、対象の視神経および／または網膜神経節細胞におけるニューロン変性を軽減する方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象は、緑内障またはＮＡＩＯＮに罹患している。
いくつかの実施形態において、本発明は、治療的有効量の本明細書において開示される核酸分子を対象に投与することを含む、対象の聴神経におけるニューロン変性を軽減する方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象はメニエール病に罹患している。
いくつかの実施形態において、本発明は、治療的有効量の本明細書において開示される核酸分子を対象に投与することを含む、対象の神経および／または網膜神経節細胞に神経保護を与える方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象は、緑内障またはＮＡＩＯＮに罹患している。
いくつかの実施形態において、本発明は、治療的有効量の本明細書において開示される核酸分子を対象に投与することを含む、対象の聴神経および／またはらせん神経節細胞に神経保護を与える方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象はメニエール病に罹患している。
いくつかの実施形態において、本発明は、治療的有効量の本明細書において開示される核酸分子を対象に投与することを含む、対象においてニューロパシーを治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象は、自律神経ニューロパシー、癌性ニューロパシー、圧迫性ニューロパシー、糖尿病性ニューロパシー、薬剤性ニューロパシー、中毒性ニューロパシー、化学療法誘発性ニューロパシー、胃腸ニューロパシー、栄養性ニューロパシー、遺伝性ニューロパシー、免疫介在性ニューロパシーおよび慢性免疫介在性多発ニューロパシー、感染性ニューロパシー、またはニューロパシー性疼痛に罹患している。いくつかの実施形態において、対象は糖尿病性ニューロパシーに罹患している。いくつかの実施形態において、対象はアロディニアに罹患している。いくつかの実施形態において、本発明は、異常なおよび／または混乱した細胞運動、細胞骨格調節、および／または微小管構築に関連する疾患または障害を患っている対象を治療する方法であって、治療的有効量の本明細書において開示される核酸分子を対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象は、血管新生障害、血管疾患、および／または動脈疾患に罹患している。いくつかの実施形態において、対象は、角膜血管新生疾患もしくは障害、網膜血管新生疾患もしくは障害、脈絡膜血管新生疾患もしくは障害、またはそれらの組み合わせから選択される、眼球血管新生疾患もしくは障害を患っている。いくつかの実施形態において、対象は、網膜症、例えば、糖尿病性網膜症を患っている。いくつかの実施形態において、対象は、角膜移植片拒絶反応の危険性がある、または角膜移植片拒絶反応を起こしている、角膜移植患者である。いくつかの実施形態において、対象は、再狭窄の危険性がある、または再狭窄を起こしている。
かかる方法は、かかる治療の必要性がある哺乳動物に、予防的または治療的有効量のＲｈｏＡの発現または活性を阻害する、または減少させる本明細書において開示される１つまたは複数の核酸分子を投与することを含む。
別の態様において、本発明は、ある量の配列番号１に示すＲｈｏＡの発現を阻害する核酸分子を対象に投与することを含む、ＲｈｏＡの発現に関連する疾患または障害に関連する疾患または障害または症状の治療の必要性のある対象の治療ための方法に関する。
合成された例示的ｄｓＲＮＡの表を提示する。分子の一部を様々な濃度でインビトロで試験し、残存ｍＲＮＡｓ％を提示する。 漸増用量のｄｓＲｈｏＡ化合物がラットにおける視神経挫滅後にＲＧＣ軸索再生を誘導する能力を測定するインビボ研究における、ｄｓＲｈｏＡ処置後の平均ＲＧＣ生存率 漸増用量のｄｓＲｈｏＡ化合物が、ラットにおける視神経挫滅後にＲＧＣ軸索再生を誘導する能力を測定するインビボ研究における、ｄｓＥＧＦＰと比較したＲＧＣ生存率の促進 ＩＴポンプ移植およびガバペンチン治療による投与を受けた試験項目 ＩＴ単一腰椎注入による投与を受けた試験項目
本明細書において開示されるのは、ＲｈｏＡの発現を下方制御する化合物であり、とりわけ新規の化学修飾二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｄｓＲＮＡｓ）、および様々な疾患および医学的状態、とりわけ中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患および障害の治療におけるこれらの新規ｄｓＲＮＡｓの使用に関する。一態様によると、本発明は、非修飾および修飾ヌクレオチドと、非従来的部分とを含む阻害性オリゴヌクレオチド化合物を提供する。この化合物は、糖修飾、塩基修飾、およびヌクレオチド間連結修飾からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含み、ＤＮＡと、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＥＮＡ（エチレン−架橋核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、アラビノシド、ＰＡＣＥ、ミラーヌクレオチド、２’−５’ヌクレオチド間結合によって隣接するヌクレオチドと接合したヌクレオチド、もしくは６炭素糖を有するヌクレオチドを含む修飾ヌクレオチドまたは非従来的部分とをさらに含んでもよい。
ＲｈｏＡは、ＲＧＣを含むＣＮＳニューロンにおける運動、成長、分化、およびアポトーシスなどの細胞機能を制御する、低分子ＧＴＰａｓｅタンパク質である。また、ＲｈｏＡは、神経系の免疫細胞（小膠細胞およびマクロファージ）および星状膠細胞におけるシグナル伝達により、二次炎症および瘢痕性のＣＮＳ傷害応答にも関与する。治療される特定の疾患および状態には、ＳＣＩ、緑内障、ＡＭＤ、アルツハイマー病およびパーキンソン病を含む神経変性疾患、ＡＬＳ、脳卒中、ＴＢＩなどが含まれる。
本開示によるｓｉＲＮＡ化合物を生成する際に有用な好ましいセンス配列およびアンチセンス配列の一覧は、表Ｉ、表ＩＩ、および表ＩＩＩに提示する。
ＲｈｏＡを下方制御する方法、核酸分子、および組成物が、本明細書において詳細に説明され、また、前記分子および／または組成物のいずれも前記状態のいずれを患っている対象の治療にも有益に使用することができる。
本明細書において提供される核酸化合物は、活性を向上し、安定性を向上し、および／または毒性を最小限に抑えることができる構造および修飾を有し、本明細書において開示されるｄｓＲＮＡ化合物を生成する際に有用な新規の修飾は、ＲｈｏＡ発現を防止または減少する際に有用な二本鎖ＲＮＡに有益に適用することができる。
いくつかの実施形態において、構造（Ａ１）：
（Ａ１） ５’ （Ｎ）ｘ‐Ｚ ３’ （アンチセンス鎖）
３’ Ｚ’−（Ｎ’）ｙ‐ｚ" ５’（センス鎖）
を有する二本鎖ＲＮＡ化合物が本明細書において提供され、式中、それぞれのＮおよびＮ’は、修飾されていなくても修飾されていてもよいリボヌクレオチド、または非従来的部分であり、
それぞれの（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、それぞれの連続するＮまたはＮ’が、共有結合によって次のＮまたはＮ’と接合するオリゴヌクレオチドであり、
それぞれのＺおよびＺ’は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端で共有結合した、１〜５個の連続するヌクレオチド、１〜５個の連続する非ヌクレオチド部分、またはそれらの組み合わせを含み、
ｚ"は、存在しても不在でもよいが、存在する場合は、（Ｎ’）ｙの５’末端で共有結合したキャッピング部分であり、
それぞれのｘおよびｙは、独立して、１８〜４０の整数であり、
（Ｎ’）ｙの配列は（Ｎ）ｘの配列に相補的であり、（Ｎ）ｘは、表ＩＩＩまたは表ＩＶに記載されるアンチセンス配列を含む。
表ＩＩＩに提示されるｄｓＲＮＡ化合物を生成する際に有用なセンス配列およびアンチセンス配列は、ＲＨＯＡ＿３１（配列番号１３５および１４９）、ＲＨＯＡ＿３３（配列番号１３６および１５０）、ＲＨＯＡ＿３７（配列番号１３７および１５１）、ＲＨＯＡ＿３８（配列番号１３８および１５２）、ＲＨＯＡ＿４３（配列番号１３９および１５３）、ＲＨＯＡ＿５２（配列番号１４０および１５４）、ＲＨＯＡ＿５６（配列番号１４１および１５５）、ＲＨＯＡ＿５７（配列番号１４２および１５６）、ＲＨＯＡ＿５８（配列番号１４３および１５７）、ＲＨＯＡ＿６８（配列番号１４４および１５８）、ＲＨＯＡ＿６９（配列番号１４５および１５９）、ＲＨＯＡ＿７０（配列番号１４６および１６０）、ＲＨＯＡ＿７３（配列番号１４７および１６１）、ならびにＲＨＯＡ＿７６（配列番号１４８および１６２）である。表ＩＶに提示するｄｓＲＮＡ化合物を生成する際に有用なセンス配列およびアンチセンス配列は、ＲＨＯＡ＿２３（配列番号１６３および１６７）、ＲＨＯＡ＿２４（配列番号１６４および１６８）、ＲＨＯＡ＿２６（配列番号１６５および１６９）、またはＲＨＯＡ＿２９（配列番号１６６および１７０）に示される。
いくつかの実施形態において、連続するＮおよび／またはＮ’それぞれを接合する共有結合はリン酸ジエステル結合である。
いくつかの実施形態において、ｘ＝ｙであり、それぞれのｘおよびｙは、１９、２０、２１、２２、または２３である。好ましい実施形態において、ｘ＝ｙ＝１９である。
本明細書において開示される核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）のいくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子はｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、またはｍｉＲＮＡである。
いくつかの実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿５８（配列番号１４３および１５７）に示される配列対を含む。いくつかの実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、ＲＨＯＡ＿７０（配列番号１４６および１６０）に示される配列対を含む。
いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、アンチセンス鎖の１位（５’末端）にＤＮＡ部分または標的に対するミスマッチを含む。かかる二重鎖構造を本明細書において説明する。一実施形態によると、下記に示す構造（Ａ２）を有する二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物が提供され、
（Ａ２） ５’ Ｎ１−（Ｎ）ｘ−Ｚ ３’（アンチセンス鎖）
３’ Ｚ’−Ｎ２−（Ｎ’）ｙ‐ｚ" ５’（センス鎖）
式中、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ、およびＮ’はそれぞれ、独立して、非修飾もしくは修飾ヌクレオチド、または非従来的部分であり、
それぞれの（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙはオリゴヌクレオチドであり、それぞれの連続するＮまたはＮ’は、共有結合によって隣接するＮまたはＮ’と接合され、
それぞれのｘおよびｙは、独立して、１７〜３９の整数であり、
Ｎ２は、（Ｎ’）ｙと共有結合し、
Ｎ１は、（Ｎ）ｘと共有結合し、標的ｍＲＮＡ（配列番号１）と一致しないか、または標的ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ部分であり、
Ｎ１は、天然または修飾された、ウリジン、デオキシリボウリジン、リボチミジン、デオキシリボチミジン、アデノシン、またはデオキシアデノシン、脱塩基リボース部分、および脱塩基デオキシリボース部分からなる群から選択される部分であり、
ｚ"は、存在しても不在でもよいが、存在する場合は、Ｎ２−（Ｎ’）ｙの５’末端で共有結合したキャッピング部分であり、
それぞれのＺおよびＺ’は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端で共有結合した、１〜５個の連続するヌクレオチド、１〜５個の連続する非ヌクレオチド部分、またはそれらの組み合わせであり、
（Ｎ’）ｙの配列は（Ｎ）ｘの配列に相補的であり、（Ｎ）ｘの配列は、表Ｉに記載されるアンチセンス配列を含む。
種々の実施形態において、Ｎ１−（Ｎ）ｘの配列は、表ＩＩに記載されるアンチセンス配列を含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡ化合物を生成する際に有用なＮ２−（Ｎ’）ｙおよびＮ１−（Ｎ）ｘは、表ＩＩに提示され、ＲＨＯＡ＿３２（配列番号６７および１０１）、ＲＨＯＡ＿３４（配列番号６８および１０２）、ＲＨＯＡ＿３５（配列番号６９および１０３）、ＲＨＯＡ＿３６（配列番号７０および１０４）、ＲＨＯＡ＿３９（配列番号７１および１０５）、ＲＨＯＡ＿４０（配列番号７２および１０６）、ＲＨＯＡ＿４１（配列番号７３および１０７）、ＲＨＯＡ＿４２（配列番号７４および１０８）、ＲＨＯＡ＿４４（配列番号７５および１０９）、ＲＨＯＡ＿４５（配列番号７６および１１０）、ＲＨＯＡ＿４６（配列番号７７および１１１）、ＲＨＯＡ＿４７（配列番号７８および１１２）、ＲＨＯＡ＿４８（配列番号７９および１１３）、ＲＨＯＡ＿４８ｕ（配列番号８０および１１４）、ＲＨＯＡ＿４９（配列番号８１および１１５）、ＲＨＯＡ＿５０（配列番号８２および１１６）、ＲＨＯＡ＿５１（配列番号８３および１１７）、ＲＨＯＡ＿５３（配列番号８４および１１８）、ＲＨＯＡ＿５４（配列番号８５および１１９）、ＲＨＯＡ＿５５（配列番号８６および１２０）、ＲＨＯＡ＿５９（配列番号８７および１２１）、ＲＨＯＡ＿６０（配列番号８８および１２２）、ＲＨＯＡ＿６１（配列番号８９および１２３）、ＲＨＯＡ＿６１ｕ（配列番号９０および１２４）、ＲＨＯＡ＿６２（配列番号９１および１２５）、ＲＨＯＡ＿６３（配列番号９２および１２６）、ＲＨＯＡ＿６４（配列番号９３および１２７）、ＲＨＯＡ＿６５（配列番号９４および１２８）、ＲＨＯＡ＿６６（配列番号９５および１２９）、ＲＨＯＡ＿６７（配列番号９６および１３０）、ＲＨＯＡ＿７１（配列番号９７および１３１）、ＲＨＯＡ＿７２（配列番号９８および１３２）、ＲＨＯＡ＿７４（配列番号９９および１３３）、ならびにＲＨＯＡ＿７５（配列番号１００および１３４）に示される。
センス（パッセンジャー鎖）配列およびアンチセンス（ガイド鎖）配列を用いる新規のｄｓＲＮＡ化合物が、本明細書に記載される。
定義
便宜上、本明細書、実施例、および特許請求の範囲で用いられる特定の用語を、本明細書において説明する。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明示しない限り、複数形を含むことに留意されたい。
本発明の態様または実施形態が、マーカッシュ群または他の選択肢の系列化に関して記載される場合、当業者は、本発明が、それによって、任意の個々の要素または群の要素の亜群に関しても記載されていることを認識するであろう。
「阻害剤」は、遺伝子の発現またはこのような遺伝子の産物の活性を、所望の生物学的または生理学的な効果を達成するのに十分な程度まで、（部分的または完全に）下方制御する、または減少させることができる化合物である。
本明細書で使用する「阻害剤」という用語は、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、合成ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、ならびにリボザイムを含む、オリゴヌクレオチド阻害剤または核酸阻害剤のうちの１つまたは複数を指す。
「ｄｓＲＮＡ阻害剤」は、遺伝子の発現またはこのような遺伝子の産物の活性を、所望の生物学的または生理学的効果を達成するのに十分な程度まで下方制御する、または減少させることが可能な化合物である。本明細書で使用される用語「ｄｓＲＮＡ阻害剤」は、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、合成ｓｈＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡのうちの１つまたは複数を指す。阻害は、下方制御、またはＲＮＡｉについてはサイレンシング、と称されてもよい。
本明細書で使用する「阻害する」という用語は、遺伝子の発現またはこのような遺伝子の産物の活性を、所望の生物学的または生理学的な効果を達成するのに十分な程度まで、下方制御する、または減少させることを指す。阻害は、完全であっても、部分的であってもよい。
本明細書において使用する場合、ＲｈｏＡの「阻害」または「下方制御」という用語は、遺伝子発現（転写もしくは翻訳）またはポリペプチド活性の下方制御または阻害を意味する。標的ｍＲＮＡ配列のポリヌクレオチド配列は、配列番号１示すｍＲＮＡ配列、またはＲｈｏＡ ｍＲＮＡに対して、少なくとも７０％の同一性、より好ましくは８０％の同一性、さらに好ましくは９０％もしくは９５％の同一性を有するその任意の相同配列を指す。したがって、本明細書に記載されるように、変異、変更、または修飾を受けたポリヌクレオチド配列は、本発明に包含される。「ｍＲＮＡポリヌクレオチド配列」および「ｍＲＮＡ」という用語は、互換的に使用される。ＲｈｏＡは、アクチン細胞骨格を制御するＧＴＰａｓｅであり、これは脊髄傷害後に上方制御され、眼の小柱網で発現することが示されている。
本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、互換的に使用してもよく、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含むヌクレオチド配列を指す。これらの用語は、ヌクレオチド類似体から作られるＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの類似体を同等物として含むことも理解されたい。本出願全体を通して、ｍＲＮＡ配列は、相当する遺伝子を表すものとして記載される。
「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、約２個〜約５０個のヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を指す。それぞれのＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドは、独立して、天然もしくは合成、および／または修飾もしくは非修飾であってもよい。修飾は、糖部分、塩基部分、および／またはオリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチド間の連結に対する変更を含む。本明細書において開示される化合物は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、およびそれらの組み合わせを含む分子を包含する。
「ヌクレオチド」は、天然もしくは合成、および／または修飾もしくは非修飾であってもよい、デオキシヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを包含することを意味する。修飾には、オリゴリボヌクレオチド中の糖部分、塩基部分、および／またはリボヌクレオチド間の連結に対する変更が含まれる。本明細書で使用される場合、用語「リボヌクレオチド」は、天然および合成の、非修飾および修飾リボヌクレオチドを包含する。修飾には、オリゴヌクレオチド中の糖部分、塩基部分、および／またはリボヌクレオチド間の連結に対する変更が含まれる。
いくつかの実施形態によると、非修飾ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチド、および／または非従来的部分を含む、阻害性オリゴヌクレオチド化合物が提供される。この化合物は、糖修飾、塩基修飾、およびヌクレオチド間連結修飾からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含み、ＤＮＡと、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＥＮＡ（エチレン−架橋核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、アラビノシド、ＰＡＣＥ、ミラーヌクレオチド、または６炭素糖を有するヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドを含んでもよい。
ヌクレオチド／オリゴヌクレオチドの全ての類似体または修飾体は、前記類似体または修飾体が、ヌクレオチド／オリゴヌクレオチドの機能に実質的に悪影響を及ぼさないという条件で、本明細書において開示される修飾を伴って使用することができる。許容される修飾には、糖部分の修飾、塩基部分の修飾、ヌクレオチド間連結における修飾、およびこれらの組み合わせが含まれる。
一実施形態において、化合物は、少なくとも１個のリボヌクレオチドの糖部分の２’修飾（「２’糖修飾」）を含む。特定の実施形態において、化合物は、場合により交互の位置に、２’Ｏ−アルキルまたは２′−フルオロまたは２’Ｏ−アリルまたは任意の他の２’修飾を含む。他の安定化させる修飾もまた可能である（例えば、末端修飾）。いくつかの実施形態において、好ましい２’Ｏ−アルキルは、２’Ｏ−メチル（メトキシ、２’ＯＭｅ）糖修飾である。糖修飾には、糖残基の２’部分の修飾が含まれ、アミノ、フルオロ、アルコキシ、例えばメトキシ、アルキル、アミノ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＣＮ、ＣＦ、イミダゾール、カルボキシレート、チオエート、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、もしくはアラルキル、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ヘテロジクロアルキル、ヘテロジクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、または置換シリル、とりわけ欧州特許第０ ５８６ ５２０（Ｂ１）号または欧州特許第０ ６１８ ９２５（Ｂ１）号に記載されているようなものを包含する。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの骨格が修飾され、ホスフェート−Ｄ−リボース実体を含むが、チオホスフェート−Ｄ−リボース実体、トリエステル、チオエート、２’−５’架橋骨格（５’−２’とも称され得る）、ＰＡＣＥなども含み得る。
本明細書において使用する場合、用語「非対合ヌクレオチド類似体」は、６デスアミノアデノシン（ネブラリン）、４−Ｍｅ−インドール、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、Ｄｓ、Ｐａ、Ｎ３−ＭｅリボＵ、Ｎ３−ＭｅリボＴ、Ｎ３−Ｍｅ−ｄＣ、Ｎ３−Ｍｅ−ｄＴ、Ｎ１−Ｍｅ−ｄＧ、Ｎ１−Ｍｅ−ｄＡ、Ｎ３−エチル−ｄＣ、Ｎ３−Ｍｅ−ｄＣを含むがこれらに限定されない、非塩基対合部分を含むヌクレオチド類似体を意味する。いくつかの実施形態において、非塩基対合ヌクレオチド類似体はリボヌクレオチドである。他の実施形態において、これはデオキシリボヌクレオチドである。
他の修飾には、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’部分の末端修飾が含まれ、これはキャッピング部分としても知られている。かかる末端修飾は、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、脂質、ペプチド、および糖から選択される。
「アルキル部分またはその誘導体」とは、直鎖もしくは分岐炭素部分、および部分自体またはアルコール、リン酸ジエステル、ホスホロチオエート、ホスホノアセテートを含む官能基をさらに含む部分を指し、またアミン、カルボン酸、エステル、アミド、アルデヒドも含む。「炭化水素部分」および「アルキル部分」は、互換的に使用される。
「末端官能基」には、ハロゲン基、アルコール基、アミン基、カルボン酸基、エステル基、アミド基、アルデヒド基、ケトン基、エーテル基が含まれる。
「ヌクレオチド」は、天然もしくは合成、および修飾もしくは非修飾であってもよい、デオキシヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを包含することを意味する。修飾には、糖部分、塩基部分、および／またはヌクレオチド間連結の変更および置換が含まれる。
修飾リボヌクレオチドには、デオキシリボヌクレオチドおよび修飾デオキシリボヌクレオチドが含まれる。修飾デオキシヌクレオチドには、例えば、５’末端位置（位置番号１）におけるヌクレオチドとして有用であり得る５’ＯＭｅ ＤＮＡ（５−メチル−デオキシリボグアノシン−３'−ホスフェート）、ＰＡＣＥ（デオキシリボアデニン３'ホスホノアセテート、デオキシリボシチジン３'ホスホノアセテート、デオキシリボグアノシン３'ホスホノアセテート、デオキシリボチミジン３'ホスホノアセテートが含まれる。さらに、インビボでＲｈｏＡの発現を阻害する方法および組成物が本明細書において提供される。一般的に、この方法は、ＲｈｏＡから転写されたｍＲＮＡを標的とする、オリゴリボヌクレオチド、とりわけ二本鎖ＲＮＡ（即ち、ｄｓＲＮＡ）、または細胞中でｄｓＲＮＡを産生することができる核酸物質を、例えばＲＮＡ干渉機構によってＲｈｏＡの発現を下方制御するのに十分な量で投与することを含む。具体的には、当該方法を使用して、疾患、障害、または傷害の治療のために、ＲｈｏＡの発現を下方制御することができる。本発明に従って、核酸分子またはＲｈｏＡの阻害剤は、種々の病状を治療するために薬物として使用される。本発明に従って、核酸分子またはＲｈｏＡの阻害剤は、ＣＮＳ、ＰＮＳ、前庭感覚系、視覚系、および／または循環（脈管、動脈）系の種々の疾患または障害を治療するために、薬物として使用される。
ｄｓＲＮＡおよびＲＮＡ干渉
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ依存的な遺伝子特異的な転写後サイレンシングを含む現象である。この現象を研究して、実験的に哺乳動物細胞を操る初期の試みは、長鎖ｄｓＲＮＡ分子に応答して活性化された活性な非特異的抗ウイルス防衛機構によって頓挫していた（Ｇｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，２０００．５：１０７−１１４）。のちに、２１個のヌクレオチドＲＮＡの合成二重鎖が、一般的な抗ウイルス機構を刺激することなく、哺乳動物細胞の遺伝子特異的ＲＮＡｉを媒介することができることが発見された（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２００１，４１１：４９４−４９８、およびＣａｐｌｅｎ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ ２００１，９８：９７４２−９７４７）。結果として、短い二重鎖ＲＮＡである低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、遺伝子発現を阻害し、遺伝子機能を理解するために広く使用されている。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、低分子干渉ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ）（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ １９９８，３９１：８０６）、またはマイクロＲＮＡｓ（ｍｉＲＮＡｓ）（Ａｍｂｒｏｓ Ｖ．Ｎａｔｕｒｅ ２００４，４３１：３５０−３５５）、およびＢａｒｔｅｌ ＤＰ．Ｃｅｌｌ．２００４ １１６（２）：２８１−９７）により媒介される。これに対応する過程は、植物において観察される場合、特異的な転写後遺伝子サイレンシング、また真菌において観察される場合、クエリングと一般に称される。
ｓｉＲＮＡ化合物は、内在性もしくは外来の遺伝子／ｍＲＮＡの発現を下方制御またはサイレンシングする（即ち、完全または部分的に阻害する）、二本鎖ＲＮＡである。ＲＮＡ干渉は、特定のｄｓＲＮＡ種が、特異的なタンパク質複合体に侵入する能力に基づき、これらは次いで相補的細胞ＲＮＡに対する標的とされ、それらを特異的に分解する。したがって、ＲＮＡ干渉応答は、ｓｉＲＮＡを含むエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とし、一般に、ＲＮＡ誘発性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と称され、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で生じ得る（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，２００１，１５：１８８）。より詳細には、より長いｄｓＲＮＡは、ＩＩＩ型ＲＮＡｓｅ（ＤＩＣＥＲ、ＤＲＯＳＨＡなど（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４０９：３６３−６およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００３，４２５：４１５−９を参照）によって消化され、短い（１７〜２９ｂｐ）ｄｓＲＮＡ断片（短い阻害ＲＮＡまたは「ｓｉＲＮＡ」とも称される）になる。ＲＩＳＣタンパク質複合体は、これらの断片および相補的ｍＲＮＡを認識する。全過程は、標的ｍＲＮＡのエンドヌクレアーゼ切断によって終了する（ＭｃＭａｎｕｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ，２００２，３：７３７−４７、Ｐａｄｄｉｓｏｎ ａｎｄ Ｈａｎｎｏｎ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００３，５（３）：２１７−２４）。（これらの用語および提案される機構に関する追加情報については、例えば、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ．２００１，７（１１）：１５０９−２１、Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ，Ｃｅｌｌ．２００１，１０７（４）：４１５−８、およびＰＣＴ広報第ＷＯ０１／３６６４６号を参照）。
研究によって、ｓｉＲＮＡが哺乳動物およびヒトの双方において、インビボで有効であり得ることが明らかになった。具体的には、Ｂｉｔｋｏらは、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ヌクレオカプシドＮ遺伝子を対象とする特異的なｓｉＲＮＡが、経鼻的に投与した場合に、マウスの治療に有効であることを示した（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００５，１１（１）：５０−５５）。ｓｉＲＮＡの治療用途に関する概説については、例えば、Ｂａｒｉｋ（Ｍｏｌ．Ｍｅｄ ２００５，８３：７６４−７７３）およびＣｈａｋｒａｂｏｒｔｙ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ２００７ ８（３）：４６９−８２を参照）。さらに、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）を治療するための、ＶＥＧＦＲ１受容体を標的とする短いｓｉＲＮＡを用いた臨床試験が、ヒト患者において実施された（Ｋａｉｓｅｒ，Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２００６ １４２（４）：６６０−８）。治療薬としてのｓｉＲＮＡの使用に関するさらなる情報は、Ｄｕｒｃａｎ，２００８．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａ．５（４）：５５９‐５６６、Ｋｉｍ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ，２００８．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４４：６１３−６１６、Ｇｒｉｍｍ ａｎｄ Ｋａｙ，２００７，ＪＣＩ，１１７（１２）：３６３３−４１に記載されている。
化学合成
本発明の化合物は、当技術分野において公知のリボ核酸（またはデオキシリボ核酸）オリゴヌクレオチドの合成のための方法のうちのいずれによって合成してもよい。かかる合成は、とりわけ、Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｉｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９２；４８：２２２３−２３１１、Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｉｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９３；４９：６１２３−６１９４、およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７；１５４：２８７−３１３に記載され、チオエートの合成は、とりわけ、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８５；５４：３６７−４０２に記載され、ＲＮＡ分子の合成は、Ｓｐｒｏａｔ，ｉｎ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ ２００５ ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ Ｐ．；Ｋａｐ．２：１７−３１に記載され、それぞれの後続プロセスは、とりわけ、Ｐｉｎｇｏｕｄ ｅｔ．ａｌ．，ｉｎ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８９ ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｏｌｉｖｅｒ Ｒ．Ｗ．Ａ．；Ｋａｐ ７：１８３−２０８に記載されている。
他の合成手順、例えば、Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５、Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０，ＮＡＲ．，１８，５４３３、Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＮＡＲ．２３，２６７７−２６８４、およびＷｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９が、当時技術分野において公知であり、これらの手順は、５′末端のジメトキシトリチル、および３′末端のホスホラミダイトなど、一般の核酸保護基および結合基を用いてもよい。修飾（例えば、２′−Ｏ−メチル化）ヌクレオチドおよび非修飾ヌクレオチドが、所望により組み込まれる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、別個に合成して、例えば、ライゲーション（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６，９９２３、Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，国際公開第ＷＯ９３／２３５６９号、Ｓｈａｂａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＮＡＲ １９，４２４７、Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ & Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６，９５１、Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．８，２０４）、または合成および／または脱保護後のハイブリダイゼーションにより、合成後に接合することができる。
市販の機械（とりわけ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能）を使用可能であり、オリゴヌクレオチドは、本明細書において開示される配列に従って調製されることに留意されたい。化学的に合成した断片の重複する対は、当技術分野において公知の方法（例えば、米国特許第６，１２１，４２６号を参照）を用いてライゲートすることができる。鎖を別個に合成し、その後管内で互いにアニールする。次いで、二本鎖ｓｉＲＮＡｓをアニールしなかった一本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、それらの一方が過剰であるため）から、例えばＨＰＬＣによって分離する。本発明のｓｉＲＮＡｓ断片またはｓｉＲＮＡ断片に関連して、２個以上のかかる配列を合成し、本発明で使用するために連結させることができる。
また、本発明の化合物は、例えば、米国特許第２００４／００１９００１号（ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ）に記載されているように、タンデム合成方法によって合成することもできるが、このとき両ｓｉＲＮＡ鎖は、切断可能なリンカーで隔てられた単一の隣接オリゴヌクレオチド断片または鎖として合成され、このリンカーがその後切断されて、ハイブリダイズしてｓｉＲＮＡ二重鎖の精製を可能にする、別個のｓｉＲＮＡ断片または鎖が提供される。このリンカーは、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーであってよい。
本発明は、本明細書において言及する疾患および状態のいずれかの治療のための２個以上のｓｉＲＮＡ分子を含む薬学的組成物をさらに提供する。前記２個の分子は、薬学的組成物中に、同等もしくは有利な活性を生じる量で物理的に一緒に混合してもよく、あるいは共有結合または非共有結合しても、または２個〜１００個、好ましくは２個〜５０個もしくは２個〜３０個の範囲のヌクレオチドの長さの核酸リンカーによって一緒に接合されてもよい。一実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、本明細書において記載するような二本鎖核酸構造体からなり、２つのｓｉＲＮＡ配列は、表Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶに示す核酸から選択される。したがって、ｓｉＲＮＡ分子は、共有結合または非共有結合するか、あるいはリンカーで接合されて、タンデムｓｉＲＮＡ化合物を形成する。２つのｓｉＲＮＡ配列を含むかかるタンデムｓｉＲＮＡ化合物は、通常は、３８個〜１５０個のヌクレオチドの長さ、より好ましくは３８個もしくは４０個〜６０個のヌクレオチドの長さであり、２つを上回るｓｉＲＮＡ配列がタンデム分子に含まれる場合、それに応じてより長くなる。細胞内処理によって産生されるｓｉＲＮＡをコードする２つ以上のより長い配列からなるより長いタンデム化合物、例えば、長いｄｓＲＮＡもまた、２つ以上のｓｈＲＮＡをコードするタンデム分子同様想定される。かかるタンデム分子も本開示の一部とみなされる。本明細書において開示される２つ（タンデム）またはそれ以上（「ＲＮＡｓｔａｒ」）のｄｓＲＮＡ配列を含む化合物が想定されている。かかる「タンデム」または「ｓｔａｒ」分子の例は、本願の譲受人に譲渡され、参照によりその全体として本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許公開第ＷＯ２００７／０９１２６９号において提供される。
ＲｈｏＡを標的にするｄｓＲＮＡ分子は、薬学的組成物中の主要な活性成分であっても、または２個以上のｄｓＲＮＡ（または２個以上のｄｓＲＮＡをコードする分子または１つもしくは複数のタンデム分子の混合物であれば、２個以上のｄｓＲＮＡをコードする、もしくは内因的に産生する分子）を含む薬学的組成物の１つの活性成分であってもよく、前記薬学的組成物は、さらに、１つまたは複数の付加的な遺伝子を標的にする１つまたは複数の付加的なｄｓＲＮＡ分子からなる。前記付加的遺伝子の同時阻害は、本明細書において開示される疾患の治療に対する相加効果または相乗効果を有する可能性が高い。
さらに、本明細書において開示されるｄｓＲＮＡ、またはかかるｄｓＲＮＡを含む、またはコードする任意の核酸分子は、本明細書において開示される疾患の治療のための改善された標的化を達成するために、標的細胞上に発現した細胞表面内面化可能分子に対する抗体（アプタマー分子を含む）に連結または結合（共有結合的または非共有結合的に）することもできる。例えば、抗Ｆａｓ抗体（好ましくは、中和抗体）を任意のｄｓＲＮＡと結合（共有結合的または非共有結合的に）させてもよい。別の例において、リガンド／抗体のように作用し得るアプタマーを任意のｄｓＲＮＡと結合（共有結合的または非共有結合的に）させてもよい。
本発明の核酸化合物は、直接送達しても、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターと共に送達してもよい。直接送達する場合、一般に、配列をヌクレアーゼ耐性にする。あるいは、配列は、発現カセットまたは構築物に組み込んで、本明細書において下記で説明するように配列を細胞中に発現させてもよい。一般に、この構築物は、標的細胞中で配列が発現できるように、適切な調節配列またはプロモーターを含む。本発明の化合物の送達のために場合により使用されるベクターは、市販されており、本発明の化合物の送達目的で、当業者に公知の方法で改変してもよい。
化学修飾
ヌクレオチド／オリゴヌクレオチドの全ての類似体または修飾体は、前記類似体または修飾体が、ヌクレオチド／オリゴヌクレオチドの機能に実質的に影響を及ぼさないという条件で、本発明で使用することができる。ヌクレオチドは、天然に生じるまたは合成的に修飾された塩基から選択することができる。天然に生じる塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルが含まれる。ヌクレオチドの修飾された塩基には、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、２−プロピル、および他のアルキルアデニン類、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザシトシンおよび６−アザチミン、擬似ウラシル、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオールアルキルアデニン類、８−ヒドロキシルアデニンおよび他の８置換アデニン類、８−ハログアニン類、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオアルキルグアニン類、８−ヒドロキシルグアニンおよび他の置換グアニン類、他のアザアデニンおよびデアザアデニン類、他のアザグアニンおよびデアザグアニン類、５−トリフルオロメチルウラシル、ならびに５−トリフルオロシトシンが含まれる。いくつかの実施形態において、オリゴマー中の１つまたは複数のヌクレオチドは、イノシンで置換されている。
さらに、１つまたは複数のヌクレオチドの構造が、本質的に変更されており、治療的または実験的試薬としてより適したポリヌクレオチドの類似体を調製することができる。ヌクレオチド類似体の例は、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）中のデオキシリボース（またはリボース）リン酸骨格が、ペプチド中に見られるものに類似するポリアミド骨格に置き換えられているペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ類似体は、酵素分解に対して耐性であり、インビボおよびインビトロにおいて向上した安定性を有することが示されている。オリゴヌクレオチドに行うことができる他の修飾には、ポリマー骨格、環状骨格、非環状骨格、チオホスフェート−Ｄ−リボース骨格、トリエステル骨格、チオエート骨格、２’−５’架橋骨格、人工核酸、モルホリノ核酸、ロックド核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、アラビノシド、およびミラーヌクレオシド（例えば、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシドの代わりにβ−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド）が含まれる。ＬＮＡヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡ化合物の例は、Ｅｌｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，（ＮＡＲ ２００５，３３（１）：４３９−４４７）に開示されている。
本発明の核酸化合物は、１つまたは複数の逆位ヌクレオチド、例えば、逆位チミジンまたは逆位アデニンを用いて合成することができる（例えば、Ｔａｋｅｉ，ｅｔ ａｌ．，２００２，ＪＢＣ ２７７（２６）：２３８００−０６を参照）。
本明細書で使用する「非従来的部分」という用語は、脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、非塩基対合ヌクレオチド類似体、および隣接するヌクレオチドに２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合によって接合したヌクレオチド、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、およびＣ６部分、ＬＮＡおよびエチレン架橋核酸を含む架橋核酸を指す。
本明細書で使用される「キャッピング部分」という用語には、脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、２’Ｏアルキル修飾を含む修飾脱塩基リボースおよび脱塩基デオキシリボース部分；逆位脱塩基リボースおよび脱塩基デオキシリボース部分およびそれらの修飾体；Ｃ６−イミノ−Ｐｉ；Ｌ−ＤＮＡおよびＬ−ＲＮＡを含むミラーヌクレオチド；５’ＯＭｅヌクレオチド；および４′，５′−メチレンヌクレオチドを含むヌクレオチド類似体；１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４′−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；５′−アミノ−アルキルホスフェート；１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート、３−アミノプロピルホスフェート；６−アミノヘキシルホスフェート；１２−アミノドデシルホスフェート；ヒドロキシプロピルホスフェート；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環状３′，４′−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５′−５′−逆位脱塩基部分；１，４−ブタンジオールホスフェート；５′−アミノ；ならびに架橋および非架橋メチルホスホネートおよび５′−メルカプト部分が含まれる。
脱塩基デオキシリボース部分には、例えば、脱塩基デオキシリボース−３’−ホスフェート、１，２−ジデオキシ−Ｄ−リボフラノース−３−ホスフェート、１，４−アンヒドロ−２−デオキシ−Ｄ−リビトール−３−ホスフェートが含まれる。逆位脱塩基デオキシリボース部分には、逆位デオキシリボ脱塩基、３’，５’逆位デオキシリボ脱塩基５’−ホスフェートが含まれる。
「ミラー」ヌクレオチドは、天然に生じるかまたは一般に用いられるヌクレオチドと逆のキラリティーを有するヌクレオチド、即ち、天然に生じる（Ｄ−ヌクレオチド）の鏡像（Ｌ−ヌクレオチド）である。ヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドであってよく、少なくとも１つの糖、塩基、および／または骨格の修飾をさらに含んでもよい。米国特許第６，６０２，８５８号は、少なくとも１つのＬ−ヌクレオチド置換を含む核酸触媒を開示する。ミラーヌクレオチドには、例えば、Ｌ−ＤＮＡ（Ｌ−デオキシリボアデノシン−３’−ホスフェート（ミラーｄＡ）、Ｌ−デオキシリボシチジン−３’−ホスフェート（ミラーｄＣ）、Ｌ−デオキシリボグアノシン−３’−ホスフェート（ミラーｄＧ）、Ｌ−デオキシリボチミジン−３’−ホスフェート（鏡像ｄＴ））およびＬ−ＲＮＡ（Ｌ−リボアデノシン−３’−ホスフェート（ミラーｒＡ）、Ｌ−リボシチジン−３’−ホスフェート（ミラーｒＣ）、Ｌ−リボグアノシン−３’−ホスフェート（ミラーｒＧ）、Ｌ−リボウラシル−３’−ホスフェート（ミラーｄＵ））が含まれる。
構造Ａ１または構造Ａ２の種々の実施形態において、ＺおよびＺ’は不在である。他の実施形態において、ＺまたはＺ’は存在する。いくつかの実施形態において、それぞれのＺおよび／またはＺ’は、独立して、Ｃ２、３、Ｃ４、Ｃ５、またはＣ６アルキル部分、場合により、Ｃ３［プロパン、−（ＣＨ２）３−］部分またはその誘導体、例えばプロパノール（Ｃ３−ＯＨ／Ｃ３ＯＨ）、プロパンジオール、およびプロパンジオールのリン酸ジエステル誘導体（「Ｃ３Ｐｉ」）を含む。好ましい実施形態において、それぞれのＺおよび／またはＺ’は、２つの炭化水素部分を含み、一部の例では、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨまたはＣ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉである。各Ｃ３は、共有結合、好ましくはリンに基づく結合により、隣接するＣ３に共有結合的に共役する。いくつかの実施形態において、リンに基づく結合は、ホスホロチオエート、ホスホノアセテート、またはリン酸ジエステル結合である。
構造Ａ１の具体的な実施形態において、ｘ＝ｙ＝１９であり、Ｚは、少なくとも１つのＣ３アルキルオーバーハングを含む。構造Ａ２の具体的な実施形態において、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｚは、少なくとも１つのＣ３アルキルオーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ３−Ｃ３オーバーハングは、共有結合、好ましくはリン酸ジステル結合によって、（Ｎ）ｘまたは（Ｎ’）ｙの３’末端に共有結合している。いくつかの実施形態において、１番目のＣ３と２番目のＣ３との間の連結は、リン酸ジステル結合である。いくつかの実施形態において、３’非ヌクレオチドオーバーハングは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉである。いくつかの実施形態において、３’非ヌクレオチドオーバーハングは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓである。いくつかの実施形態において、３’非ヌクレオチドオーバーハングは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ（ＯＨはヒドロキシである）である。いくつかの実施形態において、３’非ヌクレオチドオーバーハングは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨである。
種々の実施形態において、アルキル部分は、末端ヒドロキシル、末端アミノ酸基、または末端リン酸基を含む、Ｃ３アルキル部分、Ｃ４アルキル部分、Ｃ５アルキル部分、またはＣ６アルキル部分を含むアルキル誘導体を含む。いくつかの実施形態において、アルキル部分は、Ｃ３アルキルまたはＣ３アルキル誘導体部分である。いくつかの実施形態において、Ｃ３アルキル部分は、プロパノール、プロピルホスフェート、プロピルホスホロチオエート、またはそれらの組み合わせを含む。Ｃ３アルキル部分は、リン酸ジエステル結合により、（Ｎ’）ｙの３’末端および／または（Ｎ）ｘの３’末端に共有結合している。いくつかの実施形態において、アルキル部分は、プロパノール、プロピルホスフェート、プロピルホスホロチオエートを含む。いくつかの実施形態において、それぞれのＺおよびＺ’は、独立して、プロパノール、プロピルホスフェート、プロピルホスホロチオエート、それらの組み合わせ、またはそれらの複数、とりわけ２個もしくは３個の共有結合したプロパノール、プロピルホスフェート、プロピルホスホロチオエートまたはそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、それぞれのＺおよびＺ’は、独立して、プロピルホスフェート、プロピルホスホロチオエート、プロピルホスホ−プロパノール；プロピルホスホ−プロピルホスホロチオエート；プロピルホスホ−プロピルホスフェート；（プロピルホスフェート）３、（プロピルホスフェート）２−プロパノール、（プロピルホスフェート）２−プロピルホスホロチオエートから選択される。いかなるプロパンまたはプロパノール共役部分も、ＺまたはＺ’に含まれてもよい。
例示的な３’末端非ヌクレオチド部分の構造は以下のとおりである。
適応症
本明細書において開示される分子および組成物は、ＣＮＳ、ＰＮＳ、前庭感覚系、視覚系、および／または循環（脈管、動脈）系の疾患および障害、ならびに細胞運動、細胞骨格調節、および微小管構築に関連する疾患および障害、および本明細書に記載する他の疾患および状態の治療の際に有用である。
ＣＮＳ障害および傷害
種々の態様および実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、ＲｈｏＡ遺伝子に関連する疾患、障害、および傷害、例えば、細胞または組織中のＲｈｏＡのレベルに関連するまたはこのレベルに応答する中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患、障害、および傷害を、単独または他の療法と組み合わせて治療するのに有用であり、とりわけＣＮＳの疾患または傷害を患っている、または罹患している、または発症しやすい対象を治療するのに有用である。
神経再生および神経保護に関連する状態
本明細書において開示されるｄｓＲｈｏＡ化合物は、脊髄ニューロンを二次損傷から保護し、機能の回復につながる軸索（神経）再生を促進するために使用することができる。
軸索再生が有益となる多くの適応症がある。軸索消失は、多発性硬化症、脳卒中、外傷性脳傷害、末梢性ニューロパシー、および慢性神経変性疾患などの障害における神経系の症状に寄与する。
中枢神経系（ＣＮＳ）の傷害
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、中枢神経系（ＣＮＳ）の傷害を治療するのに有用であり、とりわけ頭蓋の骨折または穿通（即ち、自動車事故、落下、銃創）に起因する外傷性または非外傷性の脊髄傷害および脳傷害（例えば、外傷性脳傷害（ＴＢＩ））、疾患過程（即ち、神経毒、感染、腫瘍、代謝異常など）、または頭部の急激な加速または減速（即ち、揺さぶられっ子症候群、爆風）、鈍的外傷、脳震盪、および脳震盪症候群の場合などの閉鎖性頭部傷害を含むがこれらに限定されないＣＮＳの傷害を患っている、または罹患している、または発症しやすい対象を治療するのに有用である。
さらに、頭部または背骨への打撃などに起因する中枢神経系への機械的傷害によって、虚血エピソードが生じる可能性がある。外傷は、異物と頭部、頸部、または脊柱の任意の位置または付属物との外傷性接触によって生じ得る、擦過傷、切開、打撲傷、穿刺、圧迫症などの組織侵襲を含み得る。他の形態の外傷性傷害は、体液の不適切な蓄積（例えば、正常な脳脊髄液または硝子体液の産生、代謝回転、または容量調節の遮断もしくは機能障害、あるいは硬膜下のまたは頭蓋内の血腫または浮腫）による、ＣＮＳ組織の狭窄または圧迫から生じ得る。同様に、外傷性の狭窄または圧迫は、多量の異常な組織、例えば転移性腫瘍または原発性腫瘍が存在することから生じ得る。
脊髄傷害（ＳＣＩ）
全米脊髄損傷統計センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｉｎｊｕｒｙ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）によって記載された２００９年４月のＳｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｉｎｊｕｒｙ Ｆａｃｔｓ ａｎｄ Ｆｉｇｕｒｅｓ ａｔ ａ Ｇｌａｎｃｅによると、米国における脊髄損傷（ＳＣＩ）は毎年推定１０，０００〜１２，０００件であり、２５万人以上の米国人が現在脊髄損傷を抱えて生活している。ＳＣＩを患っている人々のうち過半数（５７．５％）は、その損傷時に雇用されていたと報告されている。脊髄損傷患者の治療を管理する費用は年間４０億ドル近いが、これは賃金の損失、付加給付、および生産性などの間接的費用は含まず、この平均は２００８年１２月に年間６４，４４３ドルである。
現在、ＳＣＩの有効な治療は存在せず、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃｕｔｅ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｉｎｊｕｒｙ Ｓｔｕｄｉｅｓ（ＮＡＳＣＩＳ） Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩにより、損傷後８時間以内に２４時間投与される高用量のステロイドメチルプレドニゾロン（ＭＰ）が、現在の標準的治療である。しかしながら、その効果は小さく、賛否が分かれ、カナダなどの多くの国では、ＭＰを標準的治療とすることは中止され、現在は治療の選択肢として分類されているだけである（Ｈｕｇｅｎｈｏｌｔｚ，２００３）。近年、ＳＣＩ後の早期の外科的介入（脊髄除圧術）が有望な結果を示すことを示す研究がなされている。Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｃｕｔｅ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｉｎｊｕｒｙ Ｓｔｕｄｙ（ＳＴＡＳＣＩＳ）によると、初期損傷から１日以内に除圧術を受けた人々のうち２４％は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｐｉｎａｌ Ｉｎｊｕｒｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＳＩＡ）の基準で測定したときに有意な改善を示したが、これらの結果の最終的判断には時期尚早である。今日、２５０件近くのＳＣＩを扱う臨床試験が登録されているが、これらの大部分は、患者のリハビリテーションを扱うものである。したがって、新しい治療法の必要性があり、これはモデル系における新規の治療法の開発、およびその臨床への移行を必要とする。
一実施形態において、ＣＮＳへの損傷は、脊髄損傷（ＳＣＩ）またはミエロパシーである。ＳＣＩまたはミエロパシーは、感覚および／または運動機能の喪失をもたらす、脊髄の障害である。２つの一般的なタイプの脊髄損傷は、外傷および疾患によるものである。外傷性傷害は、とりわけ自動車事故、落下、銃創、とりわけダイビング事故が原因となり、脊髄に影響を与える疾患には、ポリオ、二分脊椎、腫瘍、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、脊髄空洞症、横断性脊髄炎、およびフリードライヒ失調症が含まれる。
種々の実施形態において、本発明の核酸化合物および薬学的組成物は、脊髄損傷に起因する損傷、特に自動車事故、落下、運動中の怪我、労働災害、銃創に起因する脊髄外傷、背骨の衰弱（関節リウマチまたは骨粗しょう症などによる）に起因する、または正常な加齢過程により脊髄を保護する脊柱管が狭くなり過ぎた（脊髄の狭窄）場合の脊髄外傷、脊髄が引っ張られたとき、横向きに押されたとき、または圧迫されたときに生じる直接損傷、出血、体液の蓄積、および脊髄内または脊髄外（であるが脊柱管内）の腫脹後の脊髄への損傷の治療および防止に使用される。
したがって、本発明は、ＳＣＩを治療するのに有効な量で、対象のＣＮＳにおけるＲｈｏＡ発現を下方制御する、治療的有効量の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド化合物を含む薬学的組成物を対象に投与することを含む、治療の必要性がある対象においてＳＣＩを治療する方法をさらに提供する。
脳傷害
一実施形態において、ＣＮＳに対する傷害は脳傷害である。外傷および脳卒中などの脳傷害は、西欧諸国において、死亡および能力障害の主な原因の１つである。外傷性脳傷害（ＴＢＩ）は、現代社会において、入院および能力障害の最も重大な原因の１つである。臨床経験により、ＴＢＩが、傷害後即座に生じる一次損傷と傷害後数日中に生じる二次損傷とに分類できることが示唆されている。現在のＴＢＩの治療法は、手術または外科的治療、あるいは主に対症療法である。
したがって、本発明は、脳傷害を治療するのに有効な量で、対象のＣＮＳにおけるＲｈｏＡ発現を下方制御する、治療的有効量の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド化合物を含む薬学的組成物を対象に投与することを含む、治療の必要性がある対象において脳傷害を治療する方法を提供する。
末梢神経傷害（ＰＮＩ）
ＰＮＩは、運動機能、感覚機能、または双方の損失をもたらし得る。末梢神経傷害は、外傷（例えば、鈍的または鋭的創傷、外傷）または激しい圧迫の結果として生じ得る。伸展に関連する傷害は、最も一般的な形態である。また、ナイフの刃によって生じるものなどの裂傷も一般的である。北米では、外傷患者のおよそ２〜３％が重大な神経傷害を有すると考えられている。遡及的研究によると、四肢外傷の発生率は、医療援助を求める集団のおよそ１．４％であり、８３％は５５歳未満であり、５０％は男性である。上肢または下肢の外傷後９０日以内の神経傷害の合計発生率は、同集団において１．６４％であった。末梢神経傷害は、脱髄または軸索変性をもたらし得る。臨床的に、脱髄および軸索変性の双方は、傷害を受けた神経の感覚機能および／または運動機能の撹乱を生じる。機能の回復は、再ミエリン化により、ならびに感覚受容器、筋終板、またはその双方の軸索再生および再神経支配によって生じる。この回復パターンは、交錯し不完全である。４度〜６度の傷害は、手術を必要とする。神経傷害手術の適応症は、以下のとおりである。
閉鎖性神経傷害：傷害３ヶ月後に、臨床的にも、電気診断検査によっても回復の兆候が見られない。
開放性神経傷害（即ち、裂傷）：可能な限り即座の外科的診査が推奨される。間隔の喪失または運動麻痺が報告される全ての裂傷は、外科的に診査すべきである。
挫滅神経傷害：３ヵ月後、電気的または臨床的に、再神経支配の兆候が見られない場合、修復またはグラフトによる外科的再建が適応される。
周術期神経損傷。神経損傷は、手術中および手術の結果としても生じ得る。周術期神経傷害は、比較的まれであるが、患者に深刻な影響を与える。永久的な傷害は、５０００例中１例発生すると考えられている。神経傷害は、大きな整形外科手術、ならびに膝関節置換術などにより（まれに）生じ得る。膝関節置換術において障害を受ける最も一般的な神経は、足を顔に向かって持ち上げる筋肉への神経（腓骨神経）である。この発生の確率は、おそらく数百分の１である。現在米国において、毎年５５０，０００例を超える関節置換術が実施されており、ほとんどの場合は股関節および膝関節に関し、足関節、肘関節、肩関節、および指関節の全置換はあまり多くない。年間１９３，０００件を超える人口股関節置換術が実施されている。この需要は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｓｕｒｇｅｏｎｓ（ＡＡＯＳ）の７３回目の年次総会で発表されたように、今後２５年間で大幅に増加すると予想されており、２０３０年には米国で３４８万例の股関節および膝関節置換術が実施されると予想されている。
前庭系の疾患および障害
種々の実施形態において、本発明の核酸化合物および薬学的組成物は、ＲｈｏＡの発現が有害である前庭系に影響を及ぼす障害および疾患、例えばメニエール病を治療するのに有用である。ヒトを含むほとんどの哺乳類の前庭感覚系は、バランス、ならびに空間的方向性および安定性の感覚に寄与する。これは蝸牛と共に内耳迷路を構成する。前庭系は、回転運動を知らせる半規管系と、直線加速を知らせる耳石との２つの構成要素を含む。
メニエール病
特発性内リンパ水腫（ＥＬＨ）としても知られるメニエール疾患は、内耳の障害であり、めまいおよび耳鳴り、さらに最終的にはニューロン傷害をもたらし、難聴につながる。メニエール病の正確な原因は解明されていないが、発症機序は、内リンパ液の蓄積による膜迷路の歪みと考えられている。内リンパ液は、主に蝸牛内の血管条によって、また前庭迷路内の半月面および暗細胞によって産生される（Ｓａｊｊａｄｉ Ｈ，Ｐａｐａｒｅｌｌａ ＭＭ．Ｍｅｎｉｅｒｅ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｌａｎｃｅｔ．３７２（９６３６）：４０６−１４）。内リンパ腔から前庭水管を通って内リンパ嚢に至る内リンパ液の流れが妨げられると、内リンパ水腫が発生する。メニエール病は、対象の片耳または両耳に影響を及ぼす可能性がある。メニエール病に関連する主な病的状態は、衰弱性の性質のめまいおよび進行性難聴である。現在の治療法は、ニューロン変性および関連する難聴の進行の防止に成功していない。内耳神経を含む内耳のニューロンを損傷から保護し、または内耳神経の再生を誘導して、それによりメニエール病患者における難聴を軽減もしくは防止する治療的処置が非常に望ましい。
本明細書において提供される核酸、組成物、方法、およびキットは、メニエール病の危険性がある、またはメニエール病を患っている対象の治療の際に有用である。
神経系の障害
種々の実施形態において、本発明の核酸化合物および薬学的組成物は、神経系の障害を治療するのに有用である。
種々の実施形態において、神経系の障害は、脳卒中、脳卒中に類似する状態（例えば、脳不全、腎不全、心不全）、ニューロン死、てんかん、パーキンソニズム、グルテン運動失調、脳虚血、および脳血管発作から選択されるが、これらに限定されない。
てんかん
一実施形態において、神経系の障害はてんかんである。てんかんは、脳の正常機能における問題を特徴とする障害群である。これらの問題は、発作、身体の異常な動き、意識の消失、または意識の変化、ならびに精神的問題または感覚の問題を生じ得る。
したがって、本発明は、てんかんを治療するのに有効な量で、対象のＣＮＳにおけるＲｈｏＡ発現を下方制御する、治療的有効量の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド化合物を含む薬学的組成物を対象に投与することを含む、治療の必要性がある対象においててんかんを治療する方法をさらに提供する。
脳卒中
別の実施形態において、神経系の障害は脳卒中である。脳卒中は、血液供給の中断の結果生じる急性の神経系の傷害であり、脳への損傷をもたらす。ほとんどの脳血管疾患は、局所神経障害の突然の発症として現れる。この傷害は、変化しないままであることもあり、またはこれは改善するか、もしくは次第に悪化することもあり、通常は虚血病巣の中心に不可逆的ニューロン損傷をもたらすこともあるが、ペナンブラにおけるニューロンの機能障害は治療可能および／または可逆的である。長期間の虚血は、明らかな組織壊死をもたらす。その後２〜４日間にわたり、脳浮腫が生じて進行する。梗塞の範囲が広い場合、浮腫は顕著な腫瘍効果をそれに付随する全ての結果を伴って生じ得る。
ニューロン組織への損傷は、重度の能力障害および死につながる可能性がある。損傷の程度は、主として傷害組織の位置と範囲に影響される。急性の傷害に応答して活性化される内因性カスケードは、機能転帰に関与する。損傷を最低限に抑える、限定する、および／または逆転させるための努力は、臨床的帰結を軽減する高い可能性を有する。
したがって、本発明は、脳血管の状態を治療するのに有効な量で、対象のＣＮＳにおけるＲｈｏＡ発現を下方制御する、治療的有効量の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド化合物を含む薬学的組成物を対象に投与することを含む、治療の必要性がある対象において脳血管の状態を治療する方法をさらに提供する。
パーキンソニズム
一実施形態において、神経系の障害は、動作緩慢、筋硬直、振戦、および姿勢動揺を特徴とする運動制御障害を特色とする障害群であるパーキンソニズムである。パーキンソン症候群は、一般に、原発性パーキンソニズム、二次性パーキンソニズム、および遺伝型に分類される。これらの状態は、基底神経節のドーパミン作動性もしくは密接に関連した運動統合ニューロン経路の機能障害に関連する。
したがって、本発明は、パーキンソニズムを治療するのに有効な量で、対象のＣＮＳにおけるＲｈｏＡ発現を下方制御する、治療的有効量の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド化合物を含む薬学的組成物を対象に投与することを含む、治療の必要性がある対象においてパーキンソニズムを治療する方法をさらに提供する。
神経変性疾患
神経変性疾患は、ＣＮＳ（脳および／または脊髄および／または眼）の細胞が消失した状態である。ＣＮＳ細胞は、容易に集団で再生せず、そのため過度の損傷は破壊的となりうる。神経変性疾患は、ニューロンまたはそのミエリン鞘の劣化に起因し、やがて機能障害および能力障害につながる。これらは、おおまかに、表現型の作用により、運動失調などの動作に影響を与える状態、および記憶に影響を与え、認知症に関連する状態の２つの群に分類されるが、これらは相互に排他的ではない。認知症は、記憶、学習、推理、問題解決、および抽象的思考などの知的機能の喪失を特徴とするが、植物性機能は影響を受けない。神経変性疾患の非限定的な例は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルー・ゲーリック病としても知られている）、ハンチントン病、レヴィー小体認知症、およびパーキンソン病である。
別のタイプの神経変性疾患には、ミスフォールドタンパク質またはプリオンに起因する疾患がある。ヒトにおけるプリオン病の非限定的な例は、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）および変異型ＣＪＤ（狂牛病）である。
眼の神経変性疾患の非限定的な例には、黄斑変性、糖尿病性網膜症、網膜色素変性、緑内障、および類似する疾患に罹患した対象における、網膜の光受容体の喪失がある。
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、神経変性疾患および状態を治療するのに有用である。
本発明の薬学的組成物は、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、プリオン病認知症、アルツハイマー病、レヴィー小体認知症、ピック病、血管拡張性運動失調症（ＡＴ）、前頭側頭認知症（ＦＴＤ）、前頭側頭葉型認知症（ＦＴＬＤ）、ハンチントン病、ＨＩＶに関連する認知症、脳卒中後の認知症、または任意の他の疾患に誘発される認知症、および眼の神経変性疾患を含むがこれらに限定されない神経変性障害を患っている、または罹患している、または発症しやすい対象を治療する際にとりわけ有用である。
アルツハイマー病（ＡＤ）
一実施形態において、神経変性障害はアルツハイマー病（ＡＤ）である。ＡＤは、脳の複数の部分における機能の喪失および神経細胞の死を特徴とする進行性神経変性疾患であり、記憶および言語などの認知機能の喪失につながる。
したがって、本発明は、ＡＤを治療するのに有効な量で、対象のＣＮＳにおけるＲｈｏＡ発現を下方制御する、治療的有効量の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド化合物を含む薬学的組成物を対象に投与することを含む、治療の必要性がある対象においてＡＤを治療する方法をさらに提供する。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）
一実施形態において、神経変性障害は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。ＡＬＳは、随意筋の動きを制御する中枢神経系の神経細胞である運動ニューロンの変性に起因する、進行性かつ通常は致命的な神経変性疾患である。この障害は、上位および下位運動ニューロンが変性し、筋肉へのメッセージの送信を停止することで、身体全体の筋肉の衰弱および萎縮をもたらす。筋肉は、機能することができず、次第に衰弱し、脱神経により線維束性収縮（痙攣）を発症し、最終的にその脱神経により萎縮する。ＡＬＳを患っている対象は、最終的には全ての随意運動を開始および制御する能力を喪失し得るが、膀胱および肛門の括約筋、ならびに眼球運動に関与する筋肉は、通常は（常にではないが）影響を逃れる。
したがって、本発明は、ＡＬＳを治療するのに有効な量で、対象のＣＮＳにおけるＲｈｏＡ発現を下方制御する、治療的有効量の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド化合物を含む薬学的組成物を対象に投与することを含む、治療の必要性がある対象においてＡＬＳを治療する方法をさらに提供する。特定の実施形態において、ＲｈｏＡの下方制御は、ＣＮＳに神経保護特性を与える。
パーキンソン病（ＰＤ）
一実施形態において、神経変性障害はパーキンソン病（ＰＤ）である。パーキンソン病は、筋肉振戦、筋硬直、可動性の低下、前屈姿勢、随意運動緩慢、および仮面様顔貌を特徴とする神経系進行性の障害である。
したがって、本発明は、ＰＤを治療するのに有効な量で、対象のＣＮＳにおけるＲｈｏＡ発現を下方制御する、治療的有効量の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド化合物を含む薬学的組成物を対象に投与することを含む、治療の必要性がある対象においてＰＤを治療する方法をさらに提供する。
血管拡張性運動失調症（ＡＴ）
一実施形態において、神経変性障害は血管拡張性運動失調症（ＡＴ）である。ＡＴは、身体の多くの部分に影響を与え、深刻な能力障害をもたらす、まれな神経変性遺伝性疾患である。運動失調とは、微小拡張血管の協調運動不良および毛細血管拡張を指し、これら双方は、この疾患の特徴である。ＡＴは、小脳（身体の運動協調性制御中枢）に影響を与え、また約７０％の例で免疫系を弱体化させて、呼吸障害をもたらし、癌の危険性を高める。
したがって、本発明は、ＡＴを治療するのに有効な量で、対象のＣＮＳにおけるＲｈｏＡ発現を下方制御する、治療的有効量の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド化合物を含む薬学的組成物を対象に投与することを含む、治療の必要性がある対象においてＡＴを治療する方法をさらに提供する。
脳卒中後認知症（ＰＳＤ）
一実施形態において、障害は脳卒中後認知症（ＰＳＤ）である。約２５％の人々が脳卒中後に認知症を有し、他の多くの人々はその後５〜１０年間で認知症を発症する。さらに、多くの個人は、その高次脳機能（計画能力および情報処理速度など）のより軽度の障害を経験し、またその後の認知症発症の極めて高い危険性を有する。この過程における脳の深部の極めて小さい脳卒中（微小血管疾患と称される）は、脳卒中後認知症に特有な脳萎縮の特定されるパターンを導く過程において不可欠であると考えられる。
したがって、本発明は、ＰＳＤを治療するのに有効な量で、対象のＣＮＳにおけるＲｈｏＡ発現を下方制御する、治療的有効量の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド化合物を含む薬学的組成物を対象に投与することを含む、治療の必要性がある対象においてＰＳＤを治療する方法をさらに提供する。
眼神経変性疾患
一実施形態において、神経変性疾患は、眼の神経変性疾患であり、これには黄斑変性、糖尿病性網膜症、網膜色素変性、緑内障、およびその他の眼疾患に罹患した対象における網膜神経節細胞（ＲＧＣ）および／または光受容細胞の消失が含まれるが、これらに限定されない。
したがって、本発明は、眼神経変性疾患を治療するのに有効な量で、対象のＣＮＳにおけるＲｈｏＡ発現を下方制御する、治療的有効量の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド化合物を含む薬学的組成物を対象に投与することを含む、治療の必要性がある対象において眼神経変性疾患を治療する方法をさらに提供する。
神経保護
さらなる実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、ＣＮＳの疾患、障害、もしくは傷害において、神経保護を提供すること、および／または脳保護を提供すること、および／または急性もしくは慢性のニューロン損傷を軽減することを目的としている。
脳血管障害
一実施形態において、神経系の障害は脳血管障害である。脳血管発作は、虚血性または出血性の頭蓋内血管イベントによる、突然の非痙攣性神経系機能喪失である。一般的に、脳血管発作は、脳内の解剖学的位置、血管分布、病因、罹患した個人の年齢、および出血性性質か非出血性性質かによって分類される（さらなる情報については、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ，ｐｐ７７７−８１０を参照）。
脳血管疾患は、中年期および後年期に主に発生する。それらは、米国において毎年およそ２００，０００例の死亡、および多数の神経系障害の原因となっている。脳卒中の発生率は年齢と共に増加して、急速に増加している人口の部分である多くの高齢者に影響を及ぼす。これらの疾患は、虚血性梗塞または頭蓋内出血をもたらす。
眼の虚血状態
虚血性視神経ニューロパシー（ＩＯＮ）には、視神経に虚血を生じる様々な障害が含まれる。定義によると、ＩＯＮは、円板の浮腫が円板に急性的に存在する場合に前部と称され、視神経の眼球に最も近い部分の梗塞を示す。ＩＯＮは後部の場合もあり、眼球の数センチ後部に位置する。虚血性視神経ニューロパシーは、通常は、６０歳を超える人々にのみ発生する。ほとんどの例は、非動脈炎性であり、アテローム性動脈硬化、糖尿病、または視神経灌流圧の上昇に起因する。側頭動脈炎が、症例の約５％の原因である（動脈炎性ＩＯＮ）。
症状および兆候は、突然の部分的または完全な視力の喪失であり、視神経頭の腫脹およびしばしば出血を伴う。視野欠損は、水平境界での視野の半分の喪失として、または中心暗点または盲点（天然の盲点を取り巻く）として現れ得る。視力の低下後すぐに視神経円板の蒼白化が生じる。
前部虚血性視神経ニューロパシー
非動脈炎性前部虚血性視神経ニューロパシー（ＮＡＩＯＮ）は、前部虚血性視神経ニューロパシー（ＡＩＯＮ）の２つの主なタイプのうちの１つであり、視神経への不十分な血液供給が視神経に損傷を与え、視力の喪失をもたらす状態である。ＮＡＩＯＮは、患者の特定の心血管系危険因子と狭い視神経円板との組み合わせが原因となる。もう一方の主なタイプのＡＩＯＮである動脈炎性前部虚血性視神経ニューロパシー（ＡＡＩＯＮ）は、ＮＡＩＯＮを生じる個人よりも一般にやや高齢者において発生する、より発症頻度の低い中型血管の炎症状態である。
この状態の原因の背後にある機序は十分に理解されていないが、神経眼科医は、一般に、２つの問題が相まって原因となるということで同意している。ほとんどの人々において、眼球外壁中の視神経が貫通する穴の直径は、視神経の直径よりも２０〜３０％大きい。ＮＡＩＯＮを発症する傾向がある個人における２つの問題のうちの１つ目は、この２０〜３０％の誤差範囲を有さないことである。２番目の問題は、視神経の前方部分である眼神経円板に血液供給不良または虚血をもたらす心血管系危険因子に関係する。円板は、その結果腫脹し、そこにこのためのスペースがないため、結果として生じる視神経の圧迫が、さらに虚血をもたらす。
これらの心血管系危険因子のうち最も一般的なものには、糖尿病、高血圧、および高コレステロール値がある。これらの危険因子を発症する可能性には、遺伝因子が関わっている。他の遺伝因子がＮＡＩＯＮを発症する可能性に関与していることも証明されている。
様々な態様および実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、ＮＡＩＯＮを治療するのに有用である。
緑内障
緑内障は、世界中で失明の主な原因の１つとなっている。これは世界のおよそ６６８０万人に発生し、毎年少なくとも１２，０００人の米国人が、この疾患により失明している（Ｋａｈｎ ａｎｄ Ｍｉｌｔｏｎ，Ａｍ Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１９８０，１１１（６）：７６９−７６）。緑内障は、米国で失明の２番目に一般的な原因であり、全失明原因の１１％を超える。
緑内障は、高眼圧（ＩＯＰ）、免疫系の妨害、および栄養素の送達の不足による視神経頭における軸索の変性を特徴とする。原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）として知られる最も一般的な形態の緑内障の１つは、小柱網（ＴＭ）における房水流出抵抗の増加に起因し、ＩＯＰ上昇および結果としての視神経損傷をもたらす。
現在、緑内障を対象とする多くの薬物が存在し、点眼剤または軟膏により投与されているが、それら全ては、ＩＯＰの低下のみに集中し、神経網膜の損傷の防止には対処していない。使用可能な薬物のいくつかは、α−２−アドレナリン受容体拮抗薬の場合のように、心拍数の増加、血圧の上昇、頭痛、視界不良、疲労、口渇、および眼内または眼の周りの発赤など、ある程度深刻な副作用を有する。これらの副作用の多くは、薬物への全身暴露のみが原因ではなく、α−アドレナリン受容体小分子拮抗薬の低い特異性にもよる。本願の譲受人は、緑内障の新規の多角的な治療として、ヒトＲｈｏＡ ｍＲＮＡおよびタンパク質の遮断を提案する。
原発性開放隅角緑内障では、眼圧（ＩＯＰ）上昇が、不全な房水排出路の結果として生じ、これは視神経ニューロパシー、その後の進行性網膜神経節細胞（ＲＧＣ）軸索変性、およびＲＧＣアポトーシスに関連する。現在の緑内障治療は、ＩＯＰの低下に焦点を合わせている。しかしながら、ＩＯＰ上昇を伴わないタイプの緑内障もあり、視力喪失は、実際には視神経およびＲＧＣの損傷に起因する。現在、臨床試験において、緑内障患者における神経保護および／または神経再生に対処する薬物はほとんどない。アルツハイマー病に対するＦＤＡの認可を受けた神経保護薬であるＮａｍｅｎｄａ（メマンチン）は、緑内障に対する第ＩＩＩ相臨床試験を最近終了したが、プラセボと比較して緑内障患者において効果を有さないと思われる不本意な結果であった。ＲｈｏＡは、ＲＧＣを含むＣＮＳニューロンにおける運動、成長、分化、およびアポトーシスなどの細胞機能を制御する、低分子ＧＴＰａｓｅタンパク質である。また、ＲｈｏＡは、神経系の免疫細胞（小膠細胞およびマクロファージ）および星状膠細胞におけるシグナル伝達により、二次炎症および瘢痕性のＣＮＳ傷害応答にも関与する。視神経挫滅（ＯＮＣ）傷害は、軸索切断ＲＧＣにおいてＲｈｏＡを活性化させ、これはアポトーシスおよび軸索再生の阻害のシグナルを送る。一方、ｓｉＲｈｏＡおよびＣ３トランスフェラーゼ細胞外酵素を含むＲｈｏＡ拮抗薬による傷害を受けたＲＧＣの治療は、ＲＧＣ生存率およびニューロトロフィンによる軸索再生を有意に向上させる。ＲｈｏＡ活性化が、細胞収縮および細胞外基質産生を調整することにより、眼の小柱網の房水流出に対する抵抗の調節にも関与し、ＩＯＰの上昇をもたらすことが示されている（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２５９：１０５７．２００８）。理論にとらわれるものではないが、緑内障眼におけるＲｈｏＡのシグナル伝達の遮断は、複数の効果により治療的利益を有し得る：（Ａ）房水排出路の恒常性の補正、（Ｂ）ＲＧＣアポトーシスシグナル伝達の遮断、および（Ｃ）ＲＧＣ軸索再生の促進。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるｄｓＲＮＡ分子、組成物、方法、およびキットは、緑内障の危険性がある、または緑内障を患っている対象の治療の際に有用である。理論にとらわれるものではないが、本明細書において提供される治療用ｄｓＲｈｏＡ分子は、複数の機序によって緑内障を治療し、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）神経保護、ＲＧＣ軸索再生の促進、および眼圧（ＩＯＰ）の低下をもたらすと考えられている。
ニューロパシー
自律神経ニューロパシー
自律神経ニューロパシーは、血圧、心拍数、排便および排尿、および消化などの日常的な身体機能を管理する神経に損傷がある場合に生じる症状群である。
自律神経系は、心臓、胃腸管、および泌尿系に関わる神経からなる。自律神経ニューロパシーは、これらの器官系のいずれにも影響を与え得る。糖尿病患者において最も一般に認識されている自律神経機能障害は、患者が立ち上がったときの起立性低血圧または不快な失神感である。糖尿病性自律神経ニューロパシーの場合、心臓および動脈が、心拍数および血管緊張を適切に調節して、血液が脳内に連続的および十分に流れるよう維持できないことにより生じる。この症状は、通常は、洞性呼吸性変動、すなわち正常呼吸で認められる心拍数の通常の変化の喪失を伴う。これら２つの所見が認められる場合、心臓自律神経ニューロパシーが存在する。
胃腸管の症状には、胃排出遅延、胃不全麻痺、吐き気、鼓腸、下痢などがある。多くの糖尿病患者は糖尿病に対する経口薬を服用するため、このような薬剤の吸収が、胃排出遅延により大きく影響される。これは、血糖値が正常または既に低いときに、経口糖尿病薬を食前に服用し、数時間または場合により数日後まで吸収されない場合、低血糖をもたらし得る。小腸の緩慢な活動は、細菌の過剰増殖を生じ得、これは高血糖の存在により悪化する。これは鼓脹、ガス発生、および下痢の原因となる。
泌尿器の症状には、頻尿、尿意切迫、失禁、および残尿が含まれる。この場合も、糖尿が残留するため尿路感染症が頻発する。残尿は膀胱憩室症、結石、逆流性腎症などの原因となり得る。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される核酸、組成物、方法、およびキットは、自律神経ニューロパシーの危険性がある、または自律神経ニューロパシーを患っている対象の治療の際に有用である。
脳ニューロパシー
脳神経が影響を受ける場合は、動眼神経（第３脳神経）ニューロパシーが最も一般的である。動眼神経は、外側直筋および上斜筋を除く、眼球を動かす全ての筋肉を制御する。これはまた、瞳孔を収縮し眼瞼を開く役割も果たす。糖尿病性第３脳神経麻痺の発症は通常は突然であり、前頭痛または眼窩周囲痛から始まり、次いで複視を生じる。瞳孔サイズを制御する筋肉を除き、第３脳神経により神経支配される動眼筋の全てが影響を受け得る。眼の外側直筋（眼球を横方向に動かす）を神経支配する第６脳神経である外転神経もよく影響を受けるが、（眼球を下方向に動かす上斜筋を神経支配する）第４脳神経である滑車神経の関与はまれである。胸部神経または腰椎神経の単ニューロパシーが生じ、心筋梗塞、胆嚢炎、または虫垂炎に似た疼痛症候群の原因となることもある。糖尿病患者では、手根管症候群などの絞扼性ニューロパシーの発症率が高い。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される核酸、組成物、方法、およびキットは、脳ニューロパシーの危険性がある、または脳ニューロパシーを患っている対象の治療の際に有用である。
癌性ニューロパシー
末梢性ニューロパシーは、最も一般的な癌の合併症の１つである。癌患者における末梢神経系機能障害の鑑別診断は、広範であり、腫瘍による直接神経圧迫または浸潤、癌治療の神経毒性、栄養欠乏、および傍腫瘍性障害を含む。末梢性ニューロパシーを示すが、既知の癌の診断を受けていない患者において、ニューロパシーが以前に診断されなかった新生物の間接的影響である可能性を考慮することは重要である。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるｄｓＲＮＡ分子、組成物、方法、およびキットは、癌性ニューロパシーの危険性がある、または癌性ニューロパシーを患っている対象の治療の際に有用である。
圧迫性ニューロパシー
絞扼性ニューロパシー：絞扼性ニューロパシーという用語は、神経が、線維性もしくは線維骨性トンネル内で機械的に収縮している、または線維帯によって変形している、特定の位置に発生する孤立性の末梢神経傷害を指す。いくつかの例では、神経は慢性的な直接圧迫によって傷害を受け、別の例では、角形成および伸展力が神経に機械的な損傷をもたらす。線維骨性トンネルにおける神経圧迫の一般的な例は、手根管症候群および肘部管の尺骨ニューロパシーである。角形成および伸展傷害は、肘関節の大奇形および神経性胸郭出口症候群に関連する尺骨ニューロパシーにおける神経傷害（「遅延性尺骨神経麻痺」）の重要な機序である。外部からの力による反復する神経圧迫は、肘の尺骨ニューロパシー、および手の尺骨神経深枝の病変など、局所神経傷害の原因ともなり得る。後者のニューロパシーは、「絞扼性ニューロパシー」の厳格な定義は満たさないが、しばしばこの題材を検討する際に考慮される。これら全ての孤立性ニューロパシーの病理学的特徴には、局所脱髄およびウォラー軸索変性の様々な組み合わせが含まれる。
様々な態様および実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、圧迫性ニューロパシーおよび／または絞扼性ニューロパシーを治療するのに有用である。
糖尿病性ニューロパシー
糖尿病性ニューロパシーは、糖尿病の一般的な合併症であり、高血糖値（高血糖症）により神経が損傷を受ける。糖尿病性ニューロパシーは、Ｉ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病の双方において発症する。
糖尿病を有する人々は、一般に神経組織に一時的または永久的な損傷を生じる。神経傷害は、血流の減少および高血糖値が原因となり、血糖値が良好に制御されていない場合に発症する可能性が高い。平均的に、症状は糖尿病診断の１０〜２０年後に始まる。糖尿病を有する人々のおよそ５０％は、最終的に神経損傷を生じる。抹消神経傷害は、頭蓋内の神経（脳神経）または脊柱からの神経およびその分枝に影響を及ぼす可能性がある。このタイプの神経傷害（ニューロパシー）は、段階的に発症する傾向がある。自律神経ニューロパシーは、心筋および平滑筋を含む生体機能を調節する神経に影響を及ぼす。
糖尿病性ニューロパシーにおける微小血管疾患
血管疾患および神経疾患は、密接に関連し、結び付いている。血管は正常な神経機能に依存し、神経は十分な血流に依存している。微小血管系における最初の病理学的変化は血管狭窄である。疾患の進行に伴い、ニューロン機能障害は、酸素圧低下および低酸素の一因となる、毛細血管基底膜の肥厚化および内皮の過形成などの血管異常の発生と密接に相関する。ニューロン虚血は、糖尿病性ニューロパシーの確立された特徴である。血管拡張剤（例えば、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、アルファ１−拮抗薬）は、ニューロンの血流の実質的な改善、それに対応して神経伝導速度の改善をもたらし得る。したがって、微小血管の機能障害は、神経の機能障害の進行と並行して糖尿病の初期に生じ、糖尿病性ニューロパシーにおいて観察される構造的、機能的、および臨床的変化の重症度に寄与するのに十分であり得る。末梢性ニューロパシー（脚）、感覚運動ニューロパシーは、糖尿病における下腿潰瘍の病理の重要な要素である。
神経伝導研究は、ニューロパシーが糖尿病診断時に患者の１０〜１８％で既に存在することを実証しており、このことは末梢神経傷害が疾患の初期段階で軽度の血糖調節異常と共に発生することを示している。ニューロパシーが糖尿病の初期の臨床的徴候であるという概念は、４０年以上前に提示されており、大部分の研究は、ＩＧＴとニューロパシーとの間の関連性を報告している。ＩＧＴおよび付随するニューロパシーを有する患者のほとんどは、顕著なニューロパシー性疼痛を伴う対称性遠位性多発ニューロパシーを有する。ＩＧＴニューロパシー（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ−Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ，Ｊ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｉｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １，２００３）は、表現型としては、初期の糖尿病性ニューロパシーと類似し、これも疼痛を含む感覚症状および自律神経機能傷害の原因となる。初期糖尿病性ニューロパシー患者６６９例の調査において、感覚症状は６０％を超え、不能症はほぼ４０％であり、他の自律神経の障害は３３％であったが、運動障害の証拠はわずか１２％のみであった。これらの臨床所見は、疼痛シグナル、温度シグナル、および自律神経シグナルを伝える小無髄神経線維の顕著な初期障害を示している。皮膚生検からの無髄表皮内神経線維の直接的定量化は、ＩＧＴおよび初期糖尿病に関連するニューロパシーを有する患者における類似の線維喪失および形態変化を示している。
自律神経機能傷害、特に勃起不全および心臓迷走神経反射の変化は、糖尿病におけるニューロパシー性損傷に一般的な初期の特徴である。ＩＧＴ患者の研究は、一般的な迷走神経性自律神経障害も示唆しており、別の研究は、同年齢の血糖正常対照被験者よりも高い比率のＩＧＴ患者において、運動後の異常な心拍数回復、深呼吸時のＲ−Ｒ間隔変動の鈍化、および呼気対吸気比の減少（全て迷走神経性自律神経障害の基準）が認められた。
糖尿病における神経損傷は、運動、感覚、および自律神経線維に影響を与える。運動性ニューロパシーは、筋肉の衰弱、萎縮、および不全麻痺の原因となる。感覚性ニューロパシーは、痛み、圧力、および熱に対する防御感覚の消失につながる。痛みの不在は、無感覚な足において、潰瘍化、認知されない外傷、およびシャルコー神経性関節症を含む多くの問題を招く。患者は、創傷が進行してしまうまで治療を求めない可能性がある。感覚機能障害および運動機能障害の併発により、患者が足に異常な応力を付与する可能性があり、その結果外傷を生じ、これが感染につながる可能性がある。自律神経系交感神経ニューロパシーは、血管拡張および発汗減少の原因となり、これは特に皮膚の破壊および微小血管の流れの機能的変化を生じやすい、高温で過度に乾燥した足の原因となる。また、自律神経機能傷害（および皮膚構造の脱神経）は、皮膚の完全性の喪失につながり、これは微生物の侵入に理想的な部位を提供する。ニューロパシー性の足は自発的には潰瘍化せず、むしろそれはニューロパシーに付随する一部の形態の外傷の組み合わせである。
微小血管の機能障害は、神経の機能障害の進行と並行して糖尿病の初期に生じ、糖尿病性ニューロパシーにおいて観察される構造的、機能的、および臨床的変化の重症度に寄与するのに十分であり得る。
様々な態様および実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、糖尿病性ニューロパシーを治療するのに有用である。
薬剤性ニューロパシーおよび中毒性ニューロパシー
日常的な臨床診療において直面する中毒性ニューロパシーのほとんどは、医原性薬剤中毒に起因し、巨大製薬会社などの集団職業性被爆はまれである。過半数であり、残念ながら最も困難な中毒性ニューロパシーの症例は、小規模かつしばしば偶然の職業性被爆による、または故意および殺人での摂取による個人の中毒である。
特発性多発ニューロパシーは、末梢性ニューロパシーの症例の有意な割合を占める。さらに、ニューロパシーの多数の特定可能な原因は、利用できる予防的もしくは治療的介入を有さず、対症療法のみである。したがって、中毒性または薬物性ニューロパシーの検出は、生活の質に影響する重要な診断となり得る。薬物性ニューロパシーは、珍しいが（１人の外来患者の神経学的環境における症例の２〜４％）、介入が有意な改善または症状の回復をもたらし得ることから、認識することは極めて重要である。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるｄｓＲＮＡ分子、組成物、方法、およびキットは、中毒性ニューロパシーの危険性がある、または中毒性ニューロパシーを患っている対象の治療の際に有用である。いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるｄｓＲＮＡ分子、組成物、方法、およびキットは、薬剤性ニューロパシーの危険性がある、または薬剤性ニューロパシーを患っている対象の治療の際に有用である。
化学療法誘発性ニューロパシー
薬剤性または中毒性ニューロパシー、および癌性ニューロパシーともみなし得る化学療法誘発性ニューロパシーは、ある特定の癌治療のための化学療法に使用される化学物質が末梢神経を損傷または破壊するときに生じる。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるｄｓＲＮＡ分子、組成物、方法、およびキットは、化学療法性ニューロパシーの危険性がある、または化学療法性ニューロパシーを患っている対象の治療の際に有用である。
胃腸ニューロパシーおよび栄養性ニューロパシー
胃腸系に関連するニューロパシーは、栄養欠乏に起因するものとして最も一般的に認識されている。このような欠乏は、栄養不良（例えば、アルコール依存症）、または身体的変化（例えば、外科的切除／バイパス）の結果としての吸収面の減少、または腸壁への浸潤（例えば、クローン病）によるものであり得る。免疫介在性機序は、現在複数の全身症状（例えば、セリアック病、炎症性腸疾患）を有すると認識される一部の胃腸状態において、ニューロパシーの発現に関与している疑いがある。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるｄｓＲＮＡ分子、組成物、方法、およびキットは、胃腸ニューロパシーの危険性がある、または胃腸ニューロパシーを患っている対象の治療の際に有用である。いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるｄｓＲＮＡ分子、組成物、方法、およびキットは、栄養性ニューロパシーの危険性がある、または栄養性ニューロパシーを患っている対象の治療の際に有用である。
遺伝性ニューロパシー
シャルコー・マリー・ツース病
シャルコー・マリー・ツース病（ＣＭＴ）とは、遺伝性末梢性ニューロパシーを指し、その名は１８００年代後半にそれらについて記載した３人の研究者に由来する。２５００人中およそ１人がＣＭＴ病に冒されることから、これは最も一般的な遺伝性の神経系障害のうちの１つである。ＣＭＴ患者の大半は、常染色体優性遺伝を有するが、Ｘ連鎖優性であり、常染色体劣性型も存在する。優性遺伝性障害であっても所定の患者における新突然変異として開始する可能性があることから、散発例と思われるものも発生する。症例の大半は脱髄性であるが、最大３分の１は、原発性軸索またはニューロン障害であると考えられる。ほとんどの患者は、遠位部の衰弱、感覚喪失、足奇形（凹足および槌趾）、および無反射を特徴とする、「典型的な」ＣＭＴ表現型を有する。しかしながら、一部の患者は、幼児期に重度の能力障害を発症し（デジェリン・ソッタス病または先天性ミエリン形成不全症）、他の患者は、疾患の症状を（もしあるとしても）ほとんど発症しない。
様々な態様および実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、遺伝性ニューロパシーを治療するのに有用である。様々な態様および実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、シャルコー・マリー・ツース病を治療するのに有用である。
免疫介在性ニューロパシーおよび慢性免疫介在性ニューロパシー
自己免疫機序が、免疫療法に適したいくつかのニューロパシー症候群に関係している。全体として、このようなニューロパシーは比較的一般的である（Ｂａｒｏｈｎ ｅｔ ａｌ（１９９８）およびＶｅｒｇｈｅｓｅ ｅｔ ａｌ（２００１））。しかしながら、実際には、自己免疫性ニューロパシーの多くは、一般に認められた臨床診断基準がないため、または信頼できる血清検査の使用可能性により、診断が難しい。その結果、自己免疫性ニューロパシーを有する多くの患者は、その代わりに「特発性ニューロパシー」を有すると診断され、その疾患の進行にもかかわらず、治療されないままとなる。
慢性自己免疫性ニューロパシーは、免疫介在性の末梢神経損傷に起因する多様な症候群の群である。このような障害の多くには確定的な診断試験がなく、対照治験がほぼまたは全くなされていない。その結果、診断が見逃され、患者は治療されないままとなる。
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、免疫介在性ニューロパシーを治療するのに有用である。様々な態様および実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、慢性免疫介在性多発ニューロパシーを治療するのに有用である。
感染性ニューロパシー
感染性ニューロパシーの非限定的な例には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染に関連するニューロパシー、ライム病性ニューロパシー、ハンセン病に関連するニューロパシー、帯状ヘルペスニューロパシー（帯状疱疹およびヘルペス後神経痛）、Ｃ型肝炎ニューロパシー、単純ヘルペス神経炎、ジフテリア性神経炎、およびシャーガス病がある。
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、感染性ニューロパシーを治療するのに有用である。一実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染に関連するニューロパシーを治療するのに有用である。一実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、ライム病性ニューロパシーを治療するのに有用である。一実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、ハンセン病に関連するニューロパシーを治療するのに有用である。一実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、帯状ヘルペスニューロパシーを治療するのに有用である。一実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、Ｃ型肝炎ニューロパシーを治療するのに有用である。一実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、単純ヘルペス神経炎を治療するのに有用である。一実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、ジフテリア性神経炎を治療するのに有用である。一実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、シャーガス病を治療するのに有用である。
ニューロパシー性疼痛（ＮＰ）
国際疼痛学会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｐａｉｎ：ＩＡＳＰ）は、ＮＰを「末梢神経系または中枢神経系の疾患または損傷、および神経系の機能障害に起因する疼痛」と定義している。
疼痛は、例えば、機械的な脊椎痛と神経根障害またはミエロパシーなど、侵害受容型およびニューロパシー型がしばしば混在する。侵害受容性脊椎痛が、根分布と似て広範囲に広がる可能性があることは、一般に認識されていない。優性疼痛型を特定して適切に治療することは、困難となり得る。このような患者は、慎重な検査、画像化、および神経生理学的検証を要する。
ＮＰに関与する病態生理学的特性は、概して５つの群に分類される：損傷を受けた一次求心性線維における異所性刺激の発生、線維の相互作用、中枢性感作、脱阻害（正常な阻害機構の不良または低下）、および可塑性（結合性の変化を伴う変性性および再生性の変化）。
疼痛は、神経系の疾患のよくある症状であり、治療におけるある程度の進歩は見られるものの、疼痛はしばしば全ての治療法に依然として応答しない。ニューロパシー性疼痛に関する概説については、例えば、Ｓｃａｄｄｉｎｇ Ｊ．ＡＣＮＲ，ｖ．３ ｎ．２ ＭＡＹ／ＪＵＮＥ ２００３，ｐａｇｅｓ ８−１４を参照されたい。ニューロパシー性疼痛は、末梢神経の癌の直接的な結果として（例えば、腫瘍による圧迫）、また多くの化学療法薬の副作用として、癌においてよく見られる。
アロディニア
文字通りには「別の力」を意味するアロディニアは、通常は痛みを誘発しない熱的または機械的な刺激による疼痛である。アロディニアは、ニューロパシー、複合性局所疼痛症候群、ヘルペス後神経痛、線維筋痛、および片頭痛などの多くの疼痛状態の臨床的特徴である。また、アロディニアは、脊髄傷害を含む神経損傷の治療に使用される幹細胞の一部の集団にも起因し得る。
アロディニアには様々な種類またはタイプがあり、これには、機械的アロディニア（接触性アロディニアとしても知られている）、静的機械的アロディニア（軽い接触／圧迫に応答した疼痛）、動的機械的アロディニア（軽擦に応答した疼痛）、熱（温または冷）アロディニア（患部における通常は温和な皮膚温度による疼痛）が含まれる。
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、ニューロパシー性疼痛を治療するのに有用である。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、アロディニアを治療するのに有用である。
感覚運動ニューロパシー
長い神経線維は、神経伝導速度が神経の長さに比例して遅くなるため、短い神経線維よりも高い程度で影響を受ける。この症候群では、感覚の低下および反射の喪失がまず足指に左右対称に生じ、次いで上方に広がる。これは、通常、痺れ、感覚喪失、感覚異常、およびの夜間の疼痛の手袋・靴下型分布と説明される。この疼痛は、灼熱痛、刺すような感覚、うずき、または鈍痛のように感じることがある。チクチクする感覚は一般的である。固有受容感覚、即ち肢が空間のどこにあるかの感覚の喪失は、初期に影響を受ける。これらの患者は、破片などの異物を踏んだとき、または合わない靴によりたこを生じたときに感じることができない。その結果、これらの患者は、足および脚に潰瘍および感染症を発症する危険性があり、これは切断につながる可能性がある。同様に、これらの患者は、膝、足首、または足の多発性骨折を起こし、シャルコー関節を発症する可能性がある。運動機能の喪失は、足指の背屈拘縮、いわゆる槌趾を引き起こす。このような拘縮は足だけでなく手でも起こる。
いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、感覚運動多発ニューロパシーを治療するのに有用である。
細胞骨格調節
細胞運動、細胞骨格調節、微小管構築
ＲｈｏファミリーＧＴＰａｓｅｓは、表面受容体をアクチン細胞骨格の構築に関連付け、基本的な細胞過程において重要な役割を果たす調節分子である。ＲｈｏＡは、アクチンを重合させ、微小管の形成に影響を与える機能を果たす足場特性を有する。アクチンは、Ｒｈｏファミリーの低分子ＧＴＰａｓｅによって調節される。遊走性細胞は、特有のアクチン細胞骨格の分極を示す。アクチンフィラメントは、細胞の突起した前部で重合するが、アクチンフィラメント束は、細胞体内で収縮し、これは細胞の後部の退縮をもたらす。アクチン細胞骨格は、細胞遊走の駆動力を提供する。最近の研究は、Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅは、アクチン細胞骨格を構築することに加え、微小管の構築および動力にも影響を与え得ることを示唆している。
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、細胞運動、細胞骨格調節、微小管構築に関連する障害または疾患の防止または治療に有用である。
血管新生、血管疾患、動脈疾患
既存の血管からの新しい血管の形成である血管新生は、複雑な多段階過程である。これは、血管内皮細胞の血管新生成長因子受容体の刺激、内皮細胞の基底膜のタンパク質分解性分解、内皮細胞増殖および遊走、周囲の細胞外基質の分解、血管成熟化、支持細胞（例えば、周皮細胞）の動員、および最後に新しく形成された動静脈ループの閉鎖を含む（Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ．１９７１．Ｔｕｍｏｕｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ＮＥＪＭ ２８５：１１８２‐１１８５；Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ ＧＤ ｅｔ ａｌ．２０００．Ｖａｓｃｕｌａｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ４０７：２４２‐２４８；Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ Ｐ．２００３．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ９：６５３‐６６０）。これらの各段階は、刺激分子（血管新生因子）および阻害分子（血管新生阻害因子）の双方の活性によって厳密に調節される（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ Ｐ & Ｊａｉｎ ＪＫ．２０００．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４０７：２４９‐２５７）。正常な状態において、血管新生阻害因子の活性が優性であるため、血管は休止している。血管新生因子を活性化させる低酸素または炎症などの特定の条件下では、このバランスは血管新生を支持するよう移行するが、この事象は「血管新生スイッチ」と称される。
血管新生の抑制は、例えば、増殖性網膜症に関連する失明を防止するため、および腫瘍成長を制限するためなど、種々の病的状態の治療として望ましい。研究により、内皮細胞の集合の調節におけるＲｈｏ活性の臨床的役割および選択的役割が特定され、Ｒｈｏ活性の抑制が新血管形成の組織化段階を抑制するための戦略として特定される。
血管系において、Ｒｈｏシグナル伝達経路は、内皮バリア機能、炎症および白血球経内皮遊走、血小板活性化、血栓および酸化ストレス、ならびに平滑筋の収縮、遊走、増殖、および分化の調節に密接に関与し、したがってアテローム発生に関連する変化の多くに関わっている。実際に、スタチンの有益な非脂質低下作用の多くは、Ｒｈｏタンパク質活性化を阻害するそれらの能力の結果として生じると考えられている（例えば、Ｈｏａｎｇ ＭＶ ｅｔ ａｌ．Ｒｈｏ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ．２００４ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １７；１０１（７）：１８７４‐１８７９、Ｒｏｌｆｅ ＢＥ ｅｔ ａｌ．Ｒｈｏ ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．２００５ ２００５ Ｎｏｖ；１８３（１）：１−１６を参照）。
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、血管新生の抑制に有用である。種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、血管疾患を治療するのに有用である。
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、動脈疾患を治療するのに有用である。
眼血管新生−角膜、網膜、脈絡膜
既存の血管樹からの新しい血管の形成である眼血管新生は、重度の視力喪失の主要な原因である。これは、網膜、脈絡膜、および角膜を含む眼の様々な構造体に影響を与え得る。
通常は増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞、または未熟児網膜症で見られる網膜血管新生は、網膜の虚血または低酸素に対する異常な血管応答の結果である。網膜血管新生において、網膜血管内皮細胞は内境界膜を通って硝子体内へと増殖を開始し、ここで硝子体出血または牽引性網膜剥離を引き起こす可能性がある。
脈絡膜（網膜下）血管新生。新生血管型の加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）では、脈絡膜血管が変性ブルッフ膜を通って網膜下腔内に成長し、網膜下滲出および出血を生じる（Ａｍｂａｔｉ Ｊ ｅｔ ａｌ．２００３．Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ａｅｔｉｏｌｏｇｙ，ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｓｕｒｖ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ４８：２５７‐２９３）。この脈絡膜の血管新生応答を引き起こす初期刺激は、未だに論議されている。局所炎症が血管の内方成長を誘発するモデルが、現在最も優位である（Ｔｅｚｅｌ ＴＨ ｅｔ ａｌ．２００４．Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ １０：４１７‐４２０）。
角膜血管新生。角膜の新血管形成は、その透明性を損ない、重度の視力障害につながる（Ｃｈａｎｇ ＪＨ ｅｔ ａｌ．２００１．Ｃｏｒｎｅａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １２：２４２‐２４９）。これは、慢性低酸素または種々の炎症性刺激、例えば感染性角膜炎、アルカリによる熱傷、および移植片拒絶反応に応答して見られる、一般的な臨床的問題である。角膜血管新生は輪部血管から現れ、したがって眼表面の障害は表層の新血管形成を生じやすくし、一方間質性角膜炎は、血管の深い浸潤を引き起こす。
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、網膜血管新生に関連する疾患、障害、または傷害の防止または治療に有用である。
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、脈絡膜（網膜下）血管新生に関連する疾患、障害、または傷害の防止または治療に有用である。
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、角膜血管新生に関連する疾患、障害、または傷害の防止または治療に有用である。
黄斑変性
米国で６５歳を超える個人における最良矯正視力の低下の最も一般的な原因は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）として知られる網膜障害である。ＡＭＤが進行すると、この疾患は鮮明な中心視の喪失を特徴とする。ＡＭＤの影響を受ける眼の部分は、光受容細胞から主に構成される網膜中心の小さな部分である黄斑である。ＡＭＤ患者の約８５％〜９０％を占める、いわゆる「萎縮型」ＡＭＤは、眼の色素分布の変化、光受容体の喪失、および細胞の全体的な萎縮による網膜機能の低下を伴う。いわゆる「滲出型」ＡＭＤは、網膜下領域における血栓および瘢痕をもたらす異常な脈絡膜血管の増殖を伴う。したがって、滲出型ＡＭＤの発症は、神経網膜下での異常な脈絡膜新生血管網の形成（脈絡膜新生血管形成、ＣＮＶ）によって生じる。新しく形成された血管は過剰に漏出する。これは網膜下の体液および血液の蓄積をもたらし、視力の喪失につながる。最終的に、脈絡膜および網膜を冒す大きな円板状瘢痕が形成されると、罹患領域において機能的な網膜が完全に喪失する。萎縮型ＡＭＤ患者は、質の低下した視力を維持し得る一方、滲出型ＡＭＤはしばしば失明に至る（Ｈａｍｄｉ & Ｋｅｎｎｅｙ，Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ Ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ‐ａ ｎｅｗ ｖｉｅｗｐｏｉｎｔ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｅ３０５−３１４，Ｍａｙ ２００３）。ＣＮＶは、滲出型ＡＭＤにおいてだけでなく、他の眼の病変、例えば眼ヒストプラスマ症候群、網膜色素線条症、ブルッフ膜破裂、近視性変性、眼の腫瘍、および一部の網膜変性疾患においても生じる。
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、網膜変性疾患を治療するのに有用である。種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）を治療するのに有用である。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、滲出型加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）を治療するのに有用である。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、萎縮型加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）を治療するのに有用である。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、眼ヒストプラスマ症候群を治療するのに有用である。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、網膜色素線条症を治療するのに有用である。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、ブルッフ膜破裂を治療するのに有用である。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、近視性変性を治療するのに有用である。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、眼の腫瘍を治療するのに有用である。
微小血管障害
微小血管障害は、微小毛細血管およびリンパ管に主に影響し、したがって直接的な外科的介入の範囲外である、幅広い状態の群から構成される。微小血管疾患は、概して、血管攣縮性疾患、脈管炎、およびリンパ管閉塞に分類できる。さらに、公知の血管状態の多くは、微小血管的要素を有する。
血管攣縮性疾患
血管痙攣疾患は、未知の理由で末梢の血管収縮反射が過敏になる比較的状態の群である。これは不適切な血管収縮と組織虚血を生じ、組織喪失にさえ至る。血管攣縮性症状は、通常は温度または振動機械の使用に関連するが、他の状態から続発する場合もある。
脈管炎疾患
脈管炎疾患は、微小循環における一次炎症過程を伴う疾患である。脈管炎は、通常は、自己免疫障害または結合組織障害の一要素であり、一般的に外科的治療に適さないが、症状が重篤な場合は免疫抑制治療が必要となる。
リンパ管閉塞疾患
下肢または上肢の慢性腫脹（リンパ浮腫）は、末梢リンパ管閉塞の結果である。これは比較的まれな状態であり、多数の原因を有するが、その一部は遺伝的なものであり、一部は後天的なものである。治療の中心となるのは、正確に適合させた圧迫帯および間欠的圧迫装置の使用である。
糖尿病に関連する微小血管病変
糖尿病は、失明の主な原因であり、切断および不能症の最大の原因であり、また最
も頻繁に発症する慢性小児疾患の一つである。糖尿病は米国における末期腎疾患の主な原因でもあり、他の腎疾患と比較して、その有病率は３１％である。また、糖尿病は、腎臓移植の最も頻度の高い適応症であり、全移植手術の２２％を占める。
一般的に、糖尿病合併症は微小血管疾患または大血管疾患に大きく分類することができる。微小血管合併症には、ニューロパシー（神経損傷）、ネフロパシー（腎疾患）、および視力障害（例えば、網膜症、緑内障、白内障、および角膜疾患）が含まれる。網膜、糸球体、および神経脈管においても、類似する病態生理学的特徴が、糖尿病特異的な微小血管疾患を特徴付ける。糖尿病に関連する微小血管病変は、例えば長期にわたり糖尿病を有した人々に生じ得る、最も小さい血管（毛細血管）の疾患と定義される。血管壁は、異常に肥厚するが、脆弱になる。そのため、毛細血管は出血し、タンパク質を漏出させ、体内の血流を緩慢にする。
臨床および動物モデルのデータは、慢性高血糖が、全てのタイプの糖尿病性微小血管障害の中心的な誘発因子であることを示唆している。高血糖の持続期間と規模は、双方とも糖尿病性微小血管疾患の程度および進行速度に強く相関する。全ての糖尿病細胞は高血漿グルコース値に暴露されるが、高血糖による損傷は細胞内高血糖を生じる細胞型（例えば、内皮細胞）に限定される。内皮細胞は、細胞内高血糖を生じるが、これは内皮細胞が他の細胞と違って、細胞外高血糖に暴露されたときに、グルコース輸送を下方制御することができないためである。
異常な内皮細胞機能：真性糖尿病過程の初期、構造的な変化が明らかになる前に、高血糖により、網膜、糸球体、および末梢神経の神経脈管において血流および血管透過性の異常が生じる。この血流および毛細血管内圧の増加は、毛細血管床の輸出側における高血糖誘発性の一酸化窒素（ＮＯ）産生の減少、またおそらくはアンジオテンシンＩＩに対する感受性の増加を反映すると考えられる。毛細血管内圧の増加および内皮細胞機能障害の結果として、網膜毛細血管はフルオレセインの漏出の増加を示し、糸球体毛細血管はアルブミン排出率（ＡＥＲ）の増加を示す。同様の変化は末梢神経の栄養血管でも生じる。糖尿病過程の初期には、透過性の増加は可逆的であるが、これは時間の経過に伴い不可逆的になる。
血管壁タンパク質蓄積の増加
糖尿病性微小血管疾患の一般的な病態生理学的特徴は、血管腔の進行性の狭窄および最終的な閉塞であり、これにより罹患組織の灌流および機能の不良を生じる。初期高血糖誘発性の微小血管の高血圧および血管透過性の増加は、３つの過程によって不可逆的な微小血管閉塞の一因となる。
第１の過程は、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）陽性の糖質含有血漿タンパク質の異常漏出であり、このタンパク質は毛細血管壁に沈着し、周皮細胞やメサンギウム細胞などの血管周囲細胞を刺激して増殖因子や細胞外基質を産生させ得る。
第２の過程は、増殖因子、例えばトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ−β１）の管外遊出であり、これは細胞外基質成分の過剰産生を直接刺激し、特定の合併症感に関連する細胞型においてアポトーシスを誘発し得る。
第３の過程は、内皮細胞および支持細胞による病的な遺伝子発現の高血圧誘発性刺激であり、これにはｇｌｕｔ−１グルコース輸送体、成長因子、成長因子受容体、細胞外基質成分、および循環白血球を活性化することができる接着分子が含まれる。糖尿病性微小血管疾患の重症度の片側性減少が眼および腎臓の動脈狭窄と同じ側で起きるという観察は、この概念と一致する。
微小血管細胞消失および血管梗塞
糖尿病性微小血管腔の進行性の狭窄および閉塞は、微小血管細胞の消失も伴う。網膜において、真性糖尿病は、ミューラー細胞および神経節細胞、周皮細胞、ならびに内皮細胞のプログラム細胞死を誘発する。糸球体では、腎機能低下が広範囲にわたる毛細血管閉塞および有足細胞消失と関連するが、糸球体細胞消失の発生機序は未だ不明である。神経脈管においては、内皮細胞および周皮細胞の変性が起こるが、これらの微小血管の変化は、糖尿病性末梢性ニューロパシーの発症に先行すると思われる。糖尿病における軸索変性の多発局所性分布は微小血管閉塞の因果的役割を支持するが、高血糖誘発性のニューロトロフィン減少が、正常な軸索の修復再生を妨げることによって寄与している可能性もある。
糖尿病性微小血管疾患の別の一般的な特徴は、高血糖の記憶と称されているが、これは高血糖誘発性の微小血管の変化が、その後の正常なグルコース恒常性の期間に持続または進行することである。この現象の最も顕著な例は、２年半の高血糖後の２年半の正常血糖期のみに、糖尿病のイヌの組織学的に正常な眼に発症する重度の網膜症である。高血糖誘発性の選択基質遺伝子の転写の増加は、インビボで正常血糖の回復後数週間持続し、それほど顕著ではないが質的には類似する、高血糖誘発性の選択基質遺伝子の転写の増加の長期化は、培養内皮細胞でも生じる。
さらなる情報については、例えば、"Ｓｈａｒｅｄ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ"（Ｌａｒｓｅｎ：Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１０ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ ２００３ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）を参照されたい。
微小血管合併症は、顕性糖尿病において生じるだけでなく、耐糖能異常（ＩＧＴ）にも起因する。ＩＧＴの微小血管合併症：ニューロパシー、網膜症、および腎性微量蛋白尿。種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、微小血管疾患を治療するのに有用である。
糖尿病性肢虚血および糖尿病性足部潰瘍
糖尿病および圧力は、微小血管の循環を損ない、下肢の皮膚に変化を起こし、次いで皮膚の変化は潰瘍の形成およびその後の感染を引き起こす可能性がある。微小血管の変化は肢筋肉の微小血管障害、ならびに末梢虚血を発症する素因および虚血イベントに対する血管新生代償反応の減少につながる。微小血管の病変は、末梢血管疾患（ＰＶＤ）（または末梢動脈疾患（ＰＡＤ）もしくは下肢動脈疾患（ＬＥＡＤ）、つまりアテローム性動脈硬化による脚動脈の狭窄である大血管合併症）を悪化させる。ＰＶＤは、糖尿病の初期に発生し、より重度でより広範囲にわたり、脚、眼、および腎臓に影響を及ぼす併発性微小循環障害をしばしば伴う。
足部の潰瘍および壊疽は、よく見られるＰＡＤの併存症状である。感覚障害を併発末梢性ニューロパシーは、足部が外傷、潰瘍化、および感染の影響を受けやすくする。糖尿病におけるＰＡＤの進行は、末梢性ニューロパシー、ならびに疼痛および外傷に対する足および下肢の無感覚などの併存疾患により悪化する。循環低下および感覚低下に伴い、潰瘍化および感染症が生じる。骨髄炎および壊疽に進行すると、切断が必要となる可能性がある。
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、糖尿病性肢虚血を治療するのに有用である。種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、潰瘍を治療するのに有用である。種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、糖尿病性足部潰瘍を治療するのに有用である。
糖尿病における冠微小血管機能障害
糖尿病における組織病理と微小循環機能障害との相関は、過去の実験的研究および剖検から周知であり、基底膜の肥厚化、血管周囲の線維症、血管密度の減少、および毛細血管出血がしばしば認められる。最近の論文は病理と眼の微小血管機能障害の相関を実証しているが（Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００３；２８５）、これらのデータをインビボで確認することは依然として困難である。しかしながら、多数の臨床研究は、顕性糖尿病だけでなく代謝制御障害も冠微小循環に影響し得ることを示している（Ｈｙｐｅｒｔ Ｒｅｓ ２００２；２５：８９３）。Ｗｅｒｎｅｒは、Ｓａｍｂｕｃｅｔｉ ｅｔ ａｌによる重要な論文（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００１；１０４：１１２９）に触れているが、これは梗塞に関連する動脈の再開通成功後の患者における微小血管機能障害の持続について示しており、またこれらの患者における心血管疾患の有病率および死亡率の増加を説明できるかもしれない。大規模な急性再潅流試験から、罹患率および死亡率は、梗塞に関連する動脈の再開通自体には関連せず、ＴＩＭＩフロー＋／−心筋染影により大きく依存するという多くの証拠が得られている（Ｓｔｏｎｅ ２００２；Ｆｅｌｄｍａｎｎ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００３）。Ｈｅｒｒｍａｎｎは、とりわけ、これに関して、冠微小循環の完全性がおそらく最も重要な臨床および予後因子であることを示した（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００１）。保護装置の中立的な効果（ＴＩＭＩフロー、ＳＴ解像度、またはＭＡＣＥに対して関連する変化がない）は、微小循環の機能障害が主な予後決定因子であることを示し得る。また、冠微小血管の機能障害は非閉塞性のＣＡＤにおいても重要な役割を果たすという証拠も蓄積されつつある。冠動脈内皮機能障害は、これらの患者においては依然として強力な予後予測因子となっている。
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、冠微小血管機能障害を治療するのに有用である。
糖尿病性ネフロパシー（糖尿病における腎機能障害）
糖尿病性ネフロパシーは、微量アルブミン尿（微小血管疾患の影響）、蛋白尿、およびＥＳＲＤを包含する。糖尿病は、腎不全の最も一般的な原因であり、新たな症例の４０％を超える。薬物および食事によって糖尿病を制御できる場合でさえ、この疾患はネフロパシーおよび腎不全を引き起こす可能性がある。糖尿病を有する人々のほとんどは、腎不全を生じるほど重度のネフロパシーは発症しない。米国では約１，６００万人が糖尿病を有し、約１０万人が糖尿病に起因する腎不全を有する。
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、糖尿病性ネフロパシーを治療するのに有用である。
網膜症
網膜症とは、眼の網膜の非炎症性損傷を指す一般的用語である。網膜症の原因は様々であり、例えば、糖尿病（糖尿病性網膜症）、動脈性高血圧（高血圧性網膜症）、未熟児（未熟児網膜症）、網膜の静脈または動脈の閉塞がある。多くのタイプの網膜症は進行性であり、失明または重度の視力の喪失もしくは障害の原因となり得る。
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、網膜の静脈または動脈の閉塞に関連する疾患、障害、または傷害の防止または治療に有用である。
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、ステント内網膜症の防止または治療に有用である。
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、ステント内網膜症の防止または治療に有用である。
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、高血圧性網膜症の防止または治療に有用である。
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、未熟児網膜症の防止または治療に有用である。
糖尿病性網膜症
糖尿病性網膜症は、糖尿病の合併症であり、失明の主な原因である。これは、糖尿病が網膜内の小血管に損傷を与えたときに発症する。糖尿病性網膜症には４つの段階がある：
−軽度の非増殖性網膜症：網膜の血管内の微細動脈瘤。
−中度の非増殖性網膜症：疾患が進行すると、網膜に栄養を与える一部の血管が閉塞される。
−重度の非増殖性網膜症：より多くの血管が閉塞され、網膜の複数部分への血液供給が絶たれるが、これは新しい血管の成長によって克服される。
−増殖性網膜症：新しい血管は、網膜に沿って、また硝子体ゲルに沿って成長する。この血管が血液を漏出したときに、重度の視力喪失および失明すら引き起こしうる。
妊娠中、糖尿病性網膜症は、糖尿病を有する女性にとって問題となり得る。
理論にとらわれるものではないが、糖尿病性網膜症により損傷を受けた血管は、２通りの形で視力喪失を生じ得る。脆弱な異常血管が発生して、眼の中心内に血液を漏出し、視界を不明瞭にすることがある。これは増殖性網膜症であり、４番目の疾患の最も進行した段階である。体液が黄斑の中心内に漏出して、不明瞭な視界をもたらし得る。この状態は黄斑浮腫と称される。これは糖尿病性網膜症のいずれの段階でも起こり得るが、疾患が進行するとより発生しやすくなり、これは糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）として知られている。
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、糖尿病性網膜症の防止または治療に有用である。
糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）
ＤＭＥは、糖尿病性網膜症の合併症であり、網膜の血管を冒す疾患である。糖尿病性網膜症は、網膜に複数の異常を引き起こすが、これには網膜の肥厚化および浮腫、出血、血流障害、血管からの液体の過剰漏出、および最終段階での異常血管成長が含まれる。この血管成長は、大出血および重度の網膜損傷につながり得る。糖尿病性網膜症の血管漏出により黄斑に腫脹が生じたとき、これはＤＭＥと称される。ＤＭＥの主な症状は、中心視の喪失である。ＤＭＥに関連する危険因子には、血中グルコースの制御不良、高血圧、体液うっ滞をもたらす異常な腎機能、高コレステロール値、および一般的な全身性因子がある。
世界保健機関によると、糖尿病性網膜症は、労働年齢の成人における失明の主な原因であり、糖尿病患者における失明の主な原因である。米国糖尿病協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）は、米国の糖尿病患者はおよそ１，８００万人のであり、米国において毎年およそ１３０万例が新たに糖尿病と診断されていると報告している。米国失明防止協会（Ｐｒｅｖｅｎｔ Ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ Ａｍｅｒｉｃａ）および米国眼学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｙｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）は、５３０万を超える１８歳以上の米国人が糖尿病性網膜症を有し、そのうちおよそ５０万人のＤＭＥ患者であると推定している。ＣＤＣは、米国におけるＤＭＥの新症例は毎年およそ７５，０００例であると推定してる。
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）の防止または治療に有用である。
網膜微小血管障害（ＡＩＤＳ網膜症）
網膜微小血管障害は、ＡＩＤＳ患者の１００％において見られる。これは、網膜内出血、微細動脈瘤、Ｒｏｔｈ斑、綿花状白斑（神経線維層の微小梗塞）、および血管周囲鞘形成を特徴とする。この網膜症の病因は不明であるが、循環免疫複合体、細胞傷害性物質の局所的放出、異常な血液レオロジー、および内皮細胞のＨＩＶ感染に起因すると考えられている。ＡＩＤＳ網膜症に対する特別な治療は存在しない。
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、ＡＩＤＳ網膜症の防止または治療に有用である。
骨髄移植（ＢＭＴ）網膜症
骨髄移植網膜症は、１９８３年に始めて報告された。これは通常はＢＭＴ後６ヶ月以内に発症するが、６２ヶ月も経ってから発症することもある。糖尿病および高血圧などの危険因子は、虚血性微小血管障害を悪化させて、ＢＭＴ網膜症の発症を促進する可能性がある。ＢＭＴ網膜症を発症しやすい年齢、性別、または人種は不明である。患者は症視力低下および／または視野欠損を示す。後区の所見は、通常は、両側性かつ対称性である。臨床的兆候には、複数の綿花状白斑、毛細血管拡張、微細動脈瘤、黄斑浮腫、硬性白斑、および網膜出血が含まれる。蛍光眼底血管造影法により、毛細血管の不灌流および脱落、網膜内微小血管異常、微小動脈瘤、および黄斑浮腫が示される。ＢＭＴ網膜症の正確な病因は解明されていないが、シクロスポリン毒性、全身被爆（ＴＢＩ）、および化学療法薬などのいくつかの因子による影響が考えられる。シクロスポリンは移植片対宿主免疫応答を抑制する強力な免疫調節剤である。これは内皮細胞傷害および神経学的副作用を引き起こす可能性があり、そのためＢＭＴ網膜症の原因であることが示唆されている。しかしながら、ＢＭＴ網膜症は、シクロスポリンを使用していなくても発症し得、シクロスポリンが自己または同系骨髄レシピエントにおいてＢＭＴ網膜症を引き起こすことは示されていない。したがって、シクロスポリンがＢＭＴ網膜症の唯一の原因であるとは思われない。全身被爆（ＴＢＩ）もＢＭＴ網膜症の原因あるとされている。放射線は網膜の微小血管系を損傷し、虚血性血管障害につながる。放射線の総線量および放射線照射と骨髄除去との間の時間間隔などの変数は重要そうに思われる。しかし、ＢＭＴ網膜症はＴＢＩを受けていない患者でも発症し得、またＢＭＴ網膜症は同様の線量の照射を受けた固形臓器移植レシピエントにおいては観察されない。したがって、ＴＢＩはＢＭＴ網膜症の発症の唯一の原因ではなく、要因の１つである。化学療法薬はＢＭＴ網膜症の可能性のある要因であることが示唆されている。シスプラチン、カルムスチン、およびシクロホスファミドなどの薬物は、乳頭水腫、視神経炎、視野欠損、および皮質盲を含む眼への副作用の原因となり得る。これらの化学療法薬により、患者は放射線誘発性網膜損傷を生じやすくなり、放射線の悪影響が強くなることが示唆されている。一般的に、ＢＭＴ網膜症患者の予後は良好である。ＢＭＴ網膜症は、通常は、シクロスポリン投与を停止または減少したあと２〜４か月以内に解消する。
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、骨髄移植網膜症の防止または治療に有用である。
角膜移植
現在ヒトにおいて最も一般的な移植術の１つは、全層角膜移植（角膜移植またはグラフト）である。現在、後天性（例えば、感染症）および遺伝性（例えば、スティーブンス・ジョンソン症候群）の角膜疾患による失明を防ぐために、世界中で毎年４０，０００例を越える角膜移植が実施されている。角膜移植の主な目的は、視力の向上、疼痛の緩和、および構造的損傷の修復であり、良好な視力転帰は、長期的な移植片の生着に依存する。時間の経過に伴い、移植不全の可能性は高まり、したがって、多くの血管新生臓器移植片とは対照的に、角膜移植片の磨耗速度は一般的に遅いが、回避することはできない。角膜移植不全に対する再移植の必要性は、角膜移植の主な適応症の１つである。
角膜移植不全は、ドナー組織の不良（一次不全）の結果として、または早期または後期術後合併症によって生じる。しかしながら、角膜移植不全の最も一般的な理由の１つは角膜移植片免疫拒絶反応であり、これはおよそ３０％の症例で発生する。
角膜移植の成功は、血管の欠如、リンパ管の欠如、血液眼関門、角膜中央における成熟抗原提示細胞（ＡＰＣ）の相対的不足、および房水における免疫調節因子の存在を含む複数の機序による、眼の免疫特権状態の維持に主に依存する。しかしながら、角膜における炎症および外傷、ならびにその結果生じる新血管形成は、眼における免疫特権の喪失につながり、角膜移植片拒絶反応をもたらす細胞性免疫応答を引き起こす。
通常は血管のないホスト角膜内での新血管形成は、角膜移植片拒絶反応の最も立証され、かつ認識されている危険因子として浸透している。正常角膜は無血管であり、血管およびリンパ管を有さないが、これは透明性および視力の双方のために、また角膜に免疫特権を与えて、ドナー角膜が拒否されるのを防止するために不可欠であり、これは移植角膜の長期生着の重要な予後因子となる。角膜移植の前または後に新血管形成が存在する場合、新しい血管（新生血管）の成長は、免疫媒介細胞にグラフトへの侵入経路を提供し、一方新しいリンパ管の成長（リンパ管新生）は、ＡＰＣのおよび抗原物質がグラフトから所属リンパ節へと出て行けるようにする。結果として、角膜は、免疫応答メディエーターに浸潤および感作され、免疫応答そのものではないが、新血管形成が角膜移植片免疫拒絶反応につながり得る免疫応答を誘発する。
角膜移植片拒絶反応の危険性は、無血管の眼と比べ、眼の４象限全てで新血管形成が見られる眼で３分の２上昇する。
現在、確立されている治療法は、抗炎症薬（即ち、コルチコステロイド）および／または眼における免疫応答を管理するための免疫抑制剤の使用を伴うが、これは拒絶反応の初期には役立つ可能性があるが、後期には役立たない。したがって、患者が角膜移植後に視力を確実に保持するために、角膜移植片拒絶反応の管理への新しい取り組みが必要とされる。後続する免疫応答または炎症の治療よりもむしろ新血管形成の防止または治療の可能性に対する研究がなされてきた。しかしながら、現在まで、角膜新血管形成を治療するための特別な治療は認可されていない。
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、角膜新血管形成の防止または治療に有用である。
新生内膜増殖および平滑筋細胞遊走（ステント）の阻害
ステント内再狭窄は、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の増殖、遊走、および過剰な基質産生に起因する病理学的過程である。
ヒト内胸動脈の生体外臓器培養モデルにおけるＲｈｏＡ活性の分析（Ｊ Ｖａｓｃ Ｒｅｓ．２００５ Ｊａｎ−Ｆｅｂ；４２（１）：２１−８）は、ステント留置が、ｐ２７発現の同時減少に関連するＲｈｏＡ活性の時間依存性増加を誘発したことを実証した。ＲｈｏＡ阻害剤によるステント動脈の治療は、新生内膜形成およびｐ２７発現の減少の双方を阻害した。ステント移植は、ＲｈｏＡ活性の維持を誘発し、ＲｈｏＡ発現に対するラパマイシンの阻害作用が、その抗再狭窄効果において重要な役割を果たすことを実証する。
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、ステント内再狭窄の防止または治療に有用である。
肺高血圧症
肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）は、肺血管狭窄による肺動脈圧および血管抵抗の進行性上昇、および血管再構築、ならびに炎症を特徴とする深刻な疾患である。
安静時に２５ｍｍＨｇまたは労作時に３０ｍｍＨｇを超える、高い持続的な肺動脈圧の上昇を特徴とする肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）は、不良な予後を有する進行性疾患であり、治療しなければ通常は５年以内に死に至る。さらに、原発性または特発性肺高血圧症（ＩＰＡＨ）は、未治療では右心不全から平均３年以内に死に至る可能性があり、現在の治療にかかわらず、１年死亡率は１５％である。ＰＡＨ寄与因子には、血管病変の形成をもたらす、長期の血管狭窄、血管再構築、炎症性細胞遊走、および原位置の血栓症がある。現在、ＰＡＨにおいて生じる高肺血管抵抗の主な原因は、血管再構築による機械的な閉塞によるものと考えられている。さらに、病理学的所見は、ＰＡＨが、内膜および／または内側肥厚、内膜線維症、および叢状病変に関連することを示している。
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、肺高血圧症の防止または治療に有用である。
炎症
炎症は、病原体、損傷細胞、または刺激物などの有害刺激に対する血管組織の複雑な生物学的応答の一部である。炎症に関連する異常は、様々なヒト疾患の根底をなす、正式には無関連の障害の大きな群を含む。免疫系が、アレルギー反応および一部のミオパシーの双方において示される炎症性障害としばしば関連し、多くの免疫系障害は異常な炎症を引き起こす。炎症過程を病因とする非免疫疾患は、癌、アテローム性動脈硬化、および虚血性心疾患を含むと考えられている。
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、炎症の防止または治療に有用である。種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、炎症性障害の防止または治療に有用である。
腫瘍形成
近年、研究により、Ｒｈｏファミリータンパク質が、腫瘍の成長、進行、転移、および血管新生に関与していることが示されている。Ｒｈｏタンパク質関与の経路は実際上未知であるが、Ｒｈｏタンパク質と癌との間の関連は著しい。とりわけ、ＲｈｏＡタンパク質は、特定のタイプの癌と大きく関連していると思われる。ＲｈｏＡの過剰発現は、結腸、乳房、肺、精巣生殖細胞、ならびに頭部および頸部の扁平上皮細胞の癌腫瘍に関連することがわかっている。
ＲｈｏＡの過剰発現レベルは、その既知の３つのエフェクターの活性増加と相関し得、これは腫瘍形成を可能にし得る考えられる機能を生じさせる。これら３つのエフェクターには、ＲＯＣＫ Ｉ、ＩＩファミリーが含まれる。これらのエフェクターは、ＳＲＦ遺伝子のアクトミオシン収縮、形質転換、および転写をもたらすキナーゼである。また、これらのエフェクターは、アクチンを重合させ、微小管の形成に影響を与える足場特性を示す。第２のエフェクターは、エンドサイトーシスをもたらすＰＲＫ１／ＰＫＮタンパク質である。最後に、ＲｈｏＡは、エフェクターであるシトロンに結合して、細胞質分裂をもたらす。これらのエフェクターは、細胞運動および細胞極性におけるＲｈｏＡの関与を示唆していると考えられる。これら２つの機能に対するＲｈｏＡ発現の効果は、腫瘍形成の有力な原因と思われる。実際に、最も頻繁に癌を生じる組織である上皮細胞における極性喪失、およびそれらの細胞運動の増加は、異常な細胞株を生じると考えられるであろう。
ＲｈｏＡの過剰発現は、結腸癌、乳癌、肺癌、および精巣生殖細胞癌、ならびに頭部および頸部の扁平上皮細胞の癌腫と関連付けられている。これらの癌におけるＲｈｏＡの役割に関する異なる仮説が研究中である。１つは、ＲｈｏＡのＧＴＰａｓｅ活性が、小胞輸送および細胞形状変化などの腫瘍形成に必要な過程のためのエネルギーを提供するというものである。別の矛盾しない仮説は、癌の転移が、細胞運動および突起形成におけるＲｈｏＡの役割によって影響を受け得るというものである。
「癌」および「癌性疾患」は、互換的に使用され、これらは不適切に高レベルの細胞分裂、不適切に低レベルのアポトーシス、またはこれら双方によって生じる、あるいはこれらの原因となる疾患を指す。癌性疾患の例には、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、ならびに肉腫および癌腫等の固形腫瘍（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、ヘパトーム、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、シュワン腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫）を含むが、これらに限定されない。いくつかの好ましい実施形態において、本発明の化合物は、肺癌および肺における転移を治療する際に有用である。
本明細書で使用する用語「増殖性疾患」は、悪性または良性のいずれかの細胞増殖が、その状態の病理に寄与している疾患を指す。そのような望ましくない増殖は、癌および多くの慢性炎症性疾患の特徴であり、したがって「増殖性疾患」の例には、上記に挙げた癌、また慢性炎症性増殖性疾患、例えば乾癬、炎症性腸疾患、および関節リウマチ、増殖性心臓血管疾患、例えば再狭窄、増殖性眼障害、例えば糖尿病性網膜症、ならびに良性過剰増殖性疾患、例えば血管腫が含まれる。
種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、癌の防止または治療に有用である。種々の実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、癌腫、腫瘍、および／または悪性疾患の防止または治療に有用である。
一実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、結腸癌の防止または治療に有用である。一実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、乳癌の防止または治療に有用である。一実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、肺癌の防止または治療に有用である。一実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、精巣生殖細胞癌の防止または治療に有用である。一実施形態において、本明細書において開示される核酸化合物および薬学的組成物は、単独または他の治療法と組み合わせて、頸部の扁平上皮細胞の癌腫の防止または治療に有用である。
上述の疾患および障害を治療するためのより有効な治療法は、治療的価値を有するであろう。
結論として、本明細書において開示される状態（例えば、緑内障、ＳＣＩ、ＣＮＳ傷害、神経変性）の防止および／または治療のための有効な治療方法は存在せず、組織収縮に対する有効な治療も眼の瘢痕化に対する有効な治療も確かに存在しない。利用可能な治療は、とりわけ選択的標的化の欠如による深刻な副作用の不利益を被り、そのためこのような目的の新規の化合物および治療方法を開発する必要性が依然として存在する。
種々の実施形態において、本発明の化合物および薬学的組成物は、本明細書において下に開示するがこれらに限定されない疾患、障害、および傷害など、中枢神経系（ＣＮＳ）に影響を及ぼす種々の疾患、障害、および傷害を治療または防止する際に有用である。理論にとらわれるものではないが、本明細書において提供される治療用ｄｓＲｈｏＡ分子は、複数の機序によってＣＮＳ障害、疾患、および傷害を治療し、神経保護および神経再生をもたらすと考えられている。
ＲｈｏＡタンパク質
ＲｈｏＡは、低分子ＧＴＰａｓｅのＲａｓホモロジーファミリーのメンバーである。これらのタンパク質は、ＧＴＰからＧＤＰへの加水分解によって、その活性（ＧＴＰ結合）配座から不活性（ＧＤＰ結合）配座へと循環する。特異的グアニン交換因子（ＧＥＦ）は、ＧＤＰの新しいＧＴＰへの置換を触媒することによって、ＧＴＰａｓｅを再活性化する。他の調節因子には、ＧＴＰａｓｅ活性を向上させる（ひいては、タンパク質をより迅速にそのＧＤＰ結合不活性形態に転換する）ことによってＲｈｏＡを不活性化するＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）、およびＧＡＰの機能を阻害し、その結果ＲｈｏＡのＧＴＰａｓｅ活性を緩慢にするグアニンヌクレオチド解離阻害剤（ＧＤＩ）が含まれる。
細胞におけるＲｈｏＡの機能は、主に細胞骨格調節に関連する。最近の研究により、ミオシンリン酸化およびストレスに対する細胞応答、例えば接着斑およびアクチンストレスファイバーの形成における、その間接的関与（関連因子を介する）が示されている。またこれは、ミオシン鎖延長、アクチンフィラメント再構成、遺伝子発現、細胞形状決定、および細胞増殖と直接関連することも示されている。
ＲｈｏＡの過剰発現は、結腸癌、乳癌、肺癌、および精巣生殖細胞癌、ならびに頭部および頸部の扁平上皮細胞の癌腫と関連付けられている。これらの癌におけるＲｈｏＡの役割に関する異なる仮説が研究中である。１つは、ＲｈｏＡのＧＴＰａｓｅ活性が、小胞輸送および細胞形状変化などの腫瘍形成に必要な過程のためのエネルギーを提供するというものである。別の矛盾しない仮説は、癌の転移が、細胞運動および突起形成におけるＲｈｏＡの役割によって影響を受け得るというものである。
ｄｓＲＮＡオリゴリボヌクレオチド化合物
表Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶは、非修飾および化学修飾ＲｈｏＡ ｄｓＲＮＡ化合物を調製する際に有用な、センスオリゴヌクレオチドおよび対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸配列を提示する。表Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩに提示されるセンスオリゴヌクレオチドおよび対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲｈｏＡ発現の下方制御ならびに本明細書において開示する疾患、障害、および傷害の治療の際に有用な合成ｓｉＲＮＡ化合物（二重鎖）の生成に有用な、好ましいオリゴヌクレオチドを提供する。
既知の遺伝子に対応するｄｓＲＮＡ化合物の選択および合成は、広く報告されている（例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６；６５０５２、Ｃｈａｌｋ ｅｔ ａｌ．，ＢＢＲＣ．２００４，３１９（１）：２６４−７４、Ｓｉｏｕｄ ａｎｄ Ｌｅｉｒｄａｌ，Ｍｅｔ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．；２００４，２５２：４５７−６９、Ｌｅｖｅｎｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．２００４，２０（３）：４３０−２、Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ ２００４，３２（３）：９３６−４８を参照）。修飾ｓｉＲＮＡの使用および製造の例については、Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００３，４２（２６）：７９６７−７５、Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ，２００３，９（９）：１０３４−４８、ＰＣＴ広報第ＷＯ２００４／０１５１０７号（ａｔｕｇｅｎ）、国際公開第ＷＯ０２／４４３２１号（Ｔｕｓｃｈｌ ｅｔ ａｌ）、および米国特許第５，８９８，０３１号および第６，１０７，０９４号を参照されたい。
いくつかのグループは、細胞内にｓｉＲＮＡを生成することができるＤＮＡに基づくベクターの開発について記載している。この方法は、一般に、細胞内にｓｉＲＮＡを生成するように効果的に処理される、低分子ヘアピンＲＮＡの転写を伴う（Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ ２００２，９９：１４４３−１４４８、Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ & Ｄｅｖ ２００２，１６：９４８−９５８、Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ ２００２，８：５５１５−５５２０、およびＢｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２，２９６：５５０−５５３）。これらの報告は、多数の内因的および外因的に発現された遺伝子を特異的に標的とすることができるｓｉＲＮＡを生成する方法を説明している。
本発明は、本発明によりＲｈｏＡの発現を下方制御する、二本鎖オリゴリボヌクレオチド（例えば、ｄｓＲＮＡｓ）を提供する。本発明のｄｓＲＮＡ化合物は、二重鎖オリゴリボヌクレオチドであり、センス鎖は、ＲｈｏＡのｍＲＮＡ配列に由来し、アンチセンス鎖は、センス鎖に相補的である。一般に、標的ｍＲＮＡ配列からの多少の偏差は、ｄｓＲＮＡ活性を損なうことなく許容される（例えば、Ｃｚａｕｄｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．，２００３，ＮＡＲ ３１（１１），２７０５−２７１６を参照）。本発明のｄｓＲＮＡ化合物は、ｍＲＮＡの破壊を伴って、または伴わずに、転写後レベルで遺伝子発現を下方制御する。理論にとらわれるものではないが、ｄｓＲＮＡは、特異的切断および分解のためにｍＲＮＡを標的とすることができ、および／または標的メッセージからの翻訳を阻害し得る。
本明細書において開示されるｄｓＲＮＡ化合物は、本明細書において開示される構造に示す修飾により、またはタンデムｄｓＲＮＡもしくはＲＮＡｓｔａｒとして、化学的または構造的に修飾されている。
ＲｈｏＡを阻害するための薬学的組成物
ＲｈｏＡ遺伝子発現の下方制御を媒介することができる、またはＲｈｏＡ遺伝子発現に対するＲＮＡ干渉を媒介する小核酸分子、例えば低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子、および低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を使用することによる、ＲｈｏＡ発現の下方制御のための組成物および方法が提供される。本明細書において開示される組成物および方法は、種々の神経変性および神経系の障害、ならびに疼痛を治療する際にも有用である。
本発明の核酸分子および／または方法は、例えばＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１６６４で示されるｍＲＮＡをコードするＲｈｏＡの発現を下方制御するために使用される。
本発明の化合物をそのまま化学物質として投与することは可能であるが、それらを薬学的組成物として提供することが好ましい。したがって、本発明は、本発明の化合物のうちの１つまたは複数と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。この組成物は、２つ以上の異なる核酸化合物の混合物を含み得る。
本明細書において提供される組成物、方法、およびキットは、ＲｈｏＡタンパク質、および／またはＲｈｏＡタンパク質をコードする遺伝子、ＲｈｏＡに関連する疾患、状態、または障害、例えばＣＮＳ障害、疾患、および傷害の維持および／または発症に関連するタンパク質および／または遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１６６４で示される配列を含む遺伝子コード配列）、あるいは遺伝子もしくは遺伝子ファミリー配列が配列相同性を共有するＲｈｏＡ遺伝子ファミリーメンバーの発現を独立してもしくは組み合わせで調整する（例えば、下方制御する）、１つまたは複数の核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ）および方法を含み得る。種々の態様および実施形態の説明は、例示的遺伝子ＲｈｏＡに関連して提示している。しかしながら、これらの種々の態様および実施形態は、他の関連ＲｈｏＡ遺伝子、例えばホモログ遺伝子および転写変異体、ならびに特定のＲｈｏＡ遺伝子に関連する多型（例えば、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ））も対象としている。したがって、種々の態様および実施形態は、例えば、本明細書において開示される疾患、特性、または状態の維持または発症に関与するシグナル変換または遺伝子発現のＲｈｏＡ媒介経路に関与する、他の遺伝子も対象としている。これらの付加的な遺伝子は、本明細書においてＲｈｏＡ遺伝子について説明される方法を用いて、標的部位について分析することができる。したがって、他の遺伝子の下方制御、および他の遺伝子のかかる調整の影響は、本明細書に記載されるように実施、判定、および測定することができる。
本発明は、ＲｈｏＡ発現を下方制御するのに有効な量で１つまたは複数の本発明の化合物と共有結合または非共有結合した少なくとも１つの本発明の化合物と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物をさらに提供する。この化合物を内因性細胞複合体により細胞内で処理して、１つまたは複数の本発明のオリゴリボヌクレオチドを産生してもよい。
本発明は、薬学的に許容される担体と、ヒトＲｈｏＡの細胞における発現を阻害するのに有効な量の本発明の化合物であって、（Ｎ）ｘの配列に実質的に相補的な配列を含む化合物のうちの１つまたは複数とを含む薬学的組成物をさらに提供する。
実質的に相補性であるとは、別の配列に対する約８４％を超える相補性を指す。例えば、１９塩基対からなる二重鎖領域において、１つのミスマッチは、９４．７％の相補性をもたらし、２つのミスマッチは、約８９．５％の相補性をもたらし、３つのミスマッチは、約８４．２％の相補性をもたらし、二重鎖領域を実質的に相補的にする。したがって、実質的に同一とは、別の配列に対して約８４％より高い同一性を指す。
さらに、本発明は、対照と比較して、ＲｈｏＡの発現を少なくとも４０％、好ましくは５０％、６０％、もしくは７０％、より好ましくは７５％、８０％、もしくは９０％阻害する方法であって、本発明のＲｈｏＡのｍＲＮＡ転写物を本発明の化合物のうちの１つまたは複数と接触させることを含む方法を提供する。
一実施形態において、本明細書において開示されるオリゴリボヌクレオチド化合物、組成物、および方法は、ＲｈｏＡ遺伝子を阻害／下方制御し、この阻害／下方制御は、遺伝子機能の阻害／下方制御、ポリペプチドの阻害／下方制御、およびｍＲＮＡ発現の阻害／下方制御を含む群から選択される。
一実施形態において、本明細書において開示される組成物および方法は、ＲｈｏＡ遺伝子（例えば、配列番号１に例示されるヒトＲｈｏＡのｍＲＮＡコード配列）の発現を下方制御する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）化合物を含み、この核酸分子は、約１５〜約４９の塩基対を含む。
一実施形態において、本明細書において開示される核酸を用いて、ＲｈｏＡ遺伝子またはＲｈｏＡ遺伝子ファミリーの発現を阻害することができ、この遺伝子または遺伝子ファミリーの配列は、配列相同性を共有する。かかる相同配列は、例えば配列アラインメントを用いて、当技術分野において知られているように特定することができる。核酸分子は、例えば、完全に相補的な配列を用いて、または付加的な標的配列を提供し得る非標準塩基対、例えばミスマッチおよび／またはウォッブル塩基対を組み込むことによって、かかる相同配列を標的とするようにデザインすることができる。ミスマッチが特定される場合には、非標準塩基対（例えば、ミスマッチおよび／またはウォッブル塩基）を用いて、１つより多い遺伝子配列を標的とする核酸分子を生成することができる。非限定的な例では、非標準塩基対、例えばＵＵおよびＣＣ塩基対を用いて、配列相同性を共有する異なるＲｈｏＡ標的の配列を標的とすることができる核酸分子を生成する。したがって、本明細書において開示されるｄｓＲＮＡｓを使用することの１つの利点は、相同遺伝子間に保存されるヌクレオチド配列に相補的な核酸配列を含むように、単一の核酸をデザインできることである。この手法では、異なる遺伝子を標的とするために、１つより多いの核酸分子を用いる代わりに、単一の核酸を用いて、１つより多い遺伝子の発現を阻害することができる。
核酸分子を使用して、ＲｈｏＡファミリー遺伝子などの１つまたは複数の遺伝子ファミリーに対応する保存配列を標的とすることもできる。したがって、複数のＲｈｏＡ標的を標的とする核酸分子は、改善された治療効果を提供する。さらに、核酸を用いて、様々な用途で遺伝子機能の経路を特徴付けることができる。例えば、核酸分子を用いて、経路における標的遺伝子の活性を阻害して、遺伝子機能分析、ｍＲＮＡ機能分析、または翻訳分析において、特徴が明らかになっていない遺伝子の機能を究明することができる。核酸分子を用いて、医薬の開発に向けて、種々の疾患および状態に関与する可能性のある標的遺伝子経路を決定することもできる。核酸分子を用いて、例えば、ＣＮＳ障害、例えば神経変性障害、および／または炎症性疾患、障害、および／または状態に関与する遺伝子発現の経路を理解することも可能である。
一実施形態において、本明細書において提供される核酸化合物、組成物、および方法は、ＲｈｏＡポリペプチドを阻害し、この阻害は、機能の阻害（これは、とりわけ、酵素アッセイまたは天然の遺伝子／ポリペプチドの既知の相互作用物質を用いる結合アッセイにより試験可能である）、タンパク質の阻害（これは、とりわけ、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、または免疫沈降法により試験可能である）およびｍＲＮＡ発現の阻害（これは、とりわけ、ノーザンブロット法、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、インサイツハイブリダイゼーション、またはマイクロアレイハイブリダイゼーションにより試験可能である）を含む群から選択される。
一実施形態において、本明細書において開示される組成物および方法には、ＲｈｏＡ ＲＮＡに対するＲＮＡｉ活性を有する核酸分子が含まれ、この核酸分子は、配列番号１に示す配列のような、ＲｈｏＡをコードする配列を有する任意のＲＮＡに相補的な配列を含む。別の実施形態において、核酸分子は、ＲｈｏＡ ＲＮＡに対するＲＮＡｉを有してもよく、この核酸分子は、例えば配列番号１には示されてないが、神経変性および／またはニューロパシーの発現および／または維持および／または発症に関連することが当技術分野で知られている他の突然変異ＲｈｏＡ遺伝子、例えばＳＮＰなど、変異ＲｈｏＡをコードする配列を有するＲＮＡに相補的な配列を含む。本明細書において説明するような化学修飾は、本明細書において開示されるいずれの核酸構築物に適用してもよい。別の実施形態において、本明細書において開示される核酸分子は、ＲｈｏＡ遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用して、それによってＲｈｏＡ遺伝子発現の下方制御またはサイレンシングを媒介することができるヌクレオチド配列を含み、例えば、この核酸分子は、ＲｈｏＡ遺伝子のクロマチン構造またはメチル化パターンを調節し、ＲｈｏＡ遺伝子の転写を防止する細胞過程によって、ＲｈｏＡ遺伝子発現の制御を媒介する。
さらなる実施形態において、本発明は、上昇したレベルのＲｈｏＡを伴う疾患を患っている対象を治療する方法であって、本発明の化合物を治療的有効用量で対象に投与し、それによって対象を治療することを含む方法を提供する。
より具体的には、本発明は、１つの鎖が５’から３’に、表Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶに記載の化合物、またはそれらのホモログを有する連続するヌクレオチドを含み、各末端領域のリボヌクレオチドのうち最大２個において変更されている、オリゴリボヌクレオチドを提供する。
核酸分子および薬学的処方物の送達
本発明の核酸分子は、担体または希釈剤と共に調製したネイキッド分子の直接適用によって、標的組織に送達してもよい。
「ネイキッド核酸」または「ネイキッドｄｓＲＮＡ」または「ネイキッドｓｉＲＮＡ」とは、細胞への侵入を補助、促進、または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクルも含まない核酸分子を指し、これにはウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム製剤、リポフェクチン、または沈殿剤などを含む。例えば、ＰＢＳ中のｄｓＲＮＡは、「ネイキッドｄｓＲＮＡ」である。
核酸分子は、単独または他の治療法と組み合わせて、ＣＮＳ障害（例えば、神経変性、眼、耳）の疾患、特性、状態、および／または障害、および／または細胞または組織中のＲｈｏＡレベルに関連するまたはそれに応答する任意の他の特性、疾患、障害、または状態を防止または治療するための使用に適合させることができる。
本明細書において開示される核酸分子は、ウイルスベクター、ウイルス粒子、リポソーム製剤、リポフェクチン、または沈殿剤などの細胞への侵入を補助、促進、または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクルを含まずに、担体または希釈剤とともに直接送達または投与してもよい。
核酸分子は、対象への投与のためのリポソームを含む送達ビヒクル、担体、および希釈剤、ならびにそれらの塩を含んでもよく、および／または薬学的に許容される製剤中に含まれてもよい。いくつかの実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、リポソーム製剤やリポフェクチン製剤などの形態で送達され、当業者に周知の方法で調製することができる。かかる方法は、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５９３，９７２，５，５８９，４６６号および第５，５８０，８５９に記載されている。
哺乳動物細胞内へのｓｉＲＮＡの強化および改善された送達を特に目的にした送達系が開発されている（例えば、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔ．２００３，５３９：１１１−１１４、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００２，２０：１００６−１０１０、Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｖｉｓｉｏｎ ２００３，９：２１０−２１６、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００３．３２７：７６１−７６６、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２００２，３２：１０７−１０８、およびＳｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ ２００３，３１，１１：２７１７−２７２４を参照）。ｓｉＲＮＡは、近年、霊長類における遺伝子発現の阻害のために使用に成功している（例えば、Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｉｎａ ２４（４）：６６０を参照）。
所望の対象への核酸の導入を容易にするポリペプチドは、当技術分野において知られており、例えば米国特許出願第２００７０１５５６５８号に記載されている（例えば、２，４，６−トリグアニジノとリアジンおよび２，４，６−トリアミドサルコシルメラミンなどのメラミン誘導体、ポリアルギニンポリペプチド、および交互のグルタミン残基およびアスパラギン残基を含むポリペプチド）。
薬学的に許容される担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバント、およびビヒクル、ならびに移植担体は、一般に、本発明の活性成分と反応しない不活性な非毒性の固体または液体の充填剤、希釈剤、またはカプセル化材料を指し、それらには、リポソームおよびミクロスフェアが含まれる。本発明において有用な送達系の例には、米国特許第５，２２５，１８２号、第５，１６９，３８３号、第５，１６７，６１６号、第４，９５９，２１７号、第４，９２５，６７８号、第４，４８７，６０３号、第４，４８６，１９４号、第４，４４７，２３３号、第４，４４７，２２４号、第４，４３９，１９６号、および第４，４７５，１９６が含まれる。他の多数の移植、送達系、およびモジュールが、当業者に周知である。
核酸分子の送達のための方法は、Ａｋｈｔａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．，２：１３９（１９９２）；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，（１９９５）、Ｍａｕｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．，１６：１２９−１４０（１９９９）、Ｈｏｆｌａｎｄ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３７：１６５−１９２（１９９９）、およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，７５２：１８４−１９２（２０００）、米国特許第６，３９５，７１３号、第６，２３５，３１０号、第５，２２５，１８２号、第５，１６９，３８３号、第５，１６７，６１６号、第４，９５９２１７号、第４．９２５，６７８号、第４，４８７，６０３号、および第４，４８６，１９４号、ならびにＳｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ第ＷＯ９４／０２５９５号、ＰＣＴ第ＷＯ００／０３６８３号、およびＰＣＴ第ＷＯ０２／０８７５４号、ならびに米国特許出願公開第２００３０７７８２９号に記載されている。これらの手順は、実質上いかなる核酸分子の送達にも使用可能である。核酸分子は、当業者に知られる様々な方法によって細胞に投与することができ、これにはリポソーム中へのカプセル化、イオン導入による、または他のビヒクル、例えば、生分解性ポリマー、ヒドロゲル、シクロデキストリン（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１０：１０６８−１０７４（１９９９）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ国際公開第ＷＯ０３／４７５１８号および第ＷＯ０３／４６１８５号を参照）、ポリ（ラクティック−コ−グリコリック）酸（ＰＬＧＡ）およびＰＬＣＡミクロスフェア（例えば、米国特許第６，４４７，７９６号および米国特許出願公開第２００２１３０４３０号）、ならびに生分解性ナノ粒子へ組み込みによる、またはタンパク質性ベクターによる（Ｏ’Ｈａｒｅ ａｎｄ Ｎｏｒｍａｎｄ、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ００／５３７２２号）ものが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、直接注入により、または輸液ポンプを使用して、核酸／ビヒクルの組み合わせを局所的に送達する。本発明の核酸分子の直接注入は、硝子体内、皮下、経鼓膜、筋肉内、または皮内にかかわらず、標準的な針と注射器の方法を用いて、またはＣｏｎｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５：２３３０−２３３７（１９９９）、およびＢａｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９９／３１２６２号に記載されているものなどの針を用いない技術によって実施することができる。本発明の分子は、薬学的物質として使用することができる。薬学的物質は、対象における疾患状態をある程度（好ましくは全ての症状）防止する、発生を調節する、または治療もしくは軽減する。本発明の具体的な一実施形態において、局所製剤および経皮製剤を選択してもよい。
本発明のｄｓＲＮＡまたは薬学的組成物は、個々の対象の臨床状態、処置しようとする疾患、投与の部位および方法、投与の計画、患者の年齢、性別、体重、ならびに医師に公知の他の要因を考慮して、適切な医療行為に従って投与および服用される。
別の実施形態において、投与は、点眼剤、点耳剤、または軟膏によるなどの局所（ｔｏｐｉｃａｌまたはｌｏｃａｌ）投与を含む。非限定的例において、ＲｈｏＡを標的とするｄｓＲＮＡ化合物は、神経網膜における損傷を患っている対象を治療する際に有用であり、このｄｓＲＮＡ化合物は、局所送達（例えば、点眼剤、点耳剤、または軟膏）によって眼に送達される。非限定的例において、ＲｈｏＡを標的とするｄｓＲＮＡ化合物は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）消失を患っている対象を治療する際に有用であり、このｄｓＲＮＡ化合物は、局所送達（例えば、点眼剤、点耳剤、または軟膏）によって眼に送達される。非限定的例において、ＲｈｏＡを標的とするｄｓＲＮＡ化合物は、緑内障を患っている対象を治療する際に有用であり、このｄｓＲＮＡ化合物は、局所送達（例えば、点眼剤、点耳剤、または軟膏）によって眼に送達される。
核酸分子は、カチオン性脂質と複合体を形成するか、リポソーム内に封入されるか、あるいは別の方法で標的細胞または組織に送達される。核酸または核酸複合体は、バイオポリマーに組み込んで、または組み込まずに、直接皮膚適用、経皮適用、または注入によって、エクスビボまたはインビボで関連組織に局所投与することができる。本発明の核酸分子は、本明細書において表Ｉ〜ＩＶに示す配列を含み得る。かかる核酸分子の例は、基本的に表Ｉ〜ＩＶに提示する配列からなる。
送達系には、ポリ（エチレングリコール）脂質を含む表面修飾リポソーム（ＰＥＧ−修飾、または長期循環リポソーム、またはステルスリポソーム）を含み得る。これらの製剤は、標的組織における薬物の蓄積を増加させる方法を提供する。この種の薬物担体は、単核食細胞系（ＭＰＳまたはＲＥＳ）によるオプソニン化および排除に対する耐性を有し、それによって血液循環時間が長くなり、カプセル化された薬物の組織への暴露が促進される（Ｌａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９５，９５，２６０１−２６２７、Ｉｓｈｉｗａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９５，４３，１００５−１０１１）。
核酸分子は、ポリエチレンイミン（例えば、線状またはは分枝ＰＥＩ）、および／または例えばポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）誘導体またはポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−トリ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ｔｒｉＧＡＬ）誘導体を含むポリエチレンイミン誘導体、グラフトＰＥＩ、例えばガラクトースＰＥＩ、コレステロールＰＥＩ、抗体によって誘導体化されたＰＥＩ、およびそのポリエチレングリコールＰＥＩ（ＰＥＧ−ＰＥＩ）誘導体と一緒に処方または複合体化してもよい（例えば、Ｏｇｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＡＡＰＡ ＰｈａｒｍＳｃｉ，３，１−１１、Ｆｕｒｇｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１４，８４０−８４７、Ｋｕｎａｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９、８１０−８１７、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｂｕｌｌ．Ｋｏｒｅａｎ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２２，４６−５２、Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１０，５５８−５６１、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１３，８４５−８５４、Ｅｒｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｐｒｅｐｒｉｎｔ，１，１−１８、Ｇｏｄｂｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，９６，５１７７−５１８１、Ｇｏｄｂｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，６０，１４９−１６０、Ｄｉｅｂｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４，１９０８７−１９０９４、Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｋｌｉｂａｎｏｖ，２００２，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，９９，１４６４０−１４６４５、Ｓａｇａｒａ，米国特許第６，５８６，５２４号および米国特許出願公開第２００３００７７８２９号を参照）。
核酸分子は、米国特許出願公開第２００１０００７６６６号に記載されているものなどの膜破壊剤と複合体を形成してもよい。また、１つまたは複数の膜破壊剤および核酸分子は、米国特許第６，２３５，３１０号に記載されている脂質などのカチオン性脂質またはヘルパー脂質分子と複合体を形成してもよい。
本明細書において開示される核酸分子は、中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）に投与してもよい。実験により、ニューロンによる効率的なインビボでの核酸の取り込みが実証されている。
参考として、例えば、Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，８，７５、Ｅｐａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１０，４６９、Ｂｒｏａｄｄｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．，８８（４），７３４、Ｋａｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍｏｃｏｌ．，３４０（２／３），１５３、Ｂａｎｎａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７８４（１，２），３０４、Ｒａｊａｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｓｙｎａｐｓｅ，２６（３），１９９、Ｗｕ−ｐｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９，ＢｉｏＰｈａｒｍ，１２（１），３２、Ｂａｎｎａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｐｒｏｔｏｃ．，３（１），８３、およびＳｉｍａｎｔｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，７４（１），３９を参照されたい。したがって、核酸分子は、ＣＮＳおよび／またはＰＮＳ中の細胞、例えばニューロン、マクロファージ、白質軸索、および内皮細胞への送達、およびそれらによる取り込みに適している。
核酸分子のＣＮＳへの送達は、多様な戦略によって提供される。使用可能なＣＮＳ送達のための従来の手法には、くも膜下投与および脳室内投与、カテーテルおよびポンプの移植、傷害または病変の部位における直接注入または灌流、脳動脈系への注入、あるいは血液脳関門の化学的または浸透圧的開放によるものが含まれるが、これらに限定されない。核酸分子のＣＮＳへの送達の非侵襲的方法も知られており、これには例えば、鼻腔内投与、眼内投与（例えば、点眼剤）、または耳内投与（例えば、点耳剤）を含み得る。侵襲的投与方法と非侵襲的投与方法との組み合わせを用いてもよい。他の手法には、種々の輸送系および担体系の使用、例えば抱合体および生分解性ポリマーの使用によるものを含み得る。さらに、例えばＫａｐｌｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，１８０，６１３号およびＤａｖｉｄｓｏｎ，国際公開第ＷＯ０４／０１３２８０号に記載されているような遺伝子治療法を用いて、ＣＮＳにおいて核酸を発現されることもできる。
送達系は、例えば、水性ゲルおよび非水性ゲル、クリーム、多相乳剤、マイクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水性溶液および非水性溶液、ローション剤、エアロゾル、炭化水素基剤、ならびに粉剤を含み得、また可溶化剤、浸透促進剤（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコール、およびアミノ酸）、ならびに親水性ポリマー（例えば、ポリカルボフィルおよびポリビニルピロリドン）も含んでよい。一実施形態において、薬学的に許容される担体は、リポソームまたは経皮促進剤である。本発明の化合物とともに使用可能なリポソームの非限定的例には、（１）ＣｅｌｌＦｅｃｔｉｎ、カチオン性脂質Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラメチル−Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラパルミト−ｙ−スペルミンおよびジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の１：１．５（Ｍ／Ｍ）リポソーム製剤（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、（２）Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ ＧＳＶ、カチオン性脂質およびＤＯＰＥの２：１（Ｍ／Ｍ）リポソーム製剤（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、（３）ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリ−メチル−アンモニウムエチルサルフェート）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）、および（４）Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ポリカチオン性脂質ＤＯＳＰＡ、中性脂質ＤＯＰＥ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、およびにジアルキル化アミノ酸（ＤｉＬＡ２）の３：１（Ｍ／Ｍ）リポソーム製剤がある。
送達系には、パッチ、錠剤、坐剤、ペッサリー、ゲル、水性溶液および非水性溶液、ローション剤、クリーム含んでもよく、また、賦形剤、例えば可溶化剤および促進剤（例えば、プロピレングリコール、胆汁塩、およびアミノ酸）、ならびに他のビヒクル（例えば、ポリエチレングリコール、グリセロール、脂肪酸エステル、および誘導体、ならびに親水性ポリマー、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびヒアルロン酸）を含み得る。
核酸分子は、バイオコンジュゲート、例えば、Ｖａｒｇｅｅｓｅ ｅｔ ａｌ．の米国特許出願第１０／４２７，１６０号、米国特許第６，５２８，６３１号、米国特許第６，３３５，４３４号、米国特許第６，２３５，８８６号、米国特許第６，１５３，７３７号、米国特許第５，２１４，１３６号、米国特許第５，１３８，０４５号に記載されているような核酸コンジュゲートを含み得る。
本明細書において開示される組成物、方法、およびキットは、核酸分子の発現を可能にするように、本発明の少なくとも１つの核酸分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含んでもよい。核酸分子あるいは細胞環境中にｄｓＲＮＡの鎖を発現することができる１つまたは複数のベクターを導入する方法は、細胞の種類およびその環境の性質に依存するであろう。核酸分子またはベクター構築物は、細胞内に直接導入しても（即ち、細胞内導入）、または腔内、間質腔、生物の循環内に細胞外導入しても、経口導入してもよく、あるいはｄｓＲＮＡを含む溶液に生物または細胞を浸漬することによって導入してもよい。細胞は、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞である。発現ベクターの核酸分子は、センス領域およびアンチセンス領域を含み得る。アンチセンス領域は、ＲｈｏＡをコードするＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列に相補的な配列を含んでもよく、センス領域は、アンチセンス領域に相補的な配列を含んでもよい。核酸分子は、相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を有する、２つの明白に異なる鎖を含んでもよい。核酸分子は、相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を有する単一の鎖を含んでもよい。
標的ＲＮＡ分子と相互作用して、遺伝子をコードする標的ＲＮＡ分子（例えば、ＲｈｏＡ ｍＲＮＡ、配列番号１）を下方制御する核酸分子は、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターに挿入された転写ユニットから発現させることができる。組換えベクターは、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターであってよい。核酸分子を発現するウイルスベクターは、限定されないがアデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアルファウイルスに基づいて構築することができる。核酸分子を発現することができる組換えベクターは、本明細書において説明するように送達され、標的細胞中で存続することが可能である。あるいは、核酸分子の一時的発現を提供するウイルスベクターを用いてもよい。かかるベクターは、必要に応じて、繰り返し投与することができる。一旦発現すると、核酸分子は結合して、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により遺伝子の機能または発現を下方制御する。核酸分子発現ベクターの送達は全身性であってよく、例えば、静脈内または筋肉内投与によって、局所投与によって、対象から外植された標的細胞への投与およびその後の対象への再導入によって、または所望の標的細胞への導入を可能にするであろう任意の他の手段によって行われる。
発現ベクターは、少なくとも１つの本明細書において開示される核酸分子をコードする核酸配列を、核酸分子の発現を可能にする形で含んでもよい。例えば、ベクターは、二重鎖を含む核酸分子の両鎖をコードする配列を含んでもよい。また、ベクターは、自己相補的であり、それにより核酸分子を形成する、単一の核酸分子をコードする配列も含んでよい。かかる発現ベクターの非限定的例は、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５０５、Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ａｎｄ Ｔａｉｒａ，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，４９７、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５００、およびＮｏｖｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ａｄｖａｎｃｅ ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ７２５に記載されている。また、発現ベクターは、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞に含まれてもよい。
発現ベクターは、同じであっても異なってもよい２つ以上の核酸分子をコードする核酸配列を含んでもよい。発現ベクターは、例えば表Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶに示されるものなど、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１６６４で示される核酸分子に相補的な核酸分子の配列を含んでもよい。
発現ベクターは、核酸二重鎖の一方もしくは両方の鎖、または核酸二重鎖に自己ハイブリダイズ可能な単一の自己相補的鎖をコードしてよい。核酸分子をコードする核酸配列は、核酸分子の発現を可能にするように、作用可能に連結させることができる（例えば、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５０５、Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ａｎｄ Ｔａｉｒａ，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，４９７、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５００、およびＮｏｖｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ａｄｖａｎｃｅ ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ７２５を参照）。
発現ベクターは、以下のうち１つまたは複数を含んでもよい：ａ）転写開始領域（例えば真核生物ｐｏｌ Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ開始領域）、ｂ）転写終結領域（例えば真核生物ｐｏｌ Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ終結領域）、ｃ）イントロン、およびｄ）核酸分子のうちの少なくとも１つをコードする核酸配列であって、核酸分子の発現および／または送達を可能にするように、開始領域および終結領域に作用可能に連結した配列。ベクターは、場合により、核酸分子をコードする配列の５’側または３’側に作用可能に連結したタンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、および／またはイントロン（介在配列）を含んでもよい。
核酸分子配列の転写は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ）、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）のプロモーターから引き起こすことができる。ｐｏｌ ＩＩまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターからの転写産物は、全ての細胞において高いレベルで発現され、所与の細胞型における所与のｐｏｌ ＩＩプロモーターのレベルは、付近に存在する遺伝子調節配列（エンハンサー、サイレンサーなど）の性質に依存する。原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモーターも、その原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素が、適切な細胞において発現されるという条件で使用される（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｍｏｓｓ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，６７４３−７、Ｇａｏ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ １９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，２８６７−７２、Ｌｉｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１７，４７−６６、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，４５２９−３７）。数人の研究者が、かかるプロモーターから発現された核酸分子が、哺乳動物細胞において機能し得ることを実証している（例えば、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５、Ｏｊｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０８０２−６、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６３４０−４、Ｌ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＥＭＢＯ Ｊ．，１１，４４１１−８、Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，９０，８０００−４、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３，２２５９、Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ & Ｃｅｃｈ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，１５６６）。より具体的には、Ｕ６低分子核酸（ｓｎＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、およびアデノウイルスＶＡ ＲＮＡをコードする遺伝子から誘導されたものなどの転写ユニットは、高濃度の所望のＲＮＡ分子、例えばｓｉＮＡを細胞中に生成する際に有用である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，上記参照、Ｃｏｕｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，上記参照、Ｎｏｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２２，２８３０、Ｎｏｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，６２４，８０３号、Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４，４５、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９６／１８７３６号）。上記の核酸転写ユニットは、様々なベクターに組み込んで哺乳動物細胞に導入するたことができ、これにはプラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターなど）、またはウイルスＲＮＡベクター（レトロウイルスベクターまたはアルファウイルスベクターなど）が含まれるが、これらに限定されない（Ｃｏｕｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６、上記参照）。
核酸分子は、真核生物プロモーターから細胞内で発現させることができる（例えば、Ｉｚａｎｔ ａｎｄ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９，３４５、ＭｃＧａｒｒｙ ａｎｄ Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８３，３９９、Ｓｃａｎｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１０５９１−５、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５、Ｄｒｏｐｕｌｉｃ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６，１４３２−４１、Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，５５３１−４、Ｏｊｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０８０２−６、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９、Ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１２２２−１２２５、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３，２２５９、Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，４，４５）。当業者は、適切なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから、真核細胞中で任意の核酸を発現させることができることを理解する。かかる核酸の活性は、酵素的核酸により、一次転写産物からそれらの核酸を放出することによって増加させることができる（Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ第ＷＯ９３／２３５６９号、およびＳｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ第ＷＯ９４／０２５９５号、Ｏｈｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，２７，１５−６、Ｔａｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９，５１２５−３０、Ｖｅｎｔｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，３２４９−５５、Ｃｈｏｗｒｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２５８５６）。
ウイルス粒子中にパッケージングされたウイルス構築物は、発現構築物の細胞への効率的な導入、および発現構築物によりコードされるｄｓＲＮＡ構築物の転写の両方を達成するであろう。
経口導入のための方法には、その生物の食物へのＲＮＡの直接混入、ならびに食物として使用される種をＲＮＡを発現するように操作し、影響を受ける生物に摂取させる、工学的手法が含まれる。物理的方法を用いて、核酸分子溶液を細胞に導入してもよい。核酸を導入する物理的方法には、核酸分子を含有する溶液の注入、核酸分子で被覆した粒子による衝撃、細胞または生物のＲＮＡ溶液への浸漬、または核酸分子の存在下での細胞膜のエレクトロポレーションが含まれる。
核酸を細胞に導入するための当技術分野において公知の他の方法、例えばリン酸カルシウムなどの化学物質媒介輸送などを用いてもよい。したがって、核酸分子は、以下の活性のうちの１つまたは複数を行う成分とともに導入してもよい：細胞によるＲＮＡの取り込みを強化する、二本鎖のアニーリングを促進する、アニールされた鎖を安定化する、あるいは標的遺伝子の阻害／下方制御を向上する。
高分子ナノカプセルまたはマイクロカプセルは、カプセル化されたまたは結合したｄｓＲＮＡの細胞中への輸送および放出を容易にする。これらは、ポリマー材料およびモノマー材料を含み、特にポリブチルシアノアクリレートを含む。材料および製造方法の概要は公開されている（Ｋｒｅｕｔｅｒ，１９９１を参照）。重合／ナノ粒子生成ステップにおいてモノマー前駆物質および／またはオリゴマー前駆物質から形成されるポリマー材料は、ナノ粒子製造分野の当業者が通常の技能により適切に選択することができるポリマー材料の分子量および分子量分布と同様に、先行技術から自体公知である。
核酸分子は、マイクロエマルジョンとして製剤化することもできる。マイクロエマルジョンは、単一の光学的等方性かつ熱力学的に安定な液体溶液である、水、油、および両親媒性物質の系である。通常は、マイクロエマルジョンは、まず油を界面活性剤水溶液に分散させ、次いで十分な量の４番目の成分、一般に中間鎖長のアルコールを添加して、透明の系を形成することによって調製する。
マイクロエマルジョンの調製に使用可能な界面活性剤には、単独または共界面活性剤と組み合わせた、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレエート（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡ０７５０）が含まれるが、これらに限定されない。通常はエタノール、１−プロパノール、および１−ブタノールなどの短鎖アルコールである共界面活性剤は、界面活性剤膜に浸透し、その結果、界面活性剤分子間に生じた空隙により不規則な膜を作成することで、界面流動性を増加させる役割を果たす。
送達製剤は、１つまたは複数の分解性架橋性脂質部分、１つまたは複数のＰＥＩ部分、および／または１つもしくは複数のｍＰＥＧ（ＰＥＧのメチルエーテル誘導体（メトキシポリ（エチレングリコール））を含む水溶性かつ分解性の架橋ポリマーを含んでもよい。
投与量
有用な投薬量および個々の投与方式は、当業者が容易に理解するであろうように、細胞型、またはインビボでの使用の場合、年齢、体重、ならびに治療する個々の動物およびその領域、使用する個々の核酸および送達方法、意図される治療上または診断上の使用、また例えば、懸濁剤、乳剤、ミセル、またはリポソームのような製剤の形態などの要因に応じて異なることになる。通常は、投与量は、低レベルで投与され、所望の効果が達成されるまで増加される。
本明細書における目的での「治療的有効用量」は、したがって、当技術分野において知られているような検討項目によって決定される。用量は、生存率の改善もしくはより迅速な回復、または症状の改善もしくは解消、および当業者により適切な尺度として選択されるような他の指標が含まれるが、これらに限定されない改善を達成するのに有効でなければならない。
適切な量の核酸分子を導入してよいが、この量は標準的方法を用いて経験的に決定することができる。細胞環境における個々の核酸分子種の有効な濃度は、約１フェムトモル、約５０フェムトモル、１００フェムトモル、１ピコモル、１．５ピコモル、２．５ピコモル、５ピコモル、１０ピコモル、２５ピコモル、５０ピコモル、１００ピコモル、５００ピコモル、１ナノモル、２．５ナノモル、５ナノモル、１０ナノモル、２５ナノモル、５０ナノモル、１００ナノモル、５００ナノモル、１マイクロモル、２．５マイクロモル、５マイクロモル、１０マイクロモル、１００マイクロモル、またはそれ以上であってもよい。
一般に、ヒトの場合の核酸化合物の活性用量は、単回用量、１〜４週間またはそれ以上の期間にわたる１日１用量、または１日２用量もしくは３用量以上のの投与計画で、１日に受容者の体重１ｋｇ当り１ｎｇから約２０〜１００ｍｇの範囲、好ましくは１日に受容者の体重１ｋｇ当り約０．０１ｍｇから約２〜１０ｍｇの範囲である。核酸分子の適切な投薬単位は、１日に受容者の体重１キログラム当り０．００１〜０．２５ミリグラムの範囲、または１日に体重１キログラム当り０．０１〜２０マイクログラム範囲、または１日に体重１キログラム当り０．０１〜１０マイクログラムの範囲、または１日に体重１キログラム当り０．１０〜５マイクログラムの範囲、または１日に体重１キログラム当り０．１〜２．５マイクログラムの範囲であってもよい。投与量は、体重１ｋｇ当り０．０１μｇ〜１ｇ（例えば、体重１ｋｇ当り０．１μｇ、０．２５μｇ、０．５μｇ、０．７５μｇ、１μｇ、２．５μｇ、５μｇ、１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ、１００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、１ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇ、または５００ｍｇ）であってもよい。
１日に体重１キログラム当り約０．１ｍｇ〜約１４０ｍｇ程度の投与量レベルは、上に示した状態の治療に有用である（１日に１対象当り約０．５ｍｇ〜約７ｇ）。単一剤形を作製するために担体材料と配合可能な活性成分の量は、治療されるホストおよび特定の投与方式に応じて異なる。単位剤形は、一般に、約１ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分を含有する。
いかなる個々の対象に対する特定の用量レベルも使用する特定の化合物の活性、年齢、体重、全般的な健康、性別、食事、投与時間、投与経路、および排泄速度、薬剤の組合せ、ならびに治療を受ける個々の疾患の重症度を含む様々な要因に応じて異なることは理解される。
本発明の化合物は、従来のいずれの投与経路によって投与してもよい。この化合物は、化合物としてまたは薬学的に許容される塩として投与可能であり、また単独で、または薬学的に許容される担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバント、およびビヒクルと組み合わせて、活性成分として投与可能であることに留意すべきである。化合物は、経口的、皮下的、または非経口的に投与してもよく、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、眼内、および／または耳内投与、ならびに髄腔内および輸液手技を含む。また、化合物の移植片も有用である。液体形態は、注入用に調製され、該用語は、皮下、経皮、静脈内、筋肉内、髄腔内、経鼓膜の注入、および他の非経口投与経路を含む。液体組成物は、有機共溶媒を含む、または含まない水溶液、水性または油性の懸濁液、食用油を含む乳剤、および同様の薬学的ビヒクルを含む。一実施形態において、投与は、静脈内投与を含む。好ましい実施形態において、投与は、局所投与、とりわけ外耳道への局所投与、鼓膜への局所投与、眼への局所投与、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、本願の化合物は、点耳剤として鼓膜に適用される。いくつかの実施形態において、本願の化合物は、点眼剤として眼に適用される。いくつかの好ましい実施形態において、本明細書において開示されるｄｓＲＮＡ分子は、点耳剤による経鼓膜注入によって投与される。他の実施形態において、本明細書において開示されるｄｓＲＮＡ分子は、硬膜外投与またはくも膜下投与によって投与される。
本明細書において開示される核酸分子を含む薬学的組成物は、１日１回（ＱＤ）、１日２回（ｂｉｄ）、１日３回（ｔｉｄ）、１日４回（ｑｉｄ）、または任意の間隔で、また医学的に適切な任意の期間投与してよい。しかしながら、治療薬は、１日を通して適切な間隔で投与される、２回、３回、４回、５回、６回またはそれ以上の副用量を含む投薬単位で投与してもよい。その場合、各副用量に含まれる核酸分子をそれに対応して少なくして、１日当りの総投薬単位を達成することができる。投薬単位は、例えば、数日間の期間にわたって、ｄｓＲＮＡの持続および一貫した放出を提供する従来の持続放出製剤を用いて、数日間にわたる単回用量用に調合することもできる。持続放出製剤は、当技術分野において公知である。投薬単位は、相当する倍数の１日用量を含有してもよい。組成物は、複数単位の核酸の合計が十分な用量を含有するように調合することができる。
薬学的組成物、キット、および容器
また、核酸分子を患者に投与および配布するための、本明細書において提供されるＲｈｏＡの発現を下方制御するための核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ分子）を含む、組成物、キット、容器、および製剤も提供される。キットは、少なくとも１つの容器および少なくとも１つのラベルを含み得る。好適な容器には、例えば、瓶、バイアル、注射器、および試験管が含まれる。容器は、ガラス、金属、またはプラスチックなどの様々な材料で作られていてよい。容器は、アミノ酸配列、小分子、核酸配列、細胞集団、および／または抗体、および／または関連の実験、予後、診断、予防、および治療の目的で必要とされる任意の他の成分を保持することができる。かかる使用についての指示および／または用法は、かかる容器上にまたは容器とともに、試薬および他の組成物またはこのような目的で使用される器具と同様に含まれていてよい。
容器は、代替的に、状態の治療、診断、予後、または予防に有効な組成物を保持してもよく、また無菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、静注溶液バッグ、または皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであってよい）。組成物中の活性成分は、ＲｈｏＡ ｍＲＮＡを特異的に結合させる、および／またはＲｈｏＡの機能を下方制御する核酸分子であってよい。
キットは、薬学的に許容される緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、および／またはデキストロース溶液を含む第２の容器さらに含んでもよい。これは、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよく、これには他の緩衝液、希釈剤、フィルター、撹拌器、針、注射器、および／または指示および／または使用説明を含む添付文書が含まれ得る。
米国連邦法により、ヒトの治療における薬学的組成物の使用には、連邦政府機関による承認が求められる。米国では、食品医薬品局（ＦＤＡ）が実施を担当し、ＦＤＡはそのような承認のための適切な規制を発行し、これは２１ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§３０１−３９２に詳述されている。動物の組織から作製される製品を含む生物材料に関する規制は、４２ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§２６２に規定されている。諸外国のほとんどは同様の承認を要求している。規制は国によって異なるが、個々の手順は当業者に公知であり、本明細書において開示される組成物および方法は、好ましくは適宜準拠する。
本明細書において開示される核酸分子は、ＲｈｏＡに関連する疾患、状態、または障害、例えばＣＮＳ、ＰＮＳ、前庭感覚系、視覚系、および／または循環（脈管、動脈）系における疾患、傷害、状態、または病態、ならびに細胞または組織中のＲｈｏＡレベルに関連するまたはそれに応答する任意の他の疾患または状態（例えば、異常なおよび／または混乱した細胞運動、細胞骨格調節、および／または微小管構築に関連する疾患または障害）を治療するために、単独または他の治療法と組み合わせて使用することができる。したがって、本明細書において開示される組成物、キット、および方法は、ラベルまたは添付文書を含んで、本明細書において開示される核酸分子をパッケージ化することを含んでもよい。ラベルは、脊髄傷害（ＳＣＩ）、緑内障、ＮＡＩＯＮ、アルツハイマー病、メニエール病、および本明細書において開示される任意の他の疾患または状態を含むがこれらに限定されない中枢神経系（ＣＮＳ）、末梢神経系（ＰＮＳ）、視覚系、循環（脈管、動脈）系、または前庭系の疾患、障害、傷害、および状態の治療、または防止のための使用など、核酸分子の使用のための指示を含んでもよい。ラベルは、ニューロン変性の治療または防止または軽減のための使用など、核酸分子の使用のための指示を含んでもよい。神経変性には、例えば、視神経および網膜神経節細胞を含む網膜、聴神経（内耳神経または聴覚神経としても知られ、内耳から脳への音および平衡情報の伝達に関与する）、蝸牛神経と前庭神経とからなり、延髄から出て、顔面神経とともに側頭骨内の内耳道（または内聴道）を通って頭蓋内に入る聴神経を介して脳に情報を伝達する内耳の有毛細胞の変性が含まれる。ラベルは、悪性腫瘍または癌の治療または防止のための使用など、核酸分子の使用のための指示を含んでもよい。ラベルは、単独または他の治療法と組み合わせた、細胞または組織中のＲｈｏＡレベルに関連するまたはそれに応答する任意の他の疾患または状態の治療または防止のための使用など、核酸分子の使用のための指示を含んでもよい。ラベルは、ＲｈｏＡの発現を減少させる、および／または下方制御する際の使用のための指示を含んでもよい。「添付文書」とは、治療用製品の商品パッケージに慣例的に含まれる使用説明書を指して使用され、これは適応症、使用法、投与量、用法、禁忌、パッケージ化されている製品と併用する他の治療用製品、および／またはそのような治療用製品の使用に関する注意などについての情報を含む。
当業者は、当技術分野において周知の他の治療、薬物、および療法が、本明細書の核酸分子（例えば、ｄｓＮＡ分子）と容易に組み合わせることができ、したがって本明細書において想定されていることを理解するであろう。
治療方法
別の態様において、本発明は、ＲｈｏＡの異常発現に関連する疾患または障害の治療の必要性がある対象の治療のための方法であって、ある量のＲｈｏＡの発現を減少または阻害する阻害剤を対象に投与することを含む方法に関する。
ＲｈｏＡは、細胞骨格の調節、ひいては細胞骨格再構築に関連する全ての過程、例えば、細胞運動、侵入、増殖に関与するＧＴＰａｓｅである。その神経再生との関連性は、それらの特性に直接起因している。
一実施形態において、核酸分子を用いて、疾患または状態（例えば、神経変性）と関連する、ＲｈｏＡおよび／またはＲｈｏＡおよび／またはＲｈｏＡハプロタイプ多型から生じるＲｈｏＡタンパク質の発現を下方制御または阻害することができる。ＲｈｏＡおよび／またはＲｈｏＡ遺伝子、あるいはＲｈｏＡおよび／またはＲｈｏＡタンパク質、あるいはＲＮＡレベルの分析を用いて、そのような多型を有する対象、または本明細書に記載する特性、状態、または疾患を発症する危険性がある対象を特定することができる。これらの対象は、治療、例えば、本明細書において開示される核酸分子ならびにＲｈｏＡおよび／またはＲｈｏＡ遺伝子発現に関連する疾患の治療に有用な任意の他の組成物を用いた治療に適している。したがって、ＲｈｏＡおよび／またはＲｈｏＡタンパク質あるいはＲＮＡレベルの分析を用いて、治療の種類および対象を治療する際の治療過程を決定することができる。ＲｈｏＡおよび／またはＲｈｏＡタンパク質あるいはＲＮＡレベルをモニターすることにより、治療成果を予測し、特性、状態、または疾患に関連する特定のＲｈｏＡおよび／またはＲｈｏＡタンパク質のレベルおよび／または活性を調節する化合物および組成物の有効性を判定することができる。
ＲｈｏＡ遺伝子発現を下方制御することができる、またはＲｈｏＡ遺伝子発現に対するＲＮＡ干渉を媒介することができる、本明細書において提供されるような小核酸分子、例えば低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子、および低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を使用することによる、ＲｈｏＡ発現の阻害のための組成物および方法が提供される。また、本明細書において開示される組成物および方法は、種々の状態または疾患、例えばＣＮＳ、ＰＮＳ、および前庭感覚系の障害、疾患、および傷害、目の障害、メニエール病、ならびに疼痛を治療する際にも有用である。
本明細書において開示される核酸分子は、独立して、または他の薬物と組み合わせて、もしくは併用して、本明細書に記載される疾患、障害、および傷害などのＲｈｏＡに関連する疾患、特性、状態、および／または障害を防止または治療するために使用することができる。
本明細書において開示される核酸分子は、配列特異的な形でＲｈｏＡの発現を調節することができる。核酸分子は、ＲｈｏＡ ｍＲＮＡの一部に少なくとも部分的に相補的な（アンチセンス）隣接ヌクレオチドを含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、ＲｈｏＡに対して特異的なｄｓＲＮＡは、神経保護および／または神経再生および／または神経形成を助ける他の治療薬および／または他の分子標的に対して特異的なｄｓＲＮＡと併用することができ、これには神経ステロイド（例えば、プロゲステロン、プレグネノロン）、抗不安薬（例えば、Ｅｔｉｆｏｘｉｎ）、成長因子、神経栄養因子（例えば、ＣＮＴＦ）、眼圧（ＩＯＰ）降下薬、（例えば、ラタノプロスト（Ｘａｌａｔａｎ（登録商標）））、幹細胞を含むが、これらに限定されない。
神経変性障害、神経障害、腫瘍障害、および脳血管障害を、本明細書において開示される核酸分子を用いたＲＮＡ干渉によって治療することができる。例示的神経変性障害には、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄傷害、および他の神経変性障害がある。本明細書において開示される核酸分子は、配列特異的な形でＲｈｏＡの発現を下方制御することができる。
対象または生物におけるＲｈｏＡに関連する疾患または状態を治療または防止するための方法は、対象または生物におけるＲｈｏＡ遺伝子の発現を下方制御するのに適した条件下で、対象または生物を本明細書において提供されるような核酸分子に接触させることを含み得る。
対象または生物における神経変性を治療または防止するための方法は、対象または生物におけるＲｈｏＡ遺伝子の発現を下方制御するのに適した条件下で、対象または生物を核酸分子に接触させることを含み得る。
対象または生物における、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病（ＰＤ）、血管拡張性運動失調症（ＡＴ）、脳卒中後認知症（ＰＳＤ）、眼神経変性疾患、および／または聴神経変性疾患からなる群から選択される神経変性障害を治療または防止するための方法は、対象または生物におけるＲｈｏＡ遺伝子の発現を下方制御するのに適した条件下で、対象または生物を核酸分子に接触させることを含み得る。
対象または生物における脊髄傷害（ＳＣＩ）、脳傷害、神経系の障害、脳卒中、およびパーキンソニズムからなる群から選択される中枢神経系の傷害を治療または防止するための方法は、対象または生物におけるＲｈｏＡ遺伝子の発現を下方制御するのに適した条件下で、対象または生物を核酸分子に接触させることを含み得る。
対象または生物における目の虚血状態、例えば前部虚血性視神経ニューロパシーからなる群から選択される脳血管障害を治療または防止するための方法は、対象または生物におけるＲｈｏＡ遺伝子の発現を下方制御するのに適した条件下で、対象または生物を核酸分子に接触させることを含み得る。
対象または生物におけるニューロパシーを治療または防止するための方法は、対象または生物におけるＲｈｏＡ遺伝子の発現を下方制御するのに適した条件下で、対象または生物を核酸分子に接触させることを含み得る。
自律神経ニューロパシー、癌性ニューロパシー、圧迫性ニューロパシー、糖尿病性ニューロパシー、薬剤性ニューロパシー、中毒性ニューロパシー、化学療法誘発性ニューロパシー、胃腸ニューロパシー、栄養性ニューロパシー、遺伝性ニューロパシー、免疫介在性ニューロパシーおよび慢性免疫介在性多発ニューロパシー、感染性ニューロパシー、ならびにニューロパシー性疼痛からなる群から選択される対象におけるニューロパシーを治療または防止する方法は、対象または生物におけるＲｈｏＡ遺伝子の発現を下方制御するのに適した条件下で、対象または生物を核酸分子に接触させることを含み得る。いくつかの実施形態において、本発明は、糖尿病性ニューロパシーを患っている対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象はアロディニアに罹患している。
対象または生物における神経再生を促進するための方法は、対象または生物におけるＲｈｏＡ遺伝子の発現を下方制御するのに適した条件下で、対象または生物を核酸分子に接触させることを含み得る。
対象または生物に神経保護を与えるための方法は、対象または生物におけるＲｈｏＡ遺伝子の発現を下方制御するのに適した条件下で、対象または生物を核酸分子に接触させることを含み得る。
自律神経ニューロパシー、癌性ニューロパシー、圧迫性ニューロパシー、糖尿病性ニューロパシー、薬剤性ニューロパシー、中毒性ニューロパシー、化学療法誘発性ニューロパシー、胃腸ニューロパシー、栄養性ニューロパシー、遺伝性ニューロパシー、免疫介在性ニューロパシー、感染性疾患媒介ニューロパシー、ニューロパシー性疼痛、およびアロディニアからなる群から選択されるニューロパシーの危険性がある、またはニューロパシーを患っている対象または生物に神経保護を与える方法は、対象または生物におけるＲｈｏＡ遺伝子の発現を下方制御するのに適した条件下で、対象または生物を核酸分子に接触させることを含み得る。
神経系の傷害または神経変性疾患に罹患している対象または生物に神経保護を与える方法は、対象または生物におけるＲｈｏＡ遺伝子の発現を下方制御するのに適した条件下で、対象または生物を核酸分子に接触させることを含み得る。
対象または生物における異常なおよび／または混乱した細胞運動、細胞骨格調節に関連する疾患または障害を治療または防止するための方法は、対象または生物におけるＲｈｏＡ遺伝子の発現を下方制御するのに適した条件下で、対象または生物を核酸分子に接触させることを含み得る。
対象または生物における血管新生障害、血管疾患、および／または動脈疾患を治療または防止するための方法は、対象または生物におけるＲｈｏＡ遺伝子の発現を下方制御するのに適した条件下で、対象または生物を核酸分子に接触させることを含み得る。
対象または生物における眼球血管新生疾患または障害を治療または防止するための方法は、対象または生物におけるＲｈｏＡ遺伝子の発現を下方制御するのに適した条件下で、対象または生物を核酸分子に接触させることを含み得る。
角膜血管新生疾患または障害、網膜血管新生疾患または障害、脈絡膜血管新生疾患または障害、あるいはそれらの組み合わせからなる群から選択される眼球血管新生疾患または障害を治療または防止するための方法は、対象または生物におけるＲｈｏＡ遺伝子の発現を下方制御するのに適した条件下で、対象または生物を核酸分子に接触させることを含み得る。
対象または生物における網膜症を治療または防止するための方法は、対象または生物におけるＲｈｏＡ遺伝子の発現を下方制御するのに適した条件下で、対象または生物を核酸分子に接触させることを含み得る。
対象または生物における糖尿病性網膜症を治療または防止するための方法は、対象または生物におけるＲｈｏＡ遺伝子の発現を下方制御するのに適した条件下で、対象または生物を核酸分子に接触させることを含み得る。
角膜移植対象または生物における角膜移植片拒絶反応を治療または防止するための方法は、対象または生物におけるＲｈｏＡ遺伝子の発現を下方制御するのに適した条件下で、対象または生物を核酸分子に接触させることを含み得る。
対象または生物における再狭窄を治療または防止するための方法は、対象または生物におけるＲｈｏＡ遺伝子の発現を下方制御するのに適した条件下で、対象または生物を核酸分子に接触させることを含み得る。
対象または生物における癌、または悪腫瘍、または癌腫、または腫瘍形成を治療または防止するための方法は、対象または生物におけるＲｈｏＡ遺伝子の発現を下方制御するのに適した条件下で、対象または生物を核酸分子に接触させることを含み得る。
好ましい実施形態において、治療される対象は、温血動物、とりわけヒトを含む哺乳動物である。
本発明の方法は、ＲｈｏＡの発現を下方制御する１つまたは複数の阻害性化合物、とりわけｓｉＲＮＡを治療有効用量で対象に投与することを含み、それによって対象を治療する。
「治療」という用語は、上にあげる関連障害を防止または遅延（軽減）することを目的とする、治療的処置および予防または防止措置の双方を指す。治療の必要性がある者には、既にその疾患または状態を経験している者、その疾患または状態を生じる傾向がある者、およびその疾患または状態が予防されるべき者が含まれる。本発明の化合物は、それに関連する疾患または状態または症状の発病の前、最中、または後に投与してよい。処置が予防目的である場合、本発明は、疾患または障害の発病を遅延させるまたはその発症を回避するための方法に関する。
本発明は、ＲｈｏＡの発現の下方制御が有益である疾患または状態の治療における、ＲｈｏＡの発現を下方制御する化合物、とりわけ新規の二本鎖ＲＮＡ化合物（ｄｓＲＮＡ）の使用に関する。
ＲｈｏＡを下方制御する方法、分子、および組成物は、本明細書において詳細に説明され、また、前記分子および／または組成物のいずれも前記状態のいずれを患っている対象の治療においても有益に使用することができる。ＲｈｏＡを対象とするｓｉＲＮＡの調製において有用な好ましいオリゴマー配列は、表Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶに記載する。
本発明の化合物が治療剤として有用な特定の適応症の詳細が、本明細書に記載される。
本発明は、実施例を参照して以下に詳細に例示されるが、それに限定されると解釈されるべきではない。
本明細書中のいかなる文書の引用も、このような文書が関連する従来技術であることの承認であること、または本出願の任意の特許請求の範囲の特許性の問題とみなされることを意図しない。いかなる文書の内容または日付に関する任意の記述も、出願人が出願時に入手可能な情報に基づいており、このような記述の正確性の承認を構成するものではない。
実施例
分子生物学における一般的方法
当技術分野において公知であり、具体的に記載されていない標準的な分子生物学の技術に関しては、概ね、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）、およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）、およびＰｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）、およびＷａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、およびＢｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ（ｅｄｓ） Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌｓ．１−４ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）に記載されるもの、ならびに米国特許第４，６６６，８２８号、第４，６８３，２０２号、第４，８０１，５３１号、第，１９２，６５９号、および第５，２７２，０５７号に記載の方法論に従い、それらは参照により本明細書に組み込まれる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、概ね、ＰＣＲプロトコル：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されるように行った。フローサイトメトリーと組み合わせたインサイツ（細胞内）ＰＣＲは、特定のＤＮＡおよびｍＲＮＡ配列を含有する細胞の検出に使用することができる（Ｔｅｓｔｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｌｏｏｄ ８７：３８２２）。ＲＴ−ＰＣＲを実施する方法は当技術分野で周知である。
実施例１：ＲｈｏＡに対する活性ｄｓＲＮＡ化合物の配列の生成およびｄｓＲＮＡ化合物の生成
独自のアルゴリズムおよびヒトＲｈｏＡ ｍＲＮＡの配列（配列番号１）を使用し、多くの潜在的なｄｓＲＮＡ化合物の配列を生成した。本方法を用いて生成された配列は、対応するヒトＲｈｏＡ ｍＲＮＡ配列に完全に相補的であるか（表Ｉ「１８−ｍｅｒ」、表ＩＩＩおよびＩＶ「１９−ｍｅｒ」）、あるいはアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドと標的ｍＲＮＡとの間にミスマッチを含む（表ＩＩ、「１８＋１−ｍｅｒ」）。ヒトＲｈｏＡ ｍＲＮＡ、およびラット、マウス、アカゲザル、および／またはチンパンジーＲｈｏＡ ｍＲＮＡを含む少なくとももう１つの種に対して最も活性であると、独自のアルゴリズムを用いてコンピュータで予測された候補ｄｓＲＮＡ化合物を選択した。
ヒトＲｈｏＡ ｍＲＮＡのポリヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１６６４．２において特定され、配列番号１に記載する。ＲｈｏＡ ｍＲＮＡは、配列番号２に記載する、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１６５５．１において特定されるポリペプチドをコードする。各センスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列番号を表に記載する。本明細書の表中に以下の略記を使用する。「Ｘ＝−種」は、他の動物との異種間同一性を指す：Ｒｔ−ラット、Ｒｈ−アカゲザル、Ｍｓ−マウス、Ｃｐ−チンパンジー。ＯＲＦ：オープンリーディングフレーム。１９−ｍｅｒおよび１８＋１−ｍｅｒは、それぞれ長さが１９および１８＋１（アンチセンス鎖の１位にＵ、センス鎖の１９位にＡ）リボ核酸のオリゴマーを指す。
それぞれの選択された配列対（二重鎖）を３’末端ジヌクレオチドｄＴｄＴオーバーハングを有する１９−ｍｅｒ二重鎖（＿Ｓ７０９化合物）として試験する。
表Ｉ １８−ｍｅｒオリゴヌクレオチド対
表ＩＩ １８＋１−ｍｅｒオリゴヌクレオチド対
表ＩＩＩ １９−ｍｅｒオリゴヌクレオチド対
表ＩＶは、化学修飾ｄｓＲＮＡ分子を生成する際に有用なオリゴヌクレオチド対を提示する。これらのオリゴヌクレオチド対は、本願の譲受人の国際公開第ＷＯ２００９／０４４３９２号に開示されている。
表Ｖは、比較活性試験のためのオリゴヌクレオチド対を提示する。
これらのＲｈｏＡ ｄｓＲＮＡ（ｄｓＲｈｏＡ）分子、ならびに既に特定され、少なくともヒト種およびラット種と適合する活性ｄｓＲｈｏＡ化合物を合成し、ヒト細胞株における残存ＲｈｏＡ ｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲ分析を用いて、インビトロＲＮＡｉ活性を検査した５ｎＭ以下の濃度で少なくとも８５％のノックダウンを生じる（５ｍＭで残存ｍＲＮＡ１５％未満）ｄｓＲＮＡ化合物をラット細胞株において再試験し、さらなる最適化に進めた。化学修飾を組み込んで、ヌクレアーゼ耐性を与え、オンターゲット活性は維持または増加したままオフターゲット活性を低下させ、炎症誘発性応答を減少させることにより、選択された候補ｄｓＲＮＡ分子を最適化した。異なるタイプの化学修飾およびｄｓＲＮＡ配列を評価した。合成された化学修飾ｄｓＲＮＡを図１に示す。これらの修飾ｄｓＲＮＡ化合物を合成して、細胞培養においてＲＮＡｉ活性について検査した。親分子と比較して類似するまたは改善された活性を有するものをさらなる特徴付けに進めた。第１に、ｄｓＲＮＡ化合物のヌクレアーゼ耐性をヒト血漿、ヒト血清、ＣＳＦ（脳脊髄液）、および／または細胞溶解物中で評価した。血漿、血清、ＣＳＦ、および細胞溶解物中で少なくとも１０時間の安定性を示したｄｓＲＮＡ化合物をｐｓｉＣＨＥＣＫ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）ルシフェラーゼレポーターシステムを使用するオフターゲットアッセイに進めた。ルシフェラーゼ発現のＲＮＡｉ媒介阻害を細胞培養において分析した。
ｄｓＲＮＡ化合物による先天性免疫の可能性のある活性化の試験を３つの異なるインビトロ方法を用いて実施した：（ａ）ＴＬＲ／ＲＩＧ−Ｉ／Ｍｄａ５依存ルシフェラーゼレポーターのｄｓＲＮＡ活性化の評価、（ｂ）ｄｓＲＮＡで治療したヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）におけるサイトカイン産生の評価、（ｃ）ｄｓＲＮＡで治療したヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ応答遺伝子の発現を分析することによる、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の活性化の評価。当業者はこれらの方法に精通しており、これらを容易に実施する。
対照対のインビトロ試験
対照対は、１９−ｍｅｒ二重鎖と、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端に共有結合したジヌクレオチドｄＴｄＴとを有するｄｓＲＮＡ化合物を含む。この対照化合物は、ＲＨＯＡ＿Ｘ＿Ｓ７０９と称される。
ＲｈｏＡ遺伝子を内因的に発現する約２×１０５ヒトＰＣ３細胞を２４時間後に３０〜５０％のコンフルエンスに達するように１．５ｍＬの成長培地でインキュベートした。細胞に、トランスフェクト細胞当たりの最終濃度０．３〜５ｎＭまで、ｄｓＲＮＡ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標） ２０００試薬をトランスフェクトした。細胞を３７±１℃、５％ ＣＯ２で４８時間インキュベートした。Ｃｙ３標識ｄｓＲＮＡ二重鎖をトランスフェクション効率に対する陽性対照として使用した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標） ２０００試薬でのみ処理した細胞をノックダウン活性に対する陰性対照として使用した。ｄｓＲＮＡをトランスフェクトした細胞を採取し、ＥＺ−ＲＮＡ（商標）キット［Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（＃２０−４１０−１００）］を用いてＲＮＡを単離した。このプロトコルを用いて試験したｄｓＲＮＡ化合物には、表Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＶに記載の対が含まれる。非修飾１８＋Ａ二重鎖の活性データは、下記の表Ａに提示する。１８＋Ａとは、１９塩基対の二重鎖を指し、１〜１８位［（Ｎ’）ｙ］に標的ｍＲＮＡとの完全一致を有し、１９位にＡ（Ｎ２、アデノシン）を有するこのオリゴヌクレオチド（Ｎ’）ｙ−Ｎ２は、相補的オリゴヌクレオチド（Ｎ）ｘ−Ｎ１と二重鎖を形成する。化合物は非置換であり、インビトロでの活性を試験するために、３’ｄＴｄＴオーバーハングを含んで合成された。表Ａおよび表Ｂの活性結果は、濃度５ｎＭ、０．５ｎＭ、および０．１ｎＭでｄｓＲＮＡを適用後の残存標的％として提供される。
表Ａ‐両鎖に非修飾リボヌクレオチドを、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端にｄＴｄＴジヌクレオチドオーバーハングを含む１８＋１ｍｅｒ ｄｓＲＮＡのノックダウン活性結果（残存ｍＲＮＡ％）。
表Ｂ‐両鎖に非修飾リボヌクレオチドを、および両鎖の３’末端にｄＴｄＴジヌクレオチドオーバーハングを含む１９ｍｅｒ ｄｓＲＮＡのノックダウン活性結果（残存ｍＲＮＡ％）。
対照分子（７８〜８４）と比較したある特定の好ましい分子（４８、５０、５８）の活性を表Ｃに示す。
化学修飾ｄｓＲＮＡ分子およびプロファイルされた活性（ノックダウン）を、図１に提示する。修飾の凡例は、以下のとおりである：接頭辞「ｚ」は、３’または５’末端ヌクレオチドに共有結合した部分（ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド）を示す。例えば、ｚｄＴは、ｄＴオーバーハングを指し、ｚｄＴ；ｚｄＴは、ｄＴｄＴオーバーハングを指す。接頭辞「ｙ」は、ヌクレオチド置換を示し、例えばｙＬｄＡは、センス鎖またはアンチセンス鎖でリボヌクレオチドを置換したＬ−デオキシリボアデニンを指し、ｙｒＵは、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドで別のリボヌクレオチドを置換したウリジンを指す。接頭辞「ｍ」は、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを指す。さらなる符号を、下記の表Ｄに記載する。
表Ｄ−化学修飾ｄｓＲＮＡ分子の凡例
ＲｈｏＡ核酸化合物のインビトロ試験
細胞株：ヒト前立腺腺癌ＰＣ３細胞（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ＃ＣＲＬ−１４３５）を１０％ ＦＢＳおよび２ｍＭ Ｌ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ培地で成長させ、ヒト上皮子宮頸癌ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ＃ＣＣＬ−２）を１０％ ＦＢＳおよび２ｍＭ Ｌ−グルタミンを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。細胞を３７℃、５％ ＣＯ２で維持した。
ＲｈｏＡ遺伝子を内因的に発現する約２×１０５ヒトＰＣ−３細胞を２４時間後に３０〜５０％のコンフルエンスに達するように１．５ｍＬの成長培地でインキュベートした。細胞に、トランスフェクト細胞当たりの最終濃度０．１〜５ｎＭまで、ｄｓＲＮＡおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標） ２０００試薬をトランスフェクトした。細胞を３７±１℃、５％ ＣＯ２で４８時間インキュベートした。Ｃｙ３標識ｄｓＲＮＡ二重鎖をトランスフェクション効率に対する陽性対照として使用した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標） ２０００試薬で処理した細胞をｓｉＲＮＡ活性に対する陰性対照として使用した。ｄｓＲＮＡをトランスフェクトした細胞を採取し、ＥＺ−ＲＮＡ（商標）キット［Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（＃２０−４１０−１００）］を用いてＲＮＡを単離した。
試験したそれぞれのｄｓＲＮＡ二重鎖による標的遺伝子発現の阻害の割合は、細胞からの標的ｍＲＮＡのｑＰＣＲ分析によって測定した。細胞からｃＤＮＡを合成し、リアルタイムｑＰＣＲによって標的遺伝子ｍＲＮＡレベルを測定することにより、逆転写を実施した。各試料について、測定した細胞ｍＲＮＡレベルをサイクロフィリンＡ（ＣＹＮＡ、ＰＰＩＡ）ｍＲＮＡのものに対して正規化した。ｄｓＲＮＡで処理した試料中および非トランスフェクト対照試料中の標的遺伝子ｍＲＮＡ量の比率に基づいて、ノックダウン活性を決定した。
試験したそれぞれのｄｓＲＮＡ二重鎖による標的遺伝子発現の阻害の割合は、細胞からの標的ｍＲＮＡのｑＰＣＲ分析によって測定した。細胞からｃＤＮＡを合成し、リアルタイムｑＰＣＲによって標的遺伝子ｍＲＮＡレベルを測定することにより、逆転写を実施した。各試料について、測定した細胞ｍＲＮＡレベルをサイクロフィリンＡ（ＣＹＮＡ、ＰＰＩＡ）ｍＲＮＡのものに対して正規化した。ｄｓＲＮＡで処理した試料中および非トランスフェクト対照試料中の標的遺伝子ｍＲＮＡ量の比率に基づいて、ノックダウン活性を測定した。
ＲｈｏＡ ｄｓＲＮＡのヌクレアーゼ安定性の特徴付け
ｄｓＲＮＡ ＲｈｏＡ化合物のエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ安定性は以下のように測定した。
（１）ヒト血漿および／またはヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）（エンドヌクレアーゼ安定性）
非変性ゲルの臭化エチジウム（ＥｔｈＢｒ）染色によるｄｓＲＮＡ完全性の評価
変性ゲルから得られたノーザンブロットに対する配列特異的プローブのハイブリダイゼーションによる、二重鎖中の各ｄｓＲＮＡ鎖の安定性の評価
（２）ヒトＨＣＴ１１６の抽出物（エキソヌクレアーゼ安定性）
変性ゲルから得られたノーザンブロットに対する配列特異的プローブのハイブリダイゼーションによる、二重鎖中の各ｄｓＲＮＡ鎖の安定性の評価
（３）血漿中での安定性（エンドヌクレアーゼ耐性）
ＲｈｏＡ ｄｓＲＮＡ化合物をヒト全血漿またはＣＳＦ中、３７℃で最長２４時間インキュベートした。インキュベーション１時間、３時間、６時間、１２時間、および２４時間で、３μＬアリコートを回収して液体窒素中で瞬間凍結した。ｄｓＲＮＡ完全性を（１）１５％天然ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）による電気泳動（約４０ｎｇ／レーン）、次いで臭化エチジウム（ＥｔｈＢｒ）染色（ヒト血漿試料のみ）によって、（２）変性８Ｍ尿素８％ ＰＡＧＥによる電気泳動（１ｎｇ／レーン）（ホルムアミド中１：８７希釈物）、次いでナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ‐ＸＬ）への電気ブロッティング、およびｄｓＲＮＡ二重鎖のセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかを検出する放射性標識したオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによって分析した。５μＬのＰＢＳに溶解し、天然または変性ＰＡＧＥ加えた４０ｎｇまたは１ｎｇのｄｓＲＮＡそれぞれが、無傷の未処理ｄｓＲＮＡ分子の移動参照物質としての役割を果たした。非修飾ｄｓＲＮＡの対応物、即ち非修飾のリボヌクレオチドの全てとの同じヌクレオチド配列を有するｄｓＲＮＡ化合物をエンドヌクレアーゼ安定性の陰性対照として使用した。
ヒトＨＣＴ１１６細胞質抽出物中での安定性（エキソヌクレアーゼ耐性）：ｄｓＲＮＡ ＲｈｏＡ化合物のエキソヌクレアーゼ耐性は、ヒトＨＣＴ１１６の細胞質抽出物において、３７℃でのインキュベーションにより、異なる時間間隔（１時間、３時間、６時間、１２時間、または２４時間）について評価した。様々なインキュベーション時間後のｄｓＲＮＡ完全性を変性ゲル（ＰＡＧＥ）による電気泳動、ブロッティング、およびその後の放射性標識した鎖特異的プローブ（ｄｓＲＮＡ化合物二重鎖のセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかを検出するオリゴヌクレオチドプローブ）へのハイブリダイゼーションによって分析した。
試験した化合物の安定性結果は、本明細書において下記表Ｅ、Ｆ、およびＧに示す。安定性データは時間で示し、即ち２４は２４時間を指す。好ましい分子のいくつかは、血漿および／または血清中で３時間を上回って安定であった。
表Ｅは、対照化合物（ＲＨＯＡ＿４８、５０、および５８（Ｓ７０９））ならびにＲＨＯＡ４８およびＲＨＯＡ＿４８ｕに基づく化学修飾ｄｓＲＮＡの安定性を示す。
表Ｆは、ＲＨＯＡ＿５０に基づく化学修飾ｄｓＲＮＡの安定性データを示す。

表Ｇは、ＲＨＯＡ＿５８に基づく化学修飾ｄｓＲＮＡの安定性データを示す。
ＲｈｏＡ化合物のオンターゲットノックダウン活性とオフターゲットノックダウン活性の評価
ヒトＨｅＬａ細胞における活性：ｄｓＲＮＡ ＲｈｏＡ化合物（対非修飾対応物）のノックダウン効率を、ヒトＨｅＬａ細胞における「オンターゲット」ｐｓｉ−ＣＨＥＣＫ試験を用いて試験した（ｄｓＲＮＡ化合物のガイド鎖の対応する一致する相補的標的配列を含有するルシフェラーゼレポータープラスミド構築物の活性を分析する）。各ｄｓＲＮＡを４ｐＭ〜１００ｎＭの５種類の濃度でトランスフェクトした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅに暴露した細胞が陰性対照としての役割を果たした。
オフターゲット活性：ｄｓＲＮＡ ＲＨＯＡ化合物の可能性のあるシード媒介オフターゲット効果をｐｓｉ−ＣＨＥＣＫプラスミドレポーターシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ（商標））において分析した。このシステムは、
ガイド鎖（ＧＳ）‐完全に一致する配列に向けた「オンターゲット」活性；
ガイドシード領域‐「オフターゲット」ｍｉＲＮＡ様活性；
パッセンジャー鎖（ＰＳ）‐パッセンジャー鎖のＲＩＳＣへの競合取り込みによる「オフターゲット」効果（ＰＳ−ＣＭ）、の固有の可能性の評価を可能にする。
全ての標的配列をルシフェラーゼレポーター構築物の３’−ＵＴＲに挿入し、ルシフェラーゼレポータールミネセンス、次いでｄｓＲＮＡトランスフェクションの特異的減少としてｓｉＲＮＡ活性を測定した。４つのｐｓｉＣＨＥＣＫ（商標）−２に基づく構築物を各候補ｄｓＲＮＡ一次配列について調製した。これらのｐｓｉＣＨＥＣＫ構築物は、一致する相補的ガイド（ＧＳ−ＣＭ）またはパッセンジャー（ＰＳ−ＣＭ）鎖配列の単一コピー、またはガイドシード領域（ＧＳ−ＳＭ）に相補的な配列の３つのコピーであり、それらの間の最適距離でクローニングしたもの（最もストリンジェントな条件で潜在的シード媒介オフターゲット効果を試験するため）を含み、あるいは「フルセンサ」ｐｓｉＣＨＥＣＫ構築物は、ガイド「フルセンサ」配列の４つのタンデムコピーを含み、この配列は、センス鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖の２位〜８位（５’から３’の方向で）のシード領域、それに続く４つの非標的ヌクレオチドのスペーサ、次いで１３位〜１９位のアンチセンス鎖の中央領域からなる（これらの構築物は、極めて広範囲の塩基対合オフターゲットを模倣するために生成した）。
オンターゲット活性およびオフターゲット活性の結果は、下記の表Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、およびＵに示す。
表Ｈ ｄｓＲＨＯＡ＿４８およびｄｓＲＨＯＡ＿４８ｕ分子のアンチセンス鎖の標的との完全一致（オンターゲット）
表Ｊ ｄｓＲＨＯＡ＿４８およびｄｓＲＨＯＡ＿４８ｕ分子のアンチセンス鎖のその標的とのシード一致（オフターゲット）
表Ｋ ｄｓＲＨＯＡ＿４８およびｄｓＲＨＯＡ＿４８ｕ分子のセンス鎖の標的との完全一致（オフターゲット）
表Ｌ ｄｓＲＨＯＡ＿４８およびｄｓＲＨＯＡ＿４８ｕ分子のアンチセンス鎖のそのシードヌクレオチドおよびヌクレオチド１３〜１７との一致（オフターゲット）
表Ｍ ｄｓＲＨＯＡ＿５０分子のアンチセンス鎖のその標的との完全一致（オンターゲット）
表Ｎ ＲＨＯＡ＿５０分子のアンチセンス鎖のシードとのシード一致（オフターゲット）
表Ｐ ｄｓＲＨＯＡ＿５０分子のセンス鎖のその標的との完全一致（オフターゲット）
表Ｑ ｄｓＲＨＯＡ＿５０分子のアンチセンス鎖のシードヌクレオチド＋ヌクレオチド１３〜１７との一致（オフターゲット）
表Ｒ ｄｓＲＨＯＡ＿５８分子のアンチセンス鎖の標的との完全一致
表Ｓ ｄｓＲＨＯＡ＿５８分子のアンチセンス鎖シードとのシード一致（オフターゲット）
表Ｔ ｄｓＲＨＯＡ＿５８分子のセンス鎖のその標的との完全一致（オフターゲット）
表Ｕ ｄｓＲＨＯＡ＿５８分子のアンチセンス鎖のシードヌクレオチド＋ヌクレオチド１３〜１７との一致（オフターゲット）
候補分子
特定の現在好ましいｄｓＲＮＡ（ｄｓＲＨＯＡ）分子を表Ｗに記載し、ノックダウン活性（ｑＰＣＲ）、オンターゲット（Ｐｓｉ−ＡＳ−ＣＭ）、オフターゲット（Ｐｓｉ−ＡＳ−ＳＭおよびＰｓｉ−Ｓ−ＳＭ）、およびアンチセンス鎖安定性データを各分子について提示する。
ｎａ：該当なし。試験していないか、あるいはアッセイがＱＣを通過しなかった。
５ｎＭでのｑＰＣＲノックダウン：＋＋＋ ≦１５％；＋＋ １５<３０％；＋ ３１<５０％

ＲＨＯＡ ｄｓＲＮＡ分子に対する先天的免疫応答：
新鮮なヒト血液（室温）を室温で滅菌０．９％ ＮａＣｌと１：１の比率で混合し、Ｆｉｃｏｌｌ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ，Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ ｃａｔ＃１１１４５４７）に徐々に加える（比率１：２）。スイング式遠心分離機で試料を室温で３０分間遠心分離し（２２℃、８００ｇ）、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し、１０分間遠心分離する（室温、２５０ｇ）。細胞を計数し、最終濃度１．５×１０６細胞／ｍＬで成長培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋２ｍＭ Ｌ−グルタミン＋１％ Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ）に播種し、ｄｓＲＮＡ処理の前に３７℃で１時間インキュベートする。
製造業者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標） ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、細胞を異なる濃度の試験ｄｓＲＮＡと接触させ、５％ ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間インキュベートする。
ＩＦＮ応答に対する陽性対照として、細胞を最終濃度０．２５〜５．０μｇ／ｍＬのＴＬＲ３リガンドである二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の合成類似体のポリ（Ｉ：Ｃ）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ Ｃａｔ＃ｔｌｒｌ−ｐｉｃ）、または最終濃度０．０７５〜２μｇ／ｍＬのＴＬＲ ７／８リガンドであるチアゾロキノロン（ＣＬＯ７５）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ Ｃａｔ＃ｔｌｒｌ−ｃ７５）で処理する。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標） ２０００試薬で処理した細胞をＩＦＮ応答に対する陰性（参照）対照として使用した。
インキュベーション約２４時間後に、細胞を回収し、上清を新しい試験管に移す。試料を液体窒素中で即座に凍結し、ＩＬ−６ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ ＤＹ２０６０）およびＴＮＦ−α ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ ＤＹ２１０）を用いて、製造業者の指示に従って、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αサイトカインの分泌を試験する。ＲＮＡを細胞ペレットから抽出し、ヒト遺伝子ＩＦＩＴ１（テトラトリコペプチド反復配列１を含むインターフェロン誘導タンパク質）およびＭＸ１（ミクソウイルス（インフルエンザウイルス）耐性１、インターフェロン誘導性タンパク質ｐ７８）のｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲによって測定した。測定したｍＲＮＡの量を参照遺伝子ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（サイクロフィリンＡ；ＣｙｃｌｏＡ）の量に対して正規化した。ＩＦＮシグナル伝達の誘導を、処理細胞からのＩＦＩＴ１遺伝子およびＭＸ１遺伝子からのｍＲＮＡの量を未処理細胞における量と比較することによって評価する。ｑＰＣＲ結果は、ＱＣ基準を通過したもの、即ち標準曲線の傾きの値が間隔［−４、−３］であり、Ｒ２>０．９９であり、プライマーダイマーが存在しなかったものである。ＱＣ要件を通過しなかった結果は、分析に不適格とする。
実施例２：動物モデル
緑内障のモデル系
緑内障の治療および防止に関する本発明の活性ｄｓＲＮＡ化合物の試験は、例えばＭａｅｄａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，"Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ ａｇａｉｎｓｔ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｇａｎｇｌｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｄａｍａｇｅ ｉｎ ａ Ｇｌａｕｃｏｍａ Ｍｏｄｅｌ ａｎｄ ａｎ Ｏｐｔｉｃ Ｎｅｒｖｅ Ｃｒｕｓｈ Ｍｏｄｅｌ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ"，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＩＯＶＳ），Ｍａｒｃｈ ２００４，４５（３）８５１に記載されている、視神経挫滅のラット動物モデルで実施する。具体的には、視神経切断のために、麻酔したラットの眼窩内視神経（ＯＮ）を眼窩上手技により露出し、髄膜を切断し、篩板から２ｍｍを１０秒間鉗子で挫滅することにより、ＯＮの全ての軸索を切断する。
本明細書において開示されるＲｈｏＡ ｄｓＲＮＡ化合物は、この動物モデルで試験され、結果はこれらのＲｈｏＡ ｄｓＲＮＡ化合物が、緑内障の治療および／または防止に有用であることを示している。
ラット視神経挫滅（ＯＮＣ）モデル：硝子体内（ＩＶＴ）ｄｓＲＮＡ送達および点眼剤ｄｓＲＮＡ送達
視神経切断のために、麻酔したラットの眼窩内視神経（ＯＮ）を眼窩上手技により露出し、髄膜を切断し、篩板から２ｍｍを１０秒間鉗子で挫滅することにより、ＯＮの全ての軸索を切断する。
ｄｓＲＮＡ化合物を単独または組み合わせて、点眼剤として５ｕＬ容量（１０ｕｇ／ｕＬ）で送達する。視神経挫滅（ＯＮＣ）後即座に、２０μｇ／１０μＬの試験ｄｓＲＮＡ化合物または１０μＬのＰＢＳを成体ウィスターラットの片眼または両眼に投与し、注入５時間後および１日後、さらに２日後、４日後、７日後、１４日後、および２１日後に、切除し瞬間凍結した全網膜に取り込まれたｄｓＲＮＡのレベルを測定する。点眼剤により投与されたｄｓＲＮＡ化合物の活性および有効性を試験するために、同様の実験を実施する。
ＭＡＳＣＩＳラット脊髄傷害モデル
ほとんどのヒト脊髄障害は、脊髄の挫傷に関わる。ラット脊髄挫傷の衝突モデルは、一貫した傷害を生成し、細胞外カリウムおよびカルシウム移動、下降誘発応答、ならびに脊髄の病変体積を含む様々な評価基準に反映されるように、薬物候補を試験するための非常に貴重なインビボモデルを提供する（Ｐｉｎｚｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８ａ、Ｐｉｎｚｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８ｂ）。このモデルは、メチルプレドニゾロン（ＭＰ）治療による、７匹のみのラットで有意な病変体積変化を検出することができる（（Ｙｏｕｎｇ，２００２）に概説される）。さらに、ＭＡＳＣＩＳ群は、衝突部位における組織学的変化と線形相関した、２１ポイント順序尺度であるＢａｓｓｏ−Ｂｅａｔｔｉｅ−Ｂｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）運動スコアを確認した（Ｂａｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。このモデルは、極めて一貫した慢性的な組織学的変化をもたらす（Ｂｅａｔｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。近年、脊髄傷害の研究にラットを使用する傾向がある。ＭＡＳＣＩＳ衝突体は、十分に標準化されたラット脊髄挫傷モデルであり、これはラットにおける２４時間後の病変体積、６週間後の白質の残存、および運動回を線形予測する極めて一貫した段階的な脊髄損傷を生じる（Ｙｏｕｎｇ，２００２）。他の脊柱傷害モデルは、このような障害に関連する複数の機序を研究するのに役立ってきたが、脊髄離断は、二次損傷の最悪の局面に関連する広範囲に及ぶ外傷的損傷を生じない。したがって、離断に有効な治療は、打撲傷害には有効でない可能性がある（Ｉｓｅｄａ ｅｔ ａｌ．，２００８）。
本明細書において開示されるｄｓＲＮＡ化合物は、この動物モデルで試験され、結果はこれらのｄｓＲＮＡ化合物が、脊髄傷害の治療および／または防止に有用であることを示している。
実施例３：ＳＣＩの治療におけるｄｓＲｈｏＡ化合物のインビボ研究
挫傷性ＳＣＩ後のＲｈｏＡ免疫組織化学的検査
ＲｈｏＡ ｄｓＲＮＡ化合物未処置動物において、タンパク質の上方制御を確認するために、傷害後１週間、２週間、および４週間でのＳＣＩ後のＲｈｏＡの免疫局在性を検査する。傷害を受けていない対照動物と比較して、ＳＣＩ後のＲｈｏＡタンパク質の増加が観察される。ＲｈｏＡタンパク質の増加は、４週間を通して維持され、１〜２週間辺りにピークに達すると思われる。後根および前根は、血管を裏打ちする内皮細胞と同様に、ＲｈｏＡの強い免疫局在性を示す。共焦点顕微鏡分析は、ＲｈｏＡの多くが、形質膜付近に位置することを示しており（Ｄ'Ａｌｅｓｓａｎｄｒｏ ｅｔ ａｌ．，２００４）、これがＳＣＩ後に活性状態にあることを示唆している。
脊髄傷害および実質内送達後のラット脊髄におけるｄｓＲＮＡ化合物の細胞局在
Ｃｙ３．５フルオロフォアと結合したネイキッドヌクレアーゼ安定化ｄｓＲＮＡは、運動ニューロン、マクロファージ、白質軸索、ならびに後根のニューロン、および内皮細胞への取り込みを示した。したがって、打撲傷害直後に注入した場合、ｄｓＲＮＡは、ニューロン、星状膠細胞、小膠細胞、マクロファージ、および内皮細胞を含む、ＲｈｏＡの作用がＳＣＩに関わっている細胞の多くによって取り込まれ得る。したがって、これら全ての細胞は、神経保護性（Ｄｕｂｒｅｕｉｌ ｅｔ ａｌ．，２００３、Ｌｏｒｄ−Ｆｏｎｔａｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００８）、抗炎症性（Ｓｃｈｗａｂ ｅｔ ａｌ．，２００４）、および神経再生性（Ｂｅｒｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００７、ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒ ａｎｄ Ｈｉｇｕｃｈｉ，２００６）であることが予想される、ＲｈｏＡの阻害の可能性のある標的である。
ＳＣＩ後のＲｈｏＡタンパク質誘導の阻害
本明細書において開示されるＲｈｏＡ ｄｓＲＮＡ化合物のＲｈｏＡタンパク質のレベルを変更する能力を分析するために、脊髄組織の５ｍｍ切片からタンパク質を抽出し、ＲｈｏＡタンパク質の相対レベルを免疫ブロット後に測定する。ＲｈｏＡタンパク質のレベルは、ｄｓＲｈｏＡ化合物で処置された注射挫傷部位では、ｓｉＧＦＰ対照と比較して低く、ＲｈｏＡタンパク質誘導の阻害を示す。同じ抽出物の坑ＲｈｏＡ抗体での免疫ブロットは、ｓｉＧＦＰ対照と比較して、Ｒｈｏに対するＲｈｏＡ ｄｓＲＮＡ化合物との免疫反応性の同様の減少を示す。
ＳＣＩおよびｓｉＲＮＡの実質内注入後のラットの後肢歩行の機能回復（Ｂａｓｓｏ、Ｂｅａｔｔｉｅ、およびＢｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）スコア試験）
ＲｈｏＡに対する本明細書において開示されるｄｓＲＮＡ化合物を用いて、６週間の運動ＢＢＢ分析を実施する。ｄｓＲｈｏＡ化合物の髄腔内注入後に、対照としてのｄｓＧＦＰ化合物と比較して、有意な運動改善が観察される。ＢＢＢ歩行スコアの改善を示す効果は、試験した最も初期に観察され、これはｓｉＲＮＡの効果が、軸索が成長するのにより長い時間を要し得る再生の促進に加え、保護機序によるものである可能性を示している。
腰椎穿刺注入後のＳＣＩ部位におけるｄｓＲＮＡ取り込み
本明細書において開示されるｄｓＲＮＡ化合物が、脳脊髄液に髄腔内導入される。実質内送達と髄腔内送達とを比較するため、挫傷１日後、ボーラス投与を用いてＣｙ３．５標識ネイキッドｄｓＲＮＡ化合物を腰膨大に投与する。結果は、傷害の中心、ならびに脊髄の隣接する吻側領域および尾部領域における染料の脊髄への広範囲に取り込みを示す。凍結超薄切片法は、ｄｓＲＮＡが、傷害部位内および周辺の近傍で最も確実に白質および灰白質に浸透したことを示す。より遠位に弱い実質シグナルが観察されるが、このシグナルは中心管および脊髄周囲の双方では強い。結果は、おそらくは傷害部位におけるｄｓＲＮＡの浸透の増加により、傷害部位付近の実質においてより多量の取り込みを示す。腰部の髄腔内送達は、脊髄の胸部における傷害部位内または周辺のｄｓＲＮＡの選択的取り込みをもたらす。
腰椎穿刺によるｄｓＲＮＡ注入３日後のＲｈｏＡ ｍＲＮＡ発現の阻害。
本明細書において開示されるＲｈｏＡ ｄｓＲＮＡ化合物のＳＣＩ誘導性のＲｈｏＡ ｍＲＮＡ増加を阻害する能力を、定量ＲＴ−ＰＣＲで測定する。挫傷１日後、腰椎穿刺によりＲｈｏＡ ｄｓＲＮＡ化合物を注入し、３日後に、ＲｈｏＡ ｍＲＮＡの相対レベルについて脊髄組織を分析する。結果は、ＲｈｏＡ ｍＲＮＡの相対レベルが、傷害部位においてＳＣＩ後４日までに増加すること、またｄｓＲｈｏＡ化合物治療が４０μｇおよび１００μｇが注入された場合に、この増加を減少させることを示す。
腰椎穿刺後のラット後肢歩行（ＢＢＢ）の機能回復
挫傷傷害１日後に投与される本明細書において開示されるｄｓＲｈｏＡ化合物の腰椎穿刺注入のｄｓＧＦＰ対照と比較した治療効果は、ＢＢＢスコア法を用いて測定する。ｄｓＲｈｏＡ化合物治療は、ｄｓＧＦＰ対照よりも高いスコアをもたらす。
本願において提供されるオリゴヌクレオチド配列および構造を用いるｄｓＲｈｏＡ化合物は、ＳＣＩの治療に有用である。
実施例４：眼の疾患、障害、および傷害に関連するモデル系および結果
視神経挫滅（ＯＮＣ）モデル、上昇ＩＯＰモデル、および視神経軸索切断モデルを含むモデル系
ラット緑内障モデルにおける、硝子体内注入（ＩＶＴ）による、または点眼剤（ＥＤ）としての送達後のｄｓＲｈｏＡ化合物のＩＯＰ低下活性
上昇したＩＯＰを誘発するために、ウィスターラットの眼の前房に、ＩＯＰの上昇が３０％を超える（０日目として指定される日）まで、週１回マイクロビーズを注入する。ＩＯＰは、ＴｏｎｏＰｅｎ ＸＬ眼圧計を用いて週３回測定し、ＩＯＰ低下におけるｄｓＲｈｏＡ化合物の相対的有効性を評価する。点眼剤（ＥＤ）による送達：上昇したＩＯＰの誘発後、１００μｇのｄｓＲｈｏＡ化合物または対照ｄｓＲＮＡ化合物（ｓｉＣＮＬ）、あるいは３μＬの２％メチルセルロース（ＭＣ）中の６０ｎｇのラタノプロスト（陽性対照）または３μＬの２％ ＭＣのみを用量内で点眼剤として１日１回、１４日間送達する（ｎ＝４）。硝子体内注入による送達：２０μｇのｄｓＲｈｏＡまたはｓｉＣＮＬ、あるいは１０μＬのＰＢＳ中の６０ｎｇのラタノプロストまたは１０μＬのＰＢＳのみを硝子体内注入（ＩＶＴ）により、０日目および７日目に送達する（ｎ＝４）。併用ＩＶＴ−ＥＤ処置：２０μｇのｄｓＲｈｏＡまたは１０μＬのＰＢＳ中のｓｉＣＮＬ、または１０μＬのＰＢＳのみを０日目に硝子体内注入（ＩＶＴ）により送達し、続いて１日１００μｇのｄｓＲｈｏＡ化合物または３μＬの２％メチルセルロース（ＭＣ）中の対照ｄｓＲＮＡ化合物（ｓｉＣＮＬ）、または３μＬの２％ ＭＣのみをＥＤとして１４日間送達する。
ラットＯＮＣモデルにおけるｄｓＲｈｏＡの神経保護効果：
麻酔した成体ウィスターラットの眼窩内視神経（ＯＮ）を露出し、髄膜を切断し、篩板から２ｍｍを１０秒間、目盛付き鉗子で挫滅することにより、ＯＮの全ての軸索を切断する。１０μｇのｄｓＲｈｏＡ化合物、または１０μＬのＰＢＳ中の対照ｄｓＲＮＡ化合物（ｓｉＣＮＬ）、または１０μＬのＰＢＳのみをＩＶＴ注入により、ＯＮＣ後０日目に送達する（ｎ＝４）。５μｇの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を同様に注入した眼が、陽性対照としての役割を果たす。終了２日前に、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）をＯＮへのフルオロゴールド注入により逆行的に標識する。終了時（ＯＮＣ後７日目）に、カテーテルにより実験動物に４％パラホルムアルデヒドを灌流する。ＯＮを有する眼を摘出し、ナイフで角膜を切除し、水晶体／硝子体を慎重に取り除く。次に網膜を切除し、４％パラホルムアルデヒド中でさらに３０分間固定し、ＵＶフィルター（３６５／４２０ｎｍ）を用いた蛍光顕微鏡下での標識ＲＧＣの検査のために調製する。逆行性標識された蛍光ＲＧＣの数を、各網膜ホールマウントの４象限のそれぞれを撮影した画像から決定する。無傷の眼のＲＧＣ密度は、ベースライン対照としての役割を果たす。
ＯＮＣモデルにおけるｄｓＲｈｏＡ有効性：
成体フィッシャーラットのＯＮを上記に記載のように挫滅し、同時に摘出したばかりの坐骨神経の切片を眼の硝子体内に移植し、軸索再生を促進する。２０μｇのｄｓＲｈｏＡ化合物、または１０μＬのＰＢＳ中の対照ｄｓＲＮＡ化合物（ｓｉＣＮＬ）、または１０μＬのＰＢＳのみをＯＮＣ後０日目、７日目、および１４日目に、３回のＩＶＴ注入によって送達する（ｎ＝４）。５μｇのＢＤＮＦを注入した群は、陽性対照としての役割を果たす。実験は、２１日目に終了する。ＧＡＰ４３抗体によるＯＮ切片の免疫組織化学的検査は、各治療群における、挫滅地点を越えるＲＧＣ軸索再生の程度の定量的測定および定性的測定を可能にする。
緑内障モデルにおけるｄｓＲｈｏＡ化合物のＩＯＰ低下効果：
ＩＯＰの上昇を記載のように誘導する。ｄｓＲｈｏＡ試験化合物、または対照ｄｓＲＮＡ化合物（ｓｉＣＮＬ）、または６０ｎｇのラタノプロスト、または賦形剤のみをそれぞれ、実施した実験において最良の結果を示した送達経路のうちの１つにより送達する（例えば、ＩＶＴ注入、点眼剤、点耳剤、またはそれらの任意の組み合わせ）。ＩＯＰを、ＴｏｎｏＰｅｎ ＸＬ眼圧計を用いて週３回測定し、ＩＯＰ低下に関する試験したＲｈｏＡ ｄｓＲｈｏＡ化合物の相対的有効性を評価する。
３種類の動物モデルの結果に基づいて最良のインビボ有効性を示すものとして、主要薬物候補を選択する。本明細書において提供されるオリゴヌクレオチド配列および構造を使用するｄｓＲｈｏＡ化合物は、眼の疾患、障害、および傷害（例えば、緑内障）の治療に有用である。
主要ｄｓＲｈｏＡ薬物候補を用いた治療計画の最適化（視神経挫滅（ＯＮＣ）傷害モデル、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）軸索再生モデル、高眼圧（ＩＯＰ）モデルにおける用量反応試験）。
緑内障モデルにおいて漸増用量の主要ｄｓＲｈｏＡ化合物がＩＯＰを低下させる能力の測定：
上に記載のように、ＩＯＰの上昇を誘導し、結果を分析する。漸増用量の主要ｄｓＲｈｏＡ化合物をＩＶＴ（単回用量として、１０μＬの５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、および４０μｇ）で、または１００μｇのｓｉＲＮＡを３μＬ容量で１日１回、２回、または３回、２０分の投与間隔で１４日間送達する点眼剤（ＥＤ）により、またはＸＸμｇのｓｉＲＮＡをＸμＬ容量で１日１回、２回、または３回、ＸＸ分の投与間隔で１４日間送達する点耳剤（ＥｒＤ）により送達する（ｎ＝４）。ｓｉＣＮＬは、陰性対照としての役割を果たし、ラタノプロストは陽性対照としての役割を果たす。ＩＯＰは、ＴｏｎｏＰｅｎ ＸＬ眼圧計を用いて週３回測定し、ＩＯＰ低下におけるｄｓＲｈｏＡ化合物の有効性を評価する。
ラットにおけるＯＮＣ後に漸増用量のｄｓＲｈｏＡ化合物がＲＧＣ生存を導く能力の測定：
上に記載のように、ＯＮＣモデルを実施し、結果を分析する。漸増用量の５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、もしくは４０μｇのｄｓＲｈｏＡ試験化合物、または１０μＬのＰＢＳ中の４０μｇのｓｉＣＮＬ、または１０μＬのＰＢＳのみをＯＮＣ後０日目に単一ＩＶＴ注入により送達する（ｎ＝４）。ＢＤＮＦを注入した眼は、陽性対照としての役割を果たす。試験は、ＯＮＣ後７日目に終了する。
実施例５：ラットにおける視神経挫滅後に漸増用量のｄｓＲｈｏＡ化合物がＲＧＣ軸索再生を誘導する能力を測定するインビボ研究
ＯＮＣモデルについて上に記載のように、研究を実施し、結果を分析した。漸増用量の１０μｇ、２０μｇ、および４０μｇの試験ｄｓＲｈｏＡ化合物、または１０μＬのＰＢＳ中の４０μｇのｄｓＥＧＦＰ化合物、または１０μＬのＰＢＳのみをＯＮＣ後０日目、１０日目、および２０日目に硝子体内（ＩＶＴ）注入によって送達した（ｎ＝４）。毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）注入群は、陽性対照としての役割を果たした。実験は、３０日目に終了した。
ＯＮＣおよびｄｓＲＮＡ注入
２００〜２５０ｇの成体雌ウィスターラットをＨｙｐｎｏｒｍ／Ｈｙｐｎｏｖｅｌ麻酔剤（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）で腹腔内麻酔し、両眼の視神経（ＯＮ）を眼窩内で挫滅して（ＯＮＣモデル）、全てのＲＧＣ軸索を完全に切断した。ガラス製マイクロピペットを用いて、最終容量１０μＬで、全ての試薬を硝子体内に注入した。動物は、
（ｉ） ＰＢＳ；
（ｉｉ） ２０μｇのｄｓＥＧＦＰ対照化合物ＥＧＦＰ＿５＿Ｓ７６３＿Ｌ１ ｄｓＲＮＡ；
センス鎖：
ｒＧ；ｍＧ；ｒＣ；ｍＵ；ｒＡ；ｍＣ；ｒＧ；ｍＵ；ｒＣ；ｍＣ；ｒＡ；ｍＧ；ｒＧ；ｍＡ；ｒＧ；ｍＣ；ｒＧ；ｍＣ；ｒＡ；ｍＣ；ｒＣ＄；
アンチセンス鎖：
ｍＧ；ｒＧ；ｍＵ；ｒＧ；ｍＣ；ｒＧ；ｍＣ；ｒＵ；ｍＣ；ｒＣ；ｍＵ；ｒＧ；ｍＧ；ｒＡ；ｍＣ；ｒＧ；ｍＵ；ｒＡ；ｍＧ；ｒＣ；ｍＣ＄；
（ｍＣ、ｍＧ、ｍＡ、およびｍＵは、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを示し；Ｃ、Ｇ、Ａ、およびＵは、非修飾リボヌクレオチドを示し；＄は、末端Ｐｉを示す）、
（ｉｉｉ） １０μｇ、２０μｇ、または４０μｇのｄｓＲｈｏＡ化合物ＲＨＯＡ＿４＿Ｓ５００（「ＲｈｏＡバッチ１」とも表される）：
センス鎖：
ｒＧ；ｍＣ；ｒＣ；ｍＡ；ｒＣ；ｍＵ；ｒＵ；ｍＡ；ｒＡ；ｍＵ；ｒＧ；ｍＵ；ｒＡ；ｍＵ；ｒＧ；ｍＵ；ｒＵ；ｍＡ；ｒＣ
アンチセンス鎖：
ｍＧ；ｒＵ；ｍＡ；ｒＡ；ｍＣ；ｒＡ；ｍＵ；ｒＡ；ｍＣ；ｒＡ；ｍＵ；ｒＵ；ｍＡ；ｒＡ；ｍＧ；ｒＵ；ｍＧ；ｒＧ；ｍＣ
（ｍＣ、ｍＧ、ｍＡ、およびｍＵは、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを示し；Ｃ、Ｇ、Ａ、およびＵは、非修飾リボヌクレオチドを示す）；
（ｉｖ） １０μｇ、２０μｇ、または４０μｇのｄｓＲｈｏＡ化合物ＲＨＯＡ＿２９＿Ｓ７３、「ＲｈｏＡバッチ２」：
センス鎖：Ｕ；ｍＣ；Ｇ；ｍＡ；Ｃ；ｍＡ；Ｇ；ｍＣ；Ｃ；ｍＣ；Ｕ；ｍＧ；Ａ；ｍＵ；Ａ；ｍＧ；Ｕ；ｍＵ；Ｕ＄
（配列番号１６６）
アンチセンス鎖：ｍＡ；Ａ；ｍＡ；Ｃ；ｍＵ；Ａ；ｍＵ；Ｃ；ｍＡ；Ｇ；ｍＧ；Ｇ；ｍＣ；Ｕ；ｍＧ；Ｕ；ｍＣ；Ｇ；ｍＡ＄
（配列番号１７０）
（ｍＣ、ｍＧ、ｍＡ、およびｍＵは、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを示し；Ｃ、Ｇ、Ａ、およびＵは、非修飾リボヌクレオチドを示し；＄は、末端Ｐｉを示す）；または
（ｖ） ５μｇのＣＮＴＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ Ｌｔｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）；
のうちのいずれかで、ＯＮＣ後０日目、１０日目、および２０日目に処置した。
ＯＮＣ後３０日目に、ＣＯ２に暴露して動物を致死させ、４％ホルムアルデヒド（ＴＡＡＢ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｌｄｅｒｍａｓｔｏｎ，ＵＫ）を心臓内に灌流させた。網膜を切除し、４％ホルムアルデヒド（ＴＡＡＢ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で３０分間浸漬固定した後、ＰＢＳで１回につき３０分間、３回洗浄した。次いで、眼およびＯＮを１０％、２０％、および３０％ショ糖に各２時間浸漬して凍結保護してから、試料をＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド中で包埋し、ドライアイス上で凍結した。クリオスタットを使用して１５μｍ厚の切片を切り取り、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔスライドに付着させ、−２０℃で必要になるまで保管した。
ＲＧＣ計数
視神経円板が見える位置で切り取った眼の切片を室温で３０分間解凍し、次いでＨａｅｍｏｔｏｘｙｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）中で２分間染色し、水道水の流水で２分間洗浄し、Ｓｃｏｔｔｓ水道水で１分間洗浄し、その後Ｅｏｓｉｎ（Ｓｉｇｍａ）中で３０秒間染色した。次いで切片を水道水の流水で２分間洗浄し、段階的な一連のアルコール各１分間によって脱水し、Ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒに１分間および３分間浸漬してからＶｅｃｔａｍｏｕｎｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ）に取り付けた。互いから等距離であり、網膜の全周を占める各網膜の５つの部分を用いて、神経節細胞層中に存在するＲＧＣの数を計数した。４網膜、５部分／条件からの計数を合計し、平均を出して、平均ＲＧＣ／網膜±標準偏差を示した。
免疫組織化学的検査
二重免疫蛍光染色のために、切片を１００％エタノールで１分間後固定し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過化処理し、洗浄し、ブロックし、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ）および０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ−ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳで希釈した適切な一次抗体（表３）とともに、４℃で一晩インキュベートした。
表３−使用した抗体の特性
次に切片をＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳＴ−ＢＳＡで１：４００に希釈した適切な蛍光標識二次抗体（Ａｌｅｘａ−４８８またはＴｅｘａｓ Ｒｅｄ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）とともに室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳ中でさらに洗浄後、ＤＡＰＩ含有Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ）に取り付けた。対照には、一次抗体を省いた切片または特定のＩｇＧ対照を含んだ。切片をＺｅｉｓｓ落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）下で観察し、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ（登録商標）ソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ４，２）により制御されるＡｘｉｏＣａｍ（登録商標） ＨＲｃを用いて、画像を倍率１０倍（元の倍率１００倍）で撮影した。全ての画像をＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ３（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）に蓄積した。
結果：ｄｓＲｈｏＡ処置後の平均ＲＧＣ生存を図２に示す。
ｄｓＥＧＦＰ化合物と比較した、ＲｈｏＡ ｄｓＲＮＡ化合物によるＲＧＣ生存の促進を図３に示す。
結果は、「ＲｈｏＡバッチ２」とも表されるｄｓＲｈｏＡ化合物ＲＨＯＡ＿２９＿Ｓ７３が、３０日で有意なＲＧＣ生存を促進したことを示している。このｄｓＲｈｏＡ化合物による処置時に、傷害後３０日で、ＰＢＳ処理対照と比較して５０％超高いＲＧＣ生存が観察され、ＣＮＴＦ処理対照と比較して、約２０％高いＲＧＣ生存が観察されたが、これは現在の神経保護治療における著しい前進を示している。
ラット網膜およびその組織分布における試験ｄｓＲｈｏＡ化合物の用量依存的薬力学的効果：
８匹の無傷のラット群（ｎ＝８）に漸増用量の試験ｄｓＲｈｏＡ化合物または対照ｄｓＲＮＡ化合物（ｓｉＣＮＬ）（５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、および４０μｇ）をＩＶＴ注入し、２４時間後に致死させる。１群当たり６匹のラットの眼を摘出し、網膜を切除し、ｄｓＲＮＡ定量化、ｍＲＮＡノックダウン測定、およびＲＬＭ−ＲＡＣＥを用いたＲＮＡｉ確認に使用する。１群当たり２匹残ったラットにカテーテルにより４％ ＰＦＡを灌流し、眼を摘出し、後固定し、パラフィンで包埋し、眼におけるｄｓＲＮＡ分布のインサイツハイブリダイゼーション検出に使用する。
実施例６：送達経路によるモデルごとの最適用量の選択
ｄｓＲＮＡ効果持続期間の評価：
試験ｄｓＲｈｏＡ化合物の単回投与の治療効果持続期間を、上に記載される最適条件下で分析する。評価のエンドポイントは、緑内障モデルにおけるＩＯＰ低下活性の持続期間および網膜におけるＲｈｏＡノックダウン効果の持続期間である。
高ＩＯＰモデルにおけるｄｓＲｈｏＡ試験化合物の効果持続期間：
上に記載のように高ＩＯＰモデルを誘導する。上記に記載のように、ＩＶＴ注入により、または最適なＥＤ投与計画により（１日にわたる）、最適用量の試験ｄｓＲｈｏＡ化合物でラット（ｎ＝４）を処置する。対照動物をｓｉＣＮＬで同様に処置する。試験ｄｓＲｈｏＡ候補化合物の有効性および効果持続期間は、薬物が効かなくなった後にｄｓＲｈｏＡ群においてＩＯＰが再び上昇するまで、毎日ＩＯＰをモニターすることによって調査する。理論にとらわれるものではないが、この時間間隔は、小柱網におけるｄｓＲｈｏＡ ＲＮＡｉの効果持続期間と等しいと考えられる。
網膜におけるｄｓＲｈｏＡ試験化合物の薬力学的（ＲＮＡｉ）効果持続期間：
網膜における試験ＲｈｏＡ候補化合物の効果持続期間を確立するために、ｄｓＲｈｏＡ化合物を上記に記載のような最良のＩＶＴ用量で、単一ＩＶＴ注入により未処置ラットに投与する。ｓｉＣＮＬを同じＩＶＴ用量で別の群のラットに投与する。注入後１日、２日、３日、５日、７日、１０日、および１４日で、動物を致死させる（時点当たりｎ＝６）。眼を摘出し、網膜を切除し、（１）ステム・ループＰＣＲを用いたｄｓＲＮＡ定量化；（２）ｑＰＣＲを用いた標的ノックダウン測定；および（３）ＲＬＭ−ＲＡＣＥを用いたＲＮＡｉ確認に使用する。
実施例７：ラット視神経挫滅（ＯＮＣ）モデルにおける、ＲｈｏＡを標的とするｄｓＲＮＡ化合物のニューロン生存および軸索再生に対する効果
研究デザイン：群における終了は、ＯＮＣ後３０日または５０日である。全群に対するｄｓＲＮＡ投与は、１０日ごとの両眼硝子体内注入（ＩＶＴ）によって行う。
群１〜１２は、両眼ＯＮＣを行う。眼の各対は、同じ処置を受ける。
測定したエンドポイント：
組織固定し凍結した組織切片：
ａ）視神経におけるＲＧＣ軸索再生のためのＧＡＰ４３
ｂ）網膜におけるＲＧＣ生存のためのＴＵＪ１
試験ｄｓＲＮＡは、本願全体において開示される。ＣＮＴＦ注入群は、陽性対照としての役割を果たす。実験は、第２群を除く全ての群で３０日目に終了し、第２群では５０日目に終了する。
ＯＮＣおよびｓｉＲＮＡ注入
２００〜２５０ｇの成体雌ウィスターラットをＨｙｐｎｏｒｍ／Ｈｙｐｎｏｖｅｌ麻酔剤（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）で腹腔内麻酔し、両眼のＯＮを眼窩内で挫滅して（ＯＮＣ）、全てのＲＧＣ軸索を完全に切断する。ガラス製マイクロピペットを用いて、最終容量１０μＬで、全ての試薬を硝子体内に注入する。表４の研究デザインに従って動物を処置する。
ＯＮＣ後３０日目またはＯＮＣ後５０日目（研究デザインに従う）に、ＣＯ２に暴露して動物を致死させ、４％ホルムアルデヒド（ＴＡＡＢ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｌｄｅｒｍａｓｔｏｎ，ＵＫ）を心臓内に灌流させる。網膜を切除し、４％ホルムアルデヒド（ＴＡＡＢ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で３０分間浸漬固定した後、ＰＢＳで１回につき３０分間、３回洗浄する。次いで、眼およびＯＮを１０％、２０％、および３０％ショ糖に各２時間浸漬して凍結保護してから、試料をＯＣＴ中で包埋し、ドライアイス上で凍結する。クリオスタットを使用して１５μｍ厚の切片を切り取り、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔスライドに付着させ、−２０℃で必要になるまで保管する。
ＲＧＣ計数
視神経円板が見える位置で切り取った眼の切片を室温で３０分間解凍し、次いでＨａｅｍｏｔｏｘｙｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）中で２分間染色し、水道水の流水で２分間洗浄し、Ｓｃｏｔｔｓ水道水で１分間洗浄し、その後Ｅｏｓｉｎ（Ｓｉｇｍａ）中で３０秒間染色する。次いで切片を水道水の流水で２分間洗浄し、段階的な一連のアルコール各１分間によって脱水し、Ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒに１分間および３分間浸漬してからＶｅｃｔａｍｏｕｎｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ）に取り付ける。互いから等距離であり、網膜の全周を占める各網膜のの５つの部分を用いて、神経節細胞層中に存在するＲＧＣの数を計数する。４網膜、５部分／条件からの計数を合計し、平均を出して、平均ＲＧＣ計数／網膜±標準偏差を示す。
免疫組織化学的検査
二重免疫蛍光染色のために、切片を１００％エタノールで１分間後固定し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過化処理し、洗浄し、ブロックし、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ）および０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ−ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳで希釈した適切な一次抗体（表３）とともに、４℃で一晩インキュベートする。
次に切片をＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳＴ−ＢＳＡで１：４００に希釈した適切な蛍光標識二次抗体（Ａｌｅｘａ−４８８またはＴｅｘａｓ Ｒｅｄ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）とともに室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳ中でさらに洗浄後、ＤＡＰＩ含有Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ）に取り付ける。対照には、一次抗体を省いた切片または特定のＩｇＧ対照を含む。切片をＺｅｉｓｓ落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）下で観察し、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ（登録商標）ソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ４，２）により制御されるＡｘｉｏＣａｍ（登録商標） ＨＲｃを用いて、画像を倍率１０倍（元の倍率１００倍）で撮影する。全ての画像をＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ３（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）に蓄積する。
本明細書において開示されるｄｓＲｈｏＡ化合物がこの実験で試験され、神経保護を誘導することが示される。ＯＮＣ後に救出されるＲＧＣの数は、ｄｓＲｈｏＡ処理群において、ｄｓＥＧＦＰ対照ｄｓＲＮＡで処理した群よりも有意に多い。
実施例８：皮質ニューロン保護
ｄｓＲｈｏＡ化合物のインビボでの神経保護効果を評価するために、培養下で成長させたマウス皮質ニューロンをＮＭＤＡに５分間暴露し、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を測定することにより、２４時間後の細胞死をモニターする（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：３５７，１９８７）。可能性のある治療有効性を判定するための追加試験には、インビボ脳卒中モデルを使用する。これらのモデルでは、脳に通じる大動脈をクランプすることにより、血液供給を一時的に遮断する。
実施例９：メニエール病のモデル系
本明細書において開示されるｄｓＲｈｏＡ化合物は、メニエール病を患っている患者における難聴を軽減または治療する際に有用であり、また、理論にとらわれるものではないが、メニエール病に関連する神経損傷から聴覚ニューロンを保護するよう作用する。メニエール病の治療における、またはメニエール病における神経保護剤もしくは神経再生因子としてのｄｓＲｈｏＡ化合物の有効性を試験するための例示的モデルは、以下のとおりである：
Ｓｈｅｙｋｈｏｌｅｓｌａｍｉ Ｋ，Ｍｅｇｅｒｉａｎ ＣＡ，Ｚｈｅｎｇ ＱＹＶ．Ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒ ｅｖｏｋｅｄ ｍｙｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｐｈｅｘ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｐｓ．Ｏｔｏｌ Ｎｅｕｒｏｔｏｌ．２００９ Ｊｕｎ；３０（４）：５３５−４４、Ｍｅｇｅｒｉａｎ ＣＡ，Ｓｅｍａａｎ ＭＴ，Ａｆｔａｂ Ｓ，Ｋｉｓｌｅｙ ＬＢ，Ｚｈｅｎｇ ＱＹ，Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ ＫＳ，Ｗｒｉｇｈｔ ＣＧ，Ａｌａｇｒａｍａｍ ＫＮ．Ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｗｉｔｈ ｐｏｓｔｎａｔａｌ ｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｐｓ ａｎｄ ｈｅａｒｉｎｇ ｌｏｓｓ．Ｈｅａｒ Ｒｅｓ．２００８ Ｍａｒ；２３７（１−２）：９０−１０５、Ｓｅｍａａｎ ＭＴ，Ａｌａｇｒａｍａｍ ＫＮ，Ｍｅｇｅｒｉａｎ ＣＡ．Ｔｈｅ ｂａｓｉｃ ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｍｅｎｉｅｒｅ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｐｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ．２００５ Ｏｃｔ；１３（５）：３０１−７。
実施例１０：メニエール病マウスモデルの難聴の軽減または治療におけるｄｓＲｈｏＡ化合物の有効性を測定するインビボ研究
研究目的：
機能評価および組織学的評価を用いた、メニエール病のマウス遺伝モデルにおける選択された４種類のｄｓＲＮＡ化合物の有効性の評価。
研究デザイン

表５ 研究デザイン。
注：「Ｐ」は、「出生後の日数」（ｐｏｓｔｎａｔａｌ ｄａｙ）の略である。
機能試験を、試験物質または対照物質の投与日の２９日目から、およびそれらの投与前に実施する。ｄｓＲＮＡ投与は、４０〜６０分間の動物の不動化（麻酔）を要する。同じ週齢の無傷の未処置マウスにおける機能試験が、ベースライン対照としての役割を果たす。
点耳剤による試験項目の適用
麻酔：４ｍＬ／ｋｇ体重のＥｑｕｉｔｈｅｓｉｎｅ（Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ，Ｉ．Ｐ．）でマウスを麻酔する。
外耳道（右（ＲＥＡＣ））点耳剤（ＥｒＤ）送達：３μＬの試料容量（温かい１０％グリセロール系点耳剤、３７°Ｃ）を先の丸いピペットチップを用いて右外耳道（ＲＥＡＣ）にゆっくりと注入する。ＲＥＡＣ ＥｒＤの投与中および投与後に、マウスを１時間反対側横臥位に保ち、意識回復後にケージに戻す。
１０％グリセロール中製剤化試験項目の調製−試験物質の説明：
滅菌条件下での凍結乾燥により、ｄｓＲＮＡを沈殿させる。
１０％グリセロール溶液を試験化合物に添加し、１５分間放置する。次いで、１０秒間ボルテックスする。適用前に、点耳剤を３７℃の温度にする。
終了時に、マウスの内耳を切除し、固定し、パラフィンで包埋し、聴覚および前庭の両区分、ならびにせん神経節の代表を有するように薄片に切り分ける。これらのスライドを使用して、内耳形態の組織学的評価を行う。
スライド１枚当たり５ミクロンの切片２つを含む、耳１つ当たり６枚のスライドを使用して、内耳におけるｄｓＲＮＡ分布のインサイツハイブリダイゼーション分析を行う。未処置の無傷のマウス耳のスライド１５枚を使用して、系の較正を行う。
本明細書において開示されるＲｈｏＡ ｄｓＲＮＡ化合物が、この研究で試験され、モデル誘導６週間で、ＲｈｏＡ ｄｓＲＮＡ処置マウスの全ての機能試験において、ＲｈｏＡ ｄｓＲＮＡが、ビヒクル処置群と比較して、また対照ｄｓＲＮＡ処置群と比較して、有意な改善を誘導することが示される。この改善は、研究終了まで維持される。これらの結果は、本明細書において開示されるＲｈｏＡ ｄｓＲＮＡ化合物が、メニエール病の治療において有用であることを示した。
実施例１１：角膜新血管形成のモデル系
この研究の目的は、角膜新血管形成のマウス縫合モデルにおける、結膜下注入により適用したＲｈｏＡ ｄｓＲＮＡ化合物の治療効果の評価である。
研究デザインは９つの実験群を含み、各群はマウス６匹を含む。各マウスの両眼の角膜を１１−０ナイロンを用いて２点で縫合して、角膜新血管形成を誘導する。掻爬とは対照的に、縫合は約２週間で新血管形成をもたらし、眼間で血管成長のより優れた一貫性を提供し、より多くの新血管形成を誘導する。角膜縫合１日後に、試験項目のｄｓＲｈｏＡ化合物または対照ＰＢＳビヒクルを両眼に結膜下注入する。その後、ｄｓＲｈｏＡ化合物または対照ＰＢＳビヒクルを週２回、３日目、７日目、および１０日目に注入する（合計４回の適用）。
結膜下注入が新血管形成を誘導する可能性に対して調整を行うために、ｄｓＲＮＡ化合物を含まないビヒクル注入を用いる対照群＃９を含める（表６）。
表６ 研究デザイン
麻酔：ケタミン／キシラジンまたはアベルチンでマウスを麻酔する。全てのマウスの角膜を５マイクロリットルのプロパラカイン（局所麻酔剤）で麻酔する。
角膜縫合手順：（各マウスの両眼の）角膜を１１−０ナイロン糸を用いて２点で縫合する。角膜縫合の目的は、角膜新血管形成を誘導することである。縫合は、約２週間で新血管形成をもたらす。（掻爬とは対照的に、縫合は、眼間で血管成長のより優れた一貫性を提供し、より多くの新血管形成を誘導する）。
手術手順：
（Ａ）アベルチンでマウスを麻酔する。
（Ｂ）マウスのひげおよび過剰に長い睫毛をはさみで切断する。
（Ｃ）第１の１１−０ナイロン縫合は、角膜の中心と角膜縁との間の１２時の位置で、２−１−１ノットを用いて実施する。角膜内皮穿刺縫合は、新血管形成の誘導を目的とし、縫合糸を所定の位置に維持する。
（Ｄ）第２の１１−０ナイロン縫合は、角膜の中心と角膜縁との間の６時の位置（第１の縫合の逆の位置）で、２−１−１ノットを用いて行う。
（Ｅ）局所バシトラシン抗生物質軟膏を眼表面に塗布する。
（Ｆ）マウスをケージに戻し、歩行可能までモニターする。
（Ｇ）マウスを翌日検査し、抗生物質軟膏を再塗布する。
結膜下注入：
縫合１日後、ならびにその後週２回、３日目、７日目、および１０日目に、マウスに以下のように両眼結膜下注入を行う：
ａ．ベルチンでマウスを麻酔する。
ｂ．マウスをＪＭＥＣ Ａ０６１２における外科用顕微鏡下、水再循環加熱パッド上に置く。
ｃ．５マイクロリットルのトロピカミド（散瞳）および５マイクロリットルのプロパラカイン（局所麻酔剤）をマイクロピペットを用いて両眼に局所投与する。
ｄ．過剰に長い睫毛は全てＶａｎｎａｓはさみで短く切り揃える。
ｅ．３２ゲージの気密マイクロシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）を結膜下に挿入して、両眼の角膜縁後部１ｍｍにｄｓＲｈｏＡ化合物またはＰＢＳ（対照群）を送達する。
ｆ．針を除去して、局所バシトラシン抗生物質軟膏眼表面に塗布する。
ｇ．マウスをケージに戻し、歩行可能までモニターする。
ｈ．マウスを翌日検査し、抗生物質軟膏を再塗布する。
評価
データ生成および分析
角膜脈管（新血管形成）の画像：外科用顕微鏡に取り付けたカメラで顕微鏡写真を撮影する。研究の各段階において、同じ位置を比較する（毎週、両眼の角膜縫合部周辺）。角膜新血管形成を血管の面積および明度によって０〜５で等級付けする：
ａ．０−（新血管形成が存在しない）；
ｂ．１−（角膜縁からの弱く小さい血管）；
ｃ．２−（角膜縁と角膜縫合部との間に新しい血管が成長している）；
ｄ．３−（縫合部までおよびその周囲の新しい血管）；
ｅ．４−（縫合部までおよびその周囲の太い蛇行する新しい血管）、および
ｆ．５−（縫合部を超え、角膜中央に向かう太い蛇行する新しい血管）。
血管内皮細胞の免疫組織化学的染色：マウスの眼（両眼）を摘出し、角膜から残存する角膜縁および虹彩を取り除く。盲検者が角膜のフラットマウントに血管内皮細胞の免疫組織化学的染色を実施する。新鮮な角膜を切除し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で３０分間濯ぎ、１００％アセトン（Ｓｉｇｍａ）中で２０分間固定する。ＰＢＳでの洗浄後、０．１Ｍ ＰＢＳおよび２％アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を用いて、温度４℃で３晩、非特異的結合を遮断する。濃度１：５００でフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合モノクローナル抗マウスＣＤ３１抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と、および濃度１：２００でＬＹＶＥ−１（ウサギ、ａｂ １４９１７）と、０．１Ｍ ＰＢＳおよび２％アルブミン中、４℃で一晩インキュベートし、その後１：１０００の抗ウサギ抗体−Ａ５４６（Ａ１１０１０）と１時間インキュベートし、次いで室温のＰＢＳ中で洗浄する。角膜に退色防止剤（Ｇｅｌｍｏｕｎｔ；Ｂｉｏｍｅｄａ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を施し、蛍光顕微鏡で可視化する。
新血管形成のデジタル定量化：血管内皮細胞の免疫化学的染色および角膜のフラットマウント後、蛍光顕微鏡に取り付けたカメラで角膜脈管の画像を撮影する。市販のソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ ＬＥ）を用い、コンピュータで画像を分析し、角膜新血管形成を定量化する。角膜新血管形成のデジタル定量化を実施する。蛍光顕微鏡に取り付けたＣＤ−３３０電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラで、角膜脈管の画像を撮影する。ＬＳＭ−５ Ｉｍａｇｅ Ｅｘａｍｉｎｅｒ（Ｚｅｉｓｓ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて画像を分析し、６２４ ３ ４８０ピクセルに分解し、タグイメージファイル形式（ＴＩＦＦ）ファイルに変換する。新血管形成およびリンパ管新生を、それ以上の値では血管のみが捕らえられる蛍光発光の閾値を設定することによって定量化する。マウントした全角膜を分析して、サンプリングバイアスを最小限に抑える。新血管形成およびリンパ管新生の定量化は、盲検的に実施する。総角膜範囲は、境界線として輪部（角膜の縁部）の弧の最内部血管を用いて輪郭を描く。新血管形成およびリンパ管新生の総面積を、総角膜面積に対して正規化する。
本明細書において提供されるオリゴヌクレオチド配列および構造を使用するｄｓＲｈｏＡ化合物は、このモデルで試験され、ＣＮＶ誘導眼における新血管形成の減少を誘導する際に有用であることがわかる。
ｄｓＲｈｏＡ化合物処置群において計数された血管の数は、ｄｓＥＧＦＰ化合物処置群と比較した場合、有意に低い。
実施例１２：正常ラットにおける、異なる投与方式後のＲｈｏＡを標的とするｄｓＲＮＡ化合物による、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）におけるＲｈｏＡ ｍＲＮＡ切断の評価
この研究の目的は、本明細書に記載のｄｓＲｈｏＡ化合物を用いて、ラット網膜神経節細胞（ＲＧＣ）におけるＲｈｏＡ ｍＲＮＡの指向切断の証拠を得ることである。本明細書に記載のｄｓＲｈｏＡ化合物の３つの異なる投与方式後に、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）アッセイを実施する：経鼓膜（ＴＴ）、点耳剤（ＥｒＤ）、または硝子体内注入（ＩＶＴ）。
試験物質
（ｉ）物質（非製剤化化合物） ＲｈｏＡ ｍＲＮＡに対する本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ化合物
（ｉｉ）製剤（製剤化化合物） ＩＶＴ１〜６群用のＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬのｄｓＲＮＡ化合物（１１２μＬの試験管６本に分割した、１３４４μｇのｓＲＮＡ化合物を加えた６７２μｌのＰＢＳ溶液（２ｍｇ／ｍＬ））
（ｉｉｉ）製剤（製剤化化合物）（４００μｇ／３０μＬ／耳） ＴＴ７〜１０群用のＰＢＳ中ｄｓＲＮＡ化合物（４．４８ｍｇのｓｉＲＮＡを加えた１６８μＬのＰＢＳ溶液（１３．３ｍｇ／ｍＬ）を含む４本の試験管）
（ｉｖ）製剤（製剤化化合物）（２００μｇ／１０μＬ／耳） ＥｒＤ１１〜１４群用の１０％グリセロール中ｄｓＲＮＡ化合物（２．２４ｍｇのｓｉＲＮＡを加えた５６μＬの１０％グリセロール溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）をそれぞれ含む４本の試験管）。
対照物質（陽性／陰性対照及びビヒクルを含む）
（ｉ）ビヒクルＰＢＳ×１‐ＴＴおよびＩＶＴ用
（ｉｉ）ビヒクル−実験用に新たに調製したパイロジェン非含有水中の１０％滅菌グリセロール溶液‐ＥｒＤ用
試験系
動物の飼育：食餌：動物に市販のげっ歯類用飼料（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ ｄｉｅｔ ｆｏｒ ｒｏｄｅｎｔｓ）を無制限給餌し、水を自由に摂取させる。
環境：（ｉ）少なくとも５日間の順化（ｉｉ）全動物は、全研究期間にわたり、環境が制御され、収容条件の出入りが制限された施設に隔離し、承認された標準実施要領（ＳＯＰ）に従って維持する。自動制御された環境条件は、研究室を温度２０〜２４℃、相対湿度（ＲＨ）３０〜７０％、１２時間明期／１２時間暗期サイクル、および換気１５〜３０回／時に維持するよう設定する。温度、ＲＨ、および照明サイクルは、制御機器によってモニターする。
実験デザイン
全般：実験構成には、１６の実験群が含まれる（各群にラット４匹または１２匹；（研究デザイン表７））。実験群１〜６のラットは、２０μｇ／１０μＬのＲｈｏＡ ｄｓＲＮＡ化合物を両眼に注入（ＩＶＴ）する。実験群７〜１０のラットは、３０μＬのＰＢＳ×１中の４００μｇのＲｈｏＡ ｄｓＲＮＡ化合物を片耳にＴＴ（左耳）注入する。実験群１１〜１４のラットは、１０μＬグリセロール１０％中の２００μｇのＲｈｏＡ ｄｓＲＮＡ化合物で、右耳（ＲＥＡＣ）への点耳剤（ＥｒＤ）の単回適用により処置する。群１５〜１６は、無傷対照として実施する。安楽死および標本摘出は、研究デザイン（表７）に従って実施する。切除した網膜を表７に記載のように陽性細胞分離またはｑＰＣＲ分析に回す。
表７ 研究デザイン
麻酔および前投薬：
ＩＶＴ注入：イソフルレン特別循環システム（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ，ＵＳＡ）を用いて動物を麻酔する；操作設定：Ｏ２中３〜４．５％イソフルレン、Ｏ２流速６００〜２００ｍＬ／分。
ＥｒＤおよびＴＴ処置：全身麻酔前に、イソフルレン特別循環システム（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ，ＵＳＡ）を用いて、全ての動物に軽い麻酔をかけ（操作設定：Ｏ２中３〜４．５％イソフルレン、Ｏ２流速６００〜８００ｍＬ／分（３〜４分間））、その後、これらの動物をＥｑｕｉｔｈｅｓｉｎ（Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ，Ｉ．Ｐ；４ｍＬ／ｋｇ）で深く麻酔する。
経鼓膜注入（ＴＴ）：３０μＬの試料容量（温かい試験項目）を０．３ｍＬ注射器を用いてゆっくりとＴＴ注入する。この容量を左中耳腔に送達する。ＴＴ注入中および注入後に、ラットを約１時間反対側横臥位に保ち、意識回復後にケージに戻す。ＴＴ注入は、双眼顕微鏡下で実施する。
右外耳道（ＲＥＡＣ）ＥｒＤ適用：１０μＬの試料容量（温かい１０％グリセロール系点耳剤）を先の丸いピペットチップを用いてＲＥＡＣにゆっくりと注入する。ＲＥＡＣ注入中および注入後に、ラットを約１時間反対側横臥位に保ち、意識回復後にケージに戻す。
計画安楽死：全ての動物をＥｑｕｉｔｈｅｓｉｎ（４ｍＬ／ｋｇ；Ｉ．Ｐ）で深く麻酔し、研究デザインに従って安楽死させる（表７、時点）。
組織採取：両眼を摘出し、網膜を切除し、以下のようにさらなる分析のために処理する：
「分解処理」：「網膜分析処理Ａ」群の両眼を摘出し、氷上保存する。眼を解剖する。各試験管は、動物１匹から切除した２つの網膜を含む。切除した網膜をＣａ＋２およびＭｇ＋２を含む６ｍＬのＰＢＳで満たした１５ｍＬの試験管に移す。試験管をＲＧＣ単離のために室温に移す。
ＲＧＣ単離：網膜試験管から、「Ｎｅｕｒａｌ Ｔｉｓｓｕｅ−Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ−Ｐｏｓｔｎａｔａｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ」（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｃａｔ＃１３０−０９４−２０２）を用いて、製造手順に記載されているように細胞を解離する。次に、抗ＣＤ１１ｂマイクロビーズ（ＢＤ ＩＭａｇ（登録商標）、Ｃａｔ＃ＩＭＡＧ５５８０１３）を用いて、マクロファージを排除し、「ＣＤ１１ｂ未結合」画分からの細胞を抗ＣＤ９０．１−ＰＥ Ａｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ Ｎ １２−０９００−８３、Ｌｏｔ Ｎ Ｅ０１３８−２５３）で染色して、ＰＥ＿マイクロビーズ（ＢＤ ＩＭａｇ（登録商標）、Ｃａｔ＃５５７８９９）によってＲＧＣ分離を行い、製造手順に記載されているように、「ＣＤ９０．１結合」集団および「ＣＤ９０．１未結合」集団を得る。ＲＧＣの純度は、ＦＡＣＳによって測定する（「結合」集団において、ＣＤ９０．１純度レベルにより、試料の失格が決定される）。
全網膜処理：「網膜分析処理Ｂ」群の切除網膜を摘出し、氷上保存する。眼を解剖し、適当な試験管に回収し（各試験管は、動物１匹から切除した２つの網膜をを含む）、液体窒素中で即座に凍結し、全ＲＮＡの抽出およびさらなる分析に回す。
評価
分析処理ＡおよびＢによるプールした各網膜対の全ての試料をＲＮＡ抽出に回し、その後ＲｈｏＡ切断産物のＲＡＣＥ分析または遺伝子発現評価のいずれかを行う。
ＲＡＣＥ分析：ラットにおけるｄｓＲＮＡ化合物のＲｈｏＡ指向切断を、全試験群からプールした網膜対における、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）アッセイを用いた切断産物の検出によって判定する。切断部位は、配列分析により検証する。
試料ＲＮＡ単離：全群から、「Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ ＥＺ ＲＮＡ」に従って、二重抽出により、ＲＧＣ（結合）および未結合の両試料からＲＮＡを処理する。ＲＮＡの一部をｃＤＮＡ調製およびｑＰＣＲ分析に回す。
本明細書に記載のｄｓＲＮＡ化合物が、この研究で試験され、ＲｈｏＡ ｍＲＮＡの指向切断を生じることがわかる。
実施例１３：ラットのニューロパシー性疼痛の脊髄神経結紮（ＳＮＬまたはＣｈｕｎｇ）モデルにおける、ｄｓＲｈｏＡ化合物の抗侵害受容作用および鎮痛作用のインビボ研究
この研究の目的は、本明細書において開示されるｄｓＲｈｏＡ化合物の抗侵害受容作用および鎮痛作用をラットのニューロパシー性疼痛の脊髄神経結紮（ＳＮＬまたはＣｈｕｎｇ）モデルにおいて評価することである。
研究０日目に、全ての動物を左Ｌ５−Ｌ６脊髄神経を単離して切断する手技からなるＣｈｕｎｇ手術に供する。１Ｍ群、５Ｍ群、７Ｍ群、および９Ｍ群の動物に、手術日にＡＬＺＥＴ浸透圧ポンプを皮下移植し、試験項目で継続的に処置する。ポンプ機能の持続期間は２８日であるが、ポンプは、試験項目を０日目から１４日目まで、生理食塩水を１４日目から２８日目まで放出するか、あるいはポンプは、生理食塩水を０日目から１４日目まで、試験項目を１４日目から２８日目まで放出する。２Ｍ群、４Ｍ群、６Ｍ群、および８Ｍ群の動物に、損傷後１日目または１４日目のいずれかに、脊椎腔のＬ４−Ｌ５レベルに挿入された髄腔内（ＩＴ）管を介して、試験項目をゆっくりボーラス投与する。
研究デザインを表８に示す。略語：ＩＴポンプ‐髄腔内ポンプ移植；ＩＴ単回腰椎注入‐腰部における髄腔内注入。
表８ 研究デザイン
＊注：これらの群の動物は、ＴＩが投与されない日に髄腔内ポンプ移植を介して生理食塩水を投与する。５Ｍ群および９Ｍ群には、１５日目から２８日目まで、１２μＬ／日の０．９％生理食塩水ＩＴを投与する。７Ｍ群には、０日目から１３日目まで、１２μＬ／日の０．９％生理食塩水ＩＴを投与する。
＊＊注：ポンプ流量は、０．５μＬ／時（±０．１μＬ／時）である。ポンプ機能の持続期間は１４日間である。リザーバ容量は、２００μＬである。
試験手順：
Ｃｈｕｎｇ誘導モデルの原理：Ｃｈｕｎｇモデルは、ニューロパシー性疼痛の信頼性の高いモデルであり、動物が手術後に目覚めた直後に、動物の疼痛閾値の測定を可能にする。
手術および処置の概略を図４および図５に示す。
図４は、ＩＴポンプ移植により投与される試験項目およびガバペンチン処置に関する。（＊注：最初の１４日間生理食塩水滴下を適用し（０日目から１４日目まで）、次いで１４日目から２８日目まで薬物をさらに１４日間適用する（７Ｍ群）。）
図５は、ＩＴ単回腰椎注入により投与される試験項目に関する。
表９ 研究スケジュール（研究１日目から研究２８日目まで）：
ニューロパシー性疼痛誘導：ケタミン／キシラジンナトリウムを用いた麻酔下で、当該範囲の剃毛後、ラットを腹臥位にし、Ｌ４−Ｓ２レベルで左傍脊柱筋群を棘突起から分離する。Ｌ６脊椎横突起を小型骨鉗子で慎重に除去して、Ｌ５−Ｌ６脊髄神経を視覚的に確認する。左Ｌ５−Ｌ６脊髄神経を切断する。次いでこの筋肉を４−０絹縫合糸で縫合し、クランプにより皮膚を閉じる。手術後、ラットをケージに戻し、目覚めるまで加熱灯下に維持する。
事前選択の組み入れ／排除基準：
ａ．研究７日目に選択を実施する。
ｂ．下記の基準のうち１つまたは複数に当てはまる場合に疼痛が検出される：
ｃ．手術肢を舐め、付随して口で爪を軽く噛むまたは引っ張る；
ｄ．脚を空中に上げる；
ｅ．神経傷害と反対側に体重をかける；
ｆ．後肢の変形、ならびに異常な姿勢および歩行；
ｇ．左後肢の衰弱。
ｈ．これら全ては組み入れ基準である。
ｉ．動物は、Ｌ４が無傷であることを確実にするため、その脚を動かせなければならない。動物がその脚を動かせない場合、その動物は研究から排除する。
さらに、試験日に慎重な臨床検査を実施する。観察には、皮膚、毛皮、目、粘膜、分泌物および排泄物の発生（例えば、下痢）、ならびに自律神経活動（例えば、流涙、流涎、立毛、瞳孔の大きさ、異常な呼吸パターン）の変化が含まれる。歩行、姿勢、および接触時の反応の変化、ならびに奇妙な挙動、振戦、痙攣、睡眠、および昏睡の存在も観察される。上記の兆候のうちの１つまたは複数を示す動物は、研究から除外する。
ＡＬＺＥＴ浸透圧ポンプの準備および移植：１Ｍ群、５Ｍ群、７Ｍ群、および９Ｍ群の動物に、手術日に浸透圧ポンプを皮下移植する。その後皮膚切開を４−０絹縫合糸で縫合する。脊髄の髄腔内の脊椎Ｌ４レベルまで、ポリエチレンチューブを移植する。次にカニューレを浸透圧ポンプに接続し、２週間の投与に必要な量の生理食塩水を充填する。次いで、カニューレに少量の空気を充填する。ポンプ流量は、０．５μＬ／時（±０．１μＬ／時）である。ポンプ機能の持続期間は１４日間である。ポンプに２００μＬの容量のＴＩを充填する。ＴＩがＬ４の領域で投与されるように、大槽とＬ４椎骨との長さと可能な限り一致する長さで髄腔内カテーテルを挿入する。１Ｍ群、５Ｍ群、７Ｍ群、および９Ｍ群の動物を表８に指定するように処置する。
腰椎注入：髄腔内管を脊椎腔のＬ４−Ｌ５レベルに挿入し、試験項目をゆっくりボーラス投与する。
処置
処置開始：ＡＬＺＥＴポンプを用いたＩＴ経路による１４日間の継続処置（５Ｍ群、７Ｍ群、および９Ｍ群）。ＡＬＺＥＴポンプを用いたＩＴ経路による２８日間の継続処置（１Ｍ群）。
腰部におけるＩＴ経路による急性単回処置。
腰部における髄腔内注入を用いた、手術２４時間後に行う研究１日目の１回の予防的処置（４Ｍ群および８Ｍ群）。
腰椎注入を用いた、ＶＦ試験前に行う研究１４日目の１回の治療的処置（６Ｍ群）。
陽性対照のガバペンチン（３Ｍ群）は、研究１４日目、２１日目、および２８日目の疼痛試験２時間前に１日１回投与する。
投与経路
この研究で使用する投与経路Ｒを、表１０に記載する。
表１０ 投与経路
終了
研究終了時に、動物をＣＯ２で安楽死させる。
観察および計算
疼痛応答評価：機械的アロディニアのＶｏｎ Ｆｒｅｙ試験を用いて疼痛応答を評価した。機械的アロディニアのＶｏｎ Ｆｒｅｙ試験は、未処置動物にとっては痛くない短パルス圧力の印加に基づく。実際に、未処置動物の肢の引っ込めを達成するためには、印加する圧力が６０ｇを超えることもある。これにより、研究者は、未処置動物の肢を実際に持ち上げるのに十分な圧力をＶｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントにより印加することをしばしば要求される。しかしながら、疾患状態にある動物は、はるかに低い圧力に敏感であり、通常は痛くない刺激の結果として痛みを経験する。
機械的アロディニア評価（Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験）：Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ装置（Ｔｏｕｃｈ（登録商標））を用いて、触覚刺激に対するアロディニア応答を評価する。ラットを囲いに入れ、金網面上に置くが、自由に動けるようにする。ラットのキャビンを赤いセロファンで覆って、環境妨害を軽減する。試験は、探索挙動の停止後に開始する。１組のＶｏｎ Ｆｒｅｙモノフィラメントは、Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ装置の製造者（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌ）によって提供されるように、実際の力のおおよその対数目盛および認識される強度の均等目盛を提供する。
動作原理：所定の長さおよび直径の繊維の先端が皮膚に垂直に押し当てられたとき、印加される力は、繊維が曲がるまで研究者がプローブを前進させ続ける限り増加する。繊維が曲がった後、プローブが前進を続けると繊維がさらに曲がるが、さらなる力が肢に印加されることはない。
表１１は、力（ｇ）およびモノフィラメントのそれに対応するサイズを示す。
表１１ 力（ｇ）およびモノフィラメントのそれに対応するサイズ
齧歯動物は、その肢に不意に触れられたとき、肢引っ込め反射を示す。Ｔｏｕｃｈ Ｔｅｓｔ（登録商標）Ｓｅｎｓｏｒｙ Ｅｖａｌｕａｔｏｒを、ラットの足の足底面上に使用することができる。動物は、その肢を引き戻すことによって知覚を示す。引っ込め反応を高めるために必要な最小力を、基準値として指定する／みなす。
統計／データ評価：
全てのデータを、平均±標準誤差として提示する。各処置群は、一元配置ＡＮＯＶＡ、次いでＴｕｋｅｙ事後試験を用いて、その関連ビヒクル群と比較する（Ｓｏｆｔｗａｒｅ：ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）。一元配置ＡＮＯＶＡ反復測定、およびその後のＴｕｋｅｙ事後試験を使用して、各試験群について、処置前疼痛応答と処置後疼痛応答とを比較する。Ｐ値<０．０５が、有意差を示すものとする。
結果
体重：研究１日目、７日目、１４日目、２１日目、および２８日目に、体重を測定する。
Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験：結果は、左脚引っ込めの平均力（ｇ）として提示する。機械的アロディニアは、研究１４日目、１６日目、２１日目、および２８日目の異なる時点における、Ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントに対する動物の感受性の増加として観察される。
ＡＬＺＥＴポンプを用いたＩＴ経路によって処置した動物のＶｏｎ Ｆｒｅｙ応答：ビヒクル処置動物の手術した左脚の引っ込めに要するベースライン平均力（１Ｍ群）を測定する。研究１４日目、２１日目、および２８日目、左脚の引っ込め力を再び測定し、ベースライン測定値と比較する。
本明細書において開示されるｄｓＲｈｏＡ化合物が、この研究で試験され、予防的処置を用いて、ＩＴポンプにより投与した場合に、ＳＮＬ誘導ニューロパシー性疼痛の減少に有効であることがわかる。
本明細書において開示されるｄｓＲｈｏＡ化合物は、この研究で試験され、治療的処置を用いて、ＩＴポンプにより投与した場合に、ＳＮＬ誘導ニューロパシー性疼痛の減少に有効であることがわかる。
実施例１４：糖尿病性ニューロパシーのモデル系
この研究の目的は、角膜新血管形成の齧歯動物縫合モデルにおける、腹腔内（ＩＴ）ポンプ移植またはＩＴ単回腰椎注入（腰部の髄腔内注入）により適用したＲｈｏＡ ｄｓＲＮＡ化合物の治療効果の評価である。
種／株：ＳＤラット
総個体数：１２０；群当たりの個体数：１２
試験群：１つのビヒクル群
２つのｄｓＲＮＡ対照群
６つの試験項目（ｄｓＲｈｏＡおよびｄｓＴＬＲ４化合物、または異なる投与計画／経路での組み合わせ）
１つの陽性対照群
投与計画：研究１６日目の選択後に１回
ストレプトゾシン（ＳＴＺ）誘導糖尿病ラット研究概要。研究０日目にＳＴＺをＩＶ投与する。研究３日目およびその後週１回、ＢＧＬを試験する。研究１６日目に疼痛閾値を試験する。疼痛応答を示す動物を研究に組み入れ、ＩＴ経路を用いて試験項目を投与する。次いで、研究２１日目および２８日目に疼痛閾値を再試験する。
終了時に、以下のように、さらなる分析のために、脊髄およびＤＲＧを採取する：６匹の動物の組織を組織学的検査のために摘出し、６匹の動物の組織をＲＮＡ分析のために摘出する。
体重：動物の体重を週１回測定する。
読み取り：Ｖｏｎ Ｆｒｅｙに対する応答
本明細書において開示されるｄｓＲｈｏＡ化合物がこのモデル系で試験され、単独で、またはＴＬＲ４遺伝子を標的とする別のｄｓＲＮＡ化合物と組み合わせて投与した場合に、ニューロパシー性疼痛を減少させるのに有効であることが示される。
実施例１５：微小血管障害のモデル系
本明細書において開示されるｄｓＲｈｏＡ化合物は、下に記載のような一連の微小血管障害の動物モデルにおいて試験される。
１．糖尿病性網膜症
Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおいて糖尿病を誘発させ、このマウスを続いて本発明のｄｓＲｈｏＡ化合物および対照ｄｓＲＮＡ化合物の硝子体内注入に使用する。糖尿病誘発のために、マウスにストレプトゾトシン（一晩絶食後、ＳＴＺ ９０ｍｇ／ｋｇ／日で２日間）を注入する。血中グルコース、体重、およびヘマトクリットの変化について、動物の生理機能を研究を通してモニターする。ビヒクル注入マウスは、対照としての役割を果たす。適当な動物を本発明の抗ＲｈｏＡ ｄｓＲＮＡ化合物１μｇまたは抗ＧＦＰ対照ｄｓＲＮＡ化合物１μｇの硝子体内注入によって処置する。ｄｓＲＮＡ化合物は、研究過程中２度、最初のＳＴＺ注入が実施される０日目およびＳＴＺ注入後１４日目に注入する。
網膜血管漏出を、糖尿病４週間持続後の動物において、Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅ（ＥＢ）色素法を用いて測定する。マウスは、Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅ（ＥＢ）測定の２４時間前に右頸静脈にカテーテルを移植される。各動物の両眼における網膜透過性測定は、Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅ標準プロトコルに従う。
本明細書において開示されるｄｓＲｈｏＡ化合物は、このモデル系で試験され、糖尿病誘発性網膜血管漏出を減少させるのに有効であることが示される。
２．未熟児網膜症
試験動物を低酸素および過酸素の状態に暴露することによって未熟児網膜症を誘発し、その後網膜への効果を試験する。本明細書において開示されるｄｓＲｈｏＡ化合物は、このモデル系で試験され、未熟児網膜症から動物を保護するのに有効であることが示される。
３．心筋梗塞
糖尿心筋梗塞は、短期および長期の両方で、マウスの左前下行枝結紮により誘発する。本明細書において開示されるｄｓＲｈｏＡ化合物はこのモデル系で試験され、試験動物の血液において、梗塞２４時間後のトロポニン−Ｔ（ＴｎＴ）および総クレアチンホスホキナーゼのＭＢ分画（ＣＰＫ−ＭＢ）のレベルを減少するのに有効であることが示される。本明細書において開示されるｄｓＲｈｏＡ化合物で処置した動物は、対照ｄｓＲＮＡ化合物で処置した動物と比較して、梗塞後２８日後のより良好な心エコー（駆出量）を有する。
４．閉鎖性頭部傷害（ＣＨＩ）
実験的ＴＢＩは、神経性および神経代謝性カスケードに寄与する一連のイベントを生じ、それらは行動障害の程度および範囲と関連する。ＣＨＩは、麻酔下で、前頭面中央の左半球側を覆う露出した頭蓋上に、既定の高さから錘を自由落下させて誘発する（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ． Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ １３，５５７，１９９６）。
本明細書において開示されるｄｓＲｈｏＡ化合物は、このモデル系で試験され、ＴＢＩを標的とするのに有効であることが示される。
実施例１６：黄斑変性のモデル系
本明細書において開示されるｄｓＲｈｏＡ化合物は、以下の脈絡膜新血管形成（ＣＮＶ）の動物モデルで試験される。この滲出型ＡＭＤの特徴は、モデル動物においてレーザー処置によって誘発される。
マウスモデル：脈絡膜新血管形成（ＣＮＶ）誘発
滲出型ＡＭＤの特徴である脈絡膜新血管形成（ＣＮＶ）は、薬物群の割り付けを知らされていない単独の個人が０日目に各マウスの両眼に実施するレーザー光凝固術（５３２ｎｍ、２００ｍＷ、１００ｍｓ、７５μｍ）（ＯｃｕＬｉｇｈｔ ＧＬ，Ｉｒｉｄｅｘ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により誘発する。レーザースポットは、細隙灯送達系およびコンタクトレンズとしてのカバースリップを用いて、視神経周囲に標準化された方式で適用する。
処置群：ＣＮＶは、以下のマウス群において誘発する（６〜８週齢の雄）：
１２匹のＷＴマウス；
０日目および７日目に、片眼に本明細書に記載のＲｈｏＡ ｄｓＲＮＡ化合物０．２５μｇ、他眼に不活性抗ＧＦＰ ｄｓＲＮＡ化合物（陰性対象）を注入（ＩＶＴ）した１２匹のＷＴマウス；
０日目および７日目に、片眼に本明細書に記載のＲｈｏＡ ｄｓＲＮＡ化合物０．１μｇ、他眼にＰＢＳ（陰性対照）を注入（ＩＶＴ）した１２匹のＷＴマウス；
０日目および７日目に、片眼に本明細書に記載のＲｈｏＡ ｄｓＲＮＡ化合物０．０５μｇ、他眼にＰＢＳ（陰性対照）を注入（ＩＶＴ）した１２匹のＷＴマウス。
各マウスの両眼をレーザーで処置する。注入容量は、２μＬである。
評価
実験は１４日目に終了する。評価のために、眼を摘出し、４℃で３０分間、４％パラホルムアルデヒドで固定する。感覚神経網膜を分離し、視神経から切断する。残存するＲＰＥ−脈絡膜−強膜複合体を、Ｉｍｍｕ−Ｍｏｕｎｔ（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ，Ｖｅｃｔｏｒ）でフラットマウントし、カバースリップで覆う。フラットマウントを、走査型レーザー共焦点顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ，Ｌｅｉｃａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で検査する。青色アルゴンレーザーで励起して、血管を可視化する。ＲＰＥ−脈絡膜−強膜複合体の表面から、水平光学切片（１μｍステップ）を取得する。病巣につながる周囲の脈絡膜血管網を特定できる最も深い焦平面を病巣の底部であると判断する。レーザー処理範囲にある、この基準面の表面の任意の血管をＣＮＶと判断する。各切片の画像をデジタル保存する。ＣＮＶに関連する蛍光範囲を、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰソフトウェアを用いたコンピュータ画像分析によって測定する。各水平切片における全蛍光範囲の合計をＣＮＶの体積の指標として使用する。
別個のＷＴマウス（１群当たり５個の眼）を使用して、ＣＮＶにおけるＲｈｏＡ ｍＲＮＡ発現（ならびにＡＭＤに関連する他の遺伝子の発現）（本明細書において開示されるｄｓＲＮＡ化合物で未処置のもの、および処置したもの）をＲＰＥ／脈絡膜から、または神経網膜から抽出したＲＮＡのリアルタイムＰＣＲを用いて評価した。
本明細書において開示されるｄｓＲｈｏＡ化合物は、このモデル系で試験され、ＣＮＶ体積の減少を導くことが示される。
実施例１７：腫瘍成長の軽減に関するＲＨＯＡに対するｄｓＲＮＡの評価
方法：
（ａ） 皮下腫瘍異種移植片：約５×１０６のＡ５４９細胞を雄胸腺欠損ヌードマウスの後肢に注入し、皮下腫瘍を週１回測定する。次式を用いて腫瘍体積を測定する：［長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×０．５２］。皮下腫瘍内へのｄｓｉＲＮＡのインビボ送達のために、試験ｄｓＲＮＡ二重鎖をＰＢＳで希釈し、濃度１０μｇ／ｍＬでインスリン用注射器を用いて後肢腫瘍に注入する。他の動物において、用量４０ｍｇ／ｋｇ体重でカルボプラチンの腹腔内投与を行う。ｄｓＲＮＡおよびカルボプラチンは、週２回４週間投与する。本発明のｄｓＲＮＡの抗腫瘍活性をインビボで試験するために、皮下腫瘍を有するマウスを試験ｄｓＲＮＡの腫瘍内への直接注入によって、およびカルボプラチンによって、週２回４週間処置し、実験終了時に体重を測定する。
（ｂ） 肺転移実験：約２×１０６のＡ５４９−Ｃ８−ｌｕｃ細胞をＳＣＩＤ−Ｂｅｉｇｅマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，ＭＡ）に静脈内注入し、発生期の肺腫瘍を週１回測定する。試験または対照ｄｓＲＮＡの肺腫瘍へのエアロゾル送達のために、ＰＢＳで希釈した１００μｇのｄｓＲＮＡをネブライザを用いてエアロゾル投与する。マウスに、ネブライザを用いて、毎週３用量のｄｓＲＮＡ（１００μｇ／用量）を４週間投与する。対照マウスにおいて、カルボプラチンを用量３０ｍｇ／ｋｇ体重で週２回、腹腔内注入する。腫瘍重量を実験終了時に測定する。
本明細書において開示されるｄｓＲＮＡ分子が、これらの動物モデルにおいて試験され、インビボで腫瘍の荷重を軽減するのに有効であり、また癌の治療に有効である。
本明細書において言及または引用される論文、特許、および特許出願、ならびに全ての他の文書および電子的に入手可能な情報の内容は、個々の刊行物のそれぞれが具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されるかのように、それらの全体として本明細書に組み込まれる。
出願人は、いかなる当該の論文、特許、特許出願、または他の物理的および電子的文書からのいかなる材料および情報も物理的に本願に組み込む権利を留保する。
本明細書において開示される発明に、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、様々な代用および変更を行ってもよいことを当業者は容易に理解するであろう。したがって、そのような付加的な実施形態は、本発明の範囲および以下の特許請求の範囲に含まれる。本発明は、当業者に、ＲＮＡｉ活性を媒介するための改善された活性を有する核酸構築物の生成を目的として、本明細書に記載される化学修飾の種々の組み合わせおよび／または代用を試験するよう教示する。かかる改善された活性には、改善された安定性、改善された生物学的利用能、および／またはＲＮＡｉを媒介する細胞応答の改善された活性化を含み得る。したがって、本明細書に記載される具体的な実施形態は限定的なものではなく、当業者は、改善されたＲＮＡｉ活性を有する核酸分子を特定する目的で、本明細書に記載される修飾の特定の組み合わせを過度の実験を行わずに試験することが可能であることは容易に理解することができる。
本明細書において例示的に記載される本発明は、本明細書において特に開示されない任意の１つまたは複数の要素、１つまたは複数の制限の不在下でも、適切に実施することができる。したがって、例えば、本発明を説明する文脈における（特に、以下の特許請求の範囲の文脈における）、用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」、ならびに類似する指示対象は、本明細書において別段の指定がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の双方を包含すると解釈されるべきである。「備える」、「有する」、「含む」、「含有する」などの用語は、拡張的に、制限することなく読み取るべきである（例えば、「〜を含むが、これらに限定されない」を意味する）。本明細書における数値範囲の列挙は、本明細書において別段の指定がない限り、単にその範囲内に該当する個々の値それぞれを個別に言及するための簡単な方法としての役割を果たすことだけを意図しており、個々の値はそれぞれ、本明細書において個別に列挙されるかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書において別段の指定がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書において提示されるあらゆる例または例示的な表現（例えば「など」）の使用は、別段に主張しない限り、単に本発明の理解をより容易にすることのみを意図し、本発明の範囲に対する制限を設けるものではない。明細書中のいかなる表現も、請求項に記載されていない要素が本発明の実施に不可欠であると示すと解釈すべきではない。さらに、本明細書において使用する用語および表現は、説明の用語として使用したものであり、限定するものではなく、そのような用語や表現を使用には、図示および説明する特徴またはその一部のいかなる同等物も排除する意図はなく、請求項に記載される発明の範囲内で、様々な修正が可能であることを理解すべきである。したがって、本発明は、好ましい実施の形態および任意の特徴によって具体的に開示されているが、当業者は、本明細書において開示されるその中で具現される発明の修正および変形を行うことができ、またそのような修正および変形は、本発明の範囲に含まれるみなされることを理解すべきである。
本発明を幅広く、一般的に説明してきた。包括的な開示の範囲に該当するより狭い種や亜属のグループ分けも本発明の一部をなす。これは、削除される材料が本明細書において具体的に記載されているか否かに関わらず、任意の対象を属から取り除く条件または消極的な限定のもとで、本発明の一般的記述を含む。他の実施形態は、以下の特許請求の範囲に含まれる。さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群に関して記載される場合、当業者は、本発明が、それによって、マーカッシュ群の任意の個々の要素または群の要素の亜群に関しても記載されていることを認識するであろう。

Claims (85)

  1. センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖核酸分子であって、前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、ＲＨＯＡ＿４８（配列番号７９および１１３）、ＲＨＯＡ＿４８ｕ（配列番号８０および１１４）、ＲＨＯＡ＿５０（配列番号８２および１１６）、またはＲＨＯＡ＿５８（配列番号１４３および１５７）として記載されるオリゴヌクレオチドから選択される、二本鎖核酸分子。
  2. 前記アンチセンス鎖の配列が配列番号１１３を含み、前記センス鎖の配列が、配列番号７９を含む、請求項１に記載の二本鎖核酸分子。
  3. 前記アンチセンス鎖が、配列番号１１３であり、（５’から３’の方向で）５位、６位、７位、または８位のうちの少なくとも１つにミラーヌクレオチドまたは２’−５’連結ヌクレオチドと、３’末端で共有結合した非ヌクレオチド部分とを含み、（５’から３’の方向で）５位、６位、７位、または８位のうちの１つまたは複数にミラーヌクレオチドまたは２’−５’連結ヌクレオチドと、３’末端で共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分とを含み、前記センス鎖は、（配列番号７９）であり、３’末端または３’末端から２番目の位置の４個または５個に連続する２’−５’連結ヌクレオチドと、３’末端で共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分と、１つまたは複数の２’ＯＭｅ糖修飾ヌクレオチドと、５’末端で共有結合したキャップ部分とを含む、請求項２に記載の二本鎖核酸分子。
  4. 前記アンチセンス鎖（配列番号１１３）が、（５’から３’の方向で）１位、３位、１１位、１４位、１５位、１７位、および１８位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、３’末端に共有結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分とを含み、前記センス鎖（配列番号７９）が、（５’から３’の方向で）１５位、１６位、１７位、１８位、および１９位に２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドオーバーハングと、５’末端で共有結合したキャップ部分とを含む、請求項３に記載の二本鎖核酸分子。
  5. ＲＨＯＡ＿４８＿Ｓ１８３３として記載される、請求項４に記載の二本鎖核酸分子。
  6. 前記アンチセンス鎖が、６位、７位、または６位および７位に、２’−５’連結リボヌクレオチドをさらに含む、請求項４に記載の二本鎖核酸分子。
  7. ＲＨＯＡ＿４８＿Ｓ１８５７として記載される、請求項６に記載の二本鎖核酸分子。
  8. ＲＨＯＡ＿４８＿Ｓ１８７３として記載される、請求項６に記載の二本鎖核酸分子。
  9. ＲＨＯＡ＿４８＿Ｓ１８５６として記載される、請求項６に記載の二本鎖核酸分子。
  10. ＲＨＯＡ＿４８＿Ｓ１８７２として記載される、請求項６に記載の二本鎖核酸分子。
  11. ＲＨＯＡ＿４８＿Ｓ１８５８として記載される、請求項６に記載の二本鎖核酸分子。
  12. ＲＨＯＡ＿４８＿Ｓ１８５９として記載される、請求項６に記載の二本鎖核酸分子。
  13. ＲＨＯＡ＿４８＿Ｓ１８６０として記載される、請求項６に記載の二本鎖核酸分子。
  14. 前記アンチセンス鎖の１位にウリジン（ｒＵ）からデオキシリボチミジン（ｄＴ）への置換をさらに含む、請求項６に記載の二本鎖核酸分子。
  15. ＲＨＯＡ＿４８＿Ｓ１８８４として記載される、請求項１４に記載の二本鎖核酸分子。
  16. 前記アンチセンス鎖の配列が配列番号１１４を含み、前記センス鎖の配列が配列番号８０を含む、請求項１に記載の二本鎖核酸分子。
  17. 前記アンチセンス鎖（配列番号１１４）が、（５’から３’の方向で）１つまたは複数の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、（５’から３’の方向で）５位、６位、７位、または８位のうちの１つまたは複数にミラーヌクレオチドまたは２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドオーバーハングとを含み、前記センス鎖（配列番号８０）が、（５’から３’の方向で）３’末端または３’末端から２番目の位置で４個または５個の連続する２’−５’連結ヌクレオチドと、３’末端で共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分と、５’末端で共有結合したキャップ部分とを含む、二本鎖核酸分子。
  18. ＲＨＯＡ＿４８ｕ＿Ｓ１８１２として記載される、請求項１７に記載の二本鎖核酸分子。
  19. 前記センス鎖（配列番号８０）が、１つまたは複数の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドをさらに含む、請求項１７に記載の二本鎖核酸分子。
  20. ＲＨＯＡ＿４８ｕ＿Ｓ１８１３として記載される、請求項１９に記載の二本鎖核酸分子。
  21. ＲＨＯＡ＿４８ｕ＿Ｓ１８７０として記載される、請求項１９に記載の二本鎖核酸分子。
  22. ＲＨＯＡ＿４８ｕ＿Ｓ１８７１として記載される、請求項１９に記載の二本鎖核酸分子。
  23. 前記アンチセンス鎖の配列が配列番号１１６を含み、前記センス鎖の配列が配列番号８２を含む、請求項１に記載の二本鎖核酸分子。
  24. 前記アンチセンス鎖（配列番号１１６）が、（５’から３’の方向で）ＤＮＡと、５位、６位、７位、または８位のうちの１つまたは複数にミラーヌクレオチドまたは２’−５’連結ヌクレオチドと、３’末端で共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分と、１つまたは複数の２’Ｏｍｅ糖修飾ヌクレオチドとを含み、前記センス鎖（配列番号８２）が、（５’から３’の方向で）９位または１０位のうちの１つまたは複数にミラーヌクレオチドまたは２’−５’連結ヌクレオチドと、３’末端で共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分と、１つまたは複数の２’ＯＭｅ糖修飾ヌクレオチドと、５’末端で共有結合したキャップ部分と、を含む、請求項２３に記載の二本鎖核酸分子。
  25. ＲＨＯＡ＿５０＿Ｓ１７９６として記載される、請求項２４に記載の二本鎖核酸分子。
  26. ＲＨＯＡ＿５０＿Ｓ１７９８として記載される、請求項２４に記載の二本鎖核酸分子。
  27. ＲＨＯＡ＿５０＿Ｓ１７９９として記載される、請求項２４に記載の二本鎖核酸分子。
  28. ＲＨＯＡ＿５０＿Ｓ１８６５として記載される、請求項２４に記載の二本鎖核酸分子。
  29. ＲＨＯＡ＿５０＿Ｓ１８６６として記載される、請求項２４に記載の二本鎖核酸分子。
  30. 前記アンチセンス鎖の配列が配列番号１５７を含み、前記センス鎖の配列が配列番号１４３を含む、請求項１に記載の二本鎖核酸分子。
  31. 前記アンチセンス鎖（配列番号１５７）が、（５’から３’の方向で）５位、６位、７位、または８位のうちの１つまたは複数にミラーヌクレオチドまたは２’−５’連結リボヌクレオチドと、３’末端で共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分と、１つまたは複数の２’ＯＭｅ糖修飾ヌクレオチドとを含み、前記センス鎖（配列番号１４３）が、３’末端または３’末端から２番目の位置に４個または５個の連続する２’−５’連結ヌクレオチドあるいは１つまたは複数の２’ＯＭｅ糖修飾ヌクレオチドと、３’末端で共有結合したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分と、５’末端で共有結合したキャップ部分とを含む、請求項２９に記載の二本鎖核酸分子。
  32. ＲＨＯＡ＿５８＿Ｓ１８０１として記載される、請求項３０に記載の二本鎖核酸分子。
  33. ＲＨＯＡ＿５８＿Ｓ１８０４として記載される、請求項３０に記載の二本鎖核酸分子。
  34. ＲＨＯＡ＿５８＿Ｓ１８０６として記載される、請求項３０に記載の二本鎖核酸分子。
  35. ＲＨＯＡ＿５８＿Ｓ１８６１として記載される、請求項３０に記載の二本鎖核酸分子。
  36. ＲＨＯＡ＿５８＿Ｓ１８６２として記載される、請求項３０に記載の二本鎖核酸分子。
  37. ＲＨＯＡ＿５８＿Ｓ１８７７として記載される、請求項３０に記載の二本鎖核酸分子。
  38. ＲＨＯＡ＿５８＿Ｓ１８７８として記載される、請求項３０に記載の二本鎖核酸分子。
  39. ＲＨＯＡ＿５８＿Ｓ１８７９として記載される、請求項３０に記載の二本鎖核酸分子。
  40. 構造（Ａ１）：

    （Ａ１） ５’ （Ｎ）ｘ‐Ｚ ３’（アンチセンス鎖）
    ３’ Ｚ’−（Ｎ’）ｙ‐" ５’（センス鎖）
    を有する二本鎖分子であって、式中、それぞれのＮおよびＮ’は、修飾されていなくても修飾されていてもよいリボヌクレオチド、または非従来的部分であり、
    （Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれはオリゴヌクレオチドであり、それぞれの連続するＮまたはＮ’は、共有結合によって次のＮまたはＮ’と接合され、
    それぞれのＺおよびＺ’は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端で共有結合した、１〜５個の連続するヌクレオチド、１〜５個の連続する非ヌクレオチド部分、またはそれらの組み合わせを含み、
    ｚ"は、存在しても不在でもよいが、存在する場合は、（Ｎ’）ｙの５’末端で共有結合したキャッピング部分であり、
    それぞれのｘおよびｙは、独立して、１８〜４０の整数であり、
    （Ｎ’）ｙの配列は（Ｎ）ｘの配列に相補的であり、（Ｎ）ｘは、表ＩＩＩに記載されるアンチセンス配列を含む、二本鎖核酸分子。
  41. ｘ＝ｙ＝１９である、請求項３８に記載の二本鎖核酸分子。
  42. 前記センス鎖の配列および前記アンチセンス鎖の配列が、ＲＨＯＡ＿３１（配列番号１３５および１４９）、ＲＨＯＡ＿３３（配列番号１３６および１５０）、ＲＨＯＡ＿３７（配列番号１３７および１５１）、ＲＨＯＡ＿３８（配列番号１３８および１５２）、ＲＨＯＡ＿４３（配列番号１３９および１５３）、ＲＨＯＡ＿５２（配列番号１４０および１５４）、ＲＨＯＡ＿５６（配列番号１４１および１５５）、ＲＨＯＡ＿５７（配列番号１４２および１５６）、ＲＨＯＡ＿５８（配列番号１４３および１５７）、ＲＨＯＡ＿６８（配列番号１４４および１５８）、ＲＨＯＡ＿６９（配列番号１４５および１５９）、ＲＨＯＡ＿７０（配列番号１４６および１６０）、ＲＨＯＡ＿７３（配列番号１４７および１６１）、ならびにＲＨＯＡ＿７６（配列番号１４８および１６２）に示されるオリゴヌクレオチドの対から選択される、請求項３８または請求項３９に記載の二本鎖核酸分子。
  43. 前記分子が、前記センス鎖中、前記アンチセンス鎖中、または前記センス鎖および前記アンチセンス鎖両鎖中の非修飾リボヌクレオチドからなる、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の二本鎖核酸分子。
  44. 前記分子が、前記センス鎖中、前記アンチセンス鎖中、または前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の両鎖中に、修飾リボヌクレオチドおよび非従来的部分を含む、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の二本鎖核酸分子。
  45. 下記に記載の構造（Ａ２）：
    （Ａ２） ５’ Ｎ１−（Ｎ）ｘ−Ｚ ３’（アンチセンス鎖）
    ３’ Ｚ’−Ｎ２−（Ｎ’）ｙ‐ｚ" ５’（センス鎖）
    を有する二本鎖核酸分子であって、式中、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ、およびＮ’はそれぞれ、独立して、非修飾もしくは修飾ヌクレオチド、または非従来的部分であり、
    （Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙのそれぞれは、それぞれの連続するＮまたはＮ’が共有結合によって隣接するＮまたはＮ’と接合されるオリゴヌクレオチドであり、
    ｘおよびｙのそれぞれは、独立して、１７〜３９の整数であり、
    Ｎ２は、（Ｎ’）ｙと共有結合し、
    Ｎ１は、（Ｎ）ｘと共有結合し、標的ｍＲＮＡ（配列番号１）と一致しないか、または標的ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ部分であり、
    Ｎ１は、天然または修飾された、ウリジン、デオキシリボウリジン、リボチミジン、デオキシリボチミジン、アデノシン、またはデオキシアデノシン、脱塩基リボース部分、および脱塩基デオキシリボース部分からなる群から選択される部分であり、
    ｚ"は、存在しても不在でもよいが、存在する場合は、Ｎ２−（Ｎ’）ｙの５’末端で共有結合したキャッピング部分であり、
    それぞれのＺおよびＺ’は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端で共有結合した、１〜５個の連続するヌクレオチド、１〜５個の連続する非ヌクレオチド部分、またはそれらの組み合わせであり、
    （Ｎ’）ｙの配列は（Ｎ）ｘの配列に相補的であり、（Ｎ）ｘの配列は、表Ｉに記載されるアンチセンス配列を含む、二本鎖核酸分子。
  46. ｘ＝ｙ＝１８である、請求項４３に記載の二本鎖核酸分子。
  47. 前記センス鎖の配列および前記アンチセンス鎖の配列が、ＲＨＯＡ＿３２（配列番号６７および１０１）、ＲＨＯＡ＿３４（配列番号６８および１０２）、ＲＨＯＡ＿３５（配列番号６９および１０３）、ＲＨＯＡ＿３６（配列番号７０および１０４）、ＲＨＯＡ＿３９（配列番号７１および１０５）、ＲＨＯＡ＿４０（配列番号７２および１０６）、ＲＨＯＡ＿４１（配列番号７３および１０７）、ＲＨＯＡ＿４２（配列番号７４および１０８）、ＲＨＯＡ＿４４（配列番号７５および１０９）、ＲＨＯＡ＿４５（配列番号７６および１１０）、ＲＨＯＡ＿４６（配列番号７７および１１１）、ＲＨＯＡ＿４７（配列番号７８および１１２）、ＲＨＯＡ＿４８（配列番号７９および１１３）、ＲＨＯＡ＿４８ｕ（配列番号８０および１１４）、ＲＨＯＡ＿４９（配列番号８１および１１５）、ＲＨＯＡ＿５０（配列番号８２および１１６）、ＲＨＯＡ＿５１（配列番号８３および１１７）、ＲＨＯＡ＿５３（配列番号８４および１１８）、ＲＨＯＡ＿５４（配列番号８５および１１９）、ＲＨＯＡ＿５５（配列番号８６および１２０）、ＲＨＯＡ＿５９（配列番号８７および１２１）、ＲＨＯＡ＿６０（配列番号８８および１２２）、ＲＨＯＡ＿６１（配列番号８９および１２３）、ＲＨＯＡ＿６１ｕ（配列番号９０および１２４）、ＲＨＯＡ＿６２（配列番号９１および１２５）、ＲＨＯＡ＿６３（配列番号９２および１２６）、ＲＨＯＡ＿６４（配列番号９３および１２７）、ＲＨＯＡ＿６５（配列番号９４および１２８）、ＲＨＯＡ＿６６（配列番号９５および１２９）、ＲＨＯＡ＿６７（配列番号９６および１３０）、ＲＨＯＡ＿７１（配列番号９７および１３１）、ＲＨＯＡ＿７２（配列番号９８および１３２）、ＲＨＯＡ＿７４（配列番号９９および１３３）、ならびにＲＨＯＡ＿７５（配列番号１００および１３４）に示されるオリゴヌクレオチドの対から選択される、請求項４３または請求項４４に記載の二本鎖核酸分子。
  48. 前記分子が、前記センス鎖中、前記アンチセンス鎖中、または前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の両鎖中の非修飾リボヌクレオチドからなる、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の二本鎖核酸分子。
  49. 前記分子が、前記センス鎖中、前記アンチセンス鎖中、または前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の両鎖中に、修飾リボヌクレオチドおよび非従来的部分を含む、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の二本鎖核酸分子。
  50. 図１に記載される分子から選択される、請求項３８または請求項４３に記載の二本鎖核酸分子。
  51. 請求項１〜４８のいずれか一項に記載の二本鎖分子と、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
  52. 患者による使用のためにパッケージ化された、先行する請求項のいずれかに記載の二本鎖分子を含む、組成物。
  53. 前記組成物が、先行する請求項のいずれかに記載の前記二本鎖分子の使用方法に関する情報を提供するラベルまたは添付文書を含む、請求項５０に記載の組成物。
  54. 前記ラベルまたは添付文書が、投薬情報および／または使用のための指示を含む、請求項５１に記載の組成物。
  55. 前記ラベルまたは添付文書が、先行する請求項のいずれかに記載の前記二本鎖分子が治療における使用に好適であることを示す、請求項５０〜５２のいずれかに記載の組成物。
  56. 前記ラベルまたは添付文書が、先行する請求項のいずれかに記載の二本鎖分子がＲｈｏＡに関連する疾患を患っている患者を治療する際の使用に好適であることを示す、５０〜５３のいずれかに記載の組成物。
  57. 治療に使用するための、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の二本鎖核酸分子または請求項４９に記載の組成物。
  58. 細胞におけるＲｈｏＡの発現を減少させるための、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の二本鎖核酸分子または請求項４９に記載の組成物。
  59. 細胞に、先行する請求項のいずれかに記載の二本鎖分子をＲｈｏＡの発現を減少させるのに十分な量で導入することを含む、細胞におけるＲｈｏＡの発現を減少させる方法。
  60. ＲｈｏＡ発現に関連する疾患を患っている個人を治療するための方法であって、前記個人に、請求項１〜４８のいずれかに記載の二本鎖分子をＲｈｏＡの発現を減少させるのに十分な量で投与することを含む方法。
  61. ＣＮＳの傷害、疾患、または障害を患っている対象を治療する方法であって、前記対象に、ＲｈｏＡの発現を阻害する請求項１〜４８のいずれかに記載の二本鎖分子を疾患または状態を治療するのに有効な量で投与することを含む方法。
  62. 必要性のある個人における、中枢神経系（ＣＮＳ）における傷害、疾患、障害、または状態に起因する神経変性の防止、抑制、または治療のための方法であって、前記個人に、有効量の請求項１〜４８のいずれかに記載の二本鎖分子を投与して、それによって前記傷害、疾患、障害、または状態を治療することを含む方法。
  63. 必要性のある個人における、中枢神経系（ＣＮＳ）における傷害、疾患、障害、または状態によって損傷した、または損傷の危険性があるニューロンに対する神経保護を達成するための方法であって、前記個人に、有効量の請求項１〜４８のいずれかに記載の二本鎖分子を投与して、それによって神経保護を達成することを含む方法。
  64. 必要性のある個人における、中枢神経系（ＣＮＳ）における傷害、疾患、障害、または状態によって損傷したニューロンに対する神経再生を達成するための方法であって、前記個人に、有効量の請求項１〜４８のいずれかに記載の二本鎖分子を投与して、それによって神経再生を達成することを含む方法。
  65. 前記傷害、疾患、障害、または状態が、神経系の傷害、神経変性疾患または障害、心血管イベントに起因する脳障害、脳血管障害または疾患、認知症、および神経変性に関連する難聴からなる群から選択される、請求項６０〜６２のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記傷害が、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）および脊髄傷害からなる群から選択される外傷性傷害である、請求項６３に記載の方法。
  67. 前記傷害、疾患、障害、または状態が、神経変性疾患または障害である、請求項６３に記載の方法。
  68. 前記神経変性疾患または障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、顔面（ベル）麻痺、多発性硬化症、緑内障、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、メニエール病、緑内障、および黄斑変性からなる群から選択される、請求項６３に記載の方法。
  69. 前記傷害、疾患、障害、または状態が心血管イベントに起因する脳障害である、請求項６３に記載の方法。
  70. 前記心血管イベントが心停止または心臓手術である、請求項６７に記載の方法。
  71. 前記傷害、疾患、障害、または状態が脳血管障害または疾患である、請求項６３に記載の方法。
  72. 前記脳血管障害が脳虚血または脳卒中である、請求項６９に記載の方法。
  73. 前記傷害、疾患、障害、または状態が認知症である、請求項６３に記載の方法。
  74. 前記認知症が、アルツハイマー病、または老年認知症、レヴィー小体認知症、血管性認知症、およびパーキンソン病、ハンチントン舞踏病、クロイツフェルトヤコブ病（ＣＪＤ）、もしくはＨＩＶ感染症に起因する認知症からなる群から選択される非アルツハイマー認知症である、請求項７１に記載の方法。
  75. 神経系の疾患、障害、傷害、または状態に関連する神経変性に罹患した、またはその危険性がある個人に、神経保護を与えるための方法であって、前記個人に、請求項１〜４８のいずれかに記載の二本鎖分子またはその薬学的に許容される塩を前記神経変性を改善または防止するのに有効な量で投与することを含む方法。
  76. 前記神経系の疾患が緑内障、ＮＡＩＯＮ、またはＡＭＤである、請求項７３に記載の方法。
  77. 前記神経変性が視神経の神経変性である、請求項７３に記載の方法。
  78. 与えられる前記神経保護が、血栓塞栓性（血栓性）脳卒中または頭蓋−脳外傷性傷害によって生じる脳傷害の治療を含む、請求項７３に記載の方法。
  79. メニエール病に罹患した個人において、聴神経に対する神経保護を与えるための方法であって、前記個人に、請求項１〜４８のいずれかに記載の二本鎖分子またはその薬学的に許容される塩を前記聴神経に対する神経保護を与えるのに有効な量で投与することを含む方法。
  80. メニエール病に罹患した個人において、難聴を軽減または防止するための方法であって、前記個人に、請求項１〜４８のいずれかに記載の二本鎖分子またはその薬学的に許容される塩を前記難聴を改善または防止するのに有効な量で投与することを含む方法。
  81. 前記必要性のある個人が、緑内障またはメニエール病に罹患している、請求項７７〜７８のいずれかに記載の方法。
  82. 前記化合物が前記個人の鼓膜に局所的に投与される、請求項７７〜７９のいずれかに記載の方法。
  83. 請求項１〜４８のいずれかに記載の二本鎖分子のうち１つまたは複数を含む細胞。
  84. 必要性のある対象において、癌または増殖性疾患を治療するための方法であって、前記対象に、請求項１〜４８のいずれかに記載の二本鎖分子を前記対象を治療するのに有効な量で投与することを含む方法。
  85. 必要性のある対象において、癌、腫瘍成長、または増殖性疾患を治療するための方法であって、前記対象に、請求項１〜４８のいずれかに記載の二本鎖分子を前記対象を治療するのに有効な量で投与することを含む方法。
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