MX2008014260A - Inhibicion mediada por arni de condiciones ?-relacionadas con factor de necrosis tumoral. - Google Patents

Inhibicion mediada por arni de condiciones ?-relacionadas con factor de necrosis tumoral.

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MX2008014260A
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Daniel A Gamache
Jon E Chatterton
Steven T Miller
Diane Michelle Senchyna
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Abstract

Se provee ARN de interferencia para la inhibición de factor de necrosis tumoral ? (TNF?) silenciando la expresión de ARNm del receptor 1 de TNF (TNFR1) del receptor de superficie celular de TNF?, o silenciando la expresión de ARNm de la enzima que convierte el TNF?, (TACE/ADAM17). El silenciamiento de dichos blancos de TNF?, en particular, es útil para tratar pacientes que tienen una condición relacionada con TNF? o en riesgo de desarrollar una condición relacionada con TNF? tal como las condiciones oculares de ojo seco, conjuntivitis alérgica, o inflación ocular, o tal como, por ejemplo dermatitis, rinitis o asma.

Description

INHIBICIÓN MEDIADA POR ARNi DE CONDICIONES oc-RELAC ONADAS CON FACTOR DE NECROSIS TUMORAL SOLICITUD RELACIONADA La presente solicitud reclama el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de E.U.A. co-pendiente Serie Número 60/801,788 presentada el 19 de mayo de 2006, titulada RNAi-MEDIATED INHIBITION OF TUMOR NECROSIS FACTOR -RELATED CONDITIONS, el texto de la cual se incorpora específicamente por referencia en la presente.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de composiciones de ARN de interferencia para silenciar el factor OÍ de necrosis tumoral (TVF a) silenciando el receptor de superficie celular de TNF a, ARNm de receptor-1 de TNF (TNFRl) , o el ARNm de enzima de conversión de TNF (TACE/ADAM17 ) . El silenciamiento de dichos blancos de TNF a es útil para el tratamiento de pacientes que tienen una condición relacionada con TNF o en riesgo de desarrollar dicha condición.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La inflamación generalmente se trata con un régimen anti-inflamatorio normal que incluye esteroides y/o fármacos anti-inflamatorios no esferoidales (NSAIDS) . La conjuntivitis alérgica, inflamación ocular, dermatitis, rinitis y asma se han tratado históricamente con un régimen de antihistaminas orales, intranasales o tópicas además de los esferoides orales o intranasales. El tratamiento sistémico normalmente requiere concentraciones superiores del compuesto de fármaco que será administrado para dar una concentración efectiva para alcanzar el sitio de tratamiento necesario. Los compuestos de antihistamina se conocen por tener actividad del sistema nervioso central; somnolencia y secado de las membranas de la mucosa son efectos laterales comunes del uso de anti-histamínicos . Los esferoides y NSAID tienen efectos laterales potenciales incluyendo incremento de presión infraocular, cataratas, glaucoma o fusión de la córnea. Los ojos secos, también conocido como conjuntivitis seca o queratoconjuntivitis seca, es un trastorno oftalmológico común que implica la ruptura de la película del lagrimal pre-ocular, dando como resultado la deshidratación de la superficie externa expuesta del ojo. A la fecha, el ojo seco se ha tratado con la administración tópica de soluciones de lágrimas artificiales. Algunas de estas soluciones contienen sustancias mucomiméticas para reemplazar temporalmente o rellenar la capa de mucina en los pacientes con deficiencia de mucina. El uso de metilprednisolona se ha propuesto en un tratamiento de "impulsos" a corto plazo para tratar exacerbaciones del ojo seco. La terapia de "impulsos" propuesta se requiere para evitar complicaciones asociadas con la terapia de esteroides tradicional para condiciones inflamatorias tales como presión infraocular incrementada y formación de cataratas. TNF a de citoquina es un blanco para la terapia anti-inflamatoria de ojo seco y uveitis. En un modelo de conejos del ojo seco inducido por inflamación de la glándula lagrimal, inhibición de mancha de cornea y restauración de tiempo de interrupción de lágrimas, se ha logrado por la modulación especifica de los niveles de TNF a de la superficie ocular. La terapia de ojos secos que resulta por la inhibición de síntesis de TNFa (RDP58) o neutralizando específicamente TNFa usando un anticuerpo monoclonal (REMICADE®) o un receptor soluble (ENBREL®) . Cada uno de estos tratamientos dirigidos a TNFa dio como resultado niveles de eficacia obtenida con esteroides antiinflamatorios oculares tópicos. La Publicación de Patente de E.U.A. 2005/0227935, publicada el 13 de octubre de 2005, de McSiggen y otros, se refiere a inhibición mediada por interferencia de ARN de TNF y expresión de genes de receptor de TNF. Sin embargo, dicha publicación no enseña ninguna de las secuencias blanco particulares para interferencia serán como se provee en la presente.
Las modalidades de la presente invención se dirigen a la necesidad en la materia de agentes y métodos de tratamiento para el ojo seco e inflamación y proveen terapias alternativas para lo mismo.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Las modalidades de la presente invención proveen tratamientos altamente potentes y eficaces, prevención o intervención de una condición relacionada con TNFa sin efectos laterales asociados con esteroides o NSAIDS. En un aspecto, los métodos de la invención incluye tratar a un sujeto que tiene una condición relacionada con TNFa o que está en riesgo de desarrollar una condición relacionada con TNFa administrando ARN de interferencia que silencian la expresión de ARNm TACE o ARNm TNFR1, interfiriendo asi con el proceso proteolitico del precursor a TNFa, o interfiriendo con la unión de TNFa a su receptor de superficie celular, respectivamente, atenuando asi la actividad de TNFa y evitando una cascada de eventos relacionados con apoptosis e inflamación. Una condición relacionada con TNFa incluye condiciones tales como o seco y condiciones inflamatorias relacionadas con TNFa. Una condición inflamatoria relacionada con TNFa incluye condiciones tales como inflamación ocular, conjuntivitis alérgica, dermatitis, rinitis, y asma, por ejemplo, e incluye aquellos cambios celulares que resultan de la cantidad de TNFa que conduce directa o indirectamente a la condición inflamatoria relacionada con TNFa. Una condición relacionada con TNFa incluye particularmente condiciones oculares relacionadas con TNFa tales como ojo seco, conjuntivitis alérgica, e inflamación ocular. El ARN de interferencia provisto en la prevete provee el silenciamiento de los blancos de TNFa de ARNm de TACE o ARNm de TNFR1 mientras que evita los efectos laterales indeseables debido a los agentes no específicos. Un método para atenuar la expresión de ARNm TACE del sujeto es una modalidad de la invención. El método comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva para ARN de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y un vehículo farmacéuticamente aceptable, el ARN de interferencia comprendiendo una región de por lo menos 13 nucleótidos contiguos que tienen por lo menos 90% de complementariedad de secuencia a, o por lo menos 90% de identidad de secuencia con, los 13 penúltimos nucleótidos del extremo 3' de un ARNm que corresponde a cualquiera de SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 14 -SEC ID NO: 58, y SEC ID NO: 155- SEC ID NO: 201. La expresión de ARNm TACE es por lo tanto atenuada. Un método para tratar una condición relacionada con TNFa en un sujeto que necesita del mismo es una modalidad de la invención. El método comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva del ARN de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleotidos y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde el ARN de interferencia comprende una región de por lo menos 13 nucleotidos contiguos que tienen una complementariedad de secuencia de por lo menos 90% para, o una identidad de secuencia de por lo menos 90% con, los 13 penúltimos nucleotidos del extremo 31 de un ARNm que corresponde a cualquiera de SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 14 - SEC ID NO: 58, y SEC ID NO: 155-SEC ID nO: 201. La condición relacionada con TNFa de un sujeto atenuando la expresión de ARNm TACE o ARNm TNFR1 del sujeto comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de ARN de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleotidos y un vehículo farmacéuticamente aceptable y ARN de interferencia comprende una hebra de nucleotidos en un sentido, una hebra de nucleotidos en contra-sentido y una región de complementariedad contigua por lo menos casi perfecta de por lo menos 19 nucleotidos en donde la hebra en contra sentido se hibridiza bajo condiciones fisiológicas a una porción de ARNm que corresponde a SEC ID NO: 297, 333, 334, 335, 434, 470, 493, 547, 570, 573, 618, 649, 689, 755, 842, 844, 846, 860, 878, 894, 900, 909, 910, 913, 942, 970, 984, 1002, 1010, 1053, 1064, 1137, 1162, 1215, 1330, 1334, 1340, 1386, 1393, 1428, 1505, 1508, 1541, 1553, 1557, 1591, 1592, 1593, 1597, 1604, 1605, 1626, 1632, 1658, 1661, 1691, 1794, 1856, 1945, 1946, 1947, 1958, 2022, 2094, 2100, 2121, 2263, 2277, 2347, 2349, 2549, 2578, 2595, 2606, 2608, 2629, 2639, 2764, 2766, 2767, 2769, 3027, 3028, 3261, 3264, 3284, 3313,3317, 3332, ó 3337 o en donde la hebra de contrasentido se hibridiza bajo condiciones fisiológicas a una porción de ARNm que corresponde a SEC ID NO: 2 iniciando en el nucleótido 124, 328, 387, 391, 393, 395, 406, 421, 423, 444, 447, 455, 459, 460, 467, 469, 470, 471, 475, 479, 513, 517, 531, 543, 556, 576, 587, 588, 589, 595, 601, 602, 611, 612, 651, 664, 667, 668, 669, 677, 678, 785, 786, 788, 791, 792, 804, 813, 824, 838, 843, 877, 884, 929, 959, 960, 961, 963, 964, 965, 970, 973, 974, 1000, 1002, 1013, 1026, 1053, 1056, 1057, 1058, 1161, 1315, 1318, 1324, 1357, 1360,1383,1393, 1420, ljas471, 1573, 1671, 2044, 2045, 2046, 2047, 2048, 2089, 2090, 2091, 2092, ó 2098. La expresión de ARNm TACE que corresponde a SEC ID NO: 1 como se citó antes. La expresión de ARNm TNFR1 se atenúa en aquellas modalidades en donde la hebra en contrasentido se hibridiza a una porción de ARNm que corresponde a SEC ID NO: 2 como se citó antes. Un método para tratar una condición relacionada con TNFa en un sujeto que necesita del mismo es una modalidad de la invención, el método que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de ARN de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y un vehículo farmacéuticamente aceptable, el ARN de interferencia comprendiendo una hebra de nucleótido de sentido, una hebra de nucleótido de contrasentido y una región de por lo menos una complementariedad contigua por lo menos casi perfecta de por lo menos 19 nucleótidos; en donde la hebra de contrasentido se hibridiza bajo condiciones fisiológicas a una porción de ARNm que corresponde a SEC ID NO: 1 que comprende nucleótido 297, 333, 334, 335, 434, 470, 493, 547, 570, 573, 618, 649, 689, 755, 842, 844, 846, 860, 878, 894, 900, 909, 910, 913, 942, 970, 984, 1002, 1010, 1053, 1064, 1137, 1162, 1215, 1330, 1334, 1340, 1386, 1393, 1428, 1505, 1508, 1541, 1553, 1557, 1591, 1592, 1593, 1597, 1604, 1605, 1626, 1632, 1658, 1661, 1691, 179- 1856, 1945, 1946, 1947, 1958, 2022, 2094, 2100, 2121, 2263, 2277, 2347, 2349, 2549, 2578, 2595, 2606, 2608, 2629, 2639, 2764, 2766, 2767, 2769, 3027, 3028, 3261, 3264, 3284, 3313, 3317, 3332, ó 3337. La condición relacionada con TNFa se trató por le mismo . ün método para tratar una condición ocular relacionada con TNFa en un sujeto que necesita del mismo es una modalidad de la invención, el método comprendiendo administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de ARN de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, el ARN de interferencia que comprende una hebra de nucleótido en sentido, una hebra de nucleótido en contrasentido y una región de complementariedad contigua por lo menos casi perfecta de por lo menos 19 nucleótidos; en donde la hebra en contra sentido se hibridiza bajo las condiciones fisiológicas a una porción de ARNm que corresponde a SEC ID NO: 2 que comprende nucleótidos 124, 328, 387, 391, 393, 395, 406, 421, 423, 444, 447, 455, 459, 460, 467, 469, 470, 471, 475, 479, 513, 517, 531, 543, 556, 576, 587, 588, 589, 595, 601, 602, 611, 612, 651, 664, 667, 668, 669, 677, 678, 785, 786, 788, 791, 792, 804, 813, 824, 838, 843, 877, 884, 929, 959, 960, 961, 963, 964, 965, 970, 973, 974, 1000, 1002, 1013, 1026, 1053, 1056, 1057, 1058, 1161, 1315, 1318, 1324, 1357, 1360, 1383, 1393, 1420, 1471, 1573, 1671, 2044, 2045, 2046, 2047, 2048, 2089, 2090, 2091, 2092, ó 2098. La condición relacionada con TNFa se trata por el mismo . Un segundo ARN de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos también puede administrarse al sujeto en una modalidad adicional; el segundo ARN de interferencia comprendiendo una hebra de nucleótidos en sentido, una hebra de nucleótidos en contrasentido y una región de complementariedad por lo menos casi perfecta de por lo menos 19 nucleótidos en donde la hebra en contrasentido del segundo ARN de interferencia se hibridiza, bajo condiciones fisiológicas a una porción del ARNm que corresponde a SEC ID NO: 1 que comprende un nucleótido como se citó antes, o en donde la hebra en contrasentido se hibridiza bajo las condiciones fisiológicas a una porción de ARNm que corresponde a SEC ID NO: 2 iniciando en el nucleótido 124, 328, 387, 391, 393, 395, 406, 421, 423, 444, 447, 455, 459, 460, 467, 469, 470, 471, 475, 479, 513, 517, 531, 543, 556, 576, 587, 588, 589, 595, 601, 602, 611, 612, 651, 664, 667, 668, 669, 677, 678, 785, 786, 788, 791, 792, 804, 813, 824, 838, 843, 877, 884, 929, 959, 960, 961, 963, 964, 965, 970, 973, 974, 1000, 1002, 1013, 1026, 1053, 1056, 1057, 1058, 1161, 1315, 1318, 1324, 1357, 1360, 1383, 1393, 1420, 1471, 1573, 1671, 2044, 2045, 2046, 2047, 2048, 2089, 2090, 2091, 2092, ó 2098. Cuando un primer ARN de interferencia se dirige a SEC ID NO: 1, el segundo ARN de interferencia puede dirigirse a SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 2, e inversamente, cuando un primer ARN de interferencia se dirige a SEC ID NO: 2, el segundo ARN de interferencia puede dirigirse a cualquier SEC ID NO: 1, o SEC ID NO: 2. En modalidades adicionales, se pueden administrar un tercero, cuarto o más ARN de interferencia . Una modalidad adicional de la invención es un método para tratar una condición relacionada con TNFa en un sujeto que necesita del mismo, en donde el método comprende administrar al sujeto una composición que comprende una molécula de ARNsi de doble hebra que disminuye la expresión de reguladores de un gen de TACE, en donde cada hebra de la molécula de ARNsi es independientemente de aproximadamente 19 a alrededor de 27 nucleótidos de longitud; y una hebra de la molécula de ARNsi comprende una secuencia de nucleótidos que tiene complementariedad sustancial a un ARNm que corresponde al gen TACE, de manera que la molécula de ARNsi dirige la separación de ARNm via la interferencia de ARN. Una modalidad adicional de la invención es un método para tratar una condición ocular relacionada con TNFa en un sujeto que necesita del mismo, en donde el método comprende administrar al sujeto una composición que comprende una molécula de ARNsi de doble hebra que regula descendentemente la expresión de un gen de TACE via interferencia de ARN, en donde cada hebra de la molécula de ARNsi es independientemente de aproximadamente 19 a alrededor de 27 nucleótidos de longitud; y una hebra de la molécula de ARNsi comprende una secuencia de nucleótidos que tienen complementariedad sustancial a un ARNm que corresponde a un gen TACE, de manera que la molécula de ARNsi dirige la separación de ARNm via la interferencia de ARN. Una modalidad adicional de la invención es un método para tratar una condición ocular relacionada con TNFa en un sujeto que necesita del mismo, en donde el método comprende administrar al sujeto una composición que comprende una molécula de ARNsi de doble hebra que regula descendentemente la expresión de un gen de TNFR1 via interferencia de ARN, en donde cada hebra de la molécula de ARNsi es independientemente de aproximadamente 19 a alrededor de 27 nucleótidos de longitud; y una hebra de la molécula de ARNsi comprende una secuencia de nucleótidos que tiene complementariedad sustancial a un ARNm que corresponde al gen de TNFR1 de manera que la molécula de ARNsi dirige la separación de ARNm via la interferencia de ARN. ün método para atenuar la expresión de ARNm de TACE del sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de un ARN de interferencia de una sola hebra y un vehiculo farmacéuticamente aceptable es una modalidad adicional. El ARN de interferencia de una sola hebra tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y se hibridiza bajo las condiciones fisiológicas a una porción de ARNm que corresponde a SEC ID NO: 1 que comprende el nucleótido 297, 333, 334, 335, 434, 470, 493, 547, 570, 573, 618, 649, 689, 755, 842, 844, 846, 860, 878, 894, 900, 909, 910, 913, 942, 970, 984, 1002, 1010, 1053, 1064, 1137, 1162, 1215, 1330, 1334, 1340, 1386, 1393, 1428, 1505, 1508, 1541, 1553, 1557, 1591, 1592, 1593, 1597, 1604, 1605, 1626, 1632, 1658, 1661, 1691, 1794, 1856, 1945, 1946, 1947, 1958, 2022, 2094, 2100, 2121, 2263, 2277, 2347, 2349, 2549, 2578, 2595, 2606, 2608, 2629, 2639, 2764, 2766, 2767, 2769, 3027, 3028, 3261, 3264, 3284, 3313, 3317, 3332, ó 3337, y el ARN de interferencia tiene una región de por lo menos una complementariedad contigua por lo menos casi perfecta con la porción de ibridización de ARNm que corresponde a SEC ID NO: 1. La expresión de ARNm TACE por lo tanto se atenúa. La invención incluye como una modalidad adicional una composición que comprende un ARN de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos, y que comprende una secuencia de nucleótidos que corresponde a cualquiera de SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 14 - SEC ID NO: 58, y SEC ID NO: 155 - SEC ID NO: 201, o un complemento del mismo; y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La invención incluye como una modalidad adicional una composición que comprende un ARN de interferencia que consiste esencialmente de una secuencia de nucleótidos que corresponde a cualquiera de SEC ID NO: 59 - SEC ID NO: 69, SEC ID NO. 71 - SEC ID NO: 92, y SEC ID NO: 94 - SEC ID NO: 154, o un complemento del mismo; y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La invención incluye como una modalidad adicional una composición que comprende un ARN de interferencia que consiste esencialmente de una secuencia de nucleótidos que corresponde a cualquiera de SEC ID NO: 59 - SEC ID nO: 69, SEC ID NO: 71 - SEC ID NO: 92, y SEC ID NO: 94 - SEC ID NO: 154, o un complemento de los mismos; y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El uso de cualquiera de las modalidades como se describió en la presente en la preparación de un medicamento para atenuar la expresión de ARNm TACE o de ARNm TNFRl como un método para atenuar la actividad de TNFa y tratar así una condición relacionada con TNFa como se exhibió en la presente también es una modalidad de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Con el fin de que la manera en la cual las se obtuvieron ventajas recitadas antes, otras ventajas y objetos de la invención, una descripción más particular de la invención descrita brevemente antes se convertirá por referencia a las modalidades específicas de las mismas, que se ilustraron, en los dibujos anexos. Entendiendo que estos dibujos describe únicamente las modalidades normales de la invención y por lo tanto no se consideren limitantes de su alcance, la invención será descrita con especificidad adicional y detalle a través del uso de los dibujos anexos en los cuales: La Fig. 1 provee una gráfica Western TNFRl de células GTM-3 transfectadas con ARNsi TNFRl #1, #2, #3 y #4 y ARNsi de control libre de RISC, cada 10 nM, 1 mM, y 0.2 mM; un ARNsi de control sin dirigirse al blanco (NTC2) a ????; y un control de solución reguladora (-ARNsi) . Las flechas sindican las posiciones de TNFR1 de 55 kDa y bandas de actina de 42 kDa.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las referencias citas en la presente, al grado que proveen procedimiento ilustrativo u otros detalles suplementarios por los exhibidos en la presente, se incorporan específicamente por referencia. Los expertos en la materia, en vista de la presente descripción, se apreciará que las modificaciones obvias de las modalidades descritas en la presente se pueden hacer sin alejarse del espíritu y alcance de la invención. Todas las modalidades descritas en la presente se pueden hacer y ejecutar sin experimentación indebida en vista de la presente descripción. El alcance completo de la invención se exhibe en la descripción y las modalidades equivalentes de las mismas. La especificación no deberá interpretarse para estrechar indebidamente el alcance completo de proteccin a la cual se dirige la presente invención. Los particulares mostrados en la presente son a manera de ejemplo y para los fines de la discusión ilustrativa de las modalidades preferidas de la presente invención únicamente y están presentes en la causa para proveer lo que se piensa que es la descripción más útil y que se puede entender más fácilmente de los principios y aspectos conceptuales de varias modalidades de la invención. A este respecto, no se hacen intentos para mostrar detalles estructurales de la invención en mayor detalle que es necesario para el entendimiento fundamental de la invención, la descripción tomada con los dibujos y/o ejemplos haciendo evidente para los expertos en la materia cómo las varias formas de la invención se pueden modalizar en la práctica. Las siguientes definiciones y explicaciones se entienden y se pretende que se controle en cualquier construcción futura a menos que se modalice clara e inambiguamente en los siguiente ejemplo o cuando la aplicación del significado forma cualquier construcción sin sentido o esencialmente sin sentido. En los caso en donde la construcción del término podrá volverlo insignificante o esencialmente insignificante, la definición deberá tomarse del Diccionario Webster, 3a. edición. Como se usa en la presente, todos los porcentajes son porcentajes en peso, a menos que se establezca de otra manera . Como se usa en la presente y amenos que se indique de otra manera, los términos "un" y "uno" se entiende que significan "uno", "por lo menos uno" o "uno o más".
El término "ojo seco" también conocidos como conjuntivitis seca o queratoconj untivitis sea, es un trastorno oftalmológico común que implica la ruptura de la película de lágrima pre-ocular, que da como resultado la dshidratación de la superficie externa expuesta del ojo. El término "ojo seco" también conocido como conjuntivitis seca o queratocon untivitis seca, es un trastorno oftalmológico común que implica la ruptura de la película de lágrima pre-ocular, que da como resultado la deshidratación de la superficie externa expuesta del ojo. El término "inflamación ocular", como se usa en la presente, incluye, por ejemplo, iritis, uveitis, epiescleritis, escleritis, queraitis, endoftlamitis, blefaritis, y condiciones inflamatorias iatrogénicas . El término "conjuntivitis alérgica", como se usa en la presente, se refiere a la inflamación de la conjuntiva que es la membrana delicada que delinea los párpados de los ojos y cubre la superficie expuesta de la esclera. El término "conjuntivitis alérgica" incluye, por ejemplo, queratoconjuntivitis atópica, conjuntivitis papilar gigante, conjuntivitis de fiebre de heno, conjuntivitis alérgica aparente, y querato-conj untivitis vernal. El término "dermatitis" como se usa en la presente, se refiere a la inflamación de la piel e incluye, por ejemplo, dermatitis de contacto alérgico, urticarias, dermatitis asteatotica (piel seca en las extremidades inferiores) , dermatitis atópica, dermatitis de contacto incluyendo dermatitis de contacto irritante y dermatitis de contacto inducido por urushiol, eczema, dermatitis gravitacional, dermatitis numular, otitis externa, dermatitis perioral, y dermatitis seborreica. El término "rinitis", como se usa en la presente, se refiere a la inflamación de las membranas mucosas de la nariz e incluye, por ejemplo, rinitis alérgica, rinitis atópica, rinitis irritante, rinitis no alérgica eosinofilica, rinitis medicamentosa, y rinosinusitis neutrofilica . El término "asma", como se usa en la presente, se refiere a la inflamación de los pasajes de aire que dan como resultado el estrechamiento de las vías aéreas que transportan aire de la nariz y boca a los pulmones e incluyen, por ejemplo, asma alérgica, asma atópica, asma mediada por IgE bronquial atópica, asma bronquial, broquolitis, asma efisematosa, asma esencial, asma inducida por el ejercicio, asma extrínseca o causada por los factores ambientales, asma incipiente, asma intrínseca ocasionada por alteraciones patofisiológicas , asma no alérgica, asma no atópica, y síndrome de niño con dificultad para respirar. La frase "una región de por lo menos 13 nucleótidos contiguos que tiene complementariedad de secuencia de por lo menos 90% para, o por lo menos identidad de secuencia del 90% con, los 13 penúltimos nucleotidos del extremo 3' de un ARNm que corresponde a cualquiera de (un identificador de secuencia)" permite una sustitución de nucleotidos. Dos sustituciones de nucleotidos (es decir, 11/13 = 85% de identidad/complementariedad) no se incluye en dicha frase. El término "porcentaje de identidad" describe el porcentaje de nucleotidos contiguos en una primera molécula de ácidos nucleicos que es igual que la que se exhibe de nucleotidos contiguos de la misma longitud en una segunda molécula de ácidos nucleicos. El término "porcentaje de complementariedad" describe los porcentajes de nucleotidos contiguos en una primera molécula de ácidos nucleicos que puede ser un par de base en el sentido de Watson-Crick con un conjunto de nucleotidos contiguos en una segunda molécula de ácidos nucleicos. Como se usa en la presente, el termino "hibridización" significa y se refiere a un proceso en el cual los ácidos nucleicos de una sola hebra con secuencias de base complementarias o casi complementarias para formar complejos unidos por hidrógeno llamadas híbridos. Las reacciones de hibridización son sensibles y selectivas. La especificidad de hibridización in Vitro (es decir, rigor) se controla por las concentraciones de sal o formamida en soluciones de prehibridización e hibridización, por ejemplo, y por la temperatura de hibridización; dichos procedimientos son bien conocidos en la materia. En particular, el rigor se incrementa reduciendo la concentración de sal, incrementando la concentración de formamida, o elevando la temperatura de hibridización . Por ejemplo, las condiciones de alto rigor pueden ocurrir de aproximadamente 50% de formamida de 37 °C a 42 °C. Las condiciones de rigor reducido puede ocurrir de aproximadamente 35% a 25% de formamida de 30 °C a 35°C. Ejemplos de condiciones rigurosas para hibridización se proveen en Sambrook, J. , 1989, Moelcular Cloning: ? Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Ejemplos adicionales de condiciones de hibridización de alto rigor incluyen 400 mM NaCL, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 50 °C o 70 °C durante 12-16 horas seguido por lavado, o hibridización a 70 °C en lxSSC o 50°C en lx""C, 50% formamida seguido por lavado a 70 °C en 0.3xSSC o 50 °C en lxSSC, 50% formamida seguido por lavado a 70 °C en 0.3xSSC, o hibridización a 70 °C en 4xSSC o 50 °C en 4xSSD, 50% formamida seguido por lavado a 67 °C en 1XSSC. La temperatura de hibridización es de aproximadamente 5-10 °C menos de la temperatura de fusión (Tm) del híbrido en donde Tm se determina para híbridos entre 19 a 49 pares de base de longitud usando el siguiente cálculo: Tm °C = 81.5 + 16.6 (log10 [Na+] ) +0.41 (%G+C) - ( 600/N) en donde N es el número de bases en el híbrido, y [Na+] es la concentración de iones sodio en la solución reguladora de hibridización . Las secuencias de ácidos nucleicos citadas en la presente se escriben en una dirección de 5 ' a 31 a menos que se indique de otra manera. El término "ácido nucleico", como se usa en la presente, se refiere a ADN o ARN o una forma modificada de los mismos comprendiendo las bases de purina o pirimidina presentes en ADN (adenina "A", citosina "C", guanina "G", timina "T") o en ARN (adenina "A", citosina "C", guanina "G", uracilo "ü"). El AR de interferencia provisto en la presente puede comprender bases "T", particularmente en extremos 31, aunque las bases "T" no ocurren naturalmente en ARN. El "acido nucleico" incluye los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" y puede referirse a una molécula de una sola hebra o una molécula de doble hebra. Una molécula de doble hebra se forma por el emparejamiento de bases de Watson-Crick entre las bases A y T, bases C y G, y entre las bases A y U. Las hebras de una molécula de doble hebra pueden tener complementariedad parcial, sustancial o completa entre ellas y formarán un híbrido doble, la resistencia de unión de la cual depende de la naturaleza y grado de complementariedad de la secuencia de bases. Una secuencia de ARNm se deduce fácilmente de la secuencia de la secuencia de ADN correspondiente. Por ejemplo, SEC ID NO: 1 provee la secuencia de la hebra en sentido de ADN que corresponde al ARNm para TACE. La secuencia de ARNm es idéntica a la secuencia de la hebra en sentido de ADN con las bases "T" reemplazadas con las bases "ü" . Por lo tanto, la secuencia de ARNm de TACE se conoce de la SEC ID NO: 1 y ARNm de TNFR1 se conoce de la SEC ID NO: 2. La interferencia (ARNi) es un proceso por el cual el ARN de doble hebra (ARNds) se usa para silenciar la expresión de genes. Mientras que no se desea estar unido por una teoría, el ARNi empieza con la separación de ARNds más largo en ARN de interferencia pequeños (ARNsi) por una enzima similar a ARNasalII, de Dicer. Los ARNsi son ARNds que usualmente son de aproximadamente 19 a 28 nucleotidos, o de 20 a 25 nucleotidos, o de 21 a 22 nucleotidos de longitud y con frecuencia contienen terminaciones de 2 nucleotidos colgantes 3', y fosfato 5' e hidroxilo 3' . Una hebra de ARNsi se incorpora en un complejo de ribonucleoproteína conocido como el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) . RISC usa esta hebra de ARNsi para identificar moléculas de ARNm que por lo menos son parcialmente complementarias a la hebra de ARNsi, y luego separa estos ARNm blanco o inhibe su traslación. Por lo tanto, la hebra de ARNsi que se incorpora en RISC se conoce como la hebra de guía o la hebra de contrasentido. La otra hebra de ARNsi, conocida como la hebra pasajera o la hebra en sentido, se elimina del ARNsi y por lo menos es parcialmente homologa al ARNm blanco. Los expertos en la materia reconocerán que, en principio, cualquier hebra de un ARNsi puede incorporarse en RISC y funcionan como la hebra guia. Sin embargo, el diseño de ARNsi (v.gr., estabilidad doble de ARNsi disminuida en el extremo 5 ' de la hebra de guia deseada) puede favorecer la incorporación de la hebra guia deseada en RISC. La separación mediada de RISC de ARNm que tiene una secuencia por lo menos parcialmente complementaria a la hebra de guia conduce a una disminución en el nivel en estado estable del ARNm y de la proteina correspondiente codificada por este ARNm. Alternativamente RISC también puede disminuir la expresión de la proteina correspondiente vía la expresión traslacional sin separación del ARNm blanco. Otras moléculas de ARN y moléculas similares a ARN también pueden interactuar con RISC y expresión de genes silenciadores. Ejemplos de otras moléculas de ARN que pueden interactuar con RISC incluyen ARN de pasadores cortos (ARNsh) , ARNsi de doble hebra, microARN (ARNmi) y duplos de separador-sustrato de 27 mer. El término "ARNsi" como se usa en la presente se refiere a un ARN de interferencia de doble hebra a menos que se observe de otra manera. Ejemplos de las moléculas similares a ARN que pueden interactuar con RISC incluyen moléculas de ARN conteniendo uno o más nucleótidos químicamente modificados, uno o más desoxi-ribunucleótidos y/o una o más ligaduras que no son de fosfodiéster . Para fines de la presente discusión, todas las moléculas de ARN o similares a ARN pueden interactuar con RISC y participar en cambios mediados por RISC en la expresión de genes se denominará como "ARN de interferencia". Los ARNsi, ARNsh, miARN, y duplos de 27 mer de sustrato de Dicer son, por lo tanto, subgrupos de "ARN de interferencia" . Los ARN de interferencia de modalidades de la invención parecen actuar en una forma catalítica para la separación de ARNm blanco, es decir, el ARN de interferencia puede efectuar la inhibición de ARNm blanco en cantidades subestequiométricas . Comparado con las terapias en contrasentido, se requiere significativamente menos ARN de interferencia para dar un efecto terapéutico bajo dichas condiciones de separación. La presente invención se refiere al uso de ARN de interferencia para inhibir la expresión de receptor-1 de TNF (TNFRl) receptor de la superficie celular de TNFa o la enzima de conversión de TNFa (TACE/ADAM17 , designada en la presente "TACE"), inhibición de la cual reduce la actividad de factor de necrosis tumoral a (TNFa) . La unión de TNFa a su receptor de superficie celular, receptor de TNF-1 (TNFRl) , activa una cascada de señalamientos que afecta a una variedad de respuestas celulares incluyendo apoptosis e inflamación. El propio TNFa se expresa inicialmente como un precursor de enlace de membrana, inactivo. La liberación de la forma activa de TNFa de la superficie celular requiere el proceso proteolitico del precursor por la enzima de conversión de TNFa (TACE/ADAM17) , un miembro de la familia de ' Desintegrina A y Metaloproteasa ' (aDAM) . De acuerdo con la presente invención, inhibiendo la expresión de ARNm de TNFRl, ARNm TACE, o ARNm de TNFRl y TACE efectivamente reduce la acción de TNFa. Además, los ARN de interferencia como reexhibe en la presente invención provistos exógenamente o expresados endógenamente son particularmente efectivos para silenciar ARNm de TNFRl o ARNm TACE. Factor de Necrosis Tumoral a que Convierte el ARNm de Enzima (TACE/ADAM17 ) : La base de datos de Banco de Genes provee la secuencia de ADN para TACE como acceso no. NM_003183, provisto en la "lista de Secuencias" como SEC ID ??: 1. SEC ID NO: 1 provee la secuencia de la hebra en sentido de ADN que corresponde a TACE que codifica ARNm (con excepción de las bases "T" para bases "U"). La secuencia de codificación para TACE es de los nucleótidos 184-2658. Equivalentes de la secuencia de ARNm TACE citada antes son formas de división alternativas, formas alélicas, isozimas, o un cognato de las mismas. Un cognato es un factor de necrosis tumoral a que convierte el ARNm de la enzima de otras especies de mamíferos que es homólogo a SEC ID NO: 1 (es decir, un ortólogo) . Receptor de ARNm de Factor de Necrosis Tumoral -1 (TNFR1) : La base de datos del Banco de Genes provee la secuencia de ADN para TNFR1 como acceso no. NM_001065, provisto en la "lista de Secuencias" como SEC ID NO: 2. SEC ID NO: 2 provee la secuencia de hebra en sentido de ADN que corresponde al ARNm que codifica TNFR1 (con excepción de las bases "T" para las bases "ü"). La secuencia de codificación para TNFR1 es de 282 - 1649 nucleótidos. Equivalentes de la secuencia de ARNm de TNFR1 citada antes son formas de división alternativa, formas alélicas, isozimas, o un cognato de las mismas. Un cognato es un ARNm de receptor de factor de necrosis tumoral - 1 de otra especie de mamíferos que es homólogo a SEC ID NO: 2 (es decir, un ortólogo) . Expresión de Atenuación de un ARNm: La frase, "expresión de atenuación de un ARNm", como se usa en la presente, significa administrar o expresar una cantidad de ARN de interferencia (v.gr., un ARNsi) para reducir al traslación del ARNm blanco en proteína, ya sea a través de la separación de ARNm o a través de inhibición directa de traslación. La reducción en la expresión del ARNm blanco o la proteína correspondiente comúnmente se denomina cono "eliminación" y se reporta en relación a los niveles presentes siguiendo la administración o expresión de un ARN de control que no se dirige a un blanco (v.gr., ARNsi de control que no se dirige a un blanco) . La eliminación de la expresión de una cantidad que incluye y que entre el 50% y 100% se contempla por las presentes modalidades. Sin embargo, no es necesario que dichos niveles de eliminación pueden lograrse para fines de la prevete invención. En una modalidad, se administra un solo ARN de interferencia que se dirige a ARNm TACE o ARNm TNFRl . En otras modalidades, se administran dos o más ARN de interferencia que se dirigen a ARNm TACE o a ARNm TNFRl. En otra modalidades, se administran dos o más ARN que se dirigen a ARNm TACE o ARNm TNFRl en combinación con un tiempo de amanera que se obtienen efectos traslapantes . La eliminación se evalúa comúnmente midiendo los niveles de ARNm usando amplificación de reacción de cadena de polimeraza cuantitativa (RCPq) o midiendo los niveles de proteina por el Análisis Western o análisis inmunoabsorbentes ligado a enzima (ELISA) . Analizando el nivel de proteina se provee una evaluación de la separación de ARNm asi como la inhibición de traslación. Las tánicas adicionales para medir la eliminación incluyen hibridización de solución de ARN, protección de nucleasa, hibridización Northern, monitoreo de expresión de genes con una microdisposición, unión de anticuerpos, radioinmunoanálisis y análisis de células activadas por fluorescencia. Inhibición de TACE 0 TNFRl puede determinarse también in vitro evaluando los niveles de ARNm blanco o niveles de proteina blanco en, por ejemplo, las células epiteliales de la cornea humanas después de la transfección de ARN de interferencia de TACE o TNFRl como se describió antes . La inhibición de la actividad de TNFa debido a la inhibición de la expresión de ARNm de TACE o de la expresión de ARNm de TNFRl también se infiere en un ser humano o mamífero observando una mejora en un síntoma de condición relacionada con TNFa tal como la mejora en los síntomas relacionados con el ojo seco, conjuntivitis alérgica, inflamación ocular, dermatitis, rinitis o asma. La mejora en cualquiera de los síntomas de ojo seco, edema, irritación, inflamación o tolerancia a conf ontaciones ambientales, por ejemplo, indican la inhibición de la actividad de TNFa. ARN de interferencia: En una modalidad de la invención, el ARN de interferencia (v.gr., ARNsi) tiene una hebra en sentido y una hebra en contrasentido, y las hebras en sentido y contrasentido comprenden una región de complementariedad contigua por lo menos casi perfecta de por lo menos 19 nucleótidos . En una modalidad adicional de la invención, el ARN de interferencia (v.gr., ARNsi) tiene una hebra en sentido y una hebra en contrasentido y la hebra en contrasentido comprende una región de complementariedad contigua por lo menos casi perfecta de por lo menos 19 nucleótidos a una secuencia blanco de ARNm TACE o ARNm TNFRl, y la hebra en sentido comprende una región de identidad contigua por lo menos casi perfecta de por lo menos 19 nucleótidos con una secuencia blanco de ARNm TACE o ARNm TNFRl, respectivamente. En una modalidad adicional de la invención, el ARN de interferencia comprende una región de por lo menos 13, 14, 15, 16, 17, ó 18 nucleótidos contiguos que tienen porcentajes de complementariedad de secuencia a, o, teniendo porcentajes de identidad de secuencia con, los penúltimos 13, 14, 15, 16, 17, ó 18 nucleótidos, respectivamente, del extremo 3' de la secuencia blanco correspondiente dentro de ARNm. La longitud de cada hebra del ARN de interferencia comprende de 19 a 49 nucleótidos y puede comprender una longitud de 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, o 49 nucleótidos. La hebra en contrasentido de ARNsi es el agente de guia activo de ARNsi en cuanto a que la hebra en contrasentido de incorpora en RISC, permitiendo asi que RISC identifique los ARNm blanco con complementariedad por lo menos parcial a la hebra de ARNsi en contrasentido para la represión de separación o trasnacional . En las modalidades de la presente invención, las secuencias blanco de ARN de interferencia (v.gr., secuencia blanco de ARNsi) dentro de una secuencia de ARNm blanco se seleccionan usando herramientas de diseño disponibles. Los ARN de interferencia correspondiendo a la secuencia blanco TACE o TNFR1 se prueban por transfección de células expresando el ARNm blanco seguido por la evaluación de eliminación como se describió antes. Las técnicas para seleccionar las secuencias blanco para ARNsi se proveen por Tuschl, T. y otros. "The siRNA User Ghide", revisado el 6 de mayo de 2004, disponible en el sitio de red de Rockefeller University; por el Boletín Técnico #506, "siRNA Design Guidelines" , Ambion Inc. En el sitio de la red de Ambion; y por otras herramientas de diseño basadas en la red, en por ejemplo, los sitos de la red de Invitrogen, Dharmacon, Integrated DNA Technologies, Genscript, o Proligo. Los parámetros de búsqueda iniciales pueden incluir contenidos de G/C entre 35% y 55% y longitudes de ARNsi entre 19 y 27 nucleótidos. La secuencia blanco puede localizarse en la región de codificación o en las regiones son trasladadas 5' ó 3' de ARNm.
Una modalidad de una secuencia blanco de ADN de 19 nucleótidos para ARNm TACE está presente en los nucléotidos 297 a 315 de SEC ID NO: 1: 5 ' -GCTCTCAGACTACGATATT-3 ' SEC ID NO: 3 Un ARNsi de la invención para dirigirse a una secuencia de ARNm correspondiente de SEC ID NO: 3 y que tiene 21 hebras de nucleótidos y 2 nucleótidos colgantes 3' es: 5 ' -GCÜCÜCAGACUACGAUAÜUNN-3 ' SEC ID NO: 4 3 ' -NNHCGAGAGUCUGAUGCUAUAA-5 ' SEC ID NO: 5. Cada residuo "N" puede ser cualquier nucleótido (A, C, G, U, T) o nucléotido modificado. El eximo 3' puede tener un número de residuos "N" e incluir entre 1, 2, 3, 4, 5, y 6. Los residuos "N" en cualquier hebra, pueden ser el mismo residuo (v.gr., ÜU, AA, cC, GG, o TT) o pueden ser diferentes (v.gr., AC, AG, Aü, CA, CG, CU, GA, GC, GU, UA, UC o UG) . Los colgantes 3' pueden ser iguales o pueden ser diferentes. En una modalidad, ambas hebras tienen un colgante 3'UU Un ARNsi de la invención para dirigirse a un blanco de una secuencia de ARN correspondiente de SEC ID NO: 3 y que tiene 21 hebras de nucleótidos y un colgante 3' UU en cada hebra es : 5 ' -GCUCUCAGACUACGAUAUUUÜ-3 ' SEC ID NO: 6 3'-UUCGAGAGUCUGAUGCUAUAA-5' SEC ID NO: 7 El ARN de interferencia también puede tener un colgante 5' de nucleótidos o puede tener extremos romos. Un ARNsi de la invención para dirigirse a una secuencia de ARNm correspondiente de SEC ID NO: 3 y que tiene 19 secuencias de nucleótidos y extremos romos es: 5 ' -GCUCUCAGACÜACGAUAUU-3 ' SEC ID NO: 8 3'-CGAGAGUCUGAUGCUAUAA-5' SEC ID NO: 9 Las hebras de un ARN de interferencia de doble hebra (v.gr., un ARNsi) puede conectarse para formar una estructura de pasador o bucle de base (v.gr., un ARNsh) . Un ARNsh de la invención que se dirige a una secuencia de ARNm correspondiente de SEC ID NO: 3 y que tiene una región de base de doble hebra de 19 pb y un colgante 3 ' Uü es: / \ '-GCUCUCAGACUACGAUAUÜ ¦UUCGAGAGÜCUGAUGCÜAUA N es un nucleótido A, T, C, G, U, o una forma modificada conocida por alguien con experiencia en la materia. El número de nucleótidos N en el bucle es un número incluyendo entre 3 a 23, o de 5 a 15, o de 7 a 13, o de 4 a 9, o de 9 a 11, o el número de nucleótidos N es 9. Algunos de los nucleótidos en el bucle puede estar implicado en las interacciones de pares de base con otros nucleótidos en el bucle. Ejemplos de secuencias de oligonucleótidos que se pueden usar para formar el bucle incluyen 5 ' -UUCAAGAGA-3 ' (Brummelkamp, T.R. y o otros (200) Science 296: 500) y 5 ' -UUUGUGUAG-3 ' (Castanotto, D. y otros, (2002) RNA 8:1454). Se reconocerá por los expertos que el oligonucleótido de una sola cadena resultante, forma un bucle de base o estructura de pasador que comprende una región de doble hebra capaz de interactuar con la maquinaria de ARNi . La secuencia blanco de ARNsi identificada antes puede extenderse en el extremo 3' para facilitar el diseño de los duplos de 27 mer del sustrato de Dicer. La extensión de la secuencia blanco de ADN de 19 nucleótidos (SEC ID NO: 3) identificada en la secuencia de ADN TACE (SEC ID NO: 1) por 6 nucleótidos da una secuencia blanco de ADN de 25 nucleótidos presente en los nucleótidos 297 a 321 de SEC ID NO: 1: 5 ' -GCTCTCAGACTACGATATTCTCTCT-3 ' SEC ID NO: 11 Un duplo de sustrato Dicer de 27 mer de la invención para dirigirse a una secuencia de ARNm correspondiente de SEC ID NO: 11 es: 5'-GCUCUCAGACUACGAUAUUCUCUCU-3' SEC ID NO: 12 3 ' -UUCGAGAGUCUGAUGCUAUAAGAGAGA-5 ' SEC ID NO: 13 Los dos nucleótidos en el extremo 3 ' de la hebra en sentido (es decir, los nucleótidos CU de SEC ID NO: 12) pueden ser desoxinucleótidos para proceso mejorado. El diseño de los duplos del sustrato Dicer de 27 met de secuencias blanco de 19-21 nucleótidos, tale como se provee en la presente, además se trata por el sitio de red de Integrated DNA Technologies (IDT) y por Kim, D.H y otros (febrero 2005) Nature Biotechnology 23:2; 222-226. Cuando los ARN de interferencia se producen por síntesis química,, la fosforilación en la posición 5' del nucleótido en el extremo 5' de una o ambas hebras (cuando están presentes) pueden mejorar la eficacia de ARNsi y especificidad del complejo RISC un idoperono se requiere dado que la fosforilación puede ocurrir intracelularmente . La Tabla 1 lista ejemplos de las secuencias blando de ADN TACE de SEC ID NO: 1 de las cuales los ARNsi de al presente invención se diseñan en una forma exhibida antes. TACE codifica la enzima de conversión del factor de necrosis tumoral a., como se observó antes.
Tabla 1. Secuencias Blanco TACE para ARNsi Secuencia Blanco TACE # partida SEC ID NO: De nucleótido con referencia a SEC ID NO: 1 GCTCTCAGACTACGATATT 297 3 CCAGCAGCATTCGGTAAGA 333 14 CAGCAGCATTCGGTAAGAA 334 15 AGCAGCATTCGG AAGAAA 335 16 AGAGATCTACAGACTTCAA 355 17 GAAAGCGAGTACACTGTAA 493 18 CCATGAAGAACACGTGTAA 842 19 GAAGAACACGTGTAAATTA 846 20 ATCATCGCTTCTACAGATA 878 21 AGAGCAATTTAGCTTTGAT 1137 22 GG TTGACGAGCACAAAGA 1330 23 TGATCCGGATGGTCTAGCA 1428 24 GCGATCACGAGAACAATAA 1508 25 GCAGTAAACAATCAATCTA 1541 26 CAATCTATAAGACCATTGA 1553 27 TTTCAAGAACGCAGCAATA 1591 28 TTCAAGAACGCAGCAATAA 1592 29 TCAAGAACGCAGCAATAAA 1593 30 TCATGTATCTGAACAACGA 1661 31 ACAGCGACTGCACGTTGAA 1691 32 GATTAATGCTACTTGCAAA 1794 33 CTGGAGTCCTGTGCATGTA 1945 34 TGGAGTCCTGTGCATGTAA 1946 35 GGAGTCCTGTGCATGTAAT 1947 36 CATGTAATGAAACTGACAA 1958 37 CTATGTCGATGCTGAACAA 2022 38 CAAATGTGAGAAACGAGTA 39 2100 GCATCGGTTCGCATTATCA 2347 40 ATCGGTTCGCATTATCAAA 2349 41 CCAAGTCATTTGAGGATCT 2549 42 CCGGTCACCAGAAGTGAAA 2578 43 AAAGGCTGCCTCCTTTAAA 2595 44 TTTAAACTGCAGCGTCAGA 2608 45 AGATGCTGGTCATGTGTTT 2764 46 ATGCTGGTCATGTGTTTGA 2766 47 TGCTGGTCATGTGTTTGAA 2767 48 CTGGTCATGTGTTTGAACT 2769 49 TGTAATGAACCGCTGAATA 3027 50 GTAATGAACCGCTGAATAT 3028 51 CTAAGACTAATGCTCTCTA 3261 52 AGACTAATGCTCTCTAGAA 3264 53 CCTAACCACCTACCTTACA 3284 54 TACATGGTAGCCAGTTGAA 3313 55 TGGTAGCCAGTTGAATTTA 3317 56 TTTATGGAATCTACCAACT 3332 57 GGAATCTACCAACTGTTTA 3337 58 CATCAAGTACTGAACGTTT 434 155 TCGTGGTGGTGGATGGTAA 470 156 GAAAGCGAGTACACTGTAA 493 157 GAGCCTGACTCTAGGGTTC 547 158 CC CATAAGAGATGATGAT 570 159 CATAAGAGATGATGATGTT 573 160 CGAATATAACATAGAGCCA 618 161 GTT???GATACCAAAGACA 649 162 CTGAAGATATCAAGAATGT 689 163 ATGAAGAGTTGCTCCCAAA 755 164 ATGAAGAACACGTGTAAAT 844 165 AATTATTGGTGGTAGCAGA 860 166 ATCATCGCTTCTACAGATA 878 167 ATACATGGGCAGAGGGGAA 894 168 GGGCAGAGGGGAAGAGAGT 900 169 GGAAGAGAGTACAACTACA 909 170 GAAGAGAGTACAACTACAA 910 171 GAGAGTACAACTACAAATT 913 172 GCTAATTGACAGAGTTGAT 942 173 CGGAACACTTCATGGGATA 970 174 GGATAATGCAGGTTTTAAA 984 175 AGGCTATGGAATACAGATA 1002 176 GAATACAGATAGAGCAGAT 1010 177 GGTAAAACCTGGTGAAAAG 1053 178 GTGAAAAGCACTACAACAT 1064 179 GAGGAAGCATCTAAAGTTT 1162 180 TATGGGAACTCTTGGATTA 1215 181 TGACGAGCACAAAGAATTA 1334 182 GCACAAAGAATTATGGTAA 1340 183 GGTTACAACTCATGAATTG 1386 184 ACTCATGAATTGGGACATA 1393 185 GTGGCGATCACGAGAACAA 1505 186 CTATAAGACCATTGAAAGT 1557 187 GAACGCAGCAATAAAGTTT 1597 188 GCAATAAAGTTTGTGGGAA 1604 189 CAATAAAGTTTGTGGGAAC 1605 190 GAGGGTGGATGAAGGAGAA 1626 191 GGATGAAGGAGAAGAGTGT 1632 192 GCATCATGTATCTGAACAA 1658 193 CAGGAAATGCTGAAGATGA 1856 194 GAATGGCAAATGTGAGAAA 2094 195 GGATGTAATTGAACGATTT 2121 196 GTGGATAAGAAATTGGATA 2263 197 GGATAAACAGTATGAATCT 2277 198 CCTTTAAACTGCAGCGTCA 2606 199 CGTGTTGACAGCAAAGAAA 2629 200 GCAAAGAAACAGAGTGCTA 2639 201 La Tabla 2 lista ejemplos de las secuencias blanco de ADN TNFR1 de SEC ID NO: 2 de la cual ARNsi de la presente invención se diseñan de la manera exhibida antes. TNFR1 codifica el receptor 1 del factor de necrosis tumoral a, como se observó antes. Tabla 2. Secuencias Blanco de TNFRl para ARNsi Secuencia Blanco TACE # partida SEC ID NO: De nucleótido con referencia a SEC ID NO: 2 ACCAGGCCGTGATCTCTAT 124 59 AATTCGATTTGCTGTACCA 444 60 TCGATTTGCTGTACCAAGT 447 61 ACAAAGGAACCTACTTGTA 469 62 GAACCTACTTGTACAATGA 475 63 CTACTTGTACAATGACTGT 479 64 TGTGAGAGCGGCTCCTTCA 531 65 TCAGGTGGAGATCTCTTCT 611 66 CAGGTGGAGATCTCTTCTT 612 67 AGAACCAGTACCGGCATTA 667 68 GAACCAGTACCGGCATTAT 668 69 AACCAGTACCGGCATTATT 669 70 CCGGCATTATTGGAGTGAA 677 71 CGGCATTATTGGAGTGAAA 678 72 AGCCTGGAGTGCACGAAGT 843 73 TTTAATGTATCGCTACCAA 77 CTCCTCTTCATTGGTTTAA 960 74 TTGGTTTAATGTATCGCTA 970 75 GTTTAATGTATCGCTACCA 973 76 TTTAATGTATCGCTACCAA 974 77 AGTCCAAGCTCTACTCCAT 1000 78 GAGCTTGAAGGAACTACTA 1053 79 CTTGAAGGAACTAC ACTA 1056 80 TTGAAGGAACTACTACTAA 1057 81 ACAAGCCACAGAGCCTAGA 1318 82 TGTACGCCGTGGTGGAGAA 1357 83 CCGTTGCGCTGGAAGGAAT 1383 84 TCTAAGGACCGTCCTGCGA 1671 85 CTAATAGAAACTTGGCACT 2044 86 TAATAGAAACTTGGCACTC 2045 87 AATAGAAACTTGGCACTCC 2046 88 ATAGAAACTTGGCACTCCT 2047 89 TAGAAACTTGGCACTCCTG 2048 90 ATAGCAAGCTGAACTGTCC 2089 91 TAGCAAGCTGAACTGTCCT 2090 92 AGCAAGCTGAACTGTCCTA 2091 93 GCAAGCTGAACTGTCCTAA 2092 94 TGAACTGTCCTAAGGCAGG 2098 95 CAAAGGAACCTACTTGTAC 470 96 GAGCTTGAAGGAACTACTA 1053 97 CACAGAGCCTAGACACTGA 1324 98 TCCAAGCTCTACTCCATTG 1002 99 TGGAGCTGTTGGTGGGAAT 328 100 GACAGGGAGAAGAGAGATA 387 101 GGGAGAAGAGAGATAGTGT 391 102 GAGAAGAGAGATAGTGTGT 393 103 GAAGAGAGATAGTGTGTGT 395 104 GTGTGTGTCCCCAAGGAAA 406 105 GAAAATATATCCACCCTCA 421 106 AAATATATCCACCCTCAAA 423 107 CTGTACCAAGTGCCACAAA 455 108 ACCAAGTGCCACAAAGGAA 459 109 CCAAGTGCCACAAAGGAAC 460 110 CCACAAAGGAACCTACTTG 467 111 CAAAGGAACCTACTTGTAC 470 112 AAAGGAACCTACTTGTACA 471 113 GATACGGACTGCAGGGAGT 513 114 CGGACTGCAGGGAGTGTGA 517 115 TCCTTCACCGCTTCAGAAA 543 116 CAGAAAACCACCTC GACA 556 117 TGCCTCAGCTGCTCCAAAT 576 118 CTCCAAATGCCGAAAGGAA 587 119 TCCAAATGCCGAAAGGAAA 588 120 CCAAATGCCGAAAGGAAAT 589 121 GCCGAAAGGAAATGGGTCA 595 122 AGGAAATGGGTCAGGTGGA 601 123 GGAAATGGGTCAGGTGGAG 602 124 GTGTGTGGCTGCAGGAAGA 651 125 GGAAGAACCAGTACCGGCA 664 126 CCATGCAGGTTTCTTTCTA 785 127 CATGCAGGTTTCTTTCTAA 786 128 TGCAGGTTTCTTTCTAAGA 788 129 AGGTTTCTTTCTAAGAGAA 791 130 GGTTTCTTTCTAAGAGAAA 792 131 AGAGAAAACGAGTGTGTCT 804 132 GAGTGTGTCTCCTGTAGTA 813 133 CTGTAGTAACTGTAAGAAA 824 134 AGAAAAGCCTGGAGTGCAC 838 135 TTGAGAATGTTAAGGGCAC 877 136 TGTTAAGGGCACTGAGGAC 884 137 GGTCATTTTCTTTGGTCTT 929 138 CCTCCTCTTCATTGGTTTA 959 139 TCCTCTTCATTGGTTTAAT 961 140 CTCTTCATTGGTTTAATGT 963 141 TCTTCATTGGTTTAATGTA 964 142 CTTCATTGGTTTAATGTAT 965 143 TCCAAGCTCTACTCCATTG 1002 144 CTCCATTGTTTGTGGGAAA 1013 145 GGGAAATCGACACCTGAAA 1026 146 TGAAGGAACTACTACTAAG 1058 147 ACCTCCAGCTCCACCTATA 1161 148 CCCACAAGCCACAGAGCCT 1315 149 ACGCCGTGGTGGAGAACGT 1360 150 GGAAGGAATTCGTGCGGCG 1393 151 TGAGCGACCACGAGATCGA 1420 152 GCGAGGCGCAATACAGCAT 1471 153 TGGGCTGCCTGGAGGACAT 1573 154 Como se citó en los ejemplos anteriores, alguien con experiencia en la materia pueden usar la información de secuencia blanco provista en las Tablas 1 ó 2 para diseñar ARN de interferencia que tienen una longitud más corta o más larga que las secuencias provistas en las tales y por referencia a la posición de secuencias en SEC ID NO: l o SEC ID NO: 2 y agregando o suprimiendo nucleótidos complementarios o casi complementarios a SEC ID NO: l o SEC ID nO: 2, respectivamente. La reacción de separación de ARN blanco guiada por ARNsi y otras formas de ARN de interferencia es altamente especifica para la secuencia. En general, los ARNsi que contienen una hebra de nucleótidos en sentido idénticos en secuencia a una porción del ARNm. blanco y una hebra de nucleótidos en contrasentido exactamente complementaria a una porción del ARNm blanco son modalidades de ANSI para la inhibición de los ARNm citados en la presente. Sin embargo, la complementar!edad de secuencia al 100% entre la hebra de ARNsi de contrasentido y el ARNm blanco, o entre la hebra de ARNsi en contrasentido y la hebra de ARNsi en sentido, no se requiere en la práctica de la presente invención. Por lo tanto, por ejemplo, la invención permite las variaciones de secuencia que pueden esperarse debido a la mutación genética, polimorfismo de cepa o divergencia evolutiva. En una modalidad de la invención, la hebra en contrasentido de ARNsi tiene una complementariedad contigua casi por lo menos perfecta de por lo menos 19 nucleótidos con ARNm blanco. "Csi perfecto", como se usa en la presente, significa que la hebra en contrasentido de ARNsi es "sustancialmente complementaria para" y la hebra en sentido de ARNsi es "sustancialmente idéntica" a por lo menos una porción del ARNm blanco. "Identidad", como se sabe por alguien con experiencia en la materia, es el grado de secuencia relacionada entre las secuencias de nucleótidos como se determina igualando el orden e identidad de nucleótidos entre las secuencias. En una modalidad, la hebra en contrasentido de un ARNsi que tiene 80% y entre 80% hasta 100% de complementariedad, por ejemplo, 85%, 90%, o 95% de complementariedad, a la secuencia de ARNm blanco se considera complementariedad casi perfecta y puede usarse en la presente invención. Complementariedad contigua "Perfecta" es base estándar de Watson-Crick que se iguala a los pares de base adyacentes. La complementariedad contigua "por o menos casi perfecta" incluye complementariedad "perfecta" como se usa en la presente, los métodos de computadora para determinar la identidad de complementariedad se designan para identificar el mayor grado de igualación de secuencias de nucelótidos, por ejemplo, BLASÓN (Altschul, S.F., y otros (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410) . La relación entre un ARNm blanco (hebra en sentido) y una hebra de un ARNsi (hebra en sentido) es el de identidad. La hebra en sentido de un ARNsi también se llama una hebra pasajera, si está presente, la relación entre un ARNm blanco (hebra en sentido) y la otra hebra de ARNsi (la hebra en contrasentido) es la de complementariedad. La hebra en contrasentido de un ARNsi también se llama una hebra de guia . La penúltima base en una secuencia de ácido nucleico que se escribe en una dirección 5 ' a 3 ' es la siguiente a la última base, es decir, la siguiente base a la base 3'. Las 13 penúltimas bases de una secuencia de ácidos nucleicos escrita en una dirección 5' a 3' sonoro lo menos 13 bases de una secuencia después de la base 3' y no incluyendo la base 3'. Similarmente, las penúltimas 14, 15, 16, 17 ó 18 bases de una secuencia, respectivamente, después de la base 3 ' y no incluyendo la base 3'. En una modalidad de la invención, la región de los nucleotidos contiguos es una región de por lo menos 13 nucleotidos contiguos que tienen por lo menos 90% de complementariedad de secuencia a, o por lo menos una identidad de secuencia del 90% con, los 13 penúltimos nucléotidos del extremo 3 ' de un ARNm que corresponde a la secuencia identificada por cada identificador de secuencia. En una modalidad de la invención, la región de nucleotidos contiguos es una región de por lo menos 14 nucleotidos contiguos que tienen complementariedad de secuencia de por lo menos 85% para, o identidad de secuencia de por lo menos 85% con, los penúltimos 14 nucleotidos del extremo 3 ' de un ARNm que corresponde a la secuencia identificada por cada identificador de secuencia. Sus sustituciones de nucleotidos (es decir, 12/14 = 86% identidad/complementariedad) se incluyen en dicha frase. En una modalidad adicional de la invención, la región de nucleotidos contiguos es una región de por lo menos 15, 16, 17, ó 18 nucleotidos contiguos que tienen complementariedad de secuencia de por lo menos 80% para, o identidad de secuencia de por lo menos 80% con, los penúltimos 14 nucleótidos del extremo 3' de un ARNm que corresponde a la secuencia del identificador de secuencias. Tres sustituciones de nucleótidos se incluyen di dicha frase. La secuencia blanco en los ARNm que corresponden a SEC ID NO: l o SEC ID nO: 2 puede estar en las regiones 5' ó 3' del ARNm asi como en la región de codificación del ARNm. Una o ambas hebras de ARN de interferencia de doble hebra pueden tener un colgante 3 ' de 1 a 6 nucleótidos que pueden ser ribonucleótidos o desoxiribonucleótidos o una mezcla de los mismos. Los nucleótidos del colgante no son pare de bases. En una modalidad de la invención, el ARN de interferencia comprende un colgante 3' de TT o UU. En otra modalidad de la invención, el ARN de interferencia comprende por lo menos un extremo romo. La terminación usualmente tiene un grupo fosgeno 5' o un grupo hidroxilo 3'. En otras modalidades, la hebra en contrasentido tiene un grupo fosfato 5' o un grupo hidroxilo 3'. En otras modalidades, la hebra en contrasentido tiene un grupo fosfato 5', y la hebra en sentido tiene un grupo hidroxilo 5'. En aún otras modalidades, las terminaciones se modifican además por la adición covalente de otras moléculas o grupos funcionales. Las hebras en sentido y contrasentido del ARNsi de doble hebra pueden tener una formación doble de dos hebras sencillas como se describió antes o pude ser una sola molécula en donde las regiones de complementariedad son pares de base y se enlazan covalentemente por un ciclo de pasador de manera que forma una sola hebra. Se piensa que el pasador se separa intracelularmente por una proteina llamada Dicer para formar un ARN de interferencia de dos moléculas de ARN de pares de base. Los ARN de interferencia pueden diferir de ARN presentes en la naturaleza por la adición, supresión, substitución o modificación de uno o más nucleótidos. El material que no es nucleótido puede unirse al ARN de interferencia, ya sea en el extremo 5', el extremo 3', o internamente. Dichas modificaciones se designan comúnmente para incrementar la resistencia de nucleasa de los ARN de interferencia, para mejorar la absorción celular, para aumentar el blanco celular, para ayudar a rastrear el ARN de interferencia, para mejorar además la estabilidad o reducir el potencial para la activación de la ruta de interferon. Por ejemplo, los ARN de interferencia pueden comprender un nucleótido de purina en los extremos de colgantes. La conjugación de colesterol al extremo 3' de la hebra en sentido de una molécula de ARNsi por medio de un entrelazador de pirrolidina, por ejemplo, también provee estabilidad a un ARNsi. Las modificaciones adicionales incluyen una molécula de botina terminal 3', un péptido conocido tiene propiedades penetrantes de células, una nanoparticula, un colorante peptidomimetico, fluorescente, o por ejemplo, un dendrimero . Los nucleótidos pueden modificarse en su porción de base, en su porción de azúcar o la porción de fosfato de la molécula y la función en las modalidades de la presente invención. Las modificaciones incluyen sustituciones con alquilo, alcoxi, amino, de aza, halo, hidroxilo, grupos tiol, o por ejemplo una combinación de los mismos. Los nucleótidos pueden ser sustituidos con análogos con mayor estabilidad tal como el reemplazo de un ribonucleótido con un desoxiribonucleótido, , o que tienen modificaciones de azúcar tal como grupos OH 2' reemplazado por grupos amino 2', grupos etilo 2', grupos metoxietilo 2', o un puente de metileno 2'-O, 4'-C, por ejemplo. Ejemplos de una purina o análogo de pirimidina de nucleótidos incluyen una xantina, una hipoxantina, una azapurina, una metiltioadenina, 7-desaza-adenosina y nucleótidos 0- y N-modificados . El grupo fosfato del nucleótido puede ser modificado sustituyendo uno o más oxígenos del grupo fosfato con nitrógeno o con azufre (fosforotioatos ) . Las modificaciones son útiles, por ejemplo, para aumentar la función, para mejorar la estabilidad o permeabilidad o dirigir la localización o dirección al blanco .
Puede haber una región o regiones de la hebra de ARN de interferencia en contrasentido que no son complementarios a una porción de SEC ID NO: l o SEC ID NO: 2. Las regiones no complementarias puede estar en los extremos 3 ' , 5 ' o ambos de una región complementaria o entre dos regiones complementarias. Los ARN de interferencia pueden generarse exógenamente por síntesis química, por la transcripción in vitro, o por separación de ARN de doble hebra más largo con Dicer o otra nucleasa apropiada con actividad similares. Los ARN de interferencia químicamente sintetizados, producidos de fosforamiditas de ribonucelósido protegido usando un sintetizador de ADN/ARN convencional, pueden obtenerse de proveedores comerciales tales como Ambion Inc. Austin, TX) , Invitrogen (Carlsbad, CA) , o Dharmacon (Lafayette, CO) . Los ARN de interferencia se purifican por la extracción con un solvente o resina, precipitación, electroforesis, cromatografía o combinación de los mismos, por ejemplo, Alternativamente, el ARN de interferencia puede usarse con poca si no es que ninguna purificación para evitar las pérdidas debido al proceso de muestras. Los ARN de interferencia también se pueden expresar endógenamente de plásmido o vectores de expresión viral o de casetes de expresión mínima, por ejemplo, los fragmentos generados por RCP comprendiendo uno o mas promotores y un patrón apropiado o patrones para el ARN de interferencia. Ejemplos de vectores de expresión basados en plásmidos comercialmente disponibles para ARNsh incluyen miembros de la serie pSilencer (Ambion, Austin, TX) y pCpG-ARNsi (InvivoGen, San Diego, CA) . Los vectores virales para la expresión de ARN de interferencia pueden derivarse de una variedad de virus incluyendo adenovirus, virus adeno-asociado, lentivirus (v.gr., VIH, VFI y VEIA), y virus de herpes. Ejemplos de vectores virales comercialmente disponibles para la expresión de ARNsh incluyen adeno pSilencer (Ambion, Austin, TX) y pLenti6/BL0CK-IT™-DEST (invitrogen, Carlsad, CA) . La selección de vectores virales, los métodos para expresar el ARN de interferencia del vector y métodos para suministrar el vector viral están dentro del experto en la materia. Ejemplos de los equipos para la producción de los casetes de expresión de ARNsh generados por RCP incluyen Silencer Express (Amion, Austin, TX) y Sixpress (Mirus, Madison, WI) . Un primer ARN de interferencia pueden administrarse via la expresión in vivo de un primer vector de expresión capaz de expresar el primer ARN de interferencia y un segundo ARN de interferencia pueden administrarse via la expresión in vivo de un segundo vector de expresión capaz de expresar el segundo ARN de interferencia o ambos ARN de interferencia pueden administrarse via la expresión in vivo de un solo vector de expresión capaz de expresar ambos ARN de interferencia.
Los ARN de interferencia pueden expresarse de una variedad de promotores eucarióticos conocidos por los expertos en la materia, incluyendo promotores pol III tal como promotores 06 o Hl, o promotores pol II, tal como el promotor citomegalovirus . Los expertos en la materia reconocerán que estos promotores pueden adaptarse para permitir la expresión inducible del ARN de interferencia. Hibridización bajo Condiciones Fisiológicas: En ciertas modalidades de la presente invención, una hebra en contrasentido de un ARN de interferencia se hibridiza con un ARNm in vivo como parte del complejo RISC. Por ejemplo, las condiciones de alto rigor pueden ocurrir en aproximadamente 50% formamida de 37 °C a 42 °C. Las condiciones de rigor reducidas pueden ocurrir en aproximadamente 35% a 25% de formamida de 30 °C a 35 °C. Ejemplos de condiciones de rigor para la hibridización se proveen en Sambrook J., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Ejemplos adicionales de condiciones de hibridización de rigor incluyen 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, ImM EDTA, 50 °C o 70 °C durante 12-16 horas seguido por lavado, o hibridización a 70°C en 1XSSC o 50°C en lXSSc, 50% formamida después del lavado a 70 °C en 0.3xSSC, o hibridización a 70 |C en 4xSSC o 50 °C en 4XSSC, 50% formamida seguido por lavado a 67 °C en 1XSSC. La temperatura para hibridización es de aproximadamente 5-10 °C menos que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido en donde Tm se determina para híbridos ente 19 y 49 pares de base en la longitud usando el siguiente cálculo: Tm °C = 81.5 + 16.6 (logio [Na+] ) + 0.41 (% G+C)-(600/N) en donde N es el número de bases en el híbrido, y [Na+] es la concentración de iones sodio en la solución reguladora de hibridización. El análisis de hibridización in Vitro descrito antes provee un método para predecir si la unión entre ARNsi candidato y un blanco tendrán especificidad. Sin embargo, en el contexto del complejo de RISC, la separación especificada de un blanco también puede ocurrir con una hebra en contrasentido que no demuestra alto rigor para hibridización in Vitro. ARN de interferencia de doble hebra: Como se citó antes, los ARN de interferencia funcional finalmente como hebras solas. Se han encontrado que los ARN de interferencia de doble hebra (ss) efectúan el silenciamiento de ARNm, menos eficientemente que el ARN de doble hebra. Por lo tanto, las modalidades de la presente invención también proveen administración de un ARN de interferencia ss que se hibridiza bajo condiciones fisiológicas a una porción de SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 2 y tiene una región de complementariedad por lo menos casi perfecta contigua de por lo menos 19 nucleótidos como la porción de hibridización de SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 2, respectivamente. El ARN de interferencia ss de la Tabla 1 o Tabla 2 tiene la longitud de 19 a 49 nucleótidos como para el ARN de interferencia citado antes. El ARN de interferencia ss tiene un fosfato 5' o se fosforila in situ o in vivo en la posición 5'. El término "5' fosforilado" se usa para describir, por ejemplo, polinucleótidos u oligonucleótidos que tiene un grupo fosfato unido via ligadura de éster al hidroxilo C5 del azúcar (v.gr., ribosa, desoxirribosa, o un análogo del mismo) en el extremo 5' del polinucleótido u oligonucleótido . Los ARN de interferencia ss se sintetizaron químicamente o por transcripción in Vitro o se expresaron endógenamente de vectores o casetes de expresión como para los ARN de interferencia ds . Los grupos fosfato 5' pueden agregarse vía una cinasa, o un fosfato 5' pueden ser el resultado de separación de nucleasa de un ARN. El suministro es para ARN de interferencia ds . En una modalidad, los ARN de interferencia ss que tiene extremos protegidos y modificaciones resientes a nucleasa se administran para silenciamiento . Los ARN de interferencia ss pueden secarse para su almacenamiento o disolverse en una solución acuosa. La solución puede contener soluciones reguladoras o sales para inhibir el recocido o para estabilización. El ARN de interferencia de pasador. Un ARN de interferencia de paso dos es una sola molécula (v.gr., una sola cadena de oligonucleótido) que comprende las hebras en sentido y contrasentido de un ARN de interferencia en una estructura de ciclo de base o pasador (v.gr., un ARNsh) . Por ejemplo, los ARNsh pueden expresarse de los vectores de ADN en los cuales los oligonucleótidos de ADN que codifican una hebra de ARN de interferencia en sentido y se ligan a los oligonucleótidos de ADN que codifican la hebra de ARN de interferencia en contrasentido complementario inverso por un separador corto. Si se requiere que el vector de expresión elegido, la t 1 de terminal 3' y se pueden agregarlos nucleótidos que forman los sitios de restricción. La transcripción de ARN resultante se doble de nuevo para formar una estructura de ciclo de base. Modo de administraron: El ARN de interferencia puede suministrarse via administración via un aerosol, o ruta bucal, dérmica, intradérmica, por inhalación, intramuscular, intranasal, intraocular, intrapulmonar, intravenosa, intraperitoneal, nasal, ocular, oral, ótica, parenteral, de parche, subcutánea, sublingual, tópica, o transdérmica, por ejemplo. La administración puede ser directamente al ojo por la administración de tejido ocular tal como administrador periocular, conjuntival, subtendonial , intracameral, intravitrea, intraocular, subretinal, subconjuntival, retrobulbar, intracanalicular, o supracoroidal; por inyección, por aplicación directa al ojo usando un catéter u otro dispositivo de colocación tal como una pella retinal, inserto intraocular, supositorio o un implante comprendiendo un material poroso, no poroso, o gelatinoso; por gotas oculares tópicas o ungüentos; o por un dispositivo de liberación lenta en cul-de-sac o implementado adyacente a la esclera (transescleral ) o dentro del ojo. Inyección intracameral puede ser a través de la córnea en la cámara anterior para permitir que el agente alcance la malla trabecular. La inyección intracanalicular puede ser en los canales colectores venosos que drenan el canal Schlemm o en el canal Schlemm. La administración puede ser directamente al oído vía, por ejemplo, gotas o ungüentos óticos tópicos, dispositivos de liberación lenta en el oído o implantados adyacentes al oído. La administración local incluye la cavidad intramuscular ótica, intratimpánica y rutas de administración de inyección intracoclear . Además, se pueden administrar agentes al oído interno por la colocación de una espuma de gel o absorbente similar y producto adherente, remojado con el ARN de interferencia contra la membrana de ventana del oído medio/interno o estructura adyacente. La administración puede ser directamente a los pulmones, vía, por ejemplo, una p reparación de aerosol, y por inhalación via un inhalador o un nebulizador, por ej emplo . Los modos adicionales de administración incluyen tabletas, pildoras y cápsulas, todos los cuales pueden formularse por alguien con experiencia en la materia. Sujeto: un sujeto que necesita del tratamiento para una condición relacionada con TNFa incluye, por ejemplo, conjuntivitis alérgica, inflamación ocular, dermatitis, rinitis, o asma asociada con actividad indeseada o inapropiada de TNFa como se citó en la presente. Las estructuras oculares asociadas con al condición relacionada con tifa pueden incluir el ojo, retina, coroide, lente, córnea, malla trabecular, iris, nervio óptico, cabeza del nervio óptico, esclera, cámara acuosa, cámara vitrea, cuerpo ciliar, o segmento posterior, por ejemplo. Las estructuras óticas asociadas con dichos trastornos pueden incluir el oido interno, oído medio, oído externo, cavidad o membrana timpánica coclear, o tubo de Eustaquio, por ejemplo. Las estructuras pulmonares asociadas con dichos trastornos pueden incluir la nariz, boca, faringe, laringe, tubos bronquiales, traquea, carina (el puente que separa la apertura de bronquio principal derecho e izquierdo) , y pulmones, particularmente los pulmones inferiores, tales como bronquiolos y alvéolos.
Un sujeto también puede ser una celda ótica, una Elda de pulmón, una celda ocular, cultivo celular, órgano o un órgano ex vivo o tejido. Formulaciones y Dosis: las formulaciones farmacéuticas comprenden ARN de interferencia o sales de los mismos, de la invención hasta 99% en peso mezclados con un medio portador fisiológicamente aceptable tal como agua, solución reguladora, solución salina, glicina, ácido hialurónico, manitol y similares. Los ARN de interferencia de la presente invención se administran como soluciones, suspensiones o emulsiones. Los siguientes son ejemplos de formulaciones posibles moralizadas por esta invención.
ARN de Interferencia Cantidad en peso % hasta 99; 0.1-99; 0.1 - 50; 0.5-10.0 Hidroxipropilmetilcelulosa 0.5 Cloruro de sodio 0.8 Cloruro de Benzalconio 0.01 EDTA 0.01 NaOH/HCl Cs. pH 7.4 Agua purificada a (libre de Cs. 100 MI RNasa ARN de Interferencia Cantidad en peso % hasta 99; 0.1-99; 0.1 - 50; 0.5 -10.0 Sol. Salina regulada con 1.0 fosfato Cloruro de Benzalconio 0.01 Polisorbato 80 0.5 Agua purificada a (libre de Cs. 100 % RNasa) ARN de Interferencia Cantidad en peso % hasta 99; 0.1-99; 0.1 - 50; 0.5-10.0 Fosfato de sodio monobásico 0.05 Fosfato de sodio dibásico 0.15 (anhídrido) Cloruro de Sodio 0.75 EDTA de disodio 0.05 Cremophor EL 0.1 Cloruro de Benzalconio 0.01 HC1 y/o NaOH Cs. pH 7.3-7.4 Agua purificada a (libre de Cs. 100 % RNasa) ARN de Interferencia Cantidad en peso % hasta 99; 0.1-99; 0.1 - 50; 0.5 -10.0 Sol. Salina reguladad con 1.0 fosfato Hidroxipropil-p-ciclodextrina 4.0 Agua purificada (libre de Cs. 100 % RNasa) Generalmente, una cantidad efectiva de los ARN de interferencia de las modalidades de la invención da como resultado una concentración extracelular en la superficie de la célula blanco de 100 pM a 1000 nM, o de 1 mM a 400 mM o de 5 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 10 M. La dosis requerida para lograr esta concentración local variará dependiendo de cierto número de factores incluyendo el método de suministro, el sitio de suministro, el número de capas celulares ente el sitio de suministro y la célula o tejido blanco, ya sea que el suministro sea local o sistémico, etc. La concentración en el sitio de suministro puede ser considerablemente superior que en la superficie de la célula o tejido blanco. Las composiciones tópicas se suministran a la superficie del órgano blanco de una a cuatro veces por dia, o en un programa de suministro extendido tal como diariamente, semanalmente, de dos semanas, mensualmente o mayor, de acuerdo con la discreción de rutina de un clínico experto. El pH de la formulación es de aproximadamente pH 4-9, o pH 4.5 a pH 7.4. El tratamiento terapéutico de pacientes con ARNsi dirigido contra ARNm TACE o ARNm TNFR1 se espera que sea benéfico en tratamientos de moléculas pequeñas por el incremento de la duración de acción, permitiendo así la dosificación menos frecuente y cumplimiento mayor del paciente. Una cantidad efectiva de una formulación puede depender de los factores tales como la edad, raza, y sexo del sujeto, la severidad de la condición relacionada con TNF , el régimen del cambio de trascripción/proteína del gen blanco, la potencia de ARN de interferencia, y la estabilidad de ARN de interferencia, por e emplo. En una modalidad, el ARN de interferencia se suministra tópicamente a un órgano blanco y alcanaza tejido que contiene ARNm TACE o ARNm TNFR1 a una dosis terapéutica disminuyendo así un proceso relacionado con TNFa. Vehículos aceptables: Un vehículo aceptable se refiere a los vehículos que ocasionan cuando mucho, poca a ninguna irradiación ocular, proveen conservación adecuada si es necesaria y suministran uno o más ARN de interferencia de la presente invención en una dosis homogénea. Un vehículo aceptable para la administración de ARN de interferencia de las modalidades de la presente invención incluyen los reactivos de transfección basados en lipidos catiónicos TransIT®-TKO (Mirus Corporation, Madison, WI) , LIPOFECTIN®, Lipofetamina, OLIGOFECTAMINE™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) , o DHARMAFECT™ (Dharmacon, Lafayette, CO) ; los policationes tales como polietilenimina; péptidos catiónicos tales como Tat, poliargnina, o Penetratina (pe'ptido AnTP) ; o liposomas. Los liposomas se forman de lipidos de formación de vesículas normales y un esterol, tal como colesterol, y pueden incluir una molécula de dirección al blanco tal como un anticuerpo monoclonal que tiene afinidad de unión para antígenos de superficie celular endotelial, por ejemplo. Además, los liposomas pueden ser liposomas Pegilados . Los ARN de indeferencia pueden suministrarse en solución, en suspensión, o dispositivos de suministro biocomestible o no biocomestible . Los ARN de interferencia pueden suministrarse solos o como componentes de los conjugados covalentes definido, los ARN de interferencia también pueden formar complejos con lipidos catiónicos, péptidos catiónicos, o polímeros catiónicos; formar complejos con proteínas, proteínas de fusión, o dominios de proteínas con propiedades de unión de ácidos nucleicos (v.gr. , protamina) ; o encapsularse en nanopartículas . El suministro específico para tejidos o células puede lograrse por la inclusión de una porción dirigida la blanco apropiada tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Para suministro oftálmico, ótico, o pulmonar, se puede combinar un ARN de interferencia con conservadores, cosolventes, agentes tensioactivos , incrementadores de viscosidad, incrementadotes de penetración, reguladores, oftalmológicamente, ópticamente o pulmonarmente aceptables, cloruro de sodio o agua, para formar una suspensión o solución acuosa, estéril. Las formulaciones de solución se pueden preparar disolviendo el ARN de interferencia en una solución acuosa isotónica fisiológicamente aceptable. Además, las soluciones pueden incluir un agente tensioactivo aceptable para ayudar a disolver el inhibidor. Los agentes de formación de viscosidad, tales como hidroxi metil celulosa, hidroxietil celulosa, metilcelulosa, polivinilpirrolidona, o similares, pueden agregare a las composiciones de la presente invención para mejorar la retención del compuesto. Con el fin de preparar una formulación de ungüento estéril, el ARN de interferencia se combina con un conservador en un vehículo apropiado, tal como aceite mineral, lanolina liquida, o petrolato blanco. Las formulaciones de gel estériles pueden prepararse suspendiendo el ARN de interferencia en una base hidrofilica preparada de la combinación de, por ejemplo, CARBOPOL®-940 (BF Goodrich, Chalotte, NC) , o similares, de acuerdo con los métodos conocidos en la materia. VISCOAT® (Alcon Laboratorios, Incl, Fort Worth, TX) se pueden usar para la inyección intraocular, por ejemplo. Otras composiciones de la presente invención pueden contener agentes que mejoran la penetración tal como cremefor y T EEN® 80 (monolaurato sorbitan de polioxietileno, Sigma Aldrich, St . Louis, MO) , en el caso que el ARN de interferencia sea menos penetrante en el órgano o tejido de interés . Equipos: las modalidades de la presente invención provee un equipo que incluye reactivos para atenuar la expresión de un ARNm como se cita en la presente en una célula. El equipo contiene un un vector de expresión de ARNsi o ARNsh. Para los vectores de expresión de ARNsi y ARNsh no virales, el equipo también puede contener un reactivo de transfección u otro vehículo de suministro adecuado. Para los vectores de expresión de ARNsh virales, el quipo puede contener el vector viral y/o los componentes necesarios para la producción de vector viral (v.gr., una línea celular de empaque así como un vector que comprende el patrón de vector viral y vectores auxiliares adicionales para el empaque) . El quipo también puede contener vectores de ARNsi o ARNsh de control positivo y negativo (v.gr., un ARNsi de control no dirigido al blanco o un ARNsi que se dirige a un ARNm no relacionado) . El equipo también puede contener reactivos para evaluar la eliminación del gen blanco pretendido (v.gr., indicadores y sondas para RCP cuantitativo para detectar el ARNm y/o anticuerpos contra la proteina correspondiente para análisis Western) . Alternativamente, el equipo puede comprender una secuencia de ARNsi o una secuencia de ARNsh y las instrucciones y materiales necesarios para penetrar los ARNsi por la transcripción in Vitro o para construir un vector de expresión de ARNsh. üna combinación farmacéutica en forma de equipo además se provee el que incluye, en combinación empaquetada, un medio de vehículo adaptado para recibir un medio de contenedor en confinamiento estrecha con el mismo y un primer medio de contenedor incluyendo una composición de ARN de interferencia y un' vehículo aceptable. Dichos equipos pueden incluir además, si se desea, uno o más componentes de equipo farmacéutico convencional, tal como, por ejemplo, contenedores con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables contendores adicionales, etc., como será fácilmente evidente por los expertos. Las instrucciones impresas, ya sea como insertos o etiquetas, que indican cantidades de los componentes que serán administrados, los lineamientos de administración y/o lineamientos para mezclar los componentes, también pueden incluirse en el equipo. La capacidad de ARN de interferencia de TACE 0 TNFR1 para eliminar los niveles de expresión de TACE o TNFR1 endógeno, por ejemplo, en células epiteliales de la córnea humanas se evalúa in Vitro como sigue. Las células epiteliales de la córnea humanas transformadas, por ejemplo, la linea celular CEPI-17 (Oxford y otros, (1999) Invest Ophthalmol Vis Sci. 40:1091-1101), se siembran en placas 24 h antes de la transfección en medio de queratinocitos de KGM (Cambrex, East Rutherford, NJ) . La transfección se lleva a cabo usando DharmaFECT™ 1 (Dharmacon, Lafayette, CO) de acuerdo con las instrucciones del fabricante en concentraciones de ARN de interferencia de TACE o TNFR1 que varian de 0.1 nM - 100 nM. El ARN de interferencia de control no dirigido al blanco y ARNN de interferencia de laminita A/C (Dharmacon) se usan como controles. Los niveles de ARNm blanco se evalúan por RCPq 24 h de post-transfección usando, por ejemplo, iniciadores hacia delante e inversos TAQMAN® y una sonda ajustada que abarca el sitio blanco (Applied Biosystems, Foste City, CA) . Los niveles de proteina blanco pueden evaluarse aproximadamente 72 h después de la transfección (tiempo al que depende del régimen de cambio de proteina) por Análisis Western, por ejemplo. Las técnicas normales de ARN y/ aislamiento de proteínas de las células cultivadas son bien conocidos para los expertos. Para reducir la oportunidad de efectos no específicos, fuera de blanco, se usa la concentración posible más inferior de ARN de interferencia TACE o TNFRl lo cual produce el nivel deseado de eliminación en una expresión de genes blanco.
Los expertos en la materia, en vista de la presente descripción, apreciarán que se pueden hacer modificaciones obvias de las modalidades descritas en la presente que se pueden hacer sin alejarse del espíritu y alcance de la invención. Todas las modalidades descritas en la presente pueden hacer y ejecutar sin experimentación indebida en vista de la presente descripción. El alcance completo de la invención se exhibe en la descripción y modalidades equivalentes de la misma. La especificación no se deberá interpretar como indebidamente estrecha del alcance completo de protección a la cual se dirige la presente invención. Mientras que una modalidad particular de la invención se ha mostrado y descrito numerosas variaciones y modalidades alternas ocurrirán para los expertos en la materia. Consecuentemente, se pretende que la invención se limita solo en términos de las reivindicaciones anexas. La invención se puede modalizar en otras formas específicas sin alejarse de su espíritu o características esenciales. Las modalidades descritas se deberán considerar en todos los aspectos solo son ilustrativos y no restrictivos. El alcance de la invención, por lo tanto, se indica por las reivindicaciones anexas en lugar de por la descripción anterior. Todos los cambios de las reivindicaciones que están dentro del significado y escala de equivalencia de las reivindicaciones se deberán abarcar dentro de su alcance. Además, todos los documentos, patentes y solicitudes publicados mencionados en la presente se incorporan aquí por referencia como se presenta en su totalidad.
Ejemplo 1 ARN de Interferencia para Silenciar Específicamente TNFRl en Células GTM-3 El presente estudio examina la capacidad del ARN de interferencia TNFRl para eliminar los niveles de expresión de proteínas de TNFRl endógeno en células de GTM-3 cultivadas. La transfección de células GTM-3 (Pang I.H. y otros, 1994, Curr. Eye. Res. 13:51-63) se logró usando concentraciones in Vitro (0.1 - 10 nM) de ARNsi TNFRl, ARNsi libre de RISC, de CONTROLsi #1 o ARNsi no dirigido al blanco de CONTROLsi #2 (NTC2) y reactivo de transfección DHARMAFECT® #1 (Dharmcon, Lafayette, CO) . todos los ARNsi se disolvieron en solución reguladora de ARNsi IX, una solución acuosa de KC1 20 mM, HEPES 6 mM (pH 7.59, 0.2 mM MgCl2. La muestras de control incluyeron un control de solución reguladora en la cual el volumen de ARNsi se remplazó con un volumen igual de solución reguladora de ARNsi IX ARNsi) . Los análisis Western usando un anticuerpo de anti-TNFRl (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) se llevaron a cabo para evaluar la expresión de proteínas de TNFRl . Los ARNsi de TNFR1 son ARN de interferencia con doble hebra que tienen especificidad para los siguientes blancos: TNFRlsi # 1 se dirige a la secuencia CAAAGGAACCÜACUUGUAC (SEC ID NO: 202) de la cual se deriva la SEC ID NO: 96; TNFRlsi #2 se dirige a la secuencia GAGCÜÜGAAGGAACÜACÜA (SEC ID NO: 203) de la cual se deriva la SEC ID NO: 97; TNFRlsi #3 se dirige a la secuencia CACAGAGCCÜAGACACUGA (SEC ID NO: 204) de la cual se deriva la SEC ID NO: 98; TNFRlsi #4 se dirige a la secuencia ÜCCAAGCUCÜACUCCAÜÜGA (SEC ID NO: 205) de la cual se deriva la SEC ID NO: 99. Como se muestra por los datos en la Figura 1, los ARNsi TNFRl si # 1, TNFR2 #2 y TNFRlsi #3, redujo la expresión de proteínas de TNFRl significativamente en las concentraciones de 10 nM y 1 nM en relación con los ARNsi de control, pero exhibieron eficacia reducida a 0.1 nM. Los ARNsi de TNFRlsi #2 y TNFRl #3 fueron particularmente efectivos. El ARNsi de TNFRl si #4 también mostraron una reducción dependiente de concentración en expresión de proteínas de TNFRl como se esperaba.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. - El uso de un compuesto para la manufactura de un medicamento para atenuar la expresión de ARNm TACE del sujeto, que comprende: administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de ARN de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y un vehículo farmacéuticamente aceptable, el ARN de interferencia comprendiendo: una región de por lo menos 13, 14, 15, 16, 17, ó 18 nucleótidos contiguos que tienen complementariedad de secuencia de por lo menos 80% a, o identidad de secuencia de por lo menos 90% con, los 13 penúltimos nucleótidos del extremo 3' de un ARNm que corresponde a cualquiera de SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 14 - SEC ID NO: 58, y SEC ID NO: 155-SEC ID NO: 201, en donde la expresión de ARNm TACE se atenúa por lo mismo . 2. - El uso de al reivindicación 1, en donde el ARN de interferencia es uno de un ARNsh, un ARNmi, o un ARN si. 3. - El uso de la reivindicación 1, en donde la composición se administra vía un aerosol, una ruta bucal, dérmica, intradérmica, de inhalación, intramuscular, intranasal, infraocular, intrapulmonar, intravenosa, intraperitoneal, nasal, ocular, oral, ótica, parenteral, de parche, subcutánea, sublingual, tópica o transdérmica . 4. - El uso de la reivindicación 1, en donde el ARN de interferencia se administra via expresión vivo de un vector de expresión capaz de expresar el ARN de interferencia . 5. - El uso de un compuesto para la manufactura de un medicamento para tratar una condición relacionada con TNFa en un sujeto que necesita del mismo, comprendiendo: administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de ARN de interferencia que tiene una longitud de 119 a 49 nucleótidos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde el ARN de interferencia comprende una región de por lo menos 13, 14, 1|5, 16, 17, ó 18 nucleótidos contiguos que tiene complementariedad de secuencia de por lo menos 80% a, o identidad de secuencia de por lo menos 90% con, los penúltimos 13 nucleótidos del extremo 3' de un ARNm que corresponde a cualquiera de SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 14 SEC ID NO: 58, y SEC ID NO: 155 -SEC ID NO: 201; en donde la condición relacionado de TNFa se trata por lo mismo. 6. - El uso de la reivindicación 5, en donde el ARN de interferencia es uno de un ARNsh, un ARNmi, o un ARN si. 7. - El uso de la reivindicación 5, en donde el composición se administra via un aerosol, una ruta bucal, dérmica, intradérmica, de inhalación, intramuscular, intranasal, intraocular, intrapulmonar, intravenosa, interperitoneal, nasal, ocular, oral, ótica, parenteral, de parche, subcutánea, sublingual, tópica o transdérmica . 8. - El uso de la reivindicación 5, en donde el ARN se administra via la expresión in vivo de un vector de expresión capas de expresar el ARN de interferencia. 9. - El uso de al reivindicación 5, en donde el sujeto es un ser humano y el ser humano tiene ojo seco está en riesgo de desarrollar ojo seco. 10. - El uso de la reivindicación 5, en donde el sujeto es un ser humano y el ser humano tiene una condición inflamatoria relacionada con TNFa. 11. - El uso de un compuesto para la manufactura de un medicamento para atenuar la expresión de ARNm TACE del sujeto, comprendiendo: administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de ARN de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y un vehículo farmacéuticamente aceptable, el ARN de interferencia comprendiendo : una hebra de nucleótido en sentido, una hebra de nucleótido en contrasentido y una región de por lo menos una complementariedad contigua casi perfecta de por lo menos 19 nucleótidos ; en donde la hebra en contrasentido se hibridiza bajo las condiciones fisiológicas a una porción de ARNm que corresponde a SEC ID NO: 1 comprendiendo los nucleótidos 297, 333, 334, 335, 434, 470, 493, 547, 570, 573, 61 8, 649, 689, 755, 842, 844, 846, 860, 878, 894, 900, 909, 910, 913, 942, 970, 984, 1002, 1010, 1053, 1064, 1137, 1162, 1215 , 1330, 1334, 1340, 1386, 1393, 1428, 1505, 1508, 1541, 1553, 1557, 1591, 1592, 1593, 1597, 1604, 1605, 1626, 1632, 1658, 1661, 1691, 1794, 1856, 1945, 1946, 1947, 1958, 2022, 2094, 2100, 2121, 2263, 2277, 2347, 2349, 2549, 2578, 2595, 2606, 2608, 2629, 2639, 2764, 2766, 2767, 2769, 3027, 3028, 3261, 3264, 3284 , 3313, 3317, 3332, ó 3337; en donde la expresión de ARNm TACE se atenúa . 12.- El uso de un compuesto para la manufactura de un medicamento para atenuar la expresión de ARNm de TNFR1 del sujeto, comprendiendo: administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de ARN de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y un vehículo farmacéuticamente aceptable, el ARN de interferencia comprendiendo: una hebra de nucleótidos en sentido, una hebra de nucleótidos en contrasentido y una región de complementariedad contigua por lo menos casi perfecta de por lo menos 19 nucleótidos; en donde la hebra en contrasentido se hibridiza bajo condiciones fisiológicas a una porción de ARNm correspondiendo a SEC ID NO: 2 iniciando en el nucleótido 124, 328, 387, 391, 393, 395, 406, 421, 423, 444, 447, 455, 459, 460, 467, 469, 470, 471, 475, 479, 513, 517, 531, 543, 556, 576, 587, 588, 589, 595, 601, 602, 611, 612, 651, 664, 667, 668, 669, 677, 678, 785, 786, 788, 791, 792, 804, 813, 824, 838, 843, 877, 884, 929, 959, 960, 961, 963, 964, 965, 970, 973, 974, 1000, 1002, 1013, 1026, 1053, 1056, 1057, 1058, 1161, 1315, 1318, 1324, 1357, 1360,1383,1393, 1420, 1471, 1573, 1671, 2044, 2045, 2046, 2047, 2048, 2089, 2090, 2091 ó 2092; en donde la expresión de ARNm de TNFR1 se atenúa por el mismo. 13. - El uso de la reivindicación 12, en donde el sujeto es un ser humano y el ser humano padece de ojo seco o está en riesgo de desarrollar ojo seco. 14. - El uso de la reivindicación 12, en donde el sujeto es un ser humano y el ser humano tiene una condición relacionada con tifa o está en riesgo de desarrollar una condición relacionada con TNF . 15. - El uso de la reivindicación 12, en donde la hebra de nucleótido en sentido y la hebra de nucleótido en contrasentido se conectan por una hebra de nucleótidos de ciclo . 16. - El uso de la reivindicación 12, en donde el composición se administra via un aerosol, una ruta bucal, dérmica, intradérmica, de inhalación, intramuscular, intranasal, intraocular, intrapulmonar, intravenosa, interperitoneal, nasal, ocular, oral, ótica, parenteral, de parche, subcutánea, sublingual, tópica o transdérmica . 17. - El uso de la reivindicación 12, en donde el ARN se administra via la expresión in vivo de un vector de expresión capas de expresar el ARN de interferencia. 18.- El uso de un compuesto de la manufactura de un medicamento para tratar una condición relacionada con TNFa en un sujeto que necesita del mismo, comprendiendo: administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de ARN de interferencia administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de ARN de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y un vehículo farmacéuticamente aceptable, el ARN de interferencia comprendiendo una hebra de nucleótido en sentido, una hebra de nucleótido en contrasentido y una región de por lo menos una complementariedad contigua casi perfecta de por lo menos 19 nucleótidos; en donde la hebra en contrasentido se hibridiza bajo las condiciones fisiológicas a una porción de ARNm que corresponde a SEC ID NO: 1 comprendiendo los nucleótidos 297, 333, 334, 335, 434, 470, 493, 547, 570, 573, 618, 649, 689, 755, 842, 844, 846, 860, 878, 894, 900, 909, 910, 913, 942, 970, 984, 1002, 1010, 1053, 1064, 1137, 1162, 1215, 1330, 1334, 1340, 1386, 1393, 1428, 1505, 1508, 1541, 1553, 1557, 1591, 1592, 1593, 1597, 1604, 1605, 1626, 1632, 1658, 1661, 1691, 1794, 1856, 1945, 1946, 1947, 1958, 2022, 2094, 2100, 2121, 2263, 2277, 2347, 2349, 2549, 2578, 2595, 2606, 2608, 2629, 2639, 2764, 2766, 2767, 2769, 3027, 3028, 3261, 3264, 3284, 3313,3317, 3332, ó 3337; en donde la condición ocular relacionada con TNFa se atenúa por el mismo. 19.- El uso de un compuesto para la manufactura de un medicamento para tratar una condición ocular relacionada con TNFa en un sujeto que necesita de la misma, comprendiendo : administrar a un ojo del sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de ARN de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, el ARN de interferencia que comprende una hebra de nucleótidos en sentido, una hebra de nucleótidos en contrasentido y una región de complementariedad contigua por lo menos casi perfecta de por lo menos 19 nucleótidos; en donde la hebra en contrasentido se hibridiza bajo condiciones fisiológicas a una porción de ARNm que corresponde a SEC ID NO: 2 que comprende los nucleótidos 124, 328, 387, 391, 393, 395, 406, 421, 423, 444, 447, 455, 459 460, 467, 469, 470, 471, 475, 479, 513, 517, 531, 543, 556 576, 587, 588, 589, 595, 601, 602, 611, 612, 651, 664, 667 668, 669, 677, 678, 785, 786, 788, 791, 792, 804, 813, 824 838, 843, 877, 884, 929, 959, 960, 961, 963, 964, 965, 970 973, 974, 1000, 1002, 1013, 1026, 1053 , 1056, 1057, 1058 1161, 1315, 1318, 1324, 1357, 1360,138 3,1393, 1420, 1471 1573, 1671, 2044, 2045, : 2046, 2047, 2048 , 208 9, 2090, 2091 2092; en donde la condición ocular relacionada con TNFa se atenúa por el mismo. 20. - El uso de la reivindicación 19, en donde el sujeto es un ser humano y el ser humano padece de ojo seco o está en riesgo de desarrollar ojo seco. 21. - El uso de la reivindicación 19, en donde el sujeto es un ser humano y el ser humano tiene conjuntivitis alérgica o inflamación ocular o está en riesgo de desarrollar conjuntivitis alérgica o inflamación ocular. 22. - El uso de la reivindicación 18, que comprende además administrar al sujeto un segundo ARN de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y que comprende : una hebra de nucleótidos en sentido, una hebra de nucleótidos en contrasentido y una región de complementariedad por lo menos casi perfecta de por lo menos 19 nucleótidos; en donde la hebra en contrasentido del segundo ARN de interferencia se hibridiza bajo las condiciones fisiológicas a una porción de ARNm que corresponde a SEC ID NO: 2 que comprende los nucleótidos 124, 328, 387, 391, 393, 395, 406, 421, 423, 444, 447, 455, 459, 460, 467, 469, 470, 471, 475, 479, 513, 517, 531, 543, 556, 576, 587, 588, 589, 595, 601, 602, 611, 612, 651, 664, 667, 668, 669, 677, 678, 785, 786, 788, 791, 792, 804, 813, 824, 838, 843, 877, 884, 929, 959, 960, 961, 963, 964, 965, 970, 973, 974, 1000, 1002, 1013, 1026, 1053, 1056, 1057, 1058, 1161, 1315, 1318, 1324, 1357, 1360,1383,1393, 1420, 1471, 1573, 1671, 2044, 2045, 2046, 2047, 2048, 2089, 2090, 2091 ó 2092. 23.- El uso de la reivindicación 19, que comprende además administrar al ojo del sujeto un segundo ARN de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y que comprende : una hebra de nucleótidos en sentido, una hebra de nucleótidos en contrasentido, y una región de complementariedad por lo menos casi perfecta de por lo menos 19 nucleótidos; en donde la hebra en contrasentido del segundo ARN de interferencia se hibridiza bajo las condiciones fisiológicas a una porción del ARNm que corresponde a SEC ID NO: 1 que comprende el nucleótido 297, 333, 334, 335, 434, 470, 4 93, 547, 570, 573, 618, 649, 689, 755, E S42, 844, 846, 860, 878, £ ¡94, 900, 909, 910, 913, 9^ 42, 970, 984, 1002, 1010, 1053, 1064, 1137, 1162, 1215, 1330, 1334, 1340, 1386, 1393, 1428, 1505, 1508, 1541, 1553, 1557, 1591, 1592, 1593, 1597, 1604, 1605, 1626, 1632, 1658, 1661, 1691, 1794, 1856, 1945, 1946, 1947, 1958, 2022, 2094, 2100, 2121, 2263, 2277, 2347, 2349, 2549, 2578, 2595, 2606, 2608, 2629, 2639, 2764, 2766, 2767, 2769, 3027, 3028, 3261, 3264, 32í 34, 3313,3317, 3332, ó 3337 24.- El uso de la reivindicación 18, en donde la hebra de nucleotidos en sentido y la hebra de nucleotidos en contrasentido se conectan por una hebra de nucleotidos de bucle. 25.- El uso de la reivindicación 18, en donde la composición se administra via un aerosol, una ruta bucal, dérmica, intradérmica, de inhalación, intramuscular, intranasal, intraocular, intrapulmonar, intravenosa, intraperitoneal, nasal, ocular, oral, ótica, parenteral, de parches, subcutánea, sublingual, tópica, o transdérmica . 26.- el uso de la reivindicación 18, en donde el ARN de interferencia se administra via expresión in vivo de un vector de expresión capaz de expresar el ARN de interferencia. 27.- el uso de la reivindicación 19, en donde la hebra de nucleotidos en sentido y la hebra de nucleotidos en contrasentido se conectan por una hebra de nucleotidos en bucles. 28. - El uso de la reivindicación 19, en donde la composición se administra via un aerosol, una ruta bucal, dérmica, intradérmica, de inhalación, intramuscular, intranasl, intraocular, intrapulmonar, intravenosa, intraperitoneal, nasal, ocular, oral, ótica, parenteral, de parche, subcutánea, sublingual, tópica, o transdérmica . 29. - El uso de la reivindicación 19, en donde el ARN se administra via la expresión in vivo de un vector de expresión capaz de expresar el ARN de interferencia. 30.- El uso de un compuesto de la manufactura de un medicamento para tratar una condición relacionada de TNFa en un sujeto que necesita del mismo, comprendiendo: administrar al sujeto una composición que comprende una molécula de ARNsi de doble hebra que desregula la expresión de un gen TACE via interferencia de ARN, en donde: cada hebra de la molécula de ARNsi es independientemente de aproximadamente 19 a 27 nucleótidos de longitud; y una hebra de la molécula de ARNsi comprendde una secuencia de nucleótidos que tiene complementariedad sustancial a un ARNm que corresponde al gen TACE de manera que la molécula de ARNsi dirige la separación de ARNm via la interferencia de ARN. 31. - El uso de un compuesto para la manufactura de un medicamento para tratar una condición ocular relacionada con TNF en un sujeto que necesita del mismo, comprendiendo: administrar al sujeto una composición que comprende una molécula de ARNsi de doble hebra que desregula al expresión de un gen de TNFRl via interferencia de ARN, en donde : cada hebra de la molécula de ARNsi es independientemente de aproximadamente 29 a alrededor de 27 nucleotidos de longitud; y una hebra de la molécula de ARNsi comprende una secuencia de nucleotidos que tiñen complementariedad sustancial a un ARNm que corresponde al gen de TNFRl de manera que la molécula de ARNsi dirige la separación de ARNm via interferencia de ARN. 32. - El uso de un compuesto para la manufactura de un medicamento para atenuar la expresión de ARNm TACE de un sujeto que comprende: administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de un ARN de interferencia de una hebra que tiene una longitud de 19 a 49 nucleotidos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde el ARN de interferencia de una hebra se hibridiza bajo condiciones fisiológicas a una porción de ARNm que corresponde a SEC ID NO: 1 que comprende el nucleótido 297, 333, 334, 335, 434, 470, 493, 547, 570, 573, 618, 649, 689, 755, 842, 844, 846, 860, 878, 894, 900, 909, 910, 913, 942, 970, 984, 1002, 1010, 1053, 1064, 1137, 1162, 1215, 1330, 1334, 1340, 1386, 1393, 1428, 1505, 1508, 1541, 1553, 1557, 1591, 1592, 1593, 1597, 1604, 1605, 1626, 1632, 1658, 1661, 1691, 1794, 1856, 1945, 1946, 1947, 1958, 2022, 2094, 2100, 2121, 2263, 2277, 2347, 2349, 2549, 2578, 2595, 2606, 2608, 2629, 2639, 2764, 2766, 2767, 2769, 3027, 3028, 3261, 3264, 3284, 3313,3317, 3332, ó 3337, y el ARN de interferencia tiene una región de complementariedad contigua por lo menos casi perfecta con la porción de hibridización de ARNm que corresponde a SEC ID NO: 1, en donde la expresión de ARNm TACE se atenúa por lo mismo. 33. - El uso de la reivindicación 31, en donde el sujeto es un ser humano y el sujeto tiene una condición ocular relacionada con TNFOÍ. 34. - El uso de la reivindicación 31, en donde el composición se administra vía un aerosol, una ruta bucal, dérmica, intradérmica, de inhalación, intramuscular, intranasal, intraocular, intrapulmonar, intravenosa, intraperitoneal, nasal, ocular, oral, ótica, parenteral, de parches, subcutánea, sublingual, tópica o transdérmica . 35. - El uso de la reivindicación 31, en donde el ARN de interferencia se administra via la expresión in vivo de un vector de expresión capaz de expresar el ARN de interferencia. 36.- El uso de la reivindicación 31, en donde el ARN de interferencia es un ARNmi o ARN si. 37. - El uso de la reivindicación 29, en donde cada hebra de la molécula de ARNsi es independientemente de aproximadamente 19 nucleotidos a alrededor de 25 nucleotidos de longitud. 38. - El uso de la reivindicación 29, en donde cada hebra de la molécula de ARNsi es independientemente de aproximadamente 19 nucleotidos a alrededor de 21 nucleotidos de longitud. 39. - Una composición que comprende un ARN de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleotidos y que comprende una secuencia de nucleotidos que corresponde a cualquiera de SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 1 - SEC ID NO: 58, y SEC ID NO: 155-SEC ID NO: 210; p un complemento del mismo; y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 40. - Una composición que comprende un ARN de interferencia que consiste esencialmente de una secuencia de nucleotidos que corresponde a uno de SEC ID NO: 59 - SEC ID NO: 69, SEC ID NO: 71 - SEC ID NO: 92, y SEC ID NO: 94 - SEC ID NO: 154, o un complemento del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable . 41. - La composición de la reivindicación 39, en donde el ARN de interferencia es uno de ARNsh, un ARNsi o un ARNmi. 42.- La composición de la reivindicación 40, en donde ARN de interferencia es uno de un ARNsh, un ARNsi o un ARNmi .
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