KR20120093306A

KR20120093306A - 종양 괴사 인자 α-관련 증상의 ＲＮＡｉ-매개 억제

Info

Publication number: KR20120093306A
Application number: KR1020127013309A
Authority: KR
Inventors: 존 엠. 야니; 존 이. 차테르톤; 다이안느 미셸 센치나; 다니엘 에이. 가마쉐; 스티븐 티. 밀러
Original assignee: 알콘 리서치, 리미티드
Priority date: 2006-05-19
Filing date: 2007-05-17
Publication date: 2012-08-22
Also published as: US8541389B2; JP2009537566A; TW200812623A; CN101448943A; AU2007253776A1; CN103285026A; RU2008150324A; US20160369283A1; CA2650416A1; AR061064A1; US20130338213A1; US20100166676A1; EP2018426A2; TWI472344B; JP2013049727A; WO2007137129A2; US20110142767A1; ZA200809203B; RU2469090C2; US20070281901A1

Abstract

본 발명은 TNFα 세포 표면 수용체 TNF 수용체-1 (TNFR1) mRNA 발현을 침묵시키거나, 또는 TNFα 전환 효소 (TACE/ADAM17) mRNA 발현을 침묵시켜 종양 괴사 인자 α (TNFα)를 억제하기 위한 RNA 간섭이 제공된다. TNFα 표적을 침묵시키는 것은 특히 안 증상 안구 건조증, 알러지성 결막염, 또는 안구 염증, 또는 이를 테면 피부염, 비염, 또는 천식과 같은 TNFα-관련 증상이 있거나 또는 이러한 증상의 발생 위험이 있는 환자의 치료에 유용하다.

Description

종양 괴사 인자 α-관련 증상의 ＲＮＡｉ-매개 억제{RNAi-MEDIATED INHIBITION OF TUMOR NECROSIS FACTOR α-RELATED CONDITIONS}

관련 출원

본 출원은 그 내용이 본원에 특별히 참고로 인용되는 "RNAi-MEDIATED INHIBITION OF TUMOR NECROSIS FACTOR α-RELATED CONDITIONS" 명칭으로 2006년 5월 19일자 출원된 함께 계류중인 미국 임시 특허 출원 제 60/801,788호의 이점을 주장한다.

발명의 분야

본 발명은 종양 괴사 인자 α (TNFα) 세포 표면 수용체 TNF 수용체-1 (TNFR1) mRNA, 또는 TNFα 전환 효소 (TACE/ADAM17) mRNA를 침묵시켜 TNFα를 침묵시키기 위한 간섭 RNA 조성물의 분야에 관한 것이다. TNFα 표적을 침묵시키는 것은 TNFα-관련 증상을 갖거나 또는 이러한 증상의 발생 위험이 있는 환자의 치료에 유용하다.

염증은 일반적으로 스테로이드 및/또는 비-스테로이드성 항-염증 약물 (NSAIDS)을 포함하는 표준 항-염증 요법으로 치료된다. 알러지성 결막염, 안구 염증, 피부염, 비염 및 천식은 과거로부터 경구 또는 비강내 스테로이드 외에, 경구, 비강내 또는 국소 항히스타민제의 요법으로 치료되어 왔다. 전신 치료는 전형적으로 필요한 치료 부위에 도달하기 위한 유효 농도를 공급하기 위하여 투여될 약물 화합물의 더 높은 농도를 요구한다. 항히스타민 화합물은 중추 신경계 활성을 갖는 것으로 알려져 있다; 졸음 및 점막의 건조는 항히스타민제 사용의 공통된 부작용이다. 스테로이드 및 NSAIDS는 안압 증가, 백내장, 녹내장 또는 각막 융해를 포함하는 잠재적 부작용을 갖는다.

건성 결막염 또는 건성 각막결막염으로도 알려진 안구 건조증(dry eye)은 안구앞 눈물막의 파괴로 눈의 노출된 외부 표면의 탈수를 수반하는 통상적 안과 질병이다. 지금까지, 안구 건조증은 인공 누액의 국소 투여로 치료되어 왔다. 이들 용액의 일부는 점액소 결함 환자에서 점액소 층을 일시적으로 대체하거나 보충하기 위한 점액유사(mucomimetic) 물질을 포함한다. 안구 건조증의 악화를 치료하기 위한 단기 "충격" 치료법에서 메틸프레드니솔론의 사용이 제안되었다. 제안된 "충격" 치료법은 안압 증가 및 백내장 형성과 같은 염증 증상을 위해 전통적인 스테로이드 치료법과 관련된 합병증을 회피하는 것이 필요하다.

사이토카인 TNFα는 안구 건조증 및 포도막염의 항-염증 치료법의 표적이다. 눈물샘 염증-유도된 안구 건조증의 래빗 모델에서, 각막 염색의 억제 및 눈물 파괴의 복원 시간이 안구 표면 TNFα 수준의 특정 조절에 의하여 성취된다. 안구 건조증 치료법은 TNFα 합성을 억제하거나 (RDP58), 또는 가용성 수용체 (ENBREL®) 또는 단일 클론 항체 (REMICADE®)를 사용하여 TNFα를 특이적으로 중화시키는 것에 의해 유래된다. 이들 TNFα 유래의 치료법 각각으로, 국소 안구 항-염증 스테로이드로 수득되는 수준의 효능이 유발된다.

2005년 10월 13일자 공개된 McSwiggen 등의 미국 특허 공개 제 2005/0227935호는 RNA 간섭 매개의 TNF 및 TNF 수용체 유전자 발현의 억제에 관한 것이다. 그러나 상기 문헌은 본원에 제공된 바와 같은 RNA 간섭을 위한 특정 표적 서열을 교시하지 않고 있다.

본 발명의 구체예는 안구 건조증 및 염증의 치료 방법 및 추가의 제제에 대한 본 발명에서의 필요성에 기초하며, 이를 위한 대안적인 치료법을 제공한다.

본 발명의 구체예는 스테로이드 또는 NSAIDS와 관련된 부작용이 없는 TNFα 관련 증상의 매우 강력하고 유효한 치료, 억제 또는 방해를 제공한다. 일면에서, 본 발명의 방법은 TACE mRNA 또는 TNFR1 mRNA의 발현을 침묵시키는 간섭 RNA를 투여하여, 각각 TNFα로 전구체가 단백질 가수 분해 처리되는 것을 간섭하거나 또는 그 세포 표면 수용체로 TNFα가 결합하는 것을 간섭하고, 이에 따라 TNFα의 활성을 약화시키고 세포 자멸사 및 염증과 관련된 사건의 캐스케이드(cascade)를 예방하여 TNFα-관련 증상을 갖거나 또는 TNFα-관련 증상의 발생 위험이 있는 대상을 치료하는 것을 포함한다.

TNFα-관련 증상은 안구 건조증 및 TNFα-관련 염증 증상과 같은 증상을 포함한다. TNFα-관련 염증 증상은 예를 들어, 안구 염증, 알러지성 결막염, 피부염, 비염 및 천식과 같은 증상을 포함하며, TNFα-관련 염증 증상을 직접적으로 또는 간접적으로 유발하는 TNFα의 활성에서 유래된 세포적 변화를 포함한다. TNFα-관련 증상은 특히 TNFα-관련 안 증상, 이를 테면 안구 건조증, 알러지성 결막염 및 안구 염증을 포함한다. 본원에 제공된 간섭 RNA는 비특정 제제로 유발되는 바람직하지 않은 부작용을 피하면서, TACE mRNA 또는 TNFR1 mRNA를 표적으로 하여 TNFα를 침묵시키기 위하여 제공된다.

대상의 TACE mRNA 발현을 약화시키는 방법은 본 발명의 일구체예이다. 상기 방법은 19개 내지 49개 뉴클레오티드 길이를 갖는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하며, 상기 간섭 RNA는 서열 번호 3, 서열 번호 14 내지 서열 번호 58 및 서열 번호 155 내지 서열 번호 201 중 어느 하나에 상응하는 mRNA의 3' 말단의 끝에서 두번째 13개 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개 인접 뉴클레오티드 영역을 포함한다. 이에 의해 TACE mRNA의 발현이 약화된다.

그를 필요로 하는 대상에서 TNFα-관련 증상을 치료하는 방법이 본 발명의 일 구체예이다. 상기 방법은 19개 내지 49개 뉴클레오티드 길이를 갖는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하며, 여기에서 상기 간섭 RNA는 서열 번호 3, 서열 번호 14 내지 서열 번호 58 및 서열 번호 155 내지 서열 번호 201 중 어느 하나에 상응하는 mRNA의 3' 말단의 끝에서 두번째 13개 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개 인접 뉴클레오티드 영역을 포함한다. 이에 의해 TNFα-관련 증상이 치료된다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 대상의 TACE mRNA 또는 TNFR1 mRNA의 발현을 약화시켜 대상의 TNFα의 활성을 약화시키는 방법은 19개 내지 49개 뉴클레오티드 길이를 갖는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하며, 상기 간섭 RNA는 센스 뉴클레오티드 가닥, 안티센스 뉴클레오티드 가닥, 및 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성의 영역을 포함하며, 여기에서 상기 안티센스 가닥은 생리적 조건 하에서 뉴클레오티드 297, 333, 334, 335, 434, 470, 493, 547, 570, 573, 618, 649, 689, 755, 842, 844, 846, 860, 878, 894, 900, 909, 910, 913, 942, 970, 984, 1002, 1010, 1053, 1064, 1137, 1162, 1215, 1330, 1334, 1340, 1386, 1393, 1428, 1505, 1508, 1541, 1553, 1557, 1591, 1592, 1593, 1597, 1604, 1605, 1626, 1632, 1658, 1661, 1691, 1794, 1856, 1945, 1946, 1947, 1958, 2022, 2094, 2100, 2121, 2263, 2277, 2347, 2349, 2549, 2578, 2595, 2606, 2608, 2629, 2639, 2764, 2766, 2767, 2769, 3027, 3028, 3261, 3264, 3284, 3313, 3317, 3332, 또는 3337를 포함하는 서열 번호 1에 상응하는 mRNA의 부분에 혼성화되거나, 또는 상기 안티센스 가닥은 생리적 조건 하에서 뉴클레오티드 124, 328, 387, 391, 393, 395, 406, 421, 423, 444, 447, 455, 459, 460, 467, 469, 470, 471, 475, 479, 513, 517, 531, 543, 556, 576, 587, 588, 589, 595, 601, 602, 611, 612, 651, 664, 667, 668, 669, 677, 678, 785, 786, 788, 791, 792, 804, 813, 824, 838, 843, 877, 884, 929, 959, 960, 961, 963, 964, 965, 970, 973, 974, 1000, 1002, 1013, 1026, 1053, 1056, 1057, 1058, 1161, 1315, 1318, 1324, 1357, 1360, 1383, 1393, 1420, 1471, 1573, 1671, 2044, 2045, 2046, 2047, 2048, 2089, 2090, 2091, 2092, 또는 2098에서 시작하는 서열번호 2에 상응하는 mRNA의 부분에 혼성화된다. 안티센스 가닥이 상기 기술된 서열 번호 1에 상응하는 mRNA의 부분에 혼성화되는 구체예에서, TACE mRNA의 발현이 약화된다. 안티센스 가닥이 상기 기술된 서열 번호 2에 상응하는 mRNA의 부분에 혼성화되는 구체예에서, TNFR1 mRNA의 발현이 약화된다.

그를 필요로 하는 대상에서 TNFα-관련 증상을 치료하는 방법이 본 발명의 일 구체예이며, 이 방법은 19개 내지 49개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하며, 상기 간섭 RNA는 센스 뉴클레오티드 가닥, 안티센스 뉴클레오티드 가닥 및 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성의 영역을 포함하고; 여기에서 안티센스 가닥은 생리적 조건 하에서 뉴클레오티드 297, 333, 334, 335, 434, 470, 493, 547, 570, 573, 618, 649, 689, 755, 842, 844, 846, 860, 878, 894, 900, 909, 910, 913, 942, 970, 984, 1002, 1010, 1053, 1064, 1137, 1162, 1215, 1330, 1334, 1340, 1386, 1393, 1428, 1505, 1508, 1541, 1553, 1557, 1591, 1592, 1593, 1597, 1604, 1605, 1626, 1632, 1658, 1661, 1691, 1794, 1856, 1945, 1946, 1947, 1958, 2022, 2094, 2100, 2121, 2263, 2277, 2347, 2349, 2549, 2578, 2595, 2606, 2608, 2629, 2639, 2764, 2766, 2767, 2769, 3027, 3028, 3261, 3264, 3284, 3313, 3317, 3332, 또는 3337을 포함하는 서열 번호 1에 상응하는 mRNA의 부분에 혼성화된다. 이에 의해 TNFα-관련 증상이 치료된다.

그를 필요로 하는 대상에서 TNFα-관련 안 증상을 치료하는 방법이 본 발명의 일 구체예이며, 이 방법은 19개 내지 49개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하며, 상기 간섭 RNA는 센스 뉴클레오티드 가닥, 안티센스 뉴클레오티드 가닥 및 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성의 영역을 포함하고; 여기에서 안티센스 가닥은 생리적 조건 하에서 뉴클레오티드 124, 328, 387, 391, 393, 395, 406, 421, 423, 444, 447, 455, 459, 460, 467, 469, 470, 471, 475, 479, 513, 517, 531, 543, 556, 576, 587, 588, 589, 595, 601, 602, 611, 612, 651, 664, 667, 668, 669, 677, 678, 785, 786, 788, 791, 792, 804, 813, 824, 838, 843, 877, 884, 929, 959, 960, 961, 963, 964, 965, 970, 973, 974, 1000, 1002, 1013, 1026, 1053, 1056, 1057, 1058, 1161, 1315, 1318, 1324, 1357, 1360, 1383, 1393, 1420, 1471, 1573, 1671, 2044, 2045, 2046, 2047, 2048, 2089, 2090, 2091, 2092, 또는 2098을 포함하는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA의 부분에 혼성화된다. 이에 의해 TNFα-관련 증상이 치료된다.

추가의 구체예에서, 19개 내지 49개 뉴클레오티드 길이를 갖는 제2 간섭 RNA도 대상에 투여될 수 있으며; 상기 제2 간섭 RNA는 센스 뉴클레오티드 가닥, 안티센스 뉴클레오티드 가닥 및 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 상보성의 영역을 포함하며, 여기에서 상기 제2 간섭 RNA의 안티센스 가닥은 생리적 조건 하에서 상기 기술된 뉴클레오티드를 포함하는 서열 번호 1에 상응하는 mRNA의 부분에 혼성화되거나, 또는 상기 안티센스 가닥은 생리적 조건 하에서 뉴클레오티드 124, 328, 387, 391, 393, 395, 406, 421, 423, 444, 447, 455, 459, 460, 467, 469, 470, 471, 475, 479, 513, 517, 531, 543, 556, 576, 587, 588, 589, 595, 601, 602, 611, 612, 651, 664, 667, 668, 669, 677, 678, 785, 786, 788, 791, 792, 804, 813, 824, 838, 843, 877, 884, 929, 959, 960, 961, 963, 964, 965, 970, 973, 974, 1000, 1002, 1013, 1026, 1053, 1056, 1057, 1058, 1161, 1315, 1318, 1324, 1357, 1360, 1383, 1393, 1420, 1471, 1573, 1671, 2044, 2045, 2046, 2047, 2048, 2089, 2090, 2091, 2092, 또는 2098에서 시작하는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA의 부분에 혼성화된다.

제1 간섭 RNA가 서열 번호 1을 표적으로 하는 경우, 제2 간섭 RNA는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2를 표적으로 할 수 있으며, 반대로, 제1 간섭 RNA가 서열 번호 2를 표적으로 하는 경우, 제2 간섭 RNA는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2를 표적으로 할 수 있다. 추가의 구체예에서, 제3, 제4 또는 그 이상의 간섭 RNA가 투여될 수 있다.

본 발명의 추가의 구체예는 RNA 간섭을 통하여 TACE 유전자의 발현을 하향 조절하는 이중 가닥 siRNA 분자를 포함하는 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하여, 그를 필요로 하는 대상에서 TNFα-관련 증상을 치료하는 방법이며, 여기에서 siRNA 분자의 각각의 가닥은 독립적으로 약 19개 내지 약 27개 뉴클레오티드 길이이며; siRNA 분자의 한 가닥은 TACE 유전자에 상응하는 mRNA에 실질적으로 상보성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하여, siRNA 분자가 RNA 간섭을 통하여 mRNA를 절단하도록 한다.

본 발명의 추가의 구체예는 RNA 간섭을 통하여 TNFR1 유전자의 발현을 하향 조절하는 이중 가닥 siRNA 분자를 포함하는 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하여, 그를 필요로 하는 대상에서 TNFα-관련 안 증상을 치료하는 방법이며, 여기에서 siRNA 분자의 각각의 가닥은 독립적으로 약 19개 내지 약 27개 뉴클레오티드 길이이며; 여기에서 siRNA 분자의 한 가닥은 TNFR1 유전자에 상응하는 mRNA에 실질적으로 상보성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하여, siRNA 분자가 RNA 간섭을 통하여 mRNA를 절단하도록 한다.

단일-가닥 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하여 대상의 TACE mRNA의 발현을 약화시키는 방법이 추가의 구체예이다. 단일-가닥 간섭 RNA는 19개 내지 49개 뉴클레오티드 길이를 가지며, 생리적 조건 하에서 뉴클레오티드 297, 333, 334, 335, 434, 470, 493, 547, 570, 573, 618, 649, 689, 755, 842, 844, 846, 860, 878, 894, 900, 909, 910, 913, 942, 970, 984, 1002, 1010, 1053, 1064, 1137, 1162, 1215, 1330, 1334, 1340, 1386, 1393, 1428, 1505, 1508, 1541, 1553, 1557, 1591, 1592, 1593, 1597, 1604, 1605, 1626, 1632, 1658, 1661, 1691, 1794, 1856, 1945, 1946, 1947, 1958, 2022, 2094, 2100, 2121, 2263, 2277, 2347, 2349, 2549, 2578, 2595, 2606, 2608, 2629, 2639, 2764, 2766, 2767, 2769, 3027, 3028, 3261, 3264, 3284, 3313, 3317, 3332, 또는 3337을 포함하는 서열 번호 1에 상응하는 mRNA의 부분에 혼성화하며, 상기 간섭 RNA는 서열 번호 1에 상응하는 mRNA의 혼성화 부분과 적어도 거의-완벽한 인접 상보성인 영역을 갖는다. 이에 의해, TACE mRNA의 발현이 약화된다.

본 발명은 추가의 구체예로서 19개 내지 49개 뉴클레오티드 길이를 가지며, 서열 번호 3, 서열 번호 14 내지 서열 번호 58 및 서열 번호 155 내지 서열 번호 201 중 어느 하나에 상응하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보물(complement)을 포함하는 간섭 RNA; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함한다.

본 발명은 추가의 구체예로서 서열 번호 59 내지 서열 번호 69, 서열 번호 71 내지 서열 번호 92 및 서열 번호 94 내지 서열 번호 154 중 어느 하나에 상응하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보물로 필수적으로 구성된 간섭 RNA; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함한다.

본원에 기술된 바와 같이 TNFα의 활성을 약화시키고 이에 의해 TNFα-관련 증상을 치료하는 방법으로서, TACE mRNA 또는 TNFR1 mRNA의 발현을 약화시키기 위한 의약을 제조하는 데에서의 본원에 기술된 임의의 구체예의 용도가 본 발명의 일 구체예이다.

상기에서 기술된 방식 및 본 발명의 다른 잇점 및 목적을 수득할 목적으로, 상기 간단히 기술된 본 발명을 더욱 특징하는 설명은 그의 특정 구체예를 참조하여 첨부된 도면에서 설명될 것이다. 이들 도면은 본 발명의 전형적인 구체예를 도시할 뿐이며, 이에 따라 이것이 그 목적을 제한하는 것이 아닌 것을 이해하여, 본 발명은 동반된 도면을 이용하여 추가적 설명과 상세한 설명으로 기술될 것이다:
도 1은 각각 10 nM, 1 nM 및 0.1 nM의 TNFR1 siRNA #1, #2, #3 및 #4 및 RISC-부재 대조군 siRNA; 10nM의 비-표적화 대조군 siRNA (NTC2); 및 완충액 대조군 (-siRNA)으로 형질감염된 GTM-3 세포의 TNFR1 웨스턴 블롯을 제공한다. 화살표는 55-kDa TNFR1 및 42-kDa 액틴 밴드의 위치를 나타낸다.

본 명세서에 인용된 참고 문헌은 본원에 진술된 예시적인 절차 또는 다른 상세한 보충을 제공하는 정도로 특별히 참고로 인용된다.

당업자들은 본 명세서에 비추어, 본원에 개시된 구체예의 명백한 변형이 본 발명의 의도 및 목적을 벗어나지 않고 만들어질 수 있다는 것을 식별할 수 있을 것이다. 본원에서 개시된 모든 구체예는 본 명세서에 비추어볼 경우, 과도한 실험 없이 만들어질 수 있으며 실행될 수 있다. 본 발명의 모든 목적은 명세서 및 이와 동등한 구체예로 준비되었다. 명세서는 본 발명에 주어진 권리를 보호하기 위한 전체 관점에서 과도하게 좁게 해석되지 않아야 한다.

본원에 나타낸 상세한 설명은 실시예의 방법으로 나타냈으며, 본 발명의 바람직한 구체예를 예시적으로 기술할 목적일 뿐이고, 본 발명의 다양한 구체예의 원리 및 개념적 면의 설명을 쉽게 이해하고 가장 유용할 것으로 여겨지는 것을 제공할 목적으로 제시하였다. 이러한 점에서, 본 발명의 기본적인 이해를 위해 필요한 것보다 더 구체적으로 본 발명의 구조적인 상세한 설명을 나타낼 시도를 하지 않았으며, 본 발명의 몇몇 형태가 실시로 구체화될 수 있는 방법이 숙련자에게 명백하도록 하는 도면 및/또는 실시예와 함께 설명하였다.

하기 실시예에서 확실하고 명백하게 변형되거나 의미의 적용이 임의로 해석을 무의미하게 하거나 본질적으로 무의미하게 하는 경우가 아닌 한, 다음 정의 및 설명이 앞으로 전개될 임의의 해석에 효력을 발휘하는 것을 의미하며 이러한 것이 의도된다. 용어의 해석이 그것을 무의미하게 하거나 본질적으로 무의미하게 하는 경우, 정의는 Webster's Dictionary, 3^rd Edition으로부터 취해질 것이다.

본원에서 사용된 모든 백분율은 달리 언급되지 않는 한 중량 퍼센트이다.

본원에 사용되는 용어 "단수"는 본원에서는 달리 특정되지 않으면 "하나", "적어도 하나" 또는 "하나 이상"의 의미를 갖는다.

건성 결막염 또는 건성 각막결막염으로도 알려진 용어 "안구 건조증"은 안구앞 눈물막의 파괴로 눈의 노출된 외부 표면의 탈수를 수반하는 통상적인 안과 질병이다.

본원에 사용되는 용어 "안구 염증"은 예를 들어, 홍채염, 포도막염, 겉공막염, 공막염, 각막염, 안구내염, 눈꺼풀염 및 의원성 염증 증상을 포함한다.

본원에 사용되는 용어 "알러지성 결막염"은 눈꺼풀 안에 위치하며, 공막의 노출된 표면을 덮는 섬세한 막인 결막의 염증을 말한다. 용어 "알러지성 결막염"은 예를 들어, 아토피 각막결막염, 거대유두결막염, 고초열 결막염, 통년 알러지성 결막염 및 춘계 각막결막염를 포함한다.

본원에 사용되는 용어 "피부염"은 피부의 염증을 말하며, 예를 들어, 알러지성 접촉 피부염, 두드러기, 무피지성 피부염 (하퇴상의 건조한 피부), 아토피 피부염, 접촉 피부염, 이를 테면 자극 접촉 피부염 및 옻-유도 접촉 피부염, 습진, 인력(gravitational) 피부염, 화폐상 피부염, 외이도염, 구강 주위 피부염 및 지루성 피부염을 포함한다.

본원에 사용되는 용어 "비염"은 코 점막의 염증을 말하며, 예를 들어, 알러지성 비염, 아토피 비염, 자극성 비염, 호산성 비-알러지성 비염, 약물성 비염 및 호중성 비부비동염을 포함한다.

본원에 사용되는 용어 "천식"은 코와 입에서 폐로 공기가 이동하는 기도의 협착을 유발하는 호흡 기도의 염증을 말하며, 예를 들어, 알러지성 천식, 아토피성 천식, 아토피 기관지 IgE-매개의 천식, 기관지 천식, 세기관지염, 기종성 천식, 본태 천식, 운동-유도 천식, 환경 인자에 의해 유발되는 외인성 천식, 초기 천식, 병태생리학적 장애에 의해 유발되는 내인성 천식, 비-알러지성 천식, 비-아토피성 천식 및 위지(wheezy) 영아 증후군을 포함한다.

구문 "(서열 식별자) 중 임의의 하나에 상응하는 mRNA의 3' 말단의 끝에서 두번째 13개 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성을 갖거나 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개 인접 뉴클레오티드의 영역"은 하나의 뉴클레오티드 치환을 허용한다. 두개의 뉴클레오티드 치환 (예를 들어, 11/13 = 85% 동일성/상보성)은 이러한 구문에 포함되지 않는다.

"동일성 퍼센트"이라는 용어는 제2 핵산 분자에서 같은 길이의 인접 뉴클레오티드의 세트와 같은 제1 핵산 분자 내의 인접 뉴클레오티드의 백분율을 나타낸다. "상보성 퍼센트"이라는 용어는 제2 핵산 분자에서 인접 뉴클레오티드의 세트와 왓슨-크릭 센스에서 염기 쌍을 이룰 수 있는 제1 핵산 분자 내 인접 뉴클레오티드의 백분율을 나타낸다.

본원에 사용되는 용어 "혼성화"는 상보적 또는 거의 상보적인 염기 서열을 갖는 단일 가닥 핵산이 혼성물이라 불리는 수소-결합 복합체를 형성하기 위하여 상호작용하는 과정을 언급하며 의미한다. 혼성화 반응은 민감하며 선택적이다. 시험관 내에서, 혼성화의 특이성(예, 엄격함)은 예를 들어, 혼성화 전 및 혼성화 용액 중의 염 또는 포름아미드의 농도에 의하여, 그리고 혼성화 온도에 의하여 조절되며; 이러한 방법은 본 분야에 공지이다. 특히, 엄격함은 염 농도를 감소시키거나, 포름아미드 농도를 증가시키거나, 또는 혼성화 온도를 올림으로써 증가된다.

예를 들어, 아주 엄격한 조건은 37℃ 내지 42℃, 약 50% 포름아미드에서 발생할 수 있다. 감소된 엄격한 조건은 30℃ 내지 35℃, 약 35% 내지 25% 포름아미드에서 발생할 수 있다. 혼성화를 위한 엄격한 조건의 예는 Sambrook, J., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.에서 제공된다. 엄격한 혼성화 조건의 또 다른 예는 50℃ 또는 70℃에서 12 ~ 16 시간 동안 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA 후 세척, 또는 70℃, 1×SSC에서 또는 50℃, 1×SSC에서 50% 포름아미드로 혼성화한 후, 70℃에서 0.3×SSC로 세척, 또는 70℃에서 4×SSC, 또는 50℃에서 4×SSC, 50% 포름아미드로 혼성화한 후, 67℃에서 1×SSC로 세척하는 것을 포함한다. 혼성화 온도는 하이브리드의 Tm(융점)보다 약 5 ~ 10℃ 낮으며, 19개 내지 49개 염기 쌍 길이의 하이브리드에 대한 Tm은 하기의 계산식으로 결정된다: Tm℃ = 81.5 + 16.6(log₁₀[Na+]) + 0.41 (% G+C)-(600/N)(여기에서 N은 하이브리드의 염기 수를 나타내며, [Na+]는 혼성화 완충액의 나트륨 이온의 농도를 나타낸다).

본 명세서에 기재된 핵산 서열은 달리 지시하지 않는 한, 5'에서 3'방향으로 기재하였다. 본원에 사용되는 "핵산"이라는 용어는 DNA 또는 RNA, 또는 DNA(아데닌"A," 시토신 "C," 구아닌 "G," 티민 "T") 또는 RNA(아데닌 "A," 시토신 "C," 구아닌 "G," 우라실 "U")에 존재하는 퓨린 또는 피리미딘 염기를 포함하는 이들의 변형된 형태를 언급한다. 비록 "T" 염기는 RNA에 자연적으로 존재할 수 없지만, 본원에서 제공된 간섭 RNA는 특별히 3' 말단에서 "T" 염기를 포함할 수 있다. "핵산"은 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"의 용어를 포함하며, 단일 가닥 분자 또는 이중 가닥 분자를 언급하는 것일 수 있다. 이중 가닥 분자는 A와 T 염기, C와 G 염기 및 A와 U 염기 사이에서 왓슨-크릭 염기 쌍에 의해 형성된다. 이중 가닥 분자의 한 가닥은 서로에게 부분적이고, 실질적이거나 완전한 상보성일 수 있으며, 염기 서열 상보성의 본질 및 정도에 의해 좌우되는 결합의 힘으로 듀플렉스 하이브리드(duplex hybrid)를 형성할 것이다.

mRNA 서열은 상응하는 DNA 서열의 서열에서 쉽게 추론된다. 예를 들면, 서열 번호 1은 TACE를 위한 mRNA에 상응하는 DNA의 센스 가닥 서열을 제공한다. mRNA 서열은 "T" 염기가 "U" 염기로 대체된 DNA 센스 가닥과 동일하다. 그러므로, TACE의 mRNA 서열은 서열 번호 1로부터 알 수 있으며, TNFR1의 mRNA는 서열 번호 2로부터 알 수 있다.

RNA 간섭(RNAi)은 이중 가닥 RNA(dsRNA)가 유전자 발현을 침묵시키기 위하여 이용되는 과정이다. 이론적인 결부없이, RNAi는 RNaseⅢ-유사 효소인 다이서(dicer)에 의해 긴 dsRNA가 작은 간섭 RNA(siRNA)로 절단되는 것으로 시작된다. siRNA는 대부분 약 19개 내지 28개 뉴클레오티드, 또는 20개 내지 25개 뉴클레오티드, 또는 21개 내지 22개 뉴클레오티드 길이의 dsRNA이며, 종종 2-뉴클레오티드 3' 오버행(overhang), 및 5' 포스페이트 및 3' 하이드록실 말단을 포함한다. siRNA의 한 가닥은 RISC(RNA-유도 침묵 복합체)로 잘 알려진 리보핵단백질 복합체로 도입된다. RISC는 도입되는 siRNA 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 mRNA 분자를 동정한 후, 이러한 표적 mRNA를 절단하거나 이들의 번역을 억제하기 위하여 이러한 siRNA 가닥을 이용한다. 그러므로, RISC로 도입되는 siRNA 가닥은 가이드(guide) 가닥 또는 안티센스 가닥으로 알려져 있다. 패신져(passenger) 가닥 또는 센스 가닥으로 알려진 다른 siRNA 가닥은 siRNA로부터 제거되며, 표적 mRNA와 적어도 부분적으로 동일성을 갖는다. 당업자들은 이론상, siRNA의 두 가닥이 RISC에 도입될 수 있으며, 가이드 가닥으로서도 작용할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 그러나 siRNA 설계(예를 들면, 목적하는 가이드 가닥의 5' 말단에서 siRNA 듀플렉스 안전성 감소)는 RISC로의 목적하는 가이드 가닥의 도입을 선호할 수 있다.

적어도 부분적으로 가이드 가닥에 상보적인 서열을 갖는 mRNA의 RISC 매개의 절단은 mRNA 및 이 mRNA에 의해 코딩되는 상응하는 단백질의 안정된 상태 수준의 감소를 가져온다. 다른 방법으로, RISC는 또한 표적 mRNA의 절단 없이 번역의 저지를 통하여 상응하는 단백질의 발현을 감소시킬 수 있다. 또한 다른 RNA 분자 및 RNA-유사 분자는 RISC와 상호작용하고, 유전자의 발현을 침묵시킬 수 있다. RISC와 상호작용할 수 있는 다른 RNA 분자의 예는 shRNA(짧은 헤어핀 RNA), 단일 가닥 siRNA, miRNA(마이크로RNA) 및 다이서-기질 27-mer 듀플렉스를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "siRNA"라는 용어는 달리 언급이 없으면, 이중 가닥 간섭 RNA를 의미한다. RISC와 상호작용할 수 있는 RNA-유사 분자의 예는 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드, 및/또는 하나 이상의 비-포스포디에스테르 결합을 포함하는 RNA 분자를 포함한다. 본 발명의 목적을 위하여, RISC와 상호작용할 수 있으며 유전자 발현에 있어서 RISC 매개의 변화에 관여하는 모든 RNA 또는 RNA-유사 분자를 "간섭 RNA"라고 칭하였다. 그러므로, siRNA, shRNA, miRNA 및 다이서-기질 27-mer 듀플렉스는 "간섭 RNA"의 부분집합이다.

본 발명의 구체예의 간섭 RNA는 표적 mRNA의 절단을 위하여, 촉매적 방식으로 작용하며, 즉 간섭 RNA는 근사화학량론(Substoichiometric)의 양으로 표적 mRNA의 억제에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 절단 조건하에 치료 효과를 제공하기 위해서는, 안티센스 요법과 비교할 경우, 상당히 적은 간섭 RNA가 요구된다.

본 발명은 TNFα 세포 표면 수용체 TNF 수용체-1 (TNFR1) 또는 TNFα 전환 효소 (TACE/ADAM17, 본원에서 "TACE"로 명명)의 발현을 억제하는 간섭 RNA의 용도에 관한 것이며, 이를 억제하면 종양 괴사 인자 α (TNFα) 활성이 감소된다. TNFα가 그의 세포 표면 수용체인 TNF 수용체-1 (TNFR1)에 결합하면 세포 자멸사 및 염증을 포함한 다양한 세포 반응에 영향을 미치는 신호 캐스케이드가 활성화된다. TNFα 그 자체는 먼저 불활성인 막-결합 전구체로서 발현된다. 세포 표면으로부터 TNFα의 활성화 형태를 방출하려면 '디스인테그린 및 메탈로프로테아제' (ADAM) 패밀리의 구성원인 TNFα 전환 효소 (TACE/ADAM17)에 의한 전구체의 단백질 분해 처리가 요구된다.

본 발명에 따라서, TNFR1 mRNA, TACE mRNA, 또는 TNFR1 및 TACE mRNA 둘의 발현을 억제하면 TNFα의 활성이 효과적으로 감소된다. 또한, 외인적으로 제공되거나 또는 내인적으로 발현되는 본원에 기술된 간섭 RNA는 TNFR1 mRNA 또는 TACE mRNA를 침묵시키는 데 특히 효율적이다.

종양 괴사 인자 α 전환 효소 mRNA ( TACE / ADAM17 ): GenBank 데이터베이스는 수탁 번호 NM_003183으로서 "서열 목록"에 서열 번호 1로 제공된 TACE에 대한 DNA 서열을 제공한다. 서열 번호 1은 TACE를 코딩하는 mRNA에 상응하는 DNA의 센스 가닥 서열을 제공한다("U" 염기를 위한 "T" 염기 제외). TACE에 대한 코딩 서열은 뉴클레오티드 184 - 2658에서의 것이다.

상기 개시된 TACE mRNA 서열의 등가물은 이의 대안적인 스플라이스 형태, 대립 유전자 형태, 동질 효소 또는 동족체이다. 동족체는 서열 번호 1과 상동인 또다른 포유동물 종의 종양 괴사 인자 α 전환 효소 mRNA이다(예를 들어, 오쏘로그).

종양 괴사 인자 수용체-1 mRNA ( TNFR1 ): GenBank 데이터베이스는 수탁 번호 NM_001065로서 "서열 목록"에 서열 번호 2로 제공된 TNFR1에 대한 DNA 서열을 제공한다. 서열 번호 2는 TNFR1을 코딩하는 mRNA에 상응하는 DNA의 센스 가닥 서열을 제공한다("U" 염기를 위한 "T" 염기 제외). TNFR1에 대한 코딩 서열은 뉴클레오티드 282 - 1649에서의 것이다.

상기 개시된 TNFR1 mRNA 서열의 등가물은 이의 대안적인 스플라이스 형태, 대립 유전자 형태, 동질 효소 또는 동족체이다. 동족체는 서열 번호 2와 상동인 또다른 포유동물 종의 종양 괴사 인자 수용체-1 mRNA이다(예를 들어, 오쏘로그).

mRNA 발현의 약화: 본 명세서에서 이용된 구문 "mRNA 발현의 약화"는 mRNA의 절단 또는 번역의 직접적인 억제를 통하여 표적 mRNA가 단백질로 번역되는 것을 감소시키는 간섭 RNA(예, siRNA)의 양을 발현시키거나 투여하는 것을 의미한다. 표적 mRNA 또는 상응 단백질의 발현 감소는 보통 "녹-다운(knock-down)"이라 언급되며, 비-표적 대조군 RNA(예, 비-표적 대조군 siRNA)를 투여하거나 발현시킨 이후 존재하는 수준과 비교하여 기록된다. 본 발명의 구체적인 예에서는 50% 내지 100%를 포함하는 양의 발현의 녹-다운이 고려되었다. 그러나 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 상기와 같은 녹-다운 수준이 필수적인 것은 아니다. 일 구체예에서, TACE mRNA 또는 TNFR1 mRNA를 표적으로 하는 단일 간섭 RNA가 투여된다. 다른 구체예에서는, TACE mRNA 또는 TNFR1 mRNA를 표적으로 하는 둘 이상의 간섭 RNA가 투여된다. 또다른 구체예에서, 오버래핑 효과를 갖도록 하기 위하여 TACE mRNA 또는 TNFR1 mRNA 각각을 표적으로 하는 간섭 RNA는 배합되거나 시간 간격을 두고 투여된다.

녹-다운은 주로 qPCR(정량적 연쇄중합효소반응) 증폭을 이용하여 mRNA 수준을 측정하거나, 웨스턴 블롯 또는 ELISA(효소-결합 면역 측정법)로 단백질 수준을 측정하여 평가된다. 단백질 수준 분석은 번역 억제뿐만 아니라 mRNA 절단의 평가도 제공한다. 더 나아가 녹-다운을 측정하는 기술은 RNA 용액 혼성화, 뉴클레아제 보호, 노던 혼성화, 마이크로어레이를 통한 유전자 발현 관찰, 항체 결합, 방사선 면역 검정법 및 형광 활성화된 세포 분석을 포함한다.

또한, TACE 또는 TNFR1의 억제는 시험관 내에서 예를 들면, 개시된 TACE- 또는 TNFR1-간섭 RNA의 형질감염 후 인간 각막 상피 세포에서 표적 mRNA 수준 또는 표적 단백질 수준을 평가하여 결정될 수 있다.

TACE mRNA 발현 또는 TNFR1 mRNA 발현의 억제에 의한 TNFα의 억제는 안구 건조증, 알러지성 결막염, 안구 염증, 피부염, 비염, 또는 천식에 관련된 증후의 개선과 같은 TNFα-관련 증상 증후의 개선의 관찰에 의해 인간 또는 포유 동물에서 추론된다. 예를 들어, 안구 건조증 증후, 부종, 소양증, 염증 또는 환경 변화에 대한 내성 중 임의의 것의 개선은 TNFα 활성의 억제를 나타내는 것이다.

간섭 RNA: 본 발명의 일 구체예에서, 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 가지며, 센스 및 안티센스 가닥은 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 지니며, 이 안티센스 가닥은 TACE mRNA 또는 TNFR1 mRNA의 표적 서열에 대하여 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 포함하며, 센스 가닥은 각각 TACE mRNA 또는 TNFR1 mRNA의 표적 서열을 갖는 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 동일성의 영역을 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 간섭 RNA는 mRNA내에서 상응하는 표적 서열 3' 말단의 끝에서 두번째 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개 뉴클레오티드와 퍼센트의 상보성 또는 동일성 갖는 적어도 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 인접한 뉴클레오티드 영역을 포함한다.

간섭 RNA의 각 가닥의 길이는 19개 내지 49개의 뉴클레오티드를 포함하며, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 또는 49개 뉴클레오티드의 길이를 포함할 수 있다.

siRNA의 안티센스 가닥은 안티센스 가닥이 RISC에 도입되는 점에서 siRNA의 활성적인 안내제(guiding agent)이며, 이에 따라 RISC가 절단 또는 번역 저지를 위하여 안티센스 siRNA 가닥에 적어도 부분적인 상보성을 갖는 표적 mRNA를 동정하게 한다.

본 발명의 구체예에서, 표적 mRNA 서열 내의 간섭 RNA 표적 서열(예를 들어, siRNA 표적 서열)은 이용가능한 설계 도구를 이용하여 선택된다. 그 다음, TACE 또는 TNFR1 표적 서열에 상응하는 간섭 RNA는 표적 mRNA를 발현하는 세포를 형질 감염시킨 후 상기 기술된 녹다운 평가로 조사된다.

siRNA의 표적 서열을 선택하는 기술은 록펠레 대학의 웹 싸이트에서 이용가능한 Tuschl 등("The siRNA User Guide" revised May 6, 2004)의 방법; Ambion 웹 싸이트, Ambion Inc.에서 이용가능한 Technical Bulletin #506, "siRNA Design Guidelines"; 및 다른 웹-기초의 설계 도구 예를 들면, Invitrogen, Dharmacon, Integrated DNA Technologies, Genscript, 또는 Proligo 웹 싸이트에 의해 제공된다. 초기 조사 기준은 G/C 함량이 35% ~ 55%를 포함하며, siRNA의 길이는 19개 내지 27개 뉴클레오티드인 것을 포함할 수 있다. 표적 서열은 코딩 부분 또는 mRNA의 5' 또는 3' 미번역 영역에 위치할 수 있다.

TACE mRNA를 위한 19-뉴클레오티드 DNA 표적 서열의 일 구체예는 서열번호 1의 뉴클레오티드 297 내지 315에 존재한다:

본 발명의 siRNA는 서열번호 3의 상응하는 mRNA 서열을 표적으로 하고, 21-뉴클레오티드 가닥 및 3' 오버행된 2-뉴클레오티드 가닥을 갖는다:

각각의 "N" 잔기는 임의의 뉴클레오티드(A, C, G, U, T) 또는 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 3' 말단은 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 포함하는 많은 수의 "N" 잔기를 가질 수 있다. 다른 가닥에서 "N" 잔기는 같은 잔기(예를 들어, UU, AA, CC, GG 또는 TT)이거나, 다를 수 있다(예를 들어, AC, AG, AU, CA, CG, CU, GA, GC, GU, UA, UC 또는 UG). 3' 오버행은 같을 수도 있고 다를 수도 있다. 한 구체예에서는, 양쪽 가닥 모두 3'UU 오버행을 갖는다.

본 발명의 siRNA는 서열번호 3의 상응하는 mRNA 서열을 표적으로 하고, 각각의 가닥에서 21-뉴클레오티드 가닥 및 3'UU 오버행을 갖는다:

또한, 간섭 RNA는 뉴클레오티드의 5'오버행을 갖거나 블런트 말단(blunt end)을 가질 수 있다. 본 발명의 siRNA는 서열번호 3의 상응하는 mRNA 서열을 표적으로 하고, 19-뉴클레오티드 및 블런트 말단을 갖는다:

이중-가닥 간섭 RNA(예, siRNA)의 가닥은 헤어핀 또는 스템-루프 구조(예, shRNA)를 형성하기 위하여 연결될 수 있다. 본 발명의 shRNA는 서열번호 3의 상응하는 mRNA 서열을 표적으로 하고, 19 bp 이중 가닥 스템 영역 및 3'UU 오버행을 갖는다:

N은 뉴클레오티드 A, T, C, G, U 또는 당업자들에게 알려진 변형된 형태이다. 루프에서 뉴클레오티드 N의 수는 3 내지 23, 5 내지 15, 7 내지 13, 4 내지 9 또는 9 내지 11 사이의 수를 포함하거나, 또는 뉴클레오티드 N의 수는 9이다. 루프에서 뉴클레오티드 중 일부는 루프에서 다른 뉴클레오티드와의 염기쌍 상호작용을 수반할 수 있다. 루프의 형성을 위해 이용될 수 있는 올리고뉴클레오티드 서열의 예는 5'-UUCAAGAGA-3'(Brummelkamp, T.R. et al. (2002) Science 296: 550) 및 5'-UUUGUGUAG-3'(Castanotto, D. et al. (2002) RNA 8:1454)를 포함한다. 생성된 단일 사슬 올리고뉴클레오티드가 RNAi 기작과 상호작용 가능한 이중 가닥 영역을 포함하는 스템-루프 또는 헤어핀 구조를 형성하는 것은 당업자들에 의해 인지될 수 있다.

상기 동정된 siRNA 표적 서열은 다이서-기질 27-mer 듀플렉스의 설계를 용이하게 하기 위하여, 3' 말단에서 연장될 수 있다. TACE DNA 서열(서열 번호 1)에서 6 뉴클레오티드로 동정된 19-뉴클레오티드 DNA 표적 서열(서열번호 3)의 연장으로 서열번호 1의 뉴클레오티드 297 내지 321에 존재하는 25-뉴클레오티드 DNA 표적 서열이 산출된다:

본 발명의 다이서-기질 27-mer 듀플렉스는 서열번호 11의 상응하는 mRNA 서열을 표적으로 한다:

센스 가닥의 3' 말단에서 두 개의 뉴클레오티드(예를 들어, 서열번호 12의 CU 뉴클레오티드)는 처리를 증진시키기 위하여 데옥시뉴클레오티드일 수 있다. 본 명세서에서 제공된 것과 같은 19개 내지 21개 뉴클레오티드 표적 서열 유래의 다이서-기질 27-mer의 설계는 IDT(Integrated DNA Technologies) 웹 싸이트 및 Kim, D.-H. et al, (February, 2005) Nature Biotechnology 23:2;222-226에 의해 검토되었다.

간섭 RNA가 화학적으로 합성되어 생산되는 경우, 한 가닥 또는 두 가닥 모두(존재할 경우)의 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서의 인산화는 siRNA 효능 및 RISC 복합체의 결합 특이성을 증진시킬 수 있으나, 인산화는 세포 내적으로 일어날 수 있으므로, 필요한 것은 아니다.

표 1은 상기 나타낸 바와 같은 방식으로 본 발명의 siRNA가 설계된 서열 번호 1의 TACE DNA 표적 서열의 예를 열거한 것이다. TACE는 상기 나타낸 바와 같은 종양 괴사 인자 α 전환 효소를 코딩한다.

표 1. siRNA를 위한 TACE 표적 서열

표 2는 상기 나타낸 바와 같은 방식으로 본 발명의 siRNA가 설계된 서열 번호 2의 TNFR1 DNA 표적 서열의 예를 열거한 것이다. TNFR1은 상기 나타낸 바와 같은 종양 괴사 인자 α 수용체-1을 코딩한다.

표 2. siRNA를 위한 TNFR1 표적 서열

상기 예에서 개시된 바와 같이, 본 분야의 숙련자는 표 1 또는 2에 제공된 표적 서열 정보를 사용하여, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에서 서열 위치를 참조하고, 각각 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 상보적이거나 거의 상보적인 뉴클레오티드를 첨가하거나 제거하여, 표에 제공된 서열보다 더 짧거나 긴 길이를 갖는 간섭 RNA를 설계할 수 있다.

siRNA 및 다른 형태의 간섭 RNA로 가이드된 표적 RNA의 절단 반응은 높은 서열 특이성이 있다. 일반적으로, 표적 mRNA의 부분 서열과 동일한 센스 뉴클레오티드 가닥 및 표적 mRNA에 정확하게 상보적인 안티센스 뉴클레오티드 가닥을 포함하는 siRNA는 본 명세서에서 언급한 mRNA의 억제를 위한 siRNA 구체예이다. 그러나 안티센스 siRNA 가닥 및 표적 mRNA 사이 또는 안티센스 siRNA 가닥 및 센스 siRNA 가닥의 사이의 100% 서열 상보성은 본 발명을 실시하는데 요구되지 않는다. 그러므로, 예를 들면, 본 발명은 유전적 돌연변이, 균주 다형성 또는 진화적인 부조화에서 기인한 것으로 여겨지는 서열 변화를 허용한다.

본 발명의 일 구체예에서, siRNA의 안티센스 가닥은 표적 mRNA와 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성을 갖는다. 본 명세서에서 사용되는 "거의-완벽한"이란 siRNA의 안티센스 가닥이 표적 mRNA의 적어도 한 부분에 "실질적으로 상보적인" 것을 의미하며, siRNA의 센스 가닥이 이에 "실질적으로 동일한" 것을 의미한다. 당업자들에게 알려진 "동일성"은 서열 사이의 뉴클레오티드의 순서 및 동일성을 매칭하여 결정된 뉴클레오티드 서열 사이에서의 서열 관련 정도이다. 일 구체예에서, 표적 mRNA서열에 80% 및 80%에서 100%까지 상보성을 갖는, 예를 들어 85%, 90% 또는 95% 상보성을 갖는 siRNA의 안티센스 가닥이 거의 완벽한 상보성으로 간주되며, 본 발명에 이용될 수 있다. "완벽한" 인접 상보성은 근접 염기 쌍의 표준 왓슨-크릭 염기 쌍이다. "적어도 거의 완벽한" 인접 상보성은 본 명세서에서 이용된 "완벽한" 상보성을 포함한다. 동일성 또는 상보성을 결정하기 위한 컴퓨터 방법은 뉴클레오티드 서열의 최상의 매칭 정도를 동정하기 위하여 설계되었으며, 예로는 BLASTN(Altschul, S.F., et al. (1990) J. MoI. Biol. 215:403-410)이 있다.

표적 mRNA(센스 가닥)와 siRNA의 한 가닥(센스 가닥) 사이의 관계는 동일성의 관계이다. 또한 siRNA의 센스 가닥은 존재한다면 패신져 가닥이라고 불린다. 표적 mRNA(센스 가닥) 및 siRNA의 다른 가닥(안티센스 가닥) 사이의 관계는 상보성의 관계이다. 또한 siRNA의 안티센스 가닥은 가이드 가닥이라고도 불린다.

5'에서 3'방향으로 기재된 핵산 서열에서 끝에서 두번째 염기는 마지막 염기의 옆의 염기를, 즉, 3' 염기 옆의 염기를 의미한다. 5'에서 3'방향으로 기재된 핵산 서열의 끝에서 두번째 13 개 염기는 3' 염기 옆의 마지막 13 개 염기의 서열을 의미하며, 3' 염기는 포함하지 않는다. 비슷하게 5'에서 3'방향으로 기재된 핵산 서열의 끝에서 두번째 14, 15, 16, 17 또는 18 개 염기는 각각 3' 염기 옆의 서열의 마지막 14, 15, 16, 17 또는 18 개 염기를 의미하며, 3' 염기는 포함하지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서, 인접 뉴클레오티드의 영역은 각 서열 식별자에 의해 확인된 서열에 상응하는 mRNA의 3' 말단의 마지막에서 두번째 13개 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성을 갖거나, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개 인접 뉴클레오티드의 영역이다.

본 발명의 일 구체예에서, 인접 뉴클레오티드의 영역은 각 서열 식별자에 의해 확인된 서열에 상응하는 mRNA의 3' 말단의 마지막에서 두번째 14개 뉴클레오티드와 적어도 85% 서열 상보성을 갖거나, 또는 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 적어도 14개 인접 뉴클레오티드의 영역이다. 두 개의 뉴클레오티드 치환(예, 12/14 = 86% 서열 동일성/상보성)은 상기 구에 포함된다.

본 발명의 다른 구체예에서, 인접 뉴클레오티드의 영역은 각 서열 식별자의 서열에 상응하는 mRNA의 3' 말단의 마지막에서 두번째 14개 뉴클레오티드와 적어도 80% 서열 상보성을 갖거나, 또는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 적어도 15, 16, 17, 또는 18개 인접 뉴클레오티드의 영역이다. 세 개의 뉴클레오티드 치환은 상기 구에 포함된다.

서열번호 1 또는 서열번호 2에 상응하는 mRNA에서 표적 서열은 mRNA의 코딩 영역 및 mRNA의 5' 또는 3'의 미번역 영역일 수 있다.

이중 가닥 간섭 RNA의 한 가닥 또는 두 가닥 모두는 1개 내지 6개 뉴클레오티드의 3' 오버행을 가질 수 있으며, 이는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 오버행의 뉴클레오티드는 염기 쌍을 이루지 않는다. 본 발명의 일구체예에서, 간섭 RNA는 TT 또는 UU의 3' 오버행을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체적인 예에서, 간섭 RNA는 적어도 하나의 블런트 말단을 포함한다. 말단은 대부분 5' 포스페이트기 또는 3' 하이드록실기를 갖는다. 다른 구체적인 예에서 안티센스 가닥은 5' 포스페이트기를 가지며, 센스 가닥은 5' 하이드록실기를 갖는다. 또 다른 구체적인 예에서, 말단은 다른 분자 또는 작용기의 공유결합 추가에 의해 추가로 변형된다.

이중 가닥 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 상기 언급한 두개의 단일 가닥의 듀플렉스 형성일 수 있거나, 또는 상보성 영역이 염기 쌍을 이루고 단일 가닥 형성을 위한 헤어핀 루프에 의한 공유결합으로 연결된 단일 분자일 수도 있다. 헤어핀은 두개 각각의 염기 쌍의 RNA 분자의 간섭 RNA 형성하기 위하여 다이서라는 단백질에 의해 세포 내적으로 절단된다고 여겨진다.

간섭 RNA는 하나 이상의 뉴클레오티드의 첨가, 결실, 치환, 또는 변형에 의해 자연적으로 발생하는 RNA와 다를 수 있다. 뉴클레오티드가 아닌 물질은 5' 말단, 3' 말단 또는 내부에서 간섭 RNA에 결합할 수 있다. 이러한 변형은 주로 간섭 RNA의 뉴클레아제 저항을 증가시키고, 세포 흡수를 증진시키며, 세포 표적을 증진시키고, 간섭 RNA 추적을 원조하고, 안정성을 개선시키거나 인터페론 경로의 활성화 가능성을 감소시키기 위하여 설계된다. 예를 들어, 간섭 RNA는 오버행의 말단에 퓨린 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 피롤리딘 링커(linker)의 수단에 의한 siRNA 분자의 센스 가닥 3' 말단에서 콜레스테롤의 접합은 또한, siRNA에 안정성을 제공한다.

다른 변형은 예를 들어, 3' 말단 비오틴 분자, 세포를 관통하는 특성을 지닌 것으로 알려진 펩티드, 나노 입자, 펩티도미메틱(peptidomimetic), 형광 염료 또는 덴드리머(dendrimer)를 포함한다.

본 발명의 구체예에서 뉴클레오티드는 그들의 염기 부분, 그들의 당 부분 또는 분자의 포스페이트 부분 및 작용에서 변형될 수 있다. 변형은 예를 들어, 알킬, 알콕시, 아미노, 데아자, 할로, 하이드록실, 티올기 또는 이들의 조합으로의 치환을 포함한다. 뉴클레오티드는 이를 테면 리보뉴클레오티드를 데옥시뉴클레오티드로 치환하는 것과 같이 더 나은 안정성을 갖거나, 2' OH 기를 2' 아미노기, 2'O-메틸기, 2' 메톡시에틸기 또는 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿쥐(bridge)로 치환하는 것과 같이 당 변형을 갖는 유사체로 치환될 수 있다. 뉴클레오티드의 퓨린 또는 피리미딘 유사체의 예로는 크산틴, 하이포크산틴, 아자퓨린, 메틸티오아데닌, 7-데아자-아데노신 및, O- 및 N- 변형 뉴클레오티드를 포함한다. 뉴클레오티드의 포스페이트 기는 포스페이트 기의 하나 이상의 산소를 질소 또는 황(포스포로티오에이트)으로 치환하여 변형될 수 있다. 변형은 예를 들면, 기능 증진, 안정성 또는 투과성의 증진, 또는 편재화 또는 표적을 지시하는데 유용하다.

서열번호 1 또는 서열번호 2의 부분에 상보적이지 않은 간섭 RNA 안티센스 가닥의 영역 또는 영역들이 있을 수 있다. 비-상보적인 영역은 3', 5' 또는 상보적 영역의 양쪽 말단 부분 또는 두 개의 상보적인 영역의 사이에 있을 수 있다.

간섭 RNA는 화학적 합성, 시험관 내의 전사, 또는 다이서 또는 유사한 활성을 갖는 다른 적당한 뉴클레아제에 의한 긴 이중 가닥 RNA의 절단으로 외생적으로 생성될 수 있다. 전통적인 DNA/RNA 합성기를 이용하여 보호된 리보뉴클레오시드 포스포라미디트로부터 생성된 화학적으로 합성된 간섭 RNA는 Ambion(Austin, TX), Invitrogen(Carlsbad, CA) 또는 다마콘(Lafayette, CO)과 같은 상업적 공급자로부터 수득될 수 있다. 간섭 RNA는 예를 들면, 용매, 또는 레진으로의 추출, 침전, 전기영동, 크로마토그래피 또는 이들의 조합으로 정제될 수 있다. 대안적으로, 샘플 처리 과정에서 기인하는 손실을 피하기 위하여, 임의의 정제가 있다 해도 거의 없이 간섭 RNA가 사용될 수 있다.

또한, 간섭 RNA는 플라스미드 또는 바이러스 발현 벡터 또는 최소 발현 카세트로부터, 예를 들면, 하나 이상의 프로모터 및 간섭 RNA를 위한 적절한 주형(들)을 포함하는 PCR 산출 단편으로부터 내생적으로 발현될 수 있다. shRNA를 위하여, 상업적으로 이용 가능한 플라스미드-기초의 발현 벡터의 예는 pSilencer 시리즈(Ambion, Austin, TX) 및 pCpG-siRNA(Invivogen, San Diego, CA)의 구성원을 포함한다. 간섭 RNA의 발현을 위한 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 렌티바이러스(예, HIV, FIV 및 EIAV) 및 허피스 바이러스를 포함하는 다양한 바이러스로부터 유래될 수 있다. shRNA 발현을 위하여, 상업적으로 이용 가능한 바이러스 벡터의 예는 pSilencer adeno(Ambion, Austin, TX) 및 pLenti6/BLOCK-iT™-DEST(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 포함한다. 바이러스 벡터의 선택, 벡터로부터 간섭 RNA를 발현시키는 방법 및 바이러스 벡터를 이동시키는 방법은 당업계의 보통의 기술로 가능하다. PCR로 생성되는 shRNA 발현 카세트의 생산 키트의 예는 Silencer Express(Ambion, Austin, TX) 및 siXpress(Mirus, Madison, WT)를 포함한다. 제1 간섭 RNA는 제1 간섭 RNA를 발현할 수 있는 제1 발현 벡터로부터의 생체 내 발현을 통하여 투여될 수 있으며, 제2 간섭 RNA는 제2 간섭 RNA를 발현할 수 있는 제2 발현 벡터로부터 생체 내 발현을 통하여 투여될 수 있거나, 두 간섭 RNA는 두 간섭 RNA들을 발현할 수 있는 단일 발현 벡터로부터 생체 내 발현을 통하여 투여될 수 있다.

간섭 RNA는 본 분야의 숙련자에게 알려진 다양한 진핵세포 프로모터, 이를 테면 U6 또는 H1 프로모터와 같은 pol III 프로모터, 또는 사이토메갈로바이러스 프로모터와 같은 pol II 프로모터로부터 발현될 수 있다. 당업자들은 이러한 프로모터가 간섭 RNA의 발현 유도를 허용하도록 사용될 수 있는 것을 인지할 것이다.

생리적 조건하의 혼성화: 본 발명의 특정 구체예에서 간섭 RNA의 안티센스 가닥이 생체 내에서 RISC 복합체의 부분으로서 mRNA와 혼성화한다.

예를 들어, 아주 엄격한 조건은 37℃ 내지 42℃에서 약 50% 포름아미드로 발생할 수 있다. 감소된 엄격한 조건은 30℃ 내지 35℃에서 약 35% 내지 25% 포름아미드로 발생할 수 있다. 혼성화를 위한 엄격한 조건의 예는 Sambrook, J., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.에서 제공된다. 엄격한 혼성화 조건의 또 다른 예는 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 50℃ 또는 70℃에서 12 ~ 16 시간 동안 혼성화 후, 세척하거나, 또는 1× SSC, 70℃에서 또는 1× SSC, 50℃에서 50% 포름아미드로 혼성화한 후, 0.3× SSC로 70℃에서 세척하거나, 또는 4×SSC, 70℃에서 또는 4×SSC, 50℃ 에서 50% 포름아미드로 혼성화한 후, 1× SSC로 67℃에서 세척하는 것을 포함한다. 혼성화 온도는 하이브리드의 Tm(융점)보다 약 5 ~ 10℃ 낮으며, 19개 내지 49개 염기 쌍의 길이의 하이브리드의 Tm은 하기의 계산식으로 결정된다: Tm℃ = 81.5 + 16.6(log₁₀[Na+]) + 0.41 (% G+C)-(600/N)(여기에서 N은 하이브리드의 염기 수를 나타내며, [Na+]는 혼성화 완충액의 나트륨 이온의 농도를 나타낸다).

상술한 시험관 내에서의 혼성화 분석은 후보 siRNA 및 표적 사이에서의 결합이 특이성이 있는지를 예상하는 방법을 제공한다. 그러나, RISC 복합체의 경우에는, 표적의 특이적 절단은 시험관 내에서 혼성화를 위한 매우 엄격한 조건이 요구되지 않는 안티센스 가닥과 함께 발생할 수 있다.

단일 가닥 간섭 RNA: 상기에서 기술하였듯이, 간섭 RNA은 궁극적으로 단일 가닥으로 작용한다. 단일 가닥(ss) 간섭 RNA가 이중 가닥 siRNA보다 mRNA 스플라이싱에 더 작은 영향을 미치는 것이 관찰되었다. 그러므로, 본 발명의 구체예는 생리적 조건하에서 서열번호 1 또는 서열번호 2의 부분과 혼성화되고, 각각의 서열번호 1 또는 서열번호 2의 부분과 혼성화는 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 갖는 ss 간섭 RNA 투여를 제공한다. 표 1 또는 표 2의 ss 간섭 RNA는 상기 기술한 ds 간섭 RNA를 위하여, 19개 내지 49개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. ss 간섭 RNA는 5' 포스페이트를 갖거나 인시츄(in situ) 또는 생체 내에서 5' 위치에 인산화된다. "5' 인산화"란 용어는 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에서 당(예, 리보오스, 디옥시리보오스 또는 이들의 유사체)의 C5 하이드록실기에 에스테르 결합을 통하여 부착된 포스페이트기를 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 기술할 경우에 이용된다.

SS 간섭 RNA는 시험관 내 전사에 의해 또는 화학적으로 합성되며, ds 간섭 RNA를 위한 백터 또는 발현 카세트로부터 내생적으로 발현된다. 5' 포스페이트기는 키나아제를 통해 첨가될 수 있거나, 5' 포스페이트는 뉴클레아제에 의한 RNA의 절단의 결과일 수도 있다. 전달은 ds 간섭 RNA에서와 같다. 한 구체예에서, 말단이 보호되고, 뉴클레아제 저항 변형을 갖는 ss 간섭 RNA는 침묵을 위해서 투여된다. SS 간섭 RNA는 저장을 위해 건조되거나 수용액에 용해될 수 있다. 이 용액은 어닐링 또는 안정화를 억제하기 위하여, 완충액 또는 염을 포함할 수 있다.

헤어핀 간섭 RNA : 헤어핀 간섭 RNA는 스템-루프 또는 헤어핀 구조(예, shRNA)에서 간섭 RNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 모두를 포함하는 단일 분자(예, 단일 올리고뉴클레오티드 사슬)이다. 예를 들면, shRNA는 DNA 벡터로부터 발현될 수 있으며, 여기서 센스 간섭 RNA 가닥을 코딩하는 DNA 올리고뉴클레오티드는 짧은 스페이서에 의해 역 상보성 안티센스 간섭 RNA 가닥을 코딩하는 DNA 올리고뉴클레오티드에 연결된다. 선택된 발현 벡터를 위하여 필요하다면, 3' 말단의 T 및 제한 자리를 형성하는 뉴클레오티드가 첨가될 수 있다. 생성된 RNA 전사물은 스템-루프 구조를 형성하기 위하여 그 자신의 뒤에 접힌다.

투여 형태: 간섭 RNA는, 예를 들어, 에어로졸, 협측(buccal), 피부, 피부내, 흡입, 근육내, 비강내, 안구내, 폐내, 정맥내, 복막내, 비강, 안구, 경구, 귀, 비경구, 패치, 피하, 혀 밑, 국소적 또는 경피 투여를 통하여 전달될 수 있다.

투여는 눈주변, 결막, 테논낭하, 전방내, 유리체내, 안구내, 망막하, 결막하, 눈뒤, 소관내 또는 맥락막위 투여와 같은 안조직 투여에 의하여; 카테터 또는 망막 펠렛, 안구내 삽입, 좌약 또는, 다공성, 비다공성 또는 젤라틴 물질을 포함하는 임플란트와 같은 다른 대체 장치를 사용하여 눈에 직접 적용하여, 주사에 의하여; 국소적 점안액 또는 연고로; 또는 공막(공막을 통하여)에 인접하거나 눈 안에 이식되거나 쿨데삭(Cul-De-Sac)의 서방성 장치에 의해 눈에 직접 전달될 수 있다. 전방 주입은 각막에서 안구의 전방으로 하여 약제가 소주망으로 도달하도록 할 수 있다. 소관내 주사는 쉴렘관으로 방출하는 정맥 채취기 채널로 또는 쉴렘관을 통하여 이루어질 수 있다.

투여는 예를 들어, 국소 귀 점적약제 또는 연고, 귀 또는 귀 근처에 이식된 서방형 장치를 통하여 귀에 직접 이루어질 수 있다. 국부 투여는 귀 근육내, 고실내강 및 달팽이관내 주사 경로의 투여를 포함한다. 또한, 제제는 중이/내이 또는 근처 구조의 창막(window membrane)에 대한 간섭 RNA로 적신 젤폼(gelform) 또는 유사 흡수성 및 점착성 산물의 대체에 의해 내이로 투여될 수 있다.

투여는 예를 들어, 연무 제제에 의해, 그리고 예를 들어 흡입기 또는 분무기를 통한 흡입에 의하여 폐에 직접 이루어질 수 있다.

추가의 투여 모드는 숙련자에 의해 모두 제형화될 수 있는 정제, 환제 및 캡슐제를 포함한다.

대상: TNFα-관련 증상의 치료를 필요로 하거나 TNFα-관련 증상의 발생 위험이 있는 대상은 TNFα-관련 염증 증상 또는 안구 건조증을 갖거나 TNFα-관련 염증 증상 또는 안구 건조증 발생 위험이 있는 인간 또는 다른 포유 동물이다. TNFα-관련 염증 증상은 예를 들어, 본원에 개시된 TNFα의 바람직하지 않거나 부적절한 활성과 관련된 알러지성 결막염, 안구 염증, 피부염, 비염, 또는 천식을 포함한다.

TNFα-관련 증상과 연관된 안구 구조는 예를 들어 눈, 망막, 맥락막, 수정체, 각막, 소주망, 홍채, 시신경, 시신경 유두, 공막, 안구방, 유리체방, 모양체, 또는 후안부를 포함할 수 있다.

상기 질병과 연관된 안구 구조는 예를 들어, 내이, 중이, 외이, 중이강 또는 막, 달팽이 또는 귀인두관을 포함할 수 있다.

세기관지염 및 폐포염과 같은 상기 질병과 연관된 폐 구조는 코, 입, 인두, 후두, 기관지 튜브, 기관, 용골(우 및 좌 주기관지의 개방을 분리시키는 능선) 및 폐, 특히 폐 하부(lower lung)를 포함할 수 있다.

대상은 귀 세포, 폐 세포, 안구 세포, 세포 배양물, 기관 또는 생체 외 기관 또는 조직일 수도 있다.

제제 및 복용량: 약학적 제제는 물, 완충액, 식염수, 글리신, 히아루론산, 맨니톨 등과 같은 생리학적으로 허용되는 담체 매질과 배합된 본 발명의 간섭 RNA 또는 이의 염을 99 중량% 이하로 포함한다.

본 발명의 간섭 RNA는 용액, 현탁액 또는 에멀젼으로서 투여된다. 하기에서는 본 발명에 의해 구체화된 가능한 제제를 예시한다.

통상, 본 발명의 구체예의 간섭 RNA의 유효량은 100 pM 내지 1000 nM, 또는 1 nM 내지 100 nM, 또는 5 nM 내지 약 100 nM, 또는 약 10 nM의 표적 세포 표면의 세포 외 농도를 유발한다. 이 국소 농도를 달성하기 위하여 요구되는 투여량은 전달 방법, 전달 부위, 전달 부위와 표적 세포 또는 조직 사이의 세포층 수, 전달이 전신적인지 또는 국소적인지 등을 포함하는 매우 다양한 인자에 따라 다를 수 있다. 전달 부위에서의 농도는 표적 세포 또는 조직의 표면에서보다 상당히 더 높을 수 있다. 국소적 조성물은 하루에 1회 내지 4회, 표적 기관의 표면에 전달되거나 또는 숙련된 임상의의 관례적인 재량에 따라서 매일, 주마다, 격주마다, 달마다 또는 그 이상으로 전달 스케쥴을 연장할 수도 있다. 제제의 pH는 약 pH 4-9 또는 pH 4.5 내지 pH 7.4이다.

TACE mRNA 또는 TNFR1 mRNA에 대하여 지시된 간섭 RNA을 갖는 환자의 치료는 작용 기간의 연장에 의한 소 분자 치료의 혜택이 예상되며, 이에 의해 투여량 횟수는 감소될 것이고 환자의 순응은 나아질 것이다.

제제의 유효량은 예를 들면, 대상의 연령, 인종 및 성별, TNFα-관련 증상의 중증도, 표적 유전자 전사/단백질 전환율, 간섭 RNA 효능 및 간섭 RNA 안정성과 같은 인자에 의해 달라질 수 있다. 일 구체예에서, 간섭 RNA는 표적 기관에 국소적으로 전달되며 치료적 용량으로 TACE mRNA 또는 TNFR1 mRNA-함유 조직에 도달하고, 이에 의해 TNFα-관련 과정이 개선된다.

허용되는 담체 : 허용되는 담체로는 최대한 안구 염증이 없고, 필요하다면 적절한 보존 상태가 제공되고, 동일한 투여량에서 본 발명의 하나 이상의 간섭 RNA를 전달할 수 있는 담체를 말한다. 본 발명의 구체예에서 간섭 RNA의 투여에 허용되는 담체는 양이온성 지질-기제의 형질감염제 TransIT^®-TKO(Mirus Corporation, Madison, WI), LIPOFECTIN^®, 리포펙타민, OLIGOFECTAMINE™(Invitrogen, Carlsbad, CA) 또는 DHARMAFECT™(Dharmacon, Lafayette, CO); 폴리에틸렌이민과 같은 폴리양이온; Tat, 폴리아르기닌 또는 Penetratin(Antp 펩티드)과 같은 양이온 펩티드; 또는 리포좀을 포함한다. 리포좀은 표준 소낭-형성 지질 및 콜레스테롤과 같은 스테롤로부터 형성되며, 예를 들면, 내피 세포 표면 항원에 대하여 결합 친화도를 갖는 단일클론 항체와 같은 표적화 분자를 포함할 수 있다. 또한, 리포좀은 페길화 리포좀일 수 있다.

간섭 RNA는 용액 중에, 현탁액 중에, 또는 생분해성 또는 비-생분해성 전달 장치로 전달될 수 있다. 간섭 RNA는 단독으로 또는 정의된 공유 접합체의 성분으로서 전달될 수 있다. 또한, 간섭 RNA는 양이온의 지질, 양이온의 펩티드 또는 양이온의 폴리머와 복합체를 형성할 수 있거나; 단백질, 융합 단백질 또는 핵산 결합성질을 갖는 단백질 도메인(예, 프로타민)과 복합체를 형성할 수 있거나; 나노입자 중에 캡슐화될 수 있다. 조직- 또는 세포-특이적 전달은 항체 또는 항체 단편과 같은 적절한 표적화 부분을 포함하여 이루어질 수 있다.

눈, 귀, 또는 폐의 전달을 위하여, 간섭 RNA는 눈으로, 귀로, 또는 폐로 허용되는 보존제, 공용매, 계면활성제, 점성 증진제, 침투 증진제, 완충액, 염화나트륨 또는 물과 배합되어, 멸균된 수성 현탁액 또는 용액을 형성할 수 있다. 용액 제제는 생리적으로 허용되는 등장성 수성 완충액 중에 간섭 RNA를 용해시켜 제조될 수 있다. 또한, 용액은 억제제의 용해를 보조하기 위하여 허용되는 계면활성제를 포함할 수 있다. 하이드록시메틸 셀룰로오스, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등의 점성 형성제는 본 발명의 조성물에 첨가되어 화합물의 보유력을 증진시킬 수 있다.

멸균 연고 제제를 제조하기 위하여, 간섭 RNA는 미네랄 오일, 액체 라놀린 또는 백색 바셀린과 같은 적절한 비히클 중에서 보존제와 배합된다. 멸균 젤 제제는 간섭 RNA를, 예를 들면, 당업계에 공지된 방법에 따라 CARBOPOL^®-940(BF Goodrich, Charlotte, NC) 등의 배합물로부터 제조된 친수성 기제에 현탁함으로써 제조될 수 있다. VISCOAT^®(Alcon Laboratories, Inc., Fort Worth, TX)는 예를 들면, 안구내 주사에 이용될 수 있다. 본 발명의 다른 조성물은 대상 기관 또는 조직에서 간섭 RNA의 침투성이 작을 경우, 크레모포르(Cremophor) 및 TWEEN^® 80(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, Sigma Aldrich, St. Louis, MO)과 같은 침투 증진제를 포함할 수 있다.

키트 : 본 발명의 구체예에는 세포에서 본원에서 상술한 mRNA의 발현을 약화하는 시약을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 siRNA 또는 shRNA 발현 벡터를 포함한다. siRNA 및 비-바이러스 shRNA 발현 벡터를 위하여, 키트는 또한 형질감염 시약 또는 다른 적절한 전달 비히클을 포함할 수 있다. 바이러스 shRNA 발현 벡터를 위하여, 키트는 바이러스 벡터 및/또는 바이러스 벡터의 생산을 위해 필요한 성분(예, 바이러스 벡터 주형 및 패키지를 위한 추가적인 헬퍼 벡터를 포함하는 벡터뿐만 아니라 패키지된 세포주)을 포함할 수 있다. 또한 키트는 양성 및 음성 대조군 siRNA 또는 shRNA 발현 벡터(예, 비-표적화 대조군 siRNA 또는 관련없는 mRNA를 표적으로 하는 siRNA)를 포함할 수 있다. 또한 키트는 의도된 표적 유전자의 녹다운을 평가하는 시약을 포함할 수 있다(예, 웨스턴 블롯을 위하여 상응하는 단백질에 대한 표적 mRNA 및/또는 항체를 검출하기 위한 정량 PCR에 이용되는 프라이머 및 프로브). 대안적으로, 키트는 siRNA 서열 또는 shRNA 서열 및 사용설명서 및 시험관 내에서 전사에 의해 siRNA를 생산하거나 shRNA 발현 벡터를 작제하기 위하여 필요한 물질을 포함할 수 있다.

패키지된 배합물에서, 그것과 함께 철저한 유폐로 컨테이너 수단을 받아들이도록 사용되는 담체 수단 및 간섭 RNA 조성물과 허용되는 담체를 포함하는 제1 컨테이너 수단을 포함하는 키트 형태의 약제학적 배합물이 추가로 제공된다. 또한, 이러한 키트는 필요에 따라, 하나 이상의 다양한 상업적 약제학적 키트 성분, 예를 들면, 당업자들이 용이하게 알 수 있는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 추가의 컨테이너 등을 갖는 컨테이너를 포함할 수 있다. 또한, 투여되는 성분의 양, 투여 안내 및/또는 성분 혼합의 안내를 설명하는 사용 설명서가 삽입물 또는 라벨로서 키트에 포함될 수 있다.

예를 들어 인간 각막 상피 세포에서 내생적으로 TACE 또는 TNFR1 발현의 수준을 녹다운시키는 TACE- 또는 TNFR1-간섭 RNA의 능력은 시험관 내에서 다음과 같이 평가된다. 형질 전환된 인간 각막 상피 세포, 예를 들어, CEPI-17 세포주 (Offord et al. (1999) Invest Ophthalmol Vis ScL 40:1091-1101)를 KGM 각질 세포 배지 (Cambrex, East Rutherford, NJ) 중에서 형질 감염시키기 24 시간 전에 플레이팅하였다. 0.1 nM 내지 100 nM 범위의 TACE- 또는 TNFR1- 간섭 RNA 농도에서 제조자의 지시에 따라 DharmaFECT™ 1 (Dharmacon, Lafayette, CO)를 사용하여 형질 감염을 수행하였다. 비-표적화 대조군 간섭 RNA 및 라민 A/C 간섭 RNA (Dharmacon)를 대조군으로 사용하였다. 형질 감염 24 시간 후 예를 들어, 표적 부위를 포함하는 TAQMAN® 정방향 및 역방향 프라이머 및 프로브 세트 (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하는 qPCR로 표적 mRNA 수준을 평가하였다. 표적 단백질 수준은, 형질감염 약 72 시간 후(실제 시간은 단백질 전환율에 좌우됨), 예를 들어, 웨스턴 블랏으로 평가될 수 있다. 배양된 세포로부터의 RNA 및/또는 단백질 분리를 위한 표준 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 비-특이적인 기회, 표적 이탈 효과를 감소시키기 위하여, 가능한 가장 작은 TACE- 또는 TNFR1 간섭 RNA 농도가 표적 유전자 발현에서 원하는 수준의 녹다운을 생산하기 위하여 사용된다.

당업자들은 본 명세서에 비추어, 본원에 개시된 구체예의 명백한 변형이 본 발명의 의도 및 범위를 벗어나지 않고 만들어질 수 있다는 것을 식별할 수 있을 것이다. 본원에서 개시된 모든 구체예는 본 명세서에 비추어볼 경우, 과도한 실험 없이 만들어질 수 있으며 실행될 수 있다. 본 발명의 모든 범위는 명세서 및 이와 동등한 구체예로 준비되었다. 명세서는 본 발명의 본 발명에 주어진 권리를 보호하기 위한 전체 관점에서 과도하게 좁게 해석되지 않아야 한다.

본 발명의 특정 구체예를 나타내고 기술하였으나, 당업자는 수많은 변형체 및 대안적인 구체예를 만들 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 청구 범위 항목으로만 한정되는 것으로 의도된다.

본 발명은 그의 관점 또는 중요한 특성에서 벗어나는 일 없이 다른 특정한 형태로 구체화될 수 있다. 개시된 구체예는 제한하고자 하는 것이 아니며 모든 관점에서 단지 설명으로서 고려된다. 그러므로, 본 발명의 범위는 앞선 설명보다 이후 청구항에 의해 나타내어진다. 청구항의 의미 및 동일한 범위 이내로부터 발생한 청구항에 대한 모든 변화는 이들의 범위 내에 포함된다. 또한, 모두 공개된 문헌, 특허 및 본원에서 언급된 공보는 그들의 전체로서 본원에 참조로서 인용된다.

실시예

실시예 1

GTM -3 세포에서 TNFR1 을 특이적으로 침묵시키는 간섭 RNA

본 연구에서는 배양된 GTM-3 세포에서 내생적 TNFR1 발현의 수준을 녹다운시키기는 TNFR1 간섭 RNA의 능력을 시험하였다.

GTM-3 세포 (Pang, IJH., et al, 1994 Curr Eye Res. 13:51-63)의 형질감염은 표준 시험관 내 농도 (0.1 내지 10 nM)의 TNFR1 siRNA, siCONTROL RISC-부재 siRNA #1, 또는 siCONTROL 비-표적화 siRNA #2 (NTC2) 및 DHARMAFECT® #1 형질 감염 시약 (Dharmacon, Lafayette, CO)을 이용하여 수행하였다. 모든 siRNA를 1 X siRNA 완충액, 20 mM KCl 수용액, 6 mM HEPES(pH 7.5), 0.2 mM MgCl₂ 중에 용해시켰다. 대조군 샘플에는 siRNA의 부피가 동 부피의 1X siRNA 완충액으로 대체된 완충액 대조군 (-siRNA)을 포함시켰다. 항-TNFR1 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)를 사용하는 웨스턴 블롯을 수행하여, TNFR1 단백질 발현을 평가하였다. TNFR1 siRNA는 다음 표적에 대하여 특이성을 갖는 이중-가닥 간섭 RNA이다: siTNFR1 #1은 서열 번호 96이 유래된 서열 CAAAGGAACCUACUUGUAC (서열 번호 202)을 표적으로 하고; siTNFR1 #2는 서열 번호 97이 유래된 서열 GAGCUUGAAGGAACUACUA (서열 번호 203)을 표적으로 하고; siTNFR1 #3은 서열 번호 98이 유래된 서열 CACAGAGCCUAGACACUGA (서열 번호 204)을 표적으로 하고; siTNFR1 #4는 서열 번호 99가 유래된 서열 UCCAAGCUCUACUCCAUUG (서열 번호 205)를 표적으로 한다. 도 1의 데이터에 나타낸 바와 같이, siTNFR1 #1, siTNFR1 #2 및 siTNFR1 #3 siRNA는 대조군 siRNA와 비교하여 10nM 및 1nM 농도에서 TNFR1 단백질 발현을 상당히 감소시켰으나, 0.1 nM에서 감소된 효능을 나타내었다. siTNFR1 #2 및 siTNFR1 #3 siRNA가 특히 유용하였다. 또한, siTNFR1 #4 siRNA가 기대된 바와 같이 TNFR1 단백질 발현에서 농도 의존적 감소를 나타내었다.

SEQUENCE LISTING <110> Yanni, John M. Chatterton, Jon E. Senchyna, Diane Michelle Gamache, Daniel A. Miller, Steven T. <120> RNAi-Mediated Inhibition of Tumor Necrosis Factor Alpha-Related Conditions <130> 45263-P019WO <160> 205 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 3572 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 acctgcactt ctgggggcgt cgagcctggc ggtagaatct tcccagtagg cggcgcggga 60 gggaaaagag gattgagggg ctaggccggg cggatcccgt cctcccccga tgtgagcagt 120 tttccgaaac cccgtcaggc gaaggctgcc cagagaggtg gagtcggtag cggggccggg 180 aacatgaggc agtctctcct attcctgacc agcgtggttc ctttcgtgct ggcgccgcga 240 cctccggatg acccgggctt cggcccccac cagagactcg agaagcttga ttctttgctc 300 tcagactacg atattctctc tttatctaat atccagcagc attcggtaag aaaaagagat 360 ctacagactt caacacatgt agaaacacta ctaacttttt cagctttgaa aaggcatttt 420 aaattatacc tgacatcaag tactgaacgt ttttcacaaa atttcaaggt cgtggtggtg 480 gatggtaaaa acgaaagcga gtacactgta aaatggcagg acttcttcac tggacacgtg 540 gttggtgagc ctgactctag ggttctagcc cacataagag atgatgatgt tataatcaga 600 atcaacacag atggggccga atataacata gagccacttt ggagatttgt taatgatacc 660 aaagacaaaa 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caataagatg ttttcaaact gcagtaaaca atcaatctat 1560 aagaccattg aaagtaaggc ccaggagtgt tttcaagaac gcagcaataa agtttgtggg 1620 aactcgaggg tggatgaagg agaagagtgt gatcctggca tcatgtatct gaacaacgac 1680 acctgctgca acagcgactg cacgttgaag gaaggtgtcc agtgcagtga caggaacagt 1740 ccttgctgta aaaactgtca gtttgagact gcccagaaga agtgccagga ggcgattaat 1800 gctacttgca aaggcgtgtc ctactgcaca ggtaatagca gtgagtgccc gcctccagga 1860 aatgctgaag atgacactgt ttgcttggat cttggcaagt gtaaggatgg gaaatgcatc 1920 cctttctgcg agagggaaca gcagctggag tcctgtgcat gtaatgaaac tgacaactcc 1980 tgcaaggtgt gctgcaggga cctttctggc cgctgtgtgc cctatgtcga tgctgaacaa 2040 aagaacttat ttttgaggaa aggaaagccc tgtacagtag gattttgtga catgaatggc 2100 aaatgtgaga aacgagtaca ggatgtaatt gaacgatttt gggatttcat tgaccagctg 2160 agcatcaata cttttggaaa gtttttagca gacaacatcg ttgggtctgt cctggttttc 2220 tccttgatat tttggattcc tttcagcatt cttgtccatt gtgtggataa gaaattggat 2280 aaacagtatg aatctctgtc tctgtttcac cccagtaacg tcgaaatgct gagcagcatg 2340 gattctgcat cggttcgcat 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gcagggaaaa tatatatcta aatttagaaa tcatttgggt 3240 taatatggct cttcataatt ctaagactaa tgctctctag aaacctaacc acctacctta 3300 cagtgagggc tatacatggt agccagttga atttatggaa tctaccaact gtttagggcc 3360 ctgatttgct gggcagtttt tctgtatttt ataagtatct tcatgtatcc ctgttactga 3420 tagggataca tgctcttaga aaattcacta ttggctggga gtggtggctc atgcctgtaa 3480 tcccagcact tggagaggct gaggttgcgc cactacactc cagcctgggt gacagagtga 3540 gactctgcct caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 3572 <210> 2 <211> 2236 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gctgttgcaa cactgcctca ctcttcccct cccaccttct ctcccctcct ctctgcttta 60 attttctcag aattctctgg actgaggctc cagttctggc ctttggggtt caagatcact 120 gggaccaggc cgtgatctct atgcccgagt ctcaaccctc aactgtcacc ccaaggcact 180 tgggacgtcc tggacagacc gagtcccggg aagccccagc actgccgctg ccacactgcc 240 ctgagcccaa atgggggagt gagaggccat agctgtctgg catgggcctc tccaccgtgc 300 ctgacctgct gctgccactg gtgctcctgg agctgttggt gggaatatac ccctcagggg 360 ttattggact ggtccctcac ctaggggaca gggagaagag agatagtgtg tgtccccaag 420 gaaaatatat ccaccctcaa aataattcga tttgctgtac caagtgccac aaaggaacct 480 acttgtacaa tgactgtcca ggcccggggc aggatacgga ctgcagggag tgtgagagcg 540 gctccttcac cgcttcagaa aaccacctca gacactgcct cagctgctcc aaatgccgaa 600 aggaaatggg tcaggtggag atctcttctt gcacagtgga ccgggacacc gtgtgtggct 660 gcaggaagaa ccagtaccgg cattattgga gtgaaaacct tttccagtgc ttcaattgca 720 gcctctgcct caatgggacc gtgcacctct cctgccagga gaaacagaac accgtgtgca 780 cctgccatgc aggtttcttt ctaagagaaa acgagtgtgt ctcctgtagt aactgtaaga 840 aaagcctgga gtgcacgaag ttgtgcctac cccagattga gaatgttaag ggcactgagg 900 actcaggcac cacagtgctg ttgcccctgg tcattttctt tggtctttgc cttttatccc 960 tcctcttcat tggtttaatg tatcgctacc aacggtggaa gtccaagctc tactccattg 1020 tttgtgggaa atcgacacct gaaaaagagg gggagcttga aggaactact actaagcccc 1080 tggccccaaa cccaagcttc agtcccactc caggcttcac ccccaccctg ggcttcagtc 1140 ccgtgcccag ttccaccttc acctccagct ccacctatac ccccggtgac tgtcccaact 1200 ttgcggctcc ccgcagagag gtggcaccac cctatcaggg ggctgacccc atccttgcga 1260 cagccctcgc ctccgacccc 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agcacggaac aatggggcct tcagctggag ctgtggactt 2160 ttgtacatac actaaaattc tgaagttaaa gctctgctct tggaaaaaaa aaaaaaaaaa 2220 aaaaaaaaaa aaaaaa 2236 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 3 gctctcagac tacgatatt 19 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sense Strand with 3'NN <220> <221> misc_RNA <222> (1)..(19) <223> ribonucleotides <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> any, A, T/U, C, G <400> 4 gcucucagac uacgauauun n 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense strand with 3'NN <220> <221> misc_RNA <222> (1)..(19) <223> ribonucleotides <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> any, A, T/U, C, G <400> 5 aauaucguag ucugagagcn n 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Sense Strand <400> 6 gcucucagac uacgauauuu u 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Antisense Strand <400> 7 aauaucguag ucugagagcu u 21 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> 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146 gggaaatcga cacctgaaa 19 <210> 147 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 147 tgaaggaact actactaag 19 <210> 148 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 148 acctccagct ccacctata 19 <210> 149 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 149 cccacaagcc acagagcct 19 <210> 150 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 150 acgccgtggt ggagaacgt 19 <210> 151 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 151 ggaaggaatt cgtgcggcg 19 <210> 152 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 152 tgagcgacca cgagatcga 19 <210> 153 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 153 gcgaggcgca atacagcat 19 <210> 154 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 154 tgggctgcct ggaggacat 19 <210> 155 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 155 catcaagtac tgaacgttt 19 <210> 156 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 156 tcgtggtggt ggatggtaa 19 <210> 157 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 157 gaaagcgagt acactgtaa 19 <210> 158 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 158 gagcctgact ctagggttc 19 <210> 159 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 159 ccacataaga gatgatgat 19 <210> 160 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 160 cataagagat gatgatgtt 19 <210> 161 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 161 cgaatataac atagagcca 19 <210> 162 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 162 gttaatgata ccaaagaca 19 <210> 163 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 163 ctgaagatat caagaatgt 19 <210> 164 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 164 atgaagagtt gctcccaaa 19 <210> 165 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 165 atgaagaaca cgtgtaaat 19 <210> 166 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 166 aattattggt ggtagcaga 19 <210> 167 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 167 atcatcgctt ctacagata 19 <210> 168 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 168 atacatgggc agaggggaa 19 <210> 169 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 169 gggcagaggg gaagagagt 19 <210> 170 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 170 ggaagagagt acaactaca 19 <210> 171 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 171 gaagagagta caactacaa 19 <210> 172 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 172 gagagtacaa ctacaaatt 19 <210> 173 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 173 gctaattgac agagttgat 19 <210> 174 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 174 cggaacactt catgggata 19 <210> 175 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 175 ggataatgca ggttttaaa 19 <210> 176 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 176 aggctatgga atacagata 19 <210> 177 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 177 gaatacagat agagcagat 19 <210> 178 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 178 ggtaaaacct ggtgaaaag 19 <210> 179 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 179 gtgaaaagca ctacaacat 19 <210> 180 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 180 gaggaagcat ctaaagttt 19 <210> 181 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 181 tatgggaact cttggatta 19 <210> 182 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 182 tgacgagcac aaagaatta 19 <210> 183 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 183 gcacaaagaa ttatggtaa 19 <210> 184 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 184 ggttacaact catgaattg 19 <210> 185 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 185 actcatgaat tgggacata 19 <210> 186 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 186 gtggcgatca cgagaacaa 19 <210> 187 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 187 ctataagacc attgaaagt 19 <210> 188 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 188 gaacgcagca ataaagttt 19 <210> 189 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 189 gcaataaagt ttgtgggaa 19 <210> 190 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 190 caataaagtt tgtgggaac 19 <210> 191 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 191 gagggtggat gaaggagaa 19 <210> 192 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 192 ggatgaagga gaagagtgt 19 <210> 193 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 193 gcatcatgta tctgaacaa 19 <210> 194 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 194 caggaaatgc tgaagatga 19 <210> 195 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 195 gaatggcaaa tgtgagaaa 19 <210> 196 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 196 ggatgtaatt gaacgattt 19 <210> 197 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 197 gtggataaga aattggata 19 <210> 198 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 198 ggataaacag tatgaatct 19 <210> 199 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 199 cctttaaact gcagcgtca 19 <210> 200 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 200 cgtgttgaca gcaaagaaa 19 <210> 201 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 201 gcaaagaaac agagtgcta 19 <210> 202 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 202 caaaggaacc uacuuguac 19 <210> 203 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 203 gagcuugaag gaacuacua 19 <210> 204 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 204 cacagagccu agacacuga 19 <210> 205 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 205 uccaagcucu acuccauug 19

Claims

19개 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 대상의 종양 괴사 인자α 전환 효소(TACE) mRNA의 발현을 약화함으로써 대상에서 TNFα-관련 증상을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서,
상기 간섭 RNA는 서열번호 3, 서열번호 14 내지 58 및 서열번호 155 내지 201 중 어느 하나에 상응하는 TACE mRNA의 3' 말단의 끝에서 두 번째 뉴클레오티드로부터 시작하는 13개의 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드의 영역을 포함하고,
상기 TNFα-관련 증상은 안구 염증, 알러지성 결막염, 피부염, 비염 및 천식으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 TNFα-관련 염증 증상, 또는 안구 건조증인, 약제학적 조성물.

제1항에 있어서, 간섭 RNA가 shRNA, miRNA 또는 siRNA 중 하나임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.

제1항에 있어서, 조성물이 에어로졸, 협측, 피부, 피부내, 흡입, 근육내, 비강내, 안구내, 폐내, 정맥내, 복막내, 비강, 안구, 경구, 귀, 주사, 패치, 피하, 혀 밑, 국소, 또는 경피 경로를 통하여 투여됨을 특징으로 하는 약제학적 조성물.

제1항에 있어서, 간섭 RNA가 간섭 RNA를 발현할 수 있는 발현 벡터로부터 생체 내 발현을 통하여 투여됨을 특징으로 하는 약제학적 조성물.

제1항에 있어서, 대상이 안구 건조증이 있거나 안구 건조증의 발생 위험이 있는 인간임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.

제1항에 있어서, 대상이 TNFα-관련 염증 증상이 있거나 TNFα-관련 염증 증상의 발생 위험이 있는 인간임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.

19개 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 대상의 종양 괴사 인자 수용체-1(TNFR1) mRNA의 발현을 약화함으로써 대상에서 안구 염증, 알러지성 결막염, 피부염, 비염 및 천식으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 TNFα-관련 염증 증상을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서,
상기 간섭 RNA는 센스 뉴클레오티드 가닥 및 안티센스 뉴클레오티드 가닥을 포함하고;
상기 안티센스 가닥은 생리적 조건하에서 서열번호 2의 뉴클레오티드 위치 124, 328, 387, 391, 393, 395, 406, 421, 423, 444, 447, 455, 459, 460, 467, 469, 470, 471, 475, 479, 513, 517, 531, 543, 556, 576, 587, 588, 589, 595, 601, 602, 611, 612, 651, 664, 667, 668, 669, 677, 678, 785, 786, 788, 791, 792, 804, 813, 824, 838, 843, 877, 884, 929, 959, 960, 961, 963, 964, 965, 970, 973, 974, 1000, 1002, 1013, 1026, 1053, 1056, 1057, 1058, 1161, 1315, 1318, 1324, 1357, 1360, 1383, 1393, 1420, 1471, 1573, 1671, 2044, 2045, 2046, 2047, 2048, 2089, 2090, 2091 또는 2092에서 시작하는 서열에 상응하는 mRNA 부분과 혼성화하며;
상기 안티센스 가닥은 서열번호 2에 상응하는 mRNA의 상기 혼성화 부분과 적어도 90% 서열 상보성을 갖는 적어도 19개의 뉴클레오티드의 영역을 포함하는, 약제학적 조성물.

제7항에 있어서, 대상이 TNFα-관련 염증 증상이 있거나 TNFα-관련 염증 증상의 발생 위험이 있는 인간임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.

제7항에 있어서, 센스 뉴클레오티드 가닥과 안티센스 뉴클레오티드 가닥이 루프 뉴클레오티드 가닥에 의해 연결됨을 특징으로 하는 약제학적 조성물.

제7항에 있어서, 조성물이 에어로졸, 협측, 피부, 피부내, 흡입, 근육내, 비강내, 안구내, 폐내, 정맥내, 복막내, 비강, 안구, 경구, 귀, 주사, 패치, 피하, 혀 밑, 국소, 또는 경피 경로를 통하여 투여됨을 특징으로 하는 약제학적 조성물.

제7항에 있어서, 간섭 RNA가 간섭 RNA를 발현할 수 있는 발현 벡터로부터 생체 내 발현을 통하여 투여됨을 특징으로 하는 약제학적 조성물.

19개 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 대상의 TACE mRNA의 발현을 약화함으로써 대상에서 TNFα-관련 증상을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서,
상기 간섭 RNA는 센스 뉴클레오티드 가닥 및 안티센스 뉴클레오티드 가닥을 포함하고;
상기 안티센스 가닥은 생리적 조건하에서 서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 297, 333, 334, 335, 434, 470, 493, 547, 570, 573, 618, 649, 689, 755, 842, 844, 846, 860, 878, 894, 900, 909, 910, 913, 942, 970, 984, 1002, 1010, 1053, 1064, 1137, 1162, 1215, 1330, 1334, 1340, 1386, 1393, 1428, 1505, 1508, 1541, 1553, 1557, 1591, 1592, 1593, 1597, 1604, 1605, 1626, 1632, 1658, 1661, 1691, 1794, 1856, 1945, 1946, 1947, 1958, 2022, 2094, 2100, 2121, 2263, 2277, 2347, 2349, 2549, 2578, 2595, 2606, 2608, 2629, 2639, 2764, 2766, 2767, 2769, 3027, 3028, 3261, 3264, 3284, 3313, 3317, 3332 또는 3337에서 시작하는 서열에 상응하는 mRNA 부분과 혼성화하며;
상기 안티센스 가닥은 서열번호 1에 상응하는 mRNA의 상기 혼성화 부분과 적어도 90% 서열 상보성을 갖는 적어도 19개의 뉴클레오티드의 영역을 포함하고;
상기 TNFα-관련 증상은 안구 염증, 알러지성 결막염, 피부염, 비염 및 천식으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 TNFα-관련 염증 증상, 또는 안구 건조증인, 약제학적 조성물.

제12항에 있어서, 19개 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 제2 간섭 RNA를 추가로 포함하되,
상기 제2 간섭 RNA는 센스 뉴클레오티드 가닥 및 안티센스 뉴클레오티드 가닥을 포함하고;
상기 안티센스 가닥은 생리적 조건하에서 서열번호 2의 뉴클레오티드 위치 124, 328, 387, 391, 393, 395, 406, 421, 423, 444, 447, 455, 459, 460, 467, 469, 470, 471, 475, 479, 513, 517, 531, 543, 556, 576, 587, 588, 589, 595, 601, 602, 611, 612, 651, 664, 667, 668, 669, 677, 678, 785, 786, 788, 791, 792, 804, 813, 824, 838, 843, 877, 884, 929, 959, 960, 961, 963, 964, 965, 970, 973, 974, 1000, 1002, 1013, 1026, 1053, 1056, 1057, 1058, 1161, 1315, 1318, 1324, 1357, 1360, 1383, 1393, 1420, 1471, 1573, 1671, 2044, 2045, 2046, 2047, 2048, 2089, 2090, 2091 또는 2092에서 시작하는 서열에 상응하는 mRNA 부분과 혼성화하며;
상기 안티센스 가닥은 서열번호 2에 상응하는 mRNA의 상기 혼성화 부분과 적어도 90% 서열 상보성을 갖는 적어도 19개의 뉴클레오티드의 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.

제12항에 있어서, 센스 뉴클레오티드 가닥과 안티센스 뉴클레오티드 가닥이 루프 뉴클레오티드 가닥에 의해 연결됨을 특징으로 하는 약제학적 조성물.

제12항에 있어서, 조성물이 에어로졸, 협측, 피부, 피부내, 흡입, 근육내, 비강내, 안구내, 폐내, 정맥내, 복막내, 비강, 안구, 경구, 귀, 주사, 패치, 피하, 혀 밑, 국소, 또는 경피 경로를 통하여 투여됨을 특징으로 하는 약제학적 조성물.

제12항에 있어서, 간섭 RNA가 간섭 RNA를 발현할 수 있는 발현 벡터로부터 생체 내 발현을 통하여 투여됨을 특징으로 하는 약제학적 조성물.

19개 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 대상의 TNFR1 mRNA의 발현을 약화함으로써 대상에서 안구 건조증, 알러지성 결막염 및 안구 염증으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 TNFα-관련 안 증상을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서,
상기 간섭 RNA는 센스 뉴클레오티드 가닥 및 안티센스 뉴클레오티드 가닥을 포함하고;
상기 안티센스 가닥은 생리적 조건하에서 서열번호 2의 뉴클레오티드 위치 124, 328, 387, 391, 393, 395, 406, 421, 423, 444, 447, 455, 459, 460, 467, 469, 470, 471, 475, 479, 513, 517, 531, 543, 556, 576, 587, 588, 589, 595, 601, 602, 611, 612, 651, 664, 667, 668, 669, 677, 678, 785, 786, 788, 791, 792, 804, 813, 824, 838, 843, 877, 884, 929, 959, 960, 961, 963, 964, 965, 970, 973, 974, 1000, 1002, 1013, 1026, 1053, 1056, 1057, 1058, 1161, 1315, 1318, 1324, 1357, 1360, 1383, 1393, 1420, 1471, 1573, 1671, 2044, 2045, 2046, 2047, 2048, 2089, 2090, 2091 또는 2092에서 시작하는 서열에 상응하는 mRNA 부분과 혼성화하며;
상기 안티센스 가닥은 서열번호 2에 상응하는 mRNA의 상기 혼성화 부분과 적어도 90% 서열 상보성을 갖는 적어도 19개의 뉴클레오티드의 영역을 포함하는, 약제학적 조성물.

제17항에 있어서, 대상이 알러지성 결막염 또는 안구 염증이 있거나 알러지성 결막염 또는 안구 염증의 발생 위험이 있는 인간임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.

제17항에 있어서, 19개 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 제2 간섭 RNA를 추가로 포함하되,
상기 제2 간섭 RNA는 센스 뉴클레오티드 가닥 및 안티센스 뉴클레오티드 가닥을 포함하고;
상기 안티센스 가닥은 생리적 조건하에서 서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 297, 333, 334, 335, 434, 470, 493, 547, 570, 573, 618, 649, 689, 755, 842, 844, 846, 860, 878, 894, 900, 909, 910, 913, 942, 970, 984, 1002, 1010, 1053, 1064, 1137, 1162, 1215, 1330, 1334, 1340, 1386, 1393, 1428, 1505, 1508, 1541, 1553, 1557, 1591, 1592, 1593, 1597, 1604, 1605, 1626, 1632, 1658, 1661, 1691, 1794, 1856, 1945, 1946, 1947, 1958, 2022, 2094, 2100, 2121, 2263, 2277, 2347, 2349, 2549, 2578, 2595, 2606, 2608, 2629, 2639, 2764, 2766, 2767, 2769, 3027, 3028, 3261, 3264, 3284, 3313, 3317, 3332 또는 3337에서 시작하는 서열에 상응하는 mRNA 부분과 혼성화하며;
상기 안티센스 가닥은 서열번호 1에 상응하는 mRNA의 상기 혼성화 부분과 적어도 90% 서열 상보성을 갖는 적어도 19개의 뉴클레오티드의 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.

제17항에 있어서, 센스 뉴클레오티드 가닥과 안티센스 뉴클레오티드 가닥이 루프 뉴클레오티드 가닥에 의해 연결됨을 특징으로 하는 약제학적 조성물.

제17항에 있어서, 조성물이 에어로졸, 협측, 피부, 피부내, 흡입, 근육내, 비강내, 안구내, 폐내, 정맥내, 복막내, 비강, 안구, 경구, 귀, 주사, 패치, 피하, 혀 밑, 국소, 또는 경피 경로를 통하여 투여됨을 특징으로 하는 약제학적 조성물.

제17항에 있어서, 간섭 RNA가 간섭 RNA를 발현할 수 있는 발현 벡터로부터 생체 내 발현을 통하여 투여됨을 특징으로 하는 약제학적 조성물.

19개 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 단일 가닥 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 대상의 TACE mRNA의 발현을 약화함으로써 대상에서 TNFα-관련 증상을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서,
상기 단일 가닥 간섭 RNA는 생리적 조건하에서 서열번호 1의 뉴클레오티드 위치 297, 333, 334, 335, 434, 470, 493, 547, 570, 573, 618, 649, 689, 755, 842, 844, 846, 860, 878, 894, 900, 909, 910, 913, 942, 970, 984, 1002, 1010, 1053, 1064, 1137, 1162, 1215, 1330, 1334, 1340, 1386, 1393, 1428, 1505, 1508, 1541, 1553, 1557, 1591, 1592, 1593, 1597, 1604, 1605, 1626, 1632, 1658, 1661, 1691, 1794, 1856, 1945, 1946, 1947, 1958, 2022, 2094, 2100, 2121, 2263, 2277, 2347, 2349, 2549, 2578, 2595, 2606, 2608, 2629, 2639, 2764, 2766, 2767, 2769, 3027, 3028, 3261, 3264, 3284, 3313, 3317, 3332 또는 3337에서 시작하는 서열에 상응하는 mRNA 부분과 혼성화하고;
상기 간섭 RNA는 서열번호 1에 상응하는 mRNA의 상기 혼성화 부분과 적어도 90% 서열 상보성을 갖는 적어도 19개의 뉴클레오티드의 영역을 가지며;
상기 TNFα-관련 증상은 안구 염증, 알러지성 결막염, 피부염, 비염 및 천식으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 TNFα-관련 염증 증상, 또는 안구 건조증인, 약제학적 조성물.

19개 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖고 서열번호 3, 서열번호 14 내지 58 및 서열번호 155 내지 201 중 어느 하나에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 간섭 RNA 또는 이의 상보물; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 대상의 TACE mRNA의 발현을 약화함으로써 대상에서 TNFα-관련 증상을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 TNFα-관련 증상은 안구 염증, 알러지성 결막염, 피부염, 비염 및 천식으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 TNFα-관련 염증 증상, 또는 안구 건조증인, 약제학적 조성물.

19개 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖고 서열번호 59 내지 69, 서열번호 71 내지 92 및 서열번호 94 내지 154 중 어느 하나에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 간섭 RNA 또는 이의 상보물; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 대상의 TNFR1 mRNA의 발현을 약화함으로써 대상에서 안구 염증, 알러지성 결막염, 피부염, 비염 및 천식으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 TNFα-관련 염증 증상을 치료하기 위한 약제학적 조성물.

제24항에 있어서, 간섭 RNA가 shRNA, siRNA 또는 miRNA 중 하나임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.

제25항에 있어서, 간섭 RNA가 shRNA, siRNA 또는 miRNA 중 하나임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.