CN101448943A - 肿瘤坏死因子α相关状况的RNAi介导的抑制 - Google Patents

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Abstract

提供了RNA干扰用于通过沉默TNFα细胞表面受体TNF受体－1(TNFR1)mRNA表达，或通过沉默TNFα转化酶(TACE/ADAM17)mRNA表达抑制肿瘤坏死因子α(TNFα)。沉默此类TNFα靶标尤其可用于治疗患有TNFα相关状况或者处于患TNFα相关状况的危险中的患者，所述状况如眼的状况干眼、变应性结膜炎或眼炎症，或者如皮炎、鼻炎或哮喘。

Description

肿瘤坏死因子α相关状况的RNAi介导的抑制
相关申请
本申请要求2006年5月19日提交的标题为“肿瘤坏死因子α相关状况的RNAi介导的抑制”的共同待决的美国临时专利申请序列号60/801,788的优先权，将其内容特别引入本文作为参考。
发明领域
本申请涉及干扰RNA组合物领域，所述组合物通过沉默TNFα细胞表面受体TNF受体-1(TNFR1)mRNA或者TNFα转化酶(TACE/ADAM17)mRNA，用于沉默肿瘤坏死因子α(TNFα)。沉默此类TNFα靶标用于治疗患有TNFα相关状况或者处于发生这种状况的危险中的患者。
发明背景
通常用标准抗炎方案治疗炎症，所述方案包括类固醇和/或非类固醇抗炎药物(NSAIDS)。在历史上，除了口服或鼻内类固醇外，还用口服、鼻内或者局部抗组胺剂治疗变应性结膜炎、眼的炎症、皮炎、鼻炎和哮喘。系统性治疗通常需要施用更高浓度的药物化合物以提供有效浓度来到达必要的治疗部位。已知抗组胺化合物具有中枢神经系统活性；嗜睡和粘膜干燥是抗组胺剂使用的常见副作用。类固醇和NSAIDS具有潜在的副作用，包括眼内压升高、白内障、青光眼或角膜溶解。
干眼，也称作干性结膜炎或干燥性角结膜炎，是常见的眼科病症，涉及眼前泪膜的破裂，导致眼的暴露的外表面脱水。迄今为止，已经用局部施用人工泪液治疗干眼。这些溶液的一些含有伪黏膜物质来暂时代替或者补充粘蛋白不足患者中的粘蛋白层。已经提出在短期“脉冲”治疗中使用甲强龙来治疗干眼的恶化。所提出的“脉冲”疗法需要避免与用于炎性状况的常规类固醇疗法相关的并发症，如增加的眼内压和白内障形成。
细胞因子TNFα是干眼和眼色素层炎的抗炎疗法靶标。在泪腺炎症诱导的干眼的兔模型中，通过眼表面TNFα水平的特定调节已经实现了角膜染色的抑制和泪液结束时间的恢复。通过抑制TNFα合成(RDP58)或通过使用单克隆抗体(
Figure A200780017777D0011084411QIETU
)或可溶性受体()特异中和TNFα导致干眼疗法。这些针对TNFα的治疗每一种都导致用局部眼抗炎类固醇得到的功效水平。
McSwiggen等人的美国专利公开2005/0227935(2005年10月13日公布)涉及TNF和TNF受体基因表达的RNA干扰介导的抑制。然而，所述公开没有教导如本文提供的用于RNA抑制的具体靶序列。
本发明的实施方案解决本领域中对干眼和炎症的其他治疗剂和治疗方法的需要并提供了备选的疗法。
发明概述
本发明的实施方案提供了对TNFα相关状况的高度有效和灵验的治疗、预防或干预，而没有与类固醇或NSAIDS相关的副作用。一方面，本发明的方法包括治疗患有TNFα相关状况或者处于发生TNFα相关状况的危险中的受试者，通过施用沉默TACE mRNA或TNFR1 mRNA表达的干扰RNA，从而分别干扰前体蛋白酶解加工成TNFα，或者干扰TNFα与它的细胞表面受体的结合，从而减弱TNFα的活性和防止与细胞凋亡和炎症相关的事件级联来实现治疗。
TNFα相关的状况包括诸如干眼和TNFα相关炎性状况的状况。TNFα相关炎性状况包括如下状况，如眼炎症、变应性结膜炎、皮炎、鼻炎和哮喘，并且包括TNFα活性引起的那些细胞改变，TNFα活性直接或间接导致TNFα相关的炎性状况。TNFα相关状况尤其包括TNFα相关的眼状况，如干眼、变应性结膜炎和眼炎症。本文提供的干扰RNA提供了沉默TNFα靶标TACE mRNA或TNFR1 mRNA而避免由于非特异活性剂引起的不希望的副作用。
减弱受试者的TACE mRNA表达的方法是本发明的实施方案。该方法包括对受试者施用组合物，该组合物包含有效量的具有19到49个核苷酸长度的干扰RNA和可药用载体，所述干扰RNA包含至少13个连续核苷酸的区域，该区域与对应于SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：14-SEQ ID NO：58、和SEQ ID NO：155-SEQ ID NO：201任一个的mRNA的3’末端倒数第二位的13个核苷酸有至少90％序列互补性，或者至少90％序列同一性。从而减弱TACE mRNA的表达。
治疗需要其的受试者中TNFα相关状况的方法是本发明的一个实施方案。该方法包括对受试者施用组合物，该组合物包含有效量的具有19到49个核苷酸长度的干扰RNA和可药用载体，所述干扰RNA包含至少13个连续核苷酸的区域，该区域与对应于SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：14-SEQID NO：58、和SEQ ID NO：155-SEQ ID NO：201任一个的mRNA的3’末端倒数第二位的13个核苷酸有至少90％序列互补性，或者至少90％序列同一性。从而治疗TNFα相关的状况。
在本发明的再一个实施方案中，通过减弱受试者中TACE mRNA或TNFR1 mRNA的表达减弱受试者的TNFα活性的方法包括对受试者施用组合物，该组合物包含有效量的具有19到49个核苷酸长度的干扰RNA和可药用载体，所述干扰RNA包含有义核苷酸链、反义核苷酸链和至少19个核苷酸的至少接近完全连续互补的区域，其中反义链在生理条件下与对应于SEQ ID NO：1的mRNA的部分杂交，所述部分包含核苷酸297、333、334、335、434、470、493、547、570、573、618、649、689、755、842、844、846、860、878、894、900、909、910、913、942、970、984、1002、1010、1053、1064、1137、1162、1215、1330、1334、1340、1386、1393、1428、1505、1508、1541、1553、1557、1591、1592、1593、1597、1604、1605、1626、1632、1658、1661、1691、1794、1856、1945、1946、1947、1958、2022、2094、2100、2121、2263、2277、2347、2349、2549、2578、2595、2606、2608、2629、2639、2764、2766、2767、2769、3027、3028、3261、3264、3284、3313、3317、3332或3337，或其中反义链在生理条件下与对应于SEQ ID NO：2的mRNA的部分杂交，所述部分在核苷酸124、328、387、391、393、395、406、421、423、444、447、455、459、460、467、469、470、471、475、479、513、517、531、543、556、576、587、588、589、595、601、602、611、612、651、664、667、668、669、677、678、785、786、788、791、792、804、813、824、838、843、877、884、929、959、960、961、963、964、965、970、973、974、1000、1002、1013、1026、1053、1056、1057、1058、1161、1315、1318、1324、1357、1360、1383、1393、1420、1471、1573、1671、2044、2045、2046、2047、2048、2089、2090、2091、2092或2098处开始。TACE mRNA的表达在那些实施方案中减弱，在所述实施方案中，反义链与对应于如上述的SEQ ID NO：1的mRNA的部分杂交。TNFR1 mRNA的表达在那些实施方案中减弱，在所述实施方案中，反义链与对应于如上述的SEQ ID NO：2的mRNA的部分杂交。
治疗需要其的受试者中TNFα相关状况的方法是本发明的一个实施方案，该方法包括对受试者施用组合物，该组合物包含有效量的具有19到49个核苷酸长度的干扰RNA和可药用载体，所述干扰RNA包含有义核苷酸链、反义核苷酸链和至少19个核苷酸的至少接近完全连续互补的区域；其中反义链在生理条件下与对应于SEQ ID NO：1的mRNA的部分杂交，所述部分包含核苷酸297、333、334、335、434、470、493、547、570、573、618、649、689、755、842、844、846、860、878、894、900、909、910、913、942、970、984、1002、1010、1053、1064、1137、1162、1215、1330、1334、1340、1386、1393、1428、1505、1508、1541、1553、1557、1591、1592、1593、1597、1604、1605、1626、1632、1658、1661、1691、1794、1856、1945、1946、1947、1958、2022、2094、2100、2121、2263、2277、2347、2349、2549、2578、2595、2606、2608、2629、2639、2764、2766、2767、2769、3027、3028、3261、3264、3284、3313、3317、3332、或3337。从而治疗TNFα相关的状况。
治疗需要其的受试者中TNFα相关的眼状况的方法是本发明的一个实施方案，该方法包括对受试者施用组合物，该组合物包含有效量的具有19到49个核苷酸长度的干扰RNA和可药用载体，所述干扰RNA包含有义核苷酸链、反义核苷酸链和至少19个核苷酸的至少接近完全连续互补的区域；其中反义链在生理条件下与对应于SEQ ID NO：2的mRNA的部分杂交，所述部分包含核苷酸124、328、387、391、393、395、406、421、423、444、447、455、459、460、467、469、470、471、475、479、513、517、531、543、556、576、587、588、589、595、601、602、611、612、651、664、667、668、669、677、678、785、786、788、791、792、804、813、824、838、843、877、884、929、959、960、961、963、964、965、970、973、974、1000、1002、1013、1026、1053、1056、1057、1058、1161、1315、1318、1324、1357、1360、1383、1393、1420、1471、1573、1671、2044、2045、2046、2047、2048、2089、2090、2091、2092或2098。从而治疗TNFα相关的状况。
在另一实施方案中，也可以对受试者施用具有19到49个核苷酸长度的第二种干扰RNA；该第二种干扰RNA包含有义核苷酸链、反义核苷酸链和至少19个核苷酸的至少接近完全互补的区域；其中反义链在生理条件下与对应于SEQ ID NO：1的mRNA的部分杂交，所述部分包含如上引用的核苷酸，或者其中反义链在生理条件下与对应于SEQ ID NO：2的mRNA的部分杂交，所述部分在核苷酸124、328、387、391、393、395、406、421、423、444、447、455、459、460、467、469、470、471、475、479、513、517、531、543、556、576、587、588、589、595、601、602、611、612、651、664、667、668、669、677、678、785、786、788、791、792、804、813、824、838、843、877、884、929、959、960、961、963、964、965、970、973、974、1000、1002、1013、1026、1053、1056、1057、1058、1161、1315、1318、1324、1357、1360、1383、1393、1420、1471、1573、1671、2044、2045、2046、2047、2048、2089、2090、2091、2092、或2098处开始。
当第一种干扰RNA靶定SEQ ID NO：1时，第二种干扰RNA可以靶定SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，并且相反地，当第一种干扰RNA靶定SEQ ID NO：2时，第二种干扰RNA可以靶定SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2。在进一步的实施方案中，可以施用第三种、第四种或更多种干扰RNA。
本发明的进一步实施方案是治疗需要其的受试者中TNFα相关状况的方法，其中该方法包括对受试者施用组合物，该组合物包含通过RNA干扰下调TACE基因表达的双链siRNA分子，其中该siRNA分子的每条链独立地为约19到约27个核苷酸长度；siRNA分子的一条链包含与对应于TACE基因的mRNA具有实质互补性的核苷酸序列，从而siRNA分子通过RNA干扰指导mRNA的切割。
本发明的另一实施方案是治疗需要其的受试者中TNFα相关的眼状况的方法，其中该方法包括对受试者施用组合物，该组合物包含通过RNA干扰下调TNFR1基因表达的双链siRNA，其中该siRNA分子的每条链独立地为约19到约27个核苷酸长度；siRNA分子的一条链包含与对应于TNFR1基因的mRNA具有实质互补性的核苷酸序列，从而siRNA分子通过RNA干扰指导mRNA的切割。
另一实施方案是减弱受试者中TACE mRNA的表达的方法，其包括对受试者施用组合物，该组合物包含有效量的单链干扰RNA和可药用载体。所述单链干扰RNA具有19到49个核苷酸的长度并且在生理条件下与对应于SEQ ID NO：1的mRNA的部分杂交，所述部分包含核苷酸297、333、334、335、434、470、493、547、570、573、618、649、689、755、842、844、846、860、878、894、900、909、910、913、942、970、984、1002、1010、1053、1064、1137、1162、1215、1330、1334、1340、1386、1393、1428、1505、1508、1541、1553、1557、1591、1592、1593、1597、1604、1605、1626、1632、1658、1661、1691、1794、1856、1945、1946、1947、1958、2022、2094、2100、2121、2263、2277、2347、2349、2549、2578、2595、2606、2608、2629、2639、2764、2766、2767、2769、3027、3028、3261、3264、3284、3313、3317、3332或3337，并且该干扰RNA具有与对应于SEQ ID NO：1的mRNA的杂交部分至少接近完全连续互补的区域。从而减弱TACE mRNA的表达。
作为进一步的实施方案，本发明包括包含干扰RNA和可药用载体的组合物，该干扰RNA具有19到49个核苷酸长度，并且包含对应于SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：14-SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：155-SEQ ID NO：201的任一个或其互补序列的核苷酸序列。
作为进一步的实施方案，本发明包括包含干扰RNA和可药用载体的组合物，该干扰RNA基本上由对应于SEQ ID NO：59-SEQ ID NO：69、SEQID NO：71-SEQ ID NO：92和SEQ ID NO：94-SEQ ID NO：154任一个的核苷酸序列或其互补序列组成。
如本文所述的任一实施方案在制备减弱TACE mRNA或者TNFR1mRNA表达的药物中的用途作为减弱TNFα活性和从而治疗如本文所述的TNFα相关状况的方法也是本发明的实施方案。
附图简述
为了得到本发明的上面引用的和其他优点和目标的方式，通过参考本发明的特定实施方案将使得可以更具体地描述上面简述的本发明，所述实施方案在附图中阐明。理解这些附图仅仅简述了本发明的典型实施方案并且因此不被认为是限制其范围，将通过使用附图以额外的特异性和细节描述本发明，其中：
图1提供了用TNFR1 siRNAs #1、#2、#3和#4、和无RISC的对照siRNA(每种10nM、1nM，和0.1nM)；10nM的非寻靶对照siRNA(NTC2)；和缓冲液对照(-siRNA)转染的GTM-3细胞的TNFR1蛋白质印迹。箭头指出55-kDa TNFR1和42-kDa肌动蛋白带的位置。
发明详述
将本文引用的参考文献特别引入本文作为参考到它们为本文给出的那些提供示例性步骤或其他补充细节的程度。
本领域技术人员按照本公开将明白可以做出本文公开的实施方案的明显修饰而不背离本发明的精神和范围。按照本公开，可以不用过度实验就做出和实施本文公开的所有实施方案。本发明的完整范围在本公开和其等同实施方案中给出。不应将说明书理解为过度限制本发明应有的完整保护范围。
本文显示的细节是示例性的并且仅仅用于说明性讨论本发明的优选实施方案并且被给出是为了提供据认为对于本发明的多种实施方案的原理和概念方面的描述是最有用和容易理解的。在这方面，不试图显示除了本发明的基本理解所必要的之外的本发明的结构细节，说明书以及附图和/或实施例使得本领域技术人员对于在实践中体现的本发明的几种形式是显而易见的。
下面的定义和解释意在控制任何将来的构造，除非在下面的实施例中清楚而明确地修饰或者当含义的应用使得任何构造无意义或者基本上无意义时。在术语的构造将使得它无意义或者基本上无意义的情况下，该定义应该来自Webster′s Dictionary(第三版)。
如本文所用，除非另外指出，所有百分比都按重量百分比计。
如本文所用和除非另外指出，术语“一个”意指“一个”、“至少一个”或“一个或多个”。
术语“干眼”，也称作干性结膜炎或干燥性角结膜炎，是常见的眼科病症，涉及眼前泪膜的破裂，导致眼的暴露的外表面脱水。
如本文所用，术语“眼炎症”包括例如虹膜炎、眼色素层炎、巩膜外层炎、巩膜炎、角膜炎、眼内炎、眼睑炎和医源性炎性状况。
如本文所用，术语“变应性结膜炎”指结膜的炎症，结膜是沿着眼睑排列并覆盖巩膜的暴露表面的精细的膜。术语“变应性结膜炎”包括例如特应性角结膜炎、巨乳头状结膜炎、枯草热性结膜炎、常年性变应性结膜炎和春季角结膜炎。
如本文所用，术语“皮炎”指皮肤的炎症并且包括例如变应性接触性皮炎、荨麻疹、皮脂缺乏性皮炎(小腿上干性皮肤)、特应性皮炎、接触性皮炎(包括刺激性接触性皮炎和漆酚诱导的接触性皮炎)、湿疹、重力性皮炎、钱币状皮炎、外耳炎、口周皮炎和脂溢性皮炎。
如本文所用，术语“鼻炎”指鼻粘膜的炎症并且包括例如变应性鼻炎、特应性鼻炎、刺激性鼻炎、嗜酸细胞性非变应性鼻炎、药物性鼻炎和嗜中性粒细胞鼻鼻窦炎。
如本文所用，术语“哮喘”指呼吸道炎症，导致将空气从鼻子和嘴向肺运输的呼吸道狭窄并且包括例如，变应性哮喘、特应性哮喘、特应性支气管IgE介导的哮喘、支气管哮喘、bronchiolytis、肺气肿性哮喘、特发性哮喘、运动性哮喘、环境因子引起的外源性哮喘、初期哮喘、病例生理紊乱引起的内源性哮喘、非变应性哮喘、非特应性哮喘、和喘鸣婴儿综合征。
短语“与对应于(序列标识符)任一个的mRNA的3’末端的倒数第二位13个核苷酸有至少90％序列互补性或至少90％序列同一性的至少13个连续核苷酸的区域”允许一个核苷酸替代。在该短语中不包括两个核苷酸替代(即，11/13＝85％同一性/互补性)。
术语“百分比同一性”描述第一个核酸分子中与第二个核酸分子中相同长度的一组连续核苷酸相同的连续核苷酸的百分比。术语“百分比互补性”描述第一个核酸分子中可以与第二个核酸分子中一组连续核苷酸在沃森-克里克意义上碱基配对的连续核苷酸的百分比。
如本文所用，术语“杂交”指具有互补或接近互补的碱基序列的单链核酸相互作用形成称作杂交分子的氢键结合的复合体的过程。杂交反应是灵敏的和选择性的。在体外，杂交的特异性(即，严格性)通过例如预杂交或杂交溶液中盐或甲酰胺的浓度，和通过杂交温度控制；此类步骤是本领域公知的。具体地，通过降低盐浓度、增加甲酰胺浓度或者升高杂交温度增加严格性。
例如，可以在约50％甲酰胺、37℃到42℃下发生高严格条件。可以在约35％到25％甲酰胺、30℃到35℃的条件下发生降低的严格性条件。杂交的严格性条件的实例在Sambrook，J.，1989，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y中提供。严格杂交条件的其他实例包括400mM NaCl，40mMPIPES pH6.4，1mM EDTA，50℃或70℃下12-16小时接着洗涤，或者在70℃下1XSSC中或者50℃下1XSSC，50％甲酰胺中杂交，接着在0.3XSSC中70℃下洗涤，或者在4XSSC中70℃下或者4XSSC，50％甲酰胺中50℃下杂交，接着在67℃下1XSSC中洗涤。杂交温度比杂交分子的解链温度(Tm)低5-10℃，其中对于长度为19到49个碱基对的杂交分子，使用下面的计算确定Tm：Tm℃＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是杂交分子中碱基数目，[Na+]是杂交缓冲液中钠离子浓度。
除非另外指出，本文引用的核酸序列以5’到3’的方向书写。如本文所用的术语“核酸”指DNA或RNA或其修饰形式，其包含DNA中存在的嘌呤或嘧啶(腺嘌呤“A”、胞嘧啶“C”、鸟嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”)或者RNA中的嘌呤或嘧啶(腺嘌呤“A”、胞嘧啶“C”、鸟嘌呤“G”、尿嘧啶“U”)。本文提供的干扰RNA可以包含“T”碱基，尤其在3’末端，尽管“T”碱基通常不在RNA中存在。“核酸”包括术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并且可以指单链分子或双链分子。双链分子通过A和T碱基、C和G碱基，和A和U碱基之间的沃森-克里克碱基配对形成。双链分子的链可以相互部分、基本上或者完全互补并且将形成双链体杂交分子，其成键强度取决于碱基序列互补性的性质和程度。
mRNA序列可以从对应DNA序列的序列容易地推导。例如，SEQ IDNO：1提供了对应于TACE的mRNA的DNA的有义链序列。mRNA序列与DNA有义链相同，只是以“U”碱基代替“T”碱基。因此，TACE的mRNA从SEQ ID NO：1知道并且TNFR1的mRNA从SEQ ID NO：2知道。
RNA干扰(RNAi)是用双链RNA(dsRNA)沉默基因表达的一种过程。不希望被理论束缚，RNAi以RNA酶III样酶切丁酶将较长dsRNA切割成小的干扰RNA(siRNA)开始。siRNA是dsRNA，其长度通常为约19到28个核苷酸，或者20到25个核苷酸，或者21到22个核苷酸，并且通常含有2个核苷酸的3’突出端，和5’磷酸和3’羟基末端。siRNA的一条链掺入到称作RNA诱导性沉默复合物(RISC)的核糖核蛋白复合物。RISC使用该siRNA链鉴定与掺入的siRNA链至少部分互补的mRNA分子，然后切割这些靶mRNA或者抑制它们的翻译。因此，掺入RISC的siRNA链被称作引导链或者反义链。另一siRNA链称作过客链或者有义链，被从siRNA清除并且与靶标mRNA至少部分同源。本领域技术人员将认识到siRNA的任一链可以掺入到RISC中并且作为引导链发挥功能。然而，siRNA设计(例如，在希望的引导链的5’末端的降低的siRNA双链体稳定性)可以有利于希望的引导链掺入到RISC中。
具有与引导链至少部分互补的序列的mRNA的RISC介导的切割导致该mRNA和该mRNA编码的对应的蛋白质的稳态水平的降低。备选地，RISC也可以通过翻译阻抑降低对应蛋白质的表达而不切割靶标mRNA。其他RNA分子和RNA样分子也可以与RISC和沉默基因表达相互作用。可以与RISC相互作用的其他RNA分子的实例包括短发夹RNA(shRNA)、单链siRNA、微小RNA(miRNA)和切丁酶底物27聚体双链体。除非另外指出，如本文所用的术语“siRNA”指双链干扰RNA。可以与RISC相互作用的RNA样分子的实例包括含有一个或多个化学修饰的核苷酸、一个或多个脱氧核糖核苷酸，和/或一个或多个非磷酸二酯键的RNA分子。为了本讨论的目的，将可以与RISC相互作用并且参与基因表达中RISC介导的改变的所有RNA和RNA样分子都称作“干扰RNA”。因此，siRNA、shRNA、miRNA和切丁酶底物27聚体双链体是“干扰RNA”的子集。
本发明实施方案的干扰RNA对于靶标mRNA的切割似乎以催化的方式作用，即，干扰RNA能够以亚化学计量的量实现靶标mRNA的抑制。与反义疗法相比，需要显著较少的干扰RNA来在此类切割条件下提供治疗效果。
本发明涉及干扰RNA用于抑制TNFα细胞表面受体TNF受体-1(TNFR1)或TNFα转化酶(TACE/ADAM17，在这里称作“TACE”)的表达的用途，所述酶的抑制降低了肿瘤坏死因子α(TNFα)的活性。TNFα与其细胞表面受体TNF受体-1(TNFR1)的结合激活了信号级联，该信号级联影响多种细胞应答，包括细胞凋亡和炎症。TNFα自身最初作为无活性的膜结合的前体表达。活性形式的TNFα从细胞表面的释放需要TNFα转化酶(TACE/ADAM17)对该前体的蛋白酶解加工，TNFα转化酶是“A解聚素和金属蛋白酶”(ADAM)家族的成员。
根据本发明，抑制TNFR1 mRNA、TACE mRNA或TNFR1和TACEmRNA两者的表达有效降低了TNFα的作用。此外，外源性提供或内源表达的如本文给出的干扰RNA在沉默TNFR1 mRNA或TACE mRNA中尤其有效。
肿瘤坏死因子α转化酶mRNA(TACE/ADAM17)：GenBank数据库以检索号NM_003183提供了TACE的DNA序列，在“序列表”中以SEQ IDNO：1提供。SEQ ID NO：1提供了对应于编码TACE的mRNA的DNA的有义链序列(只是用“T”碱基代替“U”碱基)。TACE的编码序列来自核苷酸184-2658。
上面引用的TACE mRNA的等同方案是其选择性剪接形式、等位基因形式、同工酶或者同源物(cognate)。同源物是来自另一哺乳动物物种的肿瘤坏死因子α转化酶，其与SEQ ID NO：1同源(即，直向同源物)。
肿瘤坏死因子受体-1 mRNA(TNFR1)：GenBank数据库以检索号NM_001065提供了TNFR1的DNA序列，在“序列表”中以SEQ ID NO：2提供。SEQ ID NO：2提供了对应于编码TNFR1的mRNA的DNA的有义链序列(只是用“T”碱基代替“U”碱基)。TNFR1的编码序列来自核苷酸282-1649。
上面引用的TNFR1 mRNA序列的等同方案是其选择性剪接形式、等位基因形式、同工酶或者同源物(cognate)。同源物是来自另一哺乳动物物种的肿瘤坏死因子受体-1 mRNA，其与SEQ ID NO：2同源(即，直向同源物)。
减弱mRNA的表达：如本文所用的术语“减弱mRNA的表达”指施用或表达一定量的干扰RNA(例如，siRNA)以减少靶标mRNA向蛋白质的翻译，尽管通过mRNA切割或者通过翻译的直接抑制。靶标mRNA或者对应蛋白质表达的减少通常被称作“击倒”并且相对于施用或表达非寻靶对照RNA(即，非寻靶对照siRNA)后存在的水平报告。本文的实施方案设想包括和50％到100％之间的量的表达击倒(knock down)。然而，不必为了本发明的目的实现此类击倒水平。在一个实施方案中，施用靶定TACEmRNA或TNFR1 mRNA的单一干扰RNA。在其他实施方案中，施用靶定TACE mRNA或TNFR1 mRNA的两种或多种干扰RNA。在其他实施方案中，组合或以一定的时间间隔施用靶定TACE mRNA和TNFR1mRNA每一种的干扰RNA以具有重叠效果。
通常通过用定量聚合酶链式反应(qPCR)扩增测量mRNA水平或者通过蛋白质印迹或者酶联免疫吸附测定(ELISA)测量蛋白质水平来评估击倒。分析蛋白质水平提供了mRNA切割以及翻译抑制的评估。用于测量击倒的其他技术包括RNA溶液杂交、核酸酶保护、northern杂交、用微阵列进行基因表达监测、抗体结合、放射免疫测定法，和荧光激活的细胞分析。
例如，如下文所述转染TACE或TNFR1干扰RNA后，通过在体外评估人角膜上皮细胞中的目标mRNA水平或者目标蛋白水平，也可以确定TACE或TNFR1的抑制。
通过观察TNFα相关状况症状的改善，如与干眼、变应性结膜炎、眼炎症、皮炎、鼻炎或哮喘的症状的改善，也在人或者哺乳动物中推断出由于TACE mRNA表达或者TNFR1mRNA表达的抑制引起的TNFα活性的抑制。例如，干眼症状、水肿、瘙痒、炎症或者对环境挑战的耐受性的任一种的改善表明TNFα活性的抑制。
干扰RNA：在本发明的一个实施方案中，干扰RNA(例如，siRNA)具有有义链和反义链，并且有义链和反义链包含至少19个核苷酸的至少接近完全连续互补的区域。在本发明的进一步的实施方案中，干扰RNA(例如，siRNA)具有有义链和反义链，并且反义链包含与TACE mRNA或TNFR1mRNA的靶序列的至少19个核苷酸的至少接近完全连续互补的区域，有义链包含与TACE mRNA或TNFR1 mRNA的靶序列具有至少19个核苷酸的至少接近完全连续同一性的区域。在本发明的进一步的实施方案中，干扰RNA包含分别与mRNA内的对应的靶序列的3’末端倒数第二位的13、14、15、16、17或18个核苷酸具有一定百分比的序列互补性或者一定百分比的序列同一性的至少13、14、15、16、17或18个连续核苷酸的区域。
干扰RNA的每条链的长度包含19到49个核苷酸，并且可以包含19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个核苷酸长度。
siRNA的反义链是siRNA的活性引导剂，因为反义链掺入到RISC中，从而允许RISC鉴定与该反义siRNA至少部分互补的靶标mRNA用于切割或翻译抑制。
在本发明的一个实施方案中，使用可利用的设计工具选择靶标mRNA序列内的干扰RNA靶序列(例如，siRNA靶序列)。然后通过转染表达靶mRNA的细胞，接着如上述评估击倒，来测试对应于TACE或TNFR1靶序列的干扰RNA。
选择siRNA的靶序列的技术由Tuschl，T.等人，＂The siRNA UserGuide，＂(2004年5月6日修订，可以在Rockefeller University网站获取)；技术公报#506，＂siRNA Design Guidelines，＂Ambion Inc(Ambion的网站)；和其他基于网页的设计工具，例如在Invitrogen、Dharmacon、Integrated DNATechnologies、Genscript或Proligo提供。最初的搜索参数可以包括35％到55％之间的G/C含量和19到27个核苷酸的siRNA长度。靶序列可以位于mRNA的编码区或者5’或3’非翻译区中。
TACE mRNA的19个核苷酸的DNA靶序列的实施方案在SEQ IDNO：1的核苷酸297到315中给出：
5′-GCTCTCAGACTACGATATT-3′SEQ ID NO：3。
本发明的靶定SEQ ID NO：3的对应的mRNA序列并且具有21个核苷酸链和2个核苷酸的3’突出端的siRNA是：
5′-GCUCUCAGACUACGAUAUUNN-3′SEQ ID NO：4
3′-NNCGAGAGUCUGAUGCUAUAA-5′SEQ ID NO：5。
每个“N”可以是任何核苷酸(A、C、G、U、T)或者修饰的核苷酸。3’末端可以具有许多“N”残基，包括1、2、3、4、5和6个。在任一链上的“N”残基可以是相同的残基(例如，UU、AA、CC、GG或TT)或它们可以是不同的(例如，AC、AG、AU、CA、CG、CU、GA、GC、GU、UA、UC或UG)。3’突出端可以是相同的或者它们可以是不同的。在一个实施方案中，两条链都具有3’UU突出端。
本发明的靶定SEQ ID NO：3的对应的mRNA序列并且具有21个核苷酸链和3′UU突出端的siRNA是：
5′-GCUCUCAGACUACGAUAUUUU-3′SEQ ID NO：6
3′-UUCGAGAGUCUGAUGCUAUAA-5′SEQ ID NO：7
干扰RNA也可以具有5’突出端核苷酸或者它可以具有平末端。本发明的靶定SEQ ID NO：3的对应的mRNA序列并且具有19个核苷酸链和平末端的siRNA是：
5′-GCUCUCAGACUACGAUAUU-3′SEQ ID NO：8
3′-CGAGAGUCUGAUGCUAUAA-5′SEQ ID NO：9
双链干扰RNA(例如，siRNA)的链可以连接以形成发夹或者茎环结构(例如，shRNA)。本发明的靶定SEQ ID NO：3的对应的mRNA序列并且具有19bp双链茎环区和3’UU突出端的shRNA是：
Figure A200780017777D00251
N是核苷酸A、T、C、G、U，或者本领域技术人员已知的修饰形式。环中核苷酸N的数目是3到23、或5到15、或7到13、或4到9、或9到11之间并且包括端点的数字，或者核苷酸的数目是9。环中一些核苷酸可以参与与环中其他核苷酸的碱基对相互作用。可以用于形成环的寡核苷酸序列的实例包括5’-UUCAAGAGA-3’(Brummelkamp，T.R等人(2002)Science 296：550)和5’-UUUGUGUAG-3’(Castanotto，D.等人(2002)RNA 8：1454)。本领域技术人员将认识到所得的单链寡核苷酸形成茎环或者发夹结构，其包含能够与RNAi机器相互作用的双链区。
上面鉴定的siRNA靶序列可以在3’末端延伸以方便切丁酶底物27聚体双链体的设计。在TACE DNA序列(SEQ ID NO：1)中鉴定的19个核苷酸的DNA靶序列(SEQ ID NO：3)延伸6个核苷酸产生了存在于SEQ IDNO：1的核苷酸297到321的25个核苷酸的DNA靶序列：
5′-GCTCTCAGACTACGATATTCTCTCT-3′SEQ ID NO：11
用于靶定SEQ ID NO：11的对应的mRNA序列的本发明的切丁酶底物27聚体双链体为：
5′-GCUCUCAGACUACGAUAUUCUCUCU-3′SEQ ID NO：12
3′-UUCGAGAGUCUGAUGCUAUAAGAGAGA-5′SEQ ID NO：13
有义链的3’末端的两个核苷酸(即，SEQ ID NO：12的CU核苷酸)可以是用于增强的加工的脱氧核苷酸。如本文提供的切丁酶底物27聚体双链体从19-21个核苷酸靶序列的设计由Integrated DNA Technologies(IDT)网站和Kim，D.-H.等人(February，2005)Nature Biotechnology 23：2；222-226进一步讨论。
当通过化学合成产生干扰RNA时，在一条或两条链的5’末端核苷酸的5’位的磷酸化(当存在时)可以增强siRNA功效和结合的RISC复合体的特异性，但是不是所需的，因为可以在细胞内发生磷酸化。
表1列出了SEQ ID NO：1的TACE DNA靶序列的实例，从所述靶序列以上述方式设计本发明的siRNA。TACE编码如上面提到的肿瘤坏死因子α转化酶。
表1.用于siRNA的TACE靶序列
 
TACE靶序列 关于SEQ ID NO：1的起始核苷酸# SEQ ID NO：
GCTCTCAGACTACGATATT 297 3
CCAGCAGCATTCGGTAAGA 333 14
CAGCAGCATTCGGTAAGAA 334 15
AGCAGCATTCGGTAAGAAA 335 16
AGAGATCTACAGACTTCAA 355 17
GAAAGCGAGTACACTGTAA 493 18
CCATGAAGAACACGTGTAA 842 19
GAAGAACACGTGTAAATTA 846 20
ATCATCGCTTCTACAGATA 878 21
AGAGCAATTTAGCTTTGAT 1137 22
GGTTTGACGAGCACAAAGA 1330 23
TGATCCGGATGGTCTAGCA 1428 24
GCGATCACGAGAACAATAA 1508 25
GCAGTAAACAATCAATCTA 1541 26
CAATCTATAAGACCATTGA 1553 27
TTTCAAGAACGCAGCAATA 1591 28
TTCAAGAACGCAGCAATAA 1592 29
TCAAGAACGCAGCAATAAA 1593 30
TCATGTATCTGAACAACGA 1661 31
ACAGCGACTGCACGTTGAA 1691 32
GATTAATGCTACTTGCAAA 1794 33
CTGGAGTCCTGTGCATGTA 1945 34
TGGAGTCCTGTGCATGTAA 1946 35
GGAGTCCTGTGCATGTAAT 1947 36
CATGTAATGAAACTGACAA 1958 37
CTATGTCGATGCTGAACAA 2022 38
CAAATGTGAGAAACGAGTA 2100 39
GCATCGGTTCGCATTATCA 2347 40
 
ATCGGTTCGCATTATCAAA 2349 41
CCAAGTCATTTGAGGATCT 2549 42
CCGGTCACCAGAAGTGAAA 2578 43
AAAGGCTGCCTCCTTTAAA 2595 44
TTTAAACTGCAGCGTCAGA 2608 45
AGATGCTGGTCATGTGTTT 2764 46
ATGCTGGTCATGTGTTTGA 2766 47
TGCTGGTCATGTGTTTGAA 2767 48
CTGGTCATGTGTTTGAACT 2769 49
TGTAATGAACCGCTGAATA 3027 50
GTAATGAACCGCTGAATAT 3028 51
CTAAGACTAATGCTCTCTA 3261 52
AGACTAATGCTCTCTAGAA 3264 53
CCTAACCACCTACCTTACA 3284 54
TACATGGTAGCCAGTTGAA 3313 55
TGGTAGCCAGTTGAATTTA 3317 56
TTTATGGAATCTACCAACT 3332 57
GGAATCTACCAACTGTTTA 3337 58
CATCAAGTACTGAACGTTT 434 155
TCGTGGTGGTGGATGGTAA 470 156
GAAAGCGAGTACACTGTAA 493 157
GAGCCTGACTCTAGGGTTC 547 158
CCACATAAGAGATGATGAT 570 159
CATAAGAGATGATGATGTT 573 160
CGAATATAACATAGAGCCA 618 161
GTTAATGATACCAAAGACA 649 162
CTGAAGATATCAAGAATGT 689 163
ATGAAGAGTTGCTCCCAAA 755 164
ATGAAGAACACGTGTAAAT 844 165
AATTATTGGTGGTAGCAGA 860 166
ATCATCGCTTCTACAGATA 878 167
 
ATACATGGGCAGAGGGGAA 894 168
GGGCAGAGGGGAAGAGAGT 900 169
GGAAGAGAGTACAACTACA 909 170
GAAGAGAGTACAACTACAA 910 171
GAGAGTACAACTACAAATT 913 172
GCTAATTGACAGAGTTGAT 942 173
CGGAACACTTCATGGGATA 970 174
GGATAATGCAGGTTTTAAA 984 175
AGGCTATGGAATACAGATA 1002 176
GAATACAGATAGAGCAGAT 1010 177
GGTAAAACCTGGTGAAAAG 1053 178
GTGAAAAGCACTACAACAT 1064 179
GAGGAAGCATCTAAAGTTT 1162 180
TATGGGAACTCTTGGATTA 1215 181
TGACGAGCACAAAGAATTA 1334 182
GCACAAAGAATTATGGTAA 1340 183
GGTTACAACTCATGAATTG 1386 184
ACTCATGAATTGGGACATA 1393 185
GTGGCGATCACGAGAACAA 1505 186
CTATAAGACCATTGAAAGT 1557 187
GAACGCAGCAATAAAGTTT 1597 188
GCAATAAAGTTTGTGGGAA 1604 189
CAATAAAGTTTGTGGGAAC 1605 190
GAGGGTGGATGAAGGAGAA 1626 191
GGATGAAGGAGAAGAGTGT 1632 192
GCATCATGTATCTGAACAA 1658 193
CAGGAAATGCTGAAGATGA 1856 194
GAATGGCAAATGTGAGAAA 2094 195
GGATGTAATTGAACGATTT 2121 196
GTGGATAAGAAATTGGATA 2263 197
GGATAAACAGTATGAATCT 2277 198
 
CCTTTAAACTGCAGCGTCA 2606 199
CGTGTTGACAGCAAAGAAA 2629 200
GCAAAGAAACAGAGTGCTA 2639 201
表2列出了SEQ ID NO：2的TNFR1DNA靶序列的实例，从所述靶序列以上述方式设计本发明的siRNA。TNFR1编码如上面提到的肿瘤坏死因子α受体-1。
表2.用于siRNA的TNFR1靶序列
 
TNFR1靶序列 关于SEQ ID NO：2的起始核苷酸#  SEQ ID NO：
ACCAGGCCGTGATCTCTAT 124 59
AATTCGATTTGCTGTACCA 444 60
TCGATTTGCTGTACCAAGT 447 61
ACAAAGGAACCTACTTGTA 469 62
GAACCTACTTGTACAATGA 475 63
CTACTTGTACAATGACTGT 479 64
TGTGAGAGCGGCTCCTTCA 531 65
TCAGGTGGAGATCTCTTCT 611 66
CAGGTGGAGATCTCTTCTT 612 67
AGAACCAGTACCGGCATTA 667 68
GAACCAGTACCGGCATTAT 668 69
AACCAGTACCGGCATTATT 669 70
CCGGCATTATTGGAGTGAA 677 71
CGGCATTATTGGAGTGAAA 678 72
AGCCTGGAGTGCACGAAGT 843 73
CTCCTCTTCATTGGTTTAA 960 74
TTGGTTTAATGTATCGCTA 970 75
GTTTAATGTATCGCTACCA 973 76
TTTAATGTATCGCTACCAA 974 77
 
AGTCCAAGCTCTACTCCAT 1000 78
GAGCTTGAAGGAACTACTA 1053 79
CTTGAAGGAACTACTACTA 1056 80
TTGAAGGAACTACTACTAA 1057 81
ACAAGCCACAGAGCCTAGA 1318 82
TGTACGCCGTGGTGGAGAA 1357 83
CCGTTGCGCTGGAAGGAAT 1383 84
TCTAAGGACCGTCCTGCGA 1671 85
CTAATAGAAACTTGGCACT 2044 86
TAATAGAAACTTGGCACTC 2045 87
AATAGAAACTTGGCACTCC 2046 88
ATAGAAACTTGGCACTCCT 2047 89
TAGAAACTTGGCACTCCTG 2048 90
ATAGCAAGCTGAACTGTCC 2089 91
TAGCAAGCTGAACTGTCCT 2090 92
AGCAAGCTGAACTGTCCTA 2091 93
GCAAGCTGAACTGTCCTAA 2092 94
TGAACTGTCCTAAGGCAGG 2098 95
CAAAGGAACCTACTTGTAC 470 96
GAGCTTGAAGGAACTACTA 1053 97
CACAGAGCCTAGACACTGA 1324 98
TCCAAGCTCTACTCCATTG 1002 99
TGGAGCTGTTGGTGGGAAT 328 100
GACAGGGAGAAGAGAGATA 387 101
GGGAGAAGAGAGATAGTGT 391 102
GAGAAGAGAGATAGTGTGT 393 103
GAAGAGAGATAGTGTGTGT 395 104
GTGTGTGTCCCCAAGGAAA 406 105
GAAAATATATCCACCCTCA 421 106
AAATATATCCACCCTCAAA 423 107
CTGTACCAAGTGCCACAAA 455 108
 
ACCAAGTGCCACAAAGGAA 459 109
CCAAGTGCCACAAAGGAAC 460 110
CCACAAAGGAACCTACTTG 467 111
CAAAGGAACCTACTTGTAC 470 112
AAAGGAACCTACTTGTACA 471 113
GATACGGACTGCAGGGAGT 513 114
CGGACTGCAGGGAGTGTGA 517 115
TCCTTCACCGCTTCAGAAA 543 116
CAGAAAACCACCTCAGACA 556 117
TGCCTCAGCTGCTCCAAAT 576 118
CTCCAAATGCCGAAAGGAA 587 119
TCCAAATGCCGAAAGGAAA 588 120
CCAAATGCCGAAAGGAAAT 589 121
GCCGAAAGGAAATGGGTCA 595 122
AGGAAATGGGTCAGGTGGA 601 123
GGAAATGGGTCAGGTGGAG 602 124
GTGTGTGGCTGCAGGAAGA 651 125
GGAAGAACCAGTACCGGCA 664 126
CCATGCAGGTTTCTTTCTA 785 127
CATGCAGGTTTCTTTCTAA 786 128
TGCAGGTTTCTTTCTAAGA 788 129
AGGTTTCTTTCTAAGAGAA 791 130
GGTTTCTTTCTAAGAGAAA 792 131
AGAGAAAACGAGTGTGTCT 804 132
GAGTGTGTCTCCTGTAGTA 813 133
CTGTAGTAACTGTAAGAAA 824 134
AGAAAAGCCTGGAGTGCAC 838 135
TTGAGAATGTTAAGGGCAC 877 136
TGTTAAGGGCACTGAGGAC 884 137
GGTCATTTTCTTTGGTCTT 929 138
CCTCCTCTTCATTGGTTTA 959 139
 
TCCTCTTCATTGGTTTAAT 961 140
CTCTTCATTGGTTTAATGT 963 141
TCTTCATTGGTTTAATGTA 964 142
CTTCATTGGTTTAATGTAT 965 143
TCCAAGCTCTACTCCATTG 1002 144
CTCCATTGTTTGTGGGAAA 1013 145
GGGAAATCGACACCTGAAA 1026 146
TGAAGGAACTACTACTAAG 1058 147
ACCTCCAGCTCCACCTATA 1161 148
CCCACAAGCCACAGAGCCT 1315 149
ACGCCGTGGTGGAGAACGT 1360 150
GGAAGGAATTCGTGCGGCG 1393 151
TGAGCGACCACGAGATCGA 1420 152
GCGAGGCGCAATACAGCAT 1471 153
TGGGCTGCCTGGAGGACAT 1573 154
如上面实施例中引用的，本领域技术人员使用表1或2中提供的靶序列信息并且通过参考SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中的序列位置和加入或缺失分别与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2互补或者接近互补的核苷酸序列能够设计具有比表中提供的序列更长或更短长度的干扰RNA。
通过siRNA和其他形式的干扰RNA引导的靶标RNA切割反应是高度序列特异性的。通常，含有序列与靶标mRNA的部分相同的有义核苷酸链和与靶标mRNA的部分精确互补的反义核苷酸链的siRNA是用于抑制本文引用的mRNA的siRNA实施方案。然而，反义siRNA链和靶标mRNA之间或者反义siRNA链和有义siRNA链之间100％序列互补性不是实施本发明所需的。从而，例如，本发明允许序列变异，其可以预期是由于遗传突变、菌株多态性或者进化趋异。
在本发明的一个实施方案中，siRNA的反义链具有与靶标mRNA至少接近完全连续互补的至少19个核苷酸。如本文所用的，“接近完全”指siRNA的反义链与靶标mRNA的至少部分“基本上互补”并且siRNA的有义链与靶标mRNA的至少部分“基本上同一”。如本领域普通技术人员所知的“同一性”是如通过匹配序列之间核苷酸的顺序和同一性确定的核苷酸序列之间的序列相关性程度。在一个实施方案中，与靶标mRNA序列具有80％和80到100％互补性，例如85％、90％或95％互补性的siRNA的反义链被认为是接近完全互补并且可以用于本发明中。“完全”连续互补性是相邻碱基对的标准沃森-克里克碱基配对。“至少接近完全”连续互补性包括如本文所用的“完全”互补性。设计用于确定同一性或互补性的计算机方法以鉴定核苷酸序列的最大的匹配程度，例如，BLASTN(Altschul，S.F.，等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。
靶标mRNA(有义链)和siRNA的一条链(有义链)之间的关系是同一性关系。将siRNA的有义链也称作过客链(如果存在)。靶标mRNA(有义链)和siRNA的另一条链(反义链)之间的关系是互补性关系。将siRNA的反义链也称作引导链。
以5’到3’方向书写的核酸序列中倒数第二位碱基是与最后一个碱基相邻的碱基，即3’碱基相邻的碱基。以5’到3’方向书写的核酸序列的倒数第二位13个碱基是与3’碱基相邻的最后13个碱基的序列并且不包括3’碱基。类似地，以5’到3’方向书写的核酸序列的倒数第二位的14、15、16、17、或18个碱基是分别与3’碱基相邻的最后14、15、16、17、或18个碱基并且不包括3’碱基。
在本发明的一个实施方案中，连续核苷酸区是至少13个连续核苷酸的区域，其与对应于每种序列标识符标识的序列的mRNA的3’末端的倒数第二位13个核苷酸有至少90％序列互补性或者至少90％序列同一性。
在本发明的一个实施方案中，连续核苷酸区域是与对应于每个所述序列标识符鉴定的序列的mRNA的3’末端倒数第二位14个核苷酸具有至少85％序列互补性或者至少85％序列同一性的至少14个连续核苷酸的区域。在这种短语中包括两个核苷酸替代(即，12/14＝86％同一性/互补性)。
在本发明的另一实施方案中，连续核苷酸的区域是与对应于序列标识符鉴定的序列的mRNA的3’末端倒数第二位14个核苷酸具有至少80％序列互补性或者至少80％序列同一性的至少15、16、17或18个连续核苷酸的区域。在这种短语中包括三个核苷酸替代。
对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的mRNA中的靶序列可以在mRNA的5’或3’非翻译区中或者mRNA的编码区中。
双链干扰RNA的一条或两条链可以具有1到6个核苷酸的3’突出端，所述核苷酸可以是核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸或者其混合物。突出端的核苷酸不是碱基配对的。在本发明的一个实施方案中，干扰RNA包含TT或UU的3’突出端。在本发明的另一实施方案中，干扰RNA包含至少一个平末端。末端通常具有5’磷酸基团或者3’羟基基团。在其他实施方案中，反义链具有5’磷酸基团，有义链具有5’羟基基团。在其他实施方案中，通过共价加入其他分子或官能团进一步修饰末端。
双链siRNA的有义和反义链可以为如上述的两个单链的双链体形式或者可以是单个分子，其中互补性区域是碱基配对的并且通过发夹环共价连接，从而形成单链。认为发夹通过称作切丁酶的蛋白质在细胞内切割，形成两个单独碱基配对的RNA分子的干扰RNA。
干扰RNA可以通过加入、缺失、替代或修饰一个或多个核苷酸而与天然存在的RNA不同。非核苷酸材料可以结合到干扰RNA的5’末端、3’末端或者内部。通常设计此类修饰以增加干扰RNA的核酸酶抗性，提高细胞摄入，增强细胞寻靶，帮助示踪干扰RNA，进一步提高稳定性，或者降低干扰素途径活化的潜力。例如，干扰RNA可以在突出端的末端包含嘌呤核苷酸。通过例如吡咯烷接头将胆固醇缀合到siRNA分子的有义链的3’末端为siRNA提供了稳定性。
其他修饰包括例如3’末端生物素分子、已知具有细胞穿透性质的肽、纳米颗粒、肽模拟物、荧光染料，或者树状聚体。
核苷酸可以在它们的碱基部分、在它们的糖部分、或者在该分子的磷酸部分被修饰并且在本发明的实施方案中发挥功能。修饰包括例如用烷基、烷氧基、氨基、脱氮杂、卤素、羟基、硫羟基或者其组合取代。核苷酸可以用具有更大稳定性的类似物取代，如用脱氧核糖核苷酸取代核糖核苷酸，或者具有糖修饰，如用2’氨基、2’O-甲基、2’甲氧基乙基，或者2’-O，4’-C亚甲基桥取代2’OH基团。核苷酸的嘌呤或嘧啶类似物的实例包括黄嘌呤、次黄嘌呤、氮杂嘌呤、甲基硫代腺嘌呤、7-脱氮杂-腺苷和O-和N-修饰的核苷酸。可以用氮或者硫(硫代磷酸酯)取代磷酸基团的一个或多个氧来修饰核苷酸的磷酸基团。修饰可用于例如增强功能、提高稳定性或通透性，或者指导定位或寻靶。
可以存在不与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的部分互补的反义干扰RNA链的一个或多个区域。非互补区可以在互补区的3’或5’端或两端或者在两个互补区之间。
干扰RNA可以通过化学合成、体外转录或用切丁酶或具有相似活性的另一合适的核酸酶切割较长的双链RNA外源地产生。使用常规的DNA/RNA合成仪从受保护的核糖核苷亚磷酰胺产生的化学合成的干扰RNA可以从供应商如Ambion Inc.(Austin，TX)、Invitrogen(Carlsbad，CA)，或Dharmacon(Lafayette，CO)得到。通过例如用溶剂或树脂提取、沉淀、电泳、层析或者其组合纯化干扰RNA。备选地，干扰RNA可以进行很少的纯化(如果使用)以避免由于样品处理导致的损失。
干扰RNA也可以从质粒或病毒表达载体或者从最小的表达盒内源地表达，所述表达盒为例如，PCR产生的片段，其包含一个或多个启动子和干扰RNA的一个或多个合适的模板。用于shRNA的通过商业途径可获得的基于质粒的表达载体的实例包括pSilencer系列的成员(Ambion，Austin，TX)和pCpG-siRNA(InvivoGen，San Diego，CA)。用于表达干扰RNA的病毒载体可以从多种病毒得到，包括腺病毒、腺伴随病毒、慢病毒(例如，HIV、FIV和EIAV)，和泡疹病毒。用于shRNA表达的通过商业途径可获得的病毒载体的实例包括pSilencer adeno(Ambion，Austin，TX)和pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST(Invitrogen，Carlsbad，CA)。病毒载体的选择、从载体表达干扰RNA的方法和递送病毒载体的方法是本领域技术人员能力之内的。用于产生PCR产生的shRNA表达盒的试剂盒的实例包括Silencer Express(Ambion，Austin，TX)和siXpress(Minis，Madison，WI)。可以通过从能够表达第一种干扰RNA的第一种表达载体体内表达施用第一种干扰RNA，并且可以通过从能够表达第二种干扰RNA的第二种表达载体体内表达施用第二种干扰RNA，或者可以通过从能够表达两种干扰RNA的单个表达载体体内表达施用两种干扰RNA。
可以从本领域技术人员已知的多种真核启动子表达干扰RNA，所述启动子包括pol III启动子，如U6或H1启动子，或者pol II启动子，如巨细胞病毒启动子。本领域技术人员将认识到可以改造这些启动子以允许可诱导地表达干扰RNA。
在生理条件下杂交：在本发明的一些实施方案中，干扰RNA的反义链作为RISC复合体的部分在体内与mRNA杂交。
例如，可以在约50％甲酰胺、37℃到42℃下发生高严格条件。可以在约35％到25％甲酰胺、30℃到35℃的条件下发生降低的严格性条件。杂交的严格性条件的实例在Sambrook，J.，1989，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y中提供。严格杂交条件的其他实例包括400mM NaCl，40mMPIPES pH6.4，1mM EDTA，50℃或70℃下12-16小时接着洗涤，或者在70℃下1XSSC中或者50℃下1XSSC，50％甲酰胺中杂交，接着在0.3XSSC中70℃下洗涤，或者在4XSSC中70℃下或者4XSSC，50％甲酰胺中50℃下杂交，接着在67℃下1XSSC中洗涤。杂交温度比杂交分子的解链温度(Tm)低5-10℃，其中对于长度为19到49个碱基对的杂交分子，使用下面的计算确定Tm：Tm℃＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是杂交分子中碱基数目，[Na+]是杂交缓冲液中钠离子浓度。
上述体外杂交测定法提供了预测候选siRNA和靶标之间的结合是否将具有特异性的方法。然而，在RISC复合物的背景中，用在体外杂交不表现出高严格性的反义链也可以发生对靶标的特异切割。
单链干扰RNA：如上面引用的，干扰RNA最终作为单链发挥功能。已经发现单链(ss)干扰RNA实现mRNA沉默，尽管效率比双链siRNA的低。因此，本发明的实施方案也提供了ss干扰RNA的施用，所述ss干扰RNA在生理条件下与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的一部分杂交并且具有分别与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的杂交部分至少接近完全连续互补的至少19个核苷酸的区域。与上面引用的ds干扰RNA一样，表1或表2的ss干扰RNA具有19到49个核苷酸的长度。ss干扰RNA具有5’磷酸或者在5’位置原位或体内磷酸化。术语“5’磷酸化的”用于描述例如多核苷酸或寡核苷酸，其具有通过酯键连接到该多核苷酸或寡核苷酸的5’末端的糖(例如，核糖、脱氧核糖或者它们的类似物)的C5羟基。
与ds干扰RNA一样，ss干扰RNA通过化学合成或者通过体外转录或者从载体或表达盒内源表达。5’磷酸基团可以通过激酶加入，或者5’磷酸可以是RNA的核酸酶切割的结果。递送与ds干扰RNA一样。在一个实施方案中，施用具有受保护的末端和核酸酶抗性修饰的ss干扰RNA用于沉默。可以将ss干扰RNA干燥用于保存或者溶解在水性溶液中。溶液可以含有缓冲剂或盐以抑制退火或用于稳定。
与ds干扰RNA一样，ss干扰RNA通过化学合成或者通过体外转录或者从载体或表达盒内源表达。5’磷酸基团可以通过激酶加入，或者5’磷酸可以是RNA的核酸酶切割的结果。递送与ds干扰RNA一样。在一个实施方案中，施用具有受保护的末端和核酸酶抗性修饰的ss干扰RNA用于沉默。可以将ss干扰RNA干燥用于保存或者溶解在水性溶液中。溶液可以含有缓冲剂或盐以抑制退火或用于稳定。
发夹干扰RNA：发夹干扰RNA是单个分子(例如，单个寡核苷酸链)，其在茎环或发夹结构(例如，shRNA)中包含干扰RNA的有义链和反义链。例如，shRNA可以从DNA载体表达，所述载体中，编码有义干扰RNA链的DNA寡核苷酸通过短的间隔区连接到编码反向互补的反义干扰RNA链的DNA寡核苷酸。如果选择的表达载体需要，那么可以加入3’末端T和形成限制性位点的核苷酸。所得的RNA转录物自身向后折叠形成茎环结构。
施用方式：例如，可以通过气雾剂、含服、皮肤、皮内、吸入、肌内、鼻内、眼内、肺内、静脉内、腹膜内、经鼻、眼、口、耳、肠胃外、贴剂、皮下、舌下、局部或者经皮施用递送干扰RNA。
可以通过眼组织施用，如眼周、结膜、眼球筋膜下(subtenon)、前房内(intracameral)、玻璃体内、眼内、视网膜下、结膜下、眼球后、小管内或脉络膜上；通过注射直接施用于眼；或者使用导管或者其他放置装置，如视网膜弹丸剂、眼内插入物、栓剂或者包含多孔的、非多孔的或者凝胶状材料的植入物直接应用于眼；通过局部眼滴剂或者软膏剂；或者通过盲路中的缓释装置或者植入巩膜附近(经巩膜)或者眼中进行递送。前眼房注射可以通过角膜注射到前房中以允许活性剂到达小梁网。小管内注射可以注射到静脉集合管引流输淋管或者注射到输淋管中。
可以直接施用于耳，例如，通过局部耳滴剂或软膏剂、耳中的缓释装置或者植入耳附近。局部施用包括耳的肌内、鼓室内腔和耳蜗内注射施用途径。此外，通过将用干扰RNA浸泡的明胶海绵或者类似的吸收和附着产品对着中耳/内耳膜或邻近结构的窗口膜(window membrane)放置，可以施用活性剂。
可以直接施用于肺，例如，通过气雾剂化的制剂，和通过吸入器或者雾化器吸入。
此外，施用方式包括片剂、丸剂和胶囊剂，它们都能够由本领域技术人员配制。
受试者：需要治疗TNFα相关状况或者处于发生TNFα相关状况的受试者是患有TNFα相关炎性状况或者患有干眼或者处于患TNFα相关炎性状况或干眼的人或其他哺乳动物。TNFα相关炎性状况包括例如与如本文引用的不希望的或者不合适的TNFα活性相关的变应性结膜炎、眼炎症、皮炎、鼻炎或者哮喘。
与TNFα相关状况相关的眼结构包括例如眼、视网膜、脉络膜、晶状体、角膜、小梁网、虹膜、视神经、视神经头、巩膜、眼房、玻璃体房、睫状体或者后段。
与此类病症相关的耳结构可以包括例如内耳、中耳、外耳、鼓室腔或膜、耳蜗或者咽鼓管。
与此类病症相关的肺结构可以包括鼻、嘴、咽、喉、小支气管、气管、峰板(分隔右和左主支气管的开口的隆起物)，和肺，尤其是下部肺，如细支气管和肺泡。
受试者也可以是耳细胞、肺细胞、眼细胞、细胞培养物、器官或离体(ex vivo)器官或组织。
制剂和剂量：药物制剂包含按重量计高达99％的本发明的干扰RNA或其盐，其与生理学上可接受的载体介质如水、缓冲剂、盐水、甘氨酸、透明质酸、甘露醇等等混合。
本发明的干扰RNA作为溶液剂、混悬剂或乳剂施用。下面是本发明体现的可能的制剂的实例：
 
以重量％表示的量
干扰RNA 高达99；0.1-99；0.1-50；0.5-10.0
羟丙基甲基纤维素 0.5
氯化钠 0.8
苯扎氯铵 0.01
EDTA 0.01
NaOH/HCl 至pH7.4
纯化的水(无RNA酶) 至100mL
 
以重量％表示的量
干扰RNA 高达99；0.1-99；0.1-50；0.5-10.0
磷酸缓冲盐水 1.0
苯扎氯铵 0.01
聚山梨酯80 0.5
纯化的水(无RNA酶) 至100％
 
以重量％表示的量
干扰RNA 高达99；0.1-99；0.1-50；0.5-10.0
磷酸二氢钠 0.05
磷酸氢二钠(无水) 0.15
氯化钠 0.75
 
EDTA二钠 0.05
Cremophor EL 0.1
苯扎氯铵 0.01
HCI和/或NaOH pH7.3-7.4
纯化的水(无RNA酶) 至100％
 
以重量％表示的量
干扰RNA 高达99；0.1-99；0.1-50；0.5-10.0
磷酸缓冲盐水 1.0
羟丙基-β-环糊精 4.0
纯化的水(无RNA酶) 至100％
通常，本发明实施方案的有效量的干扰RNA导致靶细胞表面的细胞外浓度为100pM到1000nM，或1nM到400nM，或5nM到约100nM或到约10nM。实现该局部浓度所需的剂量将随着许多因素而变，所述因素包括递送方法、递送位点、递送位点和靶细胞或组织之间细胞层数目，和递送是局部还是全身的，等等。递送位点的浓度可以比靶细胞或组织表面的显著更高。根据临床医生的常规考虑，将局部组合物每天四次或以延长的递送时间表，如每天、每周、每两周、每月或更长时间一次递送到靶器官表面。制剂的pH为约pH4-9，或pH4.5到pH7.4。
预期用针对TACE mRNA或TNFR1 mRNA的siRNA治疗性治疗患者与小分子治疗相比具有益处，干扰RNA治疗性治疗通过增加作用持续时间从而允许较低频率给药和更大的患者依从性。
制剂的有效量可以取决于如下因素，如受试者的年龄、种族、性别、TNFα相关状况的严重性、靶基因转录/蛋白质更新的速率、干扰RNA效力、和干扰RNA稳定性。在一个实施方案中，将干扰RNA局部递送到靶器官并且以治疗剂量到达含有TACE mRNA或TNFR1 mRNA的组织，从而减轻TNFα相关的过程。
可接受的载体：可接受的载体指这样的载体，其最多引起、很少引起或不引起眼刺激、如果需要，提供合适的防腐作用，和以均匀剂量递送本发明的一种或多种干扰RNA。用于施用本发明实施方案的干扰RNA的可接受的载体包括基于阳离子脂类的转染试剂-TKO(MirusCorporation，Madison，WI)、
Figure A200780017777D00422
Lipofectamine、OLIGOFECTAMINETM(Invitrogen，Carlsbad，CA)或DHARMAFECTTM(Dharmacon，Lafayette，CO)；聚阳离子，如聚乙烯亚胺；阳离子肽，如Tat、聚精氨酸或者Penetratin(Antp肽)；或者脂质体。脂质体从标准的形成小泡的脂类和固醇，如胆固醇形成，并且可以包括寻靶分子，如对内皮细胞表面抗原具有结合亲和力的单克隆抗体。此外，脂质体可以是加入聚乙二醇的脂质体。
可以以溶液、悬浮液、或者生物蚀解的或非生物蚀解的递送装置递送干扰RNA。干扰RNA可以单独递送或者作为确定的共价缀合物的组分递送。干扰RNA也可以与阳离子脂类、阳离子肽、或者阳离子聚合物络合；与具有核酸结合性质的蛋白质、融合蛋白或者蛋白质结构域(例如，鱼精蛋白)络合；或者包囊在纳米颗粒中。通过包括合适的寻靶部分如抗体或者抗体片段可以完成组织或细胞特异性递送。
对于经眼、耳或肺递送，干扰RNA可以与眼科、眼或肺可接受的防腐剂、共溶剂、表面活性剂、粘性增强剂、渗透增强剂、缓冲剂、氯化钠或者水组合以形成水性的无菌混悬液或溶液。通过将干扰RNA溶解在生理学上可接受的等渗水性缓冲液中可以制备溶液制剂。此外，溶液可以包括可接受的表面活性剂以帮助溶解抑制剂。粘性助剂，如羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等可以加入到本发明的组合物中用于提高化合物的保留。
为了制备无菌软膏制剂，将干扰RNA与防腐剂在合适的载体，如矿物油、液体羊毛脂或者白矿脂中组合。根据本领域中已知的方法，通过将干扰RNA悬浮在从例如
Figure A200780017777D00423
-940(BF Goodrich，Charlotte，NC)等的组合制备的亲水基质中制备无菌凝胶制剂。
Figure A200780017777D00424
(AlconLaboratories，Inc.，Fort Worth，TX)可以用于例如眼内注射。在干扰RNA在目的器官或组织中的渗透性较弱的情况下，本发明的其他组合物可以含有渗透增强剂，如cremephor和
Figure A200780017777D00431
 80(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯，Sigma Aldrich，St.Louis，MO)。
试剂盒：本发明的实施方案提供了试剂盒，其包括用于减弱如本文应用的mRNA在细胞中表达的试剂。该试剂盒含有siRNA或shRNA表达载体。对于siRNA和非病毒shRNA表达载体，试剂盒也可以含有转染试剂或者其他合适的递送载体。对于病毒shRNA表达载体，试剂盒可以含有病毒载体和/或病毒载体的产生所必须的组分(例如，包装细胞系以及包含病毒载体模板的载体和用于包装的额外辅助载体)。试剂盒也可以含有阳性和阴性对照siRNA或者shRNA表达载体(例如，非寻靶对照siRNA或者靶定不相关mRNA的siRNA)。试剂盒还可以含有用于评估预期靶基因的击倒的试剂(例如，用于检测靶标mRNA的定量PCR的引物和探针和/或用于蛋白质印迹的抗对应蛋白质的抗体)。备选地，试剂盒可以包含siRNA序列或者shRNA序列和使用说明书和通过体外转录产生siRNA或者构建shRNA表达载体必须的材料。
还提供了药盒形式的药物组合，其在包装的组合中包括载体工具，其适于接受与之密切限制的容器工具，和第一个容器工具，其包括干扰RNA组合物和可接受的载体。如果需要，此类药盒可以还包括多种常规的药物药盒组分的一种或多种，如具有一种或多种药学上可接受的载体的容器、额外容器，等等，如本领域技术人员将显而易见。药盒中也可以包括作为插页或标签的印刷的说明书，其指出待施用的组分的量，施用指导，和/或用于混合组分的指导。
如下在体外评估TACE或TNFR1干扰RNA击倒例如人角膜上皮细胞中内源TACE或TNFR1表达水平的能力。在KGM角质形成细胞培养基(Cambrex，East Rutherford，NJ)中转染前24小时，将转化的人角膜上皮细胞例如CEPI-17细胞系(Offord等人(1999)Invest Ophthalmol Vis Sci40：1091-1101)平板接种。使用DharmaFECTTM 1(Dharmacon，Lafayette，CO)根据生产商的说明书以0.1nM-100nM的TACE-或TNFR1干扰RNA浓度进行转染。将非寻靶对照干扰RNA和核纤层蛋白A/C干扰RNA(Dharmacon)用作对照。转染后24小时使用例如正向和反向引物和包含靶位点的探针组(Applied Biosystems，Foster City，CA)通过qPCR评估目标mRNA水平。可以在转染后72小时(实际的时间取决于蛋白质更新率)通过例如蛋白质印迹评估目标蛋白质水平。用于从培养的细胞分离RNA和/或蛋白质的标准技术是本领域技术人员公知的。为了减小非特异性脱靶效应的机会，使用最低可能浓度的TACE-或TNFR1干扰RNA，其在靶基因表达中产生希望水平的击倒。
本领域技术人员按照本公开将明白可以做出本文公开的实施方案的明显修饰而不背离本发明的精神和范围。根据本公开，不用过度实验就可以做出和执行本文公开的所有实施方案。本发明的完整范围在本公开和其等同实施方案中给出。说明书不应被理解为过度地限制本发明应有的完整保护范围。
尽管已经显示和描述了本发明的具体实施方案，但是本领域技术人员将想到许多变型和备选实施方案。因此，本发明预期将仅仅受到所附权利要求的限制。
本发明可以以其他特定形式体现而不背离其精神或基本特征。所述的实施方案将在所有方面仅仅被认为是说明性而非限制性的。因此，本发明的范围通过所附权利要求而不是前面的说明书指出。在权利要求等同的含义和范围内出现的权利要求的所有改变都被包括在它们的范围内。此外，将本文提到的所有出版的文献、专利和专利申请都引入本文作为参考，就好像将它们完整给出一样。
实施例1用于在GTM-3细胞中特异沉默TNFR1的干扰RNA
本研究检查TNFR1干扰RNA击倒在培养的GTM-3细胞中内源TNFR1蛋白质表达水平的能力。
使用TNFR1 siRNAs、siCONTROL无RISC的-siRNA #1，或siCONTROL非寻靶siRNA #2(NTC2)和
Figure A200780017777D00441
 #1转染试剂(Dharmacon，Lafayette，CO)的标准体外浓度(0.1-10nM)完成GTM-3细胞的转染(Pang，I.H.等人，1994.Curr.Eye Res.13：51-63)。将所有siRNA溶解在1XsiRNA缓冲液中，该缓冲液为20mM KCl，6mM HEPES(pH7.5)，0.2mM MgCl2的水溶液。对照样品包括缓冲液对照，其中将siRNA的体积用等体积的1X siRNA缓冲液(-siRNA)置换。使用抗TNFR抗体(SantaCruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)进行蛋白质印迹以评估TNFR1蛋白质表达。TNFR1 siRNA是对下面的靶标具有特异性的双链干扰RNA：siTNFR1 #1靶定序列CAAAGGAACCUACUUGUAC(SEQ ID NO：202)，从其得到SEQ ID NO：96；siTNFR1 #2靶定序列GAGCUUGAAGGAACUACUA(SEQ ID NO：203)，从其得到SEQ IDNO：97；siTNFR1 #3靶定序列CACAGAGCCUAGACACUGA(SEQ IDNO：204)，从其得到序列SEQ ID NO：98；siTNFR1#4靶定序列UCCAAGCUCUACUCCAUUG(SEQ ID NO：205)，从其得到序列SEQ IDNO：99。如图1中数据所示，siTNFR1 #1、siTNFR1 #2和siTNFR1 #3 siRNA在10nM和1nM浓度下相对于对照siRNA显著降低TNFR1蛋白质表达，但是在0.1nM显示出降低的功效。siTNFR1 #2和siTNFR1 #3 siRNA尤其有效。如所预期的，siTNFR1 #4 siRNA也显示出TNFR1蛋白质表达的浓度依赖性降低。
序列表
<110>J·M·亚恩
     J·E·查特尔顿
     Senchyna，Diane Michelle
     D·A·盖玛彻
     S·T·米勒
<120>肿瘤坏死因子α相关状况的RNAi介导的抑制
<130>45263-P019US
<160>205
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>3572
<212>DNA
<213>人
<400>1
Figure A200780017777D00461
Figure A200780017777D00471
Figure A200780017777D00481
Figure A200780017777D00491
<210>2
<211>2236
<212>DNA
<213>人
<400>2
Figure A200780017777D00492
Figure A200780017777D00501
Figure A200780017777D00511
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<211>19
<212>DNA
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<223>靶序列
<400>3
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<221>misc_feature
<222>(20)..(21)
<223>任一，A，T/U，C，G
<400>4
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<210>5
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<212>DNA
<213>人工的
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<223>具有3’NN的反义链
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<223>核糖核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(21)
<223>任一，A，T/U，C，G
<400>5
Figure A200780017777D00521
<210>6
<211>21
<212>RNA
<213>人工的
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<400>6
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<211>21
<212>RNA
<213>人工的
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<223>反义链
<400>7
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<212>RNA
<213>人工的
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<212>RNA
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<210>10
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<213>人工的
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<223>具有环的发夹双链体
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<223>核糖核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(27)
<223>任一，A，T/U，C，G
<220>
<221>misc_feature
<222>(28)..(48)
<223>核糖核苷酸
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<223>靶序列
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<213>人工的
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<223>靶序列
<400>46
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>47
<210>48
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>48
Figure A200780017777D00642
<210>49
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>49
Figure A200780017777D00643
<210>50
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>50
Figure A200780017777D00651
<210>51
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>51
Figure A200780017777D00652
<210>52
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>52
Figure A200780017777D00653
<210>53
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>53
Figure A200780017777D00654
<210>54
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>54
<210>55
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>55
Figure A200780017777D00662
<210>56
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>56
<210>57
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>57
Figure A200780017777D00664
<210>58
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>58
Figure A200780017777D00671
<210>59
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>59
<210>60
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>60
Figure A200780017777D00673
<210>61
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>61
Figure A200780017777D00681
<210>62
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>62
Figure A200780017777D00682
<210>63
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>63
<210>64
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>64
Figure A200780017777D00684
<210>65
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>65
<210>66
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>66
Figure A200780017777D00692
<210>67
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>67
Figure A200780017777D00693
<210>68
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>68
Figure A200780017777D00694
<210>69
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>69
Figure A200780017777D00701
<210>70
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>70
Figure A200780017777D00702
<210>71
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>71
Figure A200780017777D00703
<210>72
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>72
Figure A200780017777D00711
<210>73
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>73
Figure A200780017777D00712
<210>74
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>74
Figure A200780017777D00713
<210>75
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>75
<210>76
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>76
Figure A200780017777D00721
<210>77
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<440>78
Figure A200780017777D00722
<210>78
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>78
Figure A200780017777D00723
<210>79
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>79
Figure A200780017777D00724
<210>80
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>80
Figure A200780017777D00731
<210>81
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>81
<210>82
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>82
Figure A200780017777D00733
<210>83
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>83
Figure A200780017777D00741
<210>84
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>84
Figure A200780017777D00742
<210>85
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>85
Figure A200780017777D00743
<210>86
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>86
<210>87
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>87
Figure A200780017777D00751
<210>88
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>88
<210>89
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>89
Figure A200780017777D00753
<210>90
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>90
<210>91
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>91
Figure A200780017777D00761
<210>92
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>92
Figure A200780017777D00762
<210>93
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>93
Figure A200780017777D00763
<210>94
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>94
Figure A200780017777D00771
<210>95
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>95
Figure A200780017777D00772
<210>96
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>96
Figure A200780017777D00773
<210>97
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>97
<210>98
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>98
Figure A200780017777D00781
<210>99
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>99
<210>100
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>100
<210>101
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>101
Figure A200780017777D00784
<210>102
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>102
Figure A200780017777D00791
<210>103
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>103
Figure A200780017777D00792
<210>104
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>104
Figure A200780017777D00793
<210>105
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>105
Figure A200780017777D00801
<210>106
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>106
<210>107
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>107
Figure A200780017777D00803
<210>108
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>108
Figure A200780017777D00804
<210>109
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>109
Figure A200780017777D00811
<210>110
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>110
Figure A200780017777D00812
<210>111
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>111
<210>112
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>112
Figure A200780017777D00814
<210>113
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>113
<210>114
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>114
<210>115
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>115
Figure A200780017777D00823
<210>116
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>116
Figure A200780017777D00831
<210>117
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>117
Figure A200780017777D00832
<210>118
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>118
Figure A200780017777D00833
<210>119
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>119
<210>120
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>120
Figure A200780017777D00841
<210>121
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>121
Figure A200780017777D00842
<210>122
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>122
Figure A200780017777D00843
<210>123
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>123
Figure A200780017777D00844
<210>124
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>124
Figure A200780017777D00851
<210>125
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>125
Figure A200780017777D00852
<210>126
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>126
Figure A200780017777D00853
<210>127
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>127
Figure A200780017777D00861
<210>128
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>128
Figure A200780017777D00862
<210>129
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>129
Figure A200780017777D00863
<210>130
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>130
Figure A200780017777D00864
<210>131
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>131
Figure A200780017777D00871
<210>132
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>132
Figure A200780017777D00872
<210>133
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>133
Figure A200780017777D00873
<210>134
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>134
Figure A200780017777D00874
<210>135
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>135
Figure A200780017777D00881
<210>136
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>136
Figure A200780017777D00882
<210>137
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>137
Figure A200780017777D00883
<210>138
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>138
Figure A200780017777D00891
<210>139
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>139
<210>140
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>140
Figure A200780017777D00893
<210>141
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>141
Figure A200780017777D00894
<210>142
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>142
<210>143
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>143
Figure A200780017777D00902
<210>144
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>144
Figure A200780017777D00903
<210>145
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>145
Figure A200780017777D00904
<210>146
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>146
Figure A200780017777D00911
<210>147
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>147
<210>148
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>148
<210>149
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>149
Figure A200780017777D00921
<210>150
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>150
Figure A200780017777D00922
<210>151
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>151
Figure A200780017777D00923
<210>152
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>152
Figure A200780017777D00924
<210>153
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>153
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<211>19
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<213>人工的
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<210>200
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
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<223>靶序列
<400>200
Figure A200780017777D01061
<210>201
<211>19
<212>DNA
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Figure A200780017777D01062
<210>202
<211>19
<212>RNA
<213>人工的
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<223>靶序列
<400>202
Figure A200780017777D01063
<210>203
<211>19
<212>RNA
<213>人工的
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<223>靶序列
<400>203
Figure A200780017777D01064
<210>204
<211>19
<212>RNA
<213>人工的
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<223>靶序列
<400>204
Figure A200780017777D01071
<210>205
<211>19
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>205
Figure A200780017777D01072

Claims (42)

1.化合物用于生产减弱受试者中TACE mRNA表达的药物的用途，包括：
对受试者施用组合物，该组合物包含有效量的具有19到49个核苷酸长度的干扰RNA和可药用载体，所述干扰RNA包含：
与对应于SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：14-SEQ ID NO：58和SEQ IDNO：155-SEQ ID NO：201任一个的mRNA的3’末端的倒数第二位13个核苷酸有至少80％序列互补性或至少90％序列同一性的至少13、14、15、16、17或18个连续核苷酸的区域，
其中从而减弱TACE mRNA的表达。
2.权利要求1的用途，其中所述干扰RNA是shRNA、miRNA或siRNA之一。
3.权利要求1的用途，其中通过气雾剂、含服、皮肤、皮内、吸入、肌内、鼻内、眼内、肺内、静脉内、腹膜内、鼻、眼、口、耳、肠胃外、贴剂、皮下、舌下、局部或经皮途径施用所述组合物。
4.权利要求1的用途，其中通过从能够表达所述干扰RNA的表达载体在体内表达施用所述干扰RNA。
5.化合物用于生产治疗需要其的受试者中TNFα相关状况的药物的用途，包括：
对受试者施用组合物，该组合物包含有效量的具有19到49个核苷酸长度的干扰RNA和可药用载体，其中
所述干扰RNA包含与对应于SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：14-SEQ IDNO：58和SEQ ID NO：155-SEQ ID NO：201任一个的mRNA的3’末端的倒数第二位13个核苷酸有至少80％序列互补性或至少90％序列同一性的至少13、14、15、16、17或18个连续核苷酸的区域；
其中从而治疗所述TNFα相关的状况。
6.权利要求5的用途，其中所述干扰RNA是shRNA、miRNA或siRNA之一。
7.权利要求5的用途，其中通过气雾剂、含服、皮肤、皮内、吸入、肌内、鼻内、眼内、肺内、静脉内、腹膜内、鼻、眼、口、耳、肠胃外、贴剂、皮下、舌下、局部或经皮途径施用所述组合物。
8.权利要求5的用途，其中通过从能够表达所述干扰RNA的表达载体在体内表达施用所述干扰RNA。
9.权利要求5的用途，其中所述受试者是人并且该人患有干眼或者处于患干眼的危险中。
10.权利要求5的用途，其中所述受试者是人并且该人患有TNFα相关的炎性状况或处于患TNFα相关的炎性状况的危险中。
11.化合物用于生产减弱受试者的TACE mRNA表达的药物的用途，包括：
对受试者施用组合物，该组合物包含有效量的具有19到49个核苷酸长度的干扰RNA和可药用载体，所述干扰RNA包含：
有义核苷酸链、反义核苷酸链，和至少19个核苷酸的至少接近完全连续互补的区域；
其中所述反义链在生理条件下与对应于SEQ ID NO：1的mRNA的部分杂交，所述部分包含核苷酸297、333、334、335、434、470、493、547、570、573、618、649、689、755、842、844、846、860、878、894、900、909、910、913、942、970、984、1002、1010、1053、1064、1137、1162、1215、1330、1334、1340、1386、1393、1428、1505、1508、1541、1553、1557、1591、1592、1593、1597、1604、1605、1626、1632、1658、1661、1691、1794、1856、1945、1946、1947、1958、2022、2094、2100、2121、2263、2277、2347、2349、2549、2578、2595、2606、2608、2629、2639、2764、2766、2767、2769、3027、3028、3261、3264、3284、3313、3317、3332或3337；
其中从而减弱TACE mRNA的表达。
12.化合物用于生产减弱受试者的TNFR1 mRNA表达的药物的用途，包括：
对受试者施用组合物，该组合物包含有效量的具有19到49个核苷酸长度的干扰RNA和可药用载体，所述干扰RNA包含：
有义核苷酸链、反义核苷酸链，和至少19个核苷酸的至少接近完全连续互补的区域；
其中所述反义链在生理条件下与对应于SEQ ID NO：2的mRNA的部分杂交，所述部分在核苷酸124、328、387、391、393、395、406、421、423、444、447、455、459、460、467、469、470、471、475、479、513、517、531、543、556、576、587、588、589、595、601、602、611、612、651、664、667、668、669、677、678、785、786、788、791、792、804、813、824、838、843、877、884、929、959、960、961、963、964、965、970、973、974、1000、1002、1013、1026、1053、1056、1057、1058、1161、1315、1318、1324、1357、1360、1383、1393、1420、1471、1573、1671、2044、2045、2046、2047、2048、2089、2090、2091或2092处开始；
其中从而减弱TNFR1 mRNA的表达。
13.权利要求12的用途，其中所述受试者是人并且该人患有干眼或者处于患干眼的危险中。
14.权利要求12的用途，其中所述受试者是人并且该人患有TNFα相关状况或处于患TNFα相关状况的危险中。
15.权利要求12的用途，其中所述有义核苷酸链和反义核苷酸链通过环状核苷酸链连接。
16.权利要求12的用途，其中通过气雾剂、含服、皮肤、皮内、吸入、肌内、鼻内、眼内、肺内、静脉内、腹膜内、鼻、眼、口、耳、肠胃外、贴剂、皮下、舌下、局部或经皮途径施用所述组合物。
17.权利要求12的用途，其中通过从能够表达所述干扰RNA的表达载体在体内表达施用所述干扰RNA。
18.化合物用于生产治疗需要其的受试者中TNFα相关状况的药物的用途，包括：
对受试者施用组合物，该组合物包含有效量的具有19到49个核苷酸长度的干扰RNA和可药用载体，所述干扰RNA包含有义核苷酸链、反义核苷酸链，和至少19个核苷酸的至少接近完全连续互补的区域；其中所述反义链在生理条件下与对应于SEQ ID NO：1的mRNA的部分杂交，所述部分包含核苷酸297、333、334、335、434、470、493、547、570、573、618、649、689、755、842、844、846、860、878、894、900、909、910、913、942、970、984、1002、1010、1053、1064、1137、1162、1215、1330、1334、1340、1386、1393、1428、1505、1508、1541、1553、1557、1591、1592、1593、1597、1604、1605、1626、1632、1658、1661、1691、1794、1856、1945、1946、1947、1958、2022、2094、2100、2121、2263、2277、2347、2349、2549、2578、2595、2606、2608、2629、2639、2764、2766、2767、2769、3027、3028、3261、3264、3284、3313、3317、3332或3337；
其中从而治疗所述TNFα相关状况。
19.化合物用于生产治疗需要其的受试者中TNFα相关的眼状况的药物的用途，包括：
对受试者的眼睛施用组合物，该组合物包含有效量的具有19到49个核苷酸长度的干扰RNA和可药用载体，所述干扰RNA包含有义核苷酸链、反义核苷酸链，和至少19个核苷酸的至少接近完全连续互补的区域；其中所述反义链在生理条件下与对应于SEQ ID NO：2的mRNA的部分杂交，所述部分包含核苷酸124、328、387、391、393、395、406、421、423、444、447、455、459、460、467、469、470、471、475、479、513、517、531、543、556、576、587、588、589、595、601、602、611、612、651、664、667、668、669、677、678、785、786、788、791、792、804、813、824、838、843、877、884、929、959、960、961、963、964、965、970、973、974、1000、1002、1013、1026、1053、1056、1057、1058、1161、1315、1318、1324、1357、1360、1383、1393、1420、1471、1573、1671、2044、2045、2046、2047、2048、2089、2090、2091或2092；
其中从而治疗所述TNFα相关的眼状况。
20.权利要求19的用途，其中所述受试者是人并且该人患有干眼或者处于患干眼的危险中。
21.权利要求19的用途，其中所述受试者是人并且该人患有变应性结膜炎或眼炎症或处于患有变应性结膜炎或眼炎症的危险中。
22.权利要求18的用途，其还包括对受试者施用第二种干扰RNA，该第二种干扰RNA具有19到49个核苷酸的长度并且包含：
有义核苷酸链、反义核苷酸链，和至少19个核苷酸的至少接近完全连续互补的区域；
其中所述第二种干扰RNA的反义链在生理条件下与对应于SEQ IDNO：2的mRNA的部分杂交，所述部分包含核苷酸124、328、387、391、393、395、406、421、423、444、447、455、459、460、467、469、470、471、475、479、513、517、531、543、556、576、587、588、589、595、601、602、611、612、651、664、667、668、669、677、678、785、786、788、791、792、804、813、824、838、843、877、884、929、959、960、961、963、964、965、970、973、974、1000、1002、1013、1026、1053、1056、1057、1058、1161、1315、1318、1324、1357、1360、1383、1393、1420、1471、1573、1671、2044、2045、2046、2047、2048、2089、2090、2091或2092。
23.权利要求19的用途，还包括对受试者的眼施用第二种干扰RNA，该第二种干扰RNA具有19到49个核苷酸的长度并且包含：
有义核苷酸链、反义核苷酸链，和至少19个核苷酸的至少接近完全连续互补的区域；
其中所述第二种干扰RNA的反义链在生理条件下与对应于SEQ IDNO：1的mRNA的部分杂交，所述部分包含核苷酸297、333、334、335、434、470、493、547、570、573、618、649、689、755、842、844、846、860、878、894、900、909、910、913、942、970、984、1002、1010、1053、1064、1137、1162、1215、1330、1334、1340、1386、1393、1428、1505、1508、1541、1553、1557、1591、1592、1593、1597、1604、1605、1626、1632、1658、1661、1691、1794、1856、1945、1946、1947、1958、2022、2094、2100、2121、2263、2277、2347、2349、2549、2578、2595、2606、2608、2629、2639、2764、2766、2767、2769、3027、3028、3261、3264、3284、3313、3317、3332、或3337。
24.权利要求18的用途，其中所述有义核苷酸链和反义核苷酸链通过环状核苷酸链连接。
25.权利要求18的用途，其中通过气雾剂、含服、皮肤、皮内、吸入、肌内、鼻内、眼内、肺内、静脉内、腹膜内、鼻、眼、口、耳、肠胃外、贴剂、皮下、舌下、局部或经皮途径施用所述组合物。
26.权利要求18的用途，其中通过从能够表达所述干扰RNA的表达载体在体内表达施用所述干扰RNA。
27.权利要求19的用途，其中所述有义核苷酸链和反义核苷酸链通过环状核苷酸链连接。
28.权利要求19的用途，其中通过气雾剂、含服、皮肤、皮内、吸入、肌内、鼻内、眼内、肺内、静脉内、腹膜内、鼻、眼、口、耳、肠胃外、贴剂、皮下、舌下、局部或经皮途径施用所述组合物。
29.权利要求19的用途，其中通过从能够表达所述干扰RNA的表达载体在体内表达施用所述干扰RNA。
30.化合物用于生产治疗需要其的受试者中TNFα相关状况的药物的用途，包括：
对受试者施用组合物，该组合物包含双链siRNA分子，其通过RNA干扰下调TACE基因的表达，
其中：
siRNA分子的每条链独立地为约19到约27个核苷酸长度；并且
siRNA分子的一条链包含与对应于TACE基因的mRNA具有实质互补性的核苷酸序列，使得该siRNA分子通过RNA干扰指导mRNA的切割。
31.化合物用于生产治疗需要其的受试者中TNFα相关的眼状况的药物的用途，包括：
对受试者施用组合物，该组合物包含双链siRNA分子，其通过RNA干扰下调TNFR1基因的表达，
其中：
siRNA分子的每条链独立地为约19到约27个核苷酸长度；并且
siRNA分子的一条链包含与对应于TNFR1基因的mRNA具有实质互补性的核苷酸序列，使得该siRNA分子通过RNA干扰指导所述mRNA的切割。
32.化合物用于生产减弱受试者的TACE mRNA表达的药物的用途，包括：
对受试者施用组合物，该组合物包含有效量的具有19到49个核苷酸长度的单链干扰RNA和可药用载体，
其中所述单链干扰RNA在生理条件下与对应于SEQ ID NO：1的mRNA的部分杂交，所述部分包含核苷酸297、333、334、335、434、470、493、547、570、573、618、649、689、755、842、844、846、860、878、894、900、909、910、913、942、970、984、1002、1010、1053、1064、1137、1162、1215、1330、1334、1340、1386、1393、1428、1505、1508、1541、1553、1557、1591、1592、1593、1597、1604、1605、1626、1632、1658、1661、1691、1794、1856、1945、1946、1947、1958、2022、2094、2100、2121、2263、2277、2347、2349、2549、2578、2595、2606、2608、2629、2639、2764、2766、2767、2769、3027、3028、3261、3264、3284、3313、3317、3332或3337，并且该干扰RNA具有与对应于SEQ ID NO：1的mRNA的杂交部分至少接近完全连续互补的区域，
其中从而减弱TACE mRNA的表达。
33.权利要求31的用途，其中所述受试者是人并且该受试者患有TNFα相关的眼状况。
34.权利要求31的用途，其中通过气雾剂、含服、皮肤、皮内、吸入、肌内、鼻内、眼内、肺内、静脉内、腹膜内、鼻、眼、口、耳、肠胃外、贴剂、皮下、舌下、局部或经皮途径施用所述组合物。
35.权利要求31的用途，其中通过从能够表达所述干扰RNA的表达载体在体内表达施用所述干扰RNA。
36.权利要求31的用途，其中所述干扰RNA是miRNA或siRNA。
37.权利要求29的用途，其中所述siRNA分子的每条链独立地为约19个核苷酸到约25个核苷酸长度。
38.权利要求29的用途，其中所述siRNA分子的每条链独立地为约19个核苷酸到约21个核苷酸长度。
39.组合物，其包含干扰RNA和可药用载体，所述干扰RNA具有19到49个核苷酸的长度，并且包含对应于SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：14-SEQID NO：58和SEQ ID NO：155-SEQ ID NO：201的任一个的核苷酸序列或其互补序列。
40.组合物，其包含干扰RNA和可药用载体，所述干扰RNA基本上由对应于SEQ ID NO：59-SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71-SEQ ID NO：92和SEQ ID NO：94-SEQ ID NO：154任一个的核苷酸序列或其互补序列组成。
41.权利要求39的组合物，其中所述干扰RNA是shRNA、siRNA或miRNA之一。
42.权利要求40的组合物，其中所述干扰RNA是shRNA、siRNA或miRNA之一。
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