CN105349502A - Tnfr1基因重组腺病毒及其构建 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种TNFR1基因重组腺病毒，所述腺病毒含有SEQ？ID？No.1所示核苷酸序列的干扰TNFR1基因表达的siRNA，将其连接于穿梭质粒pHBAd-U6-GFP的U6启动子之下，制备腺病毒穿梭质粒，再与骨架质粒pHBAd-BHG共转染293细胞，得到腺病毒Ad-TNFR1？shRNA。本发明的TNFR1基因重组腺病毒用于阻断/减少TNFR1的表达，阻断TNF通过该途径产生的生物学效应，从而设计工具药探索TNFR1在痛敏发生中的作用及胞内作用机制，并设计阻断炎性因子激活其受体的药物，以减弱受体激活后导致的痛敏作用。

Description

TNFR1基因重组腺病毒及其构建

技术领域

本发明属于基因生物工程技术领域，涉及一种腺病毒的构建，特别是涉及一种干扰TNFR1表达的重组腺病毒。

背景技术

NMDA受体是中枢神经系统内一类重要的兴奋性氨基酸受体，属离子型受体，在突触可塑性及兴奋毒性方面具有重要作用。

NMDA受体是由NR1、NR2和NR3亚单位组成的异四聚体，每种亚基在中枢神经系统中的分布不尽相同。一般认为，NR1是NMDA受体的必需亚基，在大脑和脊髓中大量分布，是实现其通道功能所必需的。NMDA受体不仅在神经系统发育过程中发挥重要的生理作用，而且对神经元回路的形成亦起着关键作用。Bird等人发现，在关节炎模型的大鼠杏仁核神经元中，NMDA受体NR1的磷酸化(pNR1)明显上调，而NR1的表达没有明显变化；脑片膜片钳实验中，给予杏仁核神经元NMDA受体的拮抗剂AP5可显著降低NMDA受体介导的EPSC幅度，而且在抑制PKA，即阻断了PKA磷酸化NR1的途径后，NMDA受体介导的EPSC也被阻断，类似现象在抑制PKC后并没有出现。这说明PKA介导的NR1磷酸化在突触后膜表达上调，是导致突触传递发生可塑性变化的重要原因，也是发生痛觉过敏的基础。

肿瘤坏死因子(TNF-α)是由神经元和胶质细胞分泌的炎性因子，TNF-α的许多生物效应是通过两个细胞表面受体TNFR1和TNFR2介导的。TNF-α的大多生物活性由TNFR1来传递信号，如细胞程序性死亡、抗病毒活性、转录因子NF-kappaB的激活以及宿主防御等；通过TNFR2的信号通路仅局限于免疫系统。这两个受体是TNF受体超家族的成员。

疼痛发生时，不仅神经元产生的神经肽类物质参与了痛信号的传入，而且神经胶质细胞释放的多种促炎细胞因子，如IL-1β和TNF-α等也促进伤害性信息的传入，如在炎性痛模型鼠脊髓就会明显发生TNF-α的表达上调。

资料表明，中枢和外周因素引起脊髓TNF-α表达上调，可以促成炎性和神经性疼痛的发生；脊髓胶质细胞释放的TNF-α可以提高神经元的兴奋性；癌痛动物内源性的TNF-α表达上调增强热敏反应；在鞘内直接注射TNF-α可增强大鼠脊髓广动力神经元的反应，并快速诱发动物自发性缩足行为和热痛反应，而在鞘内注射溶解的TNF-α受体的抗体显著减弱大鼠异常疼痛的发生。以上这些都说明，TNF-α在脊髓水平都可以通过激活TNF受体(TNFR)诱发痛觉过敏。

Wei等人研究发现，在脑干RVM利用TNF-α抑制剂，可减弱眶下神经慢性缩窄性损伤(CCI)诱发的痛敏反应，并下调pNR1的表达。因此，可以设想在脊髓水平TNF-α通过激活TNFR，介导了NMDA受体NR1亚基的磷酸化，引起兴奋传递的可塑性变化以及痛敏的发生。新近研究表明，TNF-α可以增加普通小鼠脊髓层细胞NMDA电流，鞘内应用NMDA受体阻断剂MK-801后可减弱鞘内注射TNF-α所致的热痛反应，说明TNF-α通过其受体TNFR影响了NMDA受体的功能活动。

目前已知TNFR的2种亚型TNFR1(55KD)和TNFR2(75KD)在背根神经节(DRG)和脊髓都有表达，但二者在痛调制中的作用还有争议。一般认为TNFR1与痛信号传递、痛觉过敏发生有密切关系，TNFR2并不参与此过程。而新近研究提出了不同的观点，Schafers等通过体内和体外实验证实，神经损伤后TNFR1在引起感觉神经元兴奋及诱导痛反应的过程中起主要作用，TNFR2在TNFR1作用时发挥协同作用，它独自并不产生类似TNFR1的作用，但在神经受损后，对临近未损伤感觉神经元的兴奋有易化作用。Xu等人认为，在L5腹前根离断损伤模型引起的神经病理性疼痛中，背根神经节和脊髓后角的TNF-α及其受体TNFR1的上调主要在疼痛起始过程起作用，但与神经切断产生的持续性疼痛无关。另外敲除TNFR1和TNFR2基因的小鼠实验提示，TNFR1和TNFR2都参与炎性痛和痛敏的过程，但TNFR1发挥了主导作用，TNFR2是参与了早期阶段的炎性痛反应。

TNF-α在痛信号传入时表达增多，并参与痛敏及异常疼痛的发生和维持，但其通过何种方式介导了这一过程，脊髓TNFR被激活后通过何种途径引起痛觉过敏，目前还并不清楚。鉴于以上研究，需要对炎性痛敏发生时，TNFR1和TNFR2与痛敏及pNR1的相互关系做进一步的研究。上述研究的基础是需要构建一种干扰TNFR基因表达的质粒载体，以用于阻断TNF与TNFR结合，阻断TNF通过该途径产生生物学效应。

发明内容

本发明的目的是提供一种TNFR1基因重组腺病毒，及该重组腺病毒的构建方法，以用于阻断/减少TNFR1的表达，从而缓解TNF-α通过该途径产生的生物学效应。

为实现上述目的，本发明提供了一种含有干扰TNFR1基因表达的siRNA的TNFR1基因重组腺病毒，所述siRNA具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。

用于构建所述TNFR1基因重组腺病毒所采用的穿梭质粒为pHBAd-U6-GFP，所述干扰TNFR1基因表达的siRNA连接于所述穿梭质粒的U6启动子之下。

进一步地，本发明构建所述腺病毒所采用的骨架质粒为pHBAd-BHG，包装细胞为293细胞。

本发明所述TNFR1基因重组腺病毒的构建方法是设计SEQIDNo.1所示核苷酸序列的siRNA，化学合成对应的SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示的shRNA互补单链目的基因片段，退火得到所述目的基因片段的双链表达模版，与BamHI和EcoRI双酶切的载体pHBAd-U6-GFP连接构建腺病毒穿梭质粒，再将所述腺病毒穿梭质粒与骨架质粒pHBAd-BHG共转染293细胞，即可得到腺病毒Ad-TNFR1shRNA。

本发明所构建的TNFR1基因重组腺病毒可以作为一种工具药，用于阻断/减少TNFR1的表达，减少TNF-α与TNFR1的结合，从而缓解TNF-α的致痛敏作用。

通过本发明上述工具药的设计，可以进一步探索TNFR1在痛敏发生中的作用及胞内作用机制，进而应用于临床服务，设计阻断炎性因子激活其受体的药物，以减弱受体激活后导致的痛敏作用。

附图说明

图1是pHBAd-U6-GFP干扰载体的质粒图谱。

图2是重组腺病毒载体质粒的细胞出毒结果。

图3是腺病毒Ad-TNFR1shRNA感染大鼠PC12细胞的荧光显示结果。

图4是腺病毒Ad-TNFR1shRNA感染大鼠PC12细胞的WesternBlot检测结果。

具体实施方式

实施例1

设计干扰TNFR1表达的siRNA序列，具体为：5'-attgttactaagcccctaact-3'。

人工合成含有上述siRNA的shRNA表达序列，所述序列通过7个碱基的loop环连接上述siRNA的正义链和反义链，并在序列两端分别引入BamHI和EcoRI酶切位点。

Topstrand(62bp)：

5'-AATTCGattgttactaagcccctaactTGTGCTTagttaggggcttagtaacaatTTTTTTg-3'；

Bottomstrand(62bp)：

5'-GATCCAAAAAAattgttactaagcccctaactAAGCACAagttaggggcttagtaacaatCg-3'。

将上述互补利用3’和5’的单链退火得到相对应的目的片断shRNA的双链表达模版退火产物。退火程序为：

体系：20μl；

10×Buffer2μl；

100mMTris-ClpH7.5；

1MNaCl；

10mMEDTA；

shDNA-R/shDNA-F：1/1μl；

H₂O：16μl。

程序：95℃10分钟；75℃10分钟；55℃10分钟；35℃10分钟；15℃10分钟。

pHBAd-U6-GFP干扰载体的质粒图谱如图1所示，其U6启动子后为MCS(多克隆位点)区，BamHI和EcoRI为插入位点，目的片断插入BamHI、EcoRI位点，由U6启动子调控表达。该腺病毒载体中含有PCMV启动子调控的GFP基因表达。

用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切载体pHBAd-U6-GFP，酶切体系如下：

20μl酶切体系37℃1小时；

4μl载体(500ng/μl)；

1μlBamHI/1μlEcoRI；

2μl10×buffer；

12μlH₂O。

酶切完成后胶回收，回收体系：20μl，含10×Buffer2μl，100mMTris-ClpH7.5，1MNaCl，10mMEDTA。

将上述干扰序列TNFR1shRNA的退火产物用T4连接酶连接到载体pHBAd-U6-GFP的BamHI、EcoRI位点之间，构建腺病毒穿梭质粒，由U6启动子调控表达。

引物为上海桑尼生物合成PAGE胶纯化的oligo序列，分别稀释至100μM。

处理好的目的片段shRNA与载体连接的反应体系：1μl稀释好的退火产物；100-200ng酶切好的载体；2μlligasebuffer；1μlT4ligase；以H₂O稀释至总体积20μl。

以上连接液在4℃过夜。

将构建的腺病毒穿梭质粒转化感受态细胞DH5a，抗性：Amp；37℃培养过夜。

转化后的TNFR1shRNA进行平板挑菌，37℃250rpm摇菌14小时，将菌液进行测序，测序结果与目的序列相符。

实施例2

取实施例1制备的对数生长期的腺病毒穿梭质粒菌液2ml，加入100ml含100μg/mlAmp的LB培养基中，37℃300rpm震荡摇菌过夜，用康为世纪中提质粒试剂盒提取质粒。

转染前一天，将293细胞接种于60mm培养皿，培养基为DMEM+10%Hyclon胎牛血清，置37℃含5%CO₂的培养箱中培养过夜。

待细胞生长至长满底面积的70～80%时，取重组腺病毒载体质粒TNFR1shRNA及骨架质粒pHBAd-BHG，用Lipofiter^TM脂质体(汉恒生物，Hanbio)转染试剂进行转染。

具体步骤为：

a．转染前2小时更换完全培养基。取2μg重组腺病毒载体质粒TNFR1shRNA，4μg骨架质粒pHBAd-BHG，用300μlDMEM培养液进行稀释，室温放置5min。

b．取15μlLipofiter^TM，用300μlDMEM培养液进行稀释，室温放置5min。

c．将两者混和，室温避光放置20min。然后将混合物加入到60mm培养皿中，8字摇晃后置于37℃含5%CO₂的培养箱中培养。

转染6小时后，更换新鲜的细胞培养液。

每天观察细胞的出毒迹象。出毒现象为细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑(图2)。待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒，将60mm培养皿中所有细胞及培养液收于15ml离心管中。

将15ml离心管在液氮及37℃恒温水浴中反复冻融三次，3000rpm离心5分钟，收集含病毒的上清液，弃去沉淀。该上清即为Ad-TNFR1shRNA第一代毒种(P1)，将其作为随后大量病毒扩增的毒种。

从P1代病毒上清(约3ml左右)中取2ml，感染一个10cm细胞培养皿的细胞(细胞密度保证90%以上)。余下的病毒上清放入外旋的冻存管中，-80℃保留，做为毒种保留。

病毒扩增两天后，待所有细胞脱落底面即可进行收毒，将细胞连同培养液一同收入15ml离心管中，依据前面冻融方法冻融三次，取上清进行下一代扩增或于－80℃保存。以后每代病毒扩增及收毒都如此反复进行。

按每个75cm²方瓶中接种4×10⁶个293细胞，接种4个75cm²培养瓶，培养过夜，待细胞生长满至90%时，将P2代病毒(除取少量留毒种外)全部接种培养瓶内，24小时，显微镜下观察60%细胞病变，48小时后细胞完全病变。收获病变细胞混悬液，2000rpm离心5分钟，弃上清，加入4mlSTbuffer(培养液+10%血清+2.5%甘油)，votex混匀，于-80℃和37℃间冻融三次，3000rpm离心5min，取上清，作为第三代病毒(P3)。

实施例3

以密度2×10⁵种植MEF细胞系至6孔板中，待细胞生长至60%的汇合度后，分别感染Ad-GFP和Ad-TNFR1shRNA腺病毒，37℃5%CO₂培养箱中培养2小时，更换培养液，培养36小时后，在荧光显微镜下观察GFP的荧光表达，结果如图3所示。

收集细胞，用PBS洗涤3遍，刮刀刮取细胞移入EP管，1000rpm离心3分钟，弃上清，将细胞沉淀用液氮速冻后放入-8℃冰箱保存。从-80℃冰箱中取出细胞，加入500μlRIPA完全裂解液，冰上裂解2小时，12000rpm离心30分钟，收上清，弃沉淀。以BCA法测定上清液样本中蛋白含量，进行WesternBlot蛋白检测验证。具体方法为取每个样品蛋白50μg，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×，将含上样样品的EP管置于沸水中煮5分钟使蛋白变性，取15μl加样孔上样，进行SDS-PAGE电泳4～5小时，电压为40V。再将蛋白转至PVDF膜(200mA转移2.5小时)，之后转膜分别与一抗、二抗孵育，最后利用化学发光方法对蛋白含量进行分析。

结果显示，Ad-TNFR1shRNA腺病毒明显下调TNFR1的表达，效率明显，见图4。

实施例4

将293细胞铺于40个10cm培养皿中，待细胞长满，向每块板中加入Ad-TNFR1shRNA的P3病毒20μl，待细胞完全病变后(4～7天)，向每块板中加入约500μl10%NP-40以裂解细胞，冻存于-80℃。

提前1天从-80℃冰箱中取出病毒，室温(或4℃)融解。收集细胞裂解物，12000rpm离心10分钟，弃细胞碎片，收集上清。每100ml上清加入50mlPEG8000(20%PEG8000，2.5MNaCl)，冰上放置1小时沉淀病毒(可适当延长)。

12000rpm离心上述混合物20分钟，弃上清，将沉淀物悬浮在10ml密度1.10g/ml的CsCl溶液中(溶剂为20mMTris-HCl，pH8.0)，毒液呈粉红色。

CsCl梯度制备方法如下：加入2.0ml密度1.40g/ml的CsCl溶液(溶剂同上)，缓慢加入3.0ml密度1.30g/ml的CsCl溶液，再加入5ml病毒悬浮液。20000rpm室温离心2小时。

收集密度在1.30g/ml和1.40g/ml之间的病毒条带至透析袋中(透析袋使用前以10mMEDTA-Na₂煮沸10分钟)。在透析缓冲液(50g蔗糖，10ml1MTris-HCl，pH8.0，2ml1MMgCl₂定容至1L)中4℃搅拌透析过夜，中间换一次透析液。收集病毒，测定病毒滴度。

取10μl纯化后的Ad-TNFR1shRNA病毒液，加90μlpH8.0的Tris-HCl稀释，以100μlpH8.0的Tris-HCl作为空白对照，用分光光度计测OD₂₆₀及OD₂₆₀/OD₂₈₀的值。

OD₂₆₀/OD₂₈₀的正常范围为1.20～1.40，检测结果为1.26，符合正常范围。

病毒颗粒数(VP)与OD₂₆₀的换算公式为(OD₂₆₀)×稀释倍数×1.1×10¹²VP/ml。

所测得OD₂₆₀为0.148，体积1ml，总病毒颗粒数为1.63×10¹²VP。

感染性滴度的检测采用改进的TCID₅₀法，测得总滴度为1×10¹²PFU。

SEQUENCELISTING

<110>山西医科大学

<120>TNFR1基因重组腺病毒及其构建

<160>3

<170>Patentinversion3.2

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ATTGTTACTAAGCCCCTAACT21

<210>2

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列正义链

<400>2

AATTCGATTGTTACTAAGCCCCTAACTTGTGCTTAGTTATGGGCTTAGTAACAATTTTTT60

TG62

<210>3

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列反义链

<400>3

GATCCAAAAAAATTGTTACTAAGCCCCTAACTAAGCACAAGTTAGGGGCTTAGTAACAAT60

CG62

Claims (7)

1.TNFR1基因重组腺病毒，含有干扰TNFR1基因表达的siRNA，所述siRNA具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的TNFR1基因重组腺病毒，其中构建所述腺病毒所采用的穿梭质粒为pHBAd-U6-GFP。

3.根据权利要求2所述的TNFR1基因重组腺病毒，其中所述干扰TNFR1基因表达的siRNA连接于所述穿梭质粒的U6启动子之下。

4.根据权利要求2所述的TNFR1基因重组腺病毒，其中构建所述腺病毒所采用的骨架质粒为pHBAd-BHG。

5.根据权利要求2所述的TNFR1基因重组腺病毒，其中构建所述腺病毒所采用的包装细胞为293细胞。

6.一种TNFR1基因重组腺病毒的构建方法，设计SEQIDNo.1所示核苷酸序列的siRNA，化学合成对应的SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示的shRNA互补单链目的基因片段，退火得到所述目的基因片段的双链表达模版，与BamHI和EcoRI双酶切的载体pHBAd-U6-GFP连接构建腺病毒穿梭质粒，再将所述腺病毒穿梭质粒与骨架质粒pHBAd-BHG共转染293细胞，得到腺病毒Ad-TNFR1shRNA。

7.权利要求1所述TNFR1基因重组腺病毒作为阻断/减少TNFR1表达的工具药的应用。