JP2003531605A

JP2003531605A - 混在した細胞性組成物からの新生物細胞のウイルスクリアランス

Info

Publication number: JP2003531605A
Application number: JP2001580319A
Authority: JP
Inventors: ドナルド・モリス; ブラッドリー・ジー・トンプソン; マシュー・シー・コフィー
Original assignee: オンコリティクスバイオテク，インコーポレーテッド
Priority date: 2000-05-03
Filing date: 2001-05-01
Publication date: 2003-10-28
Anticipated expiration: 2021-05-01
Also published as: DK1278823T3; ATE517983T1; CA2408251A1; WO2001083710A3; IL152391A; BR0110481A; WO2001083710A2; IL152391A0; JP4509455B2; US20050026289A1; EP1278823A2; CA2408251C; US20010048919A1; EP1278823B1; AR028040A1; HK1050217A1; JP2008283982A; AU2001258077B2; NZ522180A; AU5807701A

Abstract

(57)【要約】本発明は、新生物細胞の選択的な殺傷を示すウイルスを使用することによって、混在した細胞組成物、例えば自己移植片から新生物細胞を選択的に除去する方法に関する。各種のウイルスが、新生物細胞を選択的に除去するが、正常細胞を除去しないことが可能である。例えば、レオウイルスは、ras-活性化新生物細胞を選択的に殺傷し、野生型p53遺伝子を発現するウイルスは、機能障害性p53を有する新生物細胞に対して選択的であり、いずれかのインターフェロン感受性ウイルスは、破壊されたインターフェロン経路を有する新生物細胞に選択的である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

関連発明本出願は、35 U.S.C. 119(e)の下で、2000年5月3日に出願された米国予備出願
60/201,990、2000年5月19日に出願された60/205,389、2001年2月13日に出願され
た60/268,054、2001年3月16日に出願された60/276,782の利益を享受する。前述
の予備出願のそれぞれの全体の開示は、参考としてここに取り込まれる。

【０００２】本発明は、新生物細胞に選択的に感染しそれを殺傷するウイルスを使用するこ
とによる、生きた生物の外側にある混合する細胞性組成物から新生物細胞を選択
的に除去する方法に関する。さらに、この方法に従って調製された組成物、及び
本発明において有用なウイルスの組み合わせを含むキットが提供される。

【０００３】

【参考文献】

全ての上述の文献、特許、及び特許出願は、各個々の文献、特許出願、または
特許の開示が特別に及び個々的に完全に参考として取り込まれるように企図され
るのと同じ範囲で、完全に参考として個々に取り込まれる。

【０００４】

【従来の技術】

細胞増殖は、増殖促進シグナルと増殖抑制シグナルの両者によって調節される
。各細胞に対してこれらの２種類のシグナルは、特定の細胞に対する身体の必要
性を反映する態様で、通常バランスを与えているであろう。もし細胞が増殖抑制
シグナルに応答しない場合、または増殖促進シグナルに過剰応答する場合、その
細胞は以上に迅速に増殖し（新生物細胞と称する）、悪性新生物であるガンに段
階的に発展するであろう。

【０００５】ガンを治療するために現在行われている方法である化学療法は、ガン細胞の迅
速な増殖特性に一般的に基づいている。ガン細胞は迅速に増殖するため、それら
は細胞増殖を阻害する薬剤により感受性である。理論的には、化学療法薬の投与
量を注意深く選択することによって、正常細胞を重大に損傷することなくガン細
胞の増殖を阻害できる。しかしながら、造血幹細胞のようないくつかの正常細胞
もまた迅速に増殖する。それ故、ガン細胞に有害なある投与量は、しばしば造血
幹細胞にも有害である。他方で、もし投与量がガン細胞を殺傷するのに十分な程
高くないと、化学療法が終結した後、ガンが短期間で再発する危険が存在する。

【０００６】選択的にガン細胞を殺傷する投与量を見出すことは困難であるため、高投与量
の化学療法、引き続き異種造血始原幹細胞移植は、多くのガンにおける治療アプ
ローチとして過度の適用が実施されている（例えば、Winter, 1999; Nieto及びS
hpall, 1999参照）。このアプローチでは、造血幹細胞の部分がガン患者から除
去されて、次いで患者は、ガン細胞と造血幹細胞のような迅速に増殖する細胞に
対して致死的な高投与量化学療法で治療される。その後患者は、同じ患者から以
前に除去された自己造血幹細胞の移植を受け、造血系が再生する。

【０００７】この治療の重大な欠点は、造血始原幹細胞が患者から除去される場合、それら
にしばしばガン細胞が混在している点である。これは特に、患者が造血系起源の
ガンを有する場合に問題であるが、特にもし固形腫瘍が転移したならば、固形腫
瘍を有する患者でも、造血幹細胞の混在に苦しむ可能性がある。結果として、除
去された細胞が戻されて移植され、造血系を再生する場合に、あるガン細胞がガ
ン患者に戻されて配置され、その場合にそのガンが再び増殖して、ガンの再発に
寄与する可能性がある。それ故、移植前の自己移植片を清浄化することが望まし
い。

【０００８】自己移植片を清浄化するためにいくつかの方法が利用されている(Spyridonidi
s等, 1998；Bensinger, 1998)。自己移植片を化学療法で処理し、in vitroで混
在した新生物細胞を殺傷できる。しかしながら、前述のように、新生物細胞また
はガン細胞を選択的に殺傷するが、清浄な造血幹細胞を完全なままにする化学療
法薬の投与量を見出すことは困難である。自己移植片はまた、新生物細胞に特異
的である抗原を認識する抗体に接合された毒素で治療することもできるが、その
ような腫瘍特異的抗原がいつも存在するとは限らない。フローサイトメトリー、
アフィニティーカラム、または磁性ビーズを使用することによって、幹細胞特異
的表面マーカー(CD34)に基づいて、幹細胞を他の細胞から分離することも可能で
ある。しかしながら、特定の造血細胞、例えばCD34⁺細胞のみを選択することに
よって、T細胞、B細胞、単球、及びナチュラルキラー細胞のような他の造血細胞
もまた除去され、免疫回復が遅延する可能性がある(Bensinger, 1998)。この方
法はまた、CD34⁺細胞の約半分の損失と、混在したガン細胞のある部分の維持を
引き起こす(Spyridonidis, 1998)。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】

それ故、新生物細胞を含む可能性のある自己移植片を清浄化するための、かな
りの収率を有する非常に選択的な方法に対する必要性が存在する。

【００１０】

【課題を解決するための手段】

本発明は、新生物細胞の選択的な殺傷を示すウイルスを使用することによって
、混在した細胞組成物、例えば自己移植片から新生物細胞を選択的に除去する方
法に関する。各種のウイルスが、新生物細胞を選択的に除去するが、正常細胞を
除去しないことが可能である。例えば、レオウイルスは、ras-活性化新生物細胞
を選択的に殺傷し、野生型p53遺伝子を発現するウイルスは、機能障害性p53を有
する新生物細胞に対して選択的であり、いずれかのインターフェロン感受性ウイ
ルスは、破壊されたインターフェロン経路を有する新生物細胞に選択的である。

【００１１】従って、本発明の一つの特徴点は、生きた生物の外側に配置された、新生物細
胞を含む疑いのある混在した細胞性組成物から新生物細胞を選択的に除去する方
法に関し、この方法は、(a)新生物細胞の実質的な殺傷を引き起こす条件下で、
ウイルスと混在した細胞性組成物を接触させる工程；(b)処理された細胞性組成
物を回収する工程を含む。

【００１２】本発明の別の実施態様では、この方法は、DMSOを含む溶液において、ウイルス
処理された細胞性組成物を凍結して貯蔵する工程をさらに含む。DMSOは、動物細
胞を凍結して貯蔵するために一般的に使用されているが、ウイルスを変性できる
。それ故DMSO処理は、細胞性組成物から感染性ウイルスを除去する一方で、長期
的な凍結状態で組成物の活性を保存する。

【００１３】本発明の別の実施態様では、特定のウイルスに特異的である抗ウイルス抗体の
混合物、または抗ウイルス抗体とウイルスを溶解するための補体の組み合わせで
処理することによって、ウイルス処理された細胞性組成物からウイルスが除去さ
れる。別法としてまたは加えて、ウイルス粒子の表面の分子を認識する抗ウイル
ス抗体が、抗体を固定化することによってウイルス粒子を除去するために使用さ
れても良く、その場合細胞性組成物を固定化抗体に適用し、抗体に結合しない組
成物の部分を回収しても良い。

【００１４】同様に、特定のウイルスに対して特異的な抗体を、in vivoでウイルスを除去
するために移植受容者に投与することができ、または受容者に免疫系刺激物を与
えてこの目的を達成できる。

【００１５】本発明の別の実施態様は、細胞からウイルスを分離できる勾配を使用すること
によって、ウイルスで処理された細胞性組成物からウイルスを除去する。

【００１６】本発明の好ましい実施態様では、混在した細胞性組成物は造血幹細胞を含む。
かくして造血幹細胞は、移植またはいずれかの他の所望の使用の前に、新生物細
胞を除去するように清浄化できる。造血幹細胞は、骨髄または血液から収集でき
る。

【００１７】本発明の応用は、造血幹細胞の清浄化に制限されない。本発明の別の実施態様
では、本発明の方法は、新生物細胞を除去するために、いずれかの組織、器官、
異なる組織／器官の組み合わせ、または組織若しくは器官のいずれかの部分に適
用できる。前記組織または器官は好ましくはその後の移植に有用である。しかし
ながら本発明の方法は、組織または器官に存在する新生物細胞を除去することが
所望されるいずれかの他の目的のために、組織または器官を清浄化する点でも有
用である。

【００１８】本発明の別の実施態様では、自発的にトランスフォームする細胞を除去するた
めに、培養細胞系を処理するためにウイルスが使用される。この方法は、人工授
精または他の再生産関連方法の前に、精液またはドナーの卵を処理するためにも
使用できる。

【００１９】本発明の別の特徴点では、ウイルスは複製可能ウイルスである。複製不全ウイ
ルスとは対照的に、複製可能ウイルスは、このウイルスに感受性である細胞にお
いて複製でき、しばしばこの細胞を溶解させる。本発明において有用な複製可能
ウイルスは、「ガン崩壊」と称される現象で、新生物細胞を選択的に溶解できる
が、正常細胞は溶解しない。

【００２０】本発明の別の実施態様では、ウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイ
ルス、ワクシニアウイルス、及びパラポックスウイルスorfからなる群から選択
されるミューテートされたまたは改変されたウイルスである。天然形態のこれら
のウイルスのそれぞれは、二本鎖RNAプロテインキナーゼ(PKR)を阻害するメカニ
ズムを発達させており、さもなければPKRによって阻害されるウイルスタンパク
質合成を促進している。それ故これらのウイルスは、PRKに関わらずいずれかの
細胞でも複製できる。しかしながら、これらのウイルスPKRインヒビターがミュ
ーテートまたは改変された場合、ウイルスはPKR阻害に感受性であり、機能的なP
KR経路を有する正常細胞で複製しない。ras活性化新生物細胞はPKR機能を欠損し
ており、かくしてこれらのウイルスの複製を阻害できないので、これらのミュー
テートまたは改変されたウイルスは、ras活性化新生物細胞を選択的に除去する
ために使用できる。

【００２１】本発明の別の特徴点では、腫瘍抑制遺伝子を有することによって、ウイルスは
新生物細胞を選択的に殺傷する。例えば、p53は正常細胞の非制御的な増殖を阻
害する細胞性腫瘍サプレッサーである。全ての腫瘍細胞の約半分は機能的に損傷
したp53を有し、非制御的な態様で増殖する。それ故、野生型p53遺伝子を発現す
るウイルスは、p53遺伝子産物の不活性化により新生物性となった新生物細胞を
選択的に殺傷できる。

【００２２】同様な実施態様は、細胞性腫瘍サプレッサー遺伝子のウイルス阻害を含む。あ
る種のウイルスは、腫瘍サプレッサーを阻害するタンパク質をコードし、それに
よって細胞におけるウイルスの複製を可能にする。これらのウイルスインヒビタ
ーをミューテートすることによって、腫瘍サプレッサーの存在のため正常細胞に
おいては複製しないウイルスが生産される。しかしながら、それは腫瘍サプレッ
サーを損失している新生物細胞では複製し、本発明において新生物細胞を選択的
に殺傷するために使用できる。

【００２３】本発明の別の実施態様では、新生物細胞を選択的に殺傷するためにインターフ
ェロン感受性ウイルスが使用される。インターフェロン感受性ウイルスはインタ
ーフェロンによって阻害され、完全なインターフェロン経路を有する正常細胞で
は複製しない。新生物細胞のあるものはインターフェロン経路が破壊されている
ため、それらはインターフェロン感受性ウイルスによって選択的に殺傷できる。
インターフェロン感受性ウイルスは好ましくは水疱性口内炎ウイルス(VSV)であ
る。新生物細胞を除去するために、インターフェロンはインターフェロン感受性
ウイルスと供に任意に加えることができる。

【００２４】新生物細胞を除去するためにウイルスで処理されており、生存可能な非新生物
細胞を残している細胞性組成物もまた提供される。そのような組成物は、in vit
roの研究のために、または移植、受精、若しくは他のin vivo方法において使用
できるであろう。移植物は、自己移植片、同種移植片、または異種移植片であっ
ても良い。好ましくは移植物は自己移植片である。より好ましくは前記組成物は
造血幹細胞を含む。

【００２５】本発明の別の特徴点は、レオウイルス、機能的なp53タンパク質を発現するウ
イルス、Delta24、ONYX-015、ニューカッスル病ウイルス、または水疱性口内炎
ウイルスのような、異なる選択性を有する少なくとも二つのウイルスを含むキッ
トを提供する。

【００２６】

【発明の実施の形態】

本発明は、新生物細胞の選択的な殺傷を示すウイルスを使用することによる、
混在した細胞性組成物、例えば自己移植片から新生物細胞を選択的に除去するた
めの方法に関する。各種のウイルスが本発明において有用である。例えば、混在
した細胞性組成物は、ras活性化新生物細胞を選択的に殺傷するレオウイルスで
処理できる。ras活性化新生物細胞はさらに、二本鎖プロテインキナーゼ(PKR)の
ウイルスインヒビターがミューテートまたは改変されているウイルスで選択的に
除去されても良い。もし前記組成物がp53欠失腫瘍細胞を含む疑いがあれば、そ
れはp53遺伝子産物における機能的な損傷を有する腫瘍細胞においてアポトーシ
スを誘導するp53腫瘍サプレッサー遺伝子を発現するウイルスで処理できる(Wima
n, 1998; Nielsen等, 1998)。水疱性口内炎ウイルス(VSV)または他のインターフ
ェロン感受性ウイルスが、破壊されたインターフェロン経路を有する新生物細胞
を殺傷するために、インターフェロンの存在下で使用できる。

【００２７】本発明において有用なウイルスの他の例は、ワクシニアウイルス、インフルエ
ンザウイルス、水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ヘルペスウイルス、及びニューカ
ッスル病ウイルスを含み、それらは腫瘍抑制または腫瘍死と関連することが報告
されている(Nemunaitis, 1999)。しかしながら本発明は、新生物細胞を選択的に
殺傷できるいずれのウイルスをも包含する。

【００２８】本発明をさらに詳細に記載する前に、この明細書において使用される用語は、
他に記載がなければ以下のように定義される。

【００２９】定義「ウイルス」は、天然形態であれ、減弱または改変形態であれ、いずれのウイ
ルスをも指す。改変されたウイルスは、化学的に改変されたウイルスまたは組換
え的に改変されたウイルスを含む。組換え的に改変されたウイルスは、ミューテ
ートされたウイルス、組換えウイルス、または再構築されたウイルスを含んで良
い。ミューテートされたウイルスは、ウイルスゲノムがミューテートされている
ウイルスであり、特にヌクレオチド挿入、欠失及び／または置換を有するもので
ある。組換えウイルスは、異なるサブタイプ由来のコートタンパク質を有するウ
イルスであり、通常ウイルスの一つ以上のサブタイプを有する細胞を共培養し、
異なるサブタイプによってコードされるコートによりエンベロープ化されたウイ
ルスを生ずることによって調製される。再構築ウイルスは、異なるサブタイプ由
来の断片が混合して細胞内でマッチするように、通常このウイルスの一つ以上の
サブタイプを有する細胞を共培養することによって、断片が再構築されているマ
ルチ断片ウイルスである。

【００３０】「新生物細胞」、または「増殖性疾患を有する細胞」は、正常な増殖阻害特性
を有さずに増殖する細胞を指す。新生物細胞を含む新たな増殖物は、新生物また
は腫瘍である。新生物は、一般的に別個の塊を形成する異常な組織増殖であり、
正常な組織増殖より迅速な細胞増殖によって増殖する。新生物は、正常な組織と
の構造的組織化及び機能的強調の部分的または完全な欠如を示すであろう。ここ
で使用される新生物は、造血性新生物、並びに固形新生物を包含するように企図
される。

【００３１】新生物は、良性（良性腫瘍）または悪性（悪性腫瘍またはガン）であって良い
。悪性腫瘍は、３種の主なタイプに広く分類できる。上皮構造から生ずる悪性新
生物はカルシノーマと称され、筋肉、軟骨、脂肪、または骨のような結合組織か
ら由来する悪性新生物はサルコーマと称され、免疫系の構成成分を含む造血構造
（血液細胞の形成と関係する構造）に影響する悪性腫瘍は白血病及びリンパ腫と
称される。他の新生物は、神経芽腫を制限することなく含む。

【００３２】「ras活性化新生物細胞」または「ras介在性新生物細胞」は、少なくとも部分
的にras経路の活性化のために異常に速い速度で増殖する細胞を指す。ras経路は
、ras遺伝子の構造的ミューテーション、ras遺伝子発現の増大したレベル、ras
遺伝子メッセージの増大した安定性、あるいはras、またはras経路におけるras
から下流または上流の因子の活性化を導くいずれかのミューテーションまたは他
のメカニズムによって活性化され、それによってras経路活性を増大するであろ
う。例えば、EGFレセプター、PDGFレセプター、またはSosの活性化は、ras経路
の活性化を導く。ras介在性新生物細胞は、ras介在性ガン細胞を制限することな
く含み、それはras経路の活性のによる悪性の態様で増殖する細胞である。

【００３３】「細胞性組成物」は、細胞を含む組成物を意味する。前記組成物は、非細胞物
を含んでも良い。例えば全血は、赤血球及び白血球のような細胞に加えて血漿、
血小板、ホルモン、及び他の非細胞物を含む細胞性組成物である。細胞性組成物
は、各種のタイプの細胞、器官、または構築物を含んでも良い。例えば、所定の
構造で整列した各種の細胞タイプを含む組織または器官は、細胞性組成物と考慮
される。

【００３４】「混在した細胞性組成物」は、少なくとも２種類の細胞を含む細胞性組成物で
ある。典型的に混在した細胞性組成物は、正常細胞と新生物細胞の両者を含む。
細胞性組成物において細胞のほとんどが分裂細胞であることは好ましく、ウイル
スは新生物細胞を選択的に殺傷するが、他の分裂細胞は必須に完全なままで残す
。

【００３５】「新生物細胞を含む疑いのある」細胞性組成物は、新生物細胞を含んでいるか
もしれない細胞性組成物である。例えば、新生物を有する患者から得られたいず
れかの自己移植片は、新生物細胞を含んでいるかもしれない。かなりの長さの時
間培養中である細胞培養物は、新生物細胞を自然発生的に含んでいるかもしれな
い。

【００３６】「実質的な殺傷」は、標的新生物細胞の生存能力の少なくとも約２０％の減少
を意味する。生存能力は処理された細胞の生存可能な細胞のカウントによって測
定でき、減少の度合いは、非処理細胞における生存可能な細胞の数と処理細胞に
おける生存可能な細胞の数を比較することによって、またはウイルス処理の前後
の生存可能な細胞のカウントを比較することによって測定できる。生存能力の減
少は好ましくは、少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７０％、さ
らにより好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％で
ある。

【００３７】新生物細胞は各種の態様で殺傷されて良い。例えばそれらは、新生物細胞の溶
解感染（腫瘍崩壊）が可能なウイルスによって溶解されて良い。新生物細胞は、
ウイルスによって直接または間接に誘導されるアポトーシスを受けて良い。前記
細胞はまた、あまり好ましくはないが、ウイルスによって活性化されている免疫
系によって殺傷されても良い。例えば前記ウイルスは、ナチュラルキラー細胞を
活性化するサイトカインの生産を誘導し、それが次いで新生物細胞を選択的に殺
傷しても良い(Zorn等, 1994)。

【００３８】「複製可能な」ウイルスは、少なくとも一つの細胞タイプで複製可能であるウ
イルスである。複製可能なウイルスとは反対に、「複製不能なウイルス」は、そ
の複製に必須であるゲノムの領域においてミューテーションを含み、それ故いず
れの細胞での複製が不可能なウイルスである。

【００３９】「アデノウイルス」は、約３．６キロベースの二本鎖DNAウイルスである。ヒ
トにおいてアデノウイルスは複製でき、眼、並びに呼吸器、胃腸、及び尿管にお
いて疾患を引き起こす。４７の周知のヒト血清型のうち約３分の１が、ヒトアデ
ノウイルス疾患のほとんどの原因に関与する(Brooks等, 1998)。

【００４０】ここで使用される用語、「ミューテートされたアデノウイルス」または「改変
されたアデノウイルス」は、PKRの活性化を妨げる遺伝子産物を欠き、PBRの活性
化がブロックされないように阻害またはミューテートされていていることを意味
する。アデノウイルスは、抗ウイルス宿主防御機構に対抗するいくつかの遺伝子
産物をコードしている。アデノウイルスのウイルス関連RNA(VAI RNAまたはVA RN
A₁)は小さく、アデノウイルス感染の後の遅延した時期に細胞質に高濃度で蓄積
する構造化RNAである。これらのVAI RNAは、PKRの二本鎖RNA(dsRNA)結合モチー
フに結合し、自己リン酸化によりRNAのdsRNA依存性活性化をブロックする。かく
してPKRは機能することができず、ウイルスは細胞内で複製できる。ビリオンの
過剰生産は、最終的に細胞死を導く。ミューテートされたまたは改変されたアデ
ノウイルスでは、VAI RNAは好ましくは転写されない。そのようなミューテート
されたまたは改変されたアデノウイルスは、活性化ras経路を有さない正常細胞
では複製できないであろう；しかしながら、活性化ras経路を有する細胞では感
染して複製できるであろう。

【００４１】「単純ヘルペスウイルス」(HSV)は、単純ヘルペスウイルス−１(HSV-1)または
単純ヘルペスウイルス−２(HSV-2)を指す。HSV遺伝子_γ134.5は、PKRによって発
揮される抗ウイルス効果を妨げることができる感染細胞タンパク質34.5(ICP34.5
)の遺伝子産物をコードする。ICP34.5は、プロテインホスファターゼ１と相互作
用し、その活性を再指向化して、eIF-2αを脱リン酸化することによってPKR活性
を妨げる独特の機構を有する(He等, 1997)。野生型ウイルス、または_γ134.5遺
伝子を欠失している遺伝的に操作されたウイルスのいずれかで感染された細胞で
は、eIF-2αが脱リン酸化され、_γ134.5マイナスウイルスで感染された細胞では
、タンパク質合成がスイッチオフされている。ICP34.5の活性が余剰である活性
化ras経路を有する細胞では、_γ134.5マイナスウイルスは複製可能であろう。

【００４２】ここで使用される用語、「ミューテートされたHSV」または「改変されたHSV」
は、PKRの活性化を妨げる遺伝子産物を欠き、PKR活性がブロックされないように
阻害またはミューテートされていることを意味する。好ましくはHSV遺伝子_γ134
.5は転写されない。そのようなミューテートされたまたは改変されたHSVは、活
性化ras経路を有さない正常細胞では複製できないであろう；しかしながら、活
性化ras経路を有する細胞では感染して複製できるであろう。

【００４３】「パラポックスウイルス」は、ポックスウイルスである。それは、ヒトを含む
各種の哺乳動物腫において急性皮膚病変を誘導するウイルスである。パラポック
スウイルスorfは、壊れたまたは損傷した皮膚を通じてヒツジ、ヤギ、及びヒト
に天然で感染し、再生した表皮細胞で複製し、かさぶたとなる膿胞性の病変を誘
導する(Haig等, 1998)。パラポックスウイルスorfは、PKR活性のブロックに関与
する遺伝子OV20.0Lをコードする(Haig等, 1998)。

【００４４】ここで使用される用語、「ミューテートされたパラポックスウイルスorf」ま
たは「改変されたパラポックスウイルスorf」は、PKRの活性化を妨げる遺伝子産
物を欠き、PKR活性がブロックされないように阻害またはミューテートされてい
ることを意味する。好ましくは遺伝子OV20.0Lは転写されない。そのようなミュ
ーテートされたまたは改変されたパラポックスウイルスorfは、活性化ras経路を
有さない正常細胞では複製できないであろう；しかしながら、活性化ras経路を
有する細胞では感染して複製できるであろう。

【００４５】「ワクシニアウイルス」は、ヒトに感染し、局在的な病変を生ずるオルトポッ
クスウイルス属のウイルスを指す(Brooks等, 1998)。ワクシニアウイルスは、二
つの全く異なる機構でPKR活性の下流調節において役割を果たす二つの遺伝子を
コードする。E3L遺伝子は、感染の早期で発現される２０及び２５kDaの二つのタ
ンパク質をコードし、PKR活性を阻害できるdsRNS結合活性を有する。E3L遺伝子
の欠失または破壊は、活性化ras系を有する細胞におけるウイルス複製の可能性
を作り出す。ワクシニアウイルスのK3L遺伝子は、PKRの偽基質であるpK3をコー
ドする。

【００４６】ここで使用される用語、「ミューテートされたワクシニアウイルス」または「
改変されたワクシニアウイルス」は、PKRの活性化を妨げる遺伝子産物を欠き、P
KR活性がブロックされないように阻害またはミューテートされていることを意味
する。好ましくはE3L遺伝子及び／またはK3L遺伝子は転写されない。そのような
ミューテートされたまたは改変されたワクシニアウイルスは、活性化ras経路を
有さない正常細胞では複製できないであろう；しかしながら、活性化ras経路を
有する細胞では感染して複製できるであろう。

【００４７】「インターフェロン感受性ウイルス」は、インターフェロンの存在下で正常細
胞で複製せず、正常細胞を殺傷しないウイルスである。正常細胞は、前述のよう
に新生物性ではない細胞である。ウイルスがインターフェロン感受性であるかを
試験するために、正常細胞の培養物を、各種の濃度のインターフェロンの存在下
でウイルスとインキュベートし、細胞の生存割合を当該技術分野で周知の方法に
従って測定しても良い。もし２０％未満、好ましくは１０％未満の正常細胞が高
濃度のインターフェロン（例えば１００ユニット／ｍｌ）で殺傷されたならば、
ウイルスはインターフェロン感受性である。

【００４８】ウイルス感染に対する細胞の「耐性」は、ウイルスでの細胞の感染が顕著なウ
イルス生産または収率を引き起こさないことを意味する。

【００４９】「ウイルス性腫瘍崩壊物」は、in vitroで腫瘍崩壊性ウイルスで腫瘍細胞を処
理することによって調製される組成物であり、その組成物は後に、腫瘍患者にお
いてこの腫瘍に対する免疫系を誘導するために、同じ種類の腫瘍を有する腫瘍患
者に投与される。前述のように、ウイルス性腫瘍崩壊物は、必須にウイルス改変
化ガン細胞膜である。

【００５０】ここで使用される用語、「移植受容者」は、細胞性組成物の移植を受ける哺乳
動物である。好ましくは前記受容者はヒトであり、より好ましくは前記受容者は
、ガンの治療において移植を受けるヒトである。

【００５１】方法本発明は、新生物細胞を含む疑いのある混在した細胞性組成物から新生物細胞
を選択的に除去するウイルスの使用に関する。各種のウイルスがこの方法におい
て使用されて良く、そのウイルスのそれぞれが、新生物または一群の新生物に対
して選択的である。レオウイルスが以下の実施例として使用されるが、当業者は
ここでの説明に従うことができ、レオウイルス以外のウイルスを使用することに
よりいずれの混在した細胞性組成物を清浄化する方法に適用できる。

【００５２】１．レオウイルスレオウイルスが、in vitro、in vivo及びex vivoで活性化新生物細胞を選択的
に溶解することを、我々は最近発見した(Coffey等, 1998; WO 99/08692)。普通
では、細胞はレオウイルス感染に感受性ではない。しかしながら、ras経路が活
性化されたならば、レオウイルスは細胞において成功して複製でき、最終的に宿
主細胞の溶解を引き起こす。例えば、レオウイルス耐性NIH 3T3細胞が、rasを活
性化するタンパク質である活性化rasまたはSosでトランスフォームされた場合、
レオウイルス感染は増大された(Strong等, 1998)。同様に、レオウイルス感染に
耐性であるマウス線維芽細胞は、EGFレセプター遺伝子またはv-erbB原ガン遺伝
子でのトランスフェクションの後感受性となった(Strong等, 1993; Strong等, 1
996)。

【００５３】一つの理論に制限されるものではないが、レオウイルス複製は翻訳レベルで調
節されているようである(Strong等, 1998; Norman等, 2000)。非トランスフォー
ム化NIH 3T3細胞では、早期のウイルス転写物が二本鎖RNA活性化プロテインキナ
ーゼ(PKR)を活性化し、それが翻訳を阻害し、それによってウイルス複製を阻害
する。活性化ras（またはras経路の活性化エレメント）は、おそらくPKR活性化
を阻害または不活性化するであろう。それ故、ウイルスタンパク質合成が進行し
、ウイルス粒子が作製され、細胞は最終的に溶解する。

【００５４】 ras原ガン遺伝子は、多数の腫瘍の原因である。ras遺伝子自体の活性化ミュー
テーションは、全てのヒト腫瘍の約３０％で生じ(Bos, J.L., 1989)、主に膵臓
（９０％）、散発生大腸（５０％）及び肺（４０％）カルシノーマ、並びにミエ
ロイド白血病（３０％）で生じている。ras経路におけるrasの上流または下流因
子の活性化も、腫瘍と関連している。例えば、HER2/Neu/ErbB2または上皮増殖因
子(EGF)レセプターの過剰発現は、乳ガンにおいて一般的であり（２５−３０％
）、血小板由来増殖因子(PDGF)レセプターまたはEGFレセプターの過剰発現は、
グリオーマ及びグリオブラストーマ（４０−５０％）で一般的である。EGFレセ
プターとPDGFレセプターは、それらのそれぞれのリガンドに対する結合に際して
rasを活性化することが知られており、v-erbBは細胞外ドメインを欠く構成的に
活性化されたレセプターをコードする。

【００５５】我々は最初に、ガン細胞を殺傷するレオウイルスの能力を測定した。レオウイ
ルスは、感染細胞においてアポトーシスを誘導することによる、３種のガンモデ
ルシステム、MCF7、SKRB3及びHTB 132の腫瘍崩壊を有効に導いた（実施例１）。
かくしてレオウイルス処理は、MCF7、SKRB3及びHTB 132細胞の生存能力の顕著な
減少を引き起こす一方、ウイルスなしまたは死んだウイルスで処理されたコント
ロールは普通に増殖した（図１Ａ−１Ｄ）。生存能力の減少は、DNA断片化、ア
ネキシンVまたはAPO2.7染色陽性（図２Ａ−２Ｇ）、並びに顕微鏡で観察される
細胞膜の気泡、核の凝集、及びクロマチン凝集のような細胞変性効果といった、
アポトーシスと関連する特徴を伴った。

【００５６】レオウイルス感染は、正常細胞において翻訳レベルで通常ブロックされるが、
ras介在性新生物細胞においてはブロックされないため、レオウイルス処理MCF7
細胞及びCD34⁺幹細胞におけるタンパク質合成の度合いを調べた（図２）。実際
、ウイルスタンパク質は、レオウイルス感染ガン細胞系で合成されるが、レオウ
イルスで処理されたCD34⁺幹細胞では合成されなかった（データ示さず）。この
結果は、レオウイルスタンパク質がレオウイルス処理幹細胞では合成されず、細
胞タンパク質合成が普通に進行しているため、レオウイルスでの造血幹細胞の処
理が安全であることを示唆している。この点を確認するために、レオウイルス処
理CD34⁺細胞の生存能力を、レオウイルス処理の各種の時点で測定した（実施例
３）。生きたレオウイルスまたはウイルスなしで処理された集団における細胞数
は各時点で同じであり、CD34⁺細胞がレオウイルス感染に感受性ではないことを
示した。

【００５７】レオウイルスが、高投与量化学療法治療における造血幹細胞の清浄化に有用で
あるために、レオウイルス処理が、全部の造血系を再構成するそれぞれ及び毎回
の造血系列へ分化する幹細胞の能力を変えないことが必須である。それ故、レオ
ウイルス処理の長期的な効果が評価された（実施例３）。ウイルスなしまたは生
きたウイルスのいずれかで処理されたCD34⁺細胞は、レオウイルス処理の７２時
間後でさえ、白血球、赤血球または白血球赤血球マクロファージ巨核球へ分化す
る能力に必須に差異を示さなかった（図３Ｂ）。これらの３種の系列の間の比は
、この長期的な処理の後同じままであった。従って、レオウイルス処理は、CD34⁺ 細胞を殺傷せず、造血系を再構成するするそれらの可能性を変化しなかった。

【００５８】さらにレオウイルスは、ガン細胞の混合物中のMCF7、SKRB3またはHTB 132細胞
の選択的な殺傷によって示されるように、混在した細胞性組成物、及びCD34⁺幹
細胞を含むアフェレーシス産物を清浄化できる（実施例４）。CD34、並びにMCF7
、SKRB3またはHTB 132のような上皮細胞に対する特異的なマーカーであるサイト
ケラチンを測定することによって、レオウイルスが混在した細胞性組成物からガ
ン細胞を必須に除去する一方（図４Ａ−４Ｃ）、幹細胞は完全なまま維持するこ
とが示された。それ故、レオウイルス処理は、造血幹細胞組成物から新生物細胞
を清浄化する有効な方法である。

【００５９】従って、本発明の一つの実施態様では、幹細胞含有自己移植片が、混在したま
たは自然発生的なras活性化新生物細胞を除去するために、移植の前にレオウイ
ルスで処理される。これは、高投与量化学療法／同種幹細胞移植治療の効力を増
大する。高投与量化学療法及び同種幹細胞移植が、腫瘍を有する患者において有
効に実施されているため、ホジキン病、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、急
性骨髄性白血病、生殖細胞（精巣）ガン、脳腫瘍、並びに乳ガンの治療は特に興
味深いであろう。しかしながら、ras経路の活性化はいずれの細胞または組織タ
イプでも生じ得るため、本発明の方法は、他のガンにおいても有用であり、いず
れのras活性化新生物細胞を除去するためにも有用であろう。

【００６０】造血始原幹細胞は、治療に先立って患者の骨髄から得ることができる。別法と
して、従来の非高投与量化学療法を受けているガン患者では、コロニー刺激因子
の下地の存在下または不存在下で、多くの幹細胞が典型的に末梢血で出現する。
それ故、造血始原幹細胞は、アフェレーシス産物として血液から得ることができ
、それは移植される前に長期に亘り貯蔵できる。本発明は、骨髄及び血液を含む
いずれかの組織ソースから回収された幹細胞含有自己移植片に適用できる。

【００６１】造血幹細胞に加えて、本発明は、多くの他の細胞性組成物からras活性化新生
物細胞を除去するために広く適用できる。例えばレオウイルスは、いずれかの組
織または器官移植物を「クリーンアップ」（それらからのras活性化新生物細胞
の除去）のために通常の実施として使用できる。前述のように、レオウイルスに
対するレセプターは豊富であり、レオウイルス複製を阻害する正常細胞の機構、
PKRもまた豊富であるため、本発明に応用は細胞または組織タイプによって制限
されない。それ故、いずれの細胞もras活性化新生物細胞となり、レオウイルス
感染に感受性となる。後の輸血のための全血またはそのいずれかの一部をクリー
ンアップするための本発明の方法は特に興味深い。同様に、組織または器官移植
はますます一般的となり、移植の前にras活性化新生物細胞を除去するように移
植物が処理できれば有益であろう。肝臓、腎臓、心臓、角膜、皮膚移植片、膵島
細胞、骨髄、またはそれらのいずれかの一部は、本発明を適用できる組織または
器官の例である。

【００６２】組織または器官は、自己物、同種物、または異種物であることができる。組織
または器官はまた、トランスジェニック動物から由来しても良く、幹細胞からin
vitroで形成された物、またはex vivoで増大したものである組織／器官でも良
い。レオウイルスで処理される組織または器官は、胚性または成人由来であるこ
とができる。例えば、胚性神経細胞は、アルツハイマー患者に移植される前に処
理できる。同様に本発明は、ex vivoで精子またはドナーの卵を処理するために
使用できる。

【００６３】本発明の応用は、移植物に制限されない。むしろいずれの細胞性組成物も、い
ずれかの目的でレオウイルスで「クリーンアップ」できる。かくして、前述の全
ての例は、組織または器官が移植のためのものを意味しなくても応用可能である
。

【００６４】細胞系はまた、自然発生的または混在したras活性化新生物細胞に対して保護
するために通常処理されても良い。再現すると、もちろんras経路の活性化によ
ってトランスフォームされた細胞系を除き、いずれの細胞系もこの方法のための
適格な候補であろう。

【００６５】最近多くの研究室が、免疫抑制マウス中に接種されたヒト前立腺ガン組織の連
続的に移植可能な異種移植片を確立することを試みている。しかしながら、マウ
スガン細胞の混在が、移植片の連続する継代培養の間でしばしば生じており、こ
れらの細胞を最終的にヒト前立腺ガン細胞に成長させ得る(Gao等, 1999)。混在
したガンがras介在性であり、移植片がそうでなければ、本発明のこの問題に対
する簡単な解決策となるであろう。

【００６６】本発明は、ウイルス性腫瘍崩壊物の調製方法とは区別される。腫瘍細胞は、し
ばしば免疫応答の微弱なインデューサーであり、それ故免疫系の攻撃を逃れるこ
とができる。ウイルス性腫瘍崩壊物、特にウイルス改変化腫瘍細胞膜は、腫瘍細
胞の免疫原性を増大するためのアプローチにおいて使用されている。ウイルス性
腫瘍崩壊物を調製するために、腫瘍細胞は腫瘍を有する患者から除去されて、腫
瘍細胞を溶解するウイルスで感染される。次いで生成した物質は、腫瘍を有する
患者に投与され、非感染腫瘍細胞に対する免疫がしばしば誘導される。腫瘍細胞
のウイルス感染が非感染腫瘍細胞に免疫を誘導する機構は知られていないが、腫
瘍細胞のウイルス異種化が関与しているかもしれない(Steele, 2000)。

【００６７】インフルエンザウイルス感染メラノーマ、外陰部カルシノーマ、及び卵巣カル
シノーマの腫瘍崩壊物、並びにニューカッスル病ウイルス感染大腸カルシノーマ
の腫瘍崩壊物、及びワクシニアウイルス腫瘍崩壊物は、全て各種の腫瘍に対して
使用されている。例えば、メラノーマ患者は、腫瘍の外科的摘出の後腫瘍崩壊物
を受け取った。ウイルス性腫瘍崩壊物は、毎週で４週まで、２週間ごとに５２週
まで、３週間ごとに１２０週まで、および６週間ごとに１６０週まで投与された
。別の臨床上のケースでは、大腸ガンに対する自己NDV腫瘍崩壊物の投与スケジ
ュールは、手術の後２週間で開始され、２週間の間隔で５回繰り返され、引き続
き３ヶ月後に一度追加された(Nemunaitis, 1999)。この研究により、ある患者で
は臨床上の応答、または腫瘍抗原に対する活性な免疫の生産が示された(Steele,
2000)。

【００６８】本発明は、ウイルス改変化腫瘍細胞に関連しないウイルス性腫瘍崩壊物とは別
個である。ウイルス性腫瘍崩壊物とは対照的に、溶解した新生物細胞は、本発明
の効力に影響することなくウイルス処理化細胞性組成物から除去でき、好ましく
は除去される。さらに、ウイルス性腫瘍崩壊物は、ほとんどの腫瘍細胞を使用し
て調製される一方、本発明における混在した細胞性組成物は、好ましくは６０％
未満、より好ましくは４０％未満、さらにより好ましくは２０％未満、最も好ま
しくは１０％未満の新生物細胞を含む。

【００６９】２．ras活性化新生物細胞を選択的に殺傷する他のウイルス通常ウイルスが細胞に侵入すると、二本鎖RNAキナーゼ(PKR)が活性化され、タ
ンパク質合成をブロックし、ウイルスはこの細胞では複製できない、あるウイル
スはPKRを阻害し、ウイルスタンパク質合成、並びにウイルス複製を容易にする
システムを発達している。例えば、アデノウイルスは大量の小さなRNA、VA1 RNA
を作製する。VA1 RNAは、伸長した二次構造を有し、通常PKRを活性化する二本鎖
RNA(dsRNA)と競合してPKRに結合する。PKRを活性化するために最小の長さのdsRN
Aが必要であるため、VA1 RNAはPKRを活性化しない。代わりに、それはその大き
な量によってPKRを隔離する。その結果タンパク質合成はブロックされず、アデ
ノウイルスは細胞内で複製できる。

【００７０】ワクシニアウイルスは、異なる機構でPKRを下流調節する二つの遺伝子産物、K
3LとE3Lをコードする。K3L遺伝子産物は、PKRの天然の基質であるeIF-2αのN末
端領域と制限されたホモロジーを有し、PKRの偽基質として機能するであろう。E
3L遺伝子産物は、dsRNA結合タンパク質であり、隔離アクチベーターdsRNAによっ
て機能するようである。

【００７１】同様に、単純ヘルペスウイルス(HSV)遺伝子_γ134.5は、PKRによって発揮され
る抗ウイルス効果を妨げることができる感染細胞タンパク質34.5(ICP34.5)の遺
伝子産物をコードする。パラポックスウイルスorfウイルスは、PKR活性のブロッ
クに関与する遺伝子OV20.0Lをコードする。かくしてこれらのウイルスは、PKRに
よって阻害されることなく細胞を成功して感染できる。

【００７２】前述のように、ras活性化新生物細胞は、rasがPKRを不活性化するため、PKRに
よるタンパク質合成阻害を受けない。それ故これらの細胞は、ウイルスがPKR阻
害システムを有さなくとも、ウイルス感染に感受性である。従って、もしアデノ
ウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、またはパラポックスor
fウイルスにおいてPKR阻害が、PKR機能をさらにブロックするようにミューテー
トされたならば、生成したウイルスは、PKRによるタンパク質合成阻害のために
正常細胞に感染しないが、PKR活性を欠くras活性化新生物細胞では複製する。

【００７３】従って本発明は、PKR機能を阻害しないように改変またはミューテートされた
、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、またはパラポ
ックスウイルスorfウイルスによる、混在した細胞性組成物からras活性化新生物
細胞を除去する方法を提供する。改変されたまたはミューテートされたウイルス
は、ras活性化新生物細胞において選択的に複製する一方、正常細胞は耐性であ
る。好ましくはこの実施態様では、アデノウイルスはVA1領域でミューテートさ
れ、ワクシニアウイルスはK3L及び／またはE3L領域でミューテートされ、単純ヘ
ルペスウイルスは_γ134.5遺伝子でミューテートされ、パラポックスウイルスorf
ウイルスはOV20.0L遺伝子ミューテートされる。

【００７４】ウイルスは、ウイルスPKRインヒビターの周知の構造−機能相互関係に従って
ミューテートまたは改変できる。例えば、E3タンパク質のアミノ末端領域は、PK
Rのカルボキシ末端領域ドメインと相互作用するため、このドメインの欠失また
はポイントミューテーションは、抗PKR機能を妨げる(Chang等, 1992, 1993, 199
5; Sharp等, 1998; Romano等, 1998)。ワクシニアウイルスのK3L遺伝子は、PKR
の偽基質であるpK3をコードする。K3L内には機能損失ミューテーションが存在す
る。K3Lタンパク質のC末端部分内の切り詰めまたはポイントミューテーションの
配置にのいずれかによって、eIF-2αにおける７９から８３残基に相同的な部分
が、PKR阻害活性を破壊する(Kawagishi-Kobayashi等, 1997)。

【００７５】３．腫瘍サプレッサー遺伝子または腫瘍サプレッサー関連遺伝子を有するウイル
ス本発明の別の特徴点では、ウイルスは腫瘍サプレッサー遺伝子を有することに
よって新生物細胞を選択的に殺傷する。例えばp53は、正常細胞の非制御的な増
殖を阻害する細胞性腫瘍サプレッサーである。しかしながら全ての腫瘍の約半分
は、機能的に損傷したp53を有し、非制御的な態様で増殖する。それ故、野生型p
53遺伝子を発現するウイルスは、p53遺伝子産物の不活性化のため新生物性とな
った新生物細胞を選択的に殺傷できる。そのようなウイルスは構築されており、
ミュータントp53を発現するガン細胞においてアポトーシスを誘導することが示
されている(Blagosklonny等, 1996)。

【００７６】同様なアプローチは、腫瘍サプレッサーのウイルス性の阻害を含む。例えば、
特定のアデノウイルス、SV40及び広パピローマウイルスは、p53を不活性化する
タンパク質を含み、それによってそれ自体の複製を可能にする(Nemunaitis 1999
)。アデノウイルス血清型５については、このタンパク質はE1B領域によってコー
ドされる５５Kdタンパク質である。もしONYX-015ウイルスにおけるように、この
５５kdタンパク質をコードするE1B領域が欠失されたならば、(Bischoff等, 1996
; Heise等, 2000; WO 94/18992)、５５kdp53インヒビターはもはや存在しない。
その結果、ONYX-015が正常細胞に侵入すると、p53は細胞増殖、並びに細胞増殖
マシネリーに依存するウイルス複製を抑制するように機能する。それ故、ONYX-0
15は正常細胞において複製しない。他方で、破壊されたp53機能を有する新生物
細胞では、ONYX-015は複製でき、結果として細胞を死に導く。従ってこのウイル
スは、混在した細胞性組成物からp53欠失新生物細胞に選択に感染し、それを除
去するために使用できる。当業者は、確立された方法に従って、アデノウイルス
５または他のウイルスにおいてp53インヒビター遺伝子をミューテートして破壊
でき、生成したウイルスは、混在した細胞性組成物から新生物細胞を除去するた
めに本発明の方法で有用である。

【００７７】別の例は、E1A領域において２４塩基対の欠失を有するミューテートされたア
デノウイルスであるDelta24ウイルスである(Fueyo等, 2000)。この領域は、細胞
性腫瘍サプレッサーRbに結合し、Rb機能を阻害し、それによって細胞増殖マシネ
リーを可能にし、ウイルス複製を非制御的な態様で進行させることに関与する。
Delta24は、Rb結合領域において欠失を有し、Rbに結合しない。それ故、ミュー
タントウイルスの複製は、正常細胞ではRbによって阻害される。しかしながら、
もしRbが不活性化され、細胞が新生物となると、Delta24はもはや阻害されない
。代わりに、ミューテートされたウイルスは効率的に複製し、Rb欠失細胞を溶解
する。再現すると、このウイルスは新生物細胞に特異的であり、混在した細胞性
組成物を清浄化し、Rb欠失細胞を除去するために使用できる。

【００７８】４．他のウイルス水疱性口内炎ウイルス(VSV)は、インターフェロンの存在下で新生物細胞を選
択的に殺傷する。インターフェロンは、細胞表面レセプターに結合する循環因子
であり、抗ウイルス応答と増殖阻害の誘導及び／または標的細胞におけるアポト
ーシスシグナルの誘導の両者を最終的に導く。インターフェロンは、腫瘍細胞の
増殖を阻害するために理論的には使用できるが、インターフェロン経路のメンバ
ーの腫瘍特異的なミューテーションのため、この試みはあまり成功していない。

【００７９】しかしながら、インターフェロンによって発揮される増殖阻害を避けるために
、インターフェロン経路を破壊することによって、腫瘍細胞は抗ウイルス応答を
自然発生的に抑制しているかもしれない。実際、エンベロープ化ネガティブセン
スRNAウイルスであるVSVは、インターフェロンの存在下で各種のヒト腫瘍細胞系
で迅速に複製してそれを殺傷し、一方で正常ヒト一次細胞培養物は、インターフ
ェロンによって明白に保護された。VSVの腫瘍内感染はまた、皮下ヒトメラノー
マ異種移植片を有するヌードマウスの腫瘍の重さを減少した(Stojdl等, 2000)。

【００８０】従って、本発明の別の実施態様では、インターフェロンの存在下で混在した細
胞性組成物から新生物細胞を除去するためにVSVが使用される。さらに、本発明
のこの特徴点は、いずれかの他のインターフェロン感受性ウイルス(WO 99/18799
)特にインターフェロンの存在下で正常細胞で複製しないウイルスに適用される
ことが企図される。そのようなウイルスは、正常細胞の培養物を増殖し、その培
養物を各種の濃度のインターフェロンの存在下で興味あるウイルスと接触させ、
次いでインキュベーション期間の後の細胞殺傷のパーセンテージを測定すること
によって同定されても良い。好ましくは、２０％未満の正常細胞が殺傷され、よ
り好ましくは１０％未満が殺傷される。

【００８１】ある新生物細胞は高レベルの酵素を発現し、この酵素に依存するウイルスを構
築するという事実を利用することも可能である。例えば、リボヌクレオチドレダ
クターゼは肝臓転移物に豊富であるが、正常な肝臓では欠乏している。それ故、
リボヌクレオチドレダクターゼ発現において欠失している単純ヘルペスウイルス
１(HSV-1)μテントのhrR3は、大腸カルシノーマ細胞において複製するが、正常
な肝臓細胞では複製しないことが示された(Yoon等, 2000)。

【００８２】前述のウイルスに加えて、各種の他のウイルスが腫瘍の殺傷と関連しているが
、存在する機構は常に明らかであるわけではない。ニューカッスル病ウイルス(N
DP)は、悪性細胞で選択的に複製し、その最も一般的に使用される株は73-Tであ
る(Reichard等, 1992; Zorn等, 1994; Bar-Eli等, 1996)。NDPが腫瘍内接種の後
腫瘍の重さを減少するという臨床上の抗腫瘍活性も、子宮系、大腸、膵臓、胃、
メラノーマ、及び腎臓ガンを含む各種の腫瘍で観察された(WO 94/25627; Nemuna
itis, 1999)。それ故、NDVは混在した細胞性組成物から新生物細胞を除去するた
めに使用できる。

【００８３】さらに、ワクシニアウイルスは、いくつかの悪性腫瘍細胞系で増殖できた。脳
炎ウイルスは、マウス肉腫において腫瘍崩壊効果を有することが示されたが、正
常細胞におけるその感染を減少するための減弱化は必要でないであろう。腫瘍抑
制は、帯状疱疹、肝炎ウイルス、インフルエンザ、水痘、及び麻疹ウイルスで感
染された腫瘍患者において記載されている（レビューとして、Nemunaitis, 1999
参照）。ここに開示された方法及び当該技術分野で周知の方法に従って、当業者
は新生物細胞を選択的に殺傷するこれらまたは他のウイルスの能力を試験でき、
興味ある混在した細胞性組成物から新生物細胞を除去するためにウイルスが使用
できるかどうかを決定できる。

【００８４】４．ウイルス処理の後のウイルスの除去本発明において使用されるウイルスは正常細胞では複製しないが、ウイルス処
理された細胞性組成物を使用する前にウイルスを除去することが望ましいであろ
う。例えばレオウイルスは、いずれかの周知の疾患と関連するものではないが、
化学療法のため免疫系が弱化されたガン患者にはより感染性であるかもしれない
。それ故、もしレオウイルスが、造血幹細胞を含む組成物を処理するために使用
され、それがその後にガン患者に移植されるのであれば、レオウイルスは細胞性
組成物の移植の前に除去できる。

【００８５】従って、本発明の別の実施態様では、ウイルスで処理された細胞性組成物は、
DMSOを含む溶液で凍結され、移植の前に解凍される。DMSOは動物細胞を凍結して
貯蔵するために一般的に使用される一方、それはウイルスを変性し、それによっ
て幹細胞調製物から感染性ウイルスを除去する。これはウイルスが幹細胞移植を
介して移植受容者内に導入された場合の非所望の感染を引き起こす危険を減少す
る。

【００８６】別の実施態様では、ウイルス処理された細胞組成物は、ウイルスを不活性化ま
たは溶解するために、特定のウイルスに対する抗体、または特定の抗体と補体の
組み合わせで処理される。別法としてまたは加えて、特定のウイルスの表面の分
子を認識する特異的な抗体が、ウイルス処理された細胞性組成物からウイルス粒
子を除去するために使用されても良い。かくして、前記抗体は、当該技術分野で
周知のカラム、ビーズ、またはいずれかの他の物質に固定化され、細胞性組成物
を固定化抗体に適用し、抗体に結合しない組成物の一部を、固定化の特定の方法
に適した方法に従って回収する。

【００８７】ウイルス処理された混合物からウイルスを除去するために使用されても良い別
の方法は、ウイルスから細胞を分離し、細胞のみを含む層を回収する勾配に混合
物をかけることである。

【００８８】別の実施態様では、移植受容者は、ウイルス感染の危険を減少するために免疫
系を刺激する治療を受ける。この治療は、移植の前、同時、または後に実施され
ても良いが、移植の前に実施されるのが好ましい。別法の治療として、または免
疫系刺激剤と組み合わせて、ウイルス感染の危険を減少するために、受容者は特
定のウイルスに対する特異的な抗体が与えられることができる。

【００８９】組成物本発明は、細胞性組成物において含まれる新生物細胞の実質的な殺傷をウイル
スが引き起こすウイルス処理に、混在した細胞性組成物をかけることによって調
製される組成物を提供する。この組成物は、ウイルス性腫瘍崩壊物ではない。ウ
イルス性腫瘍崩壊物は、ウイルスによる腫瘍細胞の腫瘍崩壊から生ずる組成物で
あり、活性成分としてウイルス改変化腫瘍細胞膜を含む。本発明では対照的に、
ウイルス処理された細胞性組成物における活性成分は生存している非新生物細胞
である。

【００９０】キット前述のウイルスの全ては、新生物細胞を含んでも良い混在した細胞性組成物を
清浄化するために使用できる。所望であれば、ウイルスが特定の細胞性組成物を
清浄化するために使用できるかが最初に決定されても良い。例えば、混在した細
胞性組成物が、ガン患者から得られた造血幹細胞を含む場合、ガンの生検が事前
に回収され、ウイルスがそのガン細胞を有効に殺傷できるかを測定するために各
種のウイルスで処理することができる。次いでそのウイルスが、造血幹細胞を清
浄化するために使用できる。

【００９１】別法として、混在した細胞性組成物は、各ウイルスの効力を最初に測定するこ
となく、ウイルスのカクテルで処理されても良い。従って本発明は、異なるまた
はオーバーラップした特異性を有するウイルスの群を含むキットを提供する。例
えば前記キットは、ras活性化新生物細胞に対するレオウイルス、p53欠失新生物
細胞に対するp53発現ウイルス、Rb欠失新生物細胞に対するDelta24、p53欠失新
生物細胞に対するOnyx-015、インターフェロン耐性新生物細胞に対する水疱性口
内炎ウイルス、またはそれらのサブセットを含んでも良い。

【００９２】以下の実施例は、本発明を説明するために与えられ、いずれの態様でも本発明
の範囲を制限するものとしては考慮されるべきではない。

【００９３】

【実施例】

以下の実施例では、以下の略語は以下の意味を有する。定義されていない略語
は、一般的に受け入れられている意味を有する ℃ ＝摂氏の温度ｈｒ＝時間ｍｉｎ＝分 μＭ＝マイクロモーラーｍＭ＝ミリモーラーＭ＝モーラーｍｌ＝ミリリットル μｌ＝マイクロリットルｍｇ＝ミリグラム μｇ＝マイクログラムＰＡＧＥ＝ポリアクリルアミドゲル電気泳動ｒｐｍ＝回転／分ＦＢＳ＝胎児ウシ血清ＤＴＴ＝ジチオスレイトールＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウムＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水ＤＭＥＭ＝ダルベッコ修飾イーグル培地 α−ＭＥＭ＝ α−修飾イーゲル培地 β−ＭＥ＝ β−メルカプトエタノールＭＯＩ＝感染の多様性ＰＦＵ＝プラーク形成ユニットＰＫＲ＝二本鎖RNA活性化プロテインキナーゼＥＧＦ＝上皮増殖因子ＰＤＧＦ＝血小板由来増殖因子ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシドＣＰＥ＝細胞変性効果ＧＣＳＦ＝顆粒球コロニー刺激因子

【００９４】実施例１：レオウイルスは乳ガン細胞におけるレオウイルス誘導腫瘍崩壊とアポ
トーシスを誘導した新生物細胞の生存能力に対するレオウイルスの効果を測定するために、最初に
３種の乳ガンモデル系、MCF7(ATCCナンバーHTB-22)、SKBR3(ATCCナンバーHTB-30
)、及びMDA MB 468(ATCCナンバーHTB 132)を使用した。各細胞系の細胞を５０−
６０％の密度に増殖し、４０の感染の多様性でレオウイルス血清型３、Dearing
株で感染した。レオウイルスは、米国特許第6,136,307号に記載されたように得
て維持した。レオウイルス感染及び非感染細胞を、感染の０、２４、４８及び７
２時間後に回収し、生存能力を測定した。

【００９５】その結果は図１Ａ−１Ｄに示されている。レオウイルス感染MCF7（図１Ａ）、
SKBR3（図１Ｂ）、またはMDA MB 468細胞（図１Ｃ）における生存細胞カウント
は感染の後に有意に減少する一方、死んだウイルスまたはウイルスなしで感染さ
れた細胞は、予測されるように増殖した。レオウイルス処理は、MCF7（図１Ｄ）
及びSKBR3の生存の能力を感染の後７２時間までに９３％から１６％の減少を引
き起こした。MDA MB 468細胞では、ウイルス処理された完全な細胞数は、感染の
２４、４８及び７２時間までに、それぞれ元の細胞数の１２．７％、８．８％及
び３．６％に減少した。かくしてレオウイルスは、全ての３種のガン細胞におい
て有効に腫瘍崩壊を引き起こした。

【００９６】細胞はアポトーシスによって死んだ。CPE、アネキシンV及びDNA断片化のよう
な典型的なアポトーシスマーカーが、生存能力の減少と平行にタイムコースで観
察できた。図２Ａ−２Ｇは、レオウイルス感染の後の各種の時点でのDNA断片化
（図２Ａ−２Ｃ）、アネキシンV染色（２Ｄ）、またはAPO2.7⁺細胞（２Ｅ−２Ｇ
）のパーセンテージを示す。レオウイルスで処理された細胞は、ウイルスなしま
たは死んだ細胞でのコントロールと比較して、劇的なレベルでアポトーシスの全
ての兆候を示し、これら３種の細胞系の全てでレオウイルスがアポトーシスを誘
導したことを示した。コントロールにおけるアポトーシスは、時間と共にゆっく
りと増大するようであり、おそらく細胞があまりに高密度で増殖した場合に死に
始めるためであろう。

【００９７】実施例２：レオウイルスはガン細胞においてタンパク質合成を阻害するが、CD34⁺ 幹細胞では阻害しなかった幹細胞の選択的なウイルス感染のさらなる証拠のために、ウイルスタンパク質
の³⁵Sラベリング／SDS／PAGEを実施した。ウイルスタンパク質合成は、レオウイ
ルスで感染されたMCF7細胞において１−２日後に明らかであった一方、細胞のタ
ンパク質合成は同じ時点で減少し、レオウイルスが細胞マシネリーを乗っ取って
いることが示された。感染の４日後では、タンパク質合成はさらには検出できず
、全ての細胞が死んでいることを示唆した。細胞を死んだレオウイルスまたはウ
イルスなしで感染したコントロール実験では、ウイルスタンパク質合成は存在し
ない一方、細胞のタンパク質合成は正常レベルであった。対照的に、レオウイル
スの存在下または不存在下でのCD34⁺幹細胞の³⁵Sラベリングは、ウイルスの添加
の後７２時間までウイルスタンパク質合成を示さなかった。それ故、レオウイル
スはMCF7細胞に選択的に感染するが、CD34⁺幹細胞には感染しない。

【００９８】実施例３：レオウイルス処理はCD34⁺細胞の細胞増殖を阻害せず、分化能力も改
変しなかったタンパク質合成の結果と一致して、生存細胞カウントは、レオウイルス処理が
、ウイルスなしのコントロールと比較してCD34⁺細胞における生存細胞の数を減
少しないことを示した（図３Ａ）。

【００９９】 CD34⁺細胞の数はレオウイルス感染によって影響されない一方で、適切な割合
で全ての造血系列に分化するCD34⁺細胞の能力を、レオウイルスは変化しないか
どうか疑問が残った。もしこの場合であれば、レオウイルスで処理された幹細胞
は、全部の造血系の再構成のための適切な候補足り得ないであろう。この可能性
を調べるために、CD34⁺細胞をレオウイルス細胞でそれぞれ２、２４、４８また
は７２時間インキュベートした。次いでレオウイルスを除去し、細胞を希釈して
、１４日間新鮮な培地で培養し、コロニーを形成させた。各コロニーを、白血球
、赤血球、または白血球赤血球マクロファージ巨核球に属するかどうか測定する
ために調べた。図３Ｂに召されるように、生存ウイルスで処理された幹細胞(LV)
は、ウイルスなし(NV)のコントロールと同様な白血球(G)、赤血球(E)または白血
球赤血球マクロファージ巨核球(GEMM)の数を生産した。それ故、レオウイルス処
理は、CD34⁺細胞の分化能力を変えなかった。

【０１００】実施例４：レオウイルスは混在した細胞性組成物からガン細胞を選択的に除去し
た新生物細胞をアフェレーシス産物と混合し、レオウイルス感染にかけ、レオウ
イルスが混在した細胞性組成物から新生物細胞を選択的に除去できるかを調べた
。アフェレーシス産物は、以前に記載された方法に従って調製した(Stewart等,
1999; Duggan等, 2000)。アフェレーシス産物（９０％）とMCF7（１０％）の混
合物をレオウイルスで処理し、細胞カウントを生存能力について毎日試験すると
、サイトケラチンポジティブMCF7細胞の数の１００倍の枯渇が存在する一方、CD
34⁺細胞は完全で生存したままであった。図４Ａ−４Ｃは、MCF7、SKBR3またはMD
A MB 468細胞を有するアフェレーシス産物の混合物に対するレオウイルスの清浄
化効果を示す。これらの結果は、レオウイルスが細胞混合物中の新生物細胞を選
択的に殺傷し、幹細胞は完全なまま維持すること示す。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】図１Ａは、示されているように生存レオウイルス、死んだウ
イルス、ウイルスなしで感染されたMCF7における生存細胞の数を示す図である。

【図１Ｂ】図１Ｂは、示されているように生存レオウイルス、死んだウ
イルス、ウイルスなしで感染されたSKRB3における生存細胞の数を示す図である
。

【図１Ｃ】図１Ｃは、示されているように生存レオウイルス、死んだウ
イルス、ウイルスなしで感染されたHTB132における生存細胞の数を示す図である
。

【図１Ｄ】図１Ｄは、レオウイルス感染の後の各種の時点での生存中の
MCF7細胞のパーセンテージを示す図である。

【図２Ａ】図２Ａは、MCF7細胞におけるレオウイルス感染によってアポ
トーシスが誘導されたことを示す図である。レオウイルス感染の後に断片化した
DNAのパーセンテージが示されている。

【図２Ｂ】図２Ｂは、SKRB3細胞におけるレオウイルス感染によってア
ポトーシスが誘導されたことを示す図である。レオウイルス感染の後に断片化し
たDNAのパーセンテージが示されている。

【図２Ｃ】図２Ｃは、HTB1327細胞におけるレオウイルス感染によって
アポトーシスが誘導されたことを示す図である。レオウイルス感染の後に断片化
したDNAのパーセンテージが示されている。

【図２Ｄ】図２Ｄは、レオウイルス感染の後のアポトーシスマーカーア
ネキシンＶ染色のパーセンテージを示す図である。

【図２Ｅ】図２Ｅは、MCF7細胞におけるAPO2.7⁺細胞のパーセンテージ
を示す図である。

【図２Ｆ】図２Ｆは、HTB132細胞におけるAPO2.7⁺細胞のパーセンテー
ジを示す図である。

【図２Ｇ】図２Ｇは、SKRB3細胞におけるAPO2.7⁺細胞のパーセンテージ
を示す図である。

【図３Ａ】図３Ａは、CD34⁺幹細胞がレオウイルスで感染された後の各
種の時点での生存細胞の数を示す図である。

【図３Ｂ】図３Ｂは、長期的な幹細胞培養に対するレオウイルスの効果
を示す図である。幹細胞をレオウイルスで感染し、それぞれ２，24，48または72
時間インキュベートし、次いで細胞を希釈して細胞を14日間培養し、個々のコロ
ニーを形成させた。顆粒球(G)、赤血球(E)、または顆粒球赤血球マクロファージ
巨核球(GEMM)の各種のコロニーの数を、それぞれウイルスなし(NV)及び生存ウイ
ルス(LV)で感染した細胞について測定した。例えば、NV-Gはウイルスなしで処理
された細胞から由来する顆粒球コロニーを示し、LV-Gは生存ウイルスで処理され
た細胞から由来する顆粒球を示す。

【図４Ａ】図４Ａは、MCF7細胞を有するアフェレーシス産物の混合物に
対するレオウイルスの清浄化効果を示す図である。

【図４Ｂ】図４Ｂは、MDA MB 468細胞を有するアフェレーシス産物の混
合物に対するレオウイルスの清浄化効果を示す図である。

【図４Ｃ】図４Ｃは、SKRB3細胞を有するアフェレーシス産物の混合物
に対するレオウイルスの清浄化効果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 35/34 Ａ６１Ｋ 35/36 35/36 35/38 35/38 35/39 35/39 35/407 35/407 35/52 35/52 35/54 35/54 Ａ６１Ｐ 43/00 １０１Ａ６１Ｐ 43/00 １０１１０５１０５Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (31)優先権主張番号６０／２６８，０５４ (32)優先日平成13年２月13日(2001．2．13) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／２７６，７８２ (32)優先日平成13年３月16日(2001．3．16) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ブラッドリー・ジー・トンプソンカナダ・アルバータ・Ｔ２Ｎ・０Ｚ５・カルガリー・セヴンス・アヴェニュ・ノース・ウエスト・1775 (72)発明者マシュー・シー・コフィーカナダ・アルバータ・Ｔ２Ｎ・３Ｌ４・カルガリー・ノース・ウエスト・ボウネス・ロード・2231 Ｆターム(参考） 4B065 AA90X AA95X AC20 BA30 CA44 4C087 AA05 BB34 BB41 BB44 BB47 BB48 BB50 BB51 BB52 BB55 BB60 BB61 BB64 DA06 DA07 NA05 ZB21 【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】混在した細胞性組成物から新生物細胞を選択的に除去する方
法であって、前記組成物を生きた生物の外側に配置し、以下の工程： (a)前記組成物から新生物細胞を選択的に除去するように、新生物細胞の実質的
な殺傷を引き起こす条件下で、混在した細胞性組成物をウイルスと接触させる工
程；並びに (b)処理された細胞性組成物を回収する工程；を含む方法。
【請求項２】混在した細胞性組成物が造血幹細胞を含む、請求項１記載の
方法。
【請求項３】造血幹細胞が骨髄から収集されている、請求項２記載の方法
。
【請求項４】造血幹細胞が血液から収集されている、請求項２記載の方法
。
【請求項５】細胞性組成物が、組織、器官、または組織若しくは器官のい
ずれかの一部を含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】組織または器官が、肝臓、腎臓、心臓、大腸、皮膚、肺、膵
島細胞、及び全血からなる群から選択される、請求項５記載の方法。
【請求項７】組織、器官、または組織若しくは器官の一部が、移植に有用
である、請求項５記載の方法。
【請求項８】細胞性組成物が、培養細胞、精子、または卵を含む、請求項
１記載の方法。
【請求項９】ウイルスが複製可能ウイルスである、請求項１記載の方法。
【請求項１０】ウイルスがレオウイルスではない、請求項１記載の方法。
【請求項１１】ウイルスが、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワ
クシニアウイルス、及びパラポックスウイルスorfからなる群から選択される、
請求項１記載の方法。
【請求項１２】ウイルスが、二本鎖RNAキナーゼ(PKR)を阻害する遺伝子産
物を生産しないようにミューテートまたは改変されている、請求項１１記載の方
法。
【請求項１３】アデノウイルスが、生成したE1A遺伝子産物がRbに結合し
ないようにE1A領域でミューテートされている、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】アデノウイルスが、生成したE1B遺伝子産物がp53に結合し
ないようにE1B領域でミューテートされている、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】アデノウイルスが野生型p53タンパク質を発現可能である
、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】混在した細胞性組成物にインターフェロンを添加すること
をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１７】インターフェロンが、ウイルスの前またはウイルスと同時
に添加される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】ウイルスがインターフェロン感受性ウイルスである、請求
項１６記載の方法。
【請求項１９】ウイルスが水疱性口内炎ウイルス(VSV)である、請求項１
８記載の方法。
【請求項２０】ウイルスがニューカッスル病ウイルス(NDV)ではない、請
求項１記載の方法。
【請求項２１】ウイルスで処理された細胞性組成物からウイルスを除去す
る工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項２２】ウイルスで処理された細胞性組成物を貯蔵する工程をさら
に含む、請求項１記載の方法。
【請求項２３】細胞性組成物がDMSOを含む溶液中に貯蔵される、請求項２
２記載の方法。
【請求項２４】請求項１記載のウイルスで処理された細胞性組成物を含む
、生存可能な非新生物細胞の組成物。
【請求項２５】レオウイルス、機能的なp53タンパク質を発現するウイル
ス、Delta24、ONYX-015、ニューカッスル病ウイルス、及び水疱性口内炎ウイル
スからなる群から選択される少なくとも二つのウイルスを含むキット。